JP5796862B2 - トリにおける導入遺伝子発現 - Google Patents
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Description
本出願は、2007年5月16日出願の米国仮出願第60/930,491号および2007年9月18日出願の米国仮出願第60/994,203号の利益を主張し、2007年1月26日出願の米国特許出願第11/699,257号の一部継続出願である。これら2つの仮出願および1つの特許出願の各々の開示は、引用によりその全体が本明細書に取込まれる。
本発明は一般的に、トランスジェニックニワトリなどのトランスジェニックトリの細胞(例えば、卵管細胞)において機能するプロモーターおよびかかるプロモーターを含有するベクターの使用に関する。より具体的には、本発明は、組換え核酸および発現ベクター、トランスフェクトされた細胞ならびにトランスジェニック動物、例えば、トランスジェニックニワトリなどのトランスジェニックトリに関し、これらはコード配列に作動可能に連結した遺伝子発現制御領域を備えたベクターを含有する。
遺伝子組換えの分野は最初、動物全体における単一の遺伝子の作用ならびに遺伝子の活性化、発現および相互作用の現象を理解するために発達した。遺伝子組換え技術は、ヒトおよび他の動物における様々な疾患のためのモデルを作成するためにも用いられてきており、遺伝学の研究ならびに遺伝的なメカニズムおよび機能の理解のために利用できる最も強力なツールの一つである。経済的観点から、動物を特定のタンパク質または医薬上興味のある他の物質の生産のための“タンパク質工場”へと変換するための遺伝子組換え技術の使用 (Gordon et al.、1987、Biotechnology 5: 1183-1187(非特許文献1); Wilmut et al.、1990、Theriogenology 33: 113-123(非特許文献2)) は、遺伝子発現によるタンパク質生産のより常套の方法を超えて顕著な利点を提供する。
本発明は、この要求およびそれ以上のものに応える。何年にもわたるトランスジェニックトリの卵管組織における少ない収量での外因性タンパク質生産の後、本発明の発明者らは、本明細書に記載される新しい構成(composition)および方法を採用することによって、かかる生産レベルを 約 10 倍から約 100 倍以上増やすことができることを見出した。
SC 陰性ベクター(すなわち、機能的プロモーターを伴う選択マーカー カセットを含有しないベクター)でもある場合には、さらに増強され得る。
5' UTR-5' 部分 (エキソン L から)
5' UTR-3' 部分 (エキソン 1 から);
2. 3.5 kb OV 断片 (DHS I、II および III を含む)
5' UTR-5' 部分 (エキソン L から)
イントロン A
5' UTR-3' 部分 (エキソン 1 から)
3' UTR;
3. 3.5 kb OV 断片 (DHS I、II および III を含む)
5' UTR-5' 部分 (エキソン L から)
イントロン A
5' UTR-3' 部分 (エキソン 1 から);
4. 3.5 kb OV 断片 (DHS I、II および III を含む)
5' UTR-5' 部分 (エキソン L から)
5' UTR-3' 部分 (エキソン 1 から)
3' UTR;
5. 3.5 kb OV 断片 (DHS I、II および III を含む)
5' UTR-5' 部分 (エキソン L から)
イントロン A
5' UTR-3' 部分 (エキソン 1 から)
3' UTR / DHS A (配列番号 22 の 13576 から 15163 bp)
6. 3.5 kb OV 断片 (DHS I、II および III を含む)
5' UTR-5' 部分 (エキソン L から)
5' UTR-3' 部分 (エキソン 1 から)
3' UTR / DHS A (配列番号 22 の 13576 から 15163 bp)
7. 3.5 kb OV 断片 (DHS I、II および III を含む)
5' UTR-5' 部分 (エキソン L から)
イントロン A
5' UTR-3' 部分 (エキソン 1 から)
部分的な 3' UTR
RRE (Rev 応答エレメント) 図 9a
8. ALV CTE (図 9 b) が挿入された 3.5 kb OV 断片の 5'
3.5 kb OV 断片 (DHS I、II および III を含む)
5' UTR-5' 部分 (エキソン L から)
イントロン A
5' UTR-3' 部分 (エキソン 1 から)
部分的な 3' UTR;
3.5 kb OV 断片 (DHS I、II および III を含む): 図 8 (配列番号 22)のうち、開始: 3199 終了: 6659;
