CN118147079A - 表达外源病毒特异性t细胞受体(tcr)的非活化t细胞 - Google Patents

表达外源病毒特异性t细胞受体(tcr)的非活化t细胞 Download PDF

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Abstract

本发明涉及包含编码特异性针对病毒的T细胞受体(TCR)的外源核酸的T细胞，特别是非活化T细胞。本发明的实施方案针对一种表达乙型肝炎病毒(HBV)包膜s183‑191TCR的非活化(静息)T细胞，其能够抑制病毒复制，并且当与表达所述TCR的活化T细胞相比时显示出对刺激做出响应穿孔蛋白和/或颗粒酶的表达降低。本发明还涵盖了生产这些细胞的方法、包含这些细胞的组合物、药物组合物和药剂盒及其医学用途。

Description

表达外源病毒特异性T细胞受体(TCR)的非活化T细胞
技术领域
本发明涉及T细胞、特别是抗病毒T细胞、用于生产这些细胞的方法、包含这些细胞的组合物及其医学用途。
背景技术
当前的抗病毒疗法能够控制HBV复制，但不能将HBV cccDNA从被感染的肝细胞中清除。标准的治疗策略昂贵，并且如使用核苷/核苷酸类似物治疗的情形中那样需要终生治疗，或者如使用IFN-α疗法那样伴有严重的不良副作用。暴露在HBV感染几年后，慢性感染的患者中HBV特异性T细胞通常缺失或功能耗失。重新调动所述病毒特异性T细胞应答的的临床治疗策略，可以治疗慢性感染或防止与严重急性感染相关的死亡。
通过植入T细胞受体(TCR)或嵌合抗原受体(CAR)进行工程化改造后的T淋巴细胞，可以特异性识别肿瘤，其用于过继治疗能显著地控制肿瘤。通过T细胞过继性表达HBV特异性T细胞受体，工程化改造T细胞，使其具有针对HBV的特异性免疫力，可以重建患者的抗病毒免疫力，类似于获得急性感染患者控制HBV病毒的抗病毒免疫力，这代表了一种有希望的治疗策略。
已显示，被工程化改造后，表达乙型肝炎病毒(HBV)特异性TCR的T细胞，能够识别整合了HBV DNA并表达HBV抗原的天然肝细胞癌(HCC)细胞(Gehring等，JHepatol(2011)55(1):103-110)；并且，通过电穿孔工程化改造的，表达HBV特异性TCR的活化T细胞，也能够阻止HCC肿瘤细胞的植入，多次灌注这种细胞还能控制肿瘤在体内的生长(Koh等，Mol TherNucleic Acids(2013)2:e114)。此外，使用表达HBV表面抗原(HBsAg)特异性TCR的T细胞的过继性T细胞疗法，已被证实可以在具有HCC转移的肝移植患者中抑制HBsAg水平(Qasim等，J Hepatol(2015)62(2):486-491)。
然而，过继性T细胞疗法也伴随着相关的严重副作用和/或毒性。靶抗原在正常组织中的低水平表达或所述TCR与内源蛋白质的交叉反应性，可以引起严重的副作用。例如，Morgan等，J Immunother(2013)36(2):133-151描述了与使用工程化改造以表达抗MAGE-A3TCR的T细胞的过继性T细胞疗法相关的神经毒性，这可能是MAGE-A12在人脑中表达的结果。对毒性的担忧阻碍了这种特异性T细胞的过继转移疗法的应用，以及重塑人体针对这些感染重要器官的病毒的免疫力的可能性。
发明内容
本发明是基于本发明人的下述发现，即可以工程化改造一种病毒特异性T细胞，其是抗病毒的，并且对被所述病毒感染的细胞不表现出显著的细胞毒性。本发明的目的是提供一种用于控制病毒感染的干预手段，其对宿主表现出降低的毒性。
具体来说，本发明人发现，对非活化T细胞进行修饰以表达特异性针对病毒的TCR，产生了能够在被病毒感染的细胞中抑制病毒复制的T细胞，但所述T细胞与被工程化改造以表达所述TCR的等同的活化T细胞表现出的细胞毒性相比，对那些被病毒感染的细胞表现出降低的细胞毒性。
本发明人还已发现，包含特异性针对病毒的TCR并且被修饰以降低细胞毒性因子的表达/活性的T细胞保留了在被病毒感染的细胞中抑制病毒复制的能力，但与它们的非修饰的对应物相比对那些细胞表现出降低的细胞毒性。
第一方面，本发明提供了一种T细胞，其任选被分离，并包含编码特异性针对病毒的T细胞受体(TCR)的外源核酸，其中所述T细胞是非活化T细胞。在某些实施方式中，所述非活化T细胞在所述TCR特异性针对的病毒多肽的刺激下，不表现出穿孔蛋白和/或颗粒酶的表达提高。在某些实施方式中，所述T细胞能够抑制所述病毒在被所述病毒感染的细胞中的复制。在某些实施方式中，所述T细胞与包含特异性针对病毒的TCR的活化T细胞相比，能够将被所述病毒感染的细胞中的病毒复制抑制到包含特异性针对所述病毒的TCR的活化T细胞对病毒复制的抑制的至少50％，所述活化T细胞未进行用于降低细胞毒性因子的表达或活性的修饰。在某些实施方式中，所述T细胞与包含特异性针对病毒的TCR的活化T细胞相比，对被所述病毒感染或包含所述病毒的肽的细胞表现出降低的细胞毒性，所述活化T细胞未进行用于降低细胞毒性因子的表达或活性的修饰。
第二方面，本发明提供了一种用于生产特异性针对病毒的修饰的T细胞的方法，任选为体外方法，所述方法包括对T细胞进行修饰以表达或包含特异性针对所述病毒的T细胞受体(TCR)，其中所述修饰的T细胞是非活化T细胞。在某些实施方式中，所述方法用于生产根据本发明的第一方面的T细胞。在某些实施方式中，对所述T细胞进行修饰以表达或包含特异性针对所述病毒的TCR，包括将编码特异性针对所述病毒的TCR的核酸引入到所述T细胞中。在某些实施方式中，所述核酸通过转导例如γ反转录病毒转导、慢病毒转导引入到所述T细胞中。在某些实施方式中，所述核酸通过DNA或RNA转染例如mRNA电穿孔导入到所述T细胞中。在某些实施方式中，所述核酸通过基于转座子的系统例如Spleeping Beauty导入到所述T细胞中。
第三方面，本发明提供了一种T细胞，其通过或可以通过根据本发明的第二方面的方法获得。
第四方面，本发明提供了一种药物组合物，其包含根据本发明的第一或第三方面的T细胞和可药用载体、佐剂、赋形剂或稀释剂。
第五方面，本发明提供了根据本发明的第一或第三方面的T细胞或根据本发明的第四方面的药物组合物，其用于治疗或预防疾病或病症的方法中。
第六方面，本发明提供了根据本发明的第一或第三方面的T细胞或根据本发明的第四方面的药物组合物在制备用于治疗或预防疾病或病症的药物中的应用。
第七方面，本发明提供了一种治疗或预防疾病或病症的方法，所述方法包括向对象给药治疗或预防有效量的根据本发明的第一或第三方面的T细胞或根据本发明的第四方面的药物组合物。
第八方面，本发明提供了一种治疗或预防对象的疾病或病症的方法，所述方法包括：
(a)从所述对象分离至少一个T细胞；
(b)对所述至少一个T细胞进行修饰，以表达或包含特异性针对病毒的T细胞受体(TCR)；以及
(c)将所述修饰的至少一个T细胞给药到所述对象；
其中所述修饰的至少一个T细胞是非活化T细胞。在某些实施方式中，对所述至少一个T细胞进行修饰以表达或包含特异性针对病毒的TCR，包括将编码特异性针对病毒的TCR的核酸导入到所述至少一个T细胞中。在某些实施方式中，所述核酸通过转导例如γ反转录病毒转导、慢病毒转导导入到所述T细胞中。在某些实施方式中，所述核酸通过DNA或RNA转染例如mRNA电穿孔导入到所述至少一个T细胞中。在某些实施方式中，所述核酸通过基于转座子的系统例如Spleeping Beauty导入到所述T细胞中。
第九方面，本发明提供了一种药剂盒，其包含预定量的根据本发明的第一或第三方面的T细胞或根据本发明的第四方面的药物组合物。
第十方面，本发明提供了一种T细胞，任选为分离的T细胞，其包含特异性针对病毒的T细胞受体(TCR)，并且被修饰以降低一种或多种细胞毒性因子的表达或活性。在某些实施方式中，所述细胞毒性因子选自穿孔蛋白、颗粒酶B、颗粒酶A、粒溶蛋白和FASL。在某些实施方式中，所述T细胞能够在被所述病毒感染的细胞中抑制所述病毒的复制。在某些实施方式中，所述T细胞与包含特异性针对病毒的TCR的活化T细胞相比，能够将被所述病毒感染的细胞中病毒的复制抑制到包含特异性针对所述病毒的TCR的活化T细胞对病毒复制的抑制的至少50％，所述活化T细胞未进行用于降低细胞毒性因子的表达或活性的修饰。在某些实施方式中，所述T细胞与包含特异性针对所述病毒的TCR的活化T细胞相比，对被所述病毒感染或包含所述病毒的肽的细胞表现出降低的细胞毒性，所述活化T细胞未进行用于降低细胞毒性因子的表达或活性的修饰。在某些实施方式中，所述T细胞包含编码所述TCR的外源核酸。
第十一方面，本发明提供了一种用于生产特异性针对病毒的修饰的T细胞的方法，任选为体外方法，所述方法包括对T细胞进行修饰以降低一种或多种细胞毒性因子的表达或活性，其中所述修饰的T细胞包含特异性针对所述病毒的T细胞受体(TCR)。在某些实施方式中，所述方法用于生产根据本发明的第十方面的T细胞。在某些实施方式中，对T细胞进行修饰以降低一种或多种细胞毒性因子的表达或活性，包括用抑制一种或多种细胞毒性因子的表达或活性的药剂处理所述T细胞。在某些实施方式中，所述细胞毒性因子选自穿孔蛋白、颗粒酶B、颗粒酶A、粒溶蛋白和FASL。在某些实施方式中，所述方法另外包括对所述T细胞进行修饰以表达或包含特异性针对所述病毒的TCR。在某些实施方式中，对所述T细胞进行修饰以表达或包含特异性针对所述病毒的TCR，包括将编码特异性针对所述病毒的TCR的核酸导入到所述T细胞中。
第十二方面，本发明提供了一种T细胞，其任选被分离，其中所述T细胞通过或可以通过根据本发明的第十一方面的方法获得。
第十三方面，本发明提供了一种药物组合物，其包含根据本发明的第十或第十二方面的T细胞和可药用载体、佐剂、赋形剂或稀释剂。
第十四方面，本发明提供了根据本发明的第十或第十二方面的T细胞或根据本发明的第十三方面的药物组合物，用于治疗或预防疾病或病症法中。
第十五方面，本发明提供了根据本发明的第十或第十二方面的T细胞或根据本发明的第十三方面的药物组合物在制备用于治疗或预防疾病或病症的方法的药物中的应用。
第十六方面，本发明提供了一种治疗或预防疾病或病症的方法，所述方法包括向对象给药治疗或预防有效量的根据本发明的第十或第十二方面的T细胞或根据本发明的第十三方面的药物组合物。
第十七方面，本发明提供了一种治疗或预防对象的疾病或病症的方法，所述方法包括：
(a)从对象分离特异性针对病毒的至少一个T细胞；
(b)对所述至少一个T细胞进行修饰，以降低一种或多种细胞毒性因子的表达或活性；以及
(c)将所述修饰的至少一个T细胞给药到所述对象。
第十八方面，本发明提供了一种治疗或预防对象的疾病或病症的方法，所述方法包括：
(a)从对象分离至少一个T细胞；
(b)对所述至少一个T细胞进行修饰，以表达或包含特异性针对病毒的T细胞受体(TCR)，其中：
(i)所述T细胞进行修饰以降低细胞毒性因子的表达或活性，或者
(ii)所述方法还包括对所述至少一个T细胞进行修饰，以降低一种或多种细胞毒性因子的表达或活性；以及
(c)将所述修饰的至少一个T细胞给药到所述对象。在某些实施方式中，对所述至少一个T细胞进行修饰以表达或包含特异性针对病毒的TCR，包括将编码特异性针对病毒的TCR的核酸导入到所述至少一个T细胞中。
在根据本发明的第十七和第十八方面的某些实施方式中，对所述至少一个T细胞进行修饰以降低一种或多种细胞毒性因子的表达或活性，包括用抑制一种或多种细胞毒性因子的表达或活性的药剂处理所述至少一个T细胞。在某些实施方式中，所述细胞毒性因子选自穿孔蛋白、颗粒酶B、颗粒酶A、粒溶蛋白和FASL。
第十九方面，本发明提供了一种药剂盒，其包含预定量的根据本发明的第十或第十二方面的T细胞或根据本发明的第十三方面的药物组合物。
第二十方面，本发明提供了一种药剂盒，其包含(i)编码特异性针对病毒的T细胞受体(TCR)的核酸，和(ii)用于降低细胞毒性因子的表达或活性的药剂。
与各个不同方面相关联，在某些实施方式中，本发明提供了一种T细胞，其任选被分离，并包含特异性针对病毒的T细胞受体(TCR)，其中所述T细胞(i)能够抑制所述病毒在被所述病毒感染的细胞中的复制，并且(ii)与包含特异性针对所述病毒的TCR的活化T细胞相比，对被所述病毒感染或包含所述病毒的肽的细胞表现出降低的细胞毒性，所述活化T细胞未进行用于降低细胞毒性因子的表达或活性的修饰。在某些实施方式中，所述T细胞包含编码所述TCR的外源核酸。在某些实施方式中，与未进行用于降低细胞毒性因子的表达或活性的修饰的活化T细胞的一种或多种细胞毒性因子的表达或活性水平相比，所述T细胞表现出表达或活性水平的降低。在某些实施方式中，所述T细胞被修饰，以降低一种或多种细胞毒性因子的表达或活性。在某些实施方式中，所述细胞毒性因子选自穿孔蛋白、颗粒酶B、颗粒酶A、粒溶蛋白和FASL。在某些实施方式中，与未进行用于降低细胞毒性因子的表达或活性的修饰的活化T细胞的表达或活性相比，所述T细胞表现出RANTES、IL-13、ΜΙΡ-1α和MIP-1β中的一者或多者的表达或活性的降低。在某些实施方式中，所述T细胞与包含特异性针对病毒的TCR的活化T细胞相比，能够将被所述病毒感染的细胞中病毒的复制抑制到包含特异性针对所述病毒的TCR的活化T细胞对病毒复制的抑制的至少50％，所述活化T细胞未进行用于降低细胞毒性因子的表达或活性的修饰。
