CN112961224A

CN112961224A - 牛病毒性腹泻病毒1型病毒样颗粒的制备及应用

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Publication number: CN112961224A
Application number: CN202110323996.XA
Authority: CN
Inventors: 吴文学; 王展慧; 彭辰
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2021-03-26
Filing date: 2021-03-26
Publication date: 2021-06-15
Anticipated expiration: 2041-03-26
Also published as: CN112961224B

Abstract

本发明公开了牛病毒性腹泻病毒1型病毒样颗粒的制备及应用。本发明提供了牛病毒性腹泻病毒1型病毒样颗粒，由牛病毒性腹泻病毒E^rns蛋白和E2蛋白构成的非感染性病毒颗粒。本发明使用杆状病毒表达系统(Baculovirus expression vectorsystem，BEVS)制备出BVDV‑VLPs，其BVDV‑VLPs为直径约50nm的圆形颗粒，参与组装的E^rns和E2均以同源二聚体的形式存在。BVDV‑VLPs免疫小鼠后可诱导小鼠产生与灭活疫苗相同的体液免疫应答水平，较强于灭活疫苗的细胞免疫应答水平。

Description

牛病毒性腹泻病毒1型病毒样颗粒的制备及应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种牛病毒性腹泻病毒1型病毒样颗粒的制备及应用。

背景技术

牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus，BVDV)为黄病毒科，瘟病毒属的成员之一，同属的成员有猪瘟病毒(Swine fever virus，CFV)，羊边界病毒(Sheepborder virus，SBV)。BVDV有囊膜，粒径大约50nm，基因组为单股正链RNA，全长大约12.3kb，由一个5'非翻译区(UTR)，一个3'非编码区(NCR)和一个编码约3,988个氨基酸的开放阅读框(ORF)组成，5'UTR包含一个高度保守的内部核糖体进入位点(IRES)。ORF经细胞和病毒蛋白酶加工后生成11种功能蛋白：NH2-Npro，C，E^rns，E1，E2，p7，NS2-3(NS2和NS3)，NS4A，NS4B，NS5A，NS5B。BVDV有三种基因型：BVDV-1(BVDV-1a～BVDV-1u)，BVDV-2(BVDV-2a～BVDV-2d)和BVDV-3(Hobi-like)，根据BVDV对细胞的致病变作用可分为致细胞病变型(Cytopathicbiotype，CP)和NCP。

E^rns和E2是两个囊膜糖蛋白，通常以二硫键连接的同源二聚体形式存在。E^rns包含8～9个保守的半胱氨酸残基，这些残基形成分子内和分子间的二硫键，成熟的E^rns中的碳水化合物含量超过50％。E2含有15～17个半胱氨酸残基，这在所有基因型中均保守，此外，E2与细胞表面受体CD46结合，介导BVDV进入宿主细胞。

BVDV在世界范围内广泛流行，对全球农业构成了巨大威胁。BVDV能够感染多种动物，包括牛，猪，绵羊，山羊，鹿和骆驼科动物。BVDV感染牛后，通常会诱发牛的急性感染和持续性感染(PI)。与急性感染相关的症状包括腹泻，发烧，白细胞减少，咳嗽和鼻涕增加。当非细胞病变型(Non-cytopathic biotype，NCP)BVDV穿过胎盘屏障感染免疫功能低下的胎儿时，即可建立PI。PI牛是传播BVDV的主要来源。在中国，根据2003-2009年至2010-2018年间的流行病学分析，奶牛中BVDV的血清阳性率为57％，病毒RNA阳性率约为27.1％。另有研究表明，罐装牛奶中病毒的RNA阳性率为43.7％，其中鉴定出BVDV-1a，1c和1m为主要流行毒株。

目前，BVDV商品化的疫苗有灭活疫苗和弱毒疫苗，但是这两种类型的疫苗都有缺点。弱毒疫苗可能会引起胎儿流产，或导致PI牛产生。灭活疫苗虽然安全性高，但与弱毒疫苗相比，其诱导的细胞免疫应答能力较弱。此外，接种BVDV疫苗牛与感染BVDV牛在血清学上不能区分，这给牛场的BVDV监测带来了困难。需要付出更多的努力来探索安全有效的BVDV疫苗的选择。

病毒样颗粒(Virus-Like Particles，VLP)是由一种或多种病毒蛋白构成的非感染性病毒颗粒。VLP在组成和结构上类似于天然病毒粒子，与病毒的单个蛋白或多肽相比，VLP表面上显示出更多的重复表位，能触发更强的B细胞和T细胞介导的免疫反应。杆状病毒表达系统(Baculovirus expression vector system，BEVS)已广泛用于VLP的生产，目前基于此表达系统已有几种许可的疫苗，例如HPV16/18疫苗(CERVARIX，GSK)和流感病毒疫苗(NanoFlu，Novavax)。杆状病毒整合外源基因的能力强，仅感染节肢动物，对哺乳动物基本上无致病性，此外，杆状病毒还具有强大的佐剂活性。昆虫细胞适合在无血清条件下悬浮培养，允许大规模生产重组蛋白。最重要的是，BEVS中表达的大多数蛋白质都经过完整的翻译后修饰，例如N-糖基化，O-糖基化或磷酸化，有助于维持重组抗原的免疫原性。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种牛病毒性腹泻病毒1型病毒样颗粒。

本发明提供的牛病毒性腹泻病毒1型病毒样颗粒，由牛病毒性腹泻病毒1型的E^rns蛋白和E2蛋白构成的非感染性病毒颗粒。

本发明的牛病毒性腹泻病毒1型病毒样颗粒，直径约50nm。

本发明另一个目的是提供一种制备上述牛病毒性腹泻病毒1型病毒样颗粒的方法。

本发明提供的方法，为利用杆状病毒表达系统(BEVS)将牛病毒性腹泻病毒1型的E^rns蛋白和E2蛋白组装成病毒样颗粒。

上述中，所述牛病毒性腹泻病毒1型的E^rns蛋白的氨基酸序列为序列表中序列2第26-252位；序列2第1-20位为gp64；序列2第21-25位为Linker；

所述牛病毒性腹泻病毒1型的E2蛋白的氨基酸序列为序列表中序列4第26-369位；序列4第1-20位为gp64；序列4第21-25位为Linker。

上述方法中，所述昆虫杆状病毒表达系统包括杆状病毒表达载体、DH10Bac菌株和昆虫细胞；

所述杆状病毒表达载体选自如下任一种或者至少2种的混合：AcRP23-lacZ、AcRP6-SC、AcUWl-lacZ、BacPAK6、Bac to Pac、Bacmid、p2Bac、p2Blue、BlucBacII、p89B310、pAc360、pAc373、pAcAB3、pAcAB 4、PAcAS3、pAcC129、pAcC4、DZI、pAcGP67、pAcIEl、pAcJPl、pAcMLF2、pAcMLF 7、pAcMLF8、pAcMPl、pAcMP2、pAcRP23、pAcRP25、pAcRW4、pAcsMAG、pAcUWl、pAcUW21、pAcUW2A、pAcUW2B、pAcUW3、pAcUW31、pAcUW41、pAcUW42、pAcUW43、pAcUW51、pAcVC2、pAcVC3、pAcYMl、pAcJcC5、pBacl、pBac2、pBlueBacIII、pBlueBacHis、pEV55、mXIV、pIEINeo、pJVETL、pJVNhel、pJVP10、pJVrsMAG、pMBac、pP10、pPAKl、pPBac、pSHONEX1.1、pSYNXIV VI+、pSYNVI+wp、pSYNXIV VI-、pVL1391、pVL1392、pVL1393、pVL941、pVL 945、pVL 985、pVTBac、pBM030、pUAC-5、pFastBac1、pFastBacHT A、pFastBacHT B、pFastBacHT C和pFastBac-Dual；

