CN114045267A - 一株分泌烟酸单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用 - Google Patents

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Abstract

一株分泌烟酸单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用，属于食品免疫检测技术领域。杂交瘤细胞株的保藏编号为：CGMCC No.45011。本发明先合成免疫原烟酸‑KLH，再使用弗氏佐剂混合乳化，注射免疫BALB/c小鼠。筛选出高效价，低IC50的小鼠脾细胞，通过PEG方法与小鼠骨髓瘤细胞融合，选择性培养基，筛选出两种细胞融合后的杂交瘤细胞；再经过间接竞争酶联免疫法筛选细胞并三次亚克隆，最终得到分泌烟酸单克隆抗体杂交瘤细胞株。此细胞株分泌的单克隆抗体，对烟酸具有较好的检测灵敏度，可用于制备烟酸的免疫检测试剂盒以及胶体金试纸条，用于食品中烟酸的检测。

Description

一株分泌烟酸单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用
技术领域
本发明属于食品免疫检测技术领域，具体涉及一株烟酸单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用。
背景技术
烟酸，也称维生素B3，是B族维生素成员之一。结构上，它由一个带有羧基的吡啶环构成，即吡啶-3-羧酸。烟酸在人体内以烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的活性发挥作用，是辅酶烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP)的一部分，NAD和NADH作为电子载体在氧化呼吸中起必要的作用。烟酸参与体内脂质代谢，组织的呼吸氧化过程和糖类无氧分解过程。此外，烟酸还能帮助身体产生与性和压力有关的激素，改善血液循环和胆固醇水平。烟酸缺乏主要由于烟酸和色氨酸吸收问题引起的，例如酗酒、消化系统紊乱和服用维生素拮抗类药物。烟酸缺乏将会导致皮肤炎症和精神系统疾病，如糙皮病、皮炎、舌炎、抑郁和痴呆等。相反地，烟酸摄入过量将导致肝损伤、血管扩张、皮肤红肿、发痒、血糖的血酶升高等。因此，烟酸的推荐膳食摄入量设定为儿童6-14mg/天，成年男性16mg/天，女性14mg/天，孕妇18mg/天及哺乳期妇女17mg/天，烟酸的良好来源包括面包、花生、酵母提取物、谷物、牛奶、鱼、以及强化食品等。烟酸也作为食品添加剂添加在一些保健品、特殊医学食品和复合维生素-矿物质补充剂中。
目前，烟酸含量分析方法主要分为传统的微生物法和现代仪器方法，包括高效液相色谱法(HPLC)和液质联用(LC-MS)等。微生物方法基于样品或标准品中烟酸存在时微生物的生长，从而测定烟酸含量。尽管微生物法具有高灵敏度和特异性，孵育时间较长和复杂的步骤限制了烟酸的快速检测。此外，尽管仪器方法准确度高，精密度好，高灵敏，但仪器分析方法需要精细化且昂贵的设备、专业的技术人员、繁杂的提取步骤、较长的结果获取时间，不适于快速检测或者现场检测。免疫分析方法作为一种基于抗原抗体特异性反应的检测方法，已成为测定农药残留、重金属污染、兽药残留和生物毒素等一种有趣的替代方法，其优点包括快速、简单、低成本、高灵敏、高特异性、实时检测等。因此，免疫分析方法使食品或保健品中烟酸的快速检测成为可能。
发明内容
一方面，本发明提供一株分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株，已于2021年12月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏名称为单克隆细胞株CBZ，保藏编号CGMCC No.45011，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。此杂交瘤细胞株分泌的烟酸单克隆抗体对烟酸具有较好的检测灵敏度(IC50为603.41ng/mL)，可以用于建立烟酸的免疫学检测方法，检测食品中烟酸的含量。
