TW202102854A - 評估皮膚狀態的方法 - Google Patents

Abstract

本發明之課題為提供一種選擇性地將角層試料中的多胺染色之方法、及以多胺量作為指標之評估皮膚紋理之方法。本發明之解決手段為一種螢光顯微鏡觀察用角層試料之調製方法，係包括將角層試料中所存在之多胺以5(6)-羧基四甲基玫瑰紅甘胺酸炔丙酯選擇性地做螢光標識之步驟。

Description

評估皮膚狀態的方法

本發明係關於以皮膚角層中的多胺作為指標之評估皮膚狀態的方法。

多胺為在體內由胺基酸合成之具有2個以上胺基的物質。在所有動物或人類細胞內於成長期積極地合成(非專利文獻1)。細胞增殖時的核酸合成中，與RNA強力鍵結，使RNA結構改變，在成長期各種階段進行蛋白質促進合成(非專利文獻2)。

此外，具有抗炎症作用(非專利文獻3)、抗氧化作用(非專利文獻4)、糖化抑制(非專利文獻5)、壽命延長(非專利文獻6)等各種功能。由此可知多胺為細胞生命現象不可或缺的物質。

隨著年齡增加，體內多胺濃度會降低(非專利文獻7)。又，多胺合成中需要一連串合成系酵素，但該酵素隨著年齡增加而降低酵素活性(非專利文獻8)。

全身各臟器中的多胺存在量為已知。例如，皮膚中存在於真皮及表皮。真皮及表皮之多胺(精胺、亞精胺、腐胺)存在量也為已知(非專利文獻9)。但是，未報導皮膚角層中的多胺量。

又，尚未發現特異性地檢測皮膚角層中的多胺之方法。又，未報導皮膚角層中的多胺功能。

另一方面，近年來伴隨癌症的研究而持續進行細胞多胺的研究，已提出對細胞生存不會造成不良影響的生體多胺染色方法(非專利文獻10)。該染色方法為活細胞之生染色技術，尚未確定是否可用於如皮膚角層之活細胞與死細胞混合存在之組織的染色。

角層在構成皮膚之4層中位於最外層，也稱為角質、角質層之組織，目前採取該角層進行染色，並進行組織觀察，藉此逐漸判明皮膚之結構或功能、構成成分的作用效果等。例如，評估角層形狀時，可以下述方法進行：以黏著性膠帶使角層剝離並採取角層，將該角層直接、或將採取的角層轉印於載玻片後，將角層以使用了藍色1號、紫色401號、綠色201號、黃色4號、黃色5號、黃色407號、紅色102號、橙色205號、亮綠、蘇木素等色素與有機酸與醇之試藥、或以剛果紅色素進行染色，再進行觀察(專利文獻1至2)。

又，從存在於角層中的物質評估肌膚狀態之染色方法已記載使用螢光標識抗體並以AGES(advanced glycation end products)存在量作為指標之評估皮膚狀態的方法、或以TARC(胸腺和激活調節趨化因子，Thymus and activation-regulated chemokine)表現量作為指標之異位性皮膚炎之局部病態評估方法(專利文獻3至4)。

專利文獻5記載以含肼基之螢光物質檢測經羰基化的角層蛋白質，而檢查有無皮膚疾病之方法。

藉由如上述方式染色皮膚角層而開發判別皮膚狀態之指標。

皮膚中，如「肌理」或「紋理」之指標係用於表現皮膚表面形態不規則肌膚狀態的情形。健康皮膚表面中，會藉由皮溝及皮丘而形成紋理(肌理)，光學性亦為規則的。但在肌膚粗糙之皮膚表面中，紋理呈不規則，進而會產生鱗屑(脫屑)，而成為光學性不規則，肉眼也可觀測到該不規則。又，肌膚觸感缺少平滑性而呈粗糙觸感。

所屬技術領域中具有通常知識者係以肉眼將脫屑程度、炎症反應所致之紅斑程度進行計分化。又，也可以數位顯微鏡拍攝表面形態，並藉由影像解析僅挑出脫屑部分而評估、或藉由皮膚測色而定量化紅腫程度。又，可藉由複製法等而測量伴隨肌膚粗糙之表面形態變化。又，有關於伴隨肌膚粗糙之角層水分量降低或屏蔽功能降低，係已提出使用角層電導或經表皮水分蒸散量之測定等在不傷害皮膚下進行測定之機器，並以非侵入性方法進行評估之各種方法(專利文獻6至12)。但是至今未有提供依據實感之評估方法。又，評估需要長年經驗、熟練且專門之訓練。因此要求客觀地評估該紋理狀態之測定方法。