所述昆虫细胞选自如下任一种：草地贪夜蛾Sf 21细胞系、草地贪夜蛾Sf9细胞系、草地贪夜蛾Mimic Sf9细胞系、甜菜夜蛾Se 301细胞系、BCIRL/AMCY-SeE-CLG1细胞系、BCIRL/AMCY-SeE-CLG4细胞系、粉纹夜蛾BTI-Tn-5B1-4细胞系、BTI-Tn-5C1细胞系、BTI-Tn-5F2细胞系、斜纹贪夜蛾ZSU-S1-1细胞系、IBL-SL1A细胞系和家蚕卵巢细胞系BmN；

在本发明的实施例中，所述昆虫细胞为草地贪夜蛾Sf9细胞系。

上述方法中，所述方法包括如下步骤：

1)将带有信号肽的牛病毒性腹泻病毒E^rns蛋白的编码基因(序列1)和带有信号肽的牛病毒性腹泻病毒E2蛋白的编码基因(序列3)插入pFastBac-Dual载体中，得到重组载体；

2)将所述重组载体转化大肠杆菌DH10Bac中后，再提取基因组，得到重组杆粒；

3)将所述重组杆粒转染昆虫细胞Sf9细胞系，培养，收集细胞培养上清液，得到含有牛病毒性腹泻病毒1型病毒样颗粒的重组杆状病毒。

上述方法中，所述信号肽为gp64。

在本发明的实施例中，所述带有信号肽的牛病毒性腹泻病毒E^rns蛋白的编码基因的核苷酸序列为序列表中序列1，其中序列1第1-60位为gp64编码基因，第61-75为Linker基因，第76-756位为E^rns蛋白的编码基因；

在本发明的实施例中，所述带有信号肽的牛病毒性腹泻病毒E2蛋白的编码基因的核苷酸序列为序列表中序列3，其中序列3第1-60位为gp64编码基因，第61-75为Linker基因，第76-1107位为E2蛋白的编码基因。

上述方法中，在步骤3)中，在收集细胞培养上清液后还包括用蔗糖密度梯度离心法纯化牛病毒性腹泻病毒1型病毒样颗粒的步骤；

所述蔗糖密度梯度离心中的蔗糖浓度为10％(g/100ml)、20％、30％，40％和50％。

具体方法如下：

1)将所述重组杆状病毒接种昆虫细胞Sf9细胞系，培养后收集培养产物中的细胞；

2)将所述细胞进行超裂，20V，工作2s，停止2s，共10min；

3)将超裂后的细胞悬液进行12 000rpm，离心20min，离心后的上清用0.2μm滤器进行过滤到，收集滤液；

4)将2ml TNE(20mM Tris-HCl,150mM NaCl,2mM EDTA，pH 8.0)缓冲液配置好的10％(g/100ml)蔗糖溶液，20％蔗糖溶液，30％蔗糖溶液，40％蔗糖溶液，50％蔗糖溶液依次由上到下加入超速离心管，最后取3ml上一步骤所得滤液小心加入蔗糖垫上；

5)将加好样品的超速离心管配平后，放入SW41Ti转子，进行超速离心，30 000rpm，离心3h；

6)组分收集：离心结束后取出超速离心管，刺穿管底，收集管底流出的液体至2mlEP管，每管大约收集1.5ml，共收集9管，管内流出的组分由下到上依次标记为1-9管。

7)BVDV-VLPs鉴定：分别用SDS-PAGE和Western blot鉴定收集到的9个组分中VLPs的存在，纯化后的BVDV-VLPs存在于组分4、5、6。

8)脱糖：上述步骤鉴定到有VLPs存在的组分混合后，用3倍TNE溶液进行稀释，稀释后加入超速离心管进行超速离心，30 000rpm，离心2h，离心后的沉淀用适量体积的TNE重悬，重悬后的溶液即为纯化BVDV-VLPs溶液，即为纯化牛病毒性腹泻病毒1型病毒样颗粒。

由上述方法制备得到的牛病毒性腹泻病毒1型病毒样颗粒也是本发明保护的范围。

上述牛病毒性腹泻病毒1型病毒样颗粒在如下至少一种中的应用也是本发明保护的范围：

1)制备预防或治疗牛病毒性腹泻产品；

2)制备预防由牛病毒性腹泻病毒1型病毒感染的疾病或由牛病毒性腹泻病毒1型病毒引发的疾病的产品。

本发明还提供了一种产品，其包括上述牛病毒性腹泻病毒1型病毒样颗粒；

所述产品具有如下至少一种功能：

1)预防或治疗牛病毒性腹泻；

2)预防由牛病毒性腹泻病毒1型病毒感染的疾病或由牛病毒性腹泻病毒1型病毒引发的疾病。

所述产品为疫苗或药物。

本发明使用BEVS制备出BVDV-VLPs，其BVDV-VLPs为直径约50nm的圆形颗粒，参与组装的E^rns和E2均以同源二聚体的形式存在。BVDV-VLPs免疫小鼠后可诱导小鼠产生与灭活疫苗相同的体液免疫应答水平，较强于灭活疫苗的细胞免疫应答水平。

附图说明

图1为重组杆状病毒感染昆虫细胞后的细胞病变图片；A：sf9细胞，B：rBac-E^rns+E2感染后的sf9细胞，C：Bac感染后的sf9细胞。

图2为E^rns和E2成功在sf9细胞中表达；A，B，C为IFA结果，A：sf9细胞，B：Bac感染后的sf9细胞，C：rBac-E^rns+E2感染后的sf9细胞，D：western blot检测结果。

图3为透射电镜观察rBac-E^rns+E2和Bac分别感染后的sf9细胞超薄切片。

图4为蔗糖密度梯度离心法纯化BVDV-VLPs；蔗糖密度梯度离心法纯化后收集到的9个组分进行SDS-PAGE(A图)和Western blot实验(B图)。

图5为纯化后的BVDV-VLPs进行SDS-PAGE。

图6为对纯化后的BVDV-VLPs进行透射电镜和免疫透射电镜观察；

A：纯化后的BVDV-VLPs，B，C和D为免疫透射电镜图片，B：E2抗体单标记的BVDV-VLPs，C：E^rns单标记的BVDV-VLPs，D：E2和E^rns双标记的BVDV-VLPs。

