WO2010073983A1 - シワ形成リスク評価方法 - Google Patents

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誠司 北島
耕介 速水
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株式会社ファンケル
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    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6881—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids from skin
    • G—PHYSICS
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    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/50—Determining the risk of developing a disease

Definitions

  • It relates to technology for predicting skin aging risk.
  • Patent Document 1 International Publication No. 07/023808 pamphlet
  • profilin 1 a technique for inhibiting the production of profilin and modifying plant growth correction
  • Patent Document 2 JP-A-11-69921
  • Patent Document 3 Japanese Patent Laid-Open No. 2005-41881
  • Patent Document 4 Japanese Patent Laid-Open No. 2007-532915
  • Patent Document 5 Japanese Patent Laid-Open No. 2008-529008
  • An object of the present invention is to provide an index of future skin aging risk using a stratum corneum collected using non-invasive means.
  • the main configuration of the present invention is as follows.
  • (1) A method for evaluating wrinkle formation risk, wherein the amount of profilin 1 protein in the skin stratum corneum is used as an index, and the risk of wrinkle formation is higher as the amount of profilin 1 protein is higher.
  • Method (3) The wrinkle formation risk evaluation method according to (1) or (2), wherein the skin stratum corneum is a skin stratum corneum collected by a noninvasive tape stripping means.
  • the wrinkle formation risk formed after the age of 45 is based on the amount of profilin 1 protein detected from the skin stratum corneum collected from subjects before the age of 45 (1) To evaluate the risk of wrinkle formation.
  • profilin 1 which is a protein that is widely expressed in the living body and is an intracellular cytoskeleton-constituting protein serves as an index for evaluating skin aging risk.
  • it focuses on wrinkle formation as a subject of aging.
  • the profilin 1 is detected and its expression level is measured, so that it is possible to predict the future such as wrinkle formation.
  • it is effective in predicting wrinkle formation that occurs after age 45.
  • preventive measures such as selecting effective cosmetics to prevent aging phenomena such as wrinkle formation in the future.
  • cosmetic counseling for skin aging risk such as wrinkle formation risk can be performed accurately.
  • Profilin 1 used in the present invention is a protein that is widely expressed in vivo and is known as a protein that regulates the polymerization and depolymerization of actin, which is a cytoskeleton constituent protein in cells. It has been.
  • the present invention is based on the abundance obtained by measuring profilin 1 which is a protein present in the skin stratum corneum collected by a non-invasive technique, and the future skin aging of the person who originated the skin stratum corneum You can know the risks. In particular, it was elucidated that even if it was not seen when young, the occurrence of wrinkles after age 45 correlates with the expression level of profilin 1 when young.
  • the present inventor modeled the expression level of profin 1 in three stages of high, middle and low by age, so that wrinkles tend to increase to the same level until around 45 years old, but advanced profin 1 group after about 45 years old It was clarified that the wrinkle area of the low-grade Prophine 1 group was suppressed from increasing, while the wrinkle area of the group was accelerated. Based on this result, knowing the expression level of Profin 1 makes it possible to predict the risk of skin aging such as wrinkle formation from a young age, and it is possible to take preventive measures such as selection of cosmetics. In addition, even after 45 years of age, it is possible to predict the acceleration of aging such as wrinkles in the future. It is possible to consider measures in accordance with the expectation.
  • cosmetic selection counseling can be performed on a scientific basis. Moreover, by searching for a test substance that affects the expression level of this profin 1 protein using a cultured skin model of advanced profin 1, a drug capable of suppressing aging such as wrinkle formation can be screened.
  • the present invention can identify the expression level of the Prophin 1 protein by collecting the skin stratum corneum safely and easily by a invasive method such as tape stripping and paying attention to the skin stratum corneum in a short time. It can be easily measured at a cosmetics store and used as a cosmetic selection material on the spot.
  • a device for measuring the expression level of the profin 1 protein can be integrated and miniaturized, and the detected result can be presented in comparison with the stepped index. Furthermore, suitable cosmetics and menus can be displayed based on this result.
  • the present invention can evaluate the risk of skin aging such as skin aging for purposes other than medical purposes, and can take countermeasures for purposes other than medical treatment based thereon.
  • Method of collecting profilin 1 from skin stratum corneum (1) Collection of stratum corneum by tape stripping method
  • the tape stripping method is a stratum corneum that adheres to the adhesive surface by affixing the adhesive tape to the skin and peeling off the adhesive tape. It is a method to collect.
