KR20080057233A - 피부 노화 마커와 그의 이용기술 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 피부 노화 마커가 될 수 있는 물질을 탐색하는 것을 목적으로 하고, 피부세포 및/또는 피부조직에 있어서의 분비 단백질 및/또는 세포내 단백질의 발현 및/또는 그의 유전자 발현을 측정하는 것을 포함하는, 피부의 노화도를 판정하는 방법으로서, 상기 분비 단백질 및/또는 세포내 단백질은 피부의 노화에 따라 발현이 변화하는 것인 상기 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 피부의 노화도를 판정하기 위한 키트 및 피부의 노화방지에 효과가 있는 물질을 동정하는 방법도 제공한다.

Description

피부 노화 마커와 그의 이용기술{Skin aging marker and technique for use thereof}
본 발명은 피부 노화 마커와 그의 이용기술에 관한 것이다.
피부의 가령(加齡)변화는 주름, 처짐 등 외관상으로 인지되는 것이 일반적으로, 피부 연령의 추정은 외관변화를 토대로 기기를 사용한 객관적인 평가가 시도되어 왔다. 실제로 행해지고 있는 방법으로서는, 주름이나 처짐의 정도로부터 실제 연령을 추정하거나, 파이버스코프 등으로 외관적인 피부결의 고운 정도를 측정하거나, 피부에 진동체(振動體)를 접촉시켰을 때의 진동변화로 피부 연령을 판정하는 방법이 보고되어 있다(특허문헌 1~3).
노화의 원인으로서 세포 노화가 제창되고 있으나, 지금까지 세포 노화가 개체 노화의 원인인 것은 실증되어 있지 않았다. 최근, 세포 노화가 개체 노화의 원인인 것을 실증하는 결과가 보고되었다(비특허문헌 1). 피부에 있어서도 가령변화는 주름, 처짐 등의 외관이 변화하기 전에 세포 레벨에서의 가령변화가 먼저 시작되고 있다고 생각된다. 예를 들면, 피부 노화에 따라 세포외 매트릭스 단백질(ECM)인 콜라겐 등이 감소하고, ECM 분해성 프로테아제의 발현이 증가하는 등 다양한 인자의 발현변화가 발생한다(비특허문헌 2~4). 또한, 생체내에 발생하는 산화 수식 등을 받은 이상(異常) 단백질은 프로테아좀에 의해 분해되나, 가령과 함께 피부 중의 프로테아좀의 발현이 저하하고, 산화 콜라겐의 축적이 발생한다(비특허문헌 5). 따라서, 피부 노화도를 적확하게 측정하기에는 외관변화를 토대로 하는 평가로는 불충분하고, 세포 레벨에서의 생화학적인 가령변화를 조사하는 것이 중요하다.
지금까지, 피부세포의 노화 마커로서 노화관련 β-갈라토시다아제(senescence-associated β-galactosidase; SA-β-Gal)가 동정(同定)되어, SA-β-Gal은 최종 분화된 세포에서는 발현하지 않고 노화된 세포에만 특이적으로 발현하여, 인간의 피부조직에서의 노화 와도 매우 밀접하게 상관하는 것이 명확해졌다(비특허문헌 6). 그 이외의 피부 노화 마커로서 세린 프로테아제 억제제(serine protease inhibitor)의 1종인 마스핀(Maspin)이나 시스테인 프로테아제 억제제(cystein protease inhibitor)의 1종인 Cystatin A 등이 보고되어 있다(비특허문헌 7, 8)
피부 노화의 바이오마커를 탐색하는 수법으로서, 특정 세포가 특정 조건하에 놓여졌을 때, 그 세포내에 존재하는 전단백질(proteome)을 2차원 전기영동에 의해 분리하고, 질량분석기에 의해 동정하는 수법(proteomics)이 유용하다. 실제로, 약년(若年)과 노년(老年)의 인간의 피부조직으로부터 단백질을 추출하고, 프로테오믹스(proteomics)로 피부 노화에 의해 유의(有意)하게 변화한 단백질로서 eIF-5A, 시클로필린 A(Cyclophilin A), 프로테아조말 프로테인(Proteasomal protein), PA28-α, 트립토파닐-tRNA 합성 효소(Tryptophanyl-tRNA synthetase), HSP60, 아넥신(Annexin) I, NM23 H2(nucleoside diphosphatase kinase), PI3K p85β 이소 폼(isoform), Mn-슈퍼옥사이드 디스뮤타제(Mn-superoxide dismutase), PAI-2, Mx-A 프로테인이 발견되어 있다(비특허문헌 9). 그러나, 지금까지 피부에 관해서 실시된 프로테오믹스는 피부조직의 추출물 또는 세포추출물을 사용한 해석으로, 미량의 분비 단백질이 많이 포함되어 있는 세포 배양상청액에 착안하여 프로테오믹스를 행한 예는 없다. 또한, 동정한 피부 노화 마커의 인간 피부에서의 검증은 생체검사(biopsy)에 의해 적출한 피부조직에서의 면역 염색 등 실용성이 낮은 방법으로, 비침습적으로 안전, 간편하게 각질층(角層) 채취를 할 수 있는 각질 체커를 사용하여 각질층을 채취하고, 그로부터 단백질을 추출하여 피부 노화 마커의 발현을 조사하는 실용성이 높은 방법으로 조사한 예는 없다.
특허문헌 1: 일본국 특허공개 제2002-330943호 공보
특허문헌 2: 일본국 특허공개 제2002-360544호 공보
특허문헌 3: 일본국 특허공개 제2001-212087호 공보
비특허문헌 1: J. Clinic. Invest., 114, 1299-1307, 2004
비특허문헌 2: Mol. Cell. Biochem. 1999 Apr, 194(1-2): 99-108
비특허문헌 3: J. Investig. Dermatol. Symp. Proc., 3(2), 172-179, 1998
비특허문헌 4: Mech. Ageing Dev., 123(7), 801-810, 2002.
비특허문헌 5: J. Gerontology, 55(5), 220-227, 2000
비특허문헌 6: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92, 9363-9367, 1995
비특허문헌 7: Cancer Research, 64, 2956-2961, 2004
비특허문헌 8: Dermatology, 188, 21-24, 1994
비특허문헌 9: Mol. Cell. Proteomics, 2(2), 70-84, 2003
발명의 개시
발명이 해결하고자 하는 과제
본 발명은 피부 노화 마커가 될 수 있는 물질을 탐색하는 것을 목적으로 한다.
과제를 해결하기 위한 수단
본 발명자들은 미량의 분비 단백질이 많이 포함되어 있는 세포 배양상청액에 착안하여, 표피 각화세포의 노화에 따라 발현이 변화하는 단백질의 프로테오믹스를 행하였다. 즉, 인간 정상 표피 각화세포의 2대째(젊은 세포)~5대째(노화된 세포)의 배양상청액을 조제하고, 2차원 전기영동과 질량분석기에 의한 프로테옴(proteome) 해석을 행하였다. 또한, 본 발명의 특징으로서, 초미량 단백질(1 femto-㏖ 이하)의 동정을 가능하게 하는 기술{실험의학, 20(16), 2367-2370, 2002}을 사용하여 동정을 시도하였다.
그 결과, 표피 각화세포의 노화에 따라 발현이 감소한 단백질이 19개(표 1), 발현이 증가한 단백질이 49개 동정되었다(표 2). 이들 단백질 중에는 기지의 피부 노화 마커 이외에도 β2-마이크로글로불린(β2-microglobulin), PAI-1, 칼리크레인 7(Kallikrein 7) 등 신규한 피부 노화 마커가 포함되어 있었다. 또한, 프로테옴 해석에 의해 동정된 단백질의 발현을 1차원의 웨스턴 블로팅(western blotting)에 의해 확인하고, 표피 각화세포의 노화와 상관하는 몇 개의 단백질을 동정하였다(표 3). 또한, 프로테옴 해석에 의해 세포골격 단백질인 2종의 케라틴(Keratin)이 동정된 점으로부터, 표피 각화세포의 노화에 따른 각종 케라틴의 발현변화도 조사하였다. 그 결과, 표피 각화세포의 노화에 따라 8종의 케라틴(Keratin 10, 13, 14, 15, 16, 18, 19 및 20)의 발현이 증가하고, 케라틴 7의 발현이 감소하였다. 발현이 변화하는 단백질 이외에도, 표피 각화세포의 노화에 따라 프로테아제에 의해 절단된 절단형에 대한 비절단형의 비율이 증가하는 단백질로서 β2-마이크로글로불린이 동정되었다.
또한, 전술한 바과 같이 하여 발견한 피부 노화 마커와 인간의 피부 노화도의 상관을 조사하기 위해, 20~60대의 자원봉사자로부터, 비침습적으로 안전, 간편하게 각질층 채취를 할 수 있는 각질 체커를 사용하여 각질층을 채취하고, 그로부터 단백질을 추출하여 피부 노화 마커의 발현을 웨스턴 블로팅에 의해 조사하였다. 그 결과, 케라틴 7, 케라틴 15 및 칼리크레인 7이 피부 노화의 지표로서 알려지는 피부 탄력성 및 주름 체적율과 매우 밀접하게 상관하는 것이 명확해졌다.
본 발명의 요지는 이하와 같다.
(1) 피부세포 및/또는 피부조직에 있어서의 분비 단백질 및/또는 세포내 단백질의 발현 및/또는 그의 유전자 발현을 측정하는 것을 포함하는, 피부의 노화도를 판정하는 방법으로서, 상기 분비 단백질 및/또는 세포내 단백질은 피부의 노화에 따라 발현이 변화하는 것인 상기 방법.
(2) 분비 단백질 및/또는 세포내 단백질이 칼리크레인 7(Kallikrein 7), PAI-1, uPA, 매트립타아제(Matriptase), GRP 94, HSP 70, HSP 90, 갈렉틴-1(Galectin-1), 갈렉틴-3(Galectin-3), 갈렉틴-7(Galectin-7), IGFBP-3, 에놀라아제-1(Enolase-1), 아넥신(Annexin) II, 에즈린(Ezrin), 라딕신(Radixin), 모에신(Moesin), 겔솔린(Gelsolin), 케라틴 7(Keratin 7), 케라틴 10(Keratin 10), 케라틴 13(Keratin 13), 케라틴 14(Keratin 14), 케라틴 15(Keratin 15), 케라틴 16(Keratin 16), 케라틴 18(Keratin 18), 케라틴 19(Keratin 19), 케라틴 20(Keratin 20) 및 β2-마이크로글로불린(β2-microglobulin)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 (1) 기재의 방법.
(3) 분비 단백질 및/또는 세포내 단백질의 발현을 단백질 레벨에서 측정하는 (1) 또는 (2) 기재의 방법.
(4) 분비 단백질 및/또는 세포내 단백질의 유전자 발현을 RNA 레벨에서 측정하는 (1) 또는 (2) 기재의 방법.
(5) 피부의 노화에 따라 발현이 변화하는 분비 단백질 및/또는 세포내 단백질을 특이적으로 인식할 수 있는 항체를 포함하는, 피부의 노화도를 판정하기 위한 키트.
(6) 분비 단백질 및/또는 세포내 단백질이 칼리크레인 7, PAI-1, uPA, 매트립타아제, GRP 94, HSP 70, HSP 90, 갈렉틴-1, 갈렉틴-3, 갈렉틴-7, IGFBP-3, 에놀라아제-1, 아넥신 II, 에즈린, 라딕신, 모에신, 겔솔린, 케라틴 7, 케라틴 10, 케라틴 13, 케라틴 14, 케라틴 15, 케라틴 16, 케라틴 18, 케라틴 19, 케라틴 20 및 β2-마이크로글로불린으로 이루어진 군으로부터 선택되는 (5) 기재의 키트.
(7) 피부의 노화에 따라 발현이 변화하는 분비 단백질 및/또는 세포내 단백질의 mRNA와 특이적으로 하이브리다이즈할 수 있는 핵산 프로브를 포함하는, 피부의 노화도를 판정하기 위한 키트.
