KR20190045321A

KR20190045321A - 관류 생물 반응기 백 조립체

Info

Publication number: KR20190045321A
Application number: KR1020197009911A
Authority: KR
Inventors: 파스칼 뷰체스네; 크리스 던칸 발버그
Original assignee: 주노 쎄러퓨티크스 인코퍼레이티드
Priority date: 2016-09-12
Filing date: 2017-09-12
Publication date: 2019-05-02
Also published as: MX2019002765A; EP3510136A1; CN109890952A; RU2019110824A; CA3035829A1; MA46194A; US20190211292A1; AU2017322752A1; RU2021123536A; JP2019526269A; NZ752132A; BR112019004662A2; RU2019110824A3; RU2755725C2; WO2018049420A1

Abstract

본 발명은 생물 반응기 백이 세포 배양에 사용될 수 있기 때문에 오염의 위험을 감소시키기 전에 생물 반응기 백에 가해지는 추가적인 연결 수단(connections)/개조 수단(adaptions)의 양을 최소화 할 수 있는 생물 반응기 백 조립체에 관한 것이다. 본 발명에 개시된 생물 반응기 백 조립체는 사전 조립된 폐기물 백 연결부 및 미리 조립된 배관(tubing) 장치를 포함하여 세포 배지(cell media) 및/또는 세포원(cell source)이 사전 조립된 배관 장치에 즉시 결합될 수 있다.

Description

관류 생물 반응기 백 조립체

본 출원은 2016년 11월 12일자로 출원된 미국 특허출원 제62/393,583호에 기초한 우선권 주장 출원이며, 상기 출원 내용 전체는 본 출원에 참조 병합된다.

본 발명은 관류 생물 반응기 백 조립체를 포함하는 생물 반응기 백 조립체에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 특정 측부(side)에서 사용 전에 조작자에 의해 만들어 지도록 요구되는 연결부의 양 및 생물 반응기 백의 오염 위험을 최소화하는 즉시 사용 가능한 생물 반응기 백 조립체에 관한 것이다.

세포 배양 제조 공정에서 전통적인 스테인레스 스틸 시스템 및 배관은 일회용 생물 반응기 백으로 대체되어 많은 경우에 생물 반응기 로커(bioreactor rocker)에 의해 흔들다. 그러나, 다양한 유형의 생물 반응기 로커가 이용될 수 있으며 각 생물 반응기 로커 시스템에는 선택적으로 여러 연결부가 있는 다양한 구성 요소를 포함할 수 있다. 이러한 구성 요소는 예를 들면, 선택적으로 뚜껑이 있는 로킹 플랫폼, 세포 백(cell bag), 투입용기, 펌프 모듈, 가스 모듈 및 폐기 용기/백과 같은 세포 용기를 포함하는 하나 이상의 다양한 용기를 포함할 수 있다. 또한, 이러한 구성 요소는 하나 이상의 그러한 구성 요소를 서로 연결 및/또는 유체 공급 연결부 뿐만 아니라 전원 코드 및 데이터 케이블과 연결하는 다수의 유체 라인을 포함할 수 있다. 다양한 생물 반응기 로커는 서로 다르므로 생물 반응기 로커는 종종 각 로커 시스템에 상이하면서 고유한 특정 생물 반응기 백을 사용한다.

관류 생물 반응기 백 조립체와 같은 생물 반응기 백 조립체가 제공되며, 이는 다양한 생물 반응기 장치에 사용될 수 있다.

본 발명은 특정 측부(side)에서 사용 전에 조작자에 의해 만들어 지도록 요구되는 연결부의 양 및 생물 반응기 백의 오염 위험을 최소화하는 즉시 사용 가능한 생물 반응기 백 조립체에 관한 것이다.

본 발명의 일부 양태에서, 세포 배지(cell media) 및/또는 세포원(cell source)이 사전 조립된 배관(tubing, 튜브) 장치에 즉시 결합될 수 있도록 미리 조립된 폐기물 백 연결부 및 사전 조립된 배관 장치를 구비한 즉시 사용 가능한 생물 반응기 백 조립체를 제공한다. 일부 구현예로서, 생물 반응기 백 조립체는 생물 반응기 백이 세포 배양에 사용하기 전에 생물 반응기 백에 가해지는 추가적인 연결 수단(connections)/개조 수단(adaptions)의 양을 최소화할 수 있다. 일부 실시예에서, 생물 반응기 백 조립체는 작동에 필요한 구성 요소의 양을 최소화할 수 있고, 따라서 생물 반응기 조립체의 인테그러티(integrity) 위험을 최소화할 수 있다. 이와 같이, 일 측부에서 상기 생물 반응기 백 조립체는 오염 및/또는 제품 손실의 위험을 감소시킬 수 있다. 또한, 연결 수단, 개조 수단 및/또는 구성 요소를 최소화함으로써, 생물 반응기 백이 다양한 생물 반응기 로커와 호환되도록 할 수 있다.

일실시예로 생물 반응기 백 및 폐기물 백을 포함하는 생물 반응기 조립체를 포함한다. 일 실시예로서, 생물 반응기 백은 복수의 포트를 갖는 하부 표면(bottom surface) 및 상부 표면(top surface)을 포함하며, 사익 복수의 포트는 공급 포트(feeding port), 샘플링 포트(sampling port) 및 관류 포트(perfusion port)를 포함할 수 있다. 일실시예로서, 상기 생물 반응기 백은 관류 포트와 유체적으로 연결된 관류 필터(perfusion filter)를 포함할 수 있다. 일실시예로서, 상기 폐기물 백은 생물 반응기 백의 관류 포트와 유체적으로 연결되어 있을 수 있다. 일실시예로서, 상기 생물 반응기 백의 상부 표면은 제1단부(first end) 및 제1단부에 대향하는 제2단부(second end)를 가지며, 관류 포트는 제1단부 보다 제2단부에 더 가까울 수 있다. 일실시예로서, 공급 포트 및 샘플링 포트는 제2단부 보다 제1단부에 더 가까울 수 있다. 일실시예로서, 생물 반응기 백의 상부 표면은 제1측부(first side) 및 제1측부에 대향하는 제2측부(second side)를 가질 수 있고, 공급 포트는 제2측부 보다 제1측부에 더 가까울 수 있다. 일실시예로서, 샘플링 포트는 제1측부 보다 제2측부에 더 가까울 수 있다. 일실시예로서, 관류 포트는 제1측부 보다 제2측부에 더 가까울 수 있다. 일실시예로서, 관류 필터는 생물 반응기 백 내부에 있을 수 있다. 일실시예로서, 생물 반응기 백 조립체는 공급 포트에 유체적으로 연결된 공급 배관 장치를 포함할 수 있다. 일실시예로서, 상기 공급 배관 장치는 폴리비닐클로라이드(PVC) 배관을 포함한다. 일실시예로서, 상기 공급 배관 장치(feed tubing arrangement)는 2개의 유입구를 가지는 공급 배관 장치인 Y-커넥터(connector)를 포함할 수 있다. 일실시예로서, 생물 반응기 백 조립체는 샘플링 포트와 유체학적으로 연결된 샘플링 배관 장치를 포함할 수 있다. 일실시예로서, 샘플링 배관 장치(sampling tubing arrangement)는 PVC 배관을 포함할 수 있다. 일실시예로서, 폐기물 백은 폐기물 배관 장치(waste tubing arrangement)를 통하여 관류 포트와 유체학적으로 연결되어 있을 수 있다. 일실시예로서, 폐기물 배관 장치는 PVC 배관을 포함한다. 일실시예로서, 상기 복수의 포트는 가스 유입 포트 및 가스 배출 포트를 포함할 수 있다. 일실시예로서, 생물 반응기 백의 상부 표면은 제1단부 및 제2단부 사이의 중간에 있는 중간부를 가질 수 있고, 가스 유입 포트 및 가스 배출 포트는 제1단부 또는 제2단부 보다 중간부에 가까이 있을 수 있다. 일실시예로서, 상기 복수의 포트는 공급 포트, 샘플링 포트, 관류 포트, 가스 유입 포트 및 가스 배출 포트만을 포함한다. 일실시예로서, 생물 반응기 백 조립체는 가스 유입 포트와 유체학적으로 연결된 가스 유입 배관 장치 및 가스 배출 포트와 유체학적으로 연결된 가스 배출 배관 장치를 포함할 수 있다.

일부 실시예는 생물 반응기 로커(bioreactor rocker), 생물 반응기 로커 상에 지지된 생물 반응기 백, 및 생물 반응기 백에 유체적으로 연결된 폐기물 백을 포함하는 생물 반응기 시스템을 포함한다.

일실시예로서, 상기 생물 반응기 백은 하부 표면(bottom surface) 및 다수의 포트를 포함하는 상부 표면을 포함하며, 상기 복수의 포트는 공급 포트, 샘플링 포트 및 관류 포트를 포함한다. 일실시예로서, 관류 필터는 상기 관류 포트에 유체학적으로 연결되어 있을 수 있다. 일실시예로서, 폐기물 백은 생물 반응기 백의 상기 관류 포트에 유체학적으로 연결되어 있을 수 있다. 일실시예로서, 생물 반응기 시스템은 공급 포트에 유체화적으로 연결된 공급 배관 장치를 포함할 수 있다. 일실시예로서, 상기 공급 배관 장치는 제1유입구 및 제2유입구를 가지는 공급 배관 장치인 Y-커넥터를 포함할 수 있다. 일실시예로서, 세포 배지 공급원(cell media source)은 공급 배관 장치의 각 유입구에 유체학적으로 연결될 수 있다. 일실시예로서, 각 유입구는 PVC를 포함하고, 상기 세포 배지 공급원은 유입구의 PVC에 결합되어 있을 수 있다. 일실시예로서, 세포원(cell source)은 제1유입구에 유체학적으로 연결되어 있고, 세포 배지 공급원은 제2 유입구에 유체학적으로 연결되어 있을 수 있다. 일실시예로서, 상기 유입구 각각은 PVC를 포함하고, 세포원은 제1유입구의 PVC에 결합되어 있을 수 있으며, 세포 배지 공급원은 제2유입구의 PVC에 결합되어 있을 수 있다. 일실시예로서, 관류 필터는 생물 반응기 백 내부에 있을 수 있다. 일실시예로서, 생물 반응기 백의 상기 상부 표면은 제1단부 및 제1단부에 대향하는 제2단부를 가지며, 관류 포트는 제1단부 보다 제2단부에 가까울 수 있다. 일실시예로서, 관류 포트 및 샘플링 포트는 제1단부 보다 제2단부에 가까운 데에 있을 수 있다. 일실시예로서, 공급 포트 및 샘플링 포트는 제2단부 보다 제1단부에 가까운 데에 있을 수 있다. 일실시예로서, 생물 반응기 백의 상부 표면은 제1측부 및 제1측부에 대향하는 제2측부를 가질 수 있고, 공급 포트는 제2측부 보다 제1측부에 더 가까울 수 있다. 일실시예로서, 샘플링 포트는 제1측부 보다 제2측부에 더 가까울 수 있고, 관류 포트는 제1측부 보다 제2측부에 더 가까울 수 있다. 일실시예로서, 생물 반응기 시스템은 샘플링 포트와 유체학적으로 연결된 샘플링 배관 장치를 포함할 수 있다. 일실시예로서, 샘플링 배관 장치(sampling tubing arrangement)는 PVC 배관을 포함할 수 있다. 일실시예로서, 폐기물 백은 폐기물 배관 장치(waste tubing arrangement)를 통하여 관류 포트와 유체학적으로 연결되어 있을 수 있다. 일실시예로서, 폐기물 배관 장치는 PVC 배관을 포함한다. 일실시예로서, 상기 복수의 포트는 가스 유입 포트 및 가스 배출 포트를 포함할 수 있다. 일실시예로서, 생물 반응기 백의 상부 표면은 제1단부 및 제2단부 사이의 중간에 있는 중간부를 가질 수 있고, 가스 유입 포트 및 가스 배출 포트는 제1단부 또는 제2단부 보다 중간부에 가까이 있을 수 있다. 일실시예로서, 상기 복수의 포트는 공급 포트, 샘플링 포트, 관류 포트, 가스 유입 포트 및 가스 배출 포트만을 포함한다. 일실시예로서, 생물 반응기 시스템은 가스 유입 포트와 유체학적으로 연결된 가스 유입 배관 장치 및 가스 배출 포트와 유체학적으로 연결된 가스 배출 배관 장치를 포함할 수 있다.

일부 실시예는 생물 반응기 로커 상에 생물 반응기 시스템의 생물 반응기 백을 배치하는 단계, 상기 생물 반응기의 공급 포트를 통해 생물 반응기 백에 세포 배지를 공급하는 단계, 상기 공급 포트를 통해 생불 반응기 백에 세포를 공급하는 단계, 생물 반응기 로커로부터 제공되는 교반을 이용하여 생물 반응기 백에서 세포를 배양하는 단계, 생물 반응기 백의 관류 포트를 통해 폐여과물(waste filtrate)을 폐기물 백으로 이송하는 단계, 배양된 세포를 수득하는 단계를 포함하는 생물 반응기 시스템의 사용방법에 관한 것이다. 일실시예로서, 생물 반응기 시스템은 상기 생물 반응기 백을 포함하며, 생물 반응기 백은 하부 표면 및 다수의 포트를 포함하는 상부 표면을 포함하며, 상기 복수의 포트는 공급 포트, 샘플링 포트 및 관류 포트를 포함한다. 일실시예로서, 생물 반응기 백 조립체는 상기 관류 포트에 유체학적으로 연결된 관류 필터를 포함한다. 일실시예로서, 생물 반응기 백 조립체는 생물 반응기 백의 상기 관류 포트에 유체학적으로 연결된 폐기물 백을 포함한다. 일실시예로서, 생물 반응기 시스템은 공급 포트에 유체화적으로 연결된 공급 배관 장치를 포함하며, 상기 공급 배관 장치는 제1유입구 및 제2유입구를 가지는 공급 배관 장치인 Y-커넥터를 포함할 수 있다. 일실시예로서, 세포 배지(cell media)는 제1유입구 세포 배지 공급원을 제1유입구에 결합되어 첨가된다. 일실시예로서, 세포는 제1유입구에 세포원을 결합되어 첨가된다. 일실시예로서, 세포 배지는 세포 배지 공급원을 제1유입구에 결합시켜서 첨가하고, 상기 세포는 세포 공급원을 제2유입구에 결합시켜서 첨가한다. 일실시예로서, 상기 복수 개의 포트는 가스 유입 포트 및 가스 배출 포트를 포함한다. 일실시예로서, 본 발명의 사용방법은 세포를 배양하기 위한 가스를 상기 가스 유입구를 통해 상기 생물 반응기 백에 공급하는 단계를 포함한다. 일실시예로서, 본 발명의 사용방법은 가스 배출 포트를 통해서 배기시켜서 생물 반응기 백으로부터 가스 일부를 제거하는 단계를 포함한다. 일실시예로서, 배양된 세포는 수득 백(harvest bag)을 제1유입구 또는 제2유입구에 결합하고, 공급 배관 장치의 유동 방향을 역전시켜서 수득된다. 일실시예로서, 본 발명의 사용방법은 가스 유입 포트를 통하여 가스로 생물 반응기 백을 적어도 부분적으로 팽창시키는 단계를 포함한다. 일실시예로서, 본 발명의 사용방법은 샘플링 포트를 통해 배양된 세포의 샘플을 회수하는 단계를 포함한다.

다음의 상세한 설명으로부터 본 발명이 당업자에게 쉽게 명백해질 것이다. 본 명세서의 실시예 및 설명은 본 발명의 이해를 돕기 위해 예시적인 것이며 본 발명을 제한적으로 해석해서는 안 된다.

본 발명은 세포 배양을 위한 생물 반응기 백 조립체 사용 전에 조작자에 의해 발생할 수 있는 생물 반응기 백의 오염 위험을 최소화 할 수 있고, 또한, 생물 반응기 백에서 일반적으로 요구되는 연결 수단의 양을 최소화할 수 있는 생물 반응기 백 조립체를 제공할 수 있다. 및 생물 반응기 백의 오염 위험을 최소화하는 즉시 사용 가능한 생물 반응기 백 조립체를 제공할 수 있다.

예시적인 실시예가 첨부된 도면을 참조하여 설명될 수 있다.
도 1은 본 명세서에 개시된 생물 반응기 백의 평면도에 대한 개략도를 도시한 것이다.
도 2a는 본 명세서에 개시된 생물 반응기 백 조립체용 공급 배관 장치의 제1예를 도시한 것이다.
도 2b는 본 명세서에 개시된 생물 반응기 백 조립체용 공급 배관 장치의 제2예를 도시한 것이다.
도 3a는 본 명세서에 개시된 생물 반응기 백 조립체용 샘플링 배관 장치의 제1예를 도시한 것이다.
도 3b는 본 명세서에 개시된 생물 반응기 백 조립체용 샘플링 배관 장치의 제2예를 도시한 것이다.
도 4a는 본 명세서에 개시된 생물 반응기 백 조립체용 폐기물 배관 장치의 제1예를 도시한 것이다.
도 4b는 본 명세서에 개시된 생물 반응기 백 조립체용 폐기물 배관 장치의 제2예를 도시한 것이다.
도 5는 본 명세서에 개시된 생물 반응기 백 조립체용 가스 배출 배관 장치의 일례를 도시한 것이다.
도 6은 본 명세서에 개시된 생물 반응기 백 조립체용 가스 유입 배관 장치의 일례를 도시한 것이다.
도 7은 본 명세서에 개시된 생물 반응기 백 조립체의 샘플링 장치의 일례를 도시한 것이다.
상기 도면에서 달리 언급되지 않는 한, 동일한 참조 번호들은 동일한 구성 요소들에 대응한다.

Ⅰ. 생물 반응기 백(bag)

일부 실시예에서, 예시적인 생물 반응기 백은 다른 구성 요소들 중에서 다양한 포트(ports), 딥 튜브(dip tubes), 플랩(flaps) 및 펌프 배관(pump tubing)을 포함한다. 일부 실시예에서, 이들 구성 요소는 밀봉된 패키지로 전달되지 않으며, 필요한 모든 구성 요소가 미리 부착(결합)되어 있다. 예를 들어, 일부 실시예에서, 폐기물 백 및/또는 공급 포트는 생물 반응기 백에 부착되어 전달되지 않을 수 있으며 사용 장소에서 작업자에 의해 부착될 필요가 있다. 일부 실시예에서, 생물 반응기 백이 세포 배양에 사용되기 전에 연결 수단(connections) 및/또는 개조 수단(adaptations)이 생물 반응기 백에 적용되어야 한다. 예를 들어, 관류 포트는 폐기물 백에 연결될 수 있으며, 사용자는 실험을 진행하기 전에 세포원 및/또는 배지 공급원을 생물 반응기 백에 연결하는 방법을 결정할 필요가 있을 수 있다. 일부 실시예들에서, 이들 구성 요소들, 연결 수단 및/또는 개조 수단 각각은 생물 반응기 백 및 관련 구성 요소들에 대한 오염지일 수 있다. 따라서, 무균 세포 인큐베이션(incubation) 환경을 보장하기 위해, 사용자는 실험 실행 전에 완료된 조립체를 멸균하거나, 오염으로 인한 제품의 잠재적 손실을 초래할 수 있다.

본원에 기술된 생물 반응기 백 조립체는, 예를 들어, 미리 조립된 폐기물 백 연결 수단(또는 연결부) 및 사전 조립된 PVC 배관이 있는 즉시 사용할 수 있는 멸균된 조립체를 제공함으로써, 세포 배지 및/또는 세포원을 즉시 PVC 배관에 결합시킬 수 있어서, 상기 위험 중 하나 이상을 감소시킬 수 있다. 이하에서 상세히 설명하는 바와 같이, 생물 반응기 백 조립체는 작동에 필요한 구성 요소의 양을 최소화할 수 있고, 따라서 생물 반응기 시스템의 다양한 잠재적 고장(failure) 지점을 최소화하고 생물 반응기 백의 인테그러티(integrity)에 대한 위험을 최소화할 수 있다. 또한, 연결 수단, 개조 수단 및/또는 구성 요소를 최소화함으로써, 생물 반응기 백이 다양한 생물 반응기 로커와 호환되도록 할 수 있다.

본원에 기술된 생물 반응기 백 조립체는 인간, 동물, 곤충 및 식물 세포의 배양과 같은 세포 배양에 사용될 수 있다. 일부 실시예에서, 본원에 기재된 생물 반응기 백 조립체는 생물 반응기 시스템에서의 관류 작동(perfusion operations)에 사용된다. 일부 실시예에서, 본원에 개시된 생물 반응기 백 조립체는 임상 세포 치료 및 T 세포 적용에 사용될 수 있다. 도 1은 생물 반응기 백(100)의 평면도의 예를 도시한 것이다. 생물 반응기 백 (100)은 상부 표면(101, 또는 상부면, top surface)을 가질 수 있다. 상기 상부 표면은 복수의 포트를 포함 할 수 있다. 일부 실시예에서, 복수의 포트 중 적어도 하나는 생물 반응기 백의 상부 표면에 대향하는 하부 표면(또는 하부면, bottom surface)에 위치될 수 있다. 복수의 포트는 공급 포트, 샘플링 포트, 관류 포트, 가스 유입 포트, DO 프로브(probe) 포트, pH 프로브 포트 및 / 또는 가스 배출 포트를 포함할 수 있다. 일부 실시 예에서, 복수의 포트는 DO 프로브 포트 및/또는 pH 프로브 포트를 포함하지 않는다. 일부 실시예에서, 상기 상부 표면의 포트는 공급 포트, 샘플링 포트, 관류 포트, 가스 유입 포트 및 가스 배출 포트만을 포함한다. 생물 반응기 백(100)의 상부 표면(101)은 공급 포트(102)를 포함한다. 공급 포트는 다양한 공급 성분을 생물 반응기 백에 첨가하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 공급 포트는 세포원으로부터 생물 반응기 백에 세포를 첨가 및/또는 세포 배지 공급원으로부터 생물 반응기 백에 세포 배지를 첨가하는데 사용될 수 있다. 세포 배지는 세포 배양 중에 세포를 위한 영양분을 함유할 수 있습니다. 일부 실시 예에서, 세포 배지는 공급 포트를 통해 생물 반응기 백에 연속적으로 첨가될 수 있다. 일부 실시예에서, 생물 반응기 백은 공급 포트를 통해 세포 배지 및 세포들로 부분적으로 채워질 수 있다. 일부 실시예에서, 생물 반응기 백은 세포 배지로 예비 충전되거나 세포들로 예비 충전 될 수 있다.

상부 표면(101)은 또한 샘플링(sampling) 포트(103)를 포함한다. 샘플링 포트는 생물 반응기 백으로부터 세포 및/또는 다른 물질의 샘플을 제거하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 배양 중에 사용자는 여러 가지 특성에 대해 세포의 일부를 테스트할 수 있다. 따라서, 사용자는 세포 샘플을 얻기 위해 생물 반응기 백의 샘플링 포트를 사용할 수 있다.

생물 반응기 백은 또한 제1 단부 및 제 1단부에 대향하는 제2 단부를 포함할 수 있다. 또한, 생물 반응기 백은 제1 측부 및 제1 측부에 대향하는 제2 측부를 포함할 수 있다. 예를 들어, 생물 반응기 백(100)의 상부 표면(101)은 제1 단부(107), 제2단부(108), 제1측부(109) 및 제2측부(110)을 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 측부들은 상기 단부들 보다 길 수 있다. 예를 들어, 일부 실시예에서, 측부는 558mm 길이일 수 있고, 단부는 275mm 길이일 수 있다. 일부 실시예에서, 사용시 제1 단부는 백(bag)의 앞부분일 수 있고, 사용시 제2 단부는 백의 뒷부분일 수 있다. 백(bag)의 상부 표면은 제1단부 및 제2단부 사이의 중간에 있을 수 있다. 공급 포트 및/또는 샘플링 포트는 제2단부 보다 제1단부에 더 가깝게 있을 수 있다. 다른 실시예에서, 공급 포트 및/또는 샘플링 포트는 제1단부 보다 제2단부에 더 가깝게 있을 수 있다. 일부 실시예에서, 공급 포트 및/또는 샘플링 포트는 중간보다 제 1 단부에 더 가깝게 있을 수 있다. 일부 실시예에서, 공급 포트 및/또는 샘플링 포트는 중간보다 제2단부에 더 가깝게 있을 수 있다. 일부 실시예에서, 공급 포트 및/또는 샘플링 포트는 제1 또는 제2단부 보다 중간에 더 가깝게 있을 수 있다. 일부 실시예에서, 공급 포트는 제2 측부 보다 제1측부에 더 가깝게 있을 수 있다. 일부 실시예에서, 공급 포트는 제1측부 보다 제2측부에 더 가깝게 있을 수 있다. 또한, 샘플링 포트는 제1측부 보다 제2측부에 더 가깝게 있을 수 있다. 다른 실시예에서, 샘플링 포트는 제2측부 보다 제1측부에 더 가깝게 있을 수 있다.

생물 반응기 백은 도 1에 도시된 바와 같이, 관류 포트(104)를 포함할 수 있다. 관류 포트는 생물 반응기 백에서 세포 폐기물을 제거하는데 사용할 수 있다. 예를 들어, 세포가 생물 반응기에서 배양되면, 세포는 독성 대사 산물을 생성할 수 있다. 따라서, 이러한 독성 부산물은 관류 포트를 통해 제거할 수 있다. 상기 생물 반응기 백은 또한 관류 포트에 유체적으로 연결된 관류 필터를 포함할 수 있다. 관류 필터는 최소한의 또는 전혀 세포 손실 없이 생물 반응기 백으로부터 유체가 제거되도록 할 수 있다. 따라서, 상기 필터는 세포가 통과할 수 없는 다공성을 가질 수 있다. 일부 실시예에서 관류 필터는 생물 반응기 백 내의 유체 표면 상에서 자유롭게 움직일 수 있도록 구성될 수 있다. 일부 실시 예에서, 관류 필터는 1.2 마이크론(기공 크기) 막을 포함한다. 여과물(filtrate, 또는 여액) 튜브는 관류 포트와 여과물 포트 사이의 연결시킬 수 있다. 따라서, 폐여액은 필터를 통해 생물 반응기 여과물 튜브로 배출된 후, 관류 포트 밖으로 배출될 수 있다. 일부 실시예에서, 폐여과물은 생물 반응기 백으로부터 연속적으로 제거된다. 도 1은 생물 반응기 백(100) 내의 필터(111), 필터 (11)상의 여과물 포트(112) 및 여과물 포트(112)와 관류 포트(104)를 연결하는 여과물 튜브(113)를 포함한다. 필터(111), 여과물 포트(112) 및 여과물 튜브(113)의 점선은 이들 아이템이 상부 표면(101)에 있지 않고 생물 반응기 백(100) 내부에 있음을 의미한다. 여과물 튜브는 필터가 생물 반응기 백의 유체 표면에서 자유롭게 이동할 수 있는 유연한 튜브일 수 있다. 일부 실시예에서, 관류 포트는 도 1에 도시된 바와 같이 제1측부 보다 제2측부에 더 가깝게 있을 수 있다. 다른 실시예에서, 관류 포트는 생물 반응기 백의 제2 단부 보다 제1단부에 더 가깝게 있을 수 있다. 일부 실시예에서, 관류 포트는 중간보다 제1단부에 더 가깝게 있을 수 있다. 일부 실시예에서, 관류 포트는 중간보다 제2단부에 더 가깝게 있을 수 있다. 일부 실시예에서, 관류 포트는 제1 또는 제2단부 보다 중간에 더 가깝게 있을 수 있다. 또한, 관류 포트는 제1측부 보다 제2측부에 더 가깝게 있을 수 있다. 다른 실시예에서, 관류 포트는 제2측부 보다 제1측부에 더 가깝게 있을 수 있다.

또한, 생물 반응기 백의 상부 표면은 가스 유입 포트 및 가스 배출 포트를 포함할 수 있다. 예를 들어, 도 1은 가스 배출 포트(105) 및 상부 표면 (111)상의 가스 유입 포트(106)를 포함한다. 일부 실시예에서, 생물 반응기 백은 팽창될 수 있으며, 일부 실시예에서는 가스 유입 포트를 통해 부분적으로 팽창 될 수 있다. 일부 실시예에서, 가스원으로부터의 가스(예를 들어, CO₂, 산소, 질소, 공기 또는 이들의 혼합물)는 가스 유입 포트를 통해 유입되어 생물 반응기 백을 팽창시킬 수 있다. 게다가, 백을 팽창시키고, 가스는 세포 배양에 사용될 수 있다. 예를 들어, 가스는 세포 신진 대사에 필요할 수 있다. 생물 반응기 백으로부터의 배기 가스(예를 들어, 호흡된 가스)는 가스 배출 포트를 통해 생물 반응기 백을 빠져 나올 수 있다. 일부 실시예에서, 가스 유입 포트 및/또는 가스 배출 포트는 제1단부 또는 제2단부 보다 중간에 더 가까울 수 있다.

일부 실시예에서, 가스 유입 포트 및/또는 가스 배출 포트는 중간 보다 제1단부에 더 가까울 수 있다. 일부 실시예에서, 가스 유입 포트 및/또는 가스 배출 포트는 중간보다 제2단부에 더 가까울 수 있다. 일부 실시예에서, 가스 유입 포트는 제2측부 보다 제1측부에 더 가까울 수 있다. 일부 실시예에서, 가스 유입 포트는 제1측부 보다 제2측부에 더 가까울 수 있다. 일부 실시예에서, 가스 배출 포트는 제1 측부 보다 제2측부에 더 가까울 수 있다. 일부 실시예에서, 가스 배출 포트는 제2측부 보다 제1 측부에 더 가까울 수 있다.

