JPS6095355A - 補体経路活性化の検出方法および装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、試料中の活性化複合体の存在による補体経路
活性化の検出および測定に関する。

発明の背景 補体系は体液中のたん白質の複合体群であって、抗体オ
たは他の因子と作用して、免疫反応、アレルギー反応、
免疫化学反応および免疫病理学的反応の媒介物として重
要な役割を発揮する。補体系の活性化は、種々の細胞類
、バクテリア類、原虫類の分解、ウィルスの不活性イど
、炎症性ゾロ士スの直接的媒介等の広汎な反応の原因と
なり得る。

補体系は、そのいくつかの成分のホルモン状活性を経て
、他の体液および細胞エフェクター系の参入をめる。反
面、補体系は白血球の直接移動を誘起し、肥扁細胞のヒ
スタミンはく離分誘発し、また食細胞からのリノソーム
成分のはく離を刺激する。

補体系は、相互に、抗体と、また細胞膜と作用し得る少
なくとも２０種の血漿たん白質からなる。

これらたん白質の多くは、活性化したとき、他のたん白
質と結合して酵素を形成し系内のさらに他のたん白質を
断裂し活性化する。こルらたん白質の連ｄした活性化は
、２つの主経路即ち古典的経路と第二経過を通る。両経
路は細弛分解またはウィルスの不活性化を促す共通の末
端部（ｔｅｒｍｉｎａｌｔｒｕｎｋ）　ｔ−用いる。

古典的経路は抗原−抗体腹合体、集合免反グロブリン、
ＤＮＡの如き非免疫学的物質およびトリジシン様酵素に
よって活性化し得る。活性化の古典的経路は、４１面の
成分Ｃ１，Ｃ４，Ｃ２ｂよびＣ３に順に含む。これらの
成分は二つの機能的ユニット：０１即ちｉｇ　＊＆　ユ
ニットと、Ｃ４，Ｃ２゜Ｃ３即ち活性化ユニットにグル
ープ化できる・５個の別の成分Ｃ５，Ｃ６，Ｃ７，Ｃ８
，Ｃ９は二つの経路に共通する末端部全形成する膜設ノ
住ユニットを形成する。

古典的経路ｌこ訃いては、Ｃ１は免疫グロブリンへ付着
するようなことで活性化するが、−運の反応はＣ１の成
分から活性化したｃ−１ｓ　を産生する・補体因子の項
式上のバー−は、活性化酵素を意味する。活性化ＣＩＳ
　は成分Ｃ４及びＣ２の両方の一部を断裂させる。次い
で、Ｃ４と０２とは一部で結合して分子ダ約２８０．０
００を有する活性化複合体Ｃ４ｂ、２ａは進行中の補体
作用を持続させるたん白η分解酵素である。初期の補体
はＣ４ｂ、２ａが形成されたあとはもはや必要としない
。Ｃ４ｂ、２ｃは分裂し、それにより次の０３の成分を
活性化してＣ３ｂを生成し、このＣ３ｂはＣ４ｂ、２ｃ
に近い細胞膜へ付着する・次いで、Ｃ３ｂはＣ４ｂ、２
ｃと結合して古典的経路Ｃ４ｂ、　２ａ、５ｂ中に最終
の活性化複合体を形成する口この酵素は、Ｉｆり数基ユ
ニットの一戎分Ｃ５を断裂させる。

第二経路は、またプロベルジン経路としても知られ、少
なくとも６　ｉＩＡの成分よりなる。これら成分の５つ
は真に第二経路に属し因子Ｂ、Ｄ１グロベルジンＰ）お
よび阻害剤ＨおよびＩである。第６の成分Ｃ３はまた、
古典的経路中に見い出し得る。

成分ｃ３ｂはときたまファクターＡとしても知られてい
る。第二経路はＩｇＡの如き免疫学的物質およびある種
の複合体ポリサッカライド類、トリブトモノ状酵≠およ
びコプラ毒因子の如き非免疫学的物質により活性化し得
る。第二経路（・よ、いかなる抗体または免疫グロブリ
ンのない状態でも微生物を破壊し得る。

第二経路の活性化は古典的経路とは異なる態様で進行す
る。初期の必要条件は本体中に連続的に小量産生するよ
うに見受られるＣ３ｂの存在である。Ｃ３ｂの産生は活
性化Ｃ３＊（これは因子ＢとＤと反応してＣ３？分裂せ
しめてＣ３ａとＣ３ｂにする酵８を産生ずる）を形成す
るＣ６中のチオエステル結合の分’Ａ　ｋ誘起する水に
基づくものと考えられている。Ｃ３ｂは一部のフィード
／？ツク機構によっても産生され、該メカニズム中では
因子りとＢｂ（因子への１成分）とがＣ３ｂと結合して
活性化複合体ｃ３ｂ、ｓｂを形成し、この複合体は増幅
ループ中の酵素がより多くの０６を分裂して追加のＣａ
ｂを形成するように作用するものである。因子１とＨは
Ｃ３ｂ１に分裂することにより不活性となる調節たん白
質として作用する。他の調節たん０釧は、Ｃ１阻害剤お
よびＣ４結合性之ん白質を包含する・ Ｃ３ｂ、Ｂｂ酵素分子は、この複合体に結合し因子ｓｂ
の自然解離を遅延させることにょシ安定化するプロベル
ジン（Ｐ）により、よシ有効となる。

Ｃ３ｂ、Ｂｂ　とｃ３ｂ、ｐ、ｓｂ　は共にさら［Ｃ３
分子を分裂させて、変性ポＩＪ−Ｃ３ｂ酵素、Ｃ３ｂ　
ｏ、　Ｓｔ：　とｃ３ｂｏ、Ｐ、ｓｂ　（式中、ｎは１
より大である）を形成する。また、これら分子のいずれ
かは０５を分裂して０５ａとＣ５ｂとし同じ共通の末端
部の膜攻撃ユニットをＪｉｌｔ始する・続いて、Ｃ５１
）はＣ６とＣ７と結合して活性な６分子複合体Ｃ５ｂ、
６．７　ｅ形成する。Ｃ５ｂ、６．７　は次いでＣ８お
よび複数のＣ９’Ｓと結合して細Ｉｔｉｉ１表面で細胞
溶解を引起す別の活性複合体を生ずる・補体経路の活性
化の研冗と測定は多くの生物学上の混乱状態を指摘でき
るであろう。２つの補体経路は人の病気および病的状態
の広範囲な病因論ま７ζは鈎理学に訃いて推論されてい
る。古典的経路の場合には、数種の免反複合体矢患、自
己免疫疾患特に全身性エリトマト−デス、および伝染病
が含まれる。第二経路はクラム陰性菌、ウィルス、を生
虫および真菌類による感染症、グラム陰性敗血症、谷ｆ
ｉｌ皮ふ病および血液病において言まｎることが判明し
ている。また、第二経路は外傷、火傷および成人呼吸困
難症候群（ＡＲＤＳ）と関連し、また血液透析および心
臓バイパス手術中のような選択膜と接触している。試験
管（Ｉｎ　ｖｌｔｒｏ）　での研究は数多くのクラム陰
性菌および両度生物、ウィルス感染細刻、ウィルス、原
虫類、外傷、火傷、偵傷した細胞％および他の生医学上
重要な物質がヒト血清の第二経路を活性化する能力を有
すゐことを示していゐ・補体経路の機能と活性化葡評価
し定１イヒする現在の方法は、間接的で、全体において
制約され、補体経路のイσＦ究にたずされっている研究
所にひいて一般にわずかしか役に立たない。これらの方
法は経路の動的活性よりも、むしろ静的末端状態ま１ヒ
は経路の能力を測定するものである。ヒト血清中の完全
補体１１１に序のそのような粗雑な試験の１つは溶血ア
ッセイである。溶血アッセイはＣＨ５Ｑレダル、即ち、
試験サンプル中の抗体被榎赤梅球（ＥＡ）の５８％が補
体成分を含む血清の特定の希釈液によって溶解する点を
創るのに用いる。この方法はむしろ感度のいへ・もので
は々い。というのは二次的な事柄である分解に依存して
おり、経路活性を直接測定するよりも補体系の残存機能
活性を測定するからである。溶血アッセイはまた活性化
順路で産生する任意の成分の活性化を測ることは出来ず
トータルの活性化だけである。活性化というならば、全
体の補体順路の機能的能力とは分解に起因することが必
要である。

血清中の個々の袖体成分の存在は適尚な補体成分に対し
て調製された抗体の使用により測定し得る。しかし、こ
れは血清中に存在する補体成分の量を示すのみで経路の
活性化量を示すものでない。

活性化成分のみの存在を測定する従来の試みは、複雑な
分離技術を必要とする。［Ｃｏｏｐｅｒ　ｒＩ　Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ　Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｃｏｍ
ｐｌｅｍｅｎｔ　Ａｃｔｉｖａ−ｔｌｏｎ　’　Ｉｎ　
」ｊｍｍＵｎＯａＳＳａ　ｙＳ　＝　Ｃｌ　１ｎｉｃａ
ｌ　ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　ｆｏ
ｒ　ｔｈｅ　１９８Ｑ’　ｓ、　ｐｐ、３９３−４１０
　。

Ｒ，Ｍ、　Ｎａｋａｍｕｒａ、　Ｗ、Ｒ，Ｄｌｔｏ　Ｊ
およびｒ　Ｅ、Ｓ。

Ｔｕｃｋｅｒ　Ｉｌｌ　、ｅｄｉｔｏｒｓ、　Ａｌａｎ
　Ｒ，Ｌｌｓｓ　Ｉｎｃ、　ＮｅｗＹｏｒｋ、　Ｎｅｗ
　Ｙｏｒｋ　（１９８０）　Ｊを参照されたい。

第二補体経路の活性化を検出し評価する従来技術には一
般に２つのタイプがある。第１のタイプは古典的経路を
遮断（ｂｌｏｃｋｉｎｇ）　したあとのヒト血清中の０
３および因子Ｂの如き第二経路成分の減少した機能的活
性の表示を含む。例えば、’Ｐｅｒｒｉｎ　ｅｔａｌ、
、Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、、１４３：　１０２７−１０４
１（１９７６）、＋よび＃Ｆｅｒｒｏｎｅ　ａｔ　ａｌ
、、　Ｐｒｏｃ−Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、Ｓｃ１．ＵＳＡ　、、７０：３６６５−３６
６８（１９７３）’を参照されたい。この方法の変形は
病んだ組織中の第二補体経路の各成分の沈着を評価する
ことである。’　Ｖｅｒｒｏｕｓｔ　ｅｔ　ａｌ＋、　
Ｊ、　ＣｌＩｎ、　Ｉｎｖｅｓｔ＋。

５３ニア７−８４（１９７４）Ｉ　’ｆｔ：参照された
い。

これらの方法は次のような制限を受ける方法である：（
ａ）　第２補体経路活性化を直接測定するのでなく、活
性化の２次的結果のみである。

（ｂ）　多くの精製補体成分を試験室で調製せねばなら
ず、試験室ではまた機能的活性を確認する平順化を有さ
せければならない〇 （Ｃ）　これらの方法は定量できない。

第二経路の活性化を相定するのに用いる第２のタイプの
方法は活性化複合体の多面上への０３または因子Ｂ、Ｈ
の如き第二経路の各成分の沈着を検出することである。

’　５ｃｈｒｅｌｂｅｒ　ｅｔ　ａｌ、。

Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、八ｃａｄ、Ｓｃ１．　Ｕ　Ｓ　Ａ
、、７　５　：　３９４８−３９５２（１９７８）と参
照されたし。この方法の変形は因子Ｈ／Ｃ３比の如く第
二経路成分の特定の比率をと１１」定することである・
Ｉ　Ｐａｎｇｂｕｒｎｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｉｍｍｕ
ｎｏｌ、　１２４　：　９７７−９８２（１９８０）’
を参■のこと。

活性化は上記方法で直接評価され定量できるけれでも、
これも次のような制限を受ける。

（ａ）　試験室で各社の補体成分を梢製し放射性標識を
付す必要性とそれに伴う機能的完全性を６１認する平順
化の必要性。

←）　手１１鱈と結果の解釈が複雑であり、システムを
十分に椙通していることが必要。

（ｃ）　以前からあった活性化を検出し定置するに用い
ることができず、かくして患者からの血清および血漿で
は使用できない。

他の試みはＣ１の副成分（ｓｕｂｃｏｍｐｏｎｅｎｔ）
　に結合したＣ１不活性化剤の如き不活性化産生物の検
出卦よび測定に関している。ＩＩ　Ｈａｒｐｅｌ　ｅｔ
　ａｌ、。

ＣｌＩｎ、Ｒｅｓ、、　３０　：５６’３Ａ（１９８２
）　”よびＩ　Ｈａｃｋ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、Ｉｍｍ
ｕｎ、＋　１２７　：　１４５９（１９８１）ｌを参照
されたし。しかし、これら方法も補体活性を連続させる
活性化複合体に関するものではない。むしろ、〃ゆきづ
甘り（ｄｅａｄｅｎｄ）’生成物に関するもので、その
存在は補体経路活性化の量を舒わすのには必要ではない
。これら生成物の検出は、これらが比較的安定てあシそ
れ故にアッセイにｆｌｊ用できるためになされた。しか
しながら、このような生成物は血液中に残留物として残
シもはや補体系の活性化が起きないときに形成できるも
のである。

