CN101652475B - 在禽类中进行转基因表达 - Google Patents

Abstract

基因组中含有外源核苷酸序列的转基因禽类，所述外源核苷酸序列包含启动子组件和具有减少的启动子干扰的载体，其中所述外源核苷酸序列整合入基因组和禽类。

Description

在禽类中进行转基因表达

相关申请信息

本申请要求享有2007年5月16日提交的美国临时申请号60/930,491和2007年9月18日提交的美国临时申请号60/994,203的优先权，并作为2007年1月26日提交的美国专利申请号11/699,257的连续部分。上述两个临时申请和一个专利申请中每一个的内容整体纳入本文作为参考文献。

发明范围

本发明一般涉及在诸如转基因鸡的转基因禽类细胞(如输卵管细胞)发挥功能的启动子和含此类启动子载体的用途。更具体的说，本发明涉及重组核酸和表达载体，转染细胞和转基因动物，例如含有与编码序列可操作连接的基因表达控制区的载体的转基因鸡等转基因禽类。

背景

最初转基因学领域发展用于了解单个基因在整体动物条件下的作用，以及基因激活、表达和相互作用的现象。转基因技术也用于在产生人或其它动物疾病模型，在遗传学研究、了解遗传机制和功能的有力工具之一。从经济的角度，使用转基因技术将动物转变为“蛋白工厂”用于产生药学感兴趣的特定蛋白或其它物质(Gordon等，1987年，Biotechnology 5：1183-1187；Wilmut等，1990，Theriogenology 33：113-123)比常规用于蛋白生产的基因表达技术提供了更显著的优势。

一种用于表达外源蛋白的系统是禽类生殖系统。禽类卵的产生开始于在雌鸟的卵巢中形成大的卵黄。未受精的卵母细胞或卵子位于卵黄囊的上部。排卵后，卵子穿过输卵管的漏斗，在此若存在精子则使其受精，接着穿过管状腺体细胞排列成的输卵管分泌部。这些细胞分泌卵白蛋白，包括卵清蛋白、溶菌酶、卵类粘蛋白、伴清蛋白和卵粘蛋白进入分泌部内腔，在此在禽胚和卵黄上沉积。过去曾在禽类生殖系统进行特定靶向禽输卵管的外源蛋白的产生。

靶向禽输卵管表达外源蛋白的优势包括靶蛋白正确的折叠和翻译后修饰，易于回收产物，与其它动物种属相比鸟类如鸡的发育期较短。

在转基因禽类的输卵管内直接表达外源基因产物比在鸟体内广泛表达具有显著的优势。即，不期望在宿主动物体内广泛表达生物活性基因产物的结果。例如，在某些情况下重组蛋白的广泛存在对于鸟类发育有害，杀死鸟类。此外，鸟类的健康受到负面影响导致蛋白生产水平的降低。

在重量上，禽类卵的约60％由蛋白组成，其包括四种主要蛋白质组分；卵清蛋白、卵类粘蛋白、溶菌酶以及卵运铁蛋白，卵清蛋白和卵类粘蛋白大量存在。

过去已成功在转基因禽类的输卵管中使用卵清蛋白启动子、卵类粘蛋白启动子和溶菌酶启动子表达异源(外源性)蛋白质。参见，例如2005年4月5日发表的美国专利号6,875,588；2007年2月13日发表的7,176,300；2007年4月3日发表的7,199,279；以及2006年6月15日公开的美国专利公开号2006/0130170(该三种发表专利和一种公开专利申请的每一公开文本均整体纳入本文作参考)，其公开了主要或仅在禽输卵管中表达的不同禽类启动子利于在禽类输卵管外源蛋白质的产生。尽管这些发表的专利以及公开的申请中使用启动子以及启动子片段的表达水平是可用的，但其产量仍低于0.1mg/ml卵白。

需要在转基因禽类的细胞尤其是输卵管细胞(如管状腺体细胞)中高水平表达外源性编码序列的系统。

发明概述

本发明满足甚至超越这种需要。本发明的发明人经过数年在转基因禽类的输卵管组织中中等产量产生外源蛋白质，发现使用本文公开的新组合物和方法可使该表达水平提高约10倍到100倍甚至更高。

一个方面，本发明涉及转基因禽类(如鸡、火鸡、鹌鹑)，在其基因组中含有具有启动子组件和SIN载体的外源核苷酸序列。通常，启动子组件与禽外源性编码序列，即在禽体内通常或天然不存在的编码序列连接。通常，外源核苷酸序列整合入禽的基因组中。在一个尤其有用的实施方式中，所述启动子组件主要在禽类输卵管(如管状腺体细胞)中发挥功能或表达。例如，所述启动子组件可为输卵管特异性启动子。例如，所述启动子组件可为禽类卵类粘蛋白启动子、禽类卵清蛋白启动子、禽类溶菌酶启动子和禽类卵抑制剂组件(即伴清蛋白启动子组件)之一。

发明人已显示SIN载体对于增加在禽输卵管中外源蛋白的表达量尤其有用。当SIN载体也为SC负载体时(即载体不含具有功能性启动子的可选择标记盒)，这种效应可进一步增强。

本发明还包括制造本发明的转基因禽类的方法以及利用本发明转基因禽类产生外源蛋白质的方法。在一个实施方式中，转基因禽类基因组的核苷酸序列中包含载体，所述载体是SIN载体和SC负载体中的至少一种。通常，所述核苷酸序列包含与外源性编码序列连接的启动子组件。

在一个有用的实施方式中，外源性编码序列在禽输卵管细胞中表达，并从输卵管细胞中分泌。例如，外源性编码序列可在管状腺体细胞中表达。在一个实施方式中，外源蛋白质在转基因禽类生出的硬壳卵中沉积。在一个实施方式中，外源蛋白质为人蛋白。在一个实施方式中，外源蛋白质为治疗性蛋白，如细胞因子。

在一个实施方式中，转基因禽类在其基因组中包含外源核苷酸序列，其具有SC负载体以及与编码外源蛋白质的外源性编码序列相连的启动子组件。在一个实施方式中，SC负载体也为SIN载体。

在一个实施方式中，根据本发明可使用禽白血病毒载体(ALV)，鼠白血病毒(MLV)逆转录病毒载体，莫洛尼氏鼠白血病毒(MMLV)和慢病毒载体。

本发明包含嵌合转基因禽类和完全转基因种系禽类，可通过家禽繁育领域操作人员理解的种系嵌合体获得。

本发明还包括具有与下列编号为1-8的序列相似或相同的核苷酸序列(即DNA序列)的基因表达控制区或启动子。在本发明的一个尤其有用的实施方式中，从片段的上部到下部以单链DNA分子中出现的5’-3’线性顺序列出。例如，序列1中3.5kb OV片段的3’末端可共价连接于5′UTR-5’部分的5’末端，5′UTR-5’部分的3’末端可共价连接于5′UTR-3’部分的5’末端。然而，本发明不限于片段的任意特定序列，并且在片段间可出现干扰序列。

1.3.5kb OV片段(包括DHS I，II和III)

5′UTR-5’部分(来自外显子L)

5′UTR-3’部分(来自外显子1)；

2.3.5kb OV片段(包括DHS I，II和III)

5′UTR-5’部分(来自外显子L)

内含子A

5′UTR-3’部分(来自外显子1)

3′UTR；

3.3.5kb OV片段(包括DHS I，II和III)

5′UTR-5’部分(来自外显子L)

内含子A

5′UTR-3’部分(来自外显子1)；

4.3.5kb OV片段(包含DHS I，II和III)

5′UTR-5’部分(来自外显子L)

5′UTR-3’部分(来自外显子1)

3′UTR；

5.3.5kb OV片段(包含DHS I，II和III)

5′UTR-5’部分(来自外显子L)

内含子A

5′UTR-3’部分(来自外显子1)

3′UTR/DHS A(SEQ ID NO：22的13576-15163bp)

6.3.5kb OV片段(包含DHS I，II和III)

5′UTR-5’部分(来自外显子L)

5′UTR-3’部分(来自外显子1)

3′UTR/DHS A(SEQ ID NO：22的13576-15163bp)

7.3.5kb OV片段(包含DHS I，II和III)

5′UTR-5’部分(来自外显子L)

内含子A

5′UTR-3’部分(来自外显子1)

部分3′UTR

RRE(Rev应答元件)图9a

8.ALV CTE(图9b)插入3.5kb OV片段5’

3.5kb OV片段(包含DHS I，II和III)

5′UTR-5’部分(来自外显子L)

内含子A

5′UTR-3’部分(来自外显子1)

