JP6531906B2 - 皮膚状態の評価方法 - Google Patents

Description

本発明は、皮膚状態の評価方法に関し、詳しくは、主要な皮膚タンパク質であるケラチン中の特定の位置のアミノ酸のカルボキシエチル化、および／またはカルボキシメチル化を検出することにより、それを指標として皮膚の状態を評価する方法に関する。

メイラード反応は、ブドウ糖などの還元糖によるタンパク質の非酵素的糖化反応であり、近年、生体内におけるメイラード反応が糖尿病性合併症、非糖尿病性腎症および老化に伴う疾患など種々の疾患の発症要因の１つであることが明らかにされた。

メイラード反応は、大きく前期反応と後期反応の二段階に分けられている。前期段階では、タンパク質のアミノ基と還元糖との反応によりアマドリ転位生成物（前期反応生成物）が可逆的に生成される。生体内における前期反応生成物として、ヘモグロビンＡｌｃおよびフルクトサミン（糖化アルブミン）が知られており、糖尿病における臨床マーカーとして用いられている。後期段階では、酸化・脱水・重合・開裂などの複雑な反応を経てＡＧＥs（ａｄｖａｎｃｅｄ ｇｌｙｃａｔｉｏｎ ｅｎｄ ｐｒｏｄｕｃｔｓ）と呼ばれる後期反応生成物が不可逆的に生成される。このようにＡＧＥsは、タンパク質のアミノ基と還元糖との間になされる反応で形成される構造体である。ＡＧＥsの特徴として褐色変化、蛍光性、あるいは分子内・分子間架橋形成などが挙げられている。ＡＧＥsの構造として、例えば、ピラリン、ペントシジン、クロスリン、イミダゾロン、カルボキシメチルリジン、およびカルボキシエチルリジンなどが報告されている。

メイラード反応は、健常人でも見られる現象であるが、糖尿病のような高血糖状態が持続する場合や、腎臓疾患のようなクリアランスの低下が認められる場合、あるいは加齢により、代謝速度の遅いタンパク質にＡＧＥｓが蓄積されることが報告されている。

生体内でのＡＧＥｓの生成が報告されているタンパク質として、ヘモグロビン、アルブミン、皮膚や血管壁等の結合組織のコラーゲンやエラスチン、神経ミエリン、眼球クリスタリンなどがあり、これらのタンパク質がメイラード反応を受けることによって、タンパク質の変性、機能低下および異常をもたらし、血管系の障害、腎症、神経障害、網膜症および白内障などの糖尿病性合併症や老化に伴う疾患を引き起こす原因の１つと考えられている。

そのため、早期にＡＧＥｓの生成および蓄積を把握することは、糖尿病、糖尿病性合併症、非糖尿病性腎症ならびに老化に伴う疾患などの予防および治療に対して極めて有効であると考えられている。ＡＧＥｓ量の測定は、当初、蛍光強度を用いて行われていた。
ＡＧＥｓ量の測定は、例えば蛍光性ＡＧＥｓを測定する場合、サンプルを加熱処理し分解した後でＨＰＬＣ分析を行う。この際、アーティファクトとしてペントシジンが生成することが知られており、このような加熱処理法では、正確なＡＧＥｓ量を求めることができない。また、蛍光検出によるＨＰＬＣ分析は、前処理などの操作が煩雑で、且つ、一定時間当たりの検体処理数が少ない。そのため、加熱処理を必要とせず、多検体処理できる簡便な測定方法が求められている。

そこで、近年、ＡＧＥｓ量の測定は主に抗メイラード反応後期生成物抗体（以下、「抗ＡＧＥｓ抗体」という）を用いた抗原抗体反応により行われている。例えば、荒木らは、抗Ｎ-カルボキシメチルリジン（以下単にカルボキシメチルリジン又はＣＭＬとも記載する）抗体（６Ｄ１２抗体）を世界にさきがけて開発し、ＣＭＬが加齢や糖尿病合併症の指標となる事を明らかにした（非特許文献１〜３）。

臨床検査で用いられる方法としては、血液中のヘモグロビンあるいはアルブミン中のＡＧＥｓ量を抗ＡＧＥｓ抗体で測定する方法が報告されている。さらに、血漿または血清を用いて、実際には摘出検査が困難な臓器中のＡＧＥｓの存在を知ることを目的として、血液または血清中のＡＧＥｓに対する自己抗体の測定方法が報告されている（特許文献１）。

