KR20190006952A - 외인성 바이러스-특이적 t 세포 수용체 (tcr)를 발현하는 비-활성화된 t 세포 - Google Patents
외인성 바이러스-특이적 t 세포 수용체 (tcr)를 발현하는 비-활성화된 t 세포 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 바이러스에 특이적인 T 세포 수용체 (TCR)을 암호화하는 외인성 핵산을 포함하는 T 세포, 특히 비-활성화된 T 세포에 관한 것이다. 본 발명의 구체예는 바이러스 복제를 억제할 수 있고 B형 간염 바이러스 (HBV) 외피 s183-191 TCR을 발현하는 활성화된 T 세포와 비교하여 자극에 반응하여 퍼포린 및/또는 그랜자임의 감소된 발현을 나타내는 상기 TCR을 발현하는 비-활성화된 (휴지기) T 세포에 관한 것이다. 또한 이러한 세포를 생산하는 방법, 이러한 세포 및 이것들의 의학적 사용을 포함하는 조성물, 약학적 조성물 및 키트를 생산하는 방법이 포함된다.
Description
본 발명은 T 세포, 특히 항바이러스성 T 세포, 이러한 세포의 생산 방법, 이러한 세포를 포함하는 조성물, 및 이것들의 의학적 사용에 관한 것이다.
현재 항바이러스 요법은 HBV 복제를 제어할 수 있지만 감염된 간 세포로부터 HBV cccDNA를 제거할 수 없다. 표준 치료 전략은 비용이 많이 들고, 뉴클레오사이드/뉴클레오타이드 유사체로의 치료의 경우와 마찬가지로 평생 동안의 치료를 필요로 하거나, 또는 IFN-α 요법과 같이, 심각한 부작용과 연관성이 있다. HBV 항원에 노출시킨 후 몇 년 후, HBV-특이적 T 세포는 만성 감염 환자에서 종종 제거되거나 기능적으로 소진된다. 바이러스-특이적 T 세포 반응을 조작하기 위한 전략은 만성 감염을 치료하거나 심각한 급성 감염과 관련된 사망을 예방하기 위한 임상 요법으로 이어질 수 있다.
T 세포 수용체 또는 키메라 항원 수용체 (CAR)의 유전적 삽입을 통해 종양 특이성을 달성하도록 조작된 T 림프구의 입양 전달은 파종성 종양의 놀라운 제어를 허용한다. HBV-특이적 T 세포 수용체를 발현하는 T 세포의 입양 전달을 통해 새로운 HBV-특이적 T 세포 면역력을 조작하는 것은 바이러스를 제어하기 위해 급성 감염을 해결하는 환자에 존재하는 것과 유사하고, 유망한 치료 전략을 제공하는 항바이러스 면역력을 복원할 수 있다.
B형 간염 바이러스 (HBV)-특이적 TCR을 발현하도록 조작된 T 세포는 통합된 HBV DNA로부터 HBV 항원을 발현하는 자연적 간 세포 암종 (HCC) 세포를 인식할 수 있는 것으로 나타났으며 (Gehring et al., J Hepatol (2011) 55(1): 103-110), 전기천공법에 의해 HBV-특이적 TCR를 발현하도록 조작된 활성화된 T 세포는 HCC 종양 세포 분주를 방지할 수 있는 것으로 나타났으며, 이러한 세포의 다회수 투입은 생체 내에서 종양 성장을 제어하는 것으로 나타났다 (Koh et al., Mol Ther Nucleic Acids (2013) 2: e114). 더욱이, HBV 표면 항원 (HBsAg)-특이적 TCR을 발현하는 T 세포로의 입양 T 세포 요법은 HCC 전이된 간 이식 환자에서 HBsAg의 수준을 억제하는 것으로 나타났다 (Qasim et al., J Hepatol (2015) 62(2): 486-491).
하지만, 입양 T 세포 요법와 관련된 심각한 부작용 및/또는 독성이 존재한다. 정상 조직에서 낮은 수준의 표적 항원의 발현, 또는 내인성 단백질과의 TCR의 교차-반응성은 심각한 부작용을 초래할 수 있다. 예를 들어, Morgan et al., J Immunother (2013) 36(2): 133-151은 아마도 인간 뇌에서 MAGE-A12의 발현의 결과로서, 항-MAGE-A3 TCR을 발현하도록 조작된 T 세포로의 입양 T 세포 요법과 연관성이 있는 신경학적 독성을 기술한다. 독성의 우려는 필수 조직을 감염시키는 바이러스에 대한 바이러스-특이적 T 세포의 입양 전달을 이용한 요법의 실행을 방해하였다.
본 발명은 항바이러스성이고, 바이러스로 감염된 세포에 대하여 실질적인 세포 독성을 나타내지 않는 바이러스-특이적 T 세포를 조작하는 것이 가능하다는 본 발명자들의 발견에 기초한다. 본 발명의 목적은 숙주에게 감소된 독성을 나타내는 바이러스 감염의 제어를 위한 간섭을 제공하는 것이다.
특히, 본 발명자들은 바이러스에 특이적인 TCR을 발현하도록 비-활성화된 T 세포를 변형시키는 것이 바이러스로 감염된 세포에서 바이러스 복제를 억제할 수 있지만, TCR을 발현하도록 조작된 동등한 활성화된 T 세포에 의해 나타나는 세포 독성과 비교하여 상기 바이러스로 감염된 세포에 대하여 감소된 세포 독성을 나타내는 T 세포를 생산한다는 것을 발견하였다.
본 발명자들은 또한 바이러스에 특이적인 TCR을 포함하고 세포 독성 인자의 감소된 발현/활성을 위해 변형된 T 세포가 바이러스로 감염된 세포에서 바이러스 복제를 억제할 수 있는 능력을 보유하고 있지만, 비-변형된 대응물과 비교하여 상기 바이러스로 감염된 세포에 대하여 감소된 세포 독성을 나타낸다는 것을 발견하였다.
제1 양태에서, 본 발명은 바이러스에 특이적인 T 세포 수용체 (TCR)를 암호화하는 외인성 핵산을 포함하는, 선택적으로 분리된, T 세포를 제공하며, 여기서 T 세포는 비-활성화된 T 세포이다. 일부 구체예에서, 비-활성화된 T 세포는 TCR이 특이적인 펩타이드로의 자극에 반응하여 퍼포린 및/또는 그랜자임의 증가된 발현을 나타내지 않는다. 일부 구체예에서, T 세포는 바이러스로 감염된 세포에서 바이러스의 복제를 억제할 수 있다. 일부 구체예에서, T 세포는 바이러스로 감염된 세포에서 바이러스의 복제를 세포 독성 인자의 감소된 발현 또는 활성을 위해 변형되지 않은 바이러스에 특이적인 TCR을 포함하는 활성화된 T 세포에 의한 바이러스 복제의 억제의 적어도 50%로 억제할 수 있다. 일부 구체예에서, T 세포는 세포 독성 인자의 감소된 발현 또는 활성을 위해 변형되지 않은 바이러스에 특이적인 TCR을 포함하는 활성화된 T 세포와 비교하여 바이러스로 감염되거나, 또는 상기 바이러스의 펩타이드를 포함하는 세포에 대하여 감소된 세포 독성을 나타낸다.
제2 양태에서, 본 발명은 바이러스에 특이적인 변형된 T 세포를 생산하기 위한 방법, 선택적으로는 시험관 내 방법을 제공하는데, 방법은 바이러스에 특이적인 T 세포 수용체 (TCR)를 발현하거나 또는 포함하도록 T 세포를 변형시키는 단계를 포함하며, 여기서 변형된 T 세포는 비-활성화된 T 세포이다. 일부 구체예에서, 방법은 본 발명의 제1 양태에 따라 T 세포를 생산하기 위한 것이다. 일부 구체예에서, 바이러스에 특이적인 TCR을 발현하거나 포함하도록 T 세포를 변형시키는 것은 바이러스에 특이적인 TCR을 암호화하는 핵산을 T 세포로 도입하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 핵산은 형질 도입, 예를 들어, 감마레트로바이러스 형질 도입, 렌티바이러스 형질 도입에 의해 T 세포로 도입된다. 일부 구체예에서, 핵산은 DNA 또는 RNA 트랜스펙션, 예를 들어, mRNA 전기천공법에 의해 T 세포로 도입된다. 일부 구체예에서, 핵산은 트랜스포손-기반 시스템, 예를 들어, Spleeping Beauty에 의해 T 세포로 도입된다.
제3 양태에서, 본 발명은 본 발명의 제2 양태에 따른 방법에 의해 얻어지거나 얻어질 수 있는 T 세포를 제공한다.
제4 양태에서, 본 발명은 본 발명의 제1 또는 데3 양태에 따르는 T 세포, 및 약학적으로 허용 가능한 담체, 보조제, 부형제, 또는 희석제를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.
제5 양태에서, 본 발명은 질환 또는 장애를 치료하거나 예방하는 방법에서 사용을 위한 본 발명의 제1 또는 제3 양태에 따르는 T 세포, 또는 본 발명의 제4 양태에 따르는 약학적 조성물을 제공한다.
제6 양태에서, 본 발명은 질환 또는 장애를 치료하거나 예방하는 방법에서 사용을 위한 의약의 제조에서 본 발명의 제1 또는 제3 양태에 따르는 T 세포, 또는 본 발명의 제4 양태에 따르는 약학적 조성물의 사용을 제공한다.
제7 양태에서, 본 발명은 질환 또는 장애를 치료하거나 예방하는 방법을 제공하며, 본 발명의 제1 또는 제3 양태에 따르는 T 세포, 또는 본 발명의 제4 양태에 따르는 약학적 조성물 치료적으로 또는 예방적 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
제8 양태에서, 본 발명은 대상체에서 질환 또는 장애를 치료하거나 예방하는 방법을 제공하는데,
(a) 대상체로부터 적어도 하나의 T 세포를 분리하는 단계;
(b) 바이러스에 특이적인 T 세포 수용체 (TCR)를 발현하거나 포함하도록 적어도 하나의 T 세포를 변형시키는 단계; 및
(c) 변형된 적어도 하나의 T 세포를 대상체에게 투여하는 단계;
를 포함하며,
여기서 변형된 적어도 하나의 T 세포는 비-활성화된 T 세포이다. 일부 구체예에서, 적어도 하나의 T 세포를 바이러스에 특이적인 TCR을 발현하거나 포함하도록 변형시키는 것은 바이러스에 특이적인 TCR을 암호화하는 핵산을 적어도 하나의 T 세포로 도입하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 핵산은 형질 도입, 예를 들어, 감마레트로바이러스 형질 도입, 렌티바이러스 형질 도입에 의해 T 세포로 도입된다. 일부 구체예에서, 핵산은 DNA 또는 RNA 트랜스펙션, 예를 들어, mRNA 전기천공법에 의해 적어도 하나의 T 세포로 도입된다. 일부 구체예에서, 핵산은 트랜스포손-기반 시스템, 예를 들어, Spleeping Beauty에 의해 T 세포로 도입된다.
제9 양태에서, 본 발명은 본 발명의 제1 또는 제3 양태에 따르는 T 세포, 또는 본 발명의 제4 양태에 따르는 약학적 조성물의 사전 결정된 양을 포함하는 부품 키트를 제공한다.
제10 양태에서, 본 발명은 바이러스에 특이적인 T 세포 수용체 (TCR)를 포함하는 T 세포, 선택적으로는 분리된 T 세포를 제공하며, 이것은 하나 이상의 세포 독성 인자의 감소된 발현 또는 활성을 위해 변형된다. 일부 구체예에서, 세포 독성 인자는 퍼포린, 그랜자임 B, 그랜자임 A, 그래뉼리신, 및 FASL로부터 선택된다. 일부 구체예에서, T 세포는 바이러스로 감염된 세포에서 바이러스의 복제를 억제할 수 있다. 일부 구체예에서, T 세포는 바이러스로 감염된 세포에서 바이러스의 복제를 세포 독성 인자의 감소된 발현 또는 활성을 위해 변형되지 않은 바이러스에 특이적인 TCR을 포함하는 활성화된 T 세포에 의한 바이러스 복제의 억제의 적어도 50%로 억제할 수 있다. 일부 구체예에서, T 세포는 세포 독성 인자의 감소된 발현 또는 활성을 위해 변형되지 않은 바이러스에 특이적인 TCR를 포함하는 활성화된 T 세포와 비교하여 바이러스로 감염되거나, 또는 상기 바이러스의 펩타이드를 포함하는 세포에 대하여 감소된 세포 독성을 나타낸다. 일부 구체예에서, T 세포는 TCR을 암호화하는 외인성 핵산을 포함한다.
제11 양태에서, 본 발명은 바이러스에 특이적인 변형된 T 세포를 생산하기 위한 방법, 선택적으로는 시험관 내 방법을 제공하는데, 방법은 하나 이상의 세포 독성 인자의 발현 또는 활성을 감소시키기 위해 T 세포를 변형시키는 단계를 포함하며, 여기서 변형된 T 세포는 바이러스에 특이적인 T 세포 수용체 (TCR)를 포함한다. 일부 구체예에서, 방법은 본 발명의 제10 양태에 따르는 T 세포를 생산하기 위한 것이다. 일부 구체예에서, 하나 이상의 세포 독성 인자의 발현 또는 활성을 감소시키기 위해 T 세포를 변형시키는 것은 T 세포를 하나 이상의 세포 독성 인자발현 또는 활성을 억제하기 위한 작용제로 처리하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 세포 독성 인자는 퍼포린, 그랜자임 B, 그랜자임 A, 그래뉼리신, 및 FASL로부터 선택된다. 일부 구체예에서, 방법은 바이러스에 특이적인 TCR을 발현하거나 포함하도록 T 세포를 변형시키는 단계를 추가적으로 포함한다. 일부 구체예에서, 바이러스에 특이적인 TCR을 발현하거나 포함하도록 T 세포를 변형시키는 것은 바이러스에 특이적인 TCR를 암호화하는 핵산을 T 세포로 도입하는 것을 포함한다.
제12 양태에서, 본 발명은 T 세포, 선택적으로는 분리된 T 세포를 제공하며, 여기서 T 세포는 본 발명의 제11 양태에 따르는 방법에 의해 얻어지거나 얻어질 수 있다.
제13 양태에서, 본 발명은 본 발명의 제10 또는 제12 양태에 따르는 T 세포, 및 약학적으로 허용 가능한 담체, 보조제, 부형제, 또는 희석제를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.
제14 양태에서, 본 발명은 질환 또는 장애를 치료하거나 예방하는 방법에서 사용을 위한 본 발명의 제10 또는 제12 양태에 따라는 T 세포, 또는 본 발명의 제13 양태에 따르는 약학적 조성물을 제공한다.
제15 양태에서, 본 발명은 질환 또는 장애를 치료하거나 예방하는 방법에서 사용을 위한 의약의 제조에서 본 발명의 제10 또는 제12 양태에 따르는 T 세포, 또는 본 발명의 제13 양태에 따르는 약학적 조성물을 제공한다.
제16 양태에서, 본 발명은 질환 또는 장애를 치료하거나 예방하는 방법을 제공하며, 본 발명의 제10 또는 제12 양태에 따르는 T 세포, 또는 본 발명의 제13 양태에 따르는 약학적 조성물의 치료적 또는 예방적 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
제17 양태에서, 본 발명은 대상체에서 질환 또는 장애를 치료하거나 예방하는 방법을 제공하는데,
(a) 대상체로부터 바이러스에 특이적인 적어도 하나의 T 세포를 분리하는 단계;
(b) 하나 이상의 세포 독성 인자의 감소된 발현 또는 활성을 위해 적어도 하나의 T 세포를 변형시키는 단계; 및
(c) 변형된 적어도 하나의 T 세포를 대상체에게 투여하는 단계
를 포함한다.
제18 양태에서, 본 발명은 대상체에서 질환 또는 장애를 치료하거나 예방하는 방법을 제공하는데,
(a) 대상체로부터 적어도 하나의 T 세포를 분리하는 단계;
(b) 바이러스에 특이적인 T 세포 수용체 (TCR)를 발현하거나 포함하도록 적어도 하나의 T 세포를 변형시키는 단계로서,
(i) T 세포는 세포 독성 인자의 감소된 발현 또는 활성을 위해 변형되거나, 또는
(ii) 방법은 하나 이상의 세포 독성 인자의 감소된 발현 또는 활성을 위해 적어도 하나의 T 세포를 변형시키는 단계를 더 포함하는 단계;
(c) 변형된 적어도 하나의 T 세포를 대상체에게 투여하는 단계
를 포함한다. 일부 구체예에서, 바이러스에 특이적인 TCR를 발현하거나 포함하도록 적어도 하나의 T 세포를 변형시키는 것은 바이러스에 특이적인 TCR를 암호화하는 핵산을 적어도 하나의 T 세포로 도입하는 것을 포함한다.
본 발명의 제17 및 제18 양태에 따르는 일부 구체예에서, 하나 이상의 세포 독성 인자의 감소된 발현 또는 활성을 위해 적어도 하나의 T 세포를 변형시키는 것은 적어도 하나의 T 세포를 하나 이상의 세포 독성 인자의 발현 또는 활성을 억제하기 위한 작용제로 처리하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 세포 독성 인자는 퍼포린, 그랜자임 B, 그랜자임 A, 그래뉼리신, 및 FASL로부터 선택된다.
제19 양태에서, 본 발명은 본 발명의 제10 또는 제12 양태에 따르는 T 세포, 또는 본 발명의 제13 양태에 따르는 약학적 조성물의 사전 결정된 양을 포함하는 부품 키트를 제공한다.
제20 양태에서, 본 발명은 (i) 바이러스에 특이적인 T 세포 수용체 (TCR)를 암호화하는 핵산 및 (ii) 세포 독성 인자의 발현 또는 활성을 감소시키기 위한 작용제를 포함하는 부품 키트를 제공한다.
다양한 양태와 관련하여, 일부 구체예에서, 본 발명은 바이러스에 특이적인 T 세포 수용체 (TCR)를 포함하는 T 세포, 선택적으로는 분리된 T 세포를 제공하며, 여기서 T 세포는 (i) 바이러스로 감염된 세포에서 바이러스의 복제를 억제할 수 있고, (ii) 세포 독성 인자의 감소된 발현 또는 활성을 위해 변형되지 않은 바이러스에 특이적인 TCR을 포함하는 활성화된 T 세포와 비교하여 바이러스로 감염되거나, 또는 상기 바이러스의 펩타이드를 포함하는 세포에 대하여 감소된 세포 독성을 나타낸다. 일부 구체예에서, T 세포는 TCR을 암호화하는 외인성 핵산을 포함한다. 일부 구체예에서, T 세포는 세포 독성 인자의 감소된 발현 또는 활성을 위해 변형되지 않은 활성화된 T 세포의 발현 또는 활성의 수준과 비교하여 감소된 수준의 하나 이상의 세포 독성 인자의 발현 또는 활성을 나타낸다. 일부 구체예에서, T 세포는 하나 이상의 세포 독성 인자의 감소된 발현 또는 활성을 위해 변형된다. 일부 구체예에서, 세포 독성 인자는 퍼포린, 그랜자임 B, 그랜자임 A, 그래뉼리신, 및 FASL로부터 선택된다. 일부 구체예에서, T 세포는 세포 독성 인자의 감소된 발현 또는 활성을 위해 변형되지 않은 활성화된 T 세포의 발현 또는 활성과 비교하여 RANTES, IL-13, MIP-1α 및 MIP-1β 중 하나 이상의 감소된 발현 또는 활성을 나타낸다. 일부 구체예에서, T 세포는 바이러스로 감염된 세포에서 바이러스의 복제를 세포 독성 인자의 감소된 발현 또는 활성을 위해 변형되지 않은 바이러스에 특이적인 TCR을 포함하는 활성화된 T 세포에 의한 바이러스 복제의 억제의 적어도 50%로 억제할 수 있다.
