WO1995009363A1

WO1995009363A1 - Procede de titrage de lipoproteine oxydee et applications de ce procede

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Publication number: WO1995009363A1
Application number: PCT/JP1994/001594
Authority: WO
Inventors: Eiji Matsuura; Tomoyoshi Katahira; Takao Koike
Original assignee: Yamasa Corporation
Priority date: 1993-09-29
Filing date: 1994-09-28
Publication date: 1995-04-06
Also published as: CA2172247A1; US5900359A; JP3370334B2; EP0722086A4; AU7707294A; EP0722086A1

Description

明細書酸化リボタンパク質の測定法およびその用途技術分野

本発明は、酸化リポタンパク質と 2-グリコプロティン I ( /32- G P I ) の特異的な結合反応を利用した酸化リポ夕ンパク質の免疫測定法及びその用途に関するものである。

背景技術

脂質は、一般に難水溶性物質であるため、生体内においてはリポタンパク質（非極性脂質である、トリグリセリドとコレステ .リルエステルの核をリン脂質とタンノ、。ク質で被った複合体）の形で組織から組織へと運搬されている。リポタンパク質は、その水和密度の違いにより、カイロミクロン（ 0. 9 5 0 g Zm l 以下）、超低密度リポタンノ、。ク質（V L D L, 0. 9 5 0 g /m l 〜

1 . 0 0 6 g / m 1 ) 、低密度リポタンパク質（ L D L 1 . O O S g Zm l l . 0 6 3 g Zm l ) 、および高密度リポタンノ、。ク質（ H D L , 1 . 0 6 3 g Zm l 〜 1 . 2 1 0 g Zm l ) の 4種類に分類されている。なおこれらリポタンパク質を構成するタンパク質は、 " アポリポタンパク質 " と称されている。

' リポタンパク質は、生体内の脂質運搬のみならず、動脈硬化の発症および進行に深く関与している。すなわち冠状動脈硬化症や脳動脈硬化症などの動脈硬化性疾患の危険因子の一つは、血中リポタンパク質濃度（特に、 L D L濃度）が上昇する高コレステロール血症であるが、これらの疾患において、 L D L は動脈硬化の促進作用を. H D L は L D L とは逆の抑制作用をそれぞれ担っているものと考えられている。

また、最近の研究から、リポタンパク質の酸化物が動脈硬化の発症を促すことも示唆されている。すなわち、動脈硬化発症の初期の段階において、血管内膜のマクロファージは、コレステロールを多量に含有する酸化 L D Lをレセプターを介して特異的に取り込み泡沫化することが解明されている（なお、酸化を受けていない L D L は、マクロファージによっては取り込まれない）。このことは、酸化 L D L に対する抗体を用いた免疫組織染色により、動脈硬化病変部位に酸化 L D Lが広く分布していることからも裏付けられている。一方、 H D L は、泡沫細胞からのコレステロールの流出を刺激する作用を有するが、酸化 H D Lではこの作用が著しく低下することも解明されている。

このように、動脈硬化性疾患と酸化リポタンパク質とは密接に関係することが示唆され、酸化リポタンパクを特異的に測定することは、動脈硬化の発症メカニズムの解析や動脈硬化性疾患の診断の一助になり得る可能性を有している。

従来、酸化リポタンパク質の測定法としては、酸化リポタンパク質を免疫して得られる抗体を用いた R I A法または E I A法が報告されている（たとえば、

Biochimica et Biophysica Acta, 963, 208-214(1988) 、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86， 1372-1376(1989) 、

CI inica Chimica Acta, 218, 97-103(1993) 参照）。

発明の開示

発明者らは、血中における酸化リポタンパク質の存在形態を詳細に解析した結果、 ①血中を循環している 2 - G P I は酸化を受けたリポタンパク質の酸化部位と結合すること、 ②抗リン脂質抗体症候群由来の抗カルジオリピン抗体が /32- G P I と酸化リポタンパク質の複合体に反応することから、 /32- G P I と酸化リポタンパク質の複合体には /52- G P I とリン脂質の複合体のみに存在する抗原決定基と類似の構造の存在が示唆されること、などを見いだし、本発明を完成させた。

すなわち、本発明は、下記の A群から選ばれた固相試薬と B群から選ばれた抗体試薬の少なくとも二種類の試薬を使用し、サンドイッチ法により /32- G P I と酸化リポタンパク質の複合体（ S 2- G P I · 酸化リポタンパク質複合体）を測定する方法（本発明方法 1 ) 及びキット (本発明キット 1 ) に関するものである。

A群； ①固相化抗カルジオリピン抗体

②固相化抗リポタンパク質抗体（または固相化抗アポリポタンパク質抗体）

③固相化抗 82-G P I 抗体 B群； ①抗カルジォリピン抗体

②抗リポタンパク質抗体（または抗ァポリポタンパク質抗体）

③抗 S 2- G P I 抗体

また、本発明は、下記の C群から選ばれた固相試薬と抗体試薬として抗カルジオリピン抗体を使用し、競合法により /32- G P I · 酸化リポタンパク質複合体を測定する方法（本発明方法 2 ) 及びキット（本発明キット 2 ) に関するものである。

