JP2021124416A - 酸化ＬＤＬ／β２ＧＰＩ複合体の検出方法、及び、検出キット - Google Patents

Abstract

【課題】 生体試料中に含まれる酸化ＬＤＬ／β_２ＧＰＩ複合体の容易かつ迅速な検出方法とそれに用いる検出キットを提供することを課題とする。
【解決手段】 ラテラルフローアッセイ用テストストリップを用い、酸化ＬＤＬ／β_２ＧＰＩ複合体と結合する第一結合コンポーネントを介して、前記試料中に含まれる酸化ＬＤＬ／β_２ＧＰＩ複合体を前記テストストリップの所定の位置に固定する工程、及び、標識体を含む第二結合コンポーネントを、テストストリップの所定の位置に固定された前記酸化ＬＤＬ／β_２ＧＰＩ複合体に結合させることで、当該酸化ＬＤＬ／β_２ＧＰＩ複合体を標識する工程を含む酸化ＬＤＬ／β_２ＧＰＩ複合体の検出方法とそれに用いる検出キットを提供することによって解決する。
【選択図】 図５

Description

本発明は試料中の酸化ＬＤＬ／β_２ＧＰＩ複合体の検出方法、及び、検出キットに関する。

抗リン脂質抗体症候群をはじめとする種々の動脈硬化性疾患において、患者の血中には、酸化ＬＤＬ／β_２ＧＰＩ複合体が存在し、動脈硬化の進展に寄与することが明らかとされている。また、血中に含まれる酸化ＬＤＬ／β_２ＧＰＩ複合体を測定することにより、動脈硬化巣の大きさが推定でき、動脈硬化の進行状況をモニタリングすることができる。

酸化ＬＤＬ／β_２ＧＰＩ複合体を検出又は定量する手法としては、ＥＬＩＳＡ法（Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎｏ Ｓｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ法）が知られている（特許文献１）。しかしながら、ＥＬＩＳＡ法は、種々の試薬の添加、インキュベーション、洗浄という煩雑な実験操作を繰り返し行う方法であるため、検査を行うスタッフに高い実験技術が要求されるとともにハイスループット性に欠けるという問題点があった。

特許第５６１６５９２号公報

本発明は、上記従来技術の問題点を解決するために為されたものであり、生体試料中に含まれる酸化ＬＤＬ／β_２ＧＰＩ複合体の容易かつ迅速な検出方法とそれに用いる検出キットを提供することを課題とする。

本発明者らは、上記課題を解決するために、鋭意研究努力を重ねた結果、ラテラルフローを用いた測定系によれば、従来のＥＬＩＳＡ法と比較して遥かに迅速かつ容易に、且つ、驚くべきことに、広いダイナミックレンジで試料中に含まれる酸化ＬＤＬ／β_２ＧＰＩ複合体を検出、定量できることを見出した。

すなわち、本発明は、
試料中に含まれる酸化ＬＤＬとβ_２−グリコプロテインＩの複合体（酸化ＬＤＬ／β_２ＧＰＩ複合体）の検出方法であって、
ラテラルフローアッセイ用テストストリップを用い、
酸化ＬＤＬ／β_２ＧＰＩ複合体と結合する第一結合コンポーネントを介して、前記試料中に含まれる酸化ＬＤＬ／β_２ＧＰＩ複合体を前記テストストリップの所定位置に捕捉する工程、及び、
標識体を含む第二結合コンポーネントを、テストストリップの所定位置に固定された前記酸化ＬＤＬ／β_２ＧＰＩ複合体に結合させることで、当該酸化ＬＤＬ／β_２ＧＰＩ複合体を標識する工程、
を含むことを特徴とする酸化ＬＤＬ／β_２ＧＰＩ複合体の検出方法を提供することによって、上記課題を解決するものである。

酸化ＬＤＬ／β_２ＧＰＩ複合体と結合する第一結合コンポーネントとしては、酸化ＬＤＬ／β_２ＧＰＩ複合体と結合し、当該第一結合コンポーネントを介して酸化ＬＤＬ／β_２ＧＰＩ複合体をラテラルフローアッセイ用テストストリップの所定位置に捕捉することができる限り、酸化ＬＤＬ／β_２ＧＰＩ複合体のどの部位とどのようなメカニズムで結合するものを用いても良い。しかし、本発明者らが独自に見出した知見によれば、第一結合コンポーネントは、酸化ＬＤＬ／β_２ＧＰＩ複合体を構成するβ_２ＧＰＩに特異的に結合する第一結合部を備えていることが好ましい。そのような第一結合コンポーネントとしては、例えば、酸化ＬＤＬ／β_２ＧＰＩ複合体を構成するβ_２ＧＰＩに特異的に結合する抗β_２ＧＰＩ抗体が好適である。抗β_２ＧＰＩ抗体を第一結合コンポーネントとして用いることによって、試料中に含まれる酸化ＬＤＬ／β_２ＧＰＩ複合体をより優れた感度で検出、測定することができる

なお、酸化ＬＤＬ／β_２ＧＰＩ複合体を構成するβ_２ＧＰＩに特異的に結合する第一結合部を備える第一結合コンポーネントを用いることによって、試料中に含まれる酸化ＬＤＬ／β_２ＧＰＩ複合体をより優れた感度で検出できるのは、以下の理由によるのではないかと推測される。すなわち、本発明に係る検出方法においては、第一結合コンポーネントは、酸化ＬＤＬ／β_２ＧＰＩ複合体と結合して、当該複合体をテストストリップの所定位置に捕捉する役割を担うものであるところ、検出対象とする酸化ＬＤＬ／β_２ＧＰＩ複合体は、一つの酸化ＬＤＬ粒子と、疾患の状態にもよるが、通常、複数のβ_２ＧＰＩ分子を構成要素として含んでいる（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ２００１， ｖｏｌ．４２， ｎｏ．５， ｐｐ．６９７−７０９.）。したがって、第一結合コンポーネントが、酸化ＬＤＬ／β_２ＧＰＩ複合体を構成するβ_２ＧＰＩ分子と特異的に結合する第一結合部を備えている場合には、第一結合コンポーネントは、複数の結合点で当該複合体と結合することができることになるため、テストストリップ上の所定の位置に酸化ＬＤＬ／β_２ＧＰＩ複合体をより高い確率で捕捉することができるものと推測される。因みに、酸化ＬＤＬ／β_２ＧＰＩ複合体を構成するβ_２ＧＰＩ分子と特異的に結合する第一結合部を備えている第一結合コンポーネントとしては、前述したとおり、例えば、抗β_２ＧＰＩ抗体が挙げられる。

また、本発明は、その好適な一態様において、
前記第一結合コンポーネントが、
酸化ＬＤＬ／β_２ＧＰＩ複合体を構成するβ_２ＧＰＩ分子と特異的に結合する前記第一結合部と、第一の特異的結合要素とを含む第一結合ユニットと、
前記第一の特異的結合要素と特異的に結合する第二の特異的結合要素を含む第二結合ユニットであって、テストストリップ上の所定位置に位置している第二結合ユニット、
を含み、
第一結合コンポーネントを介して、前記試料中に含まれる酸化ＬＤＬ／β_２ＧＰＩ複合体を前記テストストリップの所定の位置に捕捉する前記工程が、酸化ＬＤＬ／β_２ＧＰＩ複合体と前記第一結合ユニットの前記第一結合部とを結合させる工程と、前記第一結合ユニットの前記第一の特異的結合要素と前記第二結合ユニットの前記第二の特異的結合要素とを結合させる工程とを含んでいることを特徴とする酸化ＬＤＬ／β_２ＧＰＩ複合体の検出方法に係るものである。なお、酸化ＬＤＬ／β_２ＧＰＩ複合体と前記第一結合ユニットの前記第一結合部とを結合させる工程は、前記テストストリップ上で行っても良いし、前記テストストリップ外で行っても良い。

第一結合コンポーネントが、前記第一結合ユニットと前記第二結合ユニットを備えている場合には、酸化ＬＤＬ／β_２ＧＰＩ複合体を第一結合コンポーネントを介してテストストリップの所定位置に捕捉する工程が、酸化ＬＤＬ／β_２ＧＰＩ複合体と第一結合ユニットの前記第一結合部とを結合させる工程と、第一結合ユニットの第一の特異的結合要素と第二結合ユニットの第二の特異的結合要素とを結合させる工程の二つの工程に分けて行われることになる。その結果、例えば、第一結合ユニットの第一結合部についていえば、テストストリップへの一時的な固定のし易さよりも、前記複合体との特異的な結合効率を重視して、前記複合体と特異的に結合する第一結合部を選択することができるという利点が得られる。また、第一結合ユニットの第一の特異的結合要素、及び第二結合ユニットの第二の特異的結合要素についていえば、検出対象とする前記複合体との特異的な結合効率よりも、ラテラルフローにより輸送されてくる検出対象とする物質の捕捉効率を主に考慮して、第一及び第二の特異的結合要素の組み合わせを選択することができ、感度の高い検出が可能になるという利点が得られる。

なお、酸化ＬＤＬ／β_２ＧＰＩ複合体と第一結合ユニットの第一結合部とを結合させる工程と、第一結合ユニットの第一の特異的結合要素と第二結合ユニットの第二の特異的結合要素とを結合させる工程とは、どちらを先に行っても良いし、同時に行われるようにしても良いが、酸化ＬＤＬ／β_２ＧＰＩ複合体と第一結合ユニットの前記第一結合部とを結合させる工程を時間的に先に行うのが好ましく、テストストリップ上で行う場合には、ラテラルフローのより上流側で行うのが好ましい。因みに、酸化ＬＤＬ／β_２ＧＰＩ複合体と第一結合ユニットの前記第一結合部とを結合させる工程は、テストストリップ上で行っても良いが、テストストリップ外で行うのが好ましく、テストストリップ外で行う場合には、酸化ＬＤＬ／β_２ＧＰＩ複合体と第一結合ユニットの前記第一結合部とを結合させる反応に適した温度、時間等の条件を自由に設定することができるという利点が得られる。

第一結合ユニットと第二結合ユニットが備えている第一の特異的結合要素及び第二の特異的結合要素としては、特異的かつ強固な結合を形成する任意の物質の組み合わせを用いることができる。本発明に係る検出方法の好適な一態様においては、前記第一の特異的結合要素及び前記第二の特異的結合要素は、それぞれ、アビジン及びビオチン若しくはその逆、ストレプトアビジン及びビオチン若しくはその逆、又は、ニュートラビジン及びビオチン若しくはその逆のいずれかであるのが好ましい。これらの特異的結合要素の組み合わせは解離定数が１０^−１５Ｍ程度にも及ぶ非常に強い結合を形成する。この結合は、本発明に係る検出方法において第一結合コンポーネントの結合部を提供する物質として典型的に用いられる抗体、フラグメント抗体、アプタマー、及びペプチド等が酸化ＬＤＬ／β_２ＧＰＩ複合体形成する結合と比較して非常に強い結合であり、ラテラルフローにより輸送されてくる前記複合体と第一結合ユニットとの結合体を、漏れなく、効率良く、テストストリップ上の所定位置に捕捉し、検出感度の向上に寄与することができるという利点を有している。なお、「アビジン及びビオチン若しくはその逆」とは、アビジンが第一の特異的結合要素でビオチンが第二の特異的結合要素であっても良いし、その逆に、アビジンが第二の特異的結合要素でビオチンが第一の特異的結合要素であっても良いことを意味している。他の「ストレプトアビジン及びビオチン若しくはその逆」及び「ニュートラビジン及びビオチン若しくはその逆」についても同様である。