部分3′UTR；

本文公开的特定卵清蛋白构建物(如上述构建物1-8)元件的坐标(位置)如下文SEQ ID NO：22中16051bp卵清蛋白DNA区段所示：

3.5kb OV片段(包含DHS I，II和III)：图8中3199开始6659结束(SEQ IDNO：22)；

1.4kb OV片段(包含DHS I和II)：图8中5209开始6659结束(SEQ ID NO：22)；

3.8kb OV片段：图8中2863开始6659结束(SEQ ID NO：22)；

5.2kb OV片段：图8中1463开始6659结束(SEQ ID NO：22)；

5′UTR-5’部分(来自外显子L)：图8中6659开始6705结束(SEQ ID NO：22)；

5′UTR-3’部分(来自外显子1)：图8中8295开始8311结束(SEQ ID NO：22)；

3′UTR：图8中13576开始14209结束(SEQ ID NO：22)；

部分3′UTR：13576开始13996结束(SEQ ID NO：22)；

内含子A：图8中6706开始8294结束(SEQ ID NO：22)；

内含子E：图8中10010开始10968结束(SEQ ID NO：22)；

外显子L：图8中6659开始6705结束(SEQ ID NO：22)；

外显子1：图8中8295开始8478结束(SEQ ID NO：22)；

外显子2：图8中8731开始8781结束(SEQ ID NO：22)；

外显子3：图8中9363开始9491结束(SEQ ID NO：22)；

外显子4：图8中9892开始10009结束(SEQ ID NO：22)；

外显子5：图8中10968开始11110结束(SEQ ID NO：22)；

外显子6：图8中11442开始11597结束(SEQ ID NO：22)；

外显子7：图8中13180开始13575结束(SEQ ID NO：22)；

+1位点：图8中6659开始6659结束(SEQ ID NO：22)；

ATG：图8中8312开始8312结束(SEQ ID NO：22)；

聚A：图8中14204开始14209结束(SEQ ID NO：22)；

TATA：图8中6627开始6632结束(SEQ ID NO：22)；

DHS A：图8中13858开始15163结束(SEQ ID NO：22)；

DHS IV：图8中459开始859结束(SEQ IDNO：22)；

DHS III：图8中3253开始3559结束(SEQ ID NO：22)；

DHS II：图8中5629开始6009结束(SEQ ID NO：22)；及

DHS I：图8中6359开始6659结束(SEQ ID NO：22).

同时考虑核苷酸序列与本文公开的每一启动子构建物，如上文所述那些(即上述1-8)具有80％相同性、85％相同性、90％相同性、91％相同性、92％相同性、93％相同性、94％相同性、95％相同性、96％相同性、97％相同性、98％相同性、99％相同性的启动子构建物。

本发明也考虑与上述启动子构建物1-8对应的启动子构建物，其中3.5kbOV片段替换为3.8kb OV片段。本发明也考虑与上述启动子构建物1-8对应的启动子构建物，其中3.5kb OV片段替换为5.2kb OV片段。

也考虑其中DHS III从中省略的上述特定重组启动子(即1-8)的启动子构建物。

也考虑对应上述构建物2、3、5、7和8中每一个的启动子构建物，其中内含子A被内含子E替换，这将导致外源蛋白质产生水平的提高。内含子A和E具有诱导组蛋白在DNA周围区域排列的DNA序列。这种排列为OV基因提供转录调节。不意于依附任何特定理论或操作机制，用内含子A替换内含子E提供了优选组蛋白间距(即对于内含子A的周期为202bp+/-5bp，对于内含子E为196bp+/-5bp)。例如，认为组蛋白对DNA的包裹导致DNA拓扑结构的改变，对其进行操作能导致负责转录调节的蛋白(如转录因子)结合位点的优选排列引起转录水平增强。

本发明还包括本文公开的载体构建物，以及其它构建物和核苷酸序列，其核苷酸序列与本文公开的每一载体构建物和其它构建物以及核苷酸序列具有80％相同性、85％相同性、90％相同性、91％相同性、92％相同性、93％相同性、94％相同性、95％相同性、96％相同性、97％相同性、98％相同性、99％相同性。

只要任一本文描述特点的组合包含的特点在上下文中、该说明中以及本领域一般技术人员的知识中并非互相不吻合，任何此类组合均包含于本发明范围内。

在浏览下面的详细描述以及下面简要描述的附图之后，本发明的其他目的和方面将更加明了。

附图简述

图1显示了pALV-SIN-4.2-Lys-IFNa-2B载体的环状图。pALV-SIN-4.2-Lys-IFNa-2B的序列如SEQ ID NO：1所示。

图2是转基因鹌鹑卵白中IFNa表达水平的柱状图。在日本鹌鹑胚胎中注射pALV-SIN-4.0-Lys-IFNa-2B反转录病毒载体转导颗粒产生G0鹌鹑。

图3显示了pSIN-OV-3.5-I-CTLA4-inv载体的环状图。pSIN-OV-3.5-I-CTLA4-inv的核苷酸序列如SEQ ID NO：19所示。

图4显示了pSIN-3.9-OM-CTLA4-Fc载体的环状图。pSIN-3.9-OM-CTLA4-Fc的核苷酸序列如SEQ ID NO：20所示。

图5显示了pBS-OM-4.4载体的环状图。pBS-OM-4.4的核苷酸序列如SEQID NO：23所示。

图6显示了pAVIJCR-A137.91.1.2载体的环状图。pAVIJCR-A137.91.1.2的核苷酸序列如SEQ ID NO：24所示。

图7显示了pSIN-1.8-OM-IFNa-2B质粒载体的环状图。pSIN-1.8-OM-IFNa-2B的核苷酸序列如SEQ ID NO：21所示。

图8a-e(SEQ ID NO：22)显示了鸡卵清蛋白基因的一个区段。

图9a(SEQ ID NO：25)显示了慢病毒的RRE(rev应答元件)序列。图9b(SEQID NO：26)显示了ALV CTE(组成型转运元件)序列。

图10a显示了从示例性逆转录病毒LTR(ALV)中删除片段的示意图，得到SIN载体。图10b(SEQ ID NO：29)显示了10a中LTR的序列。下划线序列是删除的序列。

发明详述

定义

本文所用术语“动物”包括所有脊椎动物，包括禽类，也可包括人。也可包括处于所有发育阶段的动物，包括胚胎期和胎儿期。

本文所用术语“抗体”指多克隆和单克隆抗体及其功能片段。抗体包括保有表位特异性结合能力的修饰或衍生化抗体变体。抗体能够选择性与靶抗原或表位结合。抗体包括但不限于多克隆抗体、单克隆抗体(mAbs)、人源化和其它嵌合抗体、单链抗体(scFvs)、Fab片段、F(ab’)₂片段和二硫键连接的Fvs(sdFv)片段。

本文所用术语“禽类”指鸟纲分类的任何种、亚种或品系，例如但不限于诸如鸡、火鸡、鸭、鹅、鹌鹑、雉、鹦鹉、雀、鹰、乌鸦和平胸鸟，包括鸵鸟、鸸鹋和食火鸡等生物。该术语包括红原鸡(Gallus gallus)或鸡的各种已知品系(例如，白来杭鸡、褐来杭鸡、斑纹石鸡(Barred-Rock)、苏赛克斯鸡(Sussex)、新罕布什尔鸡、罗德岛鸡、澳洲黑鸡、米诺卡鸡、阿木鸡(Amrox)、加利福尼亚州灰鸡、意大利山鹑色鸡)，以及通常以商业规模饲养的火鸡、雉、鹌鹑、鸭、鸵鸟和其它家禽的品系。

如在基于或衍生于特定逆转录病毒或基于特定逆转录病毒的核苷酸序列中的术语“基于”或“衍生于”意思是逆转录病毒载体的基因组包含特定逆转录病毒基因组核苷酸序列的实质性部分。实质性部分可为特定基因或核苷酸序列，如编码gag、poi和/或env蛋白或其它病毒基因组的结构或功能核苷酸序列，如编码LTR的序列或充分完整的逆转录病毒基因组，例如，逆转录病毒的大部分(如，多于60％或多于70％或多于80％或多于90％)或全部，如本说明书上下文中为本领域熟练技术人员所了解的。基于或衍生于逆转录病毒的逆转录病毒载体的例子是NL逆转录病毒载体(如NLB)，其基于Cosset等，Journal of Virology(1991)65卷，3388-3394公开的ALV逆转录病毒。

本文所用术语“编码序列”和“编码区”指核苷酸序列和核酸序列，包括为合成RNA、蛋白质或RNA或蛋白质的任意部分编码遗传信息的RNA和DNA。非天然特定有机体基因组部分核苷酸序列称作“外源核苷酸序列”、“异源核苷酸序列”或“外源核苷酸序列”。“异源性蛋白质”是外源、异源或外源核苷酸序列编码的蛋白质，因此在细胞中并不常见天然表达。分离的并被引入相同类型有机体(如同种)的核苷酸序列并不认为是特定有机体基因组的天然产生的部分，因此被认为是外源性或异源性的。