C群； ①固相化カルジオリピン · ；52- G P I 複合体

②特定の担体に固定化された固相化 /32- G P I さらに、本発明は、上記方法及びキットを動脈硬化性疾患の診断に利用することに関するものである。

図面の簡単な説明

第 1 図は、酸化 L D Lに対する ^ 2- G P I の結合性を示したものである。

第 2図は、 /S 2-G P I · 酸化 L D L複合体に対する抗カルジォリピン（ a C L ) 抗体の反応性を示したものでめる ₀

第 3図は、抗 L D L抗体および抗アポ Βタンパク質抗体の反応性を示したものである。

第 4 図は、 a C L抗体を利用した競合的 E L I S A法による酸化 L D Lの測定結果を示したものである。

第 5 図は、 a C L抗体と抗 L D L抗体を利用したサンドイッチ E L I S A法による酸化 L D Lの測定結果を示したものである。

第 6図は、抗アポ Bタンノ、 'ク質抗体と抗 /32- G P I 抗体を利用したサンドイッチ E L I S A法による酸化 L D

Lの測定結果を示したものである。

第 7図は、抗 y82-G P I 抗体と抗 L D L抗体を利用したサンドイッチ E L I S A法による酸化 L D Lの測定結果を示したものである。

第 8図は、 a C L抗体と抗アポ Bタンパク質抗体を利用したサンドイッチ E L I S A法による酸化 L D Lの測定結果を示したものである。

第 9 図は、 a C L抗体と抗 H D L抗体を利用したサンドイッチ E L I S A法による酸化 H D Lの測定結果を示したものである。

第 1 0図は、健常人検体と急性心筋梗塞患者検体に含まれる酸化 L D L量を測定した結果を示したものである発明を実施するための最良の形態

本明細書において使用される各用語は、以下の定義の通りである。

「 /32-G P I J ；

内因性凝固反 Cfe系に対する働きが注目されている公知の血清タンパク質。本発明においては、哺乳類に属する動物由来のものであればいずれのものでも使用でき、 β 2-G Ρ I 中の糖鎖が一部もしくは全部欠如したものであつてもよい。

「抗 /32- G Ρ I 抗体」； /3 2- G P I に結合する抗体。特に、 /8 2- G P I 上の酸化リボタンパク質との結合部位を認識しない抗体が好ましい。

「抗カルジォリピン抗体」；

自己免疫疾患などの抗リン脂質抗体症候群の患者血清中に見い出されるような、リン脂質と /5 2- G P I の複合体に反応する抗体。

Γ抗リポタンパク質抗体」；

リポタンパク質に結合する抗体。特に、酸化リポタンパク質の S 2- G P I 結合部位を認識しない抗体が好ましい。

「抗ァポリポタンパク質抗体」；

リボタンパク質中のアポリポ夕ンパク質部分に結合する抗体。特に、酸化リポタンパク質の /3 2- G P I 結合部位を認識しない抗体が好ましい。

「特定の担体に固定化された固相化 2- G P I 」；合成樹脂の表面に物理的、化学的に水酸基、カルボ二ル基、カルボキシル基などの極性基が導入された担体に yS 2- G P I を固相化したものを指称する。

本発明でサンプルとして使用する生体試料は、酸化リポ夕ンパク質を含有するものであれば特に限定されず、具体的には血液または血清、血漿などの血液分画物などを使用することができる。また、サンプルの前処理として、酸化リポタンパク質を含むサンプルに /3 2- G P I を添加反応させ、 2- G P I · 酸化リポタンパク質複合体を形成させておくことが肝要である。ただし、血清サンプルのように、すでに十分量の 3 2- G P I が存在し、サンプル中の酸化リポタンノク質が 2- G P I ' 酸化リポタンパク質複合体を形成している場合には、上記前処理を省略することができる。なお、この前処理は、本発明方法の反応時に同時に行ってもかまわない。

(1) 本発明方法

本発明方法 1 は、上述したように、下記の A群から選ばれた固相試薬と B群から選ばれた抗体試薬の少なくとも二種類の試薬を使用し、サンドイッチ法により /3 2- G P I · 酸化リポタンパク質複合体を測定する方法に関するものである。

A群； ①固相化抗カルジオリピン抗体

③固相化抗 ^ 2 - G P I 抗体

B群； ①抗カルジォリピン抗体

③抗 5 2 - G P I 抗体

上記 A群と B群の各試薬の組み合わせは、酸化リポ夕ンパク質を測定できる組み合わせであれば特に限定されない。たとえば、好適な試薬の組み合わせとしては下記の組み合わせを例示することができる。

(組み合わせ 1 ) A群：固相化抗カルジオリピン抗体

B群：抗リポタンパク質抗体（または抗アポリポ夕ンパク質抗体）及び Zまたは抗 2- G P I 抗体

(組み合わせ 2 )

A群：固相化抗リポタンパク質抗体（または固相化抗ァポリポタンパク質抗体）

B群：抗カルジオリピン抗体及び Zまたは抗 /5 2 - G

P I 抗体

(組み合わせ 3 )

A群：固相化抗 ^ 2- G P I 抗体

B群：抗カルジォリピン抗体及び Zまたは抗リポ夕ンパク質抗体（または抗ァポリポタンパク質抗体）

(組み合わせ 4 )

A群：固相化抗カルジオリピン抗体

B群：抗カルジオリピン抗体

さらに好適な試薬の組み合わせとしては下記の組み合わせを例示することができる。

(組み合わせ 5 )

A群：固相化抗カルジオリピン抗体

B群：抗リポタンパク質抗体（または抗ァポリボタンパク質抗体）

(組み合わせ 6 )

B群：抗カルジオリピン抗体及びまたは抗 /3 2- G

P I 抗体

(組み合わせ 7 )

