EA026944B1

EA026944B1 - Применение антитела к человеческому прогастрину для приготовления лекарственного средства для лечения колоректального рака и способы лечения метастатического колоректального рака (варианты)

Info

Publication number: EA026944B1
Application number: EA201201000A
Authority: EA
Inventors: Жюли Паннекю; Лейла Уу; Беренис Фрамри; Нежла Эркилик; Доминик Жубер; Фредерик Олланд
Original assignee: Ле Лаборатуар Сервье; Инститю Насьональ Де-Ла-Санте Эт Де-Ла-Решерш Медикаль (Инсерм); Сантр Насьональ Де-Ла Решерш Сьентифик (Снрс)
Priority date: 2010-01-08
Filing date: 2011-01-07
Publication date: 2017-06-30
Also published as: EP2542585B8; CN102947337B; JP5930972B2; WO2011083088A2; HK1252832A1; ES2657458T3; CA2786417A1; SG182335A1; WO2011083088A3; NZ601584A; PL3296319T3; KR101493261B1; PL2542585T3; US9217032B2; AU2011204651A1; AU2011204651B2; CN102947337A; EA201201000A1; JP2013516437A; EP3296319B1

Abstract

Настоящее изобретение относится к применению антитела к человеческому прогастрину (hPG) для получения лекарственного средства для лечения метастатического колоректального рака, а также к способам лечения метастастатического колоректального рака с помощью композиций, включающих указанные антипрогастриновые антитела.

Description

Настоящая заявка относится применению антитела к человеческому прогастрину для получения для лечения колоректального рака и способ лечения метастатического колоректального рака.

Предпосылки создания изобретения

Несмотря на десятилетия основных и клинических исследований, колоректальный рак остается одним из наиболее смертоносных неинфекционных заболеваний. В соответствии с проектом ОЬОВОСЛЫ международного агентства по исследованию рака Всемирной организации охраны здоровья, было оценено, что только в 2008 г. частота возникновения колоректального рака составляла свыше 1,2 млн, и что в этот же год более чем 600 тысяч людей были убиты этой болезнью. Несмотря на то, что в последние годы было предпринято много исследований в отношении того, как колоректальный рак работает на молекулярном уровне, практикующие врачи все еще полагаются на такие терапевтически способы, как хирургия, лучевая терапия и химиотерапия, которые были известны онкологам прошлого поколения. Ранняя диагностика стала возможной с помощью успехов в технологии получения изображения и молекулярной диагностике, фактор, который в значительной мере определяет успех любого заболевания. Несмотря на то, что эффективность всех этих способов лечения улучшилась, совершенствование показателей излечения и повышение продолжительности жизни является постепенным. Даже новые способы направленной терапии, появившиеся в результате революции в молекулярной биологии, имеют, большей частью, только скромные результаты.

Два из наиболее сложных аспектов контроля пациентов с колоректальным раком представляют собой метастазы и рецидивы.

Метастазы возникают тогда, когда колоректальный рак распространяется на отдаленные органы из первичной опухоли. В то время как часто является возможным удалить первичную опухоль, именно метастазы часто оказываются смертоносными для пациента, поскольку они становятся весьма многочисленными или сложно переплетенными со здоровой тканью хозяина для того, чтобы подвергаться хирургическому лечению. В соответствии с Американским обществом по борьбе с раком показатель пятилетнего выживания в Соединенных Штатах для пациентов, диагностированных со стадией 111С рака кишечника, в 1998-2000 составлял 28%, который снижался до значения 6% при стадии IV (то есть, метастатического колоректального рака).

Рецидив представляет собой процесс, с помощью которого колоректальный рак возвращается после изначальной чувствительности на лечение и очевидного исчезновения. Не говоря уже об эмоциональном ударе, который наносится пациентам и их родственникам, рецидив является проблематичным потому, что вернувшийся рак может быть менее чувствительным к терапии или способам терапии, которые были эффективными для борьбы с первичным раком. Для других пациентов предыдущие способы лечения первичного рака могут вызвать необратимые побочные эффекты, такие как повреждение сердечной и нервной системы. У таких пациентов риски применения того же способа терапии для борьбы с рецидивирующим раком могут быть достаточно серьезными. При этих обстоятельствах пациент может иметь меньше возможностей для лечения с сопутствующим более высоким риском смертности.

Несмотря на то, что усовершенствования в лучевой терапии, химиотерапии и появляющихся способах целенаправленной терапии повысили длительность выживания пациентом, пораженных колоректальным раком, многие из таких пациентов продолжают умирать в течение периода времени от нескольких месяцев до нескольких лет после их диагностирования. Таким образом, существует насущная необходимость в новых способах лечения, эффективных против метастатического колоректальныого рака и рецидивов колоректального рака.

Краткое изложение сущности

Настоящая заявка относится к применению антитела к человеческому прогастрину (№О) для получения лекарственного средства для лечения метастатического колоректального рака, где антитело к №О включает (а) вариабельную область тяжелой цепи, в которой СОК 1 включает аминокислотную последовательность ν_ΗΠΌΚ1.3 (8ЕС ΙΌ N0:1), СКЭ2 включает аминокислотную последовательность ν_Η СОК 2.3 (8ЕС ГО N0:2) и СКЭ 3 включает аминокислотную последовательность ν_Η СОК 3.3 (8ЕС ГО N0:3), и вариабельную область легкой цепи, в которой СОК 1 включает аминокислотную последовательность ν₄СОК1.3 (8ЕС ΙΌ N0:4), СКЭ2 включает аминокислотную последовательность ν, СГОК 2.3 (8ЕС ГО N0:5) и СКЭ 3 включает аминокислотную последовательность V,, СОК 3.3 (8ЕС ГО N0:6); или (б) вариабельную область тяжелой цепи, в которой СОК 1 включает аминокислотную последовательность ν_Η СОК 1.8 (8ЕС ГО N0:37), СКЭ2 включает аминокислотную последовательность ν_Η СОК 2.8 (8ЕС ГО N0:41) и СКЭ 3 включает аминокислотную последовательность ν_Η СОК 3.8 (8ЕС ГО N0:45), и вариабельную область легкой цепи, в которой СОК 1 включает аминокислотную последовательность ν СОК 1.8 (8ЕС ГО N0:49), СКЭ2 включает аминокислотную последовательность ν^ΕΌΡ 2.8 (8ЕС ΙΌ N0:52) и СКЭ 3 включает аминокислотную последовательность ν СОК 3.8 (8ЕС ГО N0:55); или (в) вариабельную область тяжелой цепи, в которой СОК 1 включает аминокислотную последовательность ν_Η СЭК1.13 (8ЕС ΙΌ N0:38), СКЭ2 включает аминокислотную последовательность ν_Η СОК 2.13 (8ЕС ГО N0:42) и СКЭ 3 включает аминокислотную последовательность ν_Η СОК 3.13 (8ЕС ГО N0:46), и вариабельную область легкой цепи, в которой СОК 1 включает аминокислотную последовательность ν СЭК1.13 (8ЕС ГО

- 1 026944

N0:50), СКО2 включает аминокислотную последовательность У_ь СЭР 2.13 (8Е0 ГО N0:53) и СКО 3 включает аминокислотную последовательность У_ъ СОК 3.13 (8Е0 ГО N0:56); или (г) вариабельную область тяжелой цепи, в которой СОК 1 включает аминокислотную последовательность У_н СОК1.16 (8Е0 ГО N0: 39), СКО2 включает аминокислотную последовательность У_н СОК 2.16 (8Е0 ГО N0:43) и СКО 3 включает аминокислотную последовательность У_н СОК 3.16 (8Е0 ГО N0:47), и вариабельную область легкой цепи, в которой СОК 1 включает аминокислотную последовательность У_ъ СОК1.16 (8Е0 ГО N0:50), СОК2 включает аминокислотную последовательность У_ЪСОК 2.16 (8Е0 ГО N0:53) и СКО 3 включает аминокислотную последовательность У_ъ СОК 3.16 (8Е0 ГО N0:57); или (д) вариабельную область тяжелой цепи, в которой СОК 1 включает аминокислотную последовательность У_н СОК1.19 (8Е0 ГО N0: 40), СКО2 включает аминокислотную последовательность У_н СОК 2.19 (8Е0 ГО N0:44) и СКО 3 включает аминокислотную последовательность У_н СОК 3.19 (8Е0 ГО N0:48), и вариабельную область легкой цепи, в которой СОК 1 включает аминокислотную последовательность У_ъ СОК1.19 (8Е0 ГО N0:51), СОК2 включает аминокислотную последовательность У_ЬСОК 2.19 (8Е0 ГО N0:54) и СКО 3 включает аминокислотную последовательность У_ь СОК 3.19 (8Е0 ГО N0:58).

Причем в предпочтительном варианте осуществления изобретения антитело к №0 включает (а) последовательность вариабельной области тяжелой цепи 8Е0 ГО N0:12 и последовательность вариабельной области легкой цепи 8Е0 ГО N0:13; (б) последовательность вариабельной области тяжелой цепи 8Е0 ГО N0:61 и последовательность вариабельной области легкой цепи 8Е0 ГО N0:65; (в) последовательность вариабельной области тяжелой цепи 8Е0 ГО N0:62 и последовательность вариабельной области легкой цепи 8Е0 ГО N0:66, (г) последовательность вариабельной области тяжелой цепи 8Е0 ГО N0:59 и последовательность вариабельной области легкой цепи 8Е0 ГО N0:63; (д) последовательность вариабельной области тяжелой цепи 8Е0 ГО N0:60 и последовательность вариабельной области легкой цепи 8Е0 ГО N0:64.

Возможно осуществление изобретения, при котором указанное антитело к №0 представляет собой гуманизированное антитело. Причем аффинность связывания прогастрина указанного гуманизированного антитела составляет от приблизительно 0,001 нМ до приблизительно 5000 нМ.

В предпочтительном варианте метастатический колоректальный рак локализован в печени, легких, мозге или лимфатическом узле.

Другим объектом изобретения является способ лечения метастатического колоректального рака, включающий применение вышеописанного антитела к №0, при котором указанное антитело к №0 вводится до или после хирургического удаления метастатической колоректальной опухоли.

Еще один вариант осуществления изобретения относится к способу лечения метастатического колоректального рака, включающий применение вышеописанного антитела к №0, где указанное антитело к №0 вводят дополнительно к химиотерапии или радиотерапии.

Причем указанная химиотерапия включает химиотерапевтический агент, выбранный из группы, состоящей из антагонистов фолата, антагонистов пурина, антагонистов пиримидина, ДНК алкилирующих агентов, ДНК перекрестно связывающих лекарств, антибиотиков, комплексов платины, ингибиторов протеосомы, митотических веретеновидных ядов, ингибиторов топоизомеразы и ингибиторов тирозинкиназы.

Четвертый вариант осуществления изобретения предполагает применение вышеописанного антитела к №0 в способе лечения метастатического колоректального рака, при котором указанное антитело к №0 вводится дополнительно со вторым антителом, которое специфически связывает УЕ0Р или Е0РК. Причем оно вводится в дозе в пределах от приблизительно 0,001 до приблизительно 250 мг/кг.

Возможно осуществления изобретения, при котором доза антитела к №0 вводится в виде множества доз, разделенных периодом времени.

Краткое описание фигур

Фиг. 1 обеспечивает диаграмму, сравнивающую уровни экспрессии гена гастрина среди различных человеческих клеточных линий первичного и метастатического колоректального рака.

Фиг. 2 обеспечивает диаграмму, сравнивающую относительные уровни экспрессии гена гастрина в метастатических колоректальных опухолях от каждого из 11 различных пациентов. Уровни экспрессии в метастатической(их) колоректальной(ых) опухоли(ях) от каждого пациента являются нормализованными к уровню экспрессии в соответствующей первичной колоректальной опухоли от того же пациента.

Фиг. 3 обеспечивает диаграмму, сравнивающую количество прогастрина, секретированного в ростовую среду при использовании трех различных клеточных линий метастатического колоректального рака.