생물 반응기 백의 다수의 포트 중 적어도 하나는 딥 튜브(dip tube)를 가질 수 있다. 일부 실시예에서, 상기 포트는 딥 튜브를 포함하지 않는다. 일부 실시예에서, 생물 반응기 백은 생물 반응기 백의 적어도 하나의 단부 및/또는 측부에 플랩(즉, 과량의 플라스틱)을 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 하나 이상의 이들 플랩들은 생물 반응기 백 및 관련 구성 제조 중에 제거된다. 다른 일실시예에서, 생물 반응기 백은 백(bag)의 단부 및/또는 측부에 플랩을 포함하지 않는다. 하나 이상의 플랩을 제거하거나 백(bag)에 플랩이 없으면 생물 반응기 백을 여러 가지 다른 생물 반응기 로커에 적용할 수 있다.

또한, 생물 반응기 백의 상부 표면은 생성물 라벨(product label)을 포함할 수 있다. 예를 들어, 도 1은 상부 표면(101) 상에 생성물 라벨(114)을 포함한다. 또한, 생물 반응기 백은 하부 표면(미도시)을 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 생물 반응기 백의 하부 표면은 전술한 복수의 포트 중 적어도 하나를 포함할 수 있다. 다른 실시예에서, 하부 표면은 매끄럽다. 일부 실시예에서, 생물 반응기 백은 생물 반응기 로커 상에 위치한다. 생물 반응기 로커(bioreactor rocker)는 생물 반응기 백을 흔들거나 교반하여, 세포 배양을 촉진시키기 위해 백(bag) 내의 세포의 이동(예: 통기 및 혼합)을 제공 할 수 있다. 생물 반응기의 흔들림(rocking) 또는 교반(agitation)은 기체-액체 표면으로부터 효율적인 가스 교환을 제공할 수 있다. 본원에 개시된 생물 반응기 백 조립체와 호환 가능한 로킹 모션 플랫폼을 갖는 생물 반응기의 예는 GE Xuri W25, GE Xuri W5, Sartorius BioSTAT RM 20|50, Finesse SmartRocker Bioreactor Systems 및 Pall XRS Bioreactor Systems가 있다.

본원에 개시된 생물 반응기 조립체는 1회용 생물 반응기 조립체일 수 있다. 생물 반응기 백은 중합체 물질(예:폴리에틸렌)과 같은 가요성 물질(flexible material)로 제조될 수 있다. 중합체 물질은 플라스틱 필름 또는 라미네이트(laminate)일 수 있다. 또한, 가요성 물질은 무기 산화물 및/또는 금속을 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 생물 반응기 백은 S80 필름 물질로 제조 될 수 있다. 일 실시예에서, 생물 반응기 백은 가스 장벽층을 갖는다. 가스 배리어 층 재료는 EVOH를 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 생물 반응기 백은 생성물 접촉층(product contact layer)을 가질 수 있다. 생성물 접촉층 재료는 선형 저밀도 폴리에틸렌(LLDPE)과 같은 폴리에틸렌을 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 생물 반응기 백은 Sartorius Flexsafe RM 관류 백(perfusion bag)과 동일 물질로 제조될 수 있다. 생물 반응기 백은 1 ~ 200 L(예를 들어, 1, 2, 10, 20, 50, 100 또는 200 L)의 총 부피를 가질 수 있다. 생물 반응기 백은 100 mL ~ 100 L(예를 들어, 0.1 ~ 0.5 L, 0.2 ~ 1 L, 1 ~ 5 L, 2 ~ 10 L, 5 ~ 25 L, 10 ~ 50 L 또는 20 ~ 10 L).

또한, 생물 반응기 백 조립체는 공급 포트에 유체적으로 연결되는 공급 배관 장치를 포함할 수 있다. 공급 배관 장치는 생물 반응기 백의 공급 포트에 다양한 공급 성분(예를 들어, 세포 및/또는 배지)을 제공할 수 있다. 도 2a 및 도 2b는 본 명세서에 개시된 생물 반응기 백 조립체의 공급 포트(202)에 유체적으로 연결된 공급 배관 장치(215)의 예를 도시한 것이다. 공급 배관 장치는 Y-커넥터(216)를 포함할 수 있다. Y-커넥터는 공급 배관 장치 장치가 2 개의 유입구를 갖도록 사용될 수 있다. 따라서, 세포 배지 공급원은 공급 배관 장치의 하나 또는 각각의 유입구에 유체적으로 연결될 수 있다. 일부 실시 예에서, 세포원은 공급 배관 장치의 하나 또는 각각의 유입구에 유체적으로 연결될 수 있다. 다른 일실시예에서, 세포원은 하나의 유입구와 연결될 수 있고, 배지 공급원은 다른 유입구와 연결될 수 있다. 일부 실시예에서, Y-커넥터는 PVC 배관에 적합할 수 있다. 공급 배관 장치 내의 배관의 길이는 공급원(feed source, 예를 들어, 세포원 및/또는 배지 공급원)에 도달하기에 충분한 길이가 될 수 있다. 예를 들어, 공급원은 IV 극(IV pole)에 연결될 수 있으며, 공급 배관 장치가 공급원에 도달할 수 있도록 충분한 배관 길이를 가져야 한다.

또한, 공급 배관 장치는 공급 유입 배관을 포함할 수 있다. 예를 들어, 도 2a ~ b는 공급 유입 배관(217)을 포함한다. 공급 유입 배관은 실리콘 배관 및/또는 폴리염화비닐(PVC) 배관일 수 있다. 일부 실시예에서, 공급 유입 배관은 PVC 배관이다. 일부 실시예에서, 공급 유입 배관은 0.118 x 0.164 PVC 배관이다. 일부 실시예에서, 공급 유입 배관은 Tygon^® 0.118 x 0.164 배관이다. 일부 실시예에서, 공급 유입 배관은 추가적인 요소가 공급 유입 배관에 결합될 수 있도록 한다. 예를 들어, 세포원 및/또는 세포 배지가 공급 유입 배관을 통해 생물 반응기 백에 공급될 수 있도록 세포원 및/또는 세포 배지 공급원이 공급 유입 배관에 결합될 수 있다. 일부 실시예에서, 공급 유입 배관은 Terumo TSCD-II 용접기 사양을 충족시킬 수 있다. 일부 실시예에서, 공급 유입 배관은 표준 PVC 혈액 수집 유형 배관과 양립할 수 있다. 일부 실시예에서, 공급 유입 배관은 ID:2.9~3.1mm / OD:3.9~4.5mm를 갖는다. 일부 실시예에서, 공급 유입 배관은 ID:3mm / OD:4.17mm를 갖는다. 공급 유입 배관의 하나 또는 두 개의 섹션(section)은 약 350~550mm, 400~500mm, 425~475mm 또는 460mm 길이일 수 있습니다. 또한, 공급 배관 장치는 플러그(218, plugs)를 포함할 수 있다. 플러그는 PVC 배관용 플러그가 될 수 있다. 일부 실시예에서, 상기 플러그는 압입(press-in) 플러그(3/32)이다. 또한, 공급 배관 장치는 공급 배관 장치 상에 하나 또는 복수의 유입 클램프(inlet clamp)를 포함할 수 있다. 도 2a~b는 클램프(220)를 도시한다. 일부 실시예에서, 유입 클램프는 핀치(pinch) 클램프 및/또는 슬라이드(slide) 클램프이다. 일부 실시예에서, 유입 클램프는 PVC 배관에 적합하다.

또한, 공급 배관 장치는 또한 포스트-Y- 커넥터 배관을 포함할 수 있다. 도 2a~2b는 포스트-Y-커넥터 배관(219)을 포함한다. 포스트-Y-커넥터 배관은 실리콘 배관 및/또는 폴리염화비닐(PVC) 배관일 수 있다. 일부 실시예에서, 포스트-Y-커넥터 배관은 PVC 배관이다. 일부 실시예에서, 포스트-Y-커넥터 배관은 0.118 x 0.164 PVC 배관이다. 일부 실시예에서, 포스트-Y-커넥터 배관 Tygon^® 0.118 x 0.164 배관이다. 일부 실시 예에서, 포스트-Y-커넥터 배관은 추가 요소가 포스트-Y-커넥터 배관에 결합될 수 있도록 한다. 예를 들어, 세포 및/또는 세포 배지가 공급 포트를 통해 생물 반응기 백에 공급될 수 있도록, 세포 공급원 및/또는 세포 배양 공급원을 포스트-Y-커넥터 배관에 결합할 수 있다. 일부 실시예에서, 포스트-Y-커넥터 배관은 Terumo TSCD-II 용접기 사양을 충족시킬 수 있다. 일부 실시예에서, 포스트-Y-커넥터 배관은 표준 PVC 혈액 수집형 배관과 호환 가능할 수 있다. 일부 실시예에서, 포스트-Y-커넥터 배관은 ID:2.9~3.1mm / OD:3.9~4.5mm를 갖는다. 일부 실시예에서, 포스트-Y-커넥터 배관은 ID:3mm / OD:4.17mm를 갖는다. 포스트-Y-커넥터 배관은 약 200~400 mm, 250~350 mm, 275~325 mm 또는 300 mm 길이일 수 있다.

또한, 공급 배관 장치는 도 2a~b에 도시된 바와 같은 리듀서(221, reducer)를 포함할 수 있다. 리듀서는 고전적인 시리즈 바브(barbs)일 수 있다. 일부 실시예에서, 상기 리듀서는 1/8 x 5/32 리듀서(reducer)이다. 일부 실시예에서, 리듀서는 Value Plastics #3040-6005이다.

공급 배관 장치는 포스트-리듀서 배관(222)로서 도 2a-2b에 도시된 바와 같이 포스트-리듀서 배관을 포함할 수 있다. 상기 포스트-리듀서 배관은 실리콘 배관 및/또는 폴리염화비닐(PVC) 배관일 수 있다. 일부 실시예에서, 포스트-리듀서 배관은 실리콘 배관이다. 일부 실시예에서, 포스트-리듀서 배관은 1/8 x 1/4 실리콘 배관이다. 포스트-리듀서 배관은 약 1000~1500 mm, 1250~1450 mm, 1350~1400 mm 또는 1380 mm 길이일 수 있다. 상기 공급 배관 장치는 포스트-리듀서 배관 상에 클램프(clamp)를 포함할 수 있다. 도 2a 및 도 2b는 포스트-리듀서 클램프(223)를 도시한 것이다. 포스트-리듀서 클램프는 핀치 클램프 또는 슬라이드 클램프일 수 있다. 일부 실시예에서, 포스트-리듀서 클램프는 실리콘 배관에 적합하다.

공급 배관 장치의 배관 부분은 펌프 또는 다수의 펌프에 연결되어 공급 유입 배관에 연결된 유체가 공급 포트를 통해 반응 생성물 백으로 이송(또는 전달)될 수 있다. 일부 실시예에서, 공급 배관 장치의 실리콘 배관은 펌프에 연결된다. 일부 실시예에서, 포스트-리듀서 배관은 펌프에 연결된다. 일부 실시예에서, 중력은 공급 유입 배관에 연결된 유체가 공급 포트를 통해 생물 반응기 백으로 이송되는 힘을 제공할 수 있다.

공급 배관 장치에 사용되는 커넥터는 미늘 커넥터(barbed connectors) 및/또는 루어 록 커넥터(luer lock connectors) 일 수 있습니다. 일부 실시예에서, 미늘 커넥터만 사용된다. 일부 실시예에서, 공급 배관 장치의 커넥터 중 적어도 일부는 케이블 타이(cable ties) 또는 연결을 고정하기 위한 다른 타이(ties)를 가질 수 있다. 다른 실시예에서, 케이블 타이는 케이블 타이 (224)를 갖는 도 2b에 도시된 바와 같이 공급 배관 장치의 모든 연결부 상에 있을 수 있다. 또한, 공급 배관 장치의 모든 연결부는 유체적으로 연결될 수 있다.

일부 실시예에서, 공급 배관 장치는 배양된 세포를 수득하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 수득 백(harvest bag)을 공급 배관 장치 및/또는 포스트-Y-커넥터 배관에 결합할 수 있다. 일부 실시예에서, 수득 백은 공급 유입 배관의 PVC 배관 및/또는 포스트-Y-커넥터 배관의 PVC 배관에 결합된다. 세포 수득을 위해, 공급 배관 장치의 흐름이 역전될 수 있다. 중력은 생물 반응기 백에서 수득 백으로 세포의 흐름을 유도하는 데 충분한 힘을 제공할 수 있다. 다른 실시예에서, 펌프는 전술한 바와 같이 생물 반응기 백으로부터 수득 백으로 세포의 흐름을 유도하는데 사용될 수 있다.

또한, 생물 반응기 백 조립체는 샘플링 포트에 유체적으로 연결되는 샘플링 배관 장치를 포함할 수 있다. 샘플링 배관 장치는 생물 반응기 백으로부터 세포의 샘플 및/또는 다른 물질을 제거하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 배양 중에, 사용자는 여러 가지 특성에 대해 세포의 일부를 테스트하기를 원할 수 있다. 따라서, 사용자는 세포 샘플을 얻기 위해, 생물 반응기 백의 샘플링 포트에 유체적으로 연결된 샘플링 배관 장치를 사용할 수 있다.

도 3a 및 도 3b는 본 명세서에 개시된 생물 반응기 백 조립체를 위한 샘플링 포트(303)에 유체적으로 연결되는 샘플링 배관 장치(325)의 예를 도시한 것이다. 샘플링 배관 장치는 샘플링 유입 배관을 포함할 수 있다. 예를 들어, 도 3a~b는 샘플링 유입 배관(326)을 포함한다. 샘플링 유입 배관은 실리콘 배관 및/또는 폴리염화비닐(PVC) 배관일 수 있다. 일부 실시예에서, 샘플링 유입 배관은 PVC 배관이다. 일부 실시예에서, 샘플링 유입 배관은 0.118 x 0.164 PVC 배관이다. 일부 실시예에서, 샘플링 유입 배관은 Tygon^® 0.118 x 0.164 배관이다. 일부 실시예에서, 샘플링 유입 배관은 추가적인 구성 요소가 샘플링 유입 배관에 결합될 수 있도록 한다. 예를 들어, 샘플 세포가 샘플링 포트 및 샘플링 배관 장치를 통해 제거되도록 샘플링 장치는 샘플링 유입 배관이 결합되어 있을 수 있다. 도 7은 본 명세서에 개시된 생물 반응기 백 조립체에 결합될 수 있는 샘플링 장치(780)의 예를 도시한 것이다. 샘플링 장치는 튜브(781), 1-방향 체크 밸브(782), 및 마이크로클레이브(microclave) 재사용 가능한 샘플링 포트(783)를 포함 할 수 있다. 샘플링 장치의 배관(tubing, 튜브)은 실리콘 배관 및/또는 폴리염화비닐(PVC) 배관일 수 있다. 일부 실시예에서, 배관은 PVC 배관이다. 일부 실시예에서, 배관은 0.118 x 0.164 PVC 배관이다. 일부 실시예에서, 배관은 Tygon^® 0.118 x 0.164 배관이다. 일부 실시예에서, 배관은 Terumo TSCD-II 용접기 사양을 충족시킬 수 있다. 일부 실시예에서, 상기 배관은 표준 PVC 혈액 수집형 배관과 호환 가능할 수 있다. 일부 실시예에서, 상기 배관은 ID:2.9~3.1mm / OD:3.9~4.5mm를 갖는다. 일부 실시예에서, 상기 배관은 ID:3mm / OD:4.17mm를 갖는다. 마이크로클레이브(microclave) 재사용 가능한 샘플링 포트 반대편 배관의 단부 (784)는 밀봉될 수 있다. 시료 샘플링을 가능하게 하기 위해서, 샘플링 장치는 생물 반응기 백 조립체의 샘플링 유입 배관에 결합할 수 있다. 샘플링 장치는 약 20~40 mm, 25~35 mm 또는 30 mm 길이일 수 있다. 또한, 샘플링 장치는 약 1~5 mL, 2~3 mL 또는 2.2 mL의 부피를 가질 수 있다. 샘플링 장치의 연결 중 일부는 누수를 방지하기 위해 결합(bond)되어 있을 수 있다. 일부 실시예에서, 샘플링 장치의 모든 연결부는 누수를 방지하기 위해 결합된다. 마이크로클레이브 재사용 가능한 샘플링 포트는 마이크로 샘플링 포트의 실수로 열리는 것(unscrew)을 방지하기 위해 결합될 수 있다. 마이크로클레이브 재사용 가능한 샘플링 포트는 샘플을 생물 반응기 백에서 제거하기 위해 샘플링 주사기(syringe)에 연결할 수 있다. 1-방향(1-way) 체크 밸브는 샘플링 중에 우발적인 역류를 방지하고 오염으로부터 배양물을 보호할 수 있다. 이와 같이, 사용자는 샘플링 주사기로부터 재료를 배양 백(culture bag)에 밀어 넣지 못할 수도 있다. 또한, 생물 반응기 백이 생물 반응기 로커 상에 평평하게 놓일 때, 배양 백의 헤드스페이스(headspace)로부터 가스를 끌어 당김으로써 샘플 사이에서 라인을 플러싱(flushing)할 수 있다.

일부 실시예에서, 샘플링 유입 배관은 Terumo TSCD-II 용접기 사양을 충족시킬 수 있다. 일부 실시예에서, 샘플링 유입 배관은 표준 PVC 채혈 유형 배관과 양립할 수 있다. 일부 실시예에서, 샘플링 유입 배관은 ID:2.9~3.1mm / OD:3.9~4.5mm를 갖는다. 일부 실시예에서, 샘플링 유입 배관은 ID:3mm / OD:4.17mm를 갖는다. 샘플링 유입 배관은 약 200~400 mm, 250~350 mm, 275~325 mm 또는 300 mm 길이를 가질 수 있다. 또한, 샘플링 배관 장치는 플러그(318, plug)를 포함할 수 있다. 플러그는 PVC 배관용 플러그일 수 있다. 일부 실시예에서, 플러그는 압입(press-in) 플러그(3/32)이다.

또한, 샘플링 배관 장치는 리듀서(reducer)로서, 도 3a~b에 도시된 바와 같은 감속기(321)를 포함할 수 있다. 리듀서는 고전적인 시리즈 미늘(barbs)일 수 있다. 일부 실시예에서, 상기 리듀서는 1/8 x 5/32 리듀서이다. 일부 실시예에서, 상기 리듀서는 Value Plastics #3040-6005이다.

샘플링 배관 장치는 포스트-리듀서 샘플링 배관으로서, 도 3a-b에 도시 된 바와 같은 포스트-리듀서 샘플링 배관(327)을 포함할 수 있다. 상기 포스트-리듀서 샘플링 배관은 실리콘 배관 및/또는 폴리비닐클로라이드(PVC) 배관일 수 있다. 일부 실시예에서, 포스트-리듀서 샘플링 배관은 실리콘 배관이다. 일부 실시예에서, 포스트-리듀서 샘플링 배관은 1/8 x 1/4 실리콘 배관이다. 상기 포스트-리듀서 샘플링 배관은 약 10-100 mm, 25-75 mm, 40-60 mm, 또는 50 mm 길이를 가질 수 있다. 샘플링 배관 장치는 포스트-리듀서 샘플링 배관 상에 클램프를 포함할 수 있다. 도 3a~b는 포스트-리듀서 샘플링 클램프(323)를 도시한 것이다. 포스트-리듀서 샘플링 클램프는 실리콘 배관에 적합하다.

샘플링 배관 장치의 배관의 일부분은 샘플 유체가 샘플링 포트로부터 제거될 수 있도록 펌프 또는 다수의 펌프에 연결될 수 있다. 일부 실시예에서, 샘플링 배관 장치의 실리콘 배관은 펌프에 연결된다. 일부 실시예에서, 포스트-리듀서 샘플링 배관은 펌프에 연결된다. 일부 실시예에서, 중력은 샘플링 포트로부터 샘플 유체가 제거되도록 힘을 제공할 수 있다.

샘플링 배관 장치에 사용되는 커넥터는 미늘(barbed) 커넥터 및/또는 루어 록(luer lock) 커넥터일 수 있다. 일부 실시예에서, 미늘 커넥터만 사용된다. 일부 실시예에서, 샘플링 배관 장치의 연결 수단 중 적어도 일부는 케이블 타이(cable ties) 또는 연결을 고정하기 위한 다른 타이(ties)를 가질 수 있다. 다른 실시예에서, 케이블 타이는 도 3b에 도시된 바와 같이 케이블 타이(324)를 갖는 샘플링 배관 장치의 모든 연결 수단과 연결될 수 있다. 또한, 공급 배관 장치의 모든 연결 수단은 유체적으로 연결될 수 있다.

또한, 생물 반응기 백 조립체는 생물 반응기 백의 관류 포트에 유체적으로 연결된 폐기물 백을 포함할 수 있다. 폐기물 백은 생물 반응기 백으로부터 제거된 세포 폐기물을 저장할 수 있다. 따라서, 폐 여과액은 관류 포트 외부의 생물 반응기 백을 빠져 나와 폐기기 백에 저장될 수 있다.

도 4a 및 도 4b는 본 명세서에 개시된 생물 반응기 백 조립체의 폐기물 백(429) 및 관류 포트(404)를 유체적으로 연결하는 폐기물 배관 장치(428)의 예를 도시한 것이다. 이와 같이, 생물 반응기 백으로부터의 폐기물은 필터(411), 여과 포트(412, filtrate port), 여과 튜브(413, filtrate tube), 관류 포트(404) 및 폐기물 백(429)을 통과할 수 있다. 폐기물 배관 장치의 배관 길이는 폐기물 백이 생물 반응기 백과 동일한 또는 다른 플랫폼(platform)의 생물 반응기 테이블(table) 또는 콘솔(console) 상에 있도록 하기에 충분한 길이가 되도록 할 수 있다. 예를 들어, 폐기물 백은 생물 반응기 로커(생물 반응기 백과 함께) 아래의 선반(shelf) 또는 플랫폼(platform)에 있을 수 있으며 폐기물 배관 장치는 선반 또는 플랫폼에 도달할 수 있는 충분한 배관 길이가 가져야 한다. 상기 폐기물 백은 1 ~ 200 L(예를 들어, 1, 2, 10, 20, 50, 100 또는 200 L)의 총 부피를 가질 수 있다. 일부 실시예에서, 폐기물 백은 10L 백이다. 폐기물 백에는 폐기물 포트가 있을 수 있다. 일부 실시예에서, 폐기물 포트는 폐기물 포트(430)로서 도 4b에 도시 된 바와 같이 폐기물 백의 상부 표면 상에 있다. 폐기물 백의 상부 표면 상에 폐기물 포트를 갖는 것은 폐기물 백이 생물 반응기 백 아래의 선반 또는 플랫폼 상에 있게 하고 폐기물 백으로부터의 생물 반응기 백으로부터의 배관은 배관을 구부리지 않고 수직 정렬되도록 할 수 있다. 상기 페기물 백은 제1단부 및 제1단부에 대향하는 제2단부를 가질 수 있다. 또한, 폐기물 백은 제1측면 및 제1측면에 대향하는 제2단부를 가질 수 있다. 예를 들어, 폐기물 백(429)은 도 4b에 도시된 바와 같이 제1단부(431), 제2단부(432), 제1측면(433) 및 제2측면(434)을 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 폐기물 백의 상기 측면은 상기 단부 보다 길 수 있다. 예를 들어, 측면의 길이는 500mm이고, 단부의 길이는 380 mm 일 수 있다. 일부 일실시예에서, 사용시 제 1 단부는 폐기물 백의 전면일 수 있고, 사용시 제2 단부는 폐기물 백의 후면일 수 있다. 일부 실시예에서, 폐기물 포트는 폐기물 백의 제1단부에 있다. 폐기물 백의 상부 표면의 중간부는 제 1 말단과 제 2 말단의 중간에 있을 수 있다. 폐기물 포트는 제2단부 보다 제1단부에 더 가깝게 있을 수 있다. 다른 실시예에서, 폐기물 포트는 제1단부 보다 제2단부에 더 가까울 수 있다. 일부 실시예에서, 폐기물 포트는 상기 중간부 보다 제1단부에 더 가까울 수 있다. 일부 실시예에서, 폐기물 포트는 상기 중간부 보다 제2단부에 더 가까울 수 있다. 일부 실시예에서, 폐기물 포트는 제1 또는 제2단부 보다 중간부에 더 가까울 수 있다. 일부 실시예에서, 폐기물 포트는 제2측면 보다 제1측면에 더 가까울 수 있다. 일부 실시예에서, 폐기물 포트는 제1측면 보다 제2측면에 더 가까울 수 있다.

폐기물 배관 장치는 폐기물 유입 배관을 포함할 수 있다. 예를 들어,도 4a~b는 폐기물 유입 배관(435)을 포함한다. 폐기물 유입 배관은은 실리콘 배관 및/또는 폴리염화비닐(PVC) 배관일 수 있습니다. 일부 실시예에서, 폐기물 유입 배관은 PVC 배관이다.

일부 실시예에서, 폐기물 유입 배관은 실리콘 배관이다. 일부 실시예에서, 폐개물 유입 배관은 0.118 x 0.164 PVC 배관이다. 일부 실시예에서, 폐기물 유입 배관은 Tygon^® 0.118 x 0.164 배관이다. 일부 실시예에서, 폐기물 유입 배관은 1/8 x 1/4 실리콘 배관이다.

일부 실시예에서, 폐기물 백 유입 배관은 추가 요소가 추가적인 폐기물 백과 같은 폐기물 백 유입 배관에 결합될 수 있도록 되어 있다. 일부 실시예에서, 폐기물 유입 배관은 Terumo TSCD-II 용접기 사양을 충족시킬 수 있다. 일부 실시예에서, 폐기물 유입 배관은 표준 PVC 채혈 타입 배관과 호환 될 수 있다. 일부 일실시예어서, 상기 폐기물 백 유입 배관은 ID: 2.9~3.1 mm / OD: 3.9~4.5 mm을 가진다. 일부 일실시예어서, 상기 폐기물 백 유입 배관은 ID : 3mm / OD : 4.17mm이. 상기 폐기물 백 유입 배관은 약 10~200mm, 25~300mm, 25~75mm 또는 50mm 길이일 수 있다.

또한, 폐기물 배관 장치는 리듀서(421, reducer)로서 도 4a 내지 도 4b에 도시된 바와 같은 리듀서를 포함할 수 있다. 또한, 폐기물 배관 장치는 도 4b에 도시된 바와 같이 감속기(436)로서 제 2 감속기를 포함할 수 있다. 리듀서(들)은 고전적인 시리즈 미늘(barbs)일 수 있다. 일부 실시예에서, 리듀서(들)는 1/8 x 5/32 리듀서이다. 일부 실시예에서, 리듀서는 밸루 플라스틱(value plastics) # 3040-6005이다.

또한, 상기 폐기물 배관 장치는 관류 포트 배출 배관을 포함할 수 있다. 예를 들어, 도 4a-b는 관류 포트 배출 배관(437)을 포함한다. 상기 관류 포트 배출 배관은 실리콘 배관 및/또는 폴리염화비닐(PVC) 배관일 수 있다. 일부 실시예에서, 관류 포트 배출 배관은 실리콘 배관이다. 일부 실시예에서, 관류 포트 배출 배관은 1/8 x 1/4 실리콘 배관이다. 관류 포트 배출 배관은 약 1000~2000 mm, 1250~1750 mm, 1500~1600 mm 또는 1520 mm 길이일 수 있다. 폐기물 배관 장치는 관류 포트 배출 배관 상에 클램프를 포함할 수 있다. 도 4a-b는 관류 포트 배출 배관 클램프(423)를 도시한 것이다. 관류 포트 배출 배관 클램프는 핀치(pinch) 클램프 또는 슬라이드(slide) 클램프일 수 있다. 일부 실시예에서, 포스트-리듀서 샘플링 관류 포트 배출 배관 클램프는 실리콘 배관에 적합하다.

또한, 폐기물 배관 장치는 중간(intermediate) 폐기물 배관을 포함할 수 있다. 예를 들어, 도 4b는 중간 폐기물 배관(438)를 포함한다. 중간 폐기물 배관은 2 개의 다른 배관 사이에 있을 수 있다. 일부 실시예에서, 중간 폐기물 배관은 2 개의 리듀서(reducer) 사이에 있다.상기 중간 폐기물 배관은 실리콘 배관 및/또는 폴리염화비닐(PVC) 배관일 수 있다. 일부 실시예에서, 중간 폐기물 배관은 PVC 배관이다. 일 실시예에서, 중간 폐기물 배관은 0.118 x 0.164 PVC 배관이다. 일 실시예에서, 중간 폐기물 배관은 Tygon^® 0.118 x 0.164 배관이다. 일 실시예에서, 중간 폐기물 배관은 추가 요소가 추가적인 폐기물 백과 같은 중간 폐기물 배관에 결합될 수 있도록 되어 있다. 일부 실시예에서, 중간 폐기물 배관은 Terumo TSCD-II 용접기 사양을 충족시킬 수 있다. 일부 실시예에서, 중간 폐기물 배관은 표준 PVC 혈액 수집형 배관과 호환 가능할 수 있다. 일부 실시예에서, 중간 폐기물 배관은 ID : 2.9-3.1mm / OD : 3.9-4.5mm를 갖는다. 일부 실시예에서, 중간 폐기물 배관은 ID : 3mm / OD : 4.17mm를 갖는다. 중간 폐기물 배관은는 약 500~1500mm, 750~1250mm, 900~1000mm 또는 920mm 길이일 수 있다.

폐기물 배관 장치의 배관 부분은 펌프 또는 다수의 펌프에 연결될 수 있으며, 생물 반응기 백으로부터의 폐기물이 관류 포트를 통해 폐기물 백으로 전달될 수 있다. 일부 실시예에서, 폐기물 배관 장치의 실리콘 배관은 펌프에 연결된다. 일부 실시예에서, 관류 포트 배출 배관 및/또는 폐기물 백 유입 배관은 펌프에 연결된다. 일부 실시예에서, 중력은 폐기물 백에 전달되는 생물 반응기 백에서 제거되는 폐기물에 대해 힘을 제공할 수 있다.

