WO2020195829A1 - 皮膚の状態を評価する方法 - Google Patents

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WO2020195829A1
WO2020195829A1 PCT/JP2020/010536 JP2020010536W WO2020195829A1 WO 2020195829 A1 WO2020195829 A1 WO 2020195829A1 JP 2020010536 W JP2020010536 W JP 2020010536W WO 2020195829 A1 WO2020195829 A1 WO 2020195829A1
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stratum corneum
texture
polyamine
skin
image
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奈帆子 大石
美奈子 高橋
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株式会社ファンケル
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    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
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    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing

Definitions

  • the present invention relates to a method for evaluating the condition of the skin using polyamines in the stratum corneum as an index.
  • Polyamines are substances with two or more amino groups that are synthesized from amino acids in the body. It is actively synthesized in the cells of all animals and humans during the growth phase (Non-Patent Document 1). Nucleic acid synthesis during cell proliferation In particular, it binds strongly to RNA, changes the RNA structure, and promotes protein synthesis at various stages during the growth phase (Non-Patent Document 2). In addition to that, it has various functions such as anti-inflammatory action (Non-Patent Document 3), antioxidant action (Non-Patent Document 4), saccharification suppression (Non-Patent Document 5), and life extension (Non-Patent Document 6). . From these facts, it is well known that polyamines are indispensable substances for cell life phenomena.
  • Non-Patent Document 7 The concentration of polyamines in the body decreases with aging.
  • Non-Patent Document 8 a series of synthetic enzymes are required for the synthesis of polyamines, and the enzyme activity of these enzymes decreases with aging. It is known (Non-Patent Document 8).
  • Non-Patent Document 9 The abundance of polyamines in each organ throughout the body is known. For example, in the skin, both the dermis and the epidermis are present. The abundance of polyamines (spermine, spermidine, putrescine) in the dermis and epidermis is also known (Non-Patent Document 9). However, there are no reports on the amount of polyamines in the stratum corneum. Moreover, there is no method for specifically detecting polyamines in the stratum corneum of the skin. There is also no report on the function of polyamines in the stratum corneum.
  • Non-Patent Document 10 Non-Patent Document 10 It is unclear whether this staining method is a viable staining technique for living cells and can be applied to staining tissues in which live cells and dead cells coexist, such as the stratum corneum of the skin.
  • the stratum corneum is located in the outermost layer of the four layers that make up the skin, and is also called the stratum corneum or the stratum corneum.
  • the structure of the skin is observed by collecting the stratum corneum, staining it, and observing the tissue.
  • the functions, functions, and effects of the constituents are also being clarified.
  • the stratum corneum is peeled off with an adhesive tape and collected, and the stratum corneum is collected as it is, or the collected stratum corneum is transferred to a slide glass to make the stratum corneum blue 1. No., Purple No. 401, Green No. 201, Yellow No. 4, Yellow No. 5, Yellow No. 407, Red No.
  • Patent Documents 1 and 2 A method of dyeing with a dye and observing is performed (Patent Documents 1 and 2).
  • a staining method for evaluating the skin condition from substances present in the stratum corneum a method for evaluating the skin condition using a fluorescently labeled antibody and using the abundance of AGEs (advanced glycation end products) as an index, and TARC (Thymus and activation).
  • AGEs abvanced glycation end products
  • TARC Thymus and activation
  • a method for evaluating the local pathological condition of atopic dermatitis using the expression level of -regulated chemokine) as an index is described (Patent Documents 3 to 4).
  • Patent Document 5 describes a method for detecting a stratum corneum protein carbonylated with a hydrazino group-containing fluorescent substance and inspecting for the presence or absence of a skin disease. By staining the skin stratum corneum in this way, an index for discriminating the condition of the skin has been developed.
  • the index "texture” or “texture” is used to indicate a skin condition in which the surface morphology of the skin is disturbed.
  • textures defined by skin grooves and hills are formed and are optically regular.
  • scales scaling
  • the disorder can be recognized by the naked eye.
  • it lacks smoothness to the touch and gives a dry feel.
  • scoring the degree of scaling and the degree of erythema due to the inflammatory reaction have been performed by those skilled in the art.
  • the surface morphology is photographed with a digital microscope, and only the scaling portion is extracted and evaluated by image analysis, or the degree of redness is quantified by skin color measurement.
  • changes in surface morphology due to rough skin can be measured by the replica method or the like.
  • the decrease in the amount of water in the stratum corneum and the decrease in the barrier function due to rough skin are evaluated by a non-invasive method using a device that measures without damaging the skin, such as measuring the amount of water in the stratum corneum and transepidermal water loss.
  • Patent Documents 6 to 12 proposes the current situation is that an evaluation method that matches the actual feeling has not yet been provided.
  • many years of experience were required for evaluation, and specialized training was required for mastery. There is a need for a method of objectively evaluating and measuring the state of this texture.
  • Japanese Unexamined Patent Publication No. 2006-53117 JP-A-2007-263655 Japanese Patent No. 5275898 Japanese Patent No. 5065237 JP-A-2009-36555 Japanese Unexamined Patent Publication No. 2005-95326 Japanese Unexamined Patent Publication No. 2006-180971 JP-A-2007-130101 International Publication No. 2009/142609 Japanese Unexamined Patent Publication No. 2010-273736 Japanese Unexamined Patent Publication No. 2010-22547 JP-A-2017-216941
  • the present inventors have focused on the amount of polyamines in the skin stratum corneum, found that the amount of polyamines in the stratum corneum can be an index of skin texture, and made the present invention. That is, the present invention is a method for evaluating the skin condition by measuring the amount of polyamine in the stratum corneum, and as one of them, a method for selectively staining polyamine to prepare a skin stratum corneum sample, and a prepared sample are used.
  • An object of the present invention is to provide a method for measuring the amount of polyamine in the stratum corneum used, and a method for evaluating the texture of the skin based on the measurement result of the amount of polyamine.
  • the main configuration of the present invention is as follows. (1) A method for evaluating a skin condition by measuring the amount of polyamine present in a stratum corneum sample. (2) A method for preparing a stratum corneum sample, which comprises a step of staining the polyamine present in the stratum corneum sample. (3) The stratum corneum sample according to (2), wherein the step of staining is a step of immersing the stratum corneum sample in a solution containing 5 (6) -carboxytetramethylrhodamine lycine propagyl ester. Preparation method. (4) The method for preparing a stratum corneum sample according to (2) or (3), wherein the stratum corneum sample is collected by a tape stripping method.
  • the evaluation of the skin condition is any one or more items selected from the roughness of the texture, the shape of the texture, the difficulty of the flow of the texture, and the texture score as the physical property values representing the skin surface morphology (5) or ( The method for evaluating the skin condition according to 6).
  • the present invention provides a method for detecting or selectively staining polyamines in the stratum corneum of the skin.
  • a method for preparing a stratum corneum sample in which polyamines can be selectively observed and a method for evaluating a skin condition using the prepared sample are provided.
  • the fluorescent dye is selectively bound to the polyamine in the stratum corneum, it is extremely easy to observe the polyamine. Therefore, it is possible to easily observe the state of polyamines in the stratum corneum.
  • the amount of polyamine can be easily measured by image analysis of the observed image, and the texture of the skin can be analyzed and evaluated as an objective numerical value based on this. Unlike the conventional method, this skin texture evaluation is highly convenient because it does not require specialized training of the inspector and the evaluation measurement can be performed in a short time.
  • the present application is an invention of a method for preparing a stratum corneum sample in which a stratum corneum sample collected from the skin is made observable with a polyamine staining reagent.
  • the polyamine staining reagent is a 5 (6) -Carboxytetrameryrhodamine-Glycine probel ester, in which the glycine propagyl ester reacts specifically with the polyamine and is labeled with 5 (6) carboxytetramethylrhodamine (TAMRA) to observe fluorescence.
  • TAMRA carboxytetramethylrhodamine
  • the dye to be labeled is not limited to 5 (6) carboxytetramethylrhodamine (TAMRA), and may be any fluorescent dye, luminescent dye, or colored dye.
  • the second invention of the present invention evaluates the state of the skin by quantifying the amount of polyamine in the stratum corneum by fluorescence brightness by using the observation image of this sample for image analysis.
  • the third invention of the present invention evaluates the texture of the skin using the obtained polyamine amount as an index based on the image analysis information of the observation image.