1.4 kb OV 断片 (DHS I および II を含む): 図 8 (配列番号 22)のうち、開始: 5209 終了: 6659;
3.8 kb OV 断片: 図 8 (配列番号 22)のうち、開始: 2863 終了: 6659;
5.2 kb OV 断片: 図 8 (配列番号 22)のうち、開始: 1463 終了: 6659;
5' UTR-5' 部分 (エキソン L から): 図 8 (配列番号 22)のうち、開始: 6659 終了:
6705;
5' UTR-3' 部分 (エキソン 1 から): 図 8 (配列番号 22)のうち、開始: 8295 終了:
8311;
3' UTR: 図 8 (配列番号 22)のうち、開始: 13576 終了: 14209;
部分的な 3' UTR: 図 8 (配列番号 22)のうち、開始 13576 終了: 13996;
イントロン A: 図 8 (配列番号 22)のうち、開始: 6706 終了: 8294;
イントロン E: 図 8 (配列番号 22)のうち、開始: 10010 終了: 10968;
エキソン L: 図 8 (配列番号 22)のうち、開始: 6659 終了: 6705;
エキソン 1: 図 8 (配列番号 22)のうち、開始: 8295 終了: 8478;
エキソン 2: 図 8 (配列番号 22)のうち、開始: 8731 終了: 8781;
エキソン 3: 図 8 (配列番号 22)のうち、開始: 9363 終了: 9491;
エキソン 4: 図 8 (配列番号 22)のうち、開始: 9892 終了: 10009;
エキソン 5: 図 8 (配列番号 22)のうち、開始: 10968 終了: 11110;
エキソン 6: 図 8 (配列番号 22)のうち、開始: 11442 終了: 11597;
エキソン 7: 図 8 (配列番号 22)のうち、開始: 13180 終了: 13575;
+1 部位: 図 8 (配列番号 22)のうち、開始: 6659 終了: 6659;
ATG: 図 8 (配列番号 22)のうち、開始: 8312 終了: 8312;
Poly A: 図 8 (配列番号 22)のうち、開始: 14204 終了: 14209;
TATA: 図 8 (配列番号 22)のうち、開始: 6627 終了: 6632;
DHS A: 図 8 (配列番号 22)のうち、開始: 13858 終了: 15163;
DHS IV: 図 8 (配列番号 22)のうち、開始: 459 終了: 859;
DHS III: 図 8 (配列番号 22)のうち、開始: 3253 終了: 3559;
DHS II: 図 8 (配列番号 22)のうち、開始: 5629 終了: 6009; そして
DHS I: 図 8 (配列番号 22)のうち、開始: 6359 終了: 6659。
A とイントロン E との置換は、イントロン E の使用に起因するヒストンの優先的な間隔(preferential spacing)を提供し得る(すなわち、イントロン A についての周期性(periodicity)は 202 bp +/- 5 bp であり、イントロン E については 196 bp +/- 5 bp である)。例えば、ヒストンによる DNA のパッケージングは、その操作が転写調節の原因であるタンパク質(例えば、転写因子)のための結合部位の優先的な整列につながり得、転写レベルの増強につながる、DNA の位相幾何学的変化をもたらすと考えられる。
[1] プロモーター構成成分および SIN ベクターを含む外因性ヌクレオチド配列をそのゲノム中に含有するトランスジェニックトリであって、該外因性ヌクレオチド配列が該ゲノム中に組み込まれ、該トリによって産まれる殻の硬い卵の中に貯蔵される外因性タンパク質を生産する、トランスジェニックトリ。
[2] プロモーター構成成分が、卵管特異的プロモーターである、[1]に記載のトランスジェニックトリ。
[3] トリが、ニワトリ、シチメンチョウおよびウズラからなる群から選択される、[1]に記載のトランスジェニックトリ。
[4] プロモーター構成成分が、トリにとって外因性のコード配列に連結している、[1]に記載のトランスジェニックトリ。
[5] プロモーター構成成分が、トリ オボムコイド プロモーター構成成分である、[1]に記載のトランスジェニックトリ。
[6] プロモーター構成成分が、トリ 卵白アルブミン プロモーター構成成分である、[1]に記載のトランスジェニックトリ。
[7] プロモーター構成成分が、トリ リゾチーム プロモーター構成成分である、[1]に記載のトランスジェニックトリ。
[8] 外因性タンパク質が、治療タンパク質である、[1]に記載のトランスジェニックトリ。
[9] 外因性タンパク質が、サイトカインである、[1]に記載のトランスジェニックトリ。
