KR102097519B1 - 혈액암 치료제 - Google Patents

혈액암 치료제 Download PDF

Info

Publication number
KR102097519B1
KR102097519B1 KR1020200034510A KR20200034510A KR102097519B1 KR 102097519 B1 KR102097519 B1 KR 102097519B1 KR 1020200034510 A KR1020200034510 A KR 1020200034510A KR 20200034510 A KR20200034510 A KR 20200034510A KR 102097519 B1 KR102097519 B1 KR 102097519B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
nucleic acid
guanosine
modified nucleic
oligonucleotide
blood cancer
Prior art date
Application number
KR1020200034510A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20200033835A (ko
Inventor
문성환
이수진
지유미
신희종
기민효
박용빈
엄지현
Original Assignee
압타바이오 주식회사
삼진제약주식회사
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 압타바이오 주식회사, 삼진제약주식회사 filed Critical 압타바이오 주식회사
Publication of KR20200033835A publication Critical patent/KR20200033835A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102097519B1 publication Critical patent/KR102097519B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
    • C07H19/02—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing nitrogen
    • C07H19/04—Heterocyclic radicals containing only nitrogen atoms as ring hetero atom
    • C07H19/06—Pyrimidine radicals
    • C07H19/067—Pyrimidine radicals with ribosyl as the saccharide radical
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C07H21/02—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids with ribosyl as saccharide radical
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/712—Nucleic acids or oligonucleotides having modified sugars, i.e. other than ribose or 2'-deoxyribose
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/22—Heterocyclic compounds, e.g. ascorbic acid, tocopherol or pyrrolidones
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/08—Solutions
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
    • C07H19/02—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing nitrogen
    • C07H19/04—Heterocyclic radicals containing only nitrogen atoms as ring hetero atom
    • C07H19/06—Pyrimidine radicals
    • C07H19/09—Pyrimidine radicals with arabinosyl as the saccharide radical
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C07H21/04—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids with deoxyribosyl as saccharide radical
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/18—Type of nucleic acid acting by a non-sequence specific mechanism
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/323—Chemical structure of the sugar modified ring structure
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/33—Chemical structure of the base
    • C12N2310/334—Modified C
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/30—Special therapeutic applications

Abstract

본 발명은 치료 효능이 있는 변형핵산인 1-β-D-아라비노푸라노실시토신(1-β-D-Arabinofuranosylcytosine) 및 구아노신을 함유하는 올리고뉴클레오티드 변형핵산체에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 1개 이상의 치료 효능이 있는 변형핵산(N)과 풍부한 구아노신(G)이 포함된 신규 올리고뉴클레오티드 변형핵산체를 합성하고, 상기 올리고뉴클레오티드 변형핵산체가 혈액암세포 및 약물저항성 혈액암세포에 대해 우수한 세포사멸 활성을 가짐을 확인함으로써, 신규 올리고뉴클레오티드 변형핵산체 및, 상기 변형핵산체 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 혈액암 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