補体系の操作と６１１１定についてのさらに別の報告は
次の各文献において見い出し得る・ Ｃｏｏｐｅｒ、’　Ｔｈｅ　Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ　Ｓ
ｙｓｔｅｍ　’　Ｉｎ　Ｂａ５ｉｃａｎｄ　Ｃｌ１ｎｉ
ｃａｌ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ＋　ｐ９．１　２４−１
　２５＋５ｔｌｔｅｓ　ｅｔ　ａｌ、ｅｄｉｔｏｒｓ、
Ｌａｎｇｅ　ＭｅｄｉｃａｌＰｕｂ目ｃａｔｉｏｎｓ、
Ｌｏｓ　八ｔｌｏｓ、Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ　（１９８
２）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂａ５ｉｓ　ｏｆ　Ｃｏｍｐ
ｌｅｍｅｎｔ　Ａｃｔｌｏｎ＋　ｌ）Ｉ’ｓ８　１　−
８　３　＋　Ａｐｐｌｅｔｏｎ　Ｃｅｎｔｕｒｙ　Ｃｒ
ｏｆｔｓ、ＮｅｗＹｏｒｋ、Ｎ、Ｙ、（１９７０） Ｍｕｌｌｅｒ　−Ｅｂｅｒｈａｒｄ、ｅｔ　ａｌ、、Ａ
ｄｖ、１ｍｍｕｎｏｌｓ＋２９：１−５３（１−５３（ １９８０）Ｐａｎ　ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ
、、１　２　４　：９７７−９８２　（１９８０） Ｓｃｈｒｅｌｂｅｒ　ｅｔ　ａｌｓ、　ＣｌＩｎ、Ｉｍ
ｍｕｎｏｌ、ａｎｄＩｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ、、１　
５　：　５８　４−３　９　６　（１９８０）Ｐｌａｔ
ｔｓ　−Ｍ目Ｉｓ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ、＋　１１３：５４Ｂ−３５７（１９７４） Ｌｅｓａｖｒｅ　ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、
＋　１　２　５　：　５　２９−５３４（１９７９） Ｐｏｌ旧ＩＩ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ
、１１５　：　１３５７−１３６１（１９７５） １）ａｙ　ｅｔ　ａｌ、、　５ｃａｎｄ、　Ｊ、　Ｉｍ
ｍｕｎｏｌ、＊　５　：　７　１　５−７２０（１９７
６） Ｃｈａｔ）目：ｌｓ　ａｔ　ａｌ、、Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅ
ｄ−＊　１　４　３　：２４１−２５７（１９７６） 従来技術の難しさを回避して補体系の活性化の効果的な
検出と定量を行う方法とシステムを提出することが望ま
れている。そのような活性化の検出は全本配列または調
節たんば〈質についてでなく、経路の動的活性を表わし
得る活性化複合体に関するものである。また、そのよう
なシステムと方法は比較的用いるのが容易でありｔたア
ッセイする補体複合体に対して高度に特異的であるかど
うかが望まれることである。また、そのシステムおよび
方法は感度が良く比較的少常の補体活性化を検出できる
べきである。本発明はこれらの要求に合致する。

発明の要約一 本発明は、その存在が補体系活性化を示す活性化複合体
の検出および恐らくは定量をも可能にするアッセイ方法
およびシステムに関する。活性化複合体は補体経路活性
化のカスケード反応中に形成され補体経路の活性を持続
させる補合体ならいずれでも良い。かかる複合体は分裂
、他の成分との結合、細胞分解の助長により補体活性を
持続させる中間物である。これは不活性化即ち阻害され
従って経路活性化の拡大と活性を示さない複合体とは区
別される。予期に反し、かかる活性化複合体が、カスケ
ードの一部であるにもかかわらず、袖体経路活性化を示
す正確な手段として検出し測定できることを見い出した
。

活性化複合体は第一の補体成分と第二の補体成分とから
なる。これら成分は補体成分Ｃ１およびＣ２と混同すべ
きではない。むしろ、この第一と第二の成分は任意の袖
体成分から別個に選ぶことができる。ただし得られる初
合体は活性化複合体である。活性化複合体中の成分に対
して特異性の少なくとも二つの結合剤を本発明のアッセ
イ法では使用する。

本発明のアッセイ方法においては、血清のような液体試
料を、第一の特異性結合剤を、上記試料に存在し得かつ
複合体中の任意の第一補体成分を包含する任意の第一補
体成分に結合させることによりアッセイする。これは礪
−特異性結合剤を試料と接触させることによりなし得る
。第一の特異性結合剤は好ましくは、第一補体成分に対
する抗体であるが、そのような抗体のＦａｂ、Ｆａｂ’
またはＦ（ａｂ’）２　部分またはもし官能性が残存し
また結合可能であるならばイディオタイプ部位（ｉｄｌ
ｏｔｙｐｉｃｒｅｇｉｏｎ）のａき任意の特異性結合剤
でも良い・完全抗体の使用は完全抗体が容品に得られる
ので低分子量画分の使用よりも好せしい。第一％異性結
合剤は使用前に周知のアフイニテイ法により精製し第−
袖体成分と結合しない物価全実質的に除去しておくこと
が好寸しい。

第二の特異性結合剤は、第−補体成分と活性化複合体を
形成する任意の第二イ…体成分を含む任意の・基二醋体
成分と結合する。Ｈ−ｈよび編二の結合剤は複合体と結
合して集塊（ａｇｇｒｅｇａｔｅ　）を形成する。第二
特異性結合剤は複合体の存在全４而認し同定するのに用
いる４票−を含む。４＃鐘は酵素、螢光クロム染料また
は放射性核種のような任意の適当な形でよい。酵素およ
び放射性核種は特に感度のよい測定を可能にするので好
ましいものである。

第二特異性結合剤も第一結合剤と同様アフイニテイ精製
することおよび完全抗体であることが好ましいが、抗体
の官能性イディオタイプ部位を含む抗体画分でも良い。

標識は公知の方法で抗体に結合し得る。

各特異性結合剤はキット形で調製して診断用アッセイシ
ステムを形成する。各特異性結合剤は何も特別な順序で
複合体に結合する必要はなく、実質的に同時に結合させ
得る。即ち、必要なら、試料に同時に加えてもよい。し
かしながら、好ましいのは第一の特異性結合剤を任意の
活性化複合体に結合させ、試料の残シヲ除去し、次いで
第二の標識を含む特異性結合剤を結合させることである
。

かくして、第二特異性結合剤は活性化複合体の一部でな
い第二補体成分上では使い果さない０集塊を形成したの
ち、複合体に結合せず集塊の一部ではない標識を含む第
二特異性結合剤は適当な分離方法で除去することが好ま
しい。次いで。

活性化の存在を測定すること、好ましくは集塊の一部と
して複合体に結合して残っている標識の量を測定するこ
とができる。

分離方法は多くの手段で達成できる。第一および第二の
特異性結合剤と結合した複合体からなる集塊は単独また
は任意の遊離第二補体成分と結合した標識化第二特異性
結合剤よりも大きい分子量を有するので、分離は分子量
差選別方法によりなし得る。このような方法にはグル拡
散、クロマトグラフィー、吸着、電気泳動、遠心分離お
よび限外濾過がある。分離は第一の％異性結合剤を不溶
性ピース担体の如き分離手段にカップリングさぜること
によりさらに向上する。

好ましい分離手段は第一の特異性結合剤を固定化した固
体マトリックスまたは支持体である。第一％異性結合剤
と結合しない過剰の試料部分はマイルド々洗浄剤の水溶
液でもって洗い去り固定化した活性化複合体を残すこと
ができる。次いで、第二特異性結合剤を活性化複合体と
接触させて集塊を形成させる。形成した集塊もまた固定
化されて制定を行う前に標識をもつ未結合第二％界性結
合剤を容易に洗い出し可能とする。特に適切な固体マト
リックスは免疫化学において普通に使用される多穴微量
滴定プレートである。かかるプレートは第一特異性結合
剤を予じめ結合したアッセイキットの一部として調製す
るかあるいは供用前に固定化するよう溶液中で調製する
。

第一特異性結合剤は微量滴定プレート上に固定して実際
に使用するまで保存し得る。このような調製微量制定プ
レートは本発明の方法を実施するアッセイシステムの一
部として提供できる。微量滴定プレートは好ましいのは
２つの群の穴、即ち、予じめ測った量の試料？入れる試
料穴の群と種々の判っている量の第二補体成分を保持す
る標漁穴ノ群を有することである。アッセイシステムの
一部をも構成する第二物品性結合剤は大のすべてに加え
ることができる。未結合の標識を除去したのち、試料穴
の測定を対照としての標準穴と比較できる。

検出する複合体は補体系を活性化したときに形成するい
くつかの複合体の任意の一つであり得る。

これら複合体は古典的経路を活性化したとき形成も使用
でき、第二経路を活性化したとき血清中に存在するＣ３
ｂ　とプロペルジン（ｐ）は特に好ましいものである。

Ｃ５ｂとＣ６−Ｃ９の結合物であり古典経路と第二経路
の両方の共通末端部に沿って形成する活性化複合体の存
在も検出できる。調節たん白質の一つにより不活性化即
ち阻害さｉｚる複合体は興味がない。これら複合体は活
性化の’３ｋ　ｋ示さ々い相対的な〃ゆきづまり〃であ
るからである。

アッセイする複合体にもよるが、各行昇性結合剤は次の
うちの２種に対する抗体であることが好ましい：　Ｃ２
ａ、Ｃ３ｂ、Ｃ４ｂ、日す、ゾロペルシン。

Ｃ５ｂ、Ｃ６，Ｃ７，Ｃ８およびＣ９゜特に好ましい実
施態様においては、Ｃ３ｂ　とゾロペルシンを含む活性
化複合体を血清中で検出することである。この態様にお
いては、第一特異性結合剤は第１の抗−Ｐ抗体を含み、
第二特売性結合剤は第二の抗−Ｃ３ｂ抗体を含む。各特
界性結合剤、即ち、抗体は複合体中の２種の界なる成分
に係り、複合体は２種の結合剤間にｆサンドイッチ状）
と々つて集塊全形成しているので、本発明のアッセイは
極めて特別であるたけでなく特に感度ノ良いものである
。例えば、グロベルジント０５含有複合体は第二経路活
性化の結果として形成されるだけである。ゾロペルシン
は血清中に第二経路活性化がなくても天然に存在し抗−
ゾロペルジン抗体と結合し得る。しかし、このような結
合は、疑似の陽性結果を生じ々いであろう。標識は抗−
Ｃ３抗体に固定しているので、検出および測定は、抗−
Ｃ３抗体が抗−ゾロペルジン抗体に結合している複合体
の一部を形成しているＣ３ｂに結合したときのみ起きる
。活性化複合体に結合していないかまたは活性化複合体
の一部ではないＣ３ｂに結合している抗−Ｃ３ｂ抗体は
、いずれも、その固定化標識と一緒に集塊から分離され
る。このことは極めて特別であるだけでなく感度が良く
血清中の複合体の１０−２０＋ｉグラム／ミリリツトル
（ｎ？／ｍｅ）を再現性よく検出できる。検出する複合
体がＣ３ｂとｐからなるときは、この値は血清中に通常
存在するＣ３の０．００１５％に相当する。血清または
血漿中の複合体の安定性は貯蔵血清および非最適条件下
で集められた試料をアッセイするのを可能とする。

本発明は当該技術で公知の他のいわゆる４９７１インチ
ｌアッセイとはａ々る。本発明においては、少なくとも
２つの分子成分を有する予じめ存在する活性化複合体を
２種の特真性結合剤間にサンドインチする。より普通の
〃サンドイツチタイグ〃アッセイの一つにおいては、抗
原と抗体がアッセイ中にその場で複合体を形成し、第一
の抗体に対して生じた抗体はアッセイの第６成分として
用いる。他の通常タイプの〃サンドイッチ′アッセイに
おいては、２つの決定基部位を持つある抗原性たん白質
を抗体を用いて決定基部位相互に結合させる。通常のア
ッセイ法はｂずれの方法も予じめ形成された２分子複合
体をサンドイッチの内前部分として使用していない。

本発明は従来法に比較して著しい利点を有する。

なぜならば、本発明は補体活性化の結果としてのみ血清
中に存在する特定の活性化複合体の惜を検出し測定でき
るからである。例えば、溶血アッセイにおける赤血球分
解の測定は補体成分の残留機能活性を測定するもので、
活性化の−ＩＩ？測定するものでない。溶血アッセイは
また二次曲事がら。

即ち、細胞膜の分解に依存し、この分解は膜攻撃経路の
完全性に依存している。即ち、溶血アッセイｆｌｃ５〜
Ｃ９成分の１つが欠乏する患者の補体経路活性化を測定
するのには有効で々い。そのような欠乏は淋菌性敗血症
、多発性全身性エリテマトーデス、再発性ないしは隔離
性の髄膜炎菌性髄膜炎に伴い得る。そのような欠乏は、
欠乏補体成分がアッセイに用いる補体成分の一つである
とｂうまれな状輯を除いては本発明では問題とならない
ものである。

