WO2007023808A1 - 皮膚老化マーカーとその利用技術 - Google Patents

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WO2007023808A1
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Satoshi Miyata
Kaoru Miyazaki
Chie Yasuda
Akihiro Iwamatsu
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Fancl Corporation
Yokohama City University
Kihara Memorial Yokohama Foundation For The Advancement Of Life Sciences
Kirin Holdings Kabushiki Kaisha
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    • C12Q2600/158—Expression markers

Definitions

  • the present invention relates to a skin aging marker and a technique for using the same.
  • SA- ⁇ -Gal senescence—associated ⁇ -galactosidase
  • SA— ⁇ Gal is not expressed in terminally differentiated cells but only in senescent cells. It was revealed that it is specifically expressed and correlates very well with aging in human skin tissue (Non-patent Document 6).
  • Other skin aging markers such as Maspin, a serine protease inhibitor, and Cyatatin A, a cysteine protease mhi bitor have been reported (Non-patent Documents 7 and 8).
  • proteome As a method to search for biomarkers of skin aging, when a specific cell is placed under specific conditions, the total protein (proteome) present in the cell is separated by two-dimensional electrophoresis, and then analyzed by a mass spectrometer. Proteomics are useful. In fact, proteins from young and aged human skin tissues were also extracted, and proteins that were significantly changed by proteomics due to skin aging eIF-5A, Cyclophilin A, Proteasomal protein, PA28-, Tryptophanyl-tRNA synthetase ⁇ HSP60, Annexin
  • Non-patent Document 9 the proteomics carried out on the skin so far is an analysis using an extract of skin tissue or a cell extract, and the proteomics were performed focusing on cell culture supernatants containing a large amount of secreted proteins. There is no example.
  • verification of the identified skin aging marker in human skin is a less practical method such as immunostaining on skin tissue removed by Neuropsi, and it is safe and simple to collect the stratum corneum non-invasively.
  • a stratum corneum can be collected using a horny checker that can extract the protein from the stratum corneum, and it is highly practical to examine the expression of a skin aging marker.
  • Patent Document 2 Japanese Patent Laid-Open No. 2002-360544
  • Patent Document 3 Japanese Patent Laid-Open No. 2001-212087
  • Non-Patent Document 1 Clinic. Invest., 114, 1299-1307, 2004
  • Non-Patent Document 2 Mol. Cell. Biochem. 1999 Apr, 194 (1—2): 99—108
  • Non-Patent Document 3 J. Investig. Dermatol. Symp. Proc., 3 (2), 172-179, 1998
  • Non-Patent Document 4 Mech. Aging Dev., 123 (7), 801-810, 2002.
  • Non-Patent Document 5 Gerontology, 55 (5), 220-227, 2000
  • Non-patent document 6 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92, 9363-9367, 1995
  • Non-patent document 7 Cancer Research, 64, 2956-2961, 2004
  • Non-Patent Document 8 Dermatology, 188, 21— 24, 1994
  • Non-Patent Document 9 Mol. Cell. Proteomics, 2 (2), 70—84, 2003
  • An object of the present invention is to search for a substance that can be a skin aging marker.
  • the present inventors focused on cell culture supernatants containing a large amount of a small amount of secreted protein, and performed proteomics of proteins whose expression changes with aging of epidermal keratinocytes. Specifically, the culture supernatants of the second generation (young cells) to the fifth generation (aged cells) of human normal epidermal keratinocytes were prepared, and proteome analysis was performed by two-dimensional electrophoresis and mass spectrometry. Furthermore, as a feature of the present invention, identification was attempted using a technique ⁇ experimental medicine, 20 (16), 2367-2370, 2002 ⁇ that enables identification of ultra-trace protein (below 1 femto-mol).
  • a stratum corneum checker capable of non-invasively and safely collecting the stratum corneum from volunteers in their 20s and 60s.
  • the stratum corneum was collected using, and the protein was extracted from the stratum corneum, and the expression of the skin aging marker was examined by Western blotting.
  • Keratin 7, Keratin 15 and Kallikrein 7 correlate very well with skin elasticity and wrinkle volume ratio, which are known as indicators of skin aging.
  • the gist of the present invention is as follows.
  • a method for determining the degree of skin aging comprising measuring the expression of secreted protein and Z or intracellular protein in skin cells and Z or skin tissue, and the expression of Z or its gene.
  • the above-mentioned method wherein the secreted protein and Z or intracellular protein change in expression due to skin aging.
  • a kit for determining the degree of skin aging comprising a secreted protein whose expression is changed by skin aging and an antibody capable of specifically recognizing Z or intracellular protein.
  • a kit for determining the degree of skin aging comprising a secreted protein whose expression is changed by skin aging and a nucleic acid probe capable of specifically hybridizing with mRNA of Z or intracellular protein.
  • nucleic acid primers that can be specifically and hybridized with mRNAs of Z or intracellular proteins and cDNA synthesized by using the mRNA as a saddle type.
  • a method for identifying a substance effective in preventing skin aging comprising the following steps:
  • step (b) a step of culturing the skin cells and Z or skin tissue brought into contact with the test substance in step (a) for a predetermined time;
  • step (c) Step of measuring the expression of secreted protein and Z or intracellular protein and Z or gene expression thereof in the skin cells and / or skin tissue cultured in step (b), wherein the secreted protein and Z or intracellular A protein whose expression is altered by aging of the skin, and
  • step (d) Secreted protein and Z or intracellular protein expression and Z or its gene expression measured in step (c) are compared with secreted protein and Z or intracellular protein expression and Z in control skin cells and Z or skin tissue. Or the evaluation of the expression of secreted protein and Z or intracellular protein in skin cells and Z or skin tissue and the effect of the test substance on Z or its gene expression by comparison with its gene expression Including said method.
  • kits for determining the degree of skin aging and methods for identifying substances that are effective in preventing skin aging are also provided.
  • Fig. 1 shows changes in proliferation (a) and morphological changes (b) due to passage of epidermal keratinocytes.
  • FIG. 2 Stained images of cells stained with SA- ⁇ Gal for each passage number of epidermal keratinocytes (a) and the proportion of cells stained with SA- ⁇ Gal (b) are shown.
  • FIG. 3 shows the expression pattern obtained by two-dimensional electrophoretic analysis of the extracted protein at the passage numbers 2 and 5 of the epidermal keratinocytes.
  • FIG. 4 shows the results of analysis of Laminin 5 and Fibronectin expression changes associated with aging of epidermal keratinocytes by one-dimensional Western blotting.
  • FIG. 5 (a) (b)] shows the results of analysis of changes in the expression of protease and protease inhibitor accompanying senescence of epidermal keratinocytes by one-dimensional Western blotting.
  • FIG. 6 shows the results of analysis of heat shock protein expression change by aging of epidermal keratinocytes by one-dimensional Western blotting.
  • FIG. 8 shows the results of analysis of changes in the expression of Galectin and IGFBP-3 accompanying senescence of epidermal keratinocytes by one-dimensional Western blotting.
  • FIG. 9 shows the results of analysis of changes in Keratin expression associated with aging of epidermal keratinocytes by one-dimensional Western blotting.
  • FIG. 10 shows the correlation between the expression of Keratin 15 extracted from the corner of the corner of the eye corner and age.
  • FIG. 11 shows the correlation between the expression of Keratin 10 extracted from the corner of the corner of the eye corner and age.
  • FIG. 12 shows the correlation between age and eye corner elasticity.
  • FIG. 14 shows the correlation between the expression of Kemtin 7 extracted from the corner of the corner of the corner of the eye and elasticity of the corner of the corner of the eye.
  • FIG. 15 shows the correlation between expression of Kemtin 15 extracted from the corner of the corner of the corner of the eye and elasticity of the corner of the corner of the eye.
  • FIG. 16 shows the correlation between expression of Kemtin 7 extracted from the corner of the corner of the corner of the eye and the volume ratio of the corner of the corner of the corner of the eye.
  • FIG. 18 shows the correlation between expression of Kallikrein 7 extracted from the corner of the corner of the corner of the eye and elasticity of the corner of the corner of the eye.
  • FIG. 19 The best mode for carrying out the invention showing the correlation between the expression of Kallikrein 7 and the volume ratio of the corner of the corner of the eye
  • the present invention provides a method for determining the degree of skin aging, comprising measuring the expression of secreted proteins and Z or intracellular proteins in skin cells and Z or skin tissue.
  • Secreted proteins and Z or intracellular proteins change in expression due to skin aging.
  • Examples of “expression changes” include changes in the presence or absence of expression of protein and Z or its gene, changes in the expression level, and changes in the ratio of the cleaved and non-cleaved forms of the expressed protein by the protease. Etc.
  • Secreted protein and Z or intracellular protein for determining skin aging are Kallikrein 7, P AI-1, uPA, Matriptase, GRP 94, HSP 70, HSP 90, Galectin-1, Galectin-3, Galectin — 7, IGFBP— 3, Enolase— 1, Annexin II, Ezrin, Radixin, Moesin, Gelsolin, Keratin 7, Keratin 10, Keratin 13, Keratin 14, Ke ratin 15, Keratin 16, Keratin 18, Keratin 19, Keratin 20 * 50 ⁇ j8 2- Choose from the group that also has microglobulin power! /. Select one protein May be of multiple types.
  • Kallikrein 7 is a secreted protein with a molecular mass of 27,525 Da. It cuts the joints between cells in the stratum corneum and has the function of promoting cell desquamation of the skin surface force. In tissues, it is expressed abundantly in the skin, while expression is observed in the brain, mammary gland, spinal cord and kidney. Remnant S column information (Stratum corneum chymotrytic enzyme, J. ⁇ . Hem. 269: 19420-19426, 1994, L33404). Amino acid sequence information (Kallikrein 7 prec ursor, J. Biol. Chem. 269: 19420-19426, 1994, P49862).
  • PAI-l is a secreted protein with a molecular mass of 45,060 Da.
  • PAI-1 is an acid-stable glycoprotein and belongs to the serpin family. It is found in plasma, platelets, endothelial cells, hepatocytes, fibrosarcoma cells. Gene sequence information (Plasminogen activator inhibitor—1, J. Clin. Invest. 78: 1673— 1680, 1986, M16006). Amino acid sequence information (Plasminogen activator inhibitor—1, FEBS Lett. 210: 11—16, 1987, P05121).
  • uPA is a secreted protein having a molecular mass of 48,525 Da.
  • uPA is a type of serine protease that converts plasminogen to plasmin. It is secreted extracellularly as a precursor protein (55 kDa) and becomes a truncated form (35 kDa) and exhibits protease activity. Many expressions are seen in breast cancer.
  • Gene sequence information (Urokinase—type plasminogen activator, Nucleic Acids Res. 13: 2759-2771, 1985, BC013575). Amino acid sequence information (Uronase—type plasminogen activator, Hoppe—Seyler's Z. Physiol. Chem. 363: 1043—1058, 1982, P00749).
  • GRP94 is a secreted protein with a molecular mass of 92, 469 Da.
  • Gene distribution IJ information tumor rejection antigen (gp96) 1, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 87: 5658-5662, 1990, BC066656) Amino acid sequence information (Endoplasmin, Nat. Biotechnol. 21: 566-569, 2003, P14625;>.
  • HSP70 is an intracellular protein having a molecular mass of 70, 052 Da. It normally functions as a molecular chaperone in cells and is involved in protein folding, transport, assembly and degradation. The function of HSP70 in mitochondria and ER is to transfer proteins normally. In cooperation with HSP90, it is also involved in intracellular signal transduction. Gene base sequence information (heat shock 70 kDa protein 1A, Immunogenetics 32: 24 2- 251, 1990, BC002453). Amino acid sequence information (Heat shock 70 kDa prote in 1, P08107).
  • HSP90 is an intracellular protein having a molecular mass of 85,453 Da. Usually, it plays an important role in the signal transduction system by binding and dissociating to complexes such as steroid hormone receptors. When cells are exposed to high temperatures, HSP90 acts as a molecular chaperone that changes structure and prevents irreversible damage to proteins.
  • Gene base sequence information (Heat shoe k protein 90, Nucleic Acids Res. 17: 7108—710, 1989, X15183). Amino acid sequence information (Heat shock protein 90, J. Biol. Chem. 264: 2431-2437, 1989, P07900).
  • Galectin-3 is an intracellular protein having a molecular mass of 35,678 Da.
  • Gene sequence information (Galectin-3, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 87: 7324-7328, 1 990, AB006780). Amino acid sequence information (Galectin—3, P17931).
  • Galectin-7 is an intracellular protein with a molecular mass of 14,944 Da. In general, cell growth is controlled between cells and between cells and extracellular matrix. Apoptosis-related protein controls JNK activity and cytochrome C release. It is also secreted into the cytoplasm, nucleus, and extracellular space. It is a member of the galectin subfamily that was first clawed in human epidermis, and the research ability of cultured epidermal keratinocytes is also unaffected by the degree of stratum corneum, and is expressed in all epidermal cells. Gene sequence information (Galectin—7, Dev. Biol. 168: 259-271, 1995, L07769), amino acid sequence information (Galectin—7, J. Biol. Chem. 270: 5823—5829, 1995, P47929).
  • IGFBP-3 is a secreted protein with a molecular mass of 31,660 Da. In general, binding to IGF increases the time to half-life. In cell culture, it inhibits or promotes cell growth. It binds to the IGF receptor on the cell surface. IGFBP-3 has a higher binding strength to IG F-2 than IGF-1. Expression is observed in tissues and almost all tissues. Remnants 1zs il ⁇ Uffr report (Insulin—like growth factor binding protein—3, J. Biol. Chem. 265, 12642—12649, 1990, M35878). Amino acid sequence information (Insulin—like growth factor binding protein—3, J. Biol. Chem. 265, 1 4892-14898, 1990, P17936).
  • Enolase-1 is an intracellular protein having a molecular mass of 47,038 Da. 2—phospho
  • Annexin II is an intracellular protein with a molecular mass of 38,473 Da. Some have been reported to be secreted extracellularly. A calcium-regulated membrane-bound protein that binds two calcium ions to this protein. It is localized near the cell membrane. Of the two annexin repeats, one binds calcium and one binds phospholipids. This protein crosslinks with actin and cytoskeletal proteins bound to phospholipids in the cell membrane, and activates plasminogen via tPA. Gene base sequence information (Annexin A2, Gene 95: 243-251, 1990, BC015834). Amino acid sequence information (Annexin A2, J. Biol. Chem. 266: 5169-5176, 1991, P07355).
  • Ezrin is an intracellular protein with a molecular mass of 69,268 Da.
  • the following Radixin and Moe sin are homologous molecules. Mainly functions to connect cytoskeletal proteins to cell membranes. It is located inside the filamentous process called microvilli in the cell membrane. It constitutes the microvil li of intestinal epithelial cells. Phosphorylated by tyrosine kinase. Gene sequence information (Ezrin, J. Biol. Chem. 264: 16727-16732, 1989, X51521). Amino acid sequence information (Ezrin, Biochem. Biophys. Res. Commun. 224: 666— 674, 1996, P15311
  • Radixin is an intracellular protein having a molecular mass of 68,564 Da. It mainly functions to connect cytoskeletal proteins and cell membranes. Gene sequence information (Radixin, Genomics 16: 199-206, 1993, L02320). Amino acid sequence information (Radixin, P35241).
  • Moesin is an intracellular protein with a molecular mass of 67, 689 Da. It mainly functions to connect cytoskeletal proteins and cell membranes. There is a report that the expression decreases in epidermal keratinocytes with abnormal separation. Gene sequence information (Moesin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 88: 8297-8301, 1991, M69066). Amino acid sequence information (Moesin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 88: 8297-8301, 1991, P26038).
  • Gelsolin is a secreted protein with a molecular mass of 85, 698 Da. There are two types, one that is secreted outside the cell and the other that works inside the cell. What is secreted extracellularly binds to fibronectin. Gelsolin has three actin polymerization regulation functions: promotion of actin fiber elongation by formation of polymer nuclei, cleavage of the actin fiber, and protection of its ends. Through these dual functions, it controls both aspects of polymerization and depolymerization, and plays an important role in cell motility. Many expressions are seen in platelets and fibroblasts. Genetic information (Gelsolin, Nat. 323, 455-458, 1986, X04412). Amino acid sequence information (Gelsolin, Nat. Biotechnol. 21. 566-569, 2003, P06396).
  • Keratin 7 is a cytoskeletal protein having a molecular mass of 51,287 Da and a component of an intermediate filament. Expression is seen in a variety of epithelial cells including glandular cells. It is also expressed in the transitional epithelium, bile duct, lung, and mammary epithelium of the ureter. Some are also used as tumor markers. Gene sequence information (Keratin 7, J. Cell Biol. 107: 1337-1350, 1988, AF50988 7). Amino acid sequence information (Keratin, type II cytoskeletal 7, P08729).
