JP3440852B2 - ハイブリドーマ、モノクローナル抗体、測定方法及び免疫測定試薬 - Google Patents
ハイブリドーマ、モノクローナル抗体、測定方法及び免疫測定試薬Info
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、アポ蛋白の１種で
あるアポＢ−４８（ＡｐｏＢ−４８）を特異的に認識す
るモノクローナル抗体、これを産生するハイブリドー
マ、これを利用するアポＢ−４８及び／又はアポＢ−４
８含有リポ蛋白の測定に関する。アポＢ−４８は、ヒト
血中にあって高脂血症と密接に関連しているリポ蛋白の
構成蛋白であり、その測定は、高脂血症や動脈硬化症の
診断及び治療に有用である。
あるアポＢ−４８（ＡｐｏＢ−４８）を特異的に認識す
るモノクローナル抗体、これを産生するハイブリドー
マ、これを利用するアポＢ−４８及び／又はアポＢ−４
８含有リポ蛋白の測定に関する。アポＢ−４８は、ヒト
血中にあって高脂血症と密接に関連しているリポ蛋白の
構成蛋白であり、その測定は、高脂血症や動脈硬化症の
診断及び治療に有用である。
【０００２】
【従来の技術】動脈硬化症は、典型的な現代病の一つと
して、その効果的な診断法及び治療法の確立が待望され
ている。動脈硬化症の病因の一つとして、体内を循環す
る血液中に存在するリポ蛋白のうち、血管内壁へのコレ
ステロールの沈着を促進する種々のリポ蛋白が増加し、
又は、当該コレステロールの沈着を防止する種々のリポ
蛋白が減少することが挙げられている。そこで、これら
のリポ蛋白の血中量を測定し、高脂血症や動脈硬化症の
診断及び治療に役立てることが望まれている。
して、その効果的な診断法及び治療法の確立が待望され
ている。動脈硬化症の病因の一つとして、体内を循環す
る血液中に存在するリポ蛋白のうち、血管内壁へのコレ
ステロールの沈着を促進する種々のリポ蛋白が増加し、
又は、当該コレステロールの沈着を防止する種々のリポ
蛋白が減少することが挙げられている。そこで、これら
のリポ蛋白の血中量を測定し、高脂血症や動脈硬化症の
診断及び治療に役立てることが望まれている。
【０００３】高脂血症に関与する代表的なリポ蛋白とし
ては、カイロミクロン（ＣＭ）、ＣＭの血中での中間代
謝産物であるカイロミクロンレムナント（ＣＭレムナン
ト）、超低比重リポ蛋白（ＶＬＤＬ）、ＶＬＤＬの血中
での中間代謝産物である超低比重リポ蛋白レムナント
（ＶＬＤＬレムナント）、低比重リポ蛋白（ＬＤＬ）、
高比重リポ蛋白（ＨＤＬ）等が知られている。
ては、カイロミクロン（ＣＭ）、ＣＭの血中での中間代
謝産物であるカイロミクロンレムナント（ＣＭレムナン
ト）、超低比重リポ蛋白（ＶＬＤＬ）、ＶＬＤＬの血中
での中間代謝産物である超低比重リポ蛋白レムナント
（ＶＬＤＬレムナント）、低比重リポ蛋白（ＬＤＬ）、
高比重リポ蛋白（ＨＤＬ）等が知られている。
【０００４】脂質代謝の面からは、例えば、ＣＭレムナ
ントやＶＬＤＬレムナント〔これらはレムナント様リポ
蛋白（ｒｅｍｎａｎｔ−ｌｉｋｅ ｐａｒｔｉｃｌｅ
ｓ；ＲＬＰ）と呼ばれている〕、及び、ＬＤＬ等は、コ
レステロールを血管壁に運び込むリポ蛋白であり、これ
らの血中濃度を減少させることが動脈硬化症の治療に直
結することとなる。また、例えば、ＨＤＬは、動脈硬化
巣からコレステロールを引き抜く機能を有することか
ら、その血中濃度を上昇させることが動脈硬化症の治療
に役立つこととなる。
ントやＶＬＤＬレムナント〔これらはレムナント様リポ
蛋白（ｒｅｍｎａｎｔ−ｌｉｋｅ ｐａｒｔｉｃｌｅ
ｓ；ＲＬＰ）と呼ばれている〕、及び、ＬＤＬ等は、コ
レステロールを血管壁に運び込むリポ蛋白であり、これ
らの血中濃度を減少させることが動脈硬化症の治療に直
結することとなる。また、例えば、ＨＤＬは、動脈硬化
巣からコレステロールを引き抜く機能を有することか
ら、その血中濃度を上昇させることが動脈硬化症の治療
に役立つこととなる。
【０００５】これらのうち、ＲＬＰは、食後高脂血症の
動脈硬化病変発現に関与していることが指摘され、動脈
硬化症の危険因子の一つとして重要と考えられ始めてい
る。ＲＬＰを構成する部分蛋白（アポ蛋白）として、ア
ポＣ、アポＥ、アポＡ−Ｉ、アポＢ−１００、アポＢ−
４８等が知られている。
動脈硬化病変発現に関与していることが指摘され、動脈
硬化症の危険因子の一つとして重要と考えられ始めてい
る。ＲＬＰを構成する部分蛋白（アポ蛋白）として、ア
ポＣ、アポＥ、アポＡ−Ｉ、アポＢ−１００、アポＢ−
４８等が知られている。
【０００６】ＲＬＰの血中濃度測定方法の一つとして、
現在、ＲＬＰ−Ｃ（ｒｅｍｎａｎｔｌｉｋｅ ｐａｒｔ
ｉｃｌｅｓ ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ）測定法が知られ
ている。このＲＬＰ−Ｃ法は、抗アポＡ−Ｉモノクロー
ナル抗体と抗アポＢ−１００モノクローナル抗体とを固
相化して混合ゲルを調製し、これと検体とを反応させ、
これらの抗体に結合したリポ蛋白を遠心除去し、上清中
に存在する結合しなかったリポ蛋白の量をコレステロー
ルの量として測定するものである。
現在、ＲＬＰ−Ｃ（ｒｅｍｎａｎｔｌｉｋｅ ｐａｒｔ
ｉｃｌｅｓ ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ）測定法が知られ
ている。このＲＬＰ−Ｃ法は、抗アポＡ−Ｉモノクロー
ナル抗体と抗アポＢ−１００モノクローナル抗体とを固
相化して混合ゲルを調製し、これと検体とを反応させ、
これらの抗体に結合したリポ蛋白を遠心除去し、上清中
に存在する結合しなかったリポ蛋白の量をコレステロー
ルの量として測定するものである。
【０００７】アポＡ−Ｉは、ＣＭ、ＨＤＬの主要なアポ
蛋白として存在し、アポＢ−１００は、ＶＬＤＬ、ＶＬ
ＤＬレムナント、ＬＤＬの主要なアポ蛋白として存在す
るものである。従って、理論的には、Ａ−Ｉモノクロー
ナル抗体には、ＣＭとＨＤＬとが結合し、抗アポＢ−１
００モノクローナル抗体には、ＶＬＤＬとＶＬＤＬレム
ナントとＬＤＬとが結合するので、上述したＲＬＰ−Ｃ
測定法によれば、これらのリポ蛋白が結合されて除去さ
れる。
蛋白として存在し、アポＢ−１００は、ＶＬＤＬ、ＶＬ
ＤＬレムナント、ＬＤＬの主要なアポ蛋白として存在す
るものである。従って、理論的には、Ａ−Ｉモノクロー
ナル抗体には、ＣＭとＨＤＬとが結合し、抗アポＢ−１
００モノクローナル抗体には、ＶＬＤＬとＶＬＤＬレム
ナントとＬＤＬとが結合するので、上述したＲＬＰ−Ｃ
測定法によれば、これらのリポ蛋白が結合されて除去さ
れる。
【０００８】ＲＬＰ−Ｃ測定法に用いられる抗アポＢ−
１００モノクローナル抗体は、アポＢ−１００の２２９
１番目から２３１８番目のアミノ酸領域を特異的に認識
し、アポＢ−１００の２１５２番目までのアミノ酸配列
からなるアポＢ−４８を認識することがないので、アポ
Ｂ−４８をアポ蛋白として含有するがアポＢ−１００を
アポ蛋白として含有しないリポ蛋白が、ＲＬＰ−Ｃ測定
法の対象となる。
１００モノクローナル抗体は、アポＢ−１００の２２９
１番目から２３１８番目のアミノ酸領域を特異的に認識
し、アポＢ−１００の２１５２番目までのアミノ酸配列
からなるアポＢ−４８を認識することがないので、アポ
Ｂ−４８をアポ蛋白として含有するがアポＢ−１００を
アポ蛋白として含有しないリポ蛋白が、ＲＬＰ−Ｃ測定
法の対象となる。
【０００９】しかしながら、ＲＬＰ−Ｃ測定法は、吸着
除去操作が必須であり、作業が煩雑であると同時に、完
全な吸着が行われる必要があり、測定状況により測定値
にばらつきを生じる等の欠点があった。
除去操作が必須であり、作業が煩雑であると同時に、完
全な吸着が行われる必要があり、測定状況により測定値
にばらつきを生じる等の欠点があった。
【００１０】アポＢ−４８は、ＣＭ、ＣＭレムナントに
アポ蛋白として含有されている。ＣＭは、食後速やかに
リポ蛋白リパーゼによりＣＭレムナントに変換され、Ｃ
Ｍレムナントは、肝臓に存在するレムナントリセプター
により肝臓に取り込まれることとなる。従って、空腹時
等においては、血中にＣＭは存在しないこととなるの
で、アポＢ−４８を特異的に認識することができるモノ
クローナル抗体を得ることができれば、このような時期
の血液を検体とすることにより、ＣＭレムナントのみの
量を直接測定することができることとなる。このことに
より、より確実な高脂血症の診断が可能となり、従っ
て、動脈硬化症の診断及び治療に役立たせることができ
ることとなる。
アポ蛋白として含有されている。ＣＭは、食後速やかに
リポ蛋白リパーゼによりＣＭレムナントに変換され、Ｃ
Ｍレムナントは、肝臓に存在するレムナントリセプター
により肝臓に取り込まれることとなる。従って、空腹時
等においては、血中にＣＭは存在しないこととなるの
で、アポＢ−４８を特異的に認識することができるモノ
クローナル抗体を得ることができれば、このような時期
の血液を検体とすることにより、ＣＭレムナントのみの
量を直接測定することができることとなる。このことに
より、より確実な高脂血症の診断が可能となり、従っ
て、動脈硬化症の診断及び治療に役立たせることができ
ることとなる。
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】上記の現状に鑑み、本
発明は、アポＢ−４８を特異的に認識することができる
モノクローナル抗体を取得し、これにより、正確かつ簡
易に動脈硬化症の危険因子の量を測定し、診断及び治療
方法を提供することを目的とするものである。
発明は、アポＢ−４８を特異的に認識することができる
モノクローナル抗体を取得し、これにより、正確かつ簡
易に動脈硬化症の危険因子の量を測定し、診断及び治療
方法を提供することを目的とするものである。
【００１２】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、鋭意研究
の結果、アポＢ−４８由来ペプチドを哺乳動物に免疫す
ることにより得られるリンパ球と、ミエローマ細胞と
を、融合することによっハイブリドーマを樹立し、これ
を培養することによりアポＢ−４８を特異的に認識する
ことができるモノクローナル抗体を取得することに成功
し、本発明を完成した。以下に本発明を詳述する。
の結果、アポＢ−４８由来ペプチドを哺乳動物に免疫す
ることにより得られるリンパ球と、ミエローマ細胞と
を、融合することによっハイブリドーマを樹立し、これ
を培養することによりアポＢ−４８を特異的に認識する
ことができるモノクローナル抗体を取得することに成功
し、本発明を完成した。以下に本発明を詳述する。
【００１３】本発明は、アポＢ−４８を特異的に認識す
ることができるモノクローナル抗体を取得する方法を確
立することにより初めて成立した発明である。当該方法
は、本発明者らが抗アポＢ−４８モノクローナル抗体を
産生するハイブリドーマを初めて樹立したことにより確
立されたものである。
ることができるモノクローナル抗体を取得する方法を確
立することにより初めて成立した発明である。当該方法
は、本発明者らが抗アポＢ−４８モノクローナル抗体を
産生するハイブリドーマを初めて樹立したことにより確
立されたものである。
【００１４】アポＢ−４８は、アポＢ−１００のアミノ
酸配列の一部と同一のアミノ酸配列を有するペプチドで
あり、アポＢ−１００のアミノ酸配列もアポＢ−４８の
アミノ酸配列も、すでに公知である〔ネイチャー（Natu
re）３２３巻、７３８頁。１９８６年１０月〕。また、
抗アポＢ−４８特異抗血清も、既に公知である〔ジャー
ナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J. Biol.