다양한 양태와 관련하여, 본 발명에 따르는 바이러스에 특이적인 T 세포를 생산하기 위한 방법의 일부 구체예에서, 방법은 바이러스에 특이적인 TCR을 발현하거나 포함하도록 T 세포를 변형시키는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, 변형된 T 세포는 (i) 바이러스로 감염된 세포에서 바이러스의 복제를 억제할 수 있고, (ii) 세포 독성 인자의 감소된 발현 또는 활성을 위해 변형되지 않은 바이러스에 특이적인 TCR을 포함하는 활성화된 T 세포와 비교하여 바이러스로 감염되거나, 또는 상기 바이러스의 펩타이드를 포함하는 세포에 대하여 감소된 세포 독성을 나타낸다. 일부 구체예에서, 바이러스에 특이적인 TCR을 발현하거나 포함하도록 T 세포를 변형시키는 것은 바이러스에 특이적인 TCR을 암호화하는 핵산을 T 세포로 도입하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 핵산은 형질 도입, 예를 들어, 감마레트로바이러스 형질 도입, 렌티바이러스 형질 도입에 의해 T 세포로 도입된다. 일부 구체예에서, 핵산은 DNA 또는 RNA 트랜스펙션, 예를 들어, mRNA 전기천공법에 의해 T 세포로 도입된다. 일부 구체예에서, 핵산은 트랜스포손-기반 시스템, 예를 들어, Spleeping Beauty에 의해 T 세포로 도입된다. 일부 구체예에서, 하나 이상의 세포 독성 인자의 발현 또는 활성을 감소시키기 위해 T 세포를 변형시키는 것은 T 세포를 하나 이상의 세포 독성 인자의 발현 또는 활성을 억제하기 위한 작용제로 처리하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 세포 독성 인자는 퍼포린, 그랜자임 B, 그랜자임 A, 그래뉼리신, 및 FASL로부터 선택된다.
본 발명의 원칙을 설명하는 구체예 및 실험들은 이제 첨부된 도면을 참고하여 논의될 것이다:
도 1. T 세포에서 HBV TCR 발현을 나타내는 그래프. (A) 펜타머 염색으로 측정된 바와 같이, HBV TCR을 암호화하는 mRNA로 전기천공된 휴지기 및 활성화 T 세포에서 HBV TCR의 발현을 나타내는 산점도. (B) 전기천공법 이후 시간이 흐름에 따른 TCR의 발현 수준을 나타내는 그래프. MFI = 평균 형광 강도.
도 2. HBV TCR mRNA로 전기천공된 T 세포의 표현형을 나타내는 그래프. (A) 전기천공된 휴지기 T 세포에 의한 CD45RA, CD62L, CD27 및 CD28 발현을 나타내는 산점도, 및 휴지기 T 세포 부분 집합 중에서 CD8+ 덱스트라머+ 세포의 %를 나타내는 차트. (B) 전기천공된 활성화된 T 세포에 의한 CD45RA, CD62L, CD27 및 CD28 발현을 나타내는 산점도, 및 활성화된 T 세포 부분 집합 중에서 CD8+ 덱스트라머+ 세포의 %를 나타내는 차트. CM = 중심 기억, EM = 효과기 기억, TEM = 말단 효과기 기억.
도 3. HBV TCR mRNA로 전기천공된 T 세포에 의한 세포 독성 인자의 발현을 나타내는 그래프. (A) 비자극 활성화된, 전기천공된 T 세포와 비교하여 펩타이드로 자극된 전기천공된, 활성화된 T 세포에 의한 퍼포린 및 그랜자임의 발현을 나타내는 히스토그램. (B) 비자극, 휴지기 전기천공된 T 세포와 비교하여 펩타이드로 자극된 전기천공된, 휴지기 T 세포에 의한 퍼포린 및 그랜자임의 발현을 나타내는 히스토그램. (C) 총 림프구 수 중의 그랜자임 B+ CD8 세포의 퍼센트를 나타내는 차트. (D) 총 림프구 수 중의 퍼포린+ CD8 세포의 퍼센트를 나타내는 차트. 및 (E) 펩타이드-특이적 자극의 5시간 또는 24시간 후, 또는 자극의 부재시 (비자극), 활성화된, 전기천공된 T 세포 및 휴지기, 전기천공된 T 세포에 대한 총 림프구 수 중의 IFN-γ+ CD8 세포의 퍼센트를 나타내는 차트.
도 4. HBV 항원을 발현하는 세포에 대한, HBV TCR mRNA로 전기천공된 T 세포의 세포 독성을 나타내는 그래프 및 막대 그래프. (A) 상이한 효과기: 표적 세포 비로 휴지기, 전기천공된 T 세포에 의한 HBV 항원을 발현하는 세포의 % 세포 살해를 나타내는 그래프. (B) 상이한 효과기:표적 세포 비로 활성화된, 전기천공된 T 세포에 의한 HBV 항원을 발현하는 세포의 % 세포 살해를 나타내는 그래프. (C) 활성화된, 전기천공된 T 세포, 휴지기, 전기천공된 T 세포, 활성화된, 비-전기천공된 T 세포 및 휴지기, 비-전기천공된 T 세포에 의한 HBV Env 항원을 발현하는 세포의 % 세포 살해를 나타내는 막대 그래프.
도 5. 활성화된, 전기천공된 T 세포, 휴지기, 전기천공된 T 세포, 활성화된, 비-전기천공된 T 세포 및 휴지기, 비-전기천공된 T 세포에 의한 다양한 가용성 인자의 발현을 나타내는 이미지 및 막대 그래프.
도 6. 상이한 효과기:표적 세포 비로 HCV 레플리콘-감염된 간 세포에 대한 T 세포의 항바이러스 활성 및 세포 독성을 나타내는 그래프. 발광의 % 감소에 의해 결정된 바이러스 복제의 억제를 나타내는 막대, 및 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라제 (AST) 수준에 의해 결정된 세포 용해를 나타내는 선. (A) 휴지기, 전기천공된 T 세포 및 휴지기, 비-전기천공된 T 세포. (B) 활성화된, 전기천공된 T 세포 및 활성화된, 비-전기천공된 T 세포.
도 7. 1:3의 효과기:표적 비로 HBV 바이러스-감염된 간 세포에 대한 T 세포의 항바이러스 활성 및 세포 독성을 나타내는 그래프. HBV DNA에 대한 qPCR에 의해 결정된 바이러스 복제의 억제를 나타내는 막대, 및 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라제 (AST) 수준에 의해 결정된 세포 용해를 나타내는 선.
도 8. 휴지기 CD8+ T 세포에서 림포톡신 B 또는 LIGHT의 발현을 나타내는 산점도. (A) HBV TCR-양성, 비자극 CD8+ T 세포에서의 발현. (B) TCR 특이적 펩타이드로 펄스가 가해진 세포로의 자극 24h 및 48h 후 HBV TCR-양성, CD8+ T 세포에서의 발현. (C) CD3 및 CD28을 통한 활성화 24h 및 48h 후 HBV TCR-양성, CD8+ T 세포에서의 발현. (D) IFN-γ로의 처리 24h 후 HBV TCR-양성, CD8+ T 세포에서의 발현.
도 1. T 세포에서 HBV TCR 발현을 나타내는 그래프. (A) 펜타머 염색으로 측정된 바와 같이, HBV TCR을 암호화하는 mRNA로 전기천공된 휴지기 및 활성화 T 세포에서 HBV TCR의 발현을 나타내는 산점도. (B) 전기천공법 이후 시간이 흐름에 따른 TCR의 발현 수준을 나타내는 그래프. MFI = 평균 형광 강도.
도 2. HBV TCR mRNA로 전기천공된 T 세포의 표현형을 나타내는 그래프. (A) 전기천공된 휴지기 T 세포에 의한 CD45RA, CD62L, CD27 및 CD28 발현을 나타내는 산점도, 및 휴지기 T 세포 부분 집합 중에서 CD8+ 덱스트라머+ 세포의 %를 나타내는 차트. (B) 전기천공된 활성화된 T 세포에 의한 CD45RA, CD62L, CD27 및 CD28 발현을 나타내는 산점도, 및 활성화된 T 세포 부분 집합 중에서 CD8+ 덱스트라머+ 세포의 %를 나타내는 차트. CM = 중심 기억, EM = 효과기 기억, TEM = 말단 효과기 기억.
도 3. HBV TCR mRNA로 전기천공된 T 세포에 의한 세포 독성 인자의 발현을 나타내는 그래프. (A) 비자극 활성화된, 전기천공된 T 세포와 비교하여 펩타이드로 자극된 전기천공된, 활성화된 T 세포에 의한 퍼포린 및 그랜자임의 발현을 나타내는 히스토그램. (B) 비자극, 휴지기 전기천공된 T 세포와 비교하여 펩타이드로 자극된 전기천공된, 휴지기 T 세포에 의한 퍼포린 및 그랜자임의 발현을 나타내는 히스토그램. (C) 총 림프구 수 중의 그랜자임 B+ CD8 세포의 퍼센트를 나타내는 차트. (D) 총 림프구 수 중의 퍼포린+ CD8 세포의 퍼센트를 나타내는 차트. 및 (E) 펩타이드-특이적 자극의 5시간 또는 24시간 후, 또는 자극의 부재시 (비자극), 활성화된, 전기천공된 T 세포 및 휴지기, 전기천공된 T 세포에 대한 총 림프구 수 중의 IFN-γ+ CD8 세포의 퍼센트를 나타내는 차트.
도 4. HBV 항원을 발현하는 세포에 대한, HBV TCR mRNA로 전기천공된 T 세포의 세포 독성을 나타내는 그래프 및 막대 그래프. (A) 상이한 효과기: 표적 세포 비로 휴지기, 전기천공된 T 세포에 의한 HBV 항원을 발현하는 세포의 % 세포 살해를 나타내는 그래프. (B) 상이한 효과기:표적 세포 비로 활성화된, 전기천공된 T 세포에 의한 HBV 항원을 발현하는 세포의 % 세포 살해를 나타내는 그래프. (C) 활성화된, 전기천공된 T 세포, 휴지기, 전기천공된 T 세포, 활성화된, 비-전기천공된 T 세포 및 휴지기, 비-전기천공된 T 세포에 의한 HBV Env 항원을 발현하는 세포의 % 세포 살해를 나타내는 막대 그래프.
도 5. 활성화된, 전기천공된 T 세포, 휴지기, 전기천공된 T 세포, 활성화된, 비-전기천공된 T 세포 및 휴지기, 비-전기천공된 T 세포에 의한 다양한 가용성 인자의 발현을 나타내는 이미지 및 막대 그래프.
도 6. 상이한 효과기:표적 세포 비로 HCV 레플리콘-감염된 간 세포에 대한 T 세포의 항바이러스 활성 및 세포 독성을 나타내는 그래프. 발광의 % 감소에 의해 결정된 바이러스 복제의 억제를 나타내는 막대, 및 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라제 (AST) 수준에 의해 결정된 세포 용해를 나타내는 선. (A) 휴지기, 전기천공된 T 세포 및 휴지기, 비-전기천공된 T 세포. (B) 활성화된, 전기천공된 T 세포 및 활성화된, 비-전기천공된 T 세포.
도 7. 1:3의 효과기:표적 비로 HBV 바이러스-감염된 간 세포에 대한 T 세포의 항바이러스 활성 및 세포 독성을 나타내는 그래프. HBV DNA에 대한 qPCR에 의해 결정된 바이러스 복제의 억제를 나타내는 막대, 및 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라제 (AST) 수준에 의해 결정된 세포 용해를 나타내는 선.
도 8. 휴지기 CD8+ T 세포에서 림포톡신 B 또는 LIGHT의 발현을 나타내는 산점도. (A) HBV TCR-양성, 비자극 CD8+ T 세포에서의 발현. (B) TCR 특이적 펩타이드로 펄스가 가해진 세포로의 자극 24h 및 48h 후 HBV TCR-양성, CD8+ T 세포에서의 발현. (C) CD3 및 CD28을 통한 활성화 24h 및 48h 후 HBV TCR-양성, CD8+ T 세포에서의 발현. (D) IFN-γ로의 처리 24h 후 HBV TCR-양성, CD8+ T 세포에서의 발현.
T 세포
본 발명에 따르는 양태에서, T 세포, 선택적으로는 분리된 T 세포가 제공된다. 본원에서 본 발명의 다양한 양태에 따르면, 'T 세포'는 선택적으로는 'T 세포의 집단'일 수도 있고, '분리된 T 세포'는 선택적으로는 'T 세포의 분리된 집단'일 수도 있다.
CD8+ 및 CD4+ T 세포는 적응성 면역 시스템의 일부이다. CD8+ T 세포의 정상적인 기능은 암 세포 및 세포 내 병원체, 예컨대 박테리아 및 바이러스로 감염된 세포를 살해하는 것이다. CD4+ T 세포는 빈번하게 T 보조 세포(T helper cell)로서 특징지어 지고 B 세포에 의한 항체의 생산을 촉진하며, CD8+ T 세포의 반응을 향상 및 유지시키고, 대식 세포 활성을 조절한다.
T 세포는 상이한 발달 단계를 거치며, T 세포가 T 세포가 특이적인 접촉된 항원을 갖는지 여부 및 이러한 임의의 접촉 상황에 따라 상이한 표현형을 갖는다. T 세포 발달 및 활성화는, 예를 들어, Janeway et al., Immunobiology, (2001) 5th Edn, Garland Science, New York, Chapters 7 and 8에 기술되어 있으며, 이것은 그 전문이 참고로 포함된다.
활성화된 T 세포는 T 세포 활성화의 공정을 거친 T 세포이다. T 세포는 T 세포의 TCR이 항원 제공 세포 (APC)로부터의 양성 동시 자극 신호의 맥락에서 높은 친화도를 갖는 결합 MHC-펩타이드 복합체의 결과로서 활성화될 수도 있다. 활성화는 생체 내, 생체 외 또는 시험관 내에서 이루어질 수도 있다. T 세포는 또한 CD3를 통한, 선택적으로는 CD28을 통한 자극과 조합으로, 및 선택적으로는 고 IL-2 조건 하에서의 배양과 조합으로 자극의 결과로서 활성화될 수도 있다. 일부 구체예에서, 활성화된 T 세포는, 예를 들어, 아고니스트 항-CD3 항체로의 처리를 통한 자극에 의해, 선택적으로는 아고니스트 항-CD28 항체로의 처리와 조합으로, 및 선택적으로는 고 IL-2 조건 하에서의 배양과 조합으로 시험관 내 또는 생체 외에서 활성화될 수도 있다. 고 IL-2 조건은 >100 IU/ml, 예를 들어, >500 IU/ml, >600 IU/ml, >800 IU/ml, >900 IU/ml의 IL-2 농도일 수도 있다.
비-활성화된 T 세포는 활성화되지 않은, T 세포 활성화의 공정을 거치지 않은 T 세포이다. 본원에서, 비-활성화된 T 세포는 또한 휴지기 T 세포로서 기술될 수도 있다. 일부 구체예에서, 비-활성화된 T 세포는 T 세포의 TCR이 APC로부터의 양성 동시 자극 신호의 맥락에서 높은 친화도를 갖는 MHC-펩타이드 복합체와 접촉하지 않은 T 세포이다. 일부 구체예에서, 비-활성화된 T 세포는 CD3를 통해, 선택적으로는 CD28을 통한 자극과 조합으로, 및 선택적으로는 고 IL-2 조건 하에서의 배양과 조합으로 자극되지 않은 T 세포이다. 일부 구체예에서, 비-활성화된 T 세포는, 예를 들어, 아고니스트 항-CD3 항체로의 처리를 통한 자극에 의해, 선택적으로는 아고니스트 항-CD28 항체로의 처리와 조합으로, 및 선택적으로는 고 IL-2 조건 하에서의 배양과 조합으로 시험관 내 또는 생체 외에서 활성화되지 않았다.
일부 구체예에서, 본 발명의 다양한 양태에 따르면, 활성화된 T 세포는 나이브(naive) T 세포일 수도 있다. 일부 구체예에서, 본 발명의 다양한 양태에 따르면, 비-활성화된 T 세포는 나이브 T 세포일 수도 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, 나이브 T 세포는 T 세포의 TCR이, 예를 들어, APC에 의해 제공된 높은 친화도를 갖는 펩타이드 또는 MHC-펩타이드 복합체와 접촉되지 않은 T 세포이다.
비-활성화된 및 활성화된 T 세포는, 예를 들어, Ahlers and Belyakov, Blood (2010) 115(9): 1678-1689에서 기술된 특정 마커의 발현을 참고하여 특징지어 질 수 있으며, 이것은 그 전문이 참고로 포함된다. 비-활성화된 및 활성화된 T 세포는 또한 세포의 기능적 성질에 관하여 특징지어 질 수도 있다.
일부 구체예에서, 비-활성화된 T 세포는 세포 표면에서 CD45RA, CCR7 또는 CD62L 중 하나 이상을 발현할 수도 있다. 일부 구체예에서, 비-활성화된 T 세포는 세포 표면에서 활성화된 T 세포의 세포 표면에서의 발현과 비교하여 CD45RA, CCR7 또는 CD62L 중 하나 이상을 더 높은 수준으로 발현할 수도 있다.
일부 구체예에서, 비-활성화된 T 세포는 CD45RAhigh 표현형을 가질 수도 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, CD45RAhigh 표현형을 가진 T 세포는, 예를 들어, 유동 세포 분석법에 의해 세포 표면에서, 높은 수준의 CD45RA를 발현하는 것으로 결정된 세포이다. 당업자는, 예를 들어, 유동 세포 분석법에 의한 분석에 의해, 예를 들어, 세포 표면에서 주어진 분자를 발현하지 않거나, 또는 더 낮은 발현 수준으로 분자를 발현하는 대조군 세포 또는 세포 집단을 참고하여 상기 분자의 '높은' 표면 발현을 나타내는 세포 또는 세포 집단을 쉽게 결정할 수 있다.
일부 구체예에서, 비-활성화된 T 세포는 세포 표면에서 활성화된 T 세포의 세포 표면에서의 발현과 비교하여 CD45RO, CD43 또는 KLRG1 중 하나 이상을 낮은 수준으로 발현할 수도 있거나, 또는 세포 표면에서 CD45RO, CD43 또는 KLRG1 중 하나 이상을 검출 가능한 수준으로 발현하지 않을 수도 있다. 비-활성화된 (휴지기) T 세포에서 세포 용해 효소가 거의 또는 전혀 발현되지 않고 더 분화된 세포 유형과 비교하여 특정 사이토카인이 더 낮게 발현되는 것으로 알려져 있다 (Chattopadhyay et al., J Leukoc Biol (2009) 85(1): 88-97, 그 전문이 참고로 포함됨).
따라서, 일부 구체예에서, 비-활성화된 T 세포는 활성화된 T 세포에 의한 발현과 비교하여 퍼포린, 그랜자임 (예를 들어, 그랜자임 B 또는 그랜자임 A), 또는 그래뉼리신 중 하나 이상에 의한 낮은 수준의 발현으로 정의될 수도 있다. 일부 구체예에서, 비-활성화된 T 세포는 퍼포린, 그랜자임 (예를 들어, 그랜자임 B 또는 그랜자임 A), 또는 그래뉼리신 중 하나 이상을 검출 가능한 수준으로 발현하지 않을 수도 있다. 일부 구체예에서, 비-활성화된 T 세포는 활성화된 T 세포가 특이적 TCR을 포함하는 펩타이드로의 자극 후 활성화된 T 세포에 의한 발현과 비교하여 비-활성화된 T 세포가 특이적 TCR을 포함하는 펩타이드로의 자극 후 퍼포린, 그랜자임 (예를 들어, 그랜자임 B 또는 그랜자임 A), 또는 그래뉼리신 중 하나 이상을 낮은 수준으로 발현할 수도 있다.
일부 구체예에서, 비-활성화된 T 세포는 비-활성화된 T 세포가 특이적 TCR을 포함하는 펩타이드로의 자극 후 퍼포린, 그랜자임 (예를 들어, 그랜자임 B 또는 그랜자임 A), 또는 그래뉼리신 중 하나 이상을 검출 가능한 수준으로 발현하지 않을 수도 있다 (예를 들어, 유동 세포 분석법에 의해 결정됨). 일부 구체예에서, 비-활성화된 T 세포가 특이적 TCR을 포함하는 펩타이드로의 자극 후 비-활성화된 T 세포에 의한 퍼포린, 그랜자임 (예를 들어, 그랜자임 B 또는 그랜자임 A), 또는 그래뉼리신 중 하나 이상의 발현은 비-활성화된 T 세포가 특이적 TCR을 포함하는 펩타이드로 자극되지 않은 비-활성화된 T 세포에 의한 발현과 비교하여 증가하지 않는다.