また、生体内では種々のＡＧＥｓが形成されるが、この中でN−カルボキシメチルリジン（ＣＭＬ）は多くの組織で観察される構造体で、加齢により蓄積され、他のＡＧＥｓとともに組織の弾性低下の要因となっていることが知られている（非特許文献４）。皮膚においては、真皮に存在するターンオーバーの遅いタンパク質（フィブロネクチン、ラミニン、コラーゲン、エラスチン）でのＣＭＬ形成が知られており、光老化で重要な役割を果たしていると考えられてきた（非特許文献５）。

さらに、川端らは、ターンオーバーの短い表皮にもＣＭＬが存在することを発見し、ヒト皮膚切片の蛍光染色から表皮にＣＭＬシグナルが存在することを見出し、ヒト角層の加水分解物からＬＣ−ＭＳ／ＭＳを用いてＣＭＬの存在を明示した。加えて、角層から抽出したタンパク質の２次元電気泳動を用いた解析から、ケラチン１０が表皮でＣＭＬ化されるタンパク質の候補であることを提示するとともに、ＣＭＬの存在が示唆されるケラチン１０のアミノ酸断片配列を開示している（非特許文献６）。

他に、皮膚におけるＡＧＥｓについては、真皮（特許文献２）および表皮（特許文献３，４）における存在が報告されている。そして、真皮ＡＧＥｓの産生を抑制することによる皮膚老化防止または改善、美白剤を併用した皮膚外用剤による美白作用などが知られている。さらに、表皮の角層中のＡＧＥｓを検出する方法（特許文献３）や、表皮の角層中のＡＧＥｓの存在量を指標とした、表皮弾力性および／または皮膚表面形態の皮膚状態の評価方法が提案されている（特許文献４）。これらの報告はいずれも、粘着テープを用いたテープストリッピングにより角層採取を行い、タンパク質中のＮ−カルボキシメチルリジンを認識する抗ＡＧＥｓモノクローナル抗体（６Ｄ１２抗体）を用いて角層中のＡＧＥｓの存在を検出している。

しかしながら、ＣＭＬはＡＧＥｓ構造の中で最も抗原性が高く安定であるが、現状の抗ＣＭＬ抗体（荒木らが世界で初めて開発したものを中心として）は多種類のタンパク質に形成されるＣＭＬと非常に高く反応するため、どの組織／細胞のどのタンパク質に発現するのかなどを詳細に調べること、すなわち生物学的意義の詳細を調べることが困難である。すなわち、抗ＣＭＬ抗体（６Ｄ１２抗体）を用いる方法は、特異性が低く、特定のタンパク質のＡＧＥｓ化状態を見ることが出来ないという問題がある。

肌の状態は、きめ細やかさ、潤い、カサつき、皮脂量、メラニン色素量などを指標として総合的に判断されるのが一般的である。一方、ペントシジンなどの化合物の生成を蛍光画像として測定することも検討されているが、特異性が低いのが問題である。肌改善用商品の使用、食事のコントロール、生活パターンの改善などを行った結果として、肌の状態がどう変化しているかを知るための手法は各方面から臨まれているが、いまのところ高感度で簡便な方法論はない。
前述したように角層中のタンパク質がＣＭＬ化されることは知られてはいたが、角層中の特定のタンパク質がＣＭＬ化だけでなくＮ-カルボキシエチルリジン（以下単にカルボキシエチルリジン又はＣＥＬと記載する）化もされること、当該タンパク質中の特定の位置のアミノ酸がＣＭＬ化又はＣＥＬ化されること及びその存在量が皮膚状態と相関があることは知られていない。

特開２００１−４６２７号公報 特開２００３−２６１４３２号公報 特開２００９−００８４６０号公報 特開２０１０−２７１１６３号公報

Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ. １９９２ Ｍａｙ ２５;２６７（１５）:１０２１１-４. Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ. １９９１ Ａｐｒ ２５;２６６（１２）:７３２９-３２. Ｄｉａｂｅｔｅｓ. １９９９ Ｓｅｐ;４８（９）:１８４２-９. Ａｄｖ. Ｐｈａｒｍａｃｏｌ. ２３, １-３４ （１９９２） Ｂｒ. Ｊ. Ｄｅｒｍａｔｏｌ., １４５, １０-１８ （２００１） Ｂｉｏｃｉｍ. Ｂｉｏｐｈｙｓ. Ａｃｔａ, １８１４, １２４６−１２５２ （２０１１）

本発明の課題は、容易な方法で得られる皮膚サンプルを用いて、そこに含まれるタンパク質のＡＧＥｓ化状態を測定することにより、皮膚の状態を高感度で迅速に評価することである。

最近、本発明者を中心としたグループは、ＡＧＥｓ化が表皮細胞の形態維持に必要不可欠なケラチン線維の構成タンパク質に生じ、加齢に相関してＣＭＬが蓄積することを見出した。さらに抗ＣＭＬ抗体に特に反応する表皮タンパク質はケラチン１０であることが判明したことから、このケラチン上の特異的ＣＭＬ化が皮膚の老化による症状やそれに関連する病態の良い指標となることが考えられた。