Chem., ）、２６５巻、１５号、８３５８頁、１９９０
年。ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー
（J. Biol. Chem., ）、２６７巻、２号、１１７５頁、
１９９２年。クリニカル・サイエンス（Clinical Scien
ce）、８５巻、５２１頁、１９９３年等〕。
酸配列の一部と同一のアミノ酸配列を有するペプチドで
あり、アポＢ−１００のアミノ酸配列もアポＢ−４８の
アミノ酸配列も、すでに公知である〔ネイチャー（Natu
re）３２３巻、７３８頁。１９８６年１０月〕。また、
抗アポＢ−４８特異抗血清も、既に公知である〔ジャー
ナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J. Biol.
Chem., ）、２６５巻、１５号、８３５８頁、１９９０
年。ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー
（J. Biol. Chem., ）、２６７巻、２号、１１７５頁、
１９９２年。クリニカル・サイエンス（Clinical Scien
ce）、８５巻、５２１頁、１９９３年等〕。
【００１５】しかしながら、アポＢ−４８のみに特異的
に反応するモノクローナル抗体については、これまで取
得されたとの報告はなく、文献（臨床検査。４０巻、９
号（１９９６年）、１０２５頁、左欄下から８行）に
は、アポＢ−４８のみに特異的に反応する抗体の産生は
理論上困難である旨が記載されている。本発明に係る抗
アポＢ−４８モノクローナル抗体は、これらの従来の考
え方を、根本から覆すものである。
に反応するモノクローナル抗体については、これまで取
得されたとの報告はなく、文献（臨床検査。４０巻、９
号（１９９６年）、１０２５頁、左欄下から８行）に
は、アポＢ−４８のみに特異的に反応する抗体の産生は
理論上困難である旨が記載されている。本発明に係る抗
アポＢ−４８モノクローナル抗体は、これらの従来の考
え方を、根本から覆すものである。
【００１６】以下に本発明に係るハイブリドーマの樹立
方法について説明する。本発明においては、まず、アポ
Ｂ−４８由来のペプチドを合成する。アポＢ−４８由来
のペプチドは、好ましくはアポＢ−４８のＣ−末端から
２０個のアミノ酸配列、より好ましくは１０個のアミノ
酸配列、更に好ましくは６個のアミノ酸配列を含むペプ
チドである。本発明においては、例えば、既に公知のア
ポＢ−４８のアミノ酸配列のうち、Ｃ−末端から数えて
４個のアミノ酸配列に相当するペプチドのＮ−末端にシ
ステインを結合させたCys Thr Tyr Met Ile を合成する
（以下、本明細書において、このペプチドを「Ｃ４」と
いう）。このようなアミノ酸配列の合成は、公知のペプ
チド合成装置を用いることにより極めて容易に行うこと
ができる。
方法について説明する。本発明においては、まず、アポ
Ｂ−４８由来のペプチドを合成する。アポＢ−４８由来
のペプチドは、好ましくはアポＢ−４８のＣ−末端から
２０個のアミノ酸配列、より好ましくは１０個のアミノ
酸配列、更に好ましくは６個のアミノ酸配列を含むペプ
チドである。本発明においては、例えば、既に公知のア
ポＢ−４８のアミノ酸配列のうち、Ｃ−末端から数えて
４個のアミノ酸配列に相当するペプチドのＮ−末端にシ
ステインを結合させたCys Thr Tyr Met Ile を合成する
（以下、本明細書において、このペプチドを「Ｃ４」と
いう）。このようなアミノ酸配列の合成は、公知のペプ
チド合成装置を用いることにより極めて容易に行うこと
ができる。
【００１７】同様にして、アポＢ−４８のアミノ酸配列
のうち、Ｃ−末端から数えて５個のアミノ酸配列、及
び、６個のアミノ酸配列についても合成する（それぞ
れ、「Ｃ５」及び「Ｃ６」という）。これらのペプチド
は、常法に従って精製することができる。その後、これ
らのペプチドとヘモシアニン等との複合体を合成する。
のうち、Ｃ−末端から数えて５個のアミノ酸配列、及
び、６個のアミノ酸配列についても合成する（それぞ
れ、「Ｃ５」及び「Ｃ６」という）。これらのペプチド
は、常法に従って精製することができる。その後、これ
らのペプチドとヘモシアニン等との複合体を合成する。
【００１８】一方、食後２時間を経過したヒトから採取
した血液をプールし、このヒト血清を遠心分離操作する
ことにより、ＶＬＤＬフラクション、ＬＤＬフラクショ
ンを取得し、スクリーニング等の抗原とする。
した血液をプールし、このヒト血清を遠心分離操作する
ことにより、ＶＬＤＬフラクション、ＬＤＬフラクショ
ンを取得し、スクリーニング等の抗原とする。
【００１９】一方、抗アポＢ−４８モノクローナル抗体
を産生するハイブリドーマは、上記方法により合成した
Ｃ４−ＫＬＨ、Ｃ５−ＫＬＨ及びＣ６−ＫＬＨ複合体を
哺乳動物に免疫し、そのリンパ球とミエローマ細胞とを
融合することにより樹立することができる。
を産生するハイブリドーマは、上記方法により合成した
Ｃ４−ＫＬＨ、Ｃ５−ＫＬＨ及びＣ６−ＫＬＨ複合体を
哺乳動物に免疫し、そのリンパ球とミエローマ細胞とを
融合することにより樹立することができる。
【００２０】例えば、ＢＡＬＢ／Ｃマウス等の哺乳動物
に、フロイント完全アジュバントでエマルジョン化した
Ｃ４−ＫＬＨ、Ｃ５−ＫＬＨ及びＣ６−ＫＬＨ複合体の
アポＢ−４８由来ペプチドを免疫し、当該動物の血清の
一部を用い、ウエスタンブロッティング（ＷＢ）法にて
ネイティブアポＢ−４８に反応する抗体の確認を行う。
ＷＢ法で最も濃いバンドが確認された免疫動物に、遊離
の複合体を静脈内投与し、その３〜４日後に当該動物か
ら脾臓を取り出し脾細胞を調製する。
に、フロイント完全アジュバントでエマルジョン化した
Ｃ４−ＫＬＨ、Ｃ５−ＫＬＨ及びＣ６−ＫＬＨ複合体の
アポＢ−４８由来ペプチドを免疫し、当該動物の血清の
一部を用い、ウエスタンブロッティング（ＷＢ）法にて
ネイティブアポＢ−４８に反応する抗体の確認を行う。
ＷＢ法で最も濃いバンドが確認された免疫動物に、遊離
の複合体を静脈内投与し、その３〜４日後に当該動物か
ら脾臓を取り出し脾細胞を調製する。
【００２１】別途、培地で培養していたミエローマ細胞
と上記の脾細胞とを混合し、公知の手法により細胞融合
を行う。融合した細胞は、例えば、培地に浮遊した後、
培養プレート等に分注し、培養する。培養した細胞につ
いて、ＶＬＤＬフラクションを抗原として、ＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥ等を行った後、泳動した抗原をニトロセルロース
膜に転写し、転写膜をブロッキングした後、短冊状に細
く切り、これと培養プレートの一部を１グループとして
プールした培養液を入れて反応させる。その後、洗浄用
緩衝液で５分間の振盪洗浄を行った後、ＰＯＤ標識抗マ
ウスイムノグロブリン抗体を入れ、反応させ、アポＢ−
４８に相当する位置のバンドの確認を行う。
と上記の脾細胞とを混合し、公知の手法により細胞融合
を行う。融合した細胞は、例えば、培地に浮遊した後、
培養プレート等に分注し、培養する。培養した細胞につ
いて、ＶＬＤＬフラクションを抗原として、ＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥ等を行った後、泳動した抗原をニトロセルロース
膜に転写し、転写膜をブロッキングした後、短冊状に細
く切り、これと培養プレートの一部を１グループとして
プールした培養液を入れて反応させる。その後、洗浄用
緩衝液で５分間の振盪洗浄を行った後、ＰＯＤ標識抗マ
ウスイムノグロブリン抗体を入れ、反応させ、アポＢ−
４８に相当する位置のバンドの確認を行う。
【００２２】バンドが見られた場合、抗体を産生してい
るウエルの選択を行う。目的の抗体を産生しているウエ
ルの細胞は、限界希釈法によりクローニングを行いクロ
ーン化する。抗アポＢ−４８モノクローナル抗体を産生
する細胞は、大量に培養しマウス腹腔に投与し、抗アポ
Ｂ−４８モノクローナル抗体を含む腹水を回収する。更
にプロテインＡ−セファロース等を用い、腹水より抗体
を精製しモノクローナル抗体を得る。
るウエルの選択を行う。目的の抗体を産生しているウエ
ルの細胞は、限界希釈法によりクローニングを行いクロ
ーン化する。抗アポＢ−４８モノクローナル抗体を産生
する細胞は、大量に培養しマウス腹腔に投与し、抗アポ
Ｂ−４８モノクローナル抗体を含む腹水を回収する。更
にプロテインＡ−セファロース等を用い、腹水より抗体
を精製しモノクローナル抗体を得る。
【００２３】後に実施例で詳述するように、上記の方法
により、本発明者らは、抗アポＢ−４８モノクローナル
抗体を取得することに成功し、モノクローナル抗体Ｂ４
８−１５１と命名した。また、このモノクローナル抗体
Ｂ４８−１５１を産生する細胞をハイブリドーマＢ４８
−１５１と命名した。ハイブリドーマＢ４８−１５１
は、工業技術院生命工学工業技術研究所〔あて名；日本
国茨城県つくば市東１丁目１番３号（郵便番号３０５−
００４６）〕に、識別表示Ｂ４８−１５１、受託番号Ｆ
ＥＲＭ ＢＰ−６４７３（原寄託日；平成９年７月４
日、ブダペスト条約に基づく寄託への移管請求；平成１
０年８月２６日）として寄託した。
により、本発明者らは、抗アポＢ−４８モノクローナル
抗体を取得することに成功し、モノクローナル抗体Ｂ４
８−１５１と命名した。また、このモノクローナル抗体
Ｂ４８−１５１を産生する細胞をハイブリドーマＢ４８
−１５１と命名した。ハイブリドーマＢ４８−１５１