A群：固相化抗 /5 2- G P I 抗体

A及び B群の試薬を調製する際に使用する抗体としては、それ自体公知の方法を適宜応用して調製したものを使用することができる。

たとえば、抗カルジオリピン抗体としては、抗リン脂質抗体症候群の患者血清、またはこの血清から単離精製された抗体画分であってもよく、また N Z Wマウスと B X S Bマウス力ヽらの F 1 マウスの脾臓細胞とミエローマ細胞との細胞融合により得られるモノクローナル抗体であってちよい o

また、抗リポタンパク質抗体、抗ァポリポタンパク質抗体または抗 2- G P I 抗体は、既に市販されているものもあり、その場合にはそれを使用することができる。また、公知の各血清タンパク質を抗原として使用し、常法により調製されたものを使用することもできる。使用する上記各抗体の種類は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、それらの活性フラグメント〔 F

( a b ' ) 2 、 F a b ' など〕など特に制限されない。なお、上記各抗体を調製する際に抗原として使用する各血清タンパク質は哺乳動物由来のものが好ましく、血清中から単離精製されたもの、組換え D N A手法により調製されたもののいずれであってもかまわない。

上記 A群に属する固相試薬を調製する際に使用する担体としては、通常使用されているもの、たとえば、ポリ塩化ビニル、ポリスチレン、スチレンージビニルベンゼン共重合体、スチレン一無水マレイン酸共重合体、ナイロン、ポリビニルアルコール、ポリアクリルアミド、ポリアクリロニトリル、ポリプロピレン、ポリメチレンメタクリレートなどの合成有機高分子化合物、デキストラン誘導体（セフアデックスなど）、ァガロースゲル（セファロ一ス、ノくィォゲルなど）、セルロース（ぺ一パーディスク、濾紙など）などの多糖類、ガラス、シリカゲル、シリコーンなどの無機高分子化合物を例示することができ、これらはァミノ基、カルボキシル基、カルボ二ル基、水酸基、スルヒドリル基などの官能基が導入されたものであってもよい。特に、ポリスチレンまたはポリ塩化ビニルを好適な例として挙げることができる。

担体の形状は、平板状（マイクロ夕イタ一プレート、ディスクなど）、粒子状（ビーズなど）、管状（試験管など）、繊維状、膜状、微粒子状（ラテックス粒子など）、カプセル状、小胞体状などいずれの形状であってもよく、測定法に応じて好適な形状の担体を適宜選択すればよい。

上記 A群に属する固相試薬は、上記担体上に目的の抗体を結合させることにより調製することができる。担体と抗体の結合は、物理的吸着法、イオン結合法、共有結合法、包括法など公知の方法〔たとえば、「固定化酵素」（千畑一郎編、昭和 5 0 年 3 月 2 0 日、（株）講談社発行）参照〕を採用することができ、とりわけ、物理的吸着法は簡便である点で好ましい。また、上記結合は直接行ってもよく、両物質の間に他の物質（スぺーサーなど）を介して行ってもよい。

このようにして得られた固相試薬は、非特異的結合を抑制するため、ゼラチン、 B S Aなどの通常のブロッキング剤を用いてブロッキング処理を施してもよい。

上記 B群に属する抗体試薬は、免疫測定法で常用されている標識剤で標識されていてもよく、そのような標識剤としては、放射性同位体（たとえば ^{3 2} P、 ³ H、 ^{1 4} C 1^{2 5} I など）、酵素（たとえば； 8 — ガラクトシダーゼ、ペルォキシダーゼ、ァノレカリホスファタ一ゼ、グルコ一ス— 6 — リン酸デヒドロゲナ一ゼ、力タラ一ゼ、グルコ —スォキシダ一ゼ、乳酸ォキシダ一ゼ、アルコールォキシダーゼ、モノアミンォキシダーゼなど）、補酵素 ■ 補欠分子族（たとえば、 F A D、 F M N、 A T P、ビォチン、ヘムなど）、フルォレセイン誘導体（たとえば、フルォレセインイソチオシァネート、フルォレセインチォフルバミルなど）、ローダミン誘導体（たとえば、テトラメチルローダミン B イソチオシァネートなど）、ゥ厶ベリフエロンおよび 1 — ァニリノ一 8 — ナフ夕レンスルホン酸などの蛍光色素、ルミノール誘導体〔たとえば、ルミノール、イソノレミノール、 N— （ 6 — ァミノへキシル） — N —ェチルイソルミノールなど〕などを例示することができる。

抗体と標識剤との結合は、成書〔たとえば、「続生化学実験講座 5 免疫生化学研究法」（株）東京化学同人、 ( 1 9 8 6 年発行）第 1 0 2 〜 1 1 2 頁〕に記載されているような公知の方法から適宜選択して実施すればよい, このような固相試薬と抗体試薬を用いての測定手順は- 通常のサンドイッチ法の手順をそのまま採用すればよい ₍ すなわち、固相試薬と被検サンプルを反応させ、必要により B F分離後、さらに抗体試薬 ^反応させる（ツーステツプ法）か、固相試薬、被検サンプル及び抗体試薬を同時に反応させ（ワンステップ法）、反応後いずれの場合でもそれ自体公知の方法によりサンプル中の酸化リポタンパク質を検出または定量することができる。

また、本発明方法 2 は、下記の C群から選ばれた固相試薬と抗体試薬として抗カルジオリピン抗体を使用し、競合法により /3 2- G P I と酸化リポタンパク質の複合体を測定する方法に関するものである。

C群； ①固相化カルジオリピン · 3 2- G P I 複合体

②特定の担体に固定化された固相化 2- G P I 抗体試薬として使用する抗カルジォリピン抗体は、上述のものと同じものを例示することができる。 . 上記 C群の固相試薬の中、固相化カルジオリピン — 3 2- G P I 複合体は、担体（前記の抗体の結合に用いたものと同じもの）上にカルジオリピンを常法により結合させ、これをさらに 3 2- G P I と反応させて得られたものしある。