そこで、本発明者らは、主要皮膚タンパクであるケラチンをターゲットとして、そのＣＭＬ化部位を高感度プロテオーム解析によって特定するとともに、同じタンパク質でＣＭＬ化に加えてＣＥＬ化が生じていることを発見し、本発明を完成した。

すなわち、本発明は皮膚表皮中のタンパク質であるケラチン１０におけるカルボキシエチルリジンおよび／またはカルボキシメチルリジンの位置と存在量を指標として皮膚の状態を評価する、皮膚状態の評価方法を提供するものである。より詳細には以下の皮膚の評価方法が提供される。
配列番号１で示される皮膚表皮中のケラチン１０における特定修飾構造を検出し、それを指標として皮膚の状態を評価する、皮膚の評価方法であって、当該特定修飾構造が下記ｉ）〜ｖ）から選択される少なくとも１つである、皮膚状態の評価方法、
ｉ）２０７番目のカルボキシメチルリジン
ｉｉ）２０７番目のカルボキシエチルリジン
ｉｉｉ）２８４番目カルボキシエチルリジン
ｉｖ）２８５番目カルボキシメチルリジン
ｖ）３４５番目のカルボキシメチルリジン。

本発明によれば、簡便な方法で、皮膚の状態より詳しくは、角層厚の上昇と水分量の低下を評価することができる。

ヒト３次元皮膚モデルを用いた、ＡＧＥｓ形成誘導による角層細胞の形態変化を示した図である。上段は、角層断面の透過型電子顕微鏡写真であり、下段は、角層１枚の内部部分の高倍率拡大図である。ＤおよびＦの矢印はケラチン繊維の凝集を示す。 ヒト皮膚における、ＣＭＬ化度と角層厚および角層水分量の関係を示した図である。 ヒト角層から抽出したタンパク質を２次元電気泳動した結果である（左が、Ｓａｍｐｌｅ Ｉ，右が、Ｓａｍｐｌｅ Ｓである）。Ａ０およびＢ０は、ウェスタンブロットの結果、抗ＣＭＬ抗体が反応しなかった対照の部分である。Ａ１，Ａ２およびＢ１，Ｂ２は、抗ＣＭＬ抗体が反応したタンパク質部分である。 ヨードアセトアミドによるアルキル化を用いた従来の実験系でマス分析を行った結果を用いて、ケラチン１０の配列上に、プロテオーム解析から予測したＣＭＬ部位を示した図である。 ＣＭＬ化したＢＳＡをＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析およびプロテオーム解析（Ｍａｓｃｏｔ）する手順を示したチャートである。 ヨードアセトアミドによるアルキル化を用いた実験系により、４名の背中から採取した角質を解析した結果を示している。ケラチン１０の配列上のＣＭＬおよびＣＥＬのプロテオーム解析のスコアを示している。 ヨードアセトアミドによるアルキル化を用いた実験系により、１名の身体の各部位（上腕、背中、および額）から採取した角質を解析した結果である。独立した3回の実験を実施し、２０７ＣＭＬ、２８４ＣＥＬ＋２８５ＣＭＬ、および３４５ＣＭＬについてのＭａｓｃｏｔスコアの結果の平均および標準偏差を示している。

以下、本発明を詳細に説明するが、本発明は以下に記載の実施態様に限定されるものではない。
本発明者らは、ターンオーバーの短い表皮タンパク質にもＡＧＥｓが存在し、老化とかかわっていることを発見した。しかしそのターゲットとなる構造体の詳細を解析する方法論は簡便でなかった。そこで、侵襲を伴わない簡便なテープストリッピング法で表皮から回収したタンパク質を、ジスルフィド結合を還元して尿素を含むバッファーで可溶化し、ＳＨブロック後２次元電気泳動とウェスタンブロティングを用いて特異的タンパク質を検出した。さらに、独自の抽出法でペプチドを回収後、質量分析を行った。そして高感度プロテオーム解析によって、表皮タンパク質であるケラチン中の修飾を分析することにより、初めて、表皮ケラチン１０のＣＭＬおよびＣＥＬ部位が表皮の老化の本体であることを発見した。特に、ＣＥＬとＣＭＬは同時に同じペプチド上に修飾されたものもあり、今までこのような修飾部位は報告されていない。