Фиг. 4 обеспечивает диаграмму, показывающую концентрации прогастрина в плазме и сыворотке крови, у пациентов с первичным колоректальным раком, метастатическим колоректальным раком и метастатическим колоректальным раком, у которых была удалена первичная опухоль, по сравнению со здоровыми контролями.

Фиг. 5 обеспечивает диаграмму, сравнивающую эффект контрольных и анти-№0 поликлональных антител на рост 8\У620 клеток метастатического колоректального рака в культуре.

Фиг. 6А обеспечивает диаграмму, сравнивающую эффект контрольных и четырех различных анти- 2 026944 №0 моноклональных антителах (МАЫ-МАЬ4) на рост 8^620 клеток метастатического колоректального рака в культуре.

Фиг. 6В обеспечивает диаграмму, сравнивающую эффект на рост 8\У620 клеток метастатического колоректального рака в культуре для лечения с помощью 19 различных анти-№0 моноклональных антител (МАЬ5-МАЬ23) по сравнению с контрольным антителом.

Фиг. 7 обеспечивает диаграмму, сравнивающую эффект контрольного и анти-№0 моноклонального антитела на рост Т84 клеток метастатического колоректального рака в культуре.

Фиг. 8А обеспечивает фотографию печени, в которой не представлено никаких видимых метастазов, удаленной из голой мыши, обработанной с помощью анти-№0 поликлональных антител. 8\У620 клетки вводили в селезенку голой мыши и потом в течение шести недель обрабатывали с помощью анти-№0 поликлональных антител, контрольного поликлонального антитела или забуференного фосфатом физиологического раствора.

Фиг. 8В обеспечивает фотографию печени с видимыми метастазами, удаленной из голой мыши, обработанной с помощью контрольного поликлонального антитела. 8\У620 клетки вводили в селезенки голых мышей, и потом в течение шести недель обрабатывали с помощью анти-№0 поликлональных антител, контрольного поликлонального антитела или забуференного фосфатом физиологического раствора.

Фиг. 9 обеспечивает диаграмму, сравнивающую количество видимых печеночных метастазов, сформированных после введения 8\У620 клеток в селезенки голых мышей и потом в течение шести недель обрабатываемых с помощью анти-№0 поликлональных антител, контрольного поликлонального антитела или забуференного фосфатом физиологического раствора.

Фиг. 10 обеспечивает микрофотографию типичных метастазов печени, образованных после введения 8\У620 клеток в селезенки контрольных голых мышей и потом в течение шести недель обработанных с помощью контрольного поликлонального антитела или забуференного фосфатом физиологического раствора.

Фиг. 11 обеспечивает диаграмму, сравнивающую количество видимых метастазов печени, образованных после введения 8\У620 клеток в селезенки контрольных голых мышей и потом в течение шести недель обработанных с помощью анти-№0 моноклональных антител против контрольного антитела.

Фиг. 12 обеспечивает диаграмму, демонстрирующую эффект роста при культивировании в условиях низкого прикрепления на экспрессию маркера стволовых клеток Ь0К5 клеточными линиями первичного и метастатического колоректального рака, а также клетками, полученными из образца биопсии первичного человеческого колоректального рака.

Фиг. 13 обеспечивает диаграмму, демонстрирующую эффект роста при культивировании в условиях низкого прикрепления на количество мРНК гастрина, экспрессируемое клеточными линиями первичного и метастатического колоректального рака, а также клетками, полученными из образца биопсии первичного человеческого колоректального рака.

Фиг. 14 обеспечивает диаграмму, демонстрирующую количество прогастрина, секретированного в среду клеточными линиями первичного и метастатического колоректального рака, а также клетками, полученными из образца биопсии первичного человеческого колоректального рака, выращенными при условиях культивирования низкого прикрепления.

Фиг. 15 обеспечивает диаграмму, демонстрирующую эффект антипрогастриновых поликлональных антител на образование сфероидов НТ-29 клетками первичного колоректального рака, выращенными при условиях культивирования низкого прикрепления.

Фиг. 16 обеспечивает диаграмму, демонстрирующую эффект антипрогастриновых поликлональных антител на образование сфероидов НСТ116 клетками первичного колоректального рака, выращенными при условиях культивирования низкого прикрепления.

Фиг. 17 обеспечивает диаграмму, демонстрирующую эффект антипрогастриновых поликлональных антител на образование сфероидов клетками, полученными из образца биопсии человеческого первичного колоректального рака, выращенных при условиях культивирования низкого прикрепления.

Фиг. 18А обеспечивает диаграмму, демонстрирующую эффект антипрогастриновых поликлональных антител на образование сфероидов Ь0К.5-позигивными НТ29 клетками первичного колоректального рака, которые инкубировали при условиях низкого прикрепления в течение 14 дней.

Фиг. 18В обеспечивает диаграмму, демонстрирующую, что ингибигорный эффект лечения с помощью антипрогастриновых моноклональных антител на образование сфероидов Ь0К.5-позитивными НТ29 клетками первичного колоректального рака в условиях низкого прикрепления культуры продолжается на протяжении, по крайней мере, 17 дней после удаления антител.

Фиг. 19А обеспечивает диаграмму, демонстрирующую эффект антипрогастриновых поликлональных антител на образование сфероидов Е0Р5-позитивными НСТ116 клетками первичного колоректального рака, которые инкубировали при условиях низкого прикрепления в течение 14 дней.

Фиг. 19В обеспечивает диаграмму, демонстрирующую, что ингиб игорный эффект лечения с помощью антипрогастриновых моноклональных антител на образование сфероидов Ь0К5-позитивными НСТ116 клетками первичного колоректального рака в условиях низкого прикрепления культуры про- 3 026944 должается на протяжении по крайней мере 17 дней после удаления антител.

Фиг. 20 обеспечивает диаграмму, демонстрирующую эффект лечения с помощью четырех различных антипрогастриновых моноклональных антител на формирование сфероидов СКС1 клетками первичного колоректального рака, выращенными при условиях культивирования низкого прикрепления.

Фиг. 21 обеспечивает диаграмму, демонстрирующую эффект антипрогастриновых моноклональных антител на образование сфероидов Т84 клетками метастатического колоректального рака, выращенными при условиях культивирования низкого прикрепления.

Фиг. 22 обеспечивает диаграмму, демонстрирующую эффект лечения с помощью четырех различных антипрогастриновых моноклональных антител на рост позитивных по АЬОН1 клеток первичного колоректального рака, которые выращивали при стандартных условиях культивирования ткани.

Фиг. 23 обеспечивает диаграмму, демонстрирующую эффект предварительной обработки с помощью четырех различных антипрогастриновых моноклональных антител на рост клеток первичного колоректального рака в виде сфероидов, которые выращивали при стандартных условиях культивирования ткани при условиях культивирования низкого прикрепления.

Фиг. 24 обеспечивает диаграмму, демонстрирующую эффект предварительной обработки с помощью антипрогастриновых моноклональных антител на экспрессию маркера АЬОН1 раковой стволовой клетки в Т84 клетках метастатического колоректального рака.

Фиг. 25 обеспечивает диаграмму, демонстрирующую эффект предварительной обработки с помощью антипрогастриновых моноклональных антител на экспрессию маркера АЬОН1 раковой стволовой клетки в 8^620 клетках метастатического колоректального рака.

Фиг. 26 обеспечивает диаграмму, демонстрирующую эффект предварительной обработки с помощью антипрогастриновых моноклональных антител на образование сфероидов Т84 клетками метастатического колоректального рака, выращенными при условиях культивирования низкого прикрепления.

Фиг. 27 обеспечивает диаграмму, демонстрирующую эффект предварительной обработки с помощью антипрогастриновых моноклональных антител на образование сфероидов 8\У620 клетками метастатического колоректального рака, выращенными при условиях культивирования низкого прикрепления.

Фиг. 28 обеспечивает диаграмму, демонстрирующую эффект лечения при использовании антипрогастриновых моноклональных антител у мышей, которые несут ксенотрансплантаты человеческого метастатического колоректального рака, на способность клеток метастатического колоректального рака, изолированных из ксенотрансплантата расти в виде сфероидов при условиях культивирования низкого прикрепления.

Фиг. 29 обеспечивает диаграмму, демонстрирующую эффект лечения при использовании антипрогастриновых моноклональных антител у мышей, которые несут ксенотрансплантаты человеческого метастатического колоректального рака, на способность клеток метастатического колоректального рака, изолированных из ксенотрансплантата, инициировать рост новых опухолей при трансплантации другим мышам.

Фиг. 30 обеспечивает аминокислотные последовательности препрогастрина (8ЕО ГО N0:100), где последовательность сигнального пептида является подчеркнутой, зрелого человеческого прогастрина (8ЕО ГО N0:101) и некоторых продуктов процессинга прогастрина, включая 034 (8Е0 ГО N0:102), 034О1у (8ЕО ГО N0:103), 017 (8ЕО ГО N0:104), О17-О1у (8ЕО ГО N0:105) и СТЕР (8ЕО ГО N0:106).

Фиг. 31 обеспечивает полинуклеотидные и аминокислотные последовательности вариабельных легких и вариабельных тяжелых цепей конкретных типичных мышиных анти-ЬРО моноклональных антител. В каждом случае три СОК показаны в виде текста, выделенного жирным шрифтом с подчеркиванием. В частности:

Фиг. 31А обеспечивает полинуклеотидную последовательность У_Н цепи мышиного анти-ЬРО МАЬ3 (8Е0 ГО N0:12) и полинуклеотидную последовательность, которая ее кодирует (8Е0 ГО N0:16);

Фиг. 31В обеспечивает полинуклеотидную последовательность У_ъ цепи мышиного анти-ЬРО МАЬ3 (8Е0 ГО N0:13) и полинуклеотидную последовательность, которая ее кодирует (8Е0 ГО N0:17);

Фиг. 31С обеспечивает полинуклеотидную последовательность У_Н цепи мышиного анти-ЬРО МАЬ4 (8Е0 ГО N0:14) и полинуклеотидную последовательность, которая ее кодирует (8Е0 ГО N0:18);

Фиг. 31Ό обеспечивает полинуклеотидную последовательность У_ъ цепи мышиного анти-ЬРО МАЬ4 (8Е0 ГО N0:15) и полинуклеотидную последовательность, которая ее кодирует (8Е0 ГО N0:19);

Фиг. 31Е обеспечивает полинуклеотидную последовательность У_Н цепи мышиного анти-ЬРО МАЬ8 (8Е0 ГО N0:59) и полинуклеотидную последовательность, которая ее кодирует (8Е0 ГО N0:67);

Фиг. 31Р обеспечивает полинуклеотидную последовательность У_ъ цепи мышиного анти-ЬРО МАЬ8 (8Е0 ГО N0:63) и полинуклеотидную последовательность, которая ее кодирует (8Е0 ГО N0:71);

Фиг. 31О обеспечивает полинуклеотидную последовательность УН цепи мышиного анти-ЬРО МАЬ13 (8Е0 ГО N0:60) и полинуклеотидную последовательность, которая ее кодирует (8Е0 ГО N0:68);

Фиг. 31Н обеспечивает полинуклеотидную последовательность У_ъ цепи мышиного анти-ЬРО МАЬ13 (8Е0 ГО N0:64) и полинуклеотидную последовательность, которая ее кодирует (8Е0 ГО N0:72);

Фиг. 311 обеспечивает полинуклеотидную последовательность У_Н цепи мышиного анти-ЬРО МАЬ16 (8Е0 ГО N0:61) и полинуклеотидную последовательность, которая ее кодирует (8Е0 ГО N0:69);

- 4 026944

Фиг. ЗН обеспечивает полинуклеотидную последовательность У_ъ цепи мышиного анти-ЬРО МАЫ6 (8ЕО ГО N0:65) и полинуклеотидную последовательность, которая ее кодирует (8Е0 ГО N0:73);

Фиг. 31К обеспечивает полинуклеотидную последовательность У_н цепи мышиного анти-ЬРО МАЫ9 (8Е0 ГО N0:62) и полинуклеотидную последовательность, которая ее кодирует (8Е0 ГО N0:70); и

Фиг. 31Ь обеспечивает полинуклеотидную последовательность У_ъ цепи мышиного анти-ЬРО МАЫ9 (8Е0 ГО N0:66) и полинуклеотидную последовательность, которая ее кодирует (8Е0 ГО N0:74).