特定の担体に固定化された固相化； 8 2- G P I は、特定の担体に S 2- G P I を固定化する点を除けば、固相化抗体試薬と同様にして得られたものである。なお、特定の担体とは、前記の定義のように、物理化学的処理（例えば、放射線照射、ォゾン処理など）により、合成樹脂の表面に水酸基、カルボニル基、カルボキシル基などの極性基が導入された担体であり、具体的には、 E Bプレート（ラボシステムズ社製）、 Hタイププレート、 C タイププレート（住友ベークライト社製）、マキシソーププレート（ヌンク社製）などを例示することができる。

このような固相試薬と抗体試薬を用いての測定手順は. 通常の競合法の手順をそのまま採用すればよい。すなわち、抗体試薬に対し、固相試薬と被検サンプル中の S 2 - G P I · 酸化リポタンパク質複合体を競合反応させ、反応後それ自体公知の方法によりサンプル中の酸化リポ夕ンパク質を検出または定量することができる。

なお、サンドイッチ法、競合法などの免疫測定法の詳細に付いては、たとえば以下の文献を参照すればよい。 ①入江寛編「続ラジオィムノアツセィ」（（株）講談社、昭和 5 4 年 5 月 1 日発行）

②石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第 2 版）（（株）医学書院、 1 9 8 2 年 1 2 月 1 5 日発行）

③臨床病理臨時増刊特集第 5 3 号「臨床検査のためのィムノアツセィー技術と応用一」（臨床病理刊行会、

1 9 8 3 年発行）

④ 「バイオテクノロジー事典」（（株）シーエムシ一、

1 9 8 6 年 1 0 月 9 日発行）

⑤ 「Methods in ENZY OLOGY Vol.70」 ( Immunochemical techniques (Part A) )

⑥ 「Methods in ENZYMOLOGY Vol.73」（ Immunochemical techniques (Part B) )

⑦ 「Methods in ENZYMOLOGY Vol.74j ( Immunochemical techniques (Part C) )

⑧ 「Methods in ENZYMOLOGY Vol.84J ( Immunochemical techniques (Part D： Selected Immunoassay) ) ⑨ 「Methods in ENZYMOLOGY Vol.92」 ( Immunochemical techniques (Part E .-Monoclonal Anti odies and General Immunoassay Methods))

[⑤〜⑨はァ力デミックプレス社発行]

(2) 本発明のキット

本発明の測定キットの中、キット 1 は本発明方法 1 を. キット 2 は本発明方法 2 をそれぞれ実施するためのものである。 .

すなわち、キット 1 は、下記の A群から選ばれた固相試薬と B群から選ばれた抗体試薬の少なくとも二種類の試薬を構成試薬として含有することを特徴としている。 A群； ①固相化抗カルジオリピン抗体

③固相化抗 ^ 2- G P I 抗体

B群； ①抗カルジォリピン抗体

③抗 2- G P I 抗体

また、キット 2 は、下記の C群から選ばれた固相試薬と抗体試薬として抗カルジオリピン抗体を構成試薬として含有することを特徴とするものである。

C群； ①固相化カルジオリピン · ）δ 2- G P I 複合体

②特定の担体に固定化された固相化 /S 2- G Ρ I 上記 A〜 C群に属する各試薬は、上述した方法により調製することができる。また、上記 A〜 C群に属する各試薬のほかに、必要により、発色試薬、反応停止用試薬標準抗原試薬、サンプル前処理用試薬などの各試薬から測定法に応じた適当な試薬を適宜選択し、本発明のキットに添付することができる。

以下、実施例を示し、本発明を具体的に説明する。 (1) 実施例で使用する抗体の説明；

① S L E - 1

抗リン脂質抗体症候群患者由来の抗カルジォリピン ( a C L ) 抗体陽性血清で、カルジォリピンと；8 2- G P I の複合体に結合性を有する。 ② W B — C A L — 1 及び W B — C A L — 3

N Z W x B X S B F 1 ( W/ B F l ) マウス由来の a C L抗体産生細胞とミエローマ細胞を細胞融合して得たハイブリドーマから得られるモノクローナル a C L抗体 CThe Journal of Immunology, 149, 1063-106 8(1992) 〕で、カルジォリピンと 2-G P I の複合体に結合性を有する。

③ C 0 f — 2 2

ヒト 32-G P I を免疫した B A L B Z c マウスの脾細胞とミエローマ細胞を細胞融合して得たハイプリドーマから得られるモノクローナル抗 yS 2- G P I 抗体で、 /32- G P I に結合性を有する（W 0 9 2 / 1 9 7 5 5 ) 。ただし、 /32- G P I 上の酸化リポタンパク質との結合部位は認識しない。

④ 9 F 5 — 3 及び 1 0 E 3 — 3

酸化 L D L を免疫した B A L B Z c マウスの脾細胞とミエローマ細胞を細胞融合して得たハイプリドーマから得られるモノクローナル抗 L D L抗体で、酸化 L D L及び非酸化 L D L に結合性を有する。ただし、酸化 L D L の /52- G P I 結合部位を認識しない（第 3 図参照）。

なお、このような抗体は公知の方法により容易に取得可能である（ J. Bio. Chem. , 269, 15274-15279(1994), Science 241, 215-218(1988), Am. J. Pathol. , 135, 815-8 25(1989). Biochim, Biophys. Acta.963, 208-214(1988) など参照） ⑤ 1 D 2及び 5 G 6

