JP2024503803A - ムチン１に特異的なポリペプチドおよびその利用 - Google Patents

Abstract

ムチン１（Ｍｕｃｉｎ１）に結合するポリペプチド、これをコードする単離されたポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含むベクター、および前記ベクターを含む細胞に関する。また、ムチン１に結合するポリペプチドを含むキメラ抗原受容体、前記キメラ抗原受容体をコードする単離されたポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含むベクター、前記キメラ抗原受容体を発現する免疫細胞、およびこれらを含む癌の治療用組成物および治療方法に関する。

Description

[関連出願の相互参照]
本出願は、２０２０年１２月２４日付の韓国特許出願第１０－２０２０－０１８３７６８号および２０２１年１０月１５日付の韓国特許出願第１０－２０２１－０１３７７５７号に基づく優先権の利益を主張し、当該韓国特許出願の文献に開示された全ての内容は本明細書の一部として含まれる。

ムチン１（Ｍｕｃｉｎ１）に結合するポリペプチド、これをコードする単離されたポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含むベクター、および前記ベクターを含む細胞に関する。また、ムチン１に結合するポリペプチドを含むキメラ抗原受容体、前記キメラ抗原受容体をコードする単離されたポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含むベクター、前記キメラ抗原受容体を発現する免疫細胞、およびこれらを含む癌治療用組成物および治療方法に関する。

ムチン１（Ｍｕｃｉｎ１）は、体内のほぼすべての器官の上皮細胞に存在する膜結合型糖タンパク質である。ムチン１は、Ｎ－末端サブユニット（ＭＵＣ１－Ｎ）およびＣ－末端サブユニット（ＭＵＣ１－Ｃ）の非共有相互作用から形成されるヘテロ二量体タンパク質である。ＭＵＣ１－Ｃは、細胞外ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞質尾部を形成し、ＭＵＣ１－Ｎは、糖化部位を含む、２０個のアミノ酸（ＨＧＶＴＳＡＰＤＴＲＰＡＰＧＳＴＡＰＰＡ）を含有するタンデムリピート（ｔａｎｄｅｍ ｒｅｐｅａｔｓ、ＴＲｓ）を反復して含み、ＭＵＣ１－Ｃの細胞外ドメインと相互作用してＭＵＣ１－Ｃと継続して連結されている。

正常上皮細胞においてムチン１は低い水準で発現し、上皮の頂端膜（ａｐｉｃａｌ ｍｅｍｂｒａｎｅｓ）に限定的に発現するが、乳癌、肺癌、大腸癌、皮膚癌、甲状腺癌、胃癌、膵臓癌、腎臓癌、卵巣癌および子宮頸癌などの固形癌細胞で過剰に発現し、細胞表面全体にランダムに発現し、異常に糖化されることが知られている。したがって、ムチン１は、癌病巣を検出するための標的分子として、または癌を治療するための標的分子として有用であることが知られている。

そこで、現在、癌治療用の抗－ＭＵＣ１抗体が多数報告されているが、抗体を用いた抗癌療法の場合、抗体が特異的に認識する抗原を有する癌細胞にのみ適用可能であり、効果持続期間が短く、長期投与時に耐性が発生したりすることもある。したがって、体内免疫体系を活性化して多様な癌において持続的に強力な抗癌効果を発揮できる技術の開発が要求される。

一実施形態は、ムチン１（Ｍｕｃｉｎ１）に結合するポリペプチドを提供する。

他の実施形態は、前記ムチン１－結合ポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドを提供する。

他の実施形態は、前記ムチン１－結合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。

他の実施形態は、前記ムチン１－結合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むベクターを含む細胞を提供する。

他の実施形態は、前記ムチン１－結合ポリペプチドを含むキメラ抗原受容体を提供する。

他の実施形態は、前記キメラ抗原受容体をコードする単離されたポリヌクレオチドを提供する。

他の実施形態は、前記キメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。

他の実施形態は、前記キメラ抗原受容体を発現するか、キメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチドを含む、免疫細胞を提供する。

他の実施形態は、前記ムチン１－結合ポリペプチド；前記ムチン１－結合ポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド；前記ムチン１－結合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むベクター；前記ムチン１－結合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む細胞；前記ムチン１－結合ポリペプチドを含むキメラ抗原受容体；前記キメラ抗原受容体をコードする単離されたポリヌクレオチド；前記キメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチドを含むベクター；または前記キメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチドを含むか、前記キメラ抗原受容体を発現する免疫細胞を含む、癌治療用組成物を提供する。

ｄｏｎｏｒ０３およびｄｏｎｏｒ０４由来のＴ細胞を用いて作製した本発明の一実施形態によるＣＡＲ－Ｔ細胞の、ＭＵＣ１－陽性腫瘍細胞（Ｔ４７Ｄ、ＨＥＫ２９３Ｔ－Ｖ１）に対する反応性を評価したサイトカイン分泌解析の結果である。 ｄｏｎｏｒ０６由来のＴ細胞を用いて作製した本発明の一実施形態によるＣＡＲ－Ｔ細胞の、ＭＵＣ１－陽性腫瘍細胞（Ｔ４７Ｄ）に対する反応性を評価したサイトカイン分泌解析の結果である。 ｄｏｎｏｒ０６由来のＴ細胞を用いて作製した本発明の一実施形態によるＣＡＲ－Ｔ細胞の、ムチン１非発現細胞（ＨＥＫ２９３Ｔ）に対する反応性を評価したサイトカイン分泌解析の結果である。 ｄｏｎｏｒ０３由来のＴ細胞を用いて作製した本発明の一実施形態によるＣＡＲ－Ｔ細胞の、ヒト乳癌細胞株のＴ４７Ｄに対する細胞毒性実験の結果である。 ｄｏｎｏｒ０４由来のＴ細胞を用いて作製したＣＡＲ－Ｔ細胞の、ヒト乳癌細胞株のＴ４７Ｄに対する細胞毒性実験の結果である。 ｄｏｎｏｒ０３由来のＴ細胞を用いて作製したＣＡＲ－Ｔ細胞の、ヒト胚腎細胞のＨＥＫ２９３Ｔに対する細胞毒性実験の結果である。 ｄｏｎｏｒ０４由来のＴ細胞を用いて作製したＣＡＲ－Ｔ細胞の、ヒト胚腎細胞のＨＥＫ２９３Ｔに対する細胞毒性実験の結果である。 ｄｏｎｏｒ０４由来のＴ細胞を用いて作製したＣＡＲ－Ｔ細胞の、ヒト胚腎細胞株にＭＵＣ１－Ｃを外在的に発現させたＨＥＫ２９３Ｔ－Ｖ１に対する細胞毒性実験の結果である。 ｄｏｎｏｒ０５由来のＴ細胞を用いて作製した本発明の一実施形態によるＣＡＲ－Ｔ細胞の、ヒト乳癌細胞株のＴ４７Ｄに対する細胞毒性実験の結果である。 ｄｏｎｏｒ０６由来のＴ細胞を用いて作製した本発明の一実施形態によるＣＡＲ－Ｔ細胞の、ヒト乳癌細胞株のＴ４７Ｄに対する細胞毒性実験の結果である。 ｄｏｎｏｒ０７由来のＴ細胞を用いて作製した本発明の一実施形態によるＣＡＲ－Ｔ細胞の、ヒト胚腎細胞のＨＥＫ２９３Ｔに対する細胞毒性実験の結果である。 ｄｏｎｏｒ０８由来のＴ細胞を用いて作製した本発明の一実施形態によるＣＡＲ－Ｔ細胞の、ヒト乳癌細胞株のＨＣＣ７０に対する細胞毒性実験の結果である。＃２：２４４７＿２Ｈ０８；＃３：２４４７＿３Ａ０１；＃４：２４４７＿３Ａ０８；＃５：２４４７＿３Ａ０９；＃６：２４４７＿３Ａ１２；＃７：２４４７＿３Ｂ０７；＃８：２４４７＿３Ｃ０８；＃９：２４４７＿３Ｈ０２；＃１０：２４４７＿３Ｈ０８。 エフェクター細胞（Ｅ）と標的細胞（Ｔ）の比率０．３：１における本発明の一実施形態によるＣＡＲ－Ｔ細胞の、ヒト乳癌細胞株（ＨＣＣ７０）とヒト正常乳房細胞株（ＭＣＦ１０Ａ）に対する差別的な細胞毒性の結果を示す。＃２：２４４７＿２Ｈ０８。 エフェクター細胞（Ｅ）と標的細胞（Ｔ）の比率０．１：１における本発明の一実施形態によるＣＡＲ－Ｔ細胞の、ヒト乳癌細胞株（ＨＣＣ７０）とヒト正常乳房細胞株（ＭＣＦ１０Ａ）に対する差別的な細胞毒性の結果を示す。＃２：２４４７＿２Ｈ０８。 ＰＡＮＣ１－ｖ１細胞（ＭＵＣ１を発現させたＰＡＮＣ１膵臓癌細胞）を注入した癌動物モデルにおいて、本発明の一実施形態によるＣＡＲ－Ｔ細胞を投与した後、腫瘍成長抑制を確認した結果である。 ＰＡＮＣ１－ｖ１細胞（ＭＵＣ１を発現させたＰＡＮＣ１膵臓癌細胞）を注入した癌動物モデルにおいて、本発明の一実施形態によるＣＡＲ－Ｔ細胞を投与した後、１４日および２８日後に血液内のヒト免疫細胞（ｈＣＤ４５＋ ｃｅｌｌ）の数を確認した結果である。 ＰＡＮＣ１－ｖ１細胞（ＭＵＣ１を発現させたＰＡＮＣ１膵臓癌細胞）を注入した癌動物モデルにおいて、本発明の一実施形態によるＣＡＲ－Ｔ細胞を２つの用量で投与した後、腫瘍成長抑制を確認した結果である。 ＨＣＣ１９５４細胞（自然的にＭＵＣ１を発現する乳癌細胞）を注入した癌動物モデルにおいて、本発明の一実施形態によるＣＡＲ－Ｔ細胞を投与した後、腫瘍成長抑制を確認した結果である。 ＨＣＣ１９５４細胞（自然的にＭＵＣ１を発現する乳癌細胞）を注入した癌動物モデルにおいて、本発明の一実施形態によるＣＡＲ－Ｔ細胞を投与した後、一定の時間間隔で血液内のヒト免疫細胞（ｈＣＤ４５＋ ｃｅｌｌ）の数を確認した結果である。

本発明の一側面により、ムチン１（Ｍｕｃｉｎ１）に結合するポリペプチドが提供される。好ましい一例として、本発明におけるムチン１に結合するポリペプチドは、抗体またはその抗原結合断片であってもよい。