また、本発明は、その好適な一態様において、前記第二結合コンポーネントが、酸化ＬＤＬ／β_２ＧＰＩ複合体を構成するアポリポプロテインＢ−１００（ａｐоＢ１００）に結合する第二結合部を備えている。

なお、本発明が検出対象とする酸化ＬＤＬ／β_２ＧＰＩ複合体は、複合体一つあたり、一つの酸化ＬＤＬ粒子を構成要素として含んでおり当該ＬＤＬ粒子には、通常、一つの粒子当たり一つのａｐоＢ１００が含まれている（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ２００１， ｖｏｌ．４２， ｎｏ．９， ｐｐ．１３４６−１３６７；Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎｄ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ， ２０１６， ｖｏｌ．３９， ｎｏ．１， ｐｐ．１−２４．）。したがって、当該ａｐоＢ１００に結合する結合部を備えている第二結合コンポーネントを介して酸化ＬＤＬ／β_２ＧＰＩ複合体を標識することにより、テストストリップ上の前記所定の位置に捕捉されている酸化ＬＤＬ／β_２ＧＰＩ複合体一つあたり一つの標識体を結合させることができるため、優れた精度で酸化ＬＤＬ／β_２ＧＰＩ複合体を測定することができ、より定量性に優れた酸化ＬＤＬ／β_２ＧＰＩ複合体の検出が可能になる。

また、本発明は、その好適な一態様において、前記酸化ＬＤＬ／β_２ＧＰＩ複合体と前記第一結合部との結合が、抗原抗体反応に基づく結合であることを特徴とする酸化ＬＤＬ／β_２ＧＰＩ複合体の検出方法であり、また、前記酸化ＬＤＬ／β_２ＧＰＩ複合体と前記第二結合部との結合が、抗原抗体反応に基づく結合であることを特徴とする酸化ＬＤＬ／β_２ＧＰＩ複合体の検出方法である。

また、前記第二結合コンポーネントに含まれる標識体としては、標識体として機能し、何らかの手段でその有無、更には量を検出することができるものであれば、斯界で使用されている如何なる標識体を用いても良いが、好適な一態様において、前記標識体は金ナノ粒子、白金ナノ粒子、銀ナノ粒子、金−プラチナ合金ナノ粒子等の金属ナノ粒子又はコロイド状量子ドットである。

また、本発明は、さらに、以上の検出方法を実施するための検出キットを提供することによって、上記課題を解決するものである。

本発明に係る酸化ＬＤＬ／β_２ＧＰＩ複合体の検出方法によれば、生体試料などの試料中に含まれる酸化ＬＤＬ／β_２ＧＰＩ複合体を、従来のＥＬＩＳＡ法と比較して、迅速かつ容易に、しかも広いダイナミックレンジで検出、定量することができるという利点が得られる。また、本発明に係る検出キットによれば、熟練を要することなく、試料中に含まれる酸化ＬＤＬ／β_２ＧＰＩ複合体を、迅速かつ簡便に検出、定量することができるという利点が得られる。

ラテラルフローアッセイ用テストストリップの一例を示す概念図である。 ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果を示す写真である。各レーンは以下の試料の測定結果を示している：タンパク質分子量マーカー（Ｍ）、３Ｈ３抗体又は２Ｅ１０抗体を産生するハイブリドーマの細胞培養液の上清（Ｃ）、３Ｈ３抗体又は２Ｅ１０抗体の精製工程で得られた流出液（Ｅ）、精製された３Ｈ３抗体又は２Ｅ１０抗体（Ｐ）。なお、電気泳動には２−メルカプトエタノールによって還元処理した試料を用いた。 ＴＢＡＲＳアッセイの結果を示すグラフである。硫酸銅（ＩＩ）を用いて酸化誘導したＬＤＬ試料中、及び、エチレンジアミン四酢酸を加えて硫酸銅（ＩＩ）の酸化作用を阻害した比較用試料中に生成したＴＢＡＲＳ（チオバルビツール酸反応性物質）の量を検出した。ＴＢＡＲＳ量はｎｍоｌマロンジアルデヒド当量で示した。 アガロースゲル電気泳動の結果を示す写真である。図中（Ａ）はＡｍｉｄｏ Ｂｌａｃｋ １０Ｂを用いてタンパク質を染色した結果を、（Ｂ）はＦａｔ Ｒｅｄ ７Ｂを用いて脂質を染色した結果を示している。 本発明に係る検出方法の一例の実験手順を示す概念図である。 実験５において展開液Ａ及び展開液Ｂを展開した後のテストストリップの写真である。既知の濃度のＣｕ^２＋−酸化ＬＤＬ／β_２ＧＰＩ複合体を含む標準試料をサンプルとして用いた。 本発明に係る検出方法の一例（実験５）により得られた標準曲線を示すグラフである。既知の濃度のＣｕ^２＋−酸化ＬＤＬ／β_２ＧＰＩ複合体を含む標準試料をサンプルとし、本発明に係る検出方法によって測定値を得た。得られた測定値をプロットし、４係数ロジスティック回帰モデルを適用することによって標準曲線を取得した。 ＥＬＩＳＡ法（実験６）により得られた標準曲線を示すグラフである。既知の濃度のＣｕ^２＋−酸化ＬＤＬ／β_２ＧＰＩ複合体を含む標準試料をサンプルとし、本発明に係る検出方法によって測定値を得た。得られた測定値をプロットし、４係数ロジスティック回帰モデルを適用することによって標準曲線を取得した。 本発明に係る検出方法の一例により標準試料から得られる検出値（相対強度）と、ＥＬＩＳＡ法により同じ標準試料から得られる検出値（吸光度）との関係を示す相関図である。 本発明に係る検出方法の一例（実験７）により得られた標準曲線を示すグラフである。既知の濃度のＣｕ^２＋−酸化ＬＤＬ／β_２ＧＰＩ複合体を含む標準試料をサンプルとし、本発明に係る検出方法によって測定値を得た。得られた測定値をプロットし、４係数ロジスティック回帰モデルを適用することによって標準曲線を取得した。 本発明に係る検出方法の一例により測定された血清試料Ａ〜Ｉ中の酸化ＬＤＬ／β_２ＧＰＩ複合体の含有量を示す図である。図１０に示した標準曲線を用いることにより、各血清試料中の酸化ＬＤＬ／β_２ＧＰＩ複合体の含有量を半定量的に求めた。 ＥＬＩＳＡ法（実験７）により得られた標準曲線を示すグラフである。既知の濃度のＣｕ^２＋−酸化ＬＤＬ／β_２ＧＰＩ複合体を含む標準試料をサンプルとし、本発明に係る検出方法によって測定値を得た。得られた測定値をプロットし、４係数ロジスティック回帰モデルを適用することによって標準曲線を取得した。 ＥＬＩＳＡ法により測定された血清試料Ａ〜Ｉ中の酸化ＬＤＬ／β_２ＧＰＩ複合体の含有量を示す図である。図１２に示した標準曲線を用いることにより、各血清試料中の酸化ＬＤＬ／β_２ＧＰＩ複合体の含有量を半定量的に求めた。 本発明に係る検出方法の一例により測定された血清試料Ａ〜Ｉ中の酸化ＬＤＬ／β_２ＧＰＩ複合体の含有量と、ＥＬＩＳＡ法により測定された血清試料Ａ〜Ｉ中の酸化ＬＤＬ／β_２ＧＰＩ複合体の含有量との関係を示す相関図である。 本発明に係る検出方法のその他の一例（実験８）により得られた標準曲線を示すグラフである。既知の濃度のＣｕ^２＋−酸化ＬＤＬ／β_２ＧＰＩ複合体を含む標準試料をサンプルとし、本発明に係る検出方法によって測定値を得た。得られた測定値をプロットし、４係数ロジスティック回帰モデルを適用することによって標準曲線を取得した。

＜１．用語の説明＞
＜１．１．試料＞
まず、本発明に係る検出方法が対象とする「試料」は、酸化ＬＤＬ／β_２ＧＰＩ複合体を含む可能性がある試料であればどのようなものであってもよい。一般的な選択肢としては、動脈硬化性疾患の患者等から採取した検体、特に、血清、血漿、全血等の血液検体が挙げられるが、これらに限定されるものではない。これらの試料は、そのまま測定に用いてもよいし、適宜の希釈液によって希釈してから用いてもよい。なお、試料を濾過したものを測定に用いてもよい。

＜１．２．検出＞
本明細書における「検出」とは、検出対象となる物質の有無を判定することのみならず、検出対象となる当該物質を定量的又は半定量的に測定することを含む。なお、後述するように、本発明に係る検出方法においては、試料から得られる測定値を、既知の濃度の標準物質を含む標準試料を用いて得られる標準曲線に当てはめることによって、各種試料に含まれる酸化ＬＤＬ／β_２ＧＰＩ複合体の量を定量的又は半定量的に求めることができる。

＜１．３．ラテラルフローアッセイ用テストストリップ＞
「ラテラルフローアッセイ用テストストリップ」とは、ラテラルフロー法により試料に含まれる測定対象物を検出又は定量する際に用いられるテストストリップを意味する。以下、本発明に係る検出方法に用いられる「ラテラルフローアッセイ用テストストリップ」（以下、単に「テストストリップ」ということもある）について説明する。図１は、本発明に係る検出方法に用いられるラテラルフローアッセイ用テストストリップの一例を示す概念図である。上段に平面図、下段に垂直断面図を示してある。図１において、１はテラルフローアッセイ用テストストリップである。ラテラルフローアッセイ用テストストリップ１は、測定対象となる試料に含まれる酸化ＬＤＬ／β_２ＧＰＩ複合体を検出するためのものであって、図１に示すとおり、支持体２と、支持体２上に位置し、支持体２と一体化されているメンブレン３とから構成されている。メンブレン３には、試料が流れる方向の上流（図１では左側）から順に、試料と接触しテストストリップ中に試料を取り込む部位であるサンプルパッド１１、試料に含まれる酸化ＬＤＬ／β_２ＧＰＩ複合体を捕捉する部位である検出部１２、第二結合コンポーネントを捕捉するコントロール部１３、及び、テストストリップ中を浸潤してきた液体を吸収する吸収パッド１４が形成されている。テストストリップ１の大きさに特に制限はないが、例えば、幅３ｍｍ〜１０ｍｍ、サンプルパッド１１からウィッキングパッド１４までの長さが５ｍｍ〜３０ｍｍ程度のものが好適に用いられる。

＜１．３．１．検出部＞
検出部１２は、サンプルパッド１１を介してテストストリップ１のメンブレン３に吸収された試料に含まれる酸化ＬＤＬ／β_２ＧＰＩ複合体が捕捉される部位である。本発明に係る検出方法において、試料に含まれる酸化ＬＤＬ／β_２ＧＰＩ複合体は、当該複合体と結合する第一結合コンポーネントを介して、テストストリップの所定位置、すなわち、検出部１２に捕捉される。このようにして検出部１２に捕捉された当該酸化ＬＤＬ／β_２ＧＰＩ複合体に、標識体を含む第二結合コンポーネントが結合することによって、当該酸化ＬＤＬ／β_２ＧＰＩ複合体は、標識体により標識される。検出部１２に捕捉されている前記複合体と結合する第二結合コンポーネントの量、換言すれば標識体の量は、検出部１２に捕捉されている酸化ＬＤＬ／β_２ＧＰＩ複合体の量に依存して増加することになる。したがって、検出部１２に捕捉される標識体を検出又は定量することによって、試料に含まれる酸化ＬＤＬ／β_２ＧＰＩ複合体を検出又は定量することができる。