本発明の多くの他の利点と特長は以下の発明の詳細な説
明および図面により容易に明らかとなるであろう。

略図の目録 ＡＲＤＳ＝成人呼吸困難症候群 ＢＳ＾　＝ウシ血清アルブミン Ｂｂ　＝補体因子Ｂのたん白質分解画分Ｃ１−Ｃ９＝補
体の成分 ｃ３ｂ　＝Ｃ３の主分裂画分 ＣＮＢ、＝＝＝化シアン ＥＣ３ｂ　＝結合Ｃ３ｂを有する赤血球Ｅ　ＤＴ　Ａ＝
エチレンジアミ・ンテトラ酢酸ＥＤＴＡ−ＮＨ！３　＝
　２０　ｍｌ　Ｅ　ＤＴ　Ａを含む正常血清ＥＧＴＡ＝
エチレンービス−（オキシエチレンニトリロ）テトラ酢
酸 ＥＬＩＳＡ　＝酵素固定化イムノンルベントアッセイ Ｈ＝因子■の共通因子（ｃｏ−ずａｃｔｏｒ　）１　＝
Ｃ３の阻害剤 ＭｇＥＧＴＡ−ＮＨ８＝　２　、５　ｍＭ　のマグネシ
ウムと１０＋ｄＥＧＴＡを含んだ正常ヒト血清ＮＨＳ　
＝正常ヒト血清 Ｐ　＝ブロールソン ＰＡＰ　＝精製した第二経路たん白質 ＰＢＳ　＝０　、１５ＭＮａＣ／中の０．０１２Ｍリン
酸塩バッファー Ｒ，１，＝＝活活性化核粒子結合した０３分子に対する
結合８分子の比として表わし た制限係数 ＳＬＥ　＝全身性エリテマトーデス ＶＳＳ　＝ベロナール緩衝食塩水 ２＋ Ｖ　Ｂ　Ｓ＋＋　＝　Ｃａ　とＭｇ”＋！含むベトロナ
ール緩衝食塩水 発明の詳細 な説 明 し測定するためのアッセイ方法およびシステムに関する
。試料は患者から採取した体液でもよく、また各種伝染
性試剤が補体系にいかに影響するかを研究するのに用い
る合成補体系からのものでもよい。アッセイ用の好まし
い体液は血清であるが、使用できる体液としては系漿、
血液，滑液，脳脊髄液，水庖内液、ｌｔｌ１膜および６
膜滲出液、尿および唾液でもよい。体液中の活性化複合
体の存在は補体系活性化を示し得るものである。以下、
説明を容易にするため、血清の使用をかかる体液の例示
として記載してい〈０ 活性化補体複合体は補体系を活性化したときのみ血清中
に存在する。活性化複合体は，他の補体成分と相互作用
することによりあるいは細胞分解を助長することより補
体系の活性を持続する◎この複合体は第一補体成分と第
二補体成分を含んでいる。追加の補体成分も複合体中に
は存在し得る。

このような活性化複合体はＣ４ｂ、２ａｌＣ４ｂ、２ａ
、３ｂ、Ｃ３ｂ、Ｂｂ、Ｃ３ｂｎ、８ｂ。

Ｃ３ｂｎ、Ｐ、Ｂｂ、Ｃ３ｂ、Ｐ、Ｂｂ、Ｃ３ｂｎ、Ｐ
、Ｃ３ｂとブロイルジンを有する複合体およびＣ６＝　
Ｃ７ｅＣ８とＣ９のうちの１種またはそれ以上と結合し
たｃ５ｂを包含する。

本発明のアッセイの一局面においては、活性化補体複合
体を含むと信じられる試料を試験して、かかる複合体の
存在を検出、好ましくはその量を測定できる。第一％易
性結合剤を活性化複合体の一部を構成する任意の第一補
体成分を包含する試料中に存在する任意の第一補体成分
に結合させる。

かかる結合は１通常、第−特真性結合剤を試料と接触さ
せることにより達成できる。標識を含む第二特異性結合
剤を、複合体の一部を構成する任意の第二補体成分を包
含する試料中に存在し得る任意の第二補体成分に結合さ
せる。第一と第二特異性結合剤の複合体への結合は集塊
を形成させる。

各結合剤はなにも特別の順序で複合体に結合させる必要
はなく結合すべき試料中におよそ同時に一緒に導入して
も差支えなり。

集塊を形成したのち、集塊の一部を構成していない任意
の第二特異性結合剤と従ってそれに結合した標識とは集
塊から除去できる。次いで、複合体に結合即ち連結しそ
れにより集塊の一部をなす任意の標識の存在好ましくは
量を測定できる。

集塊の一部でない第二特異性結合剤から集塊を分離する
のに用りる数種の方法がある。このような結合剤は活性
化複合体の一部でない槙二補体成分には結合していても
結合していなくてもよい。

幾つかの方法は、集塊が集塊の一部ではない第二特異性
結合剤よシも実質的に分子量および分子粒度が大きいと
いう点で分子量−粒度選別デロセスを用いる。これらの
方法はグル拡散、クロマトグラフイー、吸着、電気泳動
、遠心分離、限外濾過および分画沈澱法を包含する。こ
れら方法のあるものは、未結合第二％ｎ性結合剤と集塊
の化学的、電気的性質にある程朋依存している・ 集塊の一部を構成しない第二特異性結合剤から集塊の分
離および除去をさらに向上するためｌｃ＃：ｌ：。

存在する第一結合剤を、例えば１分離手段にカップリン
グすることにより予備処理するができる。

分離手段は集塊の嵩を増大させその電、気的性質を変化
させて分離を向上する。嵩の増大は、分離手段として担
体を用いることで達成できる。このような担体としては
水溶性のヒドロキシエチルセルロースおよびヒドロキシ
グロピルセル四−ス誘導体の如き比較的大きい高分子体
、ポリエチレンイミン、ポリリシン％ぼりグルタミン酸
、カギ穴状ヘモシアニン（ｋｅｙｈｏｌｅ　Ｉｉｍｐｅ
ｔ　ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ　）、フェリン（分子量４６
０．０００）％または特異性結合剤を結合し得る鉄−架
橋アクリル酸またはメタクリル酸含有重合体の如き天然
または合成高分子磁性材料がある。不溶性粒子、即ち、
ガラスピーズの如き幾分大きめの物理的材料、商標”　
５ＥＰＨＡＤＥＸ　Ｉ　としてニューシャーシー、ビヌ
カタウエイのＰｈａｒｍａｃｌａ　Ｆｉｎｅ　Ｃｈｅｒ
ｎｌｅａｌｓ　より入手可能なデキストラン、アガロー
ス、ポリスチレンまたはアクリルアミドもまた担体とし
て使用できる。かかる不溶性粒子を用いれば、超遠心処
理の必要なしに簡単な遠心処理を用いることができる。

２つの容器にするような完全分離は必要でなく１一つの
容器の底に集塊と分離手段が決着ないし析出し、一方未
結合標識はその大部分が容器上部に残るような部分分離
を受入れもよい。

好ましいのは分離手段が第−特異性結合剤を固定化させ
た固体マトリックスまたは支持体の如き固体材料である
ことである。かかる固体マトリックスは、免疫化学にお
いて普通に用いられるよう々複数の穴を有する微量滴定
グレートの表面であり得る。各々９６個の穴を有するこ
のようなプレートは商標名ＩＭＭＵＬＯＮｎ　としてパ
ーツニア、アレキサンドリアのＤｙｎａｔｅｃｈ　Ｌａ
ｂｏｒａｌｏｒｌｅｓより商業的に入手できる。次いで
、固体マトリックスは、第二％真性結合剤との結合を防
止するために処理すべきである。ウシ血清アルブミン（
’ＢＳＡ）が実際上の使用に適している。

第一特異性結合剤が第一抗体であるときは、スーフ− ａｕｒｅｕｓ　）　たん白質Ａｆｔ用いて第一抗体のＦ
Ｃ部位ゲマトリックスに結合させ、固定化する。スタフ
ィロコッカスアウレウスたん白質Ａはまた、担体として
または、第−特異性結合剤の一部として用いてプラスチ
ックマトリックスに付着する〃付着端（５ｔＩａｋｙ　
ｔａ目）〃を与えることもできる。

さらに別の手法は、第一％真性結合剤の一部として、ビ
タミンビオチンを含むことである。抗体のようなたん白
質は、’　Ｂｓｒｇｅｒ　ｅｔ　ａｌｓｏ　Ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒｌｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　、　１９　：　８５７
−８６４（１９８２）’に記載されているようにしてビ
オチン化できる。

ビオチンに対するアビジン、卵白からのたん白質（会合
定数１０１５）の極端に高い親和性は、沈澱によるに分
離を容易にする。

集塊が形成され第一特異性結合剤によって固体マトリッ
クス上に固定されたのち、任意の未結合第二特売性結合
剤と標識は容易に洗い落すことができる。洗浄に適して
いるのは、ウィルミント。

デラワーのＩ　ＣＩ　ＩＶｎｅｒ　１ｃａｓ、　Ｉｎｃ
、より曲品名ＴＷＥＥＮ２０またはＴＷＥＥＮ　８０と
して、またはフラテルフイアのＲｏｈｍ　＆　Ｈａａｓ
　Ｃｏ、　ｌｎｃ＊よりのＴＲＩＴＯＮＸ　−１００と
して商燐的に入手できるような洗浄剤を含む非イオン系
洗浄剤の希溶液である。洗浄後、集塊の一部として残っ
ている標識の存在および量を容易に測定できる。

任意の第二％真性結合剤およびその集塊の一部を構成し
ていない標識とは集塊から分離することが好ましいけれ
ども、その分離はかならずしも必要でない。分離は、第
一特異性結合剤が第二特異性結合剤の一部として含１れ
る標識の操作に影響するときは必要でない。この１つの
例は螢光消光であろう。

もう一つの例は第一特異性結合剤が７９−オキシダーゼ
またはルシフェラーゼの如き化学螢光触媒を含むときで
あり、これらはその個々の基質と反応したとき化学反応
を経て光を放出する。一方。

第一％真性結合剤はカルボキシル化ベンゾフェノンのよ
うな光吸収化合物を含むことができ、該化合物は紫外線
を吸収して吸収エネルギーを刺激状態として他の分子へ
移行させる。このとき第二特異性結合剤上の標識はＩル
フリンまたは芳香族化合物のよう々螢光分子である。次
いで、光は第一％真性結合剤により第一の波長で吸収さ
れ、再放出または生成され、第２結合剤による螢光分子
により第２の波長で吸着され再受容される。この第２波
長での光の存在が集塊従って試料中の活性化補体成分複
合体の存在とｉｔ？示すものである。

各特異性結合剤はその各々の補体成分に対して抗体であ
ることが好ましい。他の好適な特異性結合剤はＦａｂ、
　Ｆａｂ’またはＦ（ａｂ’）２部位および機能性イデ
ィオタイプ部位の如き適当な抗体の一部分を包含し、こ
れらのすべては機能性イディオタイプ含有ポリペプチド
と称することができる。イブイオタイブ含有ポリペプチ
ドはそのイディオタイプ部位が相応する完全抗体に結合
するとき、同じ決定ドメインに結合する点で機能性であ
る。抗体が抗原に対してｌ産生される（　ｒａｉｓｅｄ
　）　’　限りでは、機能性、イブイオタイブ含有ポリ
ペプチドはまた抗原に対して＃産出されるＩと云える。

完全抗体は好ましい機能的イディオタイプ含有ポリペプ
チドである。それはより容易に入手できるからである。

説明を容易にするために、抗体は機能的イディオタイプ
含有ポリペプチドの代表として例示的に使用するものと
する。第−物品性結合剤はかくして第一抗体であり得、
第二％Ｒ性結合剤は第二抗体であシ得る。各抗体は必要
ならモノクロナール源からのものでもよい。

各％真性結合剤は１個より多い抗体表いし機能的イデイ
寸タイプ含有ポリベスチドを包含する。７５、例えば、
第二特異性結合剤は未標識化第二抗体および第二抗体の
ＦＣ部位に対する第三抗体とを包含し得る。榛＠はその
後第三抗体に結合できる。

第三抗体は複合体と接触する前に第二抗体と結合できる
か、あるいは第二抗体を複合体に結合した後で順次結合
できる。後の場合、複合体がすでに第一抗体と結合ない
しは固定されているときは、第一と第二抗体とは異なる
動物種から選択して第三抗体が第一抗体ＶＣＭ接結合す
るのを回避する。

標識は固定と定量ができる任意の適当な標識でよい。そ
のよう方標識としては、酵素類またはトレーサー類があ
り、後者は螢光クロム染料、またはヨウ素１２５または
１３１１水素３またはイオウ３５の如き放射性アイソト
ープのいずれかである。螢光抗体による標識化のために
第二特異性結合剤に結合できる適轟な螢光クロム染料に
はβ−アンヌラセン、ローダミンおよびフルオレセイン
がある。ラジオイムノアッセイと酵素イムノアッセイは
、その比較的高い感度故に％特に有利である。酵素イム
ノアッセイの方がラジオイムノアッセイよりも比較的短
い半減期を有する放射性材料を取扱い貯蔵する必要がな
い点で有利である。

選択する酵素は比較的安定で、比較的長い貯蔵寿命を有
し、容易に入手できかつ安価であるべきである。オだ、
酵素の活性は検出回部な少量の酵素でもって簡単な比色
分析または螢光分析法を用いて容易に測定できるが必要
である。従って、酵素は高い基質ターンオーバー数を有
しかつ試料中の生物学的成分により影響を受けないもの
でなければならない。かかる酵素にはアルカリ性ホスフ
ァターゼ、ホースラデイシュノ４−オキシダーゼ。

グルコースオキシダーゼ、カタターゼおよびβ−Ｄ−ガ
ラクトシダーゼがある。このような酵素については、一
般に、／’　Ｍａｇｇｌｏ、　Ｅｎｚｙｍｅ−１ｒｒｒ
ｎｕｎｏａｓｓａｙ。

ＣＲＣＰｒｅｙｓ、　Ｂｏｃａ　Ｒａｔｏｎ、　Ｆｌｏ
ｒｉｄａ　（１９８０）　’を参照されたい。

結合剤として作用する抗体を、例えば、微量滴定フレー
げにカップリングすることにより固定化し酵素を標識と
して使用する場合、そのアッセイ方法は酵素−結合イム
ノソーペントアッセイ（ＥＬＩＳＡ　）として公知の一
般タイデの方法である。