图7为BVDV-VLPs中E2和E^rns均以同源二聚体的形式存在。

图8为BVDV-VLPs免疫小鼠后刺激机体产生E2特异性的IgG(A)，IgG1(B)和IgG2a(C)，以及血清的中和效价(D)。

图9为BVDV-VLPs免疫小鼠后的脾细胞具有较强的T细胞免疫应答。

图10为BVDV-VLPs免疫小鼠后的脾细胞具有较强的脾淋巴细胞增殖能力。

图11为BVDV-VLPs免疫小鼠后的脾细胞分泌高水平的IL-4和IFN-γ。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中BVDV NADL株，MDBK细胞和sf9细胞购自中国兽药监察所。

下述实施例中E2单抗为BVDV E2单抗(VMRD，348)，E^rns多抗为E^rns蛋白免疫兔得到的血清，为多克隆抗体。

实施例1、牛病毒性腹泻病毒1型病毒样颗粒的制备

一、扩繁BVDV NADL株

1、MDBK细胞的复苏

从液氮中取出一支冻存的MDBK细胞迅速放置37℃水浴锅中，待其融化后用移液枪将细胞培养液转移至无菌的15ml离心管，加入10倍体积的DMEM完全培养基，1 000×g离心10min，小心移除上清，沉淀用DMEM完全培养基重悬后，吸取10μl细胞液至PCR管，再加入10μl 4％台盼蓝染色液混合均匀，然后吸取10μl混合液滴加到细胞计数板，用细胞计数仪进行细胞计数，计数完成后用DMEM完全培养基将细胞浓度调整成10⁶cells/ml，然后转移5ml细胞悬液至T25细胞培养瓶，放置37℃，5％CO₂温箱进行培养1-3d。

2、MDBK细胞的传代

显微镜下观察到MDBK细胞生长至铺满T25细胞培养瓶底的时候进行细胞传代，从温箱中取出细胞培养瓶，弃去细胞培养液，用移液枪加入5ml 37℃预热后的PBS，轻轻摇晃后弃去PBS，重复洗涤步骤一次，加入1ml 37℃预热的胰酶进行消化，放置37℃，5％CO₂温箱1-2min，取出细胞培养瓶，用移液枪弃去胰酶，轻轻拍打培养瓶部使细胞脱落，加入5ml 37℃预热后的DMEM完全培养基，轻轻吹打混匀后，以1:3比例稀释后进行分瓶培养。

3、BVDV NADL株的扩繁

取一瓶上述2得到的培养好的MDBK细胞，用PBS溶液洗涤，洗涤后的细胞加入5mlDMEM培养基，细胞浓度为10⁶cells/ml；取一支BVDV NADL毒株，以MOI＝0.1的量接种到MDBK细胞中，于37℃，5％CO₂温箱培养2h后，用移液枪弃去细胞上清，重新加入5ml 37℃预热后的DMEM完全培养基，放置37℃，5％CO₂温箱继续培养，大约2d后开始用显微镜观察细胞状态，至细胞出现明显病变的时候开始收毒。将细胞培养瓶用-80℃冰箱冻融三次，使细胞充分裂解释放出病毒粒子，然后将细胞悬液转移到15ml离心管，1 000×g离心10min，此时得到的上清即为病毒液，将病毒液分装于无菌EP管冻存于-80℃冰箱，得到扩繁后的BVDVNADL株。

二、病毒样颗粒的制备

1、BVDV NADL RNA的提取及cDNA制备

用病毒RNA提取试剂盒提取上述一扩繁后的BVDV NADL株的RNA，并反转录成cDNA。

2、pEASY-gp64+E^rns和pEASY-gp64+E2克隆质粒

以上述1得到的cDNA为模板，分别用融合PCR的方法将gp64信号肽分别和E^rns和E2连接在一起，所用引物如下：

gp64+E^rns所需的引物：

E^rns-F:CCCTCGAG(XhoI)ATGGTAAGCGCTATTGT

E^rns-R:GGGGTACC(KpnI)TTAAGCGTATGCTCCAA

E^rns+gp64:CCCTCGAGAtggtaagcgctattgttttatatgtgcttttggcggcggcggcgcattctgcctttgcgGGTGGCGGTGGCTCCGAAAACATAACACAG

gp64+E2所需的引物：

E2-F:CGGGATCC(BamHI)ATGGTAAGCGCTATTGT

E2-R:GCTCTAGA(XbaI)TTATATGGACTCAGCGAAGT

E2+gp64:CGGGATCCAtggtaagcgctattgttttatatgtgcttttggcggcggcggcgcattctgcctttgcgGGTGGCGGTGGCTCCCACTTGGATTGCAAAC

通过融合PCR方法扩增出gp64+E^rns和gp64+E2的基因片段，具体操作方法以gp64+E^rns为例进行描述：

反应体系：2×TransStart FastPfu PCR SuperMix(全式金，AS221)25μl，E^rns-F0.2μM，E^rns-R 0.2μM，E^rns+gp64 50ng，BVDV NADL cDNA 50ng，ddH₂O补足体积至50μl，设置以ddH₂O为模板的阴性对照。

反应条件：95℃1min；95℃20s，引物Tm值-5℃20s，72℃1min，35个循环；72℃5min，得到gp64+E^rns片段(序列1)。

按照上述操作扩增gp64+E2，体系中的引物为E2-F、E2-R和E2+gp64，得到gp64+E2片段(序列3)。

将上述扩增得到的gp64+E^rns片段和gp64+E2片段经鉴定无误后分别连接至pEASYBlunt载体(全式金，CB101)的，转化至Trans1-T1(全式金，CD501)克隆感受态细胞，挑取单克隆经测序鉴定无误后获得克隆质粒pEASY-gp64+E^rns和pEASY-gp64+E2。

质粒pEASY-gp64+E^rns为将序列表中序列1所示的gp64+E^rns片段的核苷酸序列插入pEASYBlunt载体，得到的质粒。

质粒pEASY-gp64+E2为将序列表中序列3所示的gp64+E2片段的核苷酸序列插入pEASYBlunt载体，得到的质粒。

3、构建pFast Bac Dual-E^rns+E2质粒

通过酶切和连接的方法先后将gp64+E^rns和gp64+E2片段插入到pFastBac-Dual载体，构建出重组质粒pFast Bac Dual-E^rns+E2，将其转化到DH10Bac(英潍捷基，10361-012)感受态细胞，构建出重组杆质粒rBacmids-E^rns+E2，具体操作如下：

1)构建质粒pFast Bac Dual-E^rns

用限制性内切酶XhoI和KpnI对质粒pEASY-gp64+E^rns和pFastBac-Dual(英潍捷基，10712-024)进行双酶切，得到的酶切产物gp64+E^rns和酶切后pFastBac-Dual连接，转化到Trans1-T1感受态细胞，测序无误的质粒为pFast Bac Dual-E^rns。