  • the “texture” in the present invention is a network structure consisting of a groove called a "skin groove” originally existing on the surface of human skin and a raised “skin hill” surrounded by the groove.
  • a skin groove originally existing on the surface of human skin
  • a raised “skin hill” surrounded by the groove.
  • the texture becomes rougher with aging, and the texture tends to flow and become irregular and unclear, but even young people may have unclear texture, so aging and roughness of the texture are not always the case. Does not have a direct effect. In this way, the shape of the texture varies greatly from person to person, and it can be said that it is the skin morphology that each person has.
  • Step 1 A stratum corneum sample is collected from the skin using a stratum corneum peeling means.
  • Step 2 The stratum corneum sample collected in step 1 is attached to a transparent plate with the peeling surface facing up.
  • Step 3 A solution containing 5 (6) -carboxytetramethylrhodamine glycine propagyl ester having a specific binding ability to polyamine is added dropwise, and then the solution is allowed to stand for a certain period of time.
  • Step 4 The stratum corneum sample obtained in step 3 is washed with water.
  • Step 5 The stratum corneum sample washed in step 4 is air-dried to prepare a fluorescence microscope observation sample (specimen).
  • Step 6 The fluorescence microscope observation sample obtained in step 5 is observed with a fluorescence microscope under observation conditions of excitation light 560 nm and fluorescence light 580 nm, and acquired as fluorescence image data.
  • Step 7) The fluorescence luminance of the fluorescence image acquired in Step 6 is displayed for each pixel in the order of 0 to 255 gray in the order of black to white, and is used as an index of polyamine in the test sample.
  • Step 8 is a step of determining the texture score by any of the following methods A or B. A.
  • a regression line is obtained from the index value of the polyamine of the stratum corneum sample collected from a large number of subjects, and the correlation formula based on the texture roughness, texture shape, texture flow difficulty, and texture score of the subject's skin, and this regression line is obtained.
  • the roughness of the skin of the subject, the shape of the texture, the difficulty of flowing the texture, and the texture score corresponding to the polyamine index obtained in step 6 are determined.
  • B. A regression line is obtained from the correlation equation based on the index value of the polyamine of the stratum corneum sample collected from a large number of subjects and the visual evaluation score, and the texture score of the subject corresponding to the polyamine index obtained in step 6 is determined from this regression line. ..
  • the stratum corneum peeling means in step 1 may be either a biopsy or a method using an adhesive tape. Considering the burden on the subject, the method using adhesive tape is preferable.
  • the method using adhesive tape is called a tape stripping method.
  • the tape stripping method is a method in which an adhesive tape is attached to the skin and then peeled off to collect the surface layer of the skin.
  • synthetic rubber such as natural rubber, polyisobutylene, polybutadiene, silicone rubber, polyisoprene, styrene-isoprene-styrene block copolymer, and synthetic resin such as polypropylene, polystyrene, and acrylic acid ester copolymer are used.
  • Adhesive tapes used in the tape stripping method are commercially available and may be used.
  • step 2 when the stratum corneum sample collected in step 1 is attached to the transparent plate with the peeling surface facing upward, it is preferable to use a transparent plate made of glass or acrylic suitable for microscopic observation.
  • a commercially available polyamine staining reagent for cells can be used.
  • 5 (6) -carboxytetramethylrhodamine lysine propagyl ester is converted to polyamine by binding to polyamine existing in tissues such as living cells by utilizing the property that glycine propagyl ester specifically binds to polyamine. It has red fluorescence.
  • "Polyamine RED" (Funakoshi Co., Ltd.) can be exemplified.
  • the washing in step 4 is performed to remove the 5 (6) -carboxytetramethylrhodamine glycine propagyl ester that has not reacted with the polyamine in the stratum corneum of the polyamine staining reagent used in step 3. Wash repeatedly with a sufficient amount of water at least 1 to 10 times (preferably 3 to 5 times).
  • the water used for cleaning include pure water, ion-exchanged water, distilled water, tap water and the like, but pure water is preferable.
  • step 5 after the completion of step 4, the water content of the sample is air-dried, and then the sample (specimen) for microscopic observation is used.
  • a water-soluble encapsulant (glycerin-based, chloral-based, gelatin-based, special encapsulant) used when storing the sample for a long period of time may be used as the encapsulating specimen.
  • step 6 the specimen used in step 5 is observed with a fluorescence microscope.
  • fluorescence data is acquired by observing with a fluorescence microscope under the conditions of excitation light of 560 nm and fluorescence light of 580 nm.
  • the amount of polyamine contained in the exfoliated and collected stratum corneum sample is confirmed as the fluorescence brightness.
  • the polyamine emits red fluorescence, and the fluorescence brightness is an index of the amount of polyamine. It has been confirmed that this specific fluorescence has a one-to-one correspondence with the amount of polyamine (see Non-Patent Document 10).
  • step 7 the observation image of the sample to be confirmed and evaluated by observing with the fluorescence microscope in step 6 is selected and imported into a computer as image data using a digital camera or the like. Then, the captured data of the acquired observation image is digitized by image processing.
  • the image processing can be used in any known image processing system. As such an image processing system, in the present invention, "ImageJ” can be used as an appropriate image processing system. "ImageJ” is open source and public domain image processing software. Those skilled in the art can easily obtain it.
  • the brightness of the fluorescence image derived from the presence of the polyamines is displayed in the order of 0 to 255 gray levels from black to white for each pixel.
  • the average brightness of the gray level in the portion (background) where the stratum corneum is not shown in each image is set to a, and the average brightness of the gray level in the layered portion (stacked portion) of the stratum corneum is set.
  • the gray level threshold value is set so that the value is b and the average luminance value of the gray level a or more and less than b becomes the polyamine output data of the stratum corneum.
  • the average luminance value per number of pixels of the image data thus output is used as an index of the amount of polyamine.
  • step 8 any of steps A and B can be adopted.
  • step 8A "texture roughness”, “texture shape”, “texture flow difficulty”, and “texture score” are measured as physical property values representing the skin surface morphology.
  • the texture evaluation system described in JP-A-2017-140206 can be mentioned.
  • step 8B visual texture evaluation is adopted as a physical property value representing the surface morphology of the conventional skin.
  • a method of calculating the texture parameter as a physical property value representing the skin surface morphology using the texture evaluation system will be described along the process. Further, a method of determining the visual texture evaluation value using a polyamine as an index will be described.
  • This image pickup apparatus includes a lens unit and an illumination unit. If shadows are generated in the captured image, the shadows will be darker than they actually are in a monochrome image, and the texture parameters calculated from the shade values will be incorrect. Therefore, arrange multiple illuminated parts so as to surround the lens part. Is preferable. For example, it is preferable to arrange a plurality of illuminated portions composed of a point light source such as an LED on the circumference centered on the lens portion in a rotation target (n ⁇ 3) n times.
  • a point light source such as an LED
  • the illumination unit can be arranged on two or more circumferences that are concentric circles, or the entire circumference can be the illumination unit.
  • an imaging device a digital microscope is desirable, and for example, i-SCOPE (manufactured by Moritex Corporation) can be mentioned.
  • the imaging location is preferably a smooth portion where there are no fine wrinkles, wrinkles, etc., and examples thereof include cheeks and forehead. Also, wipe off the shine (oil and fat) that makes the reflected light stronger, and in the case of women, remove makeup etc. before taking an image.
  • the captured image is taken into a computer as image data, and the enlarged image is converted into a monochrome image.
  • the monochrome image means a multi-gradation single-color image.
  • the color tone of the monochrome image is not particularly limited, and for example, any one of a red component (R), a green component (G), and a blue component (B) can be used. It is preferable to use the green component (G) because the shade of the image can be determined most clearly. Further, before or after converting to a monochrome image, smoothing processing for noise reduction, waviness removal processing for correcting illumination unevenness, and the like can be performed.
  • step 8A Calculation and evaluation of texture parameters by step 8A From the numerical values Z (x, y) representing the shading in each pixel (x, y) of this monochrome image, as the texture parameters having a correlation with the texture state, Sa', PSm' , Str'is calculated.
  • Sa' The average value of the absolute values of Z (x, y) of the entire screen was calculated and used as Sa'.
  • PSm' After removing noise based on the information, 1/10 of the maximum value is set as a positive threshold value, 1/10 of the minimum value is set as a negative threshold value, and 8 vertical lines are displayed on the screen. Six horizontal sampling lines were taken at equal intervals and scanned on the sampling lines to determine the distance from the point below the negative threshold to the next point below the negative threshold.