폐기물 배관 장치에 사용된 커넥터는 미늘(barbed) 커넥터 및/또는 루어 록(luer lock) 커넥터일 수 있다. 일부 실시예에서, 미늘 커넥터만 사용된다. 일부 실시예에서, 폐기물 배관 장치의 연결 수단 중 적어도 일부는 케이블 타이 또는 연결 수단을 고정하기 위한 다른 타이를 가질 수 있다. 다른 실시예에서, 케이블 타이는 도 4b에 도시된 바와 같이 케이블 타이(424)를 갖는 폐기물 배관 장치의 모든 연결 수단과 연결될 수 있다. 또한, 폐기물 배관 장치의 모든 연결 수단은 유체적으로 연결될 수 있다.

또한, 생물 반응기 조립체는 생물 반응기 백의 가스 배출 포트에 유체적으로 연결되는 가스 배출 배관 장치를 포함할 수 있다. 가스 배출 배관 장치는 생물 반응기 백으로부터의 배기 가스가 배출할 수 있다. 도 5는 생물 반응기 백의 가스 배출 포트(505)에 유체적으로 연결되는 가스 배출 배관 장치(539)의 예를 도시한 것이다. 가스 배출 배관 장치는 배기 필터(exhaust filter)를 포함할 수 있다. 배출 필터는 생물 반응기 백으로부터 에어로졸(aerosol)로서 세포 및/또는 배지이 방출되지 않도록 보장할 수 있다. 또한, 배기 필터는 배출 필터를 통한 임의의 역류가 생물 반응기 백 내의 세포 배양물의 오염을 초래하지 않도록 보장할 수 있다. 도 5는 상기 필터(543)를 도시한 것이다. 또한, 가스 배출 배관 장치는 배기 필터 유입 배관 및 배기 필터 배출 배관을 포함할 수 있다. 배기 필터는 배기 필터 유입 배관과 배기 필터 배출 배관 사이에 있을 수 있다. 예를 들어, 도 5는 배기 필터 배출 배관(544)과 배기 필터 유입 배관(542) 사이의 배기 필터(543)를 도시한 것이다.

배기 필터 유입 배관은 실리콘 배관 및/또는 폴리염화비닐(PVC) 배관일 수 있다. 일부 실시예에서, 배기 필터 유입 배관은 실리콘 배관이다. 일 실시예에서, 배기 필터 유입 배관은 3/16 x 5/16 실리콘 배관이다. 배기 필터 유입 배관은 약 10~100 mm, 25~75 mm, 40~60 mm 또는 50 mm길이일 수 있다. 가스 배출 배관 장치는 배기 필터 유입 배관 상에 클램프를 포함할 수 있다. 도 5는 배기 필터 유입 배관 클램프(523)를 도시한 것이다. 배기 필터 유입 배관 클램프는 핀치 클램프 또는 슬라이드 클램프 일 수 있습니다. 일부 실시예에서, 배기 필터 유입 배관 클램프는 실리콘 배관에 적합할 수 있다.

상기 배기 필터 배출 배관은 실리콘 배관 및/또는 폴리염화비닐(PVC) 배관일 수 있다. 일 실시예에서, 배기 필터 배출 배관은 실리콘 배관이다. 일 실시예에서, 배기 필터 배출 배관은 3/16 x 5/16 실리콘 배관이다. 배기 필터 배출 배관은 약 10~100 mm, 25~75 mm, 40~60 mm 또는 50 mm 길이 일 수 있다. 가스 배출 배관 장치는 배기 필터 배출 배관 상에 클램프를 포함할 수 있다. 배기 필터 배출 배관 클램프는 핀치 클램프 또는 슬라이드 클램프일 수 있다. 일부 실시예에서, 배기 필터 배출 배관 클램프는 실리콘 배관에 적합할 수 있다.

또한, 가스 배출 배관 장치는 도 5에 도시 된 바와 같이 M-루어 3/16(541) 및 체크 밸브(540)를 포함할 수 있다. 가스 배출 배관 장치에 사용되는 커넥터는 미늘 커넥터 및/또는 루어 록 커넥터일 수 있다. 일부 실시예에서, 미늘 커넥터 만 사용된다. 일부 실시예에서, 가스 배출 배관 장치의 연결 수단 중 적어도 일부는 연결 수단을 고정하기 위해 케이블 타이 또는 다른 연결 수단을 가질 수 있다. 다른 실시예에서, 케이블 타이는 도 5에 도시된 바와 같이 케이블 타이 (524)를 갖는 가스 배출 배관 장치의 모든 연결 수단에 연결되어 있을 수 있다. 또한, 가스 배출 배관 장치의 모든 연결 수단은 유체적으로로 연결될 수 있다.

또한, 생물 반응기 백 조립체는 생물 반응기 리액터 백의 가스 유입 포트에 유체적으로 연결된 가스 유칩 배관 장치를 포함할 수 있다. 가스 유입 배관 장치는 가스 공급원(gas source)에 연결될 수 있고, 가스 공급원으로부터 가스가 가스 유입 포트로 들어갈 수 있게 한다. 도 6은 생물 반응기 백의 가스 유입 포트(606)에 유체적으로 연결된 가스 유입 배관 장치(645)의 예를 도시한 것이다. 상기 가스 유입 배관 장치는 유입 필터를 포함할 수 있다. 유입 필터는 살균 유입 필터(sterilizing inlet filter)일 수 있다. 도 6은 유입 필터(647)을 도시한 것이다. 또한, 상기 가스 유입 배관 장치는 가스 유입 배관을 포함할 수 있다. 예를 들어, 도 6은 가스 유입 배관(646)을 도시한 것이다.

상기 가스 유입 배관은 실리콘 배관 및/또는 폴리염화비닐(PVC) 배관일 수 있다. 일부 실시예에서, 가스 유입 배관은 실리콘 배관이다. 일 실시예에서, 가스 유입 배관은 3/16 x 5/16 실리콘 배관이다. 가스 유입 배관은 약 10~100 mm, 25~75 mm, 40~60 mm 또는 50 mm 길이일 수 있다. 가스 유입 배관 장치는 가스 유입 배관 상에 클램프를 포함할 수 있다. 도 6은 가스 유입 배관 클램프(623)를 도시한 것이다. 가스 유입 배관 클램프는 핀치 클램프 또는 슬라이드 클램프일 수 있다. 일부 실시예에서, 가스 유입 배관 클램프는 실리콘 배관에 적합하다.

상기 가스 유입 배관 장치에 사용되는 커넥터는 미늘(barbed) 커넥터 및/또는 루어 록 커넥터일 수 있다. 일부 실시예에서, 미늘 커넥터만 사용된다. 일 실시예에서, 가스 유입 배관 장치의 연결 수단 중 적어도 일부는 연결 수단을 고정하기 위해 케이블 타이 또는 다른 연결 수단을 가질 수 있다. 다른 실시 예에서, 케이블 타이는 도 6에 도시된 바와 같이 케이블 타이(624)를 갖는 가스 유입 배관 장치의 모든 연결 수단 상에 있을 수 있다. 또한, 가스 유입 배관 장치의 모든 연결 수단은 유체적으로 연결될 수 있다.

본원에 개시된 생물 반응기 백 조립체는 무균일 수 있다. 예를 들어, 생물 반응기 백 조립체는 생물 반응기 백 조립체의 무균성을 보장하기 위해 투여 량을 사용하여 감마선, 전자 빔 또는 고 에너지 x- 선과 같은 이온화 방사선으로 조사될 수 있다. 또한, 생물 반응기 백 조립체(예: 생물 반응기 백, 포트, 배관 장치, 폐기물 백, 커넥터, 필터 등)의 다양한 구성 요소는 에틸렌 공중 합체, 실리콘, 스티렌 공중 합체, 폴리 술폰 등과 같은 방사선 내성 물질로 구성될 수 있다. 일부 실시예로서, 본원에 개시된 생물 반응기 백 조립체는 추가적인 멸균 없이 멸균되어 있고 즉시 사용될 수 있다. 일부 실시예에서, 생물 반응기 백 조립체는 멸균 상태(즉, 개방된 배관이 없음)로 밀봉된다. 일부 실시예에서, 생물 반응기 백 조립체는 배관의 개방(open tubing)을 방지하기 위해 배관 상에 플러그(plugs), 밀봉(seals) 또는 클램프(clamps)를 포함할 수 있다.

일부 실시예에서, 본 명세서에 개시된 PVC 배관은 DEHP-프리 PVC 결합(용접) 가능한 배관일 수 있다. 일부 실시예에서, 본 명세서에 개시된 실리콘 배관은 실리콘 펌프 배관일 수 있다. 또한, 생물 반응기 백 조립체는 바람직하게 미늘형 연결 수단(연결부)를 포함할 수 있다. 어떤 경우에는 루어 락 연결 수단이 불충분하게 조여지거나 실수로 연결이 끊어져서 생물 반응기 백 조립체의 인테그러티(integrity)가 손상될 수 있다.

Ⅱ. 세포 배양 및 가공 방법(METHOD OF CULTURING AND PROCESSING CELLS)

일부 실시예에서, 관류 생물 반응기 백 조립체와 같은 본 발명에서 제공된 생물 반응기 백 조립체는 세포치료(cell therapy) 제조(manufacturing), 생성(generating) 또는 생산(producing)과 관련과 같은, 세포 배양을 위해 사용될 수 있다. 일부 실시예에서, 면역세포치료는 재조합 수용체, 예컨데, 키메라 항원 수용체로 조작된 T 세포와 같은 세포를 포함한다(예 : CAR T 세포). 일부 실시예에서, 상기 배양은 세포 배양 및/또는 세포 확장(expansion)을 위한 조건(예를 들어, 세포의 증식 및/또는 활성화를 유도하기 위한 세포 자극) 하에서 수행된다. 일부 실시예에서, 세포치료의 제조, 생성 또는 생산과 관련하여, 생물 반응기 백 조립체를 사용하여 세포를 배양하는 것은 세포의 단리(isolation), 분리(separation), 선택(selections), 활성화(activation) 또는 자극(stimulation), 세척(washing), 현탁(suspension), 희석(dilution), 농축(concentration) 및/또는 제형화(formulation)을 위한 단계와 같은, 하나 이상의 추가적인 제조 단계를 포함하는 공정을 수행할 수 있다. 일부 실시예에서, 세포치료의 생성 또는 생산하는 방법은 피검자로부터 세포를 분리(isolating)하는 단계, 하나의 또는 자극하는 조건 하에서 세포를 제조, 가공, 배양하는 단계를 포함하며, 상기 배양의 적어도 일부는 제공된 생물 반응기 백 조립체를 사용하여 수행하며, 및/또는 세포를 조작(예:형질 도입)할 수 있다.

일부 실시예에서, 상기 방법은 이 다음과 같은 순서로 수행되는 처리 단계들을 포함한다; 우선 생물학적 시료로부터 선택되거나 분리하여, 세포(예:일차 세포, primary cells)를 분리하는 단계; 선택된 세포(분리된 세포)를 바이러스 벡터 입자와 함께 배양하여 배양하고, 선택적으로 자극 시약(stimulation reagent)의 존재 하에서 단리된 세포(isolated cells)를 자극하는 단계; 세포를 확장시키는 것과 같이 형질 도입된 세포를 배양하는 단계; 및 형질 도입된 세포를 조성물로 제제화하는 단계를 포함한다. 일 실시예에서, 생성된 조작된 세포(generated engineered cells)는 동결 보존 전 또는 후에 동일한 대상으로 재도입된다.

일 실시예에서, 제공된 방법은 임상적 사용(예를 들면, 양성 세포 치료(adoptive cell therapy)에서 세포를 무균 조건에 노출시키지 않고 무균실 또는 캐비넷을 사용할 필요 없이 수행된다)을 위한 세포 제조에서, 하나 이상의 단계 또는 모든 단계를 수행한다. 이러한 공정의 일부 실시예에서, 세포는 폐쇄 된 시스템(the closed system) 내에서 단리(isolated), 분리(separated) 또는 선택(selected), 형질 도입(tranduced), 세척, 선택적 활성화 또는 자극 및 제제화된다. 일부 실시예에서, 폐쇄된 시스템은 관류 생물 반응기 백 조립체와 같은 본 명세서에 기재된 생물 반응기 백 조립체이거나 이를 포함한다. 일 실시예에서, 상기 방법은 자동화된 방식으로 수행된다. 일 실시예에서, 하나 이상의 단계가 폐쇄된 시스템 또는 장치와는 별도로 수행된다.

일 실시예에서, 본 명세서에 기술된 생물 반응기 백 조립체는 세포 확장을 위한 폐쇄 시스템을 제공하며, 이는 세포치료(cell therapy)를 제조, 생성 또는 생산하는 방법의 하나 이상의 다른 처리 단계를 수행하기 위한 공지된 세포 확장 시스템 및/또는 시스템에 통합될 수 있다. 일부 실시예에서, 하나 이상의 또는 모든 공정 단계, 예를 들어, 단리(isolation), 선별(selection) 및/또는 농축(enrichment), 가공(processing), 형질도입 및 공학과 관련된 인큐베이션(incubation), 및 제형화 단계는 통합형 또는 자기 내장형 시스템 및/또는 자동화된 또는 프로그램화된 시스템, 기구(device) 또는 장치(apparatus)를 사용하여 수행된다. 몇몇 양태에서, 시스템 또는 장치는 시스템 및/또는 장치와 통신하는 컴퓨터 및/또는 컴퓨터 프로그램을 포함하며, 이는 사용자가 가공(processing), 단리(isolation), 엔지니어링 및 제형 단계의 다양한 측면을 프로그래밍, 제어, 평가 및/또는 조절할 수 있게 한다. 일 예시에서, 상기 시스템은 국제특허출원 공개번호 WO2009/072003 또는 US 20110003380 A1에 기술된 시스템이다. 일 예시에서, 상기 시스템은 국제공개번호 WO2016/073602에 기술된 시스템이다.

A, 세포 배양(Culturing cells)

일 실시예에서, 관류 생물 반응기 백 조립체와 같은, 본 명세서에서 제공된 생물 반응기 백 조립체는 첨가된 세포를 배양하기 위한 세포 배지 및/또는 세포가 예를 들어 공급 포트를 통해 충전될 수 있다. 상기 세포는 예를 들어, 바람직하게는 세포의 확장(expansion) 및/또는 증식을 위해 세포 배양이 요구되는 임의의 세포원(cell source)으로부터 유래될 수 있다. 일 실시예에서, 상기 세포는 대상(subject, 또는 환자)로부터 수득되고, 일차 세포 또는 환자로부터 수득된 일차 세포로부터 유래된 일차 세포와 같은 면역 세포이거나, 면역 세포를 포함한다. 일 양태에서, 상기 세포는 T 세포 또는 NK 세포이거나 또는 이들을 함유한다. 일부 실시예에서, 상기 세포는 CD4+ 및 CD8+ T 세포를 포함한다. 일부 실시예에서, 세포는 CD4+ 또는 CD8+ T 세포를 포함한다.

일부 실시예에서, 배양용 세포는 예를 들어, 세포치료(cell therapy)를 제조, 생산 또는 생성하기 위한 하나 이상의 처리 단계에 따라 생성된 것과 같은 키메라 항원 수용체(chimeric antigen receptor; CAR) 같은 재조합 수용체를 발현시키기 위해 형질 도입된, 조작되거나 조작된 세포이다. 이러한 형질 도입된 세포의 예시 및 하나 이상의 처리 단계는 하기에 기술한다.

일부 실시예에서, 생물 반응기 백 조립체는 하나 이상의 처리(processing) 단계를 수행하는 폐쇄된 시스템 또는 장치에 통합 및/또는 작동 가능한 연결을 위해 및/또는 일체형으로 또는 작동 가능하게 연결되도록 구성된다. 일 예시에서, 상기 시스템은 국제공개번호 WO2016/073602에 기술된 시스템이다. 일부 실시예에서, 상기 시스템은 원심 분리 챔버를 포함하고, 상기 공정은 재조합 수용체를 코딩하는 바이러스 벡터로 형질 도입된 세포를 함유하는 세포 샘플과 같은 배양용 세포 샘플의 원심 챔버의 내부 캐비티(cavity)로부터 제공된 조립체의 생물 반응기 백으로? 발현을 수행하는 것을 포함한다. 일 실시예에서, 상기 백(bag)은 출력 라인(output line) 또는 출력 위치(output position)에서 원심 챔버를 포함하는 시스템에 연결되고, 이로써 후속 배양(culturing) 또는 배양(cultivation)을 위해 챔버의 내부 캐비티로부터 세포를 생물 반응기 백으로 전달한다.

일부 실시예에서, 생물 반응기 백으로 옮겨지거나 채워지는 세포 및 배지의 총 부피는 약 50 mL 내지 5000 mL이고, 예를 들면, 약 300 mL 내지 3000 mL, 300 mL 내지 1500 mL, 300 mL 내지 1000 mL, 300 mL 내지 1000 mL, 300 mL 내지 500 mL, 500 mL 내지 3000 mL, 500 mL 내지 1500 mL, 500 mL 내지 1000 mL, 1000 mL 내지 2000 mL, 1000 mL 내지 1500 mL 또는 1500 mL 내지 2000 mL이다. 일 실시예에서, 생물 반응기 백에 전달되거나 충전된 세포 및 배지의 총 부피는 적어도 약 50 mL, 100 mL, 300 mL, 500 mL, 750 mL, 1000 mL, 1250 mL, 1500 mL, 1750 mL 또는 2000 mL이다. 일부 실시예에서, 생물 반응기 백은 총 부피를 약 300 mL 내지 10 L로 유지할 수 있고, 예를 들면, 약 500 mL 내지 5000 mL, 500 mL 내지 2500 mL, 500 mL 내지 2000 mL, 500 mL 내지 1500 mL, 500 mL 내지 1000 mL, 1000 mL 내지 5000 mL, 1000 mL 내지 2500 mL, 1000 mL 내지 2000 mL, 1000 mL내지 1500 mL, 1500 mL내지 5000 mL, 1500 mL내지 2500 mL, 1500 mL내지 2000 mL, 2000 mL내지 5000 mL, 2000 mL내지 2500 mL 또는 2500 mL내지 5000 mL이다.

일부 양태에서, 배양 배지는 T 세포와 같은 세포의 성장, 배양, 확장(expansion) 또는 증식을 지지하는 개조된 배양 배지이다. 일부 양태에서, 상기 배지는 염, 아미노산, 비타민, 당 또는 이들의 임의의 조합물의 혼합물을 함유하는 액체일 수 있다. 일 실시예에서, 상기 배양 배지는 인큐베이션 중에 세포의 배양, 확장 또는 증식을 자극하기 위한 것과 같은 하나 이상의 자극 조건 또는 자극제를 추가로 함유한다. 일 실시예에서, 자극 조건은 IL-2, IL-7 또는 IL-15로부터 선택되는 하나 이상의 사이토카인(cytokine)이거나 또는 이를 포함한다. 일부 실실예에서, 상기 사이토카인은 재조합 사이토카인(recombinant cytokine)이다.

일 실시예에서, 배양(culturing) 또는 인큐베이션 중 배양 배지 중 하나 이상의 사이토카인의 농도는 독립적으로 약 1 IU/mL 내지 1500 IU/mL이며, 예를 들면,약 1I IU/mL 내지 10 IU/mL 내지 500 IU/mL, 50 IU/mL 내지 250 IU/mL 또는 100 IU/mL 내지 200 IU/mL, 50 IU/mL 내지 1500 IU/mL, 100 IU/mL 내지 1000 IU/mL 또는 200 IU/mL 내지 600 IU/mL이다. 일 실시예에서, 하나 이상의 사이토카인의 농도는 독립적으로 적어도 약 1 IU/mL, 5 IU/mL, 10 IU/mL, 50 IU/mL, 100 IU/mL, 200 IU/mL, 500 IU/mL, 1000 IU/mL 또는 1500 IU/mL이다. 특정 양태에서, 항-CD3 및/또는 항-CD28 항체와 같은 TCR 복합체의 세포 내 신호 전달 도메인을 활성화시킬 수 있는 제제는 인큐베이션 중, 인큐베이션의 적어도 일부 동안 또는 인큐베이션 동안 연속적으로 포함할 수 있다.

일부 양태에서, 본 발명에서 제공되는 관류 백과 같은 생물 반응기 백은 세포 및 배양 배지의 이동 후 적어도 일부 시간 동안 항온 처리된다. 일 실시예에서, 상기 자극 조건은 사람 T 림프구와 같은 1 차 면역 세포의 성장에 적합한 온도를 포함하며, 예를 들면, 적어도 약 25℃, 일반적으로 약 30℃ 및 일반적으로 약 37℃이다. 일 실시예에서, 생물 반응기 백은 25 ~ 38℃, 예컨대 30 ~ 37℃, 예를 들어, 약 37℃±2℃에서 인큐베이션 된다. 일 실시예에서, 배양물, 배양 또는 확장이 원하는 또는 임계 밀도, 세포 수 또는 세포 투여량이 될 때까지의 시간 동안 상기 배양은 수행한다. 일부 실시예에서, 상기 인큐베이션은 약 24 시간, 48 시간, 72 시간, 96 시간, 5 일, 6 일, 7 일, 8 일, 9 일 또는 그 이상 동안 수행한다.

일부 실시예에서, 생물 반응기 백 조립체는 세포 배양 내 목표량의 이산화탄소를 유지하는 조건 하에서 배양된다. 일부 양태에서 이것은 성장하는 동안 세포의 최적 배양, 확대 및 증식을 보장한다. 일부 양태에서, 이산화탄소 (CO₂)의 양은 10% 내지 0% (v/v)이며, 바람직하게는 상기 가스의 8% 내지 2% (v/v)이고, 예를 들어 약 5% (v/v) CO₂이다.

일부 경우, 일 양태에서 생물 반응기는 산소 전달을 증가시킬 수 있도록 움직이거나 흔들릴 수 있다. 생물 반응기를 움직임은 수평축을 따라 회전, 수직축을 따라 회전, 생물 반응기의 기울어진 또는 경사진 수평축을 따라 흔들림, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 일 실시예에서, 인큐베이션의 적어도 일부는 흔들면서 수행된다. 흔들림 속도(rocking speed)및 흔들림 각(rocking angle)은 원하는 교반을 달성하도록 조절할 수 있다. 일부 실시 예에서, 흔들림 각(rock angle)은 20°, 19°, 18°, 17°, 16°, 15°, 14°, 13°, 12°, 11°, 10°, 9°, 8°, 7°, 6°, 5°, 4°, 3°, 2° 또는 1°이다. 특정 실시예에서, 흔들림 각은 6~16°이다. 다른 실시예에서, 흔들림 각은 7 ~ 16°이다. 다른 실시예에서, 흔들림 각은 8~12°사이이다. 일부 실시 양태에서, 흔들림율(rock rate)은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40 rpm이다. 일부 실시예에서, 흔들림율은 4 ~ 12 rpm, 바람직하게는4 및 6 rpm 사이이다.

일부 실시예에서, 인큐베이션의 적어도 일부는 정적 조건(static condition) 하에서 수행된다. 일부 실시예에서, 인큐베이션의 적어도 일부는 소비된 배지를 관류(perfusion)시키고, 배양(culture) 중에 신선한 배지로 관류하는 것과 같은 관류로 수행된다. 일 실시예에서, 상기 방법은 새로운 배양 배지를 세포 배양물로 관류(예:공급 포트를 통해)시키는 단계를 포함한다. 일부 실시예에서, 관류 중에 첨가된 배양 배지는 하나 이상의 자극제, 예를 들면, 하나 이상의 재조합 사이토카인(예: IL-2, IL-7 및/또는 IL-15)를 포함한다. 일부 실시예에서, 관류 중에 첨가된 배양 배지는 정적 인큐베이션(static incubation) 중에 사용되는 동일한 배양 배지이다.

일부 실시예에서, 인큐베이션 후, 생물 반응기 백 조립체는 세포치료(cell therapy)를 제조, 생성 또는 생산하기 위해 시스템(예를 들면, 원심 챔버를 포함하는 시스템)에 재연결된다. 일부 측면에서, 배양된 세포는 배양 세포의 배합을 위해 생물 반응기 백으로부터 챔버의 내부 캐비티(cavity)로 전달된다.

B. 다른 공정 단계(processing steps)

일부 실시예에서, 배양은 세포 공학과 관련하여 하나 이상의 추가 공정 단계(processing step)와 관련하여 수행 될 수 있다. 이러한 하나 이상의 공정 단계는 동일한 폐쇄 시스템의 일부로서 또는 동일한 폐쇄 시스템에 작동 가능하게 연결되어 수행할 수 있다.

일 실시예에서, 하나 이상의 공정 단계는 하나 이상의 하기 단계를 포함할 수 있다. (a) 세포(예를 들어, 전혈(whole blood) 샘플, 버피 코트(buffy coat) 샘플, 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC) 샘플, 비분획 T 세포 샘플, 림프구 샘플, 백혈구 샘플, 성분채집(apheresis) 생성물 또는 백혈구 추출물)를 함유하는 생물학적 샘플을 세척하는 단계, (b) 예를 들어, 면역 친화성-기반의 분리(separation)을 위한 선별 또는 면역 친화성 시약과의 세포 배양에 의한, 샘플로부터 세포의 원하는 서브세트(subset) 또는 세포집단((예를 들어, CD4 + 및 / 또는 CD8 + T 세포)을 분리(isolating)하는 단계, (c) 선택된 세포와 같은 분리된 세포를 바이러스 벡터 입자와 인큐베이션(incubation)하는 단계, (d) 상기 기재된 방법에 따라 세포를 배양(culturing), 인큐베이션 또는 확장(expanding)시키는 단계, 및 (e) 예를 들면, 약학적으로 허용 가능한 완충액, 저온 보존제 또는 다른 적합한 배지에서 수행하여, 형질 도입된(tranduced) 세포를 제제화하는 단계.

일 실시예에서, 상기 방법은 (e) 세포를 바이러스 벡터 입자와 함께 인큐베이션 전, 도중 및/또는 후에 수행할 수 있는 자극 조건에 세포를 노출시킴으로써 세포를 자극하는 단계를 더 포함 할 수 있다. 일 실시예에서, 세포의 희석, 농도 및/또는 완충액 교환과 같은 세척 단계 또는 현탁 단계의 하나 이상의 단계가 또한 상기 단계 중 임의의 단계 이전 또는 이후에 추가적으로 수행될 수 있다.

1. 샘플로부터 세포의 분리 또는 선택(isolation or selection of cells from Samples)

일부 실시예에서, 상기 공정 단계(processing steps)는 특정 질환 또는 상태를 가지거나 세포치료가 필요하거나 또는 세포치료가 적용될 대상(또는 환자)으로부터 수득되거나 대상으로부터 유도된 것과 같은 생물학적 샘플로부터의 세포 또는 이의 조성물의 분리를 포함한다. 일부 양태에서, 상기 대상은 세포가 분리, 가공 및/또는 조작되는 양자세포치료(adoptive cell therapy)와 같은 특정 치료적 개입이 필요한 환자와 같은 사람이다. 따라서, 일부 실시예에서의 세포는 일차 세포, 예컨대 일차 인간 세포이다. 상기 샘플은 조직에서 직접 추출한 조직(tissue), 유체 및 기타 샘플을 포함한다. 상기 생물학적 샘플은 생물학적 소스 또는 처리된 샘플에서 직접 얻은 샘플일 수 있다. 상기 생물학적 샘플로는 혈액, 혈장, 혈청, 뇌척수액, 활액, 소변 및 땀, 조직 및 기관 샘플 (이로부터 추출한 가공 샘플 포함)과 같은 체액이 있으며 이에 국한되지는 않는다.

일부 양태에서, 샘플은 혈액, 혈액 유래 샘플, 성분채집(apheresis) 또는 백혈구 추출물이다. 예시적인 샘플은 전혈(whole blood), 말초 혈액 단핵 세포 (PBMCs), 백혈구, 골수, 흉선, 조직 생검(tissue biopsy), 종양, 백혈병, 림프종, 림프절, 장 관련 림프 조직, 점막 관련 림프 조직, 비장, 기타 림프 조직, 간 결장, 신장, 췌장, 유방, 뼈, 전립선, 자궁 경부, 고환, 난소, 편도선 또는 다른 장기 및/또는 이로부터 유래된 세포로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 포함한다. 세포 치료와 관련하여 샘플은 예를 들어, 양성세포치료, 자가 및 동종 소스(source) 샘플을 포함한다.

일부 예에서, 대상(또는 환자)의 순환 혈액으로부터의 세포는 예컨대 성분채집(apheresis) 또는 백혈구 제거에 의해 수득된다. 상기 샘플은 T 세포, 단핵구, 과립구, B 세포, 다른 유핵 백혈구, 적혈구 및/또는 혈소판을 비롯한 일부 림프구를 포함하며, 일부 양태로는 적혈구 및 혈소판 이외의 세포를 포함한다.

일 실시예에서, 대상(또는 환자)로부터 수집된 혈액 세포는 예를 들어, 혈장 분획을 제거하고 후속 공정 단계를 위해 적절한 완충액 또는 배지에 세포를 놓기 위해 세척된다. 일 실시예에서, 상기 세포는 인산완충 식염수(PBS)로 세척한다. 일 실시예에서, 세척 용액은 칼슘 및/또는 마그네슘 및/또는 또는 모든 2가 양이온을 결여되어 있다. 일측면에서, 세척 단계는 반자동 "플로우 스루(flow-through)" 원심 분리기(예:Cobe 2991 세포 프로세서, Baxter)로 제조사의 지침에 따라 수행한다. 몇 양태에서, 세척 단계는 제조자의 지시에 따라 TFF(tangential flow filtration)에 의해 수행된다. 일 실시예에서, 상기 세포는 세척 후 다양한 생체 적합성 완충액, 예를 들어, Ca⁺⁺/Mg⁺⁺가 없는 PBS에 재현탁된다. 특정 실시예에서, 혈액 세포 샘플의 성분을 제거하고 세포를 배양 배지에 직접 재현탁시킨다.