は、工業技術院生命工学工業技術研究所〔あて名；日本
国茨城県つくば市東１丁目１番３号（郵便番号３０５−
００４６）〕に、識別表示Ｂ４８−１５１、受託番号Ｆ
ＥＲＭ ＢＰ−６４７３（原寄託日；平成９年７月４
日、ブダペスト条約に基づく寄託への移管請求；平成１
０年８月２６日）として寄託した。
【００２４】得られた抗アポＢ−４８モノクローナル抗
体の反応特異性は、例えば、ＣＭ、ＶＬＤＬ及びＬＤＬ
フラクションを抗原としたＷＢ法で確認することができ
る。抗アポＢ−４８モノクローナル抗体を産生するハイ
ブリドーマから得られる抗アポＢ−４８モノクローナル
抗体は、アポＢ−４８を特異的に認識することができ、
かつ、アポＢ−１００とは全く反応しないものであり、
極めて良好に、検体中のアポＢ−４８及び／又はアポＢ
−４８含有リポ蛋白を検出するのに利用することができ
る。上記アポＢ−４８含有リポ蛋白とは、リポ蛋白であ
って、そのアポ蛋白のアミノ酸配列中にアポＢ−４８と
同一のアミノ酸配列を含有するものを意味し、このよう
なアポＢ−４８含有リポ蛋白も、アポＢ−４８と同様
に、アポＢ−４８を特異的に認識することができる本発
明の抗アポＢ−４８モノクローナル抗体により特異的に
認識されうるものである。
体の反応特異性は、例えば、ＣＭ、ＶＬＤＬ及びＬＤＬ
フラクションを抗原としたＷＢ法で確認することができ
る。抗アポＢ−４８モノクローナル抗体を産生するハイ
ブリドーマから得られる抗アポＢ−４８モノクローナル
抗体は、アポＢ−４８を特異的に認識することができ、
かつ、アポＢ−１００とは全く反応しないものであり、
極めて良好に、検体中のアポＢ−４８及び／又はアポＢ
−４８含有リポ蛋白を検出するのに利用することができ
る。上記アポＢ−４８含有リポ蛋白とは、リポ蛋白であ
って、そのアポ蛋白のアミノ酸配列中にアポＢ−４８と
同一のアミノ酸配列を含有するものを意味し、このよう
なアポＢ−４８含有リポ蛋白も、アポＢ−４８と同様
に、アポＢ−４８を特異的に認識することができる本発
明の抗アポＢ−４８モノクローナル抗体により特異的に
認識されうるものである。
【００２５】更にまた、上記抗アポＢ−４８モノクロー
ナル抗体の反応特異性は、ＥＬＩＳＡ測定法によっても
確認することができる。抗アポＢ−４８モノクローナル
抗体を産生するハイブリドーマから得られる抗アポＢ−
４８モノクローナル抗体は、後の実施例で詳述するよう
に、これを固相としたＥＬＩＳＡ測定法においてアポＢ
−４８を特異的に認識することできることが明らかであ
り、従来用いられていたＷＢ法等の膜固定による測定方
法ばかりでなく、固相ＥＬＩＳＡ法にも応用することが
できるものである。
ナル抗体の反応特異性は、ＥＬＩＳＡ測定法によっても
確認することができる。抗アポＢ−４８モノクローナル
抗体を産生するハイブリドーマから得られる抗アポＢ−
４８モノクローナル抗体は、後の実施例で詳述するよう
に、これを固相としたＥＬＩＳＡ測定法においてアポＢ
−４８を特異的に認識することできることが明らかであ
り、従来用いられていたＷＢ法等の膜固定による測定方
法ばかりでなく、固相ＥＬＩＳＡ法にも応用することが
できるものである。
【００２６】本発明の抗アポＢ−４８モノクローナル抗
体は、いわゆるサンドイッチアッセイ法にも適用するこ
とができる。例えば、サンドイッチＥＬＩＳＡを行うた
め、ＥＬＩＳＡプレートに希釈した抗アポＢ−４８モノ
クローナル抗体を入れ、放置して吸着させた後、マスキ
ングを行い、洗浄後に、適切に調製したアポＢ−４８を
抗原として入れて反応させる。
体は、いわゆるサンドイッチアッセイ法にも適用するこ
とができる。例えば、サンドイッチＥＬＩＳＡを行うた
め、ＥＬＩＳＡプレートに希釈した抗アポＢ−４８モノ
クローナル抗体を入れ、放置して吸着させた後、マスキ
ングを行い、洗浄後に、適切に調製したアポＢ−４８を
抗原として入れて反応させる。
【００２７】反応特異性を確認するため、アポＢ−１０
０を同様の方法にて抗原として測定する。洗浄後、標識
抗ヒトアポＢ抗体を入れ、反応させた後、洗浄し、基質
を入れて放置後、吸収波長を測定する等して反応量を測
定することにより、アポＢ−４８が特異的に認識される
ことを確認することができる。
０を同様の方法にて抗原として測定する。洗浄後、標識
抗ヒトアポＢ抗体を入れ、反応させた後、洗浄し、基質
を入れて放置後、吸収波長を測定する等して反応量を測
定することにより、アポＢ−４８が特異的に認識される
ことを確認することができる。
【００２８】本発明の抗アポＢ−４８モノクローナル抗
体は、血清を直接検体とするアッセイ法に適用すること
もできる。例えば、上記したＥＬＩＳＡ法をヒト血清を
検体として適用することによりアポＢ−４８の測定を行
うことができる。
体は、血清を直接検体とするアッセイ法に適用すること
もできる。例えば、上記したＥＬＩＳＡ法をヒト血清を
検体として適用することによりアポＢ−４８の測定を行
うことができる。
【００２９】本発明のモノクローナル抗体を用いたアポ
Ｂ−４８及び／又はアポＢ−４８含有リポ蛋白の測定
は、本発明のモノクローナル抗体をヒト由来の種々の検
体に適用することにより行うことができる。上記検体と
しては、ヒト由来の種々の体液を挙げることができ、例
えば、血清及び血漿等を挙げることができる。これらの
検体に対する測定方法もまた、本発明の一つである。
Ｂ−４８及び／又はアポＢ−４８含有リポ蛋白の測定
は、本発明のモノクローナル抗体をヒト由来の種々の検
体に適用することにより行うことができる。上記検体と
しては、ヒト由来の種々の体液を挙げることができ、例
えば、血清及び血漿等を挙げることができる。これらの
検体に対する測定方法もまた、本発明の一つである。
【００３０】上記検体は、アポＢ−４８のエピトープを
露出させるような処理を行うことが好ましい。本発明の
モノクローナル抗体のエピトープは、アポＢ−４８のＣ
末端部分であるが、この部分は生体液中では露出してい
ないので免疫反応を行った際モノクローナル抗体が結合
しにくいと考えられるため、エピトープを露出させるよ
うな処理を行うことによって、モノクローナル抗体への
結合を容易にする必要がある。上記エピトープを露出さ
せる処理は、測定前に行ってもよく、又は、測定と同時
に行ってもよい。
露出させるような処理を行うことが好ましい。本発明の
モノクローナル抗体のエピトープは、アポＢ−４８のＣ
末端部分であるが、この部分は生体液中では露出してい
ないので免疫反応を行った際モノクローナル抗体が結合
しにくいと考えられるため、エピトープを露出させるよ
うな処理を行うことによって、モノクローナル抗体への
結合を容易にする必要がある。上記エピトープを露出さ
せる処理は、測定前に行ってもよく、又は、測定と同時
に行ってもよい。
【００３１】上記エピトープを露出させるような処理と
しては、例えば、検体を界面活性剤で処理する方法や、
凍結融解を繰り返す方法等を挙げることができる。検体
を界面活性剤で処理する方法としては、第３０回日本動
脈硬化学会総会抄録集〔平成１０年６月１１日、１２日
開催、帝京大学内科、筑波記念病院内科、木下誠ら、１
３３頁、「アポ蛋白Ｂ４８含有リポ蛋白の測定法の開
発」〕には、アポＢ−４８を特異的に認識するモノクロ
ーナル抗体を作成し、それを用いたＥＬＩＳＡプレート
に２％ＳＤＳを含むＰＢＳで希釈した血清を添加して、
アポＢ−４８を測定することが記載されている。しか
し、本発明においては、２％ＳＤＳ中では血清中のアポ
Ｂ−４８の測定を行うことはできず、ＳＤＳは界面活性
剤として好ましくない。
しては、例えば、検体を界面活性剤で処理する方法や、
凍結融解を繰り返す方法等を挙げることができる。検体
を界面活性剤で処理する方法としては、第３０回日本動
脈硬化学会総会抄録集〔平成１０年６月１１日、１２日
開催、帝京大学内科、筑波記念病院内科、木下誠ら、１
３３頁、「アポ蛋白Ｂ４８含有リポ蛋白の測定法の開
発」〕には、アポＢ−４８を特異的に認識するモノクロ
ーナル抗体を作成し、それを用いたＥＬＩＳＡプレート
に２％ＳＤＳを含むＰＢＳで希釈した血清を添加して、
アポＢ−４８を測定することが記載されている。しか
し、本発明においては、２％ＳＤＳ中では血清中のアポ
Ｂ−４８の測定を行うことはできず、ＳＤＳは界面活性
剤として好ましくない。
【００３２】本発明において、上記界面活性剤は、非イ
オン性界面活性剤が好ましく、ＳＤＳでは逆に免疫反応
を阻害するため好ましくない。より好ましくは、トライ
トンＸ−１００、トライトンＸ−１１４、ツィーン−２
０、ＮＰ−４０である。上記界面活性剤は、単独でも、
混合しても用いることができる。実際の使用において
は、エピトープ露出効果は高いが室温では溶けにくい界
面活性剤（トライトンＸ−１１４等）を用いる場合に
は、免疫反応を阻害せず溶けやすい界面活性剤（ツィー
ン−２０等）を混合して使用することが好ましい。
オン性界面活性剤が好ましく、ＳＤＳでは逆に免疫反応
を阻害するため好ましくない。より好ましくは、トライ
トンＸ−１００、トライトンＸ−１１４、ツィーン−２
０、ＮＰ−４０である。上記界面活性剤は、単独でも、
混合しても用いることができる。実際の使用において
は、エピトープ露出効果は高いが室温では溶けにくい界
面活性剤（トライトンＸ−１１４等）を用いる場合に
は、免疫反応を阻害せず溶けやすい界面活性剤（ツィー
ン−２０等）を混合して使用することが好ましい。
【００３３】本発明において、界面活性剤は、エピトー
プを露出させるために用いるものであるが、一般に界面