质粒pFast Bac Dual-E^rns为将序列表中序列1所示的gp64+E^rns片段的核苷酸序列替换pFastBac-Dual载体的XhoI和KpnI酶切位点间的片段，得到的质粒。

2)构建质粒pFastBac-Dual-E^rns+E2

用限制性内切酶BamHI和XbaI对pEASY-gp64+E2和pFast Bac Dual-E^rns进行双酶切，再将酶切产物gp64+E2连接至pFast Bac Dual-E^rns，连接产物转化到Trans1-T1感受态细胞，测序无误的质粒为pFast Bac Dual-E^rns+E2。

质粒pFast Bac Dual-E^rns+E2为将序列表中序列1所示的gp64+E^rns片段的核苷酸序列替换pFastBac-Dual载体的XhoI和KpnI酶切位点间的片段，且将序列表中序列3所示的gp64+E2片段的核苷酸序列替换pFastBac-Dual载体的BamHI和XbaI酶切位点间的片段，得到的质粒。

4、构建重组杆粒rBacmids-E^rns+E2

将上述3得到的质粒pFastBac-Dual-E^rns+E2转化到DH10Bac感受态细胞(英潍捷基，10361-012)，挑取阳性克隆经测序鉴定无误后，提取完整重组杆状基因组即为重组杆粒rBacmids-E^rns+E2。

未重组杆粒Bac为将pFastBac-Dual转化到DH10Bac感受态细胞，提取的完整重组杆状基因组即为未重组杆粒Bacmids。

5、拯救重组杆状病毒rBac-E^rns+E2

1)培养sf9细胞

从液氮中取出冻存的sf9细胞，将冻存管迅速放入37℃水浴锅，解冻后取出冻存管，用移液枪将冻存管内的细胞转移至15ml离心管，加入5倍体积的SIM SF培养基(含双抗)，1 000×g离心10min，弃上清，细胞用Grace培养基(英潍捷基，11595-030)+双抗(索莱宝，P1400)重悬后转移至摇瓶中，调整细胞密度为10⁶cells/ml，于27℃，100rpm带摇床的温箱中进行培养，培养大约3d可进行再次传代，传代3次后的细胞，对其进行细胞计数，在细胞数大约为1.5-2.5×10⁶cells/ml，活细胞数>95％时可进行下一步转染试验。

2)拯救重组杆状病毒

(1)收获步骤1)培养的sf9细胞，调整细胞密度为4×10⁵cells/ml，将细胞铺至6孔细胞培养板，2ml/孔，将细胞在超净工作台静置。

(2)孵育细胞期间，取2μg重组杆粒rBacmids-E^rns+E2和未重组杆粒Bacmids稀释于100μl无抗Grace培养基；

取8μl转染试剂Cellfectin II(英潍捷基，10362-100)稀释于100μl无抗Grace培养基；

分别将稀释好的100μl杆粒和100μl转染试剂进行混合，于室温孵育15-30min，得到重组杆粒rBacmids-E^rns+E2-转染试剂混合物和未重组杆粒Bacmids-转染试剂混合物。

(3)分别将200μl重组杆粒rBacmids-E^rns+E2-转染试剂混合物和未重组杆粒Bacmids-转染试剂混合物逐滴加入上述(1)得到的sf9细胞中，于27℃温箱静置培养3-5小时后，吸弃细胞培养上清，加入2ml/孔Grace培养基(含双抗)，于27℃温箱静置培养细胞。

(4)大约3d后开始观察细胞的状态。

用显微镜观察重组杆状病毒感染昆虫细胞后的细胞病变图片，结果如图1所示，A：sf9细胞对照，B：rBac-E^rns+E2感染后的sf9细胞，C：Bacmids感染后的sf9细胞，可以看出，与对照相比，rBac-E^rns+E2感染后的sf9细胞和Bacmids感染后的sf9细胞直径变大、核体积变大、有颗粒状外观、细胞裂解等状态。

收集细胞培养混合物，1000×g离心10min，此时收获的细胞培养上清即为拯救成功的P1病毒液，将上清转移至干净的无菌EP管，P1病毒液连续传代3次使病毒的滴度稳定。

得到重组杆状病毒rBac-E^rns+E2(滴度为10⁷TCID50)和未重组杆状病毒Bac滴度为10⁷TCID50)。

6、鉴定重组杆状病毒rBac-E^rns+E2

将上述5得到的重组杆状病毒rBac-E^rns+E2和未重组杆状病毒Bac分别用IFA和Western blot方法鉴定E^rns和E2在sf9细胞中表达。

具体实验操作：

A、IFA

将重组杆状病毒rBac-E^rns+E2和未重组杆状病毒Bac接种于24孔板培养的sf9细胞，培养3d后，弃培养上清，进行以下操作：

1)固定：加入细胞固定液，200μl/孔，室温静置10min。

2)透化：弃去固定液，用PBST洗涤2次，5min/次，加入0.1％TritonX-100，200μl/孔，室温静置10min。

3)封闭：弃去透化液，用PBST洗涤2次，5min/次，加入含5％脱脂奶粉的PBST，200μl/孔，置37℃温箱静置1h。

4)一抗：弃封闭液，用PBST洗涤2次，5min/次，加入用PBST进行1:500稀释的BVDVE2单抗(VMRD，348)，100μl/孔，37℃温箱静置2h

5)二抗：弃一抗，用PBST洗涤3次，10min/次，加入用PBST进行1:1 000稀释的FITC标记的抗小鼠IgG二抗(索莱宝，SF131)，100μl/孔，37℃温箱静置1h。

6)曝光：弃二抗，用PBST洗涤3次，10min/次，然后在荧光显微镜下观察。

IFA鉴定结果如图2A-2C所示，A：sf9细胞，B：Bac感染后的sf9细胞，C：rBac-E^rns+E2感染后的sf9细胞，可以看出，rBac-E^rns+E2感染后的sf9细胞中出现绿色荧光，而Bac感染后的sf9细胞和对照sf9细胞未出现绿色荧光，表明E2蛋白在sf9细胞中表达。

B、Western blot

将重组杆状病毒rBac-E^rns+E2和未重组杆状病毒Bac分别接种于sf9细胞，培养3d后取细胞沉淀和上清，同时取空白的sf9细胞作为阴性对照，细胞样品与6x ProteinLoading Buffer 1:5混合后煮沸10min，进行SDS-PAGE，将SDS-PAGE凝胶电泳后的样品进行Western blot检测，具体操作如下：

1)转膜：用Bio-Rad的转膜仪将蛋白胶湿转到PVDF膜上，120V，120min。

2)封闭：用PBST对PVDF膜进行简单清洗，然后放入含5％脱脂奶粉的PBST中，于37℃温箱中，100rpm封闭2h。

3)一抗孵育：用PBST对PVDF膜进行简单清洗，然后放入用PBST进行1:5 000稀释的BVDV E2单抗(VMRD，348)和1：2 000稀释的E^rns多抗溶液中，于25℃温箱中，100rpm，封闭1h。

4)洗膜：用PBST对PBVF膜于室温摇床上清洗三次，100rpm，5min/次。

5)二抗孵育：将PVDF膜放入用PBST进行1:8 000稀释的HRP标记山羊抗鼠IgG和1:9000稀释的HRP标记山羊抗兔IgG，于室温摇床，100rpm，孵育30min。

6)洗膜：用PBST对PVDF膜于室温摇床上清洗三次，100rpm，5min/次.