일 실시예에서, 제조 방법은 형질 도입 및 공학을 위한 분리, 선별 및/또는 농축 및/또는 인큐베이션 전 또는 후에 세포를 동결, 예컨대 저온 보존하는 단계를 포함한다. 일부 실시예에서, 동결 및 후속 해동 단계는 과립구 및 어느 정도는 세포 집단 내의 단핵구를 제거한다. 일부 실시예에서, 세포는 동결 용액에 현탁된다(예를 들어, 혈장 및 혈소판을 제거하기 위한 세척 단계). 임의의 다양한 공지된 동결 용액 및 파라미터(parameters)가 사용될 수 있다. 일례는 20% DMSO 및 8% HAS(human serum albumin) 또는 다른 적합한 세포 동결 배지를 함유하는 PBS를 사용하는 것을 포함한다. 그런 다음 DMSO와 HSA의 최종 농도가 각각 10%와 4%가 되도록 배지로 1:1로 희석한다. 이어서, 세포를 일반적으로 분당 1°의 속도로 -80℃로 동결시키고 액체 질소 저장 탱크의 증기 상에 저장한다.

일부 실시예에서, 세포 또는 개체군의 분리는 하나 이상의 제조 및/또는 비친화성에 기초한 세포 분리 단계(separaton steps)를 포함한다. 일부 예에서, 예를 들어 원치 않는 성분을 제거하고, 원하는 성분을 풍부하게 하고, 특정 시약에 민감한 세포를 용해시키거나 제거하기 위한, 세척, 원심 분리 및/또는 하나 이상의 시약의 존재 하에서 세포를 배양한다. 일부 예에서, 밀도, 부착 성질, 크기, 민감성 및/또는 특정 성분에 대한 내성과 같은 하나 이상의 특성에 기초하여 새포는 분리된다. 일 실시예에서, 상기 방법은 적혈구를 용해시켜 퍼콜(Percoll) 또는 피콜(Ficoll) 구배를 통해 원심 분리하여 말초 혈액으로부터 백혈구를 제조하는 것과 같은 밀도-기반 세포 분리 방법을 포함한다.

일부 실시예에서, 선별 단계(selections step)의 적어도 일부는 선별시약(selection reagent)과 함께 세포를 인큐베이션하는 것을 포함한다. 예를 들어, 선별 방법의 일부로서, 선별 시약 또는 시약과의 인큐베이션은 표면 마커(예:표면 단백질, 세포 내 마커 또는 핵산)와 같은 하나 이상의 특정 분자의 세포 내 또는 세포 상에서의 발현 또는 존재에 기초하여, 하나 이상의 상이한 세포 유형의 선별을 위한 하나 이상의 선별 시약을 사용하여 수행할 수 있다. 일부 실시예에서, 그러한 마커에 기초한 선별을 위한 선별 시약 또는 시약을 사용하는 임의의 공지된 방법이 사용될 수 있다. 일부 실시예에서, 선별 시약 또는 시약은 친화도 또는 면역 친화성-기반 선별을 초래한다.

일부 양태에서, 예를 들면, 상기 선별은 세포의 발현 또는 하나 이상의 마커, 전형적으로 세포 표면 마커의 발현 수준에 기초한 세포 및 세포 집단의 분리를 위한 시약과의 인큐베이션을 포함하며, 이러한 마커에 특이적으로 결합하는 항체 또는 결합 파트너와의 인큐베이션에 의해, 일반적으로 항체 또는 결합 파트너에 결합된 세포를 항체 또는 결합 파트너에 결합하지 않은 세포로부터 세척 및 분리한다.

이러한 공정의 일부 양태에서, 일정량의 세포가 바람직한 친화성 선별 시약의 양과 혼합된다. 면역 친화성에 기초한 선별은 분리된 세포와 세포상의 마커에 특이 적으로 결합하는 분자, 예를 들어 고체 표면(예: 입자) 상의 항체 또는 다른 결합 파트너간에 유리한 에너지 상호 작용을 일으키는 임의의 시스템 또는 방법을 사용하여 수행 될 수 있다. 일부 실시에에서, 방법은 비드(beads)와 같은 입자를 사용하여 수행된다. 예컨데, 상기 비드는 세포의 마커에 특이적인 선별 시약(예: 항체)로 코팅된 자성 비드이다. 에너지적으로 선호되는 상호 작용을 촉진 시키는데 도움을 주기 위해 일정한 세포 밀도 대 입자 (예를 들면, 비드) 비율로 흔들거나 혼합하면서 튜브 또는 백과 같은 용기에서 상기 입자(예를 들면, 비드)는 세포와 함께 배양되거나 혼합될 수 있다. 다른 경우, 상기 선별(selection)의 전부 또는 일부가 수행되는 세포의 선별을 포함하고, 원심 챔버(예: 원심 회전 하에서)의 내부 캐비티(cavity)에서 수행한다. 일부 실시예에서, 면역 친화성-기반 선별 시약과 같은 선별 시약과의 세포 인큐베이션은 원심 챔버에서 수행된다. 특정 실시예에서, 상기 분리(isolation) 또는 선별(selection)은 국제특허출원, 공개번호 WO2009/072003 또는 US 20110003380 A1에 기재된 시스템, 기구 또는 장치를 사용하여 수행된다. 일 예시에서, 상기 시스템은 국제공개번호 WO2016/073602에 기술된 시스템이다.

일부 실시예에서, 원심 챔버의 캐비티(cabity)에서 그러한 선별 단계 또는 그의 부분(예를 들어, 항체-코팅된 입자, 예: 자성 비드와의 인큐베이션)을 수행함으로써, 사용자는 다양한 용액의 부피, 공정상 용액의 추가 및 그 시기와 같은 특정 파라미터를 제어할 수 있으며, 이는 다른 이용 가능한 방법과 비교하여 장점을 제공할 수 있다. 예를 들어, 인큐베이션 중에 캐비티의 액체 부피를 감소시키는 능력은 선별에 사용된 입자(예: 비드 시약)의 농도를 증가시킬 수 있으며, 따라서, 캐비티 내 세포의 전체 양의 영향 없이 용액의 화학적인 가능성을 증가시킬 수 있다. 이것은 차례대로 처리되는 세포와 선별에 사용되는 입자 사이의 쌍방향 상호 작용을 향상시킬 수 있다. 일부 실시예에서, 예를 들어, 본 명세서에 기술된 바와 같은 시스템, 회로 및 컨트롤(control)과 관련된 챔버에서 인큐베이션 단계를 수행함으로써, 사용자는 인큐베이션 동안 원하는 시간에 용액의 교반을 수행할 수 있으며, 또한, 상기 상호 작용을 향상시킬 수 있다.

일부 실시예에서, 선별 단계의 적어도 일부는 선별 시약과 세포의 인큐베이션을 포함하는 원심 챔버에서 수행된다. 이러한 공정의 일부 양태에서, 원하는 친화성에 기초한 선별 시약와 혼합된 세포의 부피는 제조사의 지시에 따라 동일한 수의 세포 및/또는 부피의 세포를 선별하기 위해 튜브 또는 용기에서 유사한 선별을 수행할 때 통상적으로 사용되는 것보다 훨씬 적다. 일 실시예에서, 선별 시약 또는 시약의 양은 제조자의 지시에 따른 동일한 수의 세포 및/또는 세포에 대한 튜브 또는 용기-기재 인큐베이션에서 세포의 선별에 사용된 동일한 선별 시약의 양의5% 이하, 10% 이하, 15% 이하, 20% 이하, 25% 이하, 50% 이하, 60% 이하, 70% 이하, 80% 이하이다.

일 실시예에서, 선별(예:면역 친화도에 기초한 세포 선별)을 위해, 상기 세포는 농축 및/또는 고갈시키고자 하는 세포상의 표면 마커에 특이적으로 결합하지만 조성물 내의 다른 세포에는 결합하지 않는 분자(예를 들어, 항체)와 같은 선별 시약을 갖는 선별 완충액을 포함하는 조성물로 챔버의 캐비티에서 배양되며, 상기 항체는 예를 들어 CD4 및 CD8에 특이적인 단클론(monoclonal) 항체에 결합된 자기 비드(magnetic beads)와 같은 비드와 같은 중합체 또는 표면과 같은 골격에 선택적으로 커플링 되는 항체를 포함할 수 있다. 기재된 바와 같이, 일 실시예에서, 상기 선별 시약은 전형적으로 사용되거나, 흔들기 또는 회전을 갖는 튜브 내에서 선별이 수행될 때 동일한 수의 세포 또는 동일한 부피의 세포를 선별하는 것과 거의 동일하거나 유사한 효율을 달성하는데 필요한 선별 시약의 양에 비하여, 실질적으로 적은 양(예를 들어, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70% 또는 80% 이하의 양)으로 챔버의 공동 내의 세포에 첨가된다. 일 실시예에서, 상기 인큐베이션은 시약의 배양과 함께 목표 부피(예를 들어, 10 mL 내지 200 mL, 예를 들면 약 20 mL, 30 mL, 40 mL, 50 mL, 60 mL, 70 mL, 80 mL, 90 mL, 100 mL, 150 mL 또는 200 mL)를 달성하기 위해 세포 및 선별 시약에 대한 선별 완충액이 첨가되어 수행된다. 일부 실시예에서, 선별 완충액 및 선별 시약은 세포에 첨가되기 전에 예비 혼합된다. 일부 실시예에서, 선별 완충액 및 선별 시약은 세포에 개별적으로 첨가된다. 일부 실시예에서, 선별 인큐베이션(selection incubation)은 주기적인 온화한 혼합 조건에서 수행되며, 그것은 에너지적으로 선호되는 상호 작용을 촉진시키는데 도움을 줄 수 있고, 따라서 선택 효율을 높이면서도 전체으로 선별 시약을 덜 사용할 수 있게 한다.

일 실시예에서, 선별 시약을 사용한 인큐베이션의 총 지속 시간은 5분 내지 6시간이며, 예를 들어, 30분 내지 3 시간, 예를 들어 적어도 약 30분, 약 60분, 120분 또는 180분이다.

일 실시예에서, 상기 인큐베이션은 일반적으로 약 80 g ~ 100 g(예를 들어, 약 80 g, 85 g, 90 g, 95 g 또는 100 g)의 챔버 또는 다른 용기의 샘플 또는 벽에서의 RCF와 같이, 약 600 rpm ~ 1700 rpm(예를 들면, 약 600 rpm 이상, 약 1000 rpm 이상, 약 1500 rpm 이상 또는 1700 rpm)에서 또는 그와 같이 세포를 펠렛화 하기 위해 사용되는 속도보다 낮은 속도와 같은 상대적으로 낮은 힘 또는 속도로 방적(spinning)의 존재 하의 혼합 조건 하에서 수행된다.

일부 실시예에서, 상기 스핀(spin)은 그러한 저속에서의 스핀 및 휴지기의 시핀 간격을 반복하여 수행하고, 스핀 및/또는 휴지기는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10초이고, 바람직하게는 스핀은 약 1 또는 2초의 스핀을 한 후, 약 5, 6, 7 또는 8초의 휴지기 취한다.

일부 실시예에서, 이러한 공정(process)는 챔버가 통합된 완전히 폐쇄된 시스템 내에서 수행된다. 일부 실시예에서, 이 공정(및 일부 측면에서, 예를 들어, 성분채집(apheresis) 샘플과 같은 세포를 함유하는 샘플을 세척하는 이전의 세척 단계와 같은 하나 이상의 추가 단계)은 자동화된 방식으로 수행되어, 세포, 시약 및 다른 구성 요소는 자동화된 프로그램을 사용하여 단일 폐쇄 시스템에서 세척 및 결합 단계를 완료하기 위해 적절한 시간 및 원심 분리에 의해 챔버 내로 유입되고, 챔버로부터 압출되도록 한다.

일부 실시예에서, 세포 및 선별 시약 및/또는 시약의 인큐베이션 및/또는 혼합 후에, 인큐베이션된 세포는 특정 시약 또는 시약의 존재 또는 부재에 기초하여 세포를 선별을 위해 분리된다. 일부 실시예에서, 상기 분리는 세포의 선별 시약과의 인큐베이션이 수행되는 동일한 폐쇄 시스템에서 수행된다. 일부 실시예에서, 선별 시약과의 인큐베이션 후, 선별 시약이 결합된 세포를 포함하여, 세포의 면역 친화성 기반 분리를 위한 시스템으로 전달된다. 일부 실시예에서, 면역 친화성-기재 분리를 위한 시스템은 자기 분리 컬럼(magnetic separation column)이거나 이를 포함한다.

그러한 분리 단계(separation step)는 시약(예를 들어, 항체 또는 결합 파트너)을 결합한 세포가 추후 사용을 위해 보유된 양성 선별(positive selection) 및/또는 시약(예를 들어, 항체 또는 결합 파트너)을 결합되지 않은 세포가 보유되는 음성 선별(negative selection)에 기초할 수 있다. 일부 예에서, 두 분획은 추후 사용을 위해 보유된다. 일부 양태에서, 음성 선별은 이종 집단에서 세포 유형을 특이적으로 식별하는 항체가 이용 가능하지 않은 경우에 특히 유용할 수 있으며, 분리가 원하는 집단 이외의 세포에 의해 발현된 마커에 기초하여 수행되는 것이 바람직하다.

일부 실시예에서, 상기 공정 단계는 친화도-기반 선별을 수행할 수 있는 시스템 또는 장치를 사용하는 것과 같이, 배양된 세포 및 세포의 음성 및/또는 양성 선별을 추가로 포함한다. 일부 실시예에서, 단리(isolation)는 양성 선별에 의한 특정 세포 집단에 대한 농축에 의해 수행되거나 또는 음성 선별에 의한 특정 세포군의 고갈에 의해 수행된다. 일 실시예에서, 양성 또는 음성 선별은 하나 이상의 항체 또는 다른 결합제와 세포를 인큐베이션 수행하여, 상기 결합제는 양성 또는 음성으로 선택된 세포 상에 상대적으로 높은 수준(markerhigh)으로 발현 또는 발현된 하나 이상의 표면 마커(marker⁺)에 특이적으로 결합한다

상기 분리(separation)는 특정 세포 집단 또는 특정 마커를 발현하는 세포의 100% 농축 또는 제거를 할 필요는 없다. 예를 들어, 마커를 발현하는 세포와 같은 특정 유형의 세포에 대한 양성 선별 또는 농축(enrichment)은 그러한 세포의 수 또는 백분율을 증가시키는 것을 말하지만, 마커를 발현하지 않는 세포가 완전히 없게 할 필요는 없다. 마찬가지로, 마커를 발현하는 것과 같은 특정 유형의 세포의 음성 선별, 제거 또는 고갈(depletion)은 그러한 세포의 수 또는 백분율을 감소시키는 것을 의미하지만, 그러한 모든 세포를 완전히 제거할 필요는 없다.

일부 예에서, 하나의 단계로부터 양성 또는 음성으로 선택된 분획이 후속의 양성 또는 음성 선별과 같은 또 다른 분리 단계를 거치는 다중 단계의 분리 단계가 수행된다. 일부 실시예에서, 각각 음성 선별을 목표로 하는 마커에 특이적인 복수의 항체 또는 결합 파트너와 함께 세포를 인큐베이션 함으로써, 단일 분리 단계는 복수의 마커를 동시에 발현하는 세포를 고갈(deplete)시킬 수 있다. 마찬가지로, 여러 세포 유형은 다양한 세포 유형에서 발현되는 복수의 항체 또는 결합 파트너와 함께 세포를 인큐베이션 함으로써 동시에 양성으로 선별될 수 있다. 일부 양태에서, 예를 들면, CD28+, CD62L+, CCR7+, CD27+, CD127+, CD4+, CD8+, CD45RA+ 및/또는 CD45RO+ 및/또는 CD45RO+ T 세포와 같은 하나 이상의 표면 마커를 양성 또는 발현하는 세포와 같은, T 세포의 특정 하위 집단(subpopulations)은, 양성 선별 또는 음성 선별 기술에 의해 분리된다. 일 실시예에서, 이러한 세포는 그러한 마커와 특이적 결합하는 하나 이상의 항체 또는 결합 파트너와 배양에 의해 선별된다. 일부 실시예에서, 상기 항체 또는 결합 파트너는 자석 비드 또는 상자성 비드(paramagnetic bead)와 같은, 선별을 행하기 위한 고체 지지체 또는 매트릭스에 직접 또는 간접적으로 접합될 수 있다. 예를 들어, CD3+, CD28+ T 세포는 CD3/CD28 접합 자성 비드(예: DYNABEADS^® M-450 CD3/CD28 T 세포 확장기(cell expander) 및/또는 ExpACT^® 비드) 사용을 긍정적으로 선택할 수 있다.

일부 실시예에서, T 세포는 B 세포, 단구(monocytes) 또는 다른 백혈구(예: CD14)와 같은 비-T 세포에서 발현된 마커의 음성 선별에 의해 PBMC 샘플로부터 분리된다. 일부 양태에서, CD4+ 또는 CD8+ 선별 단계는 CD4+ 헬퍼(helpere) 및 CD8+ 세포 독성 T 세포를 분리하는데 사용된다. 이러한 CD4+ 및 CD8+ 모집단은 발현된 마커 또는 하나 이상의 나이브(na

ve), 기억 및/또는 작동자 T 세포 하위 집단에서 상대적으로 높게 발현된 마커에 대한 양성 또는 음성 선별에 의해 하위 집단으로 추가적으로 분류될 수 있다.

일부 실시예에서, CD8+ 세포는 각각의 부분 집단과 관련된 표면 항원에 기초한 양성 또는 음성 선별에 의한 것과 같이, 나이브(na

ve), 중추성 기억(central memory), 작동자 기억(effector memory) 및/또는 중추성 기억 줄기 세포(central memory stem cells)에 대해 더욱 농축되거나 소진된다. 일 실시예에서, TCM(central memory T) 세포의 농축은 투여 후 장기 생존, 확장 및/또는 생착을 개선시키는 것과 같은 효능을 증가시키기 위해 수행되며, 어떤 면에서 이러한 하위 집단에서 특히 강력하다. 참조 : Terakura 등., (2012) Blood.1 : 72-82; Wang et al. (2012) J Immunother. 35 (9) : 689-701. 일부 실시예에서, TCM-농축 CD8+ T 세포 및 CD4+ T 세포를 결합시키는 것은 효능을 추가로 강화시킨다.

일 실시예에서, 기억 T 세포는 CD8+ 말초 혈액 림프구의 CD62L+ 및 CD62L- 서브 세트 모두에 존재한다. PBMC는 항-CD8 및 항-CD62L 항체를 사용하는 것과 같이 CD62L-CD8+ 및/또는 CD62L+CD8+ 분획물을 농축하거나 소진시킬 수 있다.

일 실시예에서, 중추 신경계 T(TCM) 세포에 대한 농축은 CD45RO, CD62L, CCR7, CD28, CD3 및/또는 CD127의 양성 또는 높은 표면 발현에 기초한다; 일 양태에서, 이는 CD45RA 및/또는 그랜자임 B(granzyme B)를 발현하거나 고발현하는 세포에 대한 음성 선별에 기초한다. 일 양태에서, TCM 세포에 대해 농축된 CD8+ 집단의 분리(isolation)는 CD4, CD14, CD45RA를 발현하는 세포의 소진 및 CD62L을 발현하는 세포에 대한 양성 선별 또는 농축에 의해 수행된다. 한 양태에서, 중추 신경계 T(TCM) 세포에 대한 농축은 CD4 발현에 기초하여 선택된 세포의 음성 분획부터 시작하여 수행하며, 이는 CD14 및 CD45RA의 발현에 기초한 음성 선별 및 CD62L에 기초한 양성 선택에 영향을 받는다. 일부 측면에서 이러한 선택은 동시에 수행되고 다른 측면에서는 어느 순서로 순차적으로 수행한다. 또한, 일부 양태에서, CD8+ 세포 집단 또는 부분 집단을 제조하는데 사용된 동일한 CD4 발현-기반 선별 단계는 CD4+ 세포 집단 또는 하위 집단을 생성하는데 사용되며, 선택적으로 하나 이상의 추가적인 CD4-기반 분리로부터의 양성 또는 음성 선별 단계를 따르는 방법의 후속 단계에서 양성 및 음성 분획 모두가 보유되고 사용된다. 일부 실시예에서, CD4+ 세포 집단에 대한 선별 및 CD8+ 세포 집단에 대한 선별은 동시에 수행된다. 일부 실시예에서, CD4+ 세포 집단 및 CD8+ 세포 집단에 대한 선별은 임의의 순서로 순차적으로 수행된다. 일부 실시예에서, 세포를 선별하는 방법은 공개된 U.S. App. US20170037369에 개시된 내용을 포함한다. 일부 실시예에서, 선별된 CD4+ 세포 집단 및 선별된 CD8+ 세포 집단은 선별 후 조합될 수 있다. 일부 양태에서, 선별된 CD4+ 세포 집단 및 선택된 CD8+ 세포 집단은 본 명세서에 기재된 바와 같이 생물 반응기 백에서 조합될 수 있다.

특정 예에서, PBMC 샘플 또는 다른 백혈구 샘플은 CD4+ 세포의 선별에 종속되며, 여기에서 음성 및 양성 분획물 모두를 보유(retaine)한다. 이어서, 음성 분획은 CD14 및 CD45RA 또는 CD19의 발현에 기초한 음성 선별에 종속되고, 양성 분획은 CD62L 또는 CCR7과 같은 중추 신경계 T 세포의 마커에 기초하며, 여기서, 양성 및 음성 선별은 어느 순서로도 수행된다.

CD4+ T 헬퍼 세포는 세포 표면 항원을 갖는 세포 집단을 동정함으로써 나이브(naive), 중추성 기억(central memory), 작동자 기억(effector memory) 세포로 분류 될 수 있다. CD4+ 림프구는 표준 방법으로 얻을 수 있다. 일 실시예에서, 나이브(naive) CD4+ T 림프구는 CD45RO-, CD45RA+, CD62L+ 또는 CD4+ T 세포이다. 일 실시예에서, 중추성 기억 CD4+ 세포는 CD62L+ 및 CD45RO+이다. 일 실시예에서, 작동자 CD4+ 세포는 CD62L- 및 CD45RO-이다.

일례에서, 음성 선별에 의한 CD4+ 세포를 농축하기 위해, 단클론 항체 칵테일(monoclonal antibody cocktail)은 전형적으로 CD14, CD20, CD11b, CD16, HLA-DR 및 CD8에 대한 항체를 포함한다. 일부 실시예에서, 항체 또는 결합 파트너는 양성 및/또는 음성 선별을 위한 세포의 분리를 허용하기 위해 자기 비드(magnetic bead) 또는 상자성 비드(paramagnetic bead)와 같은 고체 지지체 또는 매트릭스에 결합된다.

일 실시예에서, 예를 들면, 상기 세포 및 세포 집단은 면역 자기(또는 친화력 자기) 분리 기술(Methods in Molecular Medicine, 제 58 권 : 전이 리서치 프로토콜, 2 권 : 세포 행동 in vitro 및 in Vivo, p 17-25 편집자 : SA Brooks and U. Schumacher ⓒ Humana Press Inc., Totowa, NJ)을 사용하여 분리 또는 단리된다.

일부 양태에서, 분리될 세포의 배양된 샘플 또는 조성물은 자기 적 반응성 입자 또는 상자성 비드와 같은 미립자(예 : Dynalbeads 또는 MACS^® 비드)와 같은, 작고 자화 가능한(magnetizable) 또는 자기 반응 물질을 포함하는 선별 시약(selection reagent)와 배양된다. 자기 반응 물질(예를 들어, 입자)은 일반적으로 세포 또는 세포 집단에 존재하는 분자(예:표면 마커)에 특이적으로 결합하는 결합 파트너(예: 항체)에 직접 또는 간접적으로 부착되며, 음성 또는 양성으로 선별하는 것이 바람직하다.

일부 실시예에서, 자성 입자 또는 비드는 항체 또는 다른 결합 파트너와 같은 특정 결합 부재(binding member)에 결합된 자기 반응 물질을 포함한다. 자기 분리 방법에 사용하기 위한 많은 자기 반응 재료가 공지되어 있다. 예를 들어, Molday, U.S. Pat. 미국 특허 제4,452,773호, 및 유럽 특허 EP 452342B에 개시되어 있으며, 이는 본 명세서에 참고로 인용된다. 또한, Owen U.S. Pat. 미국 특허 제4,795,698호 및 Liberti 등의 미국 특허 제5,200,084 호에 개시된 콜로이드 크기의 입자가 사용될 수 있다.

상기 인큐베이션은 일반적으로 항체, 결합 파트너, 또는 이차 항체 또는 다른 시약과 같은 분자 하에서 수행하며, 자성 입자 또는 비드에 부착된 그러한 항체 또는 결합 파트너에 특이적으로 결합하는 항체는 샘플 내의 세포 상에 존재한다면 세포 표면 분자에 특이적으로 결합한다

특정 실시예에서, 자기 응답 입자는 1 차 항체 또는 다른 결합 파트너, 2 차 항체, 렉틴, 효소 또는 스트렙타비딘(streptavidin)에 코팅된다. 특정 실시예에서, 자성 입자는 하나 이상의 마커에 특이적인 1 차 항체의 코팅을 통해 세포에 부착된다. 특정 실시예에서, 비드 보다는 세포가 1차 항체 또는 결합 파트너에 표지되고, 이이서 세포-유형 특이적인 2차 항체 또는 자성 입자가 코팅된 다른 결합 파트너(예: 스트렙타비딘)가 첨가된다. 특정 실시예에서, 자성 입자가 코팅된 스트렙타비딘은 비오틴이 부착된(biotinylated) 1차 또는 2차 항체와 함께 사용된다.

몇몇 양태에서, 선별은 샘플을 자기장 내에 배치하고, 자기적으로 반응하는 또는 자화 가능한 입자가 부착된 세포가 자석에 끌려서 비표지된 세포로부터 분리됨으로써 수행된다. 양성 선별의 경우, 자석에 끌리는 세포는 유지된다; 음성 선별의 경우, 자석에 끌리지 않는 세포(비표지 세포)는 유지된다. 일부 양태에서, 양성 및 음성 선별의 조합은 동일한 선별 단계 동안 수행하고, 여기서, 양성 및 음성 분획물은 유지되고, 추가적으로 처리되거나 또는 추가적인 분리 단계를 거친다.

일부 실시예에서, 친화성-기재 선별은 자기-활성 세포 분류(MACS) (Miltenyi Biotech, Auburn, CA)를 통해 이루어진다. 자기-활성 세포 분류(예를 들어, CliniMACS 시스템)는 자성 입자가 부착된 세포를 고순도로 선별할 수 있다. 특정 실시예에서, MACS는 비표적 종(species) 및 표적 종을 외부 자기장에 적용 후에 순차적으로 용출시키는 모드에서 작동한다. 즉, 자화된 입자에 부착된 세포는 부착되지 않은 세포가 용출되는 동안 위치를 유지한다. 이어서, 이 첫 번째 용출 단계가 완료된 후, 자기장에 포획되어 용출되는 것이 방지된 세포를 용출 및 회수할 수 있는 방법은 다양한 방법을 자유롭게 사용할 수 있다. 특정 실시예에서, 상기 비표적 세포는 표지되고 소진된다.

일부 실시예에서, 상기 자기 반응 입자는 후속적으로 인큐베이션 된(incubated), 배양된(cultured) 및/또는 조작되는(engineered) 세포에 부착된 채로 남게 된다. 몇몇 양태에서, 상기 입자는 환자에게 투여하기 위해 세포에 부착된 상태로 남는다. 일 실시예에서, 자화 가능한 입자 또는 자기 반응 입자는 상기 세포로부터 제거된다. 세포로부터 자화 가능한 입자를 제거하는 방법은 공지되어 있으며, 예를 들어, 경쟁 비표지된 항체, 자화 가능한 입자 또는 절단 가능한 링커에 접합된 항체 등을 포함한다. 일부 실시예에서, 자화 가능한 입자는 생분해성이다.

2. 유전 공학(Genetic Engineering)

일부 실시예에서, 공정 단계(processing steps)는 재조합 단백질을 코딩하는 핵산 분자의 도입을 포함한다. 이러한 재조합 단백질의 예시는 섹션 III에 기술된 것과 같은 재조합 수용체이다. 세포 내에서 재조합 수용체와 같은 재조합 단백질을 코딩하는 핵산 분자의 도입은 다수의 공지된 벡터 중 임의의 것을 사용하여 수행할 수 있다. 그런 벡터로는 렌티 바이러스(lentiviral) 및 감마레트로 바이러스(gammaretroviral) 시스템뿐만 아니라, PiggyBac 또는 슬리핑뷰티(Sleeping Beauty)-기반 유전자 전달 시스템과 같은 전위유전단위(transposon) 기반 시스템을 포함하는 바이러스 및 비-바이러스 시스템을 포함한다. 예시적인 방법은 바이러스(예를 들어, 레트로 바이러스(retroviral) 또는 렌티 바이러스(lentivira), 형질 도입(transduction), 전위유전단위 및 전기천공법(electroporation))을 포함하는 수용체를 코딩하는 핵산의 전달을 위한 방법을 포함한다.

일부 실시예에서, 유전자 전달(gene transfer)은 먼저 세포를 자극함으로써 이루어지며, 예를 들어, 사이토카인 또는 활성화 마커의 발현에 의해 측정된 바와 같은 증식, 생존 및/또는 활성화와 같은 반응을 유도하는 자극과 결합시킨 후, 이어서 활성화된 세포의 형질 도입 및 배양물의 임상적 적용을 위한 충분한 수의 확장에 의한 것이다.