与各个不同方面相关联，在用于生产根据本发明的特异性针对病毒的T细胞的某些实施方式中，所述方法包括对所述T细胞进行修饰以表达或包含特异性针对所述病毒的TCR。在某些实施方式中，所述修饰的T细胞(i)能够抑制所述病毒在被所述病毒感染的细胞中的复制，并且(ii)与包含特异性针对所述病毒的TCR的活化T细胞相比，对被所述病毒感染或包含所述病毒的肽的细胞表现出降低的细胞毒性，所述活化T细胞未进行用于降低细胞毒性因子的表达或活性的修饰。在某些实施方式中，对所述T细胞进行修饰以表达或包含特异性针对所述病毒的TCR，包括将编码特异性针对所述病毒的TCR的核酸引入到所述T细胞中。在某些实施方式中，所述核酸通过转导例如γ反转录病毒转导、慢病毒转导导入到所述T细胞中。在某些实施方式中，所述核酸通过DNA或RNA转染例如mRNA电穿孔导入到所述T细胞中。在某些实施方式中，所述核酸通过基于转座子的系统例如Spleeping Beauty导入到所述T细胞中。在某些实施方式中，对T细胞进行修饰以降低一种或多种细胞毒性因子的表达或活性，包括用抑制一种或多种细胞毒性因子的表达或活性的药剂处理所述T细胞。在某些实施方式中，所述细胞毒性因子选自穿孔蛋白、颗粒酶B、颗粒酶A、粒溶蛋白和FASL。
具体实施方式
T细胞
在根据本发明的多个方面中，提供了T细胞，任选为分离的T细胞。根据本发明的各个不同方面，“T细胞”可以任选地是“T细胞群”，并且“分离的T细胞”可以任选地是“分离的T细胞群”。
CD8+和CD4+T细胞是适应性免疫系统的一部分。CD8+T细胞的正常功能是杀死癌细胞和被细胞内病原体例如细菌和病毒感染的细胞。CD4+T细胞常常被表征为辅助性T细胞，并促进B细胞产生抗体，增强并维持CD8+T细胞的应答，以及调控巨噬细胞活性。
T细胞经历不同的发育阶段，并且取决于例如所述T细胞是否已遇到所述T细胞特异性针对的抗原以及任何这种相遇的环境而具有不同的表型。T细胞发育和活化被描述在例如Janeway等，《免疫学》(Immunobiology)第五版，(2001)，Garland Science,New York，第7和第8章中，其整体引入本文作为参考。
活化T细胞是已经历T细胞活化过程的T细胞。作为与在来自于抗原呈递细胞(APC)的正协同刺激信号的背景中对T细胞的TCR具有高亲和力的MHC-肽复合物结合的结果，所述T细胞可以变得活化。活化可以是体内、离体或体外。作为通过CD3的刺激的结果，任选地与通过CD28的刺激相组合，并任选地与在高IL-2条件下培养相组合，T细胞也可以变得活化。在某些实施方式中，活化T细胞可以在体外或离体活化，例如通过使用激动剂抗CD3抗体的处理来刺激，任选地与使用激动剂抗CD28抗体的处理相组合，并且任选地与在高IL-2条件下培养相组合。高IL-2条件可以是>100IU/ml，例如>500IU/ml、>600IU/ml、>800IU/ml、>900IU/ml的IL-2浓度。
非活化T细胞是尚未被活化，即尚未经历T细胞活化过程的T细胞。在本文中，非活化T细胞也可以被描述为静息T细胞。在某些实施方式中，非活化T细胞是尚未遇到在来自于APC的正协同刺激信号的背景中对所述T细胞的TCR具有高亲和力的MHC-肽复合物的T细胞。在某些实施方式中，非活化T细胞是尚未通过CD3进行刺激，任选地与通过CD28的刺激相组合，并任选地与在高IL-2条件下培养相组合的T细胞。在某些实施方式中，非活化T细胞尚未在体外或离体被活化，例如通过使用激动剂抗CD3抗体的处理来刺激，任选地与使用激动剂抗CD28抗体的处理相组合，并且任选地与在高IL-2条件下的培养相组合。
在根据本发明的各个不同方面的某些实施方式中，活化T细胞可以是幼稚(naive)T细胞。在根据本发明的各个不同方面的某些实施方式中，非活化T细胞可以是幼稚T细胞。当在本文中使用时，幼稚T细胞是尚未遇到对所述T细胞的TCR具有高亲和力的、例如由APC呈递的肽或MHC-肽复合物的T细胞。
非活化和活化T细胞可以参考某些标志物的表达来表征，如在Ahlers和Belyakov，Blood(2010)115(9):1678-1689中所述，所述文献整体引入本文作为参考。非活化和活化T细胞也可以根据所述细胞的功能性质来表征。
在某些实施方式中，非活化T细胞可在细胞表面处表达CD45RA、CCR7或CD62L中的一者或多者。在某些实施方式中，与在活化T细胞的细胞表面处的表达相比，非活化T细胞可在细胞表面处表达更高水平的CD45RA、CCR7或CD62L中的一者或多者。
在某些实施方式中，非活化T细胞可具有CD45RAhigh表型。当在本文中使用时，CD45RAhigh表型的T细胞是例如通过流式细胞术确定在细胞表面处表达高水平CD45RA的细胞。本领域技术人员能够容易地确定表现出给定分子的“高”表面表达的细胞或细胞群体，例如通过用流式细胞术分析，例如通过参照不在细胞表面处表达该分子或以较低表达水平表达所述分子的对照细胞或细胞群。
在某些实施方式中，与在活化T细胞的细胞表面处的表达相比，非活化T细胞可在细胞表面处表达较低水平的CD45RO、CD43或KLRG1中的一者或多者，或者可能在细胞表面处不以可检测的水平表达CD45RO、CD43或KLRG1中的一者或多者。
已知非活化(静息)T细胞表现出细胞裂解酶的很少表达或不表达，并且与分化更高的细胞类型相比表现出某些细胞因子的较低表达(Chattopadhyay等，J Leukoc Biol(2009)85(1):88-97，其整体引入本文作为参考)。
因此，在某些实施方式中，非活化T细胞可以由与活化T细胞的表达相比，穿孔蛋白、颗粒酶(例如颗粒酶B或颗粒酶A)或粒溶蛋白中的一者或多者的较低表达水平来定义。在某些实施方式中，非活化T细胞可能不以可检测的水平表达穿孔蛋白、颗粒酶(例如颗粒酶B或颗粒酶A)或粒溶蛋白中的一者或多者。在某些实施方式中，与活化T细胞在用所述活化T细胞包含的特异性TCR所针对的肽刺激后的表达相比，非活化T细胞在用所述非活化T细胞包含的特异性TCR所针对的肽刺激后，可能表达较低水平的穿孔蛋白、颗粒酶(例如颗粒酶B或颗粒酶A)或粒溶蛋白中的一者或多者。
在某些实施方式中，非活化T细胞在用所述非活化T细胞包含的特异性TCR所针对的肽刺激后，可能不以可检测的水平表达穿孔蛋白、颗粒酶(例如颗粒酶B或颗粒酶A)或粒溶蛋白中的一者或多者(例如通过流式细胞术所确定的)。在某些实施方式中，非活化T细胞在用所述非活化T细胞包含的特异性TCR所针对的肽刺激后穿孔蛋白、颗粒酶(例如颗粒酶B或颗粒酶A)或粒溶蛋白中的一者或多者的表达，与尚未用所述非活化T细胞包含的特异性TCR所针对的肽刺激的非活化T细胞的表达相比没有提高。
使用肽的刺激可以如本文实施例6中所述来进行。简单来说，可以将表达能够呈递所述T细胞包含的特异性TCR所针对的肽的MHC的细胞用1pg/ml的所述肽脉冲1h，清洗两次，然后任选地在布雷菲德菌素A存在下与所述T细胞共同培养5h或过夜。
穿孔蛋白、颗粒酶(例如颗粒酶B或颗粒酶A)或粒溶蛋白的基因/蛋白质表达可以如本文中所述来分析和定量。在某些实施方式中，在用所述非活化T细胞包含的特异性TCR所针对的肽刺激后，根据本发明的非活化T细胞可以低于所述非活化T细胞在用肽刺激之前的表达水平或未用肽刺激的对照非活化T细胞的表达水平的2倍、1.9倍、1.8倍、1.7倍、1.6倍、1.5倍、1.4倍、1.3倍、1.2倍或1.1倍的穿孔蛋白、颗粒酶(例如颗粒酶B或颗粒酶A)或粒溶蛋白中的一者或多者的表达水平。
在本文的实施方式中，使用肽刺激T细胞包括将T细胞与所述肽、包含所述肽的病毒、包含所述肽的细胞或包括含有所述肽的病毒(例如被所述病毒感染)的细胞相接触。在某些实施方式中，包含所述肽的细胞可能已被修饰以包含或表达所述肽。例如，在某些实施方式中，所述细胞可能已被修饰以包含编码所述肽的核酸，或者可能已用所述肽脉冲。在某些实施方式中，刺激可以在体外进行。在某些实施方式中，刺激可以是离体的。
在某些实施方式中，与活化T细胞的表达相比，非活化T细胞可能表达较低水平的RANTES、IL-13、ΜΙΡ-1α和MIP-1β中的一者或多者。表达可以是基因或蛋白表达，正如在下文中解释的。
在某些实施方式中，活化T细胞可以在细胞表面处表达CD45RO、CD43或KLRG1中的一者或多者。在某些实施方式中，与在非活化T细胞的细胞表面处的表达相比，活化T细胞可以在细胞表面处表达较高水平的CD45RO、CD43或KLRG1中的一者或多者。在某些实施方式中，与在非活化T细胞的细胞表面处的表达相比，活化T细胞可以在细胞表面处表达较低水平的CD45RA、CCR7或CD62L中的一者或多者，或者可以不在细胞表面处以可检测的水平表达CD45RA、CCR7或CD62L中的一者或多者。在某些实施方式中，活化T细胞可以具有CD45RAlow表型。当在本文中使用时，具有CD45RAlow表型的T细胞是例如通过流式细胞术确定的在细胞表面处以可检测的水平表达CD45RA，但在细胞表面处以不是高表达水平的水平表达CD45RA的细胞。本领域技术人员能够容易地确定表现出给定分子的“低”表面表达的细胞或细胞群，例如通过流式细胞术进行分析，例如通过参照在细胞表面处以较高表达水平表达该分子的对照细胞或细胞群。
在某些实施方式中，与非活化T细胞的表达相比，活化T细胞可以表达较高水平的穿孔蛋白、颗粒酶(例如颗粒酶B或颗粒酶A)或粒溶蛋白中的一者或多者。在某些实施方式中，与非活化T细胞在用所述非活化T细胞包含的特异性TCR所针对的肽刺激后的表达相比，活化T细胞在用所述活化T细胞包含的特异性TCR所针对的肽刺激后可能表达较高水平的穿孔蛋白、颗粒酶(例如颗粒酶B或颗粒酶A)或粒溶蛋白中的一者或多者。
在某些实施方式中，与非活化T细胞的表达相比，活化T细胞可以表达较高水平的RANTES、IL-13、ΜΙΡ-1α和MIP-1β中的一者或多者。
在某些实施方式中，与活化T细胞针对被所述活化T细胞特异性针对的病毒感染或包含所述病毒的肽的细胞表现出的细胞毒性相比，非活化T细胞针对被所述非活化T细胞特异性针对的病毒感染或包含所述病毒的肽的细胞可能表现出降低的细胞毒性活性。在某些实施方式中，非活化T细胞针对被所述非活化T细胞特异性针对的病毒感染或包含所述病毒的肽的细胞可能不表现出细胞毒性活性。
在某些实施方式中，与活化T细胞的细胞分裂速率相比，非活化T细胞可能具有较低的细胞分裂速率(即所述细胞可能每单位时间经历较少的细胞分裂)。给定细胞/细胞群的细胞分裂速率可以例如通3H-胸腺嘧啶掺入的体外分析或CFSE稀释测定法来分析，例如如Fulcher和Wong，Immunol Cell Biol(1999)77(6):559-564中所描述，其整体引入本文作为参考。
当在本文中使用时，“细胞毒性”是指被所述T细胞特异性针对的和/或呈递所述病毒的肽的病毒感染或包含所述病毒的肽的细胞的细胞死亡或细胞死亡的诱导。给定T细胞或T细胞群的细胞毒性活性可以通过本领域技术人员公知的适合的手段来测量，例如通过在将所述T细胞或T细胞群与被所述病毒感染或包含所述病毒的肽的细胞相接触后测量细胞裂解的标志物的水平。在某些实施方式中，正如本文中所述，所述细胞毒性与被病毒感染或包含病毒的肽的细胞相关。
在特定实施方式中，非活化T细胞和活化T细胞可以参考一个或多个下述特点来区分：
a)非活化T细胞具有CD45RAhigh、CD62LAhigh表型；
b)活化T细胞具有CD45RAlow、CD62Lhigh表型；
c)非活化T细胞不对用所述T细胞包含的特异性TCR所针对的肽的刺激应答显示出穿孔蛋白和/或颗粒酶的表达(例如基因或蛋白表达)提高；
d)活化T细胞对用所述T细胞包含的特异性TCR所针对的肽的刺激应答显示出穿孔蛋白和/或颗粒酶的表达(例如基因或蛋白表达)提高；
e)例如通过流式细胞术所确定的，与在活化T细胞的细胞表面处的表达相比，在非活化T细胞的细胞表面处CD45RA的表达水平更高；
f)例如通过基因或蛋白表达所确定的，与活化T细胞在用所述活化T细胞包含的特异性TCR所针对的肽刺激后的表达相比，非活化T细胞在用所述非活化T细胞包含的特异性TCR所针对的肽刺激后穿孔蛋白和/或颗粒酶的表达水平更低；