(8) 분비 단백질 및/또는 세포내 단백질이 칼리크레인 7, PAI-1, uPA, 매트립타아제, GRP 94, HSP 70, HSP 90, 갈렉틴-1, 갈렉틴-3, 갈렉틴-7, IGFBP-3, 에놀라아제-1, 아넥신 II, 에즈린, 라딕신, 모에신, 겔솔린, 케라틴 7, 케라틴 10, 케라틴 13, 케라틴 14, 케라틴 15, 케라틴 16, 케라틴 18, 케라틴 19, 케라틴 20 및 β2-마이크로글로불린으로 이루어진 군으로부터 선택되는 (7) 기재의 키트.
(9) 피부의 노화에 따라 발현이 변화하는 분비 단백질 및/또는 세포내 단백질의 mRNA와 특이적으로 하이브리다이즈할 수 있는 핵산 프라이머 및 상기 mRNA를 주형으로 하여 합성되는 cDNA와 특이적으로 하이브리다이즈할 수 있는 핵산 프라이머로 되는 한쌍의 핵산 프라이머를 포함하는, 피부의 노화도를 판정하기 위한 키트.
(10) 분비 단백질 및/또는 세포내 단백질이 칼리크레인 7, PAI-1, uPA, 매트립타아제, GRP 94, HSP 70, HSP 90, 갈렉틴-1, 갈렉틴-3, 갈렉틴-7, IGFBP-3, 에놀라아제-1, 아넥신 II, 에즈린, 라딕신, 모에신, 겔솔린, 케라틴 7, 케라틴 10, 케라틴 13, 케라틴 14, 케라틴 15, 케라틴 16, 케라틴 18, 케라틴 19, 케라틴 20 및 β2-마이크로글로불린으로 이루어진 군으로부터 선택되는 (9) 기재의 키트.
(11) 피부의 노화방지에 효과가 있는 물질을 동정하는 방법으로서, 이하의 공정:
(a) 피험(被驗)물질과 피부세포 및/또는 피부조직을 접촉시키는 공정,
(b) 공정 (a)에서 피험물질과 접촉시킨 피부세포 및/또는 피부조직을 소정 시간 배양하는 공정,
(c) 공정 (b)에서 배양한 피부세포 및/또는 피부조직에 있어서의 분비 단백질 및/또는 세포내 단백질의 발현 및/또는 그의 유전자 발현을 측정하는 공정으로서, 상기 분비 단백질 및/또는 세포내 단백질은 피부의 노화에 따라 발현이 변화하는 것인 상기 공정, 및
(d) 공정 (c)에서 측정한 분비 단백질 및/또는 세포내 단백질의 발현 및/또는 그의 유전자 발현을 대조의 피부세포 및/또는 피부조직에 있어서의 분비 단백질 및/또는 세포내 단백질의 발현 및/또는 그의 유전자 발현과 비교함으로써, 피부세포 및/또는 피부조직에 있어서의 분비 단백질 및/또는 세포내 단백질의 발현 및/또는 그의 유전자 발현에 대한 피험물질의 효과를 평가하는 공정
을 포함하는 상기 방법.
(12) 분비 단백질 및/또는 세포내 단백질이 칼리크레인 7, PAI-1, uPA, 매트립타아제, GRP 94, HSP 70, HSP 90, 갈렉틴-1, 갈렉틴-3, 갈렉틴-7, IGFBP-3, 에놀라아제-1, 아넥신 II, 에즈린, 라딕신, 모에신, 겔솔린, 케라틴 7, 케라틴 10, 케라틴 13, 케라틴 14, 케라틴 15, 케라틴 16, 케라틴 18, 케라틴 19, 케라틴 20 및 β2-마이크로글로불린으로 이루어진 군으로부터 선택되는 (11) 기재의 방법.
발명의 효과
본 발명에 의해, 피부 노화에 있어서 세포 레벨에서의 가령변화를 지표로 하는 평가계를 확립할 수 있다. 이 평가계를 사용하여, 종래법에 비해 보다 상세하고 적확하게 피부의 노화도를 판정할 수 있다. 또한, 피부의 노화도를 판정하기 위한 키트 및 피부의 노화방지에 효과가 있는 물질을 동정하는 방법도 제공된다.
도면의 간단한 설명
도 1은 표피 각화세포의 계대(passage)에 의한 증식변화(a) 및 형태변화(b)를 나타낸다.
도 2는 표피 각화세포의 계대수별로 SA-β-Gal로 염색한 세포의 염색상(a) 및 SA-β-Gal 염색된 세포의 비율(b)을 나타낸다.
도 3은 표피 각화세포의 계대수 2대째 및 5대째로부터 추출한 단백질의 2차원 전기영동해석에 의해 얻어진 발현 패턴을 나타낸다.
도 4는 표피 각화세포의 노화에 따른 라미닌 5(Laminin 5) 및 피브로넥틴(Fibronectin)의 발현변화를 1차원 웨스턴 블로팅에 의해 해석한 결과를 나타낸다.
도 5의 (a), (b)는 표피 각화세포의 노화에 따른 프로테아제 및 프로테아제 억제제의 발현변화를 1차원 웨스턴 블로팅에 의해 해석한 결과를 나타낸다.
도 6은 표피 각화세포의 노화에 따른 열 쇼크 단백질의 발현변화를 1차원 웨스턴 블로팅에 의해 해석한 결과를 나타낸다.
도 7은 표피 각화세포의 노화에 따른 세포내 단백질 및 세포골격계 단백질의 발현변화를 1차원 웨스턴 블로팅에 의해 해석한 결과를 나타낸다.
도 8은 표피 각화세포의 노화에 따른 갈렉틴 및 IGFBP-3의 발현변화를 1차원 웨스턴 블로팅에 의해 해석한 결과를 나타낸다.
도 9는 표피 각화세포의 노화에 따른 케라틴의 발현변화를 1차원 웨스턴 블로팅에 의해 해석한 결과를 나타낸다.
도 10은 눈가 각질층으로부터 추출한 케라틴 15의 발현과 연령의 상관을 나타낸다.
도 11은 눈가 각질층으로부터 추출한 케라틴 10의 발현과 연령의 상관을 나타낸다.
도 12는 연령과 눈가 탄력성의 상관을 나타낸다.
도 13은 연령과 눈가 주름 체적율의 상관을 나타낸다.
도 14는 눈가 각질층으로부터 추출한 케라틴 7의 발현과 눈가 탄력성의 상관을 나타낸다.
도 15는 눈가 각질층으로부터 추출한 케라틴 15의 발현과 눈가 탄력성의 상관을 나타낸다.
도 16은 눈가 각질층으로부터 추출한 케라틴 7의 발현과 눈가 주름 체적율의 상관을 나타낸다.
도 17은 눈가 각질층으로부터 추출한 케라틴 15의 발현과 눈가 주름 체적율의 상관을 나타낸다.
도 18은 눈가 각질층으로부터 추출한 칼리크레인 7의 발현과 눈가 탄력성의 상관을 나타낸다.
도 19는 눈가 각질층으로부터 추출한 칼리크레인 7의 발현과 눈가 주름 체적율의 상관을 나타낸다.
발명을 실시하기 위한 최선의 형태
이하, 본 발명의 실시 형태에 대해서 보다 상세하게 설명한다.
본 발명은 피부세포 및/또는 피부조직에 있어서의 분비 단백질 및/또는 세포내 단백질의 발현을 측정하는 것을 포함하는, 피부의 노화도를 판정하는 방법을 제공한다. 분비 단백질 및/또는 세포내 단백질은 피부의 노화에 따라 발현이 변화하는 것이다. 「발현이 변화하는」 태양으로서는, 단백질 및/또는 그의 유전자 발현 유무가 변하는 것, 발현량이 증감하는 것, 발현한 단백질의 프로테아제에 의한 절단형과 비절단형의 비율이 변하는 것 등을 들 수 있다. 피부의 노화도를 판정하기 위한 분비 단백질 및/또는 세포내 단백질은, 칼리크레인 7, PAI-1, uPA, 매트립타아제, GRP 94, HSP 70, HSP 90, 갈렉틴-1, 갈렉틴-3, 갈렉틴-7, IGFBP-3, 에놀라아제-1, 아넥신 II, 에즈린, 라딕신, 모에신, 겔솔린, 케라틴 7, 케라틴 10, 케라틴 13, 케라틴 14, 케라틴 15, 케라틴 16, 케라틴 18, 케라틴 19, 케라틴 20 및 β2-마이크로글로불린으로 이루어진 군으로부터 선택하는 것이 바람직하다. 선택하는 단백질은 1종이어도 되고 복수 종이어도 된다.
칼리크레인 7(Kallikrein 7)은 분자질량 27,525 Da의 분비 단백질이다. 각질층의 세포간끼리의 결합부분을 절단함으로써 피부표면으로부터의 세포 낙설(落屑)을 촉진하는 작용을 갖는다. 조직 중에서는 피부에서 많이 발현되는 한편, 뇌, 유선(乳腺), 척수, 신장에 발현이 보여진다. 유전자 서열정보(Stratum corneum chymotrytic enzyme, J. Biol. Chem. 269: 19420-19426, 1994, L33404). 아미노산 서열정보(Kallikrein 7 precursor, J. Biol. Chem. 269: 19420-19426, 1994, P49862).
PAI-1은 분자질량 45,060 Da의 분비 단백질이다. 세린 프로테아제의 일종으로 tPA(tissue plasminogen activator), uPA, 프로테인 C 등의 활성을 저해한다. PAI-1은 산에 안정한 당단백질로, 세르핀(serpin) 패밀리에 속해 있다. 혈장, 혈소판, 내피세포, 간세포, 섬유육종 세포에 보여진다. 유전자 서열정보(Plasminogen activator inhibitor-1, J. Clin. Invest. 78: 1673-1680, 1986, M16006). 아미노산 서열정보(Plasminogen activator inhibitor-1, FEBS Lett. 210: 11-16, 1987, PO5121).
uPA는 분자질량 48,525 Da의 분비 단백질이다. uPA는 플라스미노겐을 플라스민으로 변환하는 세린 프로테아제의 일종. 전구체 단백질(55 kDa)로서 세포외로 분비되고, 절단형(35 kDa)이 되어 프로테아제 활성을 나타낸다. 유방암에서 많은 발현이 보여진다. 유전자 서열정보(Urokinase-type plasminogen activator, Nucleic Acids Res. 13: 2759-2771, 1985, BC013575). 아미노산 서열정보(Urokinase-type plasminogen activator, Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem. 363: 1043-1058, 1982, P00749).
매트립타아제(Matriptase)는 분자질량 75,626 Da의 분비 단백질이다. 세포외 매트릭스를 분해하는 효소. 유방암에서 침윤과 전이에 관여한다는 보고가 있다. 트립신 유사의 효소활성을 나타낸다. 또한 매트립타아제의 억제제인 HAI-1(Hepatocyte growth factor activation inhibitor 1)과 복합체를 나타내는 것이 명확해져 있다. 또한, 이 유전자를 녹아웃한 마우스에서는 피부에서의 수분 증산의 제어를 할 수 없어 치사에 이르는 것을 알 수 있다. 유전자 서열정보(Membrane-type serin protease 1, J. Biol. Chem. 274: 18231-18236, 1999, AF188224). 아미노산 서열정보(Membrane-type serin protease 1, J. Biol. Chem. 274: 18237-18242, 1999, Q9BS01).
GRP94는 분자질량 92,469 Da의 분비 단백질이다. 열 쇼크 단백질의 일종으로 분비 단백질의 절단이나 수송에서 작용하는 분자 샤페론(molecular chaperone)이다. 시그널 펩티드를 가지고 있으므로 세포외로 분비되는 것도 있으나 ER에 국재하는 것도 있다. 유전자 서열정보(tumor rejection antigen(gp96) 1, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 87: 5658-5662, 1990, BC066656) 아미노산 서열정보(Endoplasmin, Nat. Biotechnol. 21: 566-569, 2003, P14625).
HSP70은 분자질량 70,052 Da의 세포내 단백질이다. 통상, 세포내에서 분자 샤페론으로서 기능하고, 단백질의 폴딩, 수송, 집합이나 분해 등에 관여하고 있다. 또한, 미트콘드리아나 ER에서의 HSP70의 작용은 단백질을 정상적으로 이송시키는 것이다. HSP90과 협조하여 세포내의 시그널 전달에도 관여한다. 유전자 염기서열정보(heat shock 70kDa 프로테인 1A, Immunogenetics32: 242-251, 1990, BC002453). 아미노산 서열정보(Heat shock 70 kDa protein 1, P08107).