7)曝光：将发光液A液和B液按1:1混合，滴加到PVDF膜上，用化学发光成像仪进行曝光。

Western blot方法鉴定结果如图2D所示，可以看出，rBac-E^rns+E2感染后的sf9细胞中出现与E2和E^rns抗体反应的特异性条带，而Bac感染后的sf9细胞和对照sf9细胞未出现条带，表明rBac-E^rns+E2感染后的sf9细胞中表达E2蛋白和E^rns蛋白。

7、鉴定E^rns和E2在sf9细胞中的组装

收获感染rBac-E^rns+E2的sf9细胞和感染Bac后的sf9细胞，制备细胞超薄切片，用透射电镜观察细胞内部是否有组装成的VLPs。

检测方法：

1)固定：用0.1M PBS配制的2.5％戊二醛固定细胞4h，用0.1M PBS缓冲液洗涤细胞三次，5min/次，然后用1％锇酸固定液固定细胞1.5h，用0.1M PBS缓冲液洗涤细胞三次，5min/次。

2)脱水：依次用50％丙酮、70％丙酮、90％丙酮、100％丙酮对细胞进行脱水，每次脱水15min。

3)包埋：用Epon812树脂包埋细胞，先用2:1的纯丙酮和包埋液于室温包埋0.5h，再用1:2的纯丙酮和包埋液于37℃包埋1.5h，最后用纯包埋液于37℃包埋2.5h。

4)固化：分别将细胞于37℃24h，45℃24h，60℃24h进行固化。

5)切片：使用Reichert-Jung ULTRACUT E型超薄切片机(奥地利)，70nm进行切片，然后用铜网捞片。

6)染色：先用醋酸铀染色15min，再用柠檬酸铅染色15min。

7)透射电镜观察：用日本电子JEM1200电镜对切片进行观察。

结果如图3所示，A为rBac-E^rns+E2感染后的sf9细胞(A中的左图为rBac-E^rns+E2感染后的sf9细胞，右图为局部放大图片)，B为Bac感染后的sf9细胞，可以看出，感染rBac-E^rns+E2的sf9细胞中出现大量的圆形颗粒，直径约50nm，图中黑色三角只是杆状病毒，黑色箭头指示病毒样颗粒，而Bac感染的sf9细胞中不存在圆形的颗粒，只有杆状病毒。

三、纯化BVDV-VLPs

1、用蔗糖密度梯度离心法纯化BVDV-VLPs，操作方法如下：

1)将病毒滴度为10⁷TCID50的P5的rBac-E^rns+E2接种到sf9细胞(MOI值为0.1)，培养5d后，细胞悬液进行800×g离心10min，取细胞沉淀，用5倍体积的TNE缓冲液重悬细胞。

2)超裂：重悬后的细胞放置于冰水浴中，用超声裂解仪进行超裂，20V，工作2s，停止2s，共10min。

3)离心：超裂后的细胞悬液进行12 000rpm，离心20min，离心后的上清用0.2μm滤器进行过滤到一个干净的离心管。

4)蔗糖密度梯度离心：将2ml TNE缓冲液配置好的10％(g/100ml)蔗糖溶液，20％蔗糖溶液，30％蔗糖溶液，40％蔗糖溶液，50％蔗糖溶液依次由上到下加入超速离心管，最后取3ml上一步骤所得滤液小心加入蔗糖垫上。

5)超离：将加好样品的超速离心管配平后，放入SW41Ti转子，进行超速离心，30000rpm，离心3h。

7)BVDV-VLPs鉴定：

分别用SDS-PAGE和Western blot鉴定收集到的9个组分中VLPs的存在，具体操作方法同上述，其中Western blot用到的一抗为BVDV E2单抗(VMRD，348)和E^rns多抗。

结果如图4所示，纯化后的BVDV-VLPs存在于组分4、5、6。

8)脱糖：上述步骤鉴定到有VLPs存在的组分4、5、6混合后，用3倍TNE溶液进行稀释，稀释后加入超速离心管进行超速离心，30 000rpm，离心2h，离心后的沉淀用适量体积的TNE重悬，重悬后的溶液即为纯化BVDV-VLPs溶液，将其冻存至-80℃。

9)纯度鉴定及产率计算：

对纯化后的BVDV-VLPs进行SDS-PAGE，用ImageJ分析其纯度，如图5所示纯化后的BVDV-VLPs纯度约40％。

测定纯化后的BVDV-VLPs浓度，计算此次制备的BVDV-VLPs产率＝(纯化后VLPs的质量×纯度)÷纯化前细胞培养体积，产率约12mg/L。

2、鉴定BVDV-VLPs

1)透射电镜观察VLPs的形态

将上述1得到的纯化BVDV-VLPs溶液用透射电镜和免疫电镜鉴定，免疫电镜使用抗体为BVDV E2单抗(VMRD，348)，5nm colloidal gold-conjugated anti-mouse antibody(Sigma，G7527)，E^rns多抗(自制)，10nm colloidal gold-conjugated anti-rabbitantibody(Sigma，G7402)。

结果如图6A-6D所示，A为纯化后的BVDV-VLPs，B为E2抗体单标记的BVDV-VLPs，C为E^rns单标记的BVDV-VLPs，D为E2和E^rns双标记的BVDV-VLPs；可以看出，BVDV-VLPs是由E2和E^rns蛋白共同组装成，图中黑色箭头指示E2，黑色三角形指示E^rns。

2)E^rns和E2蛋白同源二聚体鉴定

将上述1得到的纯化BVDV-VLPs溶液分别加入6x Protein Loading Buffer和4x非还原蛋白电泳上样缓冲液进行变性还原电泳和变性非还原电泳，将SDS-PAGE凝胶电泳后的样品进行Western blot检测，抗体为BVDV E2单抗和E^rns多抗。

结果如图7所示，R为还原，NR为非还原变性，可以看出，在还原变性条件下E2和E^rns蛋白分子量约为48kDa，在非还原变性条件下E2和E^rns蛋白分子量约为96kDa，说明E2和E^rns均以同源二聚体的形式参与BVDV-VLPs的组装。

实施例2、BVDV-VLPs的应用

一、BVDV-VLPs的免疫原性分析

1、免疫

动物实验方案如下表1所示。

表1为动物实验方案

5μgVLP+ISA201：实施例1制备的纯化BVDV-VLPs溶液用TNE缓冲液调整浓度为20μg/ml，与ISA 201VG佐剂一同预热至32℃，取两个5ml无菌注射器，分别吸入2ml的BVDV-VLPs和ISA 201VG佐剂，用一段约3cm的无菌软管将两个注射器连接，先缓慢来回推20次(4s/次)，再快速来回推60次(＜1s/次)，乳化好的疫苗静置于20℃1h；用此方式制备出的BVDV-VLPs疫苗抗原含量分别为10μg/ml；