  • a commercially available adhesive tape for example, by pressing the adhesive tape against the human cheek, the stratum corneum can be adhered to the adhesive tape and collected.
  • Extraction buffer An extraction buffer is used to extract profilin 1 from the stratum corneum adhered to the adhesive tape.
  • the extraction buffer include the following compositions. Composition: 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 120 mM NaCl (sodium chloride), 1 mM Na 3 VO 4 (sodium orthovanadate).
  • the stratum corneum of skin collected with adhesive tape is a differentiated keratinocyte and contains a lot of cytoskeletal proteins. Therefore, in order to increase the extraction efficiency of profilin 1, it is preferable to contain an appropriate surfactant in this extraction buffer.
  • SDS sodium lauryl sulfate, CH 3 (CH 2 ) 11 OSO 3 Na
  • profilin 1 The adhesive tape from which the stratum corneum is collected is put into a cylindrical container and quickly rubbed with an adhesive surface using a high-speed rotating homogenization pestle (hereinafter referred to as “pestle”).
  • Profilin 1 can be extracted.
  • the profilin 1 may be extracted by immersing an adhesive tape from which the stratum corneum has been collected in an extraction buffer and rubbing with a scraper, or using a shaking method or an ultrasonic irradiation method.
  • the adhesive tape is placed in the cylindrical container, with the adhesive surface facing the inside of the cylindrical container and the opposite surface of the adhesive surface along the inside of the cylindrical container.
  • the adhesive surface can be easily rubbed with the pestle.
  • the pestle only needs to have a protrusion-like or spatula-like structure that can be scraped off at the tip of the rod.
  • a concentric cylinder larger than the diameter of the rod is connected to the tip of the rod, and a plurality of missing portions are provided in parallel to the axis of the cylinder, so that a plurality of columns arranged on the circumference of the cylinder
  • a spatula-like structure (scraping part) can be provided, and the adhesive tape can be rubbed with the spatula.
  • Handy pestle TOYOBO, code HMX-301
  • the diameter of the scraping part of Handy pestle (TOYOBO, code HMX-301) is about 7 mm.
  • profilin 1 extract is allowed to stand for about 1 minute to calm the bubbles, and then the profilin 1 extract is sucked from the cylindrical container and collected.
  • Profilin 1 protein mass in the obtained profilin 1 extract can be quantitatively analyzed by ELISA method, antibody chip method, and FRET method.
  • ⁇ wrinkle area ratio is a wrinkle image analysis parameter derived in accordance with the guidelines of the Japan Cosmetic Industry Association (http://www.jcia.org/). Actually, after collecting a replica of the skin, shape correction was performed using image analysis software, wrinkles were extracted from the shape corrected three-dimensional shape, and the area ratio of the extracted wrinkles in the measurement range was calculated As the image analysis software, for example, the reflection replica analysis system ASA-03-R of Asahi Biomed Co., Ltd. can be exemplified. ⁇ The variable that best correlates is age. Furthermore, it was revealed that the profilin protein mass is effective as an explanatory variable for the wrinkle area ratio.
  • the wrinkle area ratio tends to increase.
  • those who are 45 years of age or older and who have a large amount of profilin 1 protein have a large wrinkle area ratio
  • those who have a small amount of profilin 1 protein have a tendency to have a small wrinkle area ratio. Therefore, before the age of 45, when the profilin 1 protein amount in the skin horny layer is higher than the average value, the tendency of increasing the wrinkle area ratio after the age of 45 is compared with the average of the age group. And strong.
  • the profilin 1 protein amount in the skin horny layer is lower than the average value before the age of 45 years, the tendency of the wrinkle area ratio to increase after the age of 45 is higher than the average of the age group.
  • a skin aging risk reducing agent can be screened by searching for a component that reduces the amount of profilin 1 protein. For example, in an experimental system in which nude mice are irradiated with ultraviolet rays to form wrinkles, it is possible to search for a component that decreases the amount of profilin 1 protein and to determine whether the wrinkle area ratio is reduced by administering the component. .
  • profilin 1 protein in skin stratum corneum 2.1 Collection of stratum corneum by tape stripping As the adhesive tape, a horny checker (2.5 cm ⁇ 2.5 cm) manufactured by Asahi Biomed Co., Ltd. was used. A keratin checker was applied to the test subject's face and cheek, and lightly rubbed with a fingertip to adhere the skin stratum corneum to the adhesive surface of the horny checker.
  • Extraction of profilin 1 protein Extraction buffer: 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 120 mM NaCl, 1 mM Na 3 VO 4 , 0.1% (w / v) SDS. Extraction buffer volume: 200 ⁇ L. Extraction container: cylindrical container with a diameter of 11 mm. Put the adhesive tape in the cylindrical container so that the opposite side of the adhesive surface is along the inner wall of the container, put the extraction buffer, and handy pestle (TOYOBO, code HMX-) as a pestle in a mini cordless grinder 301) was connected, the pestle was rotated at 9000 rpm, and the adhesive surface of the adhesive tape along the inner wall of the cylindrical container was rubbed. The stirring time was 30 seconds. The profilin 1 protein extract was allowed to stand for about 1 minute to calm the foam, and then the profilin 1 protein extract was aspirated and collected from the cylindrical container.
