JPH03200065A - 免疫測定用参照品及びその製造方法 - Google Patents
免疫測定用参照品及びその製造方法Info
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- JPH03200065A JPH03200065A JP33811389A JP33811389A JPH03200065A JP H03200065 A JPH03200065 A JP H03200065A JP 33811389 A JP33811389 A JP 33811389A JP 33811389 A JP33811389 A JP 33811389A JP H03200065 A JPH03200065 A JP H03200065A
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Landscapes
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
（産業上の利用分野）
（従来技術の課題）
Ｂ型肝炎ウィルスの感染等を検査する目的で、ＩｇＭ型
抗ＨＢｃ抗体を検査する種々のキットが販売されている
。
抗ＨＢｃ抗体を検査する種々のキットが販売されている
。
ＩｇＭ型抗ＨＢｃ抗体の免疫測定は、ヒトのＩｇＭ型抗
ＨＢｃ抗体を測定対象とするものであり、まず第１に検
体中のヒトＩｇＭを補足した後に抗ＨＢｃ抗体と結合す
る物質を使用する。
ＨＢｃ抗体を測定対象とするものであり、まず第１に検
体中のヒトＩｇＭを補足した後に抗ＨＢｃ抗体と結合す
る物質を使用する。
ところで、ＩｇＭ型抗ＨＢｃ抗体の免疫測定用参照品と
しては、通常１ｇＭ型抗ＨＢｃ抗体陽性のヒト血清又は
ヒト血漿を材料として製造されるが、このようなＩｇＭ
型抗ＨＢｃ抗体が陽性である血清や血漿中にはＢ型肝炎
ウィルスが存在している可能性がある（天場ら、日本臨
床、１９８２年秋季増刊、第８９６頁）ことが知られ、
従ってその製造はもとより、流通の過程や実際に使用す
る場所での保管や管理を厳重に行わなければならない、
という課題がある。しかも、厳重な管理のもとて参照品
を使用したとしてもなお感染の恐れが払拭されるわけで
はない。
しては、通常１ｇＭ型抗ＨＢｃ抗体陽性のヒト血清又は
ヒト血漿を材料として製造されるが、このようなＩｇＭ
型抗ＨＢｃ抗体が陽性である血清や血漿中にはＢ型肝炎
ウィルスが存在している可能性がある（天場ら、日本臨
床、１９８２年秋季増刊、第８９６頁）ことが知られ、
従ってその製造はもとより、流通の過程や実際に使用す
る場所での保管や管理を厳重に行わなければならない、
という課題がある。しかも、厳重な管理のもとて参照品
を使用したとしてもなお感染の恐れが払拭されるわけで
はない。
（課題を解決するための手段）
本発明者らは、ＩｇＭ型抗ＨＢｃ抗体が陽性である血清
や血漿を使用しないＩｇＭ型抗ＨＢｃ抗体の免疫測定用
参照品について鋭意検討した結果、本発明を完成するに
至った。即ち本発明は、ヒト免疫グロブリンＭと抗ＨＢ
ｃ抗体とが結合してなる免疫測定用参照品であり、更に
は過ヨーソ酸によりデキストランを酸化し、ヒト免疫グ
ロブリンＭ及び抗ＨＢｃ抗体と反応させ、当該デキスト
ランを還元することからなる免疫測定用参照品の製造方
法である。以下、本発明の詳細な説明する。
や血漿を使用しないＩｇＭ型抗ＨＢｃ抗体の免疫測定用
参照品について鋭意検討した結果、本発明を完成するに
至った。即ち本発明は、ヒト免疫グロブリンＭと抗ＨＢ
ｃ抗体とが結合してなる免疫測定用参照品であり、更に
は過ヨーソ酸によりデキストランを酸化し、ヒト免疫グ
ロブリンＭ及び抗ＨＢｃ抗体と反応させ、当該デキスト
ランを還元することからなる免疫測定用参照品の製造方
法である。以下、本発明の詳細な説明する。
本発明は、次の観点からなされたものである。
即ち、ＩｇＭ型抗ＨＢｃ抗体の免疫測定用参照品に求め
られる機能は■ヒトＩｇＭ型抗体であること、及び■抗
ＨＢｃ抗体としての活性を有すること、である。
られる機能は■ヒトＩｇＭ型抗体であること、及び■抗
ＨＢｃ抗体としての活性を有すること、である。
本発明の免疫測定用参照品は、前記■の機能を達成する
ためのヒトＩｇＭ型抗体と、前記■を達成するための抗