10μgVLP+ISA201：与上述5μgVLP+ISA201方法基本相同，不同的是实施例1制备的纯化BVDV-VLPs溶液用TNE缓冲液调整浓度为40μg/ml，用此方式制备出的BVDV-VLPs疫苗抗原含量分别为20μg/ml；

15μgVLP+ISA201：与上述5μgVLP+ISA201方法基本相同，不同的是实施例1制备的纯化BVDV-VLPs溶液用TNE缓冲液调整浓度为60μg/ml，用此方式制备出的BVDV-VLPs疫苗抗原含量分别为30μg/ml；

ISA201：等体积的TNE缓冲液与ISA 201VG佐剂按照上述操作制备而成。

5μgVLP：实施例1制备的纯化BVDV-VLPs溶液用TNE缓冲液调整浓度为10μg/ml。

10μgVLP：实施例1制备的纯化BVDV-VLPs溶液用TNE缓冲液调整浓度为20μg/ml。

15μgVLP：实施例1制备的纯化BVDV-VLPs溶液用TNE缓冲液调整浓度为30μg/ml。

所有组均采用肌肉注射方式，免疫剂量为500μl/只。

以第一次免疫当天记作第一天。

2、BVDV E2特异性抗体检测

用iElisa的方法检测血清抗体，检测样品为各组Day42时采集的血清，具体方法如下：

包被抗原为原核表达并纯化后的E2蛋白(氨基酸序列为序列4第26-344位)，包被浓度为4μg/ml，包被条件4℃过夜后，PBST洗涤三次，5Min/次；封闭：5％脱脂奶粉-PBST，37℃2h；一抗：各组Day42时采集的血清，用1％脱脂奶粉-PBST稀释50倍，37℃1h，PBST洗涤三次，5Min/次；二抗为IgG(索莱宝，SE131)，IgG1(Abclonal,AS066)，IgG2a(Sigma,PP102)，用1％脱脂奶粉-PBST分别稀释10000倍，4000倍，4000倍，37℃1h，PBST洗涤三次，5Min/次；TMB显色，RT 10min；2M H₂SO₄终止；读取OD450nm。

结果如图8所示，(A)为IgG，(B)为IgG1,(C)为IgG2a，可以看出，小鼠免疫BVDV-VLPs后呈剂量依赖性诱导产生BVDV E2特异性的IgG，IgG1和IgG2a，ISA201佐剂能显著增强BVDV-VLPs的免疫效果，15μg VLP+ISA201组能够达到与商品BVDV灭活疫苗一致的免疫效果。

3、血清中和抗体效价检测

检测样品为Day42时采集的血清，病毒为BVDV NADL株。实验步骤：

1)培养MDBK细胞，铺96孔细胞培养板，

2)补体灭活：血清稀释后56℃水浴30分钟。

3)血清稀释：Day42时采集的血清按照1:32、1:64、1:128，1:256，1:512，1:1024，1:2048进行稀释(用DMEM培养基稀释)。

4)稀释好的100μl血清与100TCID50的BVDV NADL等体积混合，37℃5％CO2孵育1h，得到病毒-血清混合物。

5)接种细胞：1)得到的培养好的96细胞培养板中的MDBK细胞用PBS洗涤两次后，再用无血清的DMEM培养基洗涤一次，加入上述4)得到的病毒-血清混合物100μl，37℃5％CO2培养箱中孵育2h。

6)吸弃掉病毒血清中和液，加入250μlDMEM洗涤一次后加入200μlDMEM于37℃5％CO2培养箱中孵育并及时观察记录结果。

以能保护50％细胞培养管不被污染的最高血清稀释度的倒数作为中和终点。

用Reed和Muench法计算血清的中和效价。

结果如图8D所示，可以看出，三种剂量的BVDV-VLPs混合ISA201佐剂免疫小鼠后产生的特异性抗体对BVDV NADL株具有较强的中和活性，血清抗体中和滴度与商品BVDV灭活疫苗相当。

4、BVDV-VLPs诱导的T细胞免疫应答

1)取Day28时15μgVLP组、15μgVLP+ISA201组、灭活疫苗组和ISA201组小鼠，分离脾淋巴细胞。

2)调整脾淋巴细胞浓度为1X 10^7/ml，铺至6孔细胞培养板，2ml/孔，每孔加入刺激物VLPs和2μl的蛋白转运抑制剂Brefeldin A(终浓度3.0ug/ml)(英潍捷基，00-4506-51)，灭活疫苗组加入60℃1h灭活后的等量的BVDV-1d病毒液，于37℃，5％CO2培养箱培养6h。

3)收集细胞：600X g/min室温离心5min，然后用Flow Cytometry StainingBuffer洗涤细胞一次，600X g/min RT离心5min，弃上清，重复一次。

4)用50μl Flow Cytometry Staining Buffer(英潍捷基，00-4222-57)重悬细胞，并稀释相应量的CD3,CD4,CD8a抗体(CD3,CD4,CD8a均为BioLegend产品，CD3-100219，CD4-100407，CD8-100733)，取50μl稀释后的抗体与50μl细胞1:1轻轻混合后，置于4℃，避光孵育30min。

5)用Flow Cytometry Staining Buffer洗涤细胞，600X g/min RT离心5min，弃上清，重复一次。

6)用500μl的Flow Cytometry Staining Buffer重悬细胞。

7)用BD Fortessa流式细胞仪上机检测。

结果如图9所示，上图为原始图，下图为对应的统计图，免疫15μgVLP或15μgVLP+ISA201的小鼠脾淋巴细胞中CD3+CD4+T细胞和CD3+CD8+T细胞的比例显著高于免疫商品BVDV灭活疫苗或ISA201佐剂的小鼠。

5、BVDV-VLPs诱导的淋巴细胞增殖

2)调整脾淋巴细胞浓度为1X10^7/ml，铺至96孔细胞培养板，100μl/孔，边缘孔用细胞培养液填充以消除边缘效应。

3)Treat：VLP组试验孔分别加入实施例1制备的纯化BVDV-VLPs溶液使加入的BVDV-VLPs为1μg；灭活疫苗试验孔分别加入灭活后的BVDV NADL病毒液1μg；

阳性对照孔加入ConA(sigma)1μg；

空白对照不加刺激物；调零孔只加细胞培养液。

各自设置3个重复孔，于37℃，5％CO2培养箱培养3d。

4)每孔加入10μl浓度为5mg/ml的MTT，37℃避光培养4h。

5)水平离心1000rpm 10min后弃上清，避免触碰底部的紫色结晶。

6)每孔加入150μl DMSO，37℃静置10-20min，加速结晶紫溶解。

7)酶标仪检测每孔的OD570，计算淋巴细胞的刺激指数，刺激指数(SI)＝OD570试验孔/OD570空白对照孔.