[10] 外因性タンパク質が、エリスロポエチン、GM-CSF、インターフェロン、融合タンパク質、CTLA4-Fc 融合タンパク質、成長ホルモン、サイトカイン、ストラクチュラル、インターフェロン、リゾチーム、β-カゼイン、アルブミン、α-1 アンチトリプシン、アンチトロンビン III、コラーゲン、第VIII因子、第IX因子、第X因子(など)、フィブリノーゲン、ラクトフェリン、プロテイン C、組織型プラスミノーゲン活性化因子(tPA)、ソマトトロピン、およびキモトリプシン、免疫グロブリン、抗体、免疫毒素、第VIII因子、b-ドメイン欠失第VIII因子、第VIIa因子、第IX因子、抗凝固剤; ヒルジン、アルテプラーゼ、tpa、レテプラーゼ、tpa、5つのドメインのうち3つが欠失した tpa、インスリン、インスリン リスプロ、インスリン アスパルト、インスリン グラルギン、長時間作用型インスリンアナログ、グルカゴン、tsh、フォリトロピン-ベータ、fsh、pdgh、inf-ベータ、inf-アルファ 1、ifn-アルファ 2、inf-ベータ、inf-ベータ 1b、ifn-ベータ 1a、ifn-ガンマ、ifn-ガンマ 1b、il-2、il-11、hbsag、ospa、ドルナーゼ-アルファ DNA分解酵素、ベータ グルコセレブロシダーゼ、tnf-アルファ、il-2-ジフテリア毒素融合タンパク質、tnfr-lgg 断片融合タンパク質、ラロニダーゼ、DNAアーゼ、アレファセプト、トシツモマブ、マウス mab、アレムツズマブ、ラスブリカーゼ、アガルシダーゼ ベータ、テリパラチド、副甲状腺ホルモン誘導体、アダリムマブ (lgg1)、アナキンラ、生物学的モディファイヤー、ネシリチド、ヒト b-型 ナトリウム利尿ペプチド(hbnp)、コロニー刺激因子、ペグビソマント、ヒト成長ホルモン受容体アンタゴニスト、組換え活性化プロテイン c、オマリズマブ、免疫グロブリン e (lge) ブロッカー、イブリツモマブチウキセタン、ACTH、グルカゴン、ソマトスタチン、ソマトトロピン、チモシン、副甲状腺ホルモン、色素性ホルモン、ソマトメジン、黄体形成ホルモン、絨毛性ゴナドトロピン、視床下部放出因子、エタネルセプト、抗利尿ホルモン、プロラクチンおよび甲状腺刺激ホルモン、免疫グロブリン ポリペプチド、免疫グロブリン ポリペプチド D 領域、免疫グロブリン ポリペプチド J 領域、免疫グロブリン ポリペプチド C 領域、免疫グロブリン軽鎖、免疫グロブリン重鎖、免疫グロブリン重鎖可変領域、免疫グロブリン軽鎖可変領域ならびにリンカー ペプチドからなる群から選択される、[1]に記載のトランスジェニックトリ。
[11] レトロウイルスが、トリ白血症ウイルスベクター(ALV)、マウス白血病ウイルス(MLV)レトロウイルス ベクター、モロニー マウス白血病ウイルス(MMLV)およびレンチウイルスベクターからなる群から選択される、[1]に記載のトランスジェニックトリ。
[12] 組み込まれた SIN ベクター中に含有される外因性コード配列に連結したプロモーター構成成分を含む外因性ヌクレオチド配列を含有する卵管細胞を含むトランスジェニックトリであって、該外因性コード配列が卵管細胞において発現し、卵管細胞から分泌される、トランスジェニックトリ。
[13] トリが、ニワトリである、[12]に記載のトランスジェニックトリ。
[14] 卵管細胞が、管状腺細胞である、[12]に記載のトランスジェニックトリ。
[15] プロモーター構成成分が、トリ オボムコイド プロモーター構成成分である、[12]に記載のトランスジェニックトリ。
[16] プロモーター構成成分が、トリ 卵白アルブミン プロモーター構成成分である、[12]に記載のトランスジェニックトリ。
[17] プロモーター構成成分が、トリ リゾチーム プロモーター構成成分である、[12]に記載のトランスジェニックトリ。
[18] SIN ベクターおよび SC 陰性ベクターの少なくとも一方であるベクターを含むヌクレオチド配列をそのゲノム中に有するトランスジェニックトリを作出することを含む、外因性タンパク質を生産する方法であって、該ヌクレオチド配列が外因性コード配列に連結したプロモーター構成成分を含む、方法。
[19] 外因性コード配列が、ヒトのタンパク質をコードする、[18]に記載の方法。
[20] 外因性コード配列が、治療タンパク質をコードする、[18]に記載の方法。
[21] プロモーター構成成分が、トリ 卵白アルブミン プロモーター構成成分、トリ オボムコイド プロモーター構成成分、トリ リゾチーム プロモーター構成成分およびトリ コンアルブミン プロモーター構成成分からなる群から選択されるプロモーターの機能的プロモーター配列を含む、[18]に記載の方法。
[22] トリが、ニワトリである、[18]に記載の方法。
