CN102124030A - 抗氧化LDL/β2GPI复合物的抗体及其用途 - Google Patents

抗氧化LDL/β2GPI复合物的抗体及其用途 Download PDF

Info

Publication number
CN102124030A
CN102124030A CN2009801322531A CN200980132253A CN102124030A CN 102124030 A CN102124030 A CN 102124030A CN 2009801322531 A CN2009801322531 A CN 2009801322531A CN 200980132253 A CN200980132253 A CN 200980132253A CN 102124030 A CN102124030 A CN 102124030A
Authority
CN
China
Prior art keywords
antibody
arteriosclerosis
sequence number
record
aminoacid sequence
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN2009801322531A
Other languages
English (en)
Other versions
CN102124030B (zh
Inventor
松浦荣次
小岛和夫
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Okayama University NUC
Original Assignee
Medical and Biological Laboratories Co Ltd
Okayama University NUC
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Medical and Biological Laboratories Co Ltd, Okayama University NUC filed Critical Medical and Biological Laboratories Co Ltd
Publication of CN102124030A publication Critical patent/CN102124030A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN102124030B publication Critical patent/CN102124030B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/001—Preparation for luminescence or biological staining
    • A61K49/0013—Luminescence
    • A61K49/0017—Fluorescence in vivo
    • A61K49/0019—Fluorescence in vivo characterised by the fluorescent group, e.g. oligomeric, polymeric or dendritic molecules
    • A61K49/0021—Fluorescence in vivo characterised by the fluorescent group, e.g. oligomeric, polymeric or dendritic molecules the fluorescent group being a small organic molecule
    • A61K49/0032—Methine dyes, e.g. cyanine dyes
    • A61K49/0034—Indocyanine green, i.e. ICG, cardiogreen
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/001—Preparation for luminescence or biological staining
    • A61K49/0013—Luminescence
    • A61K49/0017—Fluorescence in vivo
    • A61K49/005—Fluorescence in vivo characterised by the carrier molecule carrying the fluorescent agent
    • A61K49/0058—Antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5082—Supracellular entities, e.g. tissue, organisms
    • G01N33/5088—Supracellular entities, e.g. tissue, organisms of vertebrates
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531—Production of immunochemical test materials
    • G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
    • G01N33/533—Production of labelled immunochemicals with fluorescent label
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/32—Cardiovascular disorders
    • G01N2800/323—Arteriosclerosis, Stenosis

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

本发明人等对动脉硬化切片的可免疫染色的抗体中能适用于体内成像的抗体进行了确定，并对其特异性进行了分析，结果证明对确定表位具有特异性的抗氧化LDL/β2GPI复合物抗体的荧光标记物对成像是有效的。