HSP90은 분자질량 85,453 Da의 세포내 단백질이다. 보통은 스테로이드 호르몬 수용체 등의 복합체에 결합·해리함으로써 시그널 전달계에 있어서 중요한 작용을 하고 있다. 세포가 고온에 노출되면, HSP90은 구조를 바꿔 단백질의 불가역적 손상을 방지하는 분자 샤페론으로서 작용한다. 유전자 염기서열정보(Heat shock protein 90, Nucleic Acids Res. 17: 7108-7110, 1989, X15183). 아미노산 서열정보(Heat shock protein 90, J. Biol. Chem. 264: 2431-2437, 1989, P07900).
갈렉틴-1(Galectin-1)은 분자질량 14,585 Da의 세포내 단백질이다. 세포외로 분비되는 것도 있다. 심장, 위, 골격근, 신경, 흉선, 신장, 태반 등에 존재한다. β-갈락토시드나 CD45, CD3, CD4 등에 결합한다. 세포의 증식 촉진효과, 세포사의 유도, 또한 면역응답에 영향을 부여하는 것이 알려져 있다. 또한, 라미닌, 인테그린 등의 세포외 매트릭스의 구성성분이나 세포 수용체에 특이적으로 결합하여, 세포 접착이나 이동에 큰 영향을 주고 있다. 유전자 서열정보(Galectin-1, J. Biol. Chem. 264: 1310-1316, 1989, BT006775). 아미노산 서열정보(Galectin-1, J. Biochem. 104: 1-4, 1988, P09382).
갈렉틴-3(Galectin-3)은 분자질량 35,678 Da의 세포내 단백질이다. IgE에 결합하는, 갈락토오스 특이적인 렉틴. 주된 발현은 대장의 상피나 활성화 마크로파지에 있어서 보여진다. 갈렉틴 3은 표피 각화세포에 의해 생산되어 피부의 랑게르한스섬의 표면에 존재하고, IgE와 결합하여 면역계를 조절하고 있다는 보고가 있다. 유전자 서열정보(Galectin-3, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 87: 7324-7328, 1990, AB006780). 아미노산 서열정보(Galectin-3, P17931).
갈렉틴-7(Galectin-7)은 분자질량 14,944 Da의 세포내 단백질이다. 일반적으로는 세포간끼리, 세포와 세포외 매트릭스간에서 세포의 증식을 제어하고 있다. 아포토시스 관련 단백질로 JNK의 활성이나 시토크롬 C의 방출을 제어하고 있다. 세포질, 핵, 또한 세포외로도 분비되고 있다. 인간 표피에서 최초로 클로닝된 갈렉틴 서브 패밀리의 멤버로, 배양 표피 각화세포의 연구로부터 갈렉틴 7은 각질화의 정도에 영향을 받지 않고, 모든 표피세포에 발현한다. 유전자 서열정보(Galectin-7, Dev. Biol. 168: 259-271, 1995, L07769). 아미노산 서열정보(Galectin-7, J. Biol. Chem. 270: 5823-5829, 1995, P47929).
IGFBP-3은 분자질량 31,660 Da의 분비 단백질이다. 일반적으로 IGF와 결합함으로써 반감기까지의 시간이 길어진다. 세포 배양에 있어서는 세포증식을 억제 또는 촉진한다. 세포표면에서 IGF 수용체에 결합한다. IGFBP-3은 IGF-1 보다 IGF-2에 대해서 결합력이 높다. 조직 중에 있어서는 대부분의 조직에 있어서 발현이 보여진다. 유전자 서열정보(Insulin-like growth factor binding protein-3, J. Biol. Chem. 265, 12642-12649, 1990, M35878). 아미노산 서열정보(Insulin-like growth factor binding protein-3, J. Biol. Chem. 265, 14892-14898, 1990, P17936).
에놀라아제-1(Enolase-1)은 분자질량 47,038 Da의 세포내 단백질이다. 2-포스포-D-글리세레이트=포스포에놀피루베이트+H2O(2-phospho-D-glycerate=phosphoenolpyruvate+H2O)의 효소활성을 가져 해당계(解糖系)에서 작용한다. 또한 일부는 세포증식, 알레르기에도 관여한다는 보고가 있다. 백혈구나 신경에서는 세포표면에 있어서 플라스미노겐의 활성화를 제어하여 피브린을 형성하는 데 관여하고 있다. 이량체의 안정한 구조를 갖는데에는 마그네슘이 필요하다. 세포질 내에 국재하나, 호모다이머만은 세포막에도 보여진다. α-에놀라아제는 대부분의 조직에 발현하고, β-에놀라아제는 근조직, γ-에놀라아제는 신경조직에만 발현하고 있다. 유전자 서열정보(Alpha enolase, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 83: 6741-6745, 1986, M14328). 아미노산 서열정보(Alpha enolase, Enzyme Protein 48: 37-44, 1995, P06733).
아넥신 II(Annexin II)는 분자질량 38,473 Da의 세포내 단백질이다. 일부 세포외로 분비된다는 보고도 있다. 칼슘으로 제어되는 막 결합 단백질로 이 단백질에는 2개의 칼슘이온이 결합한다. 세포막 근방에 국재하고 있다. 2조(組) 있는 아넥신 리피트 중, 1개는 칼슘이 결합하고, 1개는 인지질이 결합한다. 이 단백질은 세포막에 있는 인지질에 결합하고 있는 액틴이나 세포골격계의 단백질과 가교하거나, tPA를 매개로 하여 플라스미노겐을 활성화하거나 한다. 유전자 염기서열정보(Annexin A2, Gene 95: 243-251, 1990, BC015834). 아미노산 서열정보(Annexin A2, J. Biol. Chem. 266: 5169-5176, 1991, P07355).
에즈린(Ezrin)은 분자질량 69,268 Da의 세포내 단백질이다. 하기의 라딕신, 모에신은 동족의 분자. 주로 세포골격계의 단백질을 세포막에 연결하는 작용을 하고 있다. 세포막의 마이크로빌리(microvilli)라고 불리는 사상(絲狀) 돌기의 내측에 국재한다. 장 상피세포의 마이크로빌리를 구성하고 있다. 티로신키나아제에 의해 인산화된다. 유전자 서열정보(Ezrin, J. Biol. Chem. 264: 16727-16732, 1989, X51521). 아미노산 서열정보(Ezrin, Biochem. Biophys. Res. Commun. 224: 666-674, 1996, P15311).
라딕신(Radixin)은 분자질량 68,564 Da의 세포내 단백질이다. 주로 세포골격계 단백질과 세포막을 연결하는 작용을 하고 있다. 유전자 서열정보(Radixin, Genomics 16: 199-206, 1993, L02320). 아미노산 서열정보(Radixin, P35241).
모에신(Moesin)은 분자질량 67,689 Da의 세포내 단백질이다. 주로 세포골격계 단백질과 세포막을 연결하는 작용을 하고 있다. 이상(異常) 분화를 한 표피 각화세포에 있어서 발현이 저하한다는 보고가 있다. 유전자 서열정보(Moesin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 88: 8297-8301, 1991, M69066). 아미노산 서열정보(Moesin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 88: 8297-8301, 1991, P26038).
겔솔린(Gelsolin)은 분자질량 85,698 Da의 분비 단백질이다. 세포외로 분비되는 것과 세포내에서 작용하는 타입의 2개가 있다. 세포외로 분비된 것은 피브로넥틴과 결합한다. 겔솔린은 중합 핵 형성에 의한 액틴 섬유 신장의 촉진, 액틴 섬유의 절단, 및 그 말단의 보호라고 하는, 3개의 액틴 중합 조절기능을 갖는다. 이들 양면성의 기능을 통해 중합 일탈 중합이라는 양 국면을 제어하여, 세포운동에 있어서 중요한 역할을 담당하고 있다. 혈소판이나 섬유아세포에서 많은 발현이 보여진다. 유전자 서열정보(Gelsolin, Nat. 323, 455-458, 1986, X04412). 아미노산 서열정보(Gelsolin, Nat. Biotechnol. 21. 566-569, 2003, P06396).
케라틴 7(Keratin 7)은 분자질량 51,287 Da의 세포골격 단백질로 중간계 필라멘트의 성분이다. 선세포(腺細胞)를 포함하는 다양한 상피세포에서 발현이 보여진다. 요관(尿管)의 이행 상피, 담관, 폐, 유선 상피에서도 발현하고 있다. 일부, 종양 마커로서도 사용되고 있다. 유전자 서열정보(Keratin 7, J. Cell Biol. 107: 1337-1350, 1988, AF509887). 아미노산 서열정보(Keratin, type II cytoskeletal 7, P08729).
케라틴 10(Keratin 10)은 분자질량 59,519 Da의 세포골격 단백질이다. 케라틴 1과 헤테로 사량체를 만드는, 중간계 필라멘트의 성분이다. 피부 전반에 보여지나 특히 유극층(有棘層)에 많이 보여진다. 유전자 서열정보(keratin 10, J. Mol. Biol. 204: 841-856, 1988, M19156). 아미노산 서열정보(Keratin, type I cytoskeletal 10, Electrophoresis 13: 960-969, 1992, P13645).
케라틴 13(Keratin 13)은 분자질량 49,586 Da의 세포골격 단백질이다. 케라틴 4와 헤테로 사량체를 만드는 중간계 필라멘트의 성분이다. 혀, 식도, 상피, 요로 상피 등에서 발현이 보여진다. 유전자 서열정보(Keratin 13, Gene 215: 269-279, 1998, X52426). 아미노산 서열정보(Keratin, type I cytoskeletal 13, P13646).
케라틴 14(Keratin 14)는 분자질량 51,490 Da의 세포골격 단백질이다. 케라틴 5와 헤테로 사량체를 만드는 중간계 필라멘트의 성분이다. 상피에 존재하고, 특히 기저층(基底層)에 가까운 곳에 있어서 발현이 많이 보여진다. 상피계의 미분화 마커로서도 사용되고 있다. 유전자 서열정보(Keratin 14, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 82: 1609-1613, 1985, BC002690). 아미노산 서열정보(Keratin, type I cytoskeletal 14, P02533).
케라틴 15(Keratin 15)는 분자질량 49,167 Da의 세포골격 단백질이다. 중간계 필라멘트의 성분이다. 주로 상피 기저층에 국재하고 있다. 유전자 서열정보(Keratin 15, J. Cell Biol. 106: 1249-1261, 1988, X07696). 아미노산 서열정보(Keratin, type I cytoskeletal 15, P19012).
케라틴 16(Keratin 16)은 분자질량 51,136 Da의 세포골격 단백질이다. 케라틴 6과 헤테로 사량체를 만드는 중간계 필라멘트의 성분이다. 모낭, 손톱, 구강의 편평 상피층, 상피의 기저층, 손바닥의 상피, 또한 땀샘에서 발현이 보여진다. 세포의 증식이나 분화에 관여하고 있다. 유전자 서열정보(Keratin 16, Biochem. Biophys. Res. Commun. 215: 517-523, 1995, AF061812). 아미노산 서열정보(Keratin, type I cytoskeletal 16, Electrophoresis 13: 960-969, 1992, P08779).
케라틴 18(Keratin 18)은 분자질량 47,926 Da의 세포골격 단백질이다. 케라틴 8과 헤테로 사량체를 만드는 중간계 필라멘트의 성분이다. 대부분의 단층선(單層腺) 상피에 존재한다. 케라틴 18이 결손되어 있는 환자는 특발성 간질환이 될 가능성이 있다. 유전자 서열정보(Keratin 18, Differentiation 33: 61-68, 1986, M26325). 아미노산 서열정보(Keratin, type I cytoskeletal 18, Electrophoresis 18: 605-613, 1997, P05783).
