CN102239413B - 因紫外线引起的皮肤变黑趋势的评价方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供：以采用非侵袭的方法采集的皮肤角质层中的膜联蛋白II蛋白质的量为指标的推算皮肤黑色素量的方法，或者评价因紫外线所引起的皮肤变黑趋势的评价方法。

Description

因紫外线引起的皮肤变黑趋势的评价方法
技术领域
本发明涉及因紫外线引起的皮肤变黑趋势的评价方法。
背景技术
人们担心紫外线对皮肤的致癌作用、对白内障等眼部疾病的影响、对免疫功能的影响等很多对健康方面的影响。被紫外线照射时，会诱发皮肤的各种紫外线损伤。紫外线使皮肤产生炎症，将皮肤的不饱和脂质氧化从而产生脂质自由基，生成过氧化脂质。这种因紫外线引起的炎症、氧化会诱发组织、细胞、DNA的损伤。作为因皮肤暴露于紫外线中所产生的现象，通常可例举皱纹、斑点、皮肤癌等。
近年来，作为免疫学数据，有关于根据对紫外线的敏感性(肌肤颜色、皮肤类型等)不同而发生皮肤癌的风险提高的报道(非专利文献1、2)。而且作为皮肤癌的一种的恶性黑色素瘤(melanoma)的危险风险度，已证明由黑皮质素1受体(melanocortin 1 receptor)的一个碱基置换的基因突变所引起的风险增高数倍(非专利文献3、4)。对紫外线的敏感性根据皮肤类型不同而大不相同，或者区分成为6个等级的不同类型，或者以产生红色(红斑)的最小紫外线能量(最小红斑量：MED)为标准进行分类，但前者为主观观测，而后者则伴随不照射紫外线就无法测定的风险。由于臭氧层破坏等，比以前增加的紫外线增加已成为问题，所以有必要针对个人对紫外线的敏感性风险进行适当评价。
一方面，通常来说在形成被称为斑点的色素沉积的初期阶段，在皮肤表面上明显出现之前由于各种刺激使表皮角质化细胞生成α-MSH、bFGF、CGRP、内皮素等信息传递物质，再传递给黑素细胞。传递给黑素细胞之后，在细胞内形成大量黑色素。另一方面，由于紫外线的作用使代谢回转发生异常，致使大量形成的黑色素无法排泄，所以向色素病变方面转变。有报道指出，在使用in vitro系的实验中，向黑素细胞照射紫外线时，作为细胞增殖因子标记物的p73、Nup88、p27、Id1、PCNA以及作为细胞凋亡关联蛋白质的bcl-2的表达发生增减(非专利文献5)。到目前为止，有报道指出，对于斑点的状况，通过活组织检查使用皮肤组织进行侵袭式地比较斑点部和正常部，斑点部的NT-3、ADAM9、HB-EGF等蛋白质的表达显著增加(专利文献1)。进而，有报道指出，作为预测皮肤斑点形成的检查方法，通过活组织检查来测定MLSTD1、MOGAT1、Mcp9、Krt2-6b等的mRNA量，从而判断斑点形成的风险(专利文献2、3、4)。此外，专利文献5中公开：作为非侵袭方法，将通过胶带剥离或摩擦而采集的来自皮肤的角质层作为试样，分析白介素1(IL-1)与白介素1受体拮抗剂(IL-1ra)的存在量，从而评价肌质的方法。
专利文献1日本特开2004-205246号公报
专利文献2日本特开2005-106745号公报
专利文献3日本特开2005-110505号公报
专利文献4日本特开2007-289063号公报
专利文献5日本专利第3590708号公报
非专利文献1Arch Dermatol.2004；140：819-824
非专利文献2Cancer Causes Control.1997；8(2)：246-252
非专利文献3Invest Dermatol.117：294-300，2001
非专利文献4Am.J.Hum.Genet.66：176-186，2000
非专利文献5Carcinogenesis 24(12)：1929-1934，2003
发明内容
本发明提供评价紫外线损伤风险的方法，特别是将提供以下方法作为其目的，使用采用非侵袭的方法采集的皮肤角质层，用于预知该被验者的皮肤变黑趋势的方法。
本发明的主要构成如下所述。