  • Str' A region of 120 x 120 pixels in the center of the image is cut out, and the semi-major axis radius and semi-minor axis radius are set with a threshold value of 0.3 times the maximum value of the autocorrelation coefficient (ACF) calculated from this region. This ratio (semi-major axis / semi-minor axis radius) was set to Str'.
  • the "texture roughness” corresponds to the arithmetic mean height (ISO 25178), which is a surface roughness parameter, and is a numerical value as the calculated Sa'(pseudo-arithmetic mean height related to skin unevenness). The larger the value, the coarser the texture.
  • the "texture shape” corresponds to the average length of the contour curve element of the surface roughness parameter (JIS B0601-2001), and the numerical value is small as the calculated PSm'(average length of the pseudo contour curve element). It means that the texture is finer.
  • “Difficulty in flowing texture” corresponds to the aspect ratio of the surface texture of the surface roughness parameter (ISO 25178), and as the calculated Str'(aspect ratio of the pseudo-surface texture), the smaller the value, the more the texture flows. Means the state of being.
  • “texture score” is a visual score actual measurement value (10 steps from 1 to 10 are quantified) in which a professional judge comprehensively quantifies the fineness, regularity, and isotropic of the enlarged image of the skin. Is a visual score theoretical value obtained from a multiple regression equation obtained by using the above-mentioned calculated Sa', PSm', and Str' as an explanatory variable, and calculated by applying to the following equation.
  • Texture score A x Sa'+ B x PSm'+ C x Str'+ D (where A, B, C are coefficients and D is a constant)
  • the fluorescence brightness information and the quadratic regression equation of the stratum corneum polyamine obtained in the above steps 1 to 6 are obtained, and the obtained regression equation and the fluorescence brightness information data of the stratum corneum polyamine of the subject to be measured are used to obtain the fluorescence intensity information of the skin.
  • Step 8B Visual Evaluation of Step 8B
  • visual texture evaluation is adopted as a physical property value representing the conventional surface morphology of the skin. This is evaluated by regression analysis in correlation with the fluorescence brightness information data of the subject's stratum corneum polyamine.
  • the polyamine in the stratum corneum can be selectively stained in a short time to prepare a skin stratum corneum sample, the amount of polyamine in the skin stratum corneum using the prepared sample is measured, and further.
  • the texture of the skin can be evaluated based on the measurement result of the amount of polyamine.
  • a chemical analysis method such as a high performance liquid chromatograph method, a biochemical analysis method such as an immunohistochemical staining method, and a method of fluorescently labeling a polyamine residue by utilizing chemical characteristics
  • a chemical analysis method such as a high performance liquid chromatograph method
  • a biochemical analysis method such as an immunohistochemical staining method
  • a method of fluorescently labeling a polyamine residue by utilizing chemical characteristics can be exemplified. You may.
  • the exfoliated stratum corneum sample is homogenized, and the polyamine extracted by water is used as the sample.
  • the extraction method include a method of obtaining a soluble fraction via a freeze-thaw method, an ultrasonic fracturing method, a homogenate method and the like.
  • the exfoliated stratum corneum is used as a sample.
  • ⁇ Test 1> In this test, an example in which polyamines in the stratum corneum are directly observed by a method of detecting the amount of polyamines in the stratum corneum by staining is shown.
  • 1. Preparation of sample for fluorescence microscope observation A 2.5 cm ⁇ 2.5 cm horny checker (Asahi Biomed Co., Ltd.) was used as an adhesive tape for exfoliating the stratum corneum of the skin. The stratum corneum was collected from the cheeks of 19 female subjects aged 46 to 55 years by the tape stripping method using the above-mentioned keratin checker.
  • the collected stratum corneum was placed on a transparent slide glass, and Polyamine RED (Funakoshi Co., Ltd.) was dissolved in 500 ⁇ l dimethyl sulfoxide (DMSO) to prepare 1640 ⁇ M. This diluted solution was dispensed in small portions and stored at ⁇ 20 ° C. Immediately before use, this cryopreservation reagent was further diluted 1000-fold with distilled water (1.64 ⁇ M) and used for staining. 50 ml of the 1.64 ⁇ M Polyamine RED staining solution was added dropwise to the stratum corneum sampling surface of the stratum corneum checker, reacted for 30 seconds, and then thoroughly washed with purified water. After air-drying, it was used as an observation sample.
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • ⁇ Test 2 Skin texture evaluation using skin stratum corneum polyamine as an index
  • the texture of 19 subjects in Test 1 was evaluated using a microscope with reference to the texture evaluation system described in JP-A-2017-140206 for the texture condition in the vicinity of the stratum corneum sampling site.
  • (1) Evaluation method A magnified image was imaged using a microscope (manufactured by Moritex Corporation) and imaging software (eyescope viewer Ver3.0). The obtained image was taken into a computer as image data, and only the green component was extracted and converted into a 256-tone monochrome image. Fitting was performed by a cubic function, and a waviness removing process (the Z coordinate of the waviness surface was set to 0) was performed.
  • Texture score -38.649 x Sa'-0.287 x PSm' + 2.884 x Str' + 19.460
  • Roughness of texture Using the calculated Sa'(pseudo-arithmetic mean height related to unevenness of the skin) as a measured value, the larger the value, the rougher the texture.
  • Texture shape Using the calculated PSm'(average length of pseudo contour curve elements) as a measured value, the smaller the value, the finer the texture.
  • Difficulty in flowing texture Using the calculated Str'(aspect ratio of pseudo-surface texture) as a measured value, the smaller the value, the more the texture is flowing. 4) Texture score: It is a theoretical value of the visual score of the texture, and the result calculated by applying it to the multiple regression equation is used as a measured value. The larger the numerical value, the higher the visual score and the better the texture.
  • FIGS. 3 to 6 scatter plots and regression lines of the two-dimensional arrangement of each evaluation item and the luminance data are shown in FIGS. 3 to 6. From the correlation coefficient R of each item and FIGS. 3 to 6, the roughness of the texture and the fluorescence brightness are inversely correlated, the shape of the texture and the fluorescence brightness are inversely correlated, the difficulty of flowing the texture and the fluorescence brightness are positively correlated, and the texture score and the fluorescence. Luminance was found to be a positive correlation.
  • ⁇ Test 3 (Correlation test between skin stratum corneum polyamine (polyamine average brightness value) and visual texture evaluation (texture visual score))>
  • Test method From the left and right cheeks of men aged 26 to 49, the stratum corneum using the stratum corneum checker (Asahi Biomed) was used, and from the same site, SKIN CAST (RSI) was used. Fifteen replicas were collected for each.
  • RSI stratum corneum checker
  • 1.64 ⁇ M Polyamine RED (Funakoshi Co., Ltd.) prepared by DMSO was added dropwise to the stratum corneum sampling surface of 0.5 stratum corneum checker, reacted for 30 seconds, and then washed in distilled water.
  • FIG. 7 shows a correspondence between the visual score and the replica image. Then, the average brightness value of the polyamine stain obtained at the same site and the visual score correlation of the texture were evaluated and calculated.
  • Results Table 3 shows the brightness value / image (average brightness value) and the visual score of the texture.
  • ⁇ Test 4 Measurement of polyamine amount in the stratum corneum by chemical analysis
  • Test method One sheet each from the left and right cheeks of 20 men and women aged 6 to 49 years, and the stratum corneum was collected by a stratum corneum checker (Asahi Biomed Co., Ltd.). One of the collected square layer tapes was divided into four equal parts, 1.75 sheets were used for extraction, and 0.25 sheets were used for quantification by staining.
  • a part was separated from the above-mentioned stratum corneum extract, and the total amount of protein in the stratum corneum was measured using a Pierce BCA protein assay kit (Thermo SCIENTIFIC).
  • a calibration curve was prepared using purified bovine serum albumin as a standard product, and the amount of protein was calculated from the absorbance. The value obtained by dividing the total value of each polyamine (putrescine, spermidine, spermine) by LC-MS by the total protein amount was defined as the total polyamine amount.
  • Results Table 4 shows the average luminance values and the results of chemical analysis of the stratum corneum of 20 people by polyamine staining.
  • FIG. 9 A scatter plot obtained based on Table 4 is shown in FIG.