Фиг. 32 обеспечивает прогнозируемые полинуклеотидные последовательности для гуманизированных вариабельных легких и вариабельных тяжелых цепей выбранных анти-ЬРО моноклональных антител, описанных в данной заявке. В каждом случае три ΟΌΚ показаны в виде текста, выделенного жирным шрифтом с подчеркиванием. В частности:

Фиг. 32А обеспечивает прогнозируемую аминокислотную последовательность У_н цепи гуманизированного МАЬ3 (8Е0 ГО N0:21);

Фиг. 32В обеспечивает прогнозируемую аминокислотную последовательность У_ъ цепи гуманизированного МАЬ3 (8Е0 ГО N0:22);

Фиг. 32С обеспечивает прогнозируемую аминокислотную последовательность У_н цепи гуманизированного МАЬ4 (8Е0 ГО N0:23);

Фиг. 32Ό обеспечивает прогнозируемую аминокислотную последовательность У_ъ цепи гуманизированного МАЬ4 (8Е0 ГО N0:24);

Фиг. 32Е обеспечивает прогнозируемую аминокислотную последовательность У_н цепи гуманизированного МАЬ8(а) (8Е0 ГО N0:75);

Фиг. 32Р обеспечивает прогнозируемую аминокислотную последовательность У_ъ цепи гуманизированного МАЬ8(а) (8ЕО ГО N0:76);

Фиг. 32О обеспечивает прогнозируемую аминокислотную последовательность У_н цепи гуманизированного МАЬ8(Ь) (8ЕО ГО N0:77);

Фиг. 32Н обеспечивает прогнозируемую аминокислотную последовательность У_ъ цепи гуманизированного МАЬ8(Ь) (8ЕО ГО N0:78);

Фиг. 321 обеспечивает прогнозируемую аминокислотную последовательность У_н цепи гуманизированного МАЬ8(с) (8ЕО ГО N0:79);

Фиг. 321 обеспечивает прогнозируемую аминокислотную последовательность У_ъ цепи гуманизированного МАЬ8(с) (8ЕО ГО N0:76);

Фиг. 32К обеспечивает прогнозируемую аминокислотную последовательность У_н цепи гуманизированного МАЬ13(а) (8Е0 ГО N0:80);

Фиг. 32Ь обеспечивает прогнозируемую аминокислотную последовательность У_ъ цепи гуманизированного МАЬ13(а) (8ЕО ГО N0:81);

Фиг. 32М обеспечивает прогнозируемую аминокислотную последовательность У_н цепи гуманизированного МАЬ13(Ь) (8ЕО ГО N0:82);

Фиг. 32N обеспечивает прогнозируемую аминокислотную последовательность У_ъ цепи гуманизированного МАЬ13(Ь) (8ЕО ГО N0:83);

Фиг. 320 обеспечивает прогнозируемую аминокислотную последовательность У_н цепи гуманизированного МАЬ16(а) (8ЕО ГО N0:84);

Фиг. 32Р обеспечивает прогнозируемую аминокислотную последовательность У_ъ цепи гуманизированного МАЬ16(а) (8ЕО ГО N0:85);

Фиг. 320 обеспечивает прогнозируемую аминокислотную последовательность У_н цепи гуманизированного МАЬ16(Ь) (8Е0 ГО N0:86);

Фиг. 32К обеспечивает прогнозируемую аминокислотную последовательность У_ъ цепи гуманизированного МАЬ16(Ь) (8ЕО ГО N0:87);

Фиг. 328 обеспечивает прогнозируемую аминокислотную последовательность У_н цепи гуманизированного МАЬ16(с) (8ЕО ГО N0:88);

Фиг. 32Т обеспечивает прогнозируемую аминокислотную последовательность У_ъ цепи гуманизированного МАЬ16(с) (8ЕО ГО N0:89);

Фиг. 32и обеспечивает прогнозируемую аминокислотную последовательность У_н цепи гуманизированного МАЬ19(а) (8Е0 ГО N0:90);

Фиг. 32У обеспечивает прогнозируемую аминокислотную последовательность У_ъ цепи гуманизированного МАЬ19(а) (8Е0 ГО N0:91);

Фиг. 32\ν обеспечивает прогнозируемую аминокислотную последовательность У_н цепи гуманизированного МАЬ19(Ь) (8Е0 ГО N0:92);

Фиг. 32Х обеспечивает прогнозируемую аминокислотную последовательность У_ъ цепи гуманизированного МАЬ19(Ь) (8Е0 ГО N0:93);

Фиг. 32Υ обеспечивает прогнозируемую аминокислотную последовательность У_н цепи гуманизированного МАЬ19(с) (8Е0 ГО N0:94) и

Фиг. 32Ζ обеспечивает прогнозируемую аминокислотную последовательность У_ъ цепи гуманизиро- 5 026944 ванного МЛЫ9(с) (81Т) ГО N0:95).

Подробное описание Метастаз колоректального рака

Метастаз относится к процессу, с помощью которого распространяется рак. Кратко, опухолевые клетки покидают первичную опухоль, мигрируют с помощью системы циркуляции крови или лимфатической системы к новым тканевым сайтам и образуют вторичную опухоль. Опухоли в новом тканевом сайте называются метастатическими опухолями и типично идентифицируются по источнику первичной опухоли. Например, колоректальный рак, который распространился на другие ткани называется метастатическим колоректальным раком, несмотря на локализацию вторичной, метастатической опухоли. Наиболее общими органами, в которые метастазирует колоректальный рак, представляют собой печень и легкие, но колоректальный рак может также распространяться на другие органы.

Раковые клетки часто распространяются к лимфатическим узлам вблизи первичной опухоли, что называется поражением лимфатических узлов или местно-распространенным заболеванием.

Не имея намерения быть связанным с какой-либо конкретной теорией, метастаз, как предполагается, проходит через ряд различных этапов, включая инвазию и миграцию, интравазацию, циркуляцию, экстравазацию и колонизацию, пролиферацию и ангиогенез. Во время инвазии и миграции индивидуальные клетки отсоединяются от первичной опухоли и проникают в соседнюю здоровую ткань. Для осуществления этого раковые клетки, как предполагается, подвергаются фенотипической трансформации, вызванной переходом эпителиальной клетки в мезенхимальную. Ка11ип К. и др., 1. С1ш. 1пусв1.. 119(6) (2009), 1420-28. Такие клетки могут вырабатывать ферменты, способные к деградации внеклеточного матрикса, способствуя, таким образом, миграции из первичной опухоли в окружающую здоровую ткань. Когда мигрирующая раковая клетка сталкивается с кровеносными и лимфатическими сосудами, она встраивается между выстилкой из эндотелиальных клеток сосудов и проникает в кровяное русло или лимфатическую систему. Патологическая клетка потом мигрирует по системе циркуляции крови или лимфатической системе к новому органу. Раковая клетка может потом поселяться в капиллярах или лимфатических сосудах нового органа и после вытекать из сосудов в ткань путем проникновения через эндотелий в пространство, окружающее ткань. В завершение, в процессе колонизации, пролиферации и ангиогенеза метастатическая раковая клетка поселяется в новой хозяйской ткани и начинает расти. Тогда, когда новая метастатическая опухоль достигает достаточного размера, она может секретировать ростовые факторы, такие как УЕОР, для стимуляции роста новых кровеносных сосудов в опухоли для обеспечения кислорода и питания, необходимого для быстрого роста опухоли.

Рецидивы колоректального рака

Рецидив колоректального рака определяется как возврат колоректального рака после лечения, которое явным образом вызвало исчезновение колоректального рака. Если возврат колоректального рака произошел в том же месте, что и исходная раковая опухоль или очень близко к нему, он является известным как местный рецидив. Тогда, когда возобновившийся колоректальный рак растет в лимфатических узлах или рядом с местом исходной раковой опухоли, он является известным как регионарный рецидив, и когда возобновившийся колоректальный рак метастазировал до органов или тканей, которые находятся в отдалении от места исходной раковой опухоли, он является известным как отдаленный рецидив.

Раковые стволовые клетки и колоректальный рак

Солидные опухоли с необходимостью не являются гомогенными тканями. Скорее некоторые опухоли включают множество патологических типов клеток, которые обладают различными фенотипическими и функциональными свойствами. В этой связи такие опухоли являются аналогичными патологическим органам. Одно важное отличие среди клеток, составляющих солидные опухоли, заключается в степени, до которой они являются способными к инициации образования новой опухоли тогда, когда пересаживаются в новый сайт в том же хозяине, или новому хозяину того же или отличного видов. Клетки, обладающие этой способностью, являются известными как клетки, инициирующие опухоль или рак, или, альтернативно, опухолевые или раковые стволовые клетки. В противовес этому, некоторые стволовые клетки, составляющие опухоль, имеют значительно сниженный потенциал для инициации новых опухолей после трансплантации, даже тогда, когда используется намного больше клеток. В одном нелимитирующем примере несколько сотен раковых стволовых клеток толстого кишечника, которые имеют происхождение от опухолей человека, было достаточно для инициации новой опухоли после трансплантации мышам, в то время как 10000 нестволовых клеток из опухоли было недостаточно для осуществления этого. Эа1егЬа Р. и др., 2007, РНепоКрК сНагаЧеп/аОоп о£ Ьишаи со1огес1а1 сапсег Чет се11в, Ргос. №11. Лсай. 8с1. И8Л, 104:10158-10163.

Во многих опухолях раковые стволовые клетки включают относительно небольшую часть от всех жизнеспособных клеток, которые существуют в опухоли. В противовес этому, основная часть опухолевых клеток, составляющих массу опухоли, является неспособной инициировать появление новой опухоли при трансплантации. Однако в некоторых опухолях раковые стволовые клетки могут составлять большинство или даже все клетки, составляющие опухоль. Как используется в данной заявке, выражение масса опухолевых клеток относится к опухолевым клеткам, неспособным к инициации новых опухолей при трансплантации, за исключением тех случае, когда используется большое количество таких клеток.

- 6 026944

Раковые стволовые клетки также имеют фенотипические характеристики, отличные от массы опухолевых клеток, включая способность к самовосстановлению и формирование новой опухоли при трансплантации относительно небольшого количества раковых стволовых клеток и экспрессию различных маркеров, которые определяются с помощью сортировки флуоресцентно-активированных клеток (РАС8) или других анализов. Другие отличия между раковыми стволовыми клетками и массой опухолевых клеток также являются возможными.

Не имея намерения быть связанным с какой-либо конкретной теорией операции, раковые стволовые клетки, как предполагается, имеют сходные свойства с нормальными стволовыми клетками, которые в контексте раковых стволовых клеток осуществляют свой вклад в начало развития опухолей. В частности, раковые стволовые клетки подвергаются ассиметричному клеточному делению с образованием двух типов дочерних клеток. Первые остаются недифференцированными и сохраняют характеристики своей родительской стволовой клетки, которая является способной восстановить себя саму до бесконечности. Другая дочерняя клетка, называемая клеткой-предшественником, является способной к делению и дифференциации, хотя и ошибочно, для того, чтобы давать начало спектру более дифференцированных клеток, которые обнаруживаются во многих солидных опухолях. Клетки-предшественники пролиферируют с более высокой скоростью, чем стволовые клетки и, таким образом, осуществляют свой вклад в физический рост опухоли, в то время как стволовые клетки являются ответственными за способность опухоли к неограниченному росту путем генерации новых клеток-предшественниц.