本文所用术语“构建物”指线状或环状核苷酸序列，如由分离自天然来源或化学合成或其组合的多于一种核苷酸序列片段组装而成的DNA。

本文所用术语“互补”指能够相互形成特异性作用的两个核酸分子。在特异性相互作用中，当两条核酸链极性相反时，核酸一条链中的腺嘌呤能与第二条核酸链内的胸腺嘧啶形成两个氢键。同样的特异性相互作用，当两条核酸链极性相反时，核酸一条链中的鸟嘌呤能与第二条核酸链内的胞嘧啶形成三个氢键。如本文提及的互补核酸害了包含修饰碱基，其中修饰的腺嘌呤可与胸腺嘧啶或修饰的胸腺嘧啶形成氢键，修饰的胞嘧啶可与鸟嘌呤或修饰的鸟嘌呤形成氢键。

本文所用术语“细胞因子”指任意影响细胞功能的分泌氨基酸序列，并且时调节免疫、炎症或者造血相应中细胞间相互作用的分子。细胞因子包括但不限于单核因子和淋巴因子，不管其产生细胞。例如，单核因子通常指单核细胞如巨噬细胞和/或单核细胞产生并分泌的因子。然而，其它细胞也可产生单核因子，如自然杀伤细胞、成纤维细胞、嗜碱细胞、嗜中性粒细胞、内皮细胞，脑星形胶质细胞、骨髓间质细胞、上皮角质形成细胞和B-淋巴细胞。淋巴因子通常指淋巴细胞产生的因子，包括但不限于：白介素-1(IL-1)、白介素-6(IL-6)、白介素-8(IL-8)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和肿瘤坏死因子β(TNF-β)。

本文所用术语“表达的”或“表达”从一个基因转录得到的至少与基因两条核酸链之一部分互补的RNA核酸分子。本文所用术语“表达的”或“表达”也指将RNA翻译产生蛋白质或肽.

本文所用术语“表达载体”指核酸载体，其包含如启动子或启动子组件基因的表达控制区，可操作的连接于至少一个多肽的核苷酸序列。

本文所用术语“片段”指例如至少约10、20、50、75、100、150、200、250、300、500、1000、2000、5000、6,000、8,000、10,000、20,000、30,000、40,000、50,000或60,000个核苷酸长度的核酸部分，通过PCR或其它本领域熟知多聚化技术或通过本领域熟练技术人员所了解的重组核酸技术在宿主细胞中表达，用限制性核酸内切酶或机械切割或酶解，可以为人工构建(如化学合成)或通过将天然产物切割为多个片段。本文所用术语“片段”也指至少如氨基酸序列中约5、10、20、30、40、50、75、100、150、200、250、300、400、500、1000、2000、5000、6,000、8,000或10,000个氨基酸部分，该部分来自至少一种蛋白酶酶解切割天然产生的氨基酸序列，或是本领域熟知化学方法或重组DNA技术(如，天然产生氨基酸序列编码核苷酸序列部分表达)合成的氨基酸序列的一部分。“片段”也指一部分，例如，特定核苷酸序列或氨基酸序列的约5％、约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约95％或约99％。

本文中“功能性部分”或“功能性片段”可互换使用，在此指能全部或部分执行全部功能的一部分或片段。例如，一个分子的生物学功能部分指形式全部或完整分子的生物学功能的分子的一部分。例如，基因表达控制区的一个功能部分指生物系统(如启动子)中全部或部分调节或控制基因表达的特定基因表达(如全部或部分促进)控制区域的一个片段或部分。功能部分可为任意有用的大小。例如，功能片段大小可从约20个碱基长到特定序列全长减去一个氨基酸长。在另一实施例中，一个功能性片段的大小可从约50个碱基长到特定序列全长减去一个氨基酸长。在另一实施例中，一个功能性片段的大小可从约50个碱基长到约20kb长。在另一实施例中，一个功能性片段的大小可从约500个碱基长到约20kb长。在另一实施例中，一个功能性片段的大小可从约1kb碱基长到约20kb长。在另一实施例中，一个功能性片段的大小可从约0.1kb碱基长到约10kb长。在另一实施例中，一个功能性片段的大小可从约20个碱基长到约10kb长。

本文所用术语“基因表达控制区”指与编码序列连接的部分或全部调节编码序列表达，如全部或部分调节编码序列转录，的核苷酸序列。基因表达控制区可从天然产生的来源分离或者化学合成，并能被掺入核酸载体使其能在合适的细胞中调节转录。“基因表达控制区”可在位于编码序列5’末端并能被转录为mRNA的核酸序列区域之前，但不仅限于在其之前。

本文中术语“异源性”、“外源性”和“外源”互换使用，通常指不存在于某种有机体或细胞、组织或其它有机体包含或产生的组件中的生物分子如核酸或蛋白。例如，卵的异源性或外源蛋白质指在卵中通常不出现的蛋白。如本文所用涉及核酸如DNA和RNA的术语“异源性”、“外源性”和“外源”可互换使用，指不作为其出现的染色体、基因组或细胞的天然发生的一部分，或者其出现的位置和/或量不同于其天然产生时的位置和/或量。可为非基因组、染色体或细胞内源性的，被外源性引入基因组、染色体或细胞的核酸。异源性DNA的例子包括但不限于：含基因表达控制区的DNA和编码产物的DNA，例如RNA或蛋白质产物。异源性DNA的例子包括但不限于：一旦从禽类或使用中分离的本文中的基因表达控制区或启动子，如，在重新引入到禽类基因组后。

本文所用术语“分离核酸”包含，例如(a)具有天然产生的基因组分子一部分序列的DNA，但不被天然发生物种基因组分子该部分的至少一个侧翼序列所包围；(b)以某种方式掺入载体或真核或原核基因组DNA的核酸，所得载体或基因组DNA与其获自的天然产生的DNA不同；(c)分离的分子如cDNA、基因组片断或聚合酶链反应(PCR)、连接酶链反应(LCR)或化学合成产生的片段，或限制性片段；(d)作为杂合基因一部分的重组核苷酸序列，即编码融合蛋白的基因以及(e)作为杂合基因一部分的重组核苷酸序列，该杂合序列并非天然产生。本发明的分离核酸分子包括，例如天然等位基因变体以及通过核苷酸删除、插入、倒序或取代修饰得到的核酸分子。

本文所用术语“核酸”指任一线性或顺序阵列的核苷酸和核苷，例如cDNA、基因组DNA、mRNA、tRNA、寡核苷酸、寡核苷及其衍生物。为了便于讨论，非天然产生的核酸在本文中也称作构建物。核酸可包括如表达、克隆、粘粒合转化载体的细菌质粒载体，如动物病毒载体，例如但不限于腺病毒、流感病毒、脊髓灰质炎病毒、痘病毒、逆转录病毒如禽类白血病病毒(ALV)逆转录病毒载体、鼠白血病病毒(MLV)逆转录病毒载体和慢病毒载体等及其片段。此外，核酸可为禽类白血病病毒(ALV)逆转录病毒载体、鼠白血病病毒(MLV)逆转录病毒载体或慢病毒载体及其片段的LTR。核酸也可包括NL载体，如NLB、NLD和NLA及片段，以及合成的寡核苷酸如化学合成的DNA或RNA。核酸可包括修饰的或衍生化的核苷酸和核苷，例如但不限于卤化核苷酸如但不限于5-溴尿嘧啶，以及衍生化核苷酸如生物素标记的核苷酸。

本文所用术语“载体”和“核酸载体”指天然的或合成的能转染或转化细胞的并不依赖于宿主细胞基因组或在宿主细胞基因组内独立复制的单链或双链质粒或病毒核酸分子。基于载体核苷酸序列选用合适的限制性酶可将环状双链载体线性化。通过用限制性酶切割载体并将需要的片段连接可将核酸插入载体。

术语″操作性连接″指配置所述组件以便行使其普通功能的元件安排。操作性连接于编码序列的基因表达控制区或启动子(如启动子组件)能够对编码序列进行表达。控制序列可不必与编码序列毗连，只要它们可发挥功能指导编码序列的表达。因此，例如，间插非翻译的转录序列存在于启动子序列和编码序列之间时，仍可认为该启动子序列与该编码序列“操作性连接”。