Description

혈액암 치료제{Therapeutics of blood cancer}
본 발명은 치료효능이 있는 변형핵산인 1-β-D-아라비노푸라노실시토신(1-β-D-Arabinofuranosylcytosine)이 도입된 신규한 올리고뉴클레오티드 변형핵산체 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 혈액암 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
혈액암은 다양한 혈액세포들이 암세포로 바뀌며 만들어지는 암을 말하며, 혈액, 골수, 및/또는 림프계를 공격하는 암의 종류를 말한다. 이와 같은 종류의 암에는 백혈병, 림프종 및 다발성 골수종이 포함된다. 백혈병은 혈액세포를 만드는 조혈모세포가 암세포로 변하여 백혈병세포를 과잉 생산해 내며, 반면에 정상 혈액세포를 제대로 생산하지 못하여 감염, 빈혈, 출혈 등이 나타날 수 있는 혈액암이다. 림프종은 림프계에서 발생하는 암으로 비호지킨림프종과 호지킨림프종이 있다. 다발성골수종은 혈액 내 백혈구의 일종인 형질세포가 비정상적으로 분화 및 증식되어 나타나는 혈액암이다. 좀 더 구체적으로 혈액암은 비호지킨림프종, 호지킨 림프종, 다발성 골수종, 백혈병, 림프종, 골수이형성 증후군, 급성 림프모구성백혈병, 급성 골수성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 고립성 골수종, 재생불량성 빈혈 등이 있다.
매년, 백혈병, 호지킨 및 비-호지킨 림프종 및 골수종의 새로운 사례가, 진단되는 모든 새로운 암 사례의 거의 10%를 차지하고 있다. 고령화 사회에 접어들면서 혈액암을 앓는 노인이 크게 늘고 있지만 이들의 생존율은 매우 낮으며, 특히 65세이상의 생존율은 9.4%에 불과하고 80세 이상의 생존율은 0%로 현격히 낮다. (Blood, 2012,120;1165-1174)
혈액암은 혈액과 림프계에 생긴 돌연변이 세포가 온몸에 흐르다가 암세포로 변하여 생기는 질환으로서 혈액암의 종류도 다양하여 70여종에 이른다. 따라서 혈액암 진단을 받은 환자는 먼저 돌연변이 이상 세포를 죽이기 위해 먼저 몸 안의 면역세포를 모두 없애는 관해유도 항암치료를 받는다. 그 후 이상 세포에만 독성이 있는 약을 주입하는 공고 항암치료를 시행한다. 관해 유도 항암치료는 세포독성이 매우 강한 항암제들을 병용하여 고용량투여로 진행되는데 독성과 부작용이 매우 커서 고령의 환자에게는 투여가 어렵다. 이는 고령의 혈액암 환자의 생존율이 매우 낮은 이유이다. (Blood, 2010,116:5818~5823)
또한 혈액암은 고용량의 관해유도 항암치료에도 반응성이 없어 치료효과가 없거나, 내성 발현율 및 5년내 재발율이 매우 높기 때문에 의학적 미충족 수요가 매우 높다.
현재 항체 및 키나제 억제제를 사용하는 표적 치료요법이 개발되었지만, 혈액암을 다루는데 있어서 여전히 화학요법 및 방사선 치료요법에 많이 의존하고 있다 (The new england journal of medicine, 2014, 371:1005~1015). 혈액암의 화학요법제로 사용되는 항암제는 대부분 상당한 독성을 지니는 세포독성 항암제로서 낮은 생체 이용률 및 암세포로의 표적 전달의 어려움으로 인해 매우 높은 용량을 투여한다. 이로 인해 환자에게 심각한 부작용을 수반하여 치료를 어렵게 한다. 따라서 독성이 적으면서 효과적인 치료효능을 갖는 새로운 치료제가 요구된다.
구아노신이 풍부한 올리고뉴클레오티드는 광범위한 암세포에 대하여 세포성장저해 효과를 가진다고 알려져 있으며, 암세포에 처리할 경우 세포내의 특정한 단백질, 예를 들어 eEF1A, JNK, Ki-ras, nucleolin, stat3, telomerase, topoisomerase 단백질 등과 같은 세포 성장과 사멸에 중요한 단백질과 결합하여 세포주기를 조절하는 역할을 하며, 이러한 단백질은 정상 세포보다 암 세포에 과발현되어 있는 것으로 알려져 있다 (Christopher R. Ireson et al. Molecular cancer therapy, 2006, 2957-2962; Naijie Jing et al. Cancer research, 2004, 6603-6609; Christophe Marchand et al. The journal of biological chemistry, 2002, 8906-8911).
이러한 구아노신이 풍부한 올리고뉴클레오타이드는 시토신과 삼중의 수소결합 외에도 특별한 구조적인 특징을 가지고 있다. 구아노신이 풍부한 올리고뉴클레오티드는 분자내 결합 또는 분자간 결합을 통하여 4가닥의 구조를 가질 수 있다. 일반적인 아데노신과 티아민, 구아노신과 시티딘과의 수소결합을 통한 이중나선구조를 형성하는 대신 4개의 구아노신이 한 평면에 위치하여 후그스텐(hoogsteen) 형태의 수소결합을 이루어서 G-쿼드로플렉스(G-quadruplex)를 형성하고 이것이 2개 이상 연속적으로 구성되어 사중 나선구조(tetrahelical structure)를 가지게 된다. 일반적으로 올리고뉴클레오티드가 혈액 내 안정성 및 세포투과율이 매우 낮아 약물로서 개발하는 어려움이 있었으나, 이러한 G-쿼드로플렉스를 이루는 올리고뉴클레오티드는 그의 구조적인 특징으로 인하여 안정한 구조를 이루고 있어 비교적 높은 혈액안정성 및 세포투과도를 가지는 것으로 알려져 있다.
이러한 G-쿼드로플렉스를 형성하는 올리고뉴클레오티드는 미국특허 제7314926, 미국 특허 공개 제2007-105805호에서와 같이 암세포 표면에 많이 발현되어 있는 특정한 단백질과 결합 후 엔도사이토시스로 암세포로 침투 후 세포사멸에 관련된 단백질에 결합하여 세포성장을 저해하는 것으로 알려져 있으며, 세포독성 효과(cytotoxic effect) 보다 세포성장 정지 효과(cytostatic effect)로 인하여 세포사멸을 유도하는 것으로 보고되어 있다 (Paula J. Bates et al. The journal of biological chemistry, 1999, 26369-26377; Bruna et al. FEBS journal, 2006, 1350-1361).
또한, G-쿼드로플렉스를 형성하는 올리고뉴클레오티드는 암세포의 성장을 저해시키는 효과 이외에도 미국 특허 제5567604호에서는 항바이러스, 미국특허 제6994959호에서는 면역조절작용, 미국 특허 공개 제2007-105805호에서는 헌팅턴 질환에 치료 효과가 있는 것으로 발표되어 생체 내에서 여러 가지 기능 및 조절작용을 하는 것으로 알려졌다 (Cheryl A. Stoddart et al. Antimicrobial agents and chemotherapy, 1998, 2113-2115; Michael Skogen et al. BMC neuroscience, 2006, 7:65).
이러한 G-쿼드러플렉스를 형성하는 올리뉴클레오티드는 세포성장 정지 효과(cytostatic effect)로 인한 세포사멸을 유도하므로 세포사멸율이 비교적 높지 않다. 따라서 강한 독성의 화학요법제와 병용투여해야 하는 어려움이 있다 (Paula J. Bates et al. Experimental and molecular pathology, 2009, 151-164; Christopher R. Ireson et al. Molecular cancer therapy, 2006, 2957-2962).
국내특허 제 10-0998365호에는 G-쿼드로플렉스를 형성하는 올리고뉴클레오티드에 세포사멸 효과를 주는 치료용 변형핵산을 도입하여 세포사멸 효과를 증대한 예가 보고되어 있다. 그러나 본 발명의 올리고뉴클레오티드 변형핵산체는 개시되어 있지 않고, 이들의 혈액암에 대한 치료효과 및 약물저항성 혈액암세포의 세포사멸 효과가 개시되어 있지 않다.
대한민국 등록특허 10-0998365 호 미국 특허 US 7314926 호 미국 공개특허 US 2007-105805 호 미국 특허 US 5567604호 미국 특허 US 6994959호 미국 공개특허 US 2007-105805호