活性剤は免疫反応を阻害するので、エピトープの露出効
果と免疫反応の阻害作用とのバランスによって使用濃度
を適宜選択することができる。上記界面活性剤は、検体
とモノクローナル抗体との免疫反応を行う際の溶液に共
存させることもでき、０．０１〜２％、好ましくは、
０．０２〜０．５％の濃度で使用する。上記界面活性剤
の処理溶液及び処理時間としては特に限定されず、例え
ば、通常免疫反応を行う際に用いる緩衝液中において、
４〜４０℃で５分〜４８時間行うことができる。
プを露出させるために用いるものであるが、一般に界面
活性剤は免疫反応を阻害するので、エピトープの露出効
果と免疫反応の阻害作用とのバランスによって使用濃度
を適宜選択することができる。上記界面活性剤は、検体
とモノクローナル抗体との免疫反応を行う際の溶液に共
存させることもでき、０．０１〜２％、好ましくは、
０．０２〜０．５％の濃度で使用する。上記界面活性剤
の処理溶液及び処理時間としては特に限定されず、例え
ば、通常免疫反応を行う際に用いる緩衝液中において、
４〜４０℃で５分〜４８時間行うことができる。
【００３４】本発明においては、検体を凍結融解を繰り
返すことによって、リポ蛋白の構造を破壊し、エピトー
プを露出させることも可能である。上記凍結融解は、１
回以上行えば、その効果が得られる。
返すことによって、リポ蛋白の構造を破壊し、エピトー
プを露出させることも可能である。上記凍結融解は、１
回以上行えば、その効果が得られる。
【００３５】本発明のモノクローナル抗体を用いたアポ
Ｂ−４８及び／又はアポＢ−４８含有リポ蛋白の測定方
法を用いることにより、アポＢ−４８及び／又はアポＢ
−４８含有リポ蛋白を測定する免疫測定試薬を製造する
ことができ、このような免疫測定試薬もまた、本発明の
一つである。このような免疫測定試薬として、例えば、
本発明のモノクローナル抗体を結合させたゼラチン粒子
やラテックス粒子等を含有させた凝集免疫測定試薬は、
通常の公知の方法により製造することができる。また、
同様にして、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）試薬、ＥＬＩＳ
Ａ試薬、放射免疫測定法（ＲＩＡ）試薬を、固相とし
て、例えば、ポリスチレン等のポリマー、ガラスビー
ズ、磁性粒子、マイクロプレート、イムノクロマトグラ
フィー用濾紙、グラスフィルター等を用いることによ
り、通常の公知の方法により製造することができる。
Ｂ−４８及び／又はアポＢ−４８含有リポ蛋白の測定方
法を用いることにより、アポＢ−４８及び／又はアポＢ
−４８含有リポ蛋白を測定する免疫測定試薬を製造する
ことができ、このような免疫測定試薬もまた、本発明の
一つである。このような免疫測定試薬として、例えば、
本発明のモノクローナル抗体を結合させたゼラチン粒子
やラテックス粒子等を含有させた凝集免疫測定試薬は、
通常の公知の方法により製造することができる。また、
同様にして、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）試薬、ＥＬＩＳ
Ａ試薬、放射免疫測定法（ＲＩＡ）試薬を、固相とし
て、例えば、ポリスチレン等のポリマー、ガラスビー
ズ、磁性粒子、マイクロプレート、イムノクロマトグラ
フィー用濾紙、グラスフィルター等を用いることによ
り、通常の公知の方法により製造することができる。
【００３６】
【実施例】以下に、実施例を掲げて本発明を更に詳しく
説明するが、本発明はこれらのみに限定されるものでは
ない。 実施例１ アポＢ−４８由来ペプチドの合成 アポＢ−４８のＣ−末端から４残基のアミノ酸配列に相
当する部分に、そのＮ−末端にシステインを結合したペ
プチドを合成した（以下、本明細書中では「Ｃ４」とい
う。配列表の配列番号１に示す）。また、アポＢ−４８
のＣ−末端から５残基のアミノ酸配列に相当する部分
に、そのＮ−末端にシステインを結合したペプチドを合
成した（以下、本明細書中では「Ｃ５」という。配列表
の配列番号２に示す）。更に、アポＢ−４８のＣ−末端
から６残基のアミノ酸配列に相当する部分に、そのＮ−
末端にシステインを結合したペプチドを合成した（以
下、本明細書中では「Ｃ６」という。配列表の配列番号
３に示す）。
説明するが、本発明はこれらのみに限定されるものでは
ない。 実施例１ アポＢ−４８由来ペプチドの合成 アポＢ−４８のＣ−末端から４残基のアミノ酸配列に相
当する部分に、そのＮ−末端にシステインを結合したペ
プチドを合成した（以下、本明細書中では「Ｃ４」とい
う。配列表の配列番号１に示す）。また、アポＢ−４８
のＣ−末端から５残基のアミノ酸配列に相当する部分
に、そのＮ−末端にシステインを結合したペプチドを合
成した（以下、本明細書中では「Ｃ５」という。配列表
の配列番号２に示す）。更に、アポＢ−４８のＣ−末端
から６残基のアミノ酸配列に相当する部分に、そのＮ−
末端にシステインを結合したペプチドを合成した（以
下、本明細書中では「Ｃ６」という。配列表の配列番号
３に示す）。
【００３７】合成には、島津製作所製多種品目同時固相
法自動ペプチド合成装置ＰＳＳＭ−８を用いた。アミノ
酸はすべてＬ−体を用い、α−アミノ基は９−フルオレ
ニルメトキシカルボニル基（Ｆｍｏｃ基）で保護し、シ
ステインのβ−スルフヒドリル基とグルタミンのγ−カ
ルボキサミド基はトリチル基で保護し、スレオニンのβ
−水酸基とチロシンのフェノール性水酸基はｔ−ブチル
基で保護した。
法自動ペプチド合成装置ＰＳＳＭ−８を用いた。アミノ
酸はすべてＬ−体を用い、α−アミノ基は９−フルオレ
ニルメトキシカルボニル基（Ｆｍｏｃ基）で保護し、シ
ステインのβ−スルフヒドリル基とグルタミンのγ−カ
ルボキサミド基はトリチル基で保護し、スレオニンのβ
−水酸基とチロシンのフェノール性水酸基はｔ−ブチル
基で保護した。
【００３８】ペプチド合成を開始するための固相担体
は、あらかじめＣ−末端イソロイシンが０．６５ｍｍｏ
ｌ／ｇの割合で導入されたＨＭＰイソロイシンレジン
（パーキンエルマー社製）３０ｍｇを用いた。縮合に
は、２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−
１，１，３，３−テトラメチルウロニウム ヘキサフル
オロフォスフェイト、１−ヒドロキシベンゾトリアゾー
ル、及び、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンを用い
た。Ｆｍｏｃ基の除去には３０％ピペリジン／ＤＭＦ溶
液を用い、溶媒はＤＭＦを用い、ＰＳＳＭ−８添付の標
準的なプログラムを使用して３種類同時に合成を行っ
た。
は、あらかじめＣ−末端イソロイシンが０．６５ｍｍｏ
ｌ／ｇの割合で導入されたＨＭＰイソロイシンレジン
（パーキンエルマー社製）３０ｍｇを用いた。縮合に
は、２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−
１，１，３，３−テトラメチルウロニウム ヘキサフル
オロフォスフェイト、１−ヒドロキシベンゾトリアゾー
ル、及び、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンを用い
た。Ｆｍｏｃ基の除去には３０％ピペリジン／ＤＭＦ溶
液を用い、溶媒はＤＭＦを用い、ＰＳＳＭ−８添付の標
準的なプログラムを使用して３種類同時に合成を行っ
た。
【００３９】合成終了後、得られた保護基を含むペプチ
ド担体を塩化メチレンで洗い、乾燥した。収量は、Ｃ４
が４１．０ｍｇ、Ｃ５が４８．４ｍｇ、Ｃ６が５２．６
ｍｇであった。上記ペプチド担体を、それぞれ、添加物
を含むトリフルオロ酢酸溶液（トリフルオロ酢酸１ｍ
ｌ、水５０μｌ、フェノール７５ｍｇ、チオアニソール
５０μｌ、エタンジチオール５０μｌ）で室温２時間処
理し、遊離のペプチド鎖を取り出した。ペプチドをジエ
チルエーテルで沈殿させ、濾取し、水に溶解して凍結乾
燥した。こうして得られた粗ペプチドの収量は、Ｃ４が
１２．２３ｍｇ、Ｃ５が１６．１７ｍｇ、Ｃ６が１７．
０４ｍｇであった。
ド担体を塩化メチレンで洗い、乾燥した。収量は、Ｃ４
が４１．０ｍｇ、Ｃ５が４８．４ｍｇ、Ｃ６が５２．６
ｍｇであった。上記ペプチド担体を、それぞれ、添加物
を含むトリフルオロ酢酸溶液（トリフルオロ酢酸１ｍ
ｌ、水５０μｌ、フェノール７５ｍｇ、チオアニソール
５０μｌ、エタンジチオール５０μｌ）で室温２時間処
理し、遊離のペプチド鎖を取り出した。ペプチドをジエ
チルエーテルで沈殿させ、濾取し、水に溶解して凍結乾
燥した。こうして得られた粗ペプチドの収量は、Ｃ４が
１２．２３ｍｇ、Ｃ５が１６．１７ｍｇ、Ｃ６が１７．
０４ｍｇであった。
【００４０】次に、上記粗ペプチドを逆相高速液体クロ
マトグラフィで精製した。カラムはコスモシル５Ｃ１８
−ＡＲ−３００ ２０ｍｍＩ．Ｄ．ｘ１５０ｍｍＬ．
（ナカライテスク社製）を用い、０．１％トリフルオロ
酢酸を含むアセトニトリル水溶液の１８〜２８％直線濃
度勾配で溶出した。凍結乾燥後得られた精製ペプチドの
収量は、Ｃ４が７．１２ｍｇ、Ｃ５が１１．７５ｍｇ、
Ｃ６が１０．７１ｍｇであった。これらのペプチドは、
その一部をプロテインシーケンサ（パーキンエルマー社
製、Ｐｒｏｃｉｓｅ４９４）にかけて、その構造を確認
した。
マトグラフィで精製した。カラムはコスモシル５Ｃ１８
−ＡＲ−３００ ２０ｍｍＩ．Ｄ．ｘ１５０ｍｍＬ．
（ナカライテスク社製）を用い、０．１％トリフルオロ
酢酸を含むアセトニトリル水溶液の１８〜２８％直線濃
度勾配で溶出した。凍結乾燥後得られた精製ペプチドの