本文所用术语“输卵管特异性启动子”指功能性的启动子和启动子组件，即为一个编码序列转录提供，在很大程度上，例如，主要(即，在动物中有特定启动子类型产生的超过50％的转录产物在输卵管细胞中)或仅仅在禽类输卵管细胞中。输卵管特异性启动子的例子包括，卵清蛋白启动子、卵类粘蛋白启动子、卵抑制剂启动子、溶菌酶启动子和卵运铁蛋白启动子，以及这些启动子的功能性部分，如启动子组件。

如在“％相同性”中使用的术语“百分比序列相同性”和“百分比相同性”，以及如“％同源性”、“百分比序列相似性”中使用的术语“百分比序列同源性”、“百分比同源性”，每一术语均指利用Karlin和Attschul(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.87：2264-2268中，Karlin和Attschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.90：5873-5877修饰的算法测定的两条核酸序列和两条氨基酸序列的序列配对程度。此类算法并入Attschul等(1990)T.Mol.Biol.Q15：403-410中的NBLAST和XBLAST程序。NBLAST程序执行BLAST核苷酸搜索，分数＝100，字长＝12，以获取与本发明核酸分子的核苷酸序列同源性。XBLAST执行BLAST蛋白质搜索，分数＝50，字长＝3，以获取与参考氨基酸序列的氨基酸序列同源性。为了获取用于比较目的的缺口比对，使用如Attschul等(1997)Nucl.Acids Res.25：3389-3402所述的缺口。当使用BLAST和缺口BLAST程序时，使用每个程序(如XBLAST和NBLAST)的默认参数。其它参数、程序和默认设置也适于但不限于包含核苷酸或氨基酸序列比较的英国人类基因组作图计划资源中心(U.K.Human GenomeMapping Project Resource Center)的GCG-序列分析包。

术语“多核苷酸”、“寡核苷酸”、“核苷酸序列”和“核酸序列”在本文中可互换使用，包括但不限于：编码序列，即当置于合适调节或控制序列的控制之下能在体外或体内转录并翻译为多肽的多核苷酸或核酸序列；控制序列，如翻译起始和终止密码子，启动子序列，核糖体结合位点，聚腺苷酸化信号，转录因子结合位点，转录终止序列，上游或下游调节结构域，增强子，沉默子，转录因子结合的DNA序列，结合后从而或正向(诱导)或负向(抑制)基因启动子的活性。本文所述术语并不暗示关于长度和合成来源的限制。

本文所用术语“多肽”和“蛋白质”指三个或多个氨基酸通过肽键连接以顺序阵列组成的氨基酸聚合物。术语“多肽”包括蛋白质、蛋白质片段、蛋白质类似物、寡肽等。术语“多肽”包括如上文定义的核酸编码的、重组技术生产的(如分离自转基因禽类)或者合成的多肽。术语“多肽”还指如上文定义的化学修饰的氨基酸或与标记配体共价或非共价结合的氨基酸。

本文所用术语“启动子”指在禽类细胞中用于起始R N A聚合酶进行转录的DNA序列。“启动子组件”本身或与其它DNA序列组合影响或促进转录的DNA序。本文公开和要求的特异性启动子组件如卵清蛋白启动子组件、卵类粘蛋白启动子组件和溶菌酶启动子组件及其它启动子和启动子组件并不描述特异性启动子序列，而它们包括用于影响或利于编码序列转录的各自启动子的任意序列或序列片段。例如，卵类粘蛋白启动子组件包括但不限于如2007年5月17日公开的美国公开号11/649,543中约1.8kb、约3.9kb和约10kb卵类粘蛋白启动子，将其整体纳入本文作参考。“启动子组件”也可包含起始RNA转录的重排的基因表达控制区以及含有起始RNA转录的天然产生的DNA序列/或合成DNA序列的杂合DNA分子。

本文所用“重组核酸”和“重组DNA”指至少两种真核或原核细胞中不存在的核酸序列的组合。核酸序列也包括但不限于：核酸载体、基因表达调控元件、复制起始点，表达时赋予抗生素抗性的基因序列、蛋白编码序列等。术语“重组多肽”意味包含重组技术产生的多肽，其位置、纯度或结构与天然产生的多肽不同。通常，此类重组多肽出现在细胞时其量与通常天然观察到的不同。

如本文所用术语“调节序列”包括可控制基因表达的启动子、增强子和其它元件。

“SC负载体”是不包含具有功能性启动子的可选择或可筛选盒标记物的载体。所述启动子可全部或部分删除或通过插入核苷酸序列使其失活。选择性盒包括但不限于如产生新霉素抗性的抗生素抗性DNA序列以及如GFP或lacZ的可选择标记物的DNA序列。

“SIN载体”是自失活载体。具体说，SIN载体是具有改变的基因组的逆转录病毒载体，当整合入靶细胞(如禽类胚胎细胞)的基因组DNA时，整合的逆转录病毒载体的5’LTR不能行使启动子的功能。例如，可删除或改变部分或全部造成逆转录病毒载体5’LTR的U3区域整合的逆转录病毒载体核苷酸序列以减少或消除5’LTR的启动子活性。如本领域所理解的那样，在某些实施例中，从5’LTR的U3中删除CAAT盒和/或TAATA盒可得到SIN载体。

“SIN/SC负载体”是一种载体，即逆转录病毒载体，既是SIN载体又是SC负载体。

本文所用术语“正义链”指来自基因组DNA的单链DNA分子，可被转录为RNA并翻译为基因的天然多肽产物。本文所用术语“反义链”指来自基因组DNA的单链DNA分子并与基因的正义链互补。

“治疗性蛋白质”或“药学蛋白质”指全部或部分组成药物的物质。具体说，“治疗性蛋白质”和“药学蛋白质”包含全部或部分组成药物的氨基酸序列。

本文所用术语“转录调节序列”和“基因表达控制区”和“启动子组件”指与一个核酸序列相连接的调节编码序列转录表达的核苷酸序列。示例性转录调节序列包括增强子元件、激素效应元件、类固醇效应元件、负调控元件等。可将“转录调节序列”分离并掺入载体核酸以调节合适细胞中载体DNA部分的转录。“转录调节序列”可位于，但不限于，可被转录为mRNA的蛋白编码序列5′区域的核酸序列区域之前。转录调节区域也可在蛋白编码区内，在鉴定为“内含子”区域的基因区域内或在核酸区域的核酸序列区域内。

本文所用术语“转化”和“转染”指将核酸插入宿主的过程。本领域熟练技术人员熟知许多利于将核酸转化或转染进入原核或真核有机体的方法。这些方法涉及许多技术，如用高浓度盐处理细胞例如但不限于钙或镁盐，电场、去污剂或脂质体介导的转染，使宿主细胞处于感受态以摄取核酸分子。

如本文所用“转基因动物”是任意非人类动物，如禽类，包括鸡，其中禽类的一种或多种细胞可包含通过人工干预引进的异源核酸，如通过本领域所知的转基因技术(参见例如，2007年10月18日公开的美国专利公开号2007/0243165，其公开内容整体纳入本文作参考)，包括本文所公开的那些技术。通过慎重的遗传操作，如通过显微注射或用重组病毒感染将核酸引入细胞的前体，从而将核酸引入动物。术语遗传操作不包括传统的杂交育种或体外受精，而是直接导入重组DNA分子。该分子可在染色体内整合或是染色体外复制的DNA。在典型的转基因动物中，转基因可引起细胞表达靶蛋白或多肽的重组形式。本文所用术语“嵌合动物”或“镶嵌动物”指表达转基因的动物，或部分但非全部细胞表达重组核苷酸序列的动物。种系嵌合动物在种系中包含转基因并使子代动物的多数或全部细胞包含转基因。

本文所用术语“转基因”指对被引入的转基因动物或细胞而言部分或全部异源的即外来的核酸序列(编码例如人蛋白质)，但被设计插入或插入动物基因组以这样的方式改变其插入的细胞基因组(如，插入到于天然基因位置不同的位点或其插入引起敲除)。根据本发明转基因包括本发明的含有利于外源蛋白质在禽类体内(如禽类输卵管中)产生的序列的载体(如SIN载体)。

本领域熟练技术人员熟知本发明中用于核酸和蛋白分离和鉴定的技术，并且可参考标准分子生物学和生物化学手册以选择使用合适的实验方案，而不选用不合适的实验方法。参见例如，Sambrook等，1989，《分子克隆：实验室手册》(Molecular Cloning：A Laboratory Manual)，第二斑，冷泉港出版社(ColdSpring Harbor)，其内容整体纳入本文作参考。