Description

抗氧化LDL/β<sub>2</sub>GPI复合物的抗体及其用途
技术分野
本发明涉及抗氧化LDL/β2GPI复合物的抗体以及利用该抗体确定粥样动脉硬化的存在部位、监测治疗效果等非介入性的动脉硬化的诊断方法。
背景技术
作为观察动脉硬化的状态的目前已得到实用的诊断方法，可例示出以下4种方法。
“脚关节手臂血压比”：在躺着的状态下测定两臂、两脚的血压，在正常情况下，脚踝一侧的值稍高。但是，在血管存在狭窄的情况下，狭窄部位下游的血压降低，脚关节的血压/手臂的血压之比(ABI)变小。从ABI降低不仅可以推测下肢动脉存在动脉硬化，而且可以推测全身都存在动脉硬化。
“脉波速度检查”：通过研究动脉硬度的方法来推测动脉硬化的进行情况的方法。健康人由于血管具有弹性，振动被血管壁吸收，脉波的速度慢。当动脉硬化时，脉波变快，因此能够以速度为指标来推测动脉硬化的进行情况。
“颈动脉超声波检查”：利用超声波能够容易地观察到行走于皮肤表面附近的颈动脉的内部状况，因此通过对该颈动脉进行研究来推测全身的动脉硬化的进行情况。
“MR血管造影(MRA)”和“CT血管造影(CTA)”：目前血管造影是主要的血管疾病的图像诊断方法，介入性更低且与血管造影基本相当的图像信息已得以应用。关于CTA的优点，可列举出(1)空间分辨力高、(2)检查简便、(3)钙化病变的检测优异。
上述“脚关节手臂血压比”、“脉波速度检查”无法确定粥样化位置和对每个单个部位的发展状况进行诊断，只能间接地通过数值进行评价。
另外，“颈动脉超声波检查”与脉波速度检查等不同，具有能够通过图像实际地直接对血管内部进行诊断的优点。但是，由于需要根据超声波图像的深浅和形状来判断血管壁的状况，因此要求进行检查的医师或检查技师具有该技能，并且无法确定除颈动脉以外的部位的粥样化位置和对每个单个部位的发展状况进行诊断。
另外，作为监测动脉硬化发展状况的方法，有通过测定血中的氧化LDL/β2GPI复合物的ELISA系统(日本专利3370334号、日本专利3898680号、WO2003/022866、WO2004/023141)。但是，目前的氧化LDL/β2GPI复合物测定ELISA虽然能够推测动脉硬化灶的大小，但是无法确定动脉硬化灶的存在部位。
此外，使用了MRI和放射性标记的成像由于也需要根据图像的深浅和形状来判断血管壁的状况，因此要求进行检查医师和检查技师具有该技能(美国专利6716410号、美国专利6375925号)。
另外，以下示出与本发明相关的现有技术文献。
专利文献1：日本专利3370334号
专利文献2：日本专利3898680号
专利文献3：WO2003/022866
专利文献4：WO2004/023141
专利文献5：日本特表2001-506983
专利文献6：日本专利第4044972
专利文献7：美国专利6716410号
专利文献8：美国专利6375925号
非专利文献1：Journal of Biological Chemistry 269，15274-15279，1994
发明内容
发明所要解决的课题
本发明的课题在于提供抗氧化LDL/β2GPI复合物的抗体以及使用该抗体确定粥样动脉硬化的存在部位、监测治疗效果等非介入性的动脉硬化的诊断方法。
用于解决课题的手段
本发明人等确定了动脉硬化切片的可免疫染色的抗体中可适用于对体内即生物体内的动脉硬化灶、特别是动脉硬化粥样斑块的存在位置及其大小进行成像的抗体，并对其特异性进行了分析。其结果证明对确定的表位具有特异性的抗氧化LDL/β2GPI复合物抗体的荧光标记物对成像是有效的。
即，本发明提供以下〔1〕～〔12〕。
〔1〕一种下述(a)～(e)中任一项所述的抗体，其与氧化LDL和β2-糖蛋白I的复合物(氧化LDL/β2GPI复合物)结合；
(a)包含具有序列号：2中记载的氨基酸序列作为CDR1、具有序列号：3中记载的氨基酸序列作为CDR2以及具有序列号：4中记载的氨基酸序列作为CDR3的重链的抗体；
(b)包含具有序列号：1中记载的氨基酸序列作为重链可变区的重链的抗体；
(c)包含具有序列号：7中记载的氨基酸序列作为CDR1、具有序列号：8中记载的氨基酸序列作为CDR2和具有序列号：9中记载的氨基酸序列作为CDR3的轻链的抗体；
(d)包含具有序列号：6中记载的氨基酸序列作为轻链可变区的轻链的抗体：
(e)具有由上述(a)或(b)中记载的重链和上述(c)或(d)中记载的轻链构成的对的抗体。
〔2〕一种抗体，其与和〔1〕所述的抗体所结合的表位相同的表位结合。
〔3〕根据〔1〕或〔2〕所述的抗体，其为人源化抗体或嵌合抗体。
〔4〕一种动脉硬化的存在部位的成像剂，其含有与氧化LDL和β2-糖蛋白I的复合物(氧化LDL/β2GPI复合物)结合的抗体。
〔5〕一种动脉硬化的存在部位的成像剂，其含有〔1〕～〔3〕中任一项所述的抗体。
〔6〕根据〔4〕或〔5〕所述的成像剂，其对动脉硬化的粥样斑块的位置和/或大小进行成像。
〔7〕一种动脉硬化的存在部位的成像用试剂盒，其包含与氧化LDL和β2-糖蛋白I的复合物(氧化LDL/β2GPI复合物)结合的抗体。
〔8〕一种动脉硬化的存在部位的成像用试剂盒，其包含〔1〕～〔3〕中任一项所述的抗体。
〔9〕一种动脉硬化治疗剂的候补化合物的筛选方法，其包含以下工序：
(a)向给予了〔1〕～〔3〕中任一项所述的抗体的动脉硬化患病非人动物模型给予候补化合物的工序；
(b)对给予了所述候补化合物的动脉硬化患病非人动物模型和未给予所述候补化合物的动脉硬化患病非人动物模型的动脉硬化灶进行成像的工序；
(c)对给予了所述候补化合物的动脉硬化患病非人动物模型和未给予所述候补化合物的动脉硬化患病非人动物模型的动脉硬化灶的大小或存在部位进行比较的工序，和
(d)从给予了所述候补化合物的动脉硬化患病非人动物模型中选择与未给予所述候补化合物的动脉硬化患病非人动物模型相比动脉硬化灶减少或消失的候补化合物的工序。
〔10〕一种动脉硬化的存在部位的成像方法，其包含〔1〕～〔3〕所述的抗体。
〔11〕〔1〕～〔3〕所述的抗体在制造动脉硬化的存在部位的成像剂中的用途。
〔12〕〔1〕～〔3〕所述的抗体在动脉硬化的存在部位的成像方法中的用途。
附图说明
图1是表示用氧化LDL/β2GPI复合物作为抗原对BALB/c小鼠进行免疫得到的单克隆抗体对固定化抗原的反应性的图。横轴表示抗体浓度、纵轴表示吸光度。
图2是用于分析与液体中的抗原的竞争性(竞争抑制试验)的示意图。
图3是表示利用抗原的竞争抑制试验的曲线图。横轴表示液体中的抗原浓度、纵轴表示当将不存在抑制抗原时的吸光度记为100％时的抑制％。3H3和4C12为识别结合于氧化LDL的β2GPI的抗体，其不识别游离β2GPI。另外，2H6、3D4、2A12为与游离的β2GPI反应的抗体。
图4为动脉硬化多发小鼠模型(高脂肪饮食喂养的apoE-/-)的主动脉瓣的免疫荧光染色照片。A)DAPI：核的染色、B)Mac3：巨噬细胞的特异性抗体、C)3H3抗体、D)对照。对用普通饲料喂养的C57BL6系统的小鼠使用3H3抗体、Mac3的免疫荧光染色中，泡沫状巨噬细胞聚集而成的粥样斑块被染色。使用3H3时，同样的部位被染色。
图5动脉硬化多发小鼠模型(高脂肪饮食喂养的apoE-/-)的主动脉瓣的免疫荧光染色照片。表示使用了氧化LDL/β2GPI复合物抗体的其他抗体的荧光免疫染色的结果。粥样斑块的染色阳性例子仅为3H3和抗体A。
图6是利用IVIS 200获得的使用了特异抗体的荧光成像(反射荧光观察)照片。体内：将成像剂从脂肪饮食喂养的ApoE-/-小鼠的尾静脉给予高脂肪饮食喂养6个月以上的ApoE-/-小鼠，2～24小时后，用IVIS 200在吸入麻醉下对体内荧光进行观察、摄影。此时，由于ApoE-/-小鼠的黑色体毛吸收荧光，因此剃掉体毛进行观察。离体：使小鼠安乐死、开胸使心脏和主动脉露出，在右心耳上开一个小口，然后向左心室插入针并用冷PBS 10ml进行心脏灌流，摘出心脏和主动脉，利用IVIS 200得到反射荧光图像。
图7是利用IVIS200获得的成像照片(激发：640nm，发射：720nm.)。实验1：从尾静脉给予高脂肪饮食喂养的apoE-/-小鼠生理盐水(PBS、对照)、Cy5.5标记抗体A、Cy5.5标记3H3抗体。24小时后剥掉胸部皮肤，在存活状态下进行全身摄影。然后，在与胸部主动脉连接的状态下摘出心脏进行摄影。实验2：从给予了PBS、Cy5.5标记2A12抗体、Cy5.5标记3H3抗体的小鼠摘出的心脏和胸部主动脉。3H3给予中，主动脉根部强烈染色。抗体A中有一定程度染色，但没有3H3的荧光强度强。2A12中完全不染色。
图8是使用了特异抗体的动脉硬化的三维图像成像照片。(A)是利用IVIS 200获得的使用了特异抗体的荧光成像(反射)、(B)是利用IVIS200获得的透射光3D图像(左图)与整合前的CT-3D像(中央)的整合后的3D图像(右图)、(C)是利用IVIS获得的荧光信号与三维CT的整合图像。
图9是整合前的利用IVIS 200获得的荧光三维图像(上图：A)以及利用IVIS 200获得的荧光信号与三维CT的整合图像(下图：B)的照片。
图10是表示用IVIS200测定时的主动脉根部周围的依存于Cy5.5的荧光量。测定主动脉根部的每单位面积的荧光强度。将给予了PBS的对照小鼠的荧光记为1.0。3H3给予中，可见为对照的3倍左右的荧光；其他抗体给予中，未见荧光强度有大的变化。
图11是3H3抗体氨基酸序列图。各CDR用下划线表示。
具体实施方式
本发明提供一种抗体，其与氧化变性LDL(氧化LDL)和β2-糖蛋白I的复合物(氧化LDL/β2GPI复合物)结合。动脉硬化灶中形成了氧化LDL与血浆糖蛋白质即β2GPI的复合物。本发明所包含的抗体的特征在于与该复合物结合。
作为本发明所包含的抗体，具体地可列举出以下抗体，但并不限定于这些。
(a)包含具有序列号：2中记载的氨基酸序列作为CDR1、具有序列号：3中记载的氨基酸序列作为CDR2以及具有序列号：4中记载的氨基酸序列作为CDR3的重链的抗体；
(b)包含具有序列号：1中记载的氨基酸序列作为重链可变区的重链的抗体；
(c)包含具有序列号：7中记载的氨基酸序列作为CDR1、具有序列号：8中记载的氨基酸序列作为CDR2和具有序列号：9中记载的氨基酸序列作为CDR3的轻链的抗体；
(d)包含具有序列号：6中记载的氨基酸序列作为轻链可变区的轻链的抗体：
(e)具有由上述(a)或(b)中记载的重链和上述(c)或(d)中记载的轻链构成的对的抗体。
另外，本发明还提供一种抗体，其与和氧化LDL和β2-糖蛋白I的复合物(氧化LDL/β2GPI复合物)结合的本发明的抗体所结合的表位相同的表位结合。该抗体对与氧化LDL形成了复合物的氧化LDL/β2GPI分子上的特定表位进行识别。
并不是进行限制，例如某种抗体是否对与其他抗体相同的表位进行识别，可以通过二者对表位的竞争来进行确认。抗体间的竞争可以通过竞争结合实验来进行评价，作为其方法，可列举出ELISA、荧光能量转移测定法(FRET)和荧光微量测定技术(FMAT(注册商标))等。与抗原结合的所述抗体的量间接地与对相同表位的结合进行竞争的候补竞争抗体(受检抗体)的结合能力相关。即，与相同表位结合的受检抗体的量或亲和性越大，该抗体与抗原的结合量越低，与抗原结合的受检抗体的结合量越增加。具体而言，将进行了适当标记的所述抗体与要评价的抗体同时添加到抗原中，利用标记检测结合的所述抗体。与抗原结合的所述抗体的量通过预先对所述抗体进行标记，能够容易地进行测定。该标记没有特别限制，可选择与技术相应的标记方法。标记方法具体地可列举出荧光标记、放射标记、酶标记等。
这里所说的“对相同表位进行识别的抗体”是指下述抗体：相对于使与标记的所述抗体的结合量比与未标记的所述抗体的结合量低50％的浓度(IC50)，受检抗体以非标记的所述抗体的IC50的通常100倍、优选为80倍、进一步优选为50倍、进一步优选为30倍、更优选为10倍的高浓度将标记的所述抗体的结合量降低至少50％。
本发明的抗体包括多克隆抗体和单克隆抗体两者。单克隆抗体和多克隆抗体的制备和纯化方法是本领域已知的，例如Harlow and Lane，Antibodies：A Laboratory Manual(New York：Cold Spring Harbor LaboratoryPress，1988)中所记载的。
本发明的抗体还包括人源化(humanized)抗体或嵌合(chimeric)抗体等重组抗体。“人源化抗体”是指与人的抗体具有类似结构的抗体。这样的人源化抗体或嵌合抗体包括人型嵌合抗体(例如抗体的一部分被人源化的抗体、CH2区被人源化的抗体、Fc区被人源化的抗体、恒定区被人源化的抗体)、和除恒定区和可变区存在的CDR(互补决定区)以外的部分被人源化的人型CDR移植(CDR-grafted)抗体(P.T.Johons et al.，Nature 321，522(1986))、完全人源化抗体等。为了提高人型CDR移植抗体的抗原结合活性，已开发出选择与小鼠抗体的同源性高的人抗体FR的方法、制作同源性高的人源化抗体的方法、将小鼠CDR移植到人抗体后进一步将FR的氨基酸替换的方法的改良技术(参照美国专利第5585089号、美国专利第5693761号、美国专利第5693762号、美国专利第6180370号、欧州专利第451216号、欧州专利第682040号、专利第2828340号等)，可用于本发明的人型CDR移植抗体的制作。
人型嵌合抗体例如可以通过将具有上述H链可变区的结构和/或L链可变区的结构的抗体的恒定区替换为人抗体的恒定区来制作。作为人抗体的恒定区，可以采用公知的恒定区。以下示出人型嵌合抗体的制作方法的一个例子。
首先，从产生抗特定的对象抗原的小鼠抗体的杂交瘤提取mRNA，按照常规方法合成cDNA。将合成的cDNA插入到载体中构建cDNA库。通过将H链基因片段和L链基因片段用作探针，从上述cDNA库中选择含有H链基因和L链基因的载体。对选择的载体的插入序列进行测序，确定H链可变区和L链可变区的基因的序列。以如此得到的序列数据为基础，通过化学合成、生化切断/再结合等来制作编码H链可变区的DNA。将得到的编码H链可变区的DNA与编码人H链恒定区的DNA连接、插入表达用载体，从而制作H链表达载体。作为表达载体，可使用例如基于SV40病毒的载体、基于EB病毒的载体、基于BPV(乳头状瘤病毒)的载体等，但并不限定于这些。另一方面，通过同样的方法制作L链表达载体。利用这些H链表达载体和L链表达载体对宿主细胞进行共转化。作为宿主细胞，优选使用CHO细胞(中国仓鼠卵巢)(A.Wright & S.L.Morrison，J.Immunol.160，3393-3402(1998))、SP2/0细胞(小鼠骨髓瘤)(K.Motmans et al.，Eur.J.Cancer Prev.5，512-519(1996)，R.P.Junghans et al.，Cancer Res.50，1495-1502(1990))等。另外，转化优选使用脂质体法(R.W.Malone et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86，6077(1989)，P.L.Felgner et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84，7413(1987))、电穿孔法、磷酸钙法(F.L.Graham& A.J.van der Eb，Virology 52，456-467(1973))、DEAE-Dextran法等。
将转化体培养后，从转化体的细胞内或培养液中分离人型嵌合抗体。抗体的分离、纯化可以适当组合使用离心分离、硫酸铵分级法、盐析、超滤、亲和层析法、离子交换层析法、凝胶过滤层析法等方法。
另一方面，人型CDR移植抗体可以通过例如以下的方法制作。首先，通过已在上述嵌合抗体的制造方法中描述的方法来确定抗特定的抗原的抗体的H链可变区和L链可变区的氨基酸序列和对其进行编码的碱基序列。各CDR区的氨基酸序列和碱基序列也一并确定。