本発明の一つの態様は、皮膚表皮中のタンパク質のＣＥＬおよび／またはＣＭＬの位置と存在量を指標として皮膚の状態を評価する、皮膚状態の評価方法である。
本発明の他の態様は、皮膚表皮中の同じタンパク質上に隣接して存在するＣＥＬおよびＣＭＬの位置と存在量を指標として皮膚の状態を評価する、皮膚状態の評価方法である。
皮膚表皮中のタンパク質は、好ましくはケラチン、特に好ましくはケラチン１０である。 ケラチン１０のアミノ酸配列を、配列番号１として示す。

本発明において検出されるＣＥＬ部位は特に制限されないが、タンパク質がケラチン１０の場合は、例えば、１７９番アミノ酸（１７９ＣＥＬ）、２０７番アミノ酸（２０７ＣＥＬ）、２８４番アミノ酸（２８４ＣＥＬ）、２８５番アミノ酸（２８５ＣＥＬ）、および３３４番アミノ酸（３３４ＣＥＬ）からなる群より選ばれる１または複数の部位である。タンパク質におけるＣＥＬの存在量が多いと、好ましくはケラチン１０におけるこれらの部位のＣＥＬの存在量が多いと、表皮のＡＧＥｓ化状態が顕著であり、皮膚が老化状態にあると判断できる。
本発明において検出されるＣＭＬ部位は特に制限されないが、タンパク質がケラチン１０の場合は、例えば、２０７番アミノ酸（２０７ＣＭＬ）、２８５番アミノ酸（２８５ＣＭＬ）、および３４５番アミノ酸（３４５ＣＭＬ）からなる群より選ばれる１または複数の部位である。タンパク質におけるＣＭＬの存在量が多いと、好ましくはケラチン１０におけるこれらの部位のＣＭＬの存在量が多いと、表皮のＡＧＥｓ化状態が顕著であり、皮膚が老化状態にあると判断できる。
本発明の皮膚評価方法において検出されるＣＥＬおよびＣＭＬの組合せは、これに限定されないが、例えば、２８４ＣＥＬ＋２８５ＣＭＬをあげることができ、これらの存在量が多いと、表皮のＡＧＥｓ化状態が顕著であり、皮膚が老化状態にあると判断できる。

本発明の別の一つの態様は、皮膚表皮中のタンパク質、好ましくはケラチン１０の特定の部位のＣＥＬ、ＣＭＬ、あるいはＣＥＬおよびＣＭＬの簡便な高感度解析法であり、例えば、接着（粘着）テープを用いてヒトの皮膚から分離された表皮を可溶化バッファー（好ましくは尿素またはグアニジン塩酸を含むバッファー）で可溶化して得られた表皮中のタンパク質を、ＳＨブロック剤を用いてＳＨブロックした後、分析することにより、表皮中のタンパク質のＣＥＬ、ＣＭＬ、あるいはＣＥＬおよびＣＭＬの存在量を測定する方法である。

本発明の方法において用いることができるＳＨブロック剤は、これに限定されないが、例えば、ヨードアセトアミド、モノヨード酢酸をあげることができ、好ましくは、ヨードアセトアミドである。用いるＳＨブロック剤の濃度は、皮膚から分離された表皮中のタンパク質のＳＨ基を十分にブロックできる濃度であれば特に制限されず、用いるバッファー、ブロッキング時間その他の条件に応じて適宜選択される。

表皮の可溶化バッファーは、表皮の角層からタンパク質、好ましくはケラチンを抽出できる限り特に制限されないが、例えば、尿素またはグアニジン塩酸を含むバッファーあげることができるが、好ましくは尿素を含むバッファーが用いられる。用いる可溶化剤、例えば尿素の濃度は、表皮中のタンパク質を抽出できる濃度であれば特に制限されず、用いるバッファー、溶出時間その他の条件に応じて適宜選択される。

本発明において、皮膚表皮中のタンパク質のＣＥＬ、ＣＭＬ、あるいはＣＥＬおよびＣＭＬの検出は、それらを特異的に検出できる方法であれば特に制限されないが、例えば、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳを用いたマス分析、抗体を用いたＥＬＩＳＡ法、ＲＩＡ法をあげることができる。
ＥＬＩＳＡ法を用いる場合は、好ましくは、特定の部位のＣＥＬおよび／またはＣＭＬを特異的に認識する一次抗体を用いることができ、例えば、ケラチン１０の１７９ＣＥＬ、２０７ＣＥＬ、２８４ＣＥＬ、２８５ＣＥＬ、３３４ＣＥＬ、２０７ＣＭＬ、２８５ＣＭＬ、または３４５ＣＭＬを特異的に認識する一次抗体が好ましく用いられる。二次抗体としては、これに限定されないが、蛍光ビオチン、ＦＩＴＣ標識抗体、酵素標識抗体を用いることができる。或いは、標識をコンジュゲートしたＣＥＬおよび／またはＣＭＬを認識する抗体を用いることができる。
また、ＣＥＬを認識する抗体とＣＭＬを認識する抗体を組み合わせて用いることにより、或いは、近傍に存在するＣＥＬおよびＣＭＬを同時に認識する抗体を用いることにより、ＣＥＬおよびＣＭＬの存在を検出することができる。

