CN102187229A - 皱纹形成风险的评价方法 - Google Patents

Abstract

一种皮肤老化风险的评价方法，其将使用非侵袭方法采集的皮肤角质层中的抑制蛋白1的量作为指标。

Description

皱纹形成风险的评价方法

技术领域

本发明涉及预测皮肤老化风险的技术。

背景技术

本申请人一直以来就着眼于老化而进行研究开发。发现了伴随老化而发生变化的蛋白质，从而提出了专利文献1(国际公开第07/023808号公报)等。

有关抑制蛋白1，已知有抑制抑制蛋白的产生、改变修正植物生长发育的技术(专利文献2：日本特开平11-69921号公报)；抑制由作为组织损伤的结果所释放出的游离肌动蛋白产生的二次组织损伤的技术(专利文献3：日本特开2005-41881号公报)；检测神经系统障碍、神经细胞障碍，作为诊断标记物的技术(专利文献4：日本特开2007-532915号公报)；作为上皮性癌的生物标记物的技术(专利文献5：日本特开2008-529008号公报)。

专利文献1国际公开第07/023808号公报

专利文献2日本特开平11-69921号公报

专利文献3日本特开2005-41881号公报

专利文献4日本特开2007-532915号公报

专利文献5日本特开2008-529008号公报

发明内容

本发明的目的在于使用利用非侵袭的方法采集的皮肤角质层，提供将来的皮肤老化风险的指标。

本发明的主要构成如下。

(1)一种皱纹形成风险的评价方法，其特征在于，将皮肤角质层中的抑制蛋白1的量作为指标，抑制蛋白1的量越多，评价皱纹形成风险越高。

(2)根据(1)所述的皱纹形成风险的评价方法，其特征在于，将从皮肤角质层中提取的抑制蛋白1的量与预先测定的被验者年龄层的标准化抑制蛋白的量进行比较对比。

(3)根据(1)或(2)中所述的皱纹形成风险的评价方法，其特征在于，皮肤角质层为通过非侵袭胶带剥离方法采集的皮肤角质层。

(4)根据(1)中所述的皱纹形成风险的评价方法，其特征在于，从45岁以前的被验者身上采集皮肤角质层，从该皮肤角质层中检测出抑制蛋白1的量，45岁以后形成的皱纹形成风险以该抑制蛋白1的量作为指标。

(5)根据(4)所述的皱纹形成风险的评价方法，其特征在于，所采集的皮肤角质层来源于脸颊。

(6)一种筛选方法，其特征在于，使用(1)～(5)中任一项所述的皱纹形成风险的评价方法筛选对皱纹形成风险有影响的成分。

本发明证实了在机体内大范围表达的蛋白质且在细胞内构成细胞骨架的蛋白质即抑制蛋白1成为皮肤老化风险评价的指标。

特别是作为老化现象的对象，着眼于皱纹形成。使用通过胶带剥离等非侵袭方法从脸颊上采集的皮肤角质层，通过检测抑制蛋白1并测定其表达量，可预测将来的皱纹形成等。特别是对预测45岁以后发生的皱纹形成有效。

可为预防将来皱纹形成等的老化现象采取选择有效化妆品等的预防措施，或者可针对皱纹形成风险等的皮肤老化风险进行恰当的美容咨询。

附图说明

图1为表示皱纹面积率和年龄的回归直线的图。

图2为用LOWESS曲线表示皮肤角质层中的抑制蛋白1的量多的组、中等的组、少的组各组的测定数据的图。

具体实施方式

本发明中使用的抑制蛋白1(PFN1、Gene ID 5216)是在机体内大范围表达的蛋白质，作为调节在细胞内构成细胞骨架的蛋白质即肌动蛋白的聚合/脱聚合的蛋白质而已知。

本申请发明测量了利用非侵袭方法采集的皮肤角质层中存在的蛋白质即抑制蛋白1，基于其存在量，可知成为该皮肤角质层原来源的人将来的皮肤老化风险。特别是阐明了即使在年轻时未表现出来，但45岁以后皱纹的发生状况也与年轻时抑制蛋白1的表达量相关。