  • the correlation was confirmed, a correlation was found between the luminance value and the total amount of polyamines (Fig. 9). From this result, it was clarified that the brightness value of the stratum corneum polyamine staining can be replaced with the chemical analysis value of polyamine. That is, it is possible to evaluate the texture of the skin by chemically analyzing the polyamines in the stratum corneum.

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Abstract

角層試料中のポリアミンを選択的に染色する方法、及びポリアミン量を指標として皮膚のキメを評価する方法を提供することを課題とする。解決手段として、角層試料中に存在するポリアミンに、選択的に５（６）－カルボキシテトラメチルローダミングリシンプロパギルエステル（Ｃａｒｂｏｘｙｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｒｈｏｄａｍｉｎｅ　Ｇｌｙｃｉｎｅ　Ｐｒｏｐａｇｙｌ　ｅｓｔｅｒ）で蛍光標識する工程を含むことを特徴とする蛍光顕微鏡観察用角層試料の調製方法を提供する。

Description

皮膚の状態を評価する方法
　本発明は、皮膚角層中のポリアミンを指標として皮膚の状態を評価する方法に関する。
　ポリアミンは体内でアミノ酸から合成される２つ以上のアミノ基を持つ物質である。全ての動物やヒトの細胞内で成長期に盛んに合成されている（非特許文献１）。細胞増殖時の核酸合成特にＲＮＡと強く結合し、ＲＮＡ構造を変化させ、成長期の多岐にわたる段階でタンパク質合成促進を行っている（非特許文献２）。
　それ以外にも抗炎症作用（非特許文献３）、抗酸化作用（非特許文献４）、糖化抑制（非特許文献５）、寿命延長（非特許文献６）など様々な機能を有している。これらのことから、ポリアミンが細胞の生命現象に欠くべからざる物質であることが周知である。
　加齢によって体内のポリアミン濃度が低下すること（非特許文献７）また、ポリアミンの合成には、一連の合成系酵素が必要であるが、この酵素は、加齢に伴って酵素活性が低下することが知られている（非特許文献８）。
　全身各臓器におけるポリアミンの存在量は既知である。例えば皮膚においては、真皮、表皮共に存在する。真皮、表皮のポリアミン（スペルミン、スペルミジン、プトレスシン）存在量も知られている(非特許文献９)。しかし、皮膚角層におけるポリアミンの量についての報告はない。
　また、皮膚角層におけるポリアミンを特異的に検出する方法は、見当たらない。また皮膚角層におけるポリアミンの機能についても報告がない。
　一方、近年癌の研究に伴って、細胞のポリアミンの研究が進んでおり、細胞の生存に悪影響を及ぼさない生体のポリアミン染色方法が提案されている（非特許文献１０）。この染色方法は、生細胞の生染色技術であって、皮膚角層のように生細胞と死細胞が混在する組織の染色に適用可能か不明である。
　角層は、皮膚を構成する４層のうち、最外層に位置し、角質、角質層ともいう組織であるが、この角層を採取して染色を行なって、組織観察することで皮膚の構造や機能、構成成分の作用効果なども判明しつつある。例えば、角層の形状を評価するには、粘着性のテープで角層を剥離させて採取し、この角層をそのまま、もしくは採取した角層をスライドガラスに転写して、角層を青色１号、紫色４０１号、緑色２０１号、黄色４号、黄色５号、黄色４０７号、赤色１０２号、橙色２０５号、ブリリアントグリーン、ヘマトキシリンなどの色素と有機酸とアルコールを用いた試薬や、コンゴレッド色素で染色し、観察する方法が行われている（特許文献１～２）。
　また、角層中に存在する物質から肌状態を評価する染色方法として、蛍光標識抗体を用いてＡＧＥｓ（ａｄｖａｎｃｅｄ　ｇｌｙｃａｔｉｏｎ　ｅｎｄ　ｐｒｏｄｕｃｔｓ）の存在量を指標として皮膚状態を評価する方法やＴＡＲＣ（Ｔｈｙｍｕｓ　ａｎｄ　ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ－ｒｅｇｕｌａｔｅｄ　ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ）の発現量を指標としてアトピー性皮膚炎の局所病態を評価する方法が記載されている（特許文献３～４）。
　特許文献５には、ヒドラジノ基含有蛍光物質によりカルボニル化した角層タンパク質を検出し、皮膚疾患の有無を検査する方法が記載されている。
　このように皮膚角層を染色することで、皮膚の状態を判別する指標が開発されている。
　皮膚において、「肌理」または「キメ」という指標は、皮膚の表面形態が乱れている肌状態をあらわす場合に使用されている。健康な皮膚の表面では、皮溝、皮丘によって規定されるキメ（肌理）が形成され、光学的にも規則的である。しかし、肌荒れした皮膚の表面では、キメが乱れて、さらには鱗屑（スケーリング）が発生し光学的に不規則になり、肉眼でもその乱れを認知できるようになる。また、肌触りもスムースさに欠け、かさついた感触になる。
　肉眼的にはスケーリングの程度、炎症反応による紅斑の程度をスコア化することが、当業者間では行なわれている。また表面形態をデジタルマイクロスコープで撮影して、画像解析によりスケーリング部分のみ抽出して評価をする、あるいは皮膚の測色により赤みの程度を定量化することが行なわれている。また、肌荒れに伴う表面形態の変化は、レプリカ法などによって計測することも可能である。さらに、肌荒れに伴う角層水分量の低下やバリア機能の低下は、角層コンダクタンスや経表皮水分蒸散量の測定など、皮膚を傷つけないで測定する機器を用いた非侵襲的な方法により評価する様々な方法が提案されている（特許文献６～１２）。しかし必ずしも実感に即した評価方法が未だ提供されていないのが現状である。また評価にあたっても長年の経験が必要であり、習熟に専門的な訓練が必要であった。このキメの状態を客観的に評価測定する方法が求められている。
特開２００６－５３１１７号公報 特開２００７－２６３６５５号公報 特許第５２７５８９８号公報 特許第５０６５２３７号公報 特開２００９－３６５５５号公報 特開２００５－９５３２６号公報 特開２００６－１８０９７１号公報 特開２００７－１３０１０１号公報 国際公開第２００９／１４２０６９号 特開２０１０－２７３７３６号公報 特開２０１０－２２５４７号公報 特開２０１７－２１６９４１号公報
Cell Tissue Kinet.1983.16,493-504 Biochem Biophys Res. Commun 2000 May 19;271(3):559-64. Igarashi et al. J Exp Med. 1997 May 19;185(10):1759-68.Zhang M et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA Vol. 95, pp. 11140-11145, September 1998 Life Sci. 2003 Apr 25;72(23):2603-16. Gugliucci et al. Aging,August,2011 Vol.3,No.8,Nadege Minois et al. Exp Gerontol. 1982;17(2):95-103. Ratna Das et al. Exp Gerontol. 1993 Nov-Dec;28(6):565-72. Kiego Yoshinaga et al. Arch Dermatol Res. 1983;275(4):218-21. P. EI Baze et al. Chemical Communications, 2017,53, 8403-8406， Katunori　Tanaka et al