本発明の一つの態様において、検出された皮膚表皮中のタンパク質（好ましくはケラチン１０）のＣＥＬ、ＣＭＬ、あるいはＣＥＬおよびＣＭＬの存在量は、ＡＧＥｓ化の数値とすることができ、この数値を指標に、皮膚の状態を評価できる。これにより、皮膚状態の現状の正確な把握と、改善あるいは増悪後の判定を客観的に行うことができ、さらには、肌の改善や美容効果の判定に用いることができる。この数値は、皮膚の状態に影響する各種疾患の状態を把握することおよび／または疾病予防のための指標として用いることもできる。
さらに本発明においては、接着（粘着）テープによる表皮の簡易定量的回収法と可溶化法とＥＬＩＳＡ法を組み合わせることにより、短時間で特定の皮膚タンパクのＡＧＥｓ化状態を数値化することができる。これにより、皮膚のＡＧＥｓ化状態や老化状態など皮膚の健康状態を高感度に迅速に測定できる。

本発明におけるＡＧＥｓ化状態とは前述したように表皮中のタンパク質、より詳しくはケラチン１０中のリジンがＣMＬ化またはＣＥＬ化することを示す。

ＣＥＬまたはＣＭＬ、あるいはＣＥＬおよびＣＭＬの存在量に基づくＡＧＥｓ化の数値化は、例えば、マス分析でのＭａｓｃｏｔスコアや非ＡＧＥペプチドに対するピークの強度、或いはｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ法やｄｏｔ ｂｌｏｔ法での染色強度などで行うことができる。
これらの数値が高くなると、皮膚の弾性低下、角層厚の上昇と水分量の低下が起こっていると判断でき、皮膚が老化状態にあると判断できる。

上記のように、本発明を用いて、容易に得られるヒトおよび病態モデル動物の表皮角層サンプル中のタンパク質のＡＧＥｓ化の度合いを、特定の部位の、ＣＥＬ化ケラチン、ＣＭＬ化ケラチンあるいはＣＥＬおよびＣＭＬ化ケラチン量として測定することができ、それにより、皮膚の状態をＡＧＥｓ化の数値で判断することができるので、皮膚の現状の正確な把握と、改善あるいは増悪後の判定を客観的に行うことができる。また、このＣＥＬ化ケラチン、ＣＭＬ化ケラチンあるいはＣＥＬおよびＣＭＬ化ケラチン量測定は、皮膚の状態に影響する各種の疾患の状態を把握することにも用いることができる。

以下、実施例により、本発明を具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

実施例１：ＡＧＥｓ形成誘導による角質細胞形態の変化
ヒト皮膚再構築モデル（東洋紡，ＴＥＳＴＳＫＩＮ ＴＭＬＳＥ−３０）を用いて、製造元のプロトコールに従いヒト３次元皮膚モデルを構築した。グリオキサール（濃度２００ μM）用いてＡＧＥｓ形成誘導を行い、構築されたヒト３次元皮膚モデルの角層を電子顕微鏡で観察した。また、ＡＧＥｓ形成阻害剤であるアミノグアニジン（濃度 ２ ｍＭ）を添加し、ＡＧＥｓの形成阻害を確認した。結果の写真を図１に示す。ＡＧＥｓ形成誘導が行われた皮膚では、角質細胞の一つ一つが肥厚するなどの形成異常が見られた。また、健全な角層の構築に必要なケラチン線維の凝集が、ＡＧＥｓ形成誘導によって阻害される様子が観察され、これはアミノグアニジン添加により回復した。
次いで、ヒト皮膚の角層（ＳＣ）におけるＡＧＥｓ量と角層厚、角層水分量を求めた。ＡＧＥｓ量は、Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔのシグナル強度から求めた。角層厚は、共焦点ラマン分光装置を用いて求めた。角層水分量は、共焦点ラマン分光装置を用いて求めた。それらの関係を図２に示す。
これらの結果より、角層でのＡＧＥｓの形成より角層厚の上昇と水分量の低下が起こっていることが確認できた。つまり、角層でのＡＧＥｓの増加は、老化皮膚の特徴である皮膚表面のゴワつきや硬化に関与していることが考えられる。