接着，选择夹有CDR区的FR(框架区)。FR的选择可采用大约三种方法。第1种方法为使用NEWM、REI等已清楚三维结构的人抗体框架的方法(Riechmann L.et al.，Nature 332，323-327(1988)；Tempst，PR.et al.，Protein Engineering 7，1501-1507(1994)；Ellis JH.etal.，J.Immunol 155，925-937(1995))。第2种方法为从数据库中选择与目标小鼠抗体可变区具有最高同源性的人抗体可变区，并使用其FR的方法(Queen C.et al.，ProcNatl Acad Sci USA 86，10029-10033(1989)；Rozak MJ.et al.，J Biol Chem271，22611-22618(1996)；Shearman CW.et al.，J.Immunol 147，4366-4373(1991))。第3种方法为在人抗体的FR中选择最通用的氨基酸的方法(SatoK.et al.，Mol Immunol 31，371-381(1994)；Kobinger F.et al.，ProteinEngineering 6，971-980(1993)；Kettle borough CA.et al.，Protein Engineering4，773-783(1991))。本发明可以使用这些方法中的任意方法。
其中，即使是对选择的人FR的氨基酸序列进行修饰而得到的氨基酸序列，只要最终得到的人型CDR移植抗体具有对对象抗原的特异性结合性，即可以用作FR的氨基酸序列。特别是，当将选择的人FR的氨基酸的一部分变更为作为CDR来源的抗体的FR的氨基酸时，维持抗的特性的可能性高。修饰的氨基酸的数目优选为FR总体的30％以下、更优选为FR总体的20％以下、进一步优选为FR总体的10％以下。
接着，通过将利用这些任一方法选择的FR与上述CDR组合来设计编码H链可变区和L链可变区的DNA。以该设计为基础，利用化学合成、生化切断/再结合等来分别制作编码H链可变区的DNA和编码L链可变区的DNA。进而，将编码H链可变区的DNA与编码人免疫球蛋白H链恒定区的DNA一起插入表达载体来构建H链表达载体。同样地，将编码L链可变区的DNA与编码人免疫球蛋白L链恒定区的DNA一起插入表达载体来构建L链表达载体。作为表达载体，可以使用例如基于SV40病毒的载体、基于EB病毒的载体、基于BPV(乳头状瘤病毒)的载体等，但并不限定于这些。
利用通过上述方法制作的H链表达载体和L链表达载体对宿主细胞进行共转化。作为宿主细胞，优选使用CHO细胞(中国仓鼠卵巢)(A.Wright&S.L.Morrison，J.Immunol.160，3393-3402(1998))、SP2/0细胞(小鼠骨髓瘤)(K.Motmans et al.，Eur.J.Cancer Prev.5，512-519(1996)，R.P.Junghanset al.，Cancer Res.50，1495-1502(1990))等。另外，转化可优选使用脂质体法(R.W.Malone et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86，6077(1989)，P.L.Felgner et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84，7413，(1987))、电穿孔法、磷酸钙法(F.L.Graham & A.J.van der Eb，Virology 52，456-467(1973))、DEAE-Dextran法等。
将转化体培养后，从转化体的细胞内或培养液中分离人型CDR移植抗体。抗体的分离、纯化可适当组合离心分离、硫酸铵分级法、盐析、超滤、亲和层析法、离子交换层析法、凝胶过滤层析法等方法来进行。
另外，人抗体的获得方法也是已知的。例如，将人淋巴细胞在体外用期望的抗原或表达期望抗原的细胞敏化，将敏化淋巴细胞与人骨髓瘤细胞例如U266融合，也能够得到具有与抗原结合的活性的期望的人抗体(参照日本特公平1-59878)。另外，通过用期望的抗原对具有全部人抗体基因的基因谱的转基因动物进行免疫，能够获得期望的人抗体(参照国际专利申请公开号WO93/12227、WO92/03918、WO94/02602、WO94/25585、WO96/34096、WO96/33735)。
在其他的实施方式中，抗体或抗体片段可以从利用McCafferty等(Nature，348：552-554(1990))中记载的技术产生的噬菌体抗体库中分离。Clackson等(Nature，352：624-628(1991))和Marks等(J.Mol.Biol.，222：581-597(1991))记述了使用了噬菌体库的小鼠和人抗体的分离。后续的刊物记述了通过链改组获得的高亲和性(nM范围)的人抗体的生成(Marks等，Bio/Technology，10：779-783[1992])以及作为用于构建非常大的噬菌体库的策略，记述了组合感染和体内重组(Waterhouse等，Nuc.Acids.Res.，21：2265-2266[1993])。因此，这些技术是与用于单克隆抗体的分离的传统的单克隆抗体杂交瘤法不同的能够实用的其他方法。
在这点上，噬菌体展示是一种检索大的寡肽库，并对具有多肽靶性特异性结合能力的这些文库中的成员进行鉴定的熟知的技术。噬菌体展示是将各种多肽以融合蛋白的形式呈递到噬菌体粒子表面上的外壳蛋白的技术(Scott，J.K.和Smith G.P.(1990)Science 249：386)。噬菌体展示的有用性在于能够快速有效地对以选择性随机化的蛋白变异体(或随机克隆cDNA)的大的文库为靶分子高亲和性地进行结合的这些序列进行分类。噬菌体中的多肽(Cwirla，S.E.等(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，87：6378)或蛋白(Lowman，H.B.等(1991)Biochemistry，30：10832；Clackson，T.等(1991)Nature，352：624；Marks，J.D.等(1991)，J.Mol.Biol.，222：581；Kang，A.S.等(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，88：8363)库的展示被用于对具有特异性结合特性的大量的多肽或寡肽进行筛选(Smith，G.P.(1991)Current Opin.Biotechnol.，2：668)。随机突变体的噬菌体库的分类需要构建大量的变异体并使之增殖的方法、使用了靶受体的亲和性纯化的方法和评价结合增强的结果的方法(参照美国专利第5223409号、美国专利第5403484号、美国专利第5571689号和美国专利第5663143号)。
几乎所有的噬菌体展示法均使用了纤维状噬菌体，但还已知λ噬菌体展示体系(WO95/34683；美国专利第5627024号)、T4噬菌体展示体系(RenJ.等Gene 215：439(1998)；Zhu等Cancer Researc，58(15)：3209-3214(1998)；Jiang等Infection & Immunity，65(11)：4770-4777(1997)；Ren等，Gene，195(2)：303-311(1997)；Ren，Protein Sci.5：1833(1996)；Efimov等Virus Genes 10：173(1995)和T7噬菌体展示体系(Smith和Scott Methodsin Enzymology，217，228-257(1993)；美国专利第5766905号)。
现在，在基础的噬菌体展示法的基础上开发出很多改良和变形。通过这些改良，改善了以与选择的靶分子的结合性等、来自多肽库或蛋白质库的特性、能力等为基础进行筛选的方法。关于用于噬菌体展示法的重组反应方法，在WO98/14277中有记载。噬菌体展示库被用于对双分子相互作用(WO98/20169；WO98/20159)和限制性螺旋肽的特性(WO98/20036)进行分析和控制。WO97/35196中记载了使噬菌体展示库与配体可与靶分子结合的第一溶液、和亲和性配体不与靶分子结合的第二溶液接触从而选择性地分离结合配体的亲和性配体的分离方法。WO97/46251中记载了利用亲和性纯化抗体对随机噬菌体展示库进行生物淘筛，然后分离结合噬菌体，接着在微板的孔中进行微淘筛(micropanning)从而分离高亲和性结合噬菌体的方法。另外，还报告了黄色葡萄球菌(Staphlylococcus aureus)蛋白质A作为亲和性标签(tag)的用途(Li等，(1998)Mol Biotech.，9：187)。WO97/47314中记载了使用可以是噬菌体展示库的组合文库来识别酶特异性的底物消减文库的用途。WO97/09446中记载了选择适用做噬菌体展示用的洗涤剂中的酶的方法。选择特异性结合的蛋白质的其他方法记载于美国专利第5498538号、美国专利第5432018号和WO98/15833。多肽库的制作和这些文库的筛选的方法记载于美国专利第5723286号、美国专利第5432018号、美国专利第5580717号、美国专利第5427908号、美国专利第5498530号、美国专利第5770434号、美国专利第5734018号、美国专利第5698426号、美国专利第5763192号和美国专利第5723323号。
此外，还已知利用人抗体库，通过淘筛来获得人抗体的技术。例如，可以利用噬菌体展示法使人抗体的可变区以单链抗体(scFv)的形式表达在噬菌体的表面，从而选择与抗原结合的噬菌体。对选择的噬菌体的基因进行分析，从而能够确定编码与抗原结合的人抗体的可变区的DNA序列。通过弄清楚与抗原结合的scFv的DNA序列，能够制作具有该序列的适当的表达载体，通过将其导入适当的宿主并使之表达，从而获得人抗体。这些方法均是已公知的，可参照WO 92/01047、WO 92/20791、WO 93/06213、WO 93/11236、WO 93/19172、WO 95/01438、WO 95/15388来实施。
作为其他方法，可以使用噬菌体展示技术(McCafferty等，Nature 348：552-553[1990])，从非免疫化供体的免疫球蛋白可变(V)区基因谱在体外生产人抗体和抗体片段。根据该技术，能够将抗体V区基因在框架单元中用纤维状噬菌体例如M13或fd的外壳蛋白基因中的任一种克隆，并使之以功能性抗体片段的形式呈递在噬菌体粒子的表面。由于纤维状粒子包含噬菌体基因组的单链DNA拷贝，因此即使基于以抗体的功能特性为基础的选择，其结果也完成了编码显示这些特性的抗体的基因的选择。因此，该噬菌体模仿B细胞的几个特性。噬菌体展示可以以多种形式进行，例如参照Johnson，Kevin S.和Chiswell，David J.，Current Opinion in Structural Biology3：564-571(1993)。可以将V-基因片段的几个供给源用于噬菌体展示。Clackson等，Nature，352：624-628(1991)从经免疫化的小鼠脾脏来源的V基因的小的随机组合文库中分离出了多种大量的抗噁唑酮抗体。能够构成非免疫化人供体的V基因的基因谱，且抗多种大量的抗原(包括自身抗原)的抗体可以直接按照Marks等，J.Mol.Biol.222：581-597(1991)、或Griffith等，EMBO J.12：725-734(1993)中记载的技术分离。另外，请参照美国专利第5565332号和美国专利5573905号。
本发明的抗体中也包括Fab、Fab′、F(ab′)2、Fv、scFv、dsFv、Diabody和sc(Fv)2等抗体的功能性片段。另外，这些功能性片段的多倍体(例如、二聚体、三聚体、四聚体、聚合物)也包括在本发明的抗体中。
Fab是通过将IgG在半胱氨酸存在下用木瓜蛋白酶消化而得到的，是由L链和H链可变区、以及包含CH1区和铰链区的一部分的H链片段构成的分子量约5万的片段。本发明中，可以通过将上述抗体用木瓜蛋白酶消化来得到。另外，也可以通过将编码上述抗体的H链的一部分和L链的DNA导入适当的载体，利用使用该载体进行转化得到的转化体来制备Fab。
Fab′是通过将后述的F(ab′)2的H链间的二硫键切断而得到的分子量约5万的片段。本发明中，可以通过将上述抗体用胃蛋白酶消化，并使用还原剂将二硫键切断来得到。另外，与Fab同样地，可以使用编码Fab′的DNA通过基因工程来制备。
F(ab′)2是通过将IgG用胃蛋白酶消化而得到的，是由片段(Fab′)通过二硫键结合而得到的分子量约10万的片段，所述片段(Fab′)是由L链和H链可变区、以及包含CH1区和铰链区的一部分的H链片段构成的。本发明中，可以通过将上述抗体用胃蛋白酶消化来得到。另外，与Fab同样地，可以使用编码F(ab′)2的DNA通过基因工程来制备。
Fv可以通过将抗体用酶例如木瓜蛋白酶、胃蛋白酶处理生成抗体片段来制备，或者通过构建编码这些抗体片段的基因并将该基因导入表达载体，然后在适当的宿主细胞中表达来制备(例如参照Co，M.S.et al.，J.Immunol.(1994)152，2968-2976、Better，M.&amp；Horwitz，A.H.Methods inEnzymology(1989)178，476-496、Plueckthun，A.；Skerra，A.Methods inEnzymology(1989)178，476-496、Lamoyi，E.，Methods in Enzymology(1989)121，652-663，Rousseaux，J.et al.，Methods in Enzymology(1989)121，663-669，Bird，R.E.et al.，TIBTECH(1991)9，132-137)。
scFv是将包含H链可变区和L链可变区的Fv的一条链的C末端用适当的多肽接头连接到另一条链的N末端并进行单链化而得到的抗体片段。作为多肽接头，可以使用例如柔软性高的(GGGGS)3等。例如可以使用编码上述抗体的H链可变区和L链可变区的DNA与编码多肽接头的DNA来构建编码scFv抗体的DNA，将其导入适当的载体，利用使用该载体进行转化而得到的转化体来制备scFv。
dsFv是通过将Cys残基导入H链可变区和L链可变区的适当位置，并通过二硫键使H链可变区和L链可变区稳定而得到的Fv片段。各链中的Cys残基的导入位置可以基于利用分子模拟预测的立体结构来确定。本发明中，例如可以根据上述抗体的H链可变区和L链可变区的氨基酸序列来预测立体结构，基于上述预测构建分别编码导入了变异的H链可变区和L链可变区的DNA，将其导入适当的载体，然后利用使用该载体进行转化而得到的转化体来制备dsFv。
另外，还可以通过使用适当的接头将scFv抗体、dsFv抗体等连接，或使链霉亲和素融合等来使抗体片段多倍体化。本发明的抗体(包括抗体片段)可以通过使低分子化合物、蛋白质、标记物等融合或结合来构成融合抗体或标记化抗体。作为标记物，可以使用125I等放射性物质等。