(비특허 문헌 1) Christopher R. Ireson et al. Molecular cancer therapy, 2006, 2957-2962; Naijie Jing et al. Cancer research, 2004, 6603-6609; Christophe Marchand et al. The journal of biological chemistry, 2002, 8906-8911. (비특허 문헌 2) Paula J. Bates et al. The journal of biological chemistry, 1999, 26369-26377; Bruna et al. FEBS journal 2006 1350-1361] (비특허 문헌 3) Cheryl A. Stoddart et al. Antimicrobial agents and chemotherapy, 1998, 2113-2115; Michael Skogen et al. BMC neuroscience, 2006, 7:65. (비특허 문헌 4) Paula J. Bates et al. Experimental and molecular pathology, 2009, 151-164; Christopher R. Ireson et al. Molecular cancer therapy, 2006, 2957-2962.
이에, 본 발명자들은 세포성장 정지 효과(cytostatic effect)를 가지는 구아노신이 풍부하여 G-쿼드로플렉스를 형성하는 올리고뉴클레오티드에 세포독성 효과(cytotoxic effect)로 세포사멸을 유도하는 치료효능이 있는 변형핵산체로서 1-β-D-아라비노푸라노실시토신(1-β-D-Arabinofuranosylcytosine)을 1개 이상 도입하여 혈액 안정성 및 세포 투과성을 증대함과 동시에 좀 더 효과적으로 혈액암세포의 성장을 억제하고 사멸에 이르게 하고자 하였으며, 이러한 구조의 신규한 올리고뉴클레오티드를 합성하여 세포독성을 비교해 본 결과 혈액암세포 사멸 효과가 획기적으로 증대되었고, 특히 기존의 혈액암 치료제에 반응하지 않아 치료를 어렵게 하는 약물저항성 혈액암세포에서도 nM 수준의 우수한 항암효과를 보이며, 혈액암 동물모델에서도 우수한 혈액암 치료효능을 나타내는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명은 치료효능이 있는 변형핵산체로서 1-β-D-아라비노푸라노실시토신이 1개 이상 도입되고 풍부한 구아노신이 포함된 신규 올리고뉴클레오티드 변형핵산체를 제공하는데 그 목적이 있다.
또한, 본 발명은 상기 올리고뉴클레오티드 변형핵산체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 혈액암 예방, 개선 또는 치료용 조성물을 제공하는데 또 다른 목적이 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일측면은 하기 화학식 2 로 표시되는 화합물을 포함하여 G-쿼드로플렉스(G-quadruplex) 구조를 형성하는 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드 변형핵산체를 제공한다.
[화학식 2]
Figure 112020029702310-pat00001
또한 본 발명의 일측면은, 하기 서열로 표시되는 올리고뉴클레오티드 변형핵산체를 그 특징으로 한다;
서열1)GGTGGTGGTTNTGGTGGTGG
서열2)GGTGGTGGTNNTGGTGGTGG
서열3)NGGTGGTGGTTGTGGTGGTGG
서열4)NNGGTGGTGGTTGTGGTGGTGG
상기 서열에서, G는 구아노신 또는 구아노신 유도체, T는 티민 또는 티민 유도체, N는 1-β-D-아라비노푸라노실시토신이다.
또한, 본 발명의 다른 측면은 상기 올리고뉴클레오티드 변형핵산체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 혈액암 예방, 개선 또는 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 신규한 올리고뉴클레오티드 변형핵산체는 1-β-D-아라비노푸라노실시토신 1개 이상과 구아노신이 포함되어 G-쿼드로플렉스를 형성할 수 있는 신규 구조의 화합물로서, 혈액암세포 및 약물저항성 혈액암세포에 대해 우수한 세포사멸 활성 및 항암 치료효능을 가지므로 혈액암 예방 및 치료제로서 활용될 수 있다.
도 1은 올리고뉴클레오티드 변형핵산체의 시타라빈(혈액암 1차치료제)에 약물저항성을 가진 혈액암세포(Cytarabine-resistant MOLM13)에서 세포사멸 효과를 나타낸 그래프이다.
도 2는 올리고뉴클레오티드 변형핵산체의 시타라빈에 대한 약물저항성을 가진 혈액암세포(Cytarabine-resistant MV-4-11)에 대한 세포성장저해 효과를 비교한 그래프이다.
도 3는 올리고뉴클레오티드 변형핵산체의 혈액암 동물모델(Luc-MOLM13 AML)에서 혈액암세포사멸 효능을 나타낸 그래프이다.
도 4는 올리고뉴클레오티드 변형핵산체의 혈액암 동물모델(Luc-MOLM13 AML)에서 혈액암세포사멸 효능을 나타낸 영상사진이다.
도 5는 올리고뉴클레오티드 변형핵산체의 혈액암 동물모델(Luc-MOLM13 AML)에서 항암효능 및 생존율을 나타낸 것이다.
도 6은 올리고뉴클레오티드 변형핵산체의 혈액암 동물모델(C1498)에서 항암효능 및 생존율을 나타낸 것이다.
도 7은 올리고뉴클레오티드 변형핵산체의 혈액암 동물모델(WEHI-3)에서 항암효능 및 생존율을 나타낸 것이다.
도 8은 올리고뉴클레오티드 변형핵산체의 재발성/난치성 급성 골수성 백혈병 환자의 골수 단핵 세포에 대한 항암 효능을 나타낸 것이다.
본 명세서에 있어서, 범위가 변수에 대해 기재되는 경우, 상기 변수는 상기 범위의 기재된 종료점들을 포함하는 기재된 범위 내의 모든 값들을 포함하는 것으로 이해될 것이다. 예를 들면, "5 내지 10"의 범위는 5, 6, 7, 8, 9, 및 10의 값들뿐만 아니라 6 내지 10, 7 내지 10, 6 내지 9, 7 내지 9 등의 임의의 하위 범위를 포함하고, 5.5, 6.5, 7.5, 5.5 내지 8.5 및 6.5 내지 9 등과 같은 기재된 범위의 범주에 타당한 정수들 사이의 임의의 값도 포함하는 것으로 이해될 것이다. 또한 예를 들면, "10% 내지 30%"의 범위는 10%, 11%, 12%, 13% 등의 값들과 30%까지를 포함하는 모든 정수 들 뿐만 아니라 10% 내지 15%, 12% 내지 18%, 20% 내지 30% 등의 임의의 하위 범위를 포함하고, 10.5%, 15.5%, 25.5% 등과 같이 기재된 범위의 범주 내의 타당한 정수들 사이의 임의의 값도 포함하는 것으로 이해될 것이다.
이하, 본 발명에 대해 상세히 설명한다.
본 발명의 일측면은, 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 포함하여 G-쿼드로플렉스 구조를 형성하는 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드 변형핵산체를 제공한다:
[화학식 1]
Figure 112020029702310-pat00002
상기 화학식 1 에서, R1은 수소 또는 다른 핵산 중 포스페이트 잔기의 인 원자이고, R2는 수소 또는 다른 핵산 중 포스페이트 잔기의 인 원자이다.
본 발명의 일측면에서, 상기 화합물은 하기 화학식 2 로 표시되는 화합물인 것을 특징으로 하는, 올리고뉴클레오티드 변형핵산체일 수 있다;
[화학식 2]
Figure 112020029702310-pat00003
본 발명의 일측면에서, 상기 올리고뉴클레오티드 변형핵산체는 'GaTbNc'서열[여기서, G는 구아노신 또는 구아노신 유도체, T는 티민 또는 티민 유도체, N는 변형핵산으로서 1-β-D-아라비노푸라노실시토신 또는 이의 유도체의 변형핵산이고, G, T, N는 순열에 의해서 무작위로 배열되며, a는 1 내지 30의 정수, b는 0 내지 30의 정수, c는 1 내지 30의 정수이고, 단, a,b,c를 합한 전체의 값은 60을 넘지 않는다.]로 표시되는 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드 변형핵산체일 수 있다.
본 발명의 일측면에서, 하기 서열로 표시되는 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드 변형핵산체일 수 있다:
서열1)GGTGGTGGTTNTGGTGGTGG ;
서열2)GGTGGTGGTNNTGGTGGTGG ;
서열3)NGGTGGTGGTTGTGGTGGTGG ; 또는
서열4)NNGGTGGTGGTTGTGGTGGTGG ;
상기 서열에서, G는 구아노신 또는 구아노신 유도체, T는 티민 또는 티민 유도체, N는 변형핵산으로서 1-β-D-아라비노푸라노실시토신이다.
본 발명의 일측면에서, 상기 구아노신 또는 구아노신 유도체는 2'-데옥시구아노신(2-deoxy-guanosine), 구아노신(guanosine), 2'-오-메틸-구아노신(2'-O-methyl-guanosine), 2'-플루오로-구아노신(2'-F-guanosine), LNA(Locked Nucleic Acid)-구아노신, D-데옥시구아노신 및 D-구아노신 중에서 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드 변형핵산체일 수 있다.