実施例２：ヒト背中角層中のＣＭＬ化タンパク質の特定
ヒト角層抽出タンパク質を２次元電気泳動しＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ法によりＣＭＬスポットを検出後、同一条件の電気泳動を別途実施しＣＭＬスポットに対応する位置のゲルを切り出しＬＣ−ＭＳ／ＭＳを用いてＣＭＬ化されるタンパク質の特定およびＣＭＬ化部位の特定を行った。方法の詳細を以下に示す。

２−１．ＣＭＬ化タンパク質試料の調製
（１）試料（ヒト背中角層）
ヒトの背中にメンディングテープ（２．４ ｃｍ Ｘ １０ ｃｍ、１０枚）を塗布し、押し付けて接着後、これをはがすことで角層を採取した。採取したテープはＯＨＰシートに貼り付けて−８０℃で保存した。対象者は１９歳から６０歳までの健常な男性（喫煙習慣のない方）を対象とした。
（２）角層タンパク質の抽出
テープ３枚を５０ ｍｌの遠心チューブに入れ、抽出溶剤（８ Ｍ ｕｒｅａ，５０ ｍＭ ＤＴＴ，５０ ｍＭ ＣＨＥＳ，ｐＨ ９．３）１５ ｍｌを加えて３０℃で１６ｈｒ振盪した。
Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ Ａｃｅｔａｔｅ膜（φ＝０．８０ μｍ，Ｄｉｓｍｉｃ−２５ＣＳ，Ｔｏｙｏ Ｒｏｓｈｉ）で濾過した後、濾液を限外濾過膜（Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ １５、ｕｌｔｒａｃｅｌ １０Ｋ：排除限界１０ｋＤａ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて遠心濃縮、さらに０．５ ｍｌスケールの限外膜（Ｕｌｔｒａｆｒｅｅ ０．５，Ｂｉｏｍａｘ ５Ｋ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて約１００ μｌに濃縮後、−２５℃で保存した。

（３）電気泳動とＰＶＤＦ膜への転写
抽出した角層タンパク質を、ヨードアセトアミドを用いてＳＨ基封鎖し、２次元電気泳動を行って分離した。
電気泳動は３０ μｇのタンパク質をアプライしてＺｏｏｍ Ｇｅｌ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて等電点電気泳動し、ＮｕＰａｇｅｐｒｅＣａｓｔｇｅｌ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）でＢｉｓ−Ｔｒｉｓ ｇｅｌ、ＭＯＰＳ ｂｕｆｆｅｒを用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施した。ＰＶＤＦ膜（ｐｏｒｅ ｓｉｚｅ ０．２ μｍ：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＬＣ２００２）への転写はＸｃｅｌｌ ＩＩを用いた標準プロトコール（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にて実施した。
（４）ウェスタンブロット（ＣＭＬ）
以下の条件にて行った。
・ｂｌｏｃｋｉｎｇ：２％ ｓｋｉｍ ｍｉｌｋ／０．２％ ＰＢＳＴに浸漬し、室温で１ ｈｒ 振盪した。
・１次／２次抗体：抗ＣＭＬ：：ＨＲＰ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ（ＫＨ００１−０２，Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ，６Ｄ１２クローン）を用い、希釈率１：５，０００となるよう２％ ｓｋｉｍ ｍｉｌｋ／０．２％ ＰＢＳＴ １０ｍｌで希釈後加え、室温で１．５ ｈｒ振盪した。
・検出：Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ：Ｓｕｐｅｒ Ｓｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔｄｕｒａ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いた。
（５）タンパク質染色
ゲルはＲａｐｉｄＳｔａｉｎ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ ＃５５３２１５）、ＰＶＤＦ膜はＣｏｏｍａｓｓｉｅ Ｂｌｕｅ Ｒを用いて染色した。

（６）ゲルからのＣＭＬ ｓｐｏｔの切り出し
ウェスタンブロットと同じ条件でタンパク質を電気泳動し、ゲルをＲａｐｉｄＳｔａｉｎ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，＃５５３２１５）を用いて染色した。この染色像からＣＭＬ ｓｐｏｔに相当する部分を、カミソリを用いて切り出した。切り出したゲルは−８０℃で保存後、プロテオーム解析を実施した。

（７）プロテオーム解析
ゲル中のタンパク質をｉｎ ｇｅｌ消化し、マス分析を実施した。ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを用いたマス分析にはＱ−Ｓｔａｒ Ｅｌｉｔｅ（ＡＢＳｃｉｅｘ）を使用した。次いで、検出したシグナルのＭａｓｃｏｔ解析は以下の条件で実施した。