  • TOYOBO, code HMX- handy pestle
  • Profilin 1 protein amount is calculated by calculating both the relative value of profilin 1 protein contained in the profilin 1 protein extract and the absolute amount of all proteins in the extract. The calculation was performed as a ratio value (hereinafter referred to as “profilin 1 protein amount”) obtained by dividing “relative value of phosphorus 1 protein” by “absolute amount of all proteins in the extract”. For the measurement of the amount of profilin 1 protein, 5 times the amount of SDS-treated solution ⁇ 0.3 M Tris-HCl (pH 6.8), 25% glycerol, 7.5% SDS, 10% mercaptoethanol ⁇ was added, and heat block treatment was performed at 95 ° C. for 5 minutes.
  • immobilization on PVDF membrane was performed in the same way as when measuring the relative value of profilin 1 protein. Immobilization of serum albumin solution (SIGMA) was performed at multiple concentrations. After that, the protein on the immobilized membrane is stained with CBB staining solution (Bio-Rad), and the blue stained image obtained in the form of dots is digitized using Image J, an image analysis software, and fixed at a known concentration. The concentration was calculated using the dyeing intensity of the obtained bovine serum albumin solution, and the result was defined as “absolute amount of total protein in the extract”.
  • SIGMA serum albumin solution
  • profilin 1 protein amount The value obtained by dividing the value of “relative value of profilin 1 protein” obtained from the blackening intensity of the X-ray film by the value of “absolute amount of total protein in the extract” obtained from the CBB-stained image of the PVDF membrane. was defined as profilin 1 protein amount.
  • profilin 1 protein in the stratum corneum was determined by determining the wrinkle area ratio as a dependent variable and the best fit multiple regression equation.
  • AIC Kaike's Information Criterion: Akaike Information Criterion, Iwasaki Manabu et al., Practical Statistical Glossary of Terms, Ohmsha Co., Ltd., published on March 25, 2006, page 21
  • AIC is used to “balance the complexity of the model with the goodness of fit with the data”. For example, consider creating a model that statistically describes certain measurement data.
  • AIC provides a solution to this problem. Specifically, if a model with the smallest AIC is selected, a good model can be selected in many cases.
  • L is the maximum likelihood
  • k is the number of free parameters.
  • AIC is a general method for evaluating the fit of a model, and when this value is smaller, it can be determined as a better fit model. Consider the following two models to explain the wrinkle area ratio.
  • y i Wrinkle area ratio x 1i : Age x 2i : Profilin 1 e i : Measurement error
  • Formula 2 is 1027.75 and Formula 3 is 939.9731, and it can be seen that Formula 3 is better applied. That is, to explain the wrinkle area ratio, it was found that not only the age but also Profilin 1 was applied with the age, that is, the accuracy increased. This is nothing but Profilin 1 is useful as an index for estimating the wrinkle area ratio. Furthermore, the correlation coefficients of Equations 2 and 3 are 0.79 and 0.81, respectively, and the accuracy of explanation of the wrinkle area ratio is improved in Equation 3 as in the AIC results.
  • profilin 1 protein amount Correlation between grouping by profilin 1 protein amount, wrinkle area ratio and age
  • the amount of profilin 1 protein in the stratum corneum was distributed in the range of 2.5 to 99.0 for a total of 191 people.
  • a person with a large amount of profilin 1 protein profilin 1 protein 44.1 to 99.0, 64 persons
  • an intermediate person profilin 1
  • the amount of protein was 25.1 to 44.0, 64
  • the number was small (Profilin 1 protein amount 2.5 to 25.0, 63).
  • the slope of the regression line indicating that the wrinkle area ratio increases with age is that the amount of profilin 1 protein in the skin stratum corneum is large group> middle group> small group, and profilin 1 protein It can be seen that the higher the amount, the higher the risk of skin aging.
  • the difference in wrinkle area rate was tested by covariance analysis between the group with a large amount of profilin 1 protein in the skin stratum corneum and the group with a small amount, the amount of profilin 1 protein in the skin stratum corneum significantly when p ⁇ 0.05 It was found that the group with more wrinkles had a higher wrinkle area ratio.
  • LOWESS Lically Weighted Scatterplot Smoother
  • the wrinkle area rate of each group increases almost similarly until the age of 45, but when the age exceeds 45, the group with a large amount of profilin 1 protein in the stratum corneum, the middle group, and the number are small It turns out that a big difference arises in the increase tendency of the wrinkle area ratio of a group. Therefore, even if the age is 45 years or younger, a person with more profilin 1 protein in the skin horny layer than the average value can be predicted to have a high risk of skin aging in which wrinkles increase when they are over 45 years old.
  • the graph which shows the regression line of a wrinkle area rate and age The graph which represented the measured data of the group with many profilin 1 protein amounts in a skin stratum corneum, an intermediate group, and a small group with the LOWESS curve.