케라틴 19(Keratin 19)는 분자질량 44,106 Da의 세포골격 단백질이다. 케라틴 중에서 가장 분자량이 작다. 중간계 필라멘트의 성분이다. 대부분의 단층 상피, 비각질화형 중층 상피에서 많이 발현하고 있다. 또한, 모든 선암(腺癌)에서 발현하고 있다. 유전자 서열정보(Keratin 19, J. Invest. Dermatol. 92: 707-716, 1989, Y00503). 아미노산 서열정보(Keratin, type I cytoskeletal 19, Electrophoresis 13: 960-969, 1992, P08727).
케라틴 20(Keratin 20)은 분자질량 48,486 Da의 세포골격 단백질이다. 중간계 필라멘트의 성분이다. 정상세포에서는 장관 상피, 소화관 상피, 위 유문(幽門) 상부에 존재하는 내분비세포나 요관 상피, 피부의 머켈세포(Merkel cell)에 존재한다. 대장암 등의 특이적 마커 단백질로서 사용되고 있다. 유전자 서열정보(Keratin 20, Differentiation 53: 75-93, 1993, BC031559). 아미노산 서열정보(Keratin, type I cytoskeletal 20, P35900).
β2-마이크로글로불린(β2-microglobulin)은 분자질량 13,175 Da의 분비 단백질이다. HLA 클래스 I 항원(조직 적합성 항원)의 L 사슬. 많은 세포표면에 존재하고 있다. 신장 기능장애나 각종 악성종양 등의 진단의 지표로서 사용되고 있다. 일부 절단형이 보여지나 그들의 의의에 대해서는 그다지 명확해져 있지 않다. 유전자 서열정보(Beta-2-microglobulin, J. Immunol. 139: 3132-3138, 1987, AB021288). 아미노산 서열정보(Beta-2-microglobulin, Biochemistry 12: 4811-4822(1973), P61769).
상기의 단백질은 전구체 단백질이어도 되고, 성숙 단백질이어도 되며, 또한, 절단형이어도 되고, 비절단형이어도 된다. 전구체 단백질로서는 프로 단백질, 프레프로 단백질 등을 들 수 있다. 프로 단백질, 프레프로 단백질 등에는 분비 단백질의 특징적 서열인 시그널 펩티드를 갖는 것도 있다.
본 발명의 방법에 있어서, 피부세포 및/또는 피부조직에 있어서의 분비 단백질 및/또는 세포내 단백질의 발현을 측정해도 되고, 그의 유전자 발현을 측정해도 된다. 예를 들면, 노던 블롯법, PCR법, 웨스턴 블롯법, 면역조직 화학분석법 등으로 측정할 수 있다. 또는, cDNA 마이크로 어레이, ELISA법, 항체 어레이 등을 이용하여 측정해도 된다.
분비 단백질 및/또는 세포내 단백질의 발현을 단백질 레벨에서 측정하기 위해서는, 측정의 대상이 되는 단백질을 특이적으로 인식하는 항체를 사용하면 된다. 항체는 단일클론항체, 다중클론항체 중 어느 것이어도 된다. 이들 항체는 공지의 방법으로 제조할 수 있고, 또한, 시판되어 있는 것도 있다. 웨스턴 블롯법으로 측정하는 경우에는, 항체는 125I 표지 프로테인 A, 퍼옥시다아제 결합 IgG 등을 사용하여 2차적으로 검출된다. 면역조직 화학분석법으로 측정하는 경우에는, 항체는 형광색소, 페리틴, 효소 등으로 표지하면 된다.
분비 단백질 및/또는 세포내 단백질의 유전자 발현을 RNA 레벨에서 측정하기 위해서는, 측정의 대상이 되는 단백질의 mRNA와 특이적으로 하이브리다이즈할 수 있는 핵산 프로브를 사용하면 된다(노던 블롯법으로 측정하는 경우). 또는, 측정의 대상이 되는 단백질의 mRNA와 특이적으로 하이브리다이즈할 수 있는 핵산 프라이머 및 상기 mRNA를 주형으로 하여 합성되는 cDNA와 특이적으로 하이브리다이즈할 수 있는 핵산 프라이머로 되는 한쌍의 핵산 프라이머를 사용해도 된다(PCR법으로 측정하는 경우). 핵산 프로브 및 핵산 프라이머는 측정의 대상이 되는 단백질의 유전자 정보를 토대로 하여 설계할 수 있다. 핵산 프로브는 통상, 약 15~1500 염기의 것이 적당하다. 핵산 프로브는 방사성 원소, 형광 색소, 효소 등으로 표지하면 된다. 핵산 프라이머는 통상, 약 15~30 염기의 것이 적당하다.
본 발명에 있어서, 피부세포 및/또는 피부조직에 있어서의 분비 단백질 및/또는 세포내 단백질의 발현 및/또는 그의 유전자 발현 유무를 검출해도 되고, 발현량을 측정해도 된다. 단백질 및/또는 그의 mRNA 발현 유무는 소정의 위치에 있어서 스폿이나 밴드의 출현 유무에 의해 확인할 수 있다. 단백질 및/또는 그의 mRNA 발현량은 스폿이나 밴드의 염색 강도에 의해 측정할 수 있다. 또는, 단백질 및/또는 그의 mRNA를 정량해도 된다. 복수의 유전자 발현이나 복수의 단백질 발현을 동시에 검출하기 위해서는 DNA 어레이(프로브를 기판에 고정)(NATURE REVIEWS, DRUG DISCOVERY, VOLUME 1, DECEMBER 2002, 951-960), 프로테인 칩(항체를 기판에 고정)(NATURE REVIEWS, DRUG DISCOVERY, VOLUME 1, SEPTEMBER 2002, 683-695), 루미넥스(NATURE REVIEWS, DRUG DISCOVERY, VOLUME 1, JUNE 2002, 447-456) 등의 검출법을 사용하는 것이 바람직하다.
피부세포 및 피부조직은 어떤 생물에 유래하는 것이어도 되고, 인간, 돼지, 원숭이, 침팬지, 개, 소, 토끼, 랫트, 마우스 등의 포유동물 등에 유래하는 것을 들 수 있다. 인간의 피부 노화도를 판정하기 위해서는, 인간 유래 조직을 사용할 필요가 있다.
본 발명의 방법에 있어서는, 피부의 노화도를 판정하기 위해서는 피부 생체검사 시료, 또는 그로부터 얻어지는 배양 피부세포, 배양 피부조직 등을 사용할 수 있다.
피부세포로서는 표피 각화세포, 피부 섬유아세포, 랑게르한스세포, 멜라닌세포, 비만세포, 내피세포, 피지세포, 모유두(毛乳頭)세포, 모모기(毛母基)세포 등을 들 수 있다. 피부세포는 일본내에서는 휴먼사이언스 연구 자원뱅크, 이화학 연구소 세포은행, 해외에서는 the American Type Culture Collection으로부터 공급된다. 또한 클론텍(Clontech)사, 구라보우사, 프로모셀(PromoCell)사로부터 구입할 수 있다. 또한, 공지의 방법에 의해 피부로부터 채취할 수 있다(분자 생물학 연구를 위한 신세포 배양실험법, p57-71, 요도샤, 1999).
피부조직으로서는 피부의 각질층, 표피, 진피 등을 들 수 있다. 피부조직은 바이오체인(Biochain)사, 슈퍼 바이오 칩스(Super Bio Chips)사로부터 구입할 수 있다. 또한, 공지의 방법에 의해 피부로부터 채취할 수 있다(Acta. Derm. Venereol., 85, 389-393, 2005).
피부 모델은 구라보우사, 도요보(TOYOBO)사 등으로부터 시판되고 있어, 이들을 사용할 수 있다. 또한, 공지의 방법{J. Invest. Dermatol., 104(1), 107-112, 1995}에 의해 제작하는 것도 가능하다.
피부 생체검사 시료는 세포여도 되고, 조직이어도 된다. 피부 생체검사 시료로서는 후술의 실시예에 기재하는 바와 같이, 피부의 각질층을 각질층 체커 등의 테이프에 의해 채취한 것을 사용하면 된다. 각질층 체커는 각질층의 부전각화도(不全角化度)나 세포면적을 측정하고, 피부 거침의 정도나 각질층의 턴오버 속도를 평가하기 위한 각질층 샘플을 채취할 때에 종래부터 사용되고 있다(화장품의 유용성·평가기술의 진보와 장래 전망, 일본 화장품 기술자회, 약사 일보사, p95-96). 카운슬링 점포나 자택에서 간단하고 안전하게 각질층 샘플을 채취할 수 있어, 비침습으로 각질층으로부터 단백질을 얻는 방법으로서 매우 유용하다.
피부의 노화도란, 가령에 의해 생긴 주름, 처짐 등의 피부 노화현상의 정도를 말한다. 주름, 처짐은 가령에 의해 진행하는 것이 명확하다. 또한, 가령에 더해 자외선 노출에 따라 주름, 처짐, 기미, 검버섯의 진행도는 증가한다. 주름, 처짐은 공지의 방법에 의해 측정할 수 있다(화장품의 유용성·평가기술의 진보와 장래 전망, 일본 화장품 기술자회, 약사 일보사, 154-158, 169-175, 179-182, 187-190, 2001).
또한, 가령에 따라 주름이나 처짐이 형성되어 오면, 피부의 내부에서는 표피세포 및 피부 섬유아세포 등의 피부 세포의 증식능이 저하하는 것이 알려지고 있다. 따라서 피부 세포의 증식능 저하를 지표로 피부의 노화도를 판정할 수 있다. 일례로서, 반복 계대하여 세포 노화시킨 표피 각화세포 및 피부 섬유아세포에서는 노화관련 β-갈락토시다아제(senescence-associated β-galactosidase; SA-β-Gal)가 증가하고, SA-β-Gal의 증가는 인간의 피부 노화와 상관하는 것이 보고되어 있다(Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 92, 9363-9367, 1995). 따라서, 본 시험에 있어서, 반복 계대하여 세포 노화시킨 표피 각화세포를 사용하여 발견한 각종 단백질은 인간의 피부 노화 마커로서 이용할 수 있는 가능성이 높다.
본 발명의 일례로서, 피부의 노화도는 이하와 같은 기준으로 판정할 수 있다.
실시예 2에 나타내는 케라틴 7, 케라틴 15 및 칼리크레인 7의 분석예와 같이, 각 연대의 자원봉사자로부터 피부 검체를 입수하고, 특정 마커 단백질의 발현량을 측정하여, 그들의 발현량과 피부 노화의 지표로서 알려져 있는 피부 탄력성이나 주름 정도의 표준곡선을 작성한다. 표준 검체와 분석 검체의 발현량의 비교로부터, 분석 검체의 피부 노화도를 판정한다. β2-마이크로글로불린에 대해서는, 각 연대의 자원봉사자로부터 피부 검체를 입수하고, 절단형과 비절단형의 비율의 평균치를 산출해 두어, 그 발현량과 피부 노화의 지표로서 알려져 있는 피부 탄력성이나 주름 정도의 표준곡선을 작성한다. 표준 검체와 분석 검체의 발현량의 비교로부터, 분석 검체의 피부 노화도를 판정한다.
본 발명은 피부의 노화도를 판정하기 위한 키트도 제공한다.
일례로서, 본 발명의 키트는 피부의 노화에 따라 발현이 변화하는 분비 단백질 및/또는 세포내 단백질을 특이적으로 인식할 수 있는 항체를 포함한다. 분비 단백질 및/또는 세포내 단백질은 칼리크레인 7, PAI-1, uPA, 매트립타아제, GRP 94, HSP 70, HSP 90, 갈렉틴-1, 갈렉틴-3, 갈렉틴-7, IGFBP-3, 에놀라아제-1, 아넥신 II, 에즈린, 라딕신, 모에신, 겔솔린, 케라틴 7, 케라틴 10, 케라틴 13, 케라틴 14, 케라틴 15, 케라틴 16, 케라틴 18, 케라틴 19, 케라틴 20 및 β2-마이크로글로불린으로 이루어진 군으로부터 선택하는 것이 바람직하다. 키트에는, 추가로 피부조직을 채취하기 위한 테이프, 테이프 상의 단백질을 면역화학적으로 검출하기 위한 시약 일식, 취급설명서 등이 포함되어도 된다. 취급설명서에는 키트의 사용방법 외에 피부 노화도의 판정기준 등도 기재해 두면 좋다.