[先前技術文獻]

[專利文獻]

專利文獻1：日本特開2006-53117號公報。

專利文獻2：日本特開2007-263655號公報。

專利文獻3：日本專利第5275898號公報。

專利文獻4：日本專利第5065237號公報。

專利文獻5：日本特開2009-36555號公報。

專利文獻6：日本特開2005-95326號公報。

專利文獻7：日本特開2006-180971號公報。

專利文獻8：日本特開2007-130101號公報。

專利文獻9：國際公開第2009/142069號。

專利文獻10：日本特開2010-273736號公報。

專利文獻11：日本特開2010-22547號公報。

專利文獻12：日本特開2017-216941號公報。

[非專利文獻]

非專利文獻1：Cell Tissue Kinet. 1983. 16, 493-504。

非專利文獻2：Biochem Biophys Res. Commun 2000 May 19；271(3)：559-64. Igarashietal。

非專利文獻3：J Exp Med. 1997 May 19；185(10)：1759-68. Zhang M et al。

非專利文獻4：Proc. Natl. Acad. Sci. USA Vol. 95, pp. 11140-11145, September 1998。

非專利文獻5：Life Sci. 2003 Apr 25；72(23)：2603-16. Gugliucci et al。

非專利文獻6：Aging, August, 2011 Vol.3, No.8, Nadege Minois et al。

非專利文獻7：Exp Gerontol. 1982；17(2)：95-103. Ratna Das et al。

非專利文獻8：Exp Gerontol. 1993 Nov-Dec；28(6)：565-72. Kiego Yoshinaga et al。

非專利文獻9：Arch Dermatol Res. 1983；275(4)：218-21. P. EI Baze et al。

非專利文獻10：Chemical Communications, 2017, 53, 8403-8406, Katunori Tanaka et al。

本發明人等著眼於皮膚角層中的多胺量，發現角層的多胺量可為皮膚紋理指標，從而完成本發明。亦即，本發明之課題係提供測定角層中的多胺量而評估皮膚狀態之方法，就該方法之一而言係提供選擇性地染色多胺並調製皮膚角層試料之方法、及測定使用所調製試料之皮膚角層的多胺量之方法、以及根據多胺量測定結果評估皮膚紋理之方法。

本發明之主要構成係如下述。

(1)一種評估皮膚狀態的方法，係測定存在於角層試料中之多胺量。

(2)一種角層試料之調製方法，係包括將存在於角層試料中之多胺染色之步驟。

(3)如(2)所記載之角層試料之調製方法，其中，染色之步驟為將角層試料浸漬於含有5(6)-羧基四甲基玫瑰紅甘胺酸炔丙酯(Carboxytetramethylrhodamine Glycine propargyl ester)之溶液之步驟。

(4)如(2)或(3)所記載之角層試料之調製方法，其中，角層試料為以膠帶剝除法採取者。

(5)一種評估皮膚狀態的方法，係將經5(6)-羧基四甲基玫瑰紅甘胺酸炔丙酯做螢光標識之角層試料進行螢光顯微鏡觀察，藉此測定經選擇性地螢光標識的皮膚角層之多胺的螢光量。

(6)如(5)所記載之評估皮膚狀態的方法，其中，多胺量之測定為藉由影像解析手法之螢光亮度測定。

(7)如(5)或(6)所記載之評估皮膚狀態的方法，其中，皮膚狀態之評估中，表示皮膚表面形態之物性值為從選自紋理粗度、紋理形狀、紋理流動(Flow of texture)之困難度、紋理計分中之任一種以上之項目。

(8)如(5)或(6)所記載之評估皮膚狀態的方法，其中，皮膚狀態之評估為以目視所進行之紋理計分。

(9)一種評估皮膚狀態的方法，係以從角層試料水萃取物藉由化學性分析方法檢測之多胺量作為指標。

(10)如(1)及(5)至(9)中任一項所記載之評估皮膚狀態的方法，其中，角層試料為以膠帶剝除法採取者。

根據本發明可提供一種檢測或選擇性地染色皮膚角層之多胺之方法。又，提供一種可選擇性地觀察多胺之角層試料之調製方法、及評估使用所調製試料之皮膚狀態之方法。本發明之方法係使角層中的多胺與螢光色素選擇性地鍵結，故極容易觀察多胺。因此，可容易地觀察角層中的多胺狀態。又，可將觀察影像進行影像解析，藉此可容易地測量多胺量，可以其為基準作為皮膚紋理之客觀數值，而進行解析評估。該皮膚紋 理評估係與以往方法相異，負責檢查者不需要專門訓練，且可於短時間內評估測定，因此，便利性極高。