　本発明者らは、皮膚角層におけるポリアミンの量に着目し、角層のポリアミン量が皮膚のキメの指標となりうることを見出し、本発明をなした。
　すなわち、本発明は角層中のポリアミン量を測定して皮膚状態を評価する方法であり、　その１つとしてポリアミンを選択的に染色し、皮膚角層試料を調製する方法、及び調製した試料を用いた皮膚角層のポリアミン量を測定する方法、さらにはポリアミン量の測定結果に基づく皮膚のキメを評価する方法を提供することを課題とする。
　本発明の主な構成は、次のとおりである。
　（１）角層試料中に存在するポリアミン量を測定して、皮膚状態を評価する方法。
　（２）角層試料中に存在するポリアミンを、染色する工程を含むことを特徴とする角層試料の調製方法。
　（３）染色する工程が、５（６）－カルボキシテトラメチルローダミングリシンプロパギルエステル（Ｃａｒｂｏｘｙｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｒｈｏｄａｍｉｎｅ　Ｇｌｙｃｉｎｅ　ｐｒｏｐａｇｙｌ　ｅｓｔｅｒ）を含む溶液に、角層試料を浸漬する工程である（２）に記載の角層試料の調製方法。
　（４）角層試料がテープストリッピング法によって採取されたものである（２）又は（３）に記載の角層試料の調製方法。
　（５）５（６）－カルボキシテトラメチルローダミングリシンプロパギルエステルで蛍光標識された角層試料を、蛍光顕微鏡観察することによって選択的に蛍光標識された皮膚角層のポリアミンの蛍光量を測定して皮膚状態を評価する方法。
　（６）ポリアミン量の測定が、画像解析の手法による蛍光輝度の測定である（５）に記載の皮膚状態を評価する方法。
　（７）皮膚状態の評価が、皮膚表面形態を表す物性値としてキメの粗さ・キメの形状・キメの流れにくさ・キメスコアから選択されるいずれか１以上の項目である（５）または（６）に記載の皮膚状態を評価する方法。
　（８）皮膚状態の評価が、目視によるキメスコアである（５）または（６）に記載の皮膚状態を評価する方法。
　（９）角層試料の水抽出物から化学的分析方法により検出したポリアミン量を指標として皮膚状態を評価する方法。
　（１０）角層試料がテープストリッピング法によって採取されたものである（１）又は（５）～（９）のいずれかに記載の皮膚状態を評価する方法。
　本発明により、皮膚角層のポリアミンを検出又は選択的に染色する方法が提供される。またポリアミンを選択的に観察可能な、角層試料の調製方法及び調製した試料を用いた皮膚状態を評価する方法が提供される。本発明の方法は、角層中のポリアミンに選択的に蛍光色素が結合しているので、ポリアミンの観察が極めて容易である。したがって、角層中におけるポリアミンの状態を容易に観察することが可能である。また観察画像を画像解析することでポリアミン量を容易に計測でき、これを基準として皮膚のキメを客観的な数値として解析評価することができる。この皮膚のキメ評価は、従来の方法と異なり、検査担当者の専門的な訓練の必要がなく、短時間で評価測定が可能となるため利便性が高い。
被験者１９名の角層試料のポリアミン染色画像の蛍光顕微鏡撮影画像である。画像は、画像の目視観察結果に基づき３段階の評価によって分類している。 被験者の１９名の角層試料のポリアミン染色画像の蛍光輝度の散布図である。Ｘ軸は画像の目視評価評点、Ｙ軸は画像の平均輝度値／画像である。 被験者の１９名の角層試料のポリアミン染色画像の蛍光輝度とマイクロスコープによるキメの粗さデータの散布図及び、相関を評価した回帰直線を示す図である。 被験者の１９名の角層試料のポリアミン染色画像の蛍光輝度とマイクロスコープによるキメの形状データの散布図及び、相関を評価した回帰直線を示す図である。 被験者の１９名の角層試料のポリアミン染色画像の蛍光輝度とマイクロスコープによるキメの流れにくさデータの散布図及び、相関を評価した回帰直線を示す図である。 被験者の１９名の角層試料のポリアミン染色画像の蛍光輝度とマイクロスコープによるキメスコアデータの散布図及び、相関を評価した回帰直線を示す図である。 ヒト皮膚のレプリカ画像とその画像に対応するキメスコアを示す画像である。 被験者１５名の角層試料のポリアミン染色画像の平均輝度値とキメ目視スコアの散布図及び相関を評価した回帰直線を示す図である。 被験者２０名の角層試料のポリアミン染色画像の平均輝度値とポリアミンの化学分析値の散布図及び相関を評価した回帰直線を示す図である。
　本願は、皮膚より採取した角層試料を、ポリアミン染色試薬により観察可能な状態とした角層試料を調製する方法の発明である。ポリアミン染色試薬とは、５（６）－Ｃａｒｂｏｘｙｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｒｈｏｄａｍｉｎｅ－Ｇｌｙｃｉｎｅ　ｐｒｏｐａｇｙｌ　ｅｓｔｅｒで、グリシンプロパギルエステルがポリアミンと特異的に反応し、５（６）カルボキシテトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）を標識することにより、蛍光観察可能な状態とする。標識する色素は、５（６）カルボキシテトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）に限らず、蛍光色素、発光色素、着色色素のいずれでも良い。例えば、メロシアニン（Ｍｅｒｏｃｙａｎｉｎｅ）、ペリレン（ｐｅｒｙｌｅｎｅ）、アクリジン（ａｃｒｉｄｉｎｅ）、ルシフェリン（ｌｕｃｉｆｅｒｉｎ）、ローダミン（Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ）、クマリン（ｃｏｕｍａｒｉｎ）、フルオロセイン（ｆｌｕｏｒｓｃｅｉｎ）、ウンベリフェロン（ｕｍｂｅｌｌｉｆｅｒｏｎｅ）などの色素があげられる。さらに、この試料の観察画像を画像解析にすることで皮膚角層のポリアミン量を蛍光輝度によって数値化して、皮膚の状態を評価することが、本発明の第２の発明である。さらにまた本発明の第３の発明は、観察画像の画像解析情報により、得られるポリアミン量を指標として皮膚のキメを評価するものである。以下に、更に詳細に説明を加える。
　なお、本発明でいう「キメ」とは、ヒトの肌表面に本来存在する「皮溝」と呼ばれる溝と、その溝に囲まれ隆起した「皮丘」とからなる網目構造である。美しく、健康的な肌に見せるためには、キメを細かく目立たなくすることが重要なポイントである。キメは、加齢に伴って粗くなり、キメが流れて不規則、不明瞭となっていく傾向はあるものの、若年者でもキメが不明瞭な場合があることから、必ずしも老化とキメの粗さが直接影響するわけではない。このようにキメの形状は個人差が大きく、各人の持って生まれた皮膚形態であるといえる。
  前記皮膚角層試料の採取、角層試料の処理及び角層試料の調製、画像解析データ取得と、皮膚状態の評価は、以下のように行うことが好ましい。
（工程１）角層剥離手段を用いて、皮膚より角層試料を採取する。
（工程２）工程１で採取した角層試料を、剥離面を上方にして透明板に貼り付ける。
（工程３）ポリアミンに対して特異的な結合能を有する５（６）－カルボキシテトラメチルローダミングリシンプロパギルエステルを含む溶液を滴下した後、一定時間静置する。
（工程４）工程３で得られた角層試料を水によって洗浄する。
（工程５）工程４で洗浄した角層試料を風乾して蛍光顕微鏡観察試料（標本）とする。
（工程６）工程５で得られた蛍光顕微鏡観察試料を、励起光５６０ｎｍ、蛍光光５８０ｎｍの観察条件で蛍光顕微鏡観察して蛍光画像データとして取得する。
（工程７）工程６で取得した蛍光画像の蛍光輝度をピクセルごとに黒から白の順序の０～２５５グレーレベルで表示し試験試料のポリアミンの指標とする。
（工程８）工程８は、次のＡ又はＢいずれかの方法によってキメスコアを決定する工程である。