ＨＢｃ抗体を含有するものである。両者はそれぞれの機
能を失わない様に直接または間接的に結合していれば良
い。例えばグルタルアルデヒド等の公知の架橋剤で両者
が結合したものを本発明の一例として例示できる。結合
反応の簡便さや結合能力の点から考えると、デキストラ
ンを介して両者を間接的に結合させると良い。
ためのヒトＩｇＭ型抗体と、前記■を達成するための抗
ＨＢｃ抗体を含有するものである。両者はそれぞれの機
能を失わない様に直接または間接的に結合していれば良
い。例えばグルタルアルデヒド等の公知の架橋剤で両者
が結合したものを本発明の一例として例示できる。結合
反応の簡便さや結合能力の点から考えると、デキストラ
ンを介して両者を間接的に結合させると良い。
デキストランを使用した二辺上の物質の結合については
、同一出願人による平成１年１１月１７日の特許出願で
ある「デキストランを介して結合した二辺上の物質の複
合体及び該複合体の製造方法」に詳細に開示されている
。簡単に説明すれば、ヒトＩｇＭ型抗体と抗ＨＢｃ抗体
を、それぞれの分子中のアミノ基を利用して酸化された
デキストランと接触させることでこれらを結合し、最終
的には還元処理することで本発明の参照品が得られるの
である。このデキストランとしては、分子量が１万ダル
トン程度以上のものが好ましい。
、同一出願人による平成１年１１月１７日の特許出願で
ある「デキストランを介して結合した二辺上の物質の複
合体及び該複合体の製造方法」に詳細に開示されている
。簡単に説明すれば、ヒトＩｇＭ型抗体と抗ＨＢｃ抗体
を、それぞれの分子中のアミノ基を利用して酸化された
デキストランと接触させることでこれらを結合し、最終
的には還元処理することで本発明の参照品が得られるの
である。このデキストランとしては、分子量が１万ダル
トン程度以上のものが好ましい。
本発明で使用されるヒトＩｇＭ型抗体は、ヒト血清等か
らゲル濾過等の物理的な分離法やその性質を利用した分
離法等により容易に取得することが可能である。このヒ
ト血清等は健康人のものであっても良く、ポリクローナ
ルであってもモノクローナルであっても良い。
らゲル濾過等の物理的な分離法やその性質を利用した分
離法等により容易に取得することが可能である。このヒ
ト血清等は健康人のものであっても良く、ポリクローナ
ルであってもモノクローナルであっても良い。
抗ＨＢｃ抗体はＨＢｃ抗体を免疫原として製造された抗
体であればその由来やポリクローナル、モノクローナル
の区別に制限はない。例えばマウスやラットに由来する
ものであっても良い。
体であればその由来やポリクローナル、モノクローナル
の区別に制限はない。例えばマウスやラットに由来する
ものであっても良い。
（発明の効果）
本発明によれば、抗ＨＢｃ抗体の免疫測定用参照品を血
清や血漿を用いることなく提供することが可能である。
清や血漿を用いることなく提供することが可能である。
従来ではＢ型肝炎ウィルスが存在する恐れのあるこれら
血清等を材料として製造されていた参照品を、ウィルス
存在の危険性のないものを材料として製造可能にせしめ
る本発明の意義は大きく、例えばそれら参照品が実際に
使用される実験室や病院内部の検査室におけるウィルス
感染の危険性を減少させることが出来るのはもちろん、
このような参照品を流通させる経路でのウィルス感染の
危険性をも減少させることが可能となる。
血清等を材料として製造されていた参照品を、ウィルス
存在の危険性のないものを材料として製造可能にせしめ
る本発明の意義は大きく、例えばそれら参照品が実際に
使用される実験室や病院内部の検査室におけるウィルス
感染の危険性を減少させることが出来るのはもちろん、
このような参照品を流通させる経路でのウィルス感染の
危険性をも減少させることが可能となる。
（実施例）
以下、本発明を更に詳細に説明するために実施例を記載
するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではな
い。
するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではな
い。
実施例１ 過ヨーソ酸によるデキストランの酸化分子′
Ｑ２００万ダルトンのデキストラン（米国シグマ社製）
３００ｍｇを１０ｍ１の０．３Ｍ重炭酸ソーダ緩衝ｍ（
ｐＨ１１）に溶解し、ついで１０ｍ１の０．０６Ｍ過ヨ