(1)一种因紫外线引起的皮肤变黑趋势的评价方法，其特征在于，根据皮肤角质层中的膜联蛋白II蛋白质的量，评价皮肤因紫外线引起的皮肤变黑趋势强。
(2)一种方法，其特征在于，采用(1)中记载的皮肤变黑趋势的评价方法，筛选对皮肤变黑产生影响的成分。
(3)一种方法，其特征在于，根据采用(1)中记载的皮肤变黑趋势的评价方法而得到的皮肤变黑趋势来选择化妆品。
本发明发现在生物体内表达的作为蛋白质的膜联蛋白II蛋白质的量与暴露于紫外线所产生的黑色素的量呈正相关性，证明能够评价皮肤变黑趋势。
通过本发明，在不实际照射紫外线的情况下可评价因紫外线引起的皮肤变黑趋势。
本发明因为可使用采用非侵袭的胶带剥离方法采集的皮肤角质层来评价，所以既安全又简便。
此外，利用本发明的评价法，可以筛选对于抑制因紫外线引起的皮肤变黑趋势或者抑制暴露于紫外线后的黑色素生成有用的成分。
根据本发明，可使应对斑点的措施、预防斑点的美容变得容易。即：可提供针对斑点等色素沉积部位的化妆品、医药部外品、医药品或美容用健康食品的选择以及对此有效的信息。可准确地进行应对斑点的措施等美容咨询。
附图说明
图1表示紫外线照射后的L*值的变化量。纵轴表示L*值的变化量。
图2表示即将照射紫外线之前(第0天)的L*值与膜联蛋白II在角质层中的表达量的相关关系。
图3表示以第0天的N值为标准的紫外线照射后第2天的L*值变化量与变换为自然对数的膜联蛋白II蛋白质的量的相关关系。
图4表示以第0天的N值为标准的紫外线照射后第4天的L*值变化量与变换为自然对数的膜联蛋白II蛋白质的量的相关关系。
图5表示以第0天的N值为标准的紫外线照射后第7天的L*值变化量与变换为自然对数的膜联蛋白II蛋白质的量的相关关系。
图6表示以第0天的N值为标准的紫外线照射后第10天的L*值的变化量与变换为自然对数的膜联蛋白II蛋白质的量的相关关系。
图7表示以第0天的N值为标准的紫外线照射后第14天的L*值的变化量与变换为自然对数的膜联蛋白II蛋白质的量的相关关系。
图8表示紫外线照射后的N值的经时变化量。纵轴表示N值的变化量。
图9表示即将照射紫外线之前(第0天)的N值与膜联蛋白II在角质层中的表达量的相关关系。
图10表示以第0天的N值为标准的紫外线照射后第2天的N值变化量与变换为自然对数的膜联蛋白II蛋白质的量的相关关系。
图11表示以第0天的N值为标准的紫外线照射后第4天的N值变化量与变换为自然对数的膜联蛋白II蛋白质的量的相关关系。
图12表示以第0天的N值为标准的紫外线照射后第7天的N值变化量与变换为自然对数的膜联蛋白II蛋白质的量的相关关系。
图13表示以第0天的N值为标准的紫外线照射后第10天的N值变化量与变换为自然对数的膜联蛋白II蛋白质的量的相关关系。
图14表示以第0天的N值为标准的紫外线照射后第14天的N值变化量与变换为自然对数的膜联蛋白II蛋白质的量的相关关系。
具体实施方式
以下对本发明的实施方式进行更加详细地说明。
本发明提供包括测定皮肤角质层中含有的膜联蛋白II蛋白质的量在内的评价紫外线损伤风险的方法。
本申请发明，根据测定的采用非侵袭方法而采集的作为在皮肤角质层中存在的蛋白质的膜联蛋白II的存在量，可预知因暴露于紫外线所引起的作为该皮肤角质层的来源的人所变黑的风险。
本发明者发现暴露后的黑色素生成的变化与膜联蛋白II的表达量有正相关性，并且证明通过测定膜联蛋白II的表达量，可预测暴露时黑色素生成的风险，进而可预测皮肤变黑的程度。
根据该结果，通过预知皮肤角质层中的膜联蛋白II的表达量，可采取选择抑制暴露于紫外线的影响的化妆品等预防措施。并且，可根据对暴露于紫外线所产生的影响的预测来研究应对措施。即：根据本发明可使应对斑点的措施、预防斑点的美容变得容易。而且可提供针对斑点等色素沉积部位的化妆品、医药部外品、医药品或美容用健康食品的选择以及对此有效的信息。可有科学根据地准确地进行应对斑点的措施等美容咨询。
此外，利用膜联蛋白II高表达产生的培养皮肤模型，通过探索对于该膜联蛋白II蛋白质的表达量产生影响的被测物质，可筛选出可抑制黑色素生成的药剂。