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Abstract

非侵襲的な手段を用いて採取した皮膚角層中のプロフィリン１蛋白質量を指標とする皮膚老化リスクの評価方法。

Description

シワ形成リスク評価方法
　皮膚老化リスクを予測する技術に関する。
　本出願人は老化について従来より着目して研究開発を行っている。老化に伴って変動する蛋白質を見出して特許文献１（国際公開第０７／０２３８０８号パンフレット）等を提案している。
　プロフィリン１に関しては、プロフィリンの産生を阻害し、植物の生育修正を変更する技術（特許文献２：特開平１１－６９９２１号公報）、組織損傷の結果として放出された遊離アクチンにより生じる二次的組織損傷を抑制する技術（特許文献３：特開２００５－４１８８１号公報）、神経系障害、ニューロンの障害を検出、診断するマーカーとする技術(特許文献４：特開２００７－５３２９１５号公報)、上皮性癌のバイオマーカーとする技術（特許文献５：特開２００８－５２９００８号公報）が知られている。
国際公開第０７／０２３８０８号パンフレット 特開平１１－６９９２１号公報 特開２００５－４１８８１号公報 特開２００７－５３２９１５号公報 特開２００８－５２９００８号公報
　本発明は、非侵襲的な手段を用いて採取した皮膚角層を用いて、将来の皮膚老化リスクの指標を提供することを目的とする。
  本発明の主な構成は、次のとおりである。
（１）皮膚角層中のプロフィリン１蛋白質量を指標とし、プロフィリン１蛋白質量が多いほどシワ形成リスクが高いと評価することを特徴とするシワ形成リスクの評価方法。
（２）皮膚角層から抽出したプロフィリン１蛋白質の量を、あらかじめ測定した被験者の年齢層の標準的プロフィリン蛋白質量と比較対比することを特徴とする（１）記載のシワ形成リスクの評価方法。
（３）皮膚角層が、非侵襲的なテープストリッピング手段によって採取された皮膚角層であることを特徴とする（１）又は（２）記載のシワ形成リスクの評価方法。
（４）４５歳以降に形成されるシワ形成リスクが、４５歳以前の被験者から採取した皮膚角層から検出したプロフィリン１蛋白質量を指標とするものであることを特徴とする（１）記載のシワ形成リスクの評価方法。
（５）採取される皮膚角層が、ほほ由来であることを特徴とする（４）に記載されたシワ形成リスクの評価方法。
（６）（１）～（５）のいずれかに記載されたシワ形成リスクの評価方法を用いて、シワ形成リスクに影響を与える成分をスクリーニングする方法。
　本発明は、生体内において広範囲に発現しているタンパク質であり、細胞内の細胞骨格構成タンパク質であるプロフィリン１が皮膚老化リスク評価の指標となることを明らかにしたものである。
　特に、老化現象の対象として、シワ形成に着目した物である。ほほからテープストリッピング等の被侵襲的な手段により採取された皮膚角層を用いて、プロフィリン１を検出してその発現量を測定することにより、シワ形成などの将来予測をすることができる。特に、４５歳以降に発生するシワ形成の予測に有効である。
　将来のシワ形成などの老化現象を予防するために有効な化粧料を選択するなどの予防措置を講ずることができる。あるいは、シワ形成リスクなどの皮膚老化リスクに対する美容カウンセリングを的確に行うことができる。
　本発明に用いるプロフィリン１（PFN1、Gene ID 5216）は、生体内において広範囲に発現しているタンパク質であり、細胞内の細胞骨格構成タンパク質であるアクチンの重合・脱重合を調節するタンパク質として知られている。
　本願発明は、非侵襲的な手法により採取した皮膚角層中に存在するタンパク質であるプロフィリン１を計測した存在量に基づいて、当該皮膚角層の出所元となった人の将来の皮膚老化リスクを知ることができるものである。特に、若いときには表見されていなくても、４５歳以降シワの発生状況が若いときのプロフィリン１の発現量に相関することを解明した。
　本発明者は、年齢別にプロフィン１の発現量を高中低の３段階にモデル化することにより、４５歳付近まではシワは同程度の増加傾向にあるが、４５歳程度以降は高度プロフィン１群のシワ面積が加速するのに対して低度プロフィン１群のシワ面積は増加が抑制されることを明らかにすることができた。
　この結果に基づき、プロフィン１の発現量を知ることにより若いときからシワ形成などの皮膚老化リスクを予測できることとなり、化粧料の選択などの予防措置を講ずることができる。また、４５歳以降であっても、今後シワなどの老化の加速性を予想することが可能となる。その予想にあわせて、対策を検討することが可能となる。あるいは、化粧料選択のカウンセリングを科学的な根拠をもって行うことができる。
　また高度プロフィン１の培養皮膚モデルを利用して、このプロフィン１タンパク質の発現量に影響を与える被検査物質を探索することにより、シワ形成などの老化を抑制できる薬剤をスクリーニングすることができる。
　本願発明は、テープストリッピング等の被侵襲的な方法によって安全に容易に皮膚角層を採取して、その皮膚角層を短時間に注目するプロフィン１タンパク質の発現量を特定することができるので、化粧品売り場で簡単に測定して、その場で化粧料選択資料に利用することができる。このプロフィン１タンパク質の発現量を測定する機器は一体化して小型することができ、検出した結果と前記段階化した指標と比較して提示することができる。
　更に、この結果に基づいて、適した化粧料やメニューを表示することもできる。
　本発明は、医療目的以外の目的で、皮膚老化などの皮膚老化リスクを評価でき、それに基づいて医療以外の目的で対処措置を施すことができるものである。
　プロフィリン１を皮膚角層から採取する方法
（１）テープストリッピング法による角層の採取
　テープストリッピング法とは皮膚に粘着テープを貼り付けて、粘着テープを剥がすことにより、粘着面に粘着した角層を採取する方法である。