一実施形態として、以下からなる群より選択される重鎖可変（ＶＨ）領域および軽鎖可変（ＶＬ）領域の対を含む、ムチン１に結合するポリペプチドが提供される：
－それぞれ配列番号１、配列番号２および配列番号３のアミノ酸配列で表される相補性決定領域（ＣＤＲ）１、２および３を含むＶＨ領域、およびそれぞれ配列番号４、配列番号５および配列番号６のアミノ酸配列で表されるＣＤＲ１、２および３を含むＶＬ領域；
－それぞれ配列番号１１、配列番号１２および配列番号１３のアミノ酸配列で表されるＣＤＲ１、２および３を含むＶＨ領域、およびそれぞれ配列番号１４、配列番号１５および配列番号１６のアミノ酸配列で表されるＣＤＲ１、２および３を含むＶＬ領域；
－それぞれ配列番号２１、配列番号２２および配列番号２３のアミノ酸配列で表されるＣＤＲ１、２および３を含むＶＨ領域、およびそれぞれ配列番号２４、配列番号２５および配列番号２６のアミノ酸配列で表されるＣＤＲ１、２および３を含むＶＬ領域；
－それぞれ配列番号３１、配列番号３２および配列番号３３のアミノ酸配列で表されるＣＤＲ１、２および３を含むＶＨ領域、およびそれぞれ配列番号４４、配列番号４５および配列番号４６のアミノ酸配列で表されるＣＤＲ１、２および３を含むＶＬ領域；
－それぞれ配列番号５１、配列番号５２および配列番号５３のアミノ酸配列で表されるＣＤＲ１、２および３を含むＶＨ領域、およびそれぞれ配列番号５４、配列番号５５および配列番号５６のアミノ酸配列で表されるＣＤＲ１、２および３を含むＶＬ領域；
－それぞれ配列番号６１、配列番号６２および配列番号６３のアミノ酸配列で表されるＣＤＲ１、２および３を含むＶＨ領域、およびそれぞれ配列番号６４、配列番号６５および配列番号６６のアミノ酸配列で表されるＣＤＲ１、２および３を含むＶＬ領域；
－それぞれ配列番号７１、配列番号７２および配列番号７３のアミノ酸配列で表されるＣＤＲ１、２および３を含むＶＨ領域、およびそれぞれ配列番号７４、配列番号７５および配列番号７６のアミノ酸配列で表されるＣＤＲ１、２および３を含むＶＬ領域；
－それぞれ配列番号８１、配列番号８２および配列番号８３のアミノ酸配列で表されるＣＤＲ１、２および３を含むＶＨ領域、およびそれぞれ配列番号８４、配列番号８５および配列番号８６のアミノ酸配列で表されるＣＤＲ１、２および３を含むＶＬ領域；および
－それぞれ配列番号９１、配列番号９２および配列番号９３のアミノ酸配列で表されるＣＤＲ１、２および３を含むＶＨ領域、およびそれぞれ配列番号９４、配列番号９５および配列番号９６のアミノ酸配列で表されるＣＤＲ１、２および３を含むＶＬ領域。

他の実施形態として、以下からなる群より選択される重鎖可変（ＶＨ）領域および軽鎖可変（ＶＬ）領域の対を含む、ムチン１に結合するポリペプチドが提供される：
－配列番号７のアミノ酸配列を含むＶＨ領域および配列番号８のアミノ酸配列を含むＶＬ領域；
－配列番号１７のアミノ酸配列を含むＶＨ領域および配列番号１８のアミノ酸配列を含むＶＬ領域；
－配列番号２７のアミノ酸配列を含むＶＨ領域および配列番号２８のアミノ酸配列を含むＶＬ領域；
－配列番号３７のアミノ酸配列を含むＶＨ領域および配列番号３８のアミノ酸配列を含むＶＬ領域；
－配列番号４７のアミノ酸配列を含むＶＨ領域および配列番号４８のアミノ酸配列を含むＶＬ領域；
－配列番号５７のアミノ酸配列を含むＶＨ領域および配列番号５８のアミノ酸配列を含むＶＬ領域；
－配列番号６７のアミノ酸配列を含むＶＨ領域および配列番号６８のアミノ酸配列を含むＶＬ領域；
－配列番号７７のアミノ酸配列を含むＶＨ領域および配列番号７８のアミノ酸配列を含むＶＬ領域；
－配列番号８７のアミノ酸配列を含むＶＨ領域および配列番号８８のアミノ酸配列を含むＶＬ領域；および
－配列番号９７のアミノ酸配列を含むＶＨ領域および配列番号９８のアミノ酸配列を含むＶＬ領域。

本発明において、用語「抗体」は、特定の抗原に特異的に結合するタンパク質を総称するもので最も広い意味で使用され、免疫系内で抗原の刺激によって作られるタンパク質またはこれを化学的合成または組換え的に製造したタンパク質であってもよいし、その種類は特に制限されない。具体的には、所望の生物学的活性を示す限り、モノクローナル抗体（全長モノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例、二重特異性抗体）、合成抗体（または抗体模倣体ともいう）、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、または抗体融合体タンパク質（または抗体接合体ともいう）を包括する。

完全な抗体（例えば、ＩｇＧ型）は、２個の全長（ｆｕｌｌ ｌｅｎｇｔｈ）軽鎖および２個の全長重鎖を有する構造であり、それぞれの軽鎖は、重鎖とジスルフィド結合で連結されている。抗体の定常領域は、重鎖定常領域と軽鎖定常領域とに分けられ、重鎖定常領域は、ガンマ（γ）、ミュー（μ）、アルファ（α）、デルタ（δ）またはイプシロン（ε）タイプを有し、サブクラスとして、ガンマ１（γ１）、ガンマ２（γ２）、ガンマ３（γ３）、ガンマ４（γ４）、アルファ１（α１）またはアルファ２（α２）を有する。軽鎖の定常領域は、カッパ（κ）およびラムダ（λ）タイプを有する。

用語「抗原結合断片」は、全長鎖に存在するアミノ酸の少なくとも一部が欠如したが、依然として抗原に特異的に結合できる抗体の部分をいう。このような断片は標的抗原に結合し、与えられたエピトープへの結合に対して無傷抗体を含む他の抗原結合分子と競争できるという点で生物学的に活性である。抗原結合断片は、無傷抗体のＦｃ領域の定常重鎖ドメイン（つまり、抗体アイソタイプに応じて、つまり、ＣＨ２、ＣＨ３およびＣＨ４）を含まなくてもよい。抗原結合断片の例としては、ｓｃＦｖ（ｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ）（例えば、ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）_２など）、Ｆａｂ（ｆｒａｇｍｅｎｔ ａｎｔｉｇｅｎ ｂｉｎｄｉｎｇ）（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２など）、ドメイン抗体、ペプチボディ、ミニボディ、イントラボディ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディまたはおよび単鎖抗体などを含むが、これに制限されない。また、抗原結合断片は、ｓｃＦｖ、またはｓｃＦｖが免疫グロブリン（例えば、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）、ＩｇＭなど）のＦｃ部位と融合した融合ポリペプチド（ｓｃＦｖ－Ｆｃ）または軽鎖の定常領域（例えば、カッパまたはラムダ）と融合した融合ポリペプチド（ｓｃＦｖ－Ｃｋ（カッパ定常領域）またはｓｃＦｖ－Ｃλ（ラムダ定常領域））であってもよいが、これに制限されない。

用語、「重鎖（ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ）」は、抗原に特異性を付与するために十分な可変領域配列を有するアミノ酸配列を含む可変領域ドメインＶ_Ｈおよび３個の定常領域ドメインＣ_Ｈ１、Ｃ_Ｈ２およびＣ_Ｈ３とヒンジ（ｈｉｎｇｅ）を含む全長重鎖およびその断片をすべて含む意味で解釈される。また、用語「軽鎖（ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ）」は、抗原に特異性を付与するための十分な可変領域配列を有するアミノ酸配列を含む可変領域ドメインＶ_Ｌおよび定常領域ドメインＣ_Ｌを含む全長軽鎖およびその断片をすべて含む意味で解釈される。

用語「相補性決定領域（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ－ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎｓ、ＣＤＲ）」は、抗体の可変領域中において抗原との結合特異性または結合親和度を付与する部位をいう。一般に、重鎖可変領域に３個のＣＤＲ（ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、ＣＤＲ－Ｈ３）が存在し、軽鎖可変領域に３個のＣＤＲ（ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、ＣＤＲ－Ｌ３）が存在する。前記ＣＤＲは、抗体またはその断片が抗原またはエピトープに結合する上で主な接触残基を提供することができる。「フレームワーク領域（Ｆｒａｍｅｗｏｒｋ ｒｅｇｉｏｎ、ＦＲ）」は、重鎖および軽鎖の可変領域の非－ＣＤＲ部分をいい、一般に、重鎖可変領域に４個のＦＲ（ＦＲ－Ｈ１、ＦＲ－Ｈ２、ＦＲ－Ｈ３およびＦＲ－Ｈ４）が存在し、軽鎖可変領域には４個のＦＲ（ＦＲ－Ｌ１、ＦＲ－Ｌ２、ＦＲ－Ｌ３およびＦＲ－Ｌ４）が存在する。与えられたＣＤＲまたはＦＲの正確なアミノ酸配列の境界は、カバット（Ｋａｂａｔ）ナンバリング体系、コチア（Ｃｈｏｔｈｉａ）ナンバリング体系、コンタクト（Ｃｏｎｔａｃｔ）ナンバリング体系、ＩＭＧＴナンバリング体系、Ａｈｏナンバリング体系、ＡｂＭナンバリング体系など多数のよく知られた体系のいずれか１つを用いて容易に決定可能である。

用語「可変領域（ｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎ）」は、抗体を抗原に結合させるのに関与する抗体重鎖または軽鎖のドメインを称する。重鎖可変（ＶＨ）領域および軽鎖可変（ＶＬ）領域は、一般に類似の構造を有し、それぞれのドメインは、４個の保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）および３個のＣＤＲを含む。

特定の実施形態において、本発明のムチン１－結合ポリペプチドは、ｓｃＦｖ（ｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ）、ペプチボディ、Ｆａｂ（ｆｒａｇｍｅｎｔ ａｎｔｉｇｅｎ ｂｉｎｄｉｎｇ）、モノクローナル抗体、二重特異性抗体、ミニボディ、ドメイン抗体、合成抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、または抗体融合体タンパク質であってもよいが、これらに制限されない。

好ましい実施形態において、本発明のムチン１－結合ポリペプチドは、ｓｃＦｖ（ｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ）であってもよい。

用語、「ｓｃＦｖ（ｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ）」は、抗体の重鎖可変（ＶＨ）領域および軽鎖可変（ＶＬ）領域が共有結合で連結された単鎖抗体断片をいう。ＶＨ領域およびＶＬ領域は、直接連結されるか、リンカーによって連結される。

リンカーは、水溶性および／または可撓性リンカー（ｆｌｅｘｉｂｌｅ ｌｉｎｋｅｒ）であってもよい。例えば、リンカーによってＶＨのＮ－末端とＶＬのＣ－末端とが連結されるか、ＶＨのＣ－末端とＶＬのＮ－末端とが連結される。リンカーは、ペプチドリンカーであってもよいし、例えば、１０～３０のアミノ酸長、１０～２５のアミノ酸長、１０～２０のアミノ酸長、１０～１５のアミノ酸長、１５～３０のアミノ酸長、１５～２５のアミノ酸長、１５～２０のアミノ酸長、具体的には、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０のアミノ酸長であってもよいが、これらに制限されない。

リンカーに適したアミノ酸配列は、当業界にて公知である。例えば、前記リンカーは、柔軟性のために、グリシン（Ｇｌｙ）が豊富であり、溶解度のために、セリン（Ｓｅｒ）、アスパラギン（Ａｓｎ）、アラニン（Ａｌａ）またはスレオニン（Ｔｈｒ）を含むことができる。リンカーは、Ｇｌｙ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、ＴｈｒおよびＡｌａからなる群より選択された１種以上を計１～１００個、２～５０個、または５～２５個を含んでなるものであってもよい。非制限的な例としては、リンカーのアミノ酸配列は、ＧＧＧＳまたはＧＧＧＧＳが多様な反復回数、例えば、２、３、４および５回の反復を有する配列であってもよい。例えば、リンカーは、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ、またはＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＡＳであってもよいが、これらに制限されない。

ｓｃＦｖは、定常領域がなく、リンカーが導入されるにもかかわらず、親抗体の抗原特異性を維持する。ｓｃＦｖは、ＶＨ領域およびＶＬ領域をコードするポリヌクレオチドから発現できるが、これに制限されない。

好ましい実施形態として、配列番号９、配列番号１９、配列番号２９、配列番号３９、配列番号４９、配列番号５９、配列番号６９、配列番号７９、配列番号８９および配列番号９９からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むｓｃＦｖポリペプチドが提供される。

本発明において抗体または抗原結合断片は、これと同等の活性を保有する変異体、例えば、本発明に記載されたアミノ酸配列と約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％または約９９％以上の同一性を有し、かつ、同等の生物学的活性を保有した変異体も本発明の範囲に含まれる。

本発明の他の側面により、前記ムチン１－結合ポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドが提供される。

好ましい実施形態として、前記ポリヌクレオチドは、配列番号１０、配列番号２０、配列番号３０、配列番号４０、配列番号５０、配列番号６０、配列番号７０、配列番号８０、配列番号９０および配列番号１００からなる群より選択される核酸配列を含むことができる。また、本発明は、前記配列と約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％または約９９％以上の同一性を有し、かつ、同等の活性を有するポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドを含むことができる。一部の実施形態において、ポリヌクレオチドは、ヒトでの発現のためのコドン最適化が可能である。