另一方面，提供一种烟酸单克隆抗体，是由保藏编号为CGMCC No.45011的烟酸单克隆抗体杂交瘤细胞株分泌产生。
另一方面，提供一种烟酸单克隆抗体的制备方法，包括：取BALB/c小鼠，腹腔注射石蜡油，再腹腔注射保藏编号为CGMCC No.45011的杂交瘤细胞株，注射后收集腹水，将腹水纯化，将获得的烟酸单克隆抗体低温保存。
进一步地，所述烟酸单克隆抗体的制备方法：取8-10周龄BALB/c小鼠，每只小鼠腹腔注射石蜡油1mL，7天后每只小鼠腹腔注射1×106个细胞，保藏编号为CGMCC No.45011的杂交瘤细胞株，从第7天开始收集腹水，将腹水通过辛酸-硫酸铵法纯化，获得的单克隆抗体置于-20℃保存。
另一方面，所述烟酸单克隆抗体的应用，应用于食品中烟酸的分析检测。
另一方面，提供一种试剂盒，含有所述烟酸单克隆抗体。
本发明实施案例中，所述试剂盒用于食品中烟酸的分析检测。
又一方面，提供一种所述试剂盒在检测烟酸含量中的应用。
本发明实施案例中，所述应用是在食品中烟酸的分析检测方面的应用。
另一方面，提供一种免疫原烟酸-KLH制备方法，用于制备所述分泌烟酸单克隆抗体的杂交瘤细胞株，所述方法是选用类似物6-肼基烟酸作为烟酸的半抗原，采用戊二醛方法制备免疫原。
在一种实施案例中，所述的选用类似物6-肼基烟酸作为烟酸的半抗原，采用戊二醛方法制备免疫原，具体包含以下步骤：
取6-肼基烟酸，加入DMF溶解，随后加入戊二醛水溶液，室温避光反应，得到反应液；将所述反应液加入含有KLH的碳酸盐缓冲液中，室温避光反应，即得偶联物烟酸-KLH混合液；将所述偶联物烟酸-KLH混合液用PBS透析数天，期间更换3～5次PBS溶液；通过透析分离完全抗原和未偶联的小分子半抗原，将分离获得的完全抗原，即免疫原烟酸-KLH，分装并冷冻保存。
在一种实施案例中，所述戊二醛水溶液的质量分数为2.5％，所述PBS的浓度为0.01mol/L。
另一方面，提供一种可以与所述烟酸单克隆抗体结合的包被原烟酸-OVA的制备方法，包含以下步骤：
将6-肼基烟酸，加入DMF溶解，随后加入戊二醛水溶液，室温避光反应，得到反应液；将所述反应液加入含有OVA的碳酸盐缓冲液中，室温避光反应，即得偶联物烟酸-OVA混合液，通过透析分离完全抗原和未偶联的小分子半抗原，获得的完全抗原即包被原烟酸-OVA。
在一种实施案例中，所述戊二醛水溶液的质量分数为2.5％。
与现有技术相比，本发明的有益效果：
(1)本发明探索了利用一种能分泌烟酸单克隆抗体的杂交瘤细胞株制备烟酸单克隆抗体的新方法，为婴幼儿乳品、保健品或其他特殊医学用途等食品中烟酸含量提供了免疫学方法。
(2)本发明利用获得的烟酸单克隆抗体，特异性强，对烟酸的检测灵敏度高(烟酸IC50为603.41ng/mL)。
(3)本发明获得的烟酸单克隆抗体细胞株及其分泌的单克隆抗体可以制成试剂盒，用于免疫分析检测烟酸的含量，尤其是食品中烟酸的分析检测，具有良好的实际应用价值。
生物材料保藏
一株分泌烟酸单克隆抗体杂交瘤细胞株，分类命名为：单克隆细胞株CBZ，保藏单位为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为：为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为：CGMCC No.45011，保藏日期为：2021年12月16日。
附图说明
图1为本发明烟酸单克隆抗体对烟酸的抑制标准曲线。
具体实施方式
本发明下面的实施例仅作为本发明内容的进一步说明，不能作为本发明的限定内容或范围。下面通过实施例对本发明作进一步说明。
本发明通过将烟酸完全抗原免疫小鼠，通过细胞融合，次黄嘌呤-氨基蝶呤-胸腺嘧啶核苷(HAT)选择性培养基培养，通过ic-ELISA筛选细胞上清，最终得到了对烟酸有较好特异性和灵敏度的单克隆抗体杂交瘤细胞株。
下述实施例中涉及的培养基如下：
RPMI-1640(mg/L)：L-精氨酸290、L-门冬酰胺50、L-门冬氨酸20、L-胱氨酸二盐酸盐65.15、L-谷氨酸20、甘氨酸10、L-组氨酸15、L-羟脯氨酸20、L-异亮氨酸50、L-亮氨酸50、L-赖氨酸盐酸盐40、L-甲硫氨酸15、L-苯丙氨酸15、L-脯氨酸20、L-丝氨酸30、L-苏氨酸20、L-色氨酸5、L-酪氨酸23.19、L-缬氨酸20、对氨基苯甲酸1、硝酸钙100、无水硫酸镁48.84、无水磷酸二氢钠676.13、氯化钾400、氯化钠6000、葡萄糖2000、还原谷胱甘肽1、酚红5、L-谷氨酰胺300、生物素0.2、D-泛酸钙0.25、叶酸1、i-肌醇35、烟酰胺1、氯化胆碱3、盐酸吡哆醇1、核黄素0.2、盐酸硫胺素1、维生素B12 0.005、碳酸氢钠2000。