结果如图10所示，15μg VLP组和15μg VLP+ISA201组小鼠的脾淋巴细胞增殖刺激指数显著高于商品BVDV灭活疫苗组和ISA201佐剂组。

6、BVDV-VLPs诱导的IL-4和IFN-γ

取免疫Day28时15μgVLP组、15μgVLP+ISA201组、灭活疫苗组和ISA201组的小鼠，分离脾淋巴细胞。

用Mouse IL-4precoated ELISPOT kit(达科为，2210402)和Mouse IFN-γprecoated ELISPOT kit(达科为，2210005)检测Day28时小鼠脾淋巴细胞分泌IL-4和IFN-γ的水平。

结果如图11所示，纵坐标单位为个，15μg VLP组和15μg VLP+ISA201组小鼠产生的IL-4和IFN-γ的脾淋巴细胞数量显著高于BVDV灭活疫苗组和ISA201佐剂组。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国农业大学

<120> 牛病毒性腹泻病毒1型病毒样颗粒的制备及应用

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 756

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 1

atggtaagcg ctattgtttt atatgtgctt ttggcggcgg cggcgcattc tgcctttgcg 60

ggtggcggtg gctccgaaaa cataacacag tggaacctac aagataatgg gacggaaggg 120

atacaacggg caatgttcca aaggggtgtg aatagaagtt tacatggaat ctggccagag 180

aaaatctgta ctggtgtccc ttcccatcta gccaccgata tagaactaaa aacaattcat 240

ggtatgatgg atgcaagtga gaagaccaac tacacgtgtt gcagacttca acgccatgag 300

tggaacaagc atggttggtg caactggtac aatattgaac cctggattct agtcatgaat 360

agaacccaag ccaatctcac tgagggacaa ccaccaaggg agtgcgcagt cacttgtagg 420

tatgataggg ctagtgactt aaacgtggta acacaagcta gagatagccc cacaccctta 480

acaggttgca agaaaggaaa gaacttctcc tttgcaggca tattgacgcg gggcccctgc 540

aactttgaaa tagctgcaag tgatgtatta ttcaaagaac atgaatgcac tagtatgttc 600

caggatacta ctcattacct tgttgacggg ttgaccaact ccttagaagg tgccagacaa 660

ggaaccgcta aactgacaac ctggttaggc aagcagctcg ggatactagg aaaaaagttg 720

gaaaacaaga gtaagacgtg gtttggagca tacgct 756

<210> 2

<211> 252

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<400> 2

<400> 1

Met Val Ser Ala Ile Val Leu Tyr Val Leu Leu Ala Ala Ala Ala His

1 5 10 15

Ser Ala Phe Ala Gly Gly Gly Gly Ser Glu Asn Ile Thr Gln Trp Asn

20 25 30

Leu Gln Asp Asn Gly Thr Glu Gly Ile Gln Arg Ala Met Phe Gln Arg

35 40 45

Gly Val Asn Arg Ser Leu His Gly Ile Trp Pro Glu Lys Ile Cys Thr

50 55 60

Gly Val Pro Ser His Leu Ala Thr Asp Ile Glu Leu Lys Thr Ile His

65 70 75 80

Gly Met Met Asp Ala Ser Glu Lys Thr Asn Tyr Thr Cys Cys Arg Leu

85 90 95

Gln Arg His Glu Trp Asn Lys His Gly Trp Cys Asn Trp Tyr Asn Ile

100 105 110

Glu Pro Trp Ile Leu Val Met Asn Arg Thr Gln Ala Asn Leu Thr Glu

115 120 125

Gly Gln Pro Pro Arg Glu Cys Ala Val Thr Cys Arg Tyr Asp Arg Ala

130 135 140

Ser Asp Leu Asn Val Val Thr Gln Ala Arg Asp Ser Pro Thr Pro Leu

145 150 155 160

Thr Gly Cys Lys Lys Gly Lys Asn Phe Ser Phe Ala Gly Ile Leu Thr

165 170 175

Arg Gly Pro Cys Asn Phe Glu Ile Ala Ala Ser Asp Val Leu Phe Lys

180 185 190

Glu His Glu Cys Thr Ser Met Phe Gln Asp Thr Thr His Tyr Leu Val

195 200 205

Asp Gly Leu Thr Asn Ser Leu Glu Gly Ala Arg Gln Gly Thr Ala Lys

210 215 220

Leu Thr Thr Trp Leu Gly Lys Gln Leu Gly Ile Leu Gly Lys Lys Leu

225 230 235 240

Glu Asn Lys Ser Lys Thr Trp Phe Gly Ala Tyr Ala

245 250

<210> 3

<211> 1107

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 3

atggtaagcg ctattgtttt atatgtgctt ttggcggcgg cggcgcattc tgcctttgcg 60

ggtggcggtg gctcccactt ggattgcaaa cctgaattct cgtatgccat agcaaaggac 120

gaaagaattg gtcaactggg ggctgaaggc cttaccacca cttggaagga atactcacct 180

ggaatgaagc tggaagacac aatggtcatt gcttggtgcg aagatgggaa gttaatgtac 240

ctccaaagat gcacgagaga aaccagatat ctcgcaatct tgcatacaag agccttgccg 300

accagtgtgg tattcaaaaa actctttgat gggcgaaagc aagaggacgt agtcgaaatg 360

aacgacaact ttgaatttgg actctgccca tgtgatgcca aacccatagt aagagggaag 420

ttcaatacaa cgctgctgaa cggaccggcc ttccagatgg tatgccccat aggatggaca 480

gggactgtaa gctgtacgtc attcaatatg gacaccttag ccacaactgt ggtacggaca 540

tatagaaggt ctaaaccatt ccctcatagg caaggctgta tcacccaaaa gaatctgggg 600

gaggatctcc ataactgcat ccttggagga aattggactt gtgtgcctgg agaccaacta 660

ctatacaaag ggggctctat tgaatcttgc aagtggtgtg gctatcaatt taaagagagt 720

gagggactac cacactaccc cattggcaag tgtaaattgg agaacgagac tggttacagg 780

ctagtagaca gtacctcttg caatagagaa ggtgtggcca tagtaccaca agggacatta 840

aagtgcaaga taggaaaaac aactgtacag gtcatagcta tggataccaa actcgggcct 900

atgccttgca gaccatatga aatcatatca agtgaggggc ctgtagaaaa gacagcgtgt 960

actttcaact acactaagac attaaaaaat aagtattttg agcccagaga cagctacttt 1020

cagcaataca tgctaaaagg agagtatcaa tactggtttg acctggaggt gactgaccat 1080

caccgggatt acttcgctga gtccata 1107

<210> 4

<211> 369

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<400> 4

Met Val Ser Ala Ile Val Leu Tyr Val Leu Leu Ala Ala Ala Ala His

1 5 10 15

Ser Ala Phe Ala Gly Gly Gly Gly Ser His Leu Asp Cys Lys Pro Glu

20 25 30

Phe Ser Tyr Ala Ile Ala Lys Asp Glu Arg Ile Gly Gln Leu Gly Ala

35 40 45

Glu Gly Leu Thr Thr Thr Trp Lys Glu Tyr Ser Pro Gly Met Lys Leu

50 55 60

Glu Asp Thr Met Val Ile Ala Trp Cys Glu Asp Gly Lys Leu Met Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Arg Cys Thr Arg Glu Thr Arg Tyr Leu Ala Ile Leu His Thr