Diabody是指通过基因融合构建的二价(bivalent)的抗体片段(HolligerP et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6444-6448(1993)、EP404097号、WO93/11161号等)。Diabody是由2条多肽链构成的二聚体，通常多肽链的各相同链中的VL和VH通过VL和VH不会相互结合的短的例如5个残基左右的接头结合。同一多肽链上编码的VL和VH由于它们之间的接头短、无法形成单链可变区片段而形成二聚体，因此Diabody具有2个抗原结合部位。Diabody可以通过将抗体用酶例如木瓜蛋白酶、胃蛋白酶等处理生成抗体片段来制备，或者通过构建编码这些抗体片段的DNA，将该DNA导入表达载体，然后在适当的宿主细胞中进行表达来制备(例如参照Co，M.S.et al.，J.Immunol.(1994)152，2968-2976；Better，M.and Horwitz，A.H.，Methods Enzymol.(1989)178，476-496；Pluckthun，A.and Skerra，A.，Methods Enzymol.(1989)178，497-515；Lamoyi，E.，Methods Enzymol.(1986)121，652-663；Rousseaux，J.et al.，Methods Enzymol.(1986)121，663-669；Bird，R.E.and Walker，B.W.，Trends Biotechnol.(1991)9，132-137)。
sc(Fv)2是将2个VH和2个VL用接头等结合制成单链而得到的低分子化抗体(Hudson et al、J Immunol.Methods 1999；231：177-189)。sc(Fv)2可以通过例如将scFv用接头连接来制作。
本发明的抗体中还包括本发明的抗体与其他的多肽或蛋白融合而得到的融合蛋白。制作融合蛋白的方法可以使用下述本领域技术人员公知的方法：将编码本发明抗体的多核苷酸与其他肽或编码多肽的多核苷酸按照框架一致的方式连接，然后将其导入表达载体，使其在宿主中表达。作为用于与本发明抗体的融合的其他肽或多肽，例如可以使用FLAG(Hopp，T.P.et al.，BioTechnology(1988)6，1204-1210)、由6个His(组氨酸)残基构成的6×His、10×His、流感病毒血凝素(HA)、人c-myc的片段、VSV-GP的片段、p18HIV的片段、T7-tag、HSV-tag、E-tag、SV40T抗原的片段、lcktag、α-tubulin的片段、B-tag、Protein C的片段等公知的肽。另外，作为用于与本发明的抗体的融合的其他多肽，可列举出例如GST(谷胱甘肽-S-转移酶)、HA(流感病毒血凝素)、β-半乳糖苷酶、MBP(麦芽糖结合蛋白)等。
本发明的抗体也包括标记物所结合的抗体。
作为标记物，可列举出利用酶发光(荧光素酶)产生的发光、发光低分子的标记物、和使用荧光蛋白或荧光低分子的标记物、放射性核素等，但并不限定于这些。作为放射性核素，可列举出51Cr、59Fe、57Co、67Ga、75Se、81mKr、99mTc、111In、125I、131I、133Xe、201Tl等γ射线发射核素或11C、13N、15O、18F、35mCl、76Br、45Ti、48V、60Cu、61Cu、62Cu、66Ga、89Zr、94mTc、124I等正电子发射核素等，但并不限定于这些。另外，本领域技术人员消楚，“m”表示核同质异能素(nuclear isomer)。
作为荧光标记或发光标记，可以使用利用酶发光(荧光素酶)产生的发光的标记和使用荧光(GFP、DsRed、Kusabira Orange等荧光蛋白质、FITC和Cy5.5、Alexa Fluor 750等荧光性低分子)的标记。
在酶发光(荧光素酶)产生的发光的情况下，底物给予需要其他途径。
特别是，优选减轻动物本来的自身荧光所产生的影响的标记，更优选发出皮肤透射性高的信号的标记。
另外，本发明还提供编码本发明的抗体的DNA、插入有该DNA的载体和导入有该载体的转化细胞。作为载体的例子，可列举出M13系载体、pUC系载体、pBR322、pBluescript、pCR-Script等。另外，当以cDNA的亚克隆、切除为目的时，除了上述载体外，还可列举出例如pGEM-T、pDIRECT、pT7等。编码本发明抗体的DNA、插入有该DNA的载体和导入有该载体的转化细胞可以使用公知的技术来制作。
作为编码与本发明的氧化LDL/β2GPI复合物结合的抗体的DNA，可列举出以下的DNA。
(a)具有序列号：5中记载的碱基序列的编码重链的DNA
(b)具有序列号：10中记载的碱基序列的编码轻链的DNA
(c)编码具有序列号：2中记载的氨基酸序列作为CDR1、具有序列号：3中记载的氨基酸序列作为CDR2和具有序列号：4中记载的氨基酸序列作为CDR3的重链的DNA，
(d)编码具有序列号：7中记载的氨基酸序列作为CDR1、具有序列号：8中记载的氨基酸序列作为CDR2和具有序列号：9中记载的氨基酸序列作为CDR3的轻链的DNA，
作为表达载体，例如当为了在大肠杆菌中表达时，载体除了具有能够在大肠杆菌中扩增等的上述特征外，当宿主为JM109、DH5α、HB101、XL1-Blue等大肠杆菌时，具有在大肠杆菌中能够高效地表达的启动子、例如lacZ启动子(Ward等，Nature(1989)341，544-546；FASEB J.(1992)6，2422-2427)、araB启动子(Better等，Science(1988)240，1041-1043)、或T7启动子等也不可缺少的。作为这样的载体，除了上述载体外还可列举出pGEX-5X-1(Pharmacia公司制)、“QIAexpress system”(QIAGEN公司制)、pEGFP或pET(此时，宿主优选为表达T7 RNA聚合酶的BL21)等。
另外，载体也可以包含用于多肽分泌的信号序列。作为用于蛋白分泌的信号序列，在产生到大肠杆菌的胞质中的情况下，可以使用pelB信号序列(Lei，S.P.et al J.Bacteriol.(1987)169，4379)。载体向宿主细胞中的导入可以使用例如氯化钙法、电穿孔法来进行。
除了大肠杆菌以外，还可列举出例如哺乳动物来源的表达载体(例如pcDNA3(Invitrogen公司制)、pEGF-BOS(Nucleic Acids.Res.1990，18(17)，p5322)、pEF、pCDM8)、或者昆虫细胞来源的表达载体(例如“Bac-to-BAC baculovairus expression system”(GIBCO-BRL公司制)、pBacPAK8)、植物来源的表达载体(例如pMH1、pMH2)、动物病毒来源的表达载体(例如pHSV、pMV、pAdexLcw)、逆转录病毒来源的表达载体(例如pZIPneo)、酵母来源的表达载体(例如“Pichia Expression Kit”(Invitrogen公司制)、pNV11、SP-Q01)、枯草杆菌来源的表达载体(例如pPL608、pKTH50)。
当为了在CHO细胞、COS细胞、NIH3T3细胞等动物细胞中表达时，载体具有细胞内表达所需的启动子例如SV40启动子(Mulligan等，Nature(1979)277，108)、MMTV-LTR启动子、EF1α启动子(Mizushima等，Nucleic Acids Res.(1990)18，5322)、CMV启动子等是不可缺少的，更优选载体具有用于挑选转化到细胞的基因(例如能够利用药物(新霉素、G418等)鉴别的耐药性基因)。作为具有这样的特性的载体，可列举出例如pMAM、pDR2、pBK-RSV、pBK-CMV、pOPRSV、pOP13等。
此外，当为了使基因稳定表达并且增加细胞内的基因的拷贝数时，可列举出下述方法：向缺少核酸合成途径的CHO细胞中导入具有对其进行补偿的DHFR基因的载体(例如pCHOI等)，并利用氨甲喋呤(MTX)使其扩增；另外，当以基因的瞬时表达为目的时，还可列举出下述方法：使用在染色体上具有表达SV40 T抗原的基因的COS细胞，并利用具有SV40的复制起点的载体(pcD等)进行转化。作为复制起点，还可以使用多瘤病毒、腺病毒、生乳头瘤病毒(BPV)等来源的复制起点。此外，为了在宿主细胞系中增加基因拷贝数，表达载体可以包含氨基糖苷转移酶(APH)基因、胸苷激酶(TK)基因、大肠杆菌黄嘌呤鸟嘌呤磷酸转移酶(Ecogpt)基因、二氢叶酸还原酶(dhfr)基因等作为选择标记物。
作为导入有载体的宿主细胞，没有特殊限制，例如可使用大肠杆菌或各种动物细胞等。宿主细胞例如可以用作本发明抗体的制造或表达用的生产体系。用于多肽制造的生产体系有体外和体内的生产体系。作为体外的生产体系，可列举出使用真核细胞的生产体系和使用原核细胞的生产体系。
当使用真核细胞时，例如可以将动物细胞、植物细胞、真菌细胞用作宿主。作为动物细胞，已知哺乳类细胞，例如CHO(J.Exp.Med.(1995)108，945)、COS、3T3、骨髓瘤、BHK(幼仓鼠肾)、HeLa、Vero；两栖动物类细胞，例如爪蟾卵母细胞(Valle，et al.，Nature(1981)291，358-340)；或者昆虫细胞，例如Sf9、Sf21、Tn5。本发明中，优选使用CHO-DG44、CHO-DXB11、COS7细胞、BHK细胞。动物细胞中，为了大量表达，特别优选CHO细胞。载体向宿主细胞中的导入可以使用例如磷酸钙法、DEAE葡聚糖法、使用了阳离子脂质体DOTAP(Boehringer-Mannheim公司制)的方法、电穿孔法、脂转染等方法来进行。
作为植物细胞，例如已知菸草(Nicotiana tabacum)来源的细胞作为蛋白生产体系，可以对其进行callus培养。作为真菌细胞，已知有酵母，例如酵母(Saccharomyces)属，例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Saccharomyces pombe)；糸状菌，例如曲霉(Aspergillus)属，例如黑曲霉(Aspergillus niger)。
当使用原核细胞时，有使用细菌细胞的生产体系。作为细菌细胞，可列举出大肠杆菌(E.coli)，例如JM109、DH5α、HB101等；其他已知枯草杆菌。将利用本发明的DNA转化得到的细胞在体外培养，并利用本领域技术人员通用的方法进行纯化，能够得到本发明的抗体。
此外，本发明还提供具有包含编码本发明的抗体的核酸的载体的宿主生物。本发明的宿主生物对于重组型抗体的生产是有用的。作为本发明中的宿主生物，可列举出山羊等。例如，本发明的转基因山羊的制作可如下进行。即，通过在编码本质上分泌到乳汁中的蛋白(山羊β酪蛋白等)的基因的内部通过框架插入抗体基因来构建融合基因。将包含插入有抗体基因的融合基因的DNA片段注入到山羊胚中，将该注入胚导入雌山羊。从由接受胚的山羊生的转基因山羊或其子孙产生的乳汁能够获得本发明的抗体。为了增加从转基因山羊产生的含有本发明抗体的乳汁量，也可以给转基因山羊适当使用激素(Ebert，K.M.et al.，Bio/Technology(1994)12，699-702)。
本发明提供一种动脉硬化的存在部位的成像剂，其含有本发明的与氧化LDL/β2GPI复合物结合的抗体。另外，本发明还提供一种动脉硬化的存在部位的成像方法，其包含将本发明的与氧化LDL/β2GPI复合物结合的抗体给予哺乳动物的工序。将本发明的成像剂给予哺乳动物以对动脉硬化的存在部位进行成像。作为哺乳动物，可列举出人、非人哺乳动物(例如小鼠、大鼠、仓鼠、兔、猪、猴等)。本发明的成像剂在动脉硬化的诊断方面是有用的。本发明的成像剂可用于体内用、体外用中的任何一种。
动脉硬化的症状大致分为粥样斑块和钙化病变，利用本发明的成像剂，特别是动脉硬化粥样斑块部位可被染色。
粥样斑块是动脉硬化的种病理状态，已知巨噬细胞借助于受体特异性地摄入含有大量胆固醇的氧化LDL并将其泡沫化，然后泡沫化的氧化LDL蓄积在血管内膜形成斑块(粥样斑块)。
本发明的成像剂是通过将能够直接或间接地进行监测的成像用标记、探针结合于与氧化LDL/β2GPI复合物结合的抗体、特别优选为3H3抗体而得到的。
可以在将所述探针生物体内给予(例如静脉内给予)生物体后，使用PET或SPECT、CCD相机等图像检测装置对蓄积量和分布进行测定。
另外，近年来，通过利用透射性射线源对物体进行扫描，并利用计算机对其数据进行处理，从而实现了构成物体的内部图像的技术计算机断层摄影(Computed Tomography：以下“CT”的表述也表示计算机断层摄影)在病状诊断、临床中的应用。
这样的CT技术是通过得到正电子发射断层法(PET)、单光子放射断层摄影(SPECT)或核磁共振成像法(MRI)等的截面像来得到物体的(轮廓等的)二维截面图像的技术，这些检查技术常常不仅仅用于得到截面图像，随着计算机图像处理技术的提高，也常常将该二维图像整合而显示为三维图形，从而成为确定三维的病变的位置、诊断、确定手术方案等的有力技术。
例如单纯CT是不使用造影剂而进行X射线照射等摄影的技术，即使不使用造影剂也能够充分地观察组织的浮肿、骨的形态异常、形态等，另一方面，造影CT是指将X射线吸收率高的造影剂等注射到血管内，然后进行摄影的方法，通过造影CT能够观察血管和血流丰富的组织的形状。此外，关于所谓的新一代CT，例如开发了射线源螺旋状运动的螺旋CT、将检测器自身沿对轴方向进行分割的多列检测器CT(MDCT)(也称为多层螺旋CT(MSCT))等，这些均没有特别限制，可以单独也可以并用地用于本发明的成像剂的检测。
当成像用标记探针(本发明的成像剂)为X射线吸收率高的放射线核素时，也可以单独使用CT作为检测器。
作为标记物，可列举出利用酶发光(荧光素酶)所产生的发光、发光低分子的标记物和使用荧光蛋白和荧光低分子的标记物、放射性核素等，但并不限定于这些。作为放射性核素，可列举出51Cr、59Fe、57Co、67Ga、75Se、81mKr、99mTc、111In、125I、131I、133Xe、201Tl等γ射线发射核素和11C、13N、15O、18F、35mCl、76Br、45Ti、48V、60Cu、61Cu、62Cu、66Ga、89Zr、94mTc、124I等正电子发射核素等，但并不限定于这些。其中，本领域技术人员清楚“m”是指核同质异能素。铟-111、锝-99m或碘-131特别优选用于平面扫描或单光子发射断层摄影(SPECT)。正电子放射标记的例子如氟-19可特别优选用于正电子放射断层法中。顺磁离子的例子如钆(III)或锰(II)特别优选用于核磁共振成像法(MRI)中。
还可以使用利用荧光标记或酶(荧光素酶)所产生的发光系的标记物和使用荧光(GFP、DsRed、Kusabira Orange等荧光蛋白质、FITC或Cy5.5、Alexa Fluor 750等荧光性低分子)的标记物。
当为酶发光(荧光素酶)所产生的发光的情况下，底物需要另外给予。
特别优选减轻动物本来的自身荧光所产生的影响的标记物，更优选能够发出皮肤透射性高的信号的标记物。
作为成像检测器，可以使用核磁共振成像法(MRI)PET或SPECT，但在荧光标记探针的观察中，从低介入性的观点出发特别优选的测定机器为CCD相机。
由此，优选发出可被CCD相机检测到的波长例如约350～900nm的光的标记。此外，优选能够根据CCD相机所测定的测定动物的体表面的测定值测定生物体内的光源的强度的机械。在荧光标记的情况下，可以是反射荧光图像、透射荧光图像中的任一个，但优选捕捉两种图像。另外，将荧光图像的多角度的面(不管反射、透射)重叠，然后对射线源信息进行整合处理，从而获得立体图像(三维)，由此能够正确地构成三维的位置、分布，因此优选。如此得到的三维图像还可以进一步与CT图像整合。
当成像用标记探针为与X射线吸收率高的放射线核素结合而成时，如上所述，即使作为成像检测器的CT单独也可使用(例如PET、SPECT)，能够对动脉硬化病灶的位置、蓄积量和分布进行测定。
另一方面，在将所述成像用标记探针生物体内给予(例如静脉内给予)生物体后，还可进行经标记的所述探针的CT观察、或与CCD并用进行观察。作为并用观察的例子，可以将经荧光标记的探针的CCD像与单纯CT(和/或造影CT)的像重叠来使用。即，通过将利用单纯CT对骨、肺等脏器像进行提取(和/或造影CT对血管、组织像的提取)而得到的CT图像与心脏等主要的动脉疾病部分的利用CCD相机得到的荧光探针图像整合，从而能够更正确地把握其动脉硬化病灶的位置、蓄积量和分布、三维的组织、血管间的相对位置关系、动脉硬化病灶的三维(局部)图像。