＜１．３．２．コントロール部＞
本発明に係る検出方法に用いられるテストストリップ１のメンブレン３は、好ましくは、コントロール部１３を備えている。コントロール部１３は、検出部１２よりも下流側に位置し、検出部１２を通過した液体が接触する部位であり、第二結合コンポーネントと結合する物質を備えている。コントロール部１３を設けておくことにより、検出部１２に捕捉された酸化ＬＤＬ／β_２ＧＰＩ複合体に結合せずに検出部１２を通過した第二結合コンポーネントをコントロール部１３において捕捉することができる。第二結合コンポーネントは、前述したとおり、標識体を含んでいるため、コントロール部１３に捕捉された標識体の有無を検出することによって、メンブレン３中で、ラテラルフローによる試料の輸送、移動が確実に行われていることを確認することができる。

＜１．３．３．サンプルパッド＞
サンプルパッド１１は、テストストリップ１中に試料を取り込むための部位であり、サンプルパッド１１が液状の試料と接触することによりテストストリップ１のメンブレン３内に試料が取り込まれる。サンプルパッド１１と試料との接触は、例えば、液状の試料をサンプルパッド１１に滴下したり、液状の試料に対してサンプルパッド１１を浸漬することにより行うことができる。サンプルパッド１１は、試料がテストストリップ１のメンブレン３中を毛細管現象により移動し、検出部１２、コントロール部１３、及び、ウィッキングパッド１４に到達することができる限りにおいて、テストストリップ上のどのような位置に設置されていてもよいが、試料との接触の容易さという観点からは、テストストリップ１の一方の端部に設置されていることが好ましい。

＜１．３．４．ウィッキングパッド＞
ウィッキングパッド１４は、テストストリップ１のメンブレン３中をラテラルフローにより移動してきた液体を吸収するとともに、テストストリップ中における毛細管現象による液状の試料の輸送を促進する部位であり、吸収性を備えた材料で構成される。

＜１．３．５．支持体＞
テストストリップ１を構成するサンプルパッド１１、検出部１２、コントロール部１３、及びウィッキングパッド１４が設けられているメンブレン３は、任意の支持体２の上に配置されることが好ましい。支持体２は、メンブレン３中の毛管流を妨げず、メンブレン３を支持できるものである限り、どのような物質から構成されていてもよく、例えば、プラスチック、ガラス、セラミック、及び紙などを好適に用いることができる。サンプルパッド１１、検出部１２、コントロール部１３、及びウィッキングパッド１４が形成されているメンブレン３は、適宜の接着剤を用いて支持体２に付着させることができる。接着剤は、メンブレン３中の毛管流を妨げない限りにおいて、任意の接着剤を用いることができる。

＜１．３．６．メンブレンの材質＞
メンブレン３は、試料が当該メンブレン３中に浸透し、毛管流によって移動することができる限りにおいて、どのような素材から構成されていても良く、例えば、セルロース、酢酸セルロースやニトロセルロースを含むセルロース誘導体、ポリエステル、ポリエチレン、ポリエーテルスルホン、ポリカーボネート、ナイロン、アクリル繊維、ガラス繊維を好適な素材として例示することができる。なお、テストストリップ１を構成するメンブレン３は、メンブレン３に対するタンパク質等の非特異的吸着を抑制する観点から、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）、カゼイン、シュークロース等のブロッキング剤を含んでいてもよい。

＜１．４．第一結合コンポーネント＞
第一結合コンポーネントとは、試料中に含まれる酸化ＬＤＬ／β_２ＧＰＩ複合体と結合する結合コンポーネントであり、それを介して、当該複合体をテストストリップ１上の所定位置、すなわち、検出部１２に捕捉する役割を担うものである。第一結合コンポーネントは、酸化ＬＤＬ／β_２ＧＰＩ複合体と結合することができ、かつ、結合した酸化ＬＤＬ／β_２ＧＰＩ複合体を検出部１２に捕捉することができる限りにおいて、どのような物質又は物質の組み合わせからなるものであっても良い。また、第一結合コンポーネントは、酸化ＬＤＬ／β_２ＧＰＩ複合体のどの部分と結合するものであっても良い。第一結合コンポーネントとしては、抗体、フラグメント抗体、ペプチド、ＤＮＡアプタマー、ＲＮＡアプタマー等、それらの修飾物、複合体等を例示することができる。

一方、より優れた検出感度を得るという観点からは、第一結合コンポーネントは、酸化ＬＤＬ／β_２ＧＰＩ複合体を構成するβ_２ＧＰＩに特異的に結合する第一結合部を備えていることが好ましい。酸化ＬＤＬ／β_２ＧＰＩ複合体を構成するβ_２ＧＰＩに特異的に結合するとは、酸化ＬＤＬに結合していないβ_２ＧＰＩと比較して、酸化ＬＤＬ／β_２ＧＰＩ複合体を構成するβ_２ＧＰＩに強く結合することを意味する。このような結合部を備えている物質としては、例えば、特許第５６１６５９２号公報に開示されている以下（ａ）乃至（ｅ）の抗体を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。
（ａ）ＣＤＲ１として配列番号：２に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ２として配列番号：３に記載のアミノ酸配列、及び、ＣＤＲ３として配列番号：４に記載のアミノ酸配列を有する重鎖を含む抗体、
（ｂ）重鎖可変領域として配列番号：１に記載のアミノ酸配列を有する重鎖を含む抗体、
（ｃ）ＣＤＲ１として配列番号：６に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ２として配列番号：７に記載のアミノ酸配列、及びＣＤＲ３として配列番号：８に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖を含む抗体、
（ｄ）軽鎖可変領域として配列番号：５に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖を含む抗体、
（ｅ）上記（ａ）または（ｂ）に記載の重鎖、および、上記（ｃ）または（ｄ）に記載の軽鎖の対を有する抗体。なお、より具体的には、同じく、特許第５６１６５９２号公報に開示されている、細胞融合法により樹立されたハイブリドーマクローン３Ｈ３が産生する抗β_２ＧＰＩ抗体を例示することができる。このような抗体は、特許第５６１６５９２号公報に開示されている方法で製造することができる。

以上のように、酸化ＬＤＬ／β_２ＧＰＩ複合体を構成するβ_２ＧＰＩに特異的に結合する第一結合部を備える第一結合コンポーネントを用いることによって、試料中に含まれる酸化ＬＤＬ／β_２ＧＰＩ複合体をより優れた感度で検出できる。その理由は定かではないが、前述したとおり、本発明に係る検出方法が対象とする酸化ＬＤＬ／β_２ＧＰＩ複合体は、一つの酸化ＬＤＬ粒子と、疾患の状態にもよるが、通常、複数のβ_２ＧＰＩ分子を構成要素として含んでいる。したがって、第一結合コンポーネントが、酸化ＬＤＬ／β_２ＧＰＩ複合体を構成するβ_２ＧＰＩ分子と特異的に結合する第一結合部を備えている場合には、第一結合コンポーネントは、複数の結合点で当該複合体と結合することができ、テストストリップ上の所定位置に酸化ＬＤＬ／β_２ＧＰＩ複合体をより高い確率で捕捉することができるからではないかと推測される。

＜１．５．第二結合コンポーネント＞
一方、第二結合コンポーネントは標識体を含む結合コンポーネントであって、第一結合コンポーネントを介して検出部１２に捕捉された酸化ＬＤＬ／β_２ＧＰＩ複合体に結合することによって、当該酸化ＬＤＬ／β_２ＧＰＩ複合体を適宜の手段で検出可能に標識する役割を担っている。第二結合コンポーネントは、酸化ＬＤＬ／β_２ＧＰＩ複合体と結合することができる限りにおいて、特に限定されず、任意の物質又は物質の組み合わせを用いることができる。なお、第二結合コンポーネントとしては、抗体、フラグメント抗体、ペプチド、ＤＮＡアプタマー、ＲＮＡアプタマー等、それらの修飾物、複合体等を例示することができる。

一方、より優れた検出感度を得るという観点から、第二結合コンポーネントは、酸化ＬＤＬ／β_２ＧＰＩ複合体を構成するａｐоＢ１００に特異的に結合する第二結合部を備えていることが好ましい。前述したとおり、本発明が検出対象とする酸化ＬＤＬ／β_２ＧＰＩ複合体は、通常、複合体一つあたり一つのａｐоＢ１００を含んでいるので、第二結合コンポーネントが、ａｐоＢ１００に結合する第二結合部を備えている場合には、検出部１２に捕捉されている酸化ＬＤＬ／β_２ＧＰＩ複合体一つあたり一つの標識体を結合させることができるため、より定量性に優れた酸化ＬＤＬ／β_２ＧＰＩ複合体の検出が可能になる。このような第二結合部を備えている物質としては、例えば、抗ａｐоＢ１００抗体が挙げられ、抗ａｐｏＢ１００抗体としては、例えば、特開２００５−０９７２０３号公報に開示されている抗体Ｎ２Ｅ１０を用いることができる。

＜１．６．標識体＞
第二結合コンポーネントに含まれる「標識体」は、標識体として機能し、何らかの手段でその有無、更には、量を検出することができるものであれば、斯界で使用されている如何なる標識体を用いてもよい。本発明に係る検出方法に用いることができる標識体としては、例えば、金ナノ粒子、白金ナノ粒子、銀ナノ粒子、金−プラチナ合金ナノ粒子などの金属ナノ粒子、コロイド状量子ドット、着色ラテックスビーズなどの色素が組み込まれたポリマー粒子、色素を含んだシリカナノ粒子、及び、炭素ナノ粒子などが例示されるが、これらに限られるものではない。結合コンポーネントへの修飾の容易さ、検出感度や検出精度、及び、検出の容易さ等の観点から、標識体としては、特に、金ナノ粒子、白金ナノ粒子、銀ナノ粒子、金−プラチナ合金ナノ粒子などの金属ナノ粒子が好適に用いられ、金ナノ粒子がより好適に用いられる。特に、平均粒子直径５〜２５０ｎｍ程度の金ナノ粒子が好ましく、平均粒径１０〜１００ｎｍ程度の金ナノ粒子がより好ましい。また、上記の標識体は、分散性向上、ラテラルフロー用テストストリップへの非特異的吸着の抑制等の観点から、適宜の方法で安定化されることができる。例えば、標識体が金ナノ粒子である場合には、クエン酸塩、シリカ、及びポリエチレングリコール等により被覆されていてもよい。

なお、標識体を含む第二結合コンポーネントとは、第二結合コンポーネントの一部に、上記標識体が共有結合、配位結合、水素結合、疎水結合、ファンデルワールス力等の相互作用により結合した結合コンポーネントを意味する。このような標識体を含む結合コンポーネントは、公知の化学的手法を用いて調製することができる。また、標識体を含む結合コンポーネントとして、市販のものがあれば、それを用いてもよい。

＜２．本発明の酸化ＬＤＬ／β_２ＧＰＩ複合体の検出方法＞
以下、試料中に含まれる酸化ＬＤＬとβ_２−グリコプロテインＩの複合体（酸化ＬＤＬ／β_２ＧＰＩ複合体）の検出方法について説明する。なお、「酸化ＬＤＬ／β_２ＧＰＩ複合体」は、酸化ＬＤＬとβ_２−グリコプロテインＩの複合体を略記したものである。