g)例如通过基因或蛋白表达(例如通过ELISA)所确定的，与活化T细胞的表达相比，非活化T细胞的RANTES、IL-13、ΜΙΡ-1α和MIP-1β中的一者或多者的表达水平更低；
h)与活化T细胞的细胞分裂速率相比，非活化T细胞的细胞分裂速率更低；
i)例如在细胞毒性的体外测定法中所确定的，与活化T细胞相比，非活化T细胞针对被所述T细胞包含的特异性TCR所针对的病毒感染或包含所述病毒的肽的细胞的细胞毒性水平更低。
根据本公开，非活化和/或活化T细胞可以在被修饰以例如表达或包含特异性针对病毒的TCR之前或之后表征。
在某些实施方式中，出于这些比较的目的，所述活化和非活化T细胞除了如本文中所述的它们的非活化/活化状态之外，可以是相同的。在某些实施方式中，所述非活化T细胞和活化T细胞包含或表达相同的TCR。在某些实施方式中，所述活化T细胞通过例如在体外活化，从非活化T细胞衍生而来。
T细胞表达标志物可以通过本领域技术人员公知的各种不同方法确定。当在本文中使用时，“表达”可以是指基因表达或蛋白表达。基因表达可以通过本领域技术人员公知的各种不同手段来测量。例如，给定基因的表达可以通过测量mRNA水平来测量，例如通过定量实时PCR(qRT-PCR)或通过基于报告基因的方法。类似地，蛋白表达可以通过本领域中公知的各种不同方法来测量，例如基于抗体的方法，例如通过western印迹、免疫组织化学、免疫细胞化学、流式细胞术、ELISA等。表达也可以通过基于报告物的方法来测量。
例如，细胞表面标志物的表达可以通过将细胞与能够特异性结合到目标标志物的试剂(例如抗体)相接触，并通过检测所述试剂与所述细胞的结合来分析，例如通过流式细胞术来分析。细胞的活性可以例如使用用于目标活性的体外测定法来分析。
根据本公开，表达或活性的读数可以在细胞或样品之间进行比较，或者可以与参比值进行比较。例如，可以在非活化T细胞与活化T细胞之间对水平进行比较。在某些实施方式中，为单个细胞或者为细胞群计算表达/活性的水平。在某些实施方式中，表达/活性水平是细胞或细胞群的平均值，例如表达/活性的平均或中值水平。
在某些实施方式中，相对于另一个细胞具有给定基因或蛋白质的降低/较低表达水平或具有给定活性的降低/较低水平的细胞，可以具有低于所述参比细胞的表达/活性水平的100％、95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％或5％的表达/活性水平。
在某些实施方式中，相对于另一个细胞具有给定基因或蛋白质的提高/较高表达水平或具有给定活性的提高/较高水平的细胞，具有高于所述参比细胞的表达/活性的水平1倍、1.1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍、2倍、2.1倍、2.2倍、2.3倍、2.4倍、2.5倍、2.6倍、2.7倍、2.8倍、2.9倍、3倍、3.1倍、3.2倍、3.3倍、3.4倍、3.5倍、3.6倍、3.7倍、3.8倍、3.9倍、4倍、4.1倍、4.2倍、4.3倍、4.4倍、4.5倍、4.6倍、4.7倍、4.8倍、4.9倍或5倍的水平中的一者。
除了上述表型标志物之外，T细胞可以在一种或多种T细胞标志物的检测的基础上与其他细胞(例如其他淋巴细胞和/或白细胞)区分开。T细胞标志物包括CD3多肽(例如CD3γ、CD3ε、CD3ζ或CD3δ)、TCR多肽(TCRα或TCRβ)、CD27、CD28、CD4和CD8。
病毒特异性
本发明特别关注病毒特异性T细胞，即对被病毒感染或包含病毒的肽的细胞具有反应性的T细胞。
根据本发明的病毒特异性T细胞包含能够结合到呈递源自于所述T细胞特异性针对的病毒的肽的MHC分子的TCR。
T细胞受体(TCR)是异二聚体抗原结合分子，通常包含α-链和β-链。在自然界中，α-链和β-链在T细胞(αβT细胞)的细胞表面处表达，作为与不变的CD3链的复合物。包含γ和δ链的可选的TCR在T细胞亚类(γδT细胞)上表达。TCR识别(结合到)由主要组织相容性复合物(MHC)分子呈递的抗原肽。TCR结构和所述肽-MHC复合物的识别详细描述在例如《免疫生物学》(Immunobiology)第5版，Janeway CA Jr,Travers P,Walport M等，New York:Garland Science(2001)的第3和6章中，所述文献整体引入作为参考。
源自于病毒的肽可以源自于病毒粒子或由来自于病毒的核酸所编码。当在本文中使用时，“肽”是指通过肽键相连的两个或更多个氨基酸单体的链。在某些实施方式中，肽的长度可以为50个氨基酸或更短。在某些实施方式中，所述肽是长度为5-15、5-14、5-13、5-12、5-11、5-10、5-9或5-8个氨基酸的肽。在某些实施方式中，所述肽是长度为5-15、6-15、7-15、8-15、9-15、10-15、11-15或12-15个氨基酸的肽。在某些实施方式中，所述肽是长度为5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个氨基酸的肽之一。
所述肽被MHC分子例如I类MHC分子呈递。I类MHC分子是α-链和β2-微球蛋白的异二聚体。所述α-链具有被称为α1、α2和α3的三个结构域。所述α1和α2结构域一起形成沟，所述由I类MHC分子呈递的肽结合到所述沟，以形成肽-MHC复合物。I类MHC的α-链是多态的，并且不同的α-链能够结合并呈递不同的肽。在人类I类MHC中，α-链由人类白细胞抗原(HLA)基因编码。
根据本公开的T细胞的TCR能够结合到源自于被I类MHC分子呈递的病毒多肽的肽。
根据本发明的病毒没有限制，并且可以是任何病毒。病毒可以是dsDNA病毒(例如腺病毒、疱疹病毒、痘病毒)、ssRNA病毒(例如细小病毒)、dsRNA病毒(例如呼肠孤病毒)、(+)ssRNA病毒(例如小核糖核酸病毒、披膜病毒)、(-)ssRNA病毒(例如正粘病毒、弹状病毒)、ssRNA-RT病毒(例如反转录病毒)或dsDNA-RT病毒(例如嗜肝DNA病毒)。
具体来说，本公开设想了腺病毒科、疱疹病毒科、乳头瘤病毒科、多瘤病毒科、痘病毒科、嗜肝DNA病毒科、细小病毒科、星状病毒科、杯状病毒科、小RNA病毒科、冠状病毒科、黄病毒科、披膜病毒科、戊型肝炎病毒科、反转录病毒科、正粘病毒科、砂粒病毒科、布尼亚病毒科、丝状病毒科、副粘病毒科、弹状病毒科和呼肠孤病毒科的病毒。
与疾病或病症相关的病毒是特别感兴趣的。因此，与本发明相关联设想了下述病毒：腺病毒，1型单纯性疱疹病毒，2型单纯性疱疹病毒，痘-带状疱疹病毒，爱泼斯坦-巴尔(Epstein-barr)病毒，人巨细胞病毒，人8型疱疹病毒，人乳头瘤病毒，BK病毒，JC病毒，天花病毒，乙型肝炎病毒，细小病毒B19，人星状病毒，诺瓦克病毒，柯萨基病毒，甲型肝炎病毒，脊髓灰质炎病毒，鼻病毒，重症急性呼吸综合征病毒，丙型肝炎病毒，黄热病病毒，登革热病毒，西尼罗病毒，TBE病毒，风疹病毒，戊型肝炎病毒，人免疫缺陷病毒，流感病毒，拉沙病毒，克里米亚-刚果出血热病毒，汉坦病毒，埃博拉病毒，马尔堡病毒，麻疹病毒，流行性腮腺炎病毒，副流感病毒，呼吸道合胞病毒，狂犬病病毒，丁型肝炎病毒，轮状病毒，环状病毒，科罗拉多壁虱热病毒和版纳病毒。
在特定实施方式中，所述病毒可以是肝炎病毒，例如乙型肝炎病毒。
在某些实施方式中，所述病毒可以是不直接引起被所述病毒感染的细胞病变的病毒。
根据本发明的T细胞对其具有反应性的细胞可以是被所述病毒感染的细胞，或者可以是包含或表达所述病毒的肽的细胞。所述被所述病毒感染或包含或表达所述病毒的细胞，可以在细胞表面处在I类MHC分子的背景中呈递所述病毒的肽。
所述被病毒感染或包含病毒的肽的细胞可以包含HLA等位基因，其编码能够呈递所述T细胞的TCR特异性针对的病毒的肽的I类MHC分子。在某些实施方式中，所述被病毒感染或包含病毒的肽的细胞对于被所述T细胞的TCR识别的病毒肽来说可以是HLA匹配的。在某些实施方式中，所述T细胞从对于被所述T细胞的TCR识别的病毒肽来说HLA匹配的供体获得。
在某些实施方式中，作为被所述病毒感染的结果，所述细胞可能表达或包含所述病毒的肽。在某些实施方式中，所述细胞可能已被修饰，以包含或表达所述病毒的肽。例如，在某些实施方式中，所述细胞可能已被修饰以包含编码所述病毒的肽的核酸，或者可能已用所述病毒的肽脉冲。
在特定实施方式中，根据本发明的T细胞可以包含能够识别由HBV的被称为“env”的编码病毒包膜蛋白的核酸区编码的多肽的肽的TCR。在本文中，被env区编码的HBV多肽被称为“Env多肽”。在某些实施方式中，被根据本发明的TCR或T细胞识别的肽包含的氨基酸序列包含HBV Env多肽的第171-180位的氨基酸，其中所述Env的残基相对于来自B基因型HBV的Env进行编号。在某些实施方式中，所述肽包括含有HBV Env多肽的第171-180位的氨基酸序列FLGPLLVLQA(SEQ ID NO：1)或LLGPLLVLQA(SEQ ID NO：2)或其在所述氨基酸序列中具有1或2或3个氨基酸取代的变体，或者由它们构成。在某些实施方式中，所述肽在所述氨基酸序列的一个或两个末端处另外包含1、2、3、4、5个氨基酸。在某些实施方式中，所述肽在所述氨基酸序列的一个或两个末端处另外包含1-2、1-3、1-4或1-5个氨基酸。
抗病毒活性
根据本发明的T细胞是抗病毒的T细胞。当在本文中使用时，抗病毒的T细胞具有针对病毒的抗病毒活性。
当在本文中使用时，抗病毒活性是指病毒复制或功能的抑制。具体来说，抗病毒活性可以减少或抑制下述一者或多者：细胞被病毒附着，病毒侵入细胞，病毒蛋白和/或病毒核酸释放在细胞中，细胞内病毒的复制，病毒粒子的组装，或病毒粒子从细胞的释放以用于感染其他细胞。在某些实施方式中，根据本发明的T细胞能够抑制/减少病毒在被感染细胞中的复制。
在某些实施方式中，抗病毒活性是指病毒复制或功能的无细胞毒性(例如无细胞裂解)的抑制；也就是说，病毒复制或功能不引起所述被感染细胞的细胞死亡(或细胞裂解)的抑制。
当在本文中使用时，病毒复制是指在被病毒感染的细胞中病毒粒子的形成。病毒复制被特定治疗的抑制可以通过本领域技术人员已知的方法来确定，例如通过检测在特定治疗之后，被所述病毒感染的细胞中的病毒量与不存在这种治疗的情况下或在对照治疗之后的病毒量相比的减少。
根据本公开，T细胞抑制病毒复制的能力，可以通过检测在存在所述T细胞的情况下培养后被病毒感染的细胞中的病毒量与在不存在向根据本发明的T细胞暴露的情况下培养之后被所述病毒感染的细胞中的病毒量相比的减少来确定。病毒特异性T细胞抑制病毒复制的能力，可以通过检测在存在所述病毒特异性T细胞的情况下培养后被病毒感染的细胞中的病毒量，与在不存在向根据本发明的T细胞暴露的情况下培养之后或在存在不特异性针对所述病毒的T细胞的情况下培养之后被所述病毒感染的细胞中的病毒量相比的减少来确定。
病毒复制的抑制可以在被所述病毒感染的细胞或多个细胞、包含一个或多个被所述病毒感染的细胞的样品或从被所述病毒感染的对象获得的样品中确定。
给定细胞、细胞群或样品中的病毒量可以通过本领域技术人员公知的方法来定量，例如在Albertoni等，Int J Infec Dis(2014)25:145-149中综述的方法，所述文献整体引入本文作为参考。所述病毒的量可以被计算为病毒载量。方法包括通过定量PCR和/或RT-PCR分析病毒核酸、噬斑测定法、斑点形成测定法、终点稀释测定法和用于检测和定量病毒多肽/肽或活性的方法，例如基于抗体的方法(例如western印迹、免疫组织化学、免疫细胞化学、流式细胞术、ELISA、ELISPOT)或基于报告物的方法。
在某些实施方式中，根据本发明的T细胞表现出的抗病毒活性(例如病毒复制的抑制)，为参比细胞例如包含特异性针对所述病毒的TCR的活化T细胞表现出的抗病毒活性的至少10％、20％、50％、55％60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。
在某些实施方式中，根据本发明的T细胞的抗病毒活性，与被所述T细胞特异性针对的病毒感染或包含所述病毒的肽的细胞相关联，与参比细胞例如包含特异性针对所述病毒的TCR的活化T细胞相比较进行分析。在某些实施方式中，所述参比细胞是包含与根据本发明的T细胞的TCR相同的TCR的活化T细胞。在某些实施方式中，所述参比细胞与根据本发明的T细胞相同，区别在于所述参比T细胞具有如本文中所描述的活化表型。在某些实施方式中，所述抗病毒活性与被本文中所描述的病毒感染或包含所述病毒的肽的细胞相关联来分析。