85 90 95

Arg Ala Leu Pro Thr Ser Val Val Phe Lys Lys Leu Phe Asp Gly Arg

100 105 110

Lys Gln Glu Asp Val Val Glu Met Asn Asp Asn Phe Glu Phe Gly Leu

115 120 125

Cys Pro Cys Asp Ala Lys Pro Ile Val Arg Gly Lys Phe Asn Thr Thr

130 135 140

Leu Leu Asn Gly Pro Ala Phe Gln Met Val Cys Pro Ile Gly Trp Thr

145 150 155 160

Gly Thr Val Ser Cys Thr Ser Phe Asn Met Asp Thr Leu Ala Thr Thr

165 170 175

Val Val Arg Thr Tyr Arg Arg Ser Lys Pro Phe Pro His Arg Gln Gly

180 185 190

Cys Ile Thr Gln Lys Asn Leu Gly Glu Asp Leu His Asn Cys Ile Leu

195 200 205

Gly Gly Asn Trp Thr Cys Val Pro Gly Asp Gln Leu Leu Tyr Lys Gly

210 215 220

Gly Ser Ile Glu Ser Cys Lys Trp Cys Gly Tyr Gln Phe Lys Glu Ser

225 230 235 240

Glu Gly Leu Pro His Tyr Pro Ile Gly Lys Cys Lys Leu Glu Asn Glu

245 250 255

Thr Gly Tyr Arg Leu Val Asp Ser Thr Ser Cys Asn Arg Glu Gly Val

260 265 270

Ala Ile Val Pro Gln Gly Thr Leu Lys Cys Lys Ile Gly Lys Thr Thr

275 280 285

Val Gln Val Ile Ala Met Asp Thr Lys Leu Gly Pro Met Pro Cys Arg

290 295 300

Pro Tyr Glu Ile Ile Ser Ser Glu Gly Pro Val Glu Lys Thr Ala Cys

305 310 315 320

Thr Phe Asn Tyr Thr Lys Thr Leu Lys Asn Lys Tyr Phe Glu Pro Arg

325 330 335

Asp Ser Tyr Phe Gln Gln Tyr Met Leu Lys Gly Glu Tyr Gln Tyr Trp

340 345 350

Phe Asp Leu Glu Val Thr Asp His His Arg Asp Tyr Phe Ala Glu Ser

355 360 365

Ile

Claims

1.牛病毒性腹泻病毒1型病毒样颗粒，由牛病毒性腹泻病毒1型的E^rns蛋白和E2蛋白构成的非感染性病毒颗粒。

2.一种制备权利要求1所述牛病毒性腹泻病毒1型病毒样颗粒的方法，为利用杆状病毒昆虫表达系统将牛病毒性腹泻病毒1型的E^rns蛋白和E2蛋白组装成病毒样颗粒。

3.根据权利要求1所述的病毒样颗粒或权利要求2所述的方法，其特征在于：

所述牛病毒性腹泻病毒1型的E^rns蛋白的氨基酸序列为序列表中序列2第26-252位；

所述牛病毒性腹泻病毒1型的E2蛋白的氨基酸序列为序列表中序列4第26-369位。

4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于：所述昆虫杆状病毒表达系统包括杆状病毒表达载体、DH10Bac菌株和昆虫细胞；

所述杆状病毒表达载体选自如下任一种或者至少2种的混合：AcRP23-lacZ、AcRP6-SC、AcUWl-lacZ、BacPAK6、Bac to Pac、Bacmid、p2Bac、p2Blue、BlucBacII、p89B310、pAc360、pAc373、pAcAB3、pAcAB 4、PAcAS3、pAcC129、pAcC4、DZI、pAcGP67、pAcIEl、pAcJPl、pAcMLF2、pAcMLF 7、pAcMLF8、pAcMPl、pAcMP2、pAcRP23、pAcRP25、pAcRW4、pAcsMAG、pAcUWl、pAcUW21、pAcUW2A、pAcUW2B、pAcUW3、pAcUW31、pAcUW41、pAcUW42、pAcUW43、pAcUW51、pAcVC2、pAcVC3、pAcYMl、pAcJcC5、pBacl、pBac2、pBlueBacIII、pBlueBacHis、pEV55、mXIV、pIEINeo、pJVETL、pJVNhel、pJVP10、pJVrsMAG、pMBac、pP10、pPAKl、pPBac、pSHONEX 1.1、pSYN XIV VI+、pSYNVI+wp、pSYNXIV VI-、pVL1391、pVL1392、pVL1393、pVL941、pVL 945、pVL 985、pVTBac、pBM030、pUAC-5、pFastBac1、pFastBacHT A、pFastBacHT B、pFastBacHT C和pFastBac-Dual；

所述昆虫细胞选自如下任一种：草地贪夜蛾Sf 21细胞系、草地贪夜蛾Sf9细胞系、草地贪夜蛾Mimic Sf9细胞系、甜菜夜蛾Se 301细胞系、BCIRL/AMCY-SeE-CLG1细胞系、BCIRL/AMCY-SeE-CLG4细胞系、粉纹夜蛾BTI-Tn-5B1-4细胞系、BTI-Tn-5C1细胞系、BTI-Tn-5F2细胞系、斜纹贪夜蛾ZSU-S1-1细胞系、IBL-SL1A细胞系和家蚕卵巢细胞系BmN。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：

所述方法包括如下步骤：

1)将带有信号肽的牛病毒性腹泻病毒E^rns蛋白的编码基因和带有信号肽的牛病毒性腹泻病毒E2蛋白的编码基因插入所述pFastBac-Dual载体中，得到重组载体；

2)将所述重组载体转化所述大肠杆菌DH10Bac，得到重组杆粒；

3)将所述重组杆粒转染所述Sf9细胞系，培养，收集细胞培养上清液，得到含有牛病毒性腹泻病毒1型病毒样颗粒的重组杆状病毒。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：在步骤3)中，在收集细胞培养上清液后还包括用蔗糖密度梯度离心法纯化牛病毒性腹泻病毒1型病毒样颗粒的步骤。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：

所述蔗糖密度梯度离心中的蔗糖浓度为10％、20％、30％，40％和50％。

8.由权利要求2-7中任一所述方法制备得到的牛病毒性腹泻病毒1型病毒样颗粒。

9.权利要求1或8所述的牛病毒性腹泻病毒1型病毒样颗粒在如下至少一种中的应用：

1)制备预防或治疗牛病毒性腹泻产品；

10.一种产品，其包括权利要求1或8所述的牛病毒性腹泻病毒1型病毒样颗粒；所述产品具有如下至少一种功能：

1)预防或治疗牛病毒性腹泻；