＜２．１．酸化ＬＤＬ／β_２ＧＰＩ複合体を捕捉する工程−その１＞
本発明に係る検出方法において、試料に含まれる酸化ＬＤＬ／β_２ＧＰＩ複合体は、当該複合体と結合する第一結合コンポーネントを介して、テストストリップ１の所定位置、すなわち、検出部１２に捕捉される。例えば、酸化ＬＤＬ／β_２ＧＰＩ複合体と結合する第一結合コンポーネントがテストストリップの検出部１２に予め一時固定されている場合には、ラテラルフローにより輸送されてくる酸化ＬＤＬ／β_２ＧＰＩ複合体が検出部１２に一時固定されている第一結合コンポーネントと結合することにより、酸化ＬＤＬ／β_２ＧＰＩ複合体を第一結合コンポーネントを介してテストストリップの所定位置に捕捉する工程が実現される。好ましい一態様において、第一結合コンポーネントの酸化ＬＤＬ／β_２ＧＰＩ複合体と結合する部位が、酸化ＬＤＬ／β_２ＧＰＩ複合体を構成するβ_２ＧＰＩと特異的に結合する第一結合部であることは前述したとおりである。ただし、酸化ＬＤＬ／β_２ＧＰＩ複合体をテストストリップの所定位置に捕捉する工程は、これに限られるものではなく、以下に述べるようなものであってもよい。

＜２．２．酸化ＬＤＬ／β_２ＧＰＩ複合体を捕捉する工程−その２＞
本発明に係る検出方法の好適な一態様においては、第一結合コンポーネントは、酸化ＬＤＬ／β_２ＧＰＩ複合体を構成するβ_２ＧＰＩ分子と特異的に結合する第一結合部と、第一の特異的結合要素とを含む第一結合ユニットと、前記第一の特異的結合要素と特異的に結合する第二の特異的結合要素を含む第二結合ユニットであって、テストストリップ上の所定位置に位置している第二結合ユニットを備えている。このような場合には、試料中に含まれる酸化ＬＤＬ／β_２ＧＰＩ複合体をテストストリップの所定位置に捕捉する前記工程は、酸化ＬＤＬ／β_２ＧＰＩ複合体と前記第一結合ユニットの第一結合部とを結合させる工程と、前記第一結合ユニットの前記第一の特異的結合要素と前記第二結合ユニットの前記第二の結合要素とを結合させる工程という二つの工程に分けて行われることになる。なお、第二の特異的結合要素を含む第二結合ユニットが、テストストリップ上の所定位置、すなわち、検出部１２に位置しているとは、第二結合ユニットが検出部１２に一時固定されていることを意味し、第二結合ユニットを検出部１２に一時固定する手段はどのような手段であっても構わない。

酸化ＬＤＬ／β_２ＧＰＩ複合体と前記第一結合ユニットの第一結合部とを結合させる工程と、前記第一結合ユニットの前記第一の特異的結合要素と前記第二結合ユニットの前記第二の結合要素とを結合させる工程は、どちらを先に行ってもよく、また両者を同時に行ってもよいが、酸化ＬＤＬ／β_２ＧＰＩ複合体と第一結合部とを結合させる工程を先に行う方が好ましい。また、酸化ＬＤＬ／β_２ＧＰＩ複合体と第一結合部とを結合させる工程はテストストリップの中で行ってもよいし、テストストリップの外で行っても良いが、テストストリップの外で行う方が好ましい。

例えば、酸化ＬＤＬ／β_２ＧＰＩ複合体と第一結合部を備えている第一結合ユニットを予め混合・インキュベートし、結合させた上でラテラルフローアッセイに供することにより、酸化ＬＤＬ／β_２ＧＰＩ複合体と第一結合部とを結合させる工程を、第一の特異的結合要素と第二の結合要素とを結合させる工程よりも先に、かつ、テストストリップの外で行うことができる。このような場合には、酸化ＬＤＬ／β２ＧＰＩ複合体と第一結合部とを、両者の結合に適した条件で十分に結合させることができるため、感度の高い検出が可能となるという利点がある。

また、例えば、テストストリップ上の、前記第二結合ユニットが位置する所定位置（すなわち、検出部１２）よりも上流側の部分に第一結合ユニットをラテラルフローによって拡散可能に塗布しておくことにより、酸化ＬＤＬ／β_２ＧＰＩ複合体と第一結合部とを結合させる工程を、第一の特異的結合要素と第二の結合要素とを結合させる工程よりも先に、かつ、テストストリップの中で行うことができる。このような場合には、試験者は、酸化ＬＤＬ／β２ＧＰＩ複合体を含んでいると思われる試料と第一結合ユニットとを、事前に混合、インキュベートする必要がなく、テストストリップ中に酸化ＬＤＬ／β_２ＧＰＩ複合体を含む試料を流す操作のみによって、酸化ＬＤＬ／β_２ＧＰＩ複合体と第一結合部とを結合させる工程が実現されるので作業効率が向上するという利点がある。

いずれにせよ、酸化ＬＤＬ／β_２ＧＰＩ複合体と第一結合部とを結合させる工程を、前記第一結合ユニットの前記第一の特異的結合要素と前記第二結合ユニットの前記第二の結合要素とを結合させる工程よりも先に行う場合には、酸化ＬＤＬ／β_２ＧＰＩ複合体が、第二結合ユニットが位置している所定位置にラテラルフローによって輸送されてくるときには、酸化ＬＤＬ／β_２ＧＰＩ複合体には既に第一結合ユニットが結合していることになり、酸化ＬＤＬ／β_２ＧＰＩ複合体に結合している第一結合ユニットが備えている第一の特異的結合要素と、所定位置に位置している第二結合ユニットが備えている第二の特異的結合要素とが結合し、酸化ＬＤＬ／β_２ＧＰＩ複合体が当該所定位置に捕捉される工程が完了する。

＜２．３．特異的結合要素＞
本発明に係る検出方法の好適な一態様において、第一結合ユニット及び第二結合ユニットが備えている「特異的結合要素」とは、対になる特異的結合要素同士で特異的に結合することができる物質又は物質の複合体を意味する。対になる特異的結合要素同士で特異的に結合することができる限り、本発明に係る検出方法に用いることができる第一の特異的結合要素と第二の特異的結合要素の組み合わせには特段の制限はないが、好適な組み合わせとして、例えば、アビジン−ビオチン結合ペアを形成することができる物質群、クラウンエーテル、シクロデキストリン、カリックスアレンなどを含むホスト−ゲスト相互作用により結合する物質群、抗原抗体反応により結合する物質群等を例示することができる。

より優れた検出感度を得るという観点からは、第一の特異的結合要素と第二の特異的結合要素との結合は、解離定数が小さいものであることが好ましく、例えば、１０^−８Ｍ以下、より好ましくは１０^−１０Ｍ以下、さらに好ましくは１０^−１２Ｍ以下であることが好ましい。具体的な物質を例示するならば、アビジンとビオチン、ストレプトアビジンとビオチン、又はニュートラビジンとビオチンの組み合わせを用いることが好ましい。アビジンとビオチン、ストレプトアビジンとビオチン、又はニュートラビジンとビオチンの結合は、解離定数が１０^−１５Ｍにも及ぶ非常に強固な結合であり、このような結合を用いることによって、ラテラルフローにより輸送されてくる酸化ＬＤＬ／β_２ＧＰＩ複合体と第一結合ユニットとの結合体を、漏れなく、効率良く、テストストリップ上の所定位置に捕捉することができる。これにより、より優れた検出感度を得ることができる。なお、解離定数は公知の実験方法で求めることができる。なお、上に挙げた２個１対の物質の組み合わせは、どちらを第一の特異的結合要素又は第二の特異的結合要素としても良い。

また、第一結合ユニットは、第一結合部と酸化ＬＤＬ／β_２ＧＰＩ複合体を構成するβ_２ＧＰＩ分子との特異的な結合を阻害しない限りにおいて、二分子以上の第一の特異的結合要素を備えていてもよい。このような場合には、ラテラルフローにより輸送されてくる酸化ＬＤＬ／β_２ＧＰＩ複合体と第一結合ユニットとの結合体を、さらに効率良く、テストストリップ上の所定位置に捕捉することができるという利点がある。なお、第二結合ユニットについても二分子以上の第二の特異的結合要素を備えていても良いことは勿論である。

＜２．４．酸化ＬＤＬ／β_２ＧＰＩ複合体を標識する工程＞
以上のようにして、テストストリップ上の所定位置に捕捉された酸化ＬＤＬ／β_２ＧＰＩ複合体に対して、標識体を含む第二結合コンポーネントを結合させることによって、当該酸化ＬＤＬ／β_２ＧＰＩ複合体は検出可能な標識体により標識される。所定位置に捕捉された酸化ＬＤＬ／β_２ＧＰＩ複合体を標識体により標識するには、試料のラテラルフローによる検出部通過が完了した時点で、サンプルパッド１１上に標識体を含む第二結合コンポーネントを含む溶液を滴下するか、サンプルパッド１１の下端等を第二結合コンポーネントを含む溶液中に浸漬することによって、テストストリップ１を構成するメンブレン３中に第二結合コンポーネントを浸透させれば良い。

検出部１２に捕捉される標識体の量は、検出部１２に捕捉されている酸化ＬＤＬ／β_２ＧＰＩ複合体の量に応じて変化することになるので、検出部１２に捕捉される標識体の有無又はその量を検出することによって、試料中に含まれる酸化ＬＤＬ／β_２ＧＰＩ複合体を検出又は定量することができる。

テストストリップ１の検出部１２に捕捉されている標識体の有無又はその量は、用いる標識体の種類に応じた適宜の手法により検出することができ、検出部１２（及び必要に応じてコントロール部１３）の、例えば、反射光の強度、蛍光強度、発光強度、光の吸収強度等を測定機器を用いて測定したり、画像撮影して画像解析するなどして行うことができる。既知の濃度の標準物質を含む標準試料から得られる標準曲線と、未知の濃度の酸化ＬＤＬ／β_２ＧＰＩ複合体を含む試料から得られた測定値を比較することで、当該試料に含まれる酸化ＬＤＬ／β_２ＧＰＩ複合体を検出又は定量することができる。なお、標準物質としては、例えば、後述する実験で調製するＣｕ^２＋−酸化ＬＤＬ／β_２ＧＰＩ複合体を用いることができる。

なお、より優れた検出感度を得るという観点からは、テストストリップ１は、第二結合コンポーネントを捕捉する物質が含浸、固定されているコントロール部１３を備えているのが望ましい。コントロール部１３が設けられている場合には、検出部１２において酸化ＬＤＬ／β_２ＧＰＩ複合体と結合せず、検出部１２に捕捉されなかった第二結合コンポーネントは、コントロール部１３に捕捉されることとなる。この場合には、検出部１２に捕捉される標識体の量が検出部１２に捕捉された酸化ＬＤＬ／β_２ＧＰＩ複合体の量を反映して増加するのみならず、コントロール部１３に捕捉される標識体の量が検出部１２に捕捉された酸化ＬＤＬ／β_２ＧＰＩ複合体の量を反映して減少することになる。したがって、検出部１２に加えてコントロール部１３に捕捉されている標識体についても、その量を反映する測定値を併せて取得し、両部における測定値の比率（検出部１２において得られる測定値／コントロール部１３において得られる測定値）を測定値として用いることによって、より優れた検出強度を得ることができるという利点がある。