収量は、Ｃ４が７．１２ｍｇ、Ｃ５が１１．７５ｍｇ、
Ｃ６が１０．７１ｍｇであった。これらのペプチドは、
その一部をプロテインシーケンサ（パーキンエルマー社
製、Ｐｒｏｃｉｓｅ４９４）にかけて、その構造を確認
した。
【００４１】実施例２ ペプチド−ＫＬＨ複合体の合成
ヘモシアニン（ＫＬＨ）（カルビオケム社製）５ｍｇを
４００μｌの０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）に溶
解し、ＤＭＦ１００μｌに溶解したＧＭＢＳ（同人化学
研究所製）１ｍｇを加え、室温で１時間撹拌した。反応
液を１ｍＭのＥＤＴＡを含む０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ７．０）で平衡化したＰＤ−１０カラム（ファルマシ
ア社製）にかけ、同緩衝液で溶出した。はじめの２．５
ｍｌを棄て、続く２．０ｍｌを集めた。
４００μｌの０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）に溶
解し、ＤＭＦ１００μｌに溶解したＧＭＢＳ（同人化学
研究所製）１ｍｇを加え、室温で１時間撹拌した。反応
液を１ｍＭのＥＤＴＡを含む０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ７．０）で平衡化したＰＤ−１０カラム（ファルマシ
ア社製）にかけ、同緩衝液で溶出した。はじめの２．５
ｍｌを棄て、続く２．０ｍｌを集めた。
【００４２】これに、実施例１で合成したＣ４約１ｍｇ
を水１ｍｌに溶解して加え、室温で２時間撹拌した。反
応液を透析チューブに移し、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）に
対して一夜透析した。同様の操作をＣ５及びＣ６につい
ても行い、それぞれ約５ｍｌのＫＬＨ複合体溶液を得
た。蛋白定量値は、Ｃ４のＫＬＨ複合体（Ｃ４−ＫＬ
Ｈ）が７６８μｇ／ｍｌ、Ｃ５のＫＬＨ複合体（Ｃ５−
ＫＬＨ）が８６１μｇ／ｍｌ、Ｃ６のＫＬＨ複合体（Ｃ
６−ＫＬＨ）が１１４０μｇ／ｍｌであった。
を水１ｍｌに溶解して加え、室温で２時間撹拌した。反
応液を透析チューブに移し、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）に
対して一夜透析した。同様の操作をＣ５及びＣ６につい
ても行い、それぞれ約５ｍｌのＫＬＨ複合体溶液を得
た。蛋白定量値は、Ｃ４のＫＬＨ複合体（Ｃ４−ＫＬ
Ｈ）が７６８μｇ／ｍｌ、Ｃ５のＫＬＨ複合体（Ｃ５−
ＫＬＨ）が８６１μｇ／ｍｌ、Ｃ６のＫＬＨ複合体（Ｃ
６−ＫＬＨ）が１１４０μｇ／ｍｌであった。
【００４３】実施例３ ヒト血清からのリポ蛋白の調製
食後２時間のヒトプール血清４ｍｌにトリスヒドロキシ
メチル・アミノメタン１．２１ｇ、塩化ナトリウム９．
０ｇ、ＥＤＴＡ２ナトリウム０．３７２ｇを蒸留水１ｌ
に溶かしｐＨを７．４に調整した溶液（以下、「ｄ＝
１．００６溶液」という）を４ｍｌ重層し、ベックマン
超高速遠心機で２６０００×ｇにて１時間遠心した。上
層部分をカイロミクロン（ＣＭ）フラクションとしてプ
ールし、下層部は更にｄ＝１．００６溶液を重層し、１
１４０００×ｇにて２０時間遠心後、上層部分をＶＬＤ
Ｌフラクションとしてプールした。更に下層部分は臭化
ナトリウム溶液によりｄ＝１．０６３に調整し１１４０
００×ｇにて２０時間遠心し、その上清部分をＬＤＬフ
ラクションとしてプールした。それぞれのプール分画を
濃縮して、免疫反応の抗原として用いた。
メチル・アミノメタン１．２１ｇ、塩化ナトリウム９．
０ｇ、ＥＤＴＡ２ナトリウム０．３７２ｇを蒸留水１ｌ
に溶かしｐＨを７．４に調整した溶液（以下、「ｄ＝
１．００６溶液」という）を４ｍｌ重層し、ベックマン
超高速遠心機で２６０００×ｇにて１時間遠心した。上
層部分をカイロミクロン（ＣＭ）フラクションとしてプ
ールし、下層部は更にｄ＝１．００６溶液を重層し、１
１４０００×ｇにて２０時間遠心後、上層部分をＶＬＤ
Ｌフラクションとしてプールした。更に下層部分は臭化
ナトリウム溶液によりｄ＝１．０６３に調整し１１４０
００×ｇにて２０時間遠心し、その上清部分をＬＤＬフ
ラクションとしてプールした。それぞれのプール分画を
濃縮して、免疫反応の抗原として用いた。
【００４４】実施例４ 抗アポＢ−４８モノクローナル
抗体を産生するハイブリドーマの樹立及び抗アポＢ−４
８モノクローナル抗体の調製 抗アポＢ−４８モノクローナル抗体を産生するハイブリ
ドーマを、実施例２で合成したＣ４−ＫＬＨ、Ｃ５−Ｋ
ＬＨ及びＣ６−ＫＬＨをＢＡＬＢ／Ｃマウスに免疫し、
その脾臓リンパ球とミエローマ細胞を融合することによ
り樹立した。
抗体を産生するハイブリドーマの樹立及び抗アポＢ−４
８モノクローナル抗体の調製 抗アポＢ−４８モノクローナル抗体を産生するハイブリ
ドーマを、実施例２で合成したＣ４−ＫＬＨ、Ｃ５−Ｋ
ＬＨ及びＣ６−ＫＬＨをＢＡＬＢ／Ｃマウスに免疫し、
その脾臓リンパ球とミエローマ細胞を融合することによ
り樹立した。
【００４５】すなわち、ＢＡＬＢ／Ｃマウスに、フロイ
ント完全アジュバントでエマルジョン化したＣ４−ＫＬ
Ｈ、Ｃ５−ＫＬＨ及びＣ６−ＫＬＨをそれぞれ２５〜１
００μｇ／マウスで免疫し、２〜３週間後、フロイント
不完全アジュバントでエマルジョン化した同複合体２５
〜１００μｇ／マウスで追加免疫を行った。マウス血清
の一部を用い、ウエスタンブロッティング（ＷＢ）法に
てネイティブアポＢ−４８に反応する抗体の確認を行っ
た。ＷＢの測定方法は後に示すスクリーニング法と同様
の方法にて行った。ＷＢ法で最も濃いバンドが確認され
たＣ６−ＫＬＨ免疫マウスに、遊離のＣ６−ＫＬＨ２５
〜１００μｇを静脈内投与し、その３〜４日後、マウス
から脾臓を取り出し脾細胞を調製した。
ント完全アジュバントでエマルジョン化したＣ４−ＫＬ
Ｈ、Ｃ５−ＫＬＨ及びＣ６−ＫＬＨをそれぞれ２５〜１
００μｇ／マウスで免疫し、２〜３週間後、フロイント
不完全アジュバントでエマルジョン化した同複合体２５
〜１００μｇ／マウスで追加免疫を行った。マウス血清
の一部を用い、ウエスタンブロッティング（ＷＢ）法に
てネイティブアポＢ−４８に反応する抗体の確認を行っ
た。ＷＢの測定方法は後に示すスクリーニング法と同様
の方法にて行った。ＷＢ法で最も濃いバンドが確認され
たＣ６−ＫＬＨ免疫マウスに、遊離のＣ６−ＫＬＨ２５
〜１００μｇを静脈内投与し、その３〜４日後、マウス
から脾臓を取り出し脾細胞を調製した。
【００４６】前もってＲＰＭＩ−１６４０培地で培養し
ていたマウスミエローマ細胞（Ｐ３Ｕ１）と上記の脾細
胞とを１：２〜１：５の比率で混合し、ＰＥＧ（ベーリ
ンガー社製）を用い細胞融合を行った。融合した細胞は
ＨＡＴ培地に浮遊した後、９６ウエル培養プレートに分
注し、３７℃二酸化炭素インキュベーターで培養した。
ていたマウスミエローマ細胞（Ｐ３Ｕ１）と上記の脾細
胞とを１：２〜１：５の比率で混合し、ＰＥＧ（ベーリ
ンガー社製）を用い細胞融合を行った。融合した細胞は
ＨＡＴ培地に浮遊した後、９６ウエル培養プレートに分
注し、３７℃二酸化炭素インキュベーターで培養した。
【００４７】培養した細胞の培養上清をＷＢ法にてスク
リーニングした。すなわち、実施例３で調製したＶＬＤ
Ｌフラクションを抗原として、３〜１５％グラジエント
のＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅ）を行った後、泳動した抗原をニトロセルロース膜に
転写しＷＢ用転写膜を作製した。転写膜をスキムミルク
でブロッキングした後、短冊状に細く切った。アキュト
ランインキュベートトレイ（Accutran Incubation Tra
y）（Ｓ＆Ｓ社製）の各溝に、短冊状の転写膜と９６ウ
エル培養プレートの６ウエル分を１グループとしてプー
ルした培養液を入れ、室温で１時間振盪し反応を行っ
た。
リーニングした。すなわち、実施例３で調製したＶＬＤ
Ｌフラクションを抗原として、３〜１５％グラジエント
のＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅ）を行った後、泳動した抗原をニトロセルロース膜に
転写しＷＢ用転写膜を作製した。転写膜をスキムミルク
でブロッキングした後、短冊状に細く切った。アキュト
ランインキュベートトレイ（Accutran Incubation Tra
y）（Ｓ＆Ｓ社製）の各溝に、短冊状の転写膜と９６ウ
エル培養プレートの６ウエル分を１グループとしてプー
ルした培養液を入れ、室温で１時間振盪し反応を行っ
た。
【００４８】０．０５％ツィーン２０を含むＰＢＳ（以
下、「洗浄用緩衝液」という）で５分間の振盪洗浄を３
回行った後、各溝にＰＯＤ標識抗マウスイムノグロブリ
ン抗体（ダコ社製）を入れ、更に室温で１時間反応させ
た。同様に、洗浄用緩衝液で４回洗浄後、基質４−クロ
ロナフトール溶液を加え、アポＢ−４８に相当する位置
のバンドの確認を行った。
下、「洗浄用緩衝液」という）で５分間の振盪洗浄を３
回行った後、各溝にＰＯＤ標識抗マウスイムノグロブリ
ン抗体（ダコ社製）を入れ、更に室温で１時間反応させ
た。同様に、洗浄用緩衝液で４回洗浄後、基質４−クロ
ロナフトール溶液を加え、アポＢ−４８に相当する位置
のバンドの確認を行った。
【００４９】バンドが見られた場合、６ウエルを更に１
ウエルづつに分け同様の方法で目的の抗体を産生してい
るウエルの選択を行った。目的の抗体を産生しているウ
エルの細胞は、限界希釈法によりクローニングを行いク