本发明者通过按各年龄不同而将抑制蛋白1的表达量建立高中低3级模型，证实了虽然在45岁左右之前皱纹有相同程度的增加趋势，但在45岁左右以后，高度抑制蛋白1组的皱纹面积的增加加速，而低度抑制蛋白1组的皱纹面积的增加得到抑制。

基于此结果，通过了解抑制蛋白1的表达量，即可从年轻时预测皱纹形成等的皮肤老化风险，从而可采取选择化妆品等的预防措施。而且，即使在45岁以后，也可推测出今后皱纹等的老化的加速性，并可根据该推测来研究对策，或者可根据科学依据来进行化妆品选择的咨询。

另外，可通过利用高度抑制蛋白1的皮肤培养模型，探索影响该抑制蛋白1表达量的被检物质，而筛选出可抑制皱纹形成等老化的药剂。

本申请发明因通过胶带剥离等非侵袭方法安全且容易地采集皮肤角质层，关注抑制蛋白1的表达量，可短时间特定该皮肤角质层，所以，可在化妆品柜台简单测定并在其柜台处作为选择化妆品的资料。测定该抑制蛋白1表达量的机器可为一体化小型机器，并将检测出的结果与前述分级指标相比较而提示。

而且，基于该结果，也可表示适合的化妆品和菜单。

本发明作为医疗目的以外的目的为可评价皮肤老化等的皮肤老化风险，并可基于此在医疗以外的目的上采取处理措施。

从皮肤角质层采集抑制蛋白1的方法

(1)通过胶带剥离法的角质层的采集

胶带剥离法是指通过在皮肤上粘贴粘附胶带并揭下粘附胶带，从而采集粘附面上粘附的角质层的方法。

使用市售的粘附胶带，例如可通过在人脸颊部按压粘附胶带，使角质层粘附在粘附胶带上来采集。作为市售的粘附胶带，可例举ASAHIBIOMED公司制角质检测仪、MORITEX公司制角质层seal、PROMOTOOL公司制角质检测仪(盘式W、盘式G、PRO式)、Integral公司制Corneofix、3M公司制透明胶带、3M公司制透明双面胶带等。

(2)提取缓冲液

为了从粘附在粘附胶带上的角质层中提取抑制蛋白1，使用提取缓冲液。作为提取缓冲液，例如可例举如下组成。组成：50mM Tris-HCl(pH7.5)、120mM NaCl(氯化钠)，1mM Na₃VO₄(正钒酸钠)。

用粘附胶带采集的皮肤的角质层是角化细胞分化的角质层，富含细胞骨架系的蛋白质。因此，为提高抑制蛋白1的提取效率，优选在该提取缓冲液中含有适当的表面活性剂。作为表面活性剂，优选使用SDS(月桂基硫酸钠、CH₃(CH₂)₁₁OSO₃Na)。

(3)抑制蛋白1的提取

通过将采集了角质层的粘附胶带放入圆筒容器，使用高速旋转的均质器用研杵(Pestle)(以下称为“研杵”)摩擦粘附面，可迅速进行抑制蛋白1的提取。此外，可将采集了角质层的粘附胶带浸入提取缓冲液中用刮刀刮擦以提取抑制蛋白1，也可使用振荡法、超声波照射法。

将粘附胶带的粘附面朝向圆筒容器内侧，将粘附面的相反面沿圆筒容器的内侧放入圆筒容器。通过将粘附胶带的粘附面的相反面沿圆筒容器的内侧放入，可容易地用研杵摩擦粘附面。

研杵可以是棒的先端具有可刮取的突起状、或是刮铲状的结构。作为研杵的结构，例如也可通过在棒的先端连接比棒的直径大的同心圆筒，在其圆筒上与轴平行设置多个缺口部，可在圆筒的圆周上并列设置多个刮铲状结构(刮取部)，用该刮铲可刮擦粘附胶带。作为市售品，可使用Handy pestle(TOYOBO公司、code HMX-301)等。Handy pestle(TOYOBO公司、code HMX-301)的刮取部的直径为约7mm。