＜３．検出キット＞
本発明に係る検出キットは、少なくとも以下（Ａ）乃至（Ｃ）を含むことを特徴とする酸化ＬＤＬ／β_２ＧＰＩ複合体の検出キットである；
（Ａ）酸化ＬＤＬ／β_２ＧＰＩ複合体と結合する第一結合コンポーネント、
（Ｂ）標識体を含む第二結合コンポーネント、及び、
（Ｃ）ラテラルフローアッセイ用テストストリップ。

なお、本発明に係る検出キットは、その好適な一態様において、第一結合コンポーネントとして、酸化ＬＤＬ／β_２ＧＰＩ複合体を構成するβ_２ＧＰＩに特異的に結合する第一結合部を備えている第一結合コンポーネントを含んでいる。

また、本発明に係る検出キットは、その好適な一態様において、第二結合コンポーネントとして、酸化ＬＤＬ／β_２ＧＰＩ複合体を構成するａｐоＢ１００に結合する第二結合部を備えている第二結合コンポーネントを含んでいる。

さらに好適な一態様において、本発明に係る検出キットは、第一結合コンポーネントとして、酸化ＬＤＬ／β_２ＧＰＩ複合体を構成するβ_２ＧＰＩ分子と特異的に結合する第一結合部と、第一の特異的結合要素とを含む第一結合ユニットと、当該第一の特異的結合要素と特異的に結合する第二の特異的結合要素を含む第二結合ユニットであって、テストストリップ上の所定位置に位置している第二結合ユニットを含んでいる。

なお、第一結合コンポーネント又は第一結合コンポーネントを構成する第二結合ユニットは、予め、ラテラルフローアッセイ用テストストリップの所定位置に一時固定されていても良いし、使用者がラテラルフローアッセイ用テストストリップの所定位置に一時固定するものであっても良い。また、キットに含まれるラテラルフローアッセイ用テストストリップには、サンプルパッド１１及び／又はウィッキングパッド１４が予め設けられているのが好ましいが、設けられておらず、使用者が適宜設けるようにしても良い。コントロール部１３についても同様である。

本検出キットの使用方法は、＜２．本発明に係る酸化ＬＤＬ／β_２ＧＰＩ複合体の検出方法＞で説明したと同様である。なお、本発明に係る検出キットは、以上（Ａ）乃至（Ｃ）を含んでいる限りにおいて、その他の構成成分を含んでいても良い。本検出キットが含むことができるその他の構成成分としては、例えば、標準試料となるＣｕ^２＋−酸化ＬＤＬ／β_２ＧＰＩ複合体が挙げられる。また、ブロッキング剤、試料希釈液等を含んでいてもよい。

以下、実験例に基づいて、本発明をさらに詳細に説明する。しかしながら、本発明は、これらの実施例に限定されるものでないことは言うまでもない。

＜実験１．抗β_２ＧＰＩ抗体及び抗ａｐоＢ１００抗体の調製＞
本明細書において用いた抗β_２ＧＰＩ抗体（以下、「３Ｈ３抗体」という）及び抗ａｐоＢ１００抗体（以下、「２Ｅ１０抗体」という）を、従来公知のハイブリドーマ法により、以下のようにして調製した。

３Ｈ３抗体を産生するハイブリドーマとしては、特許第５６１６５９２号公報の実施例３に記載の方法で得た３Ｈ３抗体を産生するハイブリドーマクローン３Ｈ３を用いた。一方、２Ｅ１０抗体を産生するハイブリドーマとしては、特開２００５−０９７２０３号公報、段落［００２０］乃至［００２４］に記載の方法で得たマウス−マウス・ハイブリドーマＮ２Ｅ１０を用いた。なお、２Ｅ１０抗体を産生する当該マウス−マウス・ハイブリドーマＮ２Ｅ１０は、独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１丁目１番地１）に国内寄託され、平成１５年（２００３年）９月２日付で受領され、受託番号として、ＦＥＲＭ Ｐ−１９５０８が付与されている。

３Ｈ３抗体又は２Ｅ１０抗体を産生するハイブリドーマを、常法に従い、２．５％（ｖ／ｖ）のウシ胎児血清（ＦＢＳ）及び１００ユニットのペニシリン−ストレプトマイシンを含むＩＭＤＭ（Ｉｓｃｏｖｅ‘ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ）培地中で培養した。当該細胞培養液の上清を遠心分離よりにより回収した後、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ セファロース樹脂を用いたアフィニティークロマトグラフィーによる精製に供した。セファロース樹脂に担持されているプロテインＡに捕捉された３Ｈ３抗体及び２Ｅ１０抗体をｐＨ２．７のグリシン−ＨＣｌ緩衝液により溶出させ、その後に、常法に従い、溶液の溶媒をＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）に置換した。

得られた３Ｈ３抗体又は２Ｅ１０抗体の純度をＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により確認した。なお、当該ＳＤＳ−ＰＡＧＥには、ゲル濃度１２．５％（ｗ／ｖ）のポリアクリルアミドゲルを用い、還元剤としては２−メルカプトエタノールを用いた。結果を図２に示す。図２において、各レーンに用いられた試料は、分子量スタンダード（レーンＭ）、還元処理した細胞培養液の上清（レーンＣ）、抗体精製工程で得られた廃液（レーンＥ）、そして、精製後の抗体（レーンＰ）である。図２のレーンＰを見ると、３Ｈ３抗体及び２Ｅ１０抗体ともに、重鎖（分子量約５０ｋＤａ）と軽鎖（分子量約２５ｋＤａ）に相当する位置に強い発色が観察され、その他の位置にはほとんど発色が観察されていない。以上の結果は、純度の高い３Ｈ３抗体及び２Ｅ１０抗体が得られていることを示している。

＜実験２．ビオチン−３Ｈ３抗体コンジュゲートの調製＞
次に、上記実験１で得られた３Ｈ３抗体に対してビオチンを修飾することにより、本実施例に用いられるビオチン−３Ｈ３抗体コンジュゲートを調製した。具体的には、市販のビオチンラベリングキット（商品名「Ｂｉｏｔｉｎ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ−ＮＨ_２」、株式会社同仁堂社製）を用いて、キット添付のマニュアルに従って、以下のようにして行った。

実験１で得られた３Ｈ３抗体２００μｇを含む溶液に、上記ビオチンラベリングキットに付属しているＷＳ Ｂｕｆｆｅｒを加え、最終体積を２００μＬとした。ピペッティングにより混合した後、混合液２００μＬ全量を、上記ビオチンラベリングキットに付属しているＦｉｌｔｒａｔｉｏｎ Ｔｕｂｅの濾過膜上部に加え、４℃、８，０００ｇ、１０分間の条件で遠心した。一方、上記ビオチンラベリングキットに付属しているＮＨ_２−Ｒｅａｃｔｉｖｅ Ｂｉｏｔｉｎに１０μＬのＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）を加え溶解させた。前記Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ Ｔｕｂｅの濾過膜上部に残留した溶液に対して、１００μＬのＲｅａｃｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ（上記ビオチンラベリングキットに付属）を加えるとともに、ＮＨ_２−Ｒｅａｃｔｉｖｅ Ｂｉｏｔｉｎを含むＤＭＳＯ溶液を全量加え、ピペッティングにより混合した。３７℃で１０分間静置した後、当該混合液に対して、ＷＳ Ｂｕｆｆｅｒを１００μＬ加え、４℃、８，０００ｇ、１０分間遠心した。抗体に結合していないフリーのビオチンを除去するため、前記Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ Ｔｕｂｅの濾過膜上部に残留した溶液に、２００μＬのＷＳ Ｂｕｆｆｅｒを加え、４℃、８，０００ｇで１０分間遠心した。さらに、もう一度、２００μＬのＷＳ Ｂｕｆｆｅｒの添加及び４℃、８，０００ｇで１０分間遠心した後に、前記Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ Ｔｕｂｅの濾過膜上部に残留した溶液に対してＰＢＳを加え、最終体積２００μＬのビオチン−３Ｈ３抗体コンジュゲート溶液を得た。当該ビオチン−３Ｈ３抗体コンジュゲート溶液に含まれるビオチン−３Ｈ３抗体コンジュゲートの濃度は、市販のキット（商品名「ＰｉｅｒｃｅＴＭ ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ」、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いて、ＢＣＡタンパク質アッセイ法に測定した。

＜実験３．金ナノ粒子−２Ｅ１０抗体コンジュゲートの調製＞
次に、上記実験１で得られた２Ｅ１０抗体に対して、直径２０ｎｍの金ナノ粒子を結合させることにより、本実施例で用いられる金ナノ粒子−２Ｅ１０抗体コンジュゲートを調製した。具体的には、市販の金ナノ粒子コンジュゲーションキット（商品名「Ｎａｋｅｄ Ｇｏｌｄ Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（２０ｎｍ）」、Ｂｉｏｐｏｒｔｏ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社製）を用いて、キット添付のマニュアルに従って、以下のようにして行った。

まず、限外ろ過によって、２Ｅ１０抗体を含む懸濁液の溶媒をＰＢＳから超純水に置換した。限外ろ過膜としては、商品名「Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ ０．５ｍＬ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ Ｆｉｌｔｅｒｓ １０Ｋ」（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）を用いた。次に、上記金ナノ粒子コンジュゲーションキットに付属している直径２０ｎｍの金ナノ粒子を含む懸濁液を、波長５２０ｎｍでの光学密度（ＯＤ）が６Ａ．Ｕ．となるように超純水で希釈した。なお、光学密度の測定は分光光度計（商品名「ＢｉｏＳｐｅｃ−Ｎａｎｏ」、株式会社島津製作所製）を用いて行った。そして、金ナノ粒子を含む当該懸濁液に対して０．２Ｍ Ｋ_２ＣＯ_３溶液を適量加えることによって、当該懸濁液のｐＨを９．０に調整した。以上のようにして調製された金ナノ粒子を含む当該懸濁液に対して、２Ｅ１０抗体を含む懸濁液（２Ｅ１０抗体の濃度：４８μｇ／ｍＬ）を加えた。得られた混合液を１時間静置した後、上記金ナノ粒子コンジュゲーションキットに付属している安定化バッファー（Ｓｔａｂｉｌｉｚｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ）を、体積比が１：５（混合液：安定化バッファー）となるように上記混合液に加えることによって反応を停止させた。

＜実験４．標準サンプルの調整＞
＜実験４．１．ヒト血清試料からのＬＤＬの単離＞
ＬＤＬ（Ｌｏｗ−Ｄｅｎｓｉｔｙ Ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ、低密度リポタンパク質）は、市販のヒト血清プール（コスモ・バイオ株式会社製）からシングルスピン密度勾配超遠心法により、以下のようにして単離した。