ヒト精製アポ Bタンノ、。ク質（Medix Biotech Inc. Fost er，CA ) を免疫した B A L B Z c マウスの脾細胞とミエローマ細胞を細胞融合して得たハイプリドーマから得られるモノクローナル抗アポ Bタンパク質抗体で、アポ B タンパク質に結合性を有する。ただし、酸化 L D Lの； 8 2-G P I 結合部位を認識しない（第 3図参照）。

なお、このような抗体はケミコン社などから市販されているので、それを使用してもかまわない。

⑥ H 1 - モノクロ一ナル抗 H D L抗体で、酸化 H D L及び非酸化 H D Lに結合性を有する。ただし、酸化 H D Lの； S 2 - G P I 結合部位を認識しない。

なお、このような抗体は抗 L D L抗体の場合と同様に公知の方法により容易に取得可能である。

(2) 酸化 L D Lの調製

6 0 0 z gのヒト L D L ( Organon Teknika Corp, Durham, NC ) を、 5 〃 M C u S 0₄ を含む P B S ( 2 m 1 ) 中で 3 7 °C、 2 4 時間処理した。

(3) L D L中の過酸化脂質の定量

非酸化 L D Lあるいは酸化 L D Lの各サンプル

( 0. 4 m l ) に対し、 8 . 1 % S D S ( 0. 1 m l ) 、 2 0 %酢酸（ ρ Η 3. 5、 0 . 7 5 m l ) および 0 . 8 %チォバルビツール酸（ 0. 7 5 m 1 ) を加え、 9 5 °C で 1 時間反応させた。冷却後、蒸留水（ 0 . 5 m 1 ) 、 n —ブタノールとピリジンの混合溶媒（ 1 5 ： 1 、

2 . 5 m l ) を添加撹拌した。 3 0 0 0 r p m、 2 0 分間の遠心後、有機層を採取し、 5 3 2 n inの吸光度を測定した。なお、標準品としてテトラメトキシプロパンを用いた。過酸化脂質量をマロンジアルデヒド当量で表わすと、非酸化 L D Lでは 8 . 8 n m o l Zm gであるのに対し、酸化 L D Lでは 5 0 . 8 n m o l Zm gであつた。

実施例 1 ：酸化 L D L に対する G P I の結合性（第

1 図）

ポリスチレンプレートの各ゥエルに 2 m g / m 1 の酸化 L D L ( O x L D L ) または非酸化 L D L ( native L D L ) を 5 0 1 ずつ添加し、 4 °Cで 1 6 — 2 4 時間静置した。 0 . 0 5 % T w e e n 2 0 含有 P B S ( P B S — T w e e n ) で洗浄後、適宜希釈した /32- G P I を 1 0 0 〗入れ、室温で 1 時間反応させた。洗浄後、ぺルォキシダ一ゼ標識抗 ^ 2- G P I 抗体（ C o f - 2 2 ) を 1 0 0 1 ずつ入れ、さらに室温で 1 時間反応させた _c 洗浄後、 0 . 0 0 5 %過酸化水素含有 0 . 3 m Mテトラメチルベンジジン（ T M B Z ) 溶液を 1 0 0 〃 1 ずつ添加し、室温で 1 0 分間反応後、 2 N硫酸を 1 0 0 1 ずつ添加して反応を停止し、 4 5 O n mの吸光度を測定した。

その結果、第 1 図に示すように、酸化 L D Lのみに /3 2- G P I が結合することが明らかとなつた。実施例 2 ： S 2-G P I · 酸化 L D L複合体に対する a C L抗体の反応性（第 2図）

ポリスチレンプレー卜の各ゥエルに 2 UL g / m 1 の酸化 L D L もしくは非酸化 L D Lを 5 0 1 ずつ添加し、 4 でで 1 6 — 2 4 時間静置した。 P B S — Tw e e nで洗浄後、 ^32- G P I ( 1 0 0 g /m l ) 存在下もしくは非存在下で、適宜希釈した WB - C A L - 1 を室温で 1 時間反応させた。洗浄後、ペルォキシダーゼ標識抗マウス I g G抗体を 1 0 0 1 ずつ添加し、さらに室温で 1 時間反応させた。洗浄後、 0 . 0 0 5 %過酸化水素含有 0. 3 mM TM B Z溶液をずつ添加して室温で 1 0分間反応後、 2 N硫酸を 1 0 Ο ί ΐ ずつ添加して反応を停止し、 4 5 O n mの吸光度を測定した。その結果、第 2図に示すように、 ^ 2- G P I · 酸化 L D L複合体のみに a C L抗体が結合することが明らかとなった。

実施例 3 ：抗 L D L抗体および抗アポ Bタンパク質抗体の反応性（第 3図）

ポリ塩化ビニルプレー卜の各ゥヱノレに 2 n g / m 1 の酸化 L D L もしくは非酸化 L D Lを 5 0 1 ずつ添加し 4 °Cで 1 6 — 2 4 時間静置した。 P B Sで洗浄後、 3 % ゼラチン溶液を 2 0 0 1 ずつ入れ、室温で 1 時間静置した。ゼラチン溶液を除去後、適宜希釈した /32- G P I 'および一定量のペルォキシダーゼ標識抗 L D L抗体（ 9 F 5 — 3、 1 0 E— 3 ) もしくはペルォキシダーゼ標識抗アポ B タンパク質抗体（ 1 D 2 、 5 G 6 ) を室温で 1 時間反応させた（全量 5 0 1 ) 。洗浄後、 0 . 0 0 5 %過酸化水素含有 0 . 3 m M T M B Z溶液を 1 0 0 〃 1 ずつ添加して室温で 1 0 分間反応後、 2 N硫酸を 5 0 1 ずつ添加して反応を停止し、 4 5 0 n mの吸光度を測定した。