(4)抑制蛋白1提取液的采集

将抑制蛋白1提取液静置约1分钟，使泡沉静后，优选从圆筒容器中吸引、采集抑制蛋白1提取液。

(5)抑制蛋白1的量分析

所得到的抑制蛋白1提取液中的抑制蛋白1的量可通过ELISA法、抗体芯片法、FRET法定量分析。

皮肤老化风险的评价

与皱纹面积率{皱纹面积率是指根据日本化妆品工业联合会(http://www.jcia.org/)的标准导出的皱纹图像分析参数。实际上，是采集皮肤复制品后，使用图像分析软件进行形状补正，从进行了形状补正的3维形状中提取皱纹，计算出占测定范围中的所提取的皱纹面积比率的值，作为图像分析软件，例如可为有限会社ASAHIBIOMED的反射用复制品分析系统ASA-03-R}最相关的变量是年龄。而且，可证实抑制蛋白的量作为皱纹面积率的解释变量有效。

越是抑制蛋白1的量多的人，越有皱纹面积率大的趋势。特别是45岁以上时，抑制蛋白1的量多的人皱纹面积率增大，抑制蛋白1的量少的人皱纹面积率减小的趋势更为显著。因此，可预测出在45岁以前，皮肤角质层中的抑制蛋白1的量比平均值高时，在超过45岁时皱纹面积率的增大趋势比其年龄层的平均强。另一方面，可预测在45岁以前，皮肤角质层中的抑制蛋白1的量比平均值低时，在超过45岁时皱纹面积率的增大趋势比其年龄层的平均弱。

即45岁以前，抑制蛋白1的量的多寡对皱纹面积率没什么影响，但在超过45岁时，皮肤角质层中抑制蛋白1的量多的人皱纹面积率会增大，可评价为皮肤老化风险高。

皮肤老化风险降低剂的筛选

此外，可通过探索使抑制蛋白1的量减少的成分来筛选皮肤老化风险降低剂。例如，在对裸鼠照射紫外线使其皱纹形成的实验系中，通过探索使抑制蛋白1的量减少的成分并投给该成分，确认能否降低皱纹面积率。

实施例

1.被验者

用表1所示的年龄组成对男女人数191名进行试验。

表1

年龄
		20～29岁	46人
30～39岁	58人
		40～49岁	44人
50岁以上	43人
		合计	191人

2.皮肤角质层中抑制蛋白1的量的测定

2.1通过胶带剥离采集角质层

作为粘附胶带，使用ASAHIBIOMED公司制角质检测仪(2.5cm×2.5cm)。在被验者的脸颊部粘贴角质检测仪，用指尖轻轻刮擦以使皮肤角质层粘附在角质检测仪的粘附面上。

2.2抑制蛋白1的提取

提取缓冲液：50mM Tris-HCl(pH7.5)、120mM NaCl，1mM Na₃VO₄，0.1％(w/v)SDS。

提取缓冲液量：200μL。

提取容器：直径11mm的圆筒容器。

将粘附胶带的粘附面的相反面沿容器内壁放入圆筒容器中，加入提取缓冲液，在Mini Cordless Grinder(funakoshi公司code13753E)中连接作为研杵的Handy pestle(TOYOBO公司、code HMX-301)，使研杵以9000rpm旋转，摩擦沿着圆筒容器内壁放入的粘附胶带的粘附面。搅拌时间为30秒。

将抑制蛋白1提取液静置约1分钟，使泡沉静后，从圆筒容器中吸引、采集抑制蛋白1提取液。

3.抑制蛋白1的量的测定

抑制蛋白1的量的计算如下进行，计算出抑制蛋白1提取液中所含有的抑制蛋白1的量的相对值和提取液中全蛋白质的绝对量这两者的值，计算“抑制蛋白1的相对值”除以“提取液中全蛋白质的绝对量”的比率值(以下称为“抑制蛋白1的量”)。