ーソ酸ナトリウムを添加し、室温にて１時間静置した。
Ｑ２００万ダルトンのデキストラン（米国シグマ社製）
３００ｍｇを１０ｍ１の０．３Ｍ重炭酸ソーダ緩衝ｍ（
ｐＨ１１）に溶解し、ついで１０ｍ１の０．０６Ｍ過ヨ
ーソ酸ナトリウムを添加し、室温にて１時間静置した。
その後１０ ｍ ｌの０．１Ｍエチレングリコールを添
加して室温にて３０分静置した後、精製水に対して透析
し、精製水を加えてその全量を６０ｍ１とした。
加して室温にて３０分静置した後、精製水に対して透析
し、精製水を加えてその全量を６０ｍ１とした。
以上の操作で得られたデキストランをデキストラン酸化
物として以下の操作に使用した。
物として以下の操作に使用した。
実施例２ ヒトＩｇＭ型抗体と抗ＨＢｃ抗体の結０．２
ｍｇのヒト血清からゲル濾過により取得したＩｇＭ型抗
体と公知の手法に従って調製された１、０ｍｇの抗ＨＢ
ｃマウスモノクローナル抗体及び実施例１で調製したデ
キストラン酸化物を混和し、４℃にて１日静置した。つ
いで１ｍｇの水素化ホウ素ナトリウムを添加し、４℃に
て１日静置してデキストランを還元した。
ｍｇのヒト血清からゲル濾過により取得したＩｇＭ型抗
体と公知の手法に従って調製された１、０ｍｇの抗ＨＢ
ｃマウスモノクローナル抗体及び実施例１で調製したデ
キストラン酸化物を混和し、４℃にて１日静置した。つ
いで１ｍｇの水素化ホウ素ナトリウムを添加し、４℃に
て１日静置してデキストランを還元した。
以上のようにして得られた参照品をゲル濾過により分画
し、以下の実験に使用した。参考のため、Ａ：実施例１
のようにして調製された酸化デキストランを添加せずに
本実施例の操作を実施して得られた調製物及びＢ：ヒト
ＩｇＭ型抗ＨＢｃ抗体活性が陽性であるヒト血清、につ
いて同様のゲル濾過を実施し、両分を得た。
し、以下の実験に使用した。参考のため、Ａ：実施例１
のようにして調製された酸化デキストランを添加せずに
本実施例の操作を実施して得られた調製物及びＢ：ヒト
ＩｇＭ型抗ＨＢｃ抗体活性が陽性であるヒト血清、につ
いて同様のゲル濾過を実施し、両分を得た。
なお、ゲル濾過に当たっては０．７５ｃｍＸ６０ｃｍの
カラム（東ソー（株）製、ＴＳＫゲルＧ４０００ＳＷ、
商品名）を使用し、分画は１ｍｌずつ取得した。
カラム（東ソー（株）製、ＴＳＫゲルＧ４０００ＳＷ、
商品名）を使用し、分画は１ｍｌずつ取得した。
実施例３ 分画中の各成分の測定
実施例２で取得された各分画中の、■ヒトＩｇＭ型抗体
、■ヒトＩ ｇＭ型抗ＨＢｃ抗体及び■抗ＨＢｃ抗体量
を以下のようにして測定した。
、■ヒトＩ ｇＭ型抗ＨＢｃ抗体及び■抗ＨＢｃ抗体量
を以下のようにして測定した。
（１）■ヒトＩｇＭ型抗体の測定
固相（ヌンク社製、イムノプレート■）の各式について
５μｇ／ｍｌの抗ヒトＩｇＭ型抗体を１００μｌずつ分
注し、４℃にて１日放置した。
５μｇ／ｍｌの抗ヒトＩｇＭ型抗体を１００μｌずつ分
注し、４℃にて１日放置した。
次いで穴中の液を廃棄し、Ａ液（０，１重′ｍ９６の牛
血清アルブミン及び０，０５％のツイーン２０を含む０
．ＩＭのＰＢＳ （ｐＨ７，５））を２５０μｌずつ分
注し、ブロッキング処理を行った。
血清アルブミン及び０，０５％のツイーン２０を含む０
．ＩＭのＰＢＳ （ｐＨ７，５））を２５０μｌずつ分
注し、ブロッキング処理を行った。
各分画液をＢ液（１重量％の牛血清アルブミンを含む０
．１ＭのＰＢＳ （ｐＨ７，５））にて２倍に希釈して
先に調製したプレートの穴に１００μｍずつ分注し、３
７℃にて１時間静置した。
．１ＭのＰＢＳ （ｐＨ７，５））にて２倍に希釈して
先に調製したプレートの穴に１００μｍずつ分注し、３
７℃にて１時間静置した。
次いでＣ液（０，０５％のツイーン２０を含む０゜１Ｍ
ＰＢＳ （ｐＨ７，５）で３回洗浄し、１００μｌのア
ルカリ性フォスファターゼで標識した抗ヒトＩｇＭ型抗
体溶液を分注した。プレートを２５℃にて２０時間静置
した後Ｃ液にて３回洗浄し、１００μｍの酵素基質溶液
（ＰＮＰＰ Ｈ１ｍＭバラニトロフェニルりん酸溶液ｐ
Ｈ１０）を各式に分注した後室温で３０分静置した。３
０分後、アルカリ性フォスファターゼの酵素反応を停止
する溶液を添加して反応を停止させ、各式の４０５０ｍ
における吸光度を測定した。
ＰＢＳ （ｐＨ７，５）で３回洗浄し、１００μｌのア