本发明的成像剂在抗体之外还可以导入医药上可容许的载体，并通过公知的方法制成制剂。例如以与水或除水以外的药学上可容许的液体形成的无菌性溶液或者悬浮液剂的注射剂形式非经口地使用。例如可以考虑通过与药理学上可容许的载体或介质、具体地、灭菌水或生理盐水、植物油、乳化剂、悬浮剂、表面活性剂、稳定剂、香味剂、赋形剂(excipients)、赋形剂(vehicle)、防腐剂、粘合剂等适当组合，并以通常认可的制药实践所要求的单位用量形态混和来制成制剂。这些制剂的有效成分量按照获得所指示的范围的适当的容量来进行设定。
用于注射的无菌组合物可以使用注射用蒸馏水等vehicle按照通常的制剂实践来配制。
作为注射用的水溶液，可列举出例如含有生理盐水、葡萄糖或其他的助剂的等渗液，例如D-山梨糖醇、D-甘露糖、D-甘露醇、氯化钠，适当的溶解助剂，可以将例如醇具体地乙醇、多元醇例如丙二醇、聚乙二醇、非离子性表面活性剂例如Polysorbate 80(TM)、HCO-50并用。
作为油性液体，可列举出芝麻油、大豆油，作为溶解助剂，可以将苯甲酸苄酯、苄醇并用。另外，还可以与缓冲剂、例如磷酸盐缓冲液、醋酸钠缓冲液，镇痛剂、例如盐酸普鲁卡因，稳定剂、例如苄醇、苯酚、抗氧化剂配合。所制备的注射液通常填充到适当的安瓿中。
给予方式优选为非经口给予，具体地可列举出注射剂型、经鼻给予剂型、经肺给予剂型、经皮给予剂型等。作为注射剂型的例子，例如可以通过静脉内注射、肌内注射、腹腔内注射、皮下注射等全身或局部地给予。
另外，可以根据患者的年龄、症状选择适当的给予方法。作为本发明的成像剂的给予量，例如可以在每次每1kg体重0.0001mg～1000mg的范围内选择。或者，可以在例如每位对象0.001～100000mg/body的范围内选择给予量，对这些数值没有必要进行限制。
给予量、给予方法根据对象的体重和年龄、症状、每mg抗体的荧光标记的强度/检测机械的检测灵敏度等的不同而发生变动，本领域技术人员可适当地进行选择。
另外，本发明还提供一种动脉硬化的存在部位的成像用试剂盒，其包含本发明的与氧化LDL/β2GPI复合物结合的抗体。本发明的试剂盒的特征在于，通过给予对象来对动脉硬化的存在部位进行成像。上述试剂盒除了本发明的抗体外，还包含例如成像剂给予用的注射(点滴)器具、抑制非特异性吸附的助剂(例如白蛋白等)等，但并不限制于这些。
另外，上述试剂盒还可以包含成像中使用的指示书、适当的容器、对照试剂等通常的试剂盒中所包含的物品。
本发明提供一种动脉硬化治疗剂的候补化合物的筛选方法，其包含以下所记载的工序。
(a)将本发明的与氧化LDL/β2GPI复合物结合的抗体和候补化合物给予动脉硬化患病非人动物模型的工序，例如将候补化合物给予已给予了本发明的与氧化LDL/β2GPI复合物结合的抗体的动脉硬化患病非人动物模型的工序；
(b)对给予了所述抗体和所述候补化合物的动脉硬化患病非人动物模型和给予了所述抗体而未给予所述候补化合物的动脉硬化患病非人动物模型的动脉硬化灶进行成像的工序；
(c)对给予了所述抗体和所述候补化合物的动脉硬化患病非人动物模型和给予了所述抗体而未给予所述候补化合物的动脉硬化患病非人动物模型的动脉硬化灶(例如动脉硬化灶的大小或存在部位)进行比较的工序；和
(d)从给予了所述抗体和所述候补化合物的动脉硬化患病非人动物模型中选择与给予了所述抗体而未给予所述候补化合物的动脉硬化患病非人动物模型相比动脉硬化灶减少或消失的候补化合物的工序。
各工序使用上述的技术或公知的技术来实施。
关于本发明的筛选方法可利用的候补化合物，可列举出纯化蛋白质(包括抗体)、基因库的表达产物、合成多肽的文库、DNA或RNA库(包括适体、siRNA等功能性核酸)、细胞提取液、细胞培养上清液和合成低分子化合物的文库等，但并不限制于这些。
作为本发明的筛选方法可利用的患病非人动物模型，可列举出小鼠、仓鼠、大鼠、兔、猪、猴等，但并不限制于这些。
例如，作为动脉硬化患病小鼠模型，有过量表达基因的转基因小鼠、和利用导致某基因缺损的基因打靶获得的基因敲除小鼠。作为动脉硬化模型，例如有构成作为不良胆固醇已知的LDL的蛋白(载脂蛋白E)的apoE缺失(apoE-/-)模型、LDL受体缺失(LDLR-/-)模型、人型apoB导入模型、显性突变apoE导入模型。此外，2型糖尿病小鼠模型(KKAy)、或者小鼠中的更容易患动脉硬化的C57BL6系统，该系统有时仅通过高胆固醇饮食即可观察到动脉硬化灶，也可以使用高胆固醇饮食等、其饲料制作的动脉硬化小鼠模型。
当给予兔高胆固醇饮食约2个半月时有时即可观察到动脉硬化灶，此外，作为LDL受体缺损的动脉硬化患病兔模型，已知有WHHL兔等。
猪也可以通过apoB的LDL受体结合部分的氨基酸序列异常来获得易患动脉硬化的模型，本领域技术人员可参照血栓症·動脈硬化モデル動物作製法
Figure BDA0000047217740000231
著 
Figure BDA0000047217740000232
木 宏治(株式会社 金芳堂)等制作动脉硬化模型动物来用于本发明。
通过本发明的筛选方法选择的使动脉硬化灶减少或消失的化合物可成为动脉硬化治疗剂的候补化合物。即，本发明提供一种动脉硬化治疗剂，其含有通过本发明的筛选方法选择的物质作为有效成分。此外，本发明涉及通过本发明的筛选方法选择的化合物在制造动脉硬化治疗剂中的用途。当将通过本发明的筛选方法分离的物质用作治疗剂时，可以利用公知的制剂学制造方法制成制剂后使用。例如，与药理学上可容许的载体或介质(生理盐水、植物油、悬浮剂、表面活性剂、稳定剂等)一起给予患者。给予方法根据物质的性质可经皮、鼻腔内、经支气管、肌内、静脉内或经口地进行。给予量根据患者的年龄、体重、症状、给予方法等的不同而发生变动，本领域技术人员可适当地选择适当的给予量。
本说明书中公开的抗体的碱基序列和氨基酸序列按照以下的序列号记载于序列表中。
<3H3抗体>
序列号1：重链可变区的氨基酸序列
序列号2：重链CDR1的氨基酸序列
序列号3：重链CDR2的氨基酸序列
序列号4：重链CDR3的氨基酸序列
序列号5：重链可变区的碱基序列
序列号6：轻链可变区的氨基酸序列
序列号7：轻链CDR1的氨基酸序列
序列号8：轻链CDR2的氨基酸序列
序列号9：轻链CDR3的氨基酸序列
序列号10：轻链可变区的碱基序列
另外，本说明书中引用的现有技术文献全部引入本说明书中作为参照。
实施例
以下，通过实施例详细地对本发明进行说明，但本发明的范围并不限定于这些实施例中记载的方式。
[实施例1]
氧化LDL/β 2 GPI复合物的制备
将600μg的人LDL(Organon Teknika Corp，Durham，NC)在含有5μMCuSO4的PBS(2mL)中在37℃下氧化处理12小时。通过添加1mM的EDTA使氧化停止。
将上述氧化LDL 0.2mg/mL与人β2GPI(从Affinity Biologicals购得)一起以终浓度0.2mg/mL在37℃条件下孵育16小时，得到氧化LDL/β2GPI复合物。
[实施例2]
抗原免疫
将人氧化LDL/β2GPI复合物纯化蛋白质与同量的完全佐剂(SIGMA；F5881)混合制成乳液，向BALB/c小鼠(雌性)的足跖(foot-pad)以5～50μg/只每3～7天免疫数次。在最终免疫的3～5天后从小鼠摘出腹股沟淋巴结，与小鼠骨髓瘤细胞P3U1(P3-X63Ag8U1)进行细胞融合。
[实施例3]
细胞融合和单克隆抗体产生细胞的选择和获得
细胞融合以如下所示的常用方法为基础进行。所有的培养基中的胎牛血清(FBS)使用通过在56℃下进行30min的保温处理而灭活的胎牛血清。P3U1通过在RPMI1640-10％FBS(含有青霉素、链霉素)中培养来准备。
将摘出的小鼠的腹股沟淋巴结细胞与P3U1以10∶1～2∶1的比例混合，离心。一边将50％聚乙二醇4000(Merck公司、气体层析法用PEG4000、Catalog No.9727)作为融合促进剂缓缓地加入沉淀的细胞中，一边温和地混合，进行细胞融合。进而，一边缓缓地加入RPMI1640，一边温和地混合，然后进行离心。将沉淀的融合细胞用含有15％FCS的HAT培养基(RPMI1640、HAT-supplement(Invitrogen；11067-030)、青霉素、链霉素)适当稀释，以200μL/孔播种到96孔微板中。
将融合细胞在CO2培养箱(5％CO2、37℃)中培养，在充分形成集落后，取样培养上清液以进行筛选。
筛选为挑选在致敏了免疫中使用的人氧化LDL/β2GPI复合物抗原的96孔平板的ELISA(实施例4中记载)中为阳性的化合物。用含有15％FCS的HT培养基(RPMI1640、HT-supplement(Invitrogen；21060-017)、青霉素、链霉素)将它们放大培养后，利用有限稀释(limiting dilution)法形成单克隆。由此，以抗人氧化LDL/β2GPI复合物抗体为免疫原，获得7种包括克隆3H3的杂交瘤克隆。
[实施例4]
对人氧化LDL/β 2 GPI复合物和β 2 GPI的反应性(ELISA)
用于检测抗人氧化LDL/β2GPI复合物抗体的ELISA按照以下的方法进行。即，将1μg/mL(50μL/孔)氧化LDL/β2GPI加到微板(Nunc公司Maxisorp)中，在4℃下孵育过夜，从而使其吸附，将该平板用1％BSA封闭。加入用检测缓冲液(1％BSA、0.15M NaCl/20mM HEPES(pH 7.4))稀释至各横轴中记载的抗体浓度的样品50μL，在孔中孵育30分钟。弃掉液体，用0.1％Tween20/PBS洗涤后，接着将2000倍稀释的HRP标记的抗小鼠IgG(MBL code 330)50μL添加到平板中，在孔中孵育30分钟。弃掉液体，用0.1％Tween20/PBS洗涤，然后添加底物TMB(MOSS公司；TMBZ)50μL，在室温下孵育3分钟，添加0.18M硫酸50μL，使反应停止，然后在吸光度450nm下进行检测(图1A)。
用于检测与β2GPI的反应性的ELISA按照以下的方法进行。即，将1μg/mL(50μL/孔)β2GPI加入到微板(Nunc公司Maxisorp)中，在4℃下孵育过夜，从而使其吸附，将该平板用1％BSA封闭。加入用检测缓冲液(1％BSA、0.15M NaCl/20mM HEPES(pH 7.4))稀释至各横轴中记载的抗体浓度的样品50μL，在孔中孵育30分钟。弃掉液体，用0.1％Tween20/PBS洗涤后，接着将2000倍稀释的HRP标记的抗小鼠IgG(MBLcode 330)50μL添加到平板中，在孔中孵育30分钟。弃掉液体，用0.1％Tween20/PBS洗涤，然后添加底物TMB(MOSS公司；TMBZ)50μL，在室温下孵育3分钟，添加0.18M硫酸50μL使反应停止，然后在吸光度450nm下进行检测(图1B)。
进而，将β2GPI改变浓度至～50μg/mL(50μL/孔)加入微板(nunc公司Maxisorp)中，在4℃下孵育过夜，从而使其吸附，同样地对抗体反应性进行试验(未图示)。
其结果是对固定化氧化LDL/β2GPI复合物显示2H6＞3H3、2A12、3D4＞4C12、1H4的反应性。另外，对固定化β2GPI显示2H6、3D4＞2A12、4F10的反应性，对3H3、4C12不显示反应性(图1A、B)。
但是，当提高对微量滴定板的致敏浓度时，3H3等也显示反应性(未图示)。
作为确认抗体的反应性的方法，用游离的抗原施加抑制来进行试验，进一步可见各抗体的特异性。
[实施例5]
对溶液中的游离β 2 GPI、氧化LDL/β 2 GPI复合物的竞争反应性 (ELISA)
在对固定化人氧化LDL/β2GPI复合物和β2GPI的反应性(ELISA)试验中，与各抗体反应时，通过在氧化LDL/β2GPI复合物或β2GPI共存下进行反应来进行对固定化抗原的抑制反应(图2显示测定系统示意图)。
即，将β2GPI1μg/mL(50μL/孔)加入到微板(Nunc公司；Maxisorp)中，在4℃下孵育过夜，从而使其吸附，将该平板用1％BSA封闭。加入用检测缓冲液(1％BSA、0.15M NaCl/20mM HEPES(pH 7.4))稀释到适当浓度的抗体样品25μL、和将作为竞争性抗原的氧化LDL/β2GPI复合物或β2GPI用检测缓冲液稀释到各横轴中记载的抗原浓度的样品25μL，在孔中孵育30分钟。弃掉液体，用0.1％Tween20/PBS洗涤后，接着将2000倍稀释的HRP标记的抗小鼠IgG(MBL；Code 330)50μL添加到平板中，在孔中孵育30分钟。弃掉液体，用0.1％Tween20/PBS洗涤，然后添加底物TMB(MOSS公司；TMBZ)50μL，在室温下孵育3分钟，添加0.18M硫酸50μL使反应停止，然后在吸光度450nm下进行检测。
其结果，当ELISA中混在的游离抗原为氧化LDL/β2GPI复合物的情况下，3H3、4C12、2A12与固定化的氧化LDL/β2GPI的结合抑制显著，β2GPI没有抑制结合。另一方面，游离抗原为氧化LDL/β2GPI复合物，2H6的结合也发生抑制，另外混在有β2GPI也可见些许抑制。在3D4中，与游离的抗原为氧化LDL/β2GPI复合物相比，β2GPI产生的抑制可见为更高的抑制(图3)。
根据这些结果，将各抗体的反应性整理于表1中(实施例7所示)。3H3虽显示与4C12近似的反应性，但不是相同的反应性，它们具有不同的特异性。
[实施例6]
抗体的动脉硬化灶免疫组织染色
用普通饲料喂养(Oriental酵母NMF)apoE-/-小鼠和LDLR-/-小鼠(从Jackson Lab获得，用冈山大学内动物实验设施维持系统)到8周龄，之后用高脂肪饮食(普通饲料中配合胆固醇1％、胆酸1％、无盐黄油15％)喂养4～6个月，胸部或腹部主动脉出现动脉硬化灶(斑块)，出现肥厚、粥样斑块。然后，将8月龄的这些小鼠宰杀，这次特别制作胸部主动脉、主动脉的根部和主动脉瓣的冷冻切片，制成标本进行观察。
在制备冷冻切片后，用多聚甲醛固定以用于荧光免疫染色抗体法的实验中。
单克隆抗体的Cy5.5标记
将在0.1M碳酸缓冲液(pH9.3)、在4℃下透析过夜的各种单克隆抗体(1mg/ml)加入到Fluorolink Cy5.5monofunctional dye(1试管)中，在室温下使其反应30分钟进行标记。反应后，通过Sephadex G-25柱得到Cy5.5标记抗体。
使用了冷冻切片的免疫荧光染色
使各种单克隆抗体与用1％多聚甲醛固定5分钟得到的切片在4℃下反应过夜。洗涤后，使FITC标记抗小鼠IgG或IgM抗体(2次抗体)在室温下反应1小时。在该2次抗体反应时添加DAP1和若丹明鬼笔环肽(Rhodamine Phalloidin)染色。然后用荧光显微镜观察、摄影。
免疫组织染色
结果，在对用普通饲料喂养的C57BL6系统的小鼠使用3H3抗体、Mac3的免疫荧光染色中，泡沫状巨噬细胞聚集而成的粥样斑块被染色。利用3H3同样的部位也被染色(图4)。
将动脉硬化多发小鼠模型(高脂肪饮食喂养的apoE-/-)的主动脉瓣的免疫荧光染色与用识别氧化LDL/β2GPI复合物的其他抗体获得的免疫荧光染色进行比较。粥样斑块的染色阳性例子仅为3H3和抗体A(图5)。
用各种特异性的单克隆抗体能够对动脉硬化灶的标记了Cy5.5、Alexa等的粥样斑块进行特异性的免疫染色。
[实施例7]
成像
体内成像：
利用Xenogen公司的IVIS(注册商标)成像系统、IVIS200进行成像(激发：640nm，发射：720nm.)。
实验1：对与实施例6同样地制作的高脂肪饮食喂养apoE-/-小鼠从尾静脉以0.15ml/只给予Cy5.5标记单克隆抗体(0.25mg/ml)。给予生理盐水(PBS、对照)、Cy5.5标记抗体A、Cy5.5标记3H3抗体这3种。给予24小时后将胸部皮肤剥离，在存活状态下对全身进行摄影(图7)。