ｍ素ｕ２つの成分をグルタルアルデヒドのような架橋剤
と一緒に混合する一段階複合方法か２段階法のいずれか
で第二抗体に結合できる。２段階法においては、抗体が
酵素のいずれかを架橋剤と反応させ、過剰の架橋剤を除
去したのちイ４１られた活性化生成物を他の所望成分と
混合する。一段階法においては、各成分がそれ自体とま
た同時に他成分と架橋し、２段階法とは逆に、第一成分
のみが自己結合する。次いでグル沖過は未標識化抗体を
除去するのに用いる・ アルカリ性ホスファターゼは、その基質％ｐ−ニトロフ
ェニルホスフェート、クロモゲンとの反応時に約４０５
ｎｒｎ（２４７００ｃｍ−’　）で最大吸収を有する黄
色発色を呈する。皐位時間当シの光学密度の変化を測定
して、酵素即ち、存在する酵素結合集塊の量を正確かつ
高感度で測定できるものである。好ましのは、標準の対
照穴を利用して存在する物質の確に対する光学密度の変
化から比較換算するための標準曲線を作ることである。

このことは後でもつと詳細に述べる。

本発明の好ましい例示的な実施態様は第二補体経路の活
性化をアッセイし、特にＣ５ｂ　とゾロペルジンを含む
複合体の量を測定する。このような測定は前述したよう
なある種の病気および病理学的条件において有用である
。　。

後でもつと詳細に述べるアッセイにおいては、次の手順
が一般的に行なわれる。９６穴の微量滴定プレートの殆
んどの列（試料穴）を第１抗体としてのアフイニテイ稍
製抗−デロベルジン抗体の５マイクログラム／ｄで被覆
する。標準対照曲線を作る目的の精製Ｃ３（５〜４０マ
イクログラム）の反覆試料を残りの列（標漁穴）に入れ
てｃ３標準を調製する。グレート中の穴全部をリン酸塩
緩衝食塩水（ＰＢＳ）中０．５係ウシ血清アルブミン（
ＢＳＡ　）で２時間、６７℃で処理して穴壁を第二の即
ち抗−Ｃ３抗体の如き続いて導入したたん白質に結合す
ることから遮断する。プレートは次いで吸引処理しＰＳ
Ｂ−ＴＷＥＥＮ　２　Ｑの溶液中で洗浄する。

反覆血清試料を、被覆し遮断した試料穴へ加え１時間室
温にて結合せしめる。血清試料は精製Ｃ３を含む標準列
には添加しない。次いで、サンプル穴をＰＢＳ−ＴＷＥ
ＥＮ　２０溶液で３回洗浄する。

アルカリ性ホスファターゼに複合したアフイニテー精製
抗−０５抗体を穴全部に加え１時間室温で結合せしめる
。穴はＰＢＳ　ＴＷＥＥＮ　２０溶液で３回再洗浄する
。

しかる後、判っている量のｐ−ニトロフェニルフォスフ
ェートをクロモゲンとして加えグレートを４０５ｒ１ｍ
で５分間隔で自動化マイクロタイタ−リーダーで読み取
る。同じ実験で得ｆｃＣ５曲線と比較することにより、
Ｃ５の伊ｊｉ’ｆｆち実験試料で検出したプロ（ルソン
ーｃ３ｂ複合体の量をｎｌＦ／穴で表現し得る。次いで
、これらの値を各穴に入れた試料の量を知ることにより
ｎ　ｔ　７ｍｌに換算する。

抗−０３抗を使用したけれども、心懸けておくべきこと
は抗−ｃｓｂ　抗体もまた抗−０３抗体であるというこ
とである。Ｃ３の大部分約９５係はＣ３ｂ　Ｆｆｌｌで
ある。従って、実際目的においては、抗−０３抗体はま
た抗−３ｂ抗体である。

他の可能外変形は、機能性抗−デロベルジンと抗−Ｃ３
ｂ　イブイオタイブ含有ポリぜグチドを使用すること、
抗−Ｃ３ｂ抗体を抗−ｆ　ａ−Ｊ！ルソン抗体に結合し
た標識と共に固体マ）　ＩＪソックス結合させること％
または抗−プロペルジンもしくは抗−０６ｂ抗体と複合
した抗−Ｂｂ抗体を用いてＣ３ｂ、ρ、Ｂｌ）とＣ３ｂ
、ａｂ複合体の存在を測定することを含む。一方、古典
型的経過の活性化は抗体をＣ２ａ、Ｃ３ｂおよび−Ｃ４
ｂのうちの２つに選択することにより測定できる。補体
経路の共通末端前の活性化もまた抗体をＣ５ｂ、Ｃ６，
、Ｃ７，Ｃ８とＣ９のうちの２つに選択すると七により
測定できる。

補体系の活性化を測定するアッセイ方法はキット形で必
要な物賀を含む診断用アッセイシステムの使用を通して
実砲できる。一般に、このようなシステムは、第一特異
性結合剤と標識を含む第２％異性結合剤とからなる。標
識が酵素であるときは、酵素基質もまた調製できる。キ
ットにおいては、数種の％異性結合剤と酵素基質が好ま
しくは別個に装填される。

第一特異性結合剤は溶液中で調製し固体マトリックスに
固定してもよく、また前述したように担体の如き分離手
段にカップリングされてもより。

第二の、標識化した物界性結合剤とその基質は、もし必
要々ら、使用を単純化する必要があるとき１液以上の溶
液で提供できる。液体中に分散した抗体は厳密な意味で
は真の溶液ではないけれども、説明上、溶液として考え
る。

使用をたやすくするため、第一！侍ｍ性結合剤は、＠１
２図に示す如く、複数の穴１４を有する微量滴定グレー
ト１２のような固体マトリックスまたｔま支持体上にカ
ップリングされ固定化されて調製する。最適の配列はｗ
、１２図に示すように穴１４の低部即ち底部に固定化さ
れた第一特異性結合剤１６を含む。ＢＳＡのような遮断
用たんばく質１８は穴１４の上部を占めるように示され
ている。

微量画定プレート１２は、清浄であり、第一特異性結合
剤を吸着するがその結合を可能にしその結果第一結合剤
を洗浄中でも残留させるような任意の適当な材料から作
るのが゛好ましい。かかる材料としてはポリスチレン、
ポリ塩化ビニル、ポリノロピレン　、Ｉｆリカーボネー
トｔｆｒは処理ガラスがある。穴は平坦な底を有してＳ
識の骨を分光油１定により読み取ることができる適切な
光学表面を与えることが好ましい。

グレート１２は２つのセクション、即ち、アッセイすべ
き試料を入れる複数の試料穴を有する試料領域２０と積
重の対照試料を入れて込るまたは入れるであろう複数の
標準穴を有する標準領域即ち穴２２に分割することが好
ましい。試料領域２ｏの各穴はアッセイすべき試料中の
第一補体成分の予定量よシ過＠惜で存在する第−特売性
結合剤１６を入れる。標準領域２２の各穴は判っている
変化量の第二補体成分を入れる。一方、標準第二補体成
分溶液は標準領域２２の空の穴へ加える。

■材料および方法 試剤および緩衝液 ＴＷＥＥＮ　２０．画分Ｖウシ血清アルブミン、Ｐ−ニ
トロフェニルホスフェート、　仔牛粘ｔｌ（（カラのタ
イツ■アルカリ性ホスファターゼ（ミズリー州、セント
ルイスのＳｉｇｍａ社）、ジェタノールアミンにューヨ
ーク、０チェスターのＥ’ａｓｔｏｒｎａｎ−Ｋｏｄａ
ｋ　社）％破傷風トギソイドにューヨーク。

ノソールリレｆ−のＬｅｄｅｒ　Ｉｓ　Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒ　Ｉｅｓ　）、ヘパリンｃカルフォルニア州ノース
リップのＲｉｋｅｒＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　のＬｉ
ｐｏ−Ｈ＠ｐｌｎ　Ｕ、Ｓ、Ｐ、　ユニット／　ｍｌと
して）、および子牛胸腺ＤＮＡにュージャージー州フリ
ーホールドのＷｏｒｔｈｌｎｇｔｏｎ　Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｉｅｓ）はそれぞれ関連製造業者から購入した。カ
ルシウムとマグネシウムによるＶＢＳとｖＢＳ＋＋は。

’Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　１ｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉ
ｓｔｒｙ　、　ｐ　１　３　３（１９６７）’にＭａｙ
ｅｒによシ開示されているようにして調製した。ＰＢＳ
は１２ミリモルのシん酸塩と１５０ミリモルのＮ　ａｃ
Ｌ　を含んでおシ、ｐＨ７，４であった。

ヒト血清 正常人からの静脈血液をガラスチューブ中で１時間、室
温にて凝固し、遠心処理し、血清を取シ出し一７０℃で
貯蔵した。ＡＲＤＳを有すると診断された患者の血清は
Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ　ｏｆＳｃｒｌ
ｐｐｓ　Ｃｌ　ｎｌｃのＣｈａｒｌｅｓ　Ｃｏｃｈｒａ
ｎｅ　博士よシ親切な提供を受けた。チブス熱を有する
と診断された患者の血清は、Ｕ、　Ｓ、　Ｎａｖａｌ　
Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈＵｎｌｔＡ２、Ｊａ
ｋａｒｔａ　Ｄｅｔａｃｈｍｅｎｔ　Ｊ：　Ｆ）得た。

全身性エリトマト−デス患者からの血清は５ｃｒｌｐｐ
ｓＣｌｉｎｉｃ　ａｎｄ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｆｏｕｎ
ｄａｔｉｏｎのＪ６ｈｎ　Ｃｕｒｄ博士よシ親切に供与
された。

Ｃ２欠乏およびＣ７欠乏のヒト血清は、各々のたん白質
の先天的欠乏を有する個体よシ得た。

Ｃ２，Ｃ３，ＢおよびＣ４の各成分除去血清は血清試料
を１０ｍＪＥＤＴＡの適当な単一特異性抗血清のＩｇＧ
ＩＩｈｉ分を含むアフィニティーカラムを通すことによ
シ調製した。各成分の不存在はオーチターロニー分析（
０ｕｃｈｔｅｒｌｏｎｙ　ａｎａｌｙｓｉｓ　）　およ
び特異性８Ｍ能アッセイによシ測定した。精製した欠損
たんば〈質の生理学的基準量（Ｃｌｑと一緒に）を加え
ることにより機能的活性の少なくとも８０チ再構成出来
た血清のみを使用した。

補体成分および細胞中１１４体 Ｃ３は、’　Ｔａｃｋ　ｅｔ　ａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍｌ
ｓｔｒｙ　ｂ　１５　：４５１３−４５２１（１９７Ｓ
）’に記載されているようにしてヒト血清から同質物に
まで精製した。因子Ｂは’　Ｇａｔｚｅ　ｅｔ　ａｈ、
　Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、、　１３４　：９０５−１
０８５（１９７１）’に記載されているようにしてヒト
血清から同質物まで精製した。

因子Ｏも、’　Ｇｏｔｚｅ　ｅｔ　ａｌ、Ｊ、Ｅｘｐ、
Ｍｅｄ、、１３９：４４−５７（１９７４）ｌｃ４己載
されるようにして同ｍＫ調興し、因子Ｈおよび−は’　
Ｐａｎｇｂｕｒｎｅｔ　ａｌ、Ｊ、εｘｐ−Ｎｊｅｄ−
＋　１　４　６　：　２　５　７−２　７　０（１９７
７）’に記載されているようにして調製した。

Ｃ３ｂは、　’　Ｐａｎｇｂｕｒｎ　ｅｔ　ａｌ、、　
Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、。

１４／）：２５７−２７０（１９７７）’に記載されて
いるようにして調製した。、Ｃ３ｂ＝量体。

Ｃ３ｂ１　、　Ｃ３ｃおよびＣ３ｄは％　’　５ｃｈｒ
ｅｉｂｅｒ　＠＊　ａｌ、。

ＣＩ　Ｉｎ＋１ｍｍｕｎｏ１．　ａｎｄ　Ｉｍｍｕｎｏ
ｐａｔｔｌ、＋　２３　：　３３５−３５７（１９８２
）＃に記載されたようにして調製した。Ｃ１ｑおよび腎
炎因子は’　Ｔｅｎｎｅｒ−ｅｔ　ａｌ。

Ｊ、１ｍｍｕｎａ１．＋　１２７　：　６４Ｂ−６５３
（１９８１）’および’　５ｃｈｒｅｌｂｅｒｅｔ　ａ
ｌ、、　Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、、　１４２　ニア６
Ｏ−７７２（１９７９）＃に記載されているようにして
調製した。

プロベルジン（Ｐ）は’　Ｍｅｄｌｃｕｓ　ｅｔ　ａｌ
、　Ｊ。

１ｍｍｕｎｏ１．１２４：６０２−６０６（１９８０）
’の方法の変形によシｎ製した。ＥＤＴＡを正常血清へ
５ｍモル濃度に加え、この血清を上記Ｔｅｎｎｅｒ　等
のＣ１ｑ精製について記載されているようにしてＢｉｏ
　Ｒｅｘ　７０　（カルフォルニア州すッチモンドのＢ
ｌｏ　Ｒｅｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓの商品名）に
通した。ゾロベルノン含有の通過画分をプールし。

３０ｍモルＮａＣｔ含有％ｐＨ８，５、に＝３．９の２
０ミリモルＴｒｌｓ　−ＨＣｌ　に透析した。その後の
手順は、　Ｍｅｄｉｃｕｓ等によシ公表されているよう
にして行った。活性化ゾロペルノンは調製物の繰返＼ しの凍結−融解によシ産牛した。Ｃ６はラクト・ｆ−オ
キシダーゼ法（εｎ　ｚｍｏビーズ、カルフォルニア、
リッチモンドのＢＩｏＲａｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅ
ｓの商標２５ 名）で　１によシ１マイクロキューリ／ｇｒ　のレベル
まで放射標識化し、放射標識化１週間以内で用いた。