Ａ．多数の被験者から採取した角層試料の前記ポリアミンの指標値と、被験者の皮膚のキメの粗さ、キメの形状、キメの流れにくさ、キメスコアに基づく相関式から回帰直線をもとめ、この回帰直線から工程６で得られたポリアミン指標に対応する被験者の皮膚のキメの粗さ、キメの形状、キメの流れにくさ、キメスコアを決定する。
Ｂ．多数の被験者から採取した角層試料の前記ポリアミンの指標値と目視評価スコアに基づく相関式から回帰直線をもとめ、この回帰直線から工程６で得られたポリアミン指標に対応する被験者のキメスコアを決定する。
　工程１の角層剥離手段は、バイオプシーや粘着テープを用いる方法のいずれであっても良い。被験者の負担を考慮すると粘着テープを用いる方法が好ましい。粘着テープを用いる方法は、テープストリッピング法と呼ばれる。
　テープストリッピング法は、粘着性テープを皮膚に貼り付けた後、剥がして皮膚の表層を採取する方法である。
　粘着剤としては、天然ゴム、ポリイソブチレン、ポリブタジエン、シリコーンゴム、ポリイソプレン、スチレン－イソプレン－スチレンブロック共重合体等の合成ゴム、ポリプロピレン、ポリスチレン、アクリル酸エステル共重合体等の合成樹脂等が用いられている。テープストリッピング法に用いる粘着テープは市販されており、これを使用しても良い。
　工程２において、工程１で採取した角層試料を、剥離面を上方にして透明板に貼り付ける場合の透明板は、顕微鏡観察に適したガラス製あるいはアクリル製のものを用いることが好ましい。
  工程３で用いる５（６）－カルボキシテトラメチルローダミングリシンプロパギルエステルを含む溶液は、市販されている細胞用のポリアミン染色試薬を用いることができる。５（６）－カルボキシテトラメチルローダミングリシンプロパギルエステルはグリシンプロパギルエステルが特異的にポリアミンに結合する特性を利用して、生細胞などの組織内に存在するポリアミンに結合することで、ポリアミンに赤色蛍光を付するものである。このような染色試薬としては、「ＰｏｌｙａｍｉｎｅＲＥＤ」（フナコシ株式会社）を例示することができる。
　工程４における洗浄は、工程３で用いたポリアミン染色用試薬の、角層中のポリアミンと未反応の５（６）－カルボキシテトラメチルローダミングリシンプロパギルエステルを除去するために行なうものである。充分量の水を用いて少なくとも１～１０回程度（好ましくは３～５回）繰り返し洗浄する。洗浄に用いる水は、純水、イオン交換水、蒸留水、水道水等があげられるが、純水が好ましい。
　工程５においては、前記工程４終了後、試料の水分を風乾させた後、顕微鏡観察用の試料（標本）とする。なお、長期間試料を保存する場合に用いる水溶性の封入剤（グリセリン系、クロラール系、ゼラチン系、特殊封入剤）によって封入標本としても良い。
　工程６においては、前記工程５で用いた標本を蛍光顕微鏡により観察する。このとき、励起光５６０ｎｍ、蛍光光５８０ｎｍの条件で蛍光顕微鏡観察して蛍光データを取得する。蛍光データの取得は、あるいは標本をビデオスコープ等でモニターに写し出し、剥離採取した角層試料に含まれているポリアミンの量を蛍光輝度として確認する。このとき、ポリアミンは、赤色の蛍光を発し、蛍光輝度がすなわちポリアミン量の指標となる。この特異的な蛍光は、ポリアミン量と１対１の対応があることが確認されている（非特許文献１０参照）。
　工程７において、上記工程６における蛍光顕微鏡に観察によって、確認評価したい標本の観察画像を選択して、デジタルカメラ等を用いて画像データとしてコンピュータに取り込む。そして取得した観察画像の取り込みデータを、画像処理によって数値化したデータを取得する。画像処理は、公知の画像処理システムであればどのようなシステムであっても使用可能である。このような画像処理システムとしては、本発明にあっては、「ＩｍａｇｅＪ」が適切な画像処理システムとして使用可能である。「ＩｍａｇｅＪ」は、オープンソースでパブリックドメインの画像処理ソフトウェアである。当業者であれば、容易に入手可能である。
　前記ポリアミン類の存在に由来する、蛍光画像の輝度をピクセル（画素）ごとに黒から白の順序の０～２５５グレーレベルで表示する。なお、グレーレベルの閾値の設定は、各画像の角層が写っていない部分（バックグラウンド）のグレーレベルの平均輝度をａとし、角層の重層部分（積層した部分）のグレーレベルの平均輝度値をｂとし、グレーレベルａ以上、ｂ未満の平均輝度値を、角層のポリアミン出力データとなるように、グレーレベル閾値を設定する。
　かくして出力された画像データの画素数あたりの平均輝度値をポリアミン量の指標とする。
　工程８においてはＡ、Ｂいずれかの工程を採用できる。
　工程８のＡでは、皮膚表面形態を表す物性値として「キメの粗さ」、「キメの形状」、「キメの流れにくさ」、「キメスコア」について測定するものである。例えば、特開２０１７－１４０２０６号公報に記載の、肌理評価システムがあげられる。
　工程８のＢでは、従来の皮膚の表面形態を表す物性値として、目視によるキメ評価を採用するものである。
　以下、肌理評価システムを用いた皮膚表面形態を表す物性値として、肌理パラメータを算出する方法を工程に沿って説明する。また目視によるキメ評価値を、ポリアミンを指標として決定する方法について説明する。
（１）複数者の肌拡大画像撮影
　まず、複数者の肌の拡大画像を撮像する。この撮像装置は、レンズ部と照光部とを備える。撮像した画像に影が生じると、モノクロ画像とした時に影部分が実際よりも濃くなり、濃淡値から算出する肌理パラメータに狂いが生じるため、レンズ部を取り囲むように複数の照光部を配置することが好ましい。例えば、ＬＥＤ等の点光源からなる複数の照光部を、レンズ部を中心とする円周上にｎ回回転対象（ｎ≧３）に配置することが好ましい。また、照光部は、同心円である２個以上の円周上に配置することもでき、全円周上を照光部とすることもできる。このような撮像装置としては、デジタル式のマイクロスコープが望ましく、例えば、ｉ－ＳＣＯＰＥ（株式会社モリテックス製）をあげることができる。
　撮像箇所は、小じわ、しわ等が存在しない滑らかな部分が好ましく、例えば頬、額などがあげられる。また、反射光が強くなるテカリ（油脂）を拭き取り、女性の場合はメイク等を落としてから撮像する。
（２）モノクロ画像変換
　撮像した画像は、画像データとしてコンピュータに取りこみ、拡大画像をモノクロ画像に変換する。ここで、モノクロ画像とは、多階調単色画像を意味する。モノクロ画像の色調は特に制限されず、例えば、赤成分（Ｒ）、緑成分（Ｇ）、青成分（Ｂ）のいずれかを用いることができる。画像の濃淡が最も明確に判断できるため、緑成分（Ｇ）を用いることが好ましい。また、モノクロ画像に変換する前、または後に、ノイズ低減のためのスムージング処理、照明ムラを補正するうねり取り処理等を行うことができる。
（３）工程８Ａによる肌理パラメータ算出と評価
　このモノクロ画像の各画素（ｘ、ｙ）における濃淡を表す数値Ｚ（ｘ、ｙ）から肌理の状態と相関を有する肌理パラメータとして、Ｓａ’、ＰＳｍ’、Ｓｔｒ’を算出する。
　Ｓａ’：画面全体のＺ（ｘ、ｙ）の絶対値の平均値を計算して、Ｓａ’とした。
　ＰＳｍ’：情報によりノイズ除去を行った後、最大値の１／１０の値を正のしきい値、最小値の１／１０の値を負のしきい値とし、画面内に縦８本、横６本のサンプリングラインを等間隔にとり、サンプリングライン上でスキャンして、負のしきい値以下になる点から次に負のしきい値以下になる点までの距離を求めた。縦ごと、横ごとにこの値を平均し、最後に縦と横の値の平均をＰＳｍ’とした。
　Ｓｔｒ’：画像中心部の１２０×１２０画素の領域を切り出し、この領域から計算した自己相関係数（ＡＣＦ）の最大値の０．３倍をしきい値として、長軸半径と短軸半径を求め、この比（長軸半径／短軸半径）をＳｔｒ’とした。