[23] プロモーター構成成分および SC 陰性ベクターを含む外因性ヌクレオチド配列をそのゲノム中に含有するトランスジェニックトリであって、該外因性ヌクレオチド配列が該ゲノム中に組み込まれ、外因性タンパク質を生産する、トランスジェニックトリ。
[24] プロモーター構成成分が、トリ 卵白アルブミン プロモーター構成成分、トリ オボムコイド プロモーター構成成分およびトリ リゾチーム プロモーター構成成分からなる群から選択されるプロモーターの機能的プロモーター配列を含む、[23]に記載のトランスジェニックトリ。
[25] 以下を含有するヌクレオチド配列からなる群から選択される核酸分子と 90% 同一の核酸:
1. 3.5 kb OV 断片 (DHS I、II および III を含む)
5' UTR-5' 部分 (エキソン L から)
5' UTR-3' 部分 (エキソン 1 から);
2. 3.5 kb OV 断片 (DHS I、II および III を含む)
5' UTR-5' 部分 (エキソン L から)
イントロン A
5' UTR-3' 部分 (エキソン 1 から)
3' UTR;
3. 3.5 kb OV 断片 (DHS I、II および III を含む)
5' UTR-5' 部分 (エキソン L から)
イントロン A
5' UTR-3' 部分 (エキソン 1 から);
4. 3.5 kb OV 断片 (DHS I、II および III を含む)
5' UTR-5' 部分 (エキソン L から)
5' UTR-3' 部分 (エキソン 1 から)
3' UTR;
5. 3.5 kb OV 断片 (DHS I、II および III を含む)
5' UTR-5' 部分 (エキソン L から)
イントロン A
5' UTR-3' 部分 (エキソン 1 から)
3' UTR / DHS A (図 8 の 13576 から 15163 bp);
6. 3.5 kb OV 断片 (DHS I、II および III を含む)
5' UTR-5' 部分 (エキソン L から)
5' UTR-3' 部分 (エキソン 1 から)
3' UTR / DHS A (図 8 の 13576 から 15163 bp);
7. 3.5 kb OV 断片 (DHS I、II および III を含む)
5' UTR-5' 部分 (エキソン L から)
イントロン A
5' UTR-3' 部分 (エキソン 1 から)
部分的な 3' UTR
RRE;
8. ALV CTE
3.5 kb OV 断片 (DHS I、II および III を含む)
5' UTR-5' 部分 (エキソン L から)
イントロン A
5' UTR-3' 部分 (エキソン 1 から)
部分的な 3' UTR;
ここで、
3.5 kb OV 断片 (DHS I、II および III を含む): 図 8 (配列番号 22)のうち、開始: 3199 終了: 6659;
5' UTR-5' 部分 (エキソン L から): 図 8 (配列番号 22)のうち、開始: 6659 終了: 6705;
5' UTR-3' 部分 (エキソン 1 から): 図 8 (配列番号 22)のうち、開始: 8295 終了: 8311;
3' UTR: 図 8 (配列番号 22)のうち、開始: 13576 終了: 14209;
部分的な 3' UTR: 図 8 (配列番号 22)のうち、開始 13576 終了: 13996;
イントロン A: 図 8 (配列番号 22)のうち、開始: 6706 終了: 8294;
エキソン L: 図 8 (配列番号 22)のうち、開始: 6659 終了: 6705;
エキソン 1: 図 8 (配列番号 22)のうち、開始: 8295 終了: 8478;
DHS III: 図 8 (配列番号 22)のうち、開始: 3253 終了: 3559;
DHS II: 図 8 (配列番号 22)のうち、開始: 5629 終了: 6009;
DHS I: 図 8 (配列番号 22)のうち、開始: 6359 終了: 6659; そして、
RRE: 図 9a (配列番号 25)に示される
ALV CTE: 図 9b (配列番号 26)に示される。
定義
本明細書において“動物”の用語は、トリを含む全ての脊椎動物を包含するために用いられ、ヒトを含み得る。それは、胚性および胎性の段階を含む発生の全段階における個々の動物をも包含する。
(1990) Proc. Natl. Acad. Sci. 87: 2264 2268 のアルゴリズムを用いて決定される、2つの核酸配列間または2つのアミノ酸配列間の配列一致の程度をいう。かかるアルゴリズムは、Attschul et al. (1990) T. Mol. Biol. Q15: 403 410 の NBLAST および XBLAST プログラムに組み込まれている。本発明の核酸分子と相同なヌクレオチド配列を得るために、BLAST ヌクレオチド検索は、NBLAST プログラム、スコア = 100、単語長(wordlength) = 12 で実行される。基準の(reference)アミノ酸配列と相同なアミノ酸配列を得るために、BLAST タンパク質検索は、XBLAST プログラム、スコア = 50、単語長(wordlength)