일부 실시예에서, 재조합 핵산은 재조합 감염성 바이러스 입자, 예를 들어, 시미안(simian) 바이러스 40(SV40), 아데노 바이러스(adenoviruses), AAV(adeno-associated virus)로부터 유래된 벡터와 같은 세포를 사용하여 세포 내로 전달된다. 일부 실시예에서, 재조합 핵산은 재조합 렌티 바이러스 벡터 또는 레트로 바이러스 벡터, 예컨대 감마-레트로 바이러스 벡터를 사용하여 T 세포로 전달된다(참조 : Koste 등. (2014) Gene Therapy 2014 Apr 3. doi: 10.1038/gt.2014.25; Carlens 등. (2000) Exp Hematol 28(10): 1137-46; Alonso-Camino 등. (2013) Mol Ther Nucl Acids 2, e93; Park 등., Trends Biotechnol. 2011 November 29(11): 550-557).

일부 실시 양태에서, 레트로 바이러스 벡터는 예를 들어, MoMLV(the Moloney murine leukemia virus), MPSV(myeloproliferative sarcoma virus), MESV(murine embryonic stem cell virus), MSCV(murine stem cell virus), SFFV(spleen focus forming virus), 또는 AAV(adeno-associated virus)로부터 유래된 레트로 바이러스 벡터와 같은 LTR(long terminal repeat sequence)를 가진다. 대부분의 레트로 바이러스 벡터는 마우스(mouse) 레트로 바이러스 유래 벡터이다. 일부 실시예에서, 레트로 바이러스는 조류 또는 포유류 세포 공급원으로부터 유도된 것들을 포함한다. 레트로 바이러스는 전형적으로 인간을 포함하는 여러 종의 숙주 세포를 감염시킬 수 있음을 의미하는 양친매성 (amphotropic)이다. 일 실시예에서, 발현될 유전자는 레트로 바이러스 개그(gag), 폴(pol) 및/또는 env 서열(env sequences)를 대체한다. 다수의 예시적인 레트로 바이러스 시스템이 공지되어 있다(예를 들면, U.S. Pat. Nos. 5,219,740; 6,207,453; 5,219,740; Miller and Rosman (1989) BioTechniques 7:980-990; Miller, A. D. (1990) Human Gene Therapy 1:5-14; Scarpa 등. (1991) Virology 180:849-852; Burns 등. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:8033-8037; and Boris-Lawrie and Temin (1993) Cur. Opin. Genet. Develop. 3:102-109).

렌티 바이러스 형질 도입 방법이 알려져 있다. 예시적인 방법이 공지되어 있다(예를 들면, Wang et al. (2012) J. Immunother. 35(9): 689-701; Cooper 등. (2003) Blood. 101:1637-1644; Verhoeyen 등. (2009) Methods Mol Biol. 506: 97-114; and Cavalieri 등. (2003) Blood.　 102(2): 497-505.).

일부 실시예에서, 재조합 핵산은 전기 천공을 통해 T 세포로 전달된다(참조: Chicaybam et al, (2013) PLoS ONE 8(3): e60298 and Van Tedeloo 등. (2000) Gene Therapy 7(16): 1431-1437). 일부 실시예에서, 재조합 핵산은 전이(transposition)를 통해 T 세포로 전달된다(참조: Manuri 등. (2010) Hum Gene Ther 21(4): 427-437; Sharma 등. (2013) Molec Ther Nucl Acids 2, e74; and Huang 등. (2009) Methods Mol Biol 506: 115-126). 면역 세포에서 유전 물질을 도입하고 발현시키는 다른 방법은 인산 칼슘 형질 감염(참조 :Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York. N.Y.), 원형질체 융합(protoplast fusion), 양이온성 리포좀 매개 형질 감염; 텅스텐 입자 촉진 미세 입자 포격(tungsten particle-facilitated microparticle bombardmen, (Johnston, Nature, 346: 776-777 (1990))) 및 스트론튬인산염 DNA 공침전(Brash 등., Mol. Cell Biol., 7 : 2031-2034 (1987))을 포함한다.

재조합 산물을 코딩하는 핵산의 전달을 위한 다른 접근법 및 벡터는 예를 들어 국제특허출원, 공개번호 WO2014055668 및 미국특허 제7,446,190호에 기재된 것이다.

일부 실시예에서, 세포(예를 들어, T 세포)는 T 세포 수용체(TCR) 또는 키메라 항원 수용체(CAR)로 확장(expansion) 도중 또는 후에 형질 주입될(transfected) 수 있다. 원하는 수용체 도입을 위한 이러한 형질 주입(transfection)은 예를 들어 임의의 적합한 레트로 바이러스 벡터(retroviral vector)로 수행할 수 있다. 유전적으로 변형된 세포 집단은 초기 자극(예: CD3/CD28 자극)으로부터 유리될 수 있고, 이어서 제2유형의 자극(예를 들어, 새롭게 도입된 수용체를 통해)으로 자극 받을 수 있다. 이 제2유형의 자극은 펩타이드/MHC 분자의 형태의 항원 자극(antigenic stimulus), 유전적으로 도입된 수용체의 동족(가교) 리간드(예: CAR 천연 리간드) 또는 새로운 수용체의 골격 내에 직접 결합(예: 수용체 내에서 불변 영역을 인식함으로써)하는 임의의 리간드(예: 항체)를 포함할 수 있다. 예를 들어, Cheadle 등의 " Chimeric antigen receptors for T-cell based therapy(T 세포 기반 치료를 위한 키메라 항원 수용체)" Methods Mol Biol. 2012; 907 : 645-66 또는 Barrett 등의 암을 위한 키메라 항원 수용체 치료 의학 Vol. 65 : 333-347 (2014)]에 기재되어 있다.

어떤 경우에는, 세포, 예를 들어, T 세포가 활성화 될 필요가 없는 벡터가 사용될 수 있다. 일부의 경우에, 상기 세포는 활성화 전에 선택 및/또는 형질 도입될 수 있다. 따라서, 상기 세포는 세포 배양 전 또는 배양 후, 경우에 따라서는 배양의 적어도 일부분과 동시에 또는 동시에 배양한다.

일부 양태에서, 상기 세포는 추가로 사이토카인 또는 다른 인자의 발현을 촉진하도록 조작된다. 부가적인 핵산 중에서, 예를 들어, 도입 유전자는 세포의 생존력 및/또는 기능을 촉진시킴으로써 치료의 효능을 향상시키는 것; 생체 내 생존 또는 국소화를 평가하는 것과 같은, 세포의 선별(selection) 및/또는 평가(evaluation)를 위한 유전적 마커를 제공하는 유전자; 예를 들어, Lupton S. D. 등., Mol. and Cell Biol., 11 : 6 (1991) 및 Riddell 등., Human Gene Therapy 3:319-338 (1992)에 기재된 바와 같이 생체 내에서 음성 선택에 감수성이 되게 함으로써 안전성을 향상시키기 위한 유전자; 및 Lupton에 따른 PCT/US91/08442와 PCT/US94/05601 공개문헌에는 지배적인 양성 선별 마커와 음성 선별 마커를 융합시킨 2 관능성 선택 융합 유전자의 사용을 기술하고 있다. 예를 들어, Riddell 등의 미국 특허 제6,040,177호의 14 ~ 17 열 내용을 참조한다.

일부 실시예에서, 상기 도입은 조성물의 하나 이상의 세포를 재조합 단백질을 코딩하는 핵산 분자(예를 들어, 재조합 수용체)와 접촉시켜서 수행한다.

일부 실시예에서, 상기 접촉은 스핀분리접종(spinoculation, 예를 들면, 원심 분리접종)와 같은 원심 분리로 수행할 수 있다. 이러한 방법은 국제 공개번호 WO2016/073602에 기술된 임의의 방법을 포함한다. 대표적인 원심 분리 챔버는 Biosafe SA가 생산 및 판매하는 것을 포함하며, 이는 A-200/F 및 A-200 원심 챔버 및 이러한 시스템에 사용하기 위한 다양한 키트(kits)를 포함하는 Sepax^® 및 Sepax^® 2 시스템과 함께 사용하는 것을 포함한다. 예시적인 챔버, 시스템 및 처리 장비와 캐비넷(cabinets)은 예를 들어 미국 특허 제6,123,655호, 미국 특허 제6,733,433호 및 미국 특허공개번호 US 2008/0171951호, 및 국제공개번호 WO 00/38762호에 개시되어 있고, 이들 각각의 내용은 그 전체가 본 발명에 참고로 인용된다. 이러한 시스템과 함께 사용하기 위한 예시적인 키트는 BioSafe SA가 CS-430.1, CS-490.1, CS-600.1 또는 CS-900.2의 제품명으로 판매하는 일회용 키트를 포함하며, 이에 한정되지는 않는다.

일부 실시예에서, 상기 시스템은 시스템에서 수행되는 처리 단계(processing steps) 및 하나 이상의 다양한 다른 처리 단계의 양상을 조작, 자동화, 제어 및/또는 모니터링하는 기기 장치(instrumentation)을 포함하는 다른 기기와 함께 및/또는 이와 관련되어 설치되며, 예를 들어, 본 명세서 또는 국제 공개번호 WO2016/07360호에 기술된 바와 같은 원심 챔버 시스템과 함께 또는 그와 관련하여 수행될 수 있는 하나 이상의 처리 단계를 포함한다. 일 실시예에서 상기 기기 장치는 캐비넷 내에 포함된다. 일 실시예에서, 상기 기기 장치는 제어회로, 원심분리기, 커버, 모터, 펌프, 센서, 디스플레이 및 사용자 인터페이스를 포함하는 하우징을 포함하는 캐비넷을 포함한다. 예시적인 기기는 미국 특허 제6,123,655호, 미국 특허 제6,733,433호 및 미국 공개 특허 2008/0171951에 개시되어 있다.

일부 실시예에서, 상기 시스템은 일련의 용기(예: 백(bag)), 배관(tubing), 잠금꼭지(stopcocks), 클램프, 연결수단(connectors) 및 원심 분리챔버를 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 용기(예: 백)는 동일 용기 또는 별도의 용기(예: 동일 백 또는 별도의 백)에서 형질 도입될 세포 및 바이러스 벡터 입자를 함유한 하나 이상의 용기(예:백)을 포함한다. 일 실시예에서, 상기 시스템은 상기 방법 동안 성분 및/또는 조성물을 희석, 재순환 및/또는 세척하기 위한 챔버 및/또는 다른 구성 요소로 인출되는 희석액 및/또는 세척액과 같은 배지를 포함하는 하나 이상의 용기(예: 백)을 더 포함한다. 상기 용기는 유입 라인(input line), 희석(diluent) 라인, 세척 라인, 폐기물(waste) 라인 및/또는 배출(output) 라인에 대응하는 위치(position)와 같은 시스템의 하나 이상의 위치(positions)에 연결될 수 있다.

일 실시예에서, 상기 챔버는 회전축 주위와 같은 챔버의 회전에 영향을 줄 수 있는 원심분리기와 관련이 있다. 회전은 세포의 형질 도입(transduction)과 관련하여 및/또는 하나 이상의 다른 처리 단계에서 인큐베이션 전, 도중 및/또는 후에 발생할 수 있다. 따라서, 일부 실시예에서, 다양한 처리 단계 중 하나 이상은 예를 들어 특정 힘으로 회전시키면서 수행될 수 있다. 상기 챔버는 일반적으로 수직 또는 수직 방향으로 회전할 수 있으며, 원심분리 중에 챔버가 수직으로 놓이며, 종단벽(the end wall)은 수평 또는 대체로 수평이면서, 측벽(the side wall) 및 축(axis)은 수직 또는 대체로 수직이다.

일 실시예에서, 세포, 바이러스 입자 및 시약을 함유하는 조성물은 약 600 rpm 내지 1700 rpm((예: 약 600 rpm, 1000 rpm, 1500 rpm 또는 1700 rpm)에서 세포를 펠렛화하는데 사용되는 속도보다 낮은 속도와 같은 일반적으로 상대적으로 낮은 힘 또는 속도로 회전될 수 있다. 일 실시예에서, 회전은 예를 들어 챔보 또는 캐비티(cavity)의 내부 또는 외부 벽에서 측정된 바와 같이 약 100 g 내지 3200 g(예를 들어, 약 100 g, 200 g, 300 g, 400g, 500 g, 1000 g, 1500 g, 2000 g, 2500 g, 3000 g 또는 3200 g)의 힘(예: 상대 원심력)으로 수행된다. "상대 원심력" 또는 RCF(relative centrifugal force)라는 용어는 일반적으로 회전축에 비해 공간의 특정 지점에서 중력에 대한 물체 또는 물질(예: 세포, 샘플, 펠렛 및/또는 챔버나 회전하는 다른 용기가 회전하는 지점)에 부여되는 유효한 힘으로 이해된다. 이 값은 중력, 회전 속도 및 회전 반경 (RCF가 측정되는 회전축과 물체, 물질 또는 입자로부터의 거리)을 고려하여 잘 알려진 공식을 사용하여 결정될 수 있다.

일부 실시예에서, 유전 공학(예를 들어, 형질 도입 및/또는 유전자 공학)의 적어도 일부 동안에서, 전술한 바와 같이, 세포는 세포의 배양 또는 확장(expansion)과 같은 유전자 조작된 세포의 배양을 위한 생물 반응기 백 조립체로 전달된다.

형질 도입(transduction)을 위한 바이러스 벡터 입자의 제조

바이러스 벡터 게놈(genome)은 전형적으로 패키징(packaging) 또는 생산자 세포주로 형질 감염될 수 있는 플라스미드(plasmid) 형태로 구성된다. 그러한 임의의 예로서, 재조합 수용체와 같은 재조합 단백질을 코딩하는 핵산은 일반적으로 바이러스 게놈의 비필수 영역과 같은 바이러스 벡터의 영역에 삽입되거나 위치한다. 일부 실시예에서, 핵산은 특정 바이러스 서열 대신에 바이러스 게놈에 삽입되어 복제 결함이 있는 바이러스를 생산한다.

게놈이 바이러스 벡터 게놈의 RNA 복제(copy)를 함유하는 레트로 바이러스 입자를 생산하기 위해 임의의 다양한 공지된 방법을 사용할 수 있다. 일 실시예어서, 바이러스-기반 유전자 전달 시스템을 제조하는데 적어도 2가지 성분이 관여한다; 첫째, 바이러스성 벡터 입자를 생성시키는데 필요한 효소뿐만 아니라 구조 단백질을 포함하는 패키징 플라스미드(packaging plasmids), 및 둘째, 바이러스 그 자체, 즉 전달될 유전물질. 바이오안전성 안전 장치(Biosafety safeguards)는 이들 구성 요소 중 하나 또는 모두의 설계에 도입 될 수 있다.

일부 실시예에서, 상기 패키징 플라스미드는 HIV-1과 같은 모든 레트로 바이러스, 엔벨로프 단백질 (Naldini et al., 1998) 이외의 단백질을 함유할 수 있다. 다른 실시예로서, 바이러스 벡터는 병독성(virulencde, 예를 들어, vpr, vif, vpu 및 nef 및/또는 Tat, HIV의 주요 트랜스 작용인자)과 관련된 추가적인 바이러스 유전자가 결핍될 수 있다. 일 실시예에서, HIV-기반 렌티 바이러스 벡터와 같은 렌티 바이러스 벡터는 단지 3개의 모 바이러스(parental virus) 유전자를 포함한다: 재조합을 통해 야생형 바이러스(wild type virus)를 재구성 할 가능성을 감소시키거나 제거하는 gag, pol 및 rev.

일부 실시예에서, 바이러스 벡터 게놈(genome)은 바이러스 벡터 게놈으로부터 전사된 바이러스 게놈 RNA를 바이러스 입자로 패키지하는데 필요한 모든 성분을 함유하는 패키징 세포주(packaging cell line)에 도입된다. 대안적으로, 바이러스 벡터 게놈은 관심 있는 하나 이상의 서열, 예를 들어 재조합 핵산에 부가하여 바이러스 성분을 코딩하는 하나 이상의 유전자를 포함할 수 있다. 그러나, 일부 양태에서, 표적 세포에서 게놈의 복제를 방지하기 위해, 복제에 필요한 내인성 바이러스 유전자를 제거하고 패키징 세포주에서 별도로 제공한다.

일부 실시예에서, 패키징 세포주는 입자를 생성 시키는데 필요한 성분을 함유하는 하나 이상의 플라스미드 벡터로 형질 감염된다. 일부 실시예에서, 패키징 세포주는 바이러스 벡터 게놈을 함유하는 플라스미드로 형질 감염되고, 상기 바이러스 벡터 게놈은 LTR, cis-작용 패키징 서열 및 관심 서열(the sequence of interest), 즉 CAR과 같은 항원 수용체를 코딩하는 핵산을 포함한다; 그리고 gag, pol 및/또는 rev와 같은 바이러스 효소 및/또는 구조 성분을 코딩하는 하나 이상의 헬퍼 플라스미드(helper plasmids)를 포함한다. 일부 실시예에서, 다수의 벡터는 레트로 바이러스 벡터 입자를 생성시키는 다양한 유전적 성분을 분리하는데 이용된다. 이러한 일부 실시예에서, 개별적인 벡터를 패키징 세포에 제공하는 것은 그렇지 않으면 RCV(replication competent viruses)를 생성할 수 있는 재조합 이벤트의 기회를 감소시킨다. 일 실시예에서, 모든 레트로 바이러스 성분을 갖는 단일 플라스미드 벡터를 사용할 수 있다.

일부 실시예에서, 렌티 바이러스 벡터 입자와 같은 레트로 바이러스 벡터 입자는 숙주 세포의 형질 도입 효율을 증가시키기 위해 슈도 타입프 된다(pseudotyped). 일 실시예에서, 예를 들어, 렌티 바이러스 벡터 입자와 같은 레트로 바이러스 벡터 입자는 형질 도입될 수 있는 세포 유형을 확장시키는 넓은 세포 숙주 범위를 제공하는 VSV-G 당단백질(glycoprotein)로 슈도 타이프 된다. 일 실시예에서, 패키징 세포주는 종양 바이러스 포락선(Sindbis virus envelope), GALV 또는 VSV-G와 같은 제노트로픽(xenotropic), 폴리트로픽(polytropic) 또는 양친매성 포락(amphotropic envelopes)을 포함하는 것과 같은 비천연 포락선 당 단백질(non-native envelope glycoprotein)을 코딩하는 플라스미드 또는 폴리 뉴클레오티드로 형질 감염된다.

일부 실시예에서, 패키징 세포주는 렌티 바이러스 벡터 입자 내로 바이러스 게놈 RNA를 패키징하기 위해 트랜스(trans)에서 요구되는 바이러스 조절(viral regulatory) 및 구조 단백질을 포함하는 성분을 제공한다. 일 실시예에서, 패키징 세포주는 렌티 바이러스 단백질을 발현하고, 기능성 렌티 바이러스 벡터 입자를 생성할 수 있는 임의의 세포주일 수 있다. 일부 양태에서, 적절한 패키징 세포주는 293(ATCC CCL X), 293T, HeLA(ATCC CCL 2), D17(ATCC CCL 183), MDCK(ATCC CCL 34), BHK(ATCC CCL-10) 및 Cf2Th(ATCC CRL 1430) 세포를 포함한다.

일부 실시예에서, 패키징 세포주는 바이러스 단백질(들)을 안정적으로 발현한다. 예를 들어, 몇몇 양태에서, gag, pol, rev 및/또는 다른 구조 유전자를 함유하지만 LTR 및 포장 성분이 없는 패키징 세포주를 제조할 수 있다. 일 실시예에서, 패키징 세포주는 이종 단백질을 코딩하는 핵산 분자 및/또는 포락선 당단백질(envelope glycoprotein)을 코딩하는 핵산을 함유하는 바이러스 벡터 게놈과 함께 하나 이상의 바이러스 단백질을 코딩하는 핵산 분자로 일시적으로 형질 감염될 수 있다.

일 실시예에서, 바이러스 벡터 및 패키징 및/또는 헬퍼 플라스미드는 형질 감염(transfection) 또는 감염(infection)을 통해 패키징 세포주에 도입된다. 패키징 세포주는 바이러스 벡터 게놈을 포함하는 바이러스 벡터 입자를 생성한다. 형질 감염 또는 감염 방법은 잘 알려져 있다. 비제한적인 예로는 인산칼슘, DEAE-덱스트란 및 리포펙션(lipofection)법, 전기 천공(electroporation) 및 마이크로 주입(microinjection)을 포함한다.

재조합 플라스미드 및 레트로 바이러스 LTR 및 패키징 서열이 특별한 세포주(예를 들어, 인산 칼슘 침전에 의해)로 도입할 때, 패키징 서열은 재조합 플라스미드의 RNA 전사체(transcript)를 바이러스 입자로 패키징할 수 있으며, 배지에 분비될 수 있습니다. 이어서, 일 실시예에서, 재조합 레트로 바이러스를 함유한 상기 배지는 수집되고, 선택적으로 농축되고, 유전자 전달에 사용된다. 일 양태에서, 예를 들어, 패키징 플라스미드 및 전달 벡터의 패키징 세포주로의 동시 형질 감염(cotransfection) 후에, 바이러스 벡터 입자를 배양 배지로부터 회수하고 당업자가 사용하는 표준 방법으로 역가를 측정한다.

일 실시예에서, 렌티 바이러스 벡터와 같은 레트로 바이러스 벡터는 렌티 바이러스 입자의 생성을 허용하기 위한 플라스미드의 도입에 의해 예시적인 HEK 293T 세포주와 같은 패키징 세포주에서 제조될 수 있다. 일 실시예에서, 패키징 세포는 형질 감염되고, 및/또는 gag 및 pol을 코딩하는 뉴클레오티드 및 항원 수용체(예:CAR)와 같은 재조합 수용체를 코팅하는 폴리튜클레오티드를 포함한다. 일부 실시예에서, 패키징 세포주는 비천연 포락선 당단백질(예: VSV-G)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드로 선택적으로 및/또는 추가적으로 형질 감염되거나 및/또는 포함한다. 　 이러한 일부 실시예에서, 세포(예를 들어, HEK 293T 세포)의 형질 감염 후 약 2 일 후에, 상기 세포 상층액은 회수 및 재조합될 수 있는 재조합 렌티 바이러스 벡터를 포함한다.

회수 및/또는 생성된 레트로 바이러스 벡터 입자는 본 명세서에 기재된 방법을 사용하여 표적 세포를 형질 도입하는데 사용될 수 있다. 일단 표적 세포에서, 바이러스 RNA는 역전사되고, 핵으로 유입되며, 숙주 게놈에 안정적으로 통합된다. 바이러스 RNA의 통합 후 1 일 또는 2 일 후에, 재조합 단백질의 발현, 예를 들어. CAR과 같은 항원 수용체가 검출될 수 있다.

3. 활성화 및 자극(Activation and Stimulation)

일부 실시예에서, 하나 이상의 공정 단계(processing steps)는 선택된 세포 집단과 같은 단리된 세포(isolated cells)를 자극하는 단계를 포함한다. 인큐베이션(incubation)은 전술한 형질 도입 방법의 양태로부터 유래된 유전 공학과 같은 유전 공학과 관련되어 있거나, 앞설 수 있다. 일 실시예에서, 상기 자극은 예를 들어, 형질 도입 전에 세포의 활성화 및/또는 증식을 초래한다.

일부 실시예에서, 상기 공정 단계는 선별된 세포(selected cells)와 같은 세포의 인큐베이션을 포함하고, 인큐베이션 단계는 세포의 배양(culture), 배양(cultivation), 자극(stimulation), 활성화(activation) 및/또는 증식을 포함할 수 있다. 일 실시예에서, 조성물 또는 세포는 자극조건 또는 자극제의 존재 하에서 인큐베이션된다. 그러한 조건은 집단 내에서 세포의 증식, 확장(expansion), 활성화 및/또는 생존을 유도하고, 항원 노출을 모방하고, 및/또는 재조합 항원 수용체의 도입과 같은 유전 공학을 위한 세포를 준비하는 것을 포함한다.

일부 실시예에서, 자극 및/또는 활성화를 위한 조건은 하나 이상의 특정 배지, 온도, 산소 함량, 이산화탄소 함량, 시간, 시약(예를 들면, 영양제, 아미노산, 항생제, 이온 및/또는 자극인자)을 포함할 수 있으며, 상기 자극인자는 사이토카인, 케모카인(chemokines), 항원, 결합 파트너, 융합 단백질, 재조합 용해성 수용체 및 세포를 활성화시키도록 고안된 임의의 다른 시약을 포함할 수 있다.

일 실시예에서, 자극 조건 또는 시약(agents)은 TCR 복합체의 세포 내 신호 전달 도메인을 활성화시킬 수 있는 하나 이상의 시약, 예를 들어 리간드를 포함한다.

일 양태에서, 상기 시약(agents)은 T 세포에서 TCR/CD3 세포 내 신호 전달 계통을 작동시키거나 개시시키며, 상기 시약은 예를 들어, TCR 구성 요소에 특유한 것들과 같은 ITAM 유발 신호의 활성화를 개시하기 위해 1 차 신호를 전달하기에 적합한 시약, 및/또는 예를 들어, 비드와 같은 고체 지지체에 결합된, T 세포 보조 자극 수용체(예: 항-CD3, 항-CD28, 또는 항-41-BB)에 대해 특이적인 것과 같은 보조 자극 신호를 촉진시키는 시약일 수 있다. 자극제 중에는 항-CD3/항-CD28 비드(예: DYNABEADS^® M-450 CD3/CD28 T 세포 확장제 및/또는 ExpACT^® 비드)가 있다. 선택적으로, 상기 확장(expansion) 방법은 항-CD3 및/또는 항 CD28 항체를 배양 배지에 첨가하는 단계를 더 포함할 수 있다. 일 실시예에서, 상기 자극제는 IL-2, IL-7 및/또는 IL-15, 예를 들어, 적어도 약 10 units/mL, 적어도 약 50 units/mL, 적어도 약 100 units/mL 또는 적어도 약 200 units/mL이다. 상기 조건은 특정 배지, 온도, 산소 함량, 이산화탄소 함량, 시간, 시약 (예를 들면, 영양제, 아미노산, 항생제, 이온 및/또는 자극인자)를 포함할 수 있으며, 상기 자극인자는 사이토카인, 케모카인(chemokines), 항원, 결합 파트너, 융합 단백질, 재조합 용해성 수용체 및 세포를 활성화시키도록 고안된 임의의 다른 시약을 포함할 수 있다.

일부 양태에서, 인큐베이션은 Riddell 등의 미국 특허 제6,040,177호, Klebanoff 등 (2012) J Immunother. 35 (9): 651-660, Terakura 등. (2012) Blood.1 : 72-82 및/또는 Wang 등. (2012) J Immunother. 35(9):689-701에 개시된 것과 같은 기술에 따라 수행된다.

일부 실시예에서, 하나 이상의 자극 조건 또는 자극제의 존재 하에서 인큐베이션의 적어도 일부는 원심 챔버의 내부 캐비티에서, 예를 들어 국제 공개 WO2016/073602호에 개시된 바와 같이 원심 회전 하에서 수행된다. 일 실시예에서, 원심 챔버에서 수행되는 인큐베이션의 적어도 일부는 자극 및/또는 활성화를 유도하기 위한 시약과 혼합을 포함한다. 이러한 공정의 일부 양태에서, 세포 배양 플레이트 또는 다른 시스템에서 유사한 자극을 수행할 때 통상적으로 사용되는 것보다 훨씬 적은 양의 세포를 하나 이상의 자극 조건 또는 시약의 양과 혼합한다.

일부 실시예에서, 자극제는 원심 챔버(예를 들면, 주기적으로 흔들거나 회전하는 튜브 또는 백에서)에서 혼합하지 않고 선택이 수행될 때 동일한 수의 세포 또는 동일한 부피의 세포를 선택하는 것과 거의 동일하거나 유사한 효율을 달성하는데 전형적으로 사용되거나 필요한 자극제의 양에 비해 실질적으로 적은 양(예를 들면, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70% 또는 80% 이하)으로 챔버의 공동 내의 세포에 첨가된다. 일 실시예에서, 인큐베이션은 세포에 대한 인큐베이션 완충액의 첨가 및 자극제의 첨가로 수행되어 예를 들어 10 mL 내지 200 mL(예: 적어도 또는 약 적어도 또는 약 20 mL, 30 mL, 40 mL, 50 mL, 60 mL, 70 mL, 80 mL, 90 mL, 100 mL, 150 mL 또는 200 mL)의 시약의 배양과 함께 목표 부피를 달성한다. 일 실시예에서, 인큐베이션 완충제 및 자극제는 세포에 첨가되기 전에 예비 혼합된다. 일 실시예에서, 인큐베이션 완충제 및 자극제는 세포에 개별적으로 첨가된다. 일 실시예에서, 자극 인큐베이션(stimulating incubation)은 주기적인 온화한 혼합 조건으로 수행되며, 이는 에너지적으로 선호되는 상호 작용을 촉진시키는데 도움을 줄 수 있고, 따라서 세포의 자극 및 활성화를 달성하면서 전체적으로 보다 적은 자극제의 사용을 가능하게 한다.

일 실시예에서, 상기 인큐베이션은 일반적으로 비교적 낮은 힘 또는 속도의 회전(spinning)과 같은 혼합 상태 하에서 수행하며, 예컨대 세포를 펠렛화하기 위해 사용되는 속도보다 낮은 속도, 예를 들어, 약 600 rpm에서 또는 약 600 내지 1700 rpm (예: 약 또는 최소 600 rpm, 1000 rpm 또는 1500 rpm 또는 1700 rpm)에서 수행하며, 인큐베이션은 샘플에 RCF, 챔버 벽 또는 약 80g 내지 100g　 (예를 들어, 약 80 g, 85 g, 90 g, 95 g 또는 100 g) 또는 그 이상의 다른 용기에서 수행한다. 일 실시예에서, 상기 회전(spin)은 휴지기가 이어지는 그러한 저속에서 반복되는 회전 간격을 사용하여 수행하며, 예를 들어, 상기 회전 간격은 1초, 2초, 3초, 4초, 5초, 6초, 7초, 8초, 9초 또는 10초 동안 동안 회전 및/또는 휴지기를 가지며, 예를 들면, 회전 간격은 약 5 초, 6 초, 7 초 또는 8 초 동안 휴지기를 가진 후, 약 1초 또는 2초간 회전을 수행한다.