本発明の他の側面により、前記ムチン１－結合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むベクターが提供される。

ベクターにおいて、前記ポリヌクレオチドは、プロモーターに作動可能に連結される。用語「作動可能に連結された（ｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙ ｌｉｎｋｅｄ）」は、ヌクレオチド発現調節配列（例えば、プロモーター配列）と他のヌクレオチド配列との間の機能的な結合を意味する。前記調節配列は、作動可能に連結されることによって、他のヌクレオチド配列の転写および／または翻訳を調節することができる。

ベクターは、典型的にクローニングのためのベクターまたは発現のためのベクターとして構築される。前記発現用ベクターは、当業界にて植物、動物または微生物で外来のタンパク質を発現するために使用される通常のものを使用することができる。前記ベクターは、当業界にて公知の多様な方法により構築可能である。

ベクターは、原核細胞または真核細胞を宿主として構築される。例えば、使用されるベクターが発現ベクターであり、原核細胞を宿主とする場合には、転写を進行させることができる強力なプロモーター（例えば、ｐＬ^λプロモーター、ＣＭＶ ｐｒｏｍｏｔｅｒ、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、Ｔ７プロモーターなど）、翻訳の開始のためのリボソーム結合サイトおよび転写／翻訳終止配列を含むことが一般的である。真核細胞を宿主とする場合には、ベクターに含まれる真核細胞で作動する複製起点は、ｆ１複製起点、ＳＶ４０複製起点、ｐＭＢ１複製起点、アデノ複製起点、ＡＡＶ複製起点およびＢＢＶ複製起点などを含むが、これらに限定されるものではない。また、哺乳動物細胞のゲノムに由来するプロモーター（例えば、メタロチオニンプロモーター）または哺乳動物ウイルスに由来するプロモーター（例えば、アデノウイルス後期プロモーター、ワクチニアウイルス７．５Ｋプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、サイトメガロウイルスプロモーターおよびＨＳＶのｔｋプロモーター）が用いられ、転写終結配列としてポリアデニル化配列を一般に有することができる。また、必要に応じて、エンハンサー配列、５’側および３’側の非翻訳領域、分泌シグナル配列、スプライシング接合部、選択マーカー（例えば、抗生剤耐性遺伝子）などをさらに含むことができる。

本発明の他の側面により、前記ムチン１－結合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むベクターを含む細胞が提供される。

前記細胞は、前記ベクターを適切な宿主細胞に導入させることによって得られたものであってもよい。ベクターを含有する宿主細胞は、ベクターに含有されたポリヌクレオチドのクローニングまたは発現に有用であり得る。前記宿主細胞は、前記ベクターを安定かつ連続的にクローニングまたは発現させる細胞であって、当業界にて公知のいかなる宿主細胞も利用可能である。例えば、原核細胞としては、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１、Ｅ．ｃｏｌｉ ＲＲ１、Ｅ．ｃｏｌｉ ＬＥ３９２、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｂ、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｘ １７７６、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０、バチルスサブチリス、バチルスチューリンゲンシスのようなバチルス属菌株、そしてサルモネラティピムリウム、セラチアマルセッセンスおよび多様なシュードモナス種のような腸内菌と菌株などがあり、真核細胞に形質転換させる場合には、宿主細胞として、酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙ ｃｅｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、昆虫細胞、植物細胞および動物細胞、例えば、Ｓｐ２／０、ＣＨＯ（Ｃｈｉｎｅｓｅ ｈａｍｓｔｅｒ ｏｖａｒｙ）Ｋ１、ＣＨＯ ＤＧ４４、ＰＥＲ．Ｃ６、Ｗ１３８、ＢＨＫ、ＣＯＳ－７、２９３、ＨｅｐＧ２、Ｈｕｈ７、３Ｔ３、ＲＩＮ、ＭＤＣＫ細胞株などが用いられるが、これらに限定されるものではない。

前記ポリヌクレオチドまたはこれを含むベクターの宿主細胞内への送達（導入）は、当業界にて広く知られた送達方法を使用することができる。前記送達方法は、例えば、宿主細胞が原核細胞の場合、ＣａＣｌ_２方法または電気穿孔方法などを用いることができ、宿主細胞が真核細胞の場合には、微細注入法、カルシウムホスフェート沈殿法、電気穿孔法、リポソーム－媒介形質感染法および遺伝子ボンバードメントなどを使用することができるが、これらに限定されない。

前記形質転換された宿主細胞を選別する方法は、選択マーカーによって発現する表現型を用いて、当業界にて広く知られた方法により容易に実施できる。例えば、前記選択マーカーが特定の抗生剤耐性遺伝子の場合には、前記抗生剤が含有された培地で形質転換体を培養することによって、形質転換体を容易に選別することができる。形質転換された宿主細胞は、ポリペプチドが発現または分泌されるのに十分な期間で培養可能であり、通常のタンパク質で使用されている分離および精製方法、例えば、塩析、溶媒沈殿法などの溶解度を用いる方法、透析、限外ろ過、ゲルろ過、ドデシル硫酸ナトリウム－ポリアクリルアミドゲル電気泳動など分子量の差を用いる方法、イオン交換クロマトグラフィーやヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーなどの荷電を用いる方法、親和性クロマトグラフィーなどの特異的な親和性を用いる方法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を用いる方法、等電点電気泳動などの等電点の差を用いる方法などによってポリペプチドを分離および精製することができる。

本発明の他の側面により、前記ムチン１－結合ポリペプチドを含むキメラ抗原受容体（ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ＣＡＲ）が提供される。前記ムチン１－結合ポリペプチドは、他のＣＡＲ成分と共に単鎖の一部として発現するように操作できるため、キメラ抗原受容体への使用に適する。

キメラ抗原受容体は、典型的にムチン１－結合ポリペプチドを含む細胞外ドメイン（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｄｏｍａｉｎ）；膜貫通ドメイン（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｄｏｍａｉｎ）；細胞内シグナル伝達ドメイン（ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｄｏｍａｉｎまたはＴ ｃｅｌｌ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｄｏｍａｉｎ）を含むことができる。また、前記細胞外ドメインは、前記ポリペプチドと膜貫通ドメインとの間にスペーサー領域（またはヒンジ領域）を追加的に含むことができる。また、キメラ抗原受容体は、１個以上の共刺激ドメイン（ｃｏ－ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ ｄｏｍａｉｎ）をさらに含むことができ、好ましくは、共刺激ドメインが膜貫通ドメインと細胞内シグナル伝達ドメインとの間に位置することができる。

したがって、好ましい一例として、キメラ抗原受容体は、ムチン１－結合ポリペプチドを含む細胞外ドメイン；ヒンジドメイン；膜貫通ドメイン；１個以上の共刺激ドメイン；および細胞内シグナル伝達ドメインを含むことができる。それぞれのドメインは異種であってもよい。つまり、異なるタンパク質鎖に由来する配列から構成される。それぞれのドメインは、短いオリゴ－またはポリペプチドリンカー、例えば、２～１０個のアミノ酸長のリンカーで連結可能である。また、キメラ抗原受容体は、各ドメインが連結された１つのポリペプチド鎖からなる。

細胞外ドメインは、前述したようなムチン１－結合ポリペプチドを含み、これは癌細胞の表面に発現するムチン１を認識する。

細胞外ドメインは、スペーサー領域（またはヒンジ領域）をさらに含むことができる。スペーサー領域は、ムチン１－結合ポリペプチドと膜貫通ドメインとの間に位置することができる。スペーサー領域は、ムチン１－結合ポリペプチドがＣＡＲ－Ｔ細胞の細胞膜と一定の距離をおいてより柔軟に標的抗原を認識できるようにする。スペーサー領域は、典型的にポリペプチドであってもよく、１０個以上のアミノ酸長、例えば、１０～３００個のアミノ酸長、１０～２５０のアミノ酸長、１０～２００のアミノ酸長、１０～１５０のアミノ酸長、１０～１００のアミノ酸長、１０～５０のアミノ酸長を有することができるが、これらに限定されない。

スペーサー領域は、ＣＤ８αまたはＣＤ２８のヒンジ部位、または免疫グロブリン（ＩｇＧ）の定常領域などを例示することができ、これらによるオフ－ターゲット効果を除去するために突然変異を導入することができる。例えば、免疫グロブリンの定常領域は、ＩｇＧヒンジ単独、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインの全部または一部に由来し、例えば、Ｆｃ領域であってもよい。ＩｇＧは、好ましくは、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４であってもよい。一部の実施形態において、スペーサーは、ＩｇＧ２、ＩｇＧ４、および／またはＩｇＧ２およびＩｇＧ４に由来するヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３配列の１つ以上を含有するキメラポリペプチドであってもよい。一部の実施形態において、ヒンジドメインは、配列番号１１２の配列で表されてもよいが、これに限定されない。

膜貫通ドメインは、細胞膜ドメインと細胞膜内部のシグナル伝達ドメインを連結する役割を果たし、天然または合成供給源に由来する。供給源が天然の場合、ドメインは、任意の膜－結合または膜－横断タンパク質に由来する。例えば、膜貫通ドメインは、Ｔ細胞受容体のアルファ、ベータまたはゼータ鎖、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ２８、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ４５、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７またはＣＤ１５４の膜貫通ドメインであってもよいが、これらに限定されない。好ましい一例として、膜貫通ドメインは、ＣＤ２８またはＣＤ８の膜貫通ドメインであってもよいが、これらに限定されない。供給源が合成の場合、合成膜貫通ドメインは、ロイシンおよびバリンなどの疎水性残基を含むことができ、フェニルアラニン、トリプトファンおよびバリンなどを各末端に含むことができるが、これらに限定されない。一部の実施形態において、膜貫通ドメインは、配列番号１１３の配列で表されてもよいが、これに限定されない。

共刺激ドメインは、共刺激シグナルが伝達される部位で、ＣＡＲ－Ｔ細胞が免疫反応を起こし、自己増殖をするようにシグナルを伝達する部位である。これはＣＡＲ－Ｔ細胞の増殖、細胞毒性、持続的な反応、寿命延長などを向上させるために選択的に導入可能である。共刺激ドメインは、ＣＤ２８、ＯＸ－４０（ＣＤ１３４）、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ－１、ＩＣＯＳ、ＬＦＡ－１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ２４７、ＣＤ２７６（Ｂ７－Ｈ３）、ＬＩＧＨＴ、（ＴＮＦＳＦ１４）、ＮＫＧ２Ｃ、Ｉｇアルファ（ＣＤ７９ａ）、ＤＡＰ－１０、Ｆｃガンマ受容体、ＭＨＣクラス１分子、ＴＮＦ受容体タンパク質、イムノグロブリンタンパク質、サイトカイン受容体、インテグリン、ＳＬＡＭ（ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）、活性化ＮＫ細胞受容体、ＢＴＬＡ、トールリガンド受容体、ＩＣＡＭ－１、Ｂ７－Ｈ３、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ－１、ＧＩＴＲ、ＢＡＦＦＲ、ＬＩＧＨＴ、ＨＶＥＭ（ＬＩＧＨＴＲ）、ＫＩＲＤＳ２、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０（ＫＬＲＦ１）、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＣＤ１９、ＣＤ４、ＣＤ８アルファ、ＣＤ８ベータ、ＩＬ－２Ｒベータ、ＩＬ－２Ｒガンマ、ＩＬ－７Ｒアルファ、ＩＴＧＡ４、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ－６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１１ｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１１ａ、ＬＦＡ－１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１１ｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１１ｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ－１、ＩＴＧＢ７、ＮＫＧ２Ｄ、ＴＮＦＲ２、ＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫＬ、ＤＮＡＭ１（ＣＤ２２６）、ＳＬＡＭＦ４（ＣＤ２４４、２Ｂ４）、ＣＤ８４、ＣＤ９６（Ｔａｃｔｉｌｅ）、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴＡＭ、Ｌｙ９（ＣＤ２２９）、ＣＤ１６０（ＢＹ５５）、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００（ＳＥＭＡ４Ｄ）、ＣＤ６９、ＳＬＡＭＦ６（ＮＴＢ－Ａ、Ｌｙ１０８）、ＳＬＡＭＦ１（ＣＤ１５０、ＩＰＯ－３）、ＢＬＡＭＥ（ＳＬＡＭＦ８）、ＳＥＬＰＬＧ（ＣＤ１６２）、ＬＴＢＲ、ＬＡＴ、ＧＡＤＳ、ＳＬＰ－７６、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、またはＣＤ１９ａのシグナル伝達部位から選択された１種以上、例えば、１種、２種または３種であってもよいが、これらに限定されない。好ましい実施形態としては、ＣＤ２８、ＯＸ－４０（ＣＤ１３４）、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＣＤ２７またはＩＣＯＳのシグナル伝達部位から選択された１種以上、例えば、１種、２種または３種であってもよいが、これらに限定されない。一部の実施形態において、共刺激ドメインは、配列番号１１４の配列で表されてもよいが、これに限定されない。