缩写

本文使用缩写包括：aa，氨基酸；bp，碱基对；cDNA，与RNA互补的DNA；nt，核苷酸；kb，千碱基对；μg，微克；ml，毫升；ng，纳克。

描述

根据本发明设计和使用的SIN载体能够减少或消除对转基因禽类体内使用的感兴趣的启动子干扰的启动子。在尤其有用的实施方式中，感兴趣的启动子(即启动子组件)优选在输卵管细胞或输卵管组织中表达其基因产物，如输卵管特异性启动子。此类启动子(如启动子组件)的例子包括但不限于，卵清蛋白、溶菌酶、伴清蛋白(即卵运铁蛋白)、卵类粘蛋白、卵粘蛋白和/或卵抑制剂基因表达控制区或启动子区域的功能部分。在一个实施方式中，感兴趣的启动子是一个或多个启动子的组合或融合，或者一个或多个启动子，如卵清蛋白、溶菌酶、伴清蛋白(即卵运铁蛋白)、卵类粘蛋白、卵粘蛋白和/或卵抑制剂启动子与其它启动子或启动子片段如病毒启动子(如LTR启动子)的组合或融合。

已显示SIN载体与输卵管特异性启动子一起尤其有用。不希望本发明局限于任一特定理论或操作机理，相信输卵管特异性启动子很容易受到逆转录病毒LTR启动子的影响。因此，SIN载体与禽类输卵管特异性启动子组合使用时尤其有用。

在一个尤其有用的实施方式中，例如，通过删除、插入或转座全部或部分干扰启动子序列产生了其中的能至少部分抑制与本发明的输卵管特异性启动子可操作连接的编码序列转录的干扰启动子(如LTR启动子)被灭活的SIN载体。例如，图1中的pALV-SIN-4.2-Lys-IFNa-2B载体，3’RAV2LTR的增强子中有一个删除，因此如本领域所理解的，当逆转录病毒区域整合时，5’LTR失活。LTR删除的详细图解参见图10。

在本发明的一个有用的实施方式中，使用同时也是SC负载体的SIN载体产生SIN/SC负载体。SC负载体和SIN载体的组合得到的载体与仅为SIN载体或仅为SC负载体相比，充分减少了启动子干扰的量。例如，如本文实施例部分公开的pALV-SIN-4.2-Lys-IFNa-2B及其它SIN载体也缺少抗生素抗性标记，使其同时成为SC负载体和SIN载体。

考虑将SIN载体、SC负载体和SIN/SC负载体依照本发明用于鸡、鹌鹑和火鸡等任何有用的禽类以产生包括种系嵌合体在内的嵌合体及采用如本领域一般技术人员已知的繁殖技术产生的子代禽类。此外，与完全相同的非SC负载体的逆转录病毒载体产生的转基因禽类相比，也关注SC负逆转录病毒载体(它是一个非SIN载体)也引起转基因禽类产生外源蛋白质数量上的增多或增加。

不希望本发明局限于任一特定理论或操作机理，相信缺少可选择标记物盒减少了启动子元件如增强子的出现，否则这些启动子元件顺式以及很接近禽类输卵管细胞中产生外源蛋白质所用的启动子(如输卵管特异性启动子)。这种很接近允许标记物基因的转录调节元件对感兴趣的启动子即用于产生外源蛋白质的启动子进行干扰。然而，本发明关注，可将标记物基因编码序列，例如但不限于，新霉素抗性编码序列和β内酰胺酶编码序列可操作的连接于一个启动子(第二启动子)，该启动子不对在禽类输卵管细胞用于产生外源蛋白质的启动子(即第一启动子)产生干扰。例如，关注当标记物启动子和感兴趣的启动子是相同或相似启动子时，可将选择性盒造成的影响降至最小或者消除。例如，选择性连接于标记物基因编码序列的第二卵清蛋白启动子可不影响用于在禽类输卵管细胞中产生外源蛋白质的第一卵清蛋白启动子。

本发明关注在禽类表达外源蛋白质的本发明的载体中任何有用的输卵管特异性启动子和输卵管特异性启动子片段的使用。例如，2005年1月31日提交的美国专利公开号2005/0176047，其公开内容整体纳入本文作参考，以及2007年1月26日提交的美国专利公开号2007/0124829，其公开内容整体纳入本文作参考，以及2003年11月11日公开的美国专利公开号2006/0130170，其公开内容整体纳入本文作参考，所公开的启动子和启动子的有用(如功能性)片段与SIN载体和SC负载体和SIN/SC负载体根据本发明的连接使用受到关注。

本发明也考虑根据本发明用作感兴趣启动子的其它启动子及其转录功能部分(如启动子组件)，如巨细胞病毒(CMV)启动子、劳氏肉瘤病毒(RSV)启动子、β-肌动蛋白启动子(如鸡β-肌动蛋白启动子)、鼠白血病病毒(MLV)启动子、小鼠乳房肿瘤病毒(MMTV)启动子。

本发明也包括多种受到关注的用于在转基因禽类中产生外源蛋白质的卵清蛋白启动子组件。考虑将本文公开的每一种启动子用于如本发明所述的载体。

下文显示了含重组卵清蛋白DNA的本发明载体的例子。从片段的上部到下部以单链DNA分子中出现的5’-3’线性顺序列出片段。例如，序列1中3.5kbOV片段的3’末端可共价连接于5′UTR-5’部分的5’末端，以及5′UTR-5’部分的3’末端将共价连接于5′UTR-3’部分的5’末端。

1.pSIN-OV-3.5-CSI

3.5kb OV片段(包括DHS I、II和III)

5′UTR-5’部分(来自外显子L)

5′UTR-3’部分(来自外显子1)

2.pSIN-OV-3.5-Int-CSI-inv

3.5kb OV片段(包括DHS I、II和III)

5′UTR-5’部分(来自外显子L)

内含子A

5′UTR-3’部分(来自外显子1)

3′UTR

3.pSIN-OV-3.5-Int-CSI

3.5kb OV片段(包括DHS I、II和III)

5′UTR-5’部分(来自外显子L)

内含子A

5′UTR-3’部分(来自外显子1)

4.pSIN-OV-3.5-CSI-UTR-inv

3.5kb OV片段(包括DHS I、II和III)

5′UTR-5’部分(来自外显子L)

5′UTR-3’部分(来自外显子1)

3′UTR

5.pSIN-OV-3.5-Int-CSI-LUTR-inv

3.5kb OV片段(包括DHS I、II和III)

5′UTR-5’部分(来自外显子L)

内含子A

5′UTR-3’部分(来自外显子1)

3′UTR/DHS A(图813576-15163bp)；

6.pSIN-OV-3.5-CSI-LUTR-inv

3.5kb OV片段(包括DHS I、II和III)

5′UTR-5’部分(来自外显子L)

5′UTR-3’部分(来自外显子1)

3′UTR/DHS A(图813576-15163bp)；

7.pSIN-OV-3.5-Int-CSI-RRE

3.5kb OV片段(包括DHS I、II和III)

5′UTR-5’部分(来自外显子L)

内含子A

5′UTR-3’部分(来自外显子1)

部分3′UTR

RRE(Rev效应元件)图9a

构建物7包括允许未剪接的RNA基因组转运到胞质的RRE，从而增强完整逆转录病毒RNA的包装。RRE仅在Rev蛋白质存在时具有活性。在逆转录病毒瞬时转染的过程中，Rev活性以编码Rev DNA、RNA和/或Rev蛋白质的形式提供，这些形式是为人所知并且市售的(如英杰公司(Invitrogen，Inc.))。因此内含子在病毒颗粒产生的转基因禽类的基因组包含的转基因中出现(rev蛋白质不在转基因禽类的细胞中出现)。因此RNA应该在产卵鸡的输卵管细胞中剪接，和具有相同无内含子转基因的相同转基因禽类相比，蛋白表达水平升高。

8.pSIN-CTE-OV-3.5-Int-CSI

ALV CTE(图9b)插入5’of 3.5kb OV片段

3.5kb OV片段(包括DHS I、II和III)

5′UTR-5’部分(来自外显子L)

内含子A

5′UTR-3’部分(来自外显子1)

部分3′UTR

本申请其它部分描述了上述8个载体一些元件的位置(坐标)。例如，上文概述部分描述了来自卵清蛋白核苷酸序列的序列的位置。CSI指感兴趣的编码序列，即，期望在转基因禽类输卵管中表达的蛋白的编码核苷酸序列。