本申请发明因通过胶带剥离等非侵袭方法安全且容易地采集皮肤角质层，使用该皮肤角质层在短时间特定目标蛋白质的表达量，所以，可在化妆品柜台等简单地进行测定，可以当场作为化妆品选择的资料。测定该膜联蛋白II蛋白质的表达量的仪器，可在比较检测结果与指标后进行提示。进而也可根据该结果，表示出合适的化妆品、产品目录。
膜联蛋白II为分子量为38,473Da的细胞内蛋白质，是通过钙调节的膜结合蛋白质，该蛋白质上结合两个钙离子。有2组的膜联蛋白重复序列中，一个结合钙，一个结合磷脂。该蛋白质或者与结合在细胞膜的磷脂上的肌动蛋白、细胞骨架系统的蛋白质发生交联，或者通过t-PA(组织型纤溶酶原激活剂(tissue plasminogen activator))激活纤溶酶原。基因碱基序列信息(Annexin A2，Gene 95：243-251(1990)，BC015834)。氨基酸序列信息(Annexin A2，J.Biol.Chem.266：5169-5176(1991)，P07355)。
从皮肤角质层上采集角质层蛋白质的方法
(1)利用胶带剥离法采集角质层
胶带剥离法是指通过在皮肤上粘贴胶带并剥离粘附胶带，而采集粘附在粘附面上的角质层的方法。
使用市售的粘附胶带，例如通过在人的面颊部按压粘附胶带，可使角质层粘附在粘附胶带上来采集。作为市售的粘附胶带，可例举ASAHIBIOMED公司制的角质检测仪、Moritex公司制角质层胶条(seal)、PROMOTOOL公司质的角质检测仪(盘式W、盘式G、PRO式)、Integral公司制Corneofix、3M公司制透明胶带、3M公司制透明双面胶带等。
(2)提取缓冲液
为了从粘附在粘附胶带上的角质层中提取出角质层蛋白质，使用提取缓冲液。作为提取缓冲液，例如可例举以下组成。组成：PBS(-)、0.1％SDS。
用粘附胶带采集到的皮肤角质层是角质化细胞分化的产物，含有大量的细胞骨架系统的蛋白质。因此，为了提高角质层蛋白质的提取效率，优选该提取缓冲液中含有适当的表面活性剂。作为表面活性剂，优选使用SDS(月桂基硫酸钠CH3(CH2)11OSO3Na)。
(3)角质层蛋白质的提取
将采集了角质层的粘附胶带放入圆筒容器，通过使用高速旋转的均质器用研杵(Pestle)(以下称为“研杵”)摩擦粘附面，可迅速地提取角质层蛋白质。将粘附胶带的粘附面朝向圆筒容器内侧，将粘附面的相反面沿圆筒容器的内侧放入圆筒容器。通过将粘附胶带的粘附面的相反面沿圆筒容器的内侧放入，可容易地用研杵摩擦粘附面。作为其他方法，可将采集了角质层的粘附胶带浸入提取缓冲液中并用刮刀刮擦以提取角质层蛋白质，也可使用振荡法、超声波法。
(4)角质层蛋白质提取液的回收
优选使角质层蛋白质提取液静置约1分钟并使泡沫沉静，然后从圆筒容器中吸出角质层蛋白质提取液并回收。
(5)角质层蛋白质中的膜联蛋白II蛋白质的量的分析
得到的角质层蛋白质提取液中的膜联蛋白II蛋白质的量可通过免疫印迹法、ELISA法、抗体芯片法、FRET法进行定量分析。
因紫外线引起的皮肤变黑趋势的评价
通过本发明证明：皮肤角质层中的膜联蛋白II蛋白质的量与1MED(最小红斑量)的紫外线照射后的皮肤亮度有负相关性。此外，皮肤角质层中的膜联蛋白II蛋白质的量与1MED(最小红斑量)的紫外线照射后的黑色素量(用测试仪(Mexameter)测定的N值)有正相关性。
因此，皮肤角质层中的膜联蛋白II蛋白质的量比平均值高时，可评价为皮肤的因紫外线引起的皮肤变黑趋势强。具体来说，皮肤角质层中的膜联蛋白II蛋白质的量比平均值高的人，可评价为由于暴露于紫外线中容易使黑色素的产生亢进，容易产生斑点等紫外线损伤。
抑制因紫外线引起的皮肤变黑的抑制剂的筛选
通过探索使小鼠等的皮肤角质层中的膜联蛋白II蛋白质的量减少的成分，可筛选出抑制因紫外线引起的皮肤变黑的抑制剂。
实施例
1.被验者