다른 일례로서, 본 발명의 키트는 피부의 노화에 따라 발현이 변화하는 분비 단백질 및/또는 세포내 단백질의 mRNA와 특이적으로 하이브리다이즈할 수 있는 핵산 프로브를 포함한다. 분비 단백질 및/또는 세포내 단백질은 칼리크레인 7, PAI-1, uPA, 매트립타아제, GRP 94, HSP 70, HSP 90, 갈렉틴-1, 갈렉틴-3, 갈렉틴-7, IGFBP-3, 에놀라아제-1, 아넥신 II, 에즈린, 라딕신, 모에신, 겔솔린, 케라틴 7, 케라틴 10, 케라틴 13, 케라틴 14, 케라틴 15, 케라틴 16, 케라틴 18, 케라틴 19, 케라틴 20 및 β2-마이크로글로불린으로 이루어진 군으로부터 선택하는 것이 바람직하다. 키트에는, 추가로 피부조직을 채취하기 위한 테이프, 테이프 상의 피부조직으로부터 RNA를 추출하기 위한 시약류, RNA를 노던 블롯법으로 분석하기 위한 시약류, 취급설명서 등이 포함되어도 된다. 취급설명서에는 키트의 사용방법 외에 피부의 노화도 판정기준 등도 기재해 두면 좋다.
또한 다른 일례로서, 본 발명의 키트는 피부의 노화에 따라 발현이 변화하는 분비 단백질 및/또는 세포내 단백질의 mRNA와 특이적으로 하이브리다이즈할 수 있는 핵산 프라이머 및 상기 mRNA를 주형으로 하여 합성되는 cDNA와 특이적으로 하이브리다이즈할 수 있는 핵산 프라이머로 되는 한쌍의 핵산 프라이머를 포함한다. 분비 단백질 및/또는 세포내 단백질은 칼리크레인 7, PAI-1, uPA, 매트립타아제, GRP 94, HSP 70, HSP 90, 갈렉틴-1, 갈렉틴-3, 갈렉틴-7, IGFBP-3, 에놀라아제-1, 아넥신 II, 에즈린, 라딕신, 모에신, 겔솔린, 케라틴 7, 케라틴 10, 케라틴 13, 케라틴 14, 케라틴 15, 케라틴 16, 케라틴 18, 케라틴 19, 케라틴 20 및 β2-마이크로글로불린으로 이루어진 군으로부터 선택하는 것이 바람직하다. 키트에는, 추가로 피부조직을 채취하기 위한 테이프, 테이프 상의 피부조직으로부터 RNA를 추출하기 위한 시약류, RNA를 RT-PCR법으로 분석하기 위한 시약류, 취급설명서 등이 포함되면 된다. 취급설명서에는 키트의 사용방법 외에 피부의 노화도 판정기준 등도 기재해 두면 좋다.
본 발명은 피부의 노화방지에 효과가 있는 물질을 동정하는 방법도 제공한다. 이 방법은, 이하의 공정:
(a) 피험물질과 피부세포 및/또는 피부조직을 접촉시키는 공정,
(b) 공정 (a)에서 피험물질과 접촉시킨 피부세포 및/또는 피부조직을 소정 시간 배양하는 공정,
(c) 공정 (b)에서 배양한 피부세포 및/또는 피부조직에 있어서의 분비 단백질 및/또는 세포내 단백질의 발현을 측정하는 공정으로서, 상기 분비 단백질 및/또는 세포내 단백질은 피부의 노화에 따라 발현이 변화하는 것인 상기 공정, 및
(d) 공정 (c)에서 측정한 분비 단백질 및/또는 세포내 단백질의 발현을 대조의 피부세포 및/또는 피부조직에 있어서의 분비 단백질 및/또는 세포내 단백질의 발현과 비교함으로써, 피부세포 및/또는 피부조직에 있어서의 분비 단백질 및/또는 세포내 단백질의 발현에 대한 피험물질의 효과를 평가하는 공정을 포함한다.
피험물질은 어떤 물질이어도 되고, 단백질, 펩티드, 비타민, 호르몬, 다당, 올리고당, 단당, 저분자화합물, 핵산(DNA, RNA, 올리고뉴클레오티드, 모노뉴클레오티드 등), 지질, 상기 이외의 천연화합물, 합성화합물, 그들의 혼합물 등을 들 수 있다.
피부세포 및 피부조직에 대해서는 상기한 바와 같다.
피험물질과 피부세포 및/또는 피부조직의 접촉은 어떤 방법으로 해도 되고, 예를 들면 피험물질을 피부세포 및/또는 피부조직의 배양액에 첨가하는 방법, 피험물질을 도포 또는 고정한 배양용기 또는 배양시트 상에서 피부세포 및/또는 피부조직을 배양하는 방법 등을 들 수 있다. 또한, 인간 또는 인간 이외의 포유동물(예를 들면 마우스, 랫트, 모르모트, 토끼, 돼지 등) 등의 생체를 사용하고, 피험물질을 직접 피부에 도포하는 방법, 피험물질을 경구 투여하는 방법이어도 된다.
피부세포 및/또는 피부조직의 배양시간은 특별히 한정되지 않고, 피부세포 및/또는 피부조직에 있어서의 분비 단백질 및/또는 세포내 단백질의 발현 및/또는 그의 유전자 발현에 대한 피험물질 효과의 유무를 확인할 수 있는 정도의 시간이면 된다. 예를 들면, 피부세포로서 인간 정상 표피 각화세포를 사용한 경우에는, 12~48시간이 적당하고, 12~24시간이 바람직하다. 여기서 「피부세포 및/또는 피부조직을 배양한다」는 것은, 피부세포 및/또는 피부조직을 생육·증식시키는 것을 말하고, 이것에는, 단리한 피부세포 및/또는 피부조직을 생육·증식시키는 것 이외에, 피부세포나 피부조직을 갖는 생체 자체를 생존시키는 것, 사육하는 것, 배양하는 것 등도 포함된다.
비교의 대조가 되는 피부세포 및/또는 피부조직은 피험물질을 접촉시키기 전의 피부세포 및/또는 피부조직이어도 되고, 피험물질을 접촉시키지 않는 것 이외는 동일한 처리를 행한 피부세포 및/또는 피부조직이어도 된다.
분비 단백질 및/또는 세포내 단백질은 칼리크레인 7, PAI-1, uPA, 매트립타아제, GRP 94, HSP 70, HSP 90, 갈렉틴-1, 갈렉틴-3, 갈렉틴-7, IGFBP-3, 에놀라아제-1, 아넥신 II, 에즈린, 라딕신, 모에신, 겔솔린, 케라틴 7, 케라틴 10, 케라틴 13, 케라틴 14, 케라틴 15, 케라틴 16, 케라틴 18, 케라틴 19, 케라틴 20 및 β2-마이크로글로불린으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이 바람직하다.
본 발명의 일례로서, 표피 각화세포의 노화에 따라 GRP 94, HSP 70, HSP 90, 갈렉틴-1, 갈렉틴-3, 갈렉틴-7, IGFBP-3, 에놀라아제-1, 아넥신 II, 에즈린, 라딕신, 모에신, 겔솔린, 케라틴 10, 케라틴 13, 케라틴 14, 케라틴 15, 케라틴 16, 케라틴 18, 케라틴 19 및 케라틴 20의 발현량은 증가하고 있는 점으로부터, 피험물질을 접촉시킨 피부세포 및/또는 피부조직에 있어서, 이들 마커 단백질의 발현량이 대조와 비교하여 감소하고 있어, 피험물질이 이들 마커 단백질의 발현을 감소시키는 효과가 있다고 평가된 경우에도, 이 피험물질은 피부의 노화방지에 효과가 있는 물질이라고 동정할 수 있다.
또한, 본 발명의 다른 예로서, 표피 각화세포의 노화에 따라, 칼리크레인 7, PAI-1, uPA, 매트립타아제, 케라틴 7의 발현량은 감소하고 있는 점으로부터, 피험물질을 접촉시킨 피부세포 및/또는 피부조직에 있어서, 이들 마커 단백질의 발현량이 대조와 비교하여 증가하고 있어, 피험물질이 이들 마커 단백질의 발현을 증가시키는 효과가 있다고 평가된 경우에는, 이 피험물질은 피부의 노화방지에 효과가 있는 물질이라고 동정할 수 있다.
본 발명의 또 다른 예로서, 표피 각화세포의 노화에 따라, β2-마이크로글로불린의 절단형에 대한 비절단형의 비율이 증가하고 있는 점으로부터, 피험물질을 접촉시킨 피부세포 및/또는 피부조직에 있어서, β2-마이크로글로불린의 절단형에 대한 비절단형의 비율이 대조와 비교하여 감소하고 있어, 피험물질이 β2-마이크로글로불린의 절단형에 대한 비절단형의 비율을 감소시키는 효과가 있다고 평가된 경우에는, 이 피험물질은 피부의 노화방지에 효과가 있는 물질이라고 동정할 수 있다.
이하, 실시예를 토대로 하여 본 발명을 상세하게 설명하나, 본 발명은 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
[실시예 1]
실험방법
1. 세포 배양
정상 표피 각화세포(NHEK, Cambrex Corporation)를 무혈청 기초배지(KBM, Cambrex Corporation)에 첨가 인자(0.1 ng/㎖ EGF, 0.03 ㎎/㎖ 소 뇌하수체 배지(bovine pituitary medium), 5 ㎍/㎖ 인슐린, 0.5 ㎍/㎖ 히드로코르티손(hydrocortisone), GA-1000)를 첨가한 배지 KGM(+)을 사용하고, 37℃, 5% CO2 인큐베이터 내에서 배양하였다. 배양액 상청(CM; Conditioned medium) 및 세포 추출물(CL; Cell lysates)의 회수용에는 세포를 5×105개/150 ㎜ 접시에 뿌리고, 2일 간격으로 배지 교환하여, 포화될 때까지 배양하였다. 계대용에는 세포를 1×105개/60 ㎜ 접시에 뿌리고, 2일 간격으로 배지 교환하여, 80% 포화가 된 단계에서 계대하였다. NHEK는 약 5대째까지 계대 배양할 수 있어, 금번의 실험에 있어서는 5대째를 노화된 세포로서 사용하였다.
2. 정상 인간 표피 각화세포(NHEK)의 각 계대수에 있어서 SA-β-Gal의 측정
NHEK의 각 계대수에 있어서 SA-β-Gal을 노화세포 염색키트(Senescent Cells Staining Kit)(Sigma Corporation)를 사용하여 측정하였다. 계대용과는 별도로 세포를 1×105개/60 ㎜ 접시로 3 접시에 뿌리고, 80% 포화가 된 단계에서 세포를 2% 포름알데히드/0.2% 글루타르알데히드 수용액 중에서, 실온에서 7분간 고정하였다. 추가로 1×PBS(-)로 3회 세정 후, 염색용액(Staining Solution)을 첨가하여 37℃, 하룻밤 염색하였다. 3 접시 각각에 대해서, 세포 100개당의 SA-β-Gal 염색세포수를 계측하였다.
3. CM 및 CL의 조제
3-1. CM의 조제
NHEK가 포화된 접시를 KBM으로 2회 세정하고, KBM으로 교환하여 1일 배양하여, 첨가 인자를 완전히 제거하였다. 추가로 KBM으로 교환하여 2일 후에 CM을 회수하였다. 회수한 CM은 130×g으로 10분간 원심하여 부유세포를 제거한 후, 10,000×g으로 30분간 원심하고, 그 상청을 회수하였다. 이 CM에 황산 암모늄(Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)을 80% 포화가 되도록 첨가하고, 교반하면서 완전히 용해시켜 4℃에서 하룻밤 두었다. 그 후, 25,000×g으로 30분간 원심하여 단백질을 침전시켰다. 침전물을 20 mM Tris-HCl(pH 7.4)로 500배 농축이 되도록 용해하고, CM을 농축하였다. 추가로, 이 농축한 CM을 20 mM Tris-HCl(pH 7.4)로 투석하였다.