精製第二経路成分Ｃ３，Ｂ、Ｄ、ＨｌｌおよびＰの生理
学濃度（ＰＡＰ）での混合物はｖｅｓ中で調製し、’　
５ｃｈｒｅｌｂｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎ
ａｔ　１．　Ａｃａｄ。

Ｓｃ１．、　ＵＳＡ、、７５　：　３９４８　（１９４
８）　’に記載されているようにして用いた。Ｃ３ｂの
みを含む羊赤血球（Ｅｓ）　はｌ＃Ｉ製したＣ３．因子
Ｂ、Ｄ。

および胸炎因子により　１　Ｐａｎｇｂｕｒｎ　ａｔ　
ａｔ、、　Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、Ｓｃ１．、　ＵＳＡ、、７５　
：　２４１６　（１９７８）’に記載されているように
して生成した。細胞は約５０−１００．０ＯＯＣ釦分子
をその表面に担持していた。

活性化剤および非活性化粒子 羊赤血球（ＥＳ）　はコロラド州デンノ（−のＣｏ１ｏ
ｒａｄｏ　Ｓｅｒｍ　Ｃｏｍｐａｎｙよ）購入し、うさ
ぎ赤血球（ＥＲ）はｖ　ｅ　ｓ＋＋で３回洗浄した正常
な研究所うさぎよシ得、同じ緩衝液で各種濃度に再構成
した。

パーキットリンノや腫の細胞系からのラージ細胞は、１
０％ウシ胎児血清（イリノイ州カンカキ−のＲｅｈａｔ
ｕｉｎ　社）、２ミリモルのグルタミンにューヨーク州
グランドアイランドのＧｌｂｃｏ社）％ペニシリンおよ
びストレノトマイシンとをつキ足したＲＰＭ１１６４０
中で生長させた。この細胞は１ｘ１ｏ６／ゴの濃度で得
、ＰＢＳで２回洗浄して、生存率が少なくとも９５チあ
ることをトライｉ４ンブルー排除によシ使用前に確認し
たつグラム陰性菌は血清感性Ｅ、コーリ（Ｅ、Ｃｏ１１
）とに。

フノオイモニイア（に、　Ｐｎｅｕｍｏｎｉａ　）の実
験室菌株であった。これらグラム菌はトリブチカーゼ大
豆ブイヨン（メイランド、コツケイビルのＢｅｃｔｏｎ
−Ｄｌ　ｘｏｎ社）中で生長させ、比濁法２よびコロニ
ー形成単位ＩＪ＋１１定によシ測定したときＩ　Ｘ　１
０９７ｍｇの濃度で得た。この微生物ＶＢＳ＋＋中で３
回洗浄し使用前に８０℃で１時間加熱殺閑した。

Ｚｙｍｏｓｅｎ　Ａ　（Ｓｉｇｍａ社）は０．１５モル
ＮａＣｔ中で２時間煮沸した。粒子をＶＢＳ＋＋中で洗
浄し、約５０〜／１ｒＬｌに再構成し使用するまで各ア
リコートに一７０℃で凍結した。

ヒト破傷風−抗破傷風免疫複合体をβＺＩＣＣａｒｄｌ
。

Ｊ、　１ｍｍｕｎｏ１．、１２８　：　２５０５　（１
９８２）　’に記載されたようにして産生させた。最終
懸濁物は。

Ｆｏｌ　Ｉｎ−Ｌｏｗｒｙ測定で１−２ｍｙ／ｌｎｌの
たんばく質を含んでいた。’　Ｌｏｗｒｙ　ｅｔ　ａＬ
Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　ＣＣ１１ｅ、　１９３：２６５（１
９８１）＃を参照されたい。

エプスタインーパールウイルスハ’　Ｎｅｍｅｒｏｗ　
ｅｔａｌ、、Ｊ、　１ｍｍｕｎｏ１．．１２７　：　２
７２−２７８　（１９８１）’に記載された方法で調製
し、インフルエンザＷ　Ｓ／３３　ウィルスは’　８ｅ
ｅｂｅ　ａｔ　ａ＋、、　Ｊ、　１ｍｍｕｎｏ１．１３
０：１３１７−１３２２（１９８３）’に記載されたよ
うにして調製し、モロニーロイケミアウイルス（Ｍｏ１
ｏｎｅｙ　Ｌｅｕｋｅｍｌａ　ｖｉｒｕｓ　）は’　Ｃ
ｏｏｐｅｒ　ｅｔａｌ、、　’　Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅ
ｄ、、１４４　：　９７０−９８４（１９７６）’に記
載されたようにして調製した。

１０確の０３と１ｍｇのプロベルジンを別個にＣＮＢｒ
　活性化シエファロース４Ｂにュージャジ州ビスコタウ
エイのｐｈａｒｍａｃ　ｌ　８社）に製造者の手引書に
従ってカップリングさせた。単一特異性ヤギ抗Ｃ３とウ
サギ抗Ｐ血清を３３チ亜硫酸アンモニウムで沈殿させた
。沈殿物をＶＳＳ中に溶解透析させた後、適当なＶＢＳ
中０６またはプロベルジンカラムに通した。ＶＢＳ中３
モルＮａＣＡ　で長時間洗浄後、各カラムを％　０．２
モルグリシン−ＨＣｌ、ｐＨ２、２で、　’　Ｎａｋａ
ｍｕｒ３，１ｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌｏｇｇＣ日ｎ１ｃ
ａｌ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｃｏｎｃｅｐｔｓ　ａｎ
ｄ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　。

Ｌｉｔｔｌｅ　、　Ｂｒｏｗｎ　ａｎｄ　Ｃｏｍｐａｎ
ｙ　、　Ｂｏｓｔｏｎ　％Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ
　ｍ　９．６５９　（１９７４）　’に記載されたよう
にしてストリッピングした。たん白質含有画分をプール
し、直ちに中和し、ｅｖｓ中で透析した。アフイニテイ
精製抗体は使用するまで一７０℃で凍結させた。

抗体のアルカリ性ホスファターゼ標識化：アルカリ性ホ
スファターゼ（Ｓｉｇｍａ社、タイプｖｎ）を、ワシン
トン０．Ｃ０のＡｍｅｒｉｃａｎ　５ｏｃｉｅｔｙｆｏ
ｒ　ＭｌｃｒｏｂｌｏｌｏＢ発行、Ｎ、　Ｒ，Ｐｏ５ｅ
およびＨ。

Ｆｒ１ｅｄｒｎａｎ　編集、の’　Ｍａｎｕａｌ　ｏず
ＣｌＣ１１ｎｉｃａｌｌｒｒｒｎｕｎｏｌｏ　’　％　
９ｐ、　５５９−３７１にＶｏｌｌｅｒ等によシ記載さ
れた方法により、上記アフイニテイ１１！！抗Ｃ３に複
合（コンシュケート）させた。使用すべきＣ６に対する
酵素標識抗体の希釈は。

１：１００〜１　：５０００希釈物を０３に対するアフ
イニテイ梢ｉ１ｇＧ抗体で前取って被覆した微量滴定プ
レー）　（Ｌｌｎｂｒｏ　５ＴＥＲＩＬＥ／ＴＩＴＥＲ
ＴＥに。

コネチカット州マンダンのＬｌｎｂｒｏ　Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｌｅｓの商品名）の穴に加え次いで血清の１　：
　１０．０００の希釈物を加えることにより測定しｆ：
、（後述を参照されたし）。次いでＥＬＩＳＡを後述す
るようにして実施し、４０５ｎｍ　で丁度２．０にの光
学密度を与える最高コンシュｆ−）希釈を測定した。

この希釈は一般に約１ニア５０であった。

への換算： 標準曲線を各測定で作成した。ＶＢ５０．１１＋ＩＪ中
精製ヒトＣ３（１〜３００　ｎｇ／ｍ／）　の２つ希釈
液を抗Ｃ３で前以って被穆しである標準穴へ２回加えた
。前以っての被覆はＰＢＳ中抗Ｃ３の５μｇ／　ｍ１４
の０．Ｌ＋ｎ／Ｖ容量を各標準穴に入れて一夜乾燥させ
ることによシ達成した。その後の各工程はＥＬＩＳＡに
関する次の記載に正確に沿って行った。４０５ノナメー
ターでの光学密度とＣ６ａ度との直線関係は３００〜５
００　ｎｇ／ｍｌのＣ５ａ度に亘っていた。

酵素固定化異種抗体イムノソルベントアッセイ：このア
ッセイは前記したＶｏｌｌｅｒ等による標準ＥＬＩＳＡ
法の変形である。微量滴定プレート中の試料穴はＰＢＳ
中５　ｍｙ　／　ｍｌ濃度のアフイニテイ精製、抗グロ
ベルジン抗体０．１ｍｌ容量で、−夜乾燥で被覆した。

次に、０．５％ＢＳＡを含むＰＢＳＱ、２ｒｎｌを各穴
に加え、各プレートを湿旧インキュベーター中で２時間
３７Ｃでインキニーベートした。この遮断用溶液を除去
したのち、０．０５％ＴＷＥＥＮ　２０を含むＰ　Ｂ　
Ｓ　（Ｐ　Ｂ　Ｓ　−Ｔｗｅｅｎ　）で一度洗浄した。

εＬＩＳＡ反応性を試験すべき試料のｐｅｓ−Ｔｗｅｅ
ｎ　−１０ミリモルεＯ丁Ａ−０，２５％ＢｓＡ（ＰＢ
Ｓ−丁ｗｅｅｎ　−ＥＤＴＡ−Ｂ　Ｓ　Ａ　）中希涙液
を０．１ｍ／容量で３つ試料穴へ入れた。１時間室温に
てロッジング（揺動かす）した後、プレートをＰ　Ｂ　
Ｓ　−Ｔｗｅｅｎで３回洗浄した。次に、ＰＢＳ−Ｔｗ
ｅｅｎ　−Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａ　−Ｂ　Ｓ　Ａ中で希釈した
抗Ｃ３抗体に結合したアルカリ性ホスファターゼの０．
１Ｍを試料穴および標準穴へ加えた。プレートを１時間
。

室温にて再びロッキングさせ、ジェタノールアミン緩衝
液中の１〜／−濃度のｐ−ニトロフェニルフォスフェー
トの０．１ｍｌを各穴中に入れたのち、Ｐ　Ｂ　Ｓ　−
Ｔｗｅｅｎで３回洗浄した。各プレートは時間変化（通
常１０〜６０分）後、コネチカット州ハンダムの口ｎｂ
ｒｏ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓによシ製造されたＴＩ
ＴＥＲＴＥにムルテイスカンホオトメーター中で４０５
ノナメーターで読み取る。上記フォトメーターはアッセ
イ試料以外のすべての反応物を含む穴に適応化されてい
る。初期発色が直線であったので、分当シの光学密度変
化を測定した。妥当なところで、これらの値を標準曲線
と比較することによりＣ３のｎｇ　／　ｍｓに換算した
。すべての実験において、別の対照は反応混合物、複合
した抗体と基負を受け入れた未被覆穴を包んでいた。妥
当なところで、これらの値を試験穴値より減じた。

変形ＥＬＩＳＡ用試験試料の一般的手順：正常ヒ　ト血
清、　２．５　ミ　リモルＭｇ＋２と　１０　ミ　リモ
ルＥＧＴＡ（古典的経路成分の参入を封鎖するために加
えられる）を含む正常ヒト血清（ＭｇＥＧＴＡ−ＮＨ３
）　、補体成分欠乏または除去面７Ｒ１またはＰＡＰ（
ＶＢＳ中の）をｖｅｓ中の活性化剤懸濁液の等容量でイ
ンキュベートした。一般に、５０μを容量を用いた。特
に断わらない限シ、Ｅ９、ＥＲ，ノイラミニダーゼ処理
εＳおよびラージ細胞をｌＸ１０８祷で用い、Ｅ、コリ
およびに、プノイモニイアをＩ　Ｘ　１　ｇ９７ｍｌで
、サイモデンを２．５η／１ｎｔで、ヒト免疫複合体を
２．０ｍ９７反で、ヘパリンを５００ユニツト／ｒｒＬ
ｌで、ＤＮＡを２０μｇ　／　ｍｔで、インフルエンザ
ウィルスを１×１０１０粒子／　ｍｌで、エプスタイン
−バールウィルスをＩ　Ｘ　１０９　粒子／　ａｔで、
モロニーロイケミアウイルスを２ｎｇ／ｄたん白質でそ
れぞれ用いた。

混合物は３７Ｃでインキュベートし、試料は間隔をおい
て採取した。動的研究よりむしろ投与応答を実施すると
きは１等容量のＭｇＥＧＴＡ−ＮＨ３と粒子（１ｘ　１
０６／ｍｅよりＩ　Ｘ　１　ｏ？　／ｍｔ）を４０分間
、３７℃で一緒にインキニーベートした。反応混合物の
試料はＰ　Ｂ　Ｓ　−Ｔｗｅｅｎ　−ＥＤＴＡ−ＢＳＡ
中で希釈し、０．１Ｍ試料を３回アッセイした。各活性
化剤に用いた希釈剤は、活性化剤の能力即ち１強度ｌに
依存していた。少量のＰとＣ３ｂを含むラージ細胞のよ
うな弱い活性化剤には１：１０〜１：２０の希釈を用い
、一方、ウサギ赤血球のような１強いＩ活性化剤には、
１：５０ないし１：１００のような高希釈を用いた。臨
床血清は１：１０に希釈した。