第1圖係19名受試者角層試料之多胺染色影像之螢光顯微鏡拍攝影像。根據影像目視觀察結果而以3階段評估分類影像。

第2圖係19名受試者角層試料之多胺染色影像之螢光亮度散布圖。X軸為影像的目視評估評點，Y軸為影像平均亮度值/影像。

第3圖係表示19名受試者角層試料之多胺染色影像之螢光亮度、顯微鏡所觀察之紋理粗度資料散布圖、及評估相關性之迴歸直線。

第4圖係表示19名受試者角層試料之多胺染色影像之螢光亮度、顯微鏡所觀察之紋理形狀資料散布圖、及評估相關性之迴歸直線。

第5圖係表示19名受試者角層試料之多胺染色影像之螢光亮度、顯微鏡所觀察之紋理流動之困難度資料散布圖、及評估相關性之迴歸直線。

第6圖係表示19名受試者角層試料之多胺染色影像之螢光亮度、顯微鏡所觀察之紋理計分資料散布圖、及評估相關性之迴歸直線。

第7圖係表示人類皮膚之複製品影像、及與該影像對應之紋理計分。

第8圖係表示15名受試者角層試料之多胺染色影像之平均亮度值、紋理目視計分散布圖、及評估相關性之迴歸直線。

第9圖係表示20名受試者角層試料之多胺染色影像之平均亮度值、多胺化學分析值散布圖、及評估相關性之迴歸直線。

本發明係一種將從皮膚採取之角層試料藉由多胺染色試藥調製成可觀察狀態之角層試料之方法。所謂多胺染色試藥係藉由5(6)-羧基四甲基玫瑰紅甘胺酸炔丙酯(5(6)-Carboxytetramethylrhodamine-Glycine propargyl ester)使甘胺酸炔丙酯與多胺進行特異性反應，而標識5(6)羧基四甲基玫瑰紅(TAMRA)，藉此成為可螢光觀察之狀態。進行標識之色素不限於5(6)羧基四甲基玫瑰紅(TAMRA)，亦可為螢光色素、發光色素、著色色素之任一者。可舉例如：部花青素(Merocyanine)、苝(perylene)、吖啶(acridine)、螢光素(luciferin)、玫瑰紅(Rhodamine)、香豆素(coumarin)、螢光黃(fluorscein)、繖形酮(umbelliferone)等色素。又，本發明之第2發明係：將該試料之觀察影像藉由影像解析將皮膚角層之多胺量以螢光亮度而數值化，並評估皮膚狀態。進一步，本發明之第3發明係：藉由觀察影像之影像解析資訊，而將所得之多胺量作為指標評估皮膚之紋理。以下更詳細地說明。

此外，本發明所稱之「紋理」是指人類肌膚表面本來就存在的稱為「皮溝」的溝、以及包圍該溝而隆起的「皮丘」所構成之網狀結構。為了讓人看到漂亮、健康的肌膚，重點為紋理較細且不明顯。紋理會隨著年齡增加變粗，且有紋理流動成為不規則、不明確之傾向，但年輕者也有紋理不明確的情形，因此老化與紋理粗度並不一定有直接影響。如上述，紋理形狀的個人差異較大，為個人與生俱來的皮膚形態。

前述皮膚角層試料採取、角層試料處理及角層試料調製、影像解析資料取得、皮膚狀態評估較佳為用以下述方式進行。

(步驟1)使用角層剝離手段從皮膚採取角層試料。

(步驟2)將步驟1所採取之角層試料以剝離面為上方之方式貼合於透明板。

(步驟3)滴下含有對於多胺具有特別鍵結能力之5(6)-羧基四甲基玫瑰紅甘胺酸炔丙酯之溶液後，靜置固定時間。

(步驟4)以水洗淨步驟3所得之角層試料。

(步驟5)將步驟4洗淨之角層試料風乾，而形成螢光顯微鏡觀察試料(標本)。

(步驟6)將步驟5所得之螢光顯微鏡觀察試料以激發光560nm、螢光光580nm之觀察條件進行螢光顯微鏡觀察，而取得螢光影像資料。

(步驟7)將步驟6取得之螢光影像之螢光亮度以每個像素從黑到白之順序之0至255灰色等級表示，而作為試驗試料之多胺指標。

(步驟8)步驟8為藉由下列A或B之任一方法而決定紋理計分之步驟。

A.根據從多數受試者採取之角層試料之前述多胺指標值、受試者皮膚紋理粗度、紋理形狀、紋理流動之困難度、紋理計分，由相關式求得迴歸直線，由該迴歸直線決定對應步驟6所得之多胺指標之受試者皮膚紋理粗度、紋理形狀、紋理流動之困難度、紋理計分。