将10名20多岁和30多岁的男性作为被验者。各被验者的年龄、皮肤类型、最小红斑量、紫外线照射前的L*值、N值如表1所示。此外，皮肤类型II为“容易产生晒斑(Sunburn)，略微产生晒黑(Suntan)”的类型，III为“一般性产生晒斑，一般性产生晒黑(晒为淡茶色)”的类型，IV为“略微产生晒斑，经常产生晒黑(晒为茶色)”的类型。
此外，L*值为用分光测色仪(CM-500、柯尼卡美能达公司制)测定的L*a*b*显色系的亮度，L*值大时评价为明亮(未变黑)，L*值小时评价为暗淡(已变黑)。此外，N值为黑色素量的指标，使用Courage+Khazaka制mexameter MX16测定。N值越大，评价为已变黑，N值小时黑色素量减少，评价为肤色白。
表1
Figure BDA0000065951770000081
2.皮肤角质层中的膜联蛋白II蛋白质的量的测定
2.1用胶带剥离法采集角质层
作为粘附胶带，使用ASAHIBIOMED公司制角质检测仪(2.5cm×2.5cm)。在被验者的背部粘贴角质检测仪，用指尖轻轻刮擦以使皮肤角质层粘附在角质检测仪的粘附面上，利用胶带剥离从背部采集共计5片的样品。
此外，利用胶带剥离的采集部位从紫外线照射部位采集。
2.2皮肤角质层蛋白质的提取
提取缓冲液：PBS(-)、0.1％(w/v)SDS。
提取缓冲液量：200μL。
提取容器：直径11mm的圆筒容器。
将粘附胶带的粘附面的相反面沿容器内壁放入圆筒容器中，加入提取缓冲液，在迷你无线研磨器(Mini Cordless Grinder)(funakoshi公司code13753E)上连接作为研杵的Handy pestle(TOYOBO公司、codeHMX-301)，使研杵以9000rpm旋转，摩擦沿着圆筒容器内壁的粘附胶带的粘附面。搅拌时间为90秒。
使皮肤角质层蛋白质提取液静置约1分钟并使泡沫沉静，然后从圆筒容器中吸出皮肤角质层蛋白质提取液并回收。
3.皮肤角质层蛋白质的量的测定
使用DC蛋白定量试剂盒(DC protein Assay Kit)(BIO-RAD公司)测定皮肤角质层蛋白质提取液中含有的全部蛋白质的量。
4.皮肤角质层蛋白质中的膜联蛋白II蛋白质量的测定
使用皮肤角质层蛋白质的量1μg份，通过免疫印迹法测定膜联蛋白II的表达量。使用各被验者的皮肤角质层蛋白质1μg份，使用5-15％梯度凝胶经过SDS-PAGE分离后，使蛋白质转印到PVDF膜上，用5％脱脂奶进行封闭(blocking)。将一级抗体(膜联蛋白II多克隆抗体：Santa CruzBiotechnology公司制)稀释1000倍，将二级抗体(兔抗羊IgG(HRP标记)：ZYMED Laboratories公司制)稀释10000倍并进行反应后，进行ECLplus(BD Bioscience公司制)检测。将得到的条带的强度用图像分析软件NIH-Image(NIH制)使其变为数值。将该数值作为膜联蛋白II蛋白质的量。
5.紫外线照射
在被验者的背部的直径约8mm的圆内照射1MED紫外线。紫外线照射装置使用solar light company制多太阳紫外线模拟器模型(Multiple SolarUltraviolet Simulator Model)601。紫外线强度使用solar light company制Erythema UV & UVAIntensity Meter Model 3D-600v2.0来设定。
6.皮肤亮度的测定
使用分光测色仪(CM-500、柯尼卡美能达公司制)测定紫外线照射部位及非照射部位的L*值。测定紫外线照射前、照射后第2、4、7、10、14天的紫外线照射部位及非照射部位的L*值，将同一天内测定的照射部位与非照射部位的L*之差作为测定日的L*变化量而用于解析。
7.皮肤黑色素量的测定
使用Courage+Khazaka制mexameterMX16测定作为黑色素量的指标的N值。N为波长568～660nm的光的反射率。
测定紫外线照射前、照射后第2、4、7、10、14天的紫外线照射部位及非照射部位的N值，将同一天内测定的照射部位与非照射部位的N值之差作为测定日的N值变化量而用于分析。