HAT选择性培养基(50X)：5mM次黄嘌呤，20μM氨基蝶呤，0.8mM胸腺嘧啶核苷。
下述实施例中涉及的试剂如下：
碳酸盐缓冲液(CBS)：称取Na2CO3 1.59g，NaHCO3 2.93g，分别溶于少量双蒸水后混合，加双蒸水至约800mL混匀，调pH值至9.6，加双蒸水定容至1000mL，4℃贮存备用。
磷酸盐缓冲液(PBS)：8.0g NaCl，0.2g KCl，0.2g KH2PO4，2.9g Na2HPO4·12H2O，溶于800mL纯水中，用NaOH或HCl调pH到7.2～7.4，定容至1000mL；
洗涤液(PBST)：1000mL的0.01mol/LpH7.4的PBS溶液中加入0.5mL的吐温-20；
PBST：含0.05％吐温-20的PBS；
抗体稀释液：含有0.1％明胶的洗涤缓冲液；
TMB显色液：A液：Na2HPO4.12H2O 18.43g，柠檬酸9.33g，纯水定容至1000mL；B液：60mg TMB溶于100mL乙二醇中。A、B液按体积比1∶5混合即为TMB，现用现混。
下述实施例中涉及的检测方法如下：
烟酸抑制率检测方法：通过棋盘试验选择ic-ELISA中最合适的抗原和抗体浓度。用碳酸盐缓冲液(CBS)将抗原稀释至0.01，0.03，0.1和0.3μg/mL，并用抗体稀释液将抗体稀释至0.03，0.1，0.3和1μg/mL。选择最佳工作点后，将烟酸标准品稀释为8个浓度(0，50ng/mL，100ng/mL，200ng/mL，500ng/mL，1000ng/mL，2000ng/mL，5000ng/mL)，按照ic-ELISA操作步骤，最后用OriginPro 8.5做图(结果如图1所示)，获得烟酸标准抑制曲线，计算IC50。
实施例1：免疫原烟酸-KLH的制备
由于烟酸小分子不具有免疫原性，不能刺激小鼠产生免疫应答，进而产生抗体，因此需通过蛋白连接技术将烟酸偶联到蛋白上，使其获得免疫原性；蛋白偶联技术中常用的活泼基团有氨基，羧基，羟基，巯基等，鉴于烟酸分子结构式中不含有这些活泼基团，因此需要衍生。
选用类似物6-肼基烟酸作为烟酸的半抗原，采用戊二醛(GA)方法制备免疫原。具体步骤如下：称取3.06mg(0.02mmol)6-肼基烟酸，加入800μL DMF溶解，随后加入12μL GA水溶液(2.5％)，室温避光反应1h。将反应液逐滴加入含有15mg KLH的碳酸盐缓冲液(CB溶液)中，室温避光反应8h，即得偶联物烟酸-KLH混合液，将所述偶联物烟酸-KLH混合液用0.01mol/L PBS透析3天，期间更换3次～5次PBS，通过透析分离完全抗原和未偶联的小分子半抗原，将分离获得的完全抗原，即免疫原烟酸-KLH，分装并保存于-20℃冰箱。反应路线如下：
Figure BDA0003439475040000061
实施例2：包被原烟酸-OVA的制备
称取2.04mg(0.013mmol)6-肼基烟酸，加入800μL DMF溶解，随后加入8μL GA水溶液(2.5％)，室温避光反应1h。将反应液逐滴加入含有5mg OVA的2mL CB溶液中，室温避光反应8h，即得偶联物烟酸-OVA混合液，通过透析分离完全抗原和未偶联的小分子半抗原，获得的完全抗原即包被原烟酸-OVA。
实施例3：分泌烟酸单克隆抗体的杂交瘤细胞株的制备
1、动物免疫的获得
选择健康的6～8周龄的BALB/c小鼠进行免疫。取三种不同摩尔比的烟酸完全抗原与等量弗氏佐剂混合乳化后，对BALB/c小鼠进行颈背部皮下多点注射免疫(冲刺免疫除外)。第一次免疫用完全弗氏佐剂，剂量为100ug/只；多次加强免疫用不完全弗氏佐剂且剂量减半即为50ug/只；在第四次免疫后第7天采血(小鼠断尾采血5uL+995uL抗体稀释液＝抗血清)，通过间接竞争酶联免疫法(ic-ELISA)观测小鼠免疫效果即检测小鼠血清的效价和抑制能力，筛选出血清中烟酸抗体含量高的获得免疫的小鼠；将筛选出的小鼠用不完全弗氏佐剂再进行第五次加强免疫，然后进行冲刺免疫，冲刺免疫不用弗氏佐剂，直接用生理盐水稀释后的烟酸完全抗原进行腹腔注射，剂量再减半即为25ug/只；首次免疫与第二次加强免疫之间间隔一个月，多次加强免疫之间间隔21天，冲刺免疫与第五次加强免疫之间间隔18-21天。