ルカリ性フォスファターゼで標識した抗ヒトＩｇＭ型抗
体溶液を分注した。プレートを２５℃にて２０時間静置
した後Ｃ液にて３回洗浄し、１００μｍの酵素基質溶液
（ＰＮＰＰ Ｈ１ｍＭバラニトロフェニルりん酸溶液ｐ
Ｈ１０）を各式に分注した後室温で３０分静置した。３
０分後、アルカリ性フォスファターゼの酵素反応を停止
する溶液を添加して反応を停止させ、各式の４０５０ｍ
における吸光度を測定した。
結果を図１に示す。図１によれば、本発明に従って調製
された参照品はヒトＩｇＭ型抗体を有していることが分
かる。
された参照品はヒトＩｇＭ型抗体を有していることが分
かる。
（２）■ヒトＩｇＭ型抗ＨＢｃ抗体の測定アルカリ性フ
ォスファターゼで標識した抗ヒトＩｇＭ型抗体の代わり
に１００μｌのアルカリ性フォスファターゼで標識した
Ｈｂｃ抗原溶液を使用した以外は（１）と同様の操作を
行った。これを２５°Ｃにて２０時間静置した後Ｃ液に
て３回洗浄し、（１）と同様の酵素基質溶液を分注して
２時間静置した。酵素反応停止液を１００μｌ添加し、
各式の４０５ｎｍにおける吸光度を測定した。 結果
を図２に示す。図２によれば、本発明に従って調製され
た参照品は、ヒ）ＩｇＭ型抗体と抗ＨＢｃ抗体の両方の
性質を有することが分かる。
ォスファターゼで標識した抗ヒトＩｇＭ型抗体の代わり
に１００μｌのアルカリ性フォスファターゼで標識した
Ｈｂｃ抗原溶液を使用した以外は（１）と同様の操作を
行った。これを２５°Ｃにて２０時間静置した後Ｃ液に
て３回洗浄し、（１）と同様の酵素基質溶液を分注して
２時間静置した。酵素反応停止液を１００μｌ添加し、
各式の４０５ｎｍにおける吸光度を測定した。 結果
を図２に示す。図２によれば、本発明に従って調製され
た参照品は、ヒ）ＩｇＭ型抗体と抗ＨＢｃ抗体の両方の
性質を有することが分かる。
（３）■抗ＨＢｃ抗体の測定
固相（ヌンク社製、イムノプレート■）の各式について
１Ｍｇ／ｍｌのＨＢｃ抗原を１００μｍずつ分注し、４
℃にて１日放置した。次いで穴中の液を廃棄し、Ａ液（
０，１重量％の牛血清アルブミン及び０．０５％のツイ
ーン２０を含む０゜１ＭのＰＢＳ （ｐＨ７，５））を
２５０ｕｌずつ分注し、ブロッキング処理を行った。
１Ｍｇ／ｍｌのＨＢｃ抗原を１００μｍずつ分注し、４
℃にて１日放置した。次いで穴中の液を廃棄し、Ａ液（
０，１重量％の牛血清アルブミン及び０．０５％のツイ
ーン２０を含む０゜１ＭのＰＢＳ （ｐＨ７，５））を
２５０ｕｌずつ分注し、ブロッキング処理を行った。
以後の操作は、前記（２）と同様にして行い、各式にお
ける４０５ｎｍの吸光度を測定した。
ける４０５ｎｍの吸光度を測定した。
結果を図３に示す。図３によれば、本発明に従って調製
された参照品は、抗ＨＢｃ抗体を有していることが分か
る。
された参照品は、抗ＨＢｃ抗体を有していることが分か
る。
以上、本実施例によれば、本発明に従って調製される参
照品は、ヒト血清中に存在するヒト■ｇＭ型抗ＨＢｃ抗
体と同様の性質を有する複合体であることが分かる。
照品は、ヒト血清中に存在するヒト■ｇＭ型抗ＨＢｃ抗
体と同様の性質を有する複合体であることが分かる。
実施例４ ヒトＩｇＭ型抗ＨＢｃ抗体としての測定
実施例２で取得された分画のうち、ヒトＩｇＭ型抗ＨＢ
ｃ抗体が比較的多量に含有されていると推定される１１
〜１５番目の分画を選択し、これを以下の実験に使用し
た。
ｃ抗体が比較的多量に含有されていると推定される１１
〜１５番目の分画を選択し、これを以下の実験に使用し
た。
実施例３における（２）と、各式に添加した分画溶液の
希釈率を変化させた以外は同様の操作を実施した。なお
、参考のために実施例２で取得された、Ａ：実施例１の
ようにして調製された酸化デキストランを添加せずに実
施例２の操作を実施して得られた調製物及びＢ：ヒトＩ
ｇＭ型抗ＨＢｃ抗体活性が陽性であるヒト血清、につい
ても同様の実験を行った。
希釈率を変化させた以外は同様の操作を実施した。なお
、参考のために実施例２で取得された、Ａ：実施例１の
ようにして調製された酸化デキストランを添加せずに実
施例２の操作を実施して得られた調製物及びＢ：ヒトＩ
ｇＭ型抗ＨＢｃ抗体活性が陽性であるヒト血清、につい
ても同様の実験を行った。
結果を図４に示す。図４によれば、本発明に従って調製