본 발명의 다른 측면은 상기 중에서 선택된 어느 하나의 올리고뉴클레오티드 변형핵산체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 혈액암 예방, 개선 또는 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 측면에서, 상기 혈액암은 비호지킨 림프종, 호지킨 림프종, 다발성 골수종, 백혈병, 림프종, 골수이형성 증후군(MDS), 급성 림프모구성백혈병, 급성 골수성 백혈병, 만성 림프구설 백혈병, 만성 골수성 백혈병 및 고립성 골수종 중 어느 하나 이상인 혈액암 예방, 개선 또는 치료용 조성물을 제공한다.
이하, 본 발명의 일 구현예들에 대하여 상세히 설명한다.
본 발명의 일측면은 치료 효능이 있는 변형핵산으로서 1-β-D-아라비노푸라노실시토신 1개 이상과 풍부한 구아노신이 포함된 신규 올리고뉴클레오티드 변형핵산체를 제공하는데 그 목적이 있다.
또한, 본 발명의 일측면은 상기 올리고뉴클레오티드 변형핵산체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 혈액암 예방, 개선 또는 치료용 조성물을 제공하는데 또 다른 목적이 있다.
본 발명에서 사용되는 G-쿼드로플렉스는 구아노신(G)으로 대표적으로 언급되어지는 2'-데옥시구아노신(2-deoxy-guanosine), 구아노신(guanosine), 2'-오-메틸-구아노신(2'-O-methyl-guanosine), 2'-플루오로-구아노신(2'-F-guanosine), LNA(Locked Nucleic Acid)-구아노신, D-데옥시구아노신 및 D-구아노신 중에서 선택된 1종 또는 2종 이상[도 1 참조] 등이 풍부하여 특정 서열의 경우 4개의 구아노신이 한 평면에 위치하여 후그스텐(hoogsteen) 형태의 수소결합을 이루어서 사중 나선구조를 가지게 되는 올리고뉴클레오티드를 말하며, 여기에 치료적 효과를 가지는 변형핵산을 도입하도록 합성된다.
구아노신이 풍부하여 G-쿼드로플렉스 구조를 형성하는 올리고뉴클레오티드는 암세포에 좀 더 선택적으로 결합하고 세포 내에서 여러 기작을 통하여 암세포의 성장을 저해한다는 것이 알려졌다.
이러한 G-쿼드로플렉스를 형성하는 올리고뉴클레오티드에 변형핵산을 한 개 이상 포함시켜 암세포 내로 전달 후 G-쿼드로플렉스 자체의 세포 성장 저해 효과 외에 뉴크레아제(Nuclease)에 의하여 분해될 경우 치료 효과를 갖는 변형핵산이 직접적으로 세포 성장을 저해시켜 복합적으로 암세포가 사멸하게 되었다. G-쿼드로플렉스를 형성하는 올리고뉴클레오티드는 단독적으로 사용 시에는 세포 성장 저지 효과만 있기 때문에 세포 사멸율이 비교적 높지 않을 뿐 아니라 일정시간 이상 지속적인 처리가 필요하다. 하지만, 본 발명에서는 혈액암 치료 효과를 갖는 변형핵산이 포함되면 세포사멸 효과가 직접적으로 증대되어 세포사멸율이 급격히 증가될 수 있음을 확인하였다.
본 발명의 일측면에에서, 치료 효능을 가지는 변형핵산으로는 1-β-D-아라비노푸라노실시토신일 수 있다.
구체적인 양태로서 본 발명에서 사용된 시티딘 유래 치료용 변형핵산(N)는 다음 화학식 2의 시티딘 유도체이며, 상기 뉴클레오티드를 통상적인 방법[Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach 1991 Fritz Eckstein et al. IRL Press: Oxford]으로 포스포라미다이트 형태로 만들거나, 뉴클레오티드 포스포라미다이트를 글렌리서치(glenresearch)사, 베리(Berry and Associates)사, 오키노스(Okeanos Tech)사, 켐젠(Chemgene)사, 프롤리고(Proligo)사 등에서 구입하고, 기존에 보고된 방법으로 DNA 합성기를 이용한 고정상 합성법을 통하여 구아노신이 풍부한 올리고뉴클레오티드에 포함되도록 생산 가능하다.
[화학식 2]
Figure 112020029702310-pat00004
상기 변형핵산이 포스포라미다이트 형태로 만들어진 것을 사용하여 고정상 합성기를 통하여 통상적인 방법으로 올리고뉴클레오티드 변형핵산체를 제조할 수 있다.
즉, 상기 변형핵산 포스포라미다이트를 무수아세토나이트릴에 녹여서 DNA 합성기에 장착하여 합성하고, 글렌리서치(glenresearch) 사에서 제공하는 지침서 및 미국특허 제 5457187호와 제 5614505호를 참고하여 통상적인 합성 및 정제방법을 이용하여 올리고뉴클레오티드 변형핵산체를 합성한다.
또한, 상기와 같이 변형핵산을 이용하여 합성 가능한 올리고뉴클레오티드 변형핵산체의 대표적인 서열은 다음과 같다.
서열1)GGTGGTGGTTNTGGTGGTGG
서열2)GGTGGTGGTNNTGGTGGTGG
서열3)NGGTGGTGGTTGTGGTGGTGG
서열4)NNGGTGGTGGTTGTGGTGGTGG
적절한 위치에 변형핵산을 도입한 상기 서열의 화합물들은 정상세포에는 거의 영향을 미치지 않으면서 혈액암세포 및 약물저항성 혈액암세포에 대해서도 우수한 세포사멸 효과를 보이는 것으로 확인되었다. 또한 혈액암에 대한 치료 효능도 매우 우수함을 동물실험을 통하여 확인하였다.
따라서 G-쿼드러플렉스를 형성하면서 생리활성을 갖는 올리고 뉴클레오타이드의 서열에 본 발명의 시티딘 변형핵산을 치환하여 도입함으로써 신규한 뉴클레오티드 변형핵산체를 완성할 수 있다.
상기 치료적 효능을 가지는 변형핵산(N)은 하기 화학식 1 로 표시되는 화합물로 올리고뉴클레오티드 변형핵산체 내에 존재하게 된다.
[화학식 1]
Figure 112020029702310-pat00005
상기 화학식 1 에서, R1은 수소 또는 다른 핵산 중 포스페이트 잔기의 인 원자이고, R2는 수소 또는 다른 핵산 중 포스페이트 잔기의 인 원자이다.
상기에서, G는 구아노신으로, 바람직하기로는 2'-데옥시구아노신(2-deoxy-guanosine), 구아노신(guanosine), 2'-오-메틸-구아노신(2'-O-methyl-guanosine), 2'-플루오로-구아노신(2'-F-guanosine), LNA(Locked Nucleic Acid)-구아노신, D-데옥시구아노신, D-구아노신 중에서 선택된 1종 또는 2종 이상일 수 있으며, N는 시티딘 유래의 변형핵산으로서, 1-β-D-아라비노푸라노실시토신(1-β-D-Arabinofuranosylcytosine)이다.
기존의 치료 효과를 가지는 뉴클레오시드 함유 치료제의 경우 전신독성, 약제 내성 등의 부작용을 나타날 수 있으며 많은 암세포가 이러한 치료용 뉴클레오시드 항암제에 내성을 획득하여 다른 약제를 선택해야 하는 경우도 발생한다. 이러한 치료 효과를 가지는 뉴클레오시드가 암세포에 상대적으로 더 선택성을 가지는 G-쿼드로플렉스 올리고뉴클레오티드에 포함될 경우 생체 내에서 정상세포에 미치는 영향을 최소화할 수 있으며, 또한 약물저항성을 가지는 암세포종에서도 복합적으로 사멸율을 증대 시킬 수 있다.
이러한 G-쿼드로플렉스(Quadruplex) 구조는 포타슘이온(K+) 등이 존재할 경우 더욱 안정한 형태를 이루어서 혈액 내에서와 같은 일반적인 생리조건에서도 상당히 오랫동안 안정한 구조를 가지게 된다. 따라서, 본 발명에서는 일정농도(30 ~ 70 mM)의 KCl 용액 등을 이용하여 치료 효과를 가지는 변형핵산이 포함된 G-쿼드로플렉스 올리고뉴클레오티드를 안정화시킨 후 사용된다.
본 발명에 따른 신규 올리고뉴클레오티드 변형핵산체는 혈액암세포 및 약물저항성 혈액암세포에서 기존의 치료 효과를 가지는 뉴클레오시드 함유 치료제에 비해 월등히 향상된 세포사멸 효과를 나타내었고, 동물모델을 이용한 항암효능 평가에서도 우수한 항암 치료 효능을 나타내었다.
따라서, 본 발명은 상기 올리고뉴클레오티드 변형핵산체 또는 이의 약제학적 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 암 예방, 개선 또는 치료용 조성물을 포함한다. 상기 약학적으로 허용 가능한 염은, 예를 들어, 금속염, 유기 염기와의 염, 무기산과의 염, 유기산과의 염, 염기성 또는 산성 아미노산과의 염 등이 있다. 적합한 금속염으로서, 나트륨염, 칼륨염 등과 같은 알칼리 금속염; 칼슘염, 마그네슘염, 바륨염 등과 같은 알칼리 토금속염; 알루미늄염 등이 있다. 유기 염기와의 염의 적합한 예로서, 예를 들어, 트리메틸아민, 트리에틸아민, 피리딘, 피콜린, 2,6-루티딘, 에탄올아민, 디에탄올아민, 트리에탄올아민, 시클로헥실아민, 디시클로헥실아민, N,N-디벤질에틸렌디아민 등의 염이 있다. 무기산과의 염의 적합한 예로서, 예를 들어, 염산, 브롬화수소산, 질산, 황산, 인산 등과의 염이 있다. 유기산과의 염의 적합한 예로는 포름산, 아세트산, 트리플루오로아세트산, 프탈산, 푸마르산, 옥살산, 타르타르산, 말레인산, 시트르산, 숙신산, 메탄술폰산, 벤젠술폰산, p-톨루엔술폰산 등의 염이 있다.