Эти свойства позволяют раковым стволовым клеткам давать начало, в конечном счете, большому количеству клеток, которые составляют растущую опухоль. Таким образом, при трансплантации в новое животное раковые стволовые клетки могут воссоздавать тип опухоли, от которой они происходят, даже после многократных серийных трансплантаций. Однако раковые стволовые клетки, в отличие от нормальных стволовых клеток, несут генетические мутации и/или эпигенетические изменения, которые могут приводить к измененным моделям пролиферации и/или низким показателям апоптоза, а также приводить к ошибочной дифференциации, вызывая аккумуляцию патологических клеток, которые могут составлять массу опухоли.

Раковые стволовые клетки могут быть идентифицированы в соответствии с рядом фенотипических характеристик, которые отличают их от массы опухолевых клеток. Прежде всего, как было указано выше, раковые стволовые клетки обладают способностью инициировать новую опухоль при трансплантации в нового хозяина. В противовес этому, масса опухолевых клеток является либо неспособной к инициации новой опухоли, либо требует значительно большего количества клеток, чем в случае раковых стволовых клеток для достижения инициации новой опухоли. Раковые стволовые клетки являются также способными к идентификации в соответствии с их экспрессией или неэкспрессией определенных маркеров, в то время как масса опухолевых клеток из той же опухоли имеет различные модели экспрессии маркера. Раковые стволовые клетки по сравнению с массой опухолевых клеток также обладают преимущественной способностью расти в свободной от сыворотки среде при условиях культивирования низкого прикрепления. Другие фенотипические отличия, обеспечивающие возможность отличить раковые стволовыми клетками от массы опухолевых клеток, также являются возможными.

Как указано выше, раковые стволовые клетки могут также быть идентифицированы в соответствии с моделями экспрессии определенных маркеров, либо отдельно, либо в комбинации с другими. Однако раковые стволовые клетки из различных опухолей могут демонстрировать различные фенотипы маркеров. Такие маркеры включают белки, которые экспрессируются в клетке или на поверхности клетки и могут определяться при использовании разнообразных методик, включая, но без ограничения, иммуногистохимию, иммунофлуоресценцию и РАС8 анализ. Другие методики для определения маркера являются также возможными в соответствии со знаниями квалифицированного специалиста в данной области техники. Маркеры также включают белки, активность которых может быть оценена функционально в раковых стволовых клетках. Неограничивающие примеры типов маркеров включают белкитранспортеры, такие как те, которые экспортируют вещества из клеток или переносят вещества в клетки, ферменты, такие как ферменты, нейтрализующие вредные вещества.

Типичные маркеры, которые могут использоваться для идентификации стволовых клеток колоректального рака, включают, но без ограничения, таковыми: СЭ133, СЭ44. СЭ166, ЕрСАМ и ЬОК5. Другие маркеры, полезные для идентификации стволовых клеток колоректального рака, также являются возможными. В некоторых случаях отсутствие экспрессии маркера является показательным для фенотипа раковой стволовой клетки. В дополнение к этому, альдегид дегидрогеназа 1 (АЬОН1) представляет собой фермент, нейтрализующий вредные вещества, и раковые клетки могут подвергаться анализу на повышенную активность АЬОНР другой маркер для раковых стволовых клеток.

Стволовые клетки колоректального рака могут быть идентифицированы с помощью следующего маркерного фенотипа при использовании РАС8 или других методик, которые являются известными квалифицированному специалисту в данной области техники: ЕрСАМ(Ы)СО44(+),

ЕрСАМ(Ы)СО44(+)СО166(+), СО133(+), АЬОН1(+), С0133(-)/АЬОН1(+), СП44(1)/СП24(1) или

ЬОК5(+). Экспрессия других маркеров, их комбинаций и моделей может также использоваться для идентификации раковых стволовых клеток при этих видах рака, а также других типов рака.

- 7 026944

Они также могут быть идентифицированы при использовании РАС8 анализа как такие клетки, которые отсортированы в так называемую побочную популяцию в соответствии с их предпочтительной способностью исключать определенные красители. Одним из примеров такого красителя является краситель 33342 НоесЬкЕ

Как указано выше, раковые стволовые клетки могут также отличаться от массы опухолевых клеток своей повышенной способностью инициировать рост новой опухоли после трансплантации новому хозяину. Таким образом, один способ для подтверждения идентичности популяции клеток, которые, как предполагается, представляют собой раковые стволовые клетки, заключается в анализе их способности инициировать опухолевый рост после трансплантации в реципиентное животное, отличное от человека, относительно небольшой популяции таких клеток по сравнению с массой опухолевых клеток.

Способы трансплантации, полезные для оценки, содержит ли опухоль или клеточная линия раковые стволовые клетки известны квалифицированному специалисту в данной области техники. Опухоль или ее часть, которые предполагаются как такие, которые содержат раковые стволовые клетки, выделяют, например, хирургически удаляют. После этого опухолевую ткань измельчают и обрабатывают ферментами, или подвергают другой обработке, эффективной для дезагрегации опухоли и высвобождают составляющие ее клетки. Альтернативно, когда линия клеток подвергается анализу, необходимо только диссоциировать клетки с помощью ферментативной или химической обработки.

После получения клеточной суспензии клетки собирают путем центрифугирования, и субпопуляции, известные как такие, которые соответствуют раковым стволовым клеткам, изолируют в соответствии со способами, известными в области техники. Такие клетки экспрессируют некоторые маркеры, показательные для раковых стволовых клеток, которые можно определить при использовании специфических антител и сортировки флуоресцентно-активированных клеток (РАС8). Субпопуляции, которые предполагаются как таковые, которые содержат раковые стволовые клетки, также могут быть выделены в соответствии с другими фенотипическими характеристиками, такими как их способность исключать некоторые красители.

После выделения соответствующей клеточной популяции, предварительно определенное количество таких клеток потом имплантируют в одну или более целевых тканей или органов реципиентного животного. В некоторых случаях реципиентное животное представляет собой иммунодефицитную мышь, включая, но без ограничения таковыми, голых мышей, мышей с тяжелым сочетанным иммунодефицитом (8СГО) и не страдающих ожирением диабетических 8СГО (Ν0Π-8ΟΌ) мышей. Могут также использоваться другие виды в соответствии со знаниями квалифицированного специалиста в данной области техники.

Клетки могут быть имплантированы подкожно, в скопление жировой ткани (такое, как скопление жировой ткани в молочной железе мышей), в мозг, слепую кишку, поджелудочную железу или печень, или в почку (как например, в почечную капсулу). Клетки также могут имплантироваться в другие органы и ткани. В некоторых случаях целевая ткань или орган выбирается для воспроизведения ткани или органа происхождения опухоли при анализе. Иногда выбирают отличные ткани или органы, в которые пересаживают имплантированные клетки. Раковые стволовые клетки толстого кишечника могут быть трансплантированы в почечную капсулу Ν0Ό-8ΟΌ мышей для оценки их способности инициировать новую опухоль.

После имплантации, которую осуществляют при использовании методик, известных специалисту, клетки оставляют без вмешательства для определения, будет ли новая опухоль расти в сайте имплантации. Для клеток, имплантированных подкожно, опухолевый рост может определяться с помощью визуальной оценки и пальпации сайта трансплантации. Если опухоль растет, то ее размер может измеряться в течение времени при использовании штангенциркуля. В случае клеток, имплантированных во внутренний орган, животное может быть умерщвлено в определенный момент времени после имплантации для определения, присутствует ли опухоль, и если это так, то каков ее размер. Альтернативно, в соответствии со знаниями квалифицированного специалиста в данной области техники могут использоваться неинвазивные методики для оценки опухолевого роста.

Фенотип раковой стволовой клетки также характеризуется преимущественной способностью раковых стволовых клеток расти в виде сфероидов в среде, свободной от сыворотки и при условиях культивирования с низким прикреплением, в то время как масса опухолевых клеток с меньшей вероятностью является способной расти в виде сфероидов при тех же условиях. Сфероиды представляют собой компактные шарики клеток, которые формируются, поскольку некоторые клетки растут в культуре после посева в культуре в виде дезагрегированной суспензии. Образование таких сфероидов усиливается тогда, когда клетки выращивают в среде, свободной от сыворотки, обычно в присутствии специфических ростовых факторов (включая, но без ограничения, эпидермальный фактор роста (БОР) и основной фактор роста фибробластов (ЬРОР)), и чашки для культуры тканей имеют поверхности, к которым клетки млекопитающих слабо прилипают. Подобно стволовым клеткам из нормальных тканей, было обнаружено, что раковые стволовые клетки преимущественно растут в виде сфероидов при приемлемых условиях культивирования. См., например, Карра О., и др., Ехр. Се11 Кек., 314: 2110 (2008); 8ш§Ь 8.К. и др., Сапсег Кек., 63: 5821 (2003); Рапд Ό. и др., Сапсег Кек., 65: 9328 (2005). В противовес этому, масса опухолевых

- 8 026944 клеток, которая имеет тенденцию быть более дифференцированной, с меньшей вероятностью формирует сфероиды при тех же условиях культивирования. Когда масса опухолевых клеток является способной формировать сфероиды, они могут иметь тенденцию быть мельче и/или в меньшем количестве по сравнению с теми, которые образованы подобным количеством раковых стволовых клеток.

Раковые стволовые клетки и рецидивы колоректального рака

Опухолевые клетки со свойствами раковых стволовых клеток были идентифицированы как такие, которые демонстрируют повышенную устойчивость к облучению и/или химиотерапевтическим агентам. Были предложены различные молекулярные механизмы для объяснения устойчивости к облучению или химиотерапевтическим агентам. Например, сообщалось, что определенные раковые стволовые клетки могут быть способными к более легкому восстановлению своей ДНК после генотоксических инсультов, в то время как другие раковые стволовые клетки экспрессируют высокие уровни антиапоптических белков или молекулярных насосов, эффективных для устранения химиотерапевтических агентов, поступивших в такие клетки. Еу1ег С.Е. и ΕΝ. ΡΚΙι, I Сйи. Опсо1., 26: 2839-2845 (2008). То, что раковые стволовые клетки пролиферируют более медленно, чем клетки-предшественники, может также объяснить сравнительную способность стволовых клеток выживать при воздействии облучения и токсических химиотерапевтических агентов, которые могли бы уничтожить массу опухолевых клеток.

Не имея намерения связываться с какой-либо конкретной теорией операции, наблюдение того факта, что раковые стволовые клетки являются устойчивыми к облучению и химиотерапии, может объяснить явление рецидивов у раковых пациентов, подвергнутых лечению с помощью таких способов терапии. Еу1ег, выше. У таких пациентов лечение изначально является эффективным, вызывая явное исчезновение опухолей на диагностических снимках, но опухоли появляются повторно через некоторое время после окончания лечения.

В отношении роли раковых стволовых клеток в механизме рецидивов следует сказать, что предполагается, что в то время как большинство или даже вся масса опухолевых клеток уничтожается с помощью терапии, остается ряд жизнеспособных раковых стволовых клеток, которые выживают благодаря своей повышенной способности противостоять воздействиям облучения или химиотерапии. После завершения терапии эти выжившие клетки продолжают расти, позволяя осуществить повторное образование исходной опухоли или формирование новых опухолей. В подтверждение этой теории было сообщено, что лечение мышей с помощью химиотерапевтического агента вызвало сокращение объема опухоли, инициированной из клеток колоректального рака, но повышало количество раковых стволовых клеток в опухолях. Эу11а 8.1, и др., 2008, Со1отес!а1 Сапсег 81еат Се1к Аге ЕттсЬеб ίη Хеноденею Титотк Ео11о\\ίη§ СЬето1етару, РЬо8 ΟΝΕ, 3 (6): е2428.

Успехи в понимании роли прогастрина в колоректальном раке

Неожиданно было обнаружено, что существует чувствительные к прогастрину клетки метастатического колоректального рака и стволовые клетки колоректального рака, как демонстрируется способностью определенных антител, которые специфически связываются с прогастрином (РО), ингибировать рост таких клеток ίη уйго или ίη νί\Ό.