펩타이드로의 자극은 본원에서 실시예 6에서 기술된 바와 같이 수행될 수 있다. 간략히 말하면, T 세포가 특이적 TCR을 포함하는 펩타이드를 제공할 수 있는 MHC를 발현하는 세포는 1 pg/ml의 펩타이드로 1 h 동안 펄스가 가해졌고, 2회 세척한 다음 T 세포와 함께, 선택적으로는 브레펠딘 A의 존재 하에서 5h 동안 또는 밤새도록 동시-배양될 수도 있다.
퍼포린, 그랜자임 (예를 들어, 그랜자임 B 또는 그랜자임 A), 또는 그래뉼리신의 유전자/단백질 발현은 본원에서 기술된 바와 같이 분석되고 정량될 수 있다. 일부 구체예에서, 비-활성화된 T 세포가 특이적 TCR을 포함하는 펩타이드로의 자극 후, 본 발명에 따르는 비-활성화된 T 세포는 펩타이드로의 자극 전 비-활성화된 T 세포에 의한 발현 수준, 또는 펩타이드로 자극되지 않은 대조군 비-활성화된 T 세포에 의한 발현 수준의 2배 미만, 1.9배 미만, 1.8배 미만, 1.7배 미만, 1.6배 미만, 1.5배 미만, 1.4배 미만, 1.3배 미만, 1.2배 미만, 또는 1.1배 미만의 수준으로 퍼포린, 그랜자임 (예를 들어, 그랜자임 B 또는 그랜자임 A), 또는 그래뉼리신 중 하나 이상을 발현할 수 있다.
본원의 구체예에서, 펩타이드로의 T 세포의 자극은 T 세포를 펩타이드, 펩타이드를 포함하는 바이러스, 펩타이드를 포함하는 세포, 또는 펩타이드를 포함하는 바이러스를 포함하는 (예를 들어, 바이러스로 감염된) 세포와 접촉시키는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 펩타이드를 포함하는 세포는 펩타이드를 포함하거나 발현하도록 변형될 수 있다. 예를 들어, 일부 구체예에서, 세포는 펩타이드를 암호화하는 핵산을 포함하도록 변형될 수 있거나, 또는 펩타이드로 펄스가 가해질 수 있다. 일부 구체예에서, 자극은 시험관 내에서 이루어질 수도 있다. 일부 구체예에서, 자극은 생체 외에서 이루어질 수도 있다.
일부 구체예에서, 비-활성화된 T 세포는 활성화된 T 세포에 의한 발현과 비교하여 RANTES, IL- 3, MIP-1α 및 MIP-1β 중 하나 이상을 낮은 수준으로 발현할 수 있다. 발현은 본원에서 하기 설명된 바와 같이, 유전자 또는 단백질 발현일 수도 있다.
일부 구체예에서, 활성화된 T 세포는 세포 표면에서 CD45RO, CD43 또는 KLRG1 중 하나 이상을 발현할 수도 있다. 일부 구체예에서, 활성화된 T 세포는 세포 표면에서 비-활성화된 T 세포의 세포 표면에서의 발현과 비교하여 CD45RO, CD43 또는 KLRG1 중 하나 이상을 높은 수준으로 발현할 수 있다. 일부 구체예에서, 활성화된 T 세포는 세포 표면에서 비-활성화된 T 세포의 세포 표면에서의 발현과 비교하여 CD45RA, CCR7 또는 CD62L 중 하나 이상을 낮은 수준으로 발현할 수 있거나, 또는 세포 표면에서 CD45RA, CCR7 또는 CD62L 중 하나 이상을 검출 가능한 수준으로 발현하지 않을 수도 있다. 일부 구체예에서, 활성화된 T 세포는 CD45RAlow 표현형을 가질 수도 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, CD45RAlow 표현형을 가진 T 세포는, 예를 들어, 유동 세포 분석법에 의해, 세포 표면에서 검출 가능한 수준으로 CD45RA를 발현하지만, 세포 표면에서 높은 발현 수준이 아닌 수준으로 CD45RA를 발현하는 것으로 결정된 세포이다. 당업자는, 예를 들어, 유동 세포 분석법에 의한 분석에 의해, 예를 들어, 세포 표면에서 주어진 분자를 더 높은 발현 수준으로 발현하는 대조군 세포 또는 세포 집단을 참고하여 상기 분자의 '낮은' 표면 발현을 나타내는 세포 또는 세포 집단을 쉽게 결정할 수 있다.
일부 구체예에서, 활성화된 T 세포는 비-활성화된 T 세포에 의한 발현과 비교하여 퍼포린, 그랜자임 (예를 들어, 그랜자임 B 또는 그랜자임 A), 또는 그래뉼리신 중 하나 이상을 높은 수준으로 발현할 수 있다. 일부 구체예에서, 활성화된 T 세포는 비-활성화된 T 세포가 특이적 TCR을 포함하는 펩타이드로의 자극 후 비-활성화된 T 세포에 의한 발현과 비교하여 활성화된 T 세포가 특이적 TCR을 포함하는 펩타이드로의 자극 후 퍼포린, 그랜자임 (예를 들어, 그랜자임 B 또는 그랜자임 A), 또는 그래뉼리신 중 하나 이상을 높은 수준으로 발현할 수 있다.
일부 구체예에서, 활성화된 T 세포는 비-활성화된 T 세포에 의한 발현과 비교하여 RANTES, IL-13, MIP-1α 및 MIP-1β 중 하나 이상을 높은 수준으로 발현할 수 있다.
일부 구체예에서, 비-활성화된 T 세포는 활성화된 T 세포가 특이적인 바이러스로 감염되거나, 또는 상기 바이러스의 펩타이드를 포함하는 세포에 대한 활성화된 T 세포에 의해 나타난 세포 독성과 비교하여 비-활성화된 T 세포가 특이적인 바이러스로 감염되거나, 또는 상기 바이러스의 펩타이드를 포함하는 세포에 대하여 감소된 세포 독성 활성을 나타낼 수도 있다. 일부 구체예에서, 비-활성화된 T 세포는 비-활성화된 T 세포가 특이적인 바이러스로 감염되거나, 또는 상기 바이러스의 펩타이드를 포함하는 세포에 대한 세포 독성 활성을 나타내지 않을 수도 있다.
일부 구체예에서, 비-활성화된 T 세포는 활성화된 T 세포의 세포 분열 속도와 비교하여 느린 세포 분열 속도를 가질 수도 있다 (즉, 세포는 단위 시간에 대하여 더 적은 세포 분열을 거칠 수도 있다). 주어진 세포/집단에 대한 세포 분열 속도는, 예를 들어, Fulcher and Wong, Immunol Cell Biol (1999) 77(6): 559-564에서 기술된 바와 같이, 예를 들어, 3H-티미딘 포함의 시험관 내 분석 또는 CFSE 희석 검정에 의해 분석될 수 있으며, 그 전문이 참고로 포함된다.
본원에서 사용된 바와 같이, '세포 독성'은 T 세포가 특이적인 바이러스로 감염되거나, 상기 바이러스의 펩타이드를 포함하고 및/또는 바이러스의 펩타이드를 제공하는 세포의 세포 사멸, 또는 세포 사멸의 유도를 지칭한다. 주어진 T 세포 또는 T 세포 집단의 세포 독성 활성은 당업자에게 널리 공지된 적합한 방법에 의해, 예를 들어, T 세포 또는 T 세포 집단을 바이러스로 감염되거나, 또는 상기 바이러스의 펩타이드를 포함하는 세포와 접촉시킨 후 세포 용해 마커의 수준을 측정함으로써 측정될 수 있다. 일부 구체예에서, 세포 독성은 본원에서 기술된 바와 같이, 바이러스로 감염되거나, 또는 상기 바이러스의 펩타이드를 포함하는 세포에 관한 것이다.
특정 구체예에서, 비-활성화된 T 세포 및 활성화된 T 세포는 다음 특징들 중 하나 이상을 참고하여 구별될 수 있다:
a) CD45RAhigh, CD62Lhigh 표현형을 가진 비-활성화된 T 세포;
b) CD45RAlow, CD62Lhigh 표현형을 가진 활성화된 T 세포;
c) T 세포가 특이적 TCR을 포함하는 펩타이드로의 자극에 반응하여 퍼포린 및/또는 그랜자임의 증가된 발현 (예를 들어, 유전자 또는 단백질 발현)을 나타내지 않는 비-활성화된 T 세포;
d) T 세포가 특이적 TCR을 포함하는 펩타이드로의 자극에 반응하여 퍼포린 및/또는 그랜자임의 증가된 발현 (예를 들어, 유전자 또는 단백질 발현)을 나타내는 활성화된 T 세포;
e) 예를 들어, 유동 세포 분석법에 의해 결정된 바와 같이, 활성화된 T 세포의 세포 표면에서의 발현에 비해 비-활성화된 T 세포의 세포 표면에서 CD45RA의 높은 발현 수준;
f) 예를 들어, 유전자 또는 단백질 발현에 의해 결정된 바와 같이, 활성화된 T 세포가 특이적 TCR을 포함하는 펩타이드로의 자극 후 활성화된 T 세포에 의한 발현에 비해 비-활성화된 T 세포가 특이적 TCR을 포함하는 펩타이드로의 자극 후 비-활성화된 T 세포에 의한 퍼포린 및/또는 그랜자임의 낮은 발현 수준;
g) 예를 들어, 유전자 또는 단백질 발현에 의해 (예를 들어, ELISA에 의해) 결정된 바와 같이, 활성화된 T 세포에 의한 발현에 비해 비-활성화된 T 세포에 의한 RANTES, 1L-13, MIP-1α 및 MIP-1β 중 하나 이상의 낮은 발현 수준;
h) 활성화된 T 세포에 대한 세포 분열 속도에 비해 비-활성화된 T 세포에 대한 느린 세포 분열 속도;
i) 예를 들어, 세포 독성에 대한 시험관 내 검정에서 결정된 바와 같이, 활성화된 T 세포에 비해 비-활성화된 T 세포에 대하여 T 세포가 특이적 TCR을 포함하는 바이러스로 감염되거나, 또는 상기 바이러스의 펩타이드를 포함하는 세포에 대한 낮은 세포 독성 수준.
본 명세서에 따르면, 비-활성화된 및/또는 활성화된 T 세포는 변형 전에 또는 후에, 예를 들어, 바이러스에 특이적인 TCR을 발현하거나 포함하도록 특징지어 질 수 있다.
일부 구체예에서, 이러한 비교의 목적을 위한 활성화된 및 비-활성화된 T 세포는, 예를 들어, 본원에서 기술된 바와 같이, 비-활성화된/활성화된 상태를 제외하고는 동일하다. 일부 구체예에서, 비-활성화된 T 세포 및 활성화된 T 세포는 같은 TCR을 포함하거나 발현한다. 일부 구체예에서, 활성화된 T 세포는, 예를 들어, 시험관 내 활성화에 의해 비-활성화된 T 세포로부터 유래된다.
T 세포에 의한 마커의 발현은 당업자에게 널리 공지된 다양한 방법에 의해 결정될 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, '발현'은 유전자 발현 또는 단백질 발현을 지칭할 수도 있다. 유전자 발현은 당업자에게 널리 공지된 다양한 수단에 의해 측정될 수 있다. 예를 들어, 주어진 유전자의 발현은 mRNA의 수준을 측정함으로써, 예를 들어, 정량적 실시간 PCR (qRT-PCR), 또는 리포터-기반 방법에 의해 측정될 수 있다. 유사하게, 단백질 발현은 업계에 널리 공지된 다양한 방법에 의해, 예를 들어, 항체-기반 방법, 예를 들어, 웨스턴 블롯, 면역조직화학법, 면역세포화학법, 유동 세포 분석법, ELISA, 등에 의해 측정될 수 있다. 발현은 또한 리포터-기반 방법에 의해 측정될 수 있다.
예를 들어, 세포 표면 마커의 발현은 세포를 관심있는 마커에 특이적으로 결합할 수 있는 작용제 (예를 들어, 항체)와 접촉시킴으로써, 및 세포로의 작용제의 결합을 검출함으로써, 예를 들어, 유동 세포 분석법에 의한 분석에 의해 분석될 수 있다. 세포의 활성은, 예를 들어, 관심있는 활성에 대한 시험관 내 검정을 사용하여 분석될 수 있다.
본 명세서에 따르면, 발현 또는 활성에 대한 판독값은 세포 또는 샘플 간에 비교될 수 있거나, 또는 기준치와 비교될 수도 있다. 예를 들어, 수준은 비-활성화된 T 세포 및 활성화된 T 세포 간에 비교될 수도 있다. 일부 구체예에서, 발현/활성의 수준은 개개의 세포, 또는 세포 집단에 대하여 계산된다. 일부 구체예에서, 발현/활성의 수준은 세포 또는 세포 집단에 대한 평균, 예를 들어, 발현/활성의 평균 또는 중간치이다.
일부 구체예에서, 또 다른 세포에 비해 주어진 유전자 또는 단백질의 감소된/낮은 발현 수준을 갖거나, 또는 주어진 활성의 감소된/낮은 수준을 갖는 세포는 대조 세포에 의한 발현/활성 수준의 100% 미만, 95% 미만, 90% 미만, 85% 미만, 80% 미만, 75% 미만, 70% 미만, 65% 미만, 60% 미만, 55% 미만, 50% 미만, 45% 미만, 40% 미만, 35% 미만, 30% 미만, 25% 미만, 20% 미만, 15% 미만, 10% 미만, 또는 5% 미만의 발현/활성 수준을 가질 수도 있다.
일부 구체예에서, 또 다른 세포에 비해 주어진 유전자 또는 단백질의 증가된/높은 발현 수준을 갖거나, 또는 주어진 활성의 증가된/높은 수준을 갖는 세포는 대조 세포에 의한 발현/활성의 수준의 1배 초과, 1.1배 초과, 1.2배 초과, 1.3배 초과, 1.4배 초과, 1.5배 초과, 1.6배 초과, 1.7배 초과, 1.8배 초과, 1.9배 초과, 2배 초과, 2.1배 초과, 2.2배 초과, 2.3배 초과, 2.4배 초과, 2.5배 초과, 2.6배 초과, 2.7배 초과, 2.8배 초과, 2.9배 초과, 3배 초과, 3.1배 초과, 3.2배 초과, 3.3배 초과, 3.4배 초과, 3.5배 초과, 3.6배 초과, 3.7배 초과, 3.8배 초과, 3.9 times 초과, 4배 초과, 4.1배 초과, 4.2배 초과, 4.3배 초과, 4.4배 초과, 4.5배 초과, 4.6배 초과, 4.7배 초과, 4.8배 초과, 4.9배 초과, 또는 5배 초과의 것을 갖는다.
상기 표현형 마커 외에도, T 세포는 T 세포에 대한 하나 이상의 마커의 검출에 기초하여 다른 세포 (예를 들어, 다른 림프구 및/또는 백혈구)로부터 구별될 수 있다. T 세포 마커는 CD3 폴리펩타이드 (예를 들어, CD3γ CD3ε CDζ 또는 CD3δ), TCR 폴리펩타이드 (TCRα 또는 TCRβ), CD27, CD28, CD4 및 CD8을 포함한다.
바이러스 특이성
본 발명은 특히 바이러스 특이적 T 세포, 즉, 바이러스로 감염되거나, 또는 상기 바이러스의 펩타이드를 포함하는 세포에 반응성인 T 세포와 관련이 있다.
본 발명에 따르는 바이러스 특이적 T 세포는 T 세포가 특이적인 바이러스로부터 유래된 펩타이드를 제공하는 MHC 분자에 결합할 수 있는 TCR을 포함한다.
T 세포 수용체 (TCR)는 전형적으로 α-사슬 및 β-사슬을 포함하는 헤테로다이머 항원-결합 분자이다. 자연에서, α-사슬 및 β-사슬은 불변 CD3 사슬을 가진 복합체로서 T 세포 (αβ T 세포)의 세포 표면에서 발현된다. γ 및 δ 사슬을 포함하는 대체 TCR은 T 세포 (γδ T 세포)의 부분 집합에서 발현된다. TCR은 주요 조직 적합성 복합체 (MHC) 분자에 의해 제공되는 항원 펩타이드을 인식한다 (이것에 결합한다). 펩타이드-MHC 복합체의 TCR 구조 및 인식은, 예를 들어, Immunobiology, 5th Edn. Janeway CA Jr, Travers P, Walport M, et al. New York: Garland Science (2001), Chapters 3 and 6에서 상세히 기술되어 있으며, 이것은 그 전문이 참고로 포함된다.
바이러스로부터 유래된 펩타이드는 비리온으로부터 유래되거나 바이러스의 핵산에 의해 암호화될 수도 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, "펩타이드"는 펩타이드 결합에 의해 결합된 둘 이상의 아미노산 모노머의 사슬을 지칭한다. 일부 구체예에서, 펩타이드는 길이가 50개 이하의 아미노산일 수도 있다. 일부 구체예에서, 펩타이드는 길이가 5-15, 5-14, 5-13, 5-12, 5-1 1, 5-10, 5-9 또는 5-8개의 아미노산 중 하나이다. 일부 구체예에서, 펩타이드는 길이가 5-15, 6-15, 7-15, 8-15, 9-15, 10-15, 11-15 또는 12-15개의 아미노산 중 하나이다. 일부 구체예에서, 펩타이드는 길이가 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 또는 15개의 아미노산 중 하나이다.
펩타이드는 MHC 분자, 예를 들어, MHC 분류 I 분자에 의해 제공된다. MHC 분류 I 분자는 α-사슬 및 β2-마이크로글로불린의 헤테로다이머이다. α-사슬은 α1, α2 및 α3으로 지정된 세 개의 도메인을 갖는다. α1 및 α2 도메인은 함께 MHC 분류 I 분자에 의해 제공된 펩타이드가 결합하는 그루브를 형성하여 펩타이드-MHC 복합체를 형성한다. MHC 분류 I α-사슬은 다형성이고, 상이한 α-사슬은 상이한 펩타이드에 결합하고 이것을 제공할 수 있다. 인간에서 MHC 분류 I α-사슬은 인간 백혈구 항원 (HLA) 유전자에 의해 암호화된다.
본 명세서에 따르는 T 세포의 TCR은 MHC 분류 I 분자에 의해 제공되는 바이러스 폴리펩타이드로부터 유래된 펩타이드에 결합할 수 있다.
본 발명에 따르는 바이러스는 제한되지 않으며, 임의의 바이러스가 될 수도 있다. 바이러스는 dsDNA 바이러스 (예를 들어, 아데노바이러스, 헤르페스바이러스, 폭스바이러스), ssRNA 바이러스 (예를 들어, 파르보바이러스), dsRNA 바이러스 (예를 들어, 레오바이러스), (+)ssRNA 바이러스 (예를 들어, 피코르나바이러스, 토가바이러스), (-)ssRNA 바이러스 (예를 들어, 오쏘믹소바이러스, 라브도바이러스), ssRNA-RT 바이러스 (예를 들어, 레트로바이러스) 또는 dsDNA-RT 바이러스 (예를 들어, 헤파드나바이러스)일 수도 있다
특히, 본 명세서는 아데노비리대, 헤르페스비리대, 파필로마비리대, 폴리오마비리대, 폭스비리대, 헤파드나비리대, 파르보비리대, 아스트로비리대, 칼리시비리대, 피코르나비리대, 코로나비리대, 플라비비리대, 토가비리대, 헤페비리대, 레트로비리대, 오쏘믹소비리대, 아레나비리대, 분야비리대, 필로비리대, 파라믹소비리대, 라브도비리대 및 레오비리대 과의 바이러스를 고려한다.
질환 또는 장애와 연관성이 있는 바이러스가 특히 흥미롭다. 따라서, 다음 바이러스들이 본 발명에 관련하여 고려된다: 아데노바이러스, 단순 헤르페스 1형 바이러스, 단순 헤르페스 2형 바이러스, 바리셀라-조스터 바이러스, 엡스타인-바 바이러스, 인간 사이토메갈로바이러스, 인간 헤르페스바이러스 8형, 인간 파필로마바이러스, BK 바이러스, JC 바이러스, 천연두, B형 간염 바이러스, 파르보바이러스 B19, 인간 아스트로바이러스, 노르워크 바이러스, 콕사키바이러스, A형 간염 바이러스, 폴리오바이러스, 리노바이러스, 중증 급성 호흡기 증후군 바이러스, C형 간염 바이러스, 황열병 바이러스, 뎅구 바이러스, 웨스트 나일 바이러스, TBE 바이러스, 루벨라 바이러스, E형 간염 바이러스, 인간 면역 결핍 바이러스, 인플루엔자 바이러스, 라싸 바이러스, 크림-콩고 출혈열 바이러스, 한탄 바이러스, 에볼라 바이러스, 마부르크 바이러스, 홍역 바이러스, 볼거리 바이러스, 파라인플루엔자 바이러스, 호흡기 세포 융합 바이러스, 광견병 바이러스, D형 간염 바이러스, 로타바이러스, 오르비바이러스, 콜티바이러스, 및 반나 바이러스.