DC 프로테인 어세이 키트(DC protein assay kit)(Bio-Rad Loboratories Inc.)를 사용하여 브래드포드(Bradford)법에 의해 단백질을 정량하고, 웨스턴 블로팅용 샘플로서 사용하였다. 2차원 전기영동용에는 조정한 CM을 동결건조하고, 건조 분말을 최종적으로 500배 농축이 되도록 2차원 전기영동용 샘플 조제액{6.5 M 우레아(ICN Biomedicals, Inc.), 1.5 M 티오우레아(Sigma Corporation), 0.15% SDS(Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), 0.85% Triton X-100(Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), 0.4% CHAPS(Dojindo Loboratories), 2.5 mM 트리부틸 포스핀(Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)}에 용해하여, 도트·블롯법에 의해 단백질을 정량하였다.
3-2. CL의 조제
CM을 회수한 후의 접시를 PBS(-)로 3회 세정 후, -30℃에서 동결하고, 세포막을 파괴하였다. 그 후, 셀 스크레이퍼(Sumitomo Bakelite Co., Ltd.)를 사용하여 세포를 회수한 후, 30초간 초음파 처리하였다. 1% Triton X-100을 첨가한 후, 4℃에서 30분간 방치하였다. 그 후, 15,000×g, 30분간 원심하고, 불용물을 제거, 상청을 샘플로 하였다. 도트·블롯법에 의해 단백질을 정량하고, 웨스턴 블로팅용 샘플로서 사용하였다.
4. 단백질의 2차원 전기영동(2-DE) 해석
4-1. 1차원째 등전점 전기영동
60 ㎍의 단백질을 겔 팽윤액{5 M 우레아(Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), 2 M 티오우레아(Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), 0.5% 양성전해질(ampholytes)(pH 3.5~10)(Amersham Biosciences), 0.0025% 오렌지 G(Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), 2.5 mM 트리부틸 포스핀(Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), 1% Triton X-100}에 전량이 340 ㎕가 되도록 혼합한 후, Immobiline Dry-Strip gel(18 ㎝, pH 3-10, NL)(Amersham Biosciences)에 첨가하고, 20℃에서 하룻밤 팽윤시켰다. 전기영동장치(Anatech Corporation)를 사용하고, 1차원째는 20℃에서 500 V-2시간, 700 V-1시간, 1000 V-1시간, 1500 V-1시간, 2000 V-1시간, 3000 V-1시간, 3500 V-10시간의 프로그램으로 등전점 전기영동을 행하였다. 영동 후, 겔을 SDS 평형화 버퍼{5.8 M 우레아, 0.06 M 티오우레아, 0.5% 디티오트레이톨(DTT, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), 25% 글리세롤(Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), 0.0025% BPB(Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)}에 침지하여 실온에서 1시간 평형화하였다.
4-2. 2차원째 SDS-PAGE
2차원째는 Tris-Tricine계의 버퍼{음극 버퍼: 0.05 M Tris, 0.05 M Tricine(Bio-Rad Loboratories Inc.), 0.05% SDS, 양극 버퍼: 1 M Tris-HCl(pH 8.8)}을 사용하여 18 ㎝×18 ㎝의 7.5% 아크릴아미드겔에 의해 SDS-PAGE를 행하였다.
4-3. 전기영동 블롯법
SDS-PAGE 종료 후의 겔을, 세미드라이 타입 전사장치(Nihon Eido Co., Ltd)를 사용하고, 20 ㎝×20 ㎝의 PVDF막{ProBlot Membranes(Applied Biosystems)}에 150 ㎃의 정전류로 2시간 전사하였다. 전사 버퍼는 양극 1액: 0.3 M Tris-HCl(pH 10.4), 20% 메탄올(Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), 양극 2액: 25 mM Tris-HCl(pH 10.4), 20% 메탄올, 음극액: 25 mM Tris-HCl(pH 10.4), 20% 메탄올, 40 mM 6-아미노 헥산산(Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)을 사용하였다. 전사 후는 TTBS 버퍼{20 mM Tris-HCl(pH 7.5)(Bio-Rad Loboratories Inc.), 500 mM NaCl(Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), 0.3% Tween-20(Bio-Rad Loboratories Inc.)으로 20분간, 3회 세정한 후, 순수(純水)로 2분간, 3회 세정하였다. 다음으로 PVDF막을 비닐막에 실링하여 50 ㎖의 금 콜로이드 용액{Colloidal Gold Total Protein Staine(Bio-Rad Loboratories Inc.)}에 침지하고, 1~2시간 진탕시켜 단백질을 염색하였다. 그 후, 금 콜로이드 용액을 제거하고, 순수로 1시간, 5회 세정한 후, 건조시켰다.
5. 단백질의 동정
5-1. PVDF막에 전사된 단백질의 환원 S-알킬화와 프로테아제 소화
PVDF막에 전사된 단백질의 스폿을 잘라내고, 튜브에 넣어 환원용 버퍼{8 M 구아니딘-HCl(pH 8.5)(Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), 0.5 M 트리스베이스(Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), 0.3% EDTA-2Na(Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), 5% 아세토니트릴(Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)을 100~300 ㎕ 첨가하였다. 환원용 버퍼에 용해한 DTT 1 ㎎을 첨가하고 튜브 내를 질소 가스로 치환하여 실온, 1시간 정치하여 단백질을 환원하였다. 그 후, 1 M NaCl(Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)에 용해한 모노 요오드 초산(Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 3 ㎎을 첨가하여 차광상태에서 15~20분간 교반을 계속하여 S-카르복시메틸화를 행하였다. PVDF막을 꺼내 순수로 5분간 교반 세정 후, 2% 아세토니트릴(Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 중에서 동일하게 교반하였다. PVDF막을 꺼내 Lys-C 소화용 버퍼{70% 아세토니트릴/20 mM Tris-HCl(pH 9.0)}를 넣 은 튜브로 옮겨 2~3회 헹군 후, Lys-C 소화용 버퍼에 침지하여 1시간 프로테아제 소화하였다.
5-2. 질량분석과 펩티드 매스 핑거프린팅(peptide mass finger printing)
프로테아제 소화한 용액을 증류수로 7배 희석하여 아세토니트릴 농도를 10%로 하였다. 전처리로서 ZipTipc 18 피펫 칩(Millipore Corporation)의 충전제 부분을 활성화하기 위해 50% 아세토니트릴/0.1% 트리플루오로-초산(TFA, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)로 수회, 2% 아세토니트릴/0.1% TFA로 수회 흡인, 배출을 반복하였다. 다음으로 활성화한 ZipTipc 18 피펫 칩으로 프로테아제 소화액을 수회 흡인, 배출하여 단편화 펩티드를 충전 부분에 흡착시켰다. 추가로 2% 아세토니트릴/0.1% TFA를 수회 흡인, 배출하여 염류를 제거하였다. 50% 아세토니트릴/0.1% TFA에 용해한 포화 매트릭스 용액 0.5~1.0 ㎕를 흡인하여 10초 정도 놓아둔 후, 질량분석계 부속의 타겟 프로브에 적하하였다. 샘플을 건고시키고, 질량분석계(MALDI-TOF MS)로 측정하였다. 얻어진 질량치를 토대로 데이터 베이스(MS-Fit, Mascot Search)를 사용하여 단백질의 동정을 행하였다.
6. 웨스턴 블롯법
웨스턴 블롯용의 샘플을 사용하여 라엠리(Laemmli)의 Tris-Glycin계에 의해 SDS-PAGE를 행하였다. SDS-PAGE 후 겔 중의 단백질을 1 ㎠당 0.8 ㎃의 정전류로 PVDF막(Millipore Corporation)에 전사 후, 5% 스킴밀크/PBS(-)에 침지하고, 4℃, 하룻밤 블로킹하였다. PVDF막을 0.1% Tween20/PBS(-)로 3회 세정한 후, 1차 항체 용액에 침지하여 실온에서 1시간 진탕하였다.
사용한 1차 항체의 종류와 희석율은 다음과 같다: 토끼 항마스핀(anti-maspin) 다중클론항체(Santa Cruz Biotechnology)(1000배 희석), 마우스 항시스타틴 A(anti-cystatin A) 단일클론항체(Sigma)(1000배 희석), 토끼 항칼리크레인 7(anti-kallikrein 7) 다중클론항체(Santa Cruz Biotechnology)(1000배 희석), 양 항PAI-1(anti-PAI-1) 다중클론항체(Biopool)(1000배 희석), 마우스 항PAI-2(atni-PAI-2) 단일클론항체(American Diagnostica)(1000배 희석), 토끼 항uPA(anti-uPA) 다중클론항체(Santa Cruz Biotechnology)(1000배 희석), 토끼 항매트립타아제(anti-matriptase) 다중클론항체(Calbiochem)(1000배 희석), 랫트 항GRP94(anti-GRP94) 단일클론항체(Stressgeen)(1000배 희석), 마우스 항HSP70(anti-HSP70) 단일클론항체(Santa Cruz Biotechnology)(1000배 희석), 마우스 항HSP90(anti-HSP90) 단일클론항체(Santa Cruz Biotechnology)(1000배 희석), 토끼 항에놀라아제-1(anti-enolase-1) 다중클론항체(Santa Cruz Biotechnology)(1000배 희석), 토끼 항아넥신(anti-annexin) II 다중클론항체(Santa Cruz Biotechnology)(1000배 희석), 토끼 항에즈린/라딕신/모에신(anti-ezrin/radixin/moesin) 다중클론항체(Chemicon)(1000배 희석), 마우스 항겔솔린(anti-gelsolin) 단일클론항체(Sigma Corporation)(1000배 희석), 마우스 항갈렉틴-1(anti-galectin-1) 단일클론항체(R&D Systems)(1000배 희석), 마우스 항갈렉틴-3(anti-galectin-3) 단일클론항체(Novocastra Laboratories)(1000배 희석), 마우스 항갈렉틴-7(anti-galectin-7) 단일클론항체(R&D Systems)(1000배 희석), 염소 항IGFBP-3(anti-IGFBP-3) 다중클론항체(Santa Cruz Biotechnology)(1000배 희석), 토끼 항매트립타아제(anti- matriptase) 다중클론항체(Calbiochem)(1000배 희석), 마우스 항β2-마이크로글로불린(anti-β2-microglobulin) 단일클론항체(Sigma)(1000배 희석), 마우스 항케라틴 3(anti-keratin 3) 단일클론항체(Cymbus Biotechnology)(1000배 희석), 마우스 항케라틴 5(anti-keratin 5) 단일클론항체(Chemicon International Inc.)(1000배 희석), 마우스 항케라틴 7(anti-keratin 7) 단일클론항체(Chemicon)(1000배 희석), 마우스 항케라틴 8(anti-keratin 8) 단일클론항체(Chemicon)(1000배 희석), 마우스 항케라틴 10(anti-keratin 10) 단일클론항체(Chemicon)(1000배 희석), 마우스 항케라틴 13(anti-keratin 13) 단일클론항체(Cymbus Biotechnology)(500배 희석), 마우스 항케라틴 14(anti-keratin 14) 단일클론항체(Cymbus Biotechnology)(500배 희석), 마우스 항케라틴 15(anti-keratin 15) 단일클론항체(Cymbus Biotechnology)(500배 희석), 마우스 항케라틴 16(anti-keratin 16) 단일클론항체(Cymbus Biotechnology)(500배 희석), 마우스 항케라틴 17(anti-keratin 17) 단일클론항체(Chemicon)(1000배 희석), 마우스 항케라틴 18(anti-keratin 18) 단일클론항체(Chemicon)(1000배 희석), 마우스 항케라틴 19(anti-keratin 19) 단일클론항체(Cymbus Biotechnology사)(500배 희석), 마우스 항케라틴 20(anti-keratin 20) 단일클론항체(Cymbus Biotechnology)(500배 희석)
1차 항체로서 양 항PAI-1 다중클론항체, 마우스 항PAI-2 단일클론항체, 토끼 항uPA 다중클론항체, 토끼 항매트립타아제 다중클론항체를 사용한 경우는, 2차 항체로서 비오틴화 항염소 IgG(biotinylated anti-goat IgG)(Vector Laboratories)(1000배 희석) 또는 비오틴화 항양 IgG(biotinylated anti-sheep IgG)(Vector Laboratories)(1000배 희석)를 사용하였다. 2차 항체 용액에 침지하여 실온에서 1시간 진탕하였다. 다음으로, 알칼리포스파타아제-콘쥬게이티드 아비딘 D(Vector Laboratories)(1000배 희석) 용액에 침지하여 실온에서 1시간 반응시켰다. 다음으로 0.6 ㎎/㎖ 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴포스페이트(Vector Laboratories), 1.2 ㎎/㎖ 니트로블루테트라졸리움(Vector Laboratories), 0.1 M Tris-HCl(pH 9.5), 5 mM MgCl2(Wako chemicals, Japan)로 발색시켰다.