РО-чувствительная клетка колоректального рака представляет собой такую, которая, по крайней мере, частично зависит от прогастрина для своего выживания и/или роста, непосредственно или опосредованно. Не имея намерения связываться с какой-либо конкретной теорией операции, предполагается, что определенные анти-РО антитела являются эффективными для ингибирования выживания и/или роста таких клеток путем связывания с РО и блокирования РО-зависимого пути передачи сигнала. Прогастрин, таким образом, устраняется из опосредования эффектов, способствующих их выживанию и/или росту. Могут существовать другие механизмы, с помощью которых анти-РО антитела ингибируют выживание и/или рост клеток колоректального рака, и конкретный механизм действия не является предназначенным для ограничения объема настоящей заявки.

Как описывается более подробно в примерах, заявители неожиданно обнаружили, что ген гастрина (ОА8Т) экспрессируется в шести различных линиях клеток первичного колоректального рака человека, НТ29, НСТ116, РКО, 8\У480, ΌΕΌ1 и СКС1 клетках и в двух различных линиях клеток метастатического колоректального рака человека, 8\У620 и Т84 клетках. Касательно данных, полученных из экспериментов ίη уйто, заявители неожиданно обнаружили, что ген гастрина экспрессируется в первичной колоректальной опухоли и соответствует колоректальным метастазам, полученным от каждого из 11 различных пациентов, несмотря на то, что по отношению к уровням в первичных опухолях уровень экспрессии в соответствующих метастазах варьирует среди различных пациентов. Поскольку прогастрин представляет собой продукт гена гастрина (вместе с другими пептидами, которые подвергаются посттрансляционному процессингу из продукта того же гена), эти данные предполагают, что первичные и метастатические колоректальные опухоли секретируют прогастрин. Дополнительные эксперименты, как объясняется ниже, подтверждают это.

Во-первых, заявители подтвердили, что определяемые количества РО белка были секретированы в ростовую среду 8\У620 и Т84 клетками (но не при использовании Со1о-205 клеток). Кроме того, заявители продемонстрировали, что пациенты, имеющие только первичный колоректальный рак, первичный и метастатический колоректальный рак одновременно, и метастатический колоректальный рак после уда- 9 026944 ления первичной опухоли, все имели уровни РО в своей крови, которые были статистически значительно выше, чем в крови здоровых контролей. Эти результаты свидетельствуют о том, что первичные и метастатические колоректальные опухоли секретировали РО, который непосредственно или опосредованно попадает в кровяное русло. Таким образом, повышенные уровни РО в крови являются показательными для присутствия первичного, а также метастатического колоректального рака. В соответствии с этим, способы настоящей заявки обеспечивают способы определения или диагностики присутствия как первичного, так и метастатического колоректального рак в различных популяциях пациентов.

Заявители также неожиданно обнаружили, что определенные анти-РО антитела, то есть, нейтрализующие антитела, являются способными ингибировать рост клеток метастатического колоректального рака в культуре. В частности, заявители экспериментально продемонстрировали, что анти-РО поликлональные антитела и четыре различных анти-РО моноклональных антитела были способными ингибировать рост 8А620 клеток, которые выращиваются в культуре. Подобно этому, рост Т84 клеток ингибировался с помощью инкубации с анти-РО моноклональным антителом. Эти данные демонстрируют, что нейтрализующие анти-РО антитела являются способными предотвращать рост клеток метастатического колоректального рака, и что такие клетки, таким образом, являются чувствительными к РО. Эти данные дополнительно свидетельствуют о том, что терапевтически эффективные количества таких антител, при введении субъекту, который нуждается в лечении метастатического колоректального рака, будут эффективными для лечения таких метастазов.

Проведенные дополнительные эксперименты у голых мышей расширили и подтвердили эксперименты заявителя' ίη νίίτο. Таким образом, заявители вводили метастатические 8А620 клетки в селезенки голых мышей. Сразу после этого селезенки удаляли, и мышам вводили анти-РО моноклональное антитело в течение курса лечения. Контрольных животных обрабатывали подобным образом, но осуществляли инъекции с помощью контрольного антитела. Через шесть месяцев лечения мышей умерщвляли, подсчитывали количество и вес метастазов, которые образовались в печени. Неожиданно заявители обнаружили, что среднее значение количества метастазов статистически значимым образом снижалось до 41% у обработанных животных против контрольных животных. Эти объединенные данные подтверждают тот факт, что нейтрализующие анти-РО антитела являются способными ингибировать рост метастатического колоректального рака ίη νίνο и демонстрируют, что терапевтически эффективные количества таких антител при введении субъекту, который нуждается в лечении метастатического колоректального рака, являются эффективными для лечения таких метастазов.

Дополнительные эксперименты, проведенные заявителем ίη νίίτο и ίη νίνο, неожиданно продемонстрировали, что первичный и метастатический колоректальный рак содержат стволовые клетки колоректального рака, которые являются чувствительными к РО и что нейтрализующие анти-ЬРО антитела являются способными ингибировать рост таких клеток.

В одном эксперименте заявители продемонстрировали, что рост клеточных линий первичного (НТ29, НСТ116, СКС1) и метастатического (8А620 и Т84) колоректального рака при условиях культивирования с низким прикреплением повышает соотношение клеток, экспрессирующих ЬОК5, фенотипический маркер стволовых клеток колоректального рака. Такие условия культивирования выбирают для преимущественного роста раковых стволовых клетками по сравнению с субпопуляцией нестволовых клеток, и повышенная экспрессия ЬОК5 подтверждает тот факт, что как первичный, так и метастатический колоректальный рак, содержат раковые стволовые клетки.

Заявители также открыли, что условия низкого прикрепления повышают уровень экспрессии гена гастрина в тех же клетках по сравнению с ростом клеток при обычных условиях. Эти данные дают возможность предположить, что экспрессия гена гастрина является более высокой в стволовых клетках колоректального рака, как из первичного, так и метастатического колоректального рака, по сравнению с нестволовыми клетками в той же популяции, это предполагает также, что уровень секретированного прогастрина будет также более высоким. Заявители подтвердили экспрессию прогастрина в СКС1, НТ29, 8А620 и Т84 клетках на различных уровнях при выращивании в условиях низкого прикрепления, что дает возможность предположить, что эти клеточные линии содержат чувствительные к РО стволовые клетки колоректального рака.

Заявители подтвердили это путем обработки клеток первичного и метастатического колоректального рака, выращенных при условиях низкого прикрепления, с помощью анти-ЬРО антител, и неожиданно обнаружили, что количество сформировавшихся так называемых клеточных сфероидов снижалось по сравнению с обработкой при использовании контрольного антитела. Поскольку образование сфероидов при условиях низкого прикрепления представляет собой свойство стволовых клеток колоректального рака, но не субпопуляции нестволовых клеток, этот результат интерпретируется до понимания, что антиЬРО антитела являются эффективными для ингибирования роста стволовых клеток колоректального рака, как при первичном, так и метастатическом колоректальном раке.

Например, обработка НТ29, НСТ116 и СКС1 клеток, все из которых являются клетками первичного колоректального рака, с помощью анти-ЬРО поликлональных антител приводила к сниженному образованию сфер. Дополнительное исследование НСТ116 и НТ29 клеток обнаружило подобный эффект на рост сфер при использовании субпопуляции позитивных по ЬОК5 раковых стволовых клеток для двух

- 10 026944 различных анти-ЬРО моноклональных антител. Интересно отметить, что удаление антител путем промывания, после чего осуществляли постоянную инкубацию в течение 17 дней при отсутствии прибавленных антител, не приводило к повышенному количеству сфер, это дает возможность предположить, что ингибирующий эффект анти-ЬРО антител на стволовые клетки колоректального рака был перманентным и не зависел от их постоянного присутствия. Обработка СКС1 клеток четырьмя различными анти-ЬРО моноклональными антителами была также эффективной для снижения образования сфер. Кроме того, предварительная обработка СКС1 клеток, которые выращивали при обычных условиях с тем же набором антиЬРО моноклональных антител, снижала количество позитивных по ЛЬОН1 клеток, а также количество сфероидов, образовавшихся после того, как предварительно обработанные клетки переносили в условия культивирования с низким прикреплением. Три из этих антител узнавали С-терминальную часть РО, в то время как одно узнавало Ν-терминальную часть.

Подобные результаты были получены тогда, когда анализировали клеточные линии метастатического колоректального рака. Таким образом, после изоляции субпопуляции Т84 клеток, позитивных по ДЬОНЕ другого маркера для стволовых клеток колоректального рака, количество сфероидов, которое образовывали такие клетки, снижалось зависимым от дозы образом путем обработки с помощью антиЬРО моноклонального антитела по сравнению с контрольным антителом. Подобно этому, предварительная обработка Т84 и 8\У620 клеток, которые выращивали при традиционных условиях с тем же анти-ЬРО моноклональным антителом, снижала количество позитивных по ЛЬОН1 клеток, как и количество сфероидов, образовавшихся после того, как предварительно обработанные клетки переносили в условия культивирования при низком прикреплении. Факт в том, что ингибирующий эффект в отношении роста был выше, чем таковой для 5-фторурацила, химиотерапевтического лекарственного средства. Эти данные подтверждают неожиданное заключение о том, что клетки метастатического колоректального рака содержат чувствительные к прогастрину стволовые клетки, рост которых может ингибироваться путем обработки с помощью специфического анти-ЬРО моноклонального антитела.

Как было описано ранее, одно из характерных свойств раковых стволовых клеток заключается в их способности инициировать новую опухоль после трансплантации. Для подтверждения способности антиЬРО антител ингибировать стволовые клетки колоректального рака заявители проанализировали эффект специфического анти-ЬРО моноклонального антитела на способность клеток метастазов колоректального рака печени расти в виде сфероидов в культуре и инициировать образование новых опухолей после трансплантации. Как объясняется дополнительно в примерах, заявители вводили метастатические 8\У620 клетки в селезенки голых мышей. Сразу же после этого селезенки удаляли и мышам вводили анти-РО моноклональное антитело в течение курса лечения. Контрольных животных подвергали подобной обработке, но вводили контрольное антитело.

После шести недель лечения мышей забивали и колоректальные метастазы, образовавшиеся в печени, вычленяли и потом обрабатывали для высвобождения клеток метастатического колоректального рака. Потом клетки подвергали анализу на их способность формировать сфероиды в культуре с низким прикреплением и образовывать новые опухоли после трансплантации в новых мышей. Оба эти свойства являются характерными для стволовых клеток колоректального рака.

Результаты подтвердили ингибирующий эффект анти-ЬРО антител на рост стволовых клеток колоректального рака. Во-первых, заявители обнаружили более слабое образование сфероидов в культуре низкого прикрепления, состоящей из клеток метастатического колоректального рака, изолированных из печеней животных, обработанных с помощью специфических антител, по сравнению с контролями. Кроме того, заявители также обнаружили, что тогда, когда клетки из сфероидов вводили подкожно в голень двух новых исследуемых животных, размер опухолей, вырастающих ίη νίνο из клеток, обработанных с помощью специфического антитела, был в среднем значительно меньше, чем те, которые вырастали из клеток, обработанных ίη νίνο с помощью контрольного антитела. Эти очевидные результаты демонстрируют, что обработка клеток метастатического колоректального рака ίη νίνο с помощью антитела, специфического для ЬРО, снижает количество стволовых клеток колоректального рака в метастатических опухолях.

На основе неожиданных и очевидных результатов, описанных выше, лечение пациентов с помощью анти-ЬРО антитела предполагаются как такое, которое будет эффективным для предотвращения рецидивов первичного или метастатического колоректального рака. Кроме того, ингибиторный эффект антител на рост таких стволовых клеток может не требовать постоянного присутствия анти-ЬРО антител.