특정 구체예에서, 바이러스는 간염 바이러스, 예를 들어, B형 간염 바이러스일 수도 있다.
일부 구체예에서, 바이러스는 바이러스로 감염된 세포에 직접적으로 세포 변성적이지 않은 바이러스일 수도 있다.
본 발명에 따르는 T 세포가 반응성인 세포는 바이러스로 감염된 세포일 수도 있거나, 또는 바이러스의 펩타이드를 포함하거나 발현하는 세포일 수도 있다. 바이러스로 감염되거나 또는 상기 바이러스를 포함하거나 발현하는 세포는 세포 표면에서 MHC 분류 I 분자의 맥락에서 바이러스의 펩타이드를 제공할 수도 있다.
바이러스로 감염되거나, 또는 상기 바이러스의 펩타이드를 포함하는 세포는 T 세포의 TCR이 특이적인 바이러스의 펩타이드를 제공할 수 있는 MHC 분류 I 분자를 암호화하는 HLA 대립 유전자를 포함할 수도 있다. 일부 구체예에서, 바이러스로 감염되거나, 또는 상기 바이러스의 펩타이드를 포함하는 세포는 T 세포의 TCR에 의해 인식되는 바이러스 펩타이드에 대하여 매치된 HLA일 수도 있다. 일부 구체예에서, T 세포는 T 세포의 TCR에 의해 인식되는 바이러스 펩타이드에 대하여 매치된 HLA인 공여체로부터 얻어진다.
일부 구체예에서, 세포는 바이러스로 감염된 결과로서 바이러스의 펩타이드를 발현하거나 포함할 수도 있다. 일부 구체예에서, 세포는 바이러스의 펩타이드를 포함하거나 발현하도록 변형될 수도 있다. 예를 들어, 일부 구체예에서는, 세포가 바이러스의 펩타이드를 암호화하는 핵산을 포함하도록 변형될 수도 있거나, 또는 바이러스의 펩타이드로 펄스가 가해질 수도 있다.
특정 구체예에서, 본 발명에 따르는 T 세포는 "env"로 알려져 있는 바이러스 외피 단백질을 암호화하는 HBV의 핵산 영역에 의해 암호화되는 폴리펩타이드의 펩타이드를 인식할 수 있는 TCR을 포함할 수도 있다. 본원에서 env 영역에 의해 암호화된 HBV 폴리펩타이드는 "Env 폴리펩타이드"라고 불린다. 일부 구체예에서, 본 발명에 따르는 TCR 또는 T 세포에 의해 인식되는 펩타이드는 HBV Env 폴리펩타이드의 위치 171-180의 아미노산을 포함하는 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 Env의 잔기는 HBV 유전자형 B의 Env에 관하여 넘버링된다. 일부 구체예에서, 펩타이드는 HBV Env 폴리펩타이드의 위치 171-180을 포함하는 아미노산의 서열, FLGPLLVLQA (서열 번호:1) 또는 LLGPLLVLQA (서열 번호:2), 또는 아미노산 서열에서 하나 또는 두 개 또는 세 개의 아미노산 치환을 갖는 이것들의 변이체를 포함하거나, 또는 이것으로 구성된다. 일부 구체예에서, 펩타이드는 아미노산 서열의 하나 또는 양 단부에서 1, 2, 3, 4, 5개의 아미노산을 추가적으로 포함한다. 일부 구체예에서, 펩타이드는 아미노산 서열의 하나 또는 양 단부에서 1-2, 1-3, 1-4, 또는 1-5개의 아미노산을 추가적으로 포함한다.
항바이러스 활성
본 발명에 따르는 T 세포는 항바이러스성 T 세포이다. 본원에서 사용된 바와 같이, 항바이러스성 T 세포는 바이러스에 대한 항바이러스 활성을 가지고 있다.
항바이러스 활성은, 본원에서 사용된 바와 같이, 바이러스 복제 또는 기능의 억제를 지칭한다. 특히, 항바이러스 활성은 다음 중 하나 이상을 감소시키거나 억제할 수 있다: 바이러스에 의한 세포로의 부착, 바이러스에 의한 세포의 진입, 세포로의 바이러스 단백질 및/또는 바이러스 핵산의 방출, 세포 내에서 바이러스의 복제, 바이러스 입자의 조립, 또는 추가의 세포 감염을 위한 세포로부터의 바이러스 입자의 방출. 일부 구체예에서, 본 발명에 따르는 T 세포는 감염된 세포에서 바이러스의 복제를 억제/감소시킬 수 있다.
일부 구체예에서, 항바이러스 활성은 바이러스 복제 또는 기능의 비-세포 독성 (예를 들어, 비-세포 용해성) 억제; 즉, 감염된 세포의 세포 사멸 (예를 들어, 세포 용해)을 유발하지 않는 바이러스 복제 또는 기능의 억제를 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 바이러스 복제는 바이러스로 감염된 세포에서 바이러스 입자의 형성을 지칭한다. 특정 처리에 의한 바이러스 복제의 억제는 당업자에게 공지된 방법에 의해, 예컨대 이러한 처리의 부재 하에서, 또는 대조군 처리 후 바이러스의 양에 비해 특정 처리 후 바이러스로 감염된 세포에서 바이러스의 감소된 양의 검출에 의해 결정될 수 있다.
본 명세서에 따르면, T 세포가 바이러스 복제를 억제할 수 있는 능력은 본 발명에 따르는 T 세포로의 노출의 부재 하에서 배양 후 바이러스 감염된 세포 내 바이러스의 양에 비해 T 세포의 존재 하에서 배양 후 바이러스로 감염된 세포 내 바이러스의 감소된 양의 검출에 의해 결정될 수 있다. 바이러스 특이적 T 세포가 바이러스 복제를 억제할 수 있는 능력은 본 발명에 따르는 T 세포로의 노출의 부재 하에서 배양 후, 또는 바이러스에 특이적이지 않은 T 세포의 존재 하에서 배양 후 바이러스로 감염된 세포 내 바이러스의 양에 비해 바이러스 특이적 T 세포의 존재 하에서 배양 후 바이러스로 감염된 세포 내 바이러스의 감소된 양의 검출에 의해 결정될 수 있다.
바이러스 복제의 억제는 바이러스로 감염된 세포 또는 복수의 상기 세포들, 바이러스로 감염된 하나 이상의 세포를 포함하는 샘플, 또는 바이러스로 감염된 대상체로부터 얻어진 샘플에서 결정될 수도 있다.
주어진 세포, 또는 세포 집단 또는 샘플 내 바이러스의 양은 Albertoni et al., Int J Infec Dis (2014) 25: 145-149에서 재검토된 것들과 같이 당업자에게 널리 공지된 방법에 의해 정량화될 수 있으며, 그 전문이 본원에 참고로 포함된다. 바이러스의 양은 바이러스 부피로 계산될 수도 있다. 방법은 바이러스 핵산에 대한 정량적 PCR 및/또는 RT-PCR, 플라크 검정, 초점-형성 검정, 종점 희석 검정, 및 바이러스 폴리펩타이드/펩타이드 또는 활성의 검출 및 정량화 방법, 예컨대 항체-기반 방법 (예를 들어, 웨스턴 블롯, 면역조직화학법, 면역세포화학법, 유동 세포 분석법, ELISA, ELISPOT), 또는 리포터-기반 방법에 의한 분석을 포함한다.
일부 구체예에서, 본 발명에 따르는 T 세포는 대조 세포, 예를 들어, 바이러스에 특이적인 TCR을 포함하는 활성화된 T 세포에 의해 나타난 항바이러스 활성의 적어도 10%, 20%, 50%, 55% 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%인 항바이러스 활성 (예를 들어, 바이러스 복제의 억제)을 나타낸다.
일부 구체예에서, 본 발명에 따르는 T 세포의 항바이러스 활성은 대조 세포, 예를 들어, 바이러스에 특이적인 TCR을 포함하는 활성화된 T 세포와 비교하여 T 세포가 특이적인 바이러스로 감염되거나, 또는 상기 바이러스의 펩타이드를 포함하는 세포에 관하여 분석된다. 일부 구체예에서, 대조 세포는 본 발명에 따르는 T 세포의 TCR과 동일한 TCR을 포함하는 활성화된 T 세포이다. 일부 구체예에서, 대조 세포는 대조 T 세포가, 예를 들어, 본원에서 기술된 바와 같이 활성화된 표현형을 갖는다는 것을 제외하고는 본 발명에 따르는 T 세포와 동일한 것이다. 일부 구체예에서, 항바이러스 활성은 본원에서 기술된 바와 같이 바이러스로 감염되거나, 또는 상기 바이러스의 펩타이드를 포함하는 세포에 관하여 분석된다.
특정 구체예에서, 본 발명에 따르는 T 세포는 세포 독성 인자의 감소된 발현 또는 활성을 위해 변형되지 않은 바이러스에 특이적인 TCR을 포함하는 활성화된 T 세포에 의한 바이러스 복제의 억제의 적어도 10%, 20%, 50%, 55% 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%로 바이러스로 감염된 세포에서 바이러스의 복제를 억제할 수 있다. 일부 구체예에서, 상대적 억제는 적어도 50%이다. 일부 구체예에서, 상대적 억제는 55% 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나이다.
바이러스로 감염되거나, 또는 바이러스의 펩타이드를 포함하는 세포에 대하여 감소된 세포 독성을 나타내는 바이러스에 특이적인 TCR을 포함하는 T 세포는 바이러스에 특이적인 TCR을 포함하는 활성화된 T 세포와 비교하여 상당한 항바이러스 활성을 보유한다는 것은 특히 놀라운 결과이다.
일부 구체예에서, 항바이러스 활성은 LTβR-의존적일 수도 있다. 일부 구체예에서, 항바이러스 활성은 LTβR을 통한 신호 전달을 수반할 수도 있다. 일부 구체예에서, 항바이러스 활성은 LTβR 및 LIGHT 간의 상호작용, 또는 LTβR 및 LTβ 간의 상호작용을 수반할 수도 있다. 일부 구체예에서, 항바이러스 활성은 LTβR/LIGHT 신호 전달, 또는 LTβR/LTβ 신호 전달을 수반할 수도 있다. 일부 구체예에서, 항바이러스 활성은 바이러스 DNA의 분해를 수반할 수도 있다.
T 세포에 의해 나타난 항바이러스 활성의 메커니즘은, 예를 들어, 본 출원의 실시예에서 기술된 바와 같이 조사될 수 있다.
세포 독성
본 발명에 따르는 T 세포는 대조군 세포와 비교하여 감소된 세포 독성을 나타낸다.
본원에서 사용된 바와 같이, 세포 독성은, 예를 들어, 바이러스 감염의 결과로서 또 다른 세포, 예를 들어, 바이러스 펩타이드 또는 핵산을 포함하거나 발현하는 세포에서 세포 사멸을 유도할 수 있는 T 세포의 능력을 지칭한다.
T 세포는 퍼포린, 그랜자임 (예를 들어, 그랜자임 B 또는 그랜자임 A), 그래뉼리신을 포함하는 세포 독서 인자를 방출함으로써, 및/또는 T 세포에서 발현된 FASL을 통해 감염된 세포 상의 FAS를 결찰시켜 감염된 세포의 아폽토시스(apoptosis)를 유도함으로써 바이러스로 감염된 세포에서 세포 사멸을 유도할 수 있다 (예를 들어, Chavez-Galan et al., Cellular and Molecular Immunology (2009) 6(1): 15-25에 의해 기술되고, 그 전문이 참고로 포함됨).
주어진 표적 세포 (즉, HBV로 감염되거나 또는 HBV 펩타이드를 포함하거나 발현하는 세포)에 대한 T 세포의 세포 독성은, 예를 들어, Zaritskaya et al., Expert Rev Vaccines (2011), 9(6):601-616에서 재검토된 방법 중 임의의 것을 사용하여 조사될 수 있으며, 그 전문이 참고로 포함된다. 표적 세포에 대한 T 세포의 세포 독성에 대한 검정의 한 예는 51Cr 방출 검정이며, 여기서 표적 세포는 51Cr로 처리되어, 51Cr이 내재화된다. T 세포에 의한 표적 세포의 용해는 세포 배양 상층액으로 방사성 51Cr을 방출시키며, 이것들이 검출될 수 있다.
다른 방법들은 세포 손상의 마커의 검출을 포함할 수 있다. 예를 들어, 아스파르테이트 트랜스아미나제 (AST) 수준은, 예를 들어, 간 세포의 손상의 측정으로서 검출될 수 있다. 본 발명에 따르면, 바이러스로 감염된 간 세포에 대한 주어진 T 세포의 세포 독성은 시험관 내에서 T 세포와 함께 감염된 세포를 인큐베이션한 후, AST의 수준을 검출함으로써 결정될 수 있다. 세포 독성은 또한, 예를 들어, 본원에서 실시예에서 기술된 바와 같이 정지 이미지화 또는 실시간 이미지화에 의한 세포 이미지화에 의해 분석될 수 있다.
일부 구체예에서, 본 발명에 따르는 T 세포는 대조 세포, 예를 들어, 바이러스에 특이적인 TCR을 포함하는 활성화된 T 세포와 비교하여 T 세포가 특이적인 바이러스로 감염되거나, 또는 상기 바이러스의 펩타이드를 포함하는 세포에 대하여 감소된 세포 독성을 나타낸다. 일부 구체예에서, 대조 세포는 본 발명에 따르는 T 세포의 TCR과 동일한 TCR을 포함하는 활성화된 T 세포이다. 일부 구체예에서, 대조 세포는, 예를 들어, 본원에서 기술된 바와 같이, 대조 T 세포가 활성화된 표현형을 갖는다는 것을 제외하고는 본 발명에 따르는 T 세포와 동일한 것이다. 일부 구체예에서, 세포 독성은, 본원에서 기술된 바와 같이, 바이러스로 감염되거나, 또는 상기 바이러스의 펩타이드를 포함하는 세포에 관하여 분석된다. 대조 활성화된 T 세포는 하나 이상의 세포 독성 인자의 감소된 발현을 위해 변형되지 않는다는 것을 알 수 있을 것이다.
일부 구체예에서, 본 발명에 따르는 T 세포는 비슷한 검정에서 대조 세포에 의해 나타난 세포 독성의 100%, 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 2%, 또는 1% 미만인 세포 독성을 나타낸다.
특히, (i) 바이러스에 특이적인 같은 TCR을 포함하는 활성화된 T 세포에 의해 나타난 항바이러스 활성의 적어도 10%, 20%, 50%, 55% 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%인 항바이러스 활성 (예를 들어, 바이러스 복제의 억제)를 나타내고, (ii) 비슷한 검정에서, 바이러스에 특이적인 같은 TCR을 포함하는 활성화된 T 세포에 의해 나타난 세포 독성의 100%, 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 2%, 또는 1% 미만인, 바이러스로 감염된 세포에 대한 세포 독성을 나타내는 바이러스에 특이적인 TCR을 포함하는 T 세포를 제공하는 것이 본 발명의 목적이다.
조작된 T 세포
다양한 양태에서, 본 발명은 비-자연 발생한 생성물을 제공한다. 이러한 생성물은 재조합, 인공, 비-고유 또는 사람이 만든 생성물이라고 다양하게 불릴 수도 있다. 특히, 본 발명은 외인성 TCR, 핵산 및 T 세포에 관한 것이다.
"외인성"은, 본원에서 사용된 바와 같이, 일반적으로 내인성이 아닌 것을 의미한다. 세포의 맥락에서, 외인성 TCR은, 예를 들어, 세포로의 외인성 TCR을 암호화하는 핵산의 임의의 도입 전에, 상기 세포의 핵산에 의해 암호화되지 않는 TCR을 지칭할 수도 있다. 외인성 핵산은, 예를 들어, 세포로의 핵산의 임의의 도입 전에 상기 세포에 존재하지 않는 핵산을 지칭한다.
대상체의 맥락에서, 외인성 TCR은 대상체로의 TCR의 임의의 도입 전에, 대상체에 존재하지 않거나 대상체의 핵산, 예를 들어, 대상체의 게놈의 핵산에 의해 암호화되지 않는 TCR을 지칭할 수도 있다. 외인성 핵산은, 예를 들어, 대상체로의 핵산의 임의의 도입 전에, 상기 대상체에 존재하지 않는 핵산을 지칭한다. 외인성 세포는, 예를 들어, 대상체로의 세포 및/또는 핵산의 임의의 도입 전에, 상기 대상체에 존재하지 않는 세포를 지칭한다.
다양한 양태와 관련하여, 본 발명은 TCR을 암호화하는 핵산을 포함한다. 일부 구체예에서, 핵산은, 예를 들어, 다른 핵산, 또는 자연 발생한 생물학적 재료로부터 정제되거나 분리된다. 일부 구체예에서, 핵산은 (a) 가변 영역 및 불변 영역을 포함하는 TCR α-사슬을 암호화하는 핵산 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 핵산은 (b) 가변 영역 및 불변 영역을 포함하는 TCR β-사슬을 암호화하는 핵산 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 핵산은 (a) 가변 영역 및 불변 영역을 포함하는 TCR α-사슬을 암호화하는 핵산 서열, 및 (b) 가변 영역 및 불변 영역을 포함하는 TCR β-사슬을 암호화하는 핵산 서열을 포함한다.
융합 단백질로서 TCR α- 및 β-사슬을 발현하는 것이 바람직할 수도 있다. 이것은, 예를 들어, 각 사슬에 대하여 유사한 단백질 발현 수준을 달성하는데 바람직할 수도 있다. 따라서, 일부 구체예에서는, 핵산이 추가적으로 (c) 링커 서열을 암호화하는 핵산 서열을 포함한다. "링커 서열"은, 본원에서 사용된 바와 같이, 발현된 펩타이드 또는 폴리펩타이드 서열을 결합시키기 위한 아미노산 서열을 지칭한다. 본 발명에서, 링커 서열은 TCR α- 및 β-사슬을 결합시키기 위한 것이다.
일부 구체예에서, 융합 단백질로서 발현된 TCR α- 및 β-사슬을 분리하는 것이 바람직할 수도 있다. 일부 구체예에서, 이것은 TCR α- 및 β-사슬 사이의 융합 단백질을 분열시킴으로써 달성될 수도 있다.
따라서, 일부 구체예에서, 링커 서열은 분열 가능한 링커일 수도 있다. 즉, 링커 서열은 분열될 수 있는 아미노산 서열을 포함할 수도 있다. 예를 들어, 링커 서열은 펩타이드 결합을 분열시킬 수 있는 효소에 대한 기질로 작용할 수 있는 서열 - 즉, 분열 부위를 포함할 수도 있다. 이러한 많은 분열 부위들은 분자 생물학 분야의 당업자에게 공지되어 있고 그들에 의해 이용될 수 있다. 일부 구체예에서, 분열 가능한 링커는 자가 분열 부위를 포함할 수도 있다. 자가 분열 부위는 효소를 처리할 필요없이 자동적으로 분열된다. 자가 QNSUDF 부위의 예는 피코르나바이러스 "NPGP"의 2A 서열이며, 이것은 "G/P"에서 분열된다. 이 자가 분열 서열은 본원에서 "피코르나바이러스 2A (P2A)"라고 불린다. P2A를 포함하는 링커 서열은 본원에서 P2A 링커라고 불린다.
TCR α- 및 β-사슬이 링커 서열에 의해 결합된 단일 폴리펩타이드로서 발현되는 것이 바람직한 경우, TCR α- 및 β-사슬 및 링커를 암호화하는 핵산 서열은 같은 리딩 프레임 내에서 제공되어야 한다는 것을 알 수 있을 것이다.
본 발명과 관련하여 사용된 핵산은 핵산 내에서 특정 배향으로 서열 (a) 및 (b), 및 선택적으로는 (c)를 포함할 수도 있다. 즉, 서열은 특정 순서로 제공될 수도 있다. 서열 (a) 및 (b), 및 선택적으로는 (c)의 5'에서 3'으로의 특정 순서는, 예를 들어, 핵산/발현된 생성물의 전사, 전사 후 가공, 번역, 번역 후 가공, 폴딩, 회합, 안정성, 분해, 트래피킹(trafficking), 및/또는 기능적 성질에 영향을 미칠 수도 있다.