일 실시예에서, 인큐베이션의 총 지속 시간은, 예를 들어, 약 1 시간 내지 96 시간, 1 시간 내지 72 시간, 1 시간 내지 48 시간, 4 시간 내지 36 시간, 8 시간 내지 30 시간 또는 12 시간 내지 24 시간 사이, 또는 적어도 또는 약 6 시간, 12 시간, 18 시간, 24 시간, 36 시간 또는 72 시간 이상 지속될 수 있다. 일 실시예에서, 추가 인큐베이션은 1 시간 내지 48 시간, 4 시간 및 36 시간, 8 시간 30 시간 또는 12 시간 및 24 시간 (또는 그 이상) 사이의 시간 동안이다.

4. 제제화(제형화, Formulations)

세포 치료 및/또는 조작된 세포의 제조, 생성 또는 생산을 위한 하나 이상의 공정 단계(예를 들어, 원심 챔버 및/또는 폐쇄 시스템에서 수행됨)는 배양(예: 배양 및 확장) 전후에 제공된 형질 도입 처리 단계 및/또는 본 명세서에 개시된 하나 이상의 다른 공정 단계로부터 유래된 유전자 조작된 세포의 제제화 같은 세포의 제제화(제형화)를 포함한다. 일 실시예에서, 세포의 제제화와 관련된 제공된 방법은 폐쇄형 시스템에서 전술한 공정 단계를 사용하여 형질 도입(transduced) 및/또는 확장된(expanded) 세포와 같은 형질 도입된 세포의 가공(processing)을 포함한다.

일 실시예에서, 하나 이상의 공정 단계에 의해 생성된 CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포와 같은 T 세포는 제제화된다. 일부 양태에서, 선택적으로 일정 시간 내에 개별적 또는 독립적으로 투여하기 위한 것과 같이, 각각 대상(subject)으로부터 상이한 집단 및/또는 하위 유형의 세포를 함유하는 다수의 조성물이 개별적으로 제조, 생산 또는 생성된다. 예를 들어, 상이한 집단 또는 하위 유형의 세포를 함유하는 조작된 세포(engineered cells)의 분리된 제제는 CD8+ 및 CD4+ T 세포 및/또는 CD8+- 및 CD4+- 강화된 집단(enriched populations)(예를 들면, 재조합 수용체를 발현하도록 유전적으로 조작된 세포를 개별적으로 포함하는 CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포)을 각각 포함할 수 있다. 일 실시예에서, 하나 이상의 조성물은 재조합 수용체를 발현하도록 유전적으로 조작된 CD4+ T 세포를 포함하여 제제화된다. 일 실시예에서, 적어도 하나의 조성물은 재조합 수용체를 발현하도록 유전적으로 조작된 CD8+ T 세포로 제제화된다. 일부 실시예에서, 투여량은 CD8+ T 세포의 투여량 또는 CD4+ T 세포의 투여량을 포함하는 제1 조성물의 투여 및 CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포의 투여량 중 다른 것을 포함하는 제2 조성물의 투여를 포함한다. 일 실시예에서, CD8+ T 세포의 용량 또는 CD4 + T 세포의 용량을 포함하는 제1 조성물은 CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포의 다른 투여량을 포함하는 제 2 조성물 전에 투여한다. 일 실시예에서, 상기 튜여량의 투여은 CD8+ T 세포의 용량 및 CD4+ T 세포의 용량 모두를 포함하는 조성물의 투여를 포함한다.

일 실시예에서, 상기 세포는 약학적으로 허용 가능한 완충액에 제제 화되며, 이는 일부 양태에서 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제를 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 상기 공정(processing)은 대상(subject)에 투여를 위해 약학적으로 허용되거나 또는 요구되는 배지 또는 제제 완충액(formulation buffer)로의 배지의 교환을 포함한다. 일 실시예에서, 상기 공정 단계(processing steps)는 하나 이상의 임의의 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제를 포함할 수 있는 약학적으로 허용 가능한 완충액 중의 세포를 대체하기 위해 형질 도입 및/또는 확장된 세포를 세척하는 것을 포함할 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제를 포함하는 이러한 약학적 형태의 예시는 세포 및 조성물을 대상(subject)에게 투여하기에 수용 가능한 형태와 함께 이하에 기재된 임의의 것일 수 있다. 일부 실시예에서, 약제학적 조성물은 질병 또는 상태를 치료하거나 예방하기에 효과적인 양, 예를 들어 치료 유효량 또는 예방적 유효량으로 세포를 포함한다.

"약학적으로 허용 가능한 담체"는 활성 성분 이외의, 약제학적 제형의 성분을 말하며, 이는 환자에게 비독성이다. 약학적으로 허용 가능한 담체는 완충제, 부형제, 안정화제 또는 방부제를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

일부 양태에서, 담체의 선택은 부분적으로는 특정 세포에 의해 및/또는 투여 방법에 의해 결정된다. 따라서, 다양한 적절한 제제가 있다. 예를 들어, 약제학적 조성물은 방부제를 함유할 수 있다. 적합한 방부제는 예를 들어, 메틸 파라벤, 프로필 파라벤, 소듐 벤조에이트 및 벤즈알코늄 클로라이드(benzalkonium chloride)를 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 둘 이상의 방부제의 혼합물이 사용된다. 방부제 또는 이들의 혼합물은 전형적으로 총 조성물의 약 0.0001 중량% 내지 약 2 중량%의 양으로 존재한다. 담체는 예를 들어 Remington 's Pharmaceutical Sciences 제 16 판, Osol, A. Ed. (1980)에 개시되어 있다.

약학적으로 허용 가능한 담체는 일반적으로 사용된 투여량 및 농도에서 수혜자에게 비독성이며, 이에 제한되는 것은 아니지만 인산염, 시트르산 및 기타 유기산과 같은 완충제; 아스코르빈산 및 메티오닌을 포함하는 항산화제; 방부제(예: 옥타데실디메틸 벤질암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드; 벤즈에토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알콜; 메틸 또는 프로필 파라벤과 같은 알킬 파라벤; 카테콜; 레조르시놀; 시클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m- 크레졸); 저 분자량(약 10 잔기(residues) 미만) 폴리펩타이드; 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역 글로불린과 같은 단백질; 폴리비닐피롤리돈과 같은 친수성 중합체; 글라이신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 라이신과 같은 아미노산; 단당류, 이당류 및 포도당, 만노오스 또는 덱스트린을 비롯한 기타 탄수화물; EDTA와 같은 킬레이트제; 수크로오스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨과 같은 당(sugar); 나트륨과 같은 염-형성 반대 이온(salt-forming counter-ions); 금속 착물(예, Zn- 단백질 착체); 및/또는 폴리에틸렌글리콜(PEG)과 같은 비이온성 계면활성제를 포함한다.

일부 측면에서 완충제가 조성물에 포함된다. 적합한 완충제는 예를 들어 시트르산, 시트르산 나트륨, 인산, 인산 칼륨 및 다양한 다른 산 및 염을 포함한다. 몇몇 양태에서, 둘 이상의 완충제의 혼합물이 사용된다. 완충제 또는 이들의 혼합물은 전형적으로 총 조성물의 약 0.001 중량% 내지 약 4 중량%의 양으로 존재한다. 투여 가능한 약제 학적 조성물의 제조 방법은 공지되어 있다. 예시적인 방법은 예를 들어, Remington : The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott Williams & Wilkins; 21st ed.(2005 년 5 월 1 일)에 상세하게 개시되어 있다.

제제는 수용액을 포함할 수 있다. 또한, 제제 또는 조성물은 세포로 치료되는 특정 징후, 질환 또는 상태에 유용한 하나 이상의 활성 성분, 바람직하게는 각각의 활성이 서로 역효과를 미치지 않는 세포에 상보적인 활성을 갖는 활성 성분을 함유할 수 있다. 이러한 활성 성분은 적절하게 의도된 목적에 유효한 양으로 조합하여 존재한다. 따라서, 일부 구체 예에서, 제약 조성물은 추가로 약학적으로 활성인 활성화제(active agents) 또는 화학치료제(chemotherapeutic agents) 같은 약물을 포함하며, 예를 들면, 아스파라기나제(asparaginase), 부설팬(busulfan), 카보플라틴(carboplatin), 시스플라틴(cisplatin), 다우노루비신(daunorubicin), 독소루비신(doxorubicin), 플루오로라실(fluorouracil), 젬시타빈(gemcitabine), 하이드록시우레아(hydroxyurea), 메톡트렉세이트(methotrexate), 파크리탁셀(paclitaxel), 리투시맵(rituximab), 빈블라스틴(vinblastine) 및/또는 빈크리스틴(vincristine)이다.

일 실시예에서 조성물은 멸균 액체 제제, 예를 들어 등장성 수용액(isotonic aqueous solutions), 현탁액(suspensions), 유제(emulsions), 분산액(dispersions) 또는 점성 조성물로서 제공되는데, 이들은 일부 양태에서 선택된 pH로 완충될 수 있다. 액체 조성물은 예를 들어 물, 식염수, 인산 완충 식염수, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌글리콜, 액체 폴리에틸렌글리콜) 및 이들의 적합한 혼합물을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있는 담체를 포함할 수 있다. 멸균 주사용 용액은 세포를 적합한 담체, 희석제 또는 멸균수, 생리 식염수, 포도당, 덱스트로스 등과 같은 부형제와 같은 혼합물과 같은 용매에 혼입시킴으로써 제조될 수 있다. 상기 조성물은 바림직한 투여 경로 및 제조 방법에 따라 습윤제, 분산제 또는 유화제(예: 메틸 셀룰로즈), pH 완충제, 겔화 또는 점도 강화 첨가제, 방부제, 향료 및/또는 색과 같은 보조 물질을 포함할 수 있다. 표준 텍스트(standard texts)는 어떤 면에서 적절한 준비를 준비하기 위해 협의될 수 있다.

항균 방부제, 항산화제, 킬레이트제 및 완충제를 비롯한 조성물의 안정성 및 무균성을 향상시키는 다양한 첨가제를 첨가할 수 있다. 미생물 활성 방지는 파라벤, 클로로부탄올, 페놀 및 소르브산과 같은 다양한 항균 및 항진균제에 의해 보장될 수 있다. 주사 가능한 약제 형태의 지속되는 흡수(prolonged absorption)는 흡수를 지연시키는 약제, 예를 들면, 알루미늄 모노스테아레이트(aluminum monostearate) 및 젤라틴의 사용에 의할 수 있다.

일부 실시예에서, 제제 완충액은 동결 보존제(cryopreservative)를 포함한다. 일 실시예에서, 상기 세포는 1.0% ~ 30 % DMSO 용액, 예를 들어 5% ~ 20% DMSO 용액 또는 5% ~ 10% DMSO 용액을 함유하는 동결 보존제로 제제화된다. 일부 실시예에서, 동결 보존제는 예를 들어 20% DMSO 및 8% HAS(human serum albumin) 또는 다른 적합한 세포 동결 배지를 함유하는 PBS이다. 일 실시예에서, 동결 보존제는 예를 들어, 적어도 약 7.5% DMSO 또는 이를 함유한다. 일 실시예에서, 공정 단계(processing steps)는 동결 보존제 중의 세포를 대체하기 위해 형질 도입(tranduced) 및/또는 확장된(expanded) 세포를 세척하는 것을 포함할 수 있다.

일 실시예에서, 상기 제제는 배양된 또는 확장된 세포와 같은 세포를 세척, 희석 또는 농축하는 것을 포함하는 하나 이상의 공정 단계를 사용하여 수행된다. 일 실시예에서, 상기 공정은 원하는 농도 또는 수로 세포를 희석 또는 농축하는 것을 포함하며, 예를 들어 주어진 투여량 또는 분획(fraction)으로 투여하기 위한 세포의 수를 포함하는 단위 투여량 형태의 조성물을 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 상기 공정 단계는 체적 감소를 포함하여 원하는 만큼 세포 농도를 증가시킬 수 있다. 　 일 실시예에서, 상기 공정 단계는 체적 첨가를 포함하여 원하는 만큼 세포 농도를 감소시킬 수 있다. 일부 실시예에서, 상기 공정은 제제 완충액(formulation buffer)을 형질 도입된 세포 및/또는 확장된 세포에 첨가하는 것을 포함한다. 일 실시예에서, 제제 완충액의 부피는 약 10 mL 내지 1000 mL, 예컨대 약 또는 적어도 50 mL, 100 mL, 200 mL, 300 mL, 400 mL, 500 mL, 600 mL, 700 mL, 800 mL, 900 mL 또는 1000 mL이다.

일 실시예에서, 세포 조성물을 제제화(제형화) 하기 위한 이러한 공정 단계는 폐쇄형 시스템(closed system)에서 수행한다. 그러한 공정 단계의 예시는 세포 공정 시스템과 관련된 하나 이상의 시스템 또는 키트와 관련하여 원심 챔버를 사용하여 수행할 수 있으며, 상기 원심 챔버의 예로는 Sepax^® 또는 Sepax 2^® 세포 공정 시스템과 함께 사용하는 것을 포함하여 Biosafe SA가 생산 및 판매하는 원심 챔버와 같은 제품이 있다. 예시적인 시스템 및 공정(process)은 국제공개번호 WO2016/073602에 개시되어 있다. 일부 실시예에서, 상기 방법은 기재된 원심 분리 챔버의 내부 캐비티로부터, 전술한 임의의 실시예에서 약학적으로 허용 가능한 완충액과 같은 제제 완충액에서 제제화된 세포의 최종 조성물인 제제화된 조성물을 효과적으로 발현시키는 것을 포함한다. 일 실시예에서, 제제화된 조성물의 발현은 밀폐된 시스템의 일부로서 원심 챔버와 작동 가능하게 연결된 백(bag)과 같은 용기에 관한 것이다. 일부 실시예에서, 백과 같은 용기는 출력 라인(output line) 또는 출력 위치(output position)에서 시스템에 연결된다. 일부 실시예에서, 원심 챔버 또는 세포 공정 시스템과 관련된 폐쇄형 시스템은 배관 라인의 각 단부에서 하나 또는 복수의 포트가 연결된 다방향 배관 매니폴드(multi-way tubing manifold)를 포함하는 다방향 출력 키트를 포함하고, 상기 포트는 제제화된 조성물의 발현을 위해 다수의 용기가 연결될 수 있다. 일 실시예에서, 백(bag)과 같은 원하는 수 또는 다수의 출력 용기는 일반적으로 하나 이상, 대개 2개 이상, 예를 들면, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개 또는 그 이상의 멀티포트출력의 포트에 무균적으로 연결될 수 있다. 예를 들어, 일 실시예에서, 백(bags)와 같은 하나 이상의 용기가 포트 또는 모든 포트보다 적은 포트에 부착될 수 있다. 따라서, 일 실시예에서, 상기 시스템은 복수의 출력 백(output bag)으로 출력 조성물의 발현에 영향을 줄 수 있다. 일부 양태에서, 세포는 단일 단위 투여 또는 다중 투여 같은 투여량으로 하나 이상의 다수의 배출 백으로 발현될 수 있다. 예를 들어, 일 실시예에서, 상기 출력 백은 각각 주어진 투여량 또는 그 분획으로 투여하기 위한 세포의 수를 각각 포함할 수 있다. 따라서, 몇몇 양태에서, 각각의 백은 투여를 위해 단일 단위 투여량을 포함할 수 있거나, 2 개의 출력 백 또는 3 개의 출력 백과 같이 복수의 출력 백 중 2 개 이상이 함께 투여량을 구성하도록 원하는 투여량의 일부를 포함할 수 있다.

따라서, 용기, 예를 들어, 배출 백은 일반적으로 투여될 세포, 예를 들어 그의 하나 이상의 단위 투여량을 함유한다. 상기 단위 투여량은 대상(또는 환자)에게 투여될 세포의 양 또는 수 또는 투여될 세포의 수(또는 그 이상) 일 수 있다. 그것은 대상에게 투여될 세포의 최소 투여량 또는 가능한 최소 투여 량일 수 있다.

일부 실시예에서, 각각의 용기, 예컨대 백은 개별적으로 세포의 단위 투여량을 포함한다. 따라서, 일 실시예에서, 각각의 컨테이너는 동일하거나 대략 또는 실질적으로 동일한 개수의 세포를 포함한다. 일 실시예에서, 각각의 단위 투여량은 적어도 또는 적어도 약 1 x 10⁶, 2 x 10⁶, 5 x10⁶, 1 x 10⁷, 5 x 10⁷ 또는 1 x 10⁸ 조작된 세포, 전체 세포, T 세포 또는 PBMC를 함유한다. 일부 실시예에서, 각각의 백에서 제제화된 세포 조성물의 부피는 10 mL 내지 100 mL, 예를 들어 적어도 또는 적어도 약 20 mL, 30 mL, 40 mL, 50 mL, 60 mL, 70 mL, 80 mL, 90 mL 또는 100 mL이다.

일 실시에서, 상기 방법에 의해 제조된 이러한 세포 또는 상기 세포를 포함하는 조성물은 질환 또는 상태를 치료하기 위해 대상에게 투여된다.

Ⅲ. 재조합 단백질(RECOMBINANT PROTEIN)

일부 실시예에서, 세포의 확장(expansion) 또는 배양과 같은 배양 방법은 재조합 단백질로 유전적으로 조작된(예를 들면, 형질 도입) 세포에서 수행된다. 일 실시예에서, 재조합 단백질은 재조합 수용체(예: 항원 수용체)이거나 이를 포함한다. 항원 수용체는 키메라 항원 수용체(CAR) 및 형질 전환 T 세포 수용체 (TCR)와 같은 다른 항원 결합 수용체를 포함하는 기능성 비-TCR 항원 수용체를 포함할 수 있다. 또한, 상기 수용체는 특정 리간드에 결합하고 CAR에 존재하는 것과 유사한 횡단막(transmembrane) 및/또는 세포 내 신호 전달 도메인(intracellular signaling domains)을 갖는 수용체와 같은 다른 키메라 수용체와 같은 다른 수용체를 포함할 수 있다.

CAR을 포함하는 예시적인 항원 수용체 및 이러한 수용체를 조작하여 세포 내로 도입시키는 방법은 예를 들어, 국제특허 공개번호 WO200014257, WO2013126726, WO2012/129514, WO2014031687, WO2013/166321, WO2013/071154, WO2013/123061, 미국 특허 공개번호 US2002131960, US2013287748, US20130149337, 미국 특허 등록번호 6,451,995, 7,446,190, 8,252,592, 8,339,645, 8,398,282, 7,446,179, 6,410,319, 7,070,995, 7,265,209, 7,354,762, 7,446,191, 8,324,353, 및 8,479,118 및 유럽 특허번호 EP2537416, 및/또는 Sadelain 등., Cancer Discov. 2013 April; 3(4): 388-398; Davila 등. (2013) PLoS ONE 8(4): e61338; Turtle 등., Curr. Opin. Immunol., 2012 October; 24(5): 633-39; Wu 등., Cancer, 2012 March 18(2): 160-75.에 개시되어 있다. 일 실시예에서, 상기 항원 수용체는 미국 특허 제7,446,190호에 기재된 바와 같은 CAR 및 국제 특허공개번호 WO/2014055668 A1에 기재된 것들을 포함한다.

CAR의 예로는 하기 모든 공보에 기재된 CAR를 포함한다. WO2014031687, US 8,339,645, US 7,446,179, US 2013/0149337, 미국 특허 제7,446,190호, 미국 특허 제8,389,282호, Kochenderfer 등., 2013, Nature Reviews Clinical Oncology, 10, 267-276 (2013); Wang 등. (2012) J. Immunother. 35(9): 689-701; 및 Brentjens 등., Sci Transl Med. 2013 5(177).

일부 실시예에서, 재조합 단백질이 코딩된 핵산은 수용체를 발현하기 위한 세포의 형질 도입 또는 조작 및/또는 폴리뉴클레오타이드에 의해 코딩되는 분자를 발현하는 세포의 선택 및/또는 표적화를 목적으로, 예를 들어 하나 이상의 마커를 추가로 코딩한다.

일부 양태에서, 그러한 마커는 유전 공학 과정 중에 도입될 수 있는 상이한 핵산 또는 폴리뉴클레오타이드에 의해 코딩될 수 있으며, 이는 또한 통상적으로 동일한 방법, 예를 들어, 동일한 벡터 또는 유형의 벡터를 통해 본 명세서에서 제공된 방법들 중 임의의 방법에 의한 형질 도입을 통해 유전 공학 과정 중에 도입 될 수 있다.

일부 양태에서, 마커, 예를 들어, 형질 도입 마커는 단백질 및/또는 세포 표면 분자이다. 예시적인 마커는 천연 발생 세포 표면 분자와 같은 자연 발생적인, 예컨대 내인성 마커(endogenous markers)의 절단된 변이체이다. 일부 양태에서, 상기 변이체는 천연 또는 내인성 세포 표면 분자와 비교하여 감소된 면역원성(immunogenicity), 감소된 트래피킹 기능(reduced trafficking function) 및/또는 감소된 신호 기능을 갖는다. 일 실시예에서, 상기 마커는 절단된 EGFR (tEGFR)과 같은 세포 표면 수용체의 절단된 형태이다. 일부 양태에서, 상기 마커는 CD34, NGFR 또는 표피 성장 인자 수용체(예를 들어, tEGFR)의 전부 또는 일부(예를 들어, 절단된 형태)를 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 마커를 코딩하는 핵산은 절단 가능한 링커 서열, 예컨대 T2A P2A, E2A 및/또는 F2A와 같은 링커 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 작동 가능하게 연결된다(예를 들어, WO2014/031687를 참조).

일 실시예에서, 상기 마커는 T 세포 상에 자연적으로 발견되지 않거나 또는 T 세포의 표면 상에 자연적으로 발견되지 않는 분자, 예를 들어 세포 표면 단백질 또는 그의 일부이다.

일부 실시예에서, 상기 분자는 비-자기 분자(non-self molecule), 예를 들어, 비-자기 단백질, 즉 세포가 입양적으로 전이될 숙주의 면역계에 의해 "스스로"로 인식되지 않는 비-자기 단백질이다

일 실시예에서, 상기 마커는 치료 기능을 제공하지 않으며 및/또는 예를 들어 성공적으로 조작된 세포를 선별하기 위한 유전자 공학용 마커로서 사용되는 것 이외의 효과를 발생시키지 않는다.

다른 일 실시예로서, 상기 마커는 생체 내에서 마주치게 될 세포에 대한 리간드와 같이 다른 효과를 발휘하는 치료용 분자 또는 분자일 수 있으며, 수용체 전달 및 리간드와의 만남시 세포의 반응을 강화 및/또는 완충시키기 위한 보조 자극 분자 또는 면역 체크 포인트 분자와 같은 분자를 포함한다.

A. 키메라 항원 수용체( Chimeric Antigen Receptors)

일부 실시예에서, CAR은 일반적으로 하나 이상의 세포 내 신호 전달 성분에 연결된 항체 또는 그의 단편을 함유하는 세포 외 부분과 같은 세포 외 리간드 결합 도메인을 갖는 유전적으로 조작된 수용체이다. 일 실시예에서, 키메라 항원 수용체는 세포 외 도메인 및 세포 내 신호 전달 도메인을 연결하는 막 횡단 도메인 및/또는 세포 내 도메인을 포함한다. 이러한 분자는 전형적으로 보조 항원과 조합하여 이러한 항원을 통한 천연 항원 수용체 및/또는 신호를 통한 신호를 모방하거나 근사한다.

일부 실시예에서, CAR은 적응 치료(adoptive therapy), 예를 들어, 암 마커 및/또는 설명된 항원과 같은 표적화 될 특정 세포 유형으로 발현된 마커와 같은, 특정 마커에 대해 특이성을 가지고 구성된다. 따라서, CAR은 전형적으로 항체의 하나 이상의 항원-결합 단편(antigen-binding fragment), 도메인 또는 항체의 일부, 또는 하나 이상의 항체 가변 도메인 및/또는 항체 분자를 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 CAR은 가변 무거운(variable heavy, VH) 사슬, 이의 항원-결합 부분 또는 단일 클론 항체(mAb)의 가변 무거운(variable heavy, VH) 및 가변 가벼운(variable light, VL) 사슬에서 유래된 scFv(single-chain antibody fragment, 단일 사슬 항체 단편)을 포함한다.

일 실시예에서, CAR은 세포의 표면 상에 발현되는 항원(예 : 손상되지 않은 항원)을 특이적으로 인식하는 항체 또는 항원 결합 단편(예 : scFv)을 포함한다.

일 실시예에서, 항원(또는 리간드)은 종양 항원 또는 암 마커이다. 일 실시예에서, 항원(또는 리간드)은 오퍼 티로신 키나제 수용체 ROR1(orphan tyrosine kinase receptor ROR1), BCMA(B cell maturation antigen), CAIX(carbonic anhydrase 9), tEGFR, Her2/neu(receptor tyrosine kinase erbB2), L1-CAM, CD19, CD20, CD22, 메소텔린(mesothelin), CEA, 및 B 형 간염 표면 항원(hepatitis B surface antigen), 항 엽산 수용체(anti-folate receptor), CD23, CD24, CD30, CD33, CD38, CD44, EGFR, EPG-2(epithelial glycoprotein 2), EPG-40(epithelial glycoprotein 40), EPHa2, erb-B2, erb-B3, erb-B4, erbB 다이머, EGFR vIII, FBP(folate binding protein), FCRL5, FCRH5, 태아 아세틸 콜린 수용체(fetal acetylcholine receptor), GD2, GD3, HMW-MAA, IL-22R-알파, IL-13R-알파2, kdr(kinase insert domain receptor), 카파경쇄(kappa light chain), 루이스 Y(Lewis Y), L1-CAM(L1-cell adhesion molecule), (MAGE)-A1(Melanoma-associated antigen), MAGE-A3, MAGE-A6, PRAME(Preferentially expressed antigen of melanoma), 서바이빙(surviving), TAG72, B7-H6, IL-13Ra2(IL-13 receptor alpha 2), CA9, GD3, HMW-MAA, CD171, G250/CAIX, HLA-AI MAGE Al, HLA-A2 NY-ESO-1, PSCA, 엽산 수용체-a(folate receptor-a), CD44v6, CD44v7/8, avb6 인테그린(avb6 integrin), 8H9, NCAM, VEGF 수용체, 5T4, 포에탈 AchR(Foetal AchR), NKG2D 리간드, CD44v6, 이중항원(dual antigen), 암-고환 항원(a cancer-testes antigen), 메소텔린(mesothelin), 쥐 CMV(murine CMV), 뮤신 1(MUC1), MUC16, PSCA, NKG2D, NY-ESO-1, MART-1, gp100, 태아항원(oncofetal antigen), ROR1, TAG72, VEGF-R2, CEA(carcinoembryonic antigen), Her2/neu, 에스트로겐 수용체(estrogen receptor), 프로게스테론 수용체(progesterone receptor), 에프린 B2(ephrinB2), CD123, c-Met, GD-2, O-아실화된 GD2(acetylated GD2, OGD2), CE7, WT-1(Wilms Tumor 1), 사이클린(a cyclin), 사이클린 A2, CCL-1, CD138, 병원균 특이적 항원 및 보편적 태그(tag)와 관련된 항원 및/또는 비오틴화 분자, 및/또는 HIV, HCV, HBV 또는 다른 병원체에 의해 발현되는 분자를 포함할 수 있다. 일부 실시예에서 수용체에 의해 표적화된 항원은 다수의 공지된 B 세포 마커 중 임의의 것과 같은 B 세포 악성 종양과 관련된 항원을 포함한다. 일부 실시예에서, 수용체에 의해 표적화 된 항원은 CD20, CD19, CD22, ROR1, CD45, CD21, CD5, CD33, Igκ, Igλ, CD79a, CD79b 또는 CD30이다.

일 실시예에서, 상기 항원은 병원체 특이적 항원이다. 일부 실시예태에서, 상기 항원은 바이러스 항원(HIV, HCV, HBV 등의 바이러스 항원과 같은), 박테리아 항원 및/또는 기생 항원이다.

일부 실시예에서, CAR은 MHC-펩티드 복합체로서.세포 표면 상에 제시되는 종양 관련 항원과 같은 세포 내 항원을 특이적으로 인식하는 항체 또는 항원 결합 단편(예: scFv)과 같은 TCR 유사 항체를 포함한다. 일 실시예에서, MHC-펩티드 복합체를 인식하는 항체 또는 이의 항원-결합 부분은 항원 수용체와 같은 재조합 수용체의 일부로서 세포 상에 발현될 수 있다. 항원 수용체 중에는 키메라 항원 수용체(CAR)와 같은 기능성 비-TCR 항원 수용체가 있다. 일반적으로, 펩타이드-MHC 복합체에 대해 지시된 TCR-유사 특이성을 나타내는 항체 또는 항원 결합 단편을 함유하는 CAR은 또한 TCR-유사 CAR로 지칭될 수 있다.