上記表中のそれぞれのサンプルの処理条件は以下の表２の通りである。

２−２：電気泳動およびＣＭＬ部位の検出
試料（Ｓａｍｐｌｅ Ｉ：５７才男性の背中より採取、Ｓａｍｐｌｅ Ｓ：４８歳男性の背中より採取）を、ヨードアセトアミドを用いてＳＨ基封鎖を行った後、２次元電気泳動を行い分離し、抗ＣＭＬ抗体でウェスタンブロットした。それぞれの試料につき、切り出しを行う部分を以下のように決定した。抗ＣＭＬ抗体が反応しなかったコントロール（Ｂｌａｎｋ）をＡ０およびＢ０とし、抗ＣＭＬ抗体が反応したスポットをそれぞれＡ１・Ａ２、およびＢ１・Ｂ２とした。２次元電気泳動の結果を図３に示す。
次いで、切り出したゲルからペプチドを抽出し、マス分析を行った。その結果、ケラチン１０の全アミノ酸配列のうちの約７０％を解析断片の配列でカバーした。そして多くのＣＭＬ化配列を検出することができた。Ｂ１の結果を図４に示す。
しかしながら、マス分析においてはＣＭＬ化すると５８ Ｄａｌｔｏｎの分子量の増加が見られるはずであるが、多くの場合５７ Ｄａｌｔｏｎの分子量が増加した形でＣＭＬ化配列が検出された。そこで、ＣＭＬ化配列で予想される分子量より１ Ｄａｌｔｏｎの分子量が異なる原因を調べる目的で、グリオキサールを用いてＣＭＬ化したＢＳＡを試料としたマス分析を以下のようにして実施した。

実施例３：グリオキサールを用いてＣＭＬ化したＢＳＡのマス分析
３−１：試料（ＣＭＬ化ＢＳＡ）と方法
１％ ＢＳＡ（和光純薬０１１−１７８４４）４ ｍｌを１５ ｍｌ ｔｕｂｅに分取し、１ Ｍ グリオキサール １ ｍｌを加え５０℃で１０日間保温した。２ Ｍ塩酸アミノグアニジン ５ ｍｌを加えて反応停止した後、精製水を用いて透析（４℃、１晩）した。
得られたＣＭＬ化ＢＳＡを用いて、図５のプロトコールに従い、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ測定およびプロテオーム解析を行った。ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを用いたマス分析にはＱ−Ｓｔａｒ Ｅｌｉｔｅ（ＡＢＳｃｉｅｘ）を使用し、検出したシグナルのＭａｓｃｏｔ解析は上記の表に示した条件で実施した。

３−２：ＣＭＬ化したＢＳＡを試料としたマス分析
上記に従い５０℃でのグリオキサール処理によりＢＳＡのＣＭＬ化を実施した試料を用いてマス分析の条件検討を行った。電気泳動から切り出したゲルをヨードアセトアミドもしくはモノヨード酢酸を用いてＳＨ基封鎖（還元アルキル化）を実施し、それぞれの試料をマス分析した。
マス分析した試料を表１に示す条件のＭａｓｃｏｔ解析で得られたペプチドはカルボキシメチル化によるリジンの修飾とカルバミドメチル化によるリジンの修飾を区別することができた。すなわち、ＢＳＡでＣＭＬ化した配列を検出できた。ヨードアセトアミドで還元アルキル化した試料では、グリオキサール処理すると多くのリジン残基がＣＭＬ化したが、モノヨード酢酸で処理した試料ではグリオキサール未処理の試料でも多くのリジン残基がＣＭＬ化されていた。結果を以下の表３に示す。

この結果とヨードアセトアミドで還元アルキル化した試料でカルバミドメチルリジンが検出されたことと併せて考えると、ＳＨ基封鎖処理でシステイン残基だけでなく、リジン残基も修飾されたと考えられる。すなわちヨードアセトアミド処理ではカルバミドメチルシステインとカルバミドメチルリジンが、モノヨード酢酸処理ではカルボキシメチルリジン（ＣＭＬ）とカルボキシメチルシステインが生成したことを示している。
以前の分析結果ではケラチン１０においてＣＭＬ化した部位が多く検出され、しかも分子量が１ Ｄａｌｔｏｎ小さかったが、これらのペプチドは、ヨードアセトアミド処理によるＳＨ基封鎖で生成したカルバミドメチルリジン（＋５７ Ｄａｌｔｏｎ）であり、ケラチン上のＣＭＬ（＋５８ Ｄａｌｔｏｎ）ではないと判断された。つまり、ＳＨ基封鎖で用いたヨードアセトアミドによりカルバミドメチルシステインが生じるが、副産物としてカルバミドメチルリジンが生じることが明らかとなった。カルバミドメチルリジンがリジン残基に対して５７ Ｄａｌｔｏｎ 分子量が増加した形で検出されていた。よって、カルバミドメチルリジンによるノイズを除去することで、ＣＭＬを検出できる実験系が確立できた。この新しい系を用いることにより、ＣＭＬ化配列の候補を正確にピックアップすることができることが判った。