实验2：进而在胸部主动脉连接的状态下摘出心脏进行摄影(图7)。在3H3给予中主动脉根部强烈染色。在抗体A中也有些许染色，但荧光强度没有3H3强。在2A12中完全没有染色。
测定主动脉根部单位规定面积的荧光强度。将给予了PBS的对照小鼠的荧光记为1.0。在3H3给予中，可见为对照的3倍左右的荧光。在其他抗体给予中，荧光强度未见大的变化(图10)。
将这次的抗体组的特异性试验整理于表1。
[表1]
抗氧化LDL/β2GPI复合物的特异性抗体
在固定化氧化LDL/β2GPI复合物或固定化β2GPI ELISA液体中可见与竞争抑制抗原β2GPI的抑制性，结果是，在固定化氧化LDL/β2GPI复合物的情况下：3D4＞2H6＞4C12＞3H3，在固定化β2GPI的情况下：2H6＞3D4(4C12、3H3只对固定化β2GPI微弱地反应)。3H3对液体中的游离氧化LDL/β2GPI复合物(非修饰)的特异性高。
[实施例8]
识别氧化LDL/β 2 GPI复合物的小鼠单克隆抗体的可变区基因的分析
分析的单克隆抗体为4种克隆(3H3、4C12、2H6、3D4)。
关于这4种克隆的抗体亚群，3H3和4C12为IgG2b、2H6和3D4为IgG1。
(L链可变区基因的分析)
将产生4种(3H3、4C12、2H6、3D4)单克隆抗体的杂交瘤细胞分别在RPMI1640+10％FCS培养基中培养。使用QuickPrep micro mRNA纯化试剂盒(Amersham Biosciences，code 27-9255-01)从该杂交瘤细胞获得mRNA。使用First-Strand cDNA合成试剂盒(Amersham Biosciences，code27-9261-01)将该mRNA制成cDNA。以该cDNA为模板，利用PCR法使基因扩增，利用以下所示的11种模式的引物的组合进行PCR反应。这里，MKV1～MKV11的引物序列通过分析大多单克隆抗体的信号序列来设定，其中，该11种引物序列包括了基本所有的单克隆抗体的L链信号的序列。通过该11种MKV引物和与小鼠L链恒定区序列相当的MKC引物间的11模式的PCR反应中的至少1种，扩增目标L链可变区。
PCR反应条件如下。
来自小鼠杂交瘤的cDNA                   4μL
2.5mM dNTPs                            4μL
MKV1～MKV11引物(20μM)的11种中的一种   2.5μL
MKC引物(20μM)                         2.5μL
DMSO                                   2.5μL
×10pfu聚合酶缓冲液                    5μL
pfu聚合酶                              1μL
灭菌水                                 285μL
总计                                   50μL
94℃                                   2min
94℃ 1min 55℃ 2min 72℃ 2min(30个循环)
72℃ 4min
4℃无限制时间
引物的DNA序列参照以下序列。
MKV1引物：ATGAAGTTGCCTGTTAGGCTGTTGGTGCTG(序列号：11)
MKV2引物：ATGGAGWCAGACACACTCCTGYTATGGGTG(序列号：12)
MKV3引物：ATGAGTGTGCTCACTCAGGTCCTGGSGTTG(序列号：13)
MKV4引物：ATGAGGRCCCCTGCTCAGWTTYTTGGMWTCTTG(序列号：14)
MKV5引物：ATGGATTTWCAGGTGCAGATTWTCAGCTTC(序列号：15)
MKV6引物：ATGAGGTKCYYTGYTSAGYTYCTGRGG(序列号：16)
MKV7引物：ATGGGCWTCAAGATGGAGTCACAKWYYCWGG(序列号：17)
MKV8引物：ATGTGGGGAYCTKTTTYCMMTTTTTCAATTG(序列号：18)
MKV9引物：ATGGTRTCCWCASCTCAGTTCCTTG(序列号：19)
MKV10引物：ATGTATATATGTTTGTTGTCTATTTCT(序列号：20)
MKV11引物：ATGGAAGCCCCAGCTCAGCTTCTCTTCC(序列号：21)
MKC引物：ACTGGATGGTGGGAAGATGG(序列号：22)
(M＝A或C、R＝A或G、W＝A或T、S＝C或G、Y＝C或T、K＝G或T)
通过PCR反应L链可变区扩增得到的PCR引物的组合为下述组合。
3H3：MKV7-MKC
4C12：MKV7-MKC
2H6：MKV5-MKC
3D4：MKV4-MKC
将PCR扩增得到的L链可变区基因插入pCR2.1载体(Invitogen)中。
插入有L链可变区基因的PCR2.1载体的DNA碱基序列用DNA测序仪(Applied Biosystems制：3130 Genatic Analyzer)进行测序。
(H链可变区基因的分析)
将产生4种(3H3、4C12、2H6、3D4)单克隆抗体的杂交瘤细胞在RPMI1640+10％FCS培养基中分别培养。使用QuickPrep micro mRNA纯化试剂盒(Amersham Biosciences，code 27-9255-01)从该杂交瘤细胞获得mRNA。使用First-Strand cDNA合成试剂盒(Amersham Biosciences，code27-9261-01)将该mRNA制成cDNA。以该cDNA为模板，利用PCR法使H链可变区基因扩增，利用以下所示的12种模式的引物的组合进行PCR反应。这里，MHV1～MHV12的引物序列通过分析多个单克隆抗体的信号序列来设定，其中，该12种引物序列包括了基本所有的单克隆抗体的H链信号的序列。通过该12种MHV引物和与小鼠H链恒定区序列相当的MHCG2b或MHCG1引物间的12模式的PCR反应中的至少1种，扩增目标H链可变区。这里，MHCG2b引物具有与小鼠IgG2b的H链恒定区相当的序列，MHCG1引物为与小鼠IgG1的H链恒定区相当的序列。因此，作为IgG2b亚群的3H3克隆和4C12克隆的PCR扩增使用MHCG2b引物、作为IgG1亚群的2H6克隆和3D4克隆的PCR扩增使用MHCG1引物。
PCR反应条件如下。
来自小鼠杂交瘤的cDNA                 4μL
2.5mM dNTPs                          4μL
MHV1～MHV12引物(20μM)的12种中的一种 2.5μL
MHCG2b或MHCG1引物(20μM)             2.5μL
DMSO                                 2.5μL
×10pfu聚合酶缓冲液                  5μL
pfu聚合酶                            1μL
灭菌水                               285μL
总计                                 50μL
94℃ 2min
94℃ 1min 55℃ 2min 72℃ 2min(30个循环)
72℃ 4min
4℃无限制时间
引物的DNA序列参照以下序列。
MHV1引物：ATGAAATGCAGCTGGGGCATSTTCTTC(序列号：23)
MHV2引物：ATGGGATGGAGCTRTATCATSYTCTT(序列号：24)
MHV3引物：ATGAAGWTGTGGTTAAACTGGGTTTTT(序列号：25)
MHV4引物：ATGRACTTTGGGYTCAGCTTGRTTT(序列号：26)
MHV5引物：ATGGACTCCAGGCTCAATTTAGTTTTCCTT(序列号：27)
MHV6引物：ATGGCTGTCYTRGSGCTRCTCTTCTGC(序列号：28)
MHV7引物：ATGGRATGGAGCKGGRTCTTTMTCTT(序列号：29)
MHV8引物：ATGAGAGTGCTGATTCTTTTGTG(序列号：30)
MHV9引物：ATGGMTTGGGTGTGGAMCTTGCTATTCCTG(序列号：31)
MHV10引物：ATGGGCAGACTTACATTCTCATTCCTG(序列号：32)
MHV11引物：ATGGATTTTGGGCTGATTTTTTTTATTG(序列号：33)
MHV12引物：ATGATGGTGTTAAGTCTTCTGTACCTG(序列号：34)
MHCG2b引物：CAGTGGATAGACTGATGGGGG(序列号：35)
MHCG1引物：CAGTGGATAGACAGATGGGGG(序列号：36)
(M＝A或C，R＝A或G，W＝A或T，S＝C或G，Y＝C或T，K＝G或T)
通过PCR反应H链可变区扩增得到的PCR引物的组合为以下的组合。
3H3：MHV4-MHCG2b
4C12：MKV4-MHCG2b
2H6：MHV4-MHCG1
3D4：MHV1-MHCG1
将PCR扩增得到的H链可变区基因插入pCR2.1载体(Invitogen)中。
插入有H链可变区基因的PCR2.1载体的DNA碱基序列用DNA测序仪(Applied Biosystems制：3130 Genatic Analyzer)进行测序。
其结果清楚了可用于本发明的3H3的氨基酸序列、CDR(图11)。
本说明书中公开的抗体的碱基序列和氨基酸序列按照下述序列号记载于序列表中。
<3H3抗体>
序列号1：重链可变区的氨基酸序列
序列号2：重链CDR1的氨基酸序列
序列号3：重链CDR2的氨基酸序列
序列号4：重链CDR3的氨基酸序列
序列号5：重链可变区的碱基序列
序列号6：轻链可变区的氨基酸序列
序列号7：轻链CDR1的氨基酸序列
序列号8：轻链CDR2的氨基酸序列
序列号9：轻链CDR3的氨基酸序列
序列号10：轻链可变区的碱基序列
[实施例9]
对使用了IVIS 200和三维CT的图像分析的研究
进行通过将计算机断层摄影(CT)图像整合得到动脉硬化病灶的三维(局部)图像的实验。
体内荧光成像：
使用IVIS 200成像系统(Xenogen公司)进行荧光成像(在Cy5.5的情况下，激发：640nm、发射：720nm；在Alexa Fluor 750的情况下，激发：745nm、发射：800nm)。将Cy5.5标记3H3抗体(IgG)以0.25mg/ml、0.15ml/只、或将Alexa Fluor750标记3H3抗体以1.0～1.5mg/ml、0.15ml/只从尾静脉给予高脂肪饮食喂养的ApoE-/-小鼠，2～24小时后，用IVIS 200在吸入麻醉下对体内荧光进行观察、摄影。由于ApoE-/-小鼠的黑色体毛吸收荧光，因此剃掉体毛进行观察。开始利用反射光进行荧光观察，然后利用透射光进行荧光观察，制作小鼠的三维(3D)图像，将光源信息融合(图9A：整合前的IVIS所获得的三维图像)。图中的红点部分为标记3H3的荧光信号，浓度越浓表示荧光强度越强，即成像剂越局部分布。
离体成像：
3D-CT分析结束后对小鼠实施安乐死，用PBS 10ml进行心脏灌流，摘出心脏和主动脉，利用IVIS 200得到反射荧光图像。
CT成像：
利用eXplore Locus CT System(GE Healthcare)进行CT成像。使用与利用IVIS200进行成像相同的小鼠个体，在吸入麻醉下进行X射线照射，得到CT图像。
荧光与CT的图像整合：
将利用IVIS 200检测的荧光成像图像与用CT摄影得到的图像用通用的3D可视化软件(Amira、Mercury Computer Systems)进行整合(图9B：整合后的三维CT图像)。
另外，示意地示出了一个流程图(图8)。
(A)利用IVIS 200获得的使用了特异抗体的荧光成像(反射)。
(B)整合前的利用IVIS 200获得的使用了特异抗体的荧光成像(透射光；左)和CT像(中)整合图(右)：荧光成像(透射光；左)中红点的部分的浓度越浓、荧光强度越强，即显示为成像剂越局部地集中的部分(3H3结合反应性高的部位)。
(C)利用IVIS获得的荧光信号与三维CT的整合图像：为在计算机的假想空间上制作三维像的动画(三维图形的动画)并从多角度确认其标记的位置的照片。
由于可见光在生物体内被吸收，因此为了进行体内成像，使用难以被生物体吸收的波长的近红外的荧光标记。本实验中通过将用Cy5.5或AlexaFluor 750标记的抗体从尾静脉给予小鼠，然后利用IVIS200测定荧光，对反射和透射的荧光测定条件进行研究。在利用Cy5.5标记抗体的体内成像的反射荧光图像中，观察到患有动脉硬化的ApoE-/-小鼠的主动脉瓣和胸部主动脉的强的信号。此外，通过离体成像和离体荧光显微镜观察，可见静脉给予的荧光标记抗体局部化到动脉硬化灶的局部分布。但是，在使用Cy5.5标记抗体的情况下，透射荧光的信号弱，难以确定立体图像(三维)中的荧光位置。另一方面，在Alexa Fluor 750标记抗体中，静脉内给予2小时后在反射荧光图像、透射荧光图像二者中均获得强的特异性信号，当尝试构建为立体图像时，可见胸的内部有强的荧光信号(图8A、B中的左图)。接着对同一小鼠进行CT摄影，得到利用CT图像提取骨和肺的脏器而获得的图像(将图8B中和利用IVIS200构建的荧光成像图像利用Amira进行整合，得到整合3D图像(图8B右)，结果观察到在心脏和其附近的位置有荧光信号。图中的红点部分的浓度越浓、荧光强度越强，即显示成像剂局部分布。显示了CT(中央)与3D-CT整合的图像(图8B右)。在计算机的假想空间上制作三维像的动画(三维图形的动画)，从多角度确认了其标记的位置(图8C)。
从上述实验的结果可观察到，在利用荧光标记3H3抗体的体内成像的反射荧光图像中，患有动脉硬化的ApoE-/-小鼠的主动脉瓣和胸部主动脉有强的信号。此外，通过离体成像和离体荧光显微镜观察，静脉给予的荧光标记抗体局部分布到动脉硬化灶。
从本实验可知，通过使用近红外荧光物质(Cy5.5、Alexa750)标记抗体，不仅小鼠的动脉硬化的成像成为可能，而且还能够与利用三维CT获得的图像整合。另外还可知，该种抗体能够检测人的动脉硬化灶，本实验结果与临床用的图像诊断技术相关。并且，该小鼠成像技术作为药物开发用的筛选体系已能够实用。
产业上的可利用性
以往的动脉硬化检查方法无法确定动脉硬化的发病部位(存在部位)。与此不同，本发明提供了能够视觉地获得动脉硬化灶(特别是粥样斑块、粥样动脉硬化)的存在部位和其大小的非介入性诊断方法。
通过使用动脉硬化多发小鼠模型(例如apoE缺失(ApoE-/-)小鼠：通过维持高血浆胆固醇浓度，即可患上自然发生的粥样动脉硬化样病变)和该成像用的抗体，能够构建粥样动脉硬化的治疗药的筛选体系。
此外，通过将所述抗体替换为人源化抗体，能够构建临床诊断用的成像体系。因此，已知来自动脉粥样斑块的游离斑块等是引起动脉塞栓从而引发脑塞栓、心肌梗塞的原因，因此对慢性且无症状地不知不觉地进展的人的粥样动脉硬化进行监测的方法可以说能够有助于生活习惯病的预防、治疗。
Figure IDA0000047217840000011
Figure IDA0000047217840000031
Figure IDA0000047217840000041
Figure IDA0000047217840000051
Figure IDA0000047217840000061
Figure IDA0000047217840000071
Figure IDA0000047217840000081
Figure IDA0000047217840000091
Figure IDA0000047217840000111