일부 실시예에서, CAR의 세포 외 부분, 예를 들어 이의 항체 부분은 항원 -인식 성분 사이의 스페이서 영역과 같은 스페이서(spacer)를 추가로 포함한다(예: scFv 및 횡단 도메인(transmembrane domain). 상기 스페이서는 경첩 영역, 예를 들어 IgG4 힌지 영역, CH1/CL, 및/또는 Fc 영역과 같은 면역 글로불린 불변 영역(the constant region) 또는 이의 변이체, 또는 변형된 버전(version)의 적어도 일부를 포함할 수 있다. 일 실시예에서, 상기 불변 영역 또는 부분은 IgG4 또는 IgG1과 같은 사람의 IgG이다. 스페이서는 스페이서 부재와 비교하여 항원 결합 후 세포의 증가된 반응성을 제공하는 길이일 수 있다. 일 실시예에서, 상기 스페이서는 길이가 약 12 아미노산 또는 12 아미노산 이하이다. 예시적인 스페이서는 적어도 약 10 내지 229 개의 아미노산, 약 10 내지 200 개의 아미노산, 약 10 내지 175 개의 아미노산, 약 10 내지 150 개의 아미노산, 약 10 내지 125 개의 아미노산, 약 10 내지 100 개의 아미노산, 10 내지 75 개의 아미노산, 약 10 내지 50 개의 아미노산, 약 10 내지 40 개의 아미노산, 약 10 내지 30 개의 아미노산, 약 10 내지 20 개의 아미노산 또는 약 10 내지 15 개의 아미노산을 포함하고, 여기에는 나열된 범위 중 하나의 끝점 사이에 있는 모든 정수를 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 스페이서 영역은 약 12 개 이하의 아미노산, 약 119 개 이하의 아미노산 또는 약 229 개 이하의 아미노산을 갖는다. 예시적인 스페이서로는 IgG4 힌지만, CH2 및 CH3 도메인에 연결된 IgG4 힌지, 또는 CH3 도메인에 연결된 IgG4 힌지를 포함한다. 이에 한정되는 것은 아니지만, 예시적인 스페이서로는 문헌 Hudecek 등. (2013) Clin. Cancer Res., 19:3153 또는 국제특허출원 공개번호 WO2014/031687에 기재되어 있다.

항원 인식 도메인과 같은 세포 외 리간드 결합은 일반적으로 하나 이상의 세포 내 신호 전달 성분과 연결되어 있고, 상기 세포 내 신호 전달 성분은 예를 들면, CAR의 경우에 TCR 복합체와 같은 항원 수용체 복합체 및/또는 다른 세포 표면 수용체를 통한 신호를 통한 활성화를 모방하는 신호 전달 성분을 포함한다. 일 실시예에서, 횡단막(transmembrane) 도메인은 세포 외 리간드 결합 및 세포 내 신호 도메인을 연결한다. 일 실시예에서, CAR은 세포 외 도메인에 융합된 횡단막 도메인을 포함한다. 일 실시예로, 수용체의 도메인 중 하나에 자연적으로 결합된 막 횡단 도메인(예 : CAR)이 사용된다. 일부 경우, 횡단막 도메인은 수용체 복합체의 다른 구성원과의 상호 작용을 최소화하기 위해 동일 또는 상이한 표면 막 단백질의 막 전 영역에 이러한 도메인이 결합하는 것을 피하기 위해 아미노산 치환에 의해 선택되거나 변형된다.

일 실시예에서 횡단막 도메인은 천연 또는 합성 소스로부터 유도된다. 소스(source)가 자연적인 경우, 일부 양태의 도메인은 임의의 막-결합 또는 횡단막 단백질로부터 유도된다. 횡단막 영역은 T-세포 수용체의 알파, 베타 또는 제타(zeta) 사슬로부터 유래된 것(즉, 적어도 막 관통 영역을 포함한다), CD28, CD3 엡실론, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137 또는 CD154을 포함한다. 일 실시예에서 횡단막 도메인은 합성한 것이다. 일부 양태에서, 합성한 횡단막 도메인은 주로 류신 및 발린과 같은 소수성 잔기를 포함한다. 일 양태에서, 페닐알라닌, 트립토판 및 발린의 삼중체는 합성 횡단막 도메인의 각 말단에서 발견될 것이다. 일부 실시예에서, 결합(linkage)은 링커, 스페이서 및/또는 횡단막 도메인(들)에 의한 것이다

일 실시예에서, 글리신 및 세린, 예를 들어, 글리신-세린 이중선을 함유하는 것과 같은 짧은 올리고(oligo)- 또는 폴리펩티드 링커(예:길이가 2 내지 10 개 아미노산인 링커)가 횡단막 도메일과 CAR의 세포질 신호 도메인 사이에 존재하고, 결합을 형성한다.

재조합 수용체(예: CAR)은 일반적으로 적어도 하나의 세포 내 신호 전달 성분을 포함한다. 일 실시예에서, 수용체는 T-세포 활성화 및 세포 독성을 매개하는 TCR CD3 사슬(예: CD3 제타 사슬)와 같은 TCR 복합체의 세포 내 성분을 포함한다. 따라서, 일부 양태에서, 항원-결합 부분은 하나 이상의 세포 신호 전달 모듈에 연결된다. 일 실시예에서, 세포 신호 전달 모듈은 CD3 횡단막 도메인, CD3 세포 내 신호 전달 도메인 및/또는 다른 CD 막 횡단 도메인을 포함한다. 일 실시예에서, 수용체(예:CAR)은 Fc 수용체 γ(Fc receptor γ), CD8, CD4, CD25 또는 CD16과 같은 하나 이상의 추가적인 분자의 부분을 더 포함한다. 예를 들어, 일부 양태에서, CAR 또는 다른 키메라 수용체는 CD3-제타(CD3-ζ) 또는 Fc 수용체 γ 및 CD8, CD4, CD25 또는 CD16 사이의 키메라 분자를 포함한다.

일부 실시예에서, CAR 또는 다른 키메라 수용체의 연결시, 수용체의 세포질 도메인 또는 세포 내 신호 도메인은 정상적인 작동자 기능(normal effector functions) 또는 면역 세포의 반응 중 하나 이상을 활성화시킨다(예: CAR를 발현하도록 조작된 T 세포). 예를 들어, 일부 상황에서, CAR은 사이토 카인 또는 다른 인자의 분비(secretion)와 같은 세포 용해 활성(cytolytic activity) 또는 T- 헬퍼 활성과 같은 T 세포의 기능을 유도한다. 일부 실시예에서, 항원 수용체 성분 또는 보조 자극 분자의 세포 내 신호 전달 도메인의 절단된 부분(truncated portion)이, 예를 들면, 작동자 기능(normal effector functions) 신호를 변환(tranduce)하는 경우, 손상되지 않은 면역 자극 사슬 대신에 사용된다. 일부 실시예에서, 세포 내 신호 전달 도메인은 T 세포 수용체(TCR)의 세포질 서열을 포함하고, 일부 측면에서, 자연적 상황에서 항원 수용체, 분자의 임의의 유도체 또는 변이체, 및/또는 동일한 기능적 능력을 갖는 임의의 합성 서열과 결합 후 신호 전달을 개시하기 위해 그러한 수용체와 협력하여 작용하는 보조 수용체를 포함한다.

자연적 TCR의 맥락에서, 완전한 활성화는 일반적으로 TCR을 통한 신호 전달뿐만 아니라 동시 자극 신호를 필요로 한다. 따라서, 일부 실시예에서, 완전한 활성화를 촉진시키기 위해, 보조 또는 공동-자극 신호를 발생시키는 성분이 또한 CAR에 포함된다. 　 다른 실시예에서, CAR은 보조 자극 신호를 생성하기 위한 구성 요소를 포함하지 않는다. 일부 실시예에서, 추가적인 CAR이 동일한 세포에서 발현되며, 2차 또는 보조 자극(costimulatory) 신호를 생성하기 위한 성분을 발현한다.

일 양태에서. T 세포 활성화는 세포질 신호 전달 서열의 적어도 두 가지 부류, 즉 TCR(일차적 인 세포질 신호 서열)을 통해 항원 의존적 1차 활성화를 개시하는 것들 및 2 차 또는 공동 자극 신호 (2차 세포질 신호 서열)를 제공하기 위해 항원 비-의존적인 방식으로 작용하는 것들로 설명된다. 일부 양태에서, CAR은 그러한 신호 구성 요소들(signaling components) 중 하나 또는 둘 모두를 포함한다.

일부 양태에서, CAR은 TCR 복합체의 1차 활성화를 조절하는 1차 세포질 신호 서열(primary cytoplasmic signaling sequence)을 포함한다. 자극적인 방식으로 작용하는 1 차 세포질 신호 서열은 면역 수용체 티로신-기반 활성 모티프 또는 ITAMs로 알려진 시그널 모티프를 포함할 수 있다. 1차 세포질 신호 전달 서열을 함유하는 ITAM의 예로는 TCR 제타, FcR 감마, FcR 베타, CD3 감마, CD3 델타, CD3 엡실론, CD8, CD22, CD79a, CD79b 및 CD66d로부터 유래된 것을 포함한다. 일부 실시예에서, CAR의 세포질 신호 전달 분자(들)는 세포질 신호 전달 도메인, 그의 부분, 또는 CD3 제타로부터 유래된 서열을 포함한다.

일 실시예에서, 상기 CAR은 CD28, 4-1BB, OX40, CD27, DAP10 및 ICOS와 같은 보조 자극 수용체의 신호 도메인 및/또는 횡단막 부분을 포함한다. 일부 양태에서, 동일한 CAR은 활성화 및 보조 자극 성분을 모두 포함한다.

일 실시예에서, 활성화 도메인은 하나의 CAR 내에 포함되는 반면, 보조 자극 성분은 또 다른 항원을 인식하는 또 다른 CAR에 의해 제공된다. 일 실시예태에서, 상기 CARs는 둘 다 동일한 세포 상에 발현되는 활성화 또는 자극성 CAR 및 보조 자극 CAR을 포함한다(WO2014/055668 참조). 일부 실시예에서, CAR은 자극성 또는 활성화 CAR이다; 다른 양태에서는 보조 자극 CAR입니다. 일 실시예에서, 상기 세포는 다른 항원을 인식하는 CAR과 같은 억제 CAR(iCARs, Fedorov et al., Sci. Transl. Medicine, 5 (215), 2013년 12 월) 참조)를 포함하며, 반면에 제1 항원을 인식하는 CAR을 통해 전달된 활성화 신호는 예를 들어 오프-타겟 효과(off-target effects)를 감소시키기 위해 억제성 CAR이 이의 리간드에 결합함으로써 감소되거나 억제된다.

일부 실시예에서, CD8+ 세포 독성 T 세포의 세포 내 신호 전달 도메인은 CD4 + 헬퍼 T 세포의 세포 내 신호 전달 도메인과 동일하다. 일 실시예에서, CD8+ 세포 독성 T 세포의 세포 내 신호 전달 도메인은 CD4+ 헬퍼 T 세포의 세포 내 신호 도메인과 다르다.

특정 실시예에서, 세포 내 신호 전달 도메인은 CD3(예를 들어, CD3-제타) 세포 내 도메인에 연결된 CD28 막 관통 및 신호 도메인을 포함한다. 일 실시예에서, 세포 내 신호 전달 도메인은 CD3 제타 세포 내 도메인에 연결된 키메라 CD28 및 CD137(4-1BB, TNFRSF9) 보조 자극 도메인을 포함한다.

일 실시예에서, 상기 CAR은 세포질 부분에 하나 이상의 보조 자극 도메인 및 예를 들어 1차 활성화 도메인과 같은 하나 이상의 보조 자극 도메인을 포함한다. 예시적인 CARs로는 CD3-제타, CD28 및 4-1BB의 세포 내 성분을 포함한다.

경우에 따라 CAR은 1 세대, 2 세대 및/또는 3 세대 CAR로 불린다. 일부 양태에서, 1 세대 CAR은 항원 결합시 단독으로 CD3-사슬 유도 신호를 제공하는 것이다; 일부 양태에서, 2 세대 CAR은 CD28 또는 CD137과 같은 보조 자극 수용체로부터의 세포 내 신호 전달 도메인을 포함하는 것과 같은 신호 및 보조 자극 신호를 제공하는 것이다; 일부 양태에서, 3 세대 CAR은 상이한 보조 자극 수용체의 복수의 보조 자극 도메인을 포함하는 것이다.

일부 실시예에서, 키메라 항원 수용체는 항체 또는 그의 단편과 같은 항원-결합 부분과 세포 내 도메인에서와 같은 세포 외 리간드-결합 부분을 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 항체 또는 단편은 scFv 또는 단일 도메인 VH 항체를 포함하고, 세포 내 도메인은 ITAM을 함유한다. 일부 실시예에서, 세포 내 신호 전달 도메인은 CD3-제타(CD3ζ) 사슬의 제타 사슬 신호 도메인을 포함한다. 일 실시예에서, 키메라 항원 수용체는 세포 외 도메인 및 세포 내 신호 전달 도메인을 연결하는 횡단막 도메인을 포함한다. 일 양태에서, 횡단막 도메인은 CD28의 막 관통 부분을 포함한다. 세포 외 도메인과 횡단막(transmembrane)은 직접 또는 간접적으로 연결될 수 있다. 일 실시예에서, 세포 외 도메인 및 횡단막은 본원에 기재된 임의의 것과 같은 스페이서에 의해 연결된다. 일 실시예에서, 키메라 항원 수용체는 , 예를 들어, 횡단막 도메인 및 세포 내 신호 도메인 사이와 같은 T 세포 보조 자극 분자(T cell costimulatory molecule)의 세포 내 도메인을 포함한다. 일 양태에서, 상기 T 세포 보조 자극 분자는 CD28 또는 4-1BB이다.

일 실시예에서, 상기 CAR은 항제(예:항체 단편), CD28의 횡단막 또는 그 기능적 변이체인 횡단막 도메인, 세포 내 신호 전달 도메인을 포함하며, 세포 내 신호 전달 도메인은 CD28 또는 그 기능적 변이체의 신호 부분 및 CD3 제타의 신호 부분 또는 이의 기능적 변이체를 포함한다. 일 실시예에서, 상기 CAR은 항제(예:항체 단편), CD28 또는 그의 기능적 변이체의 횡단막 부분이거나 이를 함유하는 횡단막 도메인, 및 4-1BB의 신호 부분 또는 이의 기능적 변이체 및 CD3 제타의 신호 부분 또는 이의 기능적 변이체를 함유하는 세포 내 신호 전달 도메인을 포함한다. 이러한 일 실시예에서, 상기 수용체는 Ig 분자의 일부를 함유하는 스페이서를 더 포함하고, 상기 Ig 분자는 Ig 힌지(hinge)와 같은 인간 Ig(예: 힌지 전용 스페이서와 같은 IgG4 힌지)분자일 수 있다.

일부 실시예에서, 상기 수용체의 횡단막 도메인은 예를 들어, CAR은 인간 CD28 횡단막 도메인 또는 그의 변이체, 예를 들어 인간 CD28(수탁 번호 : P10747.1)의 27-아미노산 횡단막 도메인이다. 일 실시예에서, 상기 세포 내 도메인은 인간 CD28 또는 이의 기능적 변이체의 세포 내 보조 자극 신호 도메인을 포함하며, 예를 들면, 41 아미노산 도메인 및/또는 천연 CD28 단백질의 186~187 위치에서 LL 대 GG 치환을 갖는 그러한 도메인을 포함한다. 일 실시예에서, 상기 세포 내 도메인은 4-1BB의 세포 내 보조 자극 신호 도메인 또는 이의 기능적 변이체를 포함하며, 예를 들면, 인간 4-1BB(수탁번호 Q07011.1)의 42 아미노산 세포질 도메인)과 같은 아미노산 서열을 포함한다. 일 실시예에서, 상기 세포 내 신호 전달 도메인은 인간 CD3 제타 자극 신호 도메인 또는 이의 기능적 변이체를 포함하며, 예를 들면, 미국 특허 제7,446,190호에 기술된 바와 같은 인간 CD3ζ(수탁번호:P20963.2)의 이소폼 3(isoform 3)의 112AA 세포질 도메인 또는 CD3 제타 신호 도메인을 포함한다. 일 양태에서, 상기 스페이서는 IgG4 또는 IgG1 힌지(hinge)와 같은 IgG의 힌지 영역만을 포함한다. 다른 실시예에서, 상기 스페이서는 CH2 및/또는 CH3 도메인에 연결된 Ig 힌지 (예 : IgG4 힌지)이다. 일부 실시예에서, 상기 스페이서는 CH2 및 CH3 도메인에 연결된 Ig 힌지, 예를 들어, IgG4 힌지이다. 일부 실시예에서, 상기 스페이서는 Ig 힌지, 예를 들어 CH3 도메인에만 연결된 IgG4 힌지이다. 일부 실시예에서, 상기 스페이서는 글리신-세린 리치 서열(rich sequence) 또는 공지된 가요성 링커(flexible linker)와 같은 다른 가요성 링커이거나, 이를 포함한다.

예를 들어, 일부 실시예에서, CAR은 다음을 포함한다: 항원에 특이적으로 결합하는 세포 외 리간드-결합 부분, 예컨대 sdAb 및 scFv를 포함하는 항체 또는 그의 단편과 같은 항원-결합 부분; 임의의 Ig-힌지 함유 스페이서와 같은 스페이서; CD28 또는 그의 변이체의 일부인 횡단막 도메인; CD28 또는 그의 기능적 변이체의 신호 부분을 포함하는 세포 내 신호 전달 도메인(intracellular signaling domain); 및 CD3 제타 신호 도메인의 신호 부분 또는 그의 기능적 변이체를 포함한다. 일부 실시예에서, CAR은 다음을 포함한다: 항원에 특이 적으로 결합하는 세포 외 리간드-결합 부분, 예컨대 sdAb 및 scFv를 포함하는 항체 또는 그의 단편과 같은 항원-결합 부분; 본 명세서에 기재된 항원; 임의의 Ig-힌지 함유 스페이서와 같은 스페이서; CD28 또는 그의 변이체의 일부인 횡단막 도메인; 4-1BB의 신호 부분 또는 이의 기능적 변이체를 함유하는 세포 내 신호 전달 도메인; 및 CD3 제타 신호 도메인의 신호 부분 또는 그의 기능적 변이체를 포함한다. 일부 실시예에서, 이러한 CAR 구조물은 T2A 리보좀 스킵 요소(ribosomal skip element) 및/또는 tEGFR 서열, 예를 들어 CAR의 하류(downstream)를 추가로 포함한다.

B. T 세포 수용체(T Cell Receptors, TCRs)

일부 실시예에서, 재조합 단백질은 재조합 T 세포 수용체 (TCR)이거나, 이를 포함한다. 일 실시예에서, 재조합 TCR은 항원, 일반적으로 종양 특이적 항원과 같은 표적 세포 상에 존재하는 항원, 자가 면역성 또는 염증성 질환과 관련된 특정 세포 유형에서 발현된 항원, 또는 바이러스성 병원체 또는 세균성 병원체로부터 유래된 항원에 특이적이다. 일 실시예에서, TCR은 자연 발생 T 세포로부터 복제(cloned)된 것이다. 일 실시예에서, 표적 항원(예를 들어, 암 항원)에 대한 고-친화성 T 세포 클론이 환자로부터 확인 및 분리된다. 일 실시예에서, 표적 항원에 대한 TCR 클론은 인간 면역계 유전자(예를 들어, 인간 백혈구 항원 시스템 또는 HLA)로 조작된 유전자 이식 마우스에서 생성되었다. 예를 들어, 문헌(tumor antigens (e.g., Parkhurst 등. (2009) Clin Cancer Res. 15:169-180 and Cohen 등. (2005) J Immunol. 175:5799-5808.)을 참조한다. 일부 실시 양태에서, 파지 디스플레이(phage display)는 표적 항원에 대한 TCR을 단리(isolate)하는데 사용된다(예를 들어, Varela-Rohena 등 (2008) Nat Med. 14 : 1390-1395 및 Li (2005) Nat Biotechnol.23 : 349-354 . 참조).

일 실시예에서, T 세포 클론이 수득된 후, TCR 알파 및 베타 사슬이 단리되고, 유전자 발현 벡터 내로 복제(clone)된다. 일 실시예에서, TCR 알파 및 베타 유전자는 피코르 바이러스 2A 리보좀 스킵 펩타이드(picornavirus 2A ribosomal skip peptide)를 통해 연결되어 양 사슬이 함께 발현된다. 일 실시예태에서, TCR을 코딩하는 핵산은 수용체를 발현시키기 위한 세포의 형질 도입 또는 조작을 확인하기 위한 마커를 추가로 포함한다.

Ⅳ. 정의

다르게 정의되지 않는 한, 여기에 사용 된 모든 기술, 표기 및 다른 기술적 및 과학적 용어 또는 용어는 청구된 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는 것으로 의도된다. 몇몇 경우에, 일반적으로 이해되는 의미를 갖는 용어는 명료성 및/또는 용이한 참조를 위해 본 명세서에서 정의되며, 본 명세서에서의 그러한 정의 포함은 반드시 당해 기술 분야에서 일반적으로 이해되는 것 이상의 실질적인 차이를 나타내는 것으로 해석되어서는 안 된다.

본 명세서에서 사용된 단수 형태 "a", "an" 및 "the"는 문맥상 다르게 지시하지 않는 한 복수 대상을 포함한다. 예를 들어, "a" 또는 "an"은 "적어도 하나" 또는 "하나 이상"을 의미한다. 본 명세서에 기재된 측면 및 변형은 양상 및 변형의 "구성된" 및/또는 "본질적으로 이루어진"을 포함하는 것으로 이해된다. 본 명세서에서 사용된 "및/또는"이라는 용어는 하나 이상의 관련 열거된 항목의 임의의 그리고 모든 가능한 조합을 가리키며 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 경우, "포함하는(includes)", "포함하는(including)" 및/또는 "포함하는(comprises)"이라는 용어는 명시된 특징, 정수, 단계, 동작, 구성 요소 및/또는 구성 요소의 존재를 특정함으로 이해해야 한다. 하나 이상의 다른 특징, 정수, 단계, 동작, 요소, 성분, 단위 및/또는 이들의 그룹의 존재 또는 추가를 배제하지 않는다.

본 출원은 텍스트 및 도면에서 몇 가지 수치 범위를 개시한다. 개시된 수치 범위는 개시된 수치 범위를 통해 실시될 수 있기 때문에 본 명세서에서 정확한 범위 제한이 본 명세서에 축약되어 있지 않더라도 개시 지점을 포함하여 개시된 수치 범위 내의 임의의 범위 또는 값을 본질적으로 지지한다.

본 명세서에 사용된 용어 "벡터"는 그것이 연결된 다른 핵산을 증식시킬 수 있는 핵산 분자를 말한다. 상기 용어는 도입된 숙주 세포의 게놈에 혼입된 벡터뿐만 아니라 자기 복제 핵산 구조로서의 벡터를 포함한다. 특정 벡터는 작동 가능하게 연결된 핵산의 발현을 지시할 수 있다. 이러한 벡터는 본 명세서에서 "발현 벡터"로 지칭된다. 벡터 중에는 레트로 바이러스(예: 감마 레트로 바이러스 및 렌티 바이러스 벡터)와 같은 바이러스 벡터가 있다.

용어 "숙주 세포(host cell)", "숙주 세포주(host cell line)"및 "숙주 세포 배양물(host cell culture)"은 동일한 의미로 사용되며, 이러한 세포의 자손을 포함하여 외인성 핵산이 도입된 세포를 지칭한다. 숙주 세포는 "형질 전환체(transformants)" 및 "형질 전환된 세포(transformed cells)"를 포함하는데, 여기에는 최초의 형질 전환된 세포 및 그로부터 파생된 자손이 계대의 수에 관계없이 포함된다. 자손은 핵산이 부모 세포와 완전히 동일하지는 않지만 돌연변이를 포함할 수 있습니다. 본래 형질 전환된 세포에서 스크리닝되거나 선택된 것과 동일한 기능 또는 생물학적 활성을 갖는 돌연변이 자손이 본 명세서에 포함된다.

본 명세서에 사용된 바와 같이, 세포 또는 세포 집단이 특정 마커에 대해 "양성"이라는 진술은 특정 마커, 전형적으로 표면 마커의 세포 또는 세포 내에서의 검출 가능한 존재를 나타낸다. 표면 마커를 언급할 때, 상기 용어는 예를 들어, 마커에 특이적으로 결합하는 항체로 염색하고 상기 항체를 검출함으로써 유세포 분석에 의해 검출 된 표면 발현의 존재를 말하며, 상기 염색은 유세포 분석에 의해 동일한 조건 하에서 및/또는 마커에 대해 양성인 것으로 공지된 세포 및/또는 실질적으로 더 높은 수준에서 실질적으로 유사한 수준에서 동일한 방법을 수행하여 검출된 염색보다 실질적으로 높은 수준 마커가 음성인 것으로 알려진 세포보다 더 높은 수준이다.

본 명세서에서 사용된 세포 또는 세포 집단이 특정 마커에 대해 "음성"이라는 것은 특정 마커, 전형적으로 표면 마커의 세포 상 또는 세포 내에서 실질적으로 검출 가능한 존재가 부재하다는 것을 나타낸다. 표면 마커를 언급할 때, 이 용어는 예를 들어, 마커에 특이 적으로 결합하는 항체로 염색하고 유세포 분석에 의해 검출되지 않는 상기 항체를 검출함으로써, 유동 세포 계측법에 의해 검출 된 표면 발현의 부재를 지칭한다. 동일한 조건 하에서 이소 타입-매치된 대조군을 사용하여 동일 절차를 수행하여 검출된 염색보다 실질적으로 높은 수준에서, 및/또는 마커에 대해 양성인 것으로 알려진 세포에 대한 수준보다 실질적으로 낮은 수준으로, 및/또는 마커에 대해 음성인 것으로 알려진 세포에 대한 것과 실질적으로 유사하다.

본 명세서에 사용된 바와 같이, 조성물은 세포를 비롯한 2 종 이상의 제품, 물질 또는 화합물의 임의의 혼합물을 지칭한다. 이는 용액, 현탁액, 액체, 분말, 페이스트, 수성, 비수성 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다.

본 명세서에 사용된 바와 같이, "대상 또는 대상체(subject)"는 인간 또는 다른 동물과 같은 포유 동물이며 전형적으로 인간이다.

본 출원서에 언급된 특허 문서, 과학 기사 및 데이터베이스를 포함한 모든 간행물은 각 개별 간행물이 개별적으로 참조로 포함된 것과 같은 정도로 모든 목적을 위해 그 전체가 참조로 포함된다. 본 명세서에 기재된 정의가 본 명세서에 참고 문헌으로 인용된 특허, 출원, 공개된 출원 및 기타 공보에 기재된 정의와 상반되거나 그렇지 않으면 일치하지 않는 경우, 본원에 기재된 정의는 본 명세서에 참고로 인용된 정의에 우선한다.

본 명세서에서 사용된 섹션 표제(section heading)는 단지 조직적인 목적을 위한 것이며, 설명된 발명을 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다.

Ⅳ. 정의

다르게 정의되지 않는 한, 여기에 사용된 모든 기술, 표기 및 다른 기술적 및 과학적 용어 또는 용어는 청구된 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는 것으로 의도된다. 몇몇 경우에, 일반적으로 이해되는 의미를 갖는 용어는 명료성 및/또는 용이한 참조를 위해 본 명세서에서 정의되며, 본 명세서에서의 그러한 정의 포함은 반드시 당해 기술 분야에서 일반적으로 이해되는 것 이상의 실질적인 차이를 나타내는 것으로 해석되어서는 안 된다.

Ⅴ. 예시적인 실시예들(EXEMPLARY EMBODIMENTS)

본 명세서에서 제공되는 실시예 중에 :

실시예 1.

공급 포트, 샘플링(sampling) 포트 및 관류 포트를 포함하는 복수의 포트를 포함하는 상부 표면;

하부 표면;

상기 관류 포트에 유체적으로 연결된 관류 필터; 및

생물 반응기 백의 관류 포트에 유체적으로 연결된 폐기물 백(waste bag);을 포함하는 생물 반응기 백(bag) 조립체.

실시예 2.

실시예 1에 있어서, 상기 생물 반응기 백의 상부 표면은 제1단부 및 상기 제1단부에 대향하는 제2단부를 가지며, 관류 포트는 제1단부 보다 제2단부에 더 가까운 것을 특징으로 하는 생물 반응기 백 조립체.

실시예 3.

실시예 1 또는 2에 있어서, 상기 공급 포트 및 샘플링 포트는 상기 제2단부 보다 상기 제1단부에 더 가까운 것을 특징으로 하는 생물 반응기 백 조립체.

실시예 4.

실시예 1 내지 3에 있어서, 생물 반응기 백의 상기 상부 표면은 제1측부 및 상기 제1측부에 대향하는 제2측부를 가지며, 상기 공급 포트는 제2측부 보다 제1측부에 가까운 것을 특징으로 하는 생물 반응기 백(bag) 조립체.

실시예 5.

실시예 4에 있어서, 상기 샘플링 포트는 상기 제1측부 보다 제2측부에 더 가까운 것을 특징으로 하는 생물 반응기 백 조립체.

실시예 6.

실시예 4 또는 5에 있어서, 상기 관류 포트는 제1측부 보다 제2측부에 더 가까운 것을 특징으로 하는 생물 반응기 백 조립체.

실시예 7.

실시예 1 내지 6 중에서 선택된 어느 한 실시예에 있어서, 상기 관류 필터는 생물 반응기 백 내부에 있는 것을 특징으로 하는 생물 반응기 백 조립체.

실시예 8.

실시예 1 내지 7 중에서 선택된 어느 한 실시예에 있어서 상기 공급 포트에 유체 적으로 연결된 공급 배관 장치(feed tubing arrangement)를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 생물 반응기 백 조립체.

실시예 9.

실시예 8에 있어서, 상기 공급 배관 장치는 폴리비닐클로라이드(PVC) 배관을 포함하는 것을 특징으로 하는 생물 반응기 백 조립체.

실시예 10.

실시예 8 또는 9에 있어서, 상기 공급 배관 장치는 2개의 유입구를 구비한 Y-커넥터를 포함하는 것을 특징으로 하는 생물 반응기 백 조립체.