Антитела

Антитела, пригодные для осуществления способа и раскрытые в данной заявке, являются такими, которые, в частности, связывают человеческий прогастрин лучше, чем другие продукты гастринового гена. Как проиллюстрировано на фиг. 30, ген гастрина транслируется в полипептид, содержащий 101 аминокислоту, называемый пре-прогастрин, который содержит сигнальную последовательность (подчеркнута), которая отщепляется, что приводит к образованию прогастрин, полипептида, содержащего 80 аминокислот. Прогастрин, в свою очередь, расщепляется с образованием продукта из 34 аминокислот, соответствующей последовательности остатков 38-71 прогастрина, который потом удлиняется на своем карбокситерминальном конце с помощью остатка глицина, образуя удлиненный глицином О34 (О34- 11 026944

01у) продукт. Побочный продукт этого расщепления представляет собой пептид, состоящий из 6 аминокислот, называемый С-терминальным фланкирующим пептидом, или СТЕР, который соответствует последовательности остатков 75-80 прогастрина. О34-О1у потом дополнительно расщепляется с образованием полипептида из 17 остатков, соответствующего последовательности остатков 55-71 прогастрина и обозначается как О17-О1у. Удаление С-терминальных глицинов О34-О1у и О17-О1у, после чего осуществляется С-терминальное амидирование, обеспечивает 034 и 017, соответственно, которые оба являются С-терминально амидированными.

Как используется в данной заявке, антитело является высоко специфическим для №0 или высоко специфически связывает №0, если он связывается с полноразмерным прогастрином, но не связывается вообще с СТЕР, амидированным гастрином, или с удлиненным глицином гастрином, и является специфическим для №0 или специфически связывает №0, если он демонстрирует, по крайней мере, приблизительно в 5 раз большее связывание №0, чем СТЕР и другие продукты гастринового гена, как измеряется в стандартных анализах связывания. Специфический анализ ЕЬРЗА, который может использоваться для оценки специфичности определенного анти-№0 антитела, обеспечивается в Примере 21.

Такие высоко специфические и/или специфические анти-№0 антитела (в данной заявке называются как анти-№0 антитела) могут быть поликлональными (анти-№0 РЛЪ) или моноклональными (анти№0 МАЪ), хотя для терапевтических применений и, в некоторых случаях, диагностических или других ίη νίίΓΟ применений моноклональные антитела являются предпочтительными.

Эпитоп, который связывается анти-№0 антителом, не является критическим. Полезные анти-№0 антитела могут связывать ^терминальный участок №0, С-терминальный участок №0 или другой участок №0. Недавно было продемонстрировано, что по крайней мере для моноклональных анти-№0 антител, выбор антигена, который используется для того, чтобы вызвать образование анти-№0 антител, может быть важным (смотри международную заявку РСТ/ЕР2010/006329, поданную 15 октября 2010 года, и заявку США № 12/906,041, поданную 15 октября 2010 года, раскрытия и, в частности, раскрытые анти№0 антитела, которые являются введенными в данную заявку в качестве ссылки; далее упоминаются как '329 и '041 заявки, соответственно). Как раскрывается в заявках '329 и '041, не все антигены, которые имеют происхождение от №0, стимулируют образование моноклональных антител, которые, в частности, связывают №0 при физиологических условиях. Действительно, некоторые антигены, которые успешно использовались для получения поликлональных анти-№0 антител, таких как полноразмерный рекомбинантный №0 (смотри, например, \У0 08/076454, которая относится к δίηβΐι) и пептид, соответствующий последним десяти аминокислотам на С-терминальном конце №0 (см. \У0 07/135542, которая относится к Но11апйе и др.), были неуспешными в получении моноклональных антител. Как указывается в '329 и '041 заявках, антигенные ^терминальные и С-терминальные последовательности в пределах №0 последовательности были идентифицированы как такие, которые могут использоваться для получения моноклональных антител, которые, в частности, связывают №0. Интересно отметить, что необходимая антигенная последовательность не является ограниченной участками №0 последовательности, которые являются уникальными для нее. Пептидные антигены, имеющие участки последовательности наряду с другими продуктами гастринового гена, например, 017, 034 и СТЕР, обеспечивают получение моноклональных антител, которые не только связывают №0, но связывают его специфически.

Анти-№0 антитела, получаемые при использовании пептидного антигена, имеющего последовательность, соответствующую ^терминальному участку №0, и/или такие, которые связывают N терминальный участок №0, называются в данной заявке '^-терминальными анти-Р0 антителами. Специфический типичный антигенный участок №0, который может использоваться для конструирования иммуногена, приемлемого для получения как поликлональных, так и моноклональных антител, специфических для №0, соответствует остаткам 1-14 №0: 5>\УКРК5>ССРОАРЕС (8ЕС ГО N0:25). Типичные иммуногены, полезные для получения ^терминальных анти-№0 антител, а также последовательности СИК и ν_Η и ν₄ ^терминальных анти-№0 моноклональных антител, полученные при использовании этих типичных иммуногенов, обеспечиваются в табл. 1А, приведенной ниже, и в разделе Примеры.

- 12 026944

ТАБЛИЦА 1А Ν-терминальные анти-НРС моноклональные антитела
Иммуноген	Гибрндома (депозит. №)	МАЬ	Последовательности мышиных СОК	Последовательности МЫШИНЫХ Уц н У_Ь	Гуманизированные последовательности У_н и Уц (и рогноз ируемые)
N1	43В9СИ	МАЫ
N1	\УЕ5Н2С7	МАЬ2
N2	6В5В11С10	МАЬЗ	ν_Η СЬК 1.3	0ΥΙΡΤ8ΥΑΥ	(ЗЕрГО N0:1)	тУ_н.З	(5Е0 ГО N0.12)	ЬУн.З	(5Е0 ГО N0:21)
			ν_Η СРК 2,3	ΡΥΡΟΝ5Ο5	(3Ε0ΙΟ N0:2)
			ν_Η СИЕ. 3.3	тккозроу	(ЗЕО ΙΟ N0:3)
			У..СОК 1.3	Ο5ΐνΗ3ΝΌΝΤΥ	(5Е0 ГО N0:4)	тУ_£.3	(5Е0ГО N0:13)	ЬУц.3	(5ΕΟΙϋΝΟ:22)
			ν_Ε СОК 2.3	КУЗ	(5Е0 ГО N0:5)
			У_£ СОК 3.3	Р0С5НУРРТ	(8Е<3 ГО N0:6)
N2	2СГО2СЗС2	МАЬ4	ν_Η СБК1.4	ΟΥΤΡ553\ν	(5Е0 ГО N0:7)	тУ_н.4	(5Е0ГО N0:14)	ЬУ_Н.4	(5ΕΟΙϋΝΟ:23)
			ν_Η СОК 2.4	ЕЬРСЗСЗТ	(5Е0 ГО N0:8)
			ν_Η СОК 3.4	ΑΤΟΟΝΥΟλΥΡΑΥ	(8Е<3 ГО N0:9)
			У_ЬСОК 1.4	ОЗЬУНЗЗСУТУ	(5Е0 ГО N0:10)	тУ_£.4	(5Е<ЗЮ N0:15)	ЬУь-4	(8Е<3 ΙΟ N0:24)
			ν_Ε СОК 2.4	КУ5	(8Е<3 ГО N0:5)
			У_Е СОК 3.4	8<38ТНУРРТ	(5Е0 ГО N0:11)
N2	1Е9А4А4 (1-4376)	МАМ 5
N2	1Е9Е»9В6	МАМ 6	ν_Η СОК 1.16	0ΥΤΡΤ5ΥΥ	(5Е0 ГО N0:39)	тУц.16	(5Е0ГО N0:61)	ЬУ_н.16а	(5Ε0[ϋΝΟ:84)
			ν_Η СОК 2.16	ЮТЗКСОТ	(5Е0 ГО N0:43)			ЬУ_Н.16Ь	(5ΕΟΙϋΝΟ:86)
			ν_Η СОК 3.16	ΤΚΟΟΥΥΡΕΟΥ	(5Е0 ГО N0:47)			ЬУ_н.16с	(5Ες>[ΟΝΟ:88)
			УьСРК 1.16	ОЗШАЗОСКТУ	(5Е0 ГО N0:50)	тУ_£.16	(ЗЕОГО N0:65)	ЬУсДба	(5Ε01ϋΝΟ:85)
			V,. СОК 2.16	ЬУЗ	(5Е0 ГО N0:53)			ЬУ_ь.16Ь	(5Ες>[ΟΝΟ:87)
			У_£ СОК 3.16	\Υζ)0ΤΗ5ΡΥΤ	(5Е0 ГО N0:57)			ЬУ[.16с	(5Ε0[ϋΝΟ:89)
N2	1С8П10Р5	МАМ7
				ТАБЛИЦА1А
			Ν-терминальные анти-НРС моноклональные антитела
Иммуноген	Гибрндома (депозит. К·)	МАЬ	Последовательности мышиных СОК		Последов ательности МЫШИНЫХ У_н и У_ь	Г уманизированные последовательности У_н и У_ь(прогнозируемые)
N2	1А7СЗР11	МАМ8
N2	1ВЗВ4Р11	МАЫ9	ν_Η СОК 1.19	ΟΥ5ΙΤ5ΟΥΑ	(5Е0 ГО N0:40)	тУ_н.19	(5Ε0ΙΟ N0:62)	ЬУ_н.19а	(3ΕΟΙΟΝΟ:90)
			ν_Μ СОК 2.19	Ι5Ρ5ΟΥΤ	(5Е0 ГО N0:44)			ЬУ_Н.19Ь	(5Ε<) ГО N0:92)
			Ун СОК 3.19	ΑΚΕνΝΥΟΟδΥΗΡΟΥ	(5Е0 ГО N0:48)			ЬУ_н.19с	(ЗЕО ГО N0:94)
			У,.СОК 1.19	5<3ΗΚΤΥΤ	(5Ер 10 N0:51)	тУ_£.19	(5Е<2ГО N0:66)	ЬУ[..19а	(5Ε<3ΙϋΝΟ:91)
			У_£ СОК 2,19	УККООЗН	(5Е0 ГО N0:54)			ЬУ[_,19Ь	<5ΕΟΠ>ΝΟ:93)
			У_Е СОК 3.19	0УС0А1КСрЗУРУ	(5Е0 ГО N0:58)			ЬУ[_.19с	(5Εζ> ГО N0:95)
N2	1С11Р5Е8	МАЬ20
Иммуноген N1 = 5\¥КРК800РОАРЬС-А11х-Су5-В8А, также представленный как (5Е<0 ГО МО:25\|-Айх-Су8-В5А Иммуноген N2 = З^VΚΡΚ5^^Ρ^ΑΡ^С-ΑЬx-Суί5-Κ^Η, также представленный как (5Е<2 ГО N0:25)-АЬх-Суа-КЬН

В табл. 1А все аминокислотные последовательности являются представленными при использовании традиционной Ν^-С ориентации. Для каждого иммуногена прогастриновый пептид синтезировали при использовании С-терминального линкера одного остатка аминогексаноевой кислоты (АЬх), после которого следует остаток цистеина (Сук), который потом конъюгируют с носителем, представленным либо бычьим сывороточным альбумином (В8А), либо гемоцианином лимфы улитки (КЬН), через линкерный остаток Сук.