= 3 で実行される。比較目的のギャップありアラインメントを得るため、Gapped BLAST が Attschul et al. (1997) Nucl. Acids Res. 25: 3389 3402 に記載される通りに利用される。BLAST および Gapped BLAST プログラムを利用する場合、それぞれのプログラム
(例えば XBLAST および NBLAST) のデフォルトのパラメータが用いられる。他のアルゴリズム、プログラムおよびデフォルトの設定、例えば、これだけではないが、ヌクレオチドまたはアミノ酸の配列比較のためのプログラムを含む U.K. Human Genome Mapping Project Resource Centre の GCG 配列解析パッケージも適し得る。
の DNA 配列を包含する。
本明細書において用いられる略称は、以下を含みうる: aa、1または複数のアミノ酸; bp、1または複数の塩基対; cDNA、RNA に対し相補的な DNA; nt、1または複数のヌクレオチド; kb、1000 塩基対; μg、マイクログラム; ml、ミリリットル; ng、ナノグラム。
本発明に従って設計され用いられる SIN ベクターは、トランスジェニックトリにおいて採用される興味の対象であるプロモーターのプロモーター干渉を減少させまたは除去することができる。特に有用な態様において、興味の対象であるプロモーター(すなわち、プロモーター構成成分)、例えば卵管特異的プロモーターは、その遺伝子産物を卵管細胞または卵管組織において優先的に発現する。かかるプロモーター(例えば、プロモーター構成成分)の例は、これらに限定されないが、卵白アルブミン、リゾチーム、コンアルブミン(すなわち、オボトランスフェリン)、オボムコイド、オボムチンおよび/またはオボインヒビター遺伝子の発現制御領域もしくはプロモーター領域の機能的部分を包含する。一つの態様において、興味の対象であるプロモーターは、1以上のプロモーターの組み合わせもしくは融合または1以上のプロモーター断片の融合、例えば、別のプロモーターもしくはプロモーター断片、例えばウイルス プロモーター(例えば、LTR プロモーター)を伴う卵白アルブミン、リゾチーム、コンアルブミン(すなわち、オボトランスフェリン)、オボムコイド、オボムチン、および/またはオボインヒビター プロモーターである。
3.5 kb OV 断片 (DHS I、II および III を含む)
5' UTR-5' 部分 (エキソン L から)
5' UTR-3' 部分 (エキソン 1 から)
2. pSIN-OV-3.5-Int-CSI-inv
3.5 kb OV 断片 (DHS I、II および III を含む)
5' UTR-5' 部分 (エキソン L から)
イントロン A
5' UTR-3' 部分 (エキソン 1 から)
3' UTR
3. pSIN-OV-3.5-Int-CSI
3.5 kb OV 断片 (DHS I、II および III を含む)
5' UTR-5' 部分 (エキソン L から)
イントロン A
5' UTR-3' 部分 (エキソン 1 から)
4. pSIN-OV-3.5-CSI-UTR-inv
3.5 kb OV 断片 (DHS I、II および III を含む)
5' UTR-5' 部分 (エキソン L から)
5' UTR-3' 部分 (エキソン 1 から)
3' UTR
5. pSIN-OV-3.5-Int-CSI-LUTR-inv
3.5 kb OV 断片 (DHS I、II および III を含む)
5' UTR-5' 部分 (エキソン L から)
イントロン A
5' UTR-3' 部分 (エキソン 1 から)
3' UTR / DHS A (図 8 の 13576 から 15163 bp);
6. pSIN-OV-3.5-CSI-LUTR-inv
3.5 kb OV 断片 (DHS I、II および III を含む)
5' UTR-5' 部分 (エキソン L から)
5' UTR-3' 部分 (エキソン 1 から)
3' UTR / DHS A (図 8 の 13576 から 15163 bp);
7. pSIN-OV-3.5-Int-CSI-RRE
3.5 kb OV 断片 (DHS I、II および III を含む)
5' UTR-5' 部分 (エキソン L から)
イントロン A
5' UTR-3' 部分 (エキソン 1 から)
部分的な 3' UTR