  • Keratin 13 is a cytoskeletal protein with a molecular mass of 49,586 Da. It is a component of intermediate filaments that make heterotetramers with keratin 4. Expression is seen in the tongue, esophagus, epithelium, urothelium, etc. Gene sequence information (Keratin 13, Gene 215: 269-279, 199 8, X52426). Amino acid sequence information (Keratin, type I cytoskeletal 13, P13646
  • Keratin 14 is a cytoskeletal protein having a molecular mass of 51,490 Da. It is a component of intermediate filaments that form heterotetramers with keratin 5. It is present in the epithelium, especially near the basal layer, where it is often expressed. It is also used as an undivided marker of epithelial system. Gene sequence information (Keratin 14, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 82: 1609 -1613, 1985, BC002690). Amino acid sequence information (Keratin, type I cytoskeleta 1 14, P02533).
  • Keratin 15 is a cytoskeletal protein with a molecular mass of 49, 167 Da. It is a component of intermediate filaments. It is mainly located in the epithelial basal layer. Gene sequence information (Keratin 1 5, J. Cell Biol. 106: 1249—1261, 1988, X07696). Amino acid sequence information (Ker atin, type I cytoskeletal 15, P19012).
  • Keratin 16 is a cytoskeletal protein with a molecular mass of 51,136 Da. Keratin 6 is a component of intermediate filaments that make heterotetramers. Hair follicle, nail, oral epithelial layer
  • Keratin 19 is a cytoskeletal protein with a molecular mass of 44, 106 Da. The smallest molecular weight among keratins. It is a component of the intermediate filament. Usually expressed in most single-layer epithelium and non-keratin type stratified epithelium. It is also expressed in all adenocarcinomas. Gene sequence information (Keratin 19, J. Invest. Dermatol. 92: 707-716, 1989, Y00503). Amino acid coordination IJ information (Keratin, type I cytoskeletal 19, Electrophoresis 13: 9 60-969, 1992, P08727).
  • ⁇ 2-microglobulin is a secreted protein with a molecular mass of 13,175 Da. L chain of HLA class I antigen (histocompatibility antigen). It is present on many cell surfaces. It is used as an index for diagnosis of renal dysfunction and various malignant tumors. Some cuts are seen, but their significance is not so clear.
  • Gene sequence information (Beta-2-mic roglobulin, J. Immunol. 139: 3132-3138, 1987, AB021288). Amino acid sequence information (Beta-2—microglobulin, Biochemistry 12: 4811—4822 (1973), P61769).
  • the protein may be a precursor protein or a mature protein.
  • the protein may be a truncated or non-cleavable type.
  • Examples of the precursor protein include proprotein and preproprotein.
  • Some proproteins and pre-proteins have signal peptides that are characteristic sequences of secreted proteins.
  • the expression of secreted protein and Z or intracellular protein in skin cells and Z or skin tissue may be measured, or the gene expression thereof may be measured.
  • it can be measured by Northern plot method, PCR method, Western plot method, immunohistochemical analysis method and the like.
  • measurement may be performed using a cDNA microarray, ELISA method, antibody array, or the like.
  • the expression of secreted protein and Z or intracellular protein in skin cells and Z or skin tissue and the presence or absence of Z or gene expression thereof may be detected, and the expression level may be measured. Also good.
  • the presence or absence of the expression of protein and Z or its mRNA can be confirmed by the presence or absence of the appearance of spots or bands at predetermined positions.
  • the expression level of protein and Z or its mRNA can be measured by staining intensity of spots and bands. Alternatively, protein and Z or mRNA thereof may be quantified.
  • DNA array probe fixed on substrate
  • protein chip antibody Use detection methods such as (NATURE REVIEWS, DRUG DISCOVERY, VOLUME 1, SEPTEMBER 20 02, 683—695)
  • Luminex NATURE REVIEWS, DRUG DISCOVER Y, VOLUME 1, JUNE 2002, 447—456), etc. Is preferred.
  • a skin biopsy sample, or cultured skin cells, cultured skin tissue or the like that can also obtain the force can be used.
  • Skin cells include epidermal keratinocytes, dermal fibroblasts, Langerno cells, cells, melanocytes Cell, mast cell, endothelial cell, sebum cell, hair papilla cell, hair matrix cell and the like. Skin cells are supplied from the Human Science Research Resource Bank, RIKEN Cell Bank, and the American Type Culture Collection overseas. You can also purchase Clontech, Kurabo and PromoCell.
  • skin force can be collected by a known method (new cell culture experiment method for molecular biology research, p57-71, Yodosha, 1999).
  • Examples of the skin tissue include the stratum corneum, epidermis and dermis of the skin.
  • Skin tissue can be purchased from Biochain and Super Bio Chips. Further, it can force s harvesting skin force al by a known method (Acta. Derm. Venereol., 85, 389- 393, 2005). Skin models are commercially available from Kurabo Industries Co., Ltd., and TO Sakai Co., Ltd., and these can be used. It can also be prepared by a known method [[. Invest. Dermatol., 104 (1), 107-112,199 5 ⁇ .
  • Skin aging refers to the degree of skin aging such as wrinkles and sagging caused by aging. It is clear that wrinkles and sagging progress with aging. In addition, wrinkles, sagging, dullness, and the degree of blotch progression increase as a result of exposure to ultraviolet rays as a result of aging. Wrinkles and sagging can be measured by a known method (Advances and future prospects of evaluation techniques for cosmetics, Cosmetics Association of Japan, Yakuji Nippo, 154- 158, 169-175, 179- 182, 187-190, 2001). In addition, when wrinkles and sagging are formed with aging, it is known that the proliferation ability of skin cells such as epidermal cells and skin fibroblasts decreases in the skin.
  • the degree of skin aging can be determined using the decrease in the proliferation ability of skin cells as an index.
  • SA— ⁇ -Gal senescence-associated ⁇ -galactosidase
  • the degree of skin aging can be determined according to the following criteria.
  • the present invention also provides a kit for determining the degree of skin aging.
  • the kit of the present invention includes a secreted protein whose expression is changed by skin aging and an antibody capable of specifically recognizing Z or intracellular protein.
  • Secreted proteins and / or intracellular proteins are Kallikrein 7, PAI-1, uPA, Matriptase, GRP 94, HSP 70, HSP 90, Galectin-1, Galectin-3, Galectin-7, IGFBP-3, Enolase-1 , Annexin II, Ezrin, Radixin, Moesin, Gelsolin, Keratin 7, Keratin 10, Keratin 13, Keratin 14, Keratin 15, Keratin 16, Keratin 18, Keratin 19, Keratin 20, and j8 2—microglobulin It is preferable.
  • Secreted proteins and Z or intracellular proteins are Kallikrein 7, PAI — 1, uPA, Matriptase, GRP 94, HSP 70, HSP 90, Galectin—1, Galectin—3, Galectin—7, IGFBP—3, Enolase— 1 , Annexin II, Ezrin, Radixin, Moesin, Gelsolin, Keratin 7, Keratin 10, Keratin 13, Keratin 14, Ker atin 15, Keratin 16, Keratin 18, Keratin 19, Keratin 20, and j8 2—m icroglobulin force It is preferable to do.
  • the kit further includes a tape for collecting skin tissue, reagents for extracting RNA from the skin tissue on the tape, reagents for analyzing RNA by the Northern plot method, instruction manuals, etc. It is okay.
  • the instruction manual should include criteria for determining the degree of skin aging.
  • the kit of the present invention comprises a secretory protein whose expression is changed by skin aging and a nucleic acid primer capable of specifically hybridizing with mRNA of Z or intracellular protein and said mRNA. It also includes a pair of nucleic acid primers that can also specifically hybridize with cDNA synthesized as a template.
  • the kit also includes a tape for collecting skin tissue, reagents for extracting RNA from the skin tissue on the tape, reagents for analyzing RNA by RT-PCR, and instruction manuals. It should be included.
  • the instruction manual should include criteria for judging the degree of skin aging.
  • the present invention also provides a method for identifying a substance effective in preventing skin aging. This method involves the following steps:
  • step (a) contacting the test substance with skin cells and Z or skin tissue; (b) a step of culturing the skin cells and Z or skin tissue brought into contact with the test substance in step (a) for a predetermined time;
  • step (c) Step of measuring the expression of secreted protein and Z or intracellular protein in the skin cells and / or skin tissue cultured in step (b), wherein the secreted protein and Z or intracellular protein are caused by skin aging. The process wherein expression is altered, and
  • step (d) By comparing the expression of secreted protein and Z or intracellular protein measured in step (c) with the expression of secreted protein and Z or intracellular protein in control skin cells and Z or skin tissue, Evaluating the effect of the test substance on the expression of secreted proteins and Z or intracellular proteins in cells and Z or skin tissue.
  • the test substance is V, which may be a protein, peptide, vitamin, hormone, polysaccharide, oligosaccharide, monosaccharide, low molecular weight compound, nucleic acid (DNA, RNA, oligonucleotide, mononucleotide Etc.), lipids, natural compounds other than those mentioned above, synthetic compounds, and mixtures thereof.
  • V may be a protein, peptide, vitamin, hormone, polysaccharide, oligosaccharide, monosaccharide, low molecular weight compound, nucleic acid (DNA, RNA, oligonucleotide, mononucleotide Etc.), lipids, natural compounds other than those mentioned above, synthetic compounds, and mixtures thereof.
  • the contact between the test substance and the skin cells and Z or skin tissue may be performed by any method, for example, a method of adding the test substance to the culture solution of skin cells and Z or skin tissue, or applying or fixing the test substance. And a method of culturing skin cells and Z or skin tissue on the cultured container or culture sheet.
  • a test substance may be applied directly to the skin using a living body such as a human or a non-human mammal (eg, mouse, rat, guinea pig, rabbit, pig, etc.), or a test substance may be orally administered. ⁇ .
  • the skin cells and Z or skin tissue to be compared may be the skin cells and Z or skin tissue before contact with the test substance, and the test substance is not contacted! Treated skin cells and Z or skin tissue.
  • Secreted proteins and Z or intracellular proteins are Kallikrein 7, PAI-1, uPA, Matriptase, GRP 94, HSP 70, HSP 90, Galectin-1, Galectin-3, Galectin-7, IGFBP-3, Enolase—1, Annexin II, Ezrin, Radixin, Moesin, Gelsolin, Keratin 7, Keratin 10, Keratin 13, Keratin 14, Keratin 15, Keratin 16, Keratin 18, Keratin 19, Keratin 20 and j8 2—from microglobulin Preferred to be selected from the group consisting of:
  • Ezrin, Radixin, Moesin, Gelsolin, Keratin 10, Keratin 13, Keratin 14, Keratin 15, Keratin 16, Keratin 18, Keratin 19 and Keratin 2 o expression levels are increased.
  • the expression level of these marker proteins is reduced compared to the control, and the test substance strength is evaluated to be effective in reducing the expression of these marker proteins.
  • the test substance can be identified as a substance effective in preventing skin aging.
  • the expression level of Kallikrein 7, PAI-1, uPA, Matriptase, and Keratin 7 is decreased with the aging of epidermal keratinocytes.
  • the expression level of these marker proteins is increased compared to the control, and the test substance has the effect of increasing the expression of these marker proteins. If it can be evaluated, the test substance can be identified as a substance effective in preventing skin aging.
  • ⁇ 2 -microglobulin is associated with the aging of epidermal keratinocytes.
  • the ratio of non-cleavable to ⁇ 2-microglobulin cleaved compared to the control in skin cells and Z or skin tissue contacted with the test substance increased. If the test substance can be evaluated to be effective in reducing the ratio of the non-cleavable to the cleaved form of j8 2 -microglobulin, this test substance is a substance that is effective in preventing skin aging. Can be identified.
  • Normal epidermal keratinocytes were added to serum-free basal medium (KB M, Cambrex Corporation) with factors (0. lng / ml EGF, 0.03 mg / ml bovine pituitary meaium, 5 ⁇ / ml msulin, Using medium KGM (+) supplemented with 0.5 ⁇ / ml hydrocortisone, GA—1000), 37 ° C, 5% CO
  • the cells were cultured in a batch. For recovery of culture supernatant (CM; Conditioned medium) and cell extract (CL; Cell lysates), seed cells in 5 x 10 5 cells / 150 mm dish, change medium every 2 days, and until saturation Cultured. For subculture, the cells were seeded in 1 ⁇ 10 5 Z60mm dishes, the medium was changed every two days, and the cells were subcultured when they reached 80% saturation. NHE K can be subcultured to approximately the fifth generation, and was used as an aged cell in the fifth generation in this experiment.
  • CM Culture supernatant
  • CL Cell lysates
  • the dish saturated with NHEK was washed twice with KBM, replaced with KBM and cultured for 1 day to completely remove additional factors.
  • the CM was recovered 2 days after the replacement with KBM.
  • the collected CM was centrifuged at 130 ⁇ g for 10 minutes to remove floating cells, and then centrifuged at 10,000 ⁇ g for 30 minutes, and the supernatant was collected.
  • Ammonium sulfate (Wako Pure Chemical)
  • DC protein assay kit (For Bio—Rad Loooratories Inc.) The protein was quantified by Bradford method and used as a sample for Western blotting.
  • the prepared CM was lyophilized and dried.
  • Sample preparation solution for two-dimensional electrophoresis (6.5M urea (lCN Biomedicals, Inc.), 1.5M thiourea (Sigma Corporation), 0.15% SDS (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), 0. 85% Triton X—100 (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), 0.4% CHAPS (Dojindo Loboratories), 2.5 mM tributyl phosphine (Wako Pure Chemical Industries, Ltd. ) ⁇ And protein was quantified by the dot 'plot method.
  • the dish after the CM was collected was washed 3 times with PBS (—) and then frozen at ⁇ 30 ° C. to destroy the cell membrane. Thereafter, the cells were collected using a cell scraper (Sumitomo Bakelite Co., Ltd.) and then sonicated for 30 seconds. After adding 1% Triton X-100, it was left at 4 ° C for 30 minutes. Thereafter, the mixture was centrifuged at 15,000 ⁇ g for 30 minutes to remove insoluble matters, and the supernatant was used as a sample. Protein was quantified by the dot'plot method and used as a sample for Western blotting.
  • the first dimension is 20 ° C, 500V—2 hours, 700V—1 hour, 1000V—1 hour, 1500V—1 hour, 2000V—1 hour, 300 0V—1 hour, Isoelectric focusing was performed with a 3500V-10 hour program.
  • the gel was equilibrated with SDS equilibration buffer 0.8M urea, 0.0M thiourea, 0.5% dithio thereitol (DTT, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), 25% glycero l (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). , 0.0025% BPB (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) ⁇ and equilibrated at room temperature for 1 hour.
  • the second dimension is Tris—Tricine buffer (cathode buffer: 0.05M Tris, 0.05M Tricine (Bio-Rad Loboratories Inc.), 0.05% SDS, anode buffer: 1M Tris—HCl (pH8.8) ) ⁇ was used for SDS-PAGE on a 7.5% acrylamide gel of 18 cm ⁇ 18 cm.
  • Transfer buffer is anode 1st solution: 0.3M Tris—HCl (pH 10.4), 20% methanol (Wako Pure Chemical Indus tries, Ltd.), anode 2 solution: 25mM Tris—HCl (pH 10.4), 20% Methanol, negative solution: 25 mM Tris—HCl (pH 10.4), 20% methanol, 40 mM 6-aminohexanoic acid (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was used.
  • Post-transcription [TTBS buffer ⁇ 20 mM Tris—HCl (pH 7.5) (Bio-Rad Loboratories Inc. ), 500 mM NaCKWako Pure Chemical Industries, Ltd.), 0.
  • the protease digested solution was diluted 7-fold with distilled water to make the acetonitrile concentration 10%. 2% with 50% acetonitrile Z0. 1% trifluoro-acetic acid (TF A, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) several times to activate the filler part of ZipTipcl8 pipette tips (Millipore Corporation) as pretreatment Acetonitrile / Aspiration was repeated several times with 0.1% TFA. Next, activate the ZipTipcl8 pipette tip. Then, the protease digestion solution was sucked and discharged several times to adsorb the fragmented peptide to the packed portion. Further, 2% acetonitrile ZO. 1% TFA was sucked and discharged several times to remove salts.