　市販の粘着テープを用いて、例えばヒト頬部に粘着テープを押し付けることにより、角層を粘着テープに粘着させて採取することができる。市販の粘着テープとしてはアサヒバイオメッド社製角質チェッカー、モリテックス社製角層シール、PROMOTOOL社製角質チェッカー（ディスクタイプW、ディスクタイプG、PROタイプ）、Integral社製Corneofix、3M社製透明テープ、3M社製透明両面テープ等が挙げられる。
（２）抽出バッファー
　粘着テープに粘着した角層からプロフィリン１を抽出するために抽出バッファーを用いる。抽出バッファーとして例えば以下の組成を挙げることができる。組成：50mM Tris-HCl (pH7.5)、120mM NaCl（塩化ナトリウム）, 1mM Na3VO4（オルトバナジン酸ナトリウム）。
　粘着テープで採取されてくる皮膚の角質層は角化細胞が分化したもので、細胞骨格系の蛋白質を多く含む。そのためプロフィリン１の抽出効率を上げるには、この抽出バッファーに適当な界面活性剤を含有させることが好ましい。界面活性剤としてはSDS（ラウリル硫酸ナトリウム、CH3(CH2)11OSO3Na）を使用することが好ましい。
（３）プロフィリン１の抽出
　角層を採取した粘着テープを円筒容器に入れて、高速回転するホモジナイゼーション用のペッスル（以下、「ペッスル」と呼ぶ）を用いて粘着面を擦ることにより迅速なプロフィリン１の抽出が可能である。また、角層を採取した粘着テープを抽出バッファーに浸してスクレーパーで擦ってプロフィリン１を抽出しても良く、振盪法や超音波照射法を用いても良い。
　粘着テープは粘着面を円筒容器内側に向けて、粘着面の反対面を円筒容器の内側に沿わせるようにして、円筒容器に入れる。粘着テープを粘着面の反対面を円筒容器の内側に沿わせて入れることにより、ペッスルにより容易に粘着面を擦ることができる。
　ペッスルは、棒の先端に掻き取り可能な突起状、あるいはヘラ状の構造を有するものであればよい。ペッスルの構造としては、例えば、棒の先端に、棒の直径より大きい同心円筒を接続し、その円筒に軸と平行に複数の欠失部を設けることにより、円筒の円周上に並んだ複数のヘラ状構造（掻きとり部）を設けることができ、そのヘラで粘着テープを擦ることができる。市販品としてはHandy pestle (TOYOBO社、code HMX-301)等を用いることができる。Handy pestle (TOYOBO社、code HMX-301)の掻きとり部の直径は約７ｍｍである。
（４）プロフィリン１抽出液の採集
　プロフィリン１抽出液を約１分間静置し、泡を沈静化し、その後、円筒容器からプロフィリン１抽出液を吸引して採集することが好ましい。
（５）プロフィリン１蛋白質量の分析
　得られたプロフィリン１抽出液中のプロフィリン１蛋白質量は、ELISA法、抗体チップ法、FRET法により定量分析することができる。
　皮膚老化リスクの評価
　シワ面積率{シワ面積率とは、日本化粧品工業連合会（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｊｃｉａ．ｏｒｇ／）のガイドラインに従って、導き出されるシワ画像解析パラメータである。実際には、皮膚のレプリカを採取した後に、画像解析ソフトウェアを用いて形状補正を行い、形状補正された3次元形状からシワを抽出し、測定範囲に占める抽出されたシワの面積比率を算出した値で、画像解析ソフトウェアとしては、例えば、有限会社アサヒバイオメッドの反射用レプリカ解析システムＡＳＡ－０３－Ｒが例示できる}と最も良く相関する変数は年齢である。さらに、プロフィリン蛋白質量がシワ面積率の説明変数として有効であることが明らかとなった。
　プロフィリン１蛋白質量が多い人ほど、シワ面積率が大きい傾向にある。特に、４５歳以上で、プロフィリン１蛋白質量が多い人は、シワ面積率が大きく、プロフィリン１蛋白質量が少ない人はシワ面積率が小さくなる傾向が顕著となる。そこで、４５歳以前に、皮膚角層中のプロフィリン１蛋白質量が平均の値よりも高い場合には、４５歳を過ぎたときのシワ面積率の増大傾向が、その年齢層の平均と比べて強いと予測できる。一方、４５歳以前に、皮膚角層中のプロフィリン１蛋白質量が平均の値よりも低い場合には、４５歳を過ぎたときのシワ面積率の増大傾向が、その年齢層の平均よりも弱いと予測できる。
　すなわち、４５歳以前は、プロフィリン１蛋白質量の多少がシワ面積率にあまり影響していないが、皮膚角層中のプロフィリン１蛋白質量が多い人は４５歳を超えたときにシワ面積率が増大するという皮膚老化リスクが高いと評価できる。
　皮膚老化リスク低減剤のスクリーニング
　また、プロフィリン１蛋白質量を減少させる成分を探索することにより、皮膚老化リスク低減剤をスクリーニングすることができる。例えば、ヌードマウスに紫外線を照射してシワを形成させる実験系において、プロフィリン１蛋白質量を減少させる成分を探索し、その成分を投与することによりシワ面積率が低減するか確認することができる。
１．被験者
　表１に示す年齢構成、男女人数の191名に対して試験を実施した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
２．皮膚角層中のプロフィリン１蛋白質量の測定
２．１　テープストリッピングによる角層の採取
　粘着テープとしてアサヒバイオメッド社製角質チェッカー（２．５ｃｍ×２．５ｃｍ）を用いた。被験者の顔面頬部に角質チェッカーを貼り、指先で軽く擦り付けて皮膚角層を角質チェッカーの粘着面に粘着させた。
２．２　プロフィリン１蛋白質の抽出
　　　抽出バッファー：50mM Tris-HCl (pH7.5)、120mM NaCl,
　　　　　　　　　　　 1mM Na3VO4, 0.1%(w/v)SDS。
　　　抽出バッファー量：２００μＬ。
　　　抽出容器：直径１１ｍｍの円筒容器。