RRE (Rev 応答エレメント) 図 9a
ALV CTE (図 9b) が挿入された 3.5 kb OV 断片の 5'
3.5 kb OV 断片 (DHS I、II および III を含む)
5' UTR-5' 部分 (エキソン L から)
イントロン A
5' UTR-3' 部分 (エキソン 1 から)
部分的な 3' UTR
pALV-SIN-4.2-Lys-IFNa-2B の作成
(図 1 に示される)ベクター pALV-SIN-4.2-Lys-IFNa-2B を構築し、図 1 に示す。pALV-SIN-4.2-Lys-IFNa-2B の配列を、配列番号 1 に示す。4.2 Kb リゾチーム プロモーターは、配列番号 1 のヌクレオチド 4810 から 9008 に及ぶ。リゾチーム シグナルペプチドのコード配列は、配列番号 1 のヌクレオチド 9037 から 9090 に及ぶ。インターフェロン アルファ 2b のコード配列は、配列番号 1 のヌクレオチド 9091 から 9585 に及ぶ。配列の他の構成要素は、配列番号 1 のヌクレオチド 4000 から 4345 およびヌクレオチド 725 から 897 に及ぶ LTR を含む。
ALV-SIN-7、配列番号 8) および TTAGTGCTTTACGGCACCTC (プライマー ALV-SIN-8、配列番号 9) を用いて PCR 増幅し、Esp3I および DraIII で消化して、ゲル精製によって単離される 596 bp の断片を得る。JCR.A108.76.1.1 を DraIII および Blp I で消化し、5024 bp の直線状ベクターを、1030 および 596 bp の PCR 断片に連結して pALV-SIN を作成する。
pALV-SIN-4.2-Lys-IFNa-2B を用いるトランスジェニック ウズラの作出
ベクター pALV-SIN-4.2-Lys-IFNa-2B の形質導入粒子を、その開示事項が全体として引用により本明細書に取り込まれている、Rapid Production of High Titer Virus という表題の2007年4月5日公開の米国特許出願公開第2007/0077650号に開示される通りに、線維芽細胞において作成した。
pALV-SIN-6.5-Lys-IFNa-2B を用いるトランスジェニック ウズラの作出
当業者に公知の標準的な方法を用いて、ベクター pALV-SIN-4.2-Lys-IFNa-2B の 4.2 kb リゾチーム プロモーターを除去し、配列番号 12 の約ヌクレオチド 5363 から 11863 に対応する 6.5 kb リゾチーム プロモーターで置き換えて、pALV-SIN-6.5-Lys-IFNa-2B を得る。新たなベクター pALV-SIN-6.5-Lys-IFNa-2B の形質導入粒子を、2007年4月5日公開の米国特許出願公開第2007/0077650号に開示される通りに作成する。
ベクター pSIN-OV-3.5-I-CTLA4-Fc-Inv の作成
このベクターは、第2のエキソン(エキソン 1) の ATG および 3' 非翻訳領域(UTR)と共に、卵白アルブミンの DNA分解酵素超感受性部位(DHS)I、II および III、第1のエキソン(エキソン L)、第1のイントロンならびにインフレームに挿入された CTLA4-Fc 融合タンパク質コード配列を含む。発現カセットは、配列番号 29 に示される ALV LTR 配列のヌクレオチド 1 から 173 の欠失によって自己不活化(SIN)にされたトリ白血症ウイルス(ALV)ベクターへ、逆方向に挿入される。
SIN-OV-3.5-I-CTLA4-inv を用いるトランスジェニック ウズラの作出
pSIN-OV-3.5-I-CTLA4-inv ベクター(図 3)を含有し、VSV エンベロープ タンパク質で偽型にされたレトロウイルス粒子を、2007年4月5日公開の米国特許出願公開第2007/0077650号に記載される通りに作成した。ウイルス粒子をトランスフェクション後 48 時間で回収し、濃縮し、同日に、約 1 x 105 の粒子を含むおよそ 4 マイクロリットルのウイルス懸濁液を、ステージ X のウズラの卵の胚下腔へ注入した。卵は再び塞がれ、そして孵化した。
の細胞質への輸送を可能にする CTE エレメントを有する。pSIN-OV-3.5-I-CTLA4-invにおいては、OV プロモーターが LTR に対して逆方向を向いているため、CTE エレメントが
5' LTR プロモーター由来の RNA 中にのみ存在し、OV プロモーターによって転写される
RNA 中には存在しないよう、CTE は OV プロモーターの上流にある。そのため、OV プロモーターによって転写されるあらゆる RNA は、細胞質中へ輸送される前にスプライスされる。