その結果、第 3 図に示すように、抗 L D L抗体および抗アポ B タンパク質抗体の両抗体とも酸化 L D Lの S 2 - G P I 結合部位を認識しないことが明らかとなった。

実施例 4 ：競合的 E L I S A法による酸化 L D Lの測定

(第 4 図）

酸素原子を含有する極性基が導入されたポリスチレンプレート〔 C タイププレート（住友ベークライト社製）：）の各ゥエルに 1 0 〃 111 1 の _/82-0 ? 1 を 5 0 〃 1 ずつ添加し、 4 °Cで 1 6 — 2 4 時間静置した。 P B S — T w e e nで洗浄後、 S 2- G P I ( 1 0 0 ^ g /m 1 ) 存在下もしくは非存在下で、 a C L抗体、すなわち 1 0 0 倍希釈した S L E — 1 血清もしくは 0 . 5 〃 g / m 1 の W B — C A L — 1 を、適宜希釈した酸化 L D L もしくは非酸化 L D L と室温で 1 時間反応させた。洗浄後、ペルォキシダーゼ標識抗ヒトもしくはマウス I g G抗体を 1 0 0 1 ずつ添加し、さらに室温で 1 時間反応させた。洗浄後、 0 . 0 0 5 %過酸化水素含有 0 . 3 m M T M B Z溶液を 1 0 0 1 ずつ添加して室温で 1 0 分間反応後、 2 N硫酸を 1 0 0 1 ずつを添加して反応を停止し、 4 5 0 n mの吸光度を測定した。

その結果、第 4 図に示すように、 a C L抗体に対して固相化 /S 2-G P I と /32- G P I · 酸化 L D L複合体が競合的に反応し、この原理を利用して酸化 L D Lを測定できることが明らかとなった。

実施例 5 ：サンドイッチ E L I S A法による酸化 L D L の測定（ 1 ) (第 5 図）

ポリスチレンプレートの各ウエノレに 5 n g / m 1 の a C L抗体（W B — C A L— 1 もしくは W B — C A L — 3 ) を 5 0 〃 1 ずつ添加し、 4 でで 1 6 - 2 4 時間静置した。 P B S — Tw e e nで洗浄後、適宜希釈した酸化 L D Lあるいは非酸化 L D Lのサンプルを 5 0 1 添加し、更に、 2 0 0 〃 g Zm l の 32- G P I を 5 0 n 1 ずつ添加して、室温にて 1 時間反応させた。洗浄後、ペルォキシダーゼ標識抗 L D L抗体（ 9 F 5 — 3 ) を 1 0 0 / 1 ずつ添加し、室温で 1 分間反応させた。洗浄後、 0. 0 0 5 %過酸化水素含有 0 . 3 mM T M B Z溶液を 1 0 0 1 ずつ添加して室温で 1 0分間反応後、 2 N 硫酸を 1 0 0 / 1 ずつを添加して反応を停止し、 4 5 0 n mの吸光度を測定した。

その結果、第 5 図に示すように、 a C L抗体と抗 L D L抗体を利用したサンドイッチ法により /S 2- G P I ，酸化 L D L複合体を特異的に測定でき、酸化 L D Lの測定に利用できることが明らかとなつた。

実施例 6 ：サンドイッチ E L I S A法による酸化 L D L の測定（ 2 ) (第 6図）

ポリスチレンプレー卜の各ゥエルに 5 g / m 1 の抗アポ Bタンパク質抗体（ 1 D 2 もしくは 5 G 6 ) を 5 0 〃 1 ずつ添加し、 4 でで 1 6 — 2 4 時間静置した。 P B Sで 3回洗浄後、適宜希釈した酸化 L D Lあるいは非酸化 L D Lのサンプルを 5 0 1 添加し、更に、 2 0 0 g Zm l の 32- G P I を 5 0 1 ずつ添加して、室温にて 1 時間反応させた。洗浄後、ペルォキシダーゼ標識抗 /S 2- G P I抗体（ C o f — 2 2 ) を 1 0 0 / 1 ずつ添加し、室温で 1 時間反応させた。洗浄後、 0. 0 0 5 %過酸化水素含有 0. 3 mM TM B Z溶液を Ι Ο Ο ί Ι ずつ添加して室温で 1 0分間反応後、 2 Ν硫酸を 1 0 0 1 ずつ添加して反応を停止し、 4 5 0 n mの吸光度を測定した。

その結果、第 6図に示すように、抗アポ Bタンパク質抗体と抗 32- G P I 抗体を利用したサンドィツチ法により 2- G P I ■ 酸化 L D L複合体を特異的に測定でき、酸化 L D Lの測定に利用できることが明らかとなつた。実施例 7 ：サンドイッチ E L I S A法による酸化 L D L の測定（ 3 ) (第 7図）