される参照品は従来参照品を製造する際の材料として使
用されているヒト血清と類似した結果を示すことが分か
る。一方、前記Ａについての結果からは、デキストラン
を介して複合体を形成していないものではヒトＩｇＭ型
抗ＨＢｃ抗体としての性質が認められないことが分かる
。
される参照品は従来参照品を製造する際の材料として使
用されているヒト血清と類似した結果を示すことが分か
る。一方、前記Ａについての結果からは、デキストラン
を介して複合体を形成していないものではヒトＩｇＭ型
抗ＨＢｃ抗体としての性質が認められないことが分かる
。
第４、
図１〜３は本発明の実施例３の（１）〜（３）の測定に
ついての結果を示すものであり、図４は実施例４の結果
を示すものである。図中、縦軸は全て４０５ｎｍにおけ
る吸光度を示し、横軸は図１〜３においては分画の番号
を示し、図４においては希釈率を示すものである。 図中、白丸は本発明に従って調製された参照品について
の結果を示し、白三角は参考のための試料Ａについての
結果を示し、黒丸は参考のための試料Ｂについての結果
を示すものである。
ついての結果を示すものであり、図４は実施例４の結果
を示すものである。図中、縦軸は全て４０５ｎｍにおけ
る吸光度を示し、横軸は図１〜３においては分画の番号
を示し、図４においては希釈率を示すものである。 図中、白丸は本発明に従って調製された参照品について
の結果を示し、白三角は参考のための試料Ａについての
結果を示し、黒丸は参考のための試料Ｂについての結果
を示すものである。
Claims (3)
- （１）ヒト免疫グロブリンＭと抗ＨＢｃ抗体とが結合し
てなる免疫測定用参照品。 - （２）ヒト免疫グロブリンＭと抗ＨＢｃ抗体とがデキス
トランの仲介により間接的に結合していることを特徴と
する請求項第（１）項記載の免疫測定用参照品。 - （３）過ヨーソ酸によりデキストランを酸化し、ヒト免
疫グロブリンＭ及び抗ＨＢｃ抗体と反応させ、当該デキ
ストランを還元することからなる請求項第（２）項記載
の免疫測定用参照品の製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP33811389A JPH03200065A (ja) | 1989-12-28 | 1989-12-28 | 免疫測定用参照品及びその製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP33811389A JPH03200065A (ja) | 1989-12-28 | 1989-12-28 | 免疫測定用参照品及びその製造方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH03200065A true JPH03200065A (ja) | 1991-09-02 |
Family
ID=18315033
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP33811389A Pending JPH03200065A (ja) | 1989-12-28 | 1989-12-28 | 免疫測定用参照品及びその製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH03200065A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5846738A (en) * | 1993-10-20 | 1998-12-08 | Boehringer Mannheim Gmbh | Synthetic standard for immunoassays |
-
1989
- 1989-12-28 JP JP33811389A patent/JPH03200065A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5846738A (en) * | 1993-10-20 | 1998-12-08 | Boehringer Mannheim Gmbh | Synthetic standard for immunoassays |
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