　円筒容器に粘着テープを粘着面の反対の面が容器の内壁に沿うようにして入れ、抽出バッファーを入れて、ミニ・コードレスグラインダー（フナコシ社　code13753E）にペッスルとしてHandy pestle (TOYOBO社、code HMX-301)を接続し、ペッスルを９０００ｒｐｍで回転させて、円筒容器内壁に沿わせた粘着テープの粘着面を擦った。攪拌時間は３０秒とした。
　プロフィリン１蛋白質抽出液を約１分間静置し、泡を沈静化し、その後、円筒容器からプロフィリン１蛋白質抽出液を吸引して採集した。
３．プロフィリン１タンパク質量の測定
　プロフィリン１タンパク質量は、プロフィリン１タンパク質抽出液に含まれるプロフィリン１タンパク質の相対値と抽出液中の全タンパク質の絶対量の両方の値を算出し、「プロフィリン１タンパク質の相対値」を「抽出液中の全タンパク質の絶対量」で割った、比率値（以下「プロフィリン１タンパク質量」とする）として算出を行った。
　プロフィリン１蛋白質の量の測定には、得られたプロフィリン１蛋白質抽出液に5倍量のSDS処理液{0.3 M Tris-HCl (pH6.8)、２５％グリセロール、７．５％SDS、１０％メルカプトエタノール}を加え、95℃、5分間ヒートブロック処理した後に、それぞれPVDF膜（アマシャムバイオサイエンス社）に正確に1μlを垂らし、３時間室温で乾燥させることで膜に固定化させた。その後、PVDF膜をブロッキング溶液（スキムミルクを５％の濃度になるように０．１％のポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレートを含むＰＢＳで溶解した溶液）に浸し、４℃で一昼夜ブロッキングした。洗浄液{０．１％のポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレートを含むＰＢＳ｝で洗浄後、一次抗体｛洗浄液で５００ｎｇ／ｍｌに調製したプロフィリン１に対するポリクローナル抗体（アブカム社）｝に浸し、室温で１時間反応させた。洗浄後、二次抗体（洗浄液で２５０ｎｇ／ｍｌに調製したホースラディッシュパーオキシダーゼ標識化抗ウサギイムノグロブリンＧ）に浸し、室温で１時間反応させた。洗浄後、ＥＣＬプラスウエスタンブロッティング検出試薬（アマシャムバイオサイエンス社）を用いて発光させ、Ｘ線フィルムに露光させた。ドット状に露光されたＸ線フィルムの黒化強度を画像解析ソフトであるImage J（ＮＩＨ製、http://rsbweb.nih.gov/ij/）を用いて数値化、算出し、「プロフィリン１タンパク質の相対値」とした。
　「抽出液中の全タンパク質の絶対量」の測定には、プロフィリン１タンパク質の相対値の測定の際と同様にPVDF膜への固定化を行い、さらに同じ膜に対して濃度が既知の牛血清アルブミン溶液（SIGMA）の固定化を複数濃度で行った。その後、固定化した膜上のタンパク質をCBB染色液（バイオラッド社）により染色し、ドット状に得られる青色の染色像を画像解析ソフトであるImage Jを用いて数値化し、既知濃度で固定化した牛血清アルブミン溶液の染色強度を用いて濃度算出を行い、「抽出液中の全タンパク質の絶対量」とした。
　X線フィルムの黒化強度より得られた「プロフィリン１タンパク質の相対値」の値をPVDF膜のCBB染色像よりえられた「抽出液中の全タンパク質の絶対量」の値で割った値をプロフィリン１タンパク質量とした。
４．シワ面積率の測定
　(有)アサヒバイオメッド製の反射型レプリカ採取キットを用いて、被験者の目尻のレプリカを採取した。レプリカ解析システムASA‐03RXDを用いて、採取したレプリカに角度27度からの平行光（LED光源）を照射し、シワの形状に応じた陰影画像をCCDカメラで撮像し、ASA‐03RXD付属のソフトウェアで画像処理することでレプリカ表面のシワ面積率{（μｍ２／ｍｍ２）×100}を計測した。
５．皮膚角層中のプロフィリン１蛋白質量の、シワ面積率の説明変数としての有効性
　説明変数としての有効性は、シワ面積率を従属変数、最も当てはまりの良い重回帰式を求めることにより行った。当てはまりの良さを判定するには、ＡＩＣ（Ａｋａｉｋｅ’ｓ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｃｒｉｔｅｒｉｏｎ：赤池情報量基準　岩崎学ら、実用統計用語事典　株式会社オーム社　２００６年３月２５日発行　２１ページ）を使用した。ＡＩＣは、「モデルの複雑さと、データとの適合度とのバランスを取る」ために使用される。
  例えば、ある測定データを統計的に説明するモデルを作成することを考える。この場合、パラメータの数や次数を増やせば増やすほど、その測定データとの適合度を高めることができる。しかし、その反面、ノイズなどの偶発的な（測定対象の構造と無関係な）変動にも無理にあわせてしまうため、同種のデータには合わなくなる（過適合問題）。この問題を避けるには、モデル化のパラメータ数を抑える必要があるが、実際にどの数に抑えるかは難しい問題である。ＡＩＣは、この問題に一つの解を与える。具体的にはＡＩＣ最小のモデルを選択すれば、多くの場合、良いモデルが選択できる。
  公式は次の式１の通りである。
　　　　　　　AIC = -2Ln(L) + 2k　　　　　　　　・・・・・・・・・式1
　　　　　　　ここでLは最大尤度、kは自由パラメータの数である。
　ＡＩＣはモデルの当てはまりを評価する一般的な手法であり、この値がより小さいとき、より当てはまりの良いモデルとして判定できる。シワ面積率を説明するモデルとして、以下の２つを考える。
　　　yi= a + b1x1i + ei  ( i =1, 2, 3,…,n )　　・・・・・・・・式２
　　　　　　　　　 
　　　yi = a + b1x1i+ b2x2i + ei  ( i =1, 2, 3,…, n )　　・・・・・式３