Анти-ЬРО антитела, получаемые при использовании пептидного антигена, имеющего последовательность, соответствующую С-терминальному участку №0, и/или такие, которые связывают Стерминальный участок №0, называются в данной заявке С-терминальными анти-РО антителами. Специфический типичный антигенный участок №0, который может использоваться для конструирования иммуногена, полезного для получения как поликлональных, так и моноклональных С-терминальных антител,, соответствует остаткам 55-80 ^0Р^^ΕΕΕΕΕАΥ0^М^Ρ0КК8АΕ^ΕN (8Е0 ГО N0:27). Типичные иммуногены, полезные для получения С-терминальных анти-ЬРО антител, а также последовательности СОК и У_Н И У_ъ С-терминальных анти-ЬРО моноклональных антител, полученные при использовании этих типичных иммуногенов, обеспечиваются в табл. 1В, приведенной ниже, и в разделе Примеры:

- 13 026944

Таблица 1В
	С-терминальные анти-НРС моноклональные антитела
Иммуноген	Гибрндома (депозит. Х«)	МАЪ	Последовательности мышиных СОК	Последовательности мышиных У_н и Уь	Гуманизированные последовательности У_н и Υ\ (прогнозируемые)
С1	1В4А1Ю11 (1-4371)	МАЬ5
С1	1В6А11Р2 (1-4372)	МАЬб
С1	1В11Е4В11 (1-4373)	МАЬ7
С1	1СКЮЗВ9	МАЬ8	ν_Η СОК 1.8	СРТРТТУА	(5Е0 ГО N0:37)	пзУ_н.8 (5Εζ> ГО N0:59)	ЬУ_н.8а	<5Ε<3ΙϋΝΟ:75)
			ν_Η СОК 2.8	Ι830ΟΤΥΤ	(8Е<3 ГО N0:41)		ЬУ_Н.8Ь	(3ΕςΐΟΝΟ:77)
			ν_Η СОК 3.8	АТрСИУЗЪОР	(5Е(^ ГО N0:45)		ЬУ_н.8е	<5Ες>ΙΟΝΟ:79)
			V,. СОК 1.8	КЗЕКНТКСГГР	(5Е0 ГО N0:49)	тУь.8 (ЗЕО ГО N0:63)	ЬУ[_.8а	<3ΕΟΙϋΝΟ:76)
			ν_Ε СОК 2.8	0М5	(8Εζ> ГО N0:52)		ЬУ[_.8Ь	(5Ε<3Π5ΝΟ:78)
			ν_Ε СОК 3.8	АОт.ЕЬРЬТ	(5Е<2 ГО N0:55)		ЬУ[,8с	(5Εζ) ГО N0:76)
С1	1О8Р5ВЗ	МАЬ9
С1	1Е1С7В4	МАЫ0
С1	2В4С8С8 (1-4374)	МАЫ1
С1	2В11Е6С4 (1-4375)	МАЫ2
С1	2С6СЗС7	МАЫЗ	ν_Η СОК 1.13	ΟΡΙΡ35ΥΟ	(8Е(3 ГО N0:38)	тУ_н.13 (ЗЕ<3 ГО N0:60)	ЬУ_н.13а	(3Ε<3ΙΟΝΟ:80)
			ν_Η СОК 2.13	ΙΝΤΡΟΟΚΤ	(5Εζ) ГО N0:42)		ЬУ_Н.13Ь	<5Ε<2 ΙΟ N0:82)
			ν_Η СОК 3.13	ΑΚΟΤΟΤΥ	(8Е0 ГО N0:46)
			ν_Ε СОК 1.13	05Ι_ΙΌ5ΟΟΚΤΥ	(5Εζ) ГО N0:50)	тУ_ь13 (5 Ер ГО N0:64)	ЬУ,..13а	<5Ε<2 ΙΟ N0:81)
			V,. СОК 2.13	13/5	(8Е<3 ГО N0:53)		ЬУ[..13Ь	(5Εζ)Π5ΝΟ:83)
			ν_Ε СРК 3.13	ν/оотнррот	(5Е<2 ГО N0:56)
					Таблица 1В
			С-терминальные анти-НРС моноклональные антитела
Иммуноген	Гибрндома (депозит. Хе»	МАЬ	Последовательности мышиных СОК		Последовательности МЫШИНЫХ Уц и Уь	Гуманизированные последовательности У_н и У_ь(прогнозируемые)
С1	2Н9Р4В7	МАЫ4
С2	1Р11Р5Е10	МАЬ21
С2	1Р11Р5О9	МАЬ22
С2	1А11Р2С9	МАЬ23
Иммуноген С1 = Κ1Ή-0γ8-ΑΚχ-Α1ιχ-(2ΟΡ\νί.ΕΕΕΕΕΑΥΟλνΜΟΡΟΚΚ5ΑΕΟΕΝ, также представленный как КЬН-Суя-АЬх-АЬхДЗЕО ГО N0:27) Иммуноген С2 = 0Т-Су^Айх-Айх-0С\|Р^,АЪЕЕЕЕЕА¥С\|\УКГОРСКК8 ΑΕϋΕΝ. также представленный как ОТ-Суя-АЬх-АЬх-(5Е0 ГО N0:27)

В табл. 1В все аминокислотные последовательности являются представленными при использовании традиционной N4-0' ориентации. Для каждого иммуногена прогастриновый пептид синтезировали при использовании ^терминального линкера АЬх-АЬх-Сук, который потом конъюгируют с носителем, представленным либо гемоцианином лимфы улитки (КВИ), либо токсином дифтерии, через линкерный остаток Сук.

Специфические эпитопы, связанные с типичными анти-№0 моноклональными антителами МАЬ1МАЬ23, которые обеспечиваются в табл. 1А и 1В, картировали при использовании 8Р0Т методики и аланинового сканирования, как описывается у Ьаипе и др., 2002, 1. 1ттипо1. МеЙюХ 267:53-70 и Ьаипе, 1997, I. Вю1. С1ет. 272:30937-30944, соответственно (см. также Пример 6 заявки '329).

В методике 8Р0Т пептидные последовательности из 15 аминокислот, охватывающие путативный эпитоп, получали и переносили на нитроцеллюлозные фильтры, которые потом подвергали зондированию с исследуемым антителом для определения минимальной последовательности эпитопа, которая узнается этим антителом. Аланиновое сканирование использовали для определения остатков в пределах эпитопа, которые являются критическими для связывания антитела. Каждый остаток в пределах путативного эпитопа подвергали мутации, один за другим, до аланина, и содержащие аланин пептиды потом зондировали с исследуемым антителом.

Для ^терминальных анти-1Р0 моноклональных антител МАЬк1-4 и 15-20, эпитопы включали, по крайней мере, следующие последовательности: ОАРЬ0 (8ЕС ГО N0:28), РОАРЬ0 (8ЕС ГО N0:29), РН8(Х)Р1) (8ЕС ГО N0:30), \\'КРН8(Х)Р1) (81X) ГО N0:31) или \\'КРН8(Х)Р1)АРРС. (81)0 ГО N0:32), как показано в табл. 2А, приведенной ниже.

- 14 026944

ТАБЛИЦА 2А
МАЬ#	РС пептидный антиген: знкркзсюроарыз	8Е0 ГО ΝΟ
МАЬ2	ИКРК509РОАРЪЗ	32
МАЬ4	икркзоорраръс	32
МАЫ	РРАРЬЗ	29
МАЬЗ	РАРЪС	28
МАЫ 7	ИКРК500РР	31
МАЫ 8	ИКРК539РО	31
МАЫ 9	ИКРК500РР	31
МАЬ20	ИКРН500РР	31
МАЫ 5	ΡΚ5ΰΩΡϋ	30
МАЫ 6	РК500РР	30

Для С-терминальных анти-ЬРО моноклональных антител МАЬ§5-7, 9-12, 14 и 21-23, эпитопы включали, по крайней мере, следующие последовательности: РОКК (8ЕО ГО N0:33), МОРОК (8Е0 ГО N0:34), ΑΕϋΕΝ (8Е0 ГО N0:35), и О^МОРОКК (8Е0 ГО N0:36), как показано в табл. 2В, приведенной ниже.

Эксперименты по картированию эпитопов выявили, что анти-ЬРО МАЬ2 и МАЬ4 связывают тот же эпитоп; анти-ЬРО МАЬ1 и МАЬ3 связывают приблизительно тот же эпитоп; МАЬ17, МАЬ18, МАЬ19, и МАЬ20 связывают приблизительно тот же эпитоп; МАЬ15 и МАЬ16 связывают приблизительно тот же эпитоп; анти-ЬРО МАЬ5, МАЬ6, МАЬ7, МАЬ9, и МАЬ12 связывают тот же эпитоп и связывают приблизительно тот же эпитоп, что и анти-ЬРО МАЬ10; и анти-ЬРО МАЬ11 и МАЬ14 связывают приблизительно тот же эпитоп.

^терминальные анти-РО антитела, пригодные для заявленных способов, включают антитела, которые связывают эпитоп, включающий остатки 10-14 ЬРО (8Е0 ГО N0:28), остатки 9-14 ЬРО (8Е0 ГО N0:29), остатки 4-10 ЬРО (8ЕО ГО N0:30), остатки 2-10 ЬРО (8ЕО ГО N0:31) или остатки 2-14 ЬРО (8ЕО ГО N0:32).

Специфические С-терминальные анти-РО антитела, полезные в способах и наборах, описанных в данной заявке, включают антитела, которые связывают эпитоп, включающий остатки 71-74 - ЬРО (8Е0 ГО N0:33), остатки 69-73 - ЬРО (8ЕО ГО N0:34), остатки 76-80 ЬРО (8ЕО ГО N0:35), или остатки 67-74 ЬРО (8ЕО ГО N0:36).

^терминальные и С-терминальные анти-ЬРО антитела, полезные в способах и наборах, описанных в данной заявке, в дополнение к тем, которые обеспечиваются в табл. 1А и 1В, могут быть идентифицированы в конкурентных анализах связывания с типичными МАЬк 1-23, или с другими эталонными антителами, которые связывают N или С-терминальные эпитопы, как будет описано более подробно в разделе, приведенном ниже.

Как демонстрируется в примерах, не все анти-ЬРО антитела, даже те, которые демонстрируют высокую степень специфичности и аффинности для ЬРО, нейтрализуют биологическую активность ЬРО. Например, несмотря на то, что анти-ЬРО МАЬ14 связывает ЬРО со значением К_с приблизительно 6 пМ, оно не ингибировало, по крайней мере, при исследуемых концентрациях, рост клеток колоректального рака в анализе ίη νίίτο, в то время как другие анти-ЬРО моноклональные антитела, например МАЬ1МАЬ13 и МАЬ15-МАЬ23, демонстрировали ингибиторную активность в варьирующей степени. В то время как оба как не-нейтрализующие, так и нейтрализующие антитела, которые, в частности, связывают ЬРО, являются полезными для диагностических способов настоящей заявки, анти-ЬРО антитела, полезные для терапевтических способов, будет демонстрировать нейтрализующую активность.

Как используется в данной заявке, нейтрализующие анти-ЬРО антитело представляет собой антиЬРО антитело, которое обеспечивает статистически значимое снижение количества живых клеток колоректального рака в исследуемом образце, обработанном с помощью анти-ЬРО антитела по сравнению с контрольным образцом, обработанным с помощью неспецифического антитела. Специфический анализ для оценки способности какого-либо конкретного анти-ЬРО антитела быть нейтрализующим описывается в примере 22. Те анти-ЬРО антитела, которые демонстрируют по крайней мере приблизительно 50% снижение количества живых клеток колоректального рака в этом анализе предполагаются как особенно полезные в лечении колоректального рака, несмотря на то, что анти-ЬРО антитела, демонстрирующие

- 15 026944 более низкие уровни нейтрализующей активности, например, статистически значимое снижение 40, 30, 20, 15, или даже 10%, количества живых клеток колоректального рака в этом анализе предполагаются как такие, которые обеспечивают терапевтические преимущества. Типичные клетки для применения в этих анализах включают, но без ограничения таковыми, клеточные линии первичного и метастатического колоректального рака, описанные в данной заявке.

В соответствии с этим, в некоторых случаях анти-ЬРО антитела являются нейтрализующими. Как раскрыто в заявках '329' и '041', способность анти-ЬРО моноклонального антитела быть нейтрализующим не является зависимой от эпитопа, как ^терминальные, так и С-терминальные анти-ЬРО моноклональные антитела демонстрируют нейтрализующую активность в анализа с клетками колоректального рака. Таким образом, нейтрализующие анти-ЬРО антитела представляют собой ^терминальные нейтрализующие анти-ЬРО антитела. В других случаях нейтрализующие анти-ЬРО антитела представляют собой С-терминальные нейтрализующие анти-ЬРО антитела.