일부 구체예에서, 본 발명에 따르는 핵산 중에서 서열 (a) 및 (b)는 5'에서 3' 배향으로 제공된다: 5'-(b)-(a)-3'. 일부 구체예에서, 서열 (a) 및 (b)는 5'에서 3' 배향으로 제공된다: 5'-(a)-(b)-3'. 일부 구체예에서, 서열 (a), (b) 및 (c)는 5'에서 3' 배향으로 제공된다: 5'-(b)-(c)-(a)-3'. 일부 구체예에서, 서열 (a), (b) 및 (c)는 5'에서 3' 배향으로 제공된다: 5'-(a)-(c)-(b)-3'.
일부 구체예에서, 핵산은 발현된 TCR α- 및 β-사슬 간의 회합을 증가시키고 및/또는 안정화시키기 위한 하나 이상의 구조적 특징을 암호화한다. 일부 구체예에서, 특징은 특정 아미노산 또는 아미노산의 서열일 수도 있다. 일부 구체예에서, 핵산은 TCR α- 및 β-사슬 사이에서 하나 이상의 이황화 결합을 형성하기 위한 하나 이상의 비-고유 시스테인 잔기를 암호화할 수도 있다. 일부 구체예에서, 핵산은 TCR α- 및/또는 β-사슬의 불변 영역에서 하나 이상의 비-고유 시스테인 잔기를 암호화할 수도 있다.
본 발명의 양태의 구체예는 본원에서 기술된 바와 같이 핵산을 포함하는 벡터의 사용을 포함한다.
"벡터"는 본원에서 사용된 바와 같이, 외인성 핵산을 세포로 전달하기 위한 비히클(vehicle)로서 사용된 핵산 (DNA 또는 RNA)이다. 벡터는 세포에서 핵산의 발현을 위한 발현 벡터일 수도 있다. 이러한 벡터는 발현되는 서열을 암호화하는 핵산에 작동 가능하게 결합된 프로모터 서열을 포함할 수도 있다. 벡터는 또한 종결 코돈 및 발현 인핸서를 포함할 수도 있다. 업계에 공지된 임의의 적합한 벡터, 프로모터, 인핸서 및 종결 코돈은 본 명세서에 따르는 벡터로부터 폴리펩타이드를 발현시키는데 사용될 수도 있다. 적합한 벡터는, 예를 들어, Maus et al., Annu Rev Immunol (2014) 32:189-225에서 기술된 바와 같이, 플라스미드, 2진 벡터, DNA 벡터, mRNA 벡터, 바이러스 벡터 (예를 들어, 감마레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터), 트랜스포손-기반 벡터, 및 인공적 염색체 (예를 들어, 효모 인공적 염색체)를 포함하며, 이것은 그 전문이 본원에 참고로 포함된다.
본 발명에 따르는 일부 구체예에서, 바이러스 벡터는 렌티바이러스, 레트로바이러스, 아데노바이러스, 또는 단순 헤르페스 바이러스 벡터일 수도 있다.
이 명세서에서, 용어 "작동 가능하게 결합된"은 선택된 핵산 서열 및 조절 핵산 서열 (예를 들어, 프로모터 및/또는 인핸서)이 조절 서열의 영향 또는 제어 하에 뉴클레오타이드 서열의 발현을 배치하는 (이로 인해 발현 카세트를 형성함) 방식으로 공유 결합된 상황을 포함할 수도 있다. 따라서, 조절 서열은 핵산 서열의 전사에 영향을 줄 수 있는 경우 선택된 핵산 서열에 작동 가능하게 결합된다. 적절한 경우, 결과로 생성된 전사물은 원하는 폴리펩타이드로 번역될 수도 있다.
본 발명은 T 세포를 생산하는 방법을 제공한다. 일부 구체예에서, 방법은 인간 또는 동물 신체에서 실시되지 않는다. 일부 구체예에서, 방법은 시험관 내에서 수행된다. 일부 구체예에서, 방법은 생체 외에서 수행된다.
본 발명에 따라 T 세포를 생산하는 방법은 전형적으로 하나 이상의 T 세포를 생산하기 위한 것임을 알 수 있을 것이다. 즉, 방법은 전형적으로 T 세포의 집단 또는 조제물을 생산하기 위한 것이다.
본 발명에 따라 T 세포를 생산하는 방법은 바이러스에 특이적인 TCR을 발현하거나 포함하도록 T 세포를 변형시키는 단계를 포함할 수도 있다. 일부 구체예에서, 변형은 T 세포에 본 명세서에 따르는 핵산 또는 벡터를 도입시키는 것을 포함할 수도 있다. 일부 구체예에서, 방법은 T 세포에 의한 핵산 또는 벡터의 발현에 적합한 조건 하에서 T 세포를 배양하는 단계를 추가적으로 포함한다.
일부 구체예에서, 핵산 또는 벡터의 도입은 형질 도입, 예를 들어, 레트로바이러스 형질 도입을 포함한다. 따라서, 일부 구체예에서, 분리된 핵산 또는 벡터는 바이러스 벡터에 포함되거나, 또는 벡터는 바이러스 벡터이다. 일부 구체예에서, 방법은, 예를 들어, Koh et al., Molecular Therapy - Nucleic Acids (2013) 2, e114에 기술된 바와 같이, 전기천공법에 의해 본 발명에 따르는 핵산 또는 벡터를 도입하는 단계를 포함하며, 그 전문이 본원에 참고로 포함된다.
일부 구체예에서, 변형은 비-활성화된 T 세포의 것일 수도 있다. 일부 구체예에서, 바이러스에 특이적인 TCR을 발현하거나 포함하기 위한 T 세포의 변형은 변형되는 T 세포의 활성화를 유발하지 않을 수도 있다. 특정 구체예에서, 방법은 바이러스에 특이적인 TCR을 발현하거나 포함하도록 비-활성화된 T 세포를 변형시키는 단계를 포함하며, 변형 이후, T 세포는 비-활성화된 표현형을 보유하고 및/또는 활성화된 표현형을 갖지 않는다. 비-활성화된 및 활성화된 T 세포 표현형은, 본원에서 기술된 바와 같이, 특정 유전자 및/또는 단백질의 발현을 참고하여 또는 T 세포에 대한 특정 활성을 참고하여 정의될 수 있다.
일부 구체예에서, 변형은 핵산의 효과적인 흡수 및/또는 발현을 위해 숙주 세포 분열을 필요로 하지 않는 방법에 의한 것이다. 특정 구체예에서, T 세포 (예를 들어, 비-활성화된 T 세포)의 변형은 mRNA 전기천공법에 의한 것이다. T 세포는, 예를 들어, 본원에서 실시예 5에서 기술된 바와 같이, TCR을 암호화하는 핵산을 이용한 mRNA 전기천공법에 의해 변형될 수 있다.
유리하게는, mRNA 전기천공법은 핵산의 효과적인 흡수 및/또는 발현에 세포 분열을 필요로 하지 않으며, 그러므로 본원에서 기술된 바와 같이 TCR을 암호화하는 핵산을 느리게 분열하거나 분열하지 않는 세포, 예컨대 비-활성화된 T 세포로 도입할 수 있다.
본 발명에 따라 T 세포를 생산하는 방법은 세포 독성 인자의 감소된 발현 및/또는 활성을 위해 T 세포를 변형시키는 단계를 포함할 수 있다.
일부 구체예에서, 세포 독성 인자는 퍼포린, 그랜자임 (예를 들어, 그랜자임 B 또는 그랜자임 A), 그래뉼리신, 또는 FASL 중 하나 이상이다. 일부 구체예에서, 세포 독성 인자는 퍼포린 및/또는 그랜자임 (예를 들어, 그랜자임 B 또는 그랜자임 A)이다. 세포 독성 인자의 감소된 발현 및/또는 활성을 위한 T 세포의 변형 후, 변형된 T 세포는 대조 세포, 예를 들어, 세포 독성 인자의 감소된 발현 및/또는 활성을 위해 변형되지 않은 비슷한 세포에 의한 발현/활성 수준의 100% 미만, 95% 미만, 90% 미만, 85% 미만, 80% 미만, 75% 미만, 70% 미만, 65% 미만, 60% 미만, 55% 미만, 50% 미만, 45% 미만, 40% 미만, 35% 미만, 30% 미만, 25% 미만, 20% 미만, 15% 미만, 10% 미만, 또는 5% 미만인 세포 독성 인자의 발현 및/또는 활성 수준을 나타낼 수 있다.
발현은 단백질 또는 유전자 발현일 수도 있다. 세포 독성 인자의 유전자 발현은, 예를 들어, mRNA 수준을 측정함으로써, 예를 들어, 정량적 실시간 PCR (qRT-PCR)에 의해, 또는 리포터-기반 방법에 의해 결정될 수 있다. 단백질 발현은, 예를 들어, 웨스턴 블롯, 면역조직화학법, 면역세포화학법, 유동 세포 분석법, ELISA, 등에 의해, 또는 리포터-기반 방법에 의해 측정될 수 있다. 세포 독성 인자의 활성은, 예를 들어, 세포 독성 인자의 활성에 대한 시험관 내 검정, 예를 들어, 상기 본원에 참고로 포함된 Zaritskaya et al., Expert Rev Vaccines (2011), 9(6):601-616에서 기술된 검정을 사용하여 분석된다.
일부 구체예에서, 변형은 세포 독성 인자의 발현 및/또는 활성을 감소시킬 수 있는 작용제로의 처리에 의해 이루어질 수도 있다. 일부 구체예에서, 작용제는 전사, mRNA 가공 (예를 들어, 스플라이싱), mRNA 안정성, 번역, 번역 후 가공, 단백질 안정성, 단백질 분해 및/또는 단백질 기능/활성에 영향을 주어서 유전자 또는 단백질 발현 및/또는 활성을 감소시킬 수도 있다.
일부 구체예에서, 작용제는 세포 독성 인자의 mRNA 양에 영향을 미치는 작용제일 수도 있다. 일부 구체예에서, 작용제는 RNA 간섭 (RNAi)에 의해 세포 독성 인자의 감소된 발현을 유발할 수도 있다. 일부 구체예에서, 작용제는 억제 핵산, 예컨대 안티센스 또는 작은 간섭 RNA일 수도 있으며, 제한되는 것은 아니지만, shRNA 또는 siRNA를 포함한다. 일부 구체예에서, 억제 핵산은 벡터에서 제공된다. 예를 들어, 일부 구체예에서, 작용제는 하나 이상의 세포 독성 인자에 대한 shRNA를 암호화하는 렌티바이러스 벡터일 수도 있다.
일부 구체예에서, 작용제는 T 세포에 의한 세포 독성 인자의 유전자 또는 단백질 발현 및/또는 활성을 감소시키기 위해 T 세포의 게놈을 변화시킬 수 있는 작용제일 수도 있다. 예를 들어, 작용제는 퍼포린, 그랜자임 (예를 들어, 그랜자임 B 또는 그랜자임 A), 그래뉼리신, 또는 FASL을 암호화하는 유전자를 파괴하고 및/또는 비활성화시킬 수 있고, 및/또는 퍼포린, 그랜자임 (예를 들어, 그랜자임 B 또는 그랜자임 A), 그래뉼리신, 또는 FASL 유전자 또는 단백질 발현 및/또는 활성을 감소시킬 수 있는 분자를 암호화하는 서열을 암호화하는 DNA 서열을 통합시킬 수 있다.
일부 구체예에서, 작용제는 퍼포린, 그랜자임 (예를 들어, 그랜자임 B 또는 그랜자임 A), 그래뉼리신, 또는 FASL 단백질의 억제자일 수도 있다. 예를 들어, 작용제는 세포 독성 인자에 결합하여 그것의 활성을 억제할 수 있는 분자일 수도 있다. 일부 구체예에서, 작용제는 퍼포린, 그랜자임 (예를 들어, 그랜자임 B 또는 그랜자임 A), 그래뉼리신, 또는 FASL에 대한 항체일 수도 있다. 일부 구체예에서, 작용제는 퍼포린, 그랜자임 (예를 들어, 그랜자임 B 또는 그랜자임 A), 그래뉼리신, 또는 FASL 활성의 경쟁적 억제자일 수도 있다.
본 발명은 또한 세포 독성 인자의 발현 및/또는 활성을 감소시키기 위해 변형된 T 세포를 포함한다. 일부 구체예에서, T 세포는 세포 독성 인자의 발현 및/또는 활성을 감소시킬 수 있는 작용제로 변형되었다. 또한 세포 독성 인자의 발현 및/또는 활성을 감소시킬 수 있는 작용제를 함유하는 T 세포가 제공된다.
일부 구체예에서, 본 발명의 다양한 양태에 따르는 작용제로 변형되고 및/또는 처리된 T 세포는 CD3+ T 세포이다. 일부 구체예에서, T 세포는 CD3+, CD8+ T 세포이다. 일부 구체예에서, T 세포는 CD3+, CD4+ T 세포이다. 일부 구체예에서, T 세포는 비-활성화된 T 세포이다. 일부 구체예에서, T 세포는 활성화된 T 세포이다. 일부 구체예에서, T 세포는 세포 독성 T 세포이다. 일부 구체예에서, T 세포는 T 보조 세포이다.
임의의 적합한 T 세포는 본 발명의 방법에 따라 사용될 수도 있다. 일부 구체예에서, T 세포는 공여체로부터 얻어질 수도 있다. 일부 구체예에서, 공여체는 질환 병태, 예컨대 바이러스, 박테리아 또는 균류 감염 또는 암을 앓고 있거나, 또는 이것들의 위험이 있을 수도 있다. 일부 구체예에서, 공여체는 건강하고 및/또는 질환 병태의 특정 위험이 없을 수도 있다.
일부 구체예에서, T 세포는 T 세포의 TCR이 특이적인 바이러스의 펩타이드를 제공할 수 있는 MHC 분류 I 분자를 암호화하는 HLA 대립 유전자를 포함한다. 일부 구체예에서, T 세포는 T 세포의 TCR에 의해 인식되는 바이러스 펩타이드에 대하여 매치된 HLA이다. 일부 구체예에서, T 세포는 T 세포의 TCR에 의해 인식되는 바이러스 펩타이드에 대하여 매치된 HLA인 공여체로부터 얻어진다.
T 세포는 공여체의 적절한 샘플, 예를 들어, 비장 또는 림프절과 같은 림프 조직의 샘플 또는 혈액 또는 종양 샘플로부터 분리되거나 그렇지 않으면 이것들로부터 얻어질 수도 있다. 적절한 분리 기술은 업계에 널리 공지되어 있고, 예를 들어, 형광 활성화된 세포 분류 (FACS: 예를 들어, Rheinherz et al (1979) PNAS 76 4061 참고), 세포 패닝(panning) (예를 들어, Lum et al (1982) Cell Immunol 72 122 참고) 및 항체 코팅된 마그네틱 비드를 사용한 분리 (예를 들어, Gaudernack et al 1986 J Immunol Methods 90 179 참고)를 포함한다. 편의상, T 세포 부분 집합은 세포 표면 마커에 대한 항체를 사용하여 분리될 수 있다; 예를 들어, 항-CD8 항체는 CD8+ T 세포를 분리하는데 사용될 수 있고, CD4+ T 세포는 항-CD4 항체를 사용하여 분리될 수 있다. 예를 들어, 샘플은 항체로 코팅된 마그네틱 비드와 함께 인큐베이션될 수 있으며, 비드는 마그네틱 분리를 사용하여 분리된다.
일부 구체예에서, 본 발명의 다양한 양태에 따르는 작용제로 변형되고 및/또는 처리된 T 세포는 공여체 개체의 세포의 샘플에 포함될 수도 있다. 세포의 샘플은 T 세포 외에도, 다른 세포 유형, 예컨대 B 세포, 수지상 세포 및 대식 세포를 포함하는 불균질 샘플일 수도 있다.
일부 구체예에서, 본원에서 기술된 방법은 T 세포를 활성화시키는 단계를 포함할 수도 있다. T 세포는 어떤 편리한 기술로도 활성화될 수 있다. 일부 구체예에서, T 세포는 T 세포의 TCR에 대한 아고니스트, 예컨대 APC의 표면 상의 MHC 분류 I 분자에서 나타나는 펩타이드로의 처리에 의해 활성화될 수도 있다. 일부 구체예에서, T 세포는 항-CD3 및/또는 IL-2로 (예를 들어, 시험관 내 배양에 의해) 활성화될 수도 있다.
다양한 양태에 따르면, 본 발명의 방법은 생체 외에서 T 세포를 배양하는 단계를 포함할 수도 있다. 본 발명의 방법은 시험관 내에서 T 세포를 배양하는 단계를 포함할 수도 있다.
T 세포는 교반 탱크 발효기, 에어리프트 발효기, 회전 병, 배양 자루 또는 접시, 및 다른 바이오리액터를 포함한 임의의 적합한 시스템에서 배양될 수 있다. 이러한 시스템의 사용은 업계에 널리 공지되어 있다.
T 세포의 시험관 내 배양에서 사용에 적합한 배양 배지, 특히 완전 배지, 예컨대 AIM-V, 이스코브 배지 및 RPMI-1640 (Invitrogen-GIBCO)이 이용 가능하다. 배지는 혈청, 혈청 단백질 및 선택적 작용제와 같은 다른 인자들로 보충될 수도 있다. 예를 들어, 일부 구체예에서, T 세포는 AIM-V + 2% 인간 AB 혈청에서 배양된다. 편의상, 세포는 적합한 배양 배지에서 5% CO2를 함유한 가습 대기 중에서 37℃에서 배양된다.
본 발명은 또한 본 발명에 따르는 T 세포를 생산하는 방법에 의해 얻어지거나 또는 얻어질 수 있는 T 세포를 제공한다.
의학적 사용 및 치료 및 예방 방법
본 발명에 따르는 T 세포는 치료적 및 약학적 방법으로 사용된다. 본 발명은 본 발명에 따르는 T 세포 및 약학적으로 허용 가능한 담체, 보조제, 부형제, 또는 희석제를 포함하는 약학적 조성물을 포함한다.
본 발명의 치료적 및 예방적 방법은 전형적으로 본 발명에 따르는 하나 이상의 T 세포의 투여/사용을 포함한다. 즉, 본 발명의 치료적 및 예방적 방법은 전형적으로 본 발명에 따르는 T 세포의 집단 또는 조제물의 투여/사용을 포함한다.
한 양태에서, 본 발명은 질환 또는 장애를 치료하거나 예방하는 방법에서 사용되는, 본 발명에 따르는 T 세포 또는 약학적 조성물을 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 질환 또는 장애를 치료하거나 예방하는 방법에서 사용되는 의약의 제조시 사용을 위한 본 발명에 따르는 T 세포 또는 약학적 조성물의 사용을 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 질환 또는 장애를 치료하거나 예방하는 방법을 제공하며 본 발명에 따르는 T 세포 또는 약학적 조성물의 치료적 또는 예방적 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
특히, 본 발명에 따르는 T 세포 또는 약학적 조성물은 바이러스 감염, 또는 바이러스 감염이 위험 인자인 질환 또는 장애에 의해 유발되거나 악화되는 질환을 예방하거나 치료하는데 사용된다.
본 발명에 따라 치료되거나 예방되는 질환 또는 장애는 T 세포 및/또는 이것의 TCR의 특이성에 기초하여 선택된다.