ローン化した。抗アポＢ−４８モノクローナル抗体を産
生する細胞は、大量に培養しマウス腹腔に投与し、抗ア
ポＢ−４８モノクローナル抗体を含む腹水を回収した。
更にプロテインＡ−セファロースを用い、腹水より抗体
を精製しモノクローナル抗体を得た。この抗アポＢ−４
８モノクローナル抗体をモノクローナル抗体Ｂ４８−１
５１と命名し、このモノクローナル抗体Ｂ４８−１５１
を産生する細胞をハイブリドーマＢ４８−１５１と命名
した。
ウエルづつに分け同様の方法で目的の抗体を産生してい
るウエルの選択を行った。目的の抗体を産生しているウ
エルの細胞は、限界希釈法によりクローニングを行いク
ローン化した。抗アポＢ−４８モノクローナル抗体を産
生する細胞は、大量に培養しマウス腹腔に投与し、抗ア
ポＢ−４８モノクローナル抗体を含む腹水を回収した。
更にプロテインＡ−セファロースを用い、腹水より抗体
を精製しモノクローナル抗体を得た。この抗アポＢ−４
８モノクローナル抗体をモノクローナル抗体Ｂ４８−１
５１と命名し、このモノクローナル抗体Ｂ４８−１５１
を産生する細胞をハイブリドーマＢ４８−１５１と命名
した。
【００５０】実施例５ モノクローナル抗体Ｂ４８−１
５１の反応特異性の確認 モノクローナル抗体Ｂ４８−１５１の反応特異性を、Ｃ
Ｍ、ＶＬＤＬ及びＬＤＬフラクションを抗原としたＷＢ
法で確認した。すなわち、実施例３で調製したそれぞれ
のフラクションを抗原として、３〜１５％グラジエント
ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った後、泳動した抗原をニトロセ
ルロース膜に転写しＷＢ用転写膜を作製した。転写膜を
スキムミルクでブロッキングした後、抗体との反応を行
った。反応にはモノクローナル抗体Ｂ４８−１５１、コ
ントロールとして抗アポＢ−１００モノクロナール抗体
ＭＡＢ０１４（ケミコン社製）及び抗アポＢ山羊抗血清
（ケミコン社製）を用いた。更に反応特異性確認のため
遊離の免疫ペプチドＣ６による抑制試験も行った。な
お、ＷＢ用転写膜の一部は、ＣＣＢ染色により蛋白質位
置の確認を行った。
５１の反応特異性の確認 モノクローナル抗体Ｂ４８−１５１の反応特異性を、Ｃ
Ｍ、ＶＬＤＬ及びＬＤＬフラクションを抗原としたＷＢ
法で確認した。すなわち、実施例３で調製したそれぞれ
のフラクションを抗原として、３〜１５％グラジエント
ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った後、泳動した抗原をニトロセ
ルロース膜に転写しＷＢ用転写膜を作製した。転写膜を
スキムミルクでブロッキングした後、抗体との反応を行
った。反応にはモノクローナル抗体Ｂ４８−１５１、コ
ントロールとして抗アポＢ−１００モノクロナール抗体
ＭＡＢ０１４（ケミコン社製）及び抗アポＢ山羊抗血清
（ケミコン社製）を用いた。更に反応特異性確認のため
遊離の免疫ペプチドＣ６による抑制試験も行った。な
お、ＷＢ用転写膜の一部は、ＣＣＢ染色により蛋白質位
置の確認を行った。
【００５１】抗体と各種抗原との反応は以下のとおりで
あった。それぞれの抗体を１％ウシ血清アルブミン（Ｂ
ＳＡ）含有リン酸緩衝液（１％ＢＳＡ−ＰＢＳ）（ｐＨ
７．４）を用いて１μｇ／ｍｌの濃度に調整し、抗原転
写ＷＢ膜と室温で１時間振盪し反応を行った。洗浄用緩
衝液で５分間の振盪洗浄を３回行った後、ＰＯＤ標識抗
マウスイムノグロブリン抗体（ダコ社製）を加え、更に
室温で１時間反応させた。同様に、洗浄用緩衝液で４回
洗浄後、基質４−クロロナフトール溶液を加え、バンド
の確認を行った。結果を図１に示す。抑制試験は、ＷＢ
膜と抗体との反応時に５μｇ／ｍｌのＣ６を共存させて
行った。結果を図２に示す。
あった。それぞれの抗体を１％ウシ血清アルブミン（Ｂ
ＳＡ）含有リン酸緩衝液（１％ＢＳＡ−ＰＢＳ）（ｐＨ
７．４）を用いて１μｇ／ｍｌの濃度に調整し、抗原転
写ＷＢ膜と室温で１時間振盪し反応を行った。洗浄用緩
衝液で５分間の振盪洗浄を３回行った後、ＰＯＤ標識抗
マウスイムノグロブリン抗体（ダコ社製）を加え、更に
室温で１時間反応させた。同様に、洗浄用緩衝液で４回
洗浄後、基質４−クロロナフトール溶液を加え、バンド
の確認を行った。結果を図１に示す。抑制試験は、ＷＢ
膜と抗体との反応時に５μｇ／ｍｌのＣ６を共存させて
行った。結果を図２に示す。
【００５２】図１に示すようにモノクローナル抗体Ｂ４
８−１５１は分子量２０万強のアポＢ−４８に相当する
位置にのみバンドを生じ、分子量約５５万のアポＢ−１
００相当位置にはバンドは見られなかった。また、図２
に示すように、モノクローナル抗体Ｂ４８−１５１のア
ポＢ−４８に相当する位置のバンドは、Ｃ６の共存で消
失した。この結果から、モノクローナル抗体Ｂ４８−１
５１は、アポＢ−４８を特異的に認識するモノクローナ
ル抗体であることが明白となった。なお、ＶＬＤＬフラ
クションでアポＢ−４８に相当するバンドが最も濃く出
ているのは、ＶＬＤＬフラクションにＣＭレムナントが
含まれているからだと考えられる。
８−１５１は分子量２０万強のアポＢ−４８に相当する
位置にのみバンドを生じ、分子量約５５万のアポＢ−１
００相当位置にはバンドは見られなかった。また、図２
に示すように、モノクローナル抗体Ｂ４８−１５１のア
ポＢ−４８に相当する位置のバンドは、Ｃ６の共存で消
失した。この結果から、モノクローナル抗体Ｂ４８−１
５１は、アポＢ−４８を特異的に認識するモノクローナ
ル抗体であることが明白となった。なお、ＶＬＤＬフラ
クションでアポＢ−４８に相当するバンドが最も濃く出
ているのは、ＶＬＤＬフラクションにＣＭレムナントが
含まれているからだと考えられる。
【００５３】実施例６ モノクローナル抗体Ｂ４８−１
５１固相ＥＬＩＳＡによるアポＢ−４８の測定 ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルより抽出調製したアポＢ−４８を
抗原としてサンドイッチＥＬＩＳＡを行った。すなわ
ち、実施例５と同様の方法により、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲ
ルで泳動したＶＬＤＬフラクションのアポＢ−４８バン
ド部分を切り取り、エレクトロエリューター（バイオラ
ッド社製）によりゲルから抽出して抗原を精製した。一
方、ヌンク社製ＥＬＩＳＡプレート（マキシソーブ）
に、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で１０μｇ／ｍｌの濃度に希
釈したモノクローナル抗体Ｂ４８−１５１を１ウェルに
７５μｌづつ入れ、４℃一晩放置して吸着させた後、１
％ＢＳＡ−ＰＢＳ（ｐＨ７．４）を１５０μｌ／ウェル
づつ入れ、３７℃で５時間放置してマスキングを行っ
た。抗体吸着プレートを洗浄用緩衝液で３回洗浄後、１
％ＢＳＡ−ＰＢＳで５μｇ／ｍｌから２ｎ希釈した精製
アポＢ−４８を７５μｌ／ウェルづつ入れ、３７℃で１
時間反応させた。
５１固相ＥＬＩＳＡによるアポＢ−４８の測定 ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルより抽出調製したアポＢ−４８を
抗原としてサンドイッチＥＬＩＳＡを行った。すなわ
ち、実施例５と同様の方法により、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲ
ルで泳動したＶＬＤＬフラクションのアポＢ−４８バン
ド部分を切り取り、エレクトロエリューター（バイオラ
ッド社製）によりゲルから抽出して抗原を精製した。一
方、ヌンク社製ＥＬＩＳＡプレート（マキシソーブ）
に、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で１０μｇ／ｍｌの濃度に希
釈したモノクローナル抗体Ｂ４８−１５１を１ウェルに
７５μｌづつ入れ、４℃一晩放置して吸着させた後、１
％ＢＳＡ−ＰＢＳ（ｐＨ７．４）を１５０μｌ／ウェル
づつ入れ、３７℃で５時間放置してマスキングを行っ
た。抗体吸着プレートを洗浄用緩衝液で３回洗浄後、１
％ＢＳＡ−ＰＢＳで５μｇ／ｍｌから２ｎ希釈した精製
アポＢ−４８を７５μｌ／ウェルづつ入れ、３７℃で１
時間反応させた。
【００５４】洗浄用緩衝液で３回洗浄後、ＰＯＤ標識抗
ヒトアポＢ抗体（ケミコン社製）を７５μｌ／ウェルづ
つ入れ、３７℃で１時間反応させた。洗浄用緩衝液で充
分洗浄し、基質ＡＢＴＳを７５μｌ／ウェルづつ入れ室
温で１５分放置後、４０５ｎｍの波長を測定した。反応
特異性を確認するため、アポＢ−１００（ケミコン社
製）を４０μｇ／ｍｌから同様の希釈方法にて抗原とし
て測定した。結果を図３に示す。図３に示すように、モ
ノクローナル抗体Ｂ４８−１５１を固相としたＥＬＩＳ
ＡでアポＢ−４８が特異的に測定できることが確認され
た。
ヒトアポＢ抗体（ケミコン社製）を７５μｌ／ウェルづ
つ入れ、３７℃で１時間反応させた。洗浄用緩衝液で充
分洗浄し、基質ＡＢＴＳを７５μｌ／ウェルづつ入れ室
温で１５分放置後、４０５ｎｍの波長を測定した。反応
特異性を確認するため、アポＢ−１００（ケミコン社
製）を４０μｇ／ｍｌから同様の希釈方法にて抗原とし
て測定した。結果を図３に示す。図３に示すように、モ
ノクローナル抗体Ｂ４８−１５１を固相としたＥＬＩＳ
ＡでアポＢ−４８が特異的に測定できることが確認され
た。
【００５５】実施例７ モノクローナル抗体Ｂ４８−１