活性化混合物の活性化複合体をアッセイするのには、わ
ずかな変形を用いた。その変形は、血清による活性化剤
のインキニーベーシヨンの後洗浄するか（赤血球の場合
）、あるいは反応混合物の２０ｍ１アリコートを１ｏミ
リモルＥＤ丁Ａを含むＰＢＳ中２０％サクロースの３０
　（１／層を通して遠心分離すること（バクテリアまた
はサイモデンの場合）を含む。ペレットを弱い活性化剤
または強い活性化剤のそれぞれに対し多容量（即ち。

０．３−０．５ａ）または大容量（即ち、１．０〜１．
５ｍＪ）のＰ８Ｓ−Ｔｗｅｅｎ　−ＥＤＴＡ−８ＳＡ中
で再懸濁させた。３つの０．１ｍｌ試料をこの変形ＥＬ
ＩＳＡで分析した、 ある実験では、活性化混合物の上溝液も試験した。この
場合、反応混合物試料をＰ　８　Ｓ　−Ｔｗｅｅｎ−Ｅ
ＤＴＡ−ＢＳＡ中で希釈し次いでペッグマンマイクロフ
ァージ（Ｂｅｃｋｍａｎ　ｍｉｃｒｏｆｕｇｅ　）で遠
心処理した。３つの０．１Ｍ試料をこの変形ＥＬＩＳＡ
で試験した。

Ｃ３ｂ被覆赤血球へのプロベルジンの結合等容量の増加
している濃度の活性化プロベルジン゛を結合Ｃ３ｂ（Ｅ
Ｃ３ｂ）を有する赤血球（Ｖｅｓ＋＋中２．５Ｘ　１０
６／ｍｌ）で１５分間、３７℃でインキニーベートした
。次すで、細胞を洗浄し、ＶＳＳ中に再ｌケ濁し％　３
個の０．１＋Ｊ試料をＥＬＩＳＡでアッセイした。

活性吐剤上での放射標識化Ｃ３の沈着 放射標識化Ｃ６を加えたＭｇＥＧＴＡ−ＮＨ５を３７℃
で活性化剤１峰濁液の等容量でインキニーベートした。

間隔をおいて、２０μを試料を１０ミリモルＥＤＴＡを
含むＶＢＳ中２０チサクロース溶液の３００μを上に被
覆した。ペッグマンマイクロファージ（カルフォルニア
、イルビンのＢａｃｋｍａｎＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、
　Ｉｎｃ、の商標名）で５分間遠心処理したのち、チュ
ーブの先端を切断し、ペレット、上清液およびチューブ
の残シをパラカードオート−ガンマ−スペクトロメータ
ー（Ｐａｃｋａｒｄ　Ａｕｔｏ〜Ｇ　Ａ　ＭＭ　Ａ　Ｓ
ｏ　ｅ　ｃ　ｔ　ｒ　Ｑｍｅ　ｔ　Ｏｒ％イリノイ州ダ
ウンナースクラブのＰａｃｋａｒｄ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅ
ｎｔ　Ｃｏ、の商標名）で計数した。放射活性値を放射
標識化Ｃ３混合物の全Ｃ３濃度（Ｍａｎｅｌｎ１分析で
測定）と比放射活性を知ることにより活性化剤１峰濁液
のＣ３のモルに換算した。同じ反応混合物の２個の試料
を同じようにして遠心処理し、ペレットを上記したよう
にしてＥＬＩＳＡで分析した。

■、アッセイ 第１図はＣ３ＥＬＩＳＡ標準曲線を示すもので。

判っている量の精製ヒトＣ３を５０〜８０口ｎｇ／ｍｌ
に希釈し前記したように抗Ｃ３で予じめ被覆しである穴
に入れた。これは黒点・、丸○、三角Δで示される３つ
の調製物で行った。一方、Δで示されるのと同じ調製物
からの０６を未被横穴で乾燥しＸで示した。洗浄後、酵
素標識化免疫特異性抗Ｃ３抗体を加えてＥｕ１ＳＡを上
述の如くして実施した。

第１図に示すように、Ｃ５標準曲線は光学密度と０３濃
度との間で約５００〜５００　ｎｇ／ａｇのレベルで直
線関係を示した。Ｃ３検出の下限は・１０〜２０ｎｇ／
ｍＪ？　（１２ａｇ／穴）％１時間のインキュベーショ
ン後に約０．１００の光学密度を与えるレベルであった
。Ｃ３の量はヒト血清の１０−５希釈液で量（約１６　
ｎｇ　／ｍｉ　）　にオ＼よそ相当する。・、Ｃ１ムで
示す異ったＣ３調製物は極めて類似の標準曲線を示す。

他の実験（図示してない）では１判明しているＣ３含有
量の各血清試料は精製Ｃ５と実質的に同じ標準曲線を与
えた。各アッセイにおいてなされアフイニテイ梢製抗Ｐ
と酵素結合抗Ｃ６の数種の調製物に適用された〈シ返し
の標準曲線は、Ｃ３ノナグラム当シの光学密度にほんの
わずかな変化、即ち、±２０％の変化しか与えなかった
。多くのＥＬＩＳＡシステムとの比較においては、ｆレ
ートへの抗原の直接カップリングは下のＸで示す線のよ
うはるかに低い感度しか与えない。

Ｃ３の種々の形および両分を検出するためのこれらの研
究で用いた抗Ｃ３抗体の能力を試験した。

これらの実験では、精製Ｃ３，Ｃ３ｂ、Ｃ３ｂ二量体、
Ｃ３ｂ１　、Ｃ５ＣおよびＣ３ｄをＣ３に代えて標準曲
線決定に用いた。抗体は極めて類似の投与応答特性を有
するＣ３、ｃ５ｂおよびＣ３ｂ二量体を検出した。わず
かに少ない反応性がＣ３ｂＩとＣ３ｃ　で観察され（Ｃ
３での反応性の５０〜７０％）、一方抗体はわずかなＣ
３ｄＬか検出しなかった（Ｃ３の同じ量で得る光学密度
の約１０％）。

多くの異なるタイプの実験を、変形ＥＬＩＳＡの必要性
を確認するために、また変形ＥＬＩＳ＾が第二経路の活
性化により生じたＣ３ｂとプロベルノン沈着を特別に測
定することを示すために実施した。ＥＬＩＳＡにおける
反応性に対してのＣ３ｂとプロベルジン両方の同じ粒子
上τの必要性を示すため、Ｃ３ｂ含有ＥＳ　を変化量の
性活化プロベルソンと反応させた。洗浄後、細胞をＥＬ
ＩＳＡ中で試験した。第２図に示すように、ＥＬＩＳＡ
での反応性１’ｔＥＣ３ｂ細胞に加えられたブロイルジ
ンの量に該細胞がブロイルジンで飽和する点での反応性
の平坦化まで相関していた。

また、第二経路のたん白質の必要性を第二経路活性化剤
、Ｅ、コーリ０４を正常血清、Ｃ３除去血清、Ｃ３を除
去し精製Ｃ５の生理学量で再構成した血清、因子Ｂ除去
血清、および因子Ｂ全除去し精製日の生理学量で再構成
した血清に加えることにより確認した。インキュベーシ
ョン後、各反応混合物を希釈しＥＬＩＳＡで試験した。

しかしながら、反応性は欠損成分の再構成後に回復した
。

他の実験では、抗Ｃ５結合または抗Ｐ被覆の各プレート
を過剰の精製Ｃ３または生のＰ　（ＥＤＴＡ血清）でそ
れぞれ前取って中和してＥＬＩＳＡ反応性を滅失させた
。また、微量滴定穴へυ■える前に過剰の抗Ｐで予めイ
ンキュベートした血清−活性他剤反応混合物（Ｅ、コー
リ０４）はＥＬＩＳＡ中で反応しなかった（図示せず）
。

次の一連の実験は、第二活性化経路の完全性がＥＬＩＳ
Ａ中での反応性に必要かどうかを決定する目的でなされ
た。ＥＲとサイモザン′ｊｋＣ２欠乏血ＭｇＥＧＴＡ−
Ｎ＋−１ｓ　（即ち、古典的経路で必要なカルシウムを
欠く）は再活性化剤で十分なＥＬＩＳＡ反応性を示した
が、ＥＤＴＡ−ＮＨ３（両経路で必要なマグネシウムを
欠く）は示さなかった。比較試験において、Ｃ４除去血
清とＭｇＥＧＴＡ＝ＮＨ８がＥＲとＥ、コーリに、１２
とで十分な必要性を示した（図示せず）。同様に、Ｃ２
欠乏血清と正常血清はサイモザンとの反応後、匹敵する
ＥＬＩＳＡ値を与えた。ＥＤＴＡは一定してＥＬＩＳＡ
反応性を滅失させた。ＥＳ、即ち非活性化剤は血清中で
のインキュベーション後のＥＬ　Ｉ　ＳＡ反応性を生じ
るのに失敗した。

・１１０の試みでハ、ノイラミニダーゼでのＥＳの処理
効果、Ｅｓ　ｅ第二経路活性への転花する公知の手順を
試験した。’　Ｐａｎｇｂｕｒｎ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐ
ｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、７５　：　２４
１６（１９７８１’を参照されたし。未処理ＥＳおよび
ノイラミニダーゼ処理ＥＳをＭｇＥＧＴＡ−ＮＨ３でイ
ンキュベートし、周期的に試料をサクロースクッション
上に層化し遠心した。ＥＳベレットはＥＬＩＳＡ反応性
を試験した。第５図に示すように、ノイラミニダーゼ処
理はＥＳ（・で示す）（ｉ７ＥＬＩｓＡ中で反応性にし
、未処理ＥＳ　（○で示す）は反応しなかった。最適Ｃ
３ｂ結合はノイラミニダーゼ処理ＥＳＯＭｇＥＧＴＡ−
ＮＨ３でのインキュベーションの１５分後に観察され細
胞の第二経路活性化剤への変換を確認した。

２種の第二経路活性化剤ＥＱとに、ジノイモニア、およ
び非活性化剤Ｅｓを放射標識化Ｃ３を含むＭｇＥＧＴＡ
−ＮＨ８でインキュベートした。反応混合物の複数試料
を間隔をおいて採取しサクロースクッション上に層化し
、遠心処理し、得られたペレットを変形ＥＬＩＳＡ反応
性と放射標識化Ｃａｂ結合について試験した。値は粒子
当りのＣ３ｂ分子として表わした。

第６図で示すように、変形ＥＬＩＳＡと放射標識化Ｃ３
ｂ沈着による第二経路活性の測定は平行な力学的挙動を
示した。上のこの曲線は、ＥＲについて、−で示す放射
標識化Ｃ３測定と口で示す変形ＥＬＩＳＡで得たもので
ある。中程の２つの曲線は、Ｋ、ブノイモニイアについ
て、・で示す放射標識化Ｃ３測定と○で示すＥＬＩＳＡ
の結果で得た。下の各曲線は、ＥＳについて、ムで示す
放射標識化Ｃ６測定と△で示すＥＬＩＳＡ結果で得た、 ２つの方法で測定した粒子当りの分子の数は同じようで
あった。両方法は数種のグラム陰性菌およびノイラミニ
ダーゼ処理εＳを含む他の活性化剤でも匹敵する平行結
果を与えた（図示せず）。

Ｅ３は下の各曲線で示すように非反応性であった。

ＥＲ，に−グツイモニアおよびＥ３を精製第二経路たん
白質（ＰＡＰ　）およびＭｇＥＧＴＡ−ＮＨ８とでイン
キュベートした。周期的に得た複数試料をサクロースを
介して遠心処理し、ペレットをＥＬＩＳＡで分析した。

値は前述したようにして０３分子／粒子に換算した 第７図の上の２つの曲線は、ウサギ赤鹿球ＥＲについて
０で示すＭｇＥＤＴＡ−ＮＨ３を含む溶液中の活性化剤
としておよび拳で示すＰＡＰとして得た。中部の２つの
曲線は、に、プ、、／　４イエモニイアについて、Δで
示すＭｇＥＧＴＡ−ＮＨ３溶液中の活性化剤としておよ
びムで示すＰＡＰとして得た。下の曲線は、羊赤血球Ｅ
Ｓ　について口で示すＭｇ　ＥＧＴ　Ａ−ＮＨ５溶液中
の活性化剤としておよび−で示すＰＡＰとして得た。

第７図で理解できるように、第二経路の２種の源は平行
な力学的特性を示した・ＰＡＰは活性化剤ＥＲによって
けＭｇＥＤＴＡ−ＮＨ３よりも幾分高い値を示すが、こ
の関係はに、デト１季（モニイアでは逆転していた。Ｅ
８　はｂずれの第二経路源でもＥＬＩＳＡ中で反応性で
なかった。

第二経路変形ＥＬＩＳＡのパラメーター二投与応答実験
を変化数のＥＲとに、デフ１イーＬモーニイアで行った
。一定量のＭｇＥＧＴＡ−ＮＨＳで１０分間（ＥＲ）ま
たは２０分間（に、デノイモニイア）インキュベートし
た後、混合物を希釈し、各アリコートをＥＬＩＳＡ中で
アッセイした。第８図に示すように、・で示すＥＲとＯ
で示すに、デノイモニイアについて、ＥＬＩＳＡ反応性
は投与量に依存した。ＭｇＥＤＴＡ−ＮＨ３での反応力
学上の異なる量の活性化剤の影響も試験した。数種の濃
度のＥＲ（１０，１０および１０／ｄ）　を一定量の−
ＭｇＥＧＴＡ−ＮＨ９でインキュベートした。間隔をお
いて採取した試料を希釈し、各アリコートＥＬＩＳＡ反
応性について試験した。得られた曲線群は平行であり５
分でピークの反応性を示しその後次第に降下した（図示
せず）。