B.根據從多數受試者採取之角層試料之前述多胺指標值及目視評估計分，由相關式求得迴歸直線，由該迴歸直線決定對應步驟6所得之多胺指標之受試者紋理計分。

步驟1之角層剝離手段可為使用活體組織切片或黏著膠帶之方法之任一者。考量受試者之負擔時，較佳為使用黏著膠帶之方法。使用黏著膠帶之方法也稱為膠帶剝除法。

膠帶剝除法為將黏著性膠帶貼合於皮膚後剝離，而採取皮膚表層之方法。

黏著劑使用天然橡膠、聚異丁烯、聚丁二烯、聚矽氧橡膠、聚異戊二烯、苯乙烯/異戊二烯/苯乙烯嵌段共聚物等合成橡膠、聚丙烯、聚苯乙烯、丙烯酸酯共聚物等合成樹脂等。膠帶剝除法所使用之黏著膠帶有市售品，亦可使用市售品。

步驟2中將步驟1所採取之角層試料以剝離面為上方之方式貼合於透明板，此時之透明板較佳為使用適合於顯微鏡觀察之玻璃製或丙烯酸製者。

步驟3所使用之含有5(6)-羧基四甲基玫瑰紅甘胺酸炔丙酯之溶液可使用市售之細胞用多胺染色試藥。5(6)-羧基四甲基玫瑰紅甘胺酸炔丙酯係利用甘胺酸炔丙酯與多胺之特異性鍵結的特性，而與活細胞等組織內所存在之多胺鍵結，藉此使多胺附有紅色螢光。如此之染色試藥可舉例如「PolyamineRED」(Funakoshi股份有限公司)。

步驟4中的洗淨是為了去除步驟3所使用之多胺染色用試藥中未與角層中的多胺反應之5(6)-羧基四甲基玫瑰紅甘胺酸炔丙酯。使用充分量的水至少重複洗淨1至10次左右(較佳為3至5次)。洗淨所使用之水可舉出：純水、離子交換水、蒸餾水、自來水等，較佳為純水。

步驟5中，在前述步驟4結束並風乾試料水分後，形成顯微鏡觀察用試料(標本)。此外，亦可藉由長期間保存試料時所使用之水溶性封入劑(甘油系、氯醛系、明膠系、特殊封入劑)而形成封入標本。

步驟6中以螢光顯微鏡觀察前述步驟5所使用之標本。此時以激發光560nm、螢光光580nm之條件進行螢光顯微鏡觀察而取得螢光數據。螢光數據之取得係以內視鏡等使標本顯示於監視器，將剝離採取之角層試料所含之多胺量作為螢光亮度而予以確認。此時，多胺發出紅色螢光，螢光亮度即為多胺量指標。該特異性螢光已確認與多胺量是呈1對1之對應(參照非專利文獻10)。

步驟7中，藉由上述步驟6中以螢光顯微鏡觀察，而選擇欲確認評估之標本的觀察影像，使用數位相機等而作為影像數據傳至電腦。接著，將所取得之觀察影像之讀取數據藉由影像處理而取得數值化數據。影像處理只要為公知影像處理系統，則可使用任意系統。如此影像處理系統在本發明中可使用「ImageJ」作為適當影像處理系統。「ImageJ」為開放原始碼且公有領域之影像處理軟體。所屬技術領域中具有通常知識者可容易地取得。

將源自於前述多胺類存在之螢光影像亮度以每個像素(pixel)從黑到白之順序之0至255灰色等級表示。此外，灰色等級閾值設定為：以各影像之角層未表示部分(背景)灰色等級之平均亮度為a，以角層重層部分(積層部分)灰色等級之平均亮度值為b，以將灰色等級為a以上且未達b之平均亮度值作為角層之多胺輸出數據之方式，設定灰色等級閾值。