2、细胞融合
在冲刺免疫3天后，按照常规PEG(聚乙二醇，分子量为4000)方法进行细胞融合，具体步骤如下：
a、摘眼球取血，颈椎脱臼法处死小鼠后，立即放入75％酒精中消毒，浸泡5min左右，无菌操作取出小鼠的脾脏，用注射器的胶头适度研磨并通过200目细胞筛网得到脾细胞悬液，收集，并离心(1200rpm，8min)，用RPMI-1640培养基洗涤脾细胞三次，最后一次离心后，将脾细胞稀释到一定体积，计数，备用；
b、收集SP2/0细胞：融合前7-10天，将SP2/0瘤细胞用含10％FBS(胎牛血清)RPMI-1640培养基在5％CO2培养箱中。融合前要求SP2/0瘤细胞数量达到1～4×107，保证融合前SP2/0瘤细胞处于对数生长期。融合时，收集瘤细胞，悬浮于RPMI-1640基础培养液中，进行细胞计数；
c、融合过程7min。第1min，将1mL的PEG 1500由慢到快滴加到细胞中；第2min，静置。第3min和第4min，在1min内滴加1mL RPMI-1640培养基；第5min和第6min，在1min内滴加2mL RPMI-1640培养基；第7min，每10s滴加1mL的RPMI-1640培养基。然后37℃温浴5min。离心(800rpm，8min)，弃上清，重悬入含20％胎牛血清，2％的50×HAT的RPMI-1640筛选培养液中，按照200μL/孔加到96孔细胞板，置于37℃，5％CO2培养箱中培养。
3、细胞筛选与细胞株建立
在细胞融合的第3天对融合细胞进行RPMI-1640筛选培养液半换液，第5天进行用含20％胎牛血清，1％的100×HT的RPMI-1640过渡培养液进行全换液，在第7天取细胞上清进行筛选。筛选分两步：第一步先用ic-ELISA筛选出阳性细胞孔，第二步选用烟酸为标准品，用ic-ELISA对阳性细胞进行抑制效果测定。选择对烟酸标准品均有较好抑制的细胞孔，采用有限稀释法进行亚克隆，用同样的方法进行检测。重复三次，获得细胞株CBZ。
实施例4：单克隆抗体的制备与鉴定
取8-10周龄BALB/c小鼠，每只小鼠腹腔注射无菌石蜡油1mL；7天后每只小鼠腹腔注射1×106杂交瘤细胞，从第七天开始收集腹水，将腹水通过辛酸-硫酸铵法纯化。
在偏酸条件下，正辛酸可以沉淀腹水中除IgG免疫球蛋白外的其他杂蛋白，然后离心，弃沉淀；再用等量饱和度的硫酸铵溶液沉淀IgG型的单克隆抗体，离心，弃上清，用0.01MPBS溶液(pH 7.4)溶解后，透析脱盐，最终得到纯化后的单克隆抗体置于-20℃保存。
用ic-ELISA测定单克隆抗体烟酸的IC50(烟酸IC50为603.41ng/mL)，说明对烟酸有很好的灵敏度，可用于烟酸免疫分析检测。
实施例5：烟酸单克隆抗体的应用
将杂交瘤细胞株通过体内腹水制备的单克隆抗体应用于烟酸的ELISA添加回收试验，具体步骤如下：
(1)将用碳酸盐缓冲液(CBS)稀释好的浓度为0.3μg/mL的包被原包被96孔酶标板，每孔100μL，37℃包被2h后，用PBST洗液洗板三次，每次每孔200μL，每次3min，拍干；
(2)用含0.2％明胶的CBS进行封闭，每孔200μL，37℃封闭2h，用PBST洗液洗板三次，每次每孔200μL，每次3min，拍干；
(3)用磷酸盐缓冲液(PBS)分别配置0，50，100，200，500，1000，2000，5000ng/mL的烟酸标准溶液，将标准溶液以及待检测样品提取液，分别加入到已经封闭好的酶标板中，每孔50μL，每个样品重复3个孔，再每孔加入50μL稀释至0.3μg/mL的抗烟酸单克隆抗体，37℃反应0.5h后，洗板拍干；
(4)每孔加入100μL用含0.1％明胶的PBS以1∶3000稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG二抗，37℃反应0.5h后，洗板拍干；
(5)每孔加入100μL的TMB显色液，37℃显色15min后，每孔加入50μL 2M的H2SO4终止液，450nm测吸光值，参见图1；
(6)添加回收及样品前处理：