第二経路活性化で産生したＥＬＩＳＡ反応性複合体の安
定性も試験した。ＭｇＥＧＴＡ−ＮＨ９をサイモザンで
１時間、３７℃でインキュベートした。

次の２４時間に亘って間隔をおいて採取した試料を希釈
しＥＬＩＳＡで試験した。１時間点では、３００ｎｇ／
−のｃ３ｂを検出した・反応性は２４時間に亘って％　
１．２！５憾／時間の割合で一灰運動で極めてゆっくり
降下した。

同時Ｃ６溶血測定も実施した。１時間点で、血清中の溶
血活性Ｃ３は初期の値の３０係へ落ち。

その後Ｃ５溶血活性は一次運動でもって約２．５係／時
間の速度で降下し念。

同様な実験において、数時間、３７℃で単独でインキニ
ーベートした血清はＥＬＩＳＡ中で反応性となった。血
清Ｃ６のほんのわずかな割合（０，００７＝Ｊｔ）が最
高反応時間（６時間）でこの自然活性化反応に保った。

この時間のあとは。

反応性は１　、２５％／時間の速度で一次運動的に消失
した。自然活性化反応中のＣ３溶血機能は２．５１／時
間の速度で一次運動的に消失した。

強、中、弱の各第二経路活性化剤による活性化力学の測
定： 活性化力学を釦、　ＥＳ、ラージ細胞およびＫ。

デノイモニイアについて測定した。各粒子をＭｇＥＧＴ
Ａ−ＮＨ８でインキユーペートシ、各混合物を間隔をお
いてサンプリングし、希釈し、各アリニー）’ｉｉＥ　
Ｌ　Ｉ　ＳＡ中で試験した。第９図に示すように、ピー
クの反応性は、・で示されるＥＲにおいては５〜１０分
で、０で示されるに、グノイモニイアについては１５〜
２０分でΔで示されるラージ細胞については６０分以上
で、それぞれあった。側で示されるＥ３は反応性はなか
ったＯ第二経路変形ＥＬＩＳＡの適用と利用 とのＥＬＩＳＡの大きい感度は、他の方法では容易に定
量されない極めて小量の第二経路活性化の研究を可能に
する。例えば、上記ＥＬＩＳＡはウィルス程度の小さい
粒子による第二経路活性化を検出するのに使用できる。

本実験では、ニゲスタイン−パール、インフルエンザお
よびモロニイロイケミアの各ウィルスを正常ヒト血清（
ＮＨ８）かＭｇＥＧＴＡ−ＮＨＳでインキュベートした
。３７℃で２０分経過後、各混合物を希釈し、各アリコ
ートを上記ＥＬＩＳＡ中で試験した。３種のウィルスは
すべて第二経路ｆＭｇＥＧＴＡ−ＮＨ８でのイア’Ｆユ
ーベーション後のＥＬＩＳＡ反応性の産生で示されるよ
うに活性化した。結果は第１表に示す。

第１表 ＮＨＳ　Ｍ　ＥＣＴ八−ＮＨＳ エプスタイン−バールウィルス　３０１（２０００）※
　１４２（５００）インフルエンザ　１００（５００）
　４５（２００）ＷＳ／３３ウイルス モロニイロイケミアウイルス　１５６　５８ウシ胸腺Ｄ
ＮＡ　１００　７３ サイモザン（１：２血清）　１９３　１８７＃　（１：
８血清）　１２４　３ 免疫複合体（１：２血清）　１００　８８１　（１：８
血清）　４２　０ ヘパリン　５７ Ｅ　Ａ　１２　１０ ※括弧内の値は結合Ｃ＋ｂ分子／ピリオンを示す。

※※前記で示した濃度、変形ＥＬＩＳＡでの試験用試料
の一般的手順を参照のこと 上記ＥＬＩＳＡを用いて第二経路の反応機構を分析する
こともできる。例えば、本発明において、ＥＬＩＳＡ反
応性がある種の古典的経路活性化剤により古典的経路の
活性化に対して二次的に発生することを観察している。

ただし、他の種類の活性剤では見られない。例えば、非
免疫古典的経路活性剤、モロニイロイケミアウイルスと
ＤＮＡとは正常血清中でのインキュベーション後にＥＬ
ＩＳＡ中の反応性で明らかに示されるようにゾロベルノ
ン補充によって増幅ルーｆｔ−活性化した（第１表）。

また、ゾロベルノン補充により古典的経路活性化が第二
経路活性化に至ることも、血清を最初希釈して第二経路
の反応性を滅失させた場合に、サイモザンおよびヒト免
疫複合体を加えることにより示された（第１表）。正常
血清でインキニーベートした赤血球アンポセプター（Ｅ
Ａ）およびヘパリンの如き他の古典的経路活性化剤は第
二経路を補充しなかった（第１’Ｒ）ｏモロニイロイケ
ミアウイルス、ＤＮＡ、サイモザン、免疫複合体、ＥＡ
およびヘパリンによる古典的経路反応性はこれらの研究
で別個に証明されたものである。

変形ＥＬＩＳＡによる臨床血清の第二経路活性化の検出
二 上記ＥＬＩＳＡ反応性複合体の安全性は上記ＥＬＩＳＡ
を臨床血清の試験に用いることを可能圧する。全身性エ
リトマト−デス（ＳＬＥ）の１゜検体よシの血清は％第
１ａ図で示〈如く１反応性もなく第二経路ＥＬＩＳＡ中
でわずかに１覗られた反応性しかなかった。図中の各横
棒は平均値を示す。

又、次の第２表も参照されたい。しかしながら、成人呼
吸困難症候群（ＡＲＤＳ　）、チグス熱およびマラリア
の各患者から試験した血清の多くは１窮性で、ＡＲＤＳ
患者は高い水邸を示している。

第２表 ヒト血清のＥＬＩＳＡ反応性 正常ヒト血清（２０個体）０−１０ ＳＬＥ患者よりの血清 １　１０ ２　１２ ５　１０ ４　１１ ５　１７ μ、ＲＤＳ患者よりの血清 １　５５ ２　４５ ３　７５ ４　１３ ５　５７ ６　３９ ７　８８ ８　４４ ９　６８ １０　２６ チプス熱患者よりの血清 １　３６ ２　２９ ３　１２ ４　５０ ５　３６ ．６　１３ ７　３２ ８　２８ ９　３２ １０　５８ マラリア患者よυの血清 １　５４ ２　５１ ９ ４　４７ ５　１９ 前述した研究はヒト血清中の第二補体経路の活性化の検
出と定量のための新規で、物界な高感度のＥＬＩＳＡ’
ｉ開示し有効にするものである。第二経路ＥＬＩＳＡ中
の反応性は同じ活性化用粒子または複合体上のプロベル
ジンと０６誘導体の２つの存在による。第二経路とマグ
ネシウムの一体性もまたＥＬＩＳＡ反応性に必要であっ
た（第２〜４図）。

変形Ｅ　ＬＩ　ＳＡを有効にする一連研究において。

ＥＳ　はノイラミニダーゼでの処理によって第二経路活
性化剤に転化したしく第５図）、変形ＥＬＩＳＡで評価
した第二経路活性化力学は放射梯識化ｃａｂの活性化、
沈着を測定するのに用いた他の技法のそれと等しかった
（第６図）。２つの方法で測定した結合ｃ３ｂ分子の数
も変形ＥＬＩＳＡ値の方がわずかに低かったけれども同
じようであった。この差異は、有意なものとは考えられ
ず、他の説明もできることであるが活性化剛結合Ｃ３ｂ
のあるものの酵素穆識化抗Ｃ３への近づき難さに基づい
ているようである。

他の研究においては、変形Ｅ　ＬＩ　ＳＡをＭｒＥＧＴ
Ａ−ＮＨ３，！：ＰＡＰ　を第二経路源として比較する
のに用いた。２つの第二経路たん白質源は数種の活性化
剤により同一の活性化力学全所み出した（第７図）。し
かしながら、結合ｃ３ｂ分子の数における差異を検出し
た。即ち、活性化剤としてＥＲを用いたとき、変形ＥＬ
ＩＳＡはＭ　ｙ　Ｅ　Ｇ　Ｔ　Ａ　−Ｎ　ＨＳに比べて
ＰＡＰを用いたときに多くの結合ｃ３ｓ分子／ａ胞を検
出したが、活性化剤としてに、ｆノイモニイアを用いた
ときは逆転していた。

また、変形ＥＬＩＳＡにより検出した最高反応性時間は
活性化の別個の測定、制限係数（Ｒ，１，）によって評
価したように第二経路活性化剤の強さに相関していた。

’　Ｐａｎｇｂｕｒｎ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ−Ｎ
ａｔｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃ１．　ＵＳＡ、、７５　：　２４１６
　（１９７８）’を参照されたい。Ｒｏｌ、は放射標識
化たん白質によるあるモデルシステムで試験したときの
結合因子Ｈの結合Ｃ３ｂ分子に対する比を示す。従って
ＲｏＩは活性化複合体の逆測定である。

かくして、約０．１のＲ９１，を有するＥＲのような強
力活性化剤は急速な運動性を与えＥＬＩＳＡにオケるピ
ークの反応性はインキューベションの５〜１０分後に生
じた。約０．３のＲ−１，ｆｔ有するＥ、コーリ０４．
に、１ノイモニイアおよびノイラミニダーゼ処理Ｅｓ　
のような中程度の活性化剤はＥ　ＬＩ　ＳＡ中で中間の
運動性を示し、ピーク反応性はインキューベージ曲ンの
１５〜３０分後に生じた・約０．６のＲ，１，ｉ有する
ラージ細胞のような弱い活性化剤はインキュベーション
後３０分でピーク反応性を示した。幾分長い時間（６〜
８時間）が〃自然Ｉ活性化反応によりピーク反応性に到
着するのに必要であった・ 本発明の変形ＥＬＩＳＡは他の第二経路活性化アッセイ
よりも著しい利点を提供する。例えば、ＥＱ　の分解を
介した第二経路は、該経路の残留機能活性？測定するも
ので活性化を測定しなり０分解は膜攻撃経路の完全性亨
基づく二次的事柄である。個々のたん白質量、メ化生成
物の測定に基づｊぐかあるいは経路の機能的完全性の評
価に基づくある他の試みは活性化が生じた証拠を示すこ
とはできるが、これらの試験は活性化を直接測定するも
のでない。

活性化を直接検出し定損する唯一の面婁的に利用できる
方法は放射標識化したブロイルジン、Ｃ３ｂ、因子８．
因子Ｈまたはこれらの組合せ物の活性化剤への結合に依
っている。ＥＬＩＳＡは機能的に活性な放射標識化の形
で精製たん白質を必要としないような試験に比し大きな
利点を有する。

このようなアッセイはまた十分な量の放射活性を定量測
定に結合せんがためにかなり大量の活性他剤粒子を必要
とする。このことは、放射標識をそのような条件下で大
量の未標識化成分で希釈するときに放射標識化成分ケ加
える血清において特に事実である。

本発明の変形Ｅ　ＬＩ　Ｓ八は多くの他の利点を有する
。利点の１つとして大きい感度がある。例えば、１Ｏ−
２０ｎｆ／ｍＪの、活性化削土にブロイルジンと一緒に
沈着したＣ３ｂを第１図に示すように容易に測定できる
。この値は血清中のＣ３の約０−００１５係に相当する
。この大きい感度は以前には検出できなかった小程度の
第二経路活性化の分析ｋ　ＯＴ　節にする。即ち、ｌ自
然ｌ活性化を定量でき研究できるのである。大きいｇ度
はまたウィルスのようなほんの限られた量でしか入手で
きない活性化剤ないし粒子による第二経路活性化の研究
を初めて可能にする（第１表）。

大量い感度は酵素イムノアッセイの木質的な性質であり
、その多くはこの点でラジオイムノアッセイに匹敵する
ものである。このことは本発明のシステムで特に事実で
ある。変形ＥＬＩＳＡは抗体を活性化複合体の２種の界
なった構成たん白質に使用する。これは無視できる背後
の反応性と結合した極端な物界性を与える。この点に関
して＃ｊ。

少量の発色さえも有意なものである。

本発明の変形ＥＬＩＳＡによる研究は第二経路の反応機
構の複雑性を解明するもので、一層の研究に貢献する。

例えば、種々のウィルス、ＤＮＡ％サイモザン、および
免疫接合体を包含する数種の活性化剤は古典的経路を活
性化してブロイルジンの補充による増幅ループを二次的
に活性化する。

対照的に、ＥＡおよびヘノやリンの如き他の古典的経路
活性化剤は増幅ループを活性化しない。さらに別の例は
サイモザンおよびに、ｆノイモニイアのようなある種の
活性化剤によりＪｒｎ清の混合物の上清液に極めて安定
なＥＬＩＳＡ反応性複合体が現出することであり、これ
はＥＲのような他の活性化剤では見られない。Ｃ５およ
びＰ決定基を含む複合体の木質は知られていない。恐ら
く、ρ、ｃ３ｂ複合体が活性化剤から溶離するか、活性
化剤の両分に付着するか、あるいは上清液中のｃ３ｂと
直接作用する能力を有する活性化Ｐを溶離するかであろ
う。

本発明のＥＬＩＳＡは臨床使用に極めて適している。ゾ
ロイルジンと０３に必要な抗血清は商業的に入手可能で
ある。抗血清のアフィニティ精製はプロベルジンと０３
を単離することなく達成できる。この目的全達成する幾
つかの方法の１つは各抗体を正常血清と予じめ反応させ
たサイモザンに吸゛着させ、次いで溶離とスタフィロコ
ッカスアウレウスたん白質へり゛ロマトグラフィーを行
うことである。