본 발명에 따라 치료되거나 예방되는 질환 또는 장애는 바이러스 감염에 의해 유발되거나 악화되는 질환 또는 장애로부터 선택될 수도 있다. 본원에서, 바이러스 감염은 dsDNA 바이러스 (예를 들어, 아데노바이러스, 헤르페스바이러스, 폭스바이러스), ssRNA 바이러스 (예를 들어, 파르보바이러스), dsRNA 바이러스 (예를 들어, 레오바이러스), (+)ssRNA 바이러스 (예를 들어, 피코르나바이러스, 토가바이러스), (-)ssRNA 바이러스 (예를 들어, 오쏘믹소바이러스, 라브도바이러스), ssRNA-RT 바이러스 (예를 들어, 레트로바이러스), dsDNA-RT 바이러스 (예를 들어, 헤파드나바이러스), 아데노비리대, 헤르페스비리대, 파필로마비리대, 폴리오마비리대, 폭스비리대, 헤파드나비리대, 파르보비리대, 아스트로비리대, 칼리시비리대, 피코르나비리대, 코로나비리대, 플라비비리대, 토가비리대, 헤페비리대, 레트로비리대, 오쏘믹소비리대, 아레나비리대, 분야비리대, 필로비리대, 파라믹소비리대, 라브도비리대 또는 레오비리대 과의 구성원, 단순 헤르페스 1형 바이러스, 단순 헤르페스 2형 바이러스, 바리셀라-조스터 바이러스, 엡스타인-바 바이러스, 인간 사이토메갈로바이러스, 인간 헤르페스바이러스 8형, 인간 파필로마바이러스, BK 바이러스, JC 바이러스, 천연두, B형 간염 바이러스 (유전자형 A, B, C, D, E, F, G, H, I 또는 J), 파르보바이러스 B19, 인간 아스트로바이러스, 노르워크 바이러스, 콕사키바이러스, A형 간염 바이러스, 폴리오바이러스, 리노바이러스, 중증 급성 호흡기 증후군 바이러스, C형 간염 바이러스, 황열병 바이러스, 뎅구 바이러스, 웨스트 나일 바이러스, TBE 바이러스, 루벨라 바이러스, E형 간염 바이러스, 인간 면역 결핍 바이러스, 인플루엔자 바이러스, 라싸 바이러스, 크림-콩고 출혈열 바이러스, 한탄 바이러스, 에볼라 바이러스, 마부르크 바이러스, 홍역 바이러스, 볼거리 바이러스, 파라인플루엔자 바이러스, 호흡기 세포 융합 바이러스, 광견병 바이러스, D형 간염 바이러스, 로타바이러스, 오르비바이러스, 콜티바이러스, 또는 반나 바이러스로의 감염, 또는 이러한 바이러스로의 감염이 위험 인자인 질환 또는 장애일 수도 있다.
예를 들어, 본 발명에 따르는 T 세포가 B형 간염 바이러스에 특이적인 TCR을 포함하는 경우, 본 발명에 따르는 T 세포 또는 약학적 조성물은 HBV 감염, 또는 HBV 감염이 위험 인자인 질환 또는 장애에 의해 유발되거나 악화되는 질환 또는 장애를 예방하거나 치료하는데 사용된다. HBV 감염에 의해 유발/악화된 질환 및 장애는 Liang, Hepatology (2009), 49(5 Suppl): S13-S21에 기술되어 있고, 급성 간염 (전격성 간부전 포함), 만성 간염, 간경변, 간암, 예컨대 간 세포 암종 (HCC), 또는 췌장암을 포함한다. HBV 감염이 위험 인자인 질환 또는 장애는 괴사 혈관염 및 신증, 예컨대 막 사구체 신염 (MGN)을 포함한다.
본 발명에 따르는 T 세포 또는 약학적 조성물의 투여는 바람직하게는 "치료적으로 유효한" 또는 "예방적으로 유효한" 양으로 이루어지며, 이것은 대상체에게 이점을 보여주기에 충분하다. 투여되는 실제량, 및 투여의 속도 및 시간 경과는 질환 또는 장애의 성질 및 심각도에 따라 달라질 것이다. 치료의 처방, 예를 들어, 투약의 결정, 등은 일반적인 의사 및 다른 의학 박사의 책임 하에서 이루어지고, 전형적으로는 치료되는 질환/장애, 개개의 대상체의 상태, 전달 부위, 투여 방법 및 의사에게 알려져 있는 다른 요인들을 고려한다. 상기 언급된 기술 및 프로토콜의 예는 Remington's Pharmaceutical Sciences, 20th Edition, 2000, pub. Lippincott, Williams & Wilkins에서 발견될 수 있다.
본 발명의 구체예에서, 치료 또는 예방 방법은 T 세포의 입양 전달을 포함할 수도 있다. 입양 T 세포 전달은 일반적으로는 전형적으로 T 세포가 분리되는 혈액 샘플로부터 뽑아냄으로써 T 세포가 대상체로부터 얻어지는 공정을 지칭한다. 이어서 T 세포는 전형적으로 어떤 방식으로든, 같은 대상체 또는 상이한 대상체에게 처리되거나 변화된다. 치료는 전형적으로 대상체에게 특정한 원하는 특징을 가진 T 세포 집단을 제공하거나, 또는 상기 대상체에서 이러한 특징을 가진 T 세포의 빈도를 증가시키는 것을 목표로 한다. 바이러스 특이적 T 세포의 입양 전달은, 예를 들어, Cobbold et al., (2005) J. Exp. Med. 202: 379-386 및 Rooney et al., (1998), Blood 92: 1549-1555에서 기술되며, 그 전문이 본원에 참고로 포함된다.
본 발명에서, 입양 전달은 대상체에서 바이러스-특이적인, 항바이러스성 T 세포, 특히 CD8+ T 세포 및/또는 CD4+ T 세포를 도입하거나, 또는 이것들의 빈도를 증가시킬 목적으로 수행된다.
따라서, 한 양태에서, 본 발명은 대상체에서 질환 또는 장애를 치료하거나 예방하는 방법을 제공하는데,
(a) 대상체로부터 적어도 하나의 비-활성화된 T 세포를 분리하는 단계;
(b) 바이러스에 특이적인 T 세포 수용체 (TCR)를 발현하거나 포함하도록 적어도 하나의 비-활성화된 T 세포를 변형시키는 단계; 및
(c) 대상체에게 적어도 하나의 변형된 비-활성화된 T 세포를 투여하는 단계
를 포함하며,
여기서 적어도 하나의 변형된 비-활성화된 T 세포는 세포 독성 인자의 감소된 발현 또는 활성을 위해 변형되지 않은 바이러스에 특이적인 TCR을 포함하는 활성화된 T 세포와 비교하여 바이러스로 감염되거나, 또는 바이러스의 펩타이드를 포함하는 세포에 대하여 감소된 세포 독성을 나타낸다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 대상체에서 질환 또는 장애를 치료하거나 예방하는 방법을 제공하며,
(a) 대상체로부터 적어도 하나의 T 세포를 분리하는 단계;
(b) 바이러스에 특이적인 T 세포 수용체 (TCR)를 발현하거나 포함하도록 적어도 하나의 T 세포를 변형시키는 단계로서,
(i) T 세포는 세포 독성 인자의 감소된 발현 또는 활성을 위해 변형되거나, 또는
(ii) 방법은 하나 이상의 세포 독성 인자의 감소된 발현 또는 활성을 위해 적어도 하나의 T 세포를 더 변형시키는 단계; 및
(c) 변형된 적어도 하나의 T 세포를 대상체에게 투여하는 단계
를 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 대상체에서 질환 또는 장애를 치료하거나 예방하는 방법을 제공하며,
(a) 대상체로부터 적어도 하나의 T 세포를 분리하는 단계;
(b) 하나 이상의 세포 독성 인자의 감소된 발현 또는 활성을 위해 적어도 하나의 T 세포를 변형시키는 단계; 및
(c) 변형된 적어도 하나의 T 세포를 대상체에게 투여하는 단계
를 포함한다.
본 발명에 따르면, "대상체"는 어떠한 대상체도 될 수 있다. 일부 구체예에서, T 세포가 분리되는 대상체는 변형된 T 세포가 투여되는 대상체이다. 즉, 일부 구체예에서, T 세포의 공급원은 자가 유래될 수 있다. 일부 구체예에서, T 세포가 분리되는 대상체는 변형된 T 세포가 투여되는 대상체와 상이한 대상체일 수도 있다. 즉, 일부 구체예에서, T 세포의 공급원은 동종이계의 것일 수도 있다. 일부 구체예에서, T 세포는 외인성일 수도 있다. 일부 구체예에서, T 세포는 이종 발생성일 수도 있다.
본 발명에 따라 변형된 적어도 하나의 T 세포는, 예를 들어, 바이러스에 특이적인 TCR을 발현하거나 포함하도록 및/또는 세포 독성 인자의 감소된 발현 또는 활성을 위해 본원에서 기술된 방법에 따라 변형될 수 있다. 변형은 전달된 핵산의 영구적인 또는 일시적인 발현을 위한 핵산 전달을 포함할 수도 있다.
임의의 적합한 유전적 조작 플랫폼이 본 발명에 따라 T 세포를 변형시키는데 사용될 수도 있다. T 세포를 변형시키는데 적합한 방법은, 예를 들어, 상기 본원에 참고로 포함된 Maus et al., Annu Rev Immunol (2014) 32: 189-225에서 기술된 바와 같이, 감마레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, DNA 트랜스펙션, 트랜스포손-기반 유전자 전달 및 RNA 트랜스펙션과 같은 유전적 조작 플랫폼의 사용을 포함한다.
일부 구체예에서, 방법은 다음 단계 중 하나 이상을 포함할 수도 있다: 대상체로부터 혈액 샘플을 채취하는 단계; 혈액 샘플로부터 적어도 하나의 T 세포 (예를 들어, 적어도 하나의 비-활성화된 T 세포)를 분리하는 단계; 시험관 내 또는 생체 외 세포 배양물에서 적어도 하나의 T 세포를 배양하는 단계; 바이러스에 특이적인 TCR을 발현하거나 포함하도록 적어도 하나의 T 세포를 변형시키는 단계; 세포 독성 인자의 감소된 발현 또는 활성을 위해 적어도 하나의 T 세포를 변형시키는 단계; 적어도 하나의 T 세포를 수거하는 단계; 변형된 T 세포를 보조제, 희석제, 또는 담체와 혼합시키는 단계; 대상체에게 변형된 T 세포를 투여하는 단계.
본원의 방법의 일부 구체예에서, 방법은, 선택적으로는 IL-2의 존재 하에서, 예를 들어, CD3/CD28을 통한 자극에 의해 및/또는 T 세포가 특이적 TCR을 포함하는 펩타이드-MHC를 제공하는 APC와 접촉시킴으로써 T 세포를 활성화시키는 단계를 포함할 수도 있다.
당업자는, 예를 들어, 그 전문이 참고로 포함된 Qasim et al., Journal of Hepatology (2015) 62: 486-491을 참고하여, 본 발명에 따르는 T 세포의 입양 전달에 적절한 시약 및 과정을 결정할 수 있다.
적어도 하나의 변형된 T 세포는 전형적으로 세포 집단으로서 대상체에게 투여된다. 일부 구체예에서, 약 1x104, 5x104, 1x105, 5x105, 1x106, 2x106, 5x106, 1x107, 2x107, 3x107, 4x107, 5x107, 6x107, 7x107, 8x107, 9x107, 1x108, 2x108, 3x108, 4x108, 5x108, 6x108, 7x108, 8x108, 9x108, 1x109, 2x109, 3x109, 4x109, 5x109, 6x109, 7x109, 8x109, 9x109, 또는 1x1010개의 세포 중 하나가 대상체에 투여된다.
일부 구체예에서, 세포 집단은 변형된 T 세포의 집단이다. 일부 구체예에서, 세포 집단은 혼합된 세포 집단으로서 대상체에게 투여된다. 혼합된 세포 집단은 변형된 T 세포 외에도, 예를 들어, 자연 살해 (NK) 세포, 비-변형된 T 세포 및/또는 수지상 세포 (DC)를 포함할 수도 있다.
대상체에게 투여된 세포 집단은 상이한 비율의 CD8+ 및 CD4+ T 세포를 가진 T 세포 집단을 포함할 수도 있다. 예를 들어, 일부 구체예에서, 대상체에게 투여된 T 세포 집단은 약 100% CD8+ T 세포 및 0% CD4+ T 세포, 약 95% CD8+ T 세포 및 5% CD4+ T 세포, 약 90% CD8+ T 세포 및 10% CD4+ T 세포, 약 85% CD8+ T 세포 및 15% CD4+ T 세포, 약 80% CD8+ T 세포 및 20% CD4+ T 세포, 약 70% CD8+ T 세포 및 30% CD4+ T 세포, 약 60% CD8+ T 세포 및 40% CD4+ T 세포, 또는 약 50% CD8+ T 세포 및 50% CD4+ T 세포를 포함할 수도 있다.
투여는 전형적으로 세포 집단의 투입 (예를 들어, 정맥내 투입)에 의해 이루어진다. 세포 집단은 투입에 의해 투여에 적절하게 제제화된다.
본 발명에 따르는 방법은 1회 이상의 투여를 수반할 수도 있다. 즉, 일부 구체예에서, 방법은 대상체에게 적어도 하나의 변형된 T 세포의 다회수 투여를 포함할 수도 있다.
본 발명에 따르는 구체예에서, 대상체는 바람직하게는 인간 대상체이다. 일부 구체예에서, 본원에서 본 발명의 치료적 또는 예방적 방법에 따라 처리되는 대상체는 HLA 유전자형에 기초하여 선택된다. 일부 구체예에서, 대상체는 MHC 분류 I 분자의 맥락에서 본 발명에 따르는 T 세포의 TCR이 특이적인 바이러스의 펩타이드를 제공할 수 있는 MHC 분류 I α-사슬을 암호화하는 HLA 대립 유전자를 갖는다.
본 발명에 따르는 구체예에서, 대상체는 바이러스 감염, 또는 바이러스 감염이 위험 인자인 질환 또는 장애에 의해 유발되거나 악화된 질환 또는 장애의 치료를 위해 이러한 질환/장애, 예를 들어, 바이러스 감염의 특정 마커에 대한 특성화에 기초하여 선택될 수 있다. 대상체는 치료가 필요한 질환 또는 장애에 걸린 것으로 진단되거나, 또는 이러한 질환 또는 장애에 걸린 것으로 의심될 수도 있다. 본 발명에 따르는 구체예에서, 대상체는 바이러스 감염, 또는 바이러스 감염이 위험 인자인 질환 또는 장애에 의해 유발되거나 악화된 질환 또는 장애의 예방을 위해 본원의 예방적 방법에 대하여 바이러스 감염에 대한 특정 위험 인자에 대한 특성화에 기초하여 선택될 수도 있다.
본 발명의 다양한 양태에 따르는 구체예에서, 본 발명에 따르는 질환 또는 장앨ㄹ 치료하거나 예방하는 것은 조합 요법을 포함할 수도 있다. 이러한 구체예에서, 본 발명에 따르는 T 세포 또는 약학적 조성물은 추가의 간섭을 포함하는 과정의 일부로서 투여될 수도 있다.
일부 구체예에서, 방법은 바이러스 감염, 또는 바이러스 감염에 의해 유발되거나 악화된 질환 또는 장애의 예방 또는 치료를 위한 - 예를 들어, 적합한 작용제의 투여를 통한 - 간섭을 포함한다. 예방적 간섭은 백신 접종을 포함할 수도 있다.
적합한 치료제는 당업자에 의해 특정 바이러스 감염에 적절한 것으로 쉽게 확인될 수 있으며, 적합한 작용제는 아바카비르, 아시클로비르, 아사이클로비르, 아데포비르, 아만타딘, 암프레나비르, 암플리겐, 아르비돌, 아타자나비르, 아트리플라, 발라비르, 시도포비르, 콤비비르, 돌루테그라비르, 다루나비르, 델라비리딘, 디다노신, 도코사놀, 에독수딘, 에파비렌즈, 엠트리시타빈, 엔푸비르티드, 엔테카비르, 에콜리에베르, 팜시클로비르, 포미비르센, 포스암프레나비르, 포스카르넷, 포스포넷, 융합 억제자, 간시클로비르, 이바시타빈, 이뮤노비르, 이독수리딘, 이미퀴모드, 인디나비르, 이노신, 인테그라제 억제자, 인터페론 III형, 인터페론 II형, 인터페론 Id형, 인터페론, 라미부딘, 로피나비르, 로비리드, 마라비록, 모록시딘, 메티사존, 넬피나비르, 네비라핀, 넥사비르, 니타족사니드, 뉴클레오사이드 유사체, 노비르, 오셀타미비르 (타미플루), PEG-인터페론 알파-2a, 펜시클로비르, 페라미비르, 플레코나릴, 포도필로톡신, 프로테아제 억제자, 랄테그라비르, 역전사 효소 억제자, 리바비린, 리만타딘, 리토나비르, 피라미딘, 사퀴나비르, 소포스부비르, 스타부딘, 상승작용 인핸서, 텔라프레비르, 테노포비르, 테노포비르 디소프록실, 티프라나비르, 트리플루리딘, 트리지비르, 트롼타딘, 트루마다, 발라시클로비르 (발트렉스), 발간시클로비르, 비크리비록, 비다라빈, 비라미딘, 잘시타빈, 자나미비르 (렐렌자), 및 지도부딘으로부터 선택된 하나 이상의 항바이러스제를 포함한다.
예를 들어, B형 간염 바이러스로 감염의 경우에, 적합한 작용제는 그 전문이 참고로 포함된 WHO Guidelines for the prevention, care and treatment of persons with chronic hepatitis B infection, March 2015, ISBN 9789241549059, 및 Alberti and Caporaso, Dig Liver Dis, 2011 43 Suppl 1: S57-63에서 기술된 것들을 포함한다. 특히, 본 발명은 항바이러스제, 예컨대 라미부딘 (에피비르), 아데포비르 (헤프세라), 테노포비르 (비리드), 텔비부딘 (티제카) 및 엔테카비르 (바라클루드), 및 이것들의 조합, 및 또한 인터페론 알파-2a 및 PEG화된 인터페론 알파-2a의 사용을 고려한다.
일부 구체예에서, 방법은 간암, 예를 들어, 간 세포 암종과 같이, 바이러스 감염과 관련된 암의 치료 또는 예방을 위한 치료적 또는 예방적 간섭을 포함한다.
환자 선택
본 발명은 또한 본 발명에 따르는 치료적 또는 예방적 치료를 위한 대상체를 확인하는 방법을 제공한다.
한 양태에서, 치료적 또는 예방적 치료를 위한 대상체를 확인하는 방법은 대상체에 대한 HLA 유형을 결정하는 단계를 포함한다. HLA형 결정은 당업자에게 널리 공지된 다양한 방법에 의해, 예컨대 형 결정되는 HLA 유전자 또는 유전자들을 시퀀싱하고, DNA 서열을 공지된 HLA 대립 유전자에 대한 서열과 비교함으로써 수행될 수 있다. 일부 구체예에서, 본 발명에 따르는 T 세포의 TCR에 의해 인식되는 바이러스의 펩타이드를 제공할 수 있는 MHC 분류 I 분자를 암호화하는 HLA 대립 유전자를 갖는 것으로 결정된 대상체는 본 발명에 따르는 치료적 또는 예방적 치료에 적합한 대상체인 것으로 확인된다.
한 양태에서, 치료적 또는 예방적 치료를 위한 대상체를 확인하는 방법은 대상체가 바이러스 감염으로 감염되었는지, 또는 이것에 의한 감염의 위험이 있는지를 결정하는 단계를 포함한다. 바이러스 감염은 당업자에게 널리 공지된 다양한 방법에 의해 진단될 수 있고, 개체로부터 얻어진 샘플에서 바이러스 핵산 및/또는 단백질의 검출 방법을 포함한다. 일부 구체예에서, 본 발명에 따르는 T 세포가 특이적 TCR을 포함하는 바이러스로 감염된 것으로 결정된 대상체는 본 발명에 따르는 치료적 또는 예방적 치료에 적합한 대상체인 것으로 확인된다.
조성물
본 발명은 또한 본 발명에 따르는 T 세포를 포함하는 조성물을 제공한다. 일부 구체예에서, 조성물은 약학적 조성물이다. 일부 구체예에서, 조성물은 연구, 치료, 예방 및/또는 진단에서의 사용에 적합한 조성물이다.
본 발명에 따르는 조성물은 전형적으로는 본 발명에 따르는 하나 이상의 T 세포를 포함한다는 것을 알 수 있을 것이다. 즉, 조성물은 전형적으로는 본 발명에 따르는 T 세포의 집단 또는 조제물을 포함한다.
일부 구체예에서, 본 발명에 따르는 T 세포는 바람직하게는, 제한되는 것은 아니지만, 약학적으로 허용 가능한 담체, 보조제, 부형제, 희석제, 충전제, 완충제, 보존제, 항산화제, 윤활제, 안정화제, 가용화제, 계면활성제 (예를 들어, 습윤제), 봉쇄제, 착색제, 방향제, 및 감미제를 포함하는 당업자에게 널리 공지된 하나 이상의 다른 약학적으로 허용 가능한 성분과 함께 의약 또는 제약으로서 제제화된다. 용어 "약학적으로 허용 가능한"은, 본원에서 사용된 바와 같이, 화합물, 성분, 재료, 조성, 투약 형태, 등과 관련이 있으며, 이것들은 정상적인 의학적 판단의 범위 내에서 합리적인 이점/위험 비율에 적합한 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응, 또는 다른 문제 또는 합병증이 없이 문제의 대상체 (예를 들어, 인간)의 조직과 접촉된 경우에 사용에 적합하다. 각각의 담체, 보조제, 부형제, 등은 또한 제제의 다른 성분과 호환 가능하다는 의미에서 "허용 가능"해야 한다. 적합한 담체, 보조제, 부형제, 등은 표준 약학 문서, 예를 들어, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th edition, Mack Publishing Company, Easton, Pa., 1990; 및 Handbook of Pharmaceutical Excipients, 2nd edition, 1994에서 발견될 수 있다.