  • TF A Trifluoro-acetic acid
  • SDS-PAGE was performed by Laemmli's Tris-Glycin system using a sample for Western blotting. After SDS-PAGE, after transferring the proteins in the gel to a PVDF membrane (Millipore Corporation) with a constant current of lcm 2 per 0. 8 mA, 5% skim milk ZPBS (-) immersed in, 4 ° C, and blocked with overnight. The PVDF membrane was washed three times with 0.1% Tween20 / PBS (—), then immersed in the primary antibody solution and shaken at room temperature for 1 hour.
  • the types and dilution ratios of primary antibodies used are as follows: rabbit anti-maspin polyclonal anti-DO ay (3 ⁇ 4anta and ruz Biotechnology) (1000-fold dilution), mouse anti-cystatin A monoclonal antibody (Sigma ) (1000-fold dilution), rabbit anti— kallikrein 7 polyclonal antibody (Santa Cruz Biotechnology) (1000-fold dilution), sheep anti— PAI— 1 polyclonal antibody (Biopool) (1000-fold dilution), mouse atni— PAI— 2 monoclonal antibody (American Diagnostics) "000-fold dilution), rabbit anti— uPA polyclonal antibody (Santa Cruz Biotec hnology) (1000-fold dilution), rabbit anti-matriptase polyclonal antibody (Ca Ibiochem) (1000-fold dilution), rat anti— GRP94 monoclonal antibody (Stress geen) (1000 times dil
  • Keratin 8 monoclonal antibody (Chemicon) (1000 times dilution), mouse anti
  • secondary antibodies such as Horseradish peroxidase labeled ami-mouse IgG (Amersham Bioscience buffer diluted 5000 times), Horseradish peroxidase labeled anti-rabbit Ig (Amersham Bioscience) (5000 times) Dilution), Horseradish peroxidase labeled anti-rat IgG (Amersham Bioscience) (5000-fold dilution) or Horseradish peroxidase labeled anti-goat IgG (Santa Cruz) (5000-fold dilution) was used.
  • 7 chemiluminescence (ECL) kits (Amersham Bioscience; for detection and detection).
  • the expression level of the protein detected by Western blotting was numerically calculated by NIH image, and the value obtained by dividing the expression level of the fifth generation protein by the expression level of the second generation protein was calculated.
  • the calculated value is 2.0 or more, it is judged that the expression level has significantly increased with the aging of the epidermal keratinocytes, and when it is less than 0.5, the expression level is significant with the aging of the epidermal keratinocytes. Judged to have decreased.
  • the calculated value was 0.5 or more and less than 2.0, it was determined that there was no change in expression accompanying senescence of epidermal keratinocytes.
  • cell senescence markers were searched using the second-generation cells as young cells and the fifth-generation cells as senescent cells.
  • CMs Second- to fifth-generation CMs were prepared, and proteins whose expression was changed by two-dimensional electrophoresis were analyzed (Figure 3). Comparison of the cell culture supernatant (CM) spots of young (2nd generation) and aged cells (5th generation) revealed that 19 proteins (Table 1) were found to decrease in expression due to cell aging. Forty-nine proteins whose expression increased with aging were identified (Table 2). The identified proteins include known skin aging markers such as Maspin, Cystatin A and HSP 27, and the analysis by two-dimensional electrophoresis performed in this study identifies proteins that change with skin aging. It was considered to be an appropriate method.
  • the identified proteins include known skin aging markers such as Maspin, Cystatin A and HSP 27, and the analysis by two-dimensional
  • a new skin aging marker protein was identified in addition to the known skin aging marker protein because it used a technology that enables identification of ultra-trace protein (below 1 femto-mol).
  • the major secreted proteins whose expression decreased with the aging of epidermal keratinocytes were identified as j8-2 microglobulin, PAI-1 and Kallikrein 7.
  • Moesin, Keratin 1 and Keratin 9 were identified as secreted proteins whose expression increased with aging of epidermal keratinocytes.
  • Rho GDP d i ssoc iat ion inhibitor Rho-GDI
  • Table 2 shows the proteins whose expression increased with the aging of epidermal keratinocytes by two-dimensional electrophoresis analysis.
  • Fatty aci d bi nding protein 5 (FAEP 5)
  • H3P 70 S.e Heat shock leakage a protein
  • HSP 70, HSP 90, and G RP 94 (only GRP 94 has a signal peptide), one of the heat shock proteins that are intracellular proteins, are frequently secreted into CM with aging.
  • the level of expression in CL was unchanged (Fig. 6).
  • Enolase-1 an glycolytic enzyme in the cell
  • Annexin II that binds to phospholipids in the cell membrane
  • EzrinZMoesinZRadixin a cytoskeletal protein
  • Keratin 3 13 types of Keratin, a cytoskeletal protein (Keratin 3, 5, 7, 8, 10, 1 3, 14, 15, 16, 17, 18, 19 and 20).
  • Keratin 10 13 types of Keratin 10, 13, 14, 15, 16, 18, 19, and 20 increased significantly with the aging of epidermal keratinocytes (Fig. 9).
  • the expression of keratin 7 in cells was significantly decreased with the aging of epidermal keratinocytes (Fig. 9). Keratin 3, 5, 8, and 17 did not change expression. Keratins were not detected in CM.
  • Table 3 summarizes the proteins whose expression changes with the aging of epidermal keratinocytes by one-dimensional Western blotting analysis.
  • Table 3 shows the proteins whose expression was changed with the aging of epidermal keratinocytes by one-dimensional Western blotting analysis.
  • the stratum corneum was peeled from the corner of the eye using the stratum corneum checker (Asahibiomed Co., Ltd.), and the protein was extracted using the protein extraction solution. Specifically, a stratum corneum was applied to the subject's eyes and rubbed lightly with the fingertips. This was repeated three times. After that, 50 1 protein extraction solutions OmM Tris-HCl (pH 7.5), 120 mM NaCl, 0.4% Igepal CA-630 (Sigma-Aidrich Co.) ) ⁇ , The stratum corneum was acclimated to the protein extraction solution using a cell scraper, and the solution was collected in a 1.5 ml plastic tube (Eppendorf AG).
  • Centrifugation was performed at 10,000 Xg for 15 minutes to precipitate insoluble matter, and the supernatant was collected in a new 1.5 ml plastic tube. The amount of protein in the collected sample was measured using a DC assay kit.
  • Detection was carried out by Western blotting using the Keratin 7, Keratinl5 and Kallikrein 7 antibodies described in Example 1, using 10 / z g of protein extracted from the corner of the corner of the corner of the eye. The intensity of the detected band was measured with a densitometer (Molecular Dinamics Co., Ltd.) and numerically calculated with NIH image.
  • Keratin 10 As for Keratin, it is clear that the expression of Keratin 10 decreases with skin aging. Therefore, Keratin 10, Keratin 7 and Keratin 15 have a correlation with any kind of Keratin strength in human skin aging. I checked if there was. As a result of examining the correlation between the age of Keratin 10 and Ker atin 15, Keratin 10 was not correlated with age, and Keratin 15 was correlated with age. It became clear that it is a more appropriate skin aging marker than the best (see Fig. 10). And Figure 11).
  • proteins whose expression increases or decreases with cellular senescence and proteins that change to uncut form can be expected to be applied to cosmetic counseling systems as diagnostic markers for skin aging. It is also expected to develop more effective cosmetics and health foods using the expression of these proteins as an index.

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Abstract

　皮膚老化マーカーとなりうる物質を探索することを目的とし、皮膚細胞及び／又は皮膚組織における分泌タンパク質及び／又は細胞内タンパク質の発現及び／又はその遺伝子発現を測定することを含む、皮膚の老化度を判定する方法であって、前記分泌タンパク質及び／又は細胞内タンパク質は皮膚の老化により発現が変化するものである前記方法。皮膚の老化度を判定するためのキット及び皮膚の老化防止に効果のある物質を同定する方法も提供される。

Description

明 細 書
皮膚老化マーカーとその利用技術
技術分野
[0001] 本発明は、皮膚老化マーカーとその利用技術に関する。
背景技術
[0002] 皮膚の加齢変化はしわ、たるみ等見た目から認知されるのが一般的で、肌年齢の 推定は外観変化をもとに機器を用いた客観的な評価が試みられてきた。実際に行わ れている方法としては、しわやたるみの程度力 実年齢を推定したり、ファイバースコ ープなどで皮膚の外観的なきめの細力さ度合 、を測定したり、皮膚に振動体を接触 させた時の振動変化で肌年齢を判定する方法が報告されている (特許文献 1〜3)。 老化の要因として細胞老化が提唱されて 、るが、これまで細胞老化が個体老化の 原因であることは実証されていな力つた。最近、細胞老化が個体老化の原因であるこ とを実証する結果が報告された (非特許文献 1)。皮膚にぉ 、ても加齢変化はしわ、 たるみ等の外観が変化する前に細胞レベルでの加齢変化が先に始まっていると考え られる。例えば、皮膚老化に伴って細胞外マトリックスタンパク質 (ECM)であるコラー ゲンなどが減少し、 ECM分解性プロテアーゼの発現が増加する等様々な因子の発 現変化が起こる (非特許文献 2〜4)。また、生体内に発生する酸ィ匕修飾などを受けた 異常なタンパク質はプロテアソームにより分解される力 加齢とともに皮膚中のプロテ ァノームの発現が低下し、酸化コラーゲンの蓄積が起こる（非特許文献 5)。よって、 皮膚老化度を的確に測定するには外観変化に基づく評価では不十分で、細胞レべ ルでの生化学的な加齢変化を調べることが重要である。
[0003] これまでに、皮膚細胞の老化マーカーとして senescence— associated β -gala ctosidase (SA- β -Gal)が同定され、 SA— β Galは最終分化した細胞では発 現せずに老化した細胞のみに特異的に発現し、ヒトの皮膚組織での老化とも非常に 良く相関することが明らかになった (非特許文献 6)。それ以外の皮膚老化マーカーと し飞 serine protease inhibitorの 1種である Maspinや cysteine protease mhi bitorの 1種である Cyatatin Aなどが報告されている（非特許文献 7、 8) 皮膚老化のバイオマーカーを探索する手法として、特定の細胞が特定の条件下に 置かれたときに、その細胞内に存在する全タンパク質 (proteome)を 2次元電気泳動 により分離し、質量分析機により同定する手法 (proteomics)が有用である。実際に 、若年と老年のヒトの皮膚組織力もタンパク質を抽出し、 proteomicsにより皮膚老化 により有意に変化したタンパク質として eIF—5A、 Cyclophilin A、 Proteasomal protein、 PA28— 、 Tryptophanyl― tRNA synthetase^ HSP60、 Annexin
I、 NM23 H2 (nucleoside diphosphatase kinase)、 PI3K p85 β isoform 、 Mn— superoxide dismutase、 PAI— 2、 Mx— A proteinが見出されている ( 非特許文献 9)。しかし、これまで皮膚に関して実施された proteomicsは皮膚組織の 抽出物もしくは細胞抽出物を用いた解析であり、微量な分泌タンパク質が多く含まれ ている細胞培養上清液に着目して proteomicsを行った例はない。また、同定した皮 膚老化マーカーのヒト皮膚での検証はノ ィォプシ一により摘出した皮膚組織での免 疫染色など実用性が低い方法であり、非浸襲的に安全、簡便に角層採取ができる角 質チェッカーを用いて角層を採取し、そこ力もタンパク質を抽出して皮膚老化マーカ 一の発現を調べる実用性の高!、方法で調べた例はな 、。
特許文献 1：特開 2002— 330943号公報
特許文献 2：特開 2002 - 360544号公報
特許文献 3：特開 2001— 212087号公報
非特許文献 1: Clinic. Invest. , 114, 1299-1307, 2004
非特許文献 2:Mol. Cell. Biochem. 1999 Apr, 194(1— 2) :99— 108 非特許文献 3 :J. Investig. Dermatol. Symp. Proc. , 3(2), 172-179, 1998 非特許文献 4:Mech. Ageing Dev. , 123(7), 801— 810, 2002.