以用上述方式輸出之影像數據之每個像素數之平均亮度值作為多胺量指標。

步驟8中可採用A、B任一步驟。

步驟8之A中，表示皮膚表面形態之物性值為測定「紋理粗度」、「紋理形狀」、「紋理流動之困難度」、「紋理計分」者。可舉例如日本特開2017-140206號公報所記載之肌理評估系統。

步驟8之B中，以往之表示皮膚表面形態之物性值係採用目視紋理評估。

以下，依據步驟說明計算肌理參數之方法，該肌理參數係作為表示使用肌理評估系統之皮膚表面形態之物性值。又，針對將目視紋理評估值以多胺為指標而決定之方法進行說明。

(1)複數者之肌膚放大影像

首先，拍攝複數者之肌膚放大影像。該拍攝裝置具備透鏡部及照光部。拍攝影像若產生陰影時，單色影像的情形中陰影部分會比實際更濃，從濃淡值計算之肌理參數會產生偏差，故較佳為以包圍透鏡部之方式配置複數照光部。例如較佳為於以透鏡部為中心之圓周上，將由LED等點光源所構成之複數照光部配置成n次旋轉對象(n≧3)。又，照光部可配置於屬於同心圓之2個以上圓周上，也可使全圓周為照光部。如此之拍攝裝置較佳為數位式顯微鏡，可舉例如i-SCOPE(MORITEX股份有限公司製)。

拍攝處較佳為不存在小皺紋、皺紋等之平滑部分，可舉例如為臉頰、額頭等。又，先擦拭掉會增強反射光之出油(油脂)，女性的情形先卸妝等後再拍攝。

(2)單色影像轉換

拍攝影像係作為影像數據傳送至電腦，將放大影像轉換為單色影像。在此，單色影像是指多階單色影像。單色影像之色調並無特別限制，例如可使用紅成分(R)、綠成分(G)、藍成分(B)之任一者。為了最明確地判斷影像濃淡，較佳為使用綠成分(G)。又，轉換為單色影像之前或之後可進行降低雜訊之平滑化處理、修正照明不均之去除波動處理等。

(3)步驟8A之肌理參數計算及評估

從該單色影像之各像素(x、y)中表示濃淡之數值Z(x、y)而計算出作為與肌理狀態相關之肌理參數之Sa’、PSm’、Str’。

Sa’：計算畫面整體之Z(x、y)之絕對值平均值作為Sa’。

PSm’：從資訊去除雜訊後，以最大值1/10的值作為正閾值、以最小值1/10的值作為負閾值，在畫面內等間隔取縱8條、橫6條之取樣線，在取樣線上掃描，求得成為負閾值以下的點到下一個成為負閾值以下的點的距離。於縱、橫分別將值取平均，最後以縱及橫的值平均作為PSm’。

Str’：切出影像中心部中120×120像素之領域，以由該領域計算之自相關函數(ACF)最大值的0.3倍作為閾值，求長軸半徑及短軸半徑，以該比(長軸半徑/短軸半徑)而作為Str’。

本發明中，「紋理粗度」相當於表面粗度參數之算術平均高度(ISO 25178)，前述計算之Sa’(與肌凹凸相關之擬算術平均高度)其數值越大則表示紋理為越粗糙之狀態。又，「紋理形狀」相當於表面粗度參數之輪廓曲線要素之平均長度(JIS B0601-2001)，前述計算之PSm’(擬輪廓曲線要素之平均長度)其數值越小表示紋理為越細之狀態。「紋理流動之困難度」相 當於表面粗度參數之表面性狀之長寬比(ISO 25178)，前述計算之Str’(擬表面性狀之長寬比)其數值越小表示紋理呈流動之狀態。又，「紋理計分」為專門判定者將肌膚放大影像之肌理之細度、規則度、等方性總合數值化之目視計分實測值(數值化為1至10之10階段)為應變數，以前述計算之Sa’、PSm’、Str’為自變數，由所得複迴歸式所求得之目視計分理論值，其是用下式計算。紋理計分其數值為越大表示目視計分數字較高，紋理較佳。

紋理計分=A×Sa’+B×PSm’+C×Str’+D(但A、B、C為係數，D為常數。)

求取前述步驟1至6所得角層多胺之螢光亮度資訊及二次迴歸式，藉由所得之迴歸式及欲測定之受試者角層多胺之螢光亮度資訊數據，而評估皮膚之「紋理粗度」、「紋理形狀」、「紋理流動之困難度」、「紋理計分」。