用于本发明的SIN载体、SIN/SC负载体和SC负载体包括以下载体，例如，禽类白血病/造白细胞组织增生病毒(ALV)，例如但不限于RAV-0、RAV-1、RAV-2；禽类肉瘤病毒(ASV)；禽类肉瘤/急性白血病病毒(ASLV)，包括但不限于，劳氏肉瘤病毒(RSV)；弗吉纳米肉瘤病毒(FSV)；禽类成髓细胞血症病毒(AMV)；禽类骨髓成红血细胞增多症病毒(AEV)；禽类髓细胞瘤病病毒(MCV)，例如但不限于，MC29；网状内皮组织增殖病毒(REV)，例如但不限于，脾坏死病毒(SNV)。本发明也关注其它有用逆转录病毒载体，包括但不限于，基于鼠白血病病毒(MLV)的逆转录病毒载体、莫罗尼鼠肉瘤病毒(MMSV)、莫洛尼鼠白血病病毒(MMLV)和慢病毒(如，本领域一般技术人员理解的改变为SIN载体、SIN/SC负载体或SC负载体的人体免疫缺陷病毒(HIV)、猫免疫缺陷病毒(FIV)、牛免疫缺陷病毒(BIV)和猿免疫缺陷病毒(SIV)。

在一个非常具体的实施方式中，J of Virology(1991)第65卷，第6期，第3388-3394页(其公开内容整体纳入本文作参考)公开的修饰的ALV载体的5’LTR的一部分缺失从而产生SIN载体。具体说，SEQ ID NO：29所示基于ALV载体的LTR序列缺失核苷酸1-173。本领域一般技术人员可测定用于从其它可用于禽类转基因的载体产生的SIN载体的5’LTR序列的特定缺失。

在一个尤其有用的实施方式中，本发明用于在转基因禽类根据本发明如鸡的输卵管内产生治疗性蛋白质。按照本发明生产的示范性蛋白质包括但不限于：红细胞生成素、GM-CSF、干扰素β、融合蛋白、CTLA4-Fc融合蛋白、生长激素、细胞因子、结构蛋白(structural)、干扰素、溶菌酶、β-酪蛋白、白蛋白、α-1抗胰蛋白酶、抗凝血酶III、胶原、因子VIII、因子IX、因子X(等)、血纤蛋白原、乳铁蛋白、蛋白C、组织型纤溶酶原激活物(tPA)、生长激素和糜蛋白酶、免疫球蛋白、抗体、免疫毒素、因子VIII、β-结构域缺失的因子VIII、因子VIIa、因子IX，抗凝剂；水蛭素、阿替普酶、tpa、瑞替普酶、tpa、tpa-5个结构域中缺失3个、胰岛素、赖脯胰岛素、速效胰岛素、甘精胰岛素、长效胰岛素类似物、高血糖素、tsh、促滤泡素-β、fsh、pdgh、inf-β、inf-α1、ifn-α2、inf-β、inf-β1b、ifn-β1a、ifn-γ、ifn-γ1b、il-2、il-11、hbsag、ospa、链道酶-α脱氧核糖核酸酶、β葡糖脑苷脂酶、tnf-α、il-2-白喉毒素融合蛋白、tnfr-lgg片段融合蛋白拉罗尼酶、DNA酶、阿法赛特(alefacept)、托西莫单抗、鼠单抗(murinemab)、阿仑单抗、拉布立酶、阿加糖酶β(agalsidase beta)、特立帕肽、甲状旁腺激素衍生物、阿达木单抗(lgg1)、阿那白滞素、奈西立肽(nesiritide)、人b-型利钠肽(hbnp)、集落刺激因子、培维索孟、人生长激素受体拮抗剂、重组活化蛋白c、奥马珠单抗(omalizumab)、免疫球蛋白e(lge)阻断物、替伊莫单抗、ACTH、高血糖素、生长抑素、生长激素、胸腺素、甲状旁腺激素、色素激素、生长调节素、黄体生成素、绒毛膜促性腺素、下丘脑释放因子、依那西普、抗利尿激素、促乳素和促甲状腺激素、免疫球蛋白多肽、免疫球蛋白多肽D区、免疫球蛋白多肽J区、免疫球蛋白多肽C区、免疫球蛋白轻链、免疫球蛋白重链、免疫球蛋白重链可变区、免疫球蛋白轻链可变区和接头肽。利用本发明的方法、载体和启动子产生这些蛋白质中的每一种以及其它蛋白质也在关注范围内。

下列实施例将以图解的方式进一步展示本发明，但不应解释为限制本发明。本申请中所有的参考文献、公开专利和引用专利均全部纳入本文作参考。

实施例1

产生pALV-SIN-4.2-Lys-IFNa-2B

构建载体pALV-SIN-4.2-Lys-IFNa-2B(图1所示)并示于图1。pALV-SIN-4.2-Lys-IFNa-2B的序列如SEQ ID NO：1所示。4.2Kb溶菌酶启动子跨越SEQ ID NO：1中核苷酸4810-9008。溶菌酶信号肽编码序列跨越SEQ IDNO：1中核苷酸9037-9090。干扰素α2b编码序列跨越SEQ ID NO：1中核苷酸9091-9585。其它序列的组件包括跨越SEQ ID NO：1中核苷酸4000-4345和核苷酸725-897的LTR。

本领域熟练技术人员了解多种构建pALV-SIN-4.2-Lys-IFNa-2B的方法。然而，下列被认为是制造载体的最有用的方法：使用引物ATGCGCGCATTGGTAATTGATCGGCTGG(引物ALV-SIN-1，SEQ ID NO：2)和ATATGCGGCCGCGGTACCGCCCGGGCATCGATATCAAGCTTACGGTTCACTAAACGAGCTCTGCTTATATAGACCTCCCA(引物ALV-SIN-2，SEQ ID NO：3)通过PCR扩增pNLB-CMV-IFN-α2B的3427bp区域(披露于2005年6月24日提交的美国专利申请号11/167,052，其内容整体纳入本文作参考)。用BssHII和Not I消化产物得到3428bp片段，该片段可通过凝胶纯化分离。使用引物ATATGCGGCCGCGTCGACGGCCGGCCAGATCTGCTGAGCCGGTCGCTACCATTACCAGT(引物ALV-SIN-3，SEQ ID NO：4)和ATACGCGTATTCCCTAACGATCACGTCG(引物ALV-SIN-4，SEQ ID NO：5)通过PCR扩增pNLB-CMV-IFN-α2B的1436bp区域。用Not I和Mlu I消化所得产物得到1438bp片段，该片段可通过凝胶纯化分离。用BssHII消化含BssHII填充片段的Bluescript II SK载体得到2788bp的线性化Bluescript载体，将其凝胶纯化然后与3428bp和1438bp PCR产物连接得到JCR.A108.49.5.24。

用Hind III消化JC R.A108.49.5.24，通过连接将得到的6823bp片段环化得到JCR.A108.76.1.1。

用引物CTGAAGTGTAAGGAATGTAAG(引物ALV-SIN-5，SEQ ID NO：6)和GCGCGTCTCATCCCCCTCCCTATGCAAAAG(引物ALV-SIN-6，SEQ IDNO：7)通过PCR扩增JCR.A108.76.1.1的1175bp区域，用Blp I和Esp3I消化所得片段得到1030bp片段，该片段可通过凝胶纯化分离。用引物GGGCGTCTCAGGGACGGATTGGACGAACCACTGAATT(引物ALV-SIN-7，SEQ ID NO：8)和TTAGTGCTTTACGGCACCTC(引物ALV-SIN-8，SEQ IDNO：9)通过PCR扩增JCR.A108.76.1.1的660bp的区域并用Esp3I和DraIII消化得到596bp片段，该片段可通过凝胶纯化分离。用DraIII和Blp I消化JCR.A108.76.1.1并将5024bp线性载体连接到1030和596bp的PCR片段上产生pALV-SIN。

用BamHI消化pALV-SIN并通过凝胶纯化分离4795bp的线性载体。用引物GACGGATCCGATACCGTCCCTATTTTTGTGTTTGCTTC(引物ALV-SIN-9，SEQ ID NO：10)和TAACGGATCCTAGACTTTTTACTCCTTAGA(引物ALV-SIN-10，SEQ ID NO：11)通过PCR扩增JCR.115.93.1.2的4815bp区域(披露于2007年1月26日提交的美国专利申请号2007/0124829)并用BamHI消化。将所得4802片段连接到795bp线性pALV-SIN产生pALV-SIN-4.0-Lys-IFNa-2B。

实施例2

用pALV-SIN-4.2-Lys-IFNa-2B产生转基因鹌鹑

2007年4月5日公开的名为《快速制备高滴度病毒》(Rapid Production ofHigh Titer Virus)的美国专利公开号2007/0077650公开了在成纤维细胞中制备pALV-SIN-4.2-Lys-IFNa-2B载体的转导颗粒，该公开内容整体纳入本文作参考。