非特許文献 5 Gerontology, 55(5), 220-227, 2000
非特許文献 6: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92, 9363-9367, 1995 非特許文献 7: Cancer Research, 64, 2956-2961, 2004
非特許文献 8: Dermatology, 188, 21— 24, 1994
非特許文献 9:Mol. Cell. Proteomics, 2(2), 70— 84, 2003
発明の開示 発明が解決しょうとする課題
[0005] 本発明は、皮膚老化マーカーとなりうる物質を探索することを目的とする。
課題を解決するための手段
[0006] 本発明者らは、微量な分泌タンパク質が多く含まれて ヽる細胞培養上清液に着目 し、表皮角化細胞の老化に伴って発現が変化するタンパク質の proteomicsを行つ た。すなわち、ヒト正常表皮角化細胞の 2代目（若い細胞)〜 5代目（老化した細胞） の培養上清液を調製し、 2次元電気泳動と質量分析機による proteome解析を行つ た。さらに、本発明の特徴として、超微量タンパク質（1 femto— mol以下）の同定を 可能とする技術 {実験医学， 20 (16) , 2367- 2370, 2002}を用いて同定を試みた その結果、表皮角化細胞の老化に伴って発現が減少したタンパク質が 19個（表 1) 、発現が増加したタンパク質が 49個同定された (表 2)。これらのタンパク質の中には 既知の皮膚老化マーカー以外にも 13 2 -microglobulin, PAI— 1、 Kallikrein 7 などの新規な皮膚老化マーカーが含まれていた。さらに、 proteome解析により同定 されたタンパク質の発現を 1次元のウェスタンブロッテイングにより確認し、表皮角化 細胞の老化と相関するいくつかのタンパク質を同定した (表 3)。また、 proteome解 析により細胞骨格タンパク質である 2種の Keratinが同定されたことから、表皮角化 細胞の老化に伴う種々の Keratinの発現変ィヒも調べた。その結果、表皮角化細胞の 老ィ匕に伴って 8種の Keratin(Ketratin 10、 13、 14、 15、 16、 18、 19および 20) の発現が増加し、 Keratin 7の発現が減少した。発現が変化するタンパク質以外に も、表皮角化細胞の老化に伴 、プロテアーゼにより切断された切断型に対する非切 断型の割合が増加するタンパク質として j8 2— microglobulinが同定された。
さらに、前述のようにして見出した皮膚老化マーカーとヒトの皮膚老化度との相関を 調べるために、 20〜60代のボランティアから、非浸襲的に安全、簡便に角層採取が できる角質チェッカーを用いて角層を採取し、そこ力もタンパク質を抽出して皮膚老 化マーカーの発現をウェスタンブロッテイングにより調べた。その結果、 Keratin 7、 Keratin 15および Kallikrein 7が皮膚老化の指標として知られる皮膚弾力性およ びしわ体積率と非常に良く相関することが明らかとなった。 本発明の要旨は以下の通りである。
(1)皮膚細胞及び Z又は皮膚組織における分泌タンパク質及び Z又は細胞内タン パク質の発現及び Z又はその遺伝子発現を測定することを含む、皮膚の老化度を判 定する方法であって、前記分泌タンパク質及び Z又は細胞内タンパク質は皮膚の老 化により発現が変化するものである前記方法。
(2)分泌タンパク質及び Z又は細胞内タンパク質力 Kallikrein 7、 PAI— 1、 uPA 、 Matriptase、 GRP 94、 HSP 70、 HSP 90、 Galectin— 1、 Galectin—3、 Ga lectin— 7、 IGFBP— 3、 Enolase— 1、 Annexin II、 Ezrin、 Radixin、 Moesin、 Gelsolin、 Keratin 7、 Keratin 10、 Keratin 13、 Keratin 14、 Keratin 15、 Keratin 16、 Keratin 18、 Keratin 19、 Keratin 20および j8 2— microglobu linからなる群より選択される (1)記載の方法。
(3)分泌タンパク質及び Z又は細胞内タンパク質の発現をタンパク質レベルで測定 する（1)又は（2)に記載の方法。
(4)分泌タンパク質及び Z又は細胞内タンパク質の遺伝子発現を RNAレベルで測 定する（1)又は（2)に記載の方法。
(5)皮膚の老化により発現が変化する分泌タンパク質及び Z又は細胞内タンパク質 を特異的に認識できる抗体を含む、皮膚の老化度を判定するためのキット。
(6)分泌タンパク質及び Z又は細胞内タンパク質力 Kallikrein 7、 PAI— 1、 uPA 、 Matriptase、 GRP 94、 HSP 70、 HSP 90、 Galectin— 1、 Galectin— 3、 Ga lectin— 7、 IGFBP— 3、 Enolase— 1、 Annexin II、 Ezrin、 Radixin、 Moesin、 Gelsolin、 Keratin 7、 Keratin 10、 Keratin 13、 Keratin 14、 Keratin 15、 Keratin 16、 Keratin 18、 Keratin 19、 Keratin 20および j8 2— microglobu linからなる群より選択される (5)記載のキット。
(7)皮膚の老化により発現が変化する分泌タンパク質及び Z又は細胞内タンパク質 の mRNAと特異的にハイブリダィズできる核酸プローブを含む、皮膚の老化度を判 定するためのキット。
(8)分泌タンパク質及び Z又は細胞内タンパク質力 Kallikrein 7、 PAI— 1、 uPA 、 Matriptase、 GRP 94、 HSP 70、 HSP 90、 Galectin— 1、 Galectin— 3、 Ga lectin— 7、 IGFBP— 3、 Enolase— 1、 Annexin II、 Ezrin、 Radixin、 Moesin、 Gelsolin、 Keratin 7、 Keratin 10、 Keratin 13、 Keratin 14、 Keratin 15、 Keratin 16、 Keratin 18、 Keratin 19、 Keratin 20および j8 2— microglobu linからなる群より選択される (7)記載のキット。
(9)皮膚の老化により発現が変化する分泌タンパク質及び Z又は細胞内タンパク質 の mRNAと特異的にノ、イブリダィズできる核酸プライマー及び前記 mRNAを铸型と して合成される cDNAと特異的にハイブリダィズできる核酸プライマーカもなる 1対の 核酸プライマーを含む、皮膚の老化度を判定するためのキット。
(10)分泌タンパク質及び Z又は細胞内タンパク質力 Kallikrein 7、 PAI— 1、 uP A、 Matriptase、 GRP 94、 HSP 70、 HSP 90、 Galectin— 1、 Galectin—3、 Galectin— 7、 IGFBP— 3、 Enolase— 1、 Annexin II、 Ezrin、 Radixin、 Moesin 、 Gelsolin、 Keratin 7、 Keratin 10、 Keratin 13、 Keratin 14、 Keratin 15 、 Keratin 16、 Keratin 18、 Keratin 19、 Keratin 20および j8 2— microglob ulin力 なる群より選択される（9)記載のキット。
(11)皮膚の老化防止に効果のある物質を同定する方法であって、以下の工程：
(a)被験物質と皮膚細胞及び Z又は皮膚組織を接触させる工程、
(b)工程 (a)で被験物質と接触させた皮膚細胞及び Z又は皮膚組織を所定時間培 養する工程、
(c)工程 (b)で培養した皮膚細胞及び,又は皮膚組織における分泌タンパク質及び Z又は細胞内タンパク質の発現及び Z又はその遺伝子発現を測定する工程であつ て、前記分泌タンパク質及び Z又は細胞内タンパク質は皮膚の老化により発現が変 化するものである前記工程、及び
(d)工程 (c)で測定した分泌タンパク質及び Z又は細胞内タンパク質の発現及び Z 又はその遺伝子発現を対照の皮膚細胞及び Z又は皮膚組織における分泌タンパク 質及び Z又は細胞内タンパク質の発現及び Z又はその遺伝子発現と比較すること により、皮膚細胞及び Z又は皮膚組織における分泌タンパク質及び Z又は細胞内タ ンパク質の発現及び Z又はその遺伝子発現に対する被験物質の効果を評価するェ 程 を含む前記方法。
(12)分泌タンパク質及び Z又は細胞内タンパク質力 Kallikrein 7、 PAI 1、 uP A、 Matriptase、 GRP 94、 HSP 70、 HSP 90、 Galectin— 1、 Galectin—3、 Galectin— 7、 IGFBP— 3、 Enolase— 1、 Annexin II、 Ezrin、 Radixin、 Moesin 、 Gelsolin、 Keratin 7、 Keratin 10、 Keratin 13、 Keratin 14、 Keratin 15 、 Keratin 16、 Keratin 18、 Keratin 19、 Keratin 20および j8 2— microglob ulin力 なる群より選択される（11)記載の方法。
発明の効果
[0008] 本発明により、皮膚老化における細胞レベルでの加齢変化を指標とする評価系が 確立できる。この評価系を用いて、従来法に比べてより詳細に、的確に皮膚の老化 度を判定することができる。また、皮膚の老化度を判定するためのキットおよび皮膚 の老化防止に効果のある物質を同定する方法も提供される。
図面の簡単な説明
[0009] [図 1]表皮角化細胞の継代による増殖変化 (a)および形態変化 (b)を示す。
[図 2]表皮角化細胞の継代数ごとに SA— β Galにより染色した細胞の染色像 (a) および SA— β Gal染色された細胞の割合 (b)を示す。
[図 3]表皮角化細胞の継代数 2代目および 5代目力 抽出したタンパク質の 2次元電 気泳動泳動解析により得られた発現パターンを示す。
[図 4]表皮角化細胞の老化に伴う Laminin 5および Fibronectinの発現変化を 1次 元ウェスタンブロッテイングにより解析した結果を示す。
[図 5(a)(b)]表皮角化細胞の老化に伴うプロテアーゼおよびプロテアーゼインヒビター の発現変化を 1次元ウェスタンブロッテイングにより解析した結果を示す。
[図 6]表皮角化細胞の老化に伴う熱ショックタンパク質の発現変化を 1次元ウエスタン ブロッテイングにより解析した結果を示す。
[図 7]表皮角化細胞の老化に伴う細胞内タンパク質及び細胞骨格系タンパク質の発 現変化を 1次元ウェスタンブロッテイングにより解析した結果を示す。
[図 8]表皮角化細胞の老化に伴う Galectinおよび IGFBP— 3の発現変化を 1次元ゥ エスタンブロッテイングにより解析した結果を示す。 [図 9]表皮角化細胞の老化に伴う Keratinの発現変化を 1次元ウェスタンブロッテイン グにより解析した結果を示す。
[図 10]目尻角層から抽出した Keratin 15の発現と年齢との相関を示す。
[図 11]目尻角層から抽出した Keratin 10の発現と年齢との相関を示す。
[図 12]年齢と目尻弾力性との相関を示す。
[図 13]年齢と目尻しわ体積率との相関を示す。
[図 14]目尻角層から抽出した Kemtin 7の発現と目尻弾力性との相関を示す。
[図 15]目尻角層から抽出した Kemtin 15の発現と目尻弾力性との相関を示す。
[図 16]目尻角層から抽出した Kemtin 7の発現と目尻しわ体積率との相関を示す。
[図 17]目尻角層から抽出した Keratin 15の発現と目尻しわ体積率との相関を示す
[図 18]目尻角層から抽出した Kallikrein 7の発現と目尻弾力性との相関を示す。
[図 19]目尻角層力も抽出した Kallikrein 7の発現と目尻しわ体積率との相関を示す 発明を実施するための最良の形態
以下、本発明の実施の形態についてより詳細に説明する。
本発明は、皮膚細胞及び Z又は皮膚組織における分泌タンパク質及び Z又は細 胞内タンパク質の発現を測定することを含む、皮膚の老化度を判定する方法を提供 する。分泌タンパク質及び Z又は細胞内タンパク質は皮膚の老化により発現が変化 するものである。「発現が変化する」態様としては、タンパク質及び Z又はその遺伝子 の発現の有無が変わること、発現量が増減すること、発現したタンパク質のプロテア ーゼによる切断型と非切断型の割合が変わることなどが挙げられる。皮膚の老化度を 判定するための分泌タンパク質及び Z又は細胞内タンパク質は、 Kallikrein 7、 P AI— 1、 uPA、 Matriptase、 GRP 94、 HSP 70、 HSP 90、 Galectin— 1、 Gale ctin— 3、 Galectin— 7、 IGFBP— 3、 Enolase— 1、 Annexin II、 Ezrin、 Radixin 、 Moesin、 Gelsolin、 Keratin 7、 Keratin 10、 Keratin 13、 Keratin 14、 Ke ratin 15、 Keratin 16、 Keratin 18、 Keratin 19、 Keratin 20*50 ^ j8 2- microglobulin力もなる群より選択することが好まし!/、。選択するタンパク質は 1種で も複数種であってもよい。
[0011] Kallikrein 7は、分子質量 27, 525Daの分泌タンパク質である。角質層の細胞間 どうしの結合部分を切断することにより皮膚表面力 の細胞の落屑を促す働きをもつ 。組織中では皮膚で多く発現される一方、脳、乳腺、脊髄、腎臓に発現が見られる。 遺 十目 S列情報 (Stratum corneum chymotrytic enzyme, J. Βιοι. し hem. 269 : 19420- 19426, 1994, L33404)。アミノ酸配列情報（Kallikrein 7 prec ursor, J. Biol. Chem. 269 : 19420—19426, 1994, P49862)。
PAI—lは、分子質量 45, 060Daの分泌タンパク質である。セリンプロテアーゼの 一種で tPA (tissue plasminogen activator) , uPA, protein C等の活'性を阻 害する。 PAI— 1は酸に安定な糖タンパク質で、セルピン（serpin)ファミリーに属して いる。血漿、血小板、内皮細胞、肝細胞、繊維肉腫細胞にみられる。遺伝子配列情 報（Plasminogen activator inhibitor— 1, J. Clin. Invest. 78 : 1673— 1680 , 1986, M16006)。アミノ酸配列情報（Plasminogen activator inhibitor— 1, FEBS Lett. 210 : 11— 16, 1987, P05121)。
[0012] uPAは、分子質量 48, 525Daの分泌タンパク質である。 uPAはプラスミノーゲンを プラスミンに変換するセリンプロテアーゼの一種。前駆体タンパク質（55kDa)として 細胞外へ分泌され、切断型（35kDa)となってプロテアーゼ活性を示す。乳がんで多 くの発現が見られる。遺伝子配列情報（Urokinase— type plasminogen activat or , Nucleic Acids Res. 13 : 2759- 2771, 1985, BC013575)。アミノ酸 酉己列情報 (Uro nase— type plasminogen activator, Hoppe— Seyler's Z. Physiol. Chem. 363 : 1043— 1058, 1982, P00749)。
[0013] Matriptaseは、分子質量 75, 626Daの分泌タンパク質である。細胞外マトリックス を分解する酵素。乳がんで浸潤と転移に関与するという報告がある。トリプシン様の 酵素活性を示す。さらに matriptaseのインヒビターである HAI—l (Hepatocyte gr owth factor activation inhibitorl)と複合体を示すことが明らかとなっている。 また、この遺伝子をノックアウトしたマウスでは皮膚での水分蒸散のコントロールがで きずに致死に至ることがわかっている。遺伝子配列情報（Membrane— type serin protease 1, J. Biol. Chem. 274 : 18231— 18236, 1999, AF188224)。アミ ノ酸酉己歹 U†青報 (Membrane— type serin protease 1, J. Biol. Chem. 274 : 1 8237- 18242, 1999, Q9BS01)。
[0014] GRP94は、分子質量 92, 469Daの分泌タンパク質である。熱ショックタンパク質の 一種で分泌タンパク質の切断や輸送で働くシャペロン分子である。シグナルペプチド を持っているので細胞外に分泌されるものもあるが ERに局在するものもある。遺伝子 配歹 IJ情報（tumor rejection antigen (gp96) 1, Proc. Natl. Acad. Sci. USA . 87 : 5658 - 5662, 1990, BC066656)アミノ酸配列情報（Endoplasmin, Nat. Biotechnol. 21 : 566— 569, 2003, P14625;>。
[0015] HSP70は、分子質量 70, 052 Daの細胞内タンパク質である。通常、細胞内で分 子シャペロンとして機能し、タンパク質のフォールデイング、輸送、集合や分解などに 関与している。また、ミトコンドリアや ERでの HSP70の働きはタンパク質を正常に移 転させることである。 HSP90と協調して細胞内のシグナル伝達にも関与する。遺伝 子塩基配列情報（heat shock 70kDa protein 1A, Immunogenetics32： 24 2- 251, 1990, BC002453)。アミノ酸配列情報（Heat shock 70 kDa prote in 1, P08107)。
[0016] HSP90は、分子質量 85, 453Daの細胞内タンパク質である。ふだんはステロイド ホルモン受容体などの複合体に結合'解離することでシグナル伝達系にお 、て重要 な働きをしている。細胞が高温にさらされると、 HSP90は構造を変えてタンパク質の 不可逆的損傷を防ぐ分子シャペロンとして働く。遺伝子塩基配列情報 (Heat shoe k protein 90, Nucleic Acids Res. 17 : 7108— 710, 1989, X15183)。アミ ノ酸配列情報（Heat shock protein 90, J. Biol. Chem. 264 : 2431— 2437, 1989, P07900)。
[0017] Galectin— 1は、分子質量 14, 585Daの細胞内タンパク質である。細胞外に分泌 されるものもある。心臓、胃、骨格筋、神経、胸腺、腎臓、胎盤などに存在する。 β ガラクトシドゃ CD45, CD3, CD4等に結合する。細胞の増殖促進効果、細胞死の 誘導、また免疫応答に影響を与えることが知られている。また、ラミニン、インテグリン などの細胞外マトリックスの構成成分や細胞受容体に特異的に結合し、細胞接着や 移動に大きな影響を与えている。遺伝子配列情報（Galectin— 1, J. Biol. Chem. 264 : 1310- 1316, 1989, BT006775)。アミノ酸配列情報（Galectin— 1, Bi ochem. 104 : 1—4, 1988, P09382)。