(4)步驟8B之目視評估

步驟8之B中，採用以目視進行之紋理評估作為以往表示皮膚表面形態之物性值。以迴歸分析評估其與受試者角層多胺之螢光亮度資訊數據的相關性。

藉由經過上述步驟，可於短時間內選擇性地染色角層中的多胺，並調製皮膚角層試料，又，可測定使用所調製之試料的皮膚角層之多胺量，進而可根據多胺量測定結果評估皮膚紋理。

此外，皮膚角層之多胺量檢測方法也有上述以外之方法，可適當地選擇。可舉例如高效液相層析法等化學性分析方法、免疫組織染色方法等生物化學性分析方法、利用化學性特徵螢光標識多胺殘基之方法，可為該等之任一者。化學性分析方法或生物化學性分析方法中，可將剝離 之角層試料進行均質化，藉此以水萃取多胺並以此作為試料。萃取方法可舉例如透過凍結融解法、超音波粉碎法、均質法等而形成可溶性部分之方法。螢光標識多胺殘基之方法可以剝離之角層作為試料。

實施例

以下顯示試驗例並具體地說明本發明。

<試驗1>

本試驗中，顯示藉由將皮膚角層之多胺量利用染色進行檢測之方法而直接觀察角層中的多胺之例子。

1.螢光顯微鏡觀察用試料之調製

皮膚之角層剝離用黏著膠帶使用2.5cm×2.5cm之角質檢測片(ASAHI BIOMED公司)。

從年齡46歲至55歲之19名女性受試者頰部使用前述角質檢測片並藉由膠帶剝除法採取角層。

將所採取之角層置於透明載玻片上，將PolyamineRED(Funakoshi股份有限公司)以500μl二甲基亞碸(DMSO)溶解並調製為1640μM。將該稀釋液分成小部分並分注保存於-20℃。

將該凍結保存試藥在正要使用之前進一步以蒸餾水稀釋1000倍(1.64μM)，用於染色。

於角層檢測片之角層採取面滴入前述1.64μM之PolyamineRED染色液50ml，反應30秒後，使用精製水充分地洗淨。風乾後作為觀察試料。

2.螢光顯微鏡觀察

使用Olympus BX63螢光顯微鏡，以顯微鏡所附之螢光單元WIG過濾器以激發波長：560nm、螢光波長：585nm、視野倍率10至20倍觀察，以數位相機拍攝影像。

3.影像解析

將所得之影像以美國國立衛生研究所(NIH)公開的ImageJ手冊進行影像解析。為了挑出具有螢光之角層細胞領域而去除背景部分及角層之重層部分，並設定螢光測定閾值。以該閾值亮度平均數值為每1影像之亮度值。

4.結果

全19例受試者之角層螢光觀察影像、及受試者個體編號、以及影像亮度示於第1圖。此外，各影像在螢光顯微鏡觀察中，根據以往專門研究員所進行之觀察基準而分類為進行目視之螢光強度評估1(低)、評估2(普通)、評估3(強)之3階段。

又，受試者ID、目視評估、影像亮度一併表示於下列表1。

[表1]

將該數據以X軸為目視判定評估值、Y軸為亮度值之二維配置進行繪圖，獲得第2圖所示之散布圖。

從第2圖可知，從皮膚角層多胺染色影像讀取之螢光亮度值可用以取代螢光顯微鏡觀察中的目視評估。

亦即，皮膚角層以5(6)-羧基四甲基玫瑰紅甘胺酸炔丙酯螢光染色時，僅將顯微鏡影像亮度以影像解析處理讀取，即可與熟練的研究者同程度地瞬間讀取角層試料中多胺量的多寡。

<試驗2(以皮膚角層多胺為指標之皮膚紋理評估)>

對於試驗1之19名受試者，將角層試料採取部位附近的紋理狀態參考日本特開2017-140206號公報所記載之肌理評估系統並使用顯微鏡進行紋理評估。

(1)評估方法

使用顯微鏡(MORITEX股份有限公司製)、拍攝軟體(i-Scope Viewer Ver3.0)拍攝放大影像。所得之影像係作為影像數據傳送至電腦，僅挑出綠成分並轉換為256階單色影像。以3次函數擬合並進行去除波動處理(以波面之Z座標為0)。