在特定实施方式中，根据本发明的T细胞与包含特异性针对病毒的TCR的活化T细胞相比，能够将被所述病毒感染的细胞中的病毒复制抑制到包含特异性针对所述病毒的TCR的活化T细胞对病毒复制的抑制的至少10％、20％、50％、55％60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％，所述活化T细胞未进行用于降低细胞毒性因子的表达或活性的修饰。在某些实施方式中，所述相对抑制为至少50％。在某些实施方式中，所述相对抑制是55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一。
特别令人吃惊的是，发现包含特异性针对病毒的TCR、与包含特异性针对所述病毒的TCR的活化T细胞相比针对被所述病毒感染或包含所述病毒的肽的细胞表现出降低的细胞毒性的T细胞，保留了相当高的抗病毒活性。
在某些实施方式中，所述抗病毒活性可以是LTβR依赖性的。在某些实施方式中，所述抗病毒活性可能涉及通过LTβR的信号传导。在某些实施方式中，所述抗病毒活性可能涉及LTβR与LIGHT之间的相互作用或LTβR与LΤβ之间的相互作用。在某些实施方式中，所述抗病毒活性可能涉及LTβR/LIGHT信号传导或LTβR/LTβ信号传导。在某些实施方式中，所述抗病毒活性可能涉及病毒DNA的降解。
可以调查T细胞表现出的抗病毒活性的机制，例如如本申请的实施例中所描述的。
细胞毒性
根据本发明的T细胞与参比细胞相比表现出降低的细胞毒性。
当在本文中使用时，细胞毒性是指T细胞在另一个细胞例如作为病毒感染的结果包含或表达病毒的肽或核酸的细胞中实现细胞死亡的能力。
T细胞能够通过下述方式在被病毒感染的细胞中实现细胞死亡：释放细胞毒性因子包括穿孔蛋白、颗粒酶(例如颗粒酶B或颗粒酶A)、粒溶蛋白，和/或通过在所述T细胞上表达的FASL连接所述被感染的细胞上的FAS，诱导所述被感染细胞的凋亡(例如描述在Chavez-Galan等，Cellular and Molecular Immunology(2009)6(1):15-25中，其整体引入本文作为参考)。
T细胞对给定靶细胞(即被HBV感染或包含或表达HBV肽的细胞)的细胞毒性，可以例如使用在Zaritskaya等，Expert Rev Vaccines(2011),9(6):601-616中综述的任何方法来调查，所述文献整体引入本文作为参考。用于T细胞对靶细胞的细胞毒性的测定法的一个实例是51Cr释放测定法，其中将靶细胞用51Cr处理，所述靶细胞将51Cr内化。所述靶细胞被T细胞裂解导致放射活性的51Cr释放到细胞培养上清液中，其可以被检测。
其他方法可以包括检测细胞损伤的标志物。例如，可以检测天冬氨酸氨基转移酶(AST)水平作为例如肝细胞损伤的度量。根据本发明，给定T细胞针对被病毒感染的肝细胞的细胞毒性可以通过将被感染的细胞与T细胞在体外温浴，随后检测AST的水平来确定。细胞毒性也可以通过细胞的成像例如通过本文实施例中所描述的静态或活细胞成像来分析。
在某些实施方式中，根据本发明的T细胞与参比细胞例如包含特异性针对所述病毒的TCR的活化T细胞相比，对被所述T细胞特异性针对的病毒感染或包含所述病毒的肽的细胞表现出降低的细胞毒性。在某些实施方式中，所述参比细胞是包含与根据本发明的T细胞的TCR相同的TCR的活化T细胞。在某些实施方式中，所述参比细胞与根据本发明的T细胞相同，区别在于所述参比T细胞具有例如本文中所描述的活化表型。在某些实施方式中，所述细胞毒性与被本文中所描述的病毒感染或包含所述病毒的肽的细胞相关联进行分析。应该认识到，所述参比活化T细胞尚未进行用于降低一种或多种细胞毒性因子的表达的修饰。
在某些实施方式中，根据本发明的T细胞表现出的细胞毒性低于在可比较的测定法中参比细胞表现出的细胞毒性的100％、95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、5％、2％或1％。
具体来说，本发明的目的是提供一种包含特异性针对病毒的TCR的T细胞，其(i)表现出的抗病毒活性(例如病毒复制的抑制)为包含特异性针对所述病毒的同一TCR的活化T细胞表现出的抗病毒活性的至少10％、20％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％，并且(ii)表现出的针对被所述病毒感染的细胞的细胞毒性低于在可比较的测定法中包含特异性针对所述病毒的同一TCR的活化T细胞表现出的细胞毒性的100％、95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、5％、2％或1％。
工程化改造的T细胞
在各个不同方面，本发明提供了非天然存在的产物。这些产物可以被各不相同地称为重组、人工、非本源或人造产物。具体来说，本发明涉及外源TCR、核酸和T细胞。
当在本文中使用时，“外源”通常意味着不是内源的。在细胞的情形中，外源TCR可以是指例如在将编码所述外源TCR的核酸通过任何方法引入所述细胞之前不被该细胞的核酸编码的TCR。外源核酸是指在例如将所述核酸通过任何方法引入所述细胞之前不存在于该细胞中的核酸。
在对象的情形中，外源TCR可以是指在将所述TCR通过任何方法引入所述对象之前不存在与所述对象中或者不被例如所述对象的基因组的核酸编码的TCR。外源核酸是指例如在将所述核酸通过任何方法引入所述对象之前不存在于该对象中的核酸。外源细胞是指例如在将细胞和/或核酸通过任何方法引入所述对象之前不存在于该对象中的细胞。
与各个不同方面相关联，本发明包括编码TCR的核酸。在某些实施方式中，所述核酸被纯化或与例如其他核酸或天然存在的生物材料分离开。在某些实施方式中，所述核酸包含(a)编码包含可变区和恒定区的TCRα-链的核酸序列。在某些实施方式中，所述核酸包含(b)编码包含可变区和恒定区的TCRβ-链的核酸序列。在某些实施方式中，所述核酸包含(a)编码包含可变区和恒定区的TCRα-链的核酸序列，和(b)编码包含可变区和恒定区的TCRβ-链的核酸序列。
可能希望将TCRα-链和TCRβ-链表达为融合蛋白。这对于例如获得每种链的相近的蛋白表达水平可能是理想的。因此，在某些实施方式中，所述核酸另外包含(c)编码连接物序列的核酸序列。当在本文中使用时，“连接物序列”是指用于连接表达的肽或多肽序列的氨基酸序列。在本发明中，连接物序列用于连接TCRα-链和TCRβ-链。
在某些实施方式中，可能希望分离作为融合蛋白表达的TCRα-链和TCRβ-链。在某些实施方式中，这可以通过提供在所述TCRα-链与TCRβ-链之间切割所述融合蛋白来实现。
因此，在某些实施方式中，所述连接物序列可以是可切割的连接物。也就是说，所述连接物序列可以包含能够被切开的氨基酸序列。例如，所述连接物序列可以包含能够充当能切开肽键的酶的底物的序列——即切割位点。许多这些切割位点为分子生物学领域的技术人员已知并且可以被他们使用。在某些实施方式中，所述可切割的连接物可以包含自切割位点。自切割位点被自动切开而不需用酶处理。自切割位点的实例是来自于小核糖核酸病毒的2A序列“NPGP”，其在“G/P”处被切开。这个自切割序列在本文中被称为“小核糖核酸病毒2A(P2A)”。包含P2A的连接物序列在本文中被称为P2A连接物。
应该认识到，在希望TCRα-链和TCRβ-链作为通过连接物序列相连的单一多肽表达的情况下，必须将编码所述TCRα-链和TCRβ-链和连接物的核酸序列提供在同一阅读框中。
与本发明相关联使用的核酸可以在所述核酸中以特定方向包含序列(a)和(b)以及任选地(c)。也就是说，所述序列可以特定顺序提供。序列(a)和(b)以及任选地(c)的所述特定5'至3'顺序可能影响例如所述核酸/表达产物的转录、转录后加工、翻译、翻译后加工、折叠、缔合、稳定性、降解、转运和/或功能性质。
在根据本发明的核酸的某些实施方式中，序列(a)和(b)以下述5'至3'方向提供：5'-(b)-(a)-3'。在某些实施方式中，序列(a)和(b)以下述5'至3'方向提供：5'-(a)-(b)-3'。在某些实施方式中，序列(a)、(b)和(c)以下述5'至3'方向提供：5'-(b)-(c)-(a)-3'。在某些实施方式中，序列(a)、(b)和(c)以下述5'至3'方向提供：5'-(a)-(c)-(b)-3'。
在某些实施方式中，所述核酸编码用于提高和/或稳定被表达的TCRα-链与TCRβ-链之间的结合的一种或多种结构特点。在某些实施方式中，所述特点可以是特定氨基酸或氨基酸序列。在某些实施方式中，所述核酸可以编码一个或多个非天然的半胱氨酸残基，用于在所述TCRα-链与β-链之间形成一个或多个二硫键。在某些实施方式中，所述核酸可以在所述TCRα-链和/或β-链的恒定区中编码一个或多个非天然的半胱氨酸残基。
本发明的各个方面的实施方式包括使用包含本文中所描述的核酸的载体。
当在本文中使用时，“载体”是作为介质用于将外源核酸转移到细胞内的核酸(DNA或RNA)。所述载体可以是用于在所述细胞中表达所述核酸的表达载体。这些载体可以包括启动子序列，其可操作连接到编码所述待表达序列的核酸。载体也可以包括终止密码子和表达增强子。本领域中已知的任何适合的载体、启动子、增强子和终止密码子都可用于从根据本公开的载体表达多肽。适合的载体包括质粒、二元载体、DNA载体、mRNA载体、病毒载体(例如γ反转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体)、基于转座子的载体和人工染色体(例如酵母人工染色体)，例如在Maus等，Annu Rev Immunol(2014)32:189-225中所述，所述文献整体通过参考并入本文。
在根据本发明的某些实施方式中，所述病毒载体可以是慢病毒、反转录病毒、腺病毒或单纯性疱疹病毒载体。
在本说明书中，术语“可操作连接”可以包括将所选的核酸序列和调控核酸序列(例如启动子和/或增强子)以某种方式共价连接，以便将所述核苷酸序列的表达置于所述调控序列的影响或控制之下(由此形成表达盒)的情形。因此，如果调控序列能够执行所选核酸序列的转录，则所述调控序列被可操作连接到所选核酸序列。在适当情况下，随后可以将所述得到的转录本翻译成所需多肽。
本发明提供了用于生产T细胞的方法。在某些实施方式中，所述方法不在人类或动物身体上实施。在某些实施方式中，所述方法在体外进行。在某些实施方式中，所述方法离体进行。
应该认识到，根据本发明的用于生产T细胞的方法通常用于生产超过一个T细胞。也就是说，所述方法通常用于生产T细胞群体或制备物。
根据本发明的用于生产T细胞的方法可以包括对T细胞进行修饰以表达或包含特异性针对病毒的TCR。在某些实施方式中，修饰可以包括将根据本发明的核酸或载体引入到T细胞中。在某些实施方式中，所述方法另外包括将所述T细胞在适合于所述T细胞表达所述核酸或载体的条件下培养。
在某些实施方式中，引入核酸或载体包括转导，例如反转录病毒转导。因此，在某些实施方式中，将所述分离的核酸或载体包含在病毒载体中，或所述载体是病毒载体。在某些实施方式中，所述方法包括通过电穿孔引入根据本发明的核酸或载体，例如在Koh等，Molecular Therapy-Nucleic Acids(2013)2,e114中所描述，所述文献整体引入作为参考。
在某些实施方式中，修饰可以对非活化T细胞进行。在某些实施方式中，修饰T细胞以表达或包含特异性针对病毒的TCR可能不引起所述待修饰的T细胞的活化。在特定实施方式中，所述方法包括对非活化T细胞进行修饰以表达或包含特异性针对病毒的TCR，其中在修饰后，所述T细胞保留非活化表型和/或不具有活化表型。非活化和活化T细胞表型可以参考特定基因和/或蛋白质的表达或参考所述T细胞的某些活性来定义，如本文中所述。
在某些实施方式中，修饰通过不需要宿主细胞分裂以有效摄取和/或表达所述核酸的方法来进行。在特定实施方式中，T细胞(例如非活化T细胞)的修饰通过mRNA电穿孔来进行。如本文实施例5中所描述，T细胞可以通过mRNA电穿孔，使用编码TCR的核酸来修饰。
有利的是，mRNA电穿孔不需要细胞分裂来有效摄取和/或表达所述核酸，并因此能够将编码本文所描述的TCR的核酸导入到缓慢分裂或不分裂的细胞例如非活化T细胞中。
根据本发明的用于生产T细胞的方法可以包括对T细胞进行修饰以降低细胞毒性因子的表达和/或活性。
在某些实施方式中，所述细胞毒性因子是穿孔蛋白、颗粒酶(例如颗粒酶B或颗粒酶A)、粒溶蛋白或FASL中的一者或多者。在某些实施方式中，所述细胞毒性因子是穿孔蛋白和/或颗粒酶(例如颗粒酶B或颗粒酶A)。在所述T细胞进行用于降低所述细胞毒性因子的表达和/或活性的修饰之后，所述修饰的T细胞可以表现出的所述细胞毒性因子的表达和/或活性水平，可以低于参比细胞、例如尚未进行用于降低所述细胞毒性因子的表达和/或活性的修饰的可比较细胞的表达/活性水平的100％、95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％或5％。