[0018] Galectin— 3は、分子質量 35, 678Daの細胞内タンパク質である。 IgEに結合す る、ガラクトース特異的なレクチン。主な発現は大腸の上皮や活性ィ匕マクロファージ において見られる。ガレクチン 3は表皮角化細胞によって産生され皮膚のランゲルノヽ ンス島の表面に存在し、 IgEと結合して免疫系を調節しているという報告がある。遺伝 子配列情報（Galectin— 3, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 87 : 7324- 7328, 1 990, AB006780)。アミノ酸配列情報（Galectin— 3, P17931)。
[0019] Galectin— 7は、分子質量 14, 944Daの細胞内タンパク質である。一般的には細 胞間どうし、細胞と細胞外マトリックス間で細胞の増殖を制御している。アポトーシス 関連タンパク質で JNKの活性ゃシトクローム Cの放出を制御している。細胞質、核、ま た細胞外にも分泌されて 、る。ヒト表皮で最初にクローユングされたガレクチンサブフ アミリーのメンバーで、培養表皮角化細胞の研究力もガレクチン 7は角質ィ匕の程度に 影響を受けず、総ての表皮細胞に発現する。遺伝子配列情報 (Galectin— 7, Dev . Biol. 168 : 259- 271, 1995, L07769) ,アミノ酸配列情報（Galectin— 7, J. B iol. Chem. 270 : 5823— 5829, 1995, P47929)。
[0020] IGFBP— 3は、分子質量 31, 660Daの分泌タンパク質である。一般的に IGFと結 合することにより半減期までの時間が長くなる。細胞培養においては細胞増殖を抑制 もしくは促進する。細胞表面で IGF受容体に結合する。 IGFBP— 3は IGF— 1より IG F— 2に対して結合力が高 、。組織中にぉ 、てはほとんどん組織にぉ 、て発現が見 られる。遺 1zs子目 il歹 Uffr報 (Insulin— like growth factor binding protein— 3, J. Biol. Chem. 265, 12642—12649, 1990, M35878)。アミノ酸配列情報（I nsulin— like growth factor binding protein— 3, J. Biol. Chem. 265, 1 4892- 14898, 1990, P17936)。
[0021] Enolase— 1は、分子質量 47, 038Daの細胞内タンパク質である。 2— phospho
-D- glycerate = phosphoenolpyruvate + H Oの酵素活性を持ち解糖系で働く
2
。また一部は細胞増殖、アレルギーにも関与するという報告がある。白血球や神経で は細胞表面においてプラスミノーゲンの活性ィ匕を制御しフイブリンを形成するのに関 与している。二量体の安定な構造を持つにはマグネシウムが必要である。細胞質内 に局在する力 ホモダイマーのみ細胞膜にも見られる。 a— enolaseはほとんどの組 織に発現し、 j8—enolaseは筋組織、 γ—enolaseは神経組織のみに発現している 。遺伝子配列情報（Alpha enolase, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 83 : 6741 - 6745, 1986, M14328)。アミノ酸配列情報（Alpha enolase, Enzyme Prot ein 48 : 37-44, 1995, P06733)。
[0022] Annexin IIは、分子質量 38, 473Daの細胞内タンパク質である。一部細胞外へ 分泌されると ヽぅ報告もある。カルシウムで制御される膜結合タンパク質でこのタンパ ク質には二つのカルシウムイオンが結合する。細胞膜近傍に局在している。 2組ある a nnexinリピートのうち、 1つはカルシウムが結合し、 1つはリン脂質が結合する。このタ ンパク質は細胞膜にあるリン脂質に結合しているァクチンや細胞骨格系のタンパク質 と架橋したり、 tPAを介してプラスミノーゲンを活性ィ匕したりする。遺伝子塩基配列情 報（Annexin A2, Gene 95 : 243— 251 , 1990, BC015834)。アミノ酸配列情 報（Annexin A2, J. Biol. Chem. 266 : 5169— 5176, 1991, P07355)。
[0023] Ezrinは、分子質量 69, 268Daの細胞内タンパク質である。下記の Radixin、 Moe sinは同族の分子。主に細胞骨格系のタンパク質を細胞膜につなぐ働きをしている。 細胞膜の microvilliと呼ばれる糸状突起の内側に局在する。腸上皮細胞の microvil liを構成している。チロシンキナーゼによってリン酸ィ匕される。遺伝子配列情報 (Ezri n, J. Biol. Chem. 264 : 16727- 16732, 1989, X51521)。アミノ酸配列情報（ Ezrin, Biochem. Biophys. Res. Commun. 224 : 666— 674, 1996, P15311
) o
[0024] Radixinは、分子質量 68, 564Daの細胞内タンパク質である。主に細胞骨格系タ ンパク質と細胞膜とをつなぐ働きをしている。遺伝子配列情報 (Radixin, Genomics 16 : 199 - 206, 1993, L02320)。アミノ酸配列情報（Radixin, P35241)。
[0025] Moesinは、分子質量 67, 689Daの細胞内タンパク質である。主に細胞骨格系タ ンパク質と細胞膜とをつなぐ働きをしている。異常な分ィ匕をした表皮角化細胞におい て発現が低下するという報告がある。遺伝子配列情報（Moesin, Proc. Natl. Acad . Sci. USA. 88 : 8297- 8301, 1991, M69066)。アミノ酸配列情報（Moesin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 88 : 8297— 8301, 1991 , P26038)。
[0026] Gelsolinは、分子質量 85, 698Daの分泌タンパク質である。細胞外へ分泌される ものと細胞内で働くタイプの 2つがある。細胞外へ分泌されたものはフイブロネクチン と結合する。ゲルゾリンは、重合核形成によるァクチン線維伸長の促進、ァクチン線 維の切断、およびその末端の保護という、 3つのァクチン重合調節機能を持つ。これ らの両面性の機能を通じて重合 脱重合という両局面を制御し、細胞運動において 重要な役割を担っている。血小板や繊維芽細胞で多く発現がみられる。遺伝子情報 (Gelsolin, Nat. 323, 455—458, 1986, X04412)。アミノ酸配列情報（Gelsoli n, Nat. Biotechnol. 21. 566— 569, 2003, P06396)。
[0027] Keratin 7は、分子質量 51, 287Daの細胞骨格タンパク質で中間系フィラメントの 成分である。腺細胞を含む多様な上皮細胞で発現が見られる。尿管の移行上皮、胆 管、肺、乳腺上皮でも発現している。一部、腫瘍マーカーとしても使用されている。遺 伝子配列情報（Keratin 7, J. Cell Biol. 107 : 1337- 1350, 1988, AF50988 7)。アミノ酸配列情報（Keratin, type II cytoskeletal 7, P08729)。
[0028] Keratin 10は、分子質量 59, 519Daの細胞骨格タンパク質である。 Keratin 1 とへテロ四量体を作る、中間系フィラメントの成分である。皮膚全般に見られるが特に 有棘層に多く見られる。遺伝子情報配列（Keratin 10, J. Mol. Biol. 204 : 841— 856, 1988, M19156)。アミノ酸配列情報（Keratin, type I cytoskeletal 10 , Electrophoresis 13 : 960— 969, 1992, P13645)。
[0029] Keratin 13は、分子質量 49, 586Daの細胞骨格タンパク質である。ケラチン 4と ヘテロ四量体を作る中間系フィラメントの成分である。舌、食道、上皮、尿路上皮など で発現が見られる。遺伝子配列情報（Keratin 13, Gene 215 : 269— 279, 199 8, X52426)。アミノ酸配列情報（Keratin, type I cytoskeletal 13, P13646
) o
[0030] Keratin 14は、分子質量 51, 490Daの細胞骨格タンパク質である。ケラチン 5と ヘテロ四量体を作る中間系フィラメントの成分である。上皮に存在し、特に基底層に 近 、ところにぉ 、て発現が多く見られる。上皮系の未分ィ匕マーカーとしても使われて いる。遺伝子配列情報（Keratin 14, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 82 : 1609 - 1613, 1985, BC002690)。アミノ酸配列情報（Keratin, type I cytoskeleta 1 14, P02533)。
[0031] Keratin 15は、分子質量 49, 167Daの細胞骨格タンパク質である。中間系フイラ メントの成分である。主に上皮基底層に局在している。遺伝子配列情報 (Keratin 1 5, J. Cell Biol. 106 : 1249— 1261, 1988, X07696)。アミノ酸配列情報（Ker atin, type I cyto skeletal 15, P19012)。
[0032] Keratin 16は、分子質量 51, 136Daの細胞骨格タンパク質である。 Keratin 6 とへテロ四量体を作る中間系フィラメントの成分である。毛包、爪、口腔の扁平上皮層
、上皮の基底層、手掌の上皮、また汗腺で発現が見られる。細胞の増殖や分化に関 与している。遺伝子情報配列（Keratin 16, Biochem. Biophys. Res. Commun . 215 : 517- 523, 1995, AF061812)。アミノ酸配列情報（Keratin, type I cy toskeletal 16, Electrophoresis 13 : 960— 969, 1992, P08779)。
[0033] Keratin 18は、分子質量 47, 926Daの細胞骨格タンパク質である。 Keratin 8 とへテロ四量体を作る中間系フィラメントの成分である。ほとんどの単層腺上皮に存 在する。 Keratin 18が欠損している患者は特発性肝疾患になる可能性がある。遺 伝子配列情報（Keratin 18, Differentiation 33 : 61— 68, 1986, M26325)。 アミノ酸配列情報（Keratin, type I cyto skeletal 18, Electrophoresis 18 : 6 05 - 613, 1997, P05783)。
[0034] Keratin 19は、分子質量 44, 106Daの細胞骨格タンパク質である。ケラチンの中 で一番分子量が小さい。中間系フィラメントの成分である。ほとんどの単層上皮、非角 質ィ匕型重層上皮で多く発現している。また、すべての腺癌で発現している。遺伝子配 列情報（Keratin 19, J. Invest. Dermatol. 92 : 707- 716, 1989, Y00503)。 アミノ酸配歹 IJ情報（Keratin, type I cyto skeletal 19, Electrophoresis 13 : 9 60 - 969, 1992, P08727)。
[0035] Keratin 20は、分子質量 48, 486Daの細胞骨格タンパク質である。中間系フイラ メントの成分である。正常細胞では腸管上皮、消化管上皮、胃幽門上部に存在する 内分泌細胞や尿管上皮、皮膚のメンケル細胞に存在する。大腸癌などの特異的マ 一力一タンパク質として用いられている。遺伝子配列情報 (Keratin 20, Different iation 53 : 75— 93, 1993, BC031559)。アミノ酸配列情報（Keratin, type I cy to skeletal 20, P35900)。
[0036] β 2— microglobulinは、分子質量 13, 175Daの分泌タンパク質である。 HLAク ラス I抗原 (組織適合性抗原)の L鎖。多くの細胞表面に存在している。腎機能障害や 各種悪性腫瘍などの診断の指標として使用されている。一部切断型が見られるがそ れらの意義につ 、てはあまり明らかになつてな 、。遺伝子配列情報（Beta - 2-mic roglobulin, J. Immunol. 139 : 3132— 3138, 1987, AB021288)。アミノ酸配 列情報（Beta— 2— microglobulin, Biochemistry 12 :4811—4822 (1973) , P61769)。
[0037] 上記のタンパク質は、前駆体タンパク質であっても、成熟タンパク質であってもよぐ また、切断型であっても、非切断型であってもよい。前駆体タンパク質としては、プロ タンパク質、プレプロタンパク質などを挙げることができる。プロタンパク質、プレブロタ ンパク質などには、分泌タンパク質の特徴的な配列であるシグナルペプチドを持つも のもある。
[0038] 本発明の方法において、皮膚細胞及び Z又は皮膚組織における分泌タンパク質 及び Z又は細胞内タンパク質の発現を測定してもよ 、し、その遺伝子発現を測定し てもよい。例えば、ノーザンプロット法、 PCR法、ウェスタンプロット法、免疫組織化学 分析法などで測定することができる。あるいはまた、 cDNAマイクロアレイ、 ELISA法 、抗体アレイなどを利用して測定してもよい。
分泌タンパク質及び Z又は細胞内タンパク質の発現をタンパク質レベルで測定す るためには、測定の対象となるタンパク質を特異的に認識する抗体を用いるとよい。 抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体のいずれであってもよい。これらの 抗体は公知の方法で製造することができるし、また、市販されているものもある。ゥェ スタンプロット法で測定する場合には、抗体は、 1251標識プロテイン A、ペルォキシダ ーゼ結合 IgGなどを用いて二次的に検出される。免疫組織化学分析法で測定する 場合には、抗体は、蛍光色素、フェリチン、酵素などで標識するとよい。
[0039] 分泌タンパク質及び Z又は細胞内タンパク質の遺伝子発現を RNAレベルで測定 するためには、測定の対象となるタンパク質の mRNAと特異的にハイブリダィズでき る核酸プローブを用いるとよ 、（ノーザンプロット法で測定する場合)。ある 、はまた、 測定の対象となるタンパク質の mRNAと特異的にノ、イブリダィズできる核酸プライマ 一及び前記 mRNAを铸型として合成される cDNAと特異的にハイブリダィズできる 核酸プライマーからなる 1対の核酸プライマーを用いてもよい (PCR法で測定する場 合)。核酸プローブ及び核酸プライマーは、測定の対象となるタンパク質の遺伝子情 報に基づいて設計することができる。核酸プローブは、通常、約 15〜1500塩基のも のが適当である。核酸プローブは、放射性元素、蛍光色素、酵素などで標識するとよ い。核酸プライマーは、通常、約 15〜30塩基のものが適当である。
[0040] 本発明にお 、て、皮膚細胞及び Z又は皮膚組織における分泌タンパク質及び Z 又は細胞内タンパク質の発現及び Z又はその遺伝子発現の有無を検出してもよいし 、発現量を測定してもよい。タンパク質及び Z又はその mRNAの発現の有無は所定 の位置におけるスポットやバンドの出現の有無により確認できる。タンパク質及び Z 又はその mRNAの発現量はスポットやバンドの染色強度により測定できる。あるいは また、タンパク質及び Z又はその mRNAを定量してもよい。複数の遺伝子発現ゃ複 数のタンパク発現を同時に検出するためには、 DNAアレイ (プローブを基板に固定） (NATURE REVIEWS, DRUG DISCOVERY, VOLUME 1, DECE MBER 2002, 951— 960)、プロテインチップ（抗体を基板に固定）（NATURE REVIEWS, DRUG DISCOVERY, VOLUME 1, SEPTEMBER 20 02, 683— 695)、ルミネックス（NATURE REVIEWS, DRUG DISCOVER Y, VOLUME 1, JUNE 2002, 447— 456)等の検出法を用いることが好ま しい。
[0041] 皮膚細胞及び皮膚組織はいかなる生物に由来するものであってもよぐヒト、ブタ、 サル、チンパンジー、ィヌ、ゥシ、ゥサギ、ラット、マウスなどの哺乳動物などに由来す るものを挙げることができる。ヒトの皮膚の老化度を判定するためには、ヒト由来組織 を使用する必要がある。
本発明の方法においては、皮膚の老化度を判定するためには、皮膚生検試料、あ るいはそこ力も得られる培養皮膚細胞、培養皮膚組織などを用いることができる。 皮膚細胞としては、表皮角化細胞、皮膚繊維芽細胞、ランゲルノ、ンス細胞、メラ二 ン細胞、肥満細胞、内皮細胞、皮脂細胞、毛乳頭細胞、毛母基細胞などを挙げるこ とができる。皮膚細胞は、国内ではヒューマンサイエンス研究資源バンク、理化学研 究所細胞銀行、海外では the American Type Culture Collectionから供給さ れる。また Clontech社、クラボウ社、 PromoCell社力 購入できる。また、公知の方 法により皮膚力 採取することができる（分子生物学研究のための新細胞培養実験 法， p57- 71,羊土社， 1999)。
皮膚組織としては、皮膚の角層、表皮、真皮などを挙げることができる。皮膚組織は 、 Biochain社、 Super Bio Chips社から購入できる。また、公知の方法により皮膚 力ら採取すること力 sできる（Acta. Derm. Venereol. , 85, 389— 393, 2005)。 皮膚モデルはクラボウ社、 TO ΥΟΒΟ社などカゝら市販されており、これらを使用する ことが出来る。また、公知の方法 [[. Invest. Dermatol. , 104 (1) ,107— 112,199 5}により作製することもできる。
皮膚生検試料は、細胞であっても、組織であってもよい。皮膚生検試料としては、 後述の実施例に記載のように、皮膚の角層を角層チヱッカーなどのテープにより採 取したものを用いるとよい。角層チェッカ一は角層の不全角化度や細胞面積を測定 し、肌荒れの程度や角層のターンオーバー速度を評価するための角層サンプルを採 取する際に従来から使用されている (化粧品の有用性'評価技術の進歩と将来展望 , 日本化粧品技術者会，薬事日報社， ρ95- 96) 0カウンセリング店舗や自宅で簡 単に安全に角層サンプルを採取でき、非浸襲で角層からタンパク質を得る方法として 非常に有用である。
皮膚の老化度とは、加齢により生じたしわ、たるみなどの皮膚の老化現象の程度を 言う。しわ、たるみは加齢により進行することが明らかである。また、加齢にカ卩えて紫 外線曝露によりしわ、たるみ、くすみ、しみの進行度は増す。しわ、たるみは公知の方 法により測定できる (ィヒ粧品の有用性'評価技術の進歩と将来展望， 日本化粧品技 術者会，薬事日報社， 154- 158, 169 - 175, 179- 182, 187- 190, 2001)。 また、加齢に伴いしわやたるみが形成されてくると、皮膚の内部では表皮細胞およ び皮膚線維芽細胞などの皮膚の細胞の増殖能が低下することが知られて 、る。よつ て皮膚の細胞の増殖能の低下を指標に皮膚の老化度を判定することが出来る。 1例 として、繰り返し継代して細胞老化させた表皮角化細胞および皮膚線維芽細胞では senescence― associated β— galactosidase (SA— β—Gal)力 S増カロし、 SA— β Galの増加はヒトの皮膚老化と相関することが報告されている（Proc. Natl. Ac ad. Sci. USA. , 92, 9363— 9367, 1995)。よって、本試験【こお!ヽて、繰り返し ϋ 代して細胞老化させた表皮角化細胞を用いて見出した各種タンパク質はヒトの皮膚 老化マーカーとして利用できる可能性が高い。