　　　yi: シワ面積率
　　　x1i: 年齢
　　　x2i: プロフィリン1
　　　ei: 測定誤差
　上記２つのモデル（式２、式３）に対してＡＩＣを求めると、式２は１０２７．７５、式３は９３９．９７３１となり、式３の方が、当てはまりが良いことが分かる。すなわち、シワ面積率を説明するには、年齢だけではなく、年齢とともにプロフィリン1を用いる方が当てはまりが良く、つまり精度が高くなることがわかった。このことはプロフィリン１がシワ面積率を推定する指標として有用であることに他ならない。さらに、式２、３の相関係数は各々、０．７９、０．８１であり、ＡＩＣの結果と同様式３のほうがシワ面積率の説明精度が向上している。
　また、式３で作成した重回帰モデルは以下の式４のとおりとなった。
 　　　　　　　y = -8.5 + 0.3x1 + 0.1x2　　　　・・・・・・・・・式４
 
　　　　　　　　y: シワ面積率
　　　　　　　　x1: 年齢
　　　　　　　　x2: プロフィリン1
６．プロフィリン１タンパク質量による群分けとシワ面積率と年齢との相関
　皮膚角層中のプロフィリン１タンパク質量量は計１９１名で２．５～９９．０の範囲で分布した。このプロフィリン１タンパク質量がシワ面積率に与える影響を調べるために、プロフィリン１タンパク質量が多い人（プロフィリン１タンパク質４４.１～９９.０、６４名）、中間の人（プロフィリン１タンパク質量２５.１～４４.０、６４名）、少ない人（プロフィリン１タンパク質量２.５～２５．０、６３名）、いずれもほぼ等しい人数からなる３群に分けた。
　それぞれの群において、シワ面積率と年齢の回帰直線を求めた。グラフを図１に示す。
　プロフィリン１蛋白質量が多い群の回帰直線は次の式５である（ｙ：シワ面積率、ｘ：年齢）。
 　　　　　　　　　　　y＝－９．０＋０．３６x　　・・・・・・・・式５
 