表达可以是蛋白质或基因表达。细胞毒性因子的基因表达可以例如通过测量mRNA水平来确定，例如通过定量实时PCR(qRT-PCR)或通过基于报告物的方法。蛋白质表达可以例如通过western印迹、免疫组织化学、免疫细胞化学、流式细胞术、ELISA等，或通过基于报告物的方法来测量。细胞毒性因子的活性使用例如用于所述细胞毒性因子的活性的体外测定法来分析，例如在Zaritskaya等，Expert Rev Vaccines(2011),9(6):601-616中描述的测定法，所述文献引入本文作为参考。
在某些实施方式中，修饰可以通过用能够降低细胞毒性因子的表达和/或活性的药剂进行处理来进行。在某些实施方式中，所述药剂可以通过影响转录、mRNA加工(例如拼接)、mRNA稳定性、翻译、翻译后加工、蛋白质稳定性、蛋白质降解和/或蛋白质功能/活性，来实现基因或蛋白质表达和/或活性的降低。
在某些实施方式中，所述药剂可以是影响所述细胞毒性因子的mRNA的量的药剂。在某些实施方式中，所述药剂可以通过RNA干扰(RNAi)引起所述细胞毒性因子的表达降低。在某些实施方式中，所述药剂可以是抑制性核酸，例如反义或小干扰RNA，包括但不限于shRNA或siRNA。在某些实施方式中，所述抑制性核酸被提供在载体中。例如，在某些实施方式中，所述药剂可以是编码用于一种或多种细胞毒性因子的shRNA的慢病毒载体。
在某些实施方式中，所述药剂可以是能够改变所述T细胞的基因组，以降低所述T细胞的细胞毒性因子的基因或蛋白质表达和/或活性的药剂。例如，所述药剂可能能够破坏和/或失活编码穿孔蛋白、颗粒酶(例如颗粒酶B或颗粒酶A)、粒溶蛋白或FASL的基因，和/或可能整合编码能够降低穿孔蛋白、颗粒酶(例如颗粒酶B或颗粒酶A)、粒溶蛋白或FASL基因或蛋白质表达和/或活性的分子的序列的编码DNA序列。
在某些实施方式中，所述药剂可以是穿孔蛋白、颗粒酶(例如颗粒酶B或颗粒酶A)、粒溶蛋白或FASL蛋白的抑制剂。例如，所述药剂可以是能够结合到细胞毒性因子并抑制其活性的分子。在某些实施方式中，所述药剂可以是针对穿孔蛋白、颗粒酶(例如颗粒酶B或颗粒酶A)、粒溶蛋白或FASL的抗体。在某些实施方式中，所述药剂可以是穿孔蛋白、颗粒酶(例如颗粒酶B或颗粒酶A)、粒溶蛋白或FASL活性的竞争性抑制剂。
本发明还包括T细胞，其已经被修饰以降低细胞毒性因子的表达和/或活性。在某些实施方式中，T细胞已经用能够细胞毒性因子表达和/或活性的药剂修饰。本发明还提供了含有能够降低细胞毒性因子的表达和/或活性的药剂的T细胞。
在某些实施方式中，根据本发明的各个不同方面的被修饰和/或用药剂处理的T细胞是CD3+T细胞。在某些实施方式中，所述T细胞是CD3+、CD8+T细胞。在某些实施方式中，所述T细胞是CD3+、CD4+T细胞。在某些实施方式中，所述T细胞是非活化T细胞。在某些实施方式中，所述T细胞是活化T细胞。在某些实施方式中，所述T细胞是细胞毒性T细胞。在某些实施方式中，所述T细胞是辅助性T细胞。
根据本发明的方法，可以使用任何适合的T细胞。在某些实施方式中，所述T细胞可以从供体获得。在某些实施方式中，所述供体可能患有病症例如病毒、细菌或真菌感染或癌症或具有发生所述病症的风险。在某些实施方式中，所述供体可以是健康的和/或没有病症的特定风险。
在某些实施方式中，所述T细胞可以包含编码能够呈递所述T细胞的TCR特异性针对的病毒的肽的I类MHC分子的HLA等位基因。在某些实施方式中，所述T细胞对于被所述T细胞的TCR识别的病毒肽来说是HLA匹配的。在某些实施方式中，所述T细胞从对于被所述T细胞的TCR识别的病毒肽来说HLA匹配的供体获得。
所述T细胞可以从来自于所述供体的适合的样品例如来自于淋巴系组织如脾脏或淋巴结的样品或从血液或肿瘤样品分离或以其他方式获得。适合的分离技术在本领域中是公知的，并包括例如荧光活化细胞分拣(FACS：参见例如Rheinherz等，(1979)PNAS764061)、免疫淘选(参见例如Lum等，(1982)Cell Immunol 72 122)和使用抗体包被的磁珠的分离(参见例如Gaudernack等，1986J Immunol Methods 90 179)。方便的是，T细胞亚类可以使用针对细胞表面标志物的抗体来分离；例如抗CD8抗体可用于分离CD8+T细胞，并且CD4+T细胞可以使用抗CD4抗体来分离。例如，可以将所述样品与包被有抗体的磁珠温浴，并使用磁性分离来分离所述珠子。
在某些实施方式中，根据本发明的各个不同方面的被修饰和/或用药剂处理的T细胞，可以包含在来自于供体个体的细胞样品中。所述细胞样品可以是非均质样品，其除了所述T细胞之外还包含其他细胞类型例如B细胞、树突细胞和巨噬细胞。
在某些实施方式中，本文中描述的方法可以包括将T细胞活化。T细胞可以通过任何方便的技术来活化。在某些实施方式中，T细胞可以通过用所述T细胞的TCR的激动剂、例如在APC表面上的I类MHC分子上展示的肽进行处理来活化。在某些实施方式中，T细胞可以用抗CD3和/或IL-2抗体(例如通过在体外培养)来活化。
根据各个不同方面，本发明的方法可以包括离体培养T细胞。本发明的方法可以包括在体外培养T细胞。
T细胞可以在任何适合的系统，包括搅拌釜式发酵罐、气升式发酵罐、滚瓶、培养袋或培养皿和其他生物反应器中培养。这些系统的使用在本领域中是公知的。
适合用于T细胞的体外培养的培养基是可以获得的，特别是完全培养基例如AIM-V、Iscoves培养基和RPMI-1640(Invitrogen-GIBCO)。所述培养基可以增补有其他因子例如血清、血清蛋白和选择性药剂。例如，在某些实施方式中，T细胞在AIM-V+2％人AB血清中培养。在方便情况下，将细胞在适合的培养基中，在含有5％CO2的加湿气氛中，在37℃下培养。
本发明还提供了通过或可以通过根据本发明的用于生产T细胞的方法获得的T细胞。
医学用途和治疗和预防方法
根据本发明的T细胞在治疗和预防方法中发现用途。本发明包括包含根据本发明的T细胞和可药用载体、佐剂、赋形剂或稀释剂的药物组合物。
应该认识到，本发明的治疗和预防方法通常包括超过一个根据本发明的T细胞的给药/使用。也就是说，本发明的治疗和预防方法通常包括根据本发明的T细胞的群体或制备物的给药/应用。
一方面，本发明提供了根据本发明的T细胞或药物组合物在治疗或预防疾病或病症的方法中的应用。
另一方面，本发明提供了根据本发明的T细胞或药物组合物在制造用于治疗或预防疾病或病症的药物中的应用。
另一方面，本发明提供了一种治疗或预防疾病或病症的方法，所述方法包括向对象给药治疗或预防有效量的根据本发明的T细胞或药物组合物。
具体来说，根据本发明的T细胞或药物组合物发现了用于预防或治疗由病毒感染引起或加重的疾病或病毒感染是其风险因子的疾病或病症的用途。
根据本发明的待治疗或预防的疾病或病症在所述T细胞和/或其TCR的特异性的基础上选择。
根据本发明的待治疗或预防的疾病或病症可以选自由病毒感染引起或加重的疾病或病症。在本文中，病毒感染可以是被下述病毒感染：dsDNA病毒(例如腺病毒、疱疹病毒、痘病毒)，ssRNA病毒(例如细小病毒)，dsRNA病毒(例如呼肠孤病毒)，(+)ssRNA病毒(例如小核糖核酸病毒、披膜病毒)，(-)ssRNA病毒(例如正粘病毒、弹状病毒)，ssRNA-RT病毒(例如反转录病毒)，dsDNA-RT病毒(例如嗜肝DNA病毒)，下述病毒科的成员：腺病毒科，疱疹病毒科，乳头瘤病毒科，多瘤病毒科，痘病毒科，嗜肝DNA病毒科，细小病毒科，星状病毒科，杯状病毒科，小RNA病毒科，冠状病毒科，黄病毒科，披膜病毒科，戊型肝炎病毒科，反转录病毒科，正粘病毒科，砂粒病毒科，布尼亚病毒科，丝状病毒科，副粘病毒科，弹状病毒科或呼肠孤病毒科，1型单纯性疱疹病毒，2型单纯性疱疹病毒，痘-带状疱疹病毒，Epstein-barr病毒，人巨细胞病毒，人8型疱疹病毒，人乳头瘤病毒，BK病毒，JC病毒，天花病毒，乙型肝炎病毒(基因型A、B、C、D、E、F、G、H、I或J)，细小病毒B19，人星状病毒，诺瓦克病毒，柯萨基病毒，甲型肝炎病毒，脊髓灰质炎病毒，鼻病毒，重症急性呼吸综合征病毒，丙型肝炎病毒，黄热病病毒，登革热病毒，西尼罗病毒，TBE病毒，风疹病毒，戊型肝炎病毒，人免疫缺陷病毒，流感病毒，拉沙病毒，克里米亚-刚果出血热病毒，汉坦病毒，埃博拉病毒，马尔堡病毒，麻疹病毒，流行性腮腺炎病毒，副流感病毒，呼吸道合胞病毒，狂犬病病毒，丁型肝炎病毒，轮状病毒，环状病毒，科罗拉多壁虱热病毒或版纳病毒，或被这些病毒的感染是其风险因子的疾病或病症。
例如，在根据本发明的T细胞包含特异性针对乙型肝炎病毒的TCR的情况下，根据本发明的T细胞或药物组合物发现了用于预防或治疗由HBV感染引起或加重的疾病或病症或HBV感染是其风险因子的疾病或病症的用途。由HBV感染引起/加重的疾病和病症描述在Liang,Hepatology(2009),49(5Suppl):S13-S21中，并包括急性肝炎(包括爆发性肝功能衰竭)、慢性肝炎、肝硬化、肝癌例如肝细胞癌(HCC)或胰腺癌。HBV感染是其风险因子的疾病或病症包括坏死性血管炎和肾病例如膜性肾小球肾炎(MGN)。
根据本发明的T细胞或药物组合物的给药优选采取“治疗有效的”或“预防有效”量，这足以对所述对象显示出益处。给药的实际量和给药频率和时间过程将取决于所述疾病或病症的本质和严重性。治疗的处方例如关于剂量等的决定，在全科医师和其他医生的责任范围之内，并通常考虑待治疗的疾病/病症、所述个体对象的状况、递送位点、给药方法和从业人员已知的其他因素。上面提到的技术和方案的实例可以在《Remington制药学》(Remington'sPharmaceutical Sciences)第20版，2000，pub.Lippincott,Williams&Wilkins中找到。
在本发明的实施方式中，治疗或预防方法可以包括T细胞的过继转移。T细胞过继转移通常是指一种用于通常通过抽取血液样品从对象获得T细胞的方法，T细胞从所述血液样品分离。然后通常以某种方式对所述T细胞进行处理或改变，并或者转移到同一对象或不同对象。所述处理通常旨在向对象提供具有某些所需特征的T细胞群体，或提高该对象中具有这些特征的T细胞的频率。病毒特异性T细胞的过继转移被描述在例如Cobbold等，(2005)J.Exp.Med.202:379-386和Rooney等，(1998),Blood 92:1549-1555中，所述文献整体引入作为参考。
在本发明中，进行过继转移的目的在于在对象中引入病毒特异性抗病毒T细胞或提高所述病毒特异性抗病毒T细胞的频率，特别是CD8+T细胞和/或CD4+T细胞。
因此，一方面，本发明提供了一种在对象中治疗或预防疾病或病症的方法，所述方法包括：
(a)从对象分离至少一个非活化T细胞；
(b)对所述至少一个非活化T细胞进行修饰，以表达或包含特异性针对病毒的T细胞受体(TCR)；以及
(c)将所述修饰的至少一个非活化T细胞给药到所述对象；
其中所述修饰的至少一个非活化T细胞与包含特异性针对所述病毒的TCR并且未进行用于降低细胞毒性因子的表达或活性的修饰的活化T细胞相比，对被所述病毒感染或包含所述病毒的肽的细胞表现出降低的细胞毒性。
另一方面，本发明提供了一种在对象中治疗或预防疾病或病症的方法，所述方法包括：
(a)从对象分离至少一个T细胞；
(b)对所述至少一个T细胞进行修饰，以表达或包含特异性针对病毒的T细胞受体(TCR)，其中：
(i)所述T细胞进行了用于降低细胞毒性因子的表达或活性的修饰，或
(ii)所述方法还包括对所述至少一个T细胞进行修饰，以降低一种或多种细胞毒性因子的表达或活性，以及
(c)将所述修饰的至少一个T细胞给药到所述对象。
另一方面，本发明提供了一种在对象中治疗或预防疾病或病症的方法，所述方法包括：
(a)从对象分离至少一个T细胞；
(b)对所述至少一个T细胞进行修饰，以降低一种或多种细胞毒性因子的表达或活性；以及
(c)将所述修饰的至少一个T细胞给药到所述对象。
根据本发明，“对象”可以是任何对象。在某些实施方式中，所述T细胞从其分离的对象是用所述修饰的T细胞给药的对象。也就是说，在某些实施方式中，所述T细胞的来源可以是自体的。在某些实施方式中，所述T细胞从其分离的对象可以是与用所述修饰的T细胞给药的对象不同的对象。也就是说，在某些实施方式中，所述T细胞的来源可以是同种异体的。在某些实施方式中，所述T细胞可以是外源的。在某些实施方式中，所述T细胞可以是异种的。
按照本发明修饰的所述至少一个T细胞可以例如按照本文中描述的方法进行修饰，以例如表达或包含特异性针对病毒的TCR和/或降低细胞毒性因子的表达或活性。所述修饰可以包括核酸转移，用于永久或暂时性表达所述转移的核酸。