[0042] 本発明の 1例として、皮膚の老化度は、以下のような基準で判定することができる。
実施例 2に示す Keratin 7、 Keratin 15および Kallikrein 7の分析例のように、 各年代のボランティア力 皮膚検体を入手し、特定のマーカータンパク質の発現量を 測定し、それらの発現量と皮膚老化の指標として知られて!/、る皮膚弾力性やしわの 程度の標準曲線を作成する。標準検体と分析検体の発現量の比較から、分析検体 の皮膚老化度を判定する。 β 2—microglobulinについては、各年代のボランティア から皮膚検体を入手し、切断型と非切断型の比率の平均値を算出しておき、その発 現量と皮膚老化の指標として知られている皮膚弾力性やしわの程度の標準曲線を作 成する。標準検体と分析検体の発現量の比較から、分析検体の皮膚老化度を判定 する。
[0043] 本発明は、皮膚の老化度を判定するためのキットも提供する。
1例として、本発明のキットは、皮膚の老化により発現が変化する分泌タンパク質及 び Z又は細胞内タンパク質を特異的に認識できる抗体を含む。分泌タンパク質及び /又は細胞内タンパク質は、 Kallikrein 7、 PAI— 1、 uPA、 Matriptase、 GRP 9 4、HSP 70、HSP 90、 Galectin—1、 Galectin—3、 Galectin—7、 IGFBP— 3 、 Enolase— 1、 Annexin II、 Ezrin、 Radixin、 Moesin、 Gelsolin、 Keratin 7、 Keratin 10、 Keratin 13、 Keratin 14、 Keratin 15、 Keratin 16、 Keratin 18、 Keratin 19、 Keratin 20および j8 2— microglobulinからなる群より選択す ることが好ましい。キットには、さらに、皮膚組織を採取するためのテープ、テープ上 のタンパク質を免疫化学的に検出するための試薬一式、取扱説明書などが含まれて もよい。取扱説明書には、キットの使用方法の他、皮膚の老化度の判定基準なども記 載しておくとよい。 [0044] 別の 1例として、本発明のキットは、皮膚の老化により発現が変化する分泌タンパク 質及び Z又は細胞内タンパク質の mRNAと特異的にノ、イブリダィズできる核酸プロ ーブを含む。分泌タンパク質及び Z又は細胞内タンパク質は、 Kallikrein 7、 PAI — 1、 uPA、 Matriptase、 GRP 94、 HSP 70、 HSP 90、 Galectin— 1、 Galect in— 3、 Galectin— 7、 IGFBP— 3、 Enolase— 1、 Annexin II、 Ezrin、 Radixin、 Moesin、 Gelsolin、 Keratin 7、 Keratin 10、 Keratin 13、 Keratin 14、 Ker atin 15、 Keratin 16、 Keratin 18、 Keratin 19、 Keratin 20および j8 2— m icroglobulin力もなる群より選択することが好ましい。キットには、さらに、皮膚組織を 採取するためのテープ、テープ上の皮膚組織から RNAを抽出するための試薬類、 R NAをノーザンプロット法で分析するための試薬類、取扱説明書などが含まれてもよ い。取扱説明書には、キットの使用方法の他、皮膚の老化度の判定基準なども記載 しておくとよい。
[0045] さらに別の 1例として、本発明のキットは、皮膚の老化により発現が変化する分泌タ ンパク質及び Z又は細胞内タンパク質の mRNAと特異的にハイブリダィズできる核 酸プライマー及び前記 mRNAを铸型として合成される cDNAと特異的にハイブリダ ィズできる核酸プライマーカもなる 1対の核酸プライマーを含む。分泌タンパク質及び /又は細胞内タンパク質は、 Kallikrein 7、 PAI— 1、 uPA、 Matriptase、 GRP 9 4、 HSP 70、 HSP 90、 Galectin— 1、 Galectin— 3、 Galectin— 7、 IGFBP— 3 、 Enolase— 1、 Annexin II、 Ezrin、 Radixin、 Moesin、 Gelsolin、 Keratin 7、 Keratin 10、 Keratin 13、 Keratin 14、 Keratin 15、 Keratin 16、 Keratin 18、 Keratin 19、 Keratin 20および j8 2— microglobulinからなる群より選択す ることが好ましい。キットには、さらに、皮膚組織を採取するためのテープ、テープ上 の皮膚組織から RNAを抽出するための試薬類、 RNAを RT—PCR法で分析するた めの試薬類、取扱説明書などが含まれるとよい。取扱説明書には、キットの使用方法 の他、皮膚の老化度の判定基準なども記載しておくとよい。
[0046] 本発明は、皮膚の老化防止に効果のある物質を同定する方法も提供する。この方 法は、以下の工程：
(a)被験物質と皮膚細胞及び Z又は皮膚組織を接触させる工程、 (b)工程 (a)で被験物質と接触させた皮膚細胞及び Z又は皮膚組織を所定時間培 養する工程、
(c)工程 (b)で培養した皮膚細胞及び,又は皮膚組織における分泌タンパク質及び Z又は細胞内タンパク質の発現を測定する工程であって、前記分泌タンパク質及び Z又は細胞内タンパク質は皮膚の老化により発現が変化するものである前記工程、 及び
(d)工程 (c)で測定した分泌タンパク質及び Z又は細胞内タンパク質の発現を対照 の皮膚細胞及び Z又は皮膚組織における分泌タンパク質及び Z又は細胞内タンパ ク質の発現と比較することにより、皮膚細胞及び Z又は皮膚組織における分泌タンパ ク質及び Z又は細胞内タンパク質の発現に対する被験物質の効果を評価する工程 を含む。
[0047] 被験物質は、 V、かなる物質であってもよぐタンパク質、ペプチド、ビタミン、ホルモ ン、多糖、オリゴ糖、単糖、低分子化合物、核酸 (DNA、 RNA、オリゴヌクレオチド、 モノヌクレオチド等)、脂質、上記以外の天然化合物、合成化合物、それらの混合物 などを挙げることができる。
[0048] 皮膚細胞及び皮膚組織については、上記の通りである。
被験物質と皮膚細胞及び Z又は皮膚組織との接触は、 、かなる方法によってもよく 、例えば、被験物質を皮膚細胞及び Z又は皮膚組織の培養液に添加する方法、被 験物質を塗布又は固定した培養容器又は培養シート上で皮膚細胞及び Z又は皮膚 組織を培養する方法などを挙げることができる。また、ヒト又はヒト以外の哺乳動物 (例 えば、マウス、ラット、モルモット、ゥサギ、ブタなど）などの生体を用いて、被験物質を 直接皮膚に塗布する方法、被験物質を経口投与する方法でもよ ヽ。
皮膚細胞及び Z又は皮膚組織の培養時間は特に限定されず、皮膚細胞及び Z又 は皮膚組織における分泌タンパク質及び Z又は細胞内タンパク質の発現及び Z又 はその遺伝子発現に対する被験物質の効果の有無が確認できる程度の時間であれ ばよい。例えば、皮膚細胞としてヒト正常表皮角化細胞を用いた場合には、 12〜48 時間が適当であり、 12〜24時間が好ましい。ここで、「皮膚細胞及び Z又は皮膚組 織を培養する」とは、皮膚細胞及び Z又は皮膚組織を生育'増殖させることを言い、 これには、単離した皮膚細胞及び Z又は皮膚組織を生育 ·増殖させることの他、皮膚 細胞や皮膚組織を有する生体自体を生存させること、飼育すること、養うことなども含 まれる。
比較の対照となる皮膚細胞及び Z又は皮膚組織は、被験物質を接触させる前の皮 膚細胞及び Z又は皮膚組織であってもよ 、し、被験物質を接触させな!、こと以外は 同様の処理を行った皮膚細胞及び Z又は皮膚組織であってもよい。
[0049] 分泌タンパク質及び Z又は細胞内タンパク質は、 Kallikrein 7、PAI— l、uPA、 Matriptase、 GRP 94、 HSP 70、 HSP 90、 Galectin— 1、 Galectin—3、 Gal ectin— 7、 IGFBP— 3、 Enolase— 1、 Annexin II、 Ezrin、 Radixin、 Moesin、 G elsolin、 Keratin 7、 Keratin 10、 Keratin 13、 Keratin 14、 Keratin 15、 K eratin 16、 Keratin 18、 Keratin 19、 Keratin 20および j8 2— microglobuli nからなる群より選択されることが好ま 、。
[0050] 本発明の 1例として、表皮角化細胞の老化に伴い GRP 94、 HSP 70、 HSP 90 、 Galectin— 1、 Galectin— 3、 Galectin— 7、 IGFBP— 3、 Enolase— 1、 Annexi n II、 Ezrin、 Radixin、 Moesin、 Gelsolin、 Keratin 10、 Keratin 13、 Keratin 14、 Keratin 15、 Keratin 16、 Keratin 18、 Keratin 19および Keratin 2 oの発現量は増加して 、ることから、被験物質を接触させた皮膚細胞及び Z又は皮 膚組織にお!、て、これらのマーカータンパク質の発現量が対照と比較して減少して おり、被験物質力 sこれらのマーカータンパク質の発現を減少させる効果がある評価で きた場合には、この被験物質は、皮膚の老化防止に効果がある物質と同定すること ができる。
[0051] また、本発明の別の例として、表皮角化細胞の老化に伴い、 Kallikrein 7、 PAI— 1、 uPA、 Matriptase, Keratin 7の発現量は減少していることから、被験物質を接 触させた皮膚細胞及び Z又は皮膚組織にぉ 、て、これらのマーカータンパク質の発 現量が対照と比較して増加しており、被験物質がこれらのマーカータンパク質の発現 を増加させる効果があると評価できた場合には、この被験物質は、皮膚の老化防止 に効果がある物質と同定することができる。
[0052] 本発明のさらに別の例として、表皮角化細胞の老化に伴い、 β 2 -microglobulin の切断型に対する非切断型の比率が増加していることから、被験物質を接触させた 皮膚細胞及び Z又は皮膚組織において、 β 2— microglobulinの切断型に対する 非切断型の比率が対照と比較して減少しており、被験物質が j8 2 -microglobulin の切断型に対する非切断型の比率を減少させる効果があると評価できた場合には、 この被験物質は、皮膚の老化防止に効果がある物質と同定することができる。
実施例
[0053] 以下、実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に 限定されるものではない。
〔実施例 1〕
1.細胞培養
正常表皮角化細胞（NHEK, Cambrex Corporation)を無血清基礎培地（KB M, Cambrex Corporation)に添加因子（0. lng/ml EGF、 0. 03mg/ml b ovine pituitary meaium、 5 μ / ml msulin、 0. 5 ^ / ml hydrocortisone 、 GA— 1000)を添カ卩した培地 KGM ( + )を使用して、 37°C、 5%COインキュベー
2
タ内で培養した。培養液上清（CM； Conditioned medium)および細胞抽出物（C L ;Cell lysates)の回収用には、細胞を 5 X 105個/ 150mmディッシュに播き、 2日 おきに培地交換し、飽和するまで培養した。継代用には、細胞を 1 X 105個 Z60mm ディッシュに播き、 2日おきに培地交換し、 80%飽和になった段階で継代した。 NHE Kはおおよそ 5代目まで継代培養でき、今回の実験においては 5代目を老化した細 胞として使用した。
[0054] 2.正常ヒト表皮角化細胞 (NHEK)の各継代数における SA— β -Galの測定
NHEKの各継代数における SA— j8 - Galを Senescent Cells Staining Kit ( Sigma Corporation)を用いて測定した。継代用とは別に細胞を 1 X 105個 Z60m mディッシュで 3ディッシュに播き、 80%飽和になった段階で細胞を 2%ホルムアルデ ヒド Z0. 2%ダルタルアルデヒド水溶液中で、室温で 7分間固定した。さら〖こ 1 X PBS (―)で 3回洗浄後、 Staining Solutionをカ卩えて 37°C、 over nightで染色した。 3 ディッシュ各々について、細胞 100個当たりの SA— β -Gal染色細胞数を計測した。 [0055] 3. CMおよび CLの調製
3 - 1. CMの調製
NHEKが飽和したディッシュを KBMで 2回洗い、 KBMに交換して 1日培養し、添 加因子を完全に取り除いた。さらに KBMに交換して 2日後に CMを回収した。回収し た CMは 130 X gで 10分間遠心して浮遊細胞を除いた後、 10, 000 X gで 30分間遠 心し、その上清を回収した。この CMに硫酸アンモ-ゥム（Wako Pure Chemical
Industries, Ltd. )を 80%飽和になるようにカ卩えて、撹拌しながら完全に溶解さ せて 4°Cでー晚おいた。その後、 25, 000 X gで 30分遠心してタンパク質を沈澱させ た。沈殿物を 20mM Tris— HCl (pH7. 4)で 500倍濃縮になるように溶解し、 CM を濃縮した。さらに、この濃縮した CMを 20mM Tris— HCl (pH7. 4)で透析した。
DC protein assay kit (Bio— Rad Loooratories Inc.ノ 用 ヽて Bradford 法によりタンパク質を定量し、ウェスタンブロッテイング用のサンプルとして使用した。 二次元電気泳動用には、調整した CMを凍結乾燥し、乾燥粉末を最終的に 500倍 濃縮になるように二次元電気泳動用サンプル調製液 {6. 5M urea (lCN Biomedi cals, Inc. )、 1. 5M thiourea (Sigma Corporation)、 0. 15% SDS (Wako Pure Chemical Industries, Ltd. ) , 0. 85% Triton X— 100 (Wako Pur e Chemical Industries, Ltd. )、 0. 4%CHAPS (Dojindo Loboratories)、 2. 5mM tributyl phosphine (Wako Pure Chemical Industries, Ltd. ) } に溶解し、ドット 'プロット法によりタンパク質を定量した。
3 - 2. CLの調整
CMを回収した後のディッシュを PBS (—）で 3回洗浄後、— 30°Cで凍結し、細胞膜 を破壊した。その後、セルスクレーパー（Sumitomo Bakelite Co. , Ltd. )を用 いて細胞を回収した後、 30秒間超音波処理した。 1% Triton X— 100を加えた後 、 4°Cで 30分間放置した。その後、 15, 000 X g, 30分間遠心し、不溶物を取り除き 、上清をサンプルとした。ドット 'プロット法によりタンパク質を定量し、ウェスタンブロッ ティング用のサンプルとして使用した。
[0056] 4.タンパク質の二次元電気泳動（2— DE)解析
4- 1. 1次元目等電点電気泳動 60 ;z gのタンパク質をゲル膨潤液 M urea (Wako Pure Chemical Industr ies, Ltd. )、 2M tniourea (Wako Pure Chemical Industries, Ltd. )、 0. 5% ampholytes (pH 3. 5~10) (Amersham Biosciences)、 0. 0025% orange G (Wako Pure Chemical Industries, Ltd. )、 2. 5mM tributyl phosphine (Wako Pure Chemical Industries, Ltd. )、 1% Triton X— 1 00}に全量力 40 1になるように混合した後、 Immobiline Dry- Strip gel (18c m、 pH3— 10、 NL) (Amersham Biosciences)〖こ添加し、 20°Cでー晚膨潤させ た。電気泳動装置（Anatech Corporation)を用いて、 1次元目は 20°Cで 500V— 2時間、 700V— 1時間、 1000V— 1時間、 1500V— 1時間、 2000V— 1時間、 300 0V— 1時間、 3500V— 10時間のプログラムで等電点電気泳動を行った。泳動後、 ゲルを SDS平衡化バッファ一 . 8M urea, 0. 06M thiourea, 0. 5% dithio thereitol (DTT, Wako Pure Chemical Industries, Ltd. )、 25% glycero l (Wako Pure Chemical Industries, Ltd. ) , 0. 0025% BPB (Wako Pur e Chemical Industries, Ltd. ) }に浸して室温で 1時間平衡化した。
4- 2. 2次元目 SDS— PAGE
2次元目は Tris— Tricine系のバッファー {陰極バッファー： 0. 05M Tris、 0. 05 M Tricine (Bio-Rad Loboratories Inc. )、 0. 05% SDS、陽極バッファー： 1M Tris— HCl (pH8. 8) }を用いて 18cm X 18cmの 7. 5%アクリルアミドゲルによ り SDS— PAGEを行った。
4- 3.電気泳動ブロット法
SDS— PAGE終了後のゲルを、セミドライタイプ転写装置（Nihon Eido Co. , Ltd. )を用いて、 20cm X 20cmの PVDF膜 {ProBlot Membranes (Applied Biosystems) }に 150mAの定電流で 2時間転写した。転写バッファ一は陽極 1液： 0 . 3M Tris— HCl(pH10. 4)、 20% メタノール（Wako Pure Chemical Indus tries, Ltd. ) ,陽極 2液： 25mM Tris— HCl(pH10. 4)、 20% メタノール、陰 極液： 25mM Tris— HCl (pH10. 4)、 20% メタノール、 40mM 6— amino he xanoic acid (Wako Pure Chemical Industries, Ltd. )を用 ヽた。転写後【ま TTBSバッファー {20mM Tris— HCl(pH7. 5) (Bio-Rad Loboratories Inc . )、 500mM NaCKWako Pure Chemical Industries, Ltd. ) , 0. 3% T ween— 20 (Bio— Rad Loboratories Inc. )で 20分間、 3回洗浄した後、純水で 2分間、 3回洗浄した。次に PVDF膜をビニール膜にシーリングして 50mlの金コロイ ド溶液 {Colloidal Gold Total Protein Staine (Bio— Rad Loboratories In c. ) }に浸し、 1〜2時間振盪させてタンパク質を染色した。その後、金コロイド溶液を 除き、純水で 1分間、 5回洗浄した後、乾燥させた。
5.タンパク質の同定
5 - 1. PVDF膜に転写されたタンパク質の還元 S—アルキル化とプロテアーゼ消化