ポリ塩化ビニルプレートの各ゥエルに 1 0 〃 g / m 1 の抗 /32- G P I 抗体（ C o f - 2 2 ) を 5 0 μ. 1 ずつ添加し、 4 °Cで 1 6 — 2 4 時間静置した。 P B Sで洗浄後、 3 %ゼラチン溶液を 2 0 0 1 ずつ添加し、室温で 1 時間静置した。ゼラチン溶液を除去した後、 1 0 0 g Z m 1 の 2- G P I を 5 0 〃 1 ずつ添加し、室温で 1 時間反応させた。洗浄後、酸化 L D Lあるいは非酸化 L D L のサンプルを 5 0 1 添加し、室温で 1 時間反応させた, 洗浄後、ペルォキシダーゼ標識抗 L D L抗体（ 1 0 Ε 3 - 3 ) を 5 0 1 ずつ添加し、室温にて 1 時間反応させた。洗浄後、 0. 0 0 5 %過酸化水素含有 0. 3 mM TM B Z溶液を 1 0 Ο ί 1 ずつ添加して室温で 1 0分間反応後、 2 Ν硫酸を 5 0 1 ずつ添加して反応を停止し. 4 5 0 n mの吸光度を測定した。

その結果、第 7図に示すように、抗 32-G P I 抗体と抗 L D L抗体を利用したサンドィツチ法により /32-G P I - 酸化 L D L複合体を特異的に測定でき、酸化 L D L の測定に利用できることが明らかとなった。

実施例 8 ：サンドイッチ E L I S A法による酸化 L D L の測定（ 4 ) (第 8 図）

ポリスチレンプレー卜の各ウエノレに 5 g /m 1 の a C L抗体（WB— C A L — 1 ) を 5 0 fi 1 ずつ添加し. 4 °Cで 1 6 — 2 4 時間静置した。 P B Sで洗浄後、 3 % ゼラチン溶液を 3 0 0 n 1 ずつ添加し、室温で 1 時間静置した。ゼラチン溶液を除去した後、 2 0 0 / g Zm l の； 82- G P I を 5 0 / l ずつ添加し、さらに適宜希釈したリポタンパク質を 5 0 fi 1 -ずつ添加し、室温で 2時間反応させた。 P B Sで洗浄後、ペルォキシダ一ゼ標識抗アポ Bタンパク質抗体（ 1 D 2 ) を 5 0 〃 1 ずつ添加し. 室温にて 1 時間反応させた。 P B Sで洗浄後、 0 . 0 0 5 %過酸化水素含有 0. 3 mM TM B Z溶液を 1 0 0 / 1 ずつ添加して室温で 2 0分間反応後、 2 N硫酸を 5 0 1 ずつ添加して反応を停止し、 4 5 0 n mの吸光度を測定した。

その結果、第 8図に示すように、 a C L抗体と抗アポ Bタンパク質抗体を利用したサンドイッチ法により / δ 2 - G Ρ I · 酸化 L D L複合体を測定でき、酸化 L D Lの測定に利用できることが明らかとなつた。

実施例 9 ：サンドイッチ E L I S A法による酸化 H D L の測定（第 9 図）

ポリスチレンプレー卜の各ゥエルに 5 S / m 1 の a C L抗体（WB— C A L— 1 ) を 5 0 1 ずつ添加し、 4 °Cで 1 6 — 2 4 時間静置した。 P B Sで洗浄後、 3 % ゼラチン溶液を 3 0 0 1 ずつ添加し、室温で 1 時間静置した。ゼラチン溶液を除去した後、 2 0 0 〃 g Zm l の； S 2- G P I を 5 0 〃 1 ずつ添加し、さらに適宜希釈したリポタンパク質を 5 0 1 ずつ添加し、室温で 2時間反応させた。 P B Sで洗浄後、ペルォキシダーゼ標識抗 H D L抗体（H I ) を 5 0 H 1 ずつ添加し、室温にて 1 時間反応させた。 P B Sで洗浄後、 0. 0 0 5 %過酸化水素含有 0. 3 mM TM B Z溶液を 1 0 ずつ添加して室温で 2 0 分間反応後、 2 N硫酸を 5 0 1 ずつ添加して反応を停止し、 4 5 0 11 111の吸光度を測定した。

その結果、第 9図に示すように、 a C L抗体と抗 H D L抗体を利用したサンドイッチ法により /32- G P I ，酸化 H D L複合体を測定でき、酸化 H D L の測定に利用できることが明らかとなった。

実施例 1 0 ：血清中の酸化 L D Lの測定（第 1 0 図）ポリスチレンプレー卜の各ウエノレに 5 g / m 1 の a C L抗体（W B — C A L — 1 ) を 5 0 〃 1 ずつ添加し、 4 °Cで 1 6 _ 2 4 時間静置した。 P B Sで洗浄後、ゼラチン溶液を 3 0 0 1 ずつ添加し、室温で 1 時間静置してブロックした。ゼラチン溶液を除去した後、 2 0 0 / g /m l の S 2- G P I を 5 0 1 ずつ添加し、さらに適宜希釈した血清検体を 5 0 1 ずつ添加し、室温にて 2 時間反応させた。 P B Sで洗浄後、ペルォキシダーゼ標識抗アポ Β抗体（ 1 D 2 ) を 1 0 0 1 ずつ添加し、室温で 1 時間反応させた。 P B Sで洗浄後、 0 . 0 0 5 % 過酸化水素含有 0 . 3 m M T M B Z溶液を

ずつ添加して室温で 2 0 分間反応後、 1 N硫酸を 1 0 0 1 ずつ添加して反応を停止し、 4 5 0 n mの吸光度を測定した。

その結果、第 1 0 図に示すように、健常人（ normal) 検体に比べ、急性心筋梗塞患者（ A M I ) 検体に含まれる酸化 L D Lの存在量は有意に高値を示した。

産業上の利用可能性

本発明の測定法及びキットは、酸化リポタンパク質と ^ 2-G P I との特異的な結合を利用したものであって、この特異的な結合反応を利用することにより、リポタンパク質の実用的な測定法の提供を初めて可能としたのである。