細胞内シグナル伝達ドメインは、ムチン１－結合ポリペプチドに結合した抗原に対してＴ細胞免疫反応を活性化させる部位である。前記シグナル伝達ドメインは、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）の成分であるか、免疫受容体チロシン－ベース活性化モチーフ（ｉｍｍｕｎｏｒｅｃｅｐｔｏｒ ｔｙｒｏｓｉｎｅ－ｂａｓｅｄ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｍｏｔｉｆ、ＩＴＡＭ）として知られたシグナル伝達モチーフを含有することができる。その例として、シグナル伝達ドメインは、ＴＣＲまたはＣＤ３ゼータ、ＦｃＲガンマ、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタおよびＣＤ３イプシロンに由来するシグナル伝達ドメインであってもよいが、これに制限されない。好ましい例としては、ＣＤ３ゼータのシグナル伝達ドメインであってもよいが、これに制限されない。細胞内シグナル伝達ドメインは、細胞外ドメインのムチン１－結合ポリペプチド部位が標的に結合する時、ＣＡＲ－Ｔ細胞を活性化することができる。例えば、ＣＡＲは、Ｔ細胞の機能、例えば、細胞溶解活性またはＴ－ヘルパー活性を刺激し、サイトカインまたは他の因子の分泌を誘導することができる。一部の実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号１１５の配列で表されてもよいが、これに限定されない。

一部の実施形態において、ＣＡＲは、シグナル配列を含む形態で発現できる。また、ＣＡＲは、発現をモニタリングするために有用な追加配列、例えば、２Ａペプチドなどのリボソームスキップ（ｓｋｉｐ）配列または切断型細胞表面ポリペプチド（ｔＨＥＲ２またはｔＥＧＦＲまたは切断されたＰＳＭＡなど）と共に発現できる。

本発明の他の側面により、前記キメラ抗原受容体をコードする単離されたポリヌクレオチドが提供される。一部の実施形態において、ポリヌクレオチドは、ヒトでの発現のためのコドン最適化が可能である。

本発明の他の側面により、前記キメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチドを含むベクターが提供される。ベクターは、遺伝子クローニングのためのベクター、タンパク質の発現のためのベクター、または遺伝子送達のためのベクターとして構築される。クローニングまたは発現のためのベクターの場合、詳しい事項は前述した通りである。

技術分野にて公知の任意のベクターが本発明に適合することができる。例えば、ベクターは、ウイルスベクターであってもよい。例えば、ベクターは、レトロウイルスベクター、ＤＮＡベクター、ムリン白血病ウイルスベクター、ＳＦＧベクター、プラスミド、ＲＮＡベクター、アデノウイルスベクター、バキュロウイルスベクター、エプスタインバールウイルスベクター、パポバウイルスベクター、ワクチニアウイルスベクター、単純ヘルペスウイルスベクター、アデノウイルス関連ベクター（ＡＡＶ）、またはレンチウイルスベクターであってもよいが、これらに限定されない。

本発明の他の側面により、前記ムチン１－結合ポリペプチドを含むキメラ抗原受容体を発現する免疫細胞が提供される。

免疫細胞は、Ｔ細胞、腫瘍浸潤リンパ球（Ｔｕｍｏｒ Ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇ Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ、ＴＩＬ）、ＮＫ（Ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ）細胞、ＴＣＲ－発現細胞、樹状細胞、またはＮＫ－Ｔ細胞を含むが、これに制限されない。また、免疫細胞は、ヒト誘導万能幹細胞（ｉＰＳＣ）に由来するものであってもよい。免疫細胞は、公知の任意の供給源に由来する。例えば、免疫細胞は、造血幹細胞集団から試験管内分化するか、患者から得られる。免疫細胞は、例えば、末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染部位からの組織、腹水、胸膜滲出、脾臓組織、および腫瘍から得られる。また、免疫細胞は、関連技術分野にて入手可能な１種以上の免疫細胞株に由来する。

免疫細胞は、自己（ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ）または同種（ａｌｌｏｇｅｎｉｃ）であってもよい。自己は、治療対象患者に由来するものをいう。同種は、治療対象患者と同じ種の他の個体に由来するものをいう。

また、免疫細胞は、ヒト誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）に由来するものであってもよい。ｉＰＳＣに由来する免疫細胞は、自己または同種免疫細胞に比べて自己増殖が可能で大量増殖が容易であり、すべての人に適用可能な汎用的な細胞治療剤の作製が可能であり、均質な生産とコスト節減が可能であるという利点がある。

免疫細胞は、微細注入、電気穿孔、超音波穿孔、バイオリスティック（例えば、遺伝子銃）、脂質形質感染、重合体形質感染、カルシウムホスフェート沈殿、原形質体融合、リポソーム－媒介形質感染、ナノ粒子またはポリフレックスなどの方法を用いてベクターによって形質感染または形質導入できるが、これらに限定されない。

本発明の他の側面により、前記ムチン１－結合ポリペプチド；前記ムチン１－結合ポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド；前記ムチン１－結合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むベクター；前記ムチン１－結合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む細胞；前記ムチン１－結合ポリペプチドを含むキメラ抗原受容体；前記キメラ抗原受容体をコードする単離されたポリヌクレオチド；前記キメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチドを含むベクター；または前記キメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチドを含むか、前記キメラ抗原受容体を発現する免疫細胞を含む、癌の予防または治療用組成物が提供される。

本発明の他の側面により、前記ムチン１－結合ポリペプチド；前記ムチン１－結合ポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド；前記ムチン１－結合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むベクター；前記ムチン１－結合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む細胞；前記ムチン１－結合ポリペプチドを含むキメラ抗原受容体；前記キメラ抗原受容体をコードする単離されたポリヌクレオチド；前記キメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチドを含むベクター；または前記キメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチドを含むか、前記キメラ抗原受容体を発現する免疫細胞の有効量を癌の予防または治療を必要とする患者に投与する段階を含む癌の予防および／または治療方法が提供される。

本発明の他の側面により、前記ムチン１－結合ポリペプチドを含むキメラ抗原受容体を含むＴ細胞を含む、癌の予防または治療用組成物が提供される。

本発明の他の側面により、前記ムチン１－結合ポリペプチドを含むキメラ抗原受容体を含むＴ細胞の有効量を癌の予防または治療を必要とする患者に投与する段階を含む癌の予防および／または治療方法が提供される。

例えば、癌は、固形癌または血液癌であってもよく、非制限的な例としては、乳癌、肺癌、前立腺癌、卵巣癌、脳癌、肝癌、子宮頸癌、子宮内膜癌、子宮癌、結腸癌、大腸癌、結腸直膓癌、直膓癌、腎臓癌、腎芽細胞腫、皮膚癌、経口扁平上皮癌、表皮癌、鼻咽頭岩、頭頸部癌、骨癌、食道癌、膀胱癌、リンパ管癌（例えば、ホジキンリンパ腫または非－ホジキンリンパ腫）、胃癌、膵臓癌、睾丸癌、甲状腺癌、甲状腺小胞癌、黒色腫、骨髄腫、多発性骨髄腫、中皮腫、骨肉腫、骨髄異形成症候群、肝葉起源の腫瘍、軟組織肉腫、脂肪肉腫、胃腸基質肉腫、悪性末梢神経鞘腫瘍（ＭＰＮＳＴ）、ユーイング肉腫、平滑筋肉腫、肝葉軟骨肉腫、リンパ肉腫、線維肉腫、横紋筋肉腫、奇形癌腫、神経芽細胞腫、髄芽腫、神経膠腫、皮膚の陽性腫瘍、または白血病であってもよい。肺癌は、例えば、小細胞肺癌腫（ＳＣＬＣ）または非－小細胞肺癌腫（ＮＳＣＬＣ）であってもよい。白血病は、例えば、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）または慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）であってもよい。

好ましくは、癌は、ＭＵＣ１タンパク質が発現した癌であって、乳癌、皮膚癌、膵臓癌、前立腺癌、肺癌、甲状腺癌、胃癌、卵巣癌、大腸癌、肝癌、胆嚢癌、腎臓癌、子宮頸癌、または膀胱癌であってもよいが、これらに限定されるものではない。前記癌は、原発性癌または転移性癌であってもよい。

治療対象患者は、２次的な抗－過剰増殖療法を受けている患者であってもよい。例えば、２次的な抗－過剰増殖療法は、化学療法、放射線療法、免疫療法、光線療法、冷凍療法、毒素療法、ホルモン療法、または外科手術であってもよい。

本発明のムチン１－結合ポリペプチドを含むキメラ抗原受容体を含むＴ細胞を用いたＣＡＲ－Ｔ抗癌治療は、健常者または治療対象患者の血液からＴ細胞を抽出した後、本発明のムチン１－結合ポリペプチドを含むキメラ抗原受容体を発現するように遺伝的に操作し、操作されたＴ細胞を増幅培養し、培養された操作Ｔ細胞を患者に投与する一連の過程で行われる。

好ましい実施形態として、健常者または治療対象患者の血液からＴ細胞を抽出する段階は、例えば、血液から白血球成分分離採集（ｌｅｕｋａｐｈｅｒｅｓｉｓまたはａｐｈｒｅｓｉｓ）を用いて白血球を分離した後、Ｔ細胞を濃縮する過程を経て、Ｔ細胞を抽出することができる。Ｔ細胞は、ＣＤ４／ＣＤ８構成レベルで特定の抗体ビーズ結合体やマーカーを用いて分離される。代案的に、幹細胞からの分化により安定的に大量のＴ細胞を得ることも可能である。

前記抽出されたＴ細胞が本発明で提供するキメラ抗原受容体を発現するように遺伝的に操作する段階は、例えば、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するようにデザインされた核酸分子をベクター、例えば、ウイルスベクター（レンチウイルスベクターまたはレトロウイルスベクターなど）を用いてＴ細胞に注入することができる。ＣＡＲは、ＤＮＡ形態で導入されてもよく、ＲＮＡ形態で導入された後、逆転写酵素によってＤＮＡに逆転写された後、Ｔ細胞のゲノムに統合されてもよい。また、同種細胞治療剤の場合、移植片対宿主疾患（ＧｖＨＤ）など拒絶反応を起こさないように、ドナーＴ細胞で移植拒絶反応を誘導する遺伝子を除去または矯正する遺伝子操作を追加的に加えることができる。

前記操作されたＴ細胞を増幅培養する段階は、当業界にて公知の培養技術によりＴ細胞を培養、増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）および増幅（ｅｘｐａｎｓｉｏｎ）させることができる。この時、ウイルスの使用に対する安全性とよく作製されたＣＡＲ－Ｔ細胞を選別する技術が要求される。

最後に、操作Ｔ細胞を患者に再び投与する段階は、例えば、注入（ｉｎｆｕｓｉｏｎ）で行われる。好ましい一例として、ＣＡＲ－Ｔ細胞の注入前、患者は、白血球数値を低下させるために、シクロホスファミドまたはフルダラビンなどを用いたリンパ球除去調節化学療法を受けることができる。また、ＣＡＲ－Ｔ細胞の持続性を向上させるために、ＩＬ－２などのサイトカインを共に投与することができる。