　プロフィリン１蛋白質量が中間の群の回帰直線は次の式６である。
 
　　　　　　　　　　　y＝－７．７＋０．３０x　　・・・・・・・・式６
　　　　　　　　　　　 
　プロフィリン１蛋白質量が少ない群の回帰直線は次の式７である。
 
　　　　　　　　　　　y＝－５.４＋０．２４x　　・・・・・・・・・式７
 
　シワ面積率が年齢に伴って増加することを示す回帰直線の傾きは、皮膚角層中のプロフィリン１タンパク質量が、多い群＞中間の群＞少ない群、となっており、プロフィリン１タンパク質量が多いほど皮膚老化リスクが高いことが分かる。皮膚角層中のプロフィリン１タンパク質量が多い群と少ない群に関してシワ面積率の差を共分散分析にて検定したところ、ｐ＜０．０５で有意に皮膚角層中のプロフィリン１タンパク質量が多い群のほうが、シワ面積率が高いことが分かった。
　さらに、皮膚角層中のプロフィリン１タンパク質量が多い群、中間の群、少ない群それぞれの測定データをＬＯＷＥＳＳ曲線で表した。ＬＯＷＥＳＳ（Ｌｏｃａｌｌｙ　Ｗｅｉｇｈｔｅｄ　Ｓｃａｔｔｅｒｐｌｏｔ　Ｓｍｏｏｔｈｅｒ）は局所重み付け回帰関数を使用する、非常によく使用されているスムージング手法である。それぞれの群のデータとＬＯＷＥＳＳ曲線を作成した。各群のＬＯＷＥＳＳ曲線を図２にまとめた。図２から分かるように、各群のシワ面積率は４５歳までは、ほぼ同様に増大するが、４５歳を超えると皮膚角層中のプロフィリン１タンパク質量が多い群、中間の群、少ない群のシワ面積率の増大傾向に大きな差が生じることが分かる。従って、４５歳以下であっても、皮膚角層中のプロフィリン１タンパク質量が平均の値よりも多い人は４５歳を超えるとシワが増大する皮膚老化リスクが高いと予測できる。
シワ面積率と年齢の回帰直線を示すグラフ。 皮膚角層中のプロフィリン１タンパク質量が多い群、中間の群、少ない群それぞれの測定データをＬＯＷＥＳＳ曲線で表したグラフ。

Claims (6)

  1. 　皮膚角層中のプロフィリン１蛋白質量を指標とし、プロフィリン１蛋白質量が多いほどシワ形成リスクが高いと評価することを特徴とするシワ形成リスクの評価方法。
  2. 　皮膚角層から抽出したプロフィリン１蛋白質の量を、あらかじめ測定した被験者の年齢層の標準的プロフィリン蛋白質量と比較対比することを特徴とする請求項１記載のシワ形成リスクの評価方法。
  3. 　皮膚角層が、非侵襲的なテープストリッピング手段によって採取された皮膚角層であることを特徴とする請求項１又は２記載のシワ形成リスクの評価方法。
  4. 　４５歳以降に形成されるシワ形成リスクが、４５歳以前の被験者から採取した皮膚角層から検出したプロフィリン１蛋白質量を指標とするものであることを特徴とする請求項１記載のシワ形成リスクの評価方法。
  5. 　採取される皮膚角層が、ほほ由来であることを特徴とする請求項４に記載されたシワ形成リスクの評価方法。
  6. 　請求項１～５のいずれかに記載されたシワ形成リスクの評価方法を用いて、シワ形成リスクに影響を与える成分をスクリーニングする方法。
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