PVDF膜に転写されたタンパク質のスポットを切り取り、チューブに入れて還元用バ ッファー {8M guanidine― HC1 (pH8. 5) (Wako Pure Chemical Industries , Ltd. )、0. 5M Trisbase (Wako Pure Chemical Industries, Ltd. )、 0 . 3% EDTA- 2Na (Wako Pure Chemical Industries, Ltd. )、 5% ァセ トニトリノレ（Wako Pure Chemical Industries, Ltd. )を 100〜300 1力卩えた。 還元用バッファーに溶解した DTTlmgを加えてチューブ内を窒素ガスに置換して室 温、 1時間静置してタンパク質を還元した。その後、 1M NaCKWako Pure Che mical Industries, Ltd. )に溶解したモノョード酢酸（Wako Pure Chemical Industries, Ltd. ) 3mgをカ卩えて遮光状態で 15〜20分間撹拌を続けて S—カル ボキシメチルイ匕を行った。 PVDF膜を取り出し純水で 5分間撹拌洗浄後、 2%ァセト 二トリル（Wako Pure Chemical Industries, Ltd. )中で同様に撹拌した。 PV DF膜を取り出し Lys— C消化用バッファー { 70% ァセトニトリル Z20mM Tris— HCl (pH9. 0) }を入れたチューブに移し 2〜3回すすいだ後、 Lys— C消化用バッフ ァ一に浸して 1時間プロテアーゼ消化した。
5 - 2.質量分析とペプチドマスフィンガープリンティング
プロテアーゼ消化した溶液を蒸留水で 7倍希釈してァセトニトリル濃度を 10%にし た。前処理として ZipTipcl8ピペットチップ（Millipore Corporation)の充填剤部 分を活性化するために 50% ァセトニトリル Z0. 1% trifluoro- acetic acid (TF A, Wako Pure Chemical Industries, Ltd. )で数回、 2%ァセトニトリル /0. 1% TFAで数回吸引、排出を繰り返した。次に活性ィ匕した ZipTipcl8ピペットチッ プでプロテアーゼ消化液を数回吸引、排出して断片化ペプチドを充填部分に吸着さ せた。さらに 2%ァセトニトリル ZO. 1% TFAを数回吸引、排出して塩類を除いた。
50%ァセトニトリル ZO. 1%TFAに溶解した飽和マトリックス溶液 0. 5〜1. 0 1を吸 引して 10秒間程置いた後、質量分析計の付属のターゲットプローブに滴下した。サ ンプルを乾固させ、質量分析計 (MALDI— TOF MS)で測定した。得られた質量 値をもとにデータベース（MS— Fit, Mascot Search)を用いてタンパク質の同定 を行った。
[0059] 6. ウェスタンブロット法
ウェスタンブロット用のサンプルを用いて Laemmliの Tris— Glycin系により SDS— PAGEを行った。 SDS— PAGE後、ゲル中のタンパク質を lcm2あたり 0. 8mAの定 電流で PVDF膜（Millipore Corporation)に転写後、 5% スキムミルク ZPBS (— )に浸して、 4°C、 overnightでブロッキングした。 PVDF膜を 0. 1% Tween20/P BS (—）で 3回洗浄した後、 1次抗体溶液に浸して室温で 1時間振盪した。
[0060] 使用した 1次抗体の種類と希釈率は次の通りである： rabbit anti—maspin poly clonal anti DO ay (¾anta し ruz Biotechnology) (1000倍希釈)、 mouse anti ― cystatin A monoclonal antibody (Sigma) (1000倍希釈)、 rabbit anti— kallikrein 7 polyclonal antibody (Santa Cruz Biotechnology) (1000倍 希釈）、 sheep anti— PAI— 1 polyclonal antibody (Biopool) (1000倍希釈） 、 mouse atni— PAI— 2 monoclonal antibody (American Diagnostics) " 000倍希釈)、 rabbit anti— uPA polyclonal antibody (Santa Cruz Biotec hnology) (1000倍希釈)、 rabbit anti― matriptase polyclonal antibody (Ca Ibiochem) (1000倍希釈）、 rat anti— GRP94 monoclonal antibody (Stress geen) (1000倍希釈）、 mouse anti— HSP70 monoclonal antibody (Santa Cruz Biotechnology) (1000倍希釈)、 mouse anti— HSP90 monoclonal a ntibody (Santa Cruz Biotechnology) (1000倍希釈)、 rabbit anti— enola se— 1 polyclonal antibody (Santa Cruz Biotechnology) (1000倍希釈) 、 rabbit anti— annexin II polyclonal antibody (Santa Cruz Biotechnol ogy) (1000倍希釈)、 rabbit anti— ezrin/ radixin/ moesin polyclonal anti body (Chemicon) (1000倍希釈)、 mouse anti— gelsolin monoclonal antib ody (Sigma Corporation) (1000倍希釈)、 mouse anti― galectin― 1 mono clonal antibody (R&D Systems) (1000倍希釈)、 mouse anti— galectin— 3 monoclonal antibody (Novocastra Laboratories) (1000† ^希釈)、 mou se anti― galectin― 7 monoclonal antibody (R&D Systems) (1000倍希 釈)、 goat anti― IGFBP― 3 polyclonal antibody (Santa Cruz Biotechno logy) (1000倍布釈)、 rabbit anti― matriptase polyclonal antibody (Calbi ochem) (1000† ^希釈)、 mouse anti— β 2— microglobulin monoclonal ant ibody (Sigma) (1000倍希釈)、 mouse anti— keratin 3 monoclonal antib od y (Cymbus Biotechnology) "000倍希釈)、 mouse anti— keratin 5 monocl onal antibody (Chemicon International Inc. ) (1000倍希积)、 mouse ant i— keratin 7 monoclonal antibody (Chemicon) 000倍希釈)、 mouse anti
— keratin 8 monoclonal antibody (Chemicon) (1000倍希釈)、 mouse anti
— keratin 10 monoclonal antibody (Chemicon) (1000倍希釈)、 mouse ant i— keratin 13 monoclonal antibody (Cymbus Biotechnology) (500倍希釈 )、 mouse anti― keratin 14 monoclonal antibody (Cymbus Biotechnolog y) (500倍希釈)、 mouse anti― keratin 15 monoclonal antibody (Cymbus Biotechnology) (500倍希釈)、 mouse anti― keratin 16 monoclonal antib o dy (Cymbus Biotechnology) (500倍希积)、 mouse anti― keratin 17 mono clonal antibody (Chemicon) (1000倍希釈)、 mouse anti— keratin 18 mon oclonal antibody (Chemicon) (1000倍希釈)、 mouse anti― keratin 19 mo noclonal antibody (Cymbus Biotechnology社) (500倍希釈)、 mouse anti — keratin20 monoclonal antibody (Cymbus Biotechnology) (500倍希积) 1次饥体として、 sheep anti— PAI— 1 polyclonal antibody、 mouse atni— PAI— 2 monoclonal antibody rabbit anti— uPA polyclonal antibody r abbit anti― matriptase polyclonal antibodyを使用した場合は、 2次抗体とし て biotinylated anti -goat IgG (Vector Laboratories) (1000倍希釈）また は biotinylated anti -sheep IgG (Vector Laboratories) (1000倍希釈）を用 いた。 2次抗体溶液に浸して室温で 1時間振盪した。次に、 alkaline phosphatase -conjugated avidin D (Vector Laboratories) (1000倍希釈）溶液に浸して 室温で 1時間反応させた。次に、 0. 6mg/ml 5 - bromo - 4 - chloro - 3 - indol ylphosphate (Vector Laboratories)、 1. 2mgz ml nitrobluetetrazonum (V ector Laboratories)、 0. 1M Tris— HCl (pH9. 5)、5mM MgCl (Wako ch
2
emicals, Japan)て発色させた。
[0062] 上記以外の 1次抗体を使用した場合は、 2次抗体として Horseradish peroxidase labeled ami— mouse IgG (Amersham Bioscienceバ 5000倍希釈)、 Hor seradish peroxidase labeled anti— rabbit Ig (Amersham Bioscience) (5000倍希釈)、 Horseradish peroxidase labeled anti— rat IgG (Amersh am Bioscience) (5000倍希釈)または Horseradish peroxidase labeled anti -goat IgG (Santa Cruz) (5000倍希釈）を使用した。次に Enhanced chemi luminescence (ECL)キット (Amersham Bioscience; 用 ヽて検出し 7こ。
[0063] 7.皮膚老化マーカーとしての判定
ウェスタンブロット法により検出したタンパク質の発現量を NIH imageにより数値ィ匕 し、 5代目のタンパク質の発現量を 2代目のタンパク質の発現量で割った値を算出し た。算出した値が 2. 0以上の場合は表皮角化細胞の老化に伴い発現量が有意に増 カロしたと判定し、 0. 5未満の場合は表皮角化細胞の老化に伴い発現量が有意に減 少したと判定した。一方、算出した値が 0. 5以上 2. 0未満の場合は表皮角化細胞の 老化に伴う発現変化はないと判定した。
[0064] 薩菓
1.表皮角化細胞の老化に伴う形態変化
ヒト正常細胞は一定回数分裂すると増殖が停止する。この現象は細胞老化と呼ば れるが、この分裂回数は細胞種によって異なる。今回実験で用いたヒト表皮角化細胞 は繰り返し継代することによりおおよそ 5代目で増殖が停止する。図 1 (a)では 150m mディッシュが飽和になるまでの日数を各継代数でプロットしたものを示している。デ イツシュが飽和になるまでの日数が 1代目では 6日間かかったのに対して 5代目では 2 8日間と 1代目〜5代目まで指数関数的に増殖速度が遅くなつている。さらに 6代目 では完全に増殖が停止した。また、細胞の形態も 2代目に比べて 5代目では細胞の 大きさが 2倍程大きくなり、細胞老化で観察される扁平肥大化の形態を示した {図 1 (b ) }。
また、繰り返し継代した表皮角化細胞の増殖が低下する原因として、細胞老化ある いは最終分ィ匕の可能性がある。そこで、実際に表皮角化細胞が老化しているかを判 別するために、最終分化では発現せず、細胞老化でのみ発現することが知られてお り、表皮角化細胞の老化と皮膚糸且織での老化のマーカーとして同定された SA— β — Galの活性を調べた（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92, 9363— 9367, 1995 ) o 2代目では SA— β Galを示すような青く染色された細胞は見られな力つた力 5 代目では青く染色された細胞が約半数まで増えた（図 2)。
以上の結果から 2代目の細胞を若 、細胞、 5代目の細胞を老化細胞として用いて、 細胞老化マーカーの探索を行った。
[0065] 2.表皮角化細胞の老化に伴って変化する分泌タンパク質の二次元電気泳動による 解析
2〜5代目の CMを調製し、 2次元電気泳動により発現が変化するタンパク質を解析 した（図 3)。若 、細胞（2代目）と老化した細胞（5代目）の細胞培養上清液 (CM)の スポットを比較したところ、細胞老化に伴って発現が減少したタンパク質が 19個（表 1 )、細胞老化に伴って発現が増カロしたタンパク質が 49個同定された (表 2)。同定され たタンパク質には Maspin、 Cystatin Aおよび HSP 27など既知の皮膚老化マー カーが含まれており、本試験で実施した 2次元電気泳動による解析は皮膚老化に伴 つて変化するタンパク質を同定するのに適切な方法であると考えられた。本試験では 超微量タンパク質（1 femto— mol以下）の同定を可能とする技術を用いたことから 、既知の皮膚老化マーカータンパク質以外にも新規の皮膚老化マーカータンパク質 が同定された。表皮角化細胞の老化に伴って発現が減少した主な分泌タンパク質と しては j8— 2 microglobulin, PAI—1および Kallikrein 7等が同定された。一方 、表皮角化細胞の老化に伴って発現が増加した分泌タンパク質としては Moesin、 K eratin 1および Keratin 9等が同定された。
[0066] 2次元電気泳動解析により表皮角化細胞の老化に伴って発現が減少したタンパク 質を表 1に示す。
[表 1]
ス^ 卜 S号 W(kDa /pl 同定された ンパゥ E
7 15/8-0 Pr egnancy-spec if i c beta- 1 g lycopr o e in 2
9 13 S.2 r of i I i n *
12,22,221 C stat in
21，23，213，220， 222 12/7.2 (i -2 mi crog lobu I i n *
206, 207 P lasminogen act i yator i nh i b ito r-1 CPfll -
20S 41/7.5 Eno I ase- 1
209 39/7.55 flspar ate tr ansam i nase *
210, 211 Squamous cel l car ci noma ant ige n 1 (SCCfl 1)
212 30/6.7 Phosphog Ivcer ate mutase 1
213 28/6.8 Per ir edo to« i n 6 *
21d 29/e.e I sopenteny I -d i phosphate- isomer ase 1 Cl PP *
217 ER- I oca I ized ype I transmembr a ne adaptor precur s> or *
21S 25/5.1 G I utath i one Ξ-tr ansfer ase
223 33 S.0 I ntegr i n- 1 i nked kinsse し f *
226 Stratum cor neum chvmo r ypt i c enzyrrte pr ote in ( a I I ikr ein 7) *
227 Rho GDP d i ssoc iat ion inhibitor (Rho-GDI
22S 14 7.3 Thr ombospond i n 1 *
229 14/5.2 Γ ce I I ant i gen r eceptor a *
230 12/5.0 Cvstat i n A
*;ホ^^によリ¾皮角化 昀の老化マ一 ft—として新たに同定された ソパゥ H
2次元電気泳動解析により表皮角化細胞の老化に伴って発現が増加したタンパク 質を表 2に示す。
[表 2]
スポ、リト番号 Mr kDa/pI 定 れ ンパゥ晳
18 10/7. .4 Phosphoglycer te mutase 1
24 13/5. .7 Fatty aci d bi nding protein 5 (FAEP 5)
SI 14/4. .1 Actin re 1 ted protein %f% complex su unit 5
11 2S/8. .e Pro tea some subuni t b 5
It 24/8. .4 Peroxiredoxin 1
24/8. .2 Pro tea some subuni t M = se 29/8. .e Pro tea some subuni t a 7
.0 Mi tochondrial inal tate dehyiirogenase
2B/7. .3 Triosephosphate isom erase (Tim)
51 ΙΙΠ . .1 Manganese superoxide dismutase
62 23/5. .e Pro tea some subuni t b3
64,68 26/5. .s Heat shock protein 27kDa (HSP27)
67 29/4. .8 Pro tea some subuni t b 7
80 .1 Pro tea some subuni t a6 木
86 so/e. .s Purine nucleoside phosphor lase
90 32/5. .7 Del ta3， 5 - del taS，4 - dienoyl - CoA isom erase
94 S4/4. .5 L-lactate dehyiirogenase E
100 20/3. .0 Similar to tubul in b5 木
105 40/4. .8 M spin
125,128,129,241 S4/8. .2 Annex in ΑΞ
136 ss/e. .S Annex in 1
140 S4/6. .8 C toso lie m 1 ate dehydrogenase
143 44/8. .3 Phosphoglycer te kinase 1
145 41/8. .S Fr JC to se - b i sp hos pha t e aldolase A
152 45/5. .5 Adenosyl hornoo s teinase
160 53/4. .8 Cy toso lie nonspecific d ipep tidase
iei 48/4. .S Actin-rel ated protein %
50/4. .2 Glutathione synthetase
168 65/7. .e Transketolase =
172 59/7. .5 Pyruvate kinase 7 Ml isozyme
176,178 54/7. .5 UTP - glucose - 1 -phosphate uridyl transferase %