任何适合的遗传工程平台可用于修饰根据本发明的T细胞。用于修饰T细胞的适合的方法包括使用遗传工程平台例如γ反转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体、DNA转染、基于转座子的基因递送和RNA转染，例如在Maus等，Annu Rev Immunol(2014)32:189-225中所描述的，其引入本文作为参考。
在某些实施方式中，所述方法可以包括一个或多个下述步骤：从对象获取血液样品；从所述血液样品分离至少一个T细胞(例如至少一个非活化T细胞)；在体外或离体细胞培养中培养所述至少一个T细胞；修饰所述至少一个T细胞以表达或包含特异性针对病毒的TCR；修饰所述至少一个T细胞以降低细胞毒性因子的表达或活性；收集所述至少一个T细胞；将所述修饰的T细胞与佐剂、稀释剂或载体混合；将所述修饰的T细胞给药到对象。
在本文中的方法的某些实施方式中，方法可以包括对T细胞进行活化的步骤，例如通过CD3/CD28刺激和/或通过任选地在IL-2存在下与呈递所述T细胞包含的特异性TCR所针对的肽-MHC的APC相接触。
本领域技术人员能够确定用于根据本发明的T细胞的过继转移的适合的试剂和程序，例如参考Qasim等，Journal of Hepatology(2015)62:486-491，其整体引入本文作为参考。
所述至少一个修饰的T细胞通常作为细胞群给药到所述对象。在某些实施方式中，将约1×104、5×104、1×104、5×105、1×106、2×106、5×106、1×107、2×107、3×107、4×107、5×107、6×107、7×107、8×107、9×107、1×108、2×108、3×108、4×108、5×108、6×108、7×108、8×108、9×108、1×109、2×109、3×109、4×109、5×109、6×109、7×109、8×109、9×109、或1×1010个细胞中的一者给药到所述对象。
在某些实施方式中，所述细胞群是修饰的T细胞的群。在某些实施方式中，所述细胞群作为混合的细胞群被给药到所述对象。所述混合的细胞群除了所述修饰的T细胞之外，还可以包含例如自然杀伤(NK)细胞、未修饰的T细胞和/或树突状细胞(DC)。
所述给药到所述对象的细胞群可以包含具有不同比例的CD8+和CD4+T细胞的T细胞群。例如，在某些实施方式中，给药到所述对象的T细胞群可以包含约100％的CD8+T细胞和0％的CD4+T细胞、约95％的CD8+T细胞和5％的CD4+T细胞、约90％的CD8+T细胞和10％的CD4+T细胞、约85％的CD8+T细胞和15％的CD4+T细胞、约80％的CD8+T细胞和20％的CD4+T细胞、约70％的CD8+T细胞和30％的CD4+T细胞、约60％的CD8+T细胞和40％的CD4+T细胞或约50％的CD8+T细胞和50％的CD4+T细胞。
给药通常通过细胞群的输注(例如静脉内输注)来进行。所述细胞群被配制成适合于通过输注给药。
根据本发明的方法可以包括超过一次给药。也就是说，在某些实施方式中，所述方法可以包括向所述对象多次给药至少一个修饰的T细胞。
在根据本发明的实施方式中，所述对象优选为人类对象。在某些实施方式中，所述根据本发明的治疗或预防方法待治疗的对象在HLA基因型的基础上选择。在某些实施方式中，所述对象具有编码I类MHCα-链的HLA等位基因，所述I类MHCα-链能够在I类MHC分子的背景中呈递根据本发明的T细胞的TCR特异性针对的病毒的肽。
在根据本发明的实施方式中，用于治疗由病毒感染引起或加重的疾病或病症或病毒感染是其风险因子的疾病或病症的对象，可以在这些疾病/病症例如病毒感染的某些标志物的表征的基础上进行选择。对象可能已被诊断为患有所述需要治疗的疾病或病症，或者被怀疑患有这种疾病或病症。在根据本发明的实施方式中，用于本文中的预防方法，用于预防由病毒感染引起或加重的疾病或病症或病毒感染是其风险因子的疾病或病症的对象，可以在病毒感染的某些标志物的表征的基础上进行选择。
在根据本发明的各个不同方面的实施方式中，治疗或预防根据本发明的疾病或病症可以包括组合疗法。在这些实施方式中，根据本发明的T细胞或药物组合物可以作为包含其他干预的过程的一部分给药。
在某些实施方式中，所述方法包括用于预防或治疗病毒感染或由病毒感染引起或加重的疾病或病症的干预，例如通过适合药剂的给药。预防性干预可以包括疫苗接种。
适合的治疗药剂可以由专业技术人员根据具体病毒感染的情况容易地鉴定。适合的药剂包括选自下列的一种或多种抗病毒药剂：阿巴卡韦，阿昔洛韦，无环鸟苷，阿德福韦，金刚烷胺，安普那韦，安普利近，阿比朵尔，阿扎那韦，立普妥，巴拉维(balavir)，西多福韦，可比韦，度鲁特韦，地瑞那韦，地拉韦啶，地达诺斯，二十二烷醇，依度尿苷，依法韦仑，恩曲他滨，恩夫韦地，恩替卡韦，ecoliever，泛昔洛韦，福米韦生，膦沙那韦，膦甲酸，膦乙酸，融合抑制剂，更昔洛韦，伊巴他滨，imunovir，碘苷，咪喹莫特，茚地那韦，肌苷，整合酶抑制剂，III型干扰素，II型干扰素，Id型干扰素，干扰素，拉米夫定，洛匹那韦，洛韦胺，马拉韦罗，吗啉胍，美替沙腙，奈非那韦，奈韦拉平，nexavir，硝唑尼特，核苷类似物，novir，奥司他韦(tamiflu)，PEG-干扰素α-2a，喷昔洛韦，帕拉米韦，普可那利，鬼臼毒素，蛋白酶抑制剂，雷特格韦，反转录酶抑制剂，病毒唑，金刚乙胺，利托那韦，嘧啶，沙奎那韦，索非布韦，司他夫定，协同增强剂，特拉匹韦，替诺福韦，替诺福韦酯，tipranavir，曲氟尿苷，三泽维尔，曲金刚胺，特鲁瓦达，伐昔洛韦(valtrex)，缬更昔洛韦，vicriviroc，阿糖腺苷，viramidine，扎西他滨，扎那米韦(relenza)和齐多夫定。
例如，在被乙型肝炎病毒感染的情况下，适合的药剂包括在WHO的患有慢性乙型肝炎感染的人预防、护理和治疗指南(WHO Guidelines for the prevention,careandtreatment of persons with chronic hepatitis B infection,March 2015,ISBN9789241549059)和Alberti和Caporaso，Dig Liver Dis,2011 43Suppl 1:S57-63中所描述的，两者整体引入本文作为参考。具体来说，本发明设想了使用抗病毒药剂例如拉米夫定(epivir)、阿德福韦(hepsera)、替诺福韦(viread)、替比夫定(tyzeka)和恩替卡韦(baraclude)及其组合，以及干扰素α-2a和PEG化的干扰素α-2a。
在某些实施方式中，所述方法包括治疗或预防性干预，用于治疗或预防与病毒感染相关的癌症例如肝癌如肝细胞癌。
患者选择
本发明还提供了用于为根据本发明的治疗性或预防性治疗鉴定对象的方法。
一方面，鉴定治疗性或预防性治疗对象的方法包括确定对象的HLA类型。HLA分型可以通过本领域技术人员公知的各种不同方法来进行，例如通过对所述待分型的一个或多个HLA基因进行测序，并将所述DNA序列与已知HLA等位基因的序列进行比较。在某些实施方式中，被确定为具有编码能够呈递被根据本发明的T细胞的TCR识别的病毒的肽的I类MHC分子的HLA等位基因的对象，被鉴定为是适合于根据本发明的治疗性或预防性治疗的对象。
一方面，鉴定治疗性或预防性治疗对象的方法包括确定所述对象是否被病毒感染或是否处于病毒感染的风险中。病毒感染可以通过本领域技术人员公知的各种不同方法来诊断，并包括在从个体获得的样品中检测病毒核酸和/或蛋白质的方法。在某些实施方式中，被确定为是根据本发明的T细胞包含的特异性TCR所针对的病毒感染的对象，被鉴定为是适合于根据本发明的治疗性或预防性治疗的对象。
组合物
本发明还提供了包含根据本发明的T细胞的组合物。在某些实施方式中，所述组合物是药物组合物。在某些实施方式中，所述组合物是适合用于研究、疗法、预防和/或诊断的组合物。
应该认识到，根据本发明的组合物通常包含超过一个根据本发明的T细胞。也就是说，所述组合物通常包含根据本发明的T细胞群体或制备物。
在某些实施方式中，根据本发明的T细胞优选地与本领域技术人员公知的一种或多种其他可药用成分一起配制成药物或药品，所述其他可药用成分包括但不限于可药用载体、佐剂、赋形剂、稀释剂、填充剂、缓冲剂、防腐剂、抗氧化剂、润滑剂、稳定剂、增溶剂、表面活性剂(例如润湿剂)、掩蔽剂、着色剂、调味剂和甜味剂。当在本文中使用时，术语“可药用的”是指化合物、成分、材料、组合物、剂型等，其在正确的医学判断范围内适用于与所讨论的对象(例如人类)的组织相接触，而没有过度毒性、刺激性、过敏反应或其他问题或并发症，与合理的利益/风险比相称。每种载体、佐剂、赋形剂等，在与配方的其他组分相容的意义上也必须是“可接受的”。适合的载体、佐剂、赋形剂等可以在标准的制药教科书中找到，例如《Remington制药学》(Remington's Pharmaceutical Sciences)第18版，MackPublishing Company,Easton,Pa.,1990；和《药物赋形剂手册》(HandbookofPharmaceutical Excipients)第2版，1994。
所述配方可以通过药物领域中公知的任何方法来制备。这些方法包括使所述活性化合物与构成一种或多种辅助成分的载体缔合在一起的步骤。一般来说，所述配方通过使活性化合物与载体(例如液体载体、细分固体载体等)均匀且密切地缔合在一起，然后如有必要对产物进行塑形来制备。
所述配方可以被制备成用于通过大量途径给药。所述药物和组合物可以被配制成流体或固体(包括粉末)形式。所述给药途径可以是表面、肠胃外、系统、静脉内、动脉内、肌肉内、鞘内、眼内、皮下、口服或透皮。在某些实施方式中，给药可以包括注射。注射用配方可以包含在无菌或等渗介质中的所选药剂。
在本发明的一个方面，提供了一种药剂盒，其包含预定量的根据本发明的T细胞或药物组合物。在某些实施方式中，所述药剂盒可以包括在本文中所描述的方法中使用T细胞或药物组合物的说明书。例如，在某些实施方式中，所述药剂盒可以包括用于将所述T细胞或药物组合物给药到患者以便治疗或预防本文中所描述的疾病或病症的说明书。
另一方面，提供了一种药剂盒，其包含编码TCR的核酸和用于降低细胞毒性因子的表达或活性的药剂。在某些实施方式中，所述药剂盒可以包括在本文中所描述的方法中使用所述核酸和/或药剂的说明书。例如，在某些实施方式中，所述药剂盒可以包括用于将所述核酸引入到T细胞中的说明书，和/或用于用所述药剂处理T细胞以降低细胞毒性因子的表达或活性的说明书。
在某些实施方式中，所述药剂盒可以另外包括用于进行根据本发明的方法的其他材料和/或试剂。例如，在某些实施方式中，所述药剂盒可以另外包括用于将核酸导入到T细胞中和/或用于在体外培养T细胞的材料和/或试剂。
本发明包括所描述的方面和优选特点的组合，除非这种组合明显不容许或明确被避免。
本文中使用的段标题仅仅是出于组织的目的，并且不应被解释为限制所描述的主题内容。
现在将通过实例并参考附图说明本发明的方面和实施方式。其他方面和实施方式对于本领域技术人员来说将是显而易见的。本文中引用的所有文献引入本文作为参考。
在整个本说明书、包括随后的权利要求书中，除非上下文另有要求，否则短语“包含”及其变化形式应该被理解为暗示包含了所陈述的整数或步骤或一组整数或步骤，但是不排除任何其他整数或步骤或一组整数或步骤。
必须指出，当在本说明书和随附的权利要求书中使用时，单数形式包括复数指称物，除非上下文明确陈述不是如此。范围在本文中可以被表述为从“约”一个特定值和/或至“约”另一个特定值。当表述这种范围时，另一个实施方式包括从所述一个特定值和/或至所述另一个特定值。同样地，当通过使用先行词“约”将值表述为近似值时，应该理解所述特定值形成另一个实施方式。
附图描述
现在将参考附图讨论说明本发明的原理的实施方式和实验，在所述附图中：
图1.示出了T细胞上的HBV TCR表达的图。(A)示出了通过五聚体染色所测量的在用编码HBV TCR的mRNA电穿孔的静息和活化T细胞上HBV TCR的表达的散点图。(B)示出了在电穿孔后TCR的表达水平随时间变化的图。MFI＝平均荧光强度。
图2.示出了用HBV TCR mRNA电穿孔的T细胞的表型的图。(A)示出了电穿孔的静息T细胞的CD45RA、CD62L、CD27和CD28表达的散点图，以及示出了静息T细胞亚类中CD8+dextramer+细胞的％的图。(B)示出了电穿孔的活化T细胞的CD45RA、CD62L、CD27和CD28表达的散点图，以及示出了活化T细胞亚类中CD8+dextramer+细胞的％的图。CM＝中央记忆细胞，EM＝效应记忆细胞，TEM＝终端效应记忆细胞。