　本発明における、「キメの粗さ」とは、表面粗さパラメータである算術平均高さ（ＩＳＯ　２５１７８）に相当し、前記算出したＳａ’（肌の凹凸に関する疑似算術平均高さ）として、数値が大きいほどキメが粗い状態を意味する。また、「キメの形状」とは表面粗さパラメータの輪郭曲線要素の平均長さ（ＪＩＳ　Ｂ０６０１－２００１）に相当し、前記算出したＰＳｍ’（疑似輪郭曲線要素の平均長さ）として数値が小さいほどキメが細かい状態を意味する。「キメの流れにくさ」とは表面粗さパラメータの表面性状のアスペクト比（ＩＳＯ　２５１７８）に相当し、前記算出したＳｔｒ’（疑似表面性状のアスペクト比）として、数値が小さいほどキメが流れている状態を意味する。なお、「キメスコア」とは、肌の拡大画像の肌理の細かさ、規則正しさ、等方性を専門判定者が総合的に数値化した目視スコア実測値（１～１０の１０段階を数値化）を目的変数、前記算出したＳａ’、ＰＳｍ’、Ｓｔｒ’を説明変数として得られた重回帰式から求められる目視スコア理論値であり、下記式にあてはめ算出した。キメスコアは、数値が大きいほど目視スコアの数字が高く、キメがよいことを意味する。
　キメスコア＝Ａ×Ｓａ’＋Ｂ×ＰＳｍ’＋Ｃ×Ｓｔｒ’＋Ｄ（ただし、Ａ、Ｂ、Ｃは係数、Ｄは定数である。） 
　前記工程１～６で得られた角層ポリアミンの蛍光輝度情報と二次回帰式を求めておき、得られた回帰式と測定しようとする被験者の角層ポリアミンの蛍光輝度情報データによって、皮膚の「キメの粗さ」、「キメの形状」、「キメの流れにくさ」、「キメスコア」の評価を行なう。
（４）工程８Ｂの目視評価
　工程８のＢでは、従来の皮膚の表面形態を表す物性値として、目視によるキメ評価を採用する。これを、被験者の角層ポリアミンの蛍光輝度情報データと相関を回帰分析によって評価する。
　以上の工程を経ることで、短時間で、角層中のポリアミンを選択的に染色し、皮膚角層試料を調製でき、調製した試料を用いた皮膚角層のポリアミン量を測定し、さらにはポリアミン量の測定結果に基づく皮膚のキメを評価することができる。
　なお、皮膚角層のポリアミン量を検出する方法は上記以外にもあり、適宜選択してよい。例えば、高速液体クロマトグラフ法などの化学的分析方法、免疫組織染色方法などの生化学的分析方法、化学的特徴を利用してポリアミン残基に蛍光標識する方法が例示でき、それらのいずれであっても良い。化学的分析方法や生化学的分析方法は剥離した角層試料をホモジネートし、これによりポリアミンを水抽出したものを試料とする。抽出方法は、たとえば凍結融解法、超音波破砕法、ホモジネート法等を介して可溶性画分とする方法があげられる。ポリアミン残基に蛍光標識する方法は、剥離した角層を試料とする。
　以下に試験例を示し、本発明を具体的に説明する。
＜試験１＞
　本試験においては、皮膚角層のポリアミン量を染色により検出する方法によって角層中のポリアミンを直接観察した例を示す。
　１．蛍光顕微鏡観察用試料の調製
　皮膚の角層剥離用粘着テープとして２．５ｃｍ×２．５ｃｍの角質チェッカー（アサヒバイオメッド社）を用いた。
　年齢４６歳～５５歳の女性被験者１９名の頬部より前記の角質チェッカーを用いて、テープストリッピング法により角層を採取した。
　採取した角層を透明スライドガラス上にのせ、ＰｏｌｙａｍｉｎｅＲＥＤ（フナコシ株式会社）を５００μｌジメチルスルフォオキシド（ＤＭＳＯ）で溶解し１６４０μＭに調製した。この希釈液は、小分け分注して－２０℃保存した。
　この凍結保存試薬を、使用直前に、さらに蒸留水にて１０００倍に希釈（１．６４μＭ）し、染色に用いた。
　角層チェッカーの角層採取面に、前記１．６４μＭのＰｏｌｙａｍｉｎｅＲＥＤ染色液を５０ｍｌ滴下し、３０秒反応させた後、精製水を用いて充分洗浄した。風乾後、観察試料とした。
　２．蛍光顕微鏡観察
　Ｏｌｙｍｐｕｓ　ＢＸ６３蛍光顕微鏡を用いて、顕微鏡付属の蛍光ユニットＷＩＧフィルターで励起波長：５６０ｎｍ、蛍光波長：５８５ｎｍで、視野倍率１０～２０倍で観察し、デジタルカメラにより画像を撮影した。
　３．画像解析
　得られた画像を、米国国立衛生研究所 （ＮＩＨ）で公開されているＩｍａｇｅＪマニュアルにしたがって画像解析を行った。蛍光を有する角層細胞の領域を抽出するため、背景部分及び角層の重層部分を除いて、蛍光測定閾値を設定した。この閾値の輝度の平均した数値を、１画像あたりの輝度値とした。
　４．結果
　全１９例の被験者の、角層の蛍光観察画像及び、被験者の個体番号、並びに画像の輝度を図１に示した。なお各画像は、蛍光顕微鏡観察にあたって、従来専門の研究員が行なっている観察基準に沿って、目視による蛍光強度評価１（低い）、評価２（普通）、評価３（強い）の３段階に分類した。
　また、被験者のＩＤ、目視評価、画像の輝度を下記の表１に一覧表として示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　このデータを、Ｘ軸を目視判定評価値、Ｙ軸を輝度値とした二次元配置でプロットしたところ図２に示すような散布図を得た。
　図２から、皮膚角層のポリアミン染色の画像から読み取ることのできた蛍光輝度の値は、蛍光顕微鏡観察における目視評価に代替できるものと考えられた。
　すなわち、皮膚角層の５（６）－Ｃａｒｂｏｘｙｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｒｈｏｄａｍｉｎｅ　Ｇｌｙｃｉｎｅ　ｐｒｏｐａｇｙｌ　ｅｓｔｅｒで蛍光染色したとき、顕微鏡画像の輝度を画像解析処理によって読み取るだけで、熟練した研究者と同等に、角層試料中のポリアミン量の多寡を瞬時に読み取ることが可能となった。
＜試験２（皮膚角層ポリアミンを指標とする皮膚のキメ評価）＞
　試験１で被験者とした１９名について、角層試料採取部位の近傍におけるキメの状態を特開２０１７－１４０２０６号公報に記載の肌理評価システムを参考に、マイクロスコープを用いたキメ評価を行った。
（１）評価方法
　マイクロスコープ（株式会社モリテックス製）、撮像ソフト（アイスコープビューワー　Ｖｅｒ３．０）を用いて拡大画像の撮像を行った。得られた画像は画像データとしてコンピュータに取りこみ、緑成分のみ抜き出し２５６諧調のモノクロ画像に変換した。３次関数でフィッティングして、うねり取り処理（うねり面のＺ座標を０とする）を行った。
このモノクロ画像の各画素における濃淡を示す値（Ｚ（ｘ、ｙ））から、肌理パラメータＳａ’、ＰＳｍ’、Ｓｔｒ’を算出し、下記重回帰式を用いてキメスコアを算出した。
　キメスコア＝－３８．６４９×Ｓａ’－０．２８７×ＰＳｍ’＋２．８８４×Ｓｔｒ’＋１９．４６０
　１）キメの粗さ：前記算出したＳａ’（肌の凹凸に関する疑似算術平均高さ）を測定値として、数値が大きいほどキメが粗い状態を意味する。
　２）キメの形状：前記算出したＰＳｍ’（疑似輪郭曲線要素の平均長さ）を測定値として、数値が小さいほどキメが細かい状態を意味する。
　３）キメの流れにくさ：前記算出したＳｔｒ’（疑似表面性状のアスペクト比）を測定値として、数値が小さいほどキメが流れている状態を意味する。
　４）キメスコア：キメの目視スコアの理論値であり前記重回帰式にあてはめ算出した結果を測定値として、数値が大きいほど目視スコアの数字が高く、キメがよいことを意味する。
（２）評価結果
　各項目の測定結果及び蛍光輝度値を下記の表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　表２に示す各項目の測定データ、及び試験１で得た、角層のポリアミン染色による蛍光輝度データを重回帰分析することで、前記の１）キメの粗さ、２）キメの形状、３）キメの流れにくさ、４）キメスコアとの相関係数を求めた。
　各項目の相関係数及び回帰直線の回帰式は次のとおりである。
　キメの粗さと蛍光輝度の相関係数Ｒ＝－０．４３２
　　回帰式：ｙ＝－０．０００５ｘ＋０．１８６１
　キメの形状と蛍光輝度の相関係数Ｒ＝－０．２１６
　　回帰式：ｙ＝－０．０３７９ｘ＋２６．５０２
　キメの流れにくさと蛍光輝度の相関係数Ｒ＝０．３１２
　　回帰式：ｙ＝０．００２ｘ＋０．３２８
　キメスコアと蛍光輝度の相関係数Ｒ＝０．３７２
　　回帰式：ｙ＝０．０４６７ｘ＋－１．９２６
　また、各評価項目と輝度データの二次元配置の散布図、回帰直線を図３～６に示す。