염기성 아미노산과의 염의 적합한 예로서, 예를 들어, 알기닌, 라이신, 오르니틴 등의 염이 있다. 산성 아미노산과의 염의 적합한 예로서, 예를 들어, 아스파르트산, 글루탐산 등의 염이 있다. 특히, 바람직한 염으로는, 화합물이 그 내에 산성 관능기를 가지는 경우, 알칼리 금속염 (예컨대, 나트륨염, 칼륨염 등), 알칼리 토금속염 (예컨대, 칼슘염, 마그네슘염, 바륨염 등) 등과 같은 무기염, 및 암모늄염과 같은 유기 염이 있으며, 화합물이 그 내에 염기성 관능기를 가지는 경우, 염산, 브롬화수소산, 질산, 황산, 인산 등과 같은 무기산과의 염, 아세트산, 프탈산, 푸마르산, 옥살산, 타르타르산, 말레인산, 시트르산, 숙신산, 메탄술폰산, p-톨루엔술폰산 등과 같은 유기산과의 염이 있다.
본 발명의 올리고뉴클레오티드 변형핵산체를 포함한 암 예방, 개선 또는 치료용 조성물은 유효성분 외에 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 상기 약제학적으로 허용되는 담체는 주사제의 경우에는 보존제, 등장화제, 무통화제, 가용화제, 완충제, 및 안정화제 등을 혼합하여 사용할 수 있으며, 경구 투여 시에는 가용화제, 결합제, 부형제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소 붕해제, 활택제 및 향료 등을 사용할 수 있고, 국소투여용의 경우에는 기제, 부형제, 윤활제 및 보존제 등을 사용할 수 있다.
본 발명의 조성물 제형은 약제학적으로 허용되는 담체와 혼합하여 다양하게 제조될 수 있다. 또한, 조성물의 제형은 주사제의 경우에는 단위 투약 앰플 또는 다수회 투약 형태로 제조할 수 있으며 경구 투여 시에는 정제, 엘릭서, 캡슐, 서스펜션, 트로키, 웨이퍼 및 시럽 등의 형태로 제조할 수 있으며 현탁액, 정제, 환약, 캡슐 및 서방형 제제 등으로 제형화할 수 있다.
한편, 제제화에 적합한 담체, 부형제 및 희석제의 예로는 미정질 셀룰로즈, 자일리톨, 에리스리톨, 메틸 셀룰오스, 폴리비닐피롤리돈, 전분, 아카시아, 알지네이트, 젤라틴, 락토즈, 덱스트로오스, 수크오스, 프로필 히드록시벤조에이트, 셀룰로오스, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 마그네슘 스테아레이트 탈크, 솔비톨, 만니톨, 말티톨, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 또는 광물유 등이 사용될 수 있다.
본 발명에서 "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 소정의 물질을 도입하는 것을 의미하며, 상기 유효성분의 투여 경로는 약물이 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 정맥내 투여, 피하 투여, 경구 투여, 근육내 투여, 복강내 투여, 폐내 투여, 직장 내 투여, 국소 투여, 비내 투여 및 피내 투여 등이 될 수 있으며, 이것에 만 제한되지는 않는다. 그러나 경구 투여 시, 올리고뉴클레오티드는 소화가 되기 때문에 경구용 조성물은 위나 장관에서의 분해 및 흡수가 용이하도록 제조되어야 하며, 바람직하게는 주사제 형태 및 비강 내로의 투여될 수 있다.
본 발명에 따른 유효성분의 제제 내 함유량은 체내에서의 활성 성분의 흡수도, 불활성화율, 배설속도, 사용자의 연령, 성별 및 상태 등에 따라 적절히 선택할 수 있다. 본 발명의 유효성분의 경우, 1 ∼ 1000 mg/kg이고, 바람직하게는 3 ∼ 100 ㎎/㎏이며, 하루 1 ∼ 3회 투여 또는 일정 기간 동안 지속적(infusion) 투여할 수 있다.
이하, 본 발명은 다음 실시예에 의거하여 구체적으로 설명하는 바, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 신규한 올리고뉴클레오티드 변형핵산체의 합성
DNA 합성은 일반적인 DNA 고정상 합성기를 이용하여 1μmole 스케일로 합성을 실시하였다. 합성에 사용되는 포스포라미다이트는 글렌리서치(Glen research) 사에서 구입한 데옥시구아노신, 티미딘, 1-β-D-아라비노푸라노실시토신 포스포라미다이트를 건조한 아세토나이트릴을 이용하여 0.067M 농도로 녹여 폴리진(Polygene)사의 DNA 고정상합성기에 장착한다. 다음 표 1 에 제시된 서열에 따라 합성이 되며, 일반적으로 3′→ 5′방향으로 진행되는데, 첫 뉴클레오티드의 3' 수산기를 수지에 붙여 놓고, 한 염기가 첨가되는 동안 크게 4 단계의 화학반응 즉, 5′-말단의 탈트리틸반응(detritylation), 새로운 염기의 부가반응(coupling), 부가반응이 되지 않은 DNA 사슬의 캡핑(capping) 반응, 인산기의 산화반응(oxidation)을 반복하였다. 반응이 종결되면 보호기를 제거하고, 합성된 CPG 레진을 암모니아수에 넣고 55 ℃에서 5시간동안 방치 후 암마니아수를 건조하여 흰색 파우더를 얻었다. 워터스(Waters) 음이온 교환 HPLC 칼럼을 이용하여 HPLC 시스템에서 1M NaCl 용액을 5~70%로 증가하여 정제를 실시하였다. 메인 피크를 수집하고 여기에 100% 에탄올을 넣어 올리고뉴클리오티드를 침전시켜 건조하였다. 결과적으로 HPLC를 이용한 측정 결과 순도 85% 이상의 올리고뉴클레오티드를 얻었으며, ESI-LC-MS (Q-TRAP 2000 ESI-MS)를 이용하여 분자량을 측정하여 합성 성공 유무를 확인하였다.
다음 표 1의 서열 이외에 기존에 치료를 목적으로 보고된 올리고뉴클레오티드 서열 또는 G-쿼드러플렉스를 형성하면서 생리적 활성을 나타내는 다양한 서열에 대해 상기와 동일한 방법으로 올리고뉴클레오티드 변형핵산체를 제조할 수 있다.
화합물번호 N G T 서열 LC/MS
화합물1 1-β-D-아라비노푸라노실시토신 2'-데옥시구아노신 티미딘 GGTGGTGGTTNTGGTGGTGG 6323.1
화합물2 1-β-D-아라비노푸라노실시토신 2'-데옥시구아노신 티미딘 GGTGGTGGTNNTGGTGGTGG 6324.1
화합물3 1-β-D-아라비노푸라노실시토신 2'-데옥시구아노신 티미딘 NGGTGGTGGTTGTGGTGGTGG 6652.3
화합물4 1-β-D-아라비노푸라노실시토신 2'-데옥시구아노신 티미딘 NNGGTGGTGGTTGTGGTGGTGG 6957.5
실시예 2: 신규한 올리고뉴클레오티드 변형핵산체 제제의 제조
각각의 올리고뉴클레오티드 변형핵산체를 10 mM Tris-HCl (pH 7.4) 용액에 희석하여 최종 농도가 100 μM이 되도록 만들었다. 희석된 용액을 94 ℃에서 5분간 방치한 후 얼음에 튜브를 방치하였다. 2M KCl 용액을 첨가하여 최종 농도가 50mM 의 KCl 용액이 되도록 한 다음 3 시간 동안 60 ℃에서 방치한 후 온도를 상온까지 천천히 낮추었다. 각각의 올리고뉴클레오티드를 10 mM Tris-HCl (pH 7.4) 용액에 희석하여 10 μM 농도가 되도록 만든 후 94 ℃에서 5분간 방치한 후 얼음에 튜브를 방치한 용액과 2M KCl 용액을 첨가하여 최종 농도가 50mM 의 KCl 용액이 되도록 한 다음 3 시간 동안 60 ℃에서 방치한 후 온도를 상온까지 천천히 낮춘 용액을 사용하였다.
실험예 1: 혈액암세포 및 내성발현 혈액암세포에서의 세포사멸율 측정
실험 전날 96 웰 플레이트에 ㎖당 104 ~ 105개의 혈액암세포로서 HL60, MV-4-11, CCRF-CEM, MOLT-4 및 MOLM-13 세포주, 약물저항성 혈액암세포로서 azacitidine (AZA-1)-resistant MOLM13, decitabine (Dec-5)-resistant MOLM13 및 cytarabine (AraC-1)-resistant MOLM13 세포주, 정상세포로서 WI38, CCD-18co 및 Fa2N4 가 현탁되어 있는 배양액 190 ㎕를 접종한 다음, 다음날 상기 실시예 2에서 제조한 올리고뉴클레오티드 변형핵산체 용액 10 ㎕를 첨가한 후 5일 동안 배양하였다.
접종 5일 후에 일반적인 MTT 방법으로 세포사멸을 측정하였다 [JBC 1999, 26369 참고].
본 발명의 신규 올리고뉴클레오티드 변형핵산체에 대한 세포사멸율 측정 결과, 표 2에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 신규 올리고뉴클레오티드 변형핵산체인 화합물1,2,3,4 의 IC50 는 다양한 혈액암세포에 대하여 탁월한 세포사멸 효과를 나타냄을 확인하였다 [표 2].
또한, 본 발명의 신규 올리고뉴클레오티드 변형핵산체는 다양한 약물저항성 혈액암세포에 대해서도 탁월한 세포사멸효과를 나타냄을 확인하였다 [표 3].