pSIN-3.9-OM-CTLA4-Fc の構築
(例えば、2007年5月31日公開の米国特許出願公開第2007/0124829号に開示される) pALV-SIN の 4907 bp の MfeI/XhoI 断片を、(2007年5月17日公開の米国特許出願公開第2007/0113299号の 図 15 に示される) pOM-3.9-CTLA4 の 5115 XhoI/EcoRI 断片に連結し、図 4 および配列番号 20 に示される pSIN-3.9-OM-CTLA4-Fc を作成した。
pSIN-3.9-OM-CTLA4-Fc を用いるトランスジェニック ニワトリの作出
VSV エンベロープ タンパク質で偽型にされ、pSIN-3.9-OM-CTLA4-Fc (図 4) ベクターを含有するレトロウイルス粒子を、2007年4月5日公開の米国特許出願公開第2007/0077650号に記載される通りに作成した。ウイルスを、トランスフェクション後 48 時間で回収し、濃縮し、同日に、およそ 7 マイクロリットルをステージ X の卵の胚下腔へ注入した。卵を再び塞ぎ、孵化するまでインキュベートした。
pSIN-1.8-OM-IFNa-2B の構築
pBS-OM-4.4 (図 5、配列番号 23) からの 1051 bp の NcoI-NcoI 断片を、pAVIJCR-A137.91.1.2 (図 6、配列番号 24) の Nco I 部位に挿入し、それによって IFN コード配列および SV40 ポリアデニル化シグナルの前に 1 kb オボムコイド プロモーターを挿入し、p1kb-OM-IFNMM を作成した。p1kb-OM-IFNMM の 1816 bp の ClaI-SacI 断片を、pBS-OM-4.4 の 6245 bp の ClaI-SacI 断片に挿入し、それによって 4.4 kb オボムコイド断片を IFN コード配列と融合させ、p4.4OM-IFNMM を作成した。pBS-OMUP-10 の 8511 bp の BamHI-SalI 断片を、p4.4OM-IFN の 5148 bp の BamHI-SalI 断片と連結し、それによって 10 kb オボムコイド プロモーターを IFN コード配列の前に配置し、p10-OM-IFN を作成した。
pSIN-1.8-OM-IFNa-2B を用いるトランスジェニック ニワトリの作出
pSIN-1.8-OM-IFNa-2B 導入遺伝子を有し、VSV エンベロープ タンパク質で偽型にされたレトロウイルス粒子を、2007年4月5日公開の米国特許出願公開第2007/0077650号に記載される通りに作成した。ウイルスを、トランスフェクション後 48 時間で回収し、濃縮し、同日に、およそ 7 マイクロリットルをステージ X のニワトリの卵の胚下腔へ注入した。卵を再び塞ぎ、孵化するまでインキュベートした。
レンチウイルス ベクターおよびモロニー マウス白血病ウイルスを用いるトランスジェニック ニワトリの作出
本発明は、本発明に従って使用するための、トリの遺伝子組換えにおいて有用な他のレトロウイルス ベクターの採用を具体的に考慮する。かかるベクターは、例えば上記の実施例 1 から 9 において ALV-SIN ベクターが用いられたのと同様の方法で、トランスジェニックトリを作出するために採用することができる。例えば、モロニー マウス白血病ウイルス (MMLV) およびレンチウイルス ベクターを、それぞれ、例えば、各ウイルスの上流 LTR の U3 領域中に含まれる CAAT ボックス; TAATA ボックス; およびエンハンサーのうち1以上を欠失させることによって、SIN ベクターを作成するために本発明に従って用いることができる。その代わりに、またはそれに加えて(すなわち、SIN ベクターと併せて)、レトロウイルス ベクターの各々の中には、転写的に活性なマーカーまたは選択可能なカセットが含まれない。
Claims (10)
- トランスジェニックトリにおいて、外因性タンパク質を生産する方法であって、以下の工程を含む方法:
トランスジェニックトリを作成するために、外因性ヌクレオチド配列をトリへ導入する工程であって、該外因性ヌクレオチド配列は、レトロウイルスに由来する選択マーカーを含有しない自己不活化(SIN)ベクターにおいて含まれる卵管特異的プロモーターと作動可能に連結した外因性タンパク質をコードする核酸配列を含み、さらにここで、該外因性ヌクレオチド配列は、外因性タンパク質がトリの卵管細胞において発現し、該卵管の内腔へ分泌し、該トリによって産まれた殻の硬い卵の中に貯蔵されるようにトリのゲノムへ組み込まれる、工程;
該トリによって産まれた卵から外因性タンパク質を含む卵白を取得する工程;および
該卵白中に貯蔵された外因性タンパク質を単離する工程。 - 外因性コード配列が、ヒトのタンパク質をコードする、請求項1に記載の方法。