抑制蛋白1的量的测定通过在所得到的抑制蛋白1提取液中加入5倍量的SDS处理液{0.3M Tris-HCl(pH6.8)、25％甘油、7.5％SDS、10％巯基乙醇}，95℃、Heat Block处理5分钟后，分别在PVDF膜(Amersham Biosciences公司)上准确垂滴1μl，在室温下干燥3小时以固定在膜上。而后，将PVDF膜浸入封闭溶液(为使脱脂奶成为5％的浓度而用含有0.1％聚氧乙烯(20)失水山梨醇单月桂酸酯的PBS溶解的溶液)，4℃下封闭一昼夜。用洗涤液{含有0.1％聚氧乙烯(20)失水山梨醇单月桂酸酯的PBS}洗涤后，浸入一次抗体{相对于用洗涤液配制成500ng/ml的抑制蛋白1的多克隆抗体(Abcam公司)}，室温下反应1小时。洗涤后，浸入二次抗体(用洗涤液配制成250ng/ml的辣根过氧化物酶标记抗兔免疫球蛋白G)中，室温下反应1小时。洗涤后，使用ECL Plus蛋白质印迹检测试剂(Amersham Biosciences公司)使其发光，并在X射线胶片上曝光。将曝光成点状的X射线胶片的黑化强度使用图像分析软件即Image J(NIH制、http://rsbweb.nih.gov/ij/)变成数值并计算，作为“抑制蛋白1的相对值”。

在进行“提取液中全蛋白质的绝对量”的测定时，与抑制蛋白1的相对值的测定同样进行在PVDF膜上的固定，且在相同膜上用多个浓度进行已知浓度的牛血清白蛋白溶液(SIGMA)的固定。而后，将固定后的膜上的蛋白质用CBB染色液(Bio-Rad公司)染色，将所得到的点状、蓝色的染色图像使用图像分析软件即Image J变成数值，使用以已知浓度固定的牛血清白蛋白溶液的染色强度进行浓度计算，作为“提取液中的全蛋白质的绝对量”。

将由X射线胶片的黑化强度得到的“抑制蛋白1的相对值”的值除以由PVDF膜的CBB染色图像得到的“提取液中全蛋白质的绝对量”的值，将所得到的值作为抑制蛋白1的量。

4.皱纹面积率的测定

使用有限公司ASAHIBIOMED制的反射型复制品采集试剂盒采集被验者眼角的复制品。使用复制品分析系统ASA-03RXD，对采集的复制品从27度角度照射平行光(LED光源)，将符合皱纹形状的阴影图像用CCD照相机摄影，通过用ASA-03RXD附属的软件进行图像处理来测量复制品表面的皱纹面积率{(μm²/mm²)×100}。

5.皮肤角质层中抑制蛋白1的量作为皱纹面积率的解释变量的有效性

作为解释变量的有效性，通过将皱纹面积率作为从属变量，求出拟合最良好的多元回归式来进行。为判断拟合的良好程度，使用AIC(Akaike’s Information Criterion：赤池信息量准则岩崎学等、实用统计用语事典株式会社OHM公司(日语原名：赤池情幸報量基準岩崎学ら、実用統計用語事典株式会社才一厶社)2006年3月25日发行21页)。AIC用于“取得模型的复杂度和数据的拟合度之间的平衡”。

例如，考虑将某测定数据建成统计性说明的模型。此时，越增加参数的数量和次数，越会提高与该测定数据的拟合度。但是相反，因要勉强与干扰等偶然(与测定对象的结构无关的)变化拟合，所以会使同种数据不拟合(过度拟合问题)。为避免此问题，需要控制模型化的参数数量，但实际上，控制到多少数量为好是个难题。AIC可给与此问题一个解决方案。具体来说，只要选择AIC最小的模型，在多数情况下即可选择良好的模型。

公式如以下式1所示。

AIC＝-2Ln(L)+2k                       ·········式1

在此，L为最大似然函数，k为自由参数的数量。

AIC为评价模型拟合的通常方法，该值更小时，可判断为拟合更加良好的模型。作为说明皱纹面积率的模型，考虑为如下2个。

y_i＝a+b1x1i+ei(i＝1，2，3，...，n)      ········式2

y_i＝a+b₁x_1i+b₂x_2i+e_i(i＝1，2，3，...，n)      ·····式3

y_i：皱纹面积率

x_1i：年龄

x_2i：抑制蛋白1

e_i：测定误差

针对上述2个模型(式2、式3)求出AIC时，可知式2为1027.75，式3为939.9731，式3的拟合良好。即可知在说明皱纹面积率时，不仅是年龄，和年龄同时使用抑制蛋白1时的拟合良好，也就是说精度增高。这无疑可说明抑制蛋白1作为推断皱纹面积率的指标有用。而且，式2、3的相关系数各自为0.79、0.81，与AIC的结果同样，式3提高了皱纹面积率的说明精度。