　各項目の相関係数Ｒと図３～６から、キメの粗さと蛍光輝度は逆相関、キメの形状と蛍光輝度は逆相関、キメの流れにくさと蛍光輝度は正の相関、キメスコアと蛍光輝度は正の相関であることがわかった。
＜試験３（皮膚角層ポリアミン（ポリアミン平均輝度値）と目視キメ評価（キメ目視スコア）の相関試験）＞
（１）試験方法
２６歳～４９歳の男性の左右頬部より、角層チェッカー（アサヒバイオメッド社）を用いた角層を、同部位よりＳＫＩＮ　ＣＡＳＴ（アール・エス・アイ社）を用いたレプリカを、各１５検体採取した。
角層のポリアミン染色は、０．５枚の角層チェッカーの角層採取面にＤＭＳＯで調製した１．６４μＭのＰｏｌｙａｍｉｎｅＲＥＤ（フナコシ株式会社）を滴下し、３０秒反応させた後に蒸留水中で洗浄、風乾後に、オールインワン蛍光顕微鏡　ＢＺ－Ｘ８００（株式会社キーエンス）で画像を撮影した。
取得した画像から、Ｉｍａｇｅ　Ｊ（ＮＩＨ）を用いて、背景部分及び角層の重層部分を除く蛍光測定閾値の範囲内の画素を抽出し、角層ポリアミン染色の平均輝度値を算出した。また、採取した皮膚のレプリカはマイクロスコープ（ＶＬ－７ＥＸII、スカラ株式会社製）を用いて３０倍の拡大画像の撮像を行い、得られた画像からキメの目視スコアを作成した。　
キメの目視スコアとは、キメが細かく、規則正しく、等方性であると、キメの状態がいいと判断される。この拡大画像のキメの細かさ、規則正しさ、等方性を、専門判定者が総合的に数値化して目視スコア実測値を作成したものをいう。このスコア数値が高い程肌が滑らかであり、見た目の肌年齢が若いことを表している。なお目視スコアとレプリカ画像を対応させたものを図７に示す。
そして同一部位で得られたポリアミン染色の平均輝度値とキメの目視スコア相関を評価計算した。
（２）結果
　下記表３に輝度値/画像（平均輝度値）とキメの目視スコアを示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
表３のデータに基づくキメ目視スコア（ｙ）と平均輝度値（ｘ）の相関係数及び回帰式は次のとおりである。
キメ目視スコアとポリアミン平均輝度値の相関係数Ｒ＝０．７７
　　回帰式：ｙ＝０．０６６４ｘ－１．０２３３
　このように、キメ目視スコアと皮膚角層のポリアミン平均輝度値は、高い相関性があることが分かった。
　以上の試験１、試験２、試験３の結果から、角層中のポリアミン量の多寡を、５（６）－カルボキシテトラメチルローダミンで蛍光標識することで容易に測定することが可能となった。またこの５（６）－カルボキシテトラメチルローダミンで角層中のポリアミンを選択的に蛍光標識すると、蛍光量を指標として皮膚のキメを容易に評価できることが明らかとなった。
＜試験４（化学分析による角層中のポリアミン量の測定）＞
（１）試験方法
６歳～４９歳の男女２０名の左右頬部より各１枚、角層チェッカー（アサヒバイオメッド社）により角層を採取した。採取した角層の角層テープは、１枚を４等分し、１．７５枚を抽出に、０．２５枚を染色による定量に用いた。
１）ポリアミン定量
ガラスビーズを入れた蒸留水５００μｌへ採取した角層テープを入れ、ビーズ式細胞破砕装置（株式会社トミー精工）を用い、４５００ｒｐｍ１８０ｓｅｃの条件で角層中タンパク質を抽出した。本角層抽出液にＬＣ－ＭＳ（液体クロマトグラフィー質量分析）用誘導体化処理を行った。誘導体化処理はダンシルクロリドのアセトン溶液（１０ｍｇ／ｍｌ）３００μｌを添加し、攪拌後、飽和炭酸ナトリウム水溶液５０μｌを添加し、再び攪拌後に室温にて一晩静置した。翌日、プロリン水溶液（１００ｍｇ／ｍｌ）５０μｌを添加し、室温で３０分間静置後、トルエン５００μｌを加えて攪拌し、遠心後に分取したトルエン層を窒素により乾固し、アセトン：水＝１：１混液１００μｌに溶解した。誘導化処理サンプルをＬＣ－ＭＳで分析し、ポリアミンを定量した。ＬＣ－ＭＳ分析条件を以下に示す。
カラム：Ｃａｐｃｅｌｌ　Ｐａｋ　ＵＧ１２０　　２．０　ｘ　１００ｍｍ　５μｍ　（株式会社大阪ソーダ）
カラム温度：４０℃
移動相Ａ：０．０１Ｍ　酢酸アンモニウム／水
移動相Ｂ：アセトニトリル
イオン化法：ＥＳＩ（正イオン検出モード）
検出法：ＳＩＭモード
ｍ／ｚ：５５５（プトレシン）、８４５（スペルミジン）、１１３５（スペルミン）
上記角層抽出液より一部を分取し、Ｐｉｅｒｃｅ　ＢＣＡ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ａｓｓａｙ　ｋｉｔ　（Ｔｈｅｒｍｏ　ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ）を用いて角層中総タンパク量の測定を行った。同時に精製ウシ血清アルブミンを標準品として検量線を作成し、吸光度からタンパク量を算出した。ＬＣ－ＭＳによる各ポリアミン　（プトレシン、スペルミジン、スペルミン）の合計値を総蛋白量で除した値を、総ポリアミン量とした。
２）ポリアミン染色
上記で述べたとおり、分割した０．２５枚の角層チェッカーの角層採取面にＤＭＳＯで調整した１．６４μＭのＰｏｌｙａｍｉｎｅＲＥＤ（フナコシ株式会社）を滴下し、３０秒反応させた後に蒸留水中で洗浄、風乾後に、Ｏｌｙｍｐｕｓ　ＢＸ６３蛍光顕微鏡、ＷＩＧフィルター（励起波長：５６０ｎｍ、蛍光波長５８５ｎｍ）で観察して画像を取得した。
取得した画像は、Ｉｍａｇｅ　Ｊ（ＮＩＨ）を用いて、背景部分及び角層の重層部分を除く蛍光測定閾値の範囲内の画素を抽出し、１画像あたりの角層のポリアミン染色の平均輝度値を算出し、３視野の平均を分析値と比較した。
（２）結果
２０名の角層をポリアミン染色による平均輝度値及び化学分析を行った結果を下記の表４に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　表４に基づいて得られた散布図を図９に示す。
相関を確認したところ、輝度値と総ポリアミン量に相関関係が見られた（図９）。この結果より、角層ポリアミン染色の輝度値は、ポリアミンの化学的分析値に代替できることが明らかとなった。すなわち、角層中のポリアミンを化学的分析を行うことで皮膚のキメの状態を評価可能である。
 

Claims (10)

  1. 　角層試料中に存在するポリアミン量を測定して、皮膚状態を評価する方法。
  2. 　角層試料中に存在するポリアミンを、染色する工程を含むことを特徴とする角層試料の調製方法。
  3. 　染色する工程が、５（６）－カルボキシテトラメチルローダミングリシンプロパギルエステル（Ｃａｒｂｏｘｙｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｒｈｏｄａｍｉｎｅ　Ｇｌｙｃｉｎｅ　ｐｒｏｐａｇｙｌ　ｅｓｔｅｒ）を含む溶液に、角層試料を浸漬する工程である請求項２に記載の角層試料の調製方法。
  4. 　角層試料がテープストリッピング法によって採取されたものである請求項２又は３に記載の角層試料の調製方法。
  5. 　５（６）－カルボキシテトラメチルローダミングリシンプロパギルエステルで蛍光標識された角層試料を、蛍光顕微鏡観察することによって選択的に蛍光標識された皮膚角層のポリアミンの蛍光量を測定して皮膚状態を評価する方法。
  6. 　ポリアミン量の測定が、画像解析の手法による蛍光輝度の測定である請求項５に記載の皮膚状態を評価する方法。
  7. 　皮膚状態の評価が、皮膚表面形態を表す物性値としてキメの粗さ・キメの形状・キメの流れにくさ・キメスコアから選択されるいずれか１以上の項目である請求項５または６に記載の皮膚状態を評価する方法。
  8. 　皮膚状態の評価が、目視によるキメスコアである請求項５または６に記載の皮膚状態を評価する方法。
  9. 　角層試料の水抽出物から化学的分析方法により検出したポリアミン量を指標として皮膚状態を評価する方法。
  10. 　角層試料がテープストリッピング法によって採取されたものである請求項１又は請求項５～９のいずれかに記載の皮膚状態を評価する方法。
     
     
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