제제는 약학 분야에서 널리 공지된 어떤 방법에 의해서도 제조될 수 있다. 이러한 방법은 활성 화합물을 하나 이상의 부수적인 성분을 구성하는 담체와 회합시키는 단계를 포함한다. 일반적으로, 제제는 활성 화합물을 담체 (예를 들어, 액체 담체, 미세하게 분리된 고체 담체, 등)와 균일하고 밀접하게 회합시킨 다음, 필요한 경우, 제품을 성형함으로써 제조된다.
제제는 많은 투여 경로에 의한 투여를 위해 제조될 수 있다. 의약 및 조성물은 유체 또는 고체 (분말 포함) 형태로 제제화될 수도 있다. 투여 경로는 국부적, 비경구, 전신, 정맥내, 동맥내, 근육내, 척추강내, 안내, 피하, 경구 또는 경피일 수도 있다. 일부 구체예에서, 투여는 주사를 포함할 수도 있다. 주사 가능한 제제는 멸균 또는 등장성 배지 중의 선택된 작용제를 포함할 수도 있다.
본 발명의 한 양태에서, 본 발명에 따르는 T 세포 또는 약학적 조성물의 사전 결정된 양을 포함하는 부품 키트가 제공된다. 일부 구체예에서, 키트는 본원에서 기술된 방법에서 T 세포 또는 약학적 조성물을 사용하기 위한 설명서를 포함할 수도 있다. 예를 들어, 일부 구체예에서, 키트는 본원에서 기술된 바와 같이 질환 또는 장애를 치료하거나 예방하기 위해서 환자에게 T 세포 또는 약학적 조성물의 투여를 위한 설명서를 포함할 수도 있다.
또 다른 양태에서, TCR을 암호화하는 핵산 및 세포 독성 인자의 발현 또는 활성을 감소시키기 위한 작용제를 포함하는 부품 키트가 제공된다. 일부 구체예에서, 키트는 본원에서 기술된 바와 같이 방법에서 핵산 및/또는 작용제를 사용하기 위한 설명서를 포함할 수도 있다. 예를 들어, 일부 구체예에서, 키트는 핵산을 T 세포로 도입하기 위한 설명서 및/또는 T 세포를 세포 독성 인자의 발현 또는 활성을 감소시키기 위한 작용제로 처리하기 위한 설명서를 포함할 수도 있다.
일부 구체예에서, 키트는 본 발명에 따르는 방법을 수행하기 위한 다른 재료 및/또는 시약을 추가적으로 포함할 수도 있다. 예를 들어, 일부 구체예에서, 키트는 핵산을 T 세포로 도입하고, 및/또는 시험관 내에서 T 세포를 배양하기 위한 재료 및/또는 시약을 추가적으로 포함할 수도 있다.
본 발명은 이러한 조합이 명백하거 허용 불가능하거나 또는 명시적으로 방지되는 경우를 제외하면 기술된 양태 및 바람직한 특징들의 조합을 포함한다.
본원에서 사용된 섹션 제목은 단지 유기적인 목적을 위한 것이며 기술된 주제를 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다.
본 발명의 양태 및 구체예는 이제, 예를 들어, 첨부된 도면을 참고하여 예시될 것이다. 추가의 양태 및 구체예는 당업자에게 명백해질 것이다. 이 맥락에서 언급된 모든 문서는 본원에 참고로 포함된다.
이어지는 청구항을 포함한 이 명세서 전반에 걸쳐, 문맥상 달리 요구되지 않는 한, 단어 "포함하다", 및 "포함하다" 및 "포함하는"과 같은 변형은 임의의 정수나 단계 또는 정수들이나 단계들의 군의 배제가 아닌 언급된 정수나 단계 또는 정수들이나 단계들의 군의 포함을 나타내는 것으로 이해될 것이다.
명세서 및 첨부된 청구항에서 사용된 바와 같이, 단수형 "하나의(a)", "하나의(an)", 및 "그(the)"는 문맥상 분명하게 지시되지 않는 한 복수의 지시대상을 포함한다. 범위는 본원에서 "약" 하나의 특정 값에서부터, 및/또는 "약" 또다른 특정 값까지로 표현될 수도 있다. 이러한 범위가 표현되면, 또 다른 구체예는 하나의 특정 값에서부터 및/또는 다른 특정 값까지를 포함한다. 유사하게, 값이 근사치로 표현되면, 선행사 "약"의 사용에 의해, 특정 값은 또 다른 구체예를 형성하는 것으로 이해될 것이다.
실시예
본 발명자들은 다음 실시예에서 바이러스-특이적 T 세포의 생성 및 특성화를 기술한다.
실시예
1: 세포주
루시퍼라제 세포주를 발현하는 HepG2-Env 및 HepG2-Core를 10% 열-비활성화된 소 태아 혈청 (FBS), 20 mM HEPES, 0.5 mM 나트륨 피루베이트, 100 U/ml 페니실린, 100 μg/ml 스트렙토마이신, MeM 아미노산, Glutamax, MeM 비필수 아미노산 (Invitrogen, Carlsbad, CA)이 보충된 RPMI 1640에서 배양하였고, 2 μg/ml 퓨로마이신 (BD Biosciences, San Jose, CA)을 추가하여 선택을 유지하였다. T2 세포를 상기 기술된 바와 같이 보충된 RPMI 1640에서 배양하였다. 전체 HBV 게놈을 안정하게 발현하고 감염성 바이러스 (HepG2.2.15)를 생산하는 HepG2 세포를 10% 열-비활성화된 FBS, 20 mM HEPES, 0.5 mM 나트륨 피루베이트, 및 150 μg/ml G418 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)로 보충된 DMEM에서 배양하였다. 인간 나트륨 타우로콜레이트 동시-수송 폴리펩타이드 (hNTCP)를 안정하게 발현하는 HepG2 세포를 10% 열-비활성화된 FBS, Glutamax로 보충된 DMEM에서 배양하였고, 100 U/ml 페니실린, 100 μg/ml 스트렙토마이신, 및 5 μg/ml 퓨로마이신을 추가하여 선택을 유지하였다. HLA-A2를 발현하고 루시퍼라제를 암호화하는 HCV 레플리콘을 가지고 있는 Huh7 세포를 10% 열-비활성화된 FBS, Glutamax, MeM 비필수 아미노산으로 보충된 DMEM에서 배양하였고 100 U/ml 페니실린, 100 μg/ml 스트렙토마이신, 1 mg/ml G418 및 3 μg/ml 블라스티시딘 S 하이드로클로라이드를 추가하여 선택을 유지하였다.
실시예
2: T 세포
말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 건강한 공여체의 사전 동의 하에 수거하였다. 활성화된 T 세포를 생산하기 위해, PBMC를 AIM-V + 2% 인간 AB 혈청에서 600 IU/ml 인터류킨-2 (rlL-2; R&D Systems) 및 50 ng/ml 항-CD3 (OKT-3; eBioscience, San Diego, CA)으로 자극하였고, rlL-2는 전기천공법 하루 전에 1000 IU/ml로 증가하였다. 비-활성화된 (휴지기) T 세포는 팬 T 세포 분리 키트 (Miltenyi Biotec, GmbH, Germany)를 사용하여 분리하였고 전기천공법 전에 100 IU/ml rlL-2에서 밤새도록 배양하였다.
실시예
3: 유동 세포 분석법
세포 표면 염색용 항체를 BD Biosciences (항-인간 CD8-PE-Cy7, CD8-V500, CD45RA-APC, CD62L-PECy7), eBioscience (항-인간 CD45RO-eFluor650), Immudex 및 Proimmune (HLA-A201-HBs183-91-PE 덱스트라머 또는 펜타머), 및 R&D Systems (인간 LTβ 수용체-Fc 키메라)으로부터 얻었다. 세포 내 사이토카인 염색용 항체를 BD Biosciences (항-인간 IFN-γ-APC, TNF-α-Alexa488, IL-2-PE, Granzyme-APC) 및 Diaclone (항-인간 퍼포린-FITC)으로부터 얻었다. 세포를 고정하고 cytofix/cytoperm (BD Biosciences)를 투과시켜 세포 내 사이토카인 염색을 수행하였다. 유동 세포 분석법을 FACS Canto 유동 세포 분석기 또는 LSRII (BD Biosciences)를 사용하여 수행하였고 데이터를 FACS Diva 프로그램 (BD Biosciences)으로 분석하였다.
실시예
4:
HBV
외피 s183-191
TCR
mRNA의
생산
HBV 외피 s183-191 TCR 구조체 (HBV s183-TCR)를 pUC57-s183cys b2Aa 벡터로부터 유도하였고, pVAX1 벡터로 서브클로닝하였다. 플라스미드를 대장균(E. coli)에서 증식시키고 One Shot Top10 대장균 키트 (Invitrogen)를 사용하여 대장균으로부터 정제하고, QIAGEN Endo Free Plasmid Maxi Kit (QIAGEN, Valencia, CA)를 사용하여 정제하고, XbaI 제한 효소를 사용하여 선형화하였다. mMESSAGE mMACHINE T7 Ultra Kit (Ambion, Austin, TX) 또는 T7 mScript Standard mRNA Production System (Cellcript, Madison, WI)을 사용하여 TCR mRNA를 생산하기 위해 선형화된 DNA를 사용하였다; T7 RNA 폴리머라제를 추가하여 전사를 시작하였다; RNA를 Anti-Reverse Cap Analog (ARCA)로 캡핑하였다(capped). 그 다음에 폴리(A)-꼬리를 대장균 Poly(A) Polymerase 및 ATP에 의해 추가하였다. 결과의 생성물을 염화 리튬 침전에 의해 농축시키고 버퍼에 재용해시켰다.
실시예
5: T 세포의
mRNA
전기천공법
4D-nucleofector 시스템 (Lonza, Cologne, Germany)로의 전기천공법을 위해, 10 x 106개의 활성화된 T 세포 또는 비-활성화된 (휴지기) T 세포를 상기 기술된 바와 같이 실온에서 100 μl의 보충된 40-Nucleofector Solution에 현탁시키고 HBV s183-TCR mRNA를 200 μg/ml로 추가하였다. 혼합물을 뉴클레오큐벳에 배치시키고 자극된 또는 비자극 T 세포에 대한 프로그램을 사용하여 전기천공하였다. 전기천공법 이후, 세포를 AIM-V 10% 인간 AB 혈청 + 100 IU/ml rlL-2에 재현탁시키고 분석할 때까지 37℃ 및 5% C02에서 배양하였다.
실시예
6:
mRNA
전기천공된 T 세포의 기능
HLA-A2+ T2 세포에 106개 세포/ml에서 1 h 동안 1 μg/ml의 s183-191 펩타이드로 펄스를 가한 다음 2회 세척하였다. HBV s183-TCR mRNA 전기천공된 활성화된 (활성화된 EP) 또는 비-활성화된 (휴지기 EP) T 세포를 각각 10 μg/ml 또는 2 μg/ml 브레펠딘 A의 존재 하에 5h 또는 밤새도록 펩타이드-로딩된 T2 세포와 함께 동시-배양하였고 CD8, IFN-γ, 그랜자임 및 퍼포린에 대하여 염색하였다.
실시예
7: 세포 독성 검정
HepG2-Core 또는 HepG2-Env를 발현하는 루시퍼라제 세포주를 밤새도록 96-웰 Rat 바닥 플레이트에서 평판 배양하여 부착시켰다. 표적 세포를 세척하고 다양한 효과기:표적 (E:T) 비 (CD8+펜타머+ 세포의 빈도에 기초하여 계산된 효과기)로 AIM-V + 2% 인간 AB 혈청에서 24h 동안 3배수로 HBV s183-TCR mRNA 전기천공된 활성화된 또는 비-활성화된 (휴지기) T 세포와 동시-배양하였다. 세포 독성을 나머지 표적 세포에서 루시퍼라제 발현을 정량화하여 측정하였다. 간략히 말하면, 배양 배지를 제거하고 100 μl Steady-Glo 시약 (Promega, Madison, Wl)을 각 웰에 추가한 다음 5분 동안 인큐베이션하여 세포 용해시킨다. 발광을 마이크로플레이트 판독기 (Tecan, Mannedorf, Switzerland)로 측정혔다. 효과기가 없는 표적 세포를 최대 발광에 대한 기준으로 사용하였다. 결과를 % 용해 = 100% - (용해 후 남아있는 발광 / 최대 발광) %로 표현하고 3배수 측정의 평균 +/- 표준 편자로 계산하였다.
실시예
8: 표적과
mRNA
전기천공된 T 세포의 동시-배양 실험
HBV S 83-TCR mRNA 전기천공된 활성화된 또는 비-활성화된 (휴지기) T 세포를 1:3 및 1:1 E:T 비 (CD8+펜타머+ 세포의 빈도에 기초하여 계산된 효과기)로 HepG2.2.15 또는 HBV-감염된 HepG2-hNTCP와 함께 24시간 동안 동시-배양하였다. HCV NS3 TCR mRNA 전기천공된 비-활성화된 (휴지기) T 세포를 18h 동안 Huh7 HCV 레플리콘 세포와 동시-배양한 후 이어서, 상기 기술된 바와 같이 발광을 정량화하였다. T 세포와 동시-배양한 후 표적 세포 용해에 대하여 평가하기 위해서, 동시-배양 실험의 상층액을 24h 후 알라닌 아미노트랜스퍼라제 (ALT)의 측정을 위해 수거하였거나, 또는 생존력 검정을 Cell Proliferation Kit II (XTT) (Roche Applied Science, Mannheim, Germany)를 사용하여 수행하였다. IFN-γ를 차단하기 위해서, 20 μg/ml 정제된 항-인간 IFN-γ 또는 아이소타입 대조군 마우스 IgG1 (BioLegend)을 추가하였다. 림포톡신 (LT)α1β2, LTα2β1 및 LIGHT를 차단하기 위해서, 1 μg/ml 재조합 인간 LTβ 수용체-Fc 키메라 (R&D Systems, Minneapolis, USA)를 사용하였다.
실시예
9:
HBV
감염
HepAD38 세포의 대략 80 내지 100배 농축된 상층액을 HBV 접종물로 사용하였다. 24-웰 플레이트에 밤새도록 분주된 HepG2-hNTCP 세포를 4% 폴리에틸렌 글리콜 (Sigma-Aldrich)을 함유하는 배지에서 대략적으로 3000/웰 HBV의 다양한 게놈 동등물로 24h 동안 접종시켰다. 감염 후, 세포를 PBS로 3회 세척하였고 DMSO가 들어있는 배양 배지를 추가하고 2일마다 교체하였다. 바이러스 감염을 유동 세포 분석법에 의해 감염된 세포에서 B형 간염 표면 항원 (HBsAg), B형 간염 코어 항원 (HBcAg) 발현을 측정하여 분석하였고 HBV DNA를 실시간 PCR로 정량화하였다.
실시예
10:
HBV
게놈
동등물
카피의 정량화
β-머캅토에탄올이 들어있는 RLT 버퍼 또는 pH 8에서 50 mM Tris, 140 mM NaCl, 1.5 mM MgCI, 0.5% NP-40을 함유하는 용해 버퍼를 추가하여 QIAamp MinElute Virus Spin 키트 (Qiagen, Valencia, CA)를 사용하여 세포 내 바이러스 핵산을 분리시키기 위해 세포를 용해시켰고, HBV DNA를 실시간 PCR에 의해 정량화하였다. Rotor-Gene Q 2-plex instrument Qiagen)에서 제조사의 지시에 따라 artus HBV RG PCR 키트를 사용하여 실시간 PCR을 수행하였다.
실시예
11: 3차원
마이크로디바이스
-기반 검정
균질하게 해리된 HepG2 표적을 함유하는 200 μl의 2.5 mg/ml 1형 콜라겐 겔 용액을 제조하기 위해서, 1OX PBS 20 μl를 NaOH (0.5 M) 4 μl, 129.2 μl의 콜라겐 I형 (Rat Tail, Dow Corning), 5 x 106개 세포/ml의 신선하게 트립신 처리되고 해리된 HepG2 표적 20 μl 및 세포 배양액 22.9 μl와 혼합하였다. 겔 용액의 최종 pH는 pH 지표 스트립을 사용하여 결정된 바와 같이 대략 7이었다. 그 다음에 HepG2 표적을 함유하는 콜라겐 겔 용액을 디바이스의 디바이스 전용 겔 영역으로 주사하였고 세포 배양 인큐베이터 (37℃, 5% CO2)에서 40분 동안 폴리머화하였다. 겔 폴리머화 직후, 겔을 수화시키고 HepG2 표적을 중요하게 유지하기 위해 배지 채널을 R10 배지로 채웠다. 세포 불투과성 핵 염료 DRAQ7 (BioLegend, San Diego, CA)를 또한 3 μM의 농도로 R10 배지에 추가하여 살아있는 세포와 죽은 세포를 구별하였다. 이어서 디바이스를 24hr 동안 인큐베이션하여 HepG2 표적과 콜라겐 매트릭스를 상호작용시켰다.
비어있는 겔 영역을 가진 디바이스 (대조군)를 유사하게 10X PBS 20 μl, NaOH (0.5 M) 4 μl, 콜라겐 I 129.2 μl 및 세포 배양액 42.8 μl를 함유하는 콜라겐 겔 용액을 추가하여 제조하였다. 디바이스에서 T 세포를 주사하기 전에, 디바이스 내 R10 배지를 AI-V 2% 인간 AB 혈청 + 100 IU/ml rlL-2를 함유하는 DRAQ7로 대체하였다.
조작된 T 세포의 공간적인 위치를 가시화하기 위해서, 세포를 RPMI 1640 중의 3 μM CellTracker Violet BMQC (Life Technologies Co., Carlsbad, CA)로 37℃에서 30분 동안 염색하였다. 이어서 T 세포 현탁액을 AIM-V 2% 인간 AB 혈청으로 세척한 후 이어서, 37℃에서 추가로 30분 인큐베이션하였다. 이어서 염색된 T 세포를 세척하고, 3 x 106개 세포/ml로 상응하는 배지에 재현탁하였다. 이어서 T 세포 현탁액 30 μl를 각 디바이스의 중앙 겔 영역에 플랭킹된 두 개의 배양 배지 채널 중 하나에 추가하였다. 마지막으로, 디바이스를 지시된 조건 하에 밤새도록 인큐베이션하였다.
37℃ 및 5% C02로 설정된 환경 챔버가 구비된 LSM7800 공초점 현미경 (Zeiss, Germany) 또는 FV1200 공초점 현미경 (Olympus, Japan)을 사용하여 실시간 이미지화 (시간차) 실험을 수행하였다. 언급된 시간 간격으로 선택된 영역의 Z 스택(stack)을 획득하기 위해 현미경의 프로그램을 설정하였다. 정지 이미지 실험을 위해서, T 세포를 추가하기 전 및 밤새도록 배양하기 전에 관심있는 같은 영역의 공초점 이미지를 획득하였다.
실시예
12: 통계 분석
통계 분석을 GraphPad Prism (Graph-Pad Software Inc)으로 수행하였다. 둘 이상의 군에 관한 비교를 위해서, 다중 비교를 위해 던 사후 테스트(Dunn's post-test)와 함께 크루스칼 왈리스 테스트(Kruksal Wallis)를 사용하여 통계적 유의성을 결정하였으며 유의차의 증거로서 p < 0.05를 취했다.
실시예
13:
TCR
mRNA
전기천공법을 사용하여 인간 비-활성화된 T 세포에서 HBV
TCR의
발현
mRNA 전기천공법은 임의의 사전 활성화 없이 1차 림프구에서 이식 유전자를 도입할 수 있는 것으로 알려져있다 (Zhao et al. Mol Ther (2006), 13 (1): 151-159). 이것은 임상적 적용과 관련하여 상당한 이점을 가질 수 있다.