本発明の第二経路ＥＬＩＳＡのさらに別の利点は。

該εＬＩＳＡを利用してすでに起った活性化？検出し定
量できることである。なぜならば、ゾロイルジンとＣ６
含有の複合体が非常に安定だからである。このことは第
２表および第１０図に示すように臨床血清での上記ＥＬ
ＩＳＡの使用を可能にする。

即ち、治療中の患者の逆行を治療期間中に観察した第二
経路活性化の奇により測定できる。その利用は該アッセ
イで測定したｃ３ｂ、ｐ　複合体の安定性によりさらに
拡大する。即ち、貯蔵した血清または血漿および最適榮
件以下の条件で集めた試料を研究できる。

ＳＬＥ、＠者よりの血清は陰性で第二経路ＥＬＩＳＡで
きりぎりの反応性しかないけれども、同じ血清は著しｂ
古典的経路活性化の証拠を示した（著しく　ＣＨ５０量
を減少した）０この発見は免疫複合体の最初の役割とＳ
ＬＥ中の古典的経路の普通の概念に従っている。’　Ａ
ｇｕａｄｏ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｃｌ１ｎ。

Ｅｘｐ、　１’、ｍｍｕｎｏｌ、、　４２　：　４９５
−５０５（１９８０）”を参照されたい。

チプス熱とマラリアの患者からの血清のいくつかは第二
経路ＥＬＩＳＡで中程度の反応性であったが、ほかの血
清は反応性でなかった。最近発展した古典的経路ＥＬ？
ＳＡを使用して同じ試料で並行して行った研究はチグス
熱試料の全部およびマラリア試料の数種を示し、著しい
Ｃ１活性化の証拠を有していた。＃　Ｈａｒｐｅｌ　ａ
ｔ　ｏｆ、、　Ｃ目ｎ、　ＲｅＳ、。

３０：５６３Ａｒ１９８ｍ）”を参照されたい。

ＡＲＤＳ患者からの１０血清の殆んどは第二経路活性で
全く□反応性であった。対照的に、古典的経路ＥＬＩＳ
Ａではこれら血清の８つが陰性で、２つがわずかにぎり
ぎりの反応性を示した。ＡＲＤＳ血清によるこれらの発
見はこの傑作では第二経路が複雑であることを示すこと
による。

以上の記載は本発明の例示として述べて来たもので、何
らそれに限定するものでない。多くの変形と修正が本発
明の新規な概念の真の精神と範囲を離れることなくなす
ことができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は標準対照として用いるＣ３調製物のＥ　Ｌ　Ｉ
　Ｓ　Ａ　？Ｔ１１１定を示すグラフである。トッド・
、九〇三角Δで示した精製ヒトＣ３の５種の調製物を５
０〜８００■／ｄに希釈し、抗−Ｃ６で予じめ′＠棲し
た穴に入れた。Ｃ３はＸで示した未被覆穴に入れ乾燥し
た。洗浄後、酵素−標識化免疫特異性抗−０６を添加し
次いで酵素基質を加えた。酵素−基質反応で生じた光吸
収ｆ：ｌｌｌ１１定しグロットした。 第２図はＥＬＩＳＡ中の反応性に対する同じ粒子上での
Ｃ３ｂとプロベルジンの必要性を示すグラフである。変
化量の活性化ゾロベルジンをＥＣ５ｂでインキニーベー
トした。洗浄後、細胞をＥＬＩＳＡ反応性について試験
した。 第６図はＥＬＩＳＡ反応性に対するＣ３と因子Ｂの必要
性を示すチャート図である。Ｅ、コーリ口４を正常血清
、Ｃ６除去血清、再構成Ｃ６除去血清、因子Ｂ除去血清
および再構成因子Ｂ除去ｎｕ清でインキニーベートした
。反応混合物を次いで希釈し各アリニー）’ｅＥＬｌｓ
Ａ中の反応性について試験した。 第４図は第二活性化経路のＥＬＩＳＡ反応性についての
必要性を示すチャート図である。ＥＲ／、サイモザンま
たはＥＳ　を正常血清％Ｃ２欠乏ヒト血清、ＭｇＥＧＴ
ＡまたはＥＤＴＡ−ＮＨ５でインキニーベートした。次
いで、混合物を希釈しＥＬＩＳＡにおいて試験した。 第５図はノイラミダーゼで処理することによりＥｓ　の
第二経路活性剤への転化の効果を示すグラフである。○
印で示したＥ３　と・で示したノイラミダーゼ処理Ｅｓ
はＭｇＥＧＴＡ　−Ｎ　ＨＳ　でインキニーベートした
ものである。各試料は間隔をおりて採取し、サクロース
のクッションを介して遠心処理した。得られた細胞ベレ
ットを再懸濁させＥＬＩＳＡ中で試験した。測定した光
学密度を第１図で示したＣ３標準曲線と比較することよ
り結合ｃ３ｂ分子／細胞に換算したものである。 第６図は放射標識化Ｃ３ｂの沈着を測定することによっ
てＥＬＩＳＡの比較を示すグラフである。 ＥＲ，に、７’ノイエモニイアお□よびＥｓヲ放射標識
化Ｃ３を含むＭｇＥＧＴＡ−ＮＨ９でインキニーベート
した。間隔をおいて採取した各試料をサクロースクッシ
ョン上に置き遠心処理した。得られたイレツ）　’ｋ　
（ａ）放射活性について、再懸ｆ４後％（ｂ）ＥＬＩＳ
Ａによシアッセイした。値を本文中の材料と方法につい
ての説明で述べたよりなＣ３ｂ／粒子に換算した。上部
の二つの曲線は、ＥＲについて、爾印で示した放射標識
化Ｃ５測定結果と口で示したＥＬＩＳＡの結果で得たも
のである。真中の２つの曲線は、　Ｅ、　ｆノイエモニ
イアについて、・で示す放射標識化Ｃ３測定結果とＯで
示すＥＬＩＳＡの結果で得たものである。また、下の曲
線は、ＥＳ　について、ムで示す放射標識化Ｃ６測定結
果とΔで示すＥＬＩＳＡの結果で得たものである。 第７図はＭｇＥＧＴＡ−ＮＨ８とＰＡＰとを比較するＥ
ＬＩＳＡの使用を示すグラフである。ＥＲ／。 に、デノイエモニイアおよびＥＳ　をＭｇＥＧＴＡ−Ｎ
Ｈ８とＰＡＰとでインキニーベートする。各試料を間隔
をおいて採取し遠心処理し、得られたペレットを再懸濁
してＥＬＩＳＡ中でアッセイした。上の２つの曲線は、
活性剤としてのＥＲについて、Ｏで示したＭｇＥＧＴＡ
−ＮＨ８の結果と・で示すＰＡ３の結果で得たものであ
る。中央の２つの曲線は、Ｋ、デノイエモニイアについ
て、Δで示すＭｇＥＧＴＡ−ＮＨ３の結果と＾で示すＰ
ＡＰの結果で得たものである。下の曲線は、Ｅｓ　につ
いて、口で示すＭｇＥＧＴＡ−、ＮＨ３と−で示すＰＡ
Ｐの結果で得たものである。 第８図は活性剤投与とＥＬＩＳＡ中の反応性との関連を
示すグラフである。変化数のＥＲとに、デノイエモニイ
アをＭｇＥＧＴＡ−ＮＨ５でインキニーベートした。１
０分後と２０分後、ＥＲとに、デノイエモニイアのそれ
ぞれについて、各混合物を希釈し６了りニー）ｔ−ＥＬ
ＩｓＡで試験した。ＥＲの結果は・で示し％　Ｋ、プノ
イエモニイアの結果はＯで示す。 第９図は活性化剤とＥＬＩＳＡ中のピーク反応性の時間
との関連を示すグラフである。ＥＲ、に。 グツイエモニアとラージ細胞’ｉＭｇＥＧＴＡ−ＮＨ９
でインキニーベートした。各試料を間隔をおいて採取し
、希釈し、各アリコートをＥＬＩＳＡで試験した。ＥＲ
の結果は・で示し、に、グツイエモニアの結果は０で示
し、ラージ細胞の結果はムで示し％　ＥＳ　の結果は−
で示した。 第１０図は臨床血清の試験結果を示すグラフである。Ｓ
ＬＥ、ＡＲ’ＤＳ、腸チグろ熱またはマラリアの診断患
者からの血清または面漿試料を希釈しＥＬＩＳＡ中で試
験した。水平のバーが各タイプの試料についての平均値
を示す。 第１１図は複数の穴を有する微量滴定プレートの透視図
である。 第１２図は一般に面１２−１２に沿って切った第１１図
のプレートの穴の一つを拡大した断面図を示す。 Ｑ％’ｌ　（ｍｌｎ、ａｔ　３７’Ｃ１１問（ｍｉｎ、
ａｔ３７・Ｃ） 籾手１ｍ１

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）　第一補体成分および第二補体成分からなる補体
   系の活性化複合体のアッセイ方法であって、該アッセイ
   方法は試料上で実施され、かつ第一の特異性結合剤を試
   料中に存在する上記複合体の一部を構成する任意の第一
   補体成分に結合させること； 第二の特異性結合剤を上記複合体の一部を構成する任意
   の第二補体成分と結合させること、上記第二特異性結合
   剤は標識を含んでおシ、上記複合体に結合し７’（第一
   と第二特異性結合剤が集塊を形成するとと： および、 上記集塊の一部として結合した標識の存在を測定するこ
   と： の各段階からなるアッセイ方法。 □ （２）第一補体成分と第二補体成分のいずれかがブロイ
   ルジンである特許請求の範囲第ｆｉ１項記載のアッセイ
   方法・ （３〕　相応する特異性結合剤が抗−プロイルジン抗体
   を含んでいる特許請求の範囲第（２）項記載のアッセイ
   方法。 （４）第１補体成分か＠２補体成分のいずれかがｃ３ｂ
   である特許請求の範囲第（１１項記載のアッセイ方法。 （５）　対応する特異性結合剤が抗−Ｃ３ｂ抗体を含む
   特許請求の範囲第（４）項記載のアッセイ方法・（６）
   　集塊から、集塊の一部として結合している標識の存在
   ｔ−測測定る前に、集塊の一部を構成していない任意の
   第二特異性結合剤を分離する追加の工程を含む特許請求
   の範囲第１１１項記載のアッセイ方法。 （７）　第一特異性結合剤を特徴とする特許請求の範囲
   第（６）項記載のアッセイ方法・ （８）　試料を最初固定化第一特異性結合剤と接触させ
   、該第−特異性結合剤と結合していない試料を、第二特
   異性結合剤を複合体に結合させる前に、除去する特許請
   求の範囲第（７）項記載のアッセイ方法。 （９）第一特異性結合剤を分離手段とカップリングさせ
   、集塊の一部を構成していない第二特異性結合剤から集
   塊の分離を向上させる特許請求の範囲第（６）項記載の
   アッセイ方法。 ＋１（Ｉ　標識が酵素であり、第一特異性結合剤を固定
   して酵素固定化イムノソーペントアッセイを形成する特
   許請求の範囲第ｆｉ１項記載のアッセイ方法・ ａη　予じめ測った量の試料を用い集塊に結合した標識
   含有第二特異性結合剤の量を測定する特許請求の範囲第
   （１）項記載のアッセイ方法。 ＠　体液中の補体系活性化を定量するためのアッセイ方
   法にかいて、 （ａ）　予じめ測った量の体液を第一補体成分に対し特
   異性の固定化第一抗体と接触させてｇ　−抗体が第二袖
   体成分を含む活性化複合体の一部を形成する体液中に存
   在する任意の第一補体成分と結合するようにし、体液中
   の上記活性化複合体の存在が補体系の活性化を示すこと
   ： （ｂ）　上記複合体全標識に結合しかつ第二補体成分に
   対し特異性の第二抗体と接触させて、第二抗体が複合体
   の一部′ｆ：構成する第二補体成分と結合して複合体に
   標識を結合するようにすること： （Ｃ）　複合体に結合していない標識を除去すること： および、 （ｄ）　複合体に結合した標識の量を室料すること二の
   各段ｙｆｉｔ−含む上記アッセイ方法。 ＯＪ　体液′（ｉ−第一抗体と接触させる７ｊ＋、ｒに
   、複合体を第二抗体と接触させる特許請求の範囲ボ１１
   ２１埴記載のアッセイ方法。 ０４　刊っている量の、第一抗体とは別に固定化した第
   二袖体成分を調製し、固定化第二イ（上体成分を標識に
   結合している別の量の４二抗体と接触させて第二抗体が
   固定化第二袖体成分と結合するようにすること、固定化
   第二補体成分に結合している標識の量を、参照標獲とし
   て測定するとと：卦よび複合体に結合した標識結合第二
   抗体の量を参照標辿の標識の測足量と比較することの各
   段階をさらに含む特許請求の範囲第０２項記載のアッセ
   イ方法。 （イ）　試料中の＠１補体成分と第二袖体成分を含す補
   体系の活性化複合体の存在をｎ１１］定する診断用アッ
   セイシステムであって、キット形状の肖（ａ）　第一補
   体成分に対して特異性の第一特異性結合剤： （ｂ）　第二補体成分に対して特異性でかつ標識を含む
   第二特異性結合剤： からなり、第一および第二特異性結合剤が複合体と個々
   に結合して複合体と集塊全形成し、かぐして形成した集
   塊が集塊の一部でない任意の第二筒・異性結合剤から分
   離出来るようにする上記アッセイシステム。 ００　（ａ）　補体系の活性化を示すことができ、かつ
   第一補体成分と第二補体成分とからなる活性化複合体： （ｂ）　上記複合体中の第一補体成分に結合している第
   一％、異性結合剤： および （ｃ）　上記被合体中の第二補体成分に結合している標
   識を含む第二特異性結合剤とからなるアッセイ方法に用
   いる集塊。