또한, 혈액암세포 또는 약물저항성 혈액암세포 대해서는 탁월한 세포사멸 효과를 나타낸 반면, 정상세포에는 거의 영향을 미치지 않음을 확인하였다 [표 4].
상기 세포사멸 효과를 확인한 결과를 하기 표 2 내지 4에 나타내었다. 또한 본 발명의 올리고뉴클레오티드 변형핵산체의 약물저항성 혈액암세포에 대한 세포사멸효과를 확인하여 도 1 및 2에 각각 나타내었다.
IC50 (μM)
HL60 CCRF-CEM MOLT-4 MOLM13
화합물1 0.03 0.01 0.021 0.09
화합물2 0.011 0.006 0.02 0.089
화합물3 1.15 0.08 0.036 0.195
화합물4 1.45 0.038 0.035 0.15
표 2는 혈액암세포에 대한 세포사멸효과이다.
IC50 (μM)
Cytarabine-
resistant
MOLM13		 Cytarabine-
resistant
HL-60		 Cytarabine-
resistant
MV-4-11		 Azacitidine-
resistant
MOLM13		 Decitabine-
resistant
MOLM13
화합물2 0.147 1.625 3.3 0.1347 0.1016
Cytarabine >10 >30 >20 3.5000 3.4930
표 3은 약물저항성 혈액암세포에 대한 세포사멸효과이다.
IC50 (μM)
WI38 CCD-18co Fa2N4
화합물2 >10 >5 >10
표 4는 정상세포에 대한 세포사멸 효과이다.
실험예 2: 사람 유래 혈액암세포(Luc-MOLM13) 항암 동물모델 효능
사람 유래 혈액암세포에 대한 동물에서의 효능을 확인하기 위하여, NOD-SCID 마우스로 혈액암을 유도하여 생체 내에서의 혈액암세포사멸 효과와 마우스의 생존율을 평가하였다.
먼저 혈액암의 유도는 구체적으로 다음과 같이 수행하였다. 실험군은 비히클군(8마리)과 약물군(9마리)으로 구성하였다.
8주령의 NOD-SCID 마우스에 Luc-MOML-13 세포(human MDS/AML cell line)을 마리당 107 세포를 정맥주사 하였다. 투여약물은 포타슘버퍼에 화합물2를 2mM 농도로 녹이고 94 oC에서 5분간 방치한 후 3시간 동안 서서히 온도를 실온으로 내린 후 사용하였다.
약물투여는 세포접종 후 이틀째부터 일주일에 5회씩 2주간 매일 정맥주사(150 mg/kg) 한 후, 생존율을 측정하였으며, 그 결과를 도 5에 나타내었다. 또한, 약물투여 후 10일째에 혈액암세포의 세포사멸효능을 생체 영상으로 촬영하여 비히클군과 비교하였으며, 그 결과를 도 3,4에 나타내었다.
도 3,4에서 확인할 수 있는 바와 같이, 비히클군에 비해서 약물투여군의 혈액암세포가 월등히 감소함을 확인하였다.
또한 도 5에서 확인할 수 있는 바와 같이, 비히클군에 비해서 약물투여군의 생존율이 월등히 우수함을 확인하였다.
실험예 3: 혈액암세포(C1498) 동종 항암 동물모델 효능
면역 체계가 있는 환경에서의 혈액암세포에 대한 동물 효능을 확인하기 위하여, C57BL/6 마우스에 마우스 유래 혈액암세포(C1498)를 이식하여 마우스의 생존율을 평가하였다.
먼저 혈액암의 유도는 구체적으로 다음과 같이 수행하였다. 실험군은 비히클군(8마리)과 약물군(9마리), 대조군 (8마리)로 구성하였다. 약물투여군은 화합물2를 300 mg/kg 주사하였고, 대조군은 cytarabine을 30 mg/kg (cytarabine으로서 2번화합물 300 mg/kg과 동등량)주사하였다.
8주령의 C57BL/6 마우스에 C1498 세포(mouse AML cell line)를 마리당 5X105 세포를 정맥주사 하였다. 투여약물은 포타슘 버퍼에 화합물2를 2 mM 농도로 녹이고 4 ℃ 에서 6 시간 이상 방치한 후 사용하였다.
약물투여는 세포접종 후 이틀째부터 하루에 2 회씩 2 주간 매일 피하주사한 후, 생존율을 측정하였으며, 그 결과를 도6에 나타내었다.
도 6에서 확인 할 수 있는 바와 같이, 비히클군에 비해서 약물투여군의 생존율이 월등히 우수함을 확인하였을 뿐만 아니라, 대조군에 비해서도 월등히 우수한 생존율을 확인하였다.
실험예 4: 혈액암세포(WEHI-3) 동종 항암 동물모델 효능
면역 체계가 있는 환경에서의 혈액암세포에 대한 동물 효능을 확인하기 위하여, Balb/c 마우스에 마우스 유래 혈액암세포(WEHI-3)를 이식하여 마우스의 생존율을 평가하였다.
먼저 혈액암의 유도는 구체적으로 다음과 같이 수행하였다. 실험군은 비히클군(7마리)과 약물군(7마리), 대조군 (7마리)로 구성하였다. 약물투여군은 화합물2를 300 mg/kg 주사하였고, 대조군은 cytarabine을 30 mg/kg (cytarabine으로서 2번화합물 300 mg/kg과 동등량)주사하였다.
8주령의 Balb/c 마우스에 WEHI-3 세포(mouse AML cell line)를 마리당 5X105 세포를 정맥주사 하였다. 투여약물은 포타슘버퍼에 화합물2를 2 mM 농도로 녹이고 4 ℃ 에서 6 시간 이상 방치한 후 사용하였다.
약물투여는 세포접종 후 이틀째부터 하루에 2 회씩 2 주간 매일 피하주사한 후, 생존율을 측정하였으며, 그 결과를 도 7에 나타내었다.
도 7에서 확인 할 수 있는 바와 같이, 비히클군에 비해서 약물투여군의 생존율이 월등히 우수함을 확인하였을 뿐만 아니라, 대조군에 비해서도 월등히 우수한 생존율을 확인하였다.
실험예 5: 재발성/난치성 환자 유래 골수 세포에서의 항암 효능
실제 환자 혈액암 세포에서의 항암 효능을 확인하기 위하여 서울아산병원의 IRB 심사 후 공여 받은 재발성/난치성 급성 골수성 백혈병 환자의 골수 단핵 세포를 이용하여 화합물2와 대조약물 (cytarabine, AS1411)에 대한 colony 형성능을 비교 하였다. 골수 단핵 세포를 colony 형성 배지에 분주한 뒤, 각각의 약물을 0.25 μM, 0.5 μM, 1μM을 처리하여 16 일간 배양한 후, colony 개수를 측정하였다.
도 8에서 확인할 수 있는 바와 같이, 재발성/난치성 혈액암 세포에서 동일 농도의 대조약물은 치료 효력이 미흡한 반면, 화합물2의 항암효과는 월등하게 우수한 것을 확인하였다.
실험예 6: 독성시험
본 발명의 유효성분에 대하여 독성실험을 다음과 같이 수행하였다.
화합물2를 포타슘 버퍼용액에 용해한 후 이를 마우스(군당 10마리)에 각각 1 g/㎏을 투여한 다음 7일간 관찰하였으나 사망하는 쥐는 없어 반수치사량 (LD50)은 최소 1 g/kg 이상으로 확인되었다.
또한, 혈액암을 유발하지 않은 일반 마우스에서 실험예 4와 동일한 조건으로 약물을 투여했을 때, 대조군에서 정상 백혈구가 급격히 감소한 반면, 화합물2번을 투여한 약물투여군에서는 백혈구 수치를 상대적으로 높게 유지함으로써 우수한 안전성을 나타내었다 (비히클군 평균값 6.29 범위 4.70-8.97, 약물투여군 평균값 4.07, 범위 3.36-4.77, 대조군 평균값 2.34, 범위 0.95-4.31). 실험예 3-5의 결과를 종합하여 보면, 화합물2가 혈액암세포를 특이적으로 사멸시켜 생존율을 높이고 정상 혈액 세포의 사멸을 최소화함으로써 혈액암 표적치료제로서의 우수한 특성을 나타냄을 확인하였다.
제조예 1: 주사액제의 제조
화합물2 10 mg을 함유하는 주사액제는 다음과 같은 방법으로 제조하였다.
화합물2 1 g, 염화나트륨 0.6 g 및 아스코르빈산 0.1 g을 증류수에 용해시켜서 100 ㎖을 만들었다. 이 용액을 병에 넣고 20 ℃에서 30 분간 가열하여 멸균시켰다.
상기 주사액제의 구성성분은 다음과 같다.
유효성분 1 g
염화나트륨 0.6 g
아스코르빈산 0.1 g
증류수 적량
<110> Aptabio Therapeutics Ltd. <120> Therapeutics of blood cancer <130> DP-2018-0544 <160> 4 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> modified oligonucleotide <400> 1 ggtggtggtt ntggtggtgg 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> modified oligonucleotide <400> 2 ggtggtggtn ntggtggtgg 20 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> modified oligonucleotide <400> 3 nggtggtggt tgtggtggtg g 21 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> modified oligonucleotide <400> 4 nnggtggtgg ttgtggtggt gg 22