상기 이외의 1차 항체를 사용한 경우는 2차 항체로서 호스래접시 퍼옥시다아제 표지 항마우스 IgG(Horseradish peroxidase labeled anti-mouse IgG)(Amersham Bioscience)(5000배 희석), 호스래접시 퍼옥시다아제 표지 항토끼 IgG(Amersham Bioscience)(5000배 희석), 호스래접시 퍼옥시다아제 표지 항랫트 IgG(Amersham Bioscience)(5000배 희석) 또는 호스래접시 퍼옥시다아제 표지 항염소 IgG(Santa Cruz)(5000배 희석)를 사용하였다. 다음으로 ECL(Enhanced chemi luminescence) 키트(Amersham Bioscience)를 사용하여 검출하였다.
7. 피부 노화 마커로서의 판정
웨스턴 블롯법에 의해 검출한 단백질 발현량을 NIH 이미지에 의해 수치화하고, 5대째의 단백질 발현량을 2대째의 단백질 발현량으로 나눈 값을 산출하였다. 산출한 값이 2.0 이상인 경우는 표피 각화세포의 노화에 따라 발현량이 유의하게 증가하였다고 판정하고, 0.5 미만인 경우는 표피 각화세포의 노화에 따라 발현량이 유의하게 감소하였다고 판정하였다. 한편, 산출한 값이 0.5 이상 2.0 미만인 경우 는 표피 각화세포의 노화에 따른 발현변화는 없다고 판정하였다.
실험결과
1. 표피 각화세포의 노화에 따른 형태변화
인간 정상세포는 일정 횟수 분열하면 증식이 정지한다. 이 현상은 세포 노화라고 불리나, 이 분열 횟수는 세포종에 따라 상이하다. 금번 실험에서 사용한 인간 표피 각화세포는 반복 계대함으로써 약 5대째에서 증식이 정지한다. 도 1의 (a)에서는 150 ㎜ 접시가 포화가 될 때까지의 일수를 각 계대수로 플롯한 것을 나타내고 있다. 접시가 포화가 될 때까지의 일수가 1대째에서는 6일간 걸렸던 것에 대해서 5대째에서는 28일간으로 1대째~5대째까지 지수함수적으로 증식속도가 느려지고 있다. 또한 6대째에서는 완전히 증식이 정지하였다. 또한, 세포의 형태도 2대째에 비해 5대째에서는 세포의 크기가 2배 정도 커지고, 세포 노화에서 관찰되는 편평 비대화의 형태를 나타냈다{도 1(b)}.
또한, 반복 계대한 표피 각화세포의 증식이 저하하는 원인으로서, 세포 노화 또는 최종 분화의 가능성이 있다. 이에, 실제로 표피 각화세포가 노화하고 있는지를 판별하기 위해, 최종 분화에서는 발현하지 않고, 세포 노화에서만 발현하는 것이 알려져 있으며, 표피 각화세포의 노화와 피부조직에서의 노화의 마커로서 동정된 SA-β-Gal의 활성을 조사하였다(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92, 9363-9367, 1995). 2대째에서는 SA-β-Gal을 나타내는 파랗게 염색된 세포는 보이지 않았으나, 5대째에서는 파랗게 염색된 세포가 약 반수까지 증가하였다(도 2).
이상의 결과로부터 2대째의 세포를 젊은 세포, 5대째의 세포를 노화세포로서 사용하여, 세포 노화 마커의 탐색을 행하였다.
2. 표피 각화세포의 노화에 따라 변화하는 분비 단백질의 2차원 전기영동에 의한 해석
2~5대째의 CM을 조제하고, 2차원 전기영동에 의해 발현이 변화하는 단백질을 해석하였다(도 3). 젊은 세포(2대째)와 노화한 세포(5대째)의 세포 배양상청액(CM)의 스폿을 비교한 결과, 세포 노화에 따라 발현이 감소한 단백질이 19개(표 1), 세포 노화에 따라 발현이 증가한 단백질이 49개 동정되었다(표 2). 동정된 단백질에는 마스핀, 시스타틴 A 및 HSP 27 등 기지의 피부 노화 마커가 포함되어 있어, 본 시험에서 실시한 2차원 전기영동에 의한 해석은 피부 노화에 따라 변화하는 단백질을 동정하는데 적절한 방법이라고 생각되었다. 본 시험에서는 초미량 단백질(1 femto-㏖ 이하)의 동정을 가능하게 하는 기술을 사용한 점으로부터, 기지의 피부 노화 마커 단백질 이외에도 신규의 피부 노화 마커 단백질이 동정되었다. 표피 각화세포의 노화에 따라 발현이 감소한 주된 분비 단백질로서는 β-2 마이크로글로불린, PAI-1 및 칼리크레인 7 등이 동정되었다. 한편, 표피 각화세포의 노화에 따라 발현이 증가한 분비 단백질로서는 모에신, 케라틴 1 및 케라틴 9 등이 동정되었다.
2차원 전기영동 해석에 의해 표피 각화세포의 노화에 따라 발현이 감소한 단백질을 표 1에 나타낸다.
Figure 112008017526902-PCT00001
2차원 전기영동 해석에 의해 표피 각화세포의 노화에 따라 발현이 증가한 단백질을 표 2에 나타낸다.
Figure 112008017526902-PCT00002
3. 표피 각화세포의 노화에 따라 발현이 변화하는 분비 단백질 및 세포내 단백질의 웨스턴 블로팅에 의한 해석
상기 단백질의 노화에 따른 발현변화를 추가로 확인하기 위해, 각각의 항체를 사용하여 웨스턴 블로팅을 행하였다. 2차원 전기영동에 의한 분석에서는 단백질량을 맞추어 비교 해석하였다. 그러나, 표피 각화세포는 노화와 동시에 형태도 변화하여 편평 비대화하는 점으로부터, 같은 포화상태에서도 세포수가 상이해진다. 실제로 세포 1개당 분비 단백질량을 계산하면 세포 배양상청액(CM), 세포 용해액(CL), 세포외 매트릭스(ECM) 중 어느 샘플에 있어서도 표피 각화세포의 노화에 따라 단백질량이 증가하는 것을 알 수 있었다. 이에, 세포수를 합친 것과 단백질량을 합친 것 2개의 샘플에 대해서, 웨스턴 블로팅으로 각 단백질 발현량의 변화를 조사하였다. 세포수를 합친 것과 단백질량을 합친 것에서, 어느 쪽이 표피 각화세포의 노화를 조사하는데 적합한가를 검증하기 위해, 피부 노화에 따라 데미지가 축척되는 피부 기저막의 주요 구성성분으로, 기저막 케어의 중요한 성분인 라미닌 5(Laminin 5)(Laminin α3, Laminin β3, Laminin γ2의 삼량체){J. Soc. Cosmet. Chem. Jpn., 총설, 35(1), 1-7, 2001} 및 피부 노화에 따라 발현이 저하하는 것이 알려져 있는 피브로넥틴(Fibronectin){Ann Pathol., 4(3), 185-94, 1984}의 발현변화를 조사하였다. 그 결과, CM에 있어서 라미닌 5의 발현은 세포수로 합친 것에서는 변화가 없으나, 단백질량으로 합친 것에서는 발현량이 감소하였다(도 4). 마찬가지로, CM에 있어서 피브로넥틴의 발현은 세포수로 합친 것에서는 증가했으나, 단백질량으로 합친 것에서는 발현량이 감소하였다. 이상의 결과로부터, 단백질량을 합친 것에서 발현변화를 해석하는 쪽이 적절하다는 것이 판명되었다.
여기서는 각종 항체를 사용한 웨스턴 블로팅의 결과로서 세포수를 합친 것, 단백질량을 합친 것 양쪽을 나타내고 있으나, 전술의 결과로부터 단백질량을 합친 것의 결과에 의해 표피 각화세포의 노화와의 상관 유무를 판단하였다.
먼저, 프로테아제 및 프로테아제 억제제에서는, 세린 프로테아제 억제제인 마스핀, PAI-2, 시스테인 프로테아제 억제제인 시스타틴 A가 노화에 따라 발현량이 증가하였다{도 5의 (a), (b)}. 한편, 세린 프로테아제인 칼리크레인 7, uPA, 막 결합형 세린 프로테아제인 매트립타아제, 세린 프로테아제 억제제인 PAI-1이 노화에 따라 발현량이 감소하였다. 또한, β2-마이크로글로불린은 산성 프로테아제에 의해 절단되는 것이 알려져 있으나, 노화에 따라 절단형(13 kDa)이 감소하고, 비절단형(14 kDa)이 증가하는 것을 알 수 있었다{도 5(a)}.
세포내 단백질인 열 쇼크 단백질의 일종인 HSP 70, HSP 90, GRP 94(GRP 94만이 시그널 펩티드를 가짐)는 노화에 따라 CM으로의 분비가 많아지나, CL에서의 발현량은 변화하지 않았다(도 6).
세포내의 해당계 효소인 에놀라아제-1, 세포막의 인지질과 결합하는 아넥신 II, 세포골격계 단백질인 에즈린/모에신/라딕신은 노화에 따라 CM으로의 분비량이 증가하는 것을 알 수 있었다(도 7). 세포골격계 단백질인 겔솔린은 CM으로의 분비량은 변화하지 않았으나, CL에서의 발현량은 증가하였다(도 7).
렉틴 패밀리 중 하나인 갈렉틴-1, 갈렉틴-3, 갈렉틴-7 및 IGFBP-3는 표피 각화세포의 노화에 따라 세포외로 분비된 단백질의 발현량이 유의하게 증가하였다(도 8). 한편, 갈렉틴-1, 갈렉틴-3, 갈렉틴-7 및 IGFBP-3는 CL에는 검출되지 않았다(도 8).
세포골격계 단백질인 케라틴 중에서 13종류(Keratin 3, 5, 7, 8, 10, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 및 20)에 대해서 조사하였다. 그 결과 케라틴 10, 13, 14, 15, 16, 18, 19 및 20은 표피 각화세포의 노화에 따라 세포내에서의 발현이 유의하게 증가하였다(도 9). 한편, 케라틴 7은 표피 각화세포의 노화에 따라 세포내에서의 발현이 유의하게 감소하였다(도 9). 케라틴 3, 5, 8 및 17은 발현이 변화하지 않았다. 케라틴류는 CM에는 검출되지 않았다.
1차원 웨스턴 블로팅 해석에 의해 표피 각화세포의 노화에 따라 발현이 변화한 단백질을 표 3에 정리하였다.
1차원 웨스턴 블로팅 해석에 의해 표피 각화세포의 노화에 따라 발현이 변화한 단백질을 표 3에 나타낸다.
Figure 112008017526902-PCT00003
[실시예 2]
실험방법
1. 눈가의 탄력성 및 주름 체적율의 측정
20~60대의 여성 59명을 대상으로, 눈가의 탄력성 및 주름 체적율을 측정하였다. 눈가의 탄력성은 흡인 탄력성을 Cutometer(Courage + Khazaka electronic GmbH)로 측정하였다. 흡인 탄력성은 피부 탄력성의 지표가 되는 측정방법으로, 가령에 따라 탄력성이 저하하는 것이 명확해져 있다. 눈가의 주름 체적율은 이제(二劑)혼합형 레플리카제인 스킨 캐스트(Yamada Cosmetic Laboratories)를 사용하여 눈가의 레플리카를 채취하고, 레플리카 화상 해석에 의해 주름의 체적율을 계측하였다. 레플리카 화상 해석은 반사용 레플리카 해석 시스템 ASA-03RXD를 사용하여 행하였다. ASA-03RXD를 사용하여, 채취한 레플리카에 각도 30도의 평행광을 조사함으로써 얻어지는 주름의 형상에 따른 음영화상을 CCD 카메라로 촬상하고, 컴퓨터에 입력 화상 처리함으로써 레플리카 표면의 주름 체적율(㎛3/㎟/100)을 계측하였다. 주름 체적율은 가령에 따라 증가하는 것이 명확해져 있다.