患者に投与された操作済みのＴ細胞は、ムチン１を発現する腫瘍細胞に対して免疫反応を媒介することができる。このような免疫反応には、Ｔ細胞の活性化、Ｔ細胞によるＩＬ－２およびＩＦＮ－ガンマなどのサイトカインの分泌、腫瘍抗原を認識するＴ細胞の増殖および拡張、および標的－陽性細胞のＴ細胞－媒介された特異的な死滅（腫瘍除去）を含む。例えば、ＣＡＲ－Ｔ細胞でＣＡＲがムチン１に特異的に結合すれば、Ｔ細胞は、ＣＤ３ゼータの免疫受容体チロシン－ベース活性化モチーフ（ｉｍｍｕｎｏｒｅｃｅｐｔｏｒ ｔｙｒｏｓｉｎｅ－ｂａｓｅｄ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｍｏｔｉｆ、ＩＴＡＭ）のリン酸化により活性化し、その後、Ｔ細胞の増殖、細胞毒性および／またはサイトカイン分泌が誘導される。

このようにＣＡＲ－Ｔ細胞を用いた抗癌療法は、根本的に患者の免疫体系を活性化して持続的な抗癌効果を発揮するため、継続して投与しなくてもよく、患者自身のＴ細胞を用いることによって、患者個人に合わせた治療が可能であるというメリットがある。

本発明の組成物の投与は、疾病状態の発病または進行を阻害したり、中止させたり、遅延させたり、予防する免疫反応を起こしたり、誘導したり促進したりすることができる。

用語「有効量」は、ヒトをはじめとする個体に投与した時、所望の結果を達成するのに十分な量、例えば、癌を治療または予防するのに効果的な量を意味する。有効量は、製剤化方法、投与方式、患者の年齢、体重、性別、疾患の重症度、飲食、投与時間、投与経路、排泄速度および反応感応性のような多様な因子により異なる。投与量または治療用法は、当業者が理解するような、最適な治療反応を提供するように調整することができる。

治療学的有効量を用いた治療用法は、１回投与で構成されるか、または他の例として、一連の適用を含むことができる。治療期の期間は、製剤化方法、投与方式、患者の年齢、体重、性別、疾患の重症度、飲食、投与時間、投与経路、排泄速度および反応感応性のような多様な因子により決定される。また、治療に使用される抗癌組成物の有効投与量は、個別治療用法のコースの間に高くしたり低くしたりすることができると理解されるであろう。投与量に変化が生じることがあり、当該技術分野にて公知の標準診断分析により明確になる。本発明の組成物は、いくつかの側面において、通常の抗癌剤、放射線治療、ホルモン治療、バイオセラピーおよび／または外科的腫瘍切除を用いた治療前に、治療中にまたは治療後に投与することができる。

本発明の組成物は、薬学的に許容される担体、希釈剤、および賦形剤などからなる群より選択された１種以上の添加剤と共に提供可能である。

前記薬学的に許容される担体は、抗体の製剤化に通常用いられるものであって、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アカシアガム、リン酸カルシウム、アルギネート、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微細結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、滑石、ステアリン酸マグネシウム、ミネラルオイルなどからなる群より選択された１種以上であってもよいが、これらに限定されるものではない。前記組成物は、前記成分以外に、薬学的組成物の製造に通常使用される希釈剤、賦形剤、潤滑剤、湿潤剤、甘味剤、香味剤、乳化剤、懸濁剤、保存剤などからなる群より選択された１種以上をさらに含むことができる。

組成物は、経口または非経口投与可能である。非経口投与の場合には、静脈内注入、皮下注入、筋肉注入、腹腔注入、内皮投与、局所投与、鼻内投与、肺内投与および直腸内投与などで投与することができる。経口投与時、タンパク質またはペプチドは消化されるため、経口用組成物は、活性薬剤をコーティングするか、胃での分解から保護されるように剤形化される。また、前記組成物は、活性物質が標的細胞に移動できる任意の装置によって投与可能である。

前記細胞は、標準投与技術、剤形またはデバイスを用いて投与される。組成物の貯蔵および投与のための注射器およびバイアルのような剤形およびデバイスを適切に使用することが可能である。細胞の投与は、自己（ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ）、同種（ａｌｌｏｇｅｎｉｃ）、または異種（ｘｅｎｏｇｅｎｉｃ）であってもよい。末梢血液由来免疫細胞またはその子孫（例えば、生体内、生体外または試験管内由来）は、カテーテル投与、全身注射、局所注射、静脈注射または非経口投与を含む局所注射により投与される。免疫細胞治療剤を投与する時、一般に、これは注射可能な単位投与量形態（溶液、懸濁液、エマルジョン）に剤形化される。一部の実施形態において、細胞集団は、非経口的に投与される。剤形は、静脈内注射、皮下注射、筋肉注射、腹腔注射、内皮投与、局所投与、鼻内投与、肺内投与および直腸内投与を含む。

一部の実施形態において、組成物は、滅菌液体製剤であって、例えば、等張性水溶液、懸濁液、エマルジョン、分散液または粘性組成物で提供され、これは一部の側面において、選択されたｐＨで緩衝される。液体製剤は、一般に、ゲル、他の粘性組成物および固体組成物より製造がより容易である。また、液体組成物は、特に注射によって投与することが便利である。他方、粘性組成物は、特定の組織とのより長い接触期間を提供するために、適切な粘度範囲内で剤形化される。液体または粘性組成物は、例えば、水、食塩水、リン酸緩衝食塩水、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液状ポリエチレングリコール）およびその好適な混合物を含有する溶媒または分散培地である、担体を含むことができる。

滅菌注射用溶液は、好適な担体、希釈剤または滅菌水、生理食塩水、ブドウ糖、デキストロースなどの賦形剤との混和剤などの溶媒に結合分子を統合することによって製造できる。組成物はまた、凍結乾燥できる。組成物は、投与経路および所望の製造経路により湿潤剤、分散剤または乳化剤（例えば、メチルセルロース）、ｐＨ緩衝剤、ゲル化または粘度向上添加剤、防腐剤、香味剤、色素などの補助物質を含有することができる。

抗菌防腐剤、抗酸化剤、キレート化剤および緩衝液を含む組成物の安定性および滅菌性を向上させる多様な添加剤を添加することができる。微生物の作用の予防は、多様な抗菌および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸などによって保障できる。注射用薬学的形態の長期間吸収は、吸収を遅延させる製剤、例えば、アルミニウムモノステアレートおよびゼラチンの使用によってもたらされる。

以下、本発明を実施例によってより具体的に説明する。しかし、これらは本発明を例示したものに過ぎず、本発明の範囲がこれらの実施例によって制限されない。

実施例１．ムチン１に結合するｓｃＦｖの製造
ヒトムチン１（配列番号１１０）をＣＤ４（配列番号１１１）と接合させて組換え抗原を用意し、ｓｃＦｖライブラリーから前記抗原に特異的なｓｃＦｖを分泌するクローンをスクリーニングして、ムチン１に特異的に結合するｓｃＦｖ１０種を選別した。選別されたｓｃＦｖ１０種と、後の実験に使用された陽性対照群ｓｃＦｖ Ｇ０３（ＷＯ２０１８／１７４５４４の表６のＧ３抗体のアミノ酸配列を用いて作った陽性対照群である）の配列情報を表３に示した。

前記ｓｃＦｖを含むｓｃＦｖ－Ｆｃ抗体のムチン１抗原に対する親和力をＢｉａｃｏｒｅ Ｔ２００（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて測定した。Ｓｅｒｉｅｓ Ｓ Ｓｅｎｓｏｒ Ｃｈｉｐ ＣＭ５（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｃａｔ．Ｎｏ．ＢＲ－１００５－３０）上に、Ａｍｉｎｅ Ｃｏｕｐｌｉｎｇ Ｋｉｔ（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｃａｔ．Ｎｏ．ＢＲ－１０００－５０）を用いてａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ＩｇＧ（Ｆｃ）抗体（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｃａｔ．Ｎｏ．ＢＲ－１００８－３９、最終濃度２５ｕｇ／ｍＬ）を５ｕＬ／ｍｉｎで３６０秒間流して約５０００－７０００ＲＵに固定させた。抗原のヒトＭＵＣ１タンパク質を２５ｎＭから４００ｎＭまでの濃度範囲内で互いに異なる５つの濃度に３０ｕＬ／ｍｉｎの速度で注入して、下記表のようにｋ_ａとｋ_ｄ値を求め、これからＫ_Ｄ値を計算した。その結果、ムチン１に対する結合親和度を示すＫ_Ｄ（Ｍ）値を表５に示した。

実施例２．ムチン１に結合するｓｃＦｖを用いたＣＡＲ－Ｔ細胞の製造
２－１．ＣＡＲを発現するレンチウイルス伝達ベクターの作製
ｓｃＦｖポリペプチド配列を含む細胞外ドメイン（表４の塩基配列）、ヒンジ（ＣＤ８α）（配列番号１１２）および膜貫通ドメイン（ＣＤ２８）（配列番号１１３）、共刺激ドメイン（ＣＤ２８）（配列番号１１４）、および細胞内シグナル伝達ドメイン（ＣＤ３ゼータ）（配列番号１１５）を含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するレンチウイルスベクター（ｔｒａｎｓｆｅｒ ｖｅｃｔｏｒまたはｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ）を製造した。ＣＡＲのｓｃＦｖ部分は、ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ企業から供給されたプラスミドからＰＣＲで断片を分離し、ヒンジ（ｈｉｎｇｅ）、膜貫通タンパク質、ＣＤ２８およびＣＤ３ｚシグナル伝達ドメインは、既に合成されたプラスミドからＰＣＲで断片分離した。２つの断片は、Ｔａｋａｒａ社のＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤクローニングキットを用いてＣｌｏｎｅｔｅｃｈ社のｐＬＶＸ－ＥＦ１ａｌｐｈａベクターにクローニングした。このようにクローニングされたレンチウイルスベクターは、同社のＬｅｎｔｉ－Ｘ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（ＥＦ１ａ Ｖｅｒｓｉｏｎ）（製品コード６３１２５３）から提供されるパッケージングプラスミドと共に、Ｔａｋａｒａ社のＬｅｎｔｉ－Ｘ ２９３Ｔ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅにトランスフェクション（製品コード６３２１８０）させ、２４時間後、ｓｏｕｐを分離してその中にあるレンチウイルスを後の研究に使用した。

２－２．レンチウイルス粒子の生成
レンチウイルスを生成するために、前記製造したレンチウイルス伝達ベクター（ｔｒａｎｓｆｅｒ ｖｅｃｔｏｒまたはｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ）とパッケージングプラスミド混合体（ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ ｐａｃｋａｇｉｎｇ ｐｌａｓｍｉｄ ｍｉｘ）を、リポソーム核酸伝達試薬（ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ、Ｇｉｂｃｏ）を用いてＬｅｎｔｉ－Ｘ ２９３Ｔ細胞（Ｔａｋａｒａ製品番号６３２１８０）にトランスフェクション（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）した。形質注入１日前に、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を培養プレート面積の６～７０％程度存在するように用意した。培地は、１０％熱によって不活性化されたウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｇｉｂｃｏ）が添加されたＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ、Ｇｉｂｃｏ）を用い、培養プレートは１００ｍｍまたは１５０ｍｍの大きさを使用した。培養条件で３７℃、５％ＣＯ_２、加湿条件を維持した。伝達ベクターとレンチウイルスパッケージングプラスミド混合体、そしてリポソーム核酸伝達試薬を製造会社の説明に従って比率を合わせて常温で混合した後、培養中のプレート上のＨＥＫ２９３Ｔ細胞にｄｒｏｐ方式で処理することによって、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を形質注入させた。形質注入後、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞で作製されたレンチウイルスは、細胞外に噴出してウイルス粒子（ｖｉｒｕｓ ｐａｒｔｉｃｌｅ）形態で細胞培養液に存在した。これに形質注入４８時間後、培養プレートから細胞培養液だけを取り出し、遠心分離を進行させてレンチウイルス粒子をペレット状にした。以後、溶液を用いてペレットを溶解した後、直ちに使用するか、超低温冷凍庫に保管した。溶液は先に用いたＤＭＥＭ培地あるいはＴ細胞の培養に使用されるＣＴＳ ｏｐｔｉｍｉｚｅｒ Ｔ ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ＳＦＭ １Ｌ瓶（Ｇｉｂｃｏ）にＯｐｔｉｍｉｚｅｒ Ｔ－Ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（２６ｍｌ）を添加し、ＣＴＳ Ｉｎｎｕｍｅ Ｃｅｌｌ ＳＲ（Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ、Ｇｉｂｏ）を最終２％となるように添加し、ＣＴＳ ＧｌｕｔａＭＡＸ－Ｉ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ １００Ｘ（Ｇｉｂｃｏ）を最終１Ｘとなるように添加したものを使用した。