基本按照美国专利号5,897,998(其公开内容整体纳入本文作参考)公开的Speksnijder步骤将受精日本鹌鹑卵开窗。80只卵的每只卵的胚盘下腔注射7微升(总共约7x10⁴个病毒颗粒)pALV-SIN-4.2-Lys-IFNa-2B转导颗粒。因为pALV-SIN-4.2-Lys-IFNa-2B中未使用可选择标记物，病毒颗粒的浓度根据过去的病毒颗粒生产结果估测，在过去的病毒生产中在载体中使用可选择盒或标记物以便量化颗粒。注射18天后孵化出16只小鸟，用IFN ELISA方法检测从孵化后12周的小鸟收集的血清样品的人IFN水平。未见血清IFN蛋白阳性。

为了鉴定基因组中含有转基因干扰素α2编码序列的G0鹌鹑，从鸟的血液中提取DNA并在7700序列检测仪(珀金埃尔默公司(Perkin Elmer))上对DNA样品进行分析。

用ELISA检测8只鹌鹑卵的卵白中IFN蛋白质的存在情况。在4号鹌鹑的卵的卵白中发现显著水平的IFN。图2显示4号鹌鹑卵白中IFN表达水平的柱状图。4号鹌鹑的卵白每毫升表达IFN-α-2 0.45μg，对于G0禽类来说这是很好的表达水平。4号鹌鹑的血中未检测到尤其显著的干扰素α2。例如，在某些情况下重组蛋白质出现在血液中时对于禽类的发育或健康有害，这样会杀死禽类或导致蛋白质生产水平的降低。

实施例3

用pALV-SIN-6.5-Lys-IFNa-2B产生转基因鹌鹑

利用本领域熟练技术人员所知标准方法，移除pALV-SIN-4.2-Lys-IFNa-2B载体中4.2kb溶菌酶启动子并用与SEQ ID NO：12中核苷酸5363-11863对应的6.5kb溶菌酶启动子替换，得到pALV-SIN-6.5-Lys-IFNa-2B。如2007年4月5日公开的美国专利公开号2007/0077650所述产生新载体pALV-SIN-6.5-Lys-IFNa-2B的转导颗粒。

将受精鸡卵或日本鹌鹑卵开窗并将约7x10⁴个pALV-SIN-6.5-Lys-IFNa-2B转导颗粒注射入每个卵的胚盘下腔。如实施例2所述，注射后将卵孵化21或18天，鉴定基因组中含活性转基因的嵌合鸟。用本领域所知方法即将雄性嵌合鸟和雌性非转基因鸟交配产生基因组中含转基因的完全转基因G1鸟。

实施例4

产生pSIN-OV-3.5-I-CTLA4-Fc-Inv载体

该载体包含卵清蛋白脱氧核糖核酸酶超敏位点(DHS)I、II和III，第一外显子(外显子L)，第一内含子和插入到与第二外显子(外显子1)以及3’非翻译区(UTR)在同一阅读框内的CTLA4-Fc融合蛋白编码序列。将表达盒反向插入到禽类白血病病毒(ALV)载体中，该载体通过缺失SEQ ID NO：29中所示ALVLTR序列的1-173位核苷酸造成自失活(SIN)。

按照如下步骤构建载体：用Nae I和Not I切割2007年5月17日公开的美国专利公开号2007/0113299(其公开内容整体纳入本文作参考)的实施例20所公开的pNLB-3.9-OM-CTLA4-Fc。在Klenow反应中填充Not I位点。所得8125bp片段经凝胶纯化、重连接产生pOM-3.9-CTLA4-dSacI。

用EcoRI和Kpn I切割pOM-3.9-CTLA4-dSacI并将8115bp片段凝胶纯化。用引物5’-GCGGAATTCAAAGAAGAAAGCTGAAAAAC-3’(SEQ ID NO：13)和5’-GCGGGTACCTTCAAATACTACAAGTGAAA-3’(SEQ ID NO：14)通过PCR从2006年6月15日公开的美国专利公开号2006/0130170公开的BAC 26中扩增鸡卵清蛋白基因3’UTR。用Eco RI和Kpn I切割3’UTR PCR产物并凝胶纯化684bp片段。pOM-3.9-CTLA4-dSacI的8115bp片段与684bp 3’UTR PCR片段连接得到pOM-3.9-CTLA4-OV3′UTR。

用引物5’-GGCCTCGAGTCAAGTTCTGAGTAGGTTTTAGTG-3’(SEQ IDNO：15)和5’-GCGCGTCTCTGTCTAGAGCAAACAGCAGAACAGTGAAAATG-3’(SEQ IDNO：16)-3’以BCA26为模板扩增3.5kb OV启动子区域、外显子L、第一内含子和外显子。用Xho I和Esp3I切割PCR产物并凝胶纯化5094bp产物。

用引物5’-GCGCGTCTCAAGACAACTCAGAGTTCACCATGGGTGTACTGCTCACACAG-3’(SEQ ID NO：17)和5’-GGCCCGGGAGTTTTGTCAGAAGATTTGGG-3’(SEQ ID NO：18)以pOM-3.9-CTLA4为模板扩增CTLA4-Fc基因的5’部分。用Esp3I和SacI切割PCR产物并凝胶纯化384bp产物。

用Sac I和Xho I切割pOM-3.9-CTLA4-OV3′UTR，将4473bp产物凝胶纯化并与5094bp OV PCR片段和384bp CTLA4-Fc片段连接产生pOV-3.5-I-CTLA4。用Mfe I和Xho I切割例如2007年5月31日公开的母案美国专利公开号2007/0124829中实施例10中的pALV-SIN，Klenow填充并凝胶纯化4911bp片段。

用XhoI和BamHI切割pOV-3.5-I-CTLA4，Klenow填充并凝胶纯化6957bp片段。将该片段与pAVI-SIN 4911bp片段连接，因此CTLA4-Fc基因和侧翼表达元件在ALV长末端重复序列的相反起始，产生了pSIN-OV-3.5-I-CTLA4-inv。参见图3和SEQ ID NO：19。如果转基因中感兴趣的编码序列(CSI)包含一个或多个内含子或剪接位点，优选此类反向起始。

实施例5

用SIN-OV-3.5-I-CTLA4-inv产生转基因鹌鹑

如2007年4月5日公开的美国专利公开号2007/0077650所述产生含pSIN-OV-3.5-I-CTLA4-inv载体(图3)和假型VSV包膜蛋白的逆转录病毒颗粒。转染后48小时收集病毒颗粒并浓缩，当天将约4微升含约1x 10⁵颗粒的病毒悬液注射入X期鹌鹑卵的胚盘下腔中。将卵重新封好并孵育。

ALV在其基因组3’端具有一个能使未剪接的逆转录病毒RNA转移的胞质的CTE元件。在pSIN-OV-3.5-I-CTLA4-inv中，由于LTR相关OV启动子的反向起始，CTE位于OV启动子的上游，因此CTE元件仅存在于起源于5’LTR启动子的RNA中，而不出现于OV启动子转录的RNA中。因此，任何OV启动子转录的RNA应在转移到胞质前剪接。

用CTLA4-Fc ELISA检测嵌合鹌鹑的卵白。发现一只鹌鹑的卵白具有浓度约16μg/ml的CTLA4-Fc。这些鹌鹑的转基因水平估计约5％或更少。因此G1的水平应该充分更高。因为鹌鹑合鸡卵清蛋白基因合其它禽类的卵清蛋白基因水平类似，期望在鸡或其它禽类出现相似的水平。

实施例6

构建pSIN-3.9-OM-CTLA4-Fc

将pALV-的4907bp Mfe I/Xho I片段(例如2007年5月31日美国专利申请号2007/0124829公开的)与pOM-3.9-CTLA4(图15所示，2007年5月31日美国专利申请号2007/0124829中)5115XhoI/EcoRI片段连接产生如图4和SEQID NO：20所示pSIN-3.9-OM-CTLA4-Fc。

实施例7

用pSIN-3.9-OM-CTLA4-Fc产生转基因鸡

如2007年4月5日公开的美国专利公开号2007/0077650所述产生VSV包膜蛋白作为假型的含有pSIN-3.9-OM-CTLA4-Fc(图4)载体的逆转录病毒颗粒。转染后48小时收集病毒并浓缩，在同一天将约7微升注射入X期卵的胚盘下腔。将卵重新封好并孵育。

用CTLA4-Fc ELISA检测鸡的卵白。发现一只鸡的卵白具有浓度约0.37μg/ml的CTLA4-Fc。这些鸡的转基因水平估计约5％或更少。因此G1的水平应该充分更高。