2. 눈가의 각질층으로부터의 단백질 추출
20~60대의 여성 59명을 대상으로, 눈가로부터 각질층 체커(Asahibiomed Co., Ltd.)를 사용하여 각질층을 박리하고, 그로부터 단백질 추출 용액을 사용하여 단백질을 추출하였다. 구체적으로는 피험자의 눈가에 각질층 체커를 붙이고, 손끝으로 가볍게 문지르듯 붙였다. 이를 3회 반복하였다. 그 후, 3장의 각질층 체커에 첩부(貼付)된 각질층에 각각 50 ㎕의 단백질 추출 용액{50 mM Tris-HCl(pH 7.5), 120 mM NaCl, 0.4% Igepal CA-630(Sigma-Aldrich Co.)}을 첨가하고, 셀 스크레이퍼를 사용하여 각질층을 단백질 추출 용액에 융화시킨 후, 용액을 1.5 ㎖의 플라스틱 튜브(Eppendorf AG)에 회수하였다.
10,000×g, 15분간 원심하고, 불용액을 침전시켜, 상청을 새로운 1.5 ㎖의 플라스틱 튜브에 회수하였다. 회수한 샘플의 단백질량을 DC 어세이 키트를 사용하여 측정하였다.
3. 피부 노화 마커의 측정
눈가 각질층으로부터 추출한 단백질 10 ㎍을 사용하고, 실시예 1에 기재한 케라틴 7, 케라틴 15 및 칼리크레인 7의 항체를 사용하여 웨스턴 블롯법에 의해 검출하였다. 검출한 밴드의 강도를 덴시토미터(Molecular Dinamics Co., Ltd.)에 의해 측정하고, NIH 이미지에 의해 수치화하였다.
실험 결과
표피 각화세포의 노화에 따라 발현이 변화하는 단백질 중에서 케라틴 7, 케라틴 10, 케라틴 15 및 칼리크레인 7에 대해서 인간의 피부 노화도와의 상관 유무를 조사하였다.
케라틴에 대해서는 케라틴 10이 피부 노화에 따라 발현이 저하하는 것이 명확해져 있는 점으로부터, 케라틴 10과 케라틴 7 및 케라틴 15에서 어느 종류의 케라틴이 인간의 피부 노화도와의 상관이 있는지 여부를 조사하였다. 케라틴 10과 케라틴 15의 연령과의 상관을 조사한 결과, 케라틴 10은 연령과의 상관은 보이지 않고, 케라틴 15는 연령과의 상관이 보여진 점으로부터, 케라틴 15는 기존의 피부 노화 마커에 비해서 보다 적절한 피부 노화 마커인 것이 명확해졌다(도 10 및 도 11).
인간의 피부 노화도의 지표로서, 가령과의 상관이 명확해지고 있는 눈가의 탄력성과 주름 체적율을 사용하였다. 본 시험에서 피부 노화도를 측정한 20~60대의 여성 59명에 있어서도, 가령에 따라 눈가의 탄력성은 유의하게 감소하고, 주름 체적율은 유의하게 증가하였다(도 12 및 13).
케라틴 7의 발현량과 눈가 탄력성의 상관을 도 14에, 케라틴 15의 발현량과 눈가 탄력성의 상관을 도 15에 나타내었다. 케라틴 7의 발현량은 눈가 탄력성의 저하에 따라 유의하게 감소하고, 케라틴 15의 발현량은 눈가 탄력성의 저하에 따라 유의하게 증가하였다. 케라틴 7의 발현량과 주름 체적율의 상관을 도 16에, 케라틴 15의 발현량과 주름 체적율의 상관을 도 17에 나타내었다. 케라틴 7의 발현량은 눈가 주름 체적율의 증가에 따라 유의하게 감소하고, 케라틴 15의 발현량은 눈가 주름 체적율의 증가에 따라 유의하게 증가하였다.
또한, 칼리크레인 7에 대해서 피부 노화도와 발현의 상관을 조사하였다. 칼리크레인 7의 발현량과 눈가 탄력성의 상관을 도 18에, 칼리크레인 7의 발현량과 눈가의 주름 체적율의 상관을 도 19에 나타내었다. 칼리크레인 7의 발현량은 눈가 탄력성의 저하에 따라 유의하게 감소하고, 눈가의 주름 체적율의 증가에 따라 유의하게 감소하였다.
이상의 결과로부터, 표피 각화세포의 세포 노화를 지표로 발견한 3종의 마커(케라틴 7, 케라틴 10 및 칼리크레인 7)가 인간의 피부 노화도와 상관하는 것이 명확해졌다.
세포 노화에 따라 발현이 증가 또는 감소하는 단백질 및 절단형으로부터 비절단형으로 변화하는 단백질을 발견하였다. 이들 새롭게 발견된 단백질은 피부 노화의 진단 마커로서 화장품의 카운슬링 시스템 등으로의 응용을 기대할 수 있다. 또한, 이들 단백질의 발현을 지표로서 보다 유효한 화장품이나 건강식품을 개발하 는 것도 기대할 수 있다.

Claims (12)

  1. 피부세포 및/또는 피부조직에 있어서의 분비 단백질 및/또는 세포내 단백질의 발현 및/또는 그의 유전자 발현을 측정하는 것을 포함하는, 피부의 노화도를 판정하는 방법으로서, 상기 분비 단백질 및/또는 세포내 단백질은 피부의 노화에 따라 발현이 변화하는 것인 상기 방법.
  2. 제1항에 있어서, 분비 단백질 및/또는 세포내 단백질이 칼리크레인 7(Kallikrein 7), 플라스미노겐 활성화제 억제제-1(Plasminogen activator inhibitor(PAI)-1), 우로키나아제 플라스미노겐 활성화제(Urokinase plasminogen activator, uPA), 매트립타아제(Matriptase), 글루코오스 조절 단백질(Glucose regulated protein, GRP) 94, HSP 70, HSP 90, 갈렉틴-1(Galectin-1), 갈렉틴-3(Galectin-3), 갈렉틴-7(Galectin-7), 인슐린 성장인자 결합 단백질-3(Insulin growth factor binding protein(IGFBP)-3), 에놀라아제-1(Enolase-1), 아넥신(Annexin) II, 에즈린(Ezrin), 라딕신(Radixin), 모에신(Moesin), 겔솔린(Gelsolin), 케라틴 7(Keratin 7), 케라틴 10(Keratin 10), 케라틴 13(Keratin 13), 케라틴 14(Keratin 14), 케라틴 15(Keratin 15), 케라틴 16(Keratin 16), 케라틴 18(Keratin 18), 케라틴 19(Keratin 19), 케라틴 20(Keratin 20) 및 β2-마이크로글로불린(β2-microglobulin)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 분비 단백질 및/또는 세포내 단백질의 발현을 단백질 레벨에서 측정하는 방법.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 분비 단백질 및/또는 세포내 단백질의 유전자 발현을 RNA 레벨에서 측정하는 방법.
  5. 피부의 노화에 따라 발현이 변화하는 분비 단백질 및/또는 세포내 단백질을 특이적으로 인식할 수 있는 항체를 포함하는, 피부의 노화도를 판정하기 위한 키트.
  6. 제5항에 있어서, 분비 단백질 및/또는 세포내 단백질이 칼리크레인 7, PAI-1, uPA, 매트립타아제, GRP 94, HSP 70, HSP 90, 갈렉틴-1, 갈렉틴-3, 갈렉틴-7, IGFBP-3, 에놀라아제-1, 아넥신 II, 에즈린, 라딕신, 모에신, 겔솔린, 케라틴 7, 케라틴 10, 케라틴 13, 케라틴 14, 케라틴 15, 케라틴 16, 케라틴 18, 케라틴 19, 케라틴 20 및 β2-마이크로글로불린으로 이루어진 군으로부터 선택되는 키트.
  7. 피부의 노화에 따라 발현이 변화하는 분비 단백질 및/또는 세포내 단백질의 mRNA와 특이적으로 하이브리다이즈할 수 있는 핵산 프로브를 포함하는, 피부의 노화도를 판정하기 위한 키트.
  8. 제7항에 있어서, 분비 단백질 및/또는 세포내 단백질이 칼리크레인 7, PAI-1, uPA, 매트립타아제, GRP 94, HSP 70, HSP 90, 갈렉틴-1, 갈렉틴-3, 갈렉틴-7, IGFBP-3, 에놀라아제-1, 아넥신 II, 에즈린, 라딕신, 모에신, 겔솔린, 케라틴 7, 케라틴 10, 케라틴 13, 케라틴 14, 케라틴 15, 케라틴 16, 케라틴 18, 케라틴 19, 케라틴 20 및 β2-마이크로글로불린으로 이루어진 군으로부터 선택되는 키트.
  9. 피부의 노화에 따라 발현이 변화하는 분비 단백질 및/또는 세포내 단백질의 mRNA와 특이적으로 하이브리다이즈할 수 있는 핵산 프라이머 및 상기 mRNA를 주형으로 하여 합성되는 cDNA와 특이적으로 하이브리다이즈할 수 있는 핵산 프라이머로 되는 한쌍의 핵산 프라이머를 포함하는, 피부의 노화도를 판정하기 위한 키트.
  10. 제9항에 있어서, 분비 단백질 및/또는 세포내 단백질이 칼리크레인 7, PAI-1, uPA, 매트립타아제, GRP 94, HSP 70, HSP 90, 갈렉틴-1, 갈렉틴-3, 갈렉틴-7, IGFBP-3, 에놀라아제-1, 아넥신 II, 에즈린, 라딕신, 모에신, 겔솔린, 케라틴 7, 케라틴 10, 케라틴 13, 케라틴 14, 케라틴 15, 케라틴 16, 케라틴 18, 케라틴 19, 케라틴 20 및 β2-마이크로글로불린으로 이루어진 군으로부터 선택되는 키트.
  11. 피부의 노화방지에 효과가 있는 물질을 동정하는 방법으로서, 이하의 공정:
    (a) 피험물질과 피부세포 및/또는 피부조직을 접촉시키는 공정,
    (b) 공정 (a)에서 피험물질과 접촉시킨 피부세포 및/또는 피부조직을 소정 시간 배 양하는 공정,
    (c) 공정 (b)에서 배양한 피부세포 및/또는 피부조직에 있어서의 분비 단백질 및/또는 세포내 단백질의 발현 및/또는 그의 유전자 발현을 측정하는 공정으로서, 상기 분비 단백질 및/또는 세포내 단백질은 피부의 노화에 따라 발현이 변화하는 것인 상기 공정, 및
    (d) 공정 (c)에서 측정한 분비 단백질 및/또는 세포내 단백질의 발현 및/또는 그의 유전자 발현을 대조의 피부세포 및/또는 피부조직에 있어서의 분비 단백질 및/또는 세포내 단백질의 발현 및/또는 그의 유전자 발현과 비교함으로써, 피부세포 및/또는 피부조직에 있어서의 분비 단백질 및/또는 세포내 단백질의 발현 및/또는 그의 유전자 발현에 대한 피험물질의 효과를 평가하는 공정
    을 포함하는 상기 방법.
  12. 제11항에 있어서, 분비 단백질 및/또는 세포내 단백질이 칼리크레인 7, PAI-1, uPA, 매트립타아제, GRP 94, HSP 70, HSP 90, 갈렉틴-1, 갈렉틴-3, 갈렉틴-7, IGFBP-3, 에놀라아제-1, 아넥신 II, 에즈린, 라딕신, 모에신, 겔솔린, 케라틴 7, 케라틴 10, 케라틴 13, 케라틴 14, 케라틴 15, 케라틴 16, 케라틴 18, 케라틴 19, 케라틴 20 및 β2-마이크로글로불린으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
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