まず、３種類の調整密度溶液（Ｄｅｎｓｉｔｙ−Ａｄｊｕｓｔｅｄ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ、以下「ＤＡＳ」という）、ＤＡＳ１〜３を調製した。ＤＡＳ１、ＤＡＳ２、及びＤＡＳ３の密度は、それぞれ１．００６ｇ／ｃｍ^３、１．０１９ｇ／ｃｍ^３、及び１．０６３ｇ／ｃｍ^３である。なお、ＤＡＳ１〜３は、１ｍＭのＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）を含んでおり、密度はＫＢｒ（臭化カリウム）によって調整したものである。次に、ヒト血清１３ｍＬ当たりＫＢｒ１．８２ｇの体積−重量割合で、解凍したヒト血清にＫＢｒを加えた後、氷浴上で１０分間、スターラーを用いて混合した。このようにして得られたヒト血清を含む混合溶液（体積２３．６ｍＬ）、ＤＡＳ１（体積１８．２ｍＬ）、ＤＡＳ２（体積１８．２ｍＬ）、及びＤＡＳ３（体積１０ｍＬ）を、ＤＡＳ３、ＤＡＳ２、ＤＡＳ１、ヒト血清を含む混合溶液の順で、遠心用のポリカーボネート製のボトル容器（商品名「８０ＰＣ ボトル（Ｃ）」、日立工機株式会社製）に、ゆっくりと充填した。以上のようにして、サンプルを充填したボトル容器をＲＰ４５Ｔアングルローター（日立工機株式会社製）に設置し、ＳＣＰ８５Ｈ超遠心機（日立工機株式会社製）を用いて、１００，０００ｇ、４℃、２４時間の条件で遠心した。遠心後、ＶＬＤＬ（超低密度リポタンパク質）含有分画及びカイロミクロン含有分画を除去し、ＬＤＬ分画を得た。得られたＬＤＬ分画は、市販の遠心式限外ろ過フィルター（商品名「Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ １５ｍＬ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ Ｆｉｌｔｅｒｓ １０Ｋ」、Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）を用いて濃縮した後、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）を外液として用い、一晩透析を行った。透析後に得られたサンプル中に含まれるＬＤＬの濃度は、市販のキット（商品名「ＰｉｅｒｃｅＴＭ ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ」、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いて、ＢＣＡタンパク質アッセイ法に測定した。

＜実験４．２．ＬＤＬの酸化＞
次に、実験４．１．で得られたＬＤＬを常法に従い硫酸銅（ＩＩ）（ＣｕＳＯ_４）を用いて酸化することによって酸化ＬＤＬを調製した。具体的な実験手順は以下に示すとおりである。

実験４．１．で得られたＬＤＬを含む溶液の濃度を、アポリポプロテインＢ（以下、「ａｐоＢ」ということもある）換算で濃度１００μｇ／ｍＬとなるように調整した。当該溶液に対して、硫酸銅（ＩＩ）の濃度が５μＭとなるように硫酸銅（ＩＩ）を添加することによって酸化反応を開始した。３７℃で１６時間インキュベートした後、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を、ＥＤＴＡの濃度が１ｍＭとなるように加えることによって酸化反応を停止させた。酸化反応を停止させた後、当該溶液の一部を、ＬＤＬの酸化を確認するための試験用試料として抜き取り、後述するＴＢＡＲＳ（Ｔｈｉｏｂａｒｂｉｔｕｒｉｃ Ｒｅａｃｔｉｖｅ Ｓｕｂｓｔａｎｃｅ）アッセイに供した。一方、残りの溶液は、１ｍＭ ＥＤＴＡを含むＰＢＳに対して一晩透析することによって精製した後、適宜濃縮及び希釈をして用いた。

以上の実験４．２．と並行して、酸化反応開始時からＥＤＴＡ濃度が１ｍＭとなるようにＥＤＴＡを加えた以外は、以上の実験４．２．と同様にして比較実験用のＬＤＬ試料を調製した。当該ＬＤＬ試料についても、酸化反応開始から３７℃で１６時間インキュベートした後、溶液の一部を比較用試料として抜き取り、後述するＴＢＡＲＳアッセイにおけるネガティブコントロールとして用いた。

＜実験４．３．ＴＢＡＲＳアッセイ＞
ＬＤＬが酸化されているか否かの確認を従来公知のＴＢＲＡＳアッセイにより行った。なお、ＴＢＲＡＳアッセイは、ＬＤＬの酸化反応の副生物として生成するマロンジアルデヒド（ＭＤＡ：Ｍａｌｏｎｄｉａｌｄｅｈｙｄｅ）を代表とするチオバルビツール酸反応性物質（ＴＢＡＲＳ）の量を定量することによって、脂質酸化反応をモニタリングする手法である。なお、不飽和脂質酸の酸化反応の副生物であるＭＤＡがチオバルビツール酸（ＴＢＡ：Ｔｈｉｏｂａｒｂｉｔｕｒｉｃ Ａｃｉｄ）と反応することによって生じるＭＤＡ−ＴＢＡ付加体は蛍光性であるため蛍光分光光度計を用いて定量が可能である。具体的な実験手順は以下に示すとおりである。

まず、０．６７％（ｗ／ｖ）のチオバルビツール酸溶液と０．２％（ｗ／ｖ）のトリクロロ酢酸溶液を等量含む反応バッファーを調製した。当該反応バッファーと、前記実験４．２．で抜き取った試験用試料又は比較用試料とを混合した後、１００℃の湯浴中で３０分間インキュベートした。冷却後、蛍光分光光度計を用いた測定により、試験用試料溶液中又は比較用試験溶液中に生成したＭＤＡ−ＴＢＡ付加体の量を定量した。なお、測定に用いた励起光の波長は５１５ｎｍ、検出した蛍光の波長は５５３ｎｍである。

なお、実験４．２．で得られた上記試験用試料溶液に代えて、既知の濃度のＭＤＡ（０〜６０ｎｍоｌｅｓ）を含む標準試料を用いた以外は、上記と同様の測定を行うことによって標準曲線を得た。当該標準曲線に基づき、実験４．２．で得られた上記試験用試料溶液及び比較用試料溶液に含まれるチオバルビツール酸反応性物質（ＴＢＡＲＳ）の量をＭＤＡ当量として求めた。結果を図３に示す。図３より、５μＭの硫酸銅（ＩＩ）を加えた後３７℃で１６時間インキュベートした試験用試料においては、有意な量のＭＤＡ−ＴＢＡ付加体が生成していることが分かる。これは当該試験用試料において、ＬＤＬの酸化反応が進行したことを示している。これに対して、実験４．２．において酸化反応開始時から１ｍＭのＥＤＴＡを加えた比較用試料においては、ＭＤＡ−ＴＢＡ付加体はほとんど生成していない。これは当該比較用試料においてはＬＤＬの酸化反応が進行していないことを示している。以上の結果より、硫酸銅（ＩＩ）を用いる酸化反応によってＣｕ^２＋−酸化ＬＤＬが得られたことが示された。

＜実験４．４．Ｃｕ^２＋−酸化ＬＤＬとβ_２ＧＰＩの複合体の形成＞
実験４．２．においてＬＤＬを常法に従い硫酸銅（ＩＩ）を用いて酸化することによって得られたＣｕ^２＋−酸化ＬＤＬと、β_２ＧＰＩとを、以下のようにして複合体とした。すなわち、適宜の濃度のＣｕ^２＋−酸化ＬＤＬ又はβ_２ＧＰＩを含む溶液を希釈、混合することにより、Ｃｕ^２＋−酸化ＬＤＬの濃度が１００μｇ／ｍＬ及びβ_２ＧＰＩの濃度が５０μｇ／ｍＬである反応溶液を調製した。当該反応溶液を３７℃で１６時間インキュベートすることによって、Ｃｕ^２＋−酸化ＬＤＬ／β_２ＧＰＩ複合体を得た。当該反応溶液を−８０℃まで冷却することによって凍結させて複合化反応を停止させ、以後の実験には、当該凍結サンプルを適宜解凍して用いた。なお、以上のようにして得られたサンプル中に含まれるＣｕ^２＋−酸化ＬＤＬ／β_２ＧＰＩ複合体の濃度は、市販のキット（商品名「ＰｉｅｒｃｅＴＭ ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ」、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いて、ＢＣＡタンパク質アッセイ法によって測定した。

＜実験４．５．電気泳動による複合体形成の確認＞
Ｃｕ^２＋−酸化ＬＤＬ／β_２ＧＰＩの複合体の形成を確認するため、ヒト血清、実験４．１．により得られたＬＤＬ、実験４．２．により得られたＣｕ^２＋−酸化ＬＤＬ、β_２ＧＰＩ、及び、実験４．４．により得られたＣｕ^２＋−酸化ＬＤＬ／β_２ＧＰＩ複合体をアガロースゲル電気泳動に供した。アガロースゲル電気泳動には、市販のＴＩＴＡＮ ＧＥＬ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｐｌａｔｅ（Ｈｅｌｅｎａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）を用い、ヒト血清サンプルを除いて、ウェル当たり８μｇのタンパク質をロードした。なお、ヒト血清サンプルのロード量はウェル当たり２μＬである。電気泳動にはバルビタール緩衝液（１０ｍＭ ｂａｒｂｉｔａｌ、５０ｍＭ ｓｏｄｉｕｍ ｄｉｅｔｈｙｌｂａｒｂｉｔｕｒａｔｅ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１５ｍＭ ＮａＮ_３）を用い、電圧９０Ｖ、泳動時間３０分の条件で電気泳動を行った。泳動後のアガロースゲルを、固定液（６０％（ｖ／ｖ）ＥｔＯＨ、１０％（ｖ／ｖ）ＣＨ_３ＣＯＯＨ、３０％（ｖ／ｖ）Ｈ_２Ｏ）に１５分間浸漬した後に、６０℃で２０分間、乾燥器中で乾燥させた。乾燥後のゲルをＡｍｉｄｏ ｂｌａｃｋ １０Ｂによるタンパク質の染色、又は、Ｆａｔ Ｒｅｄ７Ｂによる脂質の染色に供した。染色後のゲルの写真を図４に示す（図４中、左側ＡにＡｍｉｄｏ ｂｌａｃｋ １０Ｂによるタンパク質染色の結果、右側ＢにＦａｔ Ｒｅｄ７Ｂによる脂質染色の結果を示す）。図４に見られるとおり、ＬＤＬ又はＣｕ^２＋−酸化ＬＤＬをロードしたレーンにおいては、ＬＤＬ又はＣｕ^２＋−酸化ＬＤＬの泳動が確認されたのに対して、Ｃｕ^２＋−酸化ＬＤＬ／β_２ＧＰＩ複合体をロードしたレーンにおいては、タンパク質及び脂質の泳動はいずれも確認されなかった。この結果は、負に帯電しているＣｕ^２＋−酸化ＬＤＬに対してβ_２ＧＰＩが結合することによって電荷が中和されることと対応しており、実験４．４．において、確かにＣｕ^２＋−酸化ＬＤＬ／β_２ＧＰＩ複合体が得られたことを示している。

＜実験５．ラテラルフローアッセイ＞
本発明に係る検出方法によって、試料中に含まれる酸化ＬＤＬ／β_２ＧＰＩ複合体の量を検出できることを実証するため、まず、既知の濃度の酸化ＬＤＬ／β_２ＧＰＩ複合体を含む標準試料を用いて、酸化ＬＤＬ／β_２ＧＰＩ複合体の検出実験を行った。なお、図５は当該実験の手順を示す概念図である。

＜実験５．１．テストストリップ＞
ラテラルフロー用のテストストリップとしては、市販のテストストリップ（Ｂｉｏｐｏｒｔｏ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社製、商品名「ｇＲＡＤ ＯｎｅＤｅｔｅｃｔｉｏｎ−１２０ｓｔｒｉｐｓ」）を用いた。

なお、当該テストストリップは、図１に示した構造を備えており、被験試料が流れる方向の上流から、サンプルパッド、検出部、コントール部、及び、ウィッキングパッドを備えている。検出部には、ビオチン結合タンパク質が固定化されている。一方、上記コントロール部には、抗マウスＩｇＧ抗体、抗ヤギＩｇＧ抗体、抗ウサギＩｇＧ抗体の混合物（以下、「ポリクロ―ナル抗ＩｇＧ抗体」という）が固定化されている。検出部及びコントロール部はそれぞれ約１ｍｍ幅の線状の形状をしている。