可将任意有用编码序列插入到CTLA4-Fc编码序列的位置产生对应的产物。

实施例8

构建pSIN-1.8-OM-IFNa-2B

将来自pBS-OM-4.4(图5SEQ ID NO：23)的1051bp Nco I-Nco I片段插入到pAVIJCR-A137.91.1.2(图6SEQ ID NO：24)的Nco I位点，从而将1kb卵类粘蛋白启动子插入到IFN编码序列和SV40聚腺苷酸化信号前并产生plkb-OM-IFNMM。将plkb-OM-IFNMM的1816bp Cla I-Sac I片段插入到pBS-OM-4.4的6245bp Cla I-Sac I片段中，从而将4.4kb卵类粘蛋白片段与IFN编码序列融合产生p4.4OM-IFNMM。将pBS-OMUP-10的8511bp BamH I-Sal I片段与p4.4OM-IFN的5148bp BamH I-Sal I片段连接，从而将10kb卵类粘蛋白启动子置于IFN编码序列前，产生p10-OM-IFN。

用引物5’-GGCGTCGACGGATCCGTTAACCCTAGAACTAGTGGATCTCTGCCCTTGTGCTGAC-3’(SEQ ID NO：27)和5’-GGCCTCGAGCCTAGACTTTTTACTCCTTAGA-3’(SEQ ID NO：28)通过PCR扩增p10.0-OM-IFN的2487-4889区域。用Sal I和Xho I消化PCR产物并分离2435bp(片段)。用Xho I消化pALV-SIN(例如2007年5月31日美国专利申请号2007/0124829公开的)，分离4915bp片段并与2435bp片段连接，产生图7和SEQ ID NO：21所示pSIN-1.8-OM-IFNa-2B。

实施例9

用pSIN-1.8-OM-IFNa-2B产生转基因鸡

如2007年4月5日公开的美国专利公开号2007/0077650所述生产含pSIN-1.8-OM-IFNa-2B转基因并用VSV包膜蛋白产生假型的逆转录病毒颗粒。转染后48小时收集病毒并浓缩，在同一天将约7微升注射入X期卵的胚盘下腔。将卵重新封好并孵育。

用IFNa-2B ELISA检测来自鸡的卵白。发现鸡卵白IFNa-2B的水平范围为1.5-865.0ng/ml，而血清中的IFNa-2B水平至少低约600倍。这些鸡的转基因水平估计约5％或更少。

5只G0精子阳性公鸡与非转基因母鸡交配。1251只子代中，30只携带pSIN-1.8-OM-IFNa-2B转基因。30只母鸡中的6只每毫升卵白表达34.1-165.6μg人IFN-a-2B。6中母鸡中的每一只具有单一拷贝的转基因。人IFN-a-2B的血清水平为0.3-9.2ng/ml，平均比卵白中的水平低30,000倍。

实施例10

用慢病毒载体和莫洛尼鼠白血病病毒产生转基因鸡

本发明尤其关注根据本发明用于禽类转基因的其它逆转录病毒载体。可使用此类载体产生转基因禽类，例如，用上述实施例1-9相同的方式使用ALV-SIN载体。例如，可根据本发明使用莫洛尼鼠白血病病毒(MMLV)和慢病毒载体，例如通过将每一病毒上游LTR中U3区域所含的一个或多个CAAT盒、TAATA盒和增强子删除以产生SIN载体。或者，或除此之外(即与SIN载体连接)每一逆转录病毒载体包含无转录活性的标记物或选择性盒。

尽管使用特定的术语、设备和方法描述本发明的优选实施方式，但此类描述仅为说明目的。这些词语用以描述而非限定。应当被理解的是，在不背离权利要求书中列举的本发明的精神和范围内，本领域熟练技术人员可进行更改或变化。此外，应当被理解的是不同实施方式的方面可全部或部分互换。

Claims (15)

1.一种在完全转基因种系禽类中制造外源蛋白质的方法，所述方法包括以下步骤：

将来源于禽类白血病病毒的、不具有选择标记的自失活载体即SIN载体导入所述禽类的胚胎，以产生转基因禽类，其中所述SIN载体包含与输卵管特异性启动子组件可操作连接的、编码外源蛋白质的核苷酸序列，其中所述外源核苷酸序列被整合到所述转基因禽类的基因组内，并且该外源蛋白质在该转基因禽类的输卵管细胞内表达，从输卵管细胞分泌，并且沉积在该转基因禽类的蛋中；

获得完全转基因种系禽类，其产的蛋在蛋白内包含该外源蛋白质；和

从蛋白分离所述外源蛋白质。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述禽类选自鸡、火鸡和鹌鹑。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述启动子组件与禽类外源性的编码序列连接。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述启动子组件是禽类卵类粘蛋白启动子组件。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述启动子组件是禽类卵清蛋白启动子组件。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述启动子组件是禽类溶菌酶启动子组件。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述外源蛋白质是治疗性蛋白质。

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述外源蛋白质是融合蛋白。

9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述外源蛋白质是IFN-α1或IFN-α2。

10.如权利要求1所述的方法，其中，所述启动子组件包含选自由含有下述组件的核苷酸序列所构成的组中的核酸：

a)包含DHS I、II和III的3.5kb OV片段，

来自外显子L的5′UTR-5′部分，和

来自外显子1的5′UTR-3′部分；

b)包含DHS I、II和III的3.5kb OV片段，

来自外显子L的5′UTR-5′部分，

内合子A，

来自外显子1的5′UTR-3′部分，和

3′UTR；

c)包含DHS I、II和III的3.5kb OV片段，

来自外显子L的5′UTR-5′部分，

内含子A，和

来自外显子1的5′UTR-3′部分；

d)包含DHS I、II和III的3.5kb OV片段，

来自外显子L的5′UTR-5′部分，

来自外显子1的5′UTR-3′部分，和

3′UTR；

e)包含DHS I、II和III的3.5kb OV片段，

来自外显子L的5′UTR-5′部分，

内含子A，

来自外显子1的5′UTR-3′部分，和

SEQ ID NO：22中第13576-15163位核苷酸所示序列的3′UTR／DHS A；

f)包含DHS I和、II和III的3.5kb OV片段，

来自外显子L的5′UTR-5′部分，

来自外显子1的5′UTR-3′部分，和

SEQ ID NO：22中第13576-15163位核苷酸所示序列的3′UTR／DHS A；

g)包含DHS I、II和III的3.5kb OV片段，

来自外显子L的5′UTR-5′部分，

内含子A，

来自外显子1的5′UTR-3′部分，

部分3′UTR，和

RRE；以及

h)ALV CTE，

包含DHS I、II和III的3.5kb OV片段，

来自外显子L的5′UTR-5′部分，

内含子A，

来自外显子1的5′UTR-3′部分，和

部分3′UTR；

其中，

所述3.5kb OV片段是SEQ ID NO：22中第3199至6659位核苷酸所示序列；

所述来自外显子L的5′UTR-5′部分是sEQ ID NO：22中第6659至6705位核苷酸所示序列；

所述来自外显子1的5，UTR-3′部分是SEQ ID NO：22中第8295至8311位核苷酸所示序列；

所述3′UTR是SEQ ID NO：22中第13576至14209位核苷酸所示序列；

所述部分3′UTR是SEQ ID NO：22中第13576至13996位核苷酸所示序列；

所述内含子A是SEQ ID NO：22中第6706至8294位核苷酸所示序列；

所述外显子L是SEQ ID NO：22中第6659至6705位核苷酸所示序列；

所述外显子1是SEQ ID NO：22中第8295至8478位核苷酸所示序列；

DHS III是SEQ ID NO：22中第3253至3559位核苷酸所示序列；

DHS II是SEQ ID NO：22中第5629至6009位核苷酸所示序列；

DHS I是SEQ ID NO：22中第6359至6659位核苷酸所示序列；

RRE是如SEQ ID NO：25所示；以及

ALV GTE是如SEQ ID NO：26所示。

11.一种制备含有输卵管细胞的完全转基因禽类的方法，所述方法包括将来源于禽类白血病病毒、不具有选择标记的自失活载体即SIN载体引入禽类的胚胎内，由此产生转基因禽类，其中所述载体包含与输卵管特异性启动子组件可操作性连接的外源性核苷酸序列；以及从所述转基因禽类产生含有包含所述外源性核苷酸序列的输卵管细胞的完全转基因种系禽类，其中所述启动子组件驱动所述外源性核苷酸序列在所述输卵管细胞内表达，并且外源性蛋白在输卵管细胞中表达，由输卵管细胞分泌到输卵管的腔内，并且沉积到该完全转基因种系禽类的蛋的蛋白中。

12.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述禽类是鸡。

13.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述启动子组件是禽类卵类粘蛋白启动子组件。

14.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述启动子组件是禽类卵清蛋白启动子组件。

15.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述启动子组件是禽类溶菌酶启动子组件。

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