图3.示出了用HBV TCR mRNA电穿孔的T细胞的细胞毒性因子表达的图。(A)示出了用肽刺激的电穿孔的活化T细胞与未被刺激的电穿孔的活化T细胞相比穿孔蛋白和颗粒酶的表达的柱状图。(B)示出了用肽刺激的电穿孔的静息T细胞与未被刺激的电穿孔的静息T细胞相比穿孔蛋白和颗粒酶的表达的柱状图。(C)示出了淋巴细胞总数中颗粒酶B+CD8细胞的百分率的图，(D)示出了淋巴细胞总数中穿孔蛋白+CD8细胞的百分率的图，以及(E)示出了淋巴细胞总数中IFN-γ+CD8细胞的百分率的图，均对于电穿孔的活化T细胞和电穿孔的静息T细胞而言，在肽特异性刺激5小时或24小时后或在不存在刺激(未被刺激)的情况下。
图4.示出了用HBV TCR mRNA电穿孔的T细胞对表达HBV抗原的细胞的细胞毒性的图和条形图。(A)示出了在不同的效应细胞：靶细胞比例下，电穿孔的静息T细胞对表达HBV抗原的细胞的细胞杀死的％的图。(B)示出了在不同的效应细胞：靶细胞比例下，电穿孔的活化T细胞对表达HBV抗原的细胞的细胞杀死的％的图。(C)电穿孔的活化T细胞、电穿孔的静息T细胞、未电穿孔的活化T细胞和未电穿孔的静息T细胞对表达HBV Env抗原的细胞的细胞杀死％的条形图。
图5.示出了电穿孔的活化T细胞、电穿孔的静息T细胞、未电穿孔的活化T细胞和未电穿孔的静息T细胞的各种不同可溶性因子的表达的图像和条形图I。
图6.示出了在不同的效应细胞：靶细胞比例下，T细胞对HCV复制子感染的肝细胞的抗病毒活性和细胞毒性的图。条示出了通过发光降低的％确定的病毒复制的抑制，线示出了通过天冬氨酸氨基转移酶(AST)水平所确定的细胞裂解。(A)电穿孔的静息T细胞和未电穿孔的静息T细胞。(B)电穿孔的活化T细胞和未电穿孔的活化T细胞。
图7.示出了在1:3的效应细胞：靶细胞比例下，T细胞对HBV病毒感染的肝细胞的抗病毒活性和细胞毒性的图。条示出了通过HBV DNA的qPCR所确定的病毒复制的抑制，线示出了通过天冬氨酸氨基转移酶(AST)水平所确定的细胞裂解。
图8.示出了在静息CD8+T细胞上淋巴毒素B或LIGHT的表达的散点图。(A)在HBVTCR阳性的未被刺激的CD8+T细胞上的表达。(B)在用TCR特异性肽脉冲细胞进行刺激24h和48h后，在HBV TCR阳性的CD8+T细胞上的表达。(C)在通过CD3和CD28活化24h和48h后，在HBVTCR阳性的CD8+T细胞上的表达。(D)在用IFN-γ处理24h后，在HBV TCR阳性的CD8+T细胞上的表达。
实施例
在下面的实施例中，本发明人描述了病毒特异性T细胞的产生和表征。
实施例1：细胞系
表达萤光素酶的HepG2-Env和HepG2-Core细胞系在增补有10％热失活胎牛血清(FBS)、20mM HEPES、0.5mM丙酮酸钠、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素、MeM氨基酸、Glutamax、MeM非必需氨基酸(Invitrogen,Carlsbad,CA)的RPMI 1640中培养，并添加2μg/ml嘌呤霉素(BD Biosciences,San Jose,CA)以维持选择。T2细胞在如上所述增补的RPMI1640中培养。稳定地表达整个HBV基因组并产生感染性病毒的HepG2细胞(HepG2.2.15)在增补有10％热失活FBS、20mM HEPES、0.5mM丙酮酸钠和150μg/ml G418(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)的DMEM中培养。稳定地表达人牛黄胆酸钠共转运多肽(hNTCP)的HepG2细胞在增补有10％热失活FBS、Glutamax、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素的DMEM中培养，并添加5μg/ml嘌呤霉素以维持选择。表达HLA-A2并带有编码萤光素酶的HCV复制子的Huh7细胞在增补有10％热失活FBS、Glutamax、MeM非必需氨基酸、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素、1mg/ml G418的DMEM中培养，并添加3μg/ml灭瘟素S盐酸盐以维持选择。
实施例2：T细胞
从有正式知情同意书的健康供体收集外周血单核细胞(PBMC)。为了生产活化T细胞，将PBMC用600IU/ml白介素-2(rlL-2；R&D Systems)和50ng/ml抗CD3抗体(OKT-3；eBioscience,San Diego,CA)在AIM-V+2％人类AB血清中刺激8天，并在电穿孔前一天将rlL-2提高到1000IU/ml。使用全T细胞分离试剂盒(Miltenyi Biotec,GmbH,Germany)分离非活化(静息)T细胞，并在电穿孔之前将其在100IU/ml rlL-2中培养过夜。
实施例3：流式细胞术
用于细胞表面染色的抗体从BD Biosciences(抗人类CD8-PE-Cy7、CD8-V500、CD45RA-APC、CD62L-PECy7抗体)、eBioscience(抗人类CD45RO-eFluor650抗体)、Immudexand Proimmune(HLA-A201-HBs183-91-PE dextramer或五聚体)和R&D Systems(人类LTβ受体-Fc嵌合体)获得。用于细胞内细胞因子染色的抗体从BD Biosciences(抗人类IFN-γ-APC、TNF-α-Alexa488、IL-2-PE、颗粒酶-APC抗体)和Diaclone(抗人类穿孔蛋白-FITC抗体)获得。细胞内细胞因子染色通过用cytofix/cytoperm(BD Biosciences)固定并通透化细胞来进行。流式细胞术使用FACS Canto流式细胞仪或LSRII(BD Biosciences)来进行，并使用FACSDiva程序(BD Biosciences)分析数据。
实施例4：HBV包膜s183-191 TCR mRNA的产生
所述HBV包膜s183-191 TCR构建物(HBV s183-TCR)源自于pUC57-s183cys b2Aa载体，并被亚克隆到pVAX1载体中。使用One Shot Top10E.coli试剂盒(Invitrogen)在大肠埃希氏杆菌中扩增并纯化质粒，使用QIAGEN Endo Free Plasmid Maxi试剂盒(QIAGEN,Valencia,CA)进行纯化，并使用XbaI限制性酶进行线性化。使用所述线性化的DNA，利用mMESSAGE mMACHINE 17Ultra试剂盒(Ambion,Austin,TX)或T7mScript标准mRNA生产系统(Cellscript,Madison,WI)产生所述TCR mRNA；添加T7RNA聚合酶以开始转录；将RNA用Anti-Reverse Cap Analog(ARCA)封端。然后，通过大肠杆菌Poly(A)聚合酶和ATP添加Poly(A)尾部。将所述得到的产物通过氯化锂沉淀进行浓缩，并重新溶解在缓冲液中。
实施例5：T细胞的mRNA电穿孔
对于使用4D-nucleofector系统(Lonza,Cologne,Germany)的电穿孔来说，将10×106个如上所述的活化T细胞或非活化(静息)T细胞在室温下悬浮在100μl增补过的40-Nucleofector溶液中，并以200μg/ml添加HBV s183-TCR mRNA。将所述混合物置于核酸杯中，并使用用于刺激或未刺激T细胞的程序进行电穿孔。在电穿孔后，将细胞重悬浮在AIM-V10％人类AB血清+100IU/ml rlL-2中，并在37℃和5％CO2下培养直至分析。
实施例6：mRNA电穿孔的T细胞的功能
将HLA-A2+T2细胞以106个细胞/ml的密度用1μ/g/ml的s183-191肽脉冲1h，然后清洗两次。将HBV s183-TCR mRNA电穿孔的活化(活化EP)或非活化(静息EP)T细胞与装载有肽的T2细胞，分别在10μg/ml或2μg/ml布雷菲德菌素A存在下共培养5h或过夜，并对CD8、IFN-γ、颗粒酶和穿孔蛋白进行染色。
实施例7：细胞毒性测定法
将表达萤光素酶的HepG2-Core或HepG2-Env细胞系在96孔大鼠底板中铺板过夜以允许粘附。将靶细胞清洗，并与HBV s183-TCR mRNA电穿孔的活化或非活化(静息)T细胞以各种不同的效应细胞：靶细胞(E:T)比例(效应细胞基于CD8+五聚体+细胞的频率来计算)，在AIM-V+2％人类AB血清中共培养24h，实验进行三份平行样。细胞毒性通过对剩余的靶细胞中的萤光素酶表达进行定量来测量。简单来说，舍弃培养基，向每个孔添加100μl的Steady-Glo试剂(Promega,Madison,WI)并温浴5min，以允许细胞裂解。发光使用微孔板读板器(Tecan,Mannedorf,Switzerland)测量。没有效应细胞的靶细胞被用作最大发光的参比。结果被表示为裂解的％＝100％-(裂解后剩余的发光/最大发光)％，并被计算为三份平行测量的平均值+/-标准偏差。
实施例8：mRNA电穿孔的T细胞与靶细胞的共培养实验
将HBV s183-TCR mRNA电穿孔的活化或非活化(静息)T细胞与HepG2.2.15或HBV感染的HepG2-hNTCP以1:3和1:1的E:T比例(效应细胞基于CD8+五聚体+细胞的频率来计算)共培养24h。将HCV NS3 TCR mRNA电穿孔的非活化(静息)T细胞与Huh7 HCV复制子细胞共培养18h，然后如上所述对发光进行定量。为了评估靶细胞在与T细胞共培养后的裂解，在24h后收集来自于共培养实验的上清液，用于丙氨酸氨基转移酶(ALT)的测量，或者使用CellProliferation试剂盒II(XTT)(Roche Applied Science,Mannheim,Germany)进行存活率分析。为了阻断IFN-γ，添加20μg/ml纯化的抗人类IFN-γ抗体或同种型对照小鼠IgG1(BioLegend)。为了阻断淋巴毒素(LT)α1β2、LTα2β1和LIGHT，使用1μg/ml重组人类LTβ受体-Fc嵌合体(R&D Systems,Minneapolis,USA)。
实施例9：HBV感染
将约80至100倍浓缩的HepAD38细胞的上清液用作HBV接种物。将在24孔板中接种过夜的HepG2-hNTCP细胞使用大约3000/孔的HBV基因组当量的复数接种在含有4％聚乙二醇(Sigma-Aldrich)的培养基中24h。在感染后，将细胞用PBS清洗3次，添加含有DMSO的培养基并每2天更换。通过用流式细胞术测量被感染的细胞上乙肝病毒表面抗原(HBsAg)、乙肝病毒核心抗原(HBcAg)的表达来分析病毒感染，并通过实时PCR来定量HBV DNA。
实施例10：HBV基因组拷贝当量的定量
添加含有β-巯基乙醇的RLT缓冲液或含有50mM Tris、140mM NaCl、1.5mM MgCl、0.5％NP-40的pH 8的裂解缓冲液以裂解细胞，用于使用QIAamp MinElute病毒离心试剂盒(Qiagen,Valencia,CA)分离细胞内的病毒核酸，并通过实时PCR对HBV DNA进行定量。实时PCR使用artus HBV RG PCR试剂盒，按照制造商的说明书，在Rotor-Gene Q 2-plex仪器(Qiagen)中进行。
实施例11：基于三维微型装置的测定法
为了制备200μl含有均匀解离的HepG2靶细胞的2.5mg/ml的I型胶原蛋白凝胶溶液，将20μl 10X PBS与4μl NaOH(0.5M)、129.2μl I型胶原蛋白(大鼠尾，Dow Corning)、20μl 5×106个细胞/ml的新鲜胰蛋白酶处理和解离的HepG2靶细胞和22.9μl的细胞培养用水混合。所述凝胶溶液的最终pH使用pH试纸条确定为大约7。然后将所述含有HepG2靶细胞的胶原蛋白凝胶溶液注入到所述装置的装置专用凝胶区中，并在细胞培养箱(37℃，5％CO2)中聚合40min。在凝胶聚合后，立即将培养基通道用R10培养基填充，以便将所述凝胶水合并保持所述HepG2靶细胞存活。不能透过细胞的核染料DRAQ7(BioLegend,San Diego,CA)也以3μΜ的浓度添加在所述R10培养基中，以分辨活细胞和死细胞。然后将所述装置温浴24hr，以允许所述HepG2靶细胞与所述胶原蛋白基质相互作用。
通过添加含有20μl 10X PBS、4μl NaOH(0.5M)、129.2μl I型胶原蛋白和42.8μl细胞培养用水的胶原蛋白凝胶溶液，类似地制备具有空凝胶区的装置(对照)。在将所述T细胞注入到所述装置中之前，将所述装置中的R10培养基用含有AIM-V 2％人类AB血清+100IU/ml rlL-2的DRAQ7替换。