- 外因性コード配列が、治療タンパク質をコードする、請求項1に記載の方法。
- 卵管特異的プロモーターが、トリ 卵白アルブミン プロモーター構成成分、トリ オボムコイド プロモーター構成成分、トリ リゾチーム プロモーター構成成分およびトリ コンアルブミン プロモーター構成成分からなる群から選択されるプロモーターの機能的プロモーター配列を含む、請求項1に記載の方法。
- 卵管特異的プロモーターが、以下を含有するヌクレオチド配列からなる群から選択される核酸分子と 90% 同一の核酸を含む、請求項1に記載の方法:
(a) DHS I、およびIIを含む3.5 kb OV 断片
エキソン L から5' UTR-5' 部分、および
エキソン 1 から5' UTR-3' 部分;
(b) DHS I、およびIIを含む3.5 kb OV 断片
エキソン L から5' UTR-5' 部分
イントロン A
エキソン 1 から5' UTR-3' 部分、および
3' UTR;
(c) DHS I、およびIIを含む3.5 kb OV 断片
エキソン L から5' UTR-5' 部分
イントロン A、および
エキソン 1 から5' UTR-3' 部分;
(d) DHS I、およびIIを含む3.5 kb OV 断片
エキソン L から5' UTR-5' 部分
エキソン 1 から5' UTR-3' 部分、および
3' UTR;
(e) DHS I、およびIIを含む3.5 kb OV 断片
エキソン L から5' UTR-5' 部分
イントロン A
エキソン 1 から5' UTR-3' 部分、および
配列番号22の13576 から 15163のヌクレオチド配列で示される3' UTR / DHS A;
(f) DHS I、およびIIを含む3.5 kb OV 断片
エキソン L から5' UTR-5' 部分
エキソン 1 から5' UTR-3' 部分、および
配列番号22の13576 から 15163のヌクレオチド配列で示される3' UTR / DHS A;
(g) DHS I、およびIIを含む3.5 kb OV 断片
エキソン L から5' UTR-5' 部分
イントロン A
エキソン 1 から5' UTR-3' 部分
部分的な 3' UTR、および
RRE;、並びに
(h) ALV CTE
DHS I、およびIIを含む3.5 kb OV 断片
エキソン L から5' UTR-5' 部分
イントロン A
エキソン 1 から5' UTR-3' 部分、および
部分的な 3' UTR;
ここで、
3.5 kb OV 断片が配列番号22の3199 から6659のヌクレオチド配列であり;
エキソン L から5' UTR-5' 部分が配列番号22の6659から6705のヌクレオチド配列であり;
エキソン 1 から5' UTR-3' 部分が配列番号22の8295から8311のヌクレオチド配列であり;
3' UTRが配列番号22の13576から14209のヌクレオチド配列であり;
部分的な 3' UTRが配列番号22の13576から13996のヌクレオチド配列であり;
イントロン Aが配列番号22の6706から8294のヌクレオチド配列であり;
エキソン Lが配列番号22の6659から6705のヌクレオチド配列であり;
エキソン 1が配列番号22の8295から8478のヌクレオチド配列であり;
DHS IIIが配列番号22の3253から3559のヌクレオチド配列であり;
DHS IIが配列番号22の5629から6009のヌクレオチド配列であり;
DHS Iが配列番号22の6359から6659のヌクレオチド配列であり; そして、
RREが配列番号25に示され、および
ALV CTEが配列番号26に示される。 - 卵管特異的プロモーターが、請求項5におけるヌクレオチド配列からなる群から選択される核酸分子と 95% 同一の核酸を含む、請求項5に記載の方法。
- 卵管特異的プロモーターが、請求項5におけるヌクレオチド配列からなる群から選択される核酸分子と 99% 同一の核酸を含む、請求項5に記載の方法。
- 卵管特異的プロモーターが、卵白アルブミン特異的プロモーターである、請求項4に記載の方法。
- 卵管細胞が、管状腺細胞である、請求項1に記載の方法。
- 選択マーカーを含有しない組み込まれた自己不活化(SIN)ベクターにおいて含まれる外因性コード配列と連結したプロモーター構成成分を含むトランスジェニックトリ外因性ヌクレオチド配列からなるDNAであって、ここで、該プロモーター構成成分は卵管細胞において外因性コード配列の発現を駆動し、卵管細胞において生産された外因性タンパク質は該卵管細胞から卵管の内腔へ分泌し、トランスジェニックトリによって産まれた卵の卵白において貯蔵される、DNA。
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