Claims (9)

1.一种下述(a)～(e)中任一项所述的抗体，其与氧化LDL和β2-糖蛋白I的复合物即氧化LDL/β2GPI复合物结合；
(a)包含具有序列号：2中记载的氨基酸序列作为CDR1、具有序列号：3中记载的氨基酸序列作为CDR2以及具有序列号：4中记载的氨基酸序列作为CDR3的重链的抗体；
(b)包含具有序列号：1中记载的氨基酸序列作为重链可变区的重链的抗体；
(c)包含具有序列号：7中记载的氨基酸序列作为CDR1、具有序列号：8中记载的氨基酸序列作为CDR2和具有序列号：9中记载的氨基酸序列作为CDR3的轻链的抗体；
(d)包含具有序列号：6中记载的氨基酸序列作为轻链可变区的轻链的抗体：
(e)具有由上述(a)或(b)中记载的重链和上述(c)或(d)中记载的轻链构成的对的抗体。
2.一种抗体，其与和权利要求1所述的抗体所结合的表位相同的表位结合。
3.根据权利要求1或2所述的抗体，其为人源化抗体或嵌合抗体。
4.一种动脉硬化的存在部位的成像剂，其含有与氧化LDL和β2-糖蛋白I的复合物即氧化LDL/β2GPI复合物结合的抗体。
5.一种动脉硬化的存在部位的成像剂，其含有权利要求1～3中任一项所述的抗体。
6.根据权利要求4或5所述的成像剂，其对动脉硬化的粥样斑块的位置和/或大小进行成像。
7.一种动脉硬化的存在部位的成像用试剂盒，其包含与氧化LDL和β2-糖蛋白I的复合物即氧化LDL/β2GPI复合物结合的抗体。
8.一种动脉硬化的存在部位的成像用试剂盒，其包含权利要求1～3中任一项所述的抗体。
9.一种动脉硬化治疗剂的候补化合物的筛选方法，其包含以下工序：
(a)向给予了权利要求1～3中任一项所述的抗体的动脉硬化患病非人动物模型给予候补化合物的工序；
(b)对给予了所述候补化合物的动脉硬化患病非人动物模型和未给予所述候补化合物的动脉硬化患病非人动物模型的动脉硬化灶进行成像的工序；
(c)对给予了所述候补化合物的动脉硬化患病非人动物模型和未给予所述候补化合物的动脉硬化患病非人动物模型的动脉硬化灶的大小或存在部位进行比较的工序，和
(d)从给予了所述候补化合物的动脉硬化患病非人动物模型中选择与未给予所述候补化合物的动脉硬化患病非人动物模型相比动脉硬化灶减少或消失的候补化合物的工序。
CN200980132253.1A 2008-06-20 2009-03-09 抗氧化LDL/β2GPI复合物的抗体及其用途 Active CN102124030B (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2008162565 2008-06-20
JP2008-162565 2008-06-20
PCT/JP2009/054473 WO2009154025A1 (ja) 2008-06-20 2009-03-09 酸化LDL/β2GPI複合体に対する抗体及びその用途