実施例４：アミノ酸修飾部位の特定
実施例２−１に従い４名（サンプル：＃１，＃８，＃１１，＃２２）から試料を調製し、実施例３で確立したヨードアセトアミドによるアルキル化を用いた実験系で、マス分析を行いプロテオーム解析を実施した。その結果、ケラチン１０において、カルボキシルメチルリジンに加えて、カルボキシエチルリジンが存在することが判った。また、プロテオーム解析は、以下のＭａｓｃｏｔ解析条件にて行った。

Ｍａｓｃｏｔスコアの結果を図６に示す。
図６より、２０７番アミノ酸（２０７ＣＭＬ）、２８５番アミノ酸（２８５ＣＭＬ）、および３４５番アミノ酸（３４５ＣＭＬ）の顕著な存在が確認された。また、全ての試料において、２８５ＣＭＬは、２８４ＣＥＬと共に存在した（２８４ＣＥＬ＋２８５ＣＭＬ）。なお、２０７、２８５および３４５番目のアミノ酸位置は、川端ら（非特許文献６）によってＣＭＬの存在が示唆されたケラチン１０のアミノ酸断片には含まれていない。
図６より、１７９番アミノ酸（１７９ＣＥＬ）、２０７番アミノ酸（２０７ＣＥＬ）、２８４番アミノ酸（２８４ＣＥＬ）、２８５番アミノ酸（２８５ＣＥＬ）、および３３４番アミノ酸（３３４ＣＥＬ）の存在が優位に確認できた。また、２８４ＣＥＬが存在している試料は全て２８５ＣＭＬが共に存在していた（２８４ＣＥＬ＋２８５ＣＭＬ）。

実施例５：アミノ酸修飾部位の身体部位差の確認
実施例２−１と同様にして５９歳男性から、上腕、背中および額の角層を採取し、実施例３で確立したヨードアセトアミドによるアルキル化を用いた実験系にてマス分析を行いプロテオーム解析を実施した。実施例４で確認された、２０７ＣＭＬ、２８４ＣＥＬ＋２８５ＣＭＬ、および３４５ＣＭＬについてのＭａｓｃｏｔスコアの結果を図８に示す。尚、本実験では同一のタンパク質試料を独立した３回のプロテオーム解析を実施して、プロテオーム解析実験の再現性も併せて確認したものである。

上記の結果より、角層厚の上昇と水分量の低下などの皮膚性状のマーカーとして、ＣＭＬ化したリジンの近傍にあるリジンがカルボキシエチル化した配列（２８４ＣＥＬ＋２８５ＣＭＬ）が最も有力な候補としてピックアップされた。また、２０７ＣＭＬおよび３４５ＣＭＬも有力な候補として確認できた。ＣＭＬ化が単独で生じた他の配列位置もピックアップされたが、その出現頻度は低かった。

上記の記載は、本発明の目的および対象を単に説明するものであり、添付の特許請求の範囲を限定するものではない。添付の特許請求の範囲から離れることなしに、記載された実施態様に対しての、種々の変更および置換は、本明細書に記載された教示より当業者にとって明らかである。

本発明の方法により、皮膚のＡＧＥｓ化状態を高感度で測定でき、皮膚の老化状態や健康状態を的確に判定できる。本発明の方法は、医薬品、化粧品、ヒト表皮細胞老化関連分野、健康補助薬品開発分野など様々な分野で応用可能である。

Claims (5)

1. 配列番号１で示される皮膚表皮中のケラチン１０における特定修飾構造を検出し、それを指標として皮膚の状態を評価する、皮膚の評価方法であって、当該特定修飾構造が下記ｉ）〜ｖ）から選択される少なくとも１つである、皮膚状態の評価方法、
   ｉ）２０７番目のカルボキシメチルリジン
   ｉｉ）２０７番目のカルボキシエチルリジン
   ｉｉｉ）２８４番目カルボキシエチルリジン
   ｉｖ）２８５番目カルボキシメチルリジン
   ｖ）３４５番目のカルボキシメチルリジン。
2. 前記特定修飾構造が、２８４番目のカルボキシエチルリジンおよび２８５番目のカルボキシメチルリジンである、請求項１に記載の皮膚状態の評価方法。
3. 前記皮膚の状態が、皮膚の老化状態である、請求項１または２に記載の皮膚状態の評価方法。
4. 前記皮膚の老化状態が皮膚の角層厚の上昇と水分量の低下である請求項３記載の皮膚状態の評価方法。
5. 前記特定修飾構造の存在量を指標の一つとして皮膚の状態を評価する、請求項１〜４のいずれか一つに記載の皮膚状態の評価方法。