본 발명자들은 HBV TCR이 비자극 비-활성화된 (휴지기) T 세포에서 발현될 수 있는지를 조사하였다.
HLA-A2-제한된 HBV 외피 S183-TCR의 알파 및 베타 사슬을 암호화하는 mRNA를 비자극, 비-활성화된 (휴지기) T 세포, 또는 항-CD3 및 IL-2로 8일 동안 활성화된 T 세포로 전기천공하였다.
전기천공법 후 24시간에, 비-활성화된 (휴지기) T 세포의 25% 및 활성화된 T 세포의 64%가 도입된 HBV S183-TCR을 발현하였다 (도 1A).
전기천공법 이후 TCR 발현의 동역학을 또한 결정하였다. 활성화된 T 세포와 유사하게, 비-활성화된 (휴지기) T 세포에서 발현된 HBV s183-TCR은 전기천공법 이후 6시간에 검출될 수 있다; TCR 발현은 전기천공법 후 24시간에 가장 높았고 72시간 이후 사라졌다 (도 1B).
실시예
14:
HBV
TCR
mRNA
전기천공된 T 세포의 분화 표현형
전임상 동물 모델 및 인간 입양 T 세포 요법 임상 시험의 각각의 분석은 덜 분화된 비-활성화된 줄기 세포 기억 또는 중심 기억 T 세포 부분 집합의 투입이 입양 T 세포 요법의 치료적 효능을 증가시킬 수 있다는 것을 보여주었다 (Klebanoff et al. J Immunother. (2012), 35(9): 651-660).
그러므로 본 발명자들은 도입된 HBV s183-TCR을 발현하는 활성화된 및 활성화된 T 세포 둘 다의 분화 표현형을 분석하였다. 비-활성화된 HBV s183-TCR T 세포의 80% 초과가 CD45RA+CD62L+ 비-활성화된 표현형을 갖는 한편, 활성화된 HBV s183-TCR T 세포는 40% CD45RA+CD62L+ 비-활성화된, 45% CD45RA-CD62L+ 중심 기억 및 15% 효과기 기억 표현형의 혼합물로 구성된다 (도 2A 및 2B). 비-활성화된 및 활성화된 HBV S183-TCR T 세포 둘 다의 90% 초과는 동시 자극 수용체 CD27 및 CD28을 둘 다 발현하였으며 (도 2A 및 2B), 유사하게 전기천공법이 세포의 증식을 자극하기 때문이다 (Qiabius et al. New Biotech (2015), 32(1): 229-235).
비-활성화된 또는 활성화된 T 세포 내에서 TCR을 발현하는 세포와 비교하여 TCR을 발현하지 않는 분화 표현형에서 차이를 관찰할 수 없었으며, mRNA 전기천공법이 특정 분화 상태의 세포를 우선적으로 트랜스펙션하지 않는다는 것을 나타낸다 (데이터 미도시).
실시예
15:
HBV
TCR
mRNA에
의한 세포 용해 효소 생산의 분석
세포 용해 효소 (그랜자임 및 퍼포린) 및 사이토카인의 발현은 T 세포 성숙 및 분화와 관련이 있는 것으로 알려져 있다; 비-활성화된 (휴지기) T 세포는 세포 용해 효소를 거의 또는 전혀 발현하지 않고 더 분화된 세포 유형과 비교하여 더 작은 사이토카인을 발현한다 (Chattopadhyay et al., J Leukoc Biol (2009) 85(1): 88-97, 상기 본원에 참고로 포함됨). 그러므로 본 발명자들은 펩타이드-특이적 자극 5시간 및 24시간 후 비-활성화된 및 활성화된 HBV TCR mRNA-전기천공된 T 세포에서 그랜자임 B, 퍼포린 및 IFN-γ의 발현을 분석하였다.
결과는 도 3에 나타나있다. 전기천공된, 활성화된 T 세포가 전기천공된 비-활성화된 (휴지기) T 세포보다 더 높은 수준의 퍼포린, 그랜자임 B 및 IFN-γ를 발현하는 것을 발견하였다.
실시예
16:
HBV
TCR
mRNA
전기천공된 T 세포가 표적 세포를
용해시키는
능력의 분석
전기천공된, 활성화된 또는 비-활성화된 (휴지기) T 세포를 표적 세포를 용해시키는 능력에 대하여 조사하였다. 표적 세포 살해량을 정지 및 실시간 이미지화 둘 다를 사용하여 정량화하였다.
결과는 도 4에 나타나있다. 비-활성화된, 전기천공된 T 세포와 같은 항원 특이적 빈도에 대하여 표준화된, 활성화된, 전기천공된 T 세포를 밤새도록 동시-배양하는 것은 표적을 용해시킬 수 있다. 하지만, 비-활성화된, 전기천공된 T 세포는 표적 세포를 용해시키지 않았다.
실시예
17:
HBV
TCR
mRNA
전기천공된 T 세포에 의한 사이토카인 생산의 분석
전기천공된, 활성화된 또는 비-활성화된 T 세포를 다양한 사이토카인의 발현에 대하여 분석하였고, 결과는 도 5에 나타나있다.
전기천공된, 활성화된 T 세포는 전기천공된, 비-활성화된 T 세포보다 더 많은 RANTES, IL-13, MIP-1α 및 MIP-1β를 생산하였다. 비-전기천공된 활성화된 T 세포는 전기천공된 비-활성화된 T 세포보다 더 많은 RANTES, IL-13, MIP-1α 및 MIP-1β를 생산하였다.
실시예
18:
HBV
TCR
mRNA
전기천공된 T 세포의 항바이러스 활성의 분석
HCV 레플리콘 시스템을 사용하여 전기천공된 T 세포가 표적 세포의 용해를 유발하지 않으면서 항바이러스 활성을 나타내는지를 분석하였다.
HLA-A2를 발현하는 Huh7 세포를 HCV JFH-1 계통 및 루시퍼라제를 암호화하는 구조체로 트랜스펙션하였으며, Jo et al., Gastroenterology (2009) 136(4): 1391-1401에 기술되어 있다. 루시퍼라제 활성은 HCV RNA 복제와 연관성이 있으며, 그러므로 발광을 측정하여 바이러스 복제를 분석할 수 있다.
세포에 1 μg/ml HBV env 183 펩타이드로 밤새도록 펄스를 가하고, 이어서 HBV env TCR 전기천공된 활성화된 또는 비-활성화된 T 세포와 함께 24 h 동안 동시-배양하였다. 펩타이드-펄스가 가해진 HCV 레플리콘 세포를 다양한 효과기:표적 (E:T) 비로 T 세포와 동시-배양하였고, 발광의 퍼센트 감소를 계산하여 항바이러스 활성을 결정하였다. 동시-배양의 상층액을 수거하여 표적 세포 용해의 마커로서 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라제 (AST)에 대하여 분석하였다.
실험의 결과는 도 6A 및 6B에서 나타나있다. 전기천공된 비-활성화된 T 세포 및 전기천공된 활성화된 T 세포는 둘 다 높은 E:T 비에서도 높은 항바이러스 활성을 갖는 것으로 나타났다. 예를 들어, E:T 1:500에서도 -80% 발광 감소를 관찰하였다.
중요하게도, 전기천공된 비-활성화된 T 세포는 과도한 표적 세포 용해 없이 이 항바이러스 활성을 보유하는 것으로 나타나있으며, 전기천공된 활성화된 T 세포와의 동시-배양과 비교하여 동시-배양 상층액 내에서 낮은 수준의 AST의 검출에 의해 예시된 바와 같다.
추가의 동시-배양 실험을 24h 동안 1:3 E:T로 전기천공된 비-활성화된 T 세포 (표면 마커 발현에 기초하여 분류된 대용량 집단, 또는 부분 집합으로서) 및 HBV 생산 HepG2 세포를 사용하여 수행하였다. 세포 내 HBV DNA를 실시간 PCR에 의해 정량화하였고, AST 수준을 동시-배양 상층액에서 측정하였다.
결과는 도 7에 나타나있다. 전기천공된, 활성화된 T 세포 및 전기천공된, 비-활성화된 (휴지기) T 세포는 둘 다 HBV 바이러스량을 억제할 수 있었다. 하지만, 전기천공된, 활성화된 T 세포는 더 높은 AST 수준으로 나타난 바와 같이 표적 세포를 용해시키는 한편, 전기천공된, 비-활성화된 T 세포는 표적 세포를 용해시키지 않았다.
실시예
19:
HBV
TCR
mRNA
전기천공된 T 세포의 항바이러스 활성 메커니즘의 조사
최근 연구는 간 세포에서 림포톡신-β 수용체 (LTβR) 활성화가 간 세포 독성 없이 HBV 핵 공유 결합 폐환형 DNA (cccDNA)의 분해를 유도할 수 있다는 것을 시사한다 (Lucifora et al., Science (2014) 343 (6176): 1221-1228; Haybaeck et al., Cancer Cell (2009) 16(4): 295-308).
LTβR에 대한 리간드는 LTβ 및 LIGHT이고, 그것들은 비-활성화된 (휴지기) 전기천공된 T 세포에서 발현된다.
SEQUENCE LISTING
<110> Lion TCR Pte Ltd
<120> Antiviral T Cells
<130> RIC/FP7187313
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 10
<212> PRT
<213> Hepatitis B virus
<400> 1
Phe Leu Gly Pro Leu Leu Val Leu Gln Ala
1 5 10
<210> 2
<211> 10
<212> PRT
<213> Hepatitis B virus
<400> 2
Leu Leu Gly Pro Leu Leu Val Leu Gln Ala
1 5 10
<210> 3
<211> 4
<212> PRT
<213> Picornavirus
<400> 3
Asn Pro Gly Pro
1
Claims (40)
- 바이러스에 특이적인 T 세포 수용체 (TCR)를 암호화하는 외인성 핵산을 포함하는 세포로서, 선택적으로는 분리된 T 세포이며, 비-활성화된 T 세포인 T 세포.
- 제1 항에 있어서, 비-활성화된 T 세포는 TCR이 특이적인 펩타이드로의 자극에 반응하여 퍼포린 및/또는 그랜자임의 증가된 발현을 나타내지 않는 것을 특징으로 하는 T 세포.
- 제1 항 또는 제2 항에 있어서, 바이러스로 감염된 세포에서 바이러스의 복제를 억제할 수 있는 것을 특징으로 하는 T 세포.
- 제1 항 또는 제3 항 중 어느 한 항에 있어서, 바이러스로 감염된 세포에서 바이러스의 복제를 세포 독성 인자의 감소된 발현 또는 활성을 위해 변형되지 않은 바이러스에 특이적인 TCR을 포함하는 활성화된 T 세포에 의한 바이러스 복제의 억제의 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98% 또는 100%로 억제할 수 있는 것을 특징으로 하는 T 세포.
- 제1 항 내지 제4 항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 독성 인자의 감소된 발현 또는 활성을 위해 변형되지 않은 바이러스에 특이적인 TCR을 포함하는 활성화된 T 세포와 비교하여 바이러스로 감염되거나, 또는 바이러스의 펩타이드를 포함하는 세포에 대하여 감소된 세포 독성을 나타내는 것을 특징으로 하는 T 세포.
- 바이러스에 특이적인 변형된 T 세포를 생산하는 방법으로서, 선택적으로는 시험관 내 방법이며, 바이러스에 특이적인 T 세포 수용체 (TCR)를 발현하거나 포함하도록 T 세포를 변형시키는 단계를 포함하고, 변형된 T 세포는 비-활성화된 T 세포인 방법.
- 제6 항에 있어서, 바이러스에 특이적인 TCR을 발현하거나 포함하도록 T 세포를 변형시키는 단계는 바이러스에 특이적인 TCR을 암호화하는 핵산을 T 세포로 도입하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제7 항에 있어서, 핵산은 형질 도입, 트랜스펙션 또는 트랜스포손-기반 시스템에 의해 T 세포로 도입되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제6 항 내지 제8 항 중 어느 한 항의 방법에 의해 얻어지거나 얻어질 수 있는 T 세포로서, 선택적으로는 분리된 T 세포인 T 세포.
- 제1 항 내지 제5 항 또는 제9 항 중 어느 한 항의 T 세포, 및 약학적으로 허용 가능한 담체, 보조제, 부형제, 또는 희석제를 포함하는 약학적 조성물.
- 제1 항 내지 제5 항 또는 제9 항, 또는 제10 항에 중 어느 한 항에 있어서, 질환 또는 장애를 치료하거나 예방하는 방법에서의 사용을 위한 T 세포, 또는 약학적 조성물.
- 질환 또는 장애를 치료하거나 예방하는 방법에서의 사용을 위한 의약의 제조시 제1 항 내지 제5 항 또는 제9 항 중 어느 한 항의 T 세포, 또는 제10 항의 약학적 조성물의 사용.
- 질환 또는 장애를 치료하거나 예방하는 방법으로서, 제1 항 내지 제5 항 또는 제9 항 중 어느 한 항의 T 세포, 또는 제10 항의 약학적 조성물의 치료적 또는 예방적 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
- 대상체의 질환 또는 장애를 치료하거나 예방하는 방법으로서,
(a) 대상체로부터 적어도 하나의 T 세포를 분리하는 단계;
(b) 바이러스에 특이적인 T 세포 수용체 (TCR)를 발현하거나 포함하도록 적어도 하나의 T 세포를 변형시키는 단계; 및
(c) 변형된 적어도 하나의 T 세포를 대상체에게 투여하는 단계
를 포함하며,
변형된 적어도 하나의 T 세포는 비-활성화된 T 세포인 방법. - 제14 항에 있어서, 바이러스에 특이적인 TCR을 발현하거나 포함하도록 적어도 하나의 T 세포를 변형시키는 단계는 바이러스에 특이적인 TCR를 암호화하는 핵산을 적어도 하나의 T 세포로 도입하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제15 항에 있어서, 핵산은 형질 도입, 트랜스펙션 또는 트랜스포손-기반 시스템에 의해 적어도 하나의 T 세포로 도입되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1 항 내지 제5 항 또는 제9 항 중 어느 한 항의 T 세포, 또는 제10 항의 약학적 조성물의 사전 결정된 양을 포함하는 부품 키트.
- 바이러스에 특이적인 T 세포 수용체 (TCR)를 포함하는 세포로서, 선택적으로는 분리된 T 세포이며, 하나 이상의 세포 독성 인자의 감소된 발현 또는 활성을 위해 변형된 T 세포.
- 제18 항에 있어서, 세포 독성 인자는 퍼포린, 그랜자임 B, 그랜자임 A, 그래뉼리신, 및 FASL로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 T 세포.
- 제18 항 또는 제19 항에 있어서, 바이러스로 감염된 세포에서 바이러스의 복제를 억제할 수 있는 것을 특징으로 하는 T 세포.
- 제18 항 내지 제20 항 중 어느 한 항에 있어서, 바이러스로 감염된 세포에서 바이러스의 복제를 세포 독성 인자의 감소된 발현 또는 활성을 위해 변형되지 않은 바이러스에 특이적인 TCR을 포함하는 활성화된 T 세포에 의한 바이러스 복제의 억제의 적어도 50%로 억제할 수 있는 것을 특징으로 하는 T 세포.
- 제18 항 내지 제21 항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 독성 인자의 감소된 발현 또는 활성을 위해 변형되지 않은 바이러스에 특이적인 TCR을 포함하는 활성화된 T 세포와 비교하여 바이러스로 감염되거나, 또는 바이러스의 펩타이드를 포함하는 세포에 대하여 감소된 세포 독성을 나타내는 것을 특징으로 하는 T 세포.
- 제18 항 내지 제22 항 중 어느 한 항에 있어서, TCR을 암호화하는 외인성 핵산을 포함하는 것을 특징으로 하는 T 세포.
- 바이러스에 특이적인 변형된 T 세포를 생산하는 방법으로서, 선택적으로는 시험관 내 방법이고, 하나 이상의 세포 독성 인자의 발현 또는 활성을 감소시키도록 T 세포를 변형시키는 단계를 포함하며, 변형된 T 세포는 바이러스에 특이적인 T 세포 수용체 (TCR)를 포함하는 방법.
- 제24 항에 있어서, 하나 이상의 세포 독성 인자의 발현 또는 활성을 감소시키도록 T 세포를 변형시키는 단계는 T 세포를 하나 이상의 세포 독성 인자의 발현 또는 활성을 억제하기 위한 작용제로 처리하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제24 항 또는 제25 항에 있어서, 세포 독성 인자는 퍼포린, 그랜자임 B, 그랜자임 A, 그래뉼리신, 및 FASL로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제24 항 내지 제26 항 중 어느 한 항에 있어서, 방법은 바이러스에 특이적인 TCR을 발현하거나 포함하도록 T 세포를 변형시키는 단계를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제27 항에 있어서, 바이러스에 특이적인 TCR을 발현하거나 포함하도록 T 세포를 변형시키는 단계는 바이러스에 특이적인 TCR을 암호화하는 핵산을 T 세포로 도입하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제24 항 내지 제28 항 중 어느 한 항의 방법에 의해 얻어지거나 얻어질 수 있는 T 세포로서, 선택적으로는 분리된 T 세포인 T 세포.
- 제18 내지 제23 항 또는 제29 항 중 어느 한 항의 T 세포, 및 약학적으로 허용 가능한 담체, 보조제, 부형제, 또는 희석제를 포함하는 약학적 조성물.
- 제18 항 내지 제23 항 또는 제29 항, 또는 제30 항에 있어서, 질환 또는 장애를 치료하거나 예방하는 방법에서의 사용을 위한 것을 특징으로 하는 T 세포, 또는 약학적 조성물.
- 질환 또는 장애를 치료하거나 예방하는 방법에서의 사용을 위한 의약의 제조시 제18 항 내지 제23 항 또는 제29 항의 T 세포, 또는 제30 항의 약학적 조성물의 사용.
- 질환 또는 장애를 치료하거나 예방하는 방법으로서, 대상체에게 제18 항 내지 제23 항 또는 제29 항의 T 세포, 또는 제30 항의 약학적 조성물의 치료적 또는 예방적 유효량을 투여하는 단계를 포함하는 방법.
- 대상체에서 질환 또는 장애를 치료하거나 예방하는 방법으로서,
(a) 대상체로부터 바이러스에 특이적인 적어도 하나의 T 세포를 분리하는 단계;
(b) 하나 이상의 세포 독성 인자의 감소된 발현 또는 활성을 위해 적어도 하나의 T 세포를 변형시키는 단계; 및
(c) 변형된 적어도 하나의 T 세포를 대상체에게 투여하는 단계
를 포함하는 방법. - 대상체에서 질환 또는 장애를 치료하거나 예방하는 방법으로서,
(a) 대상체로부터 적어도 하나의 T 세포를 분리하는 단계;
(b) 바이러스에 특이적인 T 세포 수용체 (TCR)를 발현하거나 포함하도록 적어도 하나의 T 세포를 변형시키는 단계로서,
(i) T 세포는 세포 독성 인자의 감소된 발현 또는 활성을 위해 변형되거나, 또는
(ii) 방법은 하나 이상의 세포 독성 인자의 감소된 발현 또는 활성을 위해 적어도 하나의 T 세포를 변형시키는 단계를 더 포함하는 단계; 및
(c) 변형된 적어도 하나의 T 세포를 대상체에게 투여하는 단계
를 포함하는 방법. - 제35 항에 있어서, 바이러스에 특이적인 TCR을 발현하거나 포함하도록 적어도 하나의 T 세포를 변형시키는 단계는 바이러스에 특이적인 TCR를 암호화하는 핵산을 적어도 하나의 T 세포로 도입하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제34 항 내지 제36 항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 세포 독성 인자의 감소된 발현 또는 활성을 위해 적어도 하나의 T 세포를 변형시키는 단계는 적어도 하나의 T 세포를 하나 이상의 세포 독성 인자의 발현 또는 활성을 억제하기 위한 작용제로 처리하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제34 항 내지 제37 항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 독성 인자는 퍼포린, 그랜자임 B, 그랜자임 A, 그래뉼리신, 및 FASL로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제18 항 내지 제23 항 또는 제29 항 중 어느 한 항의 T 세포, 또는 제30 항의 약학적 조성물의 사전 결정된 양을 포함하는 부품 키트.
- (i) 바이러스에 특이적인 T 세포 수용체 (TCR)를 암호화하는 핵산 및 (ii) 세포 독성 인자의 발현 또는 활성을 감소시키기 위한 작용제를 포함하는 부품 키트.
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