また、本発明では、サンプル中の酸化リポタンノ、。ク質を、血中の存在状態である 3 2- G P I ' 酸化リポタンパク質複合体として測定するため、動脈硬化性疾患（たとえば、糖尿病性動脈硬化、心筋梗塞、脳梗塞など）の臨床症状が強く反映された測定値を得ることができ、これら疾患の診断に有用である。

Claims

1. 下記の Α群から選ばれた固相試薬と B群から選ばれた抗体試薬の少なくとも二種類の試薬を使用し、サンドイッチ法により 2-グリコプロテイン I ( 2- G P I ) と酸化リポタ請シパク質の複合体を測定することを特徴とする酸化リポタンパク質の測定法。 A群； ①固相化抗カルジォのリピン抗体

②固相化抗リポ夕ンパク質抗体（または固相化抗範

ァポリポタンパク質抗体）

囲

③固相化抗 3 2- G P I 抗体

B群； ①抗カルジォリピン抗体

③抗 3 2- G P I 抗体

2. 試薬として、 A群から固相化抗カルジオリピン抗体を選択し、 B群から抗リポタンパク質抗体（または抗アポリポタンパク質抗体）及び Zまたは抗 ^ 2- G P I 抗体を選択して使用する、請求の範囲第 1 項記載の測定法

3. 試薬として、 A群から固相化抗リポタンパク質抗体（または固相化抗ァポリポタンパク質抗体）を選択し B群から抗カルジオリピン抗体及び Zまたは抗 3 2- G P I 抗体を選択して使用する、請求の範囲第 1 項記載の測定法。

4. 試薬として、 A群から固相化抗 2- G P I 抗体を選択し、 B群から抗カルジオリピン抗体及び Zまたは抗リポタンパク質抗体（または抗アポリポタンパク質抗体）を選択して使用する、請求の範囲第 1 項記載の測定

5. 試薬として、 A群から固相化抗カルジォリピン抗体を選択し、 B群から抗カルジオリピン抗体を選択して使用する、請求の範囲第 1 項記載の測定法。

6. 下記の A群から選ばれた固相試薬と B群から選ばれた抗体試薬の少なくとも二種類の試薬を構成試薬として含有することを特徴とする、サンドイッチ法による酸化リポタンパク質の測定用キット。

A群； ①固相化抗カルジオリピン抗体

②固相化抗リポタンパク質抗体（または固相化抗ァポリボタンパク質抗体）

③固相化抗 ^ 2 - G P I 抗体

B群； ①抗カルジォリピン抗体

③抗 /5 2- G P I 抗体

7. 試薬として、 A群から固相化抗カルジォリピン抗体を選択し、 B群から抗リポタンパク質抗体（または抗アポリポタンパク質抗体）及びノまたは抗 S 2- G P I 抗体を選択して使用する、請求の範囲第 6 項記載のキット 8. 試薬として、 A群から固相化抗リポタンパク質抗体（または固相化抗ァポリポタンパク質抗体）を選択し.

B群から抗カルジオリピン抗体及び Zまたは抗 3 2_ G P I 抗体を選択して使用する、請求の範囲第 6 項記載のキッ卜

9. 試薬として、 A群から固相化抗 S 2- G P I 抗体を選択し、 B群から抗カルジオリピン抗体及び Zまたは抗リポタンパク質抗体（または抗ァポリポタンパク質抗体）を選択して使用する、請求の範囲第 6 項記載のキッ卜 o

10. 試薬として、 A群から固相化抗カルジォリピン抗体を選択し、 B群から抗カルジオリピン抗体を選択して使用する、請求の範囲第 6 項記載のキット。

1 1. 下記の C群から選ばれた固相試薬と抗体試薬として抗カルジォリピン抗体を使用し、競合法により /3 2- G P I と酸化リポタンパク質の複合体を測定することを特徴とする、酸化リポタンパク質の測定法。

C群； ①固相化カルジオリピン · /S 2- G P I 複合体

②特定の担体に固定化された固相化 3 2- G P I

12. 固相試薬として、固相化カルジォリピン · /3 2- G P I 複合体を使用する、請求の範囲第 1 1 項記載の測定法。

1 3. 固相試薬として、特定の担体に固定化された固相化 2- G P I を使用する、請求の範囲第 1 1 項記載の測定法。

'

1 4. 下記の C群から選ばれた固相試薬と抗体試薬として抗カルジォリピン抗体を構成試薬として含有することを特徴とする、競合法による酸化リポタンパク質の測定用キッ卜 o

C群； ①固相化カルジオリピン ■ /32- G P I 複合体

②特定の担体に固定化された固相化 ^ 2-G P I

15. 固相試薬として、固相化カルジォリピン ' 2- G P I 複合体を使用する、請求の範囲第 1 4 項記載のキッ卜 o

16. 固相試薬として、特定の担体に固定化された固相化 /32- G P I を使用する、請求の範囲第 1 4 項記載のキッ卜。

17. 生体試料中の酸化リポタンパク質と S 2- G P I との複合体を測定し、動脈硬化性疾患の診断に利用するためのキット。

18. 酸化リポタンパク質と /52- G P I との複合体の測定に請求の範囲第 6 項または請求の範囲第 1 4 項記載のキットを使用する、請求の範囲第 1 7 項記載のキット。

19. 動脈硬化性疾患が、糖尿病性動脈硬化、心筋梗塞または脳梗塞から選ばれたものである、請求の範囲第 1 7 項記載のキット。