为了观察工程化改造的T细胞的空间位置，将所述细胞用RPMI 1640中的3μΜCellTracker Violet BMQC(Life Technologies Co.,Carlsbad,CA)在37℃下染色30min。然后用AIM-V 2％人类AB血清清洗T细胞悬液，然后在37℃下继续温浴30min。然后清洗所述染色的T细胞，并将其以3x106个细胞/ml的密度重悬浮在相应的培养基中。然后将30μl所述T细胞悬液添加到在每个装置的中央凝胶区两侧的两个培养基通道之一中。最后，将所述装置在指示的条件下温浴过夜。
活细胞成像(延时)实验使用装备有设定在37℃和5％CO2下的环境室的LSM7800共聚焦显微镜(Zeiss,Germany)或FV1200共聚焦显微镜(Olympus,Japan)进行。所述显微镜被编程，以便以所陈述的时间间隔获取所选区域的Z叠层。对于静态成像实验来说，在添加T细胞之前和温浴过夜之后获取同一目标区域的共聚焦图像。
实施例12：统计分析
统计分析在GraphPad Prism(Graph-Pad Software Inc)中进行。对于涉及超过两个组的比较来说，统计显著性使用Kruksal Wallis检验来确定，并将Dunn's事后检验用于多重比较，取p<0.05作为显著差异的证据。
实施例13：使用TCR mRNA电穿孔在人类非活化T细胞上表达HBV TCR
已知mRNA电穿孔可以将转基因引入到没有任何预先活化的人类原代淋巴细胞中(Zhao等，Mol Ther(2006),13(1):151-159)。这对临床应用来说可能具有显著优势。
本发明人调查了HBV TCR是否可以在未被刺激的非活化(静息)T细胞上表达。
将编码HLA-A2限制的HBV包膜s183-TCR的α和β链的mRNA电穿孔到未被刺激的非活化(静息)T细胞或已用抗CD3抗体和IL-2活化8天的T细胞中。
在电穿孔后24小时，25％的非活化(静息)T细胞和64％的活化T细胞表达所述引入的HBV s183-TCR(图1A)。
也确定了电穿孔后TCR表达的动力学。与活化T细胞相似，在非活化(静息)T细胞上表达的HBV s183-TCR可以在电穿孔后6小时检测到；TCR表达峰值出现在电穿孔后24小时，并在72小时后消失(图1B)。
实施例14：HBV TCR mRNA电穿孔的T细胞的分化表型
人类T细胞过继疗法临床试验的临床前动物模型和回顾性分析显示，低分化的非活化干细胞记忆或中央记忆T细胞亚类的输注，可以提高T细胞过继疗法的治疗效能(Klebanoff等，J Immunother.(2012),35(9):651-660)。
因此，本发明人分析了表达所述引入的HBV s183-TCR的非活化和活化T细胞两者的分化表型。
尽管超过80％的非活化的HBV s183-TCR T细胞具有CD45RA+CD62L+非活化表型，但活化的HBV s183-TCR T细胞包含40％的CD45RA+CD62L+非活化、45％的CD45RA-CD62L+中央记忆和15％的效应记忆表型的混合物(图2A和2B)。超90％的非活化和活化的HBV s183-TCR T细胞两者表达辅助刺激受体CD27和CD28两者(图2A和2B)，可能是因为电穿孔可以刺激细胞的增殖(Qiabius等，New Biotech(2015),32(1):229-235)。
在非活化或活化T细胞内，不表达TCR的细胞与表达TCR的细胞相比在分化表型上没有观察到差异，表明mRNA电穿孔不偏好性转染特定分化状态的细胞(数据未示出)。
实施例15：HBV TCR mRNA电穿孔的T细胞的细胞裂解酶生产的分析
已知细胞裂解酶类(颗粒酶和穿孔蛋白)和细胞因子的表达与T细胞成熟度和分化相关；与高分化的细胞类型相比，非活化(静息)T细胞表达很少或不表达细胞裂解酶类并且表达更少的细胞因子(Chattopadhyay等，J Leukoc Biol(2009)85(1):88-97，其引入本文作为参考)。因此，本发明人分析了在肽特异性刺激5小时和24小时后，非活化和活化的HBVTCR mRNA电穿孔的T细胞中颗粒酶B、穿孔蛋白和IFN-γ的表达。
结果示出在图3中。发现电穿孔的活化T细胞与电穿孔的非活化(静息)T细胞相比，表达更高水平的穿孔蛋白、颗粒酶B和IFN-γ。
实施例16：HBV TCR mRNA电穿孔的T细胞裂解靶细胞的能力分析
调查了电穿孔的活化或非活化(静息)T细胞裂解靶细胞的能力。靶细胞杀死的量使用静态和活细胞成像两者来定量。
结果示出在图4中。归一化到与电穿孔的非活化T细胞相同的抗原特异性频率的电穿孔的活化T细胞的过夜共培养物能够裂解靶细胞。然而，电穿孔的非活化T细胞不裂解靶细胞。
实施例17：HBV TCR mRNA电穿孔的T细胞的细胞因子生产的分析
分析了电穿孔的活化或非活化T细胞的各种不同细胞因子的表达，结果示出在图5中。
与电穿孔的非活化T细胞相比，电穿孔的活化T细胞产生更多的RANTES、IL-13、MIP-1α和MIP-1β。与电穿孔的非活化T细胞相比，未电穿孔的活化T细胞产生更多的RANTES、IL-13、MIP-1α和MIP-1β。
实施例18：HBV TCR mRNA电穿孔的T细胞的抗病毒活性的分析
使用HCV复制子系统来分析电穿孔的T细胞是否表现出抗病毒活性而不引起靶细胞的裂解。
将表达HLA-A2的Huh7细胞用编码HCV JFH-1株系和萤光素酶的构建物转染，所述构建物描述在Jo等，Gastroenterology(2009)136(4):1391-1401中。萤光素酶活性与HCVRNA复制相关联，因此可以通过测量发光来分析病毒复制。
将所述细胞用1μg/ml HBV env 183肽脉冲过夜，然后与HBV env TCR电穿孔的活化或非活化T细胞共培养24h。将肽脉冲的HCV复制子细胞与T细胞以各种不同的效应细胞：靶细胞(E:T)比例共培养，并通过计算发光降低的百分率来确定抗病毒活性。收集所述共培养物的上清液，并分析作为靶细胞裂解的标志物的天冬氨酸氨基转移酶(AST)。
所述实验的结果示出在图6A和6B中。电穿孔的非活化T细胞和电穿孔的活化T细胞两者显示出具有高的抗病毒活性，即使在高的E:T比例下。例如，即使在1:500的E:T下，也观察到～80％的发光降低。
重要的是，电穿孔的非活化T细胞显示出具有这种抗病毒活性而没有大量的靶细胞裂解，正如与使用电穿孔的活化T细胞的共培养物相比，在共培养物上清液中检测到较低水平的AST所说明的。
使用1:3的E:T比例的电穿孔的非活化T细胞(作为混合群体或基于表面标志物表达的基础上分拣的亚类)和产生HBV的HepG2细胞，将共培养实验进一步进行24h。通过实时PCR定量细胞内的HBV DNA，并测量共培养物上清液中的AST水平。
结果示出在图7中。电穿孔的活化和电穿孔的非活化(静息)T细胞两者都能够抑制HBV病毒载量。然而，正如较高的AST水平所示，电穿孔的活化T细胞裂解所述靶细胞，而电穿孔的非活化T细胞不裂解所述靶细胞。
实施例19：HBV TCR mRNA电穿孔的T细胞的抗病毒活性机制的研究
最近的研究表明，肝细胞上淋巴毒素-β受体(LTβR)的活化可以引起HBV核共价闭合环状DNA(cccDNA)的降解而没有肝毒性(Lucifora等，Science(2014)343(6176):1221-1228；Haybaeck等，Cancer Cell(2009)16(4):295-308)。
LTβR的配体是LTβ和LIGHT，并且它们在所述电穿孔的非活化(静息)T细胞上表达。

Claims (18)

1.一种分离的T细胞，其包含编码特异性针对病毒的T细胞受体(TCR)的外源核酸，其中所述T细胞是非活化T细胞。
2.根据权利要求1的T细胞，其中所述非活化T细胞在所述TCR特异性针对的病毒多肽的刺激下，不表现出穿孔蛋白和/或颗粒酶表达的提高。
3.根据权利要求1或权利要求2的T细胞，其能够抑制被病毒感染的细胞中的病毒复制。
4.根据权利要求1至3任一项的T细胞，其能够将被病毒感染的细胞中的病毒复制抑制到被包含特异性针对病毒的TCR的活化T细胞对病毒复制的抑制的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％或100％，所述活化T细胞未进行用于降低细胞毒性因子的表达或活性的修饰。
5.根据权利要求1至4任一项的T细胞，其与包含特异性针对所述病毒的TCR的活化T细胞相比，对被病毒感染或包含所述病毒的肽的细胞表现出降低的细胞毒性，所述活化T细胞未进行用于降低细胞毒性因子的表达或活性的修饰。
6.根据权利要求1至5任一项的T细胞，所述病毒选自：腺病毒，1型单纯性疱疹病毒，2型单纯性疱疹病毒，痘-带状疱疹病毒，爱泼斯坦-巴尔病毒，人巨细胞病毒，人8型疱疹病毒，人乳头瘤病毒，BK病毒，JC病毒，天花病毒，乙型肝炎病毒，细小病毒B19，人星状病毒，诺瓦克病毒，柯萨基病毒，甲型肝炎病毒，脊髓灰质炎病毒，鼻病毒，重症急性呼吸综合征病毒，丙型肝炎病毒，黄热病病毒，登革热病毒，西尼罗病毒，TBE病毒，风疹病毒，戊型肝炎病毒，人免疫缺陷病毒，流感病毒，拉沙病毒，克里米亚-刚果出血热病毒，汉坦病毒，埃博拉病毒，马尔堡病毒，麻疹病毒，流行性腮腺炎病毒，副流感病毒，呼吸道合胞病毒，狂犬病病毒，丁型肝炎病毒，轮状病毒，环状病毒，科罗拉多壁虱热病毒和版纳病毒。
7.一种用于生产特异性针对病毒的修饰的T细胞的体外方法，所述方法包括对T细胞进行修饰以表达或包含特异性针对病毒的T细胞受体(TCR)，其中所述修饰的T细胞是非活化T细胞。
8.根据权利要求7的方法，其中对所述T细胞进行修饰以表达或包含特异性针对病毒的TCR，包括将编码特异性针对病毒的TCR的核酸导入到所述T细胞中。
9.根据权利要求8的方法，其中所述核酸通过转导、转染或基于转座子的系统导入到所述T细胞中。
10.根据权利要求7-9任一项的方法，所述病毒选自：腺病毒，1型单纯性疱疹病毒，2型单纯性疱疹病毒，痘-带状疱疹病毒，爱泼斯坦-巴尔病毒，人巨细胞病毒，人8型疱疹病毒，人乳头瘤病毒，BK病毒，JC病毒，天花病毒，乙型肝炎病毒，细小病毒B19，人星状病毒，诺瓦克病毒，柯萨基病毒，甲型肝炎病毒，脊髓灰质炎病毒，鼻病毒，重症急性呼吸综合征病毒，丙型肝炎病毒，黄热病病毒，登革热病毒，西尼罗病毒，TBE病毒，风疹病毒，戊型肝炎病毒，人免疫缺陷病毒，流感病毒，拉沙病毒，克里米亚-刚果出血热病毒，汉坦病毒，埃博拉病毒，马尔堡病毒，麻疹病毒，流行性腮腺炎病毒，副流感病毒，呼吸道合胞病毒，狂犬病病毒，丁型肝炎病毒，轮状病毒，环状病毒，科罗拉多壁虱热病毒和版纳病毒。
11.一种分离的T细胞，其中所述T细胞通过或能通过根据权利要求7至10任一项的方法获得。
12.一种药物组合物，其包含根据权利要求1至6或权利要求11任一项的T细胞和可药用载体、佐剂、赋形剂或稀释剂。
13.根据权利要求1至6或权利要求11任一项的T细胞或根据权利要求12的药物组合物在制备用于治疗或预防疾病或病症的方法的药物中的应用。
14.一种对T细胞进行修饰的方法，所述方法包括：
(a)从对象分离至少一个T细胞；以及
(b)对所述至少一个T细胞进行修饰，以表达或包含特异性针对病毒的T细胞受体(TCR)。
15.根据权利要求14的方法，其中对所述至少一个T细胞进行修饰以表达或包含特异性针对病毒的TCR，包括将编码特异性针对病毒的TCR的核酸导入到所述至少一个T细胞中。
16.根据权利要求15的方法，其中通过转导、转染或基于转座子的系统将核酸导入到所述至少一个T细胞中。
17.根据权利要求14-16任一项的方法，所述病毒选自：腺病毒，1型单纯性疱疹病毒，2型单纯性疱疹病毒，痘-带状疱疹病毒，爱泼斯坦-巴尔病毒，人巨细胞病毒，人8型疱疹病毒，人乳头瘤病毒，BK病毒，JC病毒，天花病毒，乙型肝炎病毒，细小病毒B19，人星状病毒，诺瓦克病毒，柯萨基病毒，甲型肝炎病毒，脊髓灰质炎病毒，鼻病毒，重症急性呼吸综合征病毒，丙型肝炎病毒，黄热病病毒，登革热病毒，西尼罗病毒，TBE病毒，风疹病毒，戊型肝炎病毒，人免疫缺陷病毒，流感病毒，拉沙病毒，克里米亚-刚果出血热病毒，汉坦病毒，埃博拉病毒，马尔堡病毒，麻疹病毒，流行性腮腺炎病毒，副流感病毒，呼吸道合胞病毒，狂犬病病毒，丁型肝炎病毒，轮状病毒，环状病毒，科罗拉多壁虱热病毒和版纳病毒。
18.一种药剂盒，其包含预定量的根据权利要求1至6或权利要求11任一项的T细胞，或根据权利要求12的药物组合物。
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