Claims (7)

  1. G-쿼드로플렉스 구조를 형성하는 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드 변형핵산체에 있어서, 하기 서열의 화합물인 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드 변형핵산체:
    서열1)GGTGGTGGTTNTGGTGGTGG ;
    서열2)GGTGGTGGTNNTGGTGGTGG ;
    서열3)NGGTGGTGGTTGTGGTGGTGG ; 또는
    서열4)NNGGTGGTGGTTGTGGTGGTGG ;
    상기 서열에서, G는 구아노신 또는 구아노신 유도체, T는 티민 또는 티민 유도체, N은 변형핵산으로서 1-β아라비노푸라노실시토신(1-β-D-Arabinofuranosylcytosine)이다.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 구아노신 또는 구아노신 유도체는 2'-데옥시구아노신(2-deoxy-guanosine), 구아노신(guanosine), 2'-오-메틸-구아노신(2'-O-methyl-guanosine), 2'-플루오로-구아노신(2'-F-guanosine), LNA(Locked Nucleic Acid)-구아노신, D-데옥시구아노신 및 D-구아노신 중에서 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드 변형핵산체.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항의 올리고뉴클레오티드 변형핵산체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 혈액암 예방, 개선 또는 치료용 조성물.
  4. 제 3항에 있어서,
    상기 혈액암은 비호지킨 림프종, 호지킨 림프종, 다발성 골수종, 백혈병, 림프종, 골수이형성 증후군(MDS), 급성 림프모구성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 만성 림프구설 백혈병, 만성 골수성 백혈병 및 고립성 골수종 중 어느 하나 이상인 혈액암 예방, 개선 또는 치료용 조성물.
  5. 제 1 항 또는 제 2 항의 올리고뉴클레오티드 변형핵산체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 DNA 합성(DNA synthetase) 또는 DNA 메틸전이효소(DNA methyltransferase) 저해제인 시타라빈(Cytarabine), 데시타빈(Decitabine) 및 아자시티딘(Azacitidine) 중 어느 하나 이상에 대한 내성 혈액암의 예방, 개선 또는 치료용 조성물.
  6. 제 1 항 또는 제 2 항의 올리고뉴클레오티드 변형핵산체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하고, 상기 올리고뉴클레오티드 변형핵산체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염은 재발성 또는 난치성 급성 백혈병 환자의 골수 단핵 세포에서 높은 세포사멸 유도효과를 나타내는 것을 특징으로 하는 급성골수성 백혈병 예방, 개선 또는 치료용 조성물.
  7. 제 1 항 또는 제 2 항의 올리고뉴클레오티드 변형핵산체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하고, 상기 올리고뉴클레오티드 변형핵산체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염은 정상세포 보다 암세포에서 더 높은 세포사멸 유도효과를 나타내는 것을 특징으로 하는 혈액암의 개선 또는 치료용 조성물.
KR1020200034510A 2017-12-01 2020-03-20 혈액암 치료제 KR102097519B1 (ko)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR20170164409 2017-12-01
KR1020170164409 2017-12-01