실시예 11.

실시예 1 내지 10 중에서 선택된 어느 한 실시예에 있어서, 상기 샘플링 포트에 유체적으로 연결된 샘플링 배관 장치를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 생물 반응기 백 조립체.

실시예 12.

실시예 11에 있어서, 상기 샘플링 배관 장치는 PVC 배관을 포함하는 것을 특징으로 하는 생물 반응기 백 조립체.

실시예 13.

실시예 1 내지 12 중에서 선택된 어느 한 실시예에 있어서, 상기 폐기물 백은 폐기물 배관 장치를 통해 사이 관류 포트에 유체적으로 연결되는 것을 특징으로 하는 생물 반응기 백 조립체.

실시예 14.

실시예 13에 있어서, 상기 페기물 배관 장치는 PVC 배관을 포함하는 것을 특징으로 하는 생물 반응기 백 조립체.

실시예 15.

실시예 1 내지 14 중에서 선택된 어느 한 실시예에 있어서, 상기 복수의 포트는 가스 유입 포트 및 가스 배출 포트를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 생물 반응기 백 조립체.

실시예 16.

실시예 15에 있어서, 생물 반응기 백의 상부 표면은 제1단부 및 제2단부 사이 중간에 있는 중간부를 가지며, 상기 가스 유입 포트 및 상기 가스 배출 포트는 제1단부 또는 제2 단부 보다 중간에 더 가까운 것을 특징으로 하는 생물 반응기 백 조립체.

실시예 17.

실시예 15 또는 16에 있어서, 상기 복수의 포트는 공급 포트, 샘플링 포트, 관류 포트, 가스 유입 포트 및 가스 배출 포트로 구성되는 것을 특징으로 하는 생물 반응기 백 조립체.

실시예 18.

실시예 15 내지 17 중에서 선택된 어느 한 실시예에 있어서, 가스 유입 포트에 유체적으로 연결된 유입 필터를 포함하는 가스 유출 배관 장치 및 가스 배출 포트에 유체적으로 연결된 배기 필터(exhaust filter)를 포함하는 가스 배출 배관 장치를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 생물 반응기 백 조립체.

실시예 19.

생물 반응기 로커(rocker); 및

생물 반응기 로커 상에 지지된 생물 반응기 백을 포함하고,

상기 생물 반응기 백은

하부 표면;

상기 관류 포트에 유체적으로 연결된 관류 필터; 및

생물 반응기 백의 관류 포트에 유체적으로 연결된 폐기물 백(waste bag);을 포함하는 것을 특징으로 하는 생물 반응기 시스템.

실시예 20.

실시예19에 있어서, 상기 공급 포트에 유체적으로 연결된 공급 배관 장치를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 생물 반응기 시스템.

실시예 21.

실시예 20에 있어서, 상기 공급 배관 장치는 제1유입구 및 제2유입구를 구비한 공급 배관 장치인 Y-커넥터를 포함하는 것을 특징으로 하는 생물 반응기 시스템.

실시예 22.

실시예 21에 있어서, 상기 세포 배지 공급원(cell media source)은 공급 배관 장치의 각 유입구에 유체적으로 연결된 것을 특징으로 하는 생물 반응기 시스템.

실시예 23.

실시예 22에 있어서, 각 유입구는 PVC를 포함하고, 세포 배지 공급원은 유입구의 PVC에 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 생물 반응기 시스템.

실시예 24.

실시예 21에 있어서, 세포원은 제1 유입구와 유체적으로 연결되어 있고, 세포 배지 공급원은 제2유입구와 유체적으로 연결되어 있는 것을 특징으로 하는 생물 반응기 시스템.

실시예 25.

실시예 24에 있어서, 각 유입구는 PVC를 포함하고, 상기 세포원은 제1유입구의 PVC와 결합되어 있고, 상기 세포 배지 공급원은 제2유입구의 PVC와 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 생물 반응기 시스템.

실시예 26.

실시예 19 내지 25 중 어느 한 실시예에 있어서, 상기 관류 필터는 생물 반응기 백 내부에 있는 것을 특징으로 하는 생물 반응기 시스템.

실시예 27.

실시예 19 내지 26 중 어느 한 실시예에 있어서, 생물 반응기 백의 상부 표면은 제1단부 및 제1단부에 대향하는 제2단부를 가지며, 상기 관류 포트는 제1단부 보다 제2단부에 더 가까운 것을 특징으로 하는 생물 반응기 시스템.

실시예 28.

실시예 27에 있어서, 상기 공급 포트 및 샘플링 포트는 제2단부 보다 제1단부에 더 가까운 것을 특징으로 하는 생물 반응기 시스템.

실시예 29.

실시예 19 내지 28 중 어느 한 실시예에 있어서, 생물 반응기 백의 상부 표면은 제1측부 및 제1측부에 대향하는 제2단면을 가지며, 상기 공급 포트는 제2측부 보다 제1측부에 더 가까운 것을 특징으로 하는 생물 반응기 시스템.

실시예 30.

실시예 29에 있어서, 상기 샘플링 포트는 제1측부 보다 제2측부에 더 가까운 것을 특징으로 하는 생물 반응기 시스템.

실시예 31.

실시예 29 또는 실시예 30에 있어서, 상기 관류 포트는 제1측부 보다 제2측부에 더 가까운 것을 특징으로 하는 생물 반응기 시스템.

실시예 32.

실시예 19 내지 31 중 어느 한 실시예에 있어서, 상기 관류 포트는 생물 반응기 백 내부에 있는 것을 특징으로 하는 생물 반응기 시스템.

실시예 33.

실시예 19 내지 32 중 어느 한 실시예에 있어서, 상기 공급 포트에 유체적으로 연결된 공급 배관 장치를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 생물 반응기 시스템.

실시예 34.

실시예 33에 있어서, 상기 공급 배관 장치는 폴리비닐클로라이드(PVC) 배관을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 생물 반응기 시스템.

실시예 35.

실시예 33 또는 34에 있어서, 상기 공급 배관 장치는 2개의 유입구를 가지는 공급 배관 장치인 Y-커넥터를 포함하는 것을 특징으로 하는 생물 반응기 시스템.

실시예 36.

실시예 19 내지 35중 어느 한 실시예에 있어서, 상기 샘플링 포트와 유체적으로 연결된 샘플링 배관 장치를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 생물 반응기 시스템.

실시예 37.

실시예 36에 있어서, 상기 샘플링 배관 장치는 PVC 배관을 포함하는 것을 특징으로 하는 생물 반응기 시스템.

실시예 38.

실시예 19 내지 37 중 어느 한 실시예에 있어서, 상기 폐기물 백은 폐기물 배관 장치를 통해서 관류 포트에 유체적으로 연결되는 것을 특징으로 하는 생물 반응기 시스템.

실시예 39.

실시예 38에 있어서, 상기 폐기물 배관 장치는 PVC 배관을 포함하는 것을 특징으로 하는 생물 반응기 시스템.

실시예 40.

실시예 19 내지 39 중 어느 한 실시예에 있어서, 상기 복수의 포트는 가스 유입 포트 및 가스 배출 포트를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 생물 반응기 시스템.

실시예 41.

실시예 40에 있어서, 생물 반응기 백의 상기 상부 표면은 제1단부 및 제2단부 사이 중간에 있는 중간부를 가지며, 상기 가스 유입 포트 및 상기 가스 배출 포트는 제1단부 또는 제2 단부 보다 중간에 더 가까운 것을 특징으로 하는 생물 반응기 시스템.

실시예 42.

실시예 40 또는 41에 있어서, 상기 복수의 포트는 공급 포트, 샘플링 포트, 관류 포트, 가스 유입 포트 및 가스 배출 포트로 구성된 것을 특징으로 하는 생물 반응기 시스템.

실시예 43.

실시예 40 내지 42 중 어느 한 실시예에 있어서, 가스 유입 포트에 유체적으로 연결된 유입 필터를 포함하는 가스 유출 배관 장치 및 가스 배출 포트에 유체적으로 연결된 배기 필터(exhaust filter)를 포함하는 가스 배출 배관 장치를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 생물 반응기 시스템.

실시예 44.

생물 반응기 백 조립체의 생물 반응기 백을 제공하는 단계;

공급 포트를 통하여 생물 반응기 백에 세포 배지(cell media)를 공급하는 단계;

상기 공급 포트를 통하여 생물 반응기 백에 세포를 공급하는 단계;

생물 반응기 로커로부터 제공되는 교반을 사용하여 생물 반응기 백에서 세포를 배양(cultivating)하는 단계;

관류 포트를 통하여 폐여과물을 폐기물 백으로 이송하는 단계; 및

배양된 세포를 수득하는 단계;를 포함하며,

상기 생물 반응기 백 조립체는 공급 포트, 샘플링(sampling) 포트 및 관류 포트를 포함하는 복수의 포트를 포함하는 상부 표면; 하부 표면; 상기 관류 포트에 유체적으로 연결된 관류 필터; 및 생물 반응기 백의 관류 포트에 유체적으로 연결된 폐기물 백(waste bag);을 포함하는 것을 특징으로 하는 생물 반응기 시스템 사용 방법.

실시예 45.

실시예 44에 있어서, 상기 생물 반응기 백 조립체는 공급 포트에 유체적으로 연결된 공급 배관 장치를 포함하며, 상기 공급 배관 장치는 제1유입구 및 제2유입구를 구비한 공급 배관 장치인 Y-커넥터를 포함하는 것을 특징으로 하는 생물 반응기 시스템 사용 방법.

실시예 46.

실시예 45에 있어서, 상기 세포 배지(cell media)는 세포 배지 공급원을 제1유입구에 결합시켜서 첨가되는 것을 특징으로 하는 생물 반응기 시스템 사용 방법.

실시예 47.

실시예 45에 있어서, 상기 세포는 제1유입구에 세포원을 결합시켜서 첨가하는 것을 특징으로 하는 생물 반응기 시스템 사용 방법.

실시예 48.

실시 예45에 있어서, 세포 배지는 세포 배지 공급원을 제1유입구에 결합시켜서 첨가하고, 상기 세포는 세포 공급원을 제2유입구에 결합시켜서 첨가하는 것을 특징으로 하는 생물 반응기 시스템 사용 방법.

실시예 49.

실시예 44 내지 48 중 어느 한 실시예에 있어서, 상기 복수 개의 포트는 가스 유입 포트 및 가스 배출 포트를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 생물 반응기 시스템 사용 방법.

실시예 50.

실시예 49에 있어서, 상기 세포를 배양하기 위한 가스를 상기 가스 유입구를 통해 상기 생물 반응기 백에 공급하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 생물 반응기 시스템 사용 방법.

실시예 51.

실시예 50에 있어서, 가스 배출 포트를 통해서 배기시켜서 생물 반응기 백으로부터 가스 일부를 제거하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 생물 반응기 시스템 사용 방법.

실시예 52.

실시예 45에 있어서, 수득 백(harvest bag)을 제1유입구 또는 제2유입구에 결합하고, 공급 배관 장치의 유동 방향을 역전시켜서 배양된 세포를 수득하는 것을 특징으로 하는 생물 반응기 시스템 사용 방법.

실시예 53.

실시예 44 내지 52 중 어느 한 실시예에 있어서, 상기 복수의 포트는 가스 유입 포트를 포함하고, 가스 유입 포트를 통하여 가스로 생물 반응기 백을 팽창시키는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 생물 반응기 시스템 사용 방법.

실시예 54.

실시예 44 내지 53 중 어느 한 실시예에 있어서, 상기 샘플링 포트를 통해 상기 배양된 세포의 샘플을 회수하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 생물 반응기 시스템 사용 방법.

Ⅵ. 실시예(Examples)

하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명의 범위를 한정하고자 하는 것은 아니다.

실시예 1 : 자가 세포 치료를 위해 조작된 T 세포를 생성하는 예시적인 방법.

이 실시예는 제공된 실시예 중 임의의 것의 생물 반응기 백 조립체를 이용하는 예시적인 공정을 기술한다. 예컨대, 본 명세서에서 제공된 특정 실시예에 따라 자가 세포 치료(autologous cell therapy)을 위한 조작된 T 세포를 제조하기 위한 도 1 ~ 7에 도시된 예시적인 생물 반응기 백 조립체.

CD4+ 및 CD8+ 세포를 포함하는 조성물은 면역 친화성-기반 농축(enrichment) 및 저온 냉동에 의해 인간 백혈구 샘플로부터 분리한다(isolated). 이어서, CD4+ 및 CD8+ 세포를 해동하여 살균 조건 하에서 밀폐 시스템으로 옮긴다. 세포를 자극 조건(stimulating conditions) 하에서 배양한 다음, 재조합 수용체를 코딩하는 레트로 바이러스 벡터 또는 렌티 바이러스 벡터와 같은 바이러스 벡터로 형질 도입한다. 재조합 수용체는 항 CD19 CAR과 같은 키메라 항원 수용체(CAR)일 수 있다. 형질 도입 후, 세포는 이후의 확장을 위한 무균 조건 하에서 밀폐 시스템에 연결된 생물 반응기 백 조립체로 옮겼다. 생물 반응기 백 조립체는 폐쇄된 시스템 하에서 세포 배양 조건을 조절하는 생물 반응기(예를 들어, Xuri W25)에 연결된다. 하나 이상의 사이토카인을 함유하는 확장 배지(expansion media)가 세포에 첨가된다. 생물 반응기는 정지 상태 또는 관류(perfusion) 하에서 세포를 배양할 수 있으며, 이에 따라 신선한 배지가 일정하게 사용된 배지를 일정한 속도로 대체한다. 세포 배양 확장의 적어도 일부는 290 ml/일, 580 ml/일 또는 1160 ml/일의 비율로 관류로 수행한다. 생물 반응기는 0.1 L/분 또는 그 근처의 일정한 기류로 37℃ 또는 이 온도 근처 및 이산화탄소 수준 5% 또는 그 근처를 유지되도록 세포 배양 조건을 조절한다. 세포 배양 확장의 적어도 일부는 5 ~ 15 RPM(예: 6 RMP 또는 10 RPM)의 속도와 같은 일정한 락킹(rocking) 속도에서 5°~ 10°(예: 6°) 각도에서 락킹 모션으로 수행한다. 세포는 임계량 또는 임계 세포 밀도에 도달할 때까지 확장시킨다. 역치가 달성되면, 생물 반응기 백과 생물 반응기 사이의 연결을 밀봉하고, 백은 후속적인 세포 제제, 예를 들어, 냉동(예: cyrofreezing)을 위해 이송한다.

실시예 2 : 자가 세포 치료를 위한 조작된 CD4+ 및 CD8+ T 세포 조성물을 생성하는 예시적인 방법

이 실시예는 제공된 실시예 중 임의의 것의 생물 반응기 백 조립체를 이용하는 예시적인 공정을 기술한다. 예컨대, 본 명세서에서 제공된 특정 실시예에 따라 자가 세포 치료(autologous cell therapy)을 위한 조작된 CD4 + 및 CD8 + T 세포를 제조하기 위한 도 1 ~ 7에 도시된 예시적인 생물 반응기 백 조립체.

CD4+ 및 CD8+ 세포의 분리된 조성물은 면역 친화성-기재 농축 및 저온 냉동에 의해 인간 백혈구 샘플로부터 분리된다(isolated). 상기 조성물의 CD4+ 및 CD8+ 세포는 이어서 해동하고 멸균 조건 하에서 폐쇄된 시스템으로 개별적으로 옮긴다. CD4+ 및 CD8+ 세포를 자극 조건 하에서 배양한 다음, 재조합 수용체를 코딩하는 레트로 바이러스 벡터 또는 렌티 바이러스 벡터와 같은 바이러스 벡터로 형질 도입한다. 재조합 수용체는 항 CD19 CAR과 같은 키메라 항원 수용체(CAR)일 수 있다. 형질 도입 후, CD4+ 및 CD8+ 세포는 이후의 확장(expansion)을 위해 무균 조건 하에서 밀폐 시스템에 연결된 생물 반응기 백 조립체로 개별적으로 옮긴다. 생물 반응기 백 조립체는 폐쇄 시스템 하에서 세포 배양 조건을 조절하는 생물 반응기(예를 들어, Xuri W25)에 연결된다. 하나 이상의 사이토카인을 함유하는 확장 배지가 CD4+ 및 CD8+ 세포에 첨가된다. CD4+ 세포 및 CD8+ 세포에 첨가된 확장 배지는 동일하거나 상이할 수 있다. 세포 배양 확장의 적어도 일부는 290 ml/일, 580 ml/일 또는 1160 ml/일의 비율로 관류로 수행한다. 생물 반응기는 0.1 L/분 또는 그 근처의 일정한 기류로 37℃ 또는 이 온도 근처 및 이산화탄소 수준 5% 또는 그 근처를 유지되도록 세포 배양 조건을 조절한다. 세포 배양 확장의 적어도 일부는 5 ~ 15 RPM(예: 6 RMP 또는 10 RPM)의 속도와 같은 일정한 락킹(rocking) 속도에서 5°~ 10°(예: 6°) 각도에서 락킹 모션으로 수행한다. CD4+ 및 CD8+ 세포 각각은 임계량 또는 임계 세포 밀도에 도달할 때까지 개별적으로 확장시킨다(expanded). 역치가 달성되면, 생물 반응기 백과 생물 반응기 사이의 연결을 밀봉하고, 백은 후속적인 세포 제제, 예를 들어, 냉동(예: cyrofreezing)을 위해 이송한다.

상기 상세한 설명은 당업자로 하여금 본 개시물을 실시하고 사용할 수 있게 하기 위해 제공되며, 특정 용도 및 그 요구 사항의 맥락에서 제공된다. 바람직한 실시예에 대한 다양한 변형은 당업자에게 용이하게 명백할 것이며, 본 명세서에 정의된 일반적인 원리는 본 발명의 사상 및 범위를 벗어나지 않고 다른 실시예 및 응용에 적용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 개시된 실시예들에 한정되는 것이 아니라, 본 명세서에 개시된 원리들 및 특징들과 일치하는 가장 넓은 범위에 따른다.

Claims

공급 포트, 샘플링(sampling) 포트 및 관류 포트를 포함하는 복수의 포트를 포함하는 상부 표면;
하부 표면;
상기 관류 포트에 유체적으로 연결된 관류 필터; 및
생물 반응기 백의 관류 포트에 유체적으로 연결된 폐기물 백(waste bag);
을 포함하는 생물 반응기 백(bag) 조립체.
제1항에 있어서, 상기 생물 반응기 백의 상부 표면은 제1단부 및 상기 제1단부에 대향하는 제2단부를 가지며, 관류 포트는 제1단부 보다 제2단부에 더 가까운 것을 특징으로 하는 생물 반응기 백 조립체.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 공급 포트 및 샘플링 포트는 상기 제2단부 보다 상기 제1단부에 더 가까운 것을 특징으로 하는 생물 반응기 백 조립체.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 생물 반응기 백의 상기 상부 표면은 제1측부 및 상기 제1측부에 대향하는 제2측부를 가지며, 상기 공급 포트는 제2측부 보다 제1측부에 가까운 것을 특징으로 하는 생물 반응기 백(bag) 조립체.
제4항에 있어서, 상기 샘플링 포트는 상기 제1측부 보다 제2측부에 더 가까운 것을 특징으로 하는 생물 반응기 백 조립체.
제4항 또는 제5항에 있어서, 상기 관류 포트는 제1측부 보다 제2측부에 더 가까운 것을 특징으로 하는 생물 반응기 백 조립체.
제1항 내지 제6항 중에서 선택된 어느 한 항에 있어서, 상기 관류 필터는 생물 반응기 백 내부에 있는 것을 특징으로 하는 생물 반응기 백 조립체.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 공급 포트에 유체 적으로 연결된 공급 배관 장치(feed tubing arrangement)를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 생물 반응기 백 조립체.
제8항에 있어서, 상기 공급 배관 장치는 폴리비닐클로라이드(PVC) 배관을 포함하는 것을 특징으로 하는 생물 반응기 백 조립체.
제8항 또는 제9항에 있어서, 상기 공급 배관 장치는 2개의 유입구를 구비한 Y-커넥터를 포함하는 것을 특징으로 하는 생물 반응기 백 조립체.
제1항 내지 제10항 중에서 선택된 어느 한 항에 있어서, 상기 샘플링 포트에 유체적으로 연결된 샘플링 배관 장치를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 생물 반응기 백 조립체.
제11항에 있어서, 상기 샘플링 배관 장치는 PVC 배관을 포함하는 것을 특징으로 하는 생물 반응기 백 조립체.
제1항 내지 제12항 중에서 선택된 어느 한 항에 있어서, 상기 폐기물 백은 폐기물 배관 장치를 통해 사이 관류 포트에 유체적으로 연결되는 것을 특징으로 하는 생물 반응기 백 조립체.
제13항에 있어서, 상기 페기물 배관 장치는 PVC 배관을 포함하는 것을 특징으로 하는 생물 반응기 백 조립체.
제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 복수의 포트는 가스 유입 포트 및 가스 배출 포트를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 생물 반응기 백 조립체.
제15항에 있어서, 생물 반응기 백의 상부 표면은 제1단부 및 제2단부 사이 중간에 있는 중간부를 가지며, 상기 가스 유입 포트 및 상기 가스 배출 포트는 제1단부 또는 제2 단부 보다 중간에 더 가까운 것을 특징으로 하는 생물 반응기 백 조립체.
제15항 또는 제16항에 있어서, 상기 복수의 포트는 공급 포트, 샘플링 포트, 관류 포트, 가스 유입 포트 및 가스 배출 포트로 구성되는 것을 특징으로 하는 생물 반응기 백 조립체.
제15항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 가스 유입 포트에 유체적으로 연결된 유입 필터를 포함하는 가스 유출 배관 장치 및 가스 배출 포트에 유체적으로 연결된 배기 필터(exhaust filter)를 포함하는 가스 배출 배관 장치를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 생물 반응기 백 조립체.
생물 반응기 로커(rocker); 및
생물 반응기 로커 상에 지지된 생물 반응기 백을 포함하고,
상기 생물 반응기 백은
공급 포트, 샘플링 포트 및 관류 포트를 포함하는 복수의 포트를 포함하는 상부 표면;
하부 표면;
상기 관류 포트에 유체적으로 연결된 관류 필터; 및
생물 반응기 백의 관류 포트에 유체적으로 연결된 폐기물 백(waste bag);을 포함하는 것을 특징으로 하는 생물 반응기 시스템.
제19항에 있어서, 상기 공급 포트에 유체적으로 연결된 공급 배관 장치를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 생물 반응기 시스템.
제20항에 있어서, 상기 공급 배관 장치는 제1유입구 및 제2유입구를 구비한 공급 배관 장치인 Y-커넥터를 포함하는 것을 특징으로 하는 생물 반응기 시스템.
제21항에 있어서, 상기 세포 배지 공급원(cell media source)은 공급 배관 장치의 각 유입구에 유체적으로 연결된 것을 특징으로 하는 생물 반응기 시스템.
제22항에 있어서, 각 유입구는 PVC를 포함하고, 세포 배지 공급원은 유입구의 PVC에 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 생물 반응기 시스템.
제21항에 있어서, 세포원은 제1 유입구와 유체적으로 연결되어 있고, 세포 배지 공급원은 제2유입구와 유체적으로 연결되어 있는 것을 특징으로 하는 생물 반응기 시스템.
제24항에 있어서, 각 유입구는 PVC를 포함하고, 상기 세포원은 제1유입구의 PVC와 결합되어 있고, 상기 세포 배지 공급원은 제2유입구의 PVC와 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 생물 반응기 시스템.
제19항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 관류 필터는 생물 반응기 백 내부에 있는 것을 특징으로 하는 생물 반응기 시스템.
제19항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 생물 반응기 백의 상부 표면은 제1단부 및 제1단부에 대향하는 제2단부를 가지며, 상기 관류 포트는 제1단부 보다 제2단부에 더 가까운 것을 특징으로 하는 생물 반응기 시스템.
제27항에 있어서, 상기 공급 포트 및 샘플링 포트는 제2단부 보다 제1단부에 더 가까운 것을 특징으로 하는 생물 반응기 시스템.
제19항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 생물 반응기 백의 상부 표면은 제1측부 및 제1측부에 대향하는 제2단면을 가지며, 상기 공급 포트는 제2측부 보다 제1측부에 더 가까운 것을 특징으로 하는 생물 반응기 시스템.
제29항에 있어서, 상기 샘플링 포트는 제1측부 보다 제2측부에 더 가까운 것을 특징으로 하는 생물 반응기 시스템.
제29항 또는 제30항에 있어서, 상기 관류 포트는 제1측부 보다 제2측부에 더 가까운 것을 특징으로 하는 생물 반응기 시스템.
제19항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 관류 포트는 생물 반응기 백 내부에 있는 것을 특징으로 하는 생물 반응기 시스템.
제19항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 공급 포트에 유체적으로 연결된 공급 배관 장치를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 생물 반응기 시스템.
제33항에 있어서, 상기 공급 배관 장치는 폴리비닐클로라이드(PVC) 배관을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 생물 반응기 시스템.
제33항 또는 제34항에 있어서, 상기 공급 배관 장치는 2개의 유입구를 가지는 공급 배관 장치인 Y-커넥터를 포함하는 것을 특징으로 하는 생물 반응기 시스템.
제19항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 샘플링 포트와 유체적으로 연결된 샘플링 배관 장치를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 생물 반응기 시스템.
제36항에 있어서, 상기 샘플링 배관 장치는 PVC 배관을 포함하는 것을 특징으로 하는 생물 반응기 시스템.
제19항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폐기물 백은 폐기물 배관 장치를 통해서 관류 포트에 유체적으로 연결되는 것을 특징으로 하는 생물 반응기 시스템.
제38항에 있어서, 상기 폐기물 배관 장치는 PVC 배관을 포함하는 것을 특징으로 하는 생물 반응기 시스템.
제19항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 복수의 포트는 가스 유입 포트 및 가스 배출 포트를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 생물 반응기 시스템.
제40항에 있어서, 생물 반응기 백의 상기 상부 표면은 제1단부 및 제2단부 사이 중간에 있는 중간부를 가지며, 상기 가스 유입 포트 및 상기 가스 배출 포트는 제1단부 또는 제2 단부 보다 중간에 더 가까운 것을 특징으로 하는 생물 반응기 시스템.
제40항 또는 제41항에 있어서, 상기 복수의 포트는 공급 포트, 샘플링 포트, 관류 포트, 가스 유입 포트 및 가스 배출 포트로 구성된 것을 특징으로 하는 생물 반응기 시스템.
제40항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 가스 유입 포트에 유체적으로 연결된 유입 필터를 포함하는 가스 유출 배관 장치 및 가스 배출 포트에 유체적으로 연결된 배기 필터(exhaust filter)를 포함하는 가스 배출 배관 장치를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 생물 반응기 시스템.
생물 반응기 백 조립체의 생물 반응기 백을 제공하는 단계;
공급 포트를 통하여 생물 반응기 백에 세포 배지(cell media)를 공급하는 단계;
상기 공급 포트를 통하여 생물 반응기 백에 세포를 공급하는 단계;
생물 반응기 로커로부터 제공되는 교반을 사용하여 생물 반응기 백에서 세포를 배양(cultivating)하는 단계;
관류 포트를 통하여 폐여과물을 폐기물 백으로 이송하는 단계; 및
배양된 세포를 수득하는 단계;를 포함하며,
상기 생물 반응기 백 조립체는 공급 포트, 샘플링 포트 및 관류 포트를 포함하는 복수의 포트를 포함하는 상부 표면; 하부 표면; 상기 관류 포트에 유체적으로 연결된 관류 필터; 및 생물 반응기 백의 관류 포트에 유체적으로 연결된 폐기물 백(waste bag);을 포함하는 것을 특징으로 하는 생물 반응기 시스템 사용 방법.
제44항에 있어서, 상기 생물 반응기 백 조립체는 공급 포트에 유체적으로 연결된 공급 배관 장치를 포함하며, 상기 공급 배관 장치는 제1유입구 및 제2유입구를 구비한 공급 배관 장치인 Y-커넥터를 포함하는 것을 특징으로 하는 생물 반응기 시스템 사용 방법.
제45항에 있어서, 상기 세포 배지(cell media)는 세포 배지 공급원을 제1유입구에 결합시켜서 첨가되는 것을 특징으로 하는 생물 반응기 시스템 사용 방법.
제45항에 있어서, 상기 세포는 제1유입구에 세포원을 결합시켜서 첨가하는 것을 특징으로 하는 생물 반응기 시스템 사용 방법.
제45항에 있어서, 세포 배지는 세포 배지 공급원을 제1유입구에 결합시켜서 첨가하고, 상기 세포는 세포 공급원을 제2유입구에 결합시켜서 첨가하는 것을 특징으로 하는 생물 반응기 시스템 사용 방법.
제44항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 복수 개의 포트는 가스 유입 포트 및 가스 배출 포트를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 생물 반응기 시스템 사용 방법.
제49항에 있어서, 상기 세포를 배양하기 위한 가스를 상기 가스 유입구를 통해 상기 생물 반응기 백에 공급하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 생물 반응기 시스템 사용 방법.
제50항에 있어서, 가스 배출 포트를 통해서 배기시켜서 생물 반응기 백으로부터 가스 일부를 제거하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 생물 반응기 시스템 사용 방법.
제45항에 있어서, 수득 백(harvest bag)을 제1유입구 또는 제2유입구에 결합하고, 공급 배관 장치의 유동 방향을 역전시켜서 배양된 세포를 수득하는 것을 특징으로 하는 생물 반응기 시스템 사용 방법.
제44항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 복수의 포트는 가스 유입 포트를 포함하고,
가스 유입 포트를 통하여 가스로 생물 반응기 백을 팽창시키는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 생물 반응기 시스템 사용 방법.
제44항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 샘플링 포트를 통해 상기 배양된 세포의 샘플을 회수하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 생물 반응기 시스템 사용 방법.