＜実験５．２．展開液の調製＞
本実験において、ラテラルフローアッセイは、試料を含む展開液Ａと、検出対象を標識する展開液Ｂの二つの展開液を用いて行った。展開液Ａと展開液Ｂは、以下の手順にて調製した。

＜展開液Ａ＞
展開液Ａは、被験試料とビオチン−３Ｈ３抗体コンジュゲートを含む展開液である。本実験において、当該展開液Ａは、前述した「実験４」で調製したＣｕ^２＋−酸化ＬＤＬ／β_２ＧＰＩ複合体を既知の濃度（０．１〜５０．０μｇ／ｍＬ）で含む標準試料溶液（２５μＬ）と、前述した「実験２」で調製したビオチン−３Ｈ３抗体コンジュゲートを含む溶液（２．５μＬ、抗体濃度：０．１ｍｇ／ｍＬ）を混合することにより調製した。なお、標準試料溶液は、「実験４」で調製したＣｕ^２＋−酸化ＬＤＬ／β_２ＧＰＩ複合体と、希釈液（２５μＬ、０．５％（ｗ／ｖ）のＢＳＡを含む１０ｍＭ ホウ酸緩衝液、ｐＨ７．０）を用いて調製した。

＜展開液Ｂ＞
一方、展開液Ｂは、測定対象である酸化ＬＤＬ／β_２ＧＰＩ複合体を標識するためのものであり、金ナノ粒子−２Ｅ１０抗体コンジュゲートを含む展開液である。当該展開液Ｂは、前述した「実験３」で調製した金ナノ粒子−２Ｅ１０抗体コンジュゲートを含む溶液（２．５μＬ、抗体濃度：４８μｇ／ｍＬ）と希釈液（２５μＬ、０．５％（ｗ／ｖ）のＢＳＡを含む１０ｍＭ ホウ酸緩衝液、ｐＨ７．０）を混合することにより調製した。

以上のようにして得られた展開液Ａは、ピペッティングにより混合した後、さらに、室温（２５℃）で１５分間インキュベートした上で、以下に述べるラテラルフローアッセイに供した。展開液Ｂについても同様に混合、インキュベートした上でラテラルフローアッセイに供した。

＜実験５．３．ラテラルフローアッセイ＞
テストストリップをウィッキングパッドが上、サンプルパッドが下を向くように、おおよそ垂直とした状態で、図５の「展開液Ａ」に示すとおり、サンプルパッドを展開液Ａと１分間接触させることによって、展開液Ａをテストストリップ中に展開した。続いて、図５の「展開液Ｂ」に示すとおり、上記サンプルパッドを展開液Ｂと４分間接触させることによって、展開液Ｂをテストストリップに展開した。

展開液Ａ及び展開液Ｂを展開した後のテストストリップの写真を図６に示す。本実験例において、展開液Ｂは、金ナノ粒子−２Ｅ１０抗体コンジュゲートを含んでいる。当該金ナノ粒子−２Ｅ１０抗体コンジュゲートは、検出部に捕捉されている酸化ＬＤＬ／β_２ＧＰＩ複合体、及び、コントロール部に固定されているポリクロ―ナル抗ＩｇＧ抗体に結合する。金ナノ粒子が捕捉されることによって検出部及びコントロール部には、図６に示すとおり、目視で確認可能なライン（紫〜赤紫色である）が現れるので、試験者は試験の成否を容易に確認することができる。

＜実験５．４．検出部及びコントロール部における標識体の検出＞
展開液Ａ及び展開液Ｂを展開した後、テストストリップの検出部及びコントロール部に捕捉された標識体、すなわち、金ナノ粒子の量を画像解析ソフト（ＩｍａｇｅＪ）を用いた画像解析により測定した。具体的な手順は以下に示すとおりである。なお、検出部及びコントロール部に捕捉された標識体の量を検出することができる限りにおいて、適宜の手法を用いることができることは勿論である。

まず、展開液Ａ及び展開液Ｂを展開した後のテストストリップの写真（図６）を、市販のスマートフォンのカメラ機能を用いて撮影した。なお、写真撮影はフラッシュを使わずに行った。得られた写真の画像データをパーソナルコンピュータに取り込み、画像解析ソフト（ＩｍａｇｅＪ）を用いてグレイスケールイメージへと変換した。次いで、グレイスケールイメージへと変換された画像上で、上記検出部又はコントロール部に相当する領域をＲＯＩ（Ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ）として選択し、次いで、このようにして選択したＲＯＩにおける輝度分布を示すヒストグラムを取得した。なお、当該ヒストグラムにおいて、ｘ軸は輝度（グレイ値）を表しており、ｙ軸は選択領域において各輝度（グレイ値）を示すピクセルの数を示している。検出部及びコントロール部について、当該ヒストグラムにおける曲線下面積を求め、検出部について得られた曲線下面積とコントロール部について得られた曲線下面積の比率（検出部について得られた曲線下面積／コントロール部について得られた曲線下面積）を測定データとして得た。

＜実験５．５．標準曲線の取得＞
得られた測定データ（検出部について得られた曲線下面積／コントロール部について得られた曲線下面積）を縦軸に、標準試料中に含まれるＣｕ^２＋−酸化ＬＤＬ／β_２ＧＰＩ複合体の濃度を横軸としてプロットした。結果を図７に示す。図７には、プロットした測定データと、以下の数１に示す４係数ロジスティック回帰モデルに基づいて得られた標準曲線を併せて示している。図７に示されているとおり、当該標準曲線の平均二乗誤差ＭＳＥは０．００２９７４、決定係数Ｒ^２は０．９８０９、残差平方和ＳＳは０．０２３７９、残差標準偏差ＳＹＸは０．０７７１２であり、当該標準曲線が信頼性の高いものであることを示している。以上の結果は、本発明に係る酸化ＬＤＬ／β_２ＧＰＩ複合体の検出方法が、少なくとも、０．１〜５０．０μｇ／ｍＬの濃度範囲において、酸化ＬＤＬ／β_２ＧＰＩ複合体の検出又は定量的な測定に応用できることを示している。

＜実験６．ＥＬＩＳＡ法との比較＞
本発明に係る酸化ＬＤＬ／β_２ＧＰＩ複合体の検出方法をＥＬＩＳＡ法に基づく従来の検出方法と比較するため、ＥＬＩＳＡ法により、既知の濃度のＣｕ^２＋−酸化ＬＤＬ／β_２ＧＰＩ複合体を含む標準試料を用いて、Ｃｕ^２＋−酸化ＬＤＬ／β_２ＧＰＩ複合体の検出実験を行った。具体的には、Ｋｏｂａｙａｓｈｉらの手法（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００３， ｖｏｌ．４４， ｐｐ．７１６−７２６．）に若干の修正を加え、以下に示す手順にて実験を行った。

市販のイムノアッセイ用マイクロプレート（商品名「イムロン２ＨＢ」、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）に、「実験１」で調製した３Ｈ３抗体を含む溶液（抗体濃度：８μｇ／ｍＬ、緩衝液：１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）を各ウェル５０μＬずつ加え、４℃で一晩インキュベートすることによって、３Ｈ３抗体を吸着させた。その後、当該プレートを５％（ｗ／ｖ）の牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を用いてブロッキングした。次いで、Ｈｅｐｅｓ緩衝液（リファレンス）、又は「実験４」で調製した既知の濃度のＣｕ^２＋−酸化ＬＤＬ／β_２ＧＰＩ複合体を含む標準試料（Ｃｕ^２＋−酸化ＬＤＬ／β_２ＧＰＩ複合体濃度：０．０２−２．００μｇ／ｍＬ）を各ウェルに５０μＬ加え、１時間室温でインキュベートした。各ウェルから液を除去し、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０／ＰＢＳで洗浄した後、「実験２」で調製したビオチン−２Ｅ１０抗体コンジュゲート（ビオチン−抗ａｐоＢ１００抗体コンジュゲート）を各ウェルに添加し、１時間静置した。各ウェルから液を除去し、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０／ＰＢＳで洗浄した後、市販のＨＲＰ（Ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）修飾されたストレプトアビジンを各ウェルに添加し、１時間インキュベートした。各ウェルから液を除去し、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０／ＰＢＳで洗浄した後、各ウェルに、ＴＭＢ（３，３‘，５，５’−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ）及び過酸化水素（Ｈ_２Ｏ_２）を加え、３０分間インキュベートした。０．３Ｎ 硫酸を加え反応を停止させた後、波長６５０ｎｍをリファレンスとして、波長４５０ｎｍの吸光度を測定した。波長４５０ｎｍにおける吸光度と波長６５０ｎｍにおける吸光度の比率を測定データとして、当該測定データを縦軸に、標準試料中に含まれるＣｕ^２＋−酸化ＬＤＬ／β_２ＧＰＩ複合体の濃度を横軸としてプロットした。その結果を図８に示す。

図８には、プロットした測定データと数１に示す４係数ロジスティック回帰モデルに基づいて得られた標準曲線を併せて示している。図８に示されているとおり、当該標準曲線の平均二乗誤差ＭＳＥは０．０００７４１１、決定係数Ｒ^２は０．９９８４、残差平方和ＳＳは０．０１５５６、残差標準偏差ＳＹＸは０．０３０２６であり、当該標準曲線が信頼性の高いものであることを示している。

一方、図８を見ると、ＥＬＩＳＡ法を用いた場合、測定対象となる標準試料に含まれるＣｕ^２＋−酸化ＬＤＬ／β_２ＧＰＩ複合体の濃度が２μｇ／ｍＬを超える濃度領域において、標準曲線が頭打ちとなっている。この結果は、Ｃｕ^２＋−酸化ＬＤＬ／β_２ＧＰＩ複合体の濃度が２．０μｇ／ｍＬを超える濃度領域において、ＥＬＩＳＡ法は定量性を失うことを示している。したがって、ＥＬＩＳＡ法を用いて酸化ＬＤＬ／β_２ＧＰＩ複合体を検出、定量する場合には、測定結果が２．０μｇ／ｍＬ以下の濃度範囲に収まるようにサンプルを希釈しなければならない。しかし、一般的にはサンプル中に含まれる酸化ＬＤＬ／β_２ＧＰＩ複合体の濃度は不明であること、また、ＥＬＩＳＡ法による測定には約３時間程度の時間がかかることを考えると、実験者には大変な負担がかかるものであるといえる。

これに対して、図７から明らかなとおり、本発明に係る酸化ＬＤＬ／β_２ＧＰＩ複合体の検出方法においては、２μｇ／ｍＬは勿論のこと、５０．０μｇ／ｍＬの濃度においても標準曲線が頭打ちとなっていない。この結果は、本発明に係る酸化ＬＤＬ／β_２ＧＰＩ複合体の検出方法は、従来のＥＬＩＳＡ法と比較して、遥かに広いダイナミックレンジで酸化ＬＤＬ／β_２ＧＰＩ複合体の検出、定量が可能であることを示している。

一方、本発明に係る検出方法は、比較的低濃度領域においても優れた定量性を発揮する。図９には、ＥＬＩＳＡ法が優れた定量性を示す低濃度領域（０．０２μｇ／ｍＬ〜１μｇ／ｍＬ）においてＥＬＩＳＡ法から得られた測定データをｘ軸に、本発明に係る検出方法から得られた測定データをｙ軸にプロットしたグラフを示している。図９に示されているとおり、本発明に係る検出方法で得られた測定データと、ＥＬＩＳＡ法で得られた測定データは非常に良く相関している（Ｒ^２＝０．９８７１）。この結果は、本発明に係る検出方法は、ＥＬＩＳＡ法が優れた定量性を示す低濃度領域（０．０２μｇ／ｍＬ〜１μｇ／ｍＬ）においても、ＥＬＩＳＡ法と遜色ないレベルで酸化ＬＤＬ／β_２ＧＰＩ複合体を検出、定量できるものであることを示している。