8.皮肤亮度的测定结果
紫外线照射后的L*值变化量如图1所示。
L*值的变化量(紫外线照射后的L*值-紫外线照射前的L*值)在紫外线照射第2天变为负值最大，其后在第14天基本恢复。紫外线照射第2天L*值最低，反映皮肤已经变黑。
分析第0天L*值与膜联蛋白II在角质层中表达量的相关关系，以及第2天、第4天、第7天、第10天、第14天的L*值的变化量与变换为自然对数的膜联蛋白II蛋白质的量的相关关系。回归直线图如图2～7所示，相关系数如表2所示。
变换为自然对数的膜联蛋白II蛋白质的量与第2、10、14天的L*值的变化量显示“较强的负相关”，第4、7天的L*值的变化量显示“强的负相关”。
由上述可知，皮肤角质层中的膜联蛋白II蛋白质的量越多，因暴露于紫外线而产生的L*值降低(皮肤变黑)的趋势越强。证明皮肤角质层中膜联蛋白II蛋白质的量成为因暴露于紫外线而引起的皮肤变黑趋势的指标。
表2
Figure BDA0000065951770000111
通常情况下，相关系数如下述方式评价。
0～0.2：几乎不相关，
0.2～0.4：略微相关，
0.4～0.7：较强正相关，
0.7～1：强正相关，
0～-0.2：几乎不相关，
-0.4～-0.2：略微相关，
-0.7～-0.4：较强负相关，
-1～-0.7：强负相关。
9.皮肤黑色素量的测定结果
紫外线照射后N值的变化量如图8所示。
N值变化量(紫外线照射后的N值-紫外线照射前的N值)，紫外线照射第4天后至第14天为止，与紫外线照射前(第0天)相比显示高值。紫外线照射第4天后至第14天为止，皮肤黑色素量增多，反映皮肤在变黑。
分析第0天的N值与膜联蛋白II在角质层中表达量的相关关系、以及将第0天的N值作为标准的第2天、第4天、第7天、第10天、第14天的N值变化量与变换为自然对数的膜联蛋白II蛋白质的量的相关关系。回归直线图如9～14所示，相关系数如表3所示。
第4天后，变换为自然对数的膜联蛋白II蛋白质的量与N值变化量显示强正相关。
因此，膜联蛋白II蛋白质的量的增加意味着因暴露于紫外线而产生的黑色素量在增加。即证明：膜联蛋白II增加时，因暴露于紫外线而产生的黑色素增加以及皮肤变黑程度增大。也就是说，这表明膜联蛋白II蛋白质的量可反映因暴露于紫外线所引起的皮肤变黑趋势，并且可成为黑色素增加的指标。
表3
Figure BDA0000065951770000121
以上，根据膜联蛋白II蛋白质的量与L*值的变化、以及膜联蛋白II蛋白质的量与N值的变化关系，证明皮肤角质层中膜联蛋白II蛋白质的量成为因暴露于紫外线而引起的皮肤变黑程度的指标。

Claims (3)

1.一种因紫外线引起的皮肤变黑趋势的评价方法，其特征在于，利用皮肤角质层中的膜联蛋白II蛋白质的量与紫外线照射后的黑色素量呈正相关性，测定皮肤角质层中的膜联蛋白Ⅱ蛋白质的量并评价皮肤因紫外线引起的皮肤变黑趋势，其中照射后第2天为较强正相关，较强正相关的相关系数为0.4～0.7，稍高于略微相关数值，略微相关数值的相关系数为0.2～0.4，照射后的第4天至第14天，变换为自然对数的膜联蛋白II蛋白质的量与黑色素量N值变化量显示强正相关，强正相关的相关系数为0.7～1。
2.一种筛选抑制皮肤变黑的成分的方法，其特征在于，利用皮肤角质层中的膜联蛋白Ⅱ蛋白质的量与紫外线照射后的黑色素量呈正相关性，辨别对皮肤角质层中的膜联蛋白Ⅱ蛋白质的量产生影响的成分并筛选抑制皮肤变黑的成分，其中照射后第2天为较强正相关，较强正相关的相关系数为0.4～0.7，稍高于略微相关数值，略微相关数值的相关系数为0.2～0.4，照射后的第4天至第14天，变换为自然对数的膜联蛋白II蛋白质的量与黑色素量N值变化量显示强正相关，强正相关的相关系数为0.7～1。
3.一种选择化妆品的方法，其特征在于，根据采用权利要求1中记载的皮肤变黑趋势的评价方法而得到的皮肤变黑趋势来选择化妆品。
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