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020180150255A Division KR20190065139A (ko) 2017-12-01 2018-11-29 혈액암 치료제

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20200033835A KR20200033835A (ko) 2020-03-30
KR102097519B1 true KR102097519B1 (ko) 2020-04-06

Family

ID=66846839

Family Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020180150255A KR20190065139A (ko) 2017-12-01 2018-11-29 혈액암 치료제
KR1020200034510A KR102097519B1 (ko) 2017-12-01 2020-03-20 혈액암 치료제
KR1020200034511A KR102258152B1 (ko) 2017-12-01 2020-03-20 혈액암 치료제

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020180150255A KR20190065139A (ko) 2017-12-01 2018-11-29 혈액암 치료제

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020200034511A KR102258152B1 (ko) 2017-12-01 2020-03-20 혈액암 치료제

Country Status (12)

Country Link
US (1) US20230192752A1 (ko)
EP (1) EP3610020A4 (ko)
JP (1) JP7027448B2 (ko)
KR (3) KR20190065139A (ko)
CN (1) CN110573620B (ko)
AU (1) AU2018375468B2 (ko)
BR (1) BR112019022459A2 (ko)
CA (1) CA3059363C (ko)
IL (1) IL270140B (ko)
MX (1) MX2019012318A (ko)
PH (1) PH12019502290A1 (ko)
RU (1) RU2751233C2 (ko)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20200033836A (ko) * 2017-12-01 2020-03-30 압타바이오 주식회사 혈액암 치료제

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11957701B2 (en) 2020-07-17 2024-04-16 Delta-Fly Pharma, Inc. Therapy and new therapeutic agent for blood cancer

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100998365B1 (ko) 2009-06-29 2010-12-06 압타바이오 주식회사 치료 효능이 있는 변형핵산 및 구아노신을 함유하는 올리고뉴클레오티드 변형체

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5567604A (en) 1993-04-23 1996-10-22 Aronex Pharmaceuticals, Inc. Anti-viral guanosine-rich oligonucleotides
BR9714438A (pt) 1996-12-27 2000-03-21 Inc Pharmaceuticals Inc Oligoaptâmeros ricos em g e métodos de modulação de uma resposta imune
JP2002541264A (ja) 1999-04-08 2002-12-03 ユーエイビー・リサーチ・ファウンデーション 冨ｇオリゴヌクレオチドの抗増殖活性およびヌクレオリンに結合するためのその使用方法
TW200637870A (en) * 2005-01-31 2006-11-01 Taiho Pharmaceutical Co Ltd Novel pyrimidine nucleoside compound and salt thereof
EP1940861A4 (en) 2005-10-06 2009-09-09 Univ Delaware G-rich polynucleotide for the treatment of chorea huntingtone
CA2947939A1 (en) * 2014-05-28 2015-12-03 Idenix Pharmaceuticals Llc Nucleoside derivatives for the treatment of cancer
KR20190065139A (ko) * 2017-12-01 2019-06-11 압타바이오 주식회사 혈액암 치료제

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100998365B1 (ko) 2009-06-29 2010-12-06 압타바이오 주식회사 치료 효능이 있는 변형핵산 및 구아노신을 함유하는 올리고뉴클레오티드 변형체

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20200033836A (ko) * 2017-12-01 2020-03-30 압타바이오 주식회사 혈액암 치료제
KR102258152B1 (ko) * 2017-12-01 2021-05-31 압타바이오 주식회사 혈액암 치료제

Also Published As

Publication number Publication date
MX2019012318A (es) 2020-01-27
IL270140B (en) 2021-12-01
KR20200033836A (ko) 2020-03-30
RU2019134045A3 (ko) 2021-04-26
JP2020517716A (ja) 2020-06-18
CN110573620A (zh) 2019-12-13
EP3610020A4 (en) 2021-01-27
AU2018375468B2 (en) 2021-04-08
CA3059363A1 (en) 2019-06-06
BR112019022459A2 (pt) 2020-06-16
KR102258152B1 (ko) 2021-05-31
JP7027448B2 (ja) 2022-03-01
RU2019134045A (ru) 2021-04-26
PH12019502290A1 (en) 2020-07-06
CN110573620B (zh) 2024-04-23
US20230192752A1 (en) 2023-06-22
RU2751233C2 (ru) 2021-07-12
CA3059363C (en) 2023-03-14
KR20190065139A (ko) 2019-06-11
AU2018375468A1 (en) 2019-11-07
KR20200033835A (ko) 2020-03-30
EP3610020A2 (en) 2020-02-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR100998365B1 (ko) 치료 효능이 있는 변형핵산 및 구아노신을 함유하는 올리고뉴클레오티드 변형체
KR102097519B1 (ko) 혈액암 치료제
WO2012175046A1 (zh) 水溶性铂配合物在制备防治肿瘤药物的用途
AU2020202332A1 (en) Glycolipids and pharmaceutical compositions thereof for use in therapy
JPWO2007046456A1 (ja) 新規水溶性プロドラッグを含有する、膵臓癌、卵巣癌または肝臓癌の予防または治療剤
EP2636677A1 (en) Cdk-inhibiting pyrrolopyrimidinone carboxamide derivative or pharmaceutically acceptable salt thereof, and pharmaceutical composition containing same as active ingredient for preventing or treating liver cell cancer
JP6431520B2 (ja) フッ化ピリミジン類縁体及びその使用方法
US20200054661A1 (en) Multitargeted nucleoside derivatives
US20190054103A1 (en) Method of treatment of tp53 wild-type tumors with 2&#39;,2&#39;-difluoro-5-aza-2&#39;-deoxycytidine or prodrugs thereof
WO2019108004A2 (en) Therapeutic agent for blood cancer
US8586561B2 (en) Anti-tumor agent comprising cytidine derivative and carboplatin
KR20230010349A (ko) 사이티딘 탈아미노효소 억제 활성을 갖는 신규한 테트라하이드로우리딘 유도체
WO2021172490A1 (ja) 組み合わせ医薬、およびピリミジン代謝拮抗剤の耐性化の予防または抑制薬
EP2854864B1 (en) Compositions comprising oligomers of gemcitabine for use in therapy

Legal Events

Date Code Title Description
A107 Divisional application of patent
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
G170 Re-publication after modification of scope of protection [patent]