從該單色影像各像素中表示濃淡的值(Z(x、y))計算肌理參數Sa’、PSm’、Str’，使用下述複迴歸式計算紋理計分。

紋理計分=-38.649×Sa’-0.287×PSm’+2.884×Str’+19.460

1)紋理粗度：以前述計算之Sa’(關於肌膚凹凸之擬算術平均高度)為測定值，數值越大表示紋理為越粗糙之狀態。

2)紋理形狀：以前述計算之PSm’(擬輪廓曲線要素之平均長度)為測定值，數值越小表示紋理為越細之狀態。

3)紋理流動之困難度：以前述計算之Str’(擬表面性狀之長寬比)為測定值，數值越小表示紋理呈流動之狀態。

4)紋理計分：為紋理目視計分理論值，適用前述複迴歸式計算之結果為測定值，其數值越大表示目視計分數字較高，紋理較佳。

(2)評估結果

各項目之測定結果及螢光亮度值示於表2。

[表2]

以表2所示之各項目之測定數據、及試驗1所得之利用角層多胺染色所得之螢光亮度數據進行複迴歸分析，藉此求得前述1)紋理粗度、2)紋理形狀、3)紋理流動之困難度、4)紋理計分的相關係數。

各項目之相關係數及迴歸直線之迴歸式如下述。

紋理粗度與螢光亮度之相關係數R=-0.432

迴歸式：y=-0.0005x+0.1861

紋理形狀與螢光亮度之相關係數R=-0.216

迴歸式：y=-0.0379x+26.502

紋理流動之困難度與螢光亮度之相關係數R=0.312

迴歸式：y=0.002x+0.328

紋理計分與螢光亮度之相關係數R=0.372

迴歸式：y=0.0467x+-1.926

又，各評估項目與亮度數據之二維配置散布圖、迴歸直線示於第3至6圖。從各項目之相關係數R與第3至6圖可知紋理粗度與螢光亮度為逆相關，紋理形狀與螢光亮度為逆相關，紋理流動之困難度與螢光亮度為正相關，紋理計分與螢光亮度為正相關。

<試驗3(皮膚角層多胺(多胺平均亮度值)與目視紋理評估(紋理目視計分)之相關試驗)>

(1)試驗方法

從26歲至49歲之男性左右頰部使用角層檢測片(ASAHI BIOMED公司)採取角層，從同部位使用SKIN CAST(Raptor Survey Institute公司)採取複製品(replica)，各採取15檢體。

角層之多胺染色係在0.5片角層檢測片之角層採取面滴入以DMSO調製之1.64μM之PolyamineRED(Funakoshi股份有限公司)，反應30秒後在蒸餾水中洗淨，風乾後以一機型(All-in-one)螢光顯微鏡BZ-X800(keyence股份有限公司)拍攝影像。

使用ImageJ(NIH)從取得之影像挑出除去背景部分與角層之重層部分之螢光測定閾值之範圍內的像素，計算出角層多胺染色之平均亮度值。又，採取之皮膚之複製品係使用顯微鏡(VL-7EXII，Scala股份有限公司製)進行30倍放大影像之拍攝，從所得之影像製成紋理之目視計分。

紋理之目視計分是指如下內容：若為紋理細緻、規則度佳、呈等方性，則判斷紋理狀態佳，專門判定者將該放大影像之紋理之細緻度、規則度、等方性總合性地數值化而製成目視計分實測值。該計分數值較高則表示肌膚平滑，外觀肌膚年齡較年輕。此外，目視計分與複製品影像對應示於第7圖。

又，評估計算相同部位所得多胺染色平均亮度值與紋理目視計分的相關性。

(2)結果

下列表3表示亮度值/影像(平均亮度值)與紋理之目視計分。

[表3]

根據表3數據之紋理目視計分(y)與平均亮度值(x)之相關係數及迴歸式係如下述。

紋理目視計分與多胺平均亮度值之相關係數R=0.77

迴歸式：y=0.0664x-1.0233

由上述可知，紋理目視計分與皮膚角層之多胺平均亮度值具有高度相關性。

由上述試驗1、試驗2、試驗3之結果而言，以5(6)-羧基四甲基玫瑰紅進行螢光標識，藉此可容易地測定角層中的多胺量多寡。又，若以該5(6)-羧基四甲基玫瑰紅選擇性地做螢光標識角層中的多胺時，可以螢光量作為指標容易地評估皮膚紋理。

<試驗4(化學分析之角層中的多胺量之測定)>

(1)試驗方法

從6歲至49歲之20名男女之左右頰部各以1片角層檢測片(ASAHI BIOMED公司)採取角層。將1片採取角層之角層膠帶分為4等分，將1.75片用於萃取，將0.25片用於利用染色進行之定量。