选择婴幼儿奶粉为检测样品，分别称取三份样品匀浆，每份5g，向样品中分别添加200ng/mL、500ng/mL、1000ng/mL的烟酸标准品(根据抗体线性范围及IC50设定添加浓度)，剧烈振荡2min。加入45mL蒸馏水，将样品涡旋10min，并在40℃温度下超声处理20min，用0.1M HCl调节pH值调至5.0。随后，样品6000g，离心10min，收集上清液并通过0.22μm滤膜进行分析。
采用间接竞争ELISA进行添加回收试验，其回收率分别为92％，93％，89％。
以上仅以较佳实施例对本发明的技术方案进行介绍，但是对于本领域的一般技术人员，依据本发明实施例的思想，应能在具体实施方式上及应用范围上进行改变，故而，综上所述，本说明书内容不应该理解为本发明的限制，凡在本发明的精神和原理之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的权利要求范围之内。

Claims (12)

1.一株分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株，已于2021年12月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏名称为单克隆细胞株CBZ，保藏编号为CGMCCNo.45011，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
2.一种烟酸单克隆抗体，其特征在于，由权利要求1所述保藏编号为CGMCC No.45011的分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株分泌产生。
3.一种如权利要求2所述的烟酸单克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括：取BALB/c小鼠，腹腔注射石蜡油，再腹腔注射保藏编号为CGMCC No.45011的杂交瘤细胞株，注射后收集腹水，将腹水纯化，将获得的烟酸单克隆抗体低温保存。
4.如权利要求2所述烟酸单克隆抗体的应用，其特征在于，应用于食品中烟酸的分析检测。
5.一种试剂盒，其特征在于，含有权利要求2所述的烟酸单克隆抗体。
6.权利要求5所述的试剂盒在检测烟酸含量中的应用。
7.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒用于食品中烟酸的分析检测。
8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述试剂盒用于食品中烟酸的分析检测。
9.一种免疫原烟酸-KLH制备方法，用于制备权利要求1所述的分泌烟酸单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其特征在于，所述方法是选用类似物6-肼基烟酸作为烟酸的半抗原，采用戊二醛方法制备免疫原。
10.根据权利要求9所述的免疫原烟酸-KLH制备方法，所述的选用类似物6-肼基烟酸作为烟酸的半抗原，采用戊二醛方法制备免疫原，具体包含以下步骤：
取6-肼基烟酸，加入DMF溶解，随后加入戊二醛水溶液，室温避光反应，得到反应液；将所述反应液加入含有KLH的碳酸盐缓冲液中，室温避光反应，即得偶联物烟酸-KLH混合液；将所述偶联物烟酸-KLH混合液用PBS透析数天，期间更换3～5次PBS溶液；通过透析分离完全抗原和未偶联的小分子半抗原，将分离获得的完全抗原，即免疫原烟酸-KLH，分装并冷冻保存。
11.根据权利要求10所述的免疫原烟酸-KLH制备方法，其特征在于，所述戊二醛水溶液的质量分数为2.5％，所述PBS的浓度为0.01mol/L。
12.一种用于与权利要求2所述烟酸单克隆抗体结合的包被原烟酸-OVA的制备方法，其特征在于，包含以下步骤：
将6-肼基烟酸，加入DMF溶解，随后加入戊二醛水溶液，室温避光反应，得到反应液；将所述反应液加入含有OVA的碳酸盐缓冲液中，室温避光反应，即得偶联物烟酸-OVA混合液，通过透析分离完全抗原和未偶联的小分子半抗原，获得的完全抗原即免疫原烟酸-OVA。
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