２－３．ＣＡＲ－Ｔ細胞の製造
末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）サンプルは、カトリック大学との研究協約により供給され、カトリック大学臨床研究審査委員会（Ｔｈｅ Ｃａｔｈｏｌｉｃ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｋｏｒｅａ－Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ｒｅｖｉｅｗ Ｂｏａｒｄ）の承認を経てドナー募集および血液採取を進行させた。すべて健常者の血液を使用した。本発明の実施例において、「Ｄｏｎｏｒ」は、実験に使用されたＰＢＭＣサンプルのドナーを称し、Ｄｏｎｏｒの後ろの数字はドナーがそれぞれ異なることを意味する（例えば、Ｄｏｎｏｒ０３、Ｄｏｎｏｒ０４、Ｄｏｎｏｒ０５、Ｄｏｎｏｒ０６、Ｄｏｎｏｒ０７、Ｄｏｎｏｒ０８、Ｄｏｎｏｒ１８－０９、Ｄｏｎｏｒ２０－０１などで表す）。Ｔ細胞の表面にキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）が発現したＣＡＲ－Ｔ細胞を製造するために、凍結ＰＢＭＣバイアルを３７℃の恒温水槽で解凍した。凍結ＰＢＭＣ解凍の翌日、細胞数の測定後に細胞を新しい培地に切り替えた。これと同時に、Ｔ細胞特異的な増幅ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｈｕｍａｎ Ｔ－ｅｘｐａｎｄｅｒ ＣＤ３／ＣＤ２８、Ｇｉｂｃｏ）を用いてＴ－細胞を活性化し、レンチウイルス形態になっているキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を活性化された細胞数に合わせて処理し、Ｔ細胞に形質導入（ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ）させた。形質転換されたＴ細胞を培養するために、ろ過した滅菌蒸留水で解いたインターロイキン－２（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－２、Ｎｏｒｖａｔｉｓ）懸濁液を培地量基準１００ＩＵ／ｍｌとなるように添加し、後の培養期間中に培地を切り替えたり、あるいは添加時ごとに持続的に入れたりした。細胞培養期間は、活性化させた後、全体１０－１１日とし、培地は細胞数に応じて１～２日ごとに切り替えたり、あるいは新たに添加して培養を進行させたりして、培養期間が終わると細胞培養を終え、ＣＡＲ－Ｔ細胞の作製を完了した。作製されたＣＡＲ－Ｔ細胞は直ちに使用するか、細胞凍結保存液と混合して細胞凍結用バイアルに注入後、液化窒素タンク（Ｌｉｑｕｉｄ Ｎｉｔｒｏｇｅｎ Ｔａｎｋ）に保管した。作製されたＣＡＲ－Ｔ細胞のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）の発現量の確認および特性の分析はフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）により進行させた。

実施例３．可溶性ｓｃＦｖのムチン１－発現細胞に対する親和力分析
以下、特別な言及がない限り、本発明の実施例で使用した細胞株に関する情報は次の通りである：
－ＰＡＮＣ－１；韓国細胞株銀行、２１４６９
－ＨＣＣ１９５４；韓国細胞株銀行、９Ｓ１９５４
－ＨＣＣ７０；韓国細胞株銀行、９Ｓ００７０
－Ｔ４７Ｄ；韓国細胞株銀行、３０１３３
－ＨＥＫ２９３Ｔ；ＡＴＣＣ、ＣＲＬ－３２１６
－Ｈｕｈ７；韓国細胞株銀行、６０１０４
－ＨｅｐＧ２；ＡＴＣＣ、ＨＢ－８０６５
－ＳＫ－Ｎ－ＳＨ；韓国細胞株銀行、３００１１

実施例３で使用した細胞株は計４種類であり、このうち、陰性対照群としてＨＥＫ２９３（ＡＴＣＣ）およびＰＡＮＣ－１（ＡＴＣＣ）細胞株を使用し、陽性対照群としてＨＥＫ２９３Ｔ－ｖ１（ＡＴＣＣおよびＬＧ化学で形質転換）およびＴ４７Ｄ（韓国細胞株銀行）細胞株を使用した。陽性対照群として用いたＨＥＫ２９３Ｔ－ｖ１細胞株は、ムチン１を発現しないＨＥＫ２９３Ｔ細胞株にＭＵＣ１のＣサブユニットを発現させた細胞株である。使用したｓｃＦｖは１１種類であり、このうち、陽性対照群はＧ０３である（表３）。実施例１で製造した可溶性ｓｃＦｖを５倍ずつ希釈して計８段階の濃度で用意した。各段階別の濃度は、３８０μｇ／ｍＬ、７６μｇ／ｍＬ、１５．２μｇ／ｍＬ、３．０４μｇ／ｍＬ、０．６０８μｇ／ｍＬ、０．１２１６μｇ／ｍＬ、０．０２４３２μｇ／ｍＬ、０．００４８６４μｇ／ｍＬであった。可溶性ｓｃＦｖ希釈および細胞洗浄時に使用したバッファーは、２％ＦＢＳ、１０ｍ ＭＥＤＴＡが入ったＰＢＳである。４種類の細胞を１×１０^６／ｍＬで用意し、９６ｗｅｌｌ Ｕ－ｂｏｔｔｏｍ細胞培養プレートに１×１０^５／１００μｌ／ｗｅｌｌに入れて１５００ＲＰＭで５分間遠心分離した。前記作っておいた可溶性ｓｃＦｖを５０μｌ／ｗｅｌｌで処理した。４℃で１時間静置した。細胞洗浄用バッファーを１５０μｌ／ｗｅｌｌに入れて混合した後、１５００ＲＰＭで５分間遠心分離した。上層液を捨てた後、細胞洗浄用バッファーを２００μｌ／ｗｅｌｌに入れて混合した後、１５００ＲＰＭで５分間遠心分離した。Ｇｏａｔ ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ＩｇＧ Ｆｃ－ｂｉｏｔｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ａ１８８２１）を５００倍希釈して５０μｌ／ｗｅｌｌで処理した。４℃で２０分間静置した。細胞洗浄用バッファーを１５０μｌ／ｗｅｌｌに入れて混合した後、１５００ＲＰＭで５分間遠心分離した。上層液を捨てた後、細胞洗浄用バッファーを２００μｌ／ｗｅｌｌに入れて混合した後、１５００ＲＰＭで５分間遠心分離した。ＰＥ－Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｇｅｎ、５５４０６１）を１０００倍希釈して５０μｌ／ｗｅｌｌで処理した。４℃で２０分間静置した。細胞洗浄用バッファーを１５０μｌ／ｗｅｌｌに入れて混合した後、１５００ＲＰＭで５分間遠心分離した。上層液を捨てた後、細胞洗浄用バッファーを２００μｌ／ｗｅｌｌに入れて混合した後、１５００ＲＰＭで５分間遠心分離した。細胞洗浄用バッファーを８０μｌ／ｗｅｌｌに入れて混合した後、フローサイトメーターで分析した。

可溶性ｓｃＦｖのムチン１－発現細胞に対する親和力は、フローサイトメーターの結果値のうち、ＰＥ ＭＦＩ値で確認した。各細胞株に可溶性ｓｃＦｖは入れず、他の蛍光抗体（Ｇｏａｔ ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ＩｇＧ Ｆｃ－ｂｉｏｔｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ、ＰＥ－Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ）を用いて染色を進行させた値を陰性対照群値とし、各細胞別Ｇ０３を３８０μｇ／ｍＬの濃度で処理した時の値を陽性対照群値として、次のようにＭＦＩ値を補正した：
（実験値－陰性対照群値）／（陽性対照群値－陰性対照群値）×１００＝実験値の補正値
補正した値を用いてＥＣ_５０を求め、記述された結果値は陽性対照群として用いた２つの細胞株の結果値である（表６）。

実施例４．ＣＡＲ－Ｔ細胞のサイトカイン分泌解析
ＭＵＣ１－陽性腫瘍細胞（Ｔ４７Ｄ、ＨＥＫ２９３Ｔ－Ｖ１）に対する、抗ＭＵＣ１ ｓｃＦｖがＣＡＲ形態で注入された免疫細胞（Ｔ細胞）の反応性を評価した。ＭＵＣ１が自然的に多く発現するＴ４７Ｄ細胞と、ヒトのＭＵＣ１のＣサブユニットを過発現させたＨＥＫ２９３Ｔ－Ｖ１細胞に、実施例２により製造した、抗ＭＵＣ１ ｓｃＦｖがＣＡＲ形態で注入された免疫細胞２４４５＿１Ｆ０９、２４４７＿３Ａ０１、２４４７＿３Ａ０８、２４４７＿３Ａ０９、２４４７＿３Ａ１２、２４４７＿３Ｃ０８、２４４７＿３Ｈ０２、２４４７＿３Ｈ０８、２４４７＿２Ｈ０８、２４４７＿３Ｂ０７（または一部の図においてはそれぞれ１Ｆ０９、３Ａ０１、３Ａ０８、３Ａ０９、３Ａ１２、３Ｃ０８、３Ｈ０２、３Ｈ０８、２Ｈ０８、３Ｂ０７と略称する）の計１０種を腫瘍細胞：免疫細胞の比率１：１．５に合わせて２４時間同時培養した。これから得られた培養液内のサイトカイン２種、つまり、インターフェロン－ガンマ（ＩＦＮｇ）とインターロイキン－２（ＩＬ－２）の濃度をＥＬＩＳＡにより確認した。ＥＬＩＳＡ解析方法は通常使用される方法と同様である。簡単に説明すると次の通りである。まず、９６ウェルの免疫プレートにインターフェロン－ガンマまたはインターロイキン－２を取り込めるキャプチャー抗体（ｃａｐｔｕｒｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ）でコーティングし、１日後、洗浄バッファー（ｗａｓｈｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ）で十分に洗浄した。ブロックバッファー（ｂｌｏｃｋ ｂｕｆｆｅｒ）をウェルごとに入れて常温で１時間静置後、再び洗浄バッファーで十分に洗浄した。絶対値を知るために、濃度を知っているスタンダードソリューションと共に、培養液サンプルを各ウェルに入れて２時間常温で静置して反応させた。洗浄バッファーで十分に洗浄した後、検出抗体（ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ）を入れて２時間常温で反応させた。洗浄バッファーで十分に洗浄した後に、ＨＲＰが標識されたストレプトアビジン（ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ）を各ウェルに入れて２０分間常温で反応させた。洗浄バッファーで十分に洗浄した後に、基質溶液を添加後、２０分間常温で反応させ、停止溶液（ｓｔｏｐ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）で反応を止めた。各ウェルのサイトカイン濃度は反応に応じた吸光度で計算した。

図１のＧ０３は陽性対照群であり、陰性対照群としていかなるＣＡＲも注入されない群（ＮＯ ＬＶ）を使用した。また、図１は、計２個のＴ細胞由来を用いた独立的な実験を代表的に示す結果グラフであって、Ｔ細胞の由来によりＤｏｎｏｒ０３、Ｄｏｎｏｒ０４と名付けた。本実施例において、「Ｄｏｎｏｒ」は、実験に使用されたＴ細胞のドナーを称し、Ｄｏｎｏｒの後ろの数字はドナーがそれぞれ異なることを意味する。図１は、対照群のＧ０３を基準としてその吸光度を平準化したグラフであり、テストされた免疫細胞がサイトカインを分泌することを示す。