1)多胺定量

將所採取之角層膠帶置入添加有玻璃珠之蒸餾水500μl，使用珠式細胞粉碎裝置(TOMY SEIKO股份有限公司)，以4500rpm、180sec之條件萃取角層中的蛋白質。於本角層萃取液進行LC-MS(液相層析法質譜法)用衍生物化處理。衍生物化處理係添加丹磺醯氯之丙酮溶液(10mg/ml)300μl，攪拌後添加飽和碳酸鈉水溶液50μl，再次攪拌後於室溫靜置一晚。隔天添加脯胺酸水溶液(100mg/ml)50μl，在室溫靜置30分鐘後，加入甲苯500μl 攪拌，離心後使分取之甲苯層以氮乾固，並溶解於丙酮：水=1：1之混合液100μl。以LC-MS分析衍生化處理樣品並定量多胺。LC-MS分析條件如下述。

管柱：Capcell Pak UG120 2.0x100mm 5μm(大阪曹達股份有限公司)

管柱溫度：40℃

移動相A：0.01M乙酸銨/水

移動相B：乙腈

離子化法：ESI(正離子檢測模式)

檢測法：SIM模式

m/z：555(腐胺)、845(亞精胺)、1135(精胺)

從上述角層萃取液分取一部分，使用Pierce BCA protein assay kit(Thermo SCIENTIFIC)測定角層中的總蛋白量。同時以精製牛血清白蛋白作為標準品而製作檢量線，由吸光度計算蛋白量。將LC-MS所得之各多胺(腐胺、亞精胺、精胺)合計值除以總蛋白量，以此值作為總多胺量。

2)多胺染色

如上述所述，於分割之0.25片角層檢測片之角層採取面滴入以DMSO調製之1.64μM之PolyamineRED(Funakoshi股份有限公司)，反應30秒後以蒸餾水中洗淨，風乾後以Olympus BX63螢光顯微鏡、WIG過濾器(激發波長：560nm、螢光波長585nm)觀察而取得影像。

所得之影像係使用ImageJ(NIH)並挑出除去背景部分與角層的重層部分之螢光測定閾值範圍內之像素，計算每1影像之角層之多胺染色平均亮度值，將3視野之平均與分析值進行比較。

(2)結果

將20名之角層之多胺染色平均亮度值及化學分析結果示於下列表4。

[表4]

將根據表4所得之散布圖示於第9圖。

確認相關性時，可觀察到亮度值與總多胺量有相關關係(第9圖)。由該結果可知，角層多胺染色亮度值可取代多胺化學性分析值。亦即，可將角層中的多胺進行化學性分析，藉此可評估皮膚紋理狀態。

Claims (10)

1. 一種評估皮膚狀態的方法，係測定存在於角層試料之多胺量。
2. 一種角層試料之調製方法，係包含將存在於角層試料中之多胺染色之步驟。
3. 如請求項2所述之角層試料之調製方法，其中，染色步驟係將角層試料浸漬於含有5(6)-羧基四甲基玫瑰紅甘胺酸炔丙酯(Carboxytetramethylrhodamine Glycine propargyl ester)之溶液之步驟。
4. 如請求項2或3所述之角層試料之調製方法，其中，角層試料係以膠帶剝除法採取者。
5. 一種評估皮膚狀態的方法，係將經5(6)-羧基四甲基玫瑰紅甘胺酸炔丙酯做螢光標識之角層試料進行螢光顯微鏡觀察，藉此測定經選擇性地螢光標識的皮膚角層之多胺之螢光量。
6. 如請求項5所述之評估皮膚狀態的方法，其中，多胺量之測定為藉由影像解析手法進行之螢光亮度測定。
7. 如請求項5或6所述之評估皮膚狀態的方法，其中，皮膚狀態之評估中，表示皮膚表面形態之物性值係選自紋理粗度、紋理形狀、紋理流動之困難度、紋理計分中之任一種以上之項目。
8. 如請求項5或6所述之評估皮膚狀態的方法，其中，皮膚狀態之評估為以目視所進行之紋理計分。
9. 一種評估皮膚狀態的方法，係將從角層試料的水萃取物藉由化學性分析方法檢測出之多胺量作為指標。
10. 如請求項1及5至9中任一項所述之評估皮膚狀態的方法，其中，角層試料係以膠帶剝除法採取者。

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