此外，式3中制作的多元回归模型如以下式4所示。

y＝-8.5+0.3x₁+0.1x₂                  ·········式4

y：皱纹面积率

x₁：年龄

x₂：抑制蛋白1

6.根据抑制蛋白1的量分组时皱纹面积率和年龄的相关性

皮肤角质层中的抑制蛋白1的量在共计191名中的分布范围为2.5～99.0。为分析该抑制蛋白1的量对皱纹面积率的影响，将抑制蛋白1的量多的人(抑制蛋白1的量为44.1～99.0，64名)、中等的人(抑制蛋白1的量为25.1～44.0，64名)、少的人(抑制蛋白1的量为2.5～25.0，63名)均分成由基本相等的人数组成的3个组。

在各个组中，求出皱纹面积率和年龄的回归直线。图如图1所示。

抑制蛋白1的量多的组的回归直线为如下式5(y：皱纹面积率、x：年龄)。

y＝-9.0+0.36x              ········式5

抑制蛋白1的量中等的组的回归直线为下式6。

y＝-7.7+0.30x              ········式6

抑制蛋白1的量少的组的回归直线为下式7。

y＝-5.4+0.24x              ········式7

表示皱纹面积率随年龄增加的回归直线的斜率为皮肤角质层中的抑制蛋白1的量多的组＞中等的组＞少的组，可知抑制蛋白1的量越多皮肤老化风险越高。有关皮肤角质层中的抑制蛋白1的量多的组和少的组，在将皱纹面积率的差用协方差分析检验时，可知p＜0.05，皮肤角质层中的抑制蛋白1的量多的组其皱纹面积率显著高。

而且，将皮肤角质层中的抑制蛋白1的量多的组、中等的组、少的组的各个测定数据用LOWESS曲线表示。LOWESS(Locally Weighted Scatterplot  Smoother)是使用局部加权回归函数的非常常用的平滑法。制作各个组的数据和LOWESS曲线，将各组的LOWESS曲线归纳于图2。从图2可知，各组的皱纹面积率在45岁之前基本同样增大，但在45岁以后，皮肤角质层中的抑制蛋白1的量多的组、中等的组、少的组的皱纹面积率的增大趋势产生了很大差异。因此，即使为45岁以下，也可预测出皮肤角质层中的抑制蛋白1的量比平均值多的人在45岁以后时皱纹增加的皮肤老化风险要高。

Claims (6)

1.一种皱纹形成风险的评价方法，其特征在于，将皮肤角质层中的抑制蛋白1的量作为指标，抑制蛋白1的量越多，评价皱纹形成风险越高。

2.根据权利要求1中所述的皱纹形成风险的评价方法，其特征在于，将从皮肤角质层中提取的抑制蛋白1的量与预先测定的被验者年龄层的标准化抑制蛋白1的量进行比较对比。

3.根据权利要求1或2中所述的皱纹形成风险的评价方法，其特征在于，皮肤角质层为通过非侵袭胶带剥离方法采集的皮肤角质层。

4.根据权利要求1中所述的皱纹形成风险的评价方法，其特征在于，从45岁以前的被验者身上采集皮肤角质层，从该皮肤角质层中检测出抑制蛋白1的量，45岁以后形成的皱纹形成风险以该抑制蛋白1的量作为指标。

5.根据权利要求4所述的皱纹形成风险的评价方法，其特征在于，所采集的皮肤角质层来源于脸颊。

6.一种筛选方法，其特征在于，使用权利要求1～5中任一项所述的皱纹形成风险的评价方法筛选对皱纹形成风险有影响的成分。

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