177 5B/7. .4 Adenylyl eye 1 se -ass oc i a teii protein 1 (CAP 1 ) 木
183 3B/6. .8 Elongation factor 2
184 7S/5. .9 oesin
185 76/5. .8 Esrin
186 eo/s. .e Ubiqui tin carboxyl -term inal hydrol ase 14
187 .4 Keratin 3
70/S. .e Heat shock 漏 a protein (H3P 70)
189 85/4. .8 Gel sol in
191 55/S. .1 Tubulin a β
193 77/3. .6 Ac lamino -acid-releasing ensyme 木
195 35/3. .4 Transi tional endoplasmic reticulum ATPase
196 100/4 .5 Actinin , al =
197 110/S ■ e Major vau 1 t protein
199 115/4 .2 Vi ncul in i so form VCL
200,201 6B/5. .2 Keratin 1 木
204 150/3 .S Lenkotriene A4 hydrolase
239 37/5. .2 G03 ac lai c ri bosormal protein P0
242 28/S. .8 Caspase 14
*； 試^によ 表皮角化^胞 Φ老化マ—お一として^たに同定されたタンパク背
3.表皮角化細胞の老化に伴って発現が変化する分泌タンパク質および細胞内タン ノ ク質のウェスタンブロッテイングによる解析
上記のタンパク質の老化に伴う発現変化をさらに確認するために、それぞれの抗体 を用いてウェスタンブロッテイングを行った。 2次元電気泳動による分析ではタンパク 質量をそろえて比較解析した。しかし、表皮角化細胞は老化とともに形態も変化し扁 平肥大化することから、同じ飽和状態でも細胞数が異なってくる。実際に細胞 1個当 たりの分泌タンパク質量を計算すると細胞培養上清液 (CM)、細胞溶解液 (CL)、細 胞外マトリックス (ECM)のどのサンプルにおいても表皮角化細胞の老化に伴ってタ ンパク質量が増加することがわ力つた。そこで、細胞数をあわせたものとタンパク質量 をあわせたものの 2つのサンプルについて、ウェスタンブロッテイングにより各タンパク 質の発現量の変化を調べた。細胞数をあわせたものとタンパク質量をあわせたもので 、どちらが表皮角化細胞の老化を調べる上で適しているかを検証するために、皮膚 老化に伴ってダメージが蓄積する皮膚基底膜の主要構成成分であり、基底膜ケアの 要な成分である Laminin 5 (Laminin a 3^ Laminin j8 3、 Laminin y 2(7)3 量体） {J. Soc. Cosmet. Chem. Jpn. ,総説, 35 ( 1) , 1— 7,2001 }および皮膚老化 に伴って発現が低下することが知られている Fibronectin{Ann Pathol. ,4 (3) , 1 85 - 94, 1984}の発現変化を調べた。その結果、 CMにおける Laminin 5の発現 は、細胞数であわせたものでは変化がないが、タンパク質量であわせたものでは発 現量が減少した（図 4)。同様に、 CMにおける Fibronectinの発現は、細胞数であわ せたものでは増加した力 タンパク質量であわせたものでは発現量が減少した。以上 の結果から、タンパク質量をあわせたもので発現変化を解析する方が適切であること が半 lj明した。
ここでは、各種抗体を用いたウェスタンブロッテイングの結果として細胞数をあわせ たもの、タンパク質量をあわせたものの両方を示している力 前述の結果力 タンパク 質量をあわせたものの結果により表皮角化細胞の老化との相関の有無を判断した。 まず、プロテアーゼおよびプロテアーゼインヒビターでは、セリンプロテアーゼインヒ ビターである Maspin、 PAI— 2、システィンプロテアーゼインヒビターである Cystatin
Aが老化に伴って発現量が増加した {図 5 (a) (b) }。一方、セリンプロテアーゼであ る Kallikrein 7、 uPA、膜結合型セリンプロテアーゼである Matriptase、セリンプロ テアーゼインヒビターである PAI—1が老化に伴って発現量が減少した。また、 β 2— microglobulinは酸性プロテアーゼにより切断を受けることが知られて!/、るが、老化 に伴って切断型（13kDa)が減少し、非切断型（14kDa)が増加することがゎカゝつた { 図 5 (a) }。
細胞内タンパク質である熱ショックタンパク質の一種である HSP 70、 HSP 90、 G RP 94 (GRP 94のみシグナルペプチドを持つ）は老化に伴って CMへの分泌が多 くなる力 CLでの発現量は変化しな力つた（図 6)。
細胞内の解糖系酵素である Enolase— 1、細胞膜のリン脂質と結合する Annexin II、細胞骨格系タンパク質である EzrinZMoesinZRadixinは老化に伴って CMへ の分泌量が増加することがわ力つた（図 7)。細胞骨格系タンパク質である Gelsolinは CMへの分泌量は変化しなかった力 CLでの発現量は増加した（図 7)。
レクチンファミリーの 1つである Galectin— 1、 Galectin— 3、 Galectin— 7および I GFBP 3は表皮角化細胞の老化に伴つて細胞外に分泌されたタンパク質の発現 量が有意に増加した（図 8)。一方、 Galectin— 1、 Galectin— 3、 Galectin— 7およ び IGFBP— 3は CLには検出されなかった（図 8)。
細胞骨格系タンパク質である Keratinの中で 13種類 (Keratin 3、 5、 7、 8、 10、 1 3、 14、 15、 16、 17、 18、 19および 20)【こつ!ヽて調ベた。その結果、 Keratin 10、 13、 14、 15、 16、 18、 19および 20は表皮角化細胞の老化に伴い細胞内での発現 が有意に増加した（図 9)。一方、ケラチン 7は表皮角化細胞の老化に伴い細胞内で の発現が有意に減少した（図 9)。 Keratin 3、 5、 8および 17は発現が変化しなかつ た。 Keratin類は CMには検出されなかった。
1次元ウェスタンブロッテイング解析により表皮角化細胞の老化に伴って発現が変 化したタンパク質を表 3にまとめた。
1次元ウェスタンブロッテイング解析により表皮角化細胞の老化に伴って発現が変 化したタンパク質を表 3に示す。
[表 3]
発現変化（passage 5/passage 2) タンパク苣の分 タンパク黄名
CM CL
ゴロチア一ゼ■ 丄（0.1) ND プロチア一ゼインヒビタ一 1 (o.i) ND
1 (o.i) I (0.S)
1 (0.4) 1 (0.2)
H3P GEP94
Η3Ρ70 → HSP90
ガレクチン galecti η-1 ND
Figure imgf000035_0001
keratin 5 ND
keratin 7 ND
keratin 3 ND
keratin 10 ND
keratin 13 ND
keratin 14 ND
keratin 15 ND
keratin 1 G ND
Figure imgf000035_0002
keratin 17 ND
keratin 18 ND
keratin 19 ND
keratin 20 ND
σι他 β Ξ -microglobulin T「*1 T (3.5
† 現 ίき加 i：発現; ¾少 —： 現変化なし ND:未検出
CM;培羞上 ί害; CL;細胞抽出；
[*] ^断 ¾に ^する非 断 ¾の割合が ¾加
〔実施例 2〕
1. 目尻の弾力性およびしわ体積率の測定
20 60歳代の女性 59名を対象に、 目尻の弾力性およびしわ体積率を測定した。 目尻の弾力性は吸引弾力性を Cutemeter(Courage + Khazaka electronic GmbH)により測定した。吸引弾力性は、肌の弾力性の指標となる測定方法であり、 加齢に伴って弾力性が低下することが明らかになつている。 目尻のしわ体積率は、二 剤混合型レプリカ剤であるスキンキャスト（Yamada Cosmetic Laboratories)を 用いて目尻のレプリカを採取し、レプリカ画像解析によりしわの体積率を計測した。レ プリカ画像解析は反射用レプリカ解析システム ASA— 03RXDを使用して行った。 A SA—03RXDを用いて、採取したレプリカに角度 30度の平行光を照射する事により 得られるシヮの形状に応じた陰影画像を CCDカメラで撮像し、コンピュータに取り込 み画像処理することでレプリカ表面のしわ体積率（ μ mVmmVlOO)を計測した。 しわ体積率は、加齢に伴って増加することが明らかになつている。
[0072] 2. 目尻の角層からのタンパク質の抽出
20〜60歳代の女性 59名を対象に、 目尻から角層チェッカー（Asahibiomed Co . , Ltd. )を用いて角層を剥離し、そこ力もタンパク質抽出溶液を用いてタンパク質 を抽出した。具体的には、被験者の目尻に角層チ ッカーを貼り、指先で軽く擦り付 けた。これを 3回繰り返した。その後、 3枚の角層チェッカーに貼り付いた角層にそれ ぞれ 50 1のタンパク質抽出溶液 OmM Tris-HCl (pH7. 5)、 120mM NaCl 、0. 4% Igepal C A - 630 (Sigma - Aidrich Co. ) }をカ卩え、セルスクレーパー を用いて角層をタンパク質抽出溶液に馴染ませた後、溶液を 1. 5mlのプラスチック チューブ（Eppendorf AG)に回収した。
10, 000 X g、 15分間遠心し、不溶物を沈殿させ、上清を新しい 1. 5mlのプラスチ ックチューブに回収した。回収したサンプルのタンパク質量を DC assay kitを用い て測定した。
3.皮膚老化マーカーの測定
目尻角層から抽出したタンパク質 10 /z gを用いて、実施例 1に記載した Keratin 7 、 Keratinl5および Kallikrein 7の抗体を用いてウェスタンブロット法により検出し た。検出したバンドの強度をデンシトロメーター（Molecular Dinamics Co. , Lt d. )により測定し、 NIH imageにより数値ィ匕した。
[0073] 睡菓
表皮角化細胞の老化に伴って発現が変化するタンパク質の中で、 Keratin 7、 Ke ratin 10、 Keratin 15および Kallikrein 7についてヒトの皮膚老化度との相関 があるかどうかを調べた。
Keratinについては Keratin 10が皮膚老化に伴って発現が低下することが明ら かになつていることから、 Keratin 10と Keratin 7および Keratin 15でどの種類 の Keratin力ヒトの皮膚老化度との相関があるかどうかを調べた。 Keratin 10と Ker atin 15の年齢との相関を調べた結果、 Keratin 10は年齢との相関は見られず、 Keratin 15は年齢との相関が見られたことから、 Keratin 15は既存の皮膚老化マ 一力一に比べてもより適切な皮膚老化マーカーであることが明らかになった（図 10お よび図 11)。
ヒトの皮膚老化度の指標として、加齢との相関が明らかになつている目尻の弾力性 としわ体積率を用いた。本試験で皮膚老化度を測定した 20〜60歳代の女性 59名に おいても、加齢に伴って目尻の弾力性は有意に減少し、しわ体積率は有意に増加し た（図 12および 13)。
Keratin 7の発現量と目尻の弾力性との相関を図 14に、 Keratin 15の発現量と 目尻の弾力性との相関を図 15に示した。 Keratin 7の発現量は目尻弾力性の低下 に伴って有意に減少し、ケラチン 15の発現量は目尻弾力性の低下に伴って有意に 増加した。 Keratin 7の発現量としわ体積率との相関を図 16に、 Keratin 15の発 現量としわ体積率との相関を図 17に示した。 Keratin 7の発現量は目尻しわ体積 率の増加に伴って有意に減少し、ケラチン 15の発現量は目尻しわ体積率の増加に 伴って有意に増加した。
また、 Kallilrein 7について皮膚老化度と発現の相関を調べた。 Kallilrein 7の 発現量と目尻の弾力性との相関を図 18に、 Kallilrein 7の発現量と目尻のしわ体 積率との相関を図 19に示した。 Kallilrein 7の発現量は目尻弾力性の低下に伴つ て有意に減少し、目尻のしわ体積率の増加に伴って有意に減少した。
以上の結果から、表皮角化細胞の細胞老化を指標に見出した 3種のマーカー (Ke ratin 7、 Keratin 10および Kallikrein 7)がヒトの皮膚老化度と相関することが 明らかになった。
産業上の利用可能性
細胞老化に伴って発現が増加あるいは減少するタンパク質および切断型力 非切 断型に変化するタンパク質を見出した。これら新たに見つ力つたタンパク質は皮膚老 化の診断マーカーとして化粧品のカウンセリングシステム等への応用が期待出来る。 また、これらのタンパク質の発現を指標としてより有効な化粧品や健康食品を開発す ることち期待でさる。

Claims

請求の範囲
[1] 皮膚細胞及び Z又は皮膚組織における分泌タンパク質及び Z又は細胞内タンパク 質の発現及び Z又はその遺伝子発現を測定することを含む、皮膚の老化度を判定 する方法であって、前記分泌タンパク質及び Z又は細胞内タンパク質は皮膚の老化 度により発現が変化するものである前記方法。
[2] 分泌タンパク質及び Z又は細胞内タンパク質力 Kallikrein 7、 Plasminogen ac tivator inhibitor (PAI)— 1、 Urokinase plasminogen activator (uP A)、 Ma triptase、 Glucose regulated protein (GRP) 94、 HSP 70、 HSP 90、 Gale ctin— 1、 Galectin— 3、 Galectin— 7、 Insulin growth factor binding prote in (IGFBP)—3、 Enolase— 1、 Annexin II、 Ezrin、 Radixin、 Moesin、 Gelsoli n、 Keratin 7、 Keratin 10、 Keratin 13、 Keratin 14、 Keratin 15、Kerati n 16、 Keratin 18、 Keratin 19、 Keratin 20および j8 2— microglobulinから なる群より選択される請求項 1記載の方法。
[3] 分泌タンパク質及び Z又は細胞内タンパク質の発現をタンパク質レベルで測定する 請求項 1又は 2に記載の方法。
[4] 分泌タンパク質及び Z又は細胞内タンパク質の遺伝子発現を RNAレベルで測定す る請求項 1又は 2に記載の方法。
[5] 皮膚の老化により発現が変化する分泌タンパク質及び Z又は細胞内タンパク質を特 異的に認識できる抗体を含む、皮膚の老化度を判定するためのキット。
[6] 分泌タンパク質及び Z又は細胞内タンパク質力 Kallikrein 7、 PAI— 1、 uPA、 M atriptase、 GRP 94、 HSP 70、 HSP 90、 Galectin— 1、 Galectin— 3、 Galect in— 7、 IGFBP— 3、 Enolase— 1、 Annexin II、 Ezrin、 Radixin、 Moesin、 Gels olin、 Keratin 7、 Keratin 10、 Keratin 13、 Keratin 14、 Keratin 15、Ker atin 16、 Keratin 18、 Keratin 19、 Keratin 20および j8 2— microglobulin からなる群より選択される請求項 5記載のキット。
[7] 皮膚の老化により発現が変化する分泌タンパク質及び Z又は細胞内タンパク質の m RNAと特異的にハイブリダィズできる核酸プローブを含む、皮膚の老化度を判定す るためのキット。
[8] 分泌タンパク質及び Z又は細胞内タンパク質力 Kallikrein 7、 PAI— 1、 uPA、 M atriptase、 GRP 94、 HSP 70、 HSP 90、 Galectin— 1、 Galectin—3、 Galect in— 7、 IGFBP— 3、 Enolase— 1、 Annexin II、 Ezrin、 Radixin、 Moesin、 Gels olin、 Keratin 7、 Keratin 10、 Keratin 13、 Keratin 14、 Keratin 15、Ker atin 16、 Keratin 18、 Keratin 19、 Keratin 20および j8 2— microglobulin からなる群より選択される請求項 7記載のキット。
[9] 皮膚の老化により発現が変化する分泌タンパク質及び Z又は細胞内タンパク質の m RNAと特異的にハイブリダィズできる核酸プライマー及び前記 mRNAを铸型として 合成される cDNAと特異的にハイブリダィズできる核酸プライマーカもなる 1対の核 酸プライマーを含む、皮膚の老化度を判定するためのキット。
[10] 分泌タンパク質及び Z又は細胞内タンパク質力 Kallikrein 7、 PAI— 1、 uPA、 M atriptase、 GRP 94、 HSP 70、 HSP 90、 Galectin— 1、 Galectin— 3、 Galect in— 7、 IGFBP— 3、 Enolase— 1、 Annexin II、 Ezrin、 Radixin、 Moesin、 Gels olin、 j8 2— microglobulin^ Keratin 7、 Keratin 10、 Keratin 丄 3、 Keratin 14、 Keratin 15、 Keratin 16、 Keratin 18、 Keratin 19、 Keratin 20およ び β 2— microglobulin力もなる群より選択される請求項 9記載のキット。
[11] 皮膚の老化防止に効果のある物質を同定する方法であって、以下の工程：
(a)被験物質と皮膚細胞及び Z又は皮膚組織を接触させる工程、
(b)工程 (a)で被験物質と接触させた皮膚細胞及び Z又は皮膚組織を所定時間培 養する工程、
(c)工程 (b)で培養した皮膚細胞及び,又は皮膚組織における分泌タンパク質及び Z又は細胞内タンパク質の発現及び Z又はその遺伝子発現を測定する工程であつ て、前記分泌タンパク質及び Z又は細胞内タンパク質は皮膚の老化により発現が変 化するものである前記工程、及び
(d)工程 (c)で測定した分泌タンパク質及び Z又は細胞内タンパク質の発現及び Z 又はその遺伝子発現を対照の皮膚細胞及び Z又は皮膚組織における分泌タンパク 質及び Z又は細胞内タンパク質の発現及び Z又はその遺伝子発現と比較すること により、皮膚細胞及び Z又は皮膚組織における分泌タンパク質及び Z又は細胞内タ ンパク質の発現及び z又はその遺伝子発現に対する被験物質の効果を評価するェ 程
を含む前記方法。
分泌タンパク質及び Z又は細胞内タンパク質力 Kallikrein 7、 PAI— 1、 uPA、 M atriptase、 GRP 94、 HSP 70、 HSP 90、 Galectin— 1、 Galectin—3、 Galect in— 7、 IGFBP— 3、 Enolase— 1、 Annexin II、 Ezrin、 Radixin、 Moesin、 Gels olin、 Keratin 7、 Keratin 10、 Keratin 13、 Keratin 14、 Keratin 15、Ker atin 16、 Keratin 18、 Keratin 19、 Keratin 20および j8 2— microglobulin からなる群より選択される請求項 11記載の方法。
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