５１固相ＥＬＩＳＡによる血清アポＢ−４８の測定 １％ＢＳＡ−ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で２０倍希釈した血
清を検体として、実施例６と同様の方法でアポＢ−４８
の測定を行った。検体には、健常者の空腹時及び食後１
時間の凍結保存血清の各８例（検体番号１〜８）を用い
た。結果を図４に示す。図４に示すように、どの検体も
食後１時間でアポＢ−４８が高値となり、ＣＭの挙動と
一致することが確認された。
５１固相ＥＬＩＳＡによる血清アポＢ−４８の測定 １％ＢＳＡ−ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で２０倍希釈した血
清を検体として、実施例６と同様の方法でアポＢ−４８
の測定を行った。検体には、健常者の空腹時及び食後１
時間の凍結保存血清の各８例（検体番号１〜８）を用い
た。結果を図４に示す。図４に示すように、どの検体も
食後１時間でアポＢ−４８が高値となり、ＣＭの挙動と
一致することが確認された。
【００５６】実施例８ 新鮮血清の界面活性剤処理
固相抗体と新鮮血清との反応時の緩衝液に各種界面活性
剤を添加し、モノクローナル抗体Ｂ４８−１５１固相Ｅ
ＬＩＳＡでの反応性を検討した。界面活性剤は、陰イオ
ン性界面活性剤としてＳＤＳ（ナカライテスク社製）、
デオキシコール酸ナトリウム（和光純薬社製）、非イオ
ン性界面活性剤としてトライトンＸ−１００（ナカライ
テスク社製）、トライトンＸ−１１４（ナカライテスク
社製）、ツィーン−２０（ナカライテスク社製）、ツィ
ーン−８０（ナカライテスク社製）、ＮＰ−４０（シグ
マ社製）、ＭＥＧＡ−８（同仁化学研究所製）、Ｂｒｉ
ｊ−３５（シグマ社製）を用いた。
剤を添加し、モノクローナル抗体Ｂ４８−１５１固相Ｅ
ＬＩＳＡでの反応性を検討した。界面活性剤は、陰イオ
ン性界面活性剤としてＳＤＳ（ナカライテスク社製）、
デオキシコール酸ナトリウム（和光純薬社製）、非イオ
ン性界面活性剤としてトライトンＸ−１００（ナカライ
テスク社製）、トライトンＸ−１１４（ナカライテスク
社製）、ツィーン−２０（ナカライテスク社製）、ツィ
ーン−８０（ナカライテスク社製）、ＮＰ−４０（シグ
マ社製）、ＭＥＧＡ−８（同仁化学研究所製）、Ｂｒｉ
ｊ−３５（シグマ社製）を用いた。
【００５７】ヌンク社製ＥＬＩＳＡプレート（マキシソ
ーブ）にＰＢＳ（ｐＨ７．４）で１０μｇ／ｍｌの濃度
に希釈したモノクローナル抗体Ｂ４８−１５１抗体を７
５μｌ／ウェルづつ入れ、４℃一晩放置し吸着させた。
次に１％ＢＳＡ−ＰＢＳ（ｐＨ７．４）を１５０μｌ／
ウェルづつ入れ、３７℃で５時間放置しマスキングを行
った。抗体吸着プレートを洗浄用緩衝液で３回洗浄後、
それぞれ２％、０．４％、０．０８％、０．０１６％の
濃度で各種界面活性剤を含むＰＢＳ（ｐＨ７．４）を用
い、２０倍希釈した血清を７５μｌ／ウェルづつ入れ、
３７℃で１時間反応させた。洗浄用緩衝液で３回洗浄
後、ヨシタケらの方法でアルカリフォスファターゼ（以
下、Ａｌｐともいう）標識した抗ヒトアポＢ−１００モ
ノクロナール抗体（Ｂ１００−２２８；自家製）を７５
μｌ／ウェルづつ入れ、３７℃で１時間反応させた。洗
浄用緩衝液で充分洗浄し、基質４−ニトロフェノールリ
ン酸（以下、ｐＮＰＰともいう）を７５μｌ／ウェルづ
つ入れ３７℃で３０分放置後、４０５ｎｍの波長を測定
した。検体には、高脂血清及び空腹時血清を用いた。結
果を図５、図６に示す。
ーブ）にＰＢＳ（ｐＨ７．４）で１０μｇ／ｍｌの濃度
に希釈したモノクローナル抗体Ｂ４８−１５１抗体を７
５μｌ／ウェルづつ入れ、４℃一晩放置し吸着させた。
次に１％ＢＳＡ−ＰＢＳ（ｐＨ７．４）を１５０μｌ／
ウェルづつ入れ、３７℃で５時間放置しマスキングを行
った。抗体吸着プレートを洗浄用緩衝液で３回洗浄後、
それぞれ２％、０．４％、０．０８％、０．０１６％の
濃度で各種界面活性剤を含むＰＢＳ（ｐＨ７．４）を用
い、２０倍希釈した血清を７５μｌ／ウェルづつ入れ、
３７℃で１時間反応させた。洗浄用緩衝液で３回洗浄
後、ヨシタケらの方法でアルカリフォスファターゼ（以
下、Ａｌｐともいう）標識した抗ヒトアポＢ−１００モ
ノクロナール抗体（Ｂ１００−２２８；自家製）を７５
μｌ／ウェルづつ入れ、３７℃で１時間反応させた。洗
浄用緩衝液で充分洗浄し、基質４−ニトロフェノールリ
ン酸（以下、ｐＮＰＰともいう）を７５μｌ／ウェルづ
つ入れ３７℃で３０分放置後、４０５ｎｍの波長を測定
した。検体には、高脂血清及び空腹時血清を用いた。結
果を図５、図６に示す。
【００５８】図５に示すように、界面活性剤を含まない
ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で血清を希釈した場合は、全く発
色が見られず、アポＢ４８Ｃ末エピトープが露出されて
いないと判断した。界面活性剤を含むＰＢＳ（ｐＨ７．
４）を用いた場合は、０．１％付近のトライトンＸ−１
００、ツィーン２０、ＮＰ−４０等の非イオン性界面活
性剤で強い発色がみられた。これら界面活性剤処理で
は、アポＢ４８Ｃ末エピトープが露出されたと判断し
た。これに対し、ＭＥＧＡ−８、Ｂｒｉｊ−３５、ＳＤ
Ｓ等の界面活性剤では、発色が弱いかまたはほとんど見
られなかった。実施例９の結果も考慮すると、ＭＥＧＡ
−８はアポＢ４８Ｃ末エピトープ露出効果が弱く、ＳＤ
Ｓ、特に０．１％以上のＳＤＳは免疫反応を阻害し、Ｂ
ｒｉｊ−３５は両方に関与している可能性が考えられ
た。
ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で血清を希釈した場合は、全く発
色が見られず、アポＢ４８Ｃ末エピトープが露出されて
いないと判断した。界面活性剤を含むＰＢＳ（ｐＨ７．
４）を用いた場合は、０．１％付近のトライトンＸ−１
００、ツィーン２０、ＮＰ−４０等の非イオン性界面活
性剤で強い発色がみられた。これら界面活性剤処理で
は、アポＢ４８Ｃ末エピトープが露出されたと判断し
た。これに対し、ＭＥＧＡ−８、Ｂｒｉｊ−３５、ＳＤ
Ｓ等の界面活性剤では、発色が弱いかまたはほとんど見
られなかった。実施例９の結果も考慮すると、ＭＥＧＡ
−８はアポＢ４８Ｃ末エピトープ露出効果が弱く、ＳＤ
Ｓ、特に０．１％以上のＳＤＳは免疫反応を阻害し、Ｂ
ｒｉｊ−３５は両方に関与している可能性が考えられ
た。
【００５９】実施例９ 界面活性剤の免疫反応への影響
固相化ペプチドＣ６とモノクローナル抗体Ｂ４８−１５
１との反応時に実施例８と同様の各種界面活性剤を添加
し、反応性を検討した。ヌンク社製ＥＬＩＳＡプレート
（マキシソーブ）にＰＢＳ（ｐＨ７．４）で１μｇ／ｍ
ｌの濃度に希釈したペプチドＣ６を７５μｌ／ウェルづ
つ入れ、４℃一晩放置し吸着させた。次に１％ＢＳＡ−
ＰＢＳ（ｐＨ７．４）を１５０μｌ／ウェルづつ入れ、
３７℃で５時間放置しマスキングを行った。洗浄用緩衝
液で３回洗浄後、それぞれ２％、０．４％、０．０８
％、０．０１６％の濃度で各種界面活性剤を含むＰＢＳ
（ｐＨ７．４）を用い、２．５μｇ／ｍｌに希釈したモ
ノクローナル抗体Ｂ４８−１５１を７５μｌ／ウェルづ
つ入れ、３７℃で１時間反応させた。洗浄用緩衝液で３
回洗浄後、ＰＯＤ標識抗マウスイムノグロブリン抗体
（ダコ社製）を７５μｌ／ウェルづつ入れ、３７℃で１
時間反応させた。洗浄用緩衝液で充分洗浄し、基質ＡＢ
ＴＳを７５μｌ／ウェルづつ入れ室温で１５分放置後、
４０５ｎｍの波長を測定した。結果を図７に示す。
１との反応時に実施例８と同様の各種界面活性剤を添加
し、反応性を検討した。ヌンク社製ＥＬＩＳＡプレート
（マキシソーブ）にＰＢＳ（ｐＨ７．４）で１μｇ／ｍ
ｌの濃度に希釈したペプチドＣ６を７５μｌ／ウェルづ
つ入れ、４℃一晩放置し吸着させた。次に１％ＢＳＡ−
ＰＢＳ（ｐＨ７．４）を１５０μｌ／ウェルづつ入れ、
３７℃で５時間放置しマスキングを行った。洗浄用緩衝
液で３回洗浄後、それぞれ２％、０．４％、０．０８
％、０．０１６％の濃度で各種界面活性剤を含むＰＢＳ
（ｐＨ７．４）を用い、２．５μｇ／ｍｌに希釈したモ
ノクローナル抗体Ｂ４８−１５１を７５μｌ／ウェルづ
つ入れ、３７℃で１時間反応させた。洗浄用緩衝液で３
回洗浄後、ＰＯＤ標識抗マウスイムノグロブリン抗体
（ダコ社製）を７５μｌ／ウェルづつ入れ、３７℃で１
時間反応させた。洗浄用緩衝液で充分洗浄し、基質ＡＢ
ＴＳを７５μｌ／ウェルづつ入れ室温で１５分放置後、
４０５ｎｍの波長を測定した。結果を図７に示す。
【００６０】図７に示すように、トライトンＸ−１０
０、ツィーン２０、ＮＰ−４０等の非イオン性界面活性
剤では、免疫反応に対する影響はみられなかった。これ
に対し、Ｂｒｉｊ−３５、ＳＤＳでは、免疫反応に対す
る影響がみられた。特に、ＳＤＳは、０．１％以上では
免疫反応は完全に阻害された。
０、ツィーン２０、ＮＰ−４０等の非イオン性界面活性
剤では、免疫反応に対する影響はみられなかった。これ
に対し、Ｂｒｉｊ−３５、ＳＤＳでは、免疫反応に対す
る影響がみられた。特に、ＳＤＳは、０．１％以上では
免疫反応は完全に阻害された。
【００６１】
【発明の効果】本発明は、上述の構成よりなり、抗アポ
Ｂ−４８モノクローナル抗体を取得することが可能とな
ったので、アポＢ−４８を特異的に認識することによ
り、簡易で確実な動脈硬化症の診断及び治療が可能とな
った。
Ｂ−４８モノクローナル抗体を取得することが可能とな
ったので、アポＢ−４８を特異的に認識することによ
り、簡易で確実な動脈硬化症の診断及び治療が可能とな
った。
【００６２】
【配列表】<110> 富士レビオ株式会社 FUJIREBIO INC.