図２は、ＭＵＣ１－陽性腫瘍細胞（Ｔ４７Ｄ）に対する、抗ＭＵＣ１ ｓｃＦｖがＣＡＲ形態で注入された免疫細胞の反応性を評価したサイトカイン分泌解析の結果であって、テストされた免疫細胞がサイトカインを分泌することを示す。Ｔ細胞はＤｏｎｏｒ０６に由来する。陰性対照群としていかなるＣＡＲも注入されない群（Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｔ ｃｅｌｌ）を使用した。

図３は、ムチン１非発現細胞（ＨＥＫ２９３Ｔ）に対する、抗ＭＵＣ１ ｓｃＦｖがＣＡＲ形態で注入された免疫細胞の反応性を評価したサイトカイン分泌解析の結果であって、インターフェロンガンマサイトカインは分泌せず、ＩＬ－２の場合、陰性対照群（Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｔ ｃｅｌｌ）と比較した時、分泌量が大きく増加しないことを示す。Ｔ細胞はＤｏｎｏｒ０６に由来する。陰性対照群としていかなるＣＡＲも注入されない群（Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｔ ｃｅｌｌ）を使用した。

実施例５．ＣＡＲ－Ｔ細胞の細胞毒性分析
ヒト乳癌細胞株（Ｔ４７Ｄ、ＨＣＣ７０、ＨＣＣ１９５４）、ヒト肝癌細胞株（Ｈｕｈ７、ＨｅｐＧ２）、ヒト神経芽細胞腫細胞株（ＳＫ－Ｎ－ＳＨ）はＫｏｒｅａｎ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ Ｂａｎｋ（ＫＣＬＢ、Ｓｅｏｕｌ、Ｋｏｒｅａ）から購入し、ヒト胚腎細胞株（ＨＥＫ２９３Ｔ）はＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）から購入した。Ｔ４７Ｄ、ＨＣＣ７０、ＨＣＣ１９５４細胞はＲＰＭＩ－１６４０ ｍｅｄｉｕｍ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で、ＨＥＫ２９３Ｔ、Ｈｕｈ７、ＨｅｐＧ２はＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）でそれぞれ培養した。すべての培地は１０％（ｗ／ｖ）ｈｅａｔ ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を補充して使用した。すべての細胞は３７℃、５％ＣＯ_２条件で培養した。実施例２により製造したＣＡＲ－Ｔ細胞はＣＴＳ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｍｅｄｉａ（ＣＴＳ（登録商標） ＯｐＴｍｉｚｅｒ（登録商標） Ｔ Ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ＳＦＭ（Ｇｉｂｃｏ、Ａ１０４８５０１）、２％（ｗ／ｖ）ＣＴＳ（登録商標） Ｉｍｍｕｎｅ Ｃｅｌｌ ＳＲ（Ｇｉｂｃｏ、Ａ２５９６１－０１）、１Ｘ ＧｌｕｔａＭＡＸ（登録商標） Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｇｉｂｃｏ、３５０５０－０６１）に３７℃、５％ＣＯ_２条件で培養した。

ＣＡＲ－Ｔ細胞のムチン１－特異的な細胞毒性を分析するために、ムチン１－発現細胞（Ｔ４７Ｄ、ＨＣＣ７０、ＨＣＣ１９５４、ＨＥＫ２９３Ｔ－Ｖ１（ＭＵＣ１－Ｃ外在的発現細胞）などを含む）とムチン１非発現細胞（ＨＥＫ２９３Ｔ、ＨｅｐＧ２、Ｈｕｈ７、ＳＫ－Ｎ－ＳＨなどを含む）に対する細胞溶解度を次の方法で測定した。まず、ＣｅｌｌＴｒａｃｅ（登録商標） ＣＦＳＥ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃ３４５５４）で染色させたムチン１発現または非発現標的細胞を０．１５～０．２×１０^６ｃｅｌｌｓ／１５０ｕｌ／ｗｅｌｌで分注して１日間培養した。同日、－１９６℃凍結保管されたＣＡＲ－Ｔ細胞を解凍させて、２×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍｌの濃度で３０Ｕ／ｍｌのＩＬ－２（Ｎｏｖａｒｔｉｓ、Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ）が含まれたＣＴＳ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｍｅｄｉａに１日間培養した。翌日、培養中のＣＡＲ－Ｔ細胞のＣＡＲ発現率をＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８－ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ、Ｆ（ａｂ’）２ Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ（Ｊａｃｋｓｏｎ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、１０９－５４５－０９７）とＡＰＣ Ｍｏｕｓｅ Ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ ＣＤ３（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ（登録商標）、５６１８１１）で染色してフローサイトメーター（ＦＡＣＳ、ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ）により両方とも陽性の比率で求めた。ＣＡＲ発現率ベースでＣＡＲ＋ Ｔ細胞の数が同一に合わせた各種類のＣＡＲ－Ｔ（Ｅ、ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｃｅｌｌｓ）を各標的細胞の細胞培養液で１００ｕｌ／ｗｅｌｌの体積に合わせて、前日培養したＣＦＳＥ染色されたムチン１発現または非発現細胞（Ｔ、ｔａｒｇｅｔ ｃｅｌｌｓ）の数に比例して入れた。３７℃、５％ＣＯ_２条件で標的細胞により５時間から最大２４時間まで培養した。以後、ＣＡＲ－Ｔ細胞と標的細胞ともを取って、Ｆｉｘａｂｌｅ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ｄｙｅ ｅＦｌｕｏｒ^ＴＭ ４５０（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ^ＴＭ、６５－０８６３－１８）、ＡＰＣ Ｍｏｕｓｅ Ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ ＣＤ３で染色して、フローサイトメーターにより生きている標的細胞数を求めた。この時、生きている標的細胞数はＦｉｘａｂｌｅ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ｄｙｅ陰性、ＣＦＳＥ陽性の細胞と定義した。力価計算（ｋｉｌｌｉｎｇ ａｃｔｉｖｉｔｙ、％）は次の式で求めた：

その結果を、図４～図８に示した。これらの図面において、Ｇ０３は陽性対照群であり、陰性対照群としていかなるＣＡＲも注入されない群（ＮＯ ＬＶ）を使用した。また、これらの図面は計２個のＴ細胞由来を用いた独立的な実験を代表的に示す結果グラフであって、Ｔ細胞の由来によりＤｏｎｏｒ０３、Ｄｏｎｏｒ０４と名付けた。図４～図８に示されているように、テストされた免疫細胞がムチン１－発現細胞に細胞毒性を示した。

図９および図１０は、それぞれＤｏｎｏｒ０５およびＤｏｎｏｒ０６由来のＴ細胞を用いて作製したＣＡＲ－Ｔ細胞の、ヒト乳癌細胞株のＴ４７Ｄに対する細胞毒性実験の結果であり、図１１は、Ｄｏｎｏｒ０７由来のＴ細胞を用いて作製したＣＡＲ－Ｔ細胞の、ヒト胚腎細胞のＨＥＫ２９３Ｔに対する細胞毒性実験の結果であり、図１２は、Ｄｏｎｏｒ０８由来のＴ細胞を用いて作製したＣＡＲ－Ｔ細胞の、ヒト乳癌細胞株ＨＣＣ７０に対する細胞毒性実験の結果である。図９～図１２に示されているように、テストされた免疫細胞がムチン１－発現細胞に細胞毒性を示した。

実施例６．ＣＡＲ－Ｔ細胞のムチン１－特異的な細胞毒性分析
ＣＡＲ－Ｔ細胞が抗原量の差により正常細胞と癌細胞とを区分できるかどうかを調べるために、乳癌細胞株（ＨＣＣ７０）とヒト正常乳房細胞株（ＭＣＦ１０Ａ）に対する細胞溶解度を次の方法で測定した：まず、ムチン１過剰発現細胞のＨＣＣ７０とムチン１を少なく発現する細胞のＭＣＦ１０Ａをそれぞれ異なる濃度のＣｅｌｌＴｒａｃｅ^ＴＭ ＣＦＳＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃ３４５５４）で染色させた後、異なる比率で混合した。使用した比率は、ＨＣＣ７０：ＭＣＦ１０Ａが、各０：０．２、０．０２５：０．１７５、０．０５：０．１５、０．０７５：０．１２５、０．１：０．１、０．１２５：０．０７５、０．１５：０．０５、０．１７５：００２５、０．２：０である。一定比率で混合された細胞は０．２×１０^６ｃｅｌｌｓ／５００ｕｌ／ｗｅｌｌで分注して１日間培養した。同日、－１９６℃凍結保管されたＣＡＲ－Ｔ細胞（２４４７＿２Ｈ０８ ｓｃＦｖ含有ＣＡＲが発現したＤｏｎｏｒ０５由来Ｔ細胞）を解凍させて、２×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍｌの濃度で３０Ｕ／ｍｌのＩＬ－２（Ｎｏｖａｒｔｉｓ、Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ）が含まれているＣＴＳ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｍｅｄｉａに１日間培養した。翌日、培養中のＣＡＲ－Ｔ細胞のＣＡＲ（２４４７＿２Ｈ０８ ｓｃＦｖを有しているＣＡＲ）発現率をＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８－ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ、Ｆ（ａｂ’）２ Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ（Ｊａｃｋｓｏｎ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、１０９－５４５－０９７）とＡＰＣ Ｍｏｕｓｅ Ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ ＣＤ３（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ^ＴＭ、５６１８１１）で染色して、フローサイトメーター（ＦＡＣＳ、ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ）により両方とも陽性の比率で求めた。ＣＡＲ発現率ベースでＣＡＲ＋ Ｔ細胞の数が同一に合わされた各種類のＣＡＲ－Ｔ（Ｅ、ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｃｅｌｌｓ）を各標的細胞の細胞培養液で１００ｕｌ／ｗｅｌｌの体積に合わせて、前日培養したＣＦＳＥ染色されたムチン１発現または非発現細胞（Ｔ、ｔａｒｇｅｔ ｃｅｌｌｓ）の数に比例して入れた。３７℃、５％ＣＯ_２条件で標的細胞に２４時間培養した。その後、ＣＡＲ－Ｔ細胞と標的細胞の両方を取り、Ｆｉｘａｂｌｅ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ｄｙｅ ｅＦｌｕｏｒ（登録商標） ４５０（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ^ＴＭ、６５－０８６３－１８）、ＡＰＣ Ｍｏｕｓｅ Ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ ＣＤ３で染色して、フローサイトメーターにより生きている標的細胞数を求めた。この時、生きている標的細胞数はＦｉｘａｂｌｅ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ｄｙｅ陰性、ＣＦＳＥ陽性（ＨＣＣ７０の場合に強いＣＦＳＥシグナル、ＭＣＦ１０Ａの場合に弱いＣＦＳＥシグナル）である細胞と定義した。力価計算（ｋｉｌｌｉｎｇ ａｃｔｉｖｉｔｙ、％）は実施例５と同様の方法で行った。

その結果を、図１３および図１４に示した。これらの図面において、陰性対照群としていかなるＣＡＲも注入されない群（ｍｏｃｋ Ｔ ｃｅｌｌ）を使用した。図１３および図１４に示されているように、２４４７＿２Ｈ０８ ｓｃＦｖを有しているＣＡＲ－Ｔ細胞（図面にてそれぞれ＃２－ＣＡＲ－Ｔで表される）は、ムチン１を過剰発現する乳癌細胞（ＨＣＣ７０）に対する細胞死滅能を示すのに対し、ムチン１を弱く発現する正常乳房細胞株（ＭＣＦ１０Ａ）に対する細胞毒性は現れなかったり、顕著に減少したりする量で現れることを観察した。

実施例７．動物モデルを用いたＣＡＲ－Ｔ細胞の抗癌効能分析
７－１．膵臓癌動物モデルを用いた抗癌効能分析
７週齢のＮＯＧ雌マウスに６×１０^６ ＰＡＮＣ１－ｖ１細胞（ＭＵＣ１を発現させたＰＡＮＣ１膵臓癌細胞）を皮下（ｓ．ｃ．）注入し、腫瘍体積が５００ｍｍ^３である時、１×１０^６の抗－ＭＵＣ１ ＣＡＲ－Ｔ細胞（本発明によるｓｃＦｖ含有ＣＡＲが発現したＤｏｎｏｒ １８－０９由来Ｔ細胞）を静脈（ｉ．ｖ．）投与した後、腫瘍成長を観察し、ＣＡＲ－Ｔ細胞投与１４日と２８日後に血液を採取して、血液内のヒト免疫細胞（ｈＣＤ４５＋ ｃｅｌｌ）の数を観察した（グループあたりｎ＝５）。陰性対照群としては、ＰＢＳ（Ｖｅｈｉｃｌｅ）注入群とＣＡＲを発現しないＴ細胞（Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｔ ｃｅｌｌ）を使用した。