＜実験７．血清中の酸化ＬＤＬ／β_２ＧＰＩ複合体の検出＞
本発明に係る酸化ＬＤＬ／β_２ＧＰＩ複合体の検出方法を用いて、血清試料中に含まれる未知濃度の酸化ＬＤＬ／β_２ＧＰＩ複合体の検出を行った。展開液Ａを調製する際に、標準試料溶液に代えて合計９検体のヒト血清（試料Ａ〜試料Ｉ）を被験試料として用いた以外は、「実験５」におけると同様にして、酸化ＬＤＬ／β_２ＧＰＩ複合体の検出を行った。

なお、本実験においても、「実験５」においてと同様の手順で、「実験４」で調製したＣｕ^２＋−酸化ＬＤＬ／β_２ＧＰＩ複合体を既知の濃度（０．１〜５０．０μｇ／ｍＬ）で含む標準試料溶液を用いて、標準曲線を得た。図１０には、このようにして得られた標準曲線を示している。図１０に示されているとおり、当該標準曲線の平均二乗誤差ＭＳＥは０．０１４５４、決定係数Ｒ^２は０．９５９、残差平方和ＳＳは０．１３０８、残差標準偏差ＳＹＸは０．１６１８であり、当該標準曲線が信頼性の高いものであることを示している。本実験では、未知濃度の酸化ＬＤＬ／β_２ＧＰＩ複合体を含む血清試料から得られた測定データを、当該標準曲線に当てはめることによって、当該血清試料に含まれる酸化ＬＤＬ／β_２ＧＰＩ複合体の含量を半定量的に求めた。合計９検体のヒト血清試料（試料Ａ〜試料Ｉ）について、本発明に係る検出方法で得られた測定結果を図１１に示す。

一方、検出結果の妥当性を検証するための比較対象として、ＥＬＩＳＡ法を用いて、合計９検体の同じヒト血清試料について、その試料中に含まれる酸化ＬＤＬ／β_２ＧＰＩ複合体の検出を行った。

なお、ＥＬＩＳＡ法についても、「実験６」においてと同様の手順で、「実験４」で調製したＣｕ^２＋−酸化ＬＤＬ／β_２ＧＰＩ複合体を既知の濃度（０．０２〜２．０μｇ／ｍＬ）で含む標準試料溶液を用いて、標準曲線を得た。図１２には、このようにして得られた標準曲線を示している。図１２に示されているとおり、当該標準曲線の平均二乗誤差ＭＳＥは０．０００７４１１、決定係数Ｒ^２は０．９９８４、残差平方和ＳＳは０．０１５５６、残差標準偏差ＳＹＸは０．０３０２６であり、当該標準曲線が信頼性の高いものであることを示している。本実験では、未知濃度の酸化ＬＤＬ／β_２ＧＰＩ複合体を含む血清試料から得られた測定データを、当該標準曲線に当てはめることによって、当該血清試料に含まれる酸化ＬＤＬ／β_２ＧＰＩ複合体の含量を半定量的に求めた。合計９検体のヒト血清試料（試料Ａ〜試料Ｉ）について、ＥＬＩＳＡ法で得られた測定結果を図１３に示す。

さらに、図１４は、図１１に示した本発明に係る検出方法により得られた測定結果をｙ軸に、図１３に示したＥＬＩＳＡ法により得られた測定結果をｘ軸にプロットしたグラフである。図１４に示されているとおり、両方法で得られた測定結果は、非常に良く相関している（Ｒ^２＝０．６３９９）。以上の結果は、本発明に係る酸化ＬＤＬ／β_２ＧＰＩ複合体の検出方法が、血清試料又は血清を含む種々の試料に含まれる酸化ＬＤＬ／β_２ＧＰＩ複合体を検出するための、有効かつ信頼性の高い方法であることを示している。

＜実験８．本発明に係る検出方法の他の一例＞
展開液Ａに含まれるビオチン−３Ｈ３抗体コンジュゲートに代えてビオチン−２Ｅ１０抗体コンジュゲート、展開液Ｂに含まれる金ナノ粒子−２Ｅ１０抗体コンジュゲートに代えて金ナノ粒子−３Ｈ３抗体コンジュゲートを用いた以外は、実験５と同様にして、既知の濃度のＣｕ^２＋−酸化ＬＤＬ／β_２ＧＰＩ複合体を含む標準試料を用いて、酸化ＬＤＬ／β_２ＧＰＩ複合体の検出実験を行った。なお、ビオチン−２Ｅ１０抗体コンジュゲートは、３Ｈ３抗体の代わりに、２Ｅ１０抗体を用いた以外は上記実験２におけると同様の実験手順にて調製した。また、金ナノ粒子−３Ｈ３抗体コンジュゲートは、２Ｅ１０抗体の代わりに、３Ｈ３抗体を用いた以外は上記実験３におけると同様の実験手順にて調製した。

得られた測定データ（検出部について得られた曲線下面積／コントロール部について得られた曲線下面積）を縦軸に、標準試料中に含まれるＣｕ^２＋−酸化ＬＤＬ／β_２ＧＰＩ複合体の濃度を横軸としてプロットした。結果を図１５に示す。図１５には、プロットした測定データと数１に示す４係数ロジスティック回帰モデルに基づいて得られた標準曲線を併せて示している。図１５に示されているとおり、当該標準曲線の平均二乗誤差ＭＳＥは０．００００６３２２、決定係数Ｒ^２は０．９９８４、残差平方和ＳＳは０．０００５０５８、残差標準偏差ＳＹＸは０．０１１２４であり、当該標準曲線が信頼性の高いものであることを示している。また、以上の結果は、本発明に係る検出方法において、第一結合コンポーネントが備えている第一結合部を提供する物質として、酸化ＬＤＬ／β_２ＧＰＩ複合体を構成するａｐоＢ１００と結合する抗ａｐоＢ１００抗体、第二結合コンポーネントが備えている第二結合部を提供する物質として、酸化ＬＤＬ／β_２ＧＰＩ複合体を構成するβ_２ＧＰＩと結合する抗β_２ＧＰＩ抗体を用いた場合であっても、酸化ＬＤＬ／β_２ＧＰＩ複合体を検出又は定量することができることを示している。

しかし、実験８で得られた図１５に示す標準曲線と、先の実験５で得られた図７に示す標準曲線とを比較すると、実験５の検出方法の方が得られるシグナルが大きく、検出感度に優れていることがわかる。この結果は、本発明に係る検出方法は、第一結合コンポーネントが備えている第一結合部を提供する物質として、酸化ＬＤＬ／β_２ＧＰＩ複合体を構成するβ_２ＧＰＩと特異的に結合する抗β_２ＧＰＩ抗体を、第二結合コンポーネントが備えている第二結合部を提供する物質として、酸化ＬＤＬ／β_２ＧＰＩ複合体を構成するａｐоＢ１００と結合する抗ａｐоＢ１００抗体を用いた場合に、極めて優れた感度を発揮することを示している。

本発明に係る酸化ＬＤＬ／β_２ＧＰＩ複合体の検出方法又は検出キットによれば、従来のＥＬＩＳＡ法と比較して、迅速かつ容易に、しかも広いダイナミックレンジで生体試料などの試料中に含まれる酸化ＬＤＬ／β_２ＧＰＩ複合体を検出、定量することができる。極めて容易かつハイスループットな動脈硬化性疾患の検査、診断技術としての応用が期待でき、その産業上の利用可能性は大きい。

１ ラテラルフローアッセイ用テストストリップ
２ 支持体
３ メンブレン
１１ サンプルパッド
１２ 検出部
１３ コントロール部
１４ ウィッキングパッド

Claims (8)

1. 試料中に含まれる酸化ＬＤＬとβ_２−グリコプロテインＩの複合体（酸化ＬＤＬ／β_２ＧＰＩ複合体）の検出方法であって、
   ラテラルフローアッセイ用テストストリップを用い、
   酸化ＬＤＬ／β_２ＧＰＩ複合体と結合する第一結合コンポーネントを介して、前記試料中に含まれる酸化ＬＤＬ／β_２ＧＰＩ複合体を前記テストストリップの所定位置に捕捉する工程、及び、
   標識体を含む第二結合コンポーネントを、テストストリップの所定位置に固定された前記酸化ＬＤＬ／β_２ＧＰＩ複合体に結合させることで、当該酸化ＬＤＬ／β_２ＧＰＩ複合体を標識する工程、
   を含むことを特徴とする酸化ＬＤＬ／β_２ＧＰＩ複合体の検出方法。
2. 前記第一結合コンポーネントが、酸化ＬＤＬ／β_２ＧＰＩ複合体を構成するβ_２ＧＰＩに特異的に結合する第一結合部を備えていることを特徴とする請求項１に記載の検出方法。
3. 前記第一結合コンポーネントが、
   酸化ＬＤＬ／β_２ＧＰＩ複合体を構成するβ_２ＧＰＩ分子と特異的に結合する前記第一結合部と、第一の特異的結合要素とを含む第一結合ユニットと、
   前記第一の特異的結合要素と特異的に結合する第二の特異的結合要素を含む第二結合ユニットであって、テストストリップ上の所定位置に位置している第二結合ユニット、
   を含み、
   第一結合コンポーネントを介して、前記試料中に含まれる酸化ＬＤＬ／β_２ＧＰＩ複合体を前記テストストリップの所定の位置に捕捉する前記工程が、酸化ＬＤＬ／β_２ＧＰＩ複合体と前記第一結合ユニットの前記第一結合部とを結合させる工程と、前記第一結合ユニットの前記第一の特異的結合要素と前記第二結合ユニットの前記第二の特異的結合要素とを結合させる工程とを含んでいることを特徴とする請求項２に記載の検出方法。
4. 前記第一の特異的結合要素及び前記第二の特異的結合要素は、それぞれ、アビジン及びビオチン若しくはその逆、ストレプトアビジン及びビオチン若しくはその逆、又は、ニュートラビジン及びビオチン若しくはその逆のいずれかであることを特徴とする請求項３に記載の検出方法。
5. 前記第二結合コンポーネントが、酸化ＬＤＬ／β_２ＧＰＩ複合体を構成するアポリポプロテインＢ−１００（ａｐоＢ１００）に結合する第二結合部を備えていることを特徴とする請求項１乃至４に記載の検出方法。
6. 前記酸化ＬＤＬ／β_２ＧＰＩ複合体と前記第一結合部との結合が、抗原抗体反応に基づく結合であることを特徴とする請求項１乃至５に記載の検出方法。
7. 前記酸化ＬＤＬ／β_２ＧＰＩ複合体と前記第二結合部との結合が、抗原抗体反応に基づく結合であることを特徴とする請求項１乃至６に記載の検出方法。
8. 少なくとも下記（Ａ）乃至（Ｃ）を含み、請求項１乃至７のいずれかに記載の検出方法を実施するための検出キット：
   （Ａ）酸化ＬＤＬ／β_２ＧＰＩ複合体と結合する第一結合コンポーネント、
   （Ｂ）標識体を含む第二結合コンポーネント、及び、
   （Ｃ）ラテラルフローアッセイ用テストストリップ。
   

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