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN102124030A true CN102124030A (zh) 2011-07-13
CN102124030B CN102124030B (zh) 2015-06-17

Family

ID=41433943

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN200980132253.1A Active CN102124030B (zh) 2008-06-20 2009-03-09 抗氧化LDL/β2GPI复合物的抗体及其用途

Country Status (7)

Country Link
US (1) US8575314B2 (zh)
EP (1) EP2319869B1 (zh)
JP (1) JP5616592B2 (zh)
KR (1) KR20110038047A (zh)
CN (1) CN102124030B (zh)
CA (1) CA2728473A1 (zh)
WO (1) WO2009154025A1 (zh)

Families Citing this family (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009154026A1 (ja) * 2008-06-20 2009-12-23 国立大学法人岡山大学 石灰化小球に対する抗体及びその用途
TW201302779A (zh) 2011-04-13 2013-01-16 Glaxosmithkline Biolog Sa 融合蛋白質及組合疫苗
WO2013157102A1 (ja) * 2012-04-18 2013-10-24 公立大学法人大阪市立大学 ムチンサブタイプ５ａｃ特異的ヒト化抗体およびその利用
WO2013157105A1 (ja) * 2012-04-18 2013-10-24 公立大学法人大阪市立大学 ムチンサブタイプ５ａｃ特異的ヒト化抗体およびその利用
WO2016123705A1 (en) 2015-02-02 2016-08-11 Novadaq Technologies Inc. Methods and systems for characterizing tissue of a subject
CA2998698A1 (en) * 2015-09-23 2017-03-30 Novadaq Technologies ULC Methods and systems for management of data derived from medical imaging
WO2017210360A1 (en) 2016-05-31 2017-12-07 Cardiovax, Llc Methods for diagnosing and treating systemic lupus erythematosus
US10858422B2 (en) 2016-05-31 2020-12-08 Abcentra, Llc Methods for treating systemic lupus erythematosus with an anti-apolipoprotein B antibody
WO2018018160A1 (en) 2016-07-29 2018-02-01 Novadaq Technologies ULC Methods and systems for characterizing tissue of a subject utilizing machine learning
CN112500490B (zh) * 2020-10-14 2022-05-03 华南农业大学 一种抗左旋氧氟沙星抗体的F(ab)2片段及其制备方法和应用
CN114716547B (zh) * 2022-05-18 2023-11-21 珠海丽禾医疗诊断产品有限公司 一种包括抗原结合结构域的结合蛋白及其生产方法和应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1995009363A1 (fr) * 1993-09-29 1995-04-06 Yamasa Corporation Procede de titrage de lipoproteine oxydee et applications de ce procede
WO2004023141A1 (ja) * 2002-09-06 2004-03-18 Eiji Matsuura 生体内の酸化LDL−β２−グリコプロテインⅠ複合体の測定方法

Family Cites Families (53)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS58201994A (ja) 1982-05-21 1983-11-25 Hideaki Hagiwara 抗原特異的ヒト免疫グロブリンの生産方法
CH0229046H1 (de) 1985-03-30 1998-07-15 Stuart Alan Kauffman Method for obtaining dna, rna, peptides, polypeptinique. des or proteins by means of a dna recombinant tech
US5763192A (en) 1986-11-20 1998-06-09 Ixsys, Incorporated Process for obtaining DNA, RNA, peptides, polypeptides, or protein, by recombinant DNA technique
US5266684A (en) * 1988-05-02 1993-11-30 The Reagents Of The University Of California Peptide mixtures
US5571689A (en) 1988-06-16 1996-11-05 Washington University Method of N-acylating peptide and proteins with diheteroatom substituted analogs of myristic acid
US5663143A (en) 1988-09-02 1997-09-02 Dyax Corp. Engineered human-derived kunitz domains that inhibit human neutrophil elastase
US5223409A (en) * 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US20040049014A1 (en) * 1988-12-28 2004-03-11 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
IL162181A (en) 1988-12-28 2006-04-10 Pdl Biopharma Inc A method of producing humanized immunoglubulin, and polynucleotides encoding the same
DE3920358A1 (de) 1989-06-22 1991-01-17 Behringwerke Ag Bispezifische und oligospezifische, mono- und oligovalente antikoerperkonstrukte, ihre herstellung und verwendung
US5498538A (en) * 1990-02-15 1996-03-12 The University Of North Carolina At Chapel Hill Totally synthetic affinity reagents
US5427908A (en) * 1990-05-01 1995-06-27 Affymax Technologies N.V. Recombinant library screening methods
US5723286A (en) 1990-06-20 1998-03-03 Affymax Technologies N.V. Peptide library and screening systems
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
WO1992020791A1 (en) 1990-07-10 1992-11-26 Cambridge Antibody Technology Limited Methods for producing members of specific binding pairs
ES2108048T3 (es) 1990-08-29 1997-12-16 Genpharm Int Produccion y utilizacion de animales inferiores transgenicos capaces de producir anticuerpos heterologos.
US5770434A (en) * 1990-09-28 1998-06-23 Ixsys Incorporated Soluble peptides having constrained, secondary conformation in solution and method of making same
US5698426A (en) * 1990-09-28 1997-12-16 Ixsys, Incorporated Surface expression libraries of heteromeric receptors
DK0605522T3 (da) 1991-09-23 2000-01-17 Medical Res Council Fremgangsmåde til fremstilling af humaniserede antistoffer
US5565332A (en) 1991-09-23 1996-10-15 Medical Research Council Production of chimeric antibodies - a combinatorial approach
US5270170A (en) * 1991-10-16 1993-12-14 Affymax Technologies N.V. Peptide library and screening method
ATE297465T1 (de) 1991-11-25 2005-06-15 Enzon Inc Verfahren zur herstellung von multivalenten antigenbindenden proteinen
ES2227512T3 (es) 1991-12-02 2005-04-01 Medical Research Council Produccion de anticuerpos contra auto-antigenos a partir de repertorios de segmentos de anticuerpos fijados en un fago.
CA2124967C (en) 1991-12-17 2008-04-08 Nils Lonberg Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
JP3507073B2 (ja) 1992-03-24 2004-03-15 ケンブリッジ アンティボディー テクノロジー リミティド 特異的結合対の成員の製造方法
US5573905A (en) 1992-03-30 1996-11-12 The Scripps Research Institute Encoded combinatorial chemical libraries
CA2140638C (en) 1992-07-24 2010-05-04 Raju Kucherlapati Generation of xenogeneic antibodies
CA2161351C (en) 1993-04-26 2010-12-21 Nils Lonberg Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
GB9313509D0 (en) 1993-06-30 1993-08-11 Medical Res Council Chemisynthetic libraries
EP0731842A1 (en) 1993-12-03 1996-09-18 Medical Research Council Recombinant binding proteins and peptides
JP4044972B2 (ja) 1994-02-24 2008-02-06 協和メデックス株式会社 ヒト粥状硬化病巣関連抗原を認識するモノクローナル抗体
EP0760012A4 (en) 1994-06-10 1997-07-02 Symbiotech Inc METHODS FOR DETECTING COMPOUNDS BY MEANS OF GENETICALLY MODIFIED LAMBDA BACTERIOPHAGE
US5627024A (en) 1994-08-05 1997-05-06 The Scripps Research Institute Lambdoid bacteriophage vectors for expression and display of foreign proteins
CA2219361C (en) 1995-04-27 2012-02-28 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
EP0823941A4 (en) 1995-04-28 2001-09-19 Abgenix Inc HUMAN ANTIBODIES DERIVED FROM IMMUNIZED XENO MOUSES
DE69628026T2 (de) 1995-09-07 2004-04-08 Novozymes A/S Nachweis der aktivität von enzymen für detergenzien durch phagen.
DE69731084T2 (de) 1996-03-20 2006-02-23 Dyax Corp., Cambridge REINIGUNG DES GEWEBE PLASMINOGENAKTIVATORS (tPA)
CA2256449A1 (en) 1996-06-06 1997-12-11 Lajolla Pharmaceutical Company Apl immunoreactive peptides, conjugates thereof and methods of treatment for apl antibody-mediated pathologies
AU735015B2 (en) 1996-06-10 2001-06-28 Scripps Research Institute, The Use of substrate subtraction libraries to distinguish enzyme specificities
US5766905A (en) 1996-06-14 1998-06-16 Associated Universities Inc. Cytoplasmic bacteriophage display system
EP0929361A4 (en) 1996-10-04 2000-07-19 Whatman Inc DEVICE AND METHOD FOR SIMULTANEOUS MULTIPLE SYNTHESIS
AU4474497A (en) 1996-10-08 1998-05-05 U-Bisys B.V. Methods and means for selecting peptides and proteins having specific affinity for a target
JP2001503064A (ja) 1996-11-06 2001-03-06 ジェネンテク，インコーポレイテッド 拘束されたラセンペプチドとその製法
IL119586A (en) 1996-11-07 2001-09-13 Univ Ramot Discontinuous library of a single biological unit and a method for its preparation
IL119587A (en) 1996-11-07 2000-12-06 Univ Ramot Method of preparing and for obtaining bimolecular interactions
US6375925B1 (en) 1996-11-08 2002-04-23 The Regents Of The University Of California Methods and reagents for non-invasive imaging of atherosclerotic plaque
ES2258798T3 (es) 1996-11-27 2006-09-01 Boston Heart Foundation, Inc. Nuevas proteinas de union a hipoproteinas de baja densidad y su uso para el diagnostico y el tratamiento de la arterosclerosis.
US6716410B1 (en) 1999-10-26 2004-04-06 The Regents Of The University Of California Reagents and methods for diagnosing, imaging and treating atherosclerotic disease
JP4272518B2 (ja) * 2001-09-07 2009-06-03 栄次 松浦 β２−グリコプロテインＩに対するリガンド及びその用途
JP3898680B2 (ja) 2003-02-21 2007-03-28 栄次 松浦 酸化ｌｄｌ−ｃｒｐ複合体の測定方法及び測定キット
WO2007139099A1 (ja) 2006-05-30 2007-12-06 Okayama Prefecture Industrial Promotion Foundation 新規な酸化ｌｄｌ複合体及びその検知方法
WO2009154026A1 (ja) * 2008-06-20 2009-12-23 国立大学法人岡山大学 石灰化小球に対する抗体及びその用途

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1995009363A1 (fr) * 1993-09-29 1995-04-06 Yamasa Corporation Procede de titrage de lipoproteine oxydee et applications de ce procede
WO2004023141A1 (ja) * 2002-09-06 2004-03-18 Eiji Matsuura 生体内の酸化LDL−β２−グリコプロテインⅠ複合体の測定方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
KOBAYASHI,K.,ET AL: "CIRCULATING OXIDIZED LDL FORM COMPLEXES WITH B2-GLYCOPROTEIN I:INPLICATION AS AN ATHEROGENIC AUTOANTIGEN.", 《JOURNAL OF LIPID RESEARCH》 *

Also Published As

Publication number Publication date
US8575314B2 (en) 2013-11-05
US20110182816A1 (en) 2011-07-28
CN102124030B (zh) 2015-06-17
WO2009154025A1 (ja) 2009-12-23
CA2728473A1 (en) 2009-12-23
EP2319869A4 (en) 2012-11-14
EP2319869A1 (en) 2011-05-11
JP5616592B2 (ja) 2014-10-29
EP2319869B1 (en) 2016-08-17
KR20110038047A (ko) 2011-04-13
JP2011042581A (ja) 2011-03-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN102124030B (zh) 抗氧化LDL/β2GPI复合物的抗体及其用途
JP5739157B2 (ja) 石灰化小球に対する抗体及びその用途
WO2011074621A1 (ja) メソセリン（msln）に対する抗体及びその用途
US9139655B2 (en) Tumor-targeting monoclonal antibodies to FZD10 and uses thereof
CN108350067A (zh) 抗-原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素抗体及其用途
EA026944B1 (ru) Применение антитела к человеческому прогастрину для приготовления лекарственного средства для лечения колоректального рака и способы лечения метастатического колоректального рака (варианты)
CN108350052A (zh) 淀粉样蛋白β中间区域中的表位及其构象选择性抗体
US20120226119A1 (en) Vivo tumor vasculature imaging
CN108350051A (zh) 淀粉样蛋白β中的N-末端表位及其构象选择性抗体
WO2011134060A1 (en) Anti-icam-1 single domain antibody and uses thereof
CN103491983B (zh) 与心血管成像相关的材料及方法
ES2614955T3 (es) Nanocuerpos anti-VCAM-1
CN102596999B (zh) 识别淀粉样蛋白β的转角结构的抗体
JP6133402B2 (ja) 急性心筋梗塞を処置および診断するための方法および組成物
CN108136008A (zh) 针对具有末端GlcNAcβ残基的肿瘤相关复合N-聚糖的抗体及其使用方法
CN101389654B (zh) 新的用于肝脏疾病的非侵入性标记
CN101460849B (zh) 胰腺癌的诊断药和治疗药
CN110036110A (zh) 针对fzd10的单克隆抗体及其用途
US9637542B2 (en) CX3CR1-targeting imaging agents and their use in the diagnosis and treatment of disease
KR101679245B1 (ko) 상피성장인자 수용체를 표적으로 하는 암 진단 또는 영상화용 조성물

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
C41 Transfer of patent application or patent right or utility model
TR01 Transfer of patent right

Effective date of registration: 20160513

Address after: Okayama County, Japan

Patentee after: Nat University Corp. Okayama Un

Address before: Okayama County, Japan

Patentee before: Nat University Corp. Okayama Un

Patentee before: Medical & Biological Lab Co., Ltd.