<120> ハイブリドーマ、モノクローナル抗体、測定方法
及び免疫測定試薬 <130> FR24 <150> JP 1997299439 <151> 1997-10-15 <160> 3 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 配列表フリーテキスト アポＢ−４８のＣ−末端から４残基のアミノ酸配列に相
当する部分に、そのＮ−末端にシステインを結合したペ
プチド <210> 2 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 配列表フリーテキスト アポＢ−４８のＣ−末端から５残基のアミノ酸配列に相
当する部分に、そのＮ−末端にシステインを結合したペ
プチド <210> 3 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 配列表フリーテキスト アポＢ−４８のＣ−末端から６残基のアミノ酸配列に相
当する部分に、そのＮ−末端にシステインを結合したペ
プチド
及び免疫測定試薬 <130> FR24 <150> JP 1997299439 <151> 1997-10-15 <160> 3 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 配列表フリーテキスト アポＢ−４８のＣ−末端から４残基のアミノ酸配列に相
当する部分に、そのＮ−末端にシステインを結合したペ
プチド <210> 2 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 配列表フリーテキスト アポＢ−４８のＣ−末端から５残基のアミノ酸配列に相
当する部分に、そのＮ−末端にシステインを結合したペ
プチド <210> 3 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 配列表フリーテキスト アポＢ−４８のＣ−末端から６残基のアミノ酸配列に相
当する部分に、そのＮ−末端にシステインを結合したペ
プチド
【図１】実施例５で行った本発明に係るＢ４８−１５１
モノクローナル抗体の各リポ蛋白フラクションに対する
反応を示す図である。
モノクローナル抗体の各リポ蛋白フラクションに対する
反応を示す図である。
【図２】実施例５で行った本発明に係るＢ４８−１５１
モノクローナル抗体の各リポ蛋白フラクションに対する
反応の、Ｃ６ペプチドによる抑制を示す図である。
モノクローナル抗体の各リポ蛋白フラクションに対する
反応の、Ｃ６ペプチドによる抑制を示す図である。
【図３】実施例６で行った本発明に係るＢ４８−１５１
モノクローナル抗体を固相としたＥＬＩＳＡ測定法によ
る試験結果を示す図である。
モノクローナル抗体を固相としたＥＬＩＳＡ測定法によ
る試験結果を示す図である。
【図４】実施例７で行った本発明に係るＢ４８−１５１
モノクローナル抗体を固相としたＥＬＩＳＡ測定法によ
る試験結果を示す図である。
モノクローナル抗体を固相としたＥＬＩＳＡ測定法によ
る試験結果を示す図である。
【図５】実施例８で行った、界面活性剤で処理した高脂
血清を用いた場合の、本発明に係るＢ４８−１５１モノ
クローナル抗体を固相としたＥＬＩＳＡ測定法による試
験結果を示す図である。Ｔｘ−１００はトライトンＸ−
１００、Ｔｘ−１１４はトライトンＸ−１１４、Ｔｗ−
２０はツィーン−２０、Ｔｗ−８０はツィーン−８０、
Ｄｅｏｘｙ−ｃｈ．はデオキシコール酸ナトリウムを表
す。ＰＢＳは界面活性剤を添加せずに試験を行ったこと
を表す。
血清を用いた場合の、本発明に係るＢ４８−１５１モノ
クローナル抗体を固相としたＥＬＩＳＡ測定法による試
験結果を示す図である。Ｔｘ−１００はトライトンＸ−
１００、Ｔｘ−１１４はトライトンＸ−１１４、Ｔｗ−
２０はツィーン−２０、Ｔｗ−８０はツィーン−８０、
Ｄｅｏｘｙ−ｃｈ．はデオキシコール酸ナトリウムを表
す。ＰＢＳは界面活性剤を添加せずに試験を行ったこと
を表す。
【図６】実施例８で行った、界面活性剤で処理した空腹
時血清を用いた場合の、本発明に係るＢ４８−１５１モ
ノクローナル抗体を固相としたＥＬＩＳＡ測定法による
試験結果を示す図である。
時血清を用いた場合の、本発明に係るＢ４８−１５１モ
ノクローナル抗体を固相としたＥＬＩＳＡ測定法による
試験結果を示す図である。
【図７】実施例９で行った本発明に係るＢ４８−１５１
モノクローナル抗体を固相としたＥＬＩＳＡ測定法に対
する界面活性剤の影響の試験結果を示す図である。
モノクローナル抗体を固相としたＥＬＩＳＡ測定法に対
する界面活性剤の影響の試験結果を示す図である。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ
Ｇ０１Ｎ 33/50 Ｇ０１Ｎ 33/577 Ｂ
33/53 Ｃ１２Ｒ 1:91
33/577 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ｃ
(Ｃ１２Ｐ 21/08 5/00 Ｂ
Ｃ１２Ｒ 1:91）
(56)参考文献 特開 昭61−7299（ＪＰ，Ａ)
特表 平６−505867（ＪＰ，Ａ)
Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ Ｂｉｏｐｈｙ
ｓｉｃａ Ａｃｔａ，1996年Ｖｏｌ.
1301，Ｎｏ．３，ｐ．221−229
Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ,
1993，Ｖｏｌ．85，Ｎｏ．５，ｐ．521
−524
(58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名)
C12N 15/00 - 15/90
ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ)
ＣＡ（ＳＴＮ)
Claims (4)
- 【請求項１】 アポＢ−４８のＣ末端より６個のアミノ
酸残基からなるペプチド（Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｔｈｒ−Ｔ
ｙｒ−Ｍｅｔ−Ｉｌｅ）を哺乳動物（但しヒトを除く）
に免疫することによって得られるリンパ球とミエローマ
細胞とを融合し、得られたハイブリドーマを、ウエスタ
ンブロッティング法により、アポＢ−４８に相当するバ
ンドに対する反応性に基づいて選別し、実質的にアポＢ
−１００とは反応せず、アポＢ−４８を特異的に認識す
るモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを作製
するハイブリドーマの製造方法。 - 【請求項２】 請求項１に記載のハイブリドーマの製造
方法を用いてなるハイブリドーマ。 - 【請求項３】 ハイブリドーマＢ４８−１５１（寄託番
号：ＦＥＲＭ ＢＰ−６４７３）である請求項２に記載
のハイブリドーマ。 - 【請求項４】 請求項２又は３に記載のハイブリドーマ
から得られるモノクローナル抗体。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP31403298A JP3440852B2 (ja) | 1997-10-15 | 1998-10-15 | ハイブリドーマ、モノクローナル抗体、測定方法及び免疫測定試薬 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP29943997 | 1997-10-15 | ||
| JP9-299439 | 1997-10-15 | ||
| JP31403298A JP3440852B2 (ja) | 1997-10-15 | 1998-10-15 | ハイブリドーマ、モノクローナル抗体、測定方法及び免疫測定試薬 |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2003096045A Division JP3833183B2 (ja) | 1997-10-15 | 2003-03-31 | ハイブリドーマ、モノクローナル抗体、測定方法及び免疫測定試薬 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH11239479A JPH11239479A (ja) | 1999-09-07 |
| JP3440852B2 true JP3440852B2 (ja) | 2003-08-25 |
Family
ID=26561934
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP31403298A Expired - Lifetime JP3440852B2 (ja) | 1997-10-15 | 1998-10-15 | ハイブリドーマ、モノクローナル抗体、測定方法及び免疫測定試薬 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3440852B2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2013224863A (ja) * | 2012-04-20 | 2013-10-31 | Fujirebio Inc | 免疫測定用標準品 |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2005093415A1 (ja) * | 2004-03-29 | 2005-10-06 | Shibayagi Co., Ltd. | アポリポタンパク質ｂ－４８の測定方法およびその用途 |
-
1998
- 1998-10-15 JP JP31403298A patent/JP3440852B2/ja not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ，１９９６年Ｖｏｌ．１３０１，Ｎｏ．３，ｐ．２２１−２２９ |
| Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９３，Ｖｏｌ．８５，Ｎｏ．５，ｐ．５２１−５２４ |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2013224863A (ja) * | 2012-04-20 | 2013-10-31 | Fujirebio Inc | 免疫測定用標準品 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH11239479A (ja) | 1999-09-07 |
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