その結果、図１５および図１６に示されているように、５００ｍｍ^３の大きさの腫瘍が小さくなることを観察し、Ｔ細胞投与後約２０日経過した時には外観で腫瘍が観察されなかった。しかし、陰性対照群の場合、癌の大きさが持続的に大きくなることを観察することができた。

次に、前記と同一の動物モデルにおいて、腫瘍体積が１５００ｍｍ^３を超えた時（つまり、ＰＡＮＣ１－ｖ１細胞投与６６日後）、１×１０^６または０．５×１０^６の抗－ＭＵＣ１ ＣＡＲ－Ｔ細胞を静脈（ｉ．ｖ．）投与した後、腫瘍成長を観察した（グループあたりｎ＝２）。

その結果、図１７に示されているように、腫瘍の大きさが、初期には大きくなったが、約１０日経過した後、その大きさが次第に小さくなり３０日経過後には測定しにくい程度に腫瘍の大きさが小さかった。

７－２．乳癌動物モデルを用いた抗癌効能分析
９週齢のＮＯＧ雌マウスに４×１０^６ ＨＣＣ１９５４細胞（自然的にＭＵＣ１を発現する乳癌細胞株）を皮下（ｓ．ｃ．）注入し、腫瘍体積が５００ｍｍ^３になった時（細胞投与２３日後）、０．５×１０^６または０．１×１０^６の抗－ＭＵＣ１ ＣＡＲ－Ｔ細胞（本発明によるｓｃＦｖ含有ＣＡＲが発現したＤｏｎｏｒ２０－０１由来Ｔ細胞）を静脈（ｉ．ｖ．）投与した後、腫瘍成長を観察し（グループあたりｎ＝７）、Ｔ細胞投与後、一定の間隔で血液を採取して、血液内のヒト免疫細胞（ｈＣＤ４５＋ ｃｅｌｌ）の数を観察した（グループあたりｎ＝３）。陰性対照群としては、ＰＢＳ（Ｖｅｈｉｃｌｅ）注入群とＣＡＲを発現しないＴ細胞（Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｔ ｃｅｌｌ）を使用した。

その結果、図１８および図１９に示されているように、５００ｍｍ^３であった腫瘍の大きさは、ＣＡＲ－Ｔ細胞投与後７日間大きさが停滞したが、その後に急激に減少し２５日後に測定が難しい程度に小さくなった。また、マウス血液内ｈＣＤ４５＋細胞の数は増加する様相を示し、約２５日後には次第にその数が減少した。これはＣＡＲ－Ｔ細胞が抗原を認識した後に活性化され、増殖して血液内の細胞数が増加したと見られる。

以上の説明から、本発明の属する技術分野における通常の知識を有する者は本発明がその技術的思想や必須的特徴を変更することなく他の具体的な形態で実施できることを理解するであろう。そのため、以上に述べた実施例はすべての面で例示的であり、限定的でないと理解しなければならない。本発明の範囲は上記の詳細な説明よりは後述する特許請求の範囲の意味および範囲、およびその等価概念から導出されるすべての変更または変形された形態が本発明の範囲に含まれると解釈されなければならない。

Claims (25)

1. 以下からなる群より選択される重鎖可変（ＶＨ）領域および軽鎖可変（ＶＬ）領域の対を含む、ムチン１（Ｍｕｃｉｎ１）に結合するポリペプチド：
   －それぞれ配列番号１、配列番号２および配列番号３のアミノ酸配列で表される相補性決定領域（ＣＤＲ）１、２および３を含むＶＨ領域、およびそれぞれ配列番号４、配列番号５および配列番号６のアミノ酸配列で表されるＣＤＲ１、２および３を含むＶＬ領域；
   －それぞれ配列番号１１、配列番号１２および配列番号１３のアミノ酸配列で表されるＣＤＲ１、２および３を含むＶＨ領域、およびそれぞれ配列番号１４、配列番号１５および配列番号１６のアミノ酸配列で表されるＣＤＲ１、２および３を含むＶＬ領域；
   －それぞれ配列番号２１、配列番号２２および配列番号２３のアミノ酸配列で表されるＣＤＲ１、２および３を含むＶＨ領域、およびそれぞれ配列番号２４、配列番号２５および配列番号２６のアミノ酸配列で表されるＣＤＲ１、２および３を含むＶＬ領域；
   －それぞれ配列番号３１、配列番号３２および配列番号３３のアミノ酸配列で表されるＣＤＲ１、２および３を含むＶＨ領域、およびそれぞれ配列番号４４、配列番号４５および配列番号４６のアミノ酸配列で表されるＣＤＲ１、２および３を含むＶＬ領域；
   －それぞれ配列番号５１、配列番号５２および配列番号５３のアミノ酸配列で表されるＣＤＲ１、２および３を含むＶＨ領域、およびそれぞれ配列番号５４、配列番号５５および配列番号５６のアミノ酸配列で表されるＣＤＲ１、２および３を含むＶＬ領域；
   －それぞれ配列番号６１、配列番号６２および配列番号６３のアミノ酸配列で表されるＣＤＲ１、２および３を含むＶＨ領域、およびそれぞれ配列番号６４、配列番号６５および配列番号６６のアミノ酸配列で表されるＣＤＲ１、２および３を含むＶＬ領域；
   －それぞれ配列番号７１、配列番号７２および配列番号７３のアミノ酸配列で表されるＣＤＲ１、２および３を含むＶＨ領域、およびそれぞれ配列番号７４、配列番号７５および配列番号７６のアミノ酸配列で表されるＣＤＲ１、２および３を含むＶＬ領域；
   －それぞれ配列番号８１、配列番号８２および配列番号８３のアミノ酸配列で表されるＣＤＲ１、２および３を含むＶＨ領域、およびそれぞれ配列番号８４、配列番号８５および配列番号８６のアミノ酸配列で表されるＣＤＲ１、２および３を含むＶＬ領域；および
   －それぞれ配列番号９１、配列番号９２および配列番号９３のアミノ酸配列で表されるＣＤＲ１、２および３を含むＶＨ領域、およびそれぞれ配列番号９４、配列番号９５および配列番号９６のアミノ酸配列で表されるＣＤＲ１、２および３を含むＶＬ領域。
2. 以下からなる群より選択される重鎖可変（ＶＨ）領域および軽鎖可変（ＶＬ）領域の対を含む、請求項１に記載のポリペプチド：
   －配列番号７のアミノ酸配列を含むＶＨ領域および配列番号８のアミノ酸配列を含むＶＬ領域；
   －配列番号１７のアミノ酸配列を含むＶＨ領域および配列番号１８のアミノ酸配列を含むＶＬ領域；
   －配列番号２７のアミノ酸配列を含むＶＨ領域および配列番号２８のアミノ酸配列を含むＶＬ領域；
   －配列番号３７のアミノ酸配列を含むＶＨ領域および配列番号３８のアミノ酸配列を含むＶＬ領域；
   －配列番号４７のアミノ酸配列を含むＶＨ領域および配列番号４８のアミノ酸配列を含むＶＬ領域；
   －配列番号５７のアミノ酸配列を含むＶＨ領域および配列番号５８のアミノ酸配列を含むＶＬ領域；
   －配列番号６７のアミノ酸配列を含むＶＨ領域および配列番号６８のアミノ酸配列を含むＶＬ領域；
   －配列番号７７のアミノ酸配列を含むＶＨ領域および配列番号７８のアミノ酸配列を含むＶＬ領域；
   －配列番号８７のアミノ酸配列を含むＶＨ領域および配列番号８８のアミノ酸配列を含むＶＬ領域；および
   －配列番号９７のアミノ酸配列を含むＶＨ領域および配列番号９８のアミノ酸配列を含むＶＬ領域。
3. 抗体またはその抗原結合断片である、請求項１に記載のポリペプチド。
4. ｓｃＦｖ（ｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ）、ペプチボディ、Ｆａｂ（ｆｒａｇｍｅｎｔ ａｎｔｉｇｅｎ ｂｉｎｄｉｎｇ）、モノクローナル抗体、二重特異性抗体、ミニボディ、ドメイン抗体、合成抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、または抗体融合体タンパク質である、請求項１に記載のポリペプチド。
5. 前記ＶＨ領域および前記ＶＬ領域がリンカーによって連結される、請求項１に記載のポリペプチド。
6. 前記リンカーのアミノ酸配列がＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＡＳである、請求項５に記載のポリペプチド。
7. 配列番号９、配列番号１９、配列番号２９、配列番号３９、配列番号４９、配列番号５９、配列番号６９、配列番号７９、配列番号８９および配列番号９９からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むｓｃＦｖである、請求項１に記載のポリペプチド。
8. 請求項１～７のいずれか一項に記載のムチン１－結合ポリペプチドをコードする、単離されたポリヌクレオチド。
9. 請求項８に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
10. 請求項９に記載のベクターを含む、細胞。
11. 請求項１～７のいずれか一項に記載のムチン１－結合ポリペプチドを含む、キメラ抗原受容体（ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）。
12. 前記ムチン１－結合ポリペプチドを含む細胞外ドメイン；膜貫通ドメイン；および細胞内シグナル伝達ドメインを含む、請求項１１に記載のキメラ抗原受容体。
13. 前記細胞外ドメインは、前記ムチン１－結合ポリペプチドと膜貫通ドメインとの間にスペーサー領域をさらに含む、請求項１２に記載のキメラ抗原受容体。
14. 前記スペーサーがＣＤ８αまたはＣＤ２８のヒンジ部位、または免疫グロブリン（ＩｇＧ）の定常領域の全部または一部を含む、請求項１３に記載のキメラ抗原受容体。
15. 前記膜貫通ドメインがＣＤ２８またはＣＤ８の膜貫通ドメインである、請求項１２に記載のキメラ抗原受容体。
16. 前記細胞内シグナル伝達ドメインがＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインである、請求項１２に記載のキメラ抗原受容体。
17. １個以上の共刺激ドメイン（ｃｏ－ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ ｄｏｍａｉｎ）をさらに含む、請求項１２に記載のキメラ抗原受容体。
18. 共刺激ドメインが膜貫通ドメインと細胞内シグナル伝達ドメインとの間に位置する、請求項１７に記載のキメラ抗原受容体。
19. 共刺激ドメインがＣＤ２８、ＯＸ－４０、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＣＤ２７またはＩＣＯＳのシグナル伝達ドメインである、請求項１７に記載のキメラ抗原受容体。
20. 請求項１１に記載のキメラ抗原受容体をコードする、単離されたポリヌクレオチド。
21. 請求項２０に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
22. 請求項１～７のいずれか一項に記載のムチン１－結合ポリペプチドを含むキメラ抗原受容体を発現するか、前記キメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチドを含む、免疫細胞。
23. Ｔ細胞、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、ＮＫ（Ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ）細胞、ＴＣＲ－発現細胞、樹状細胞、またはＮＫ－Ｔ細胞である、請求項２２に記載の免疫細胞。
24. 自己Ｔ細胞または同種Ｔ細胞である、請求項２２に記載の免疫細胞。
25. 請求項１～７のいずれか一項に記載のムチン１－結合ポリペプチド；
    前記ムチン１－結合ポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド；
    前記ムチン１－結合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むベクター；
    前記ムチン１－結合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む細胞；
    前記ムチン１－結合ポリペプチドを含むキメラ抗原受容体；
    前記キメラ抗原受容体をコードする単離されたポリヌクレオチド；
    前記キメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチドを含むベクター；または
    前記キメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチドを含むか、前記キメラ抗原受容体を発現する免疫細胞を含む、癌の予防または治療用組成物。