Аффинность каких-либо из специфических анти-ЬРО антитело не является критической. Однако при некоторых применениях антитела, демонстрирующие аффинности по крайней мере приблизительно 1 мкМ могут быть предпочтительными. Для терапевтических применений аффинность по крайней мере приблизительно 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, 15, 10, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1, 0,1, 0,01, 0,001 нМ или даже больше, может быть желательной. Измеренные аффинности анти-ЬРО моноклональных антител, идентифицированных в табл. 1А и 1В, колеблется от 10 до 10 М, как указано в табл. 3, приведенной ниже:

ТАБЛИЦА 3
Моноклональное антитело	Измеренная константа аффинности Κϋ (М)
Анти-ЬРО МАЬ 1	2.5 мкМ (2,5 х10'⁶М)
Анти-ЬРО МАЬ 2	185 нМ (1,85 х10'⁷М)
Антн-ЬРО МАЬ 3	6,4 нМ (6,4 χΙΰ'“Μ)
Антн-ЬРО МАЬ 4	3,5 нМ (3,5 хЮ'^М)
Антн-ЬРО МАЬ 5	13пМ(1,30хЮ'М)
Антн-ЬРО МАЬ 6	0.6 нМ (6.38 х10’'М)
Антн-ЬРО МАЬ 7	58 пМ (5,84 х10'М)
Анти-ЬРО МАЬ 8	0,1 нМ(1.08 х10’'М)
Антн-ЬРО МАЬ 10	3,6 нМ (3,62 х10’⁷М)
Анти-ЬРО МАЬ 11	0,3 нМ (3,12 хЮ’'М)
Анти-ЬРО МАЬ 12	0,4 нМ (4,43 х10'^иМ)
Анти-ЬРО МАЬ 13	0,6 нМ (6,12 х10’‘М)
Анти-ЬРО МАЬ 14	6,8 рМ (6,86 х10'^\|2М)
ТАБЛИЦА 3
Моноклональное антитело	Измеренная константа аффинности Кв (М)
Анти-ЬРО МАЬ 15	0.2 нМ (2.11 х10^чиМ)
Анти-ЬРО МАЬ 16	0.2 нМ (2.78 х10^чиМ)
Анти-ЬРО МАЬ 17	8.3 нМ (8.29 х10М)
Анти-ЬРО МАЬ 18	1,2 нМ (1,24 хЮ^М)
Анти-ЬРО МАЬ 19	0,7 нМ (7,79 х10'^1иМ)
Анти-ЬРО МАЬ 20	0,2 нМ (2,47 х10^чиМ)
Анти-ЬРО МАЬ 21	3.9 нМ (3.90 хЮ-’М)
Анти-ЬРО МАЬ 22	5 нМ (4,94 хЮ ’М)
Анти-ЬРО МАЬ 23	0.4 мкМ (3,99 χ1ΰ ⁷Μ.ι

Анти-РО моноклональное антитело, обладающее аффинностью, особенно приемлемой для конкретного желаемого применения, может быть легко выбрано из них, или получено, или сконструировано при использовании различных иммуногенов, последовательностей участка, определяющего комплементарность (СИК), последовательностей вариабельной тяжелой (У_Н) И вариабельной легкой (У_ъ) цепи антиЬРО антител, описанных в данной заявке. Аффинность какого-либо конкретного анти-РО моноклонального антитела может быть определена при использовании методик, хорошо известных в данной области техники или описанных в данной заявке, таких, как, например, ЕЫ8А, изотермальная титрационная калориметрия (1ТС), В1Асог, или анализы флуоресцентной поляризации. Специфический анализ обеспечивается в примере 23.

Как указано в табл. 1А и 1В, были идентифицированы некоторые ^терминальные и Стерминальные моноклональные анти-ЬРО антитела. Все эти антитела являются специфическими для ЬРО и всех тех, которые приведены, за исключением МАЬ14, которое демонстрирует нейтрализующую активность. Несколько гибридом, полезных для получения антител, были задепонированы 6 октября 2010 г. в Национальной коллекции культур микроорганизмов (СИСМ) в соответствии с Будапештским договором. Наименования гибридом, которые продуцируют анти-ЬРО МАЬО-23 и регистрационные номера этих задепонированных гибридом, присвоенные коллекцией, обеспечиваются в табл. 1А и 1В. В дополнение, для некоторых из этих антител были определены вариабельные легкие цепи (У_ъ), Уь участки, определяющие комплементарность (СИК) и У_Н СИК. Эти аминокислотные последовательности и сокращенное наименование, которое используется для ссылки на них в заявке, также обеспечиваются в табл. 1А и 1В. Кратко, мышиные вариабельные домены тяжелой и легкой цепей обозначаются в данной заявке

- 16 026944 как тУ_Н и тУ_ъ, после чего приводится номер соответствующего моноклонального антитела, например, тУ_Н.3 и тУ_ъ.3 для вариабельной легкой и вариабельной тяжелой цепей анти-ЬРО МАЬ3, соответственно. Подобно этому, человеческие вариабельные домены тяжелой и легкой цепей обозначаются в данной заявке, как ЬУ_Н и ЬУ_Ъ после чего приводится номер соответствующего моноклонального антитела. Три СОК вариабельной тяжелой цепи и три СОК вариабельной легкой цепи обозначаются как У_Н СОК 1, 2 или 3, и У_ЪСОК 1, 2 или 3, соответственно, после чего следует номер специфического анти-ЬРО моноклонального антитела. Например, У_Н СОК 1 МАЬ3 обозначается как У_Н СОК 1.3 и У_ъ СОК 1 МАЬ3 обозначается как У_ъ СОК 1.3. У_Н СОК 2 МАЬ3 обозначается как У_Н СОК 2.3, и У_ъ СОК 2 МАЬ3 обозначается как У_ь СОК 2.3.

Предполагается, что соответствующие СОК и/или У_Н И У_ъ цепи анти-ЬРО моноклональных антител, которые связывают приблизительно одинаковые эпитопы, могут быть взаимно заменены с получением анти-ЬРО моноклональных антител, полезных в способах и наборах, описанных в данной заявке. Например, как указано выше, типичные анти-ЬРО моноклональные антитела МАЬ5 и МАЬ6 связывают тот же эпитоп. Анти-ЬРО моноклональное антитело может быть сконструировано так, что включает в своей У_ъцепи различные комбинации У_ъ СОК этих двух антител, и/или в своей У_Н цепи различные комбинации У_Н СОК этих двух антител. В качестве специфического неограничивающего примера для иллюстрации различных возможных комбинаций, такое антитело может включать в своей У_ъ цепи СОКк 1 и 2 МАЬ5 (У_ь СОК 1.5 и У_ЪСОК 2.5, соответственно) и СОК 3 МАЬ6 (У_ъ СОК 3.6), и в своей У_Н цепи, СОК 1 МАЬ6 (У_Н СОК 1.6) и СОН 2 и 3 МАЬ5 (У_Н СОН 2.5 и У_Н СОН 3.5, соответственно).

Аминокислотные последовательности СОК антител, продуцируемых гибридомами, которые были задепонированы, могут быть получены при использовании традиционных средств. Например, релевантные последовательности антител, которые вырабатываются гибридомами 6В5В11С10 и 20О2С3О2, были определены так, как описано ниже. Кратко, общую РНК изолировали из замороженных клеточных осадков при использовании КNАΒее реагента, АМ8Вю каталожный номер С8-104В, который использовали в соответствии с инструкциями производителя. кДНК для У-участков получали из мРНК при использовании полимеразной цепной реакции с обратной транскриптазой (ОТ-ПЦР), после чего осуществляли 5' быструю амплификацию концов кДНК (КАСЕ). Синтез кДНК осуществляли при использовании специфических праймеров для константного участка, после чего продукт первой цепочки очищали и терминальную дезоксинуклеотид трансферазу использовали для добавления гомополимерных хвостов к 3' концам этой кДНК. Последовательности кДНК, снабженные хвостом, потом амплифицировали с помощью ПЦР при использовании пар праймеров, один праймер для гомополимерного хвоста либо У_Н, либо Уь участка, соответственно. Продукты ПЦР вариабельного участка тяжелой и легкой цепи потом клонировали в ТА клонирующий вектор (р-ОЕМ-Т еаку, Рготеда номер А 1360) и секвенировали при использовании стандартных процедур, См. фиг. 31А-В (МАЬ 3), фиг. 31С-О (МАЬ 4).

Подобно этому релевантные последовательности антител, которые вырабатываются гибридомами 1С10О3В9, 2С6С3С7, 1В3В4Р1 и 1Е9О9В61, были определены так, как описано ниже. Кратко, общую РНК изолировали из замороженных клеточных осадков при использовании КNА^иеоик®-4набора для ПЦР (АтЬюп, номер АМ1914), который использовали в соответствии с инструкциями производителя. мРНК У-участка тяжелой цепи амплифицировали при использовании набора шести пулов вырожденных праймеров (от НА до НР) и мРНК У-участка легкой цепи амплифицировали при использовании набора восьми пулов вырожденных праймеров, семь для кластера (от КА до КО) и один для λ кластера (ЬА). кДНК для вариабельных участков получали из мРНК при использовании ОТ-ПЦР. Синтез кДНК осуществляли при использовании специфических для константного участка праймеров, после чего проводили ПЦР при использовании пулов вырожденных праймеров для 5' мышиных сигнальных последовательностей и праймеров для 3' константных участков для каждого из 1дОУН, 1§кУЪ и 1д/_УЕ. (Чопек и др., 1991, Карй РСК с1отп§ о£ Ги11-1епд1Ь тоике ЬптипоДоЬиЬп уапаЫе гедюпк, Вю/ТесЬпо1оду 9:88-89). Продукты ПЦР вариабельного участка тяжелой и легкой цепи потом клонировали в ТА клонирующий вектор (рОЕМ-Т еаку, Рготеда каталожн. номер А 1360) и секвенировали при использовании стандартных процедур, см. фиг. 31Е-Р (МАЬ 8), 31О-Н (МАЬ 13), 311-1 (МаЬ 16) и 31К-Ь (МаЬ 19).

Со ссылкой на табл. 1А специфические воплощения Ν-терминальных анти-ЬРО антител, полезных в способах и наборах, описанных в данной заявке, включают, но без ограничения таковыми, следующие:

(a) антитела, имеющие Уь СОК8, которые соответствуют по последовательности У_ъ СОКк МАЬ1, МАЬ2, МАЬ3, МАЬ4, МАЬ15, МАЬ16, МАЬ17, МАЬ18, МАЬ19 или МАЬ20, и У_Н СОК8, которые соответствуют по последовательности У_Н СОКк МАЬ1, МАЬ2, МАЬ3, МАЬ4, МАЬ15, МАЬ16, МАЬ17, МАЬ18, МАЬ19 или МАЬ20;

(b) антитела, имеющие У_ъ СОК8 И У_Н СОК8, которые соответствуют по последовательности У_ъ и У_НСОКк МАЬ1, МАЬ2, МАЬ3, МАЬ4, МАЬ15, МАЬ16, МАЬ17, МАЬ18, МАЬ19 или МАЬ20;

(c) антитела, в которых:

(ί) У_ЬСОК 1 является выбранным из (48ΙΥΙ 18ХХТ¥ (У_ъ СОК 1.3; 8ЕЕ) ГО N0:4), Р8ЬУН88ОУТУ (У_ъ СОК 1.4; 8ЕЕ) ГО N0:10), (Ч8ЕЕО8ОС.КТ¥ (У_ъ СОК 1.16; 8ЕС ГО N0:50) и 8Е)11КТУТ (Уь СОК 1.19; 8ЕС ГО N0:51);

- 17 026944 (ίί) У_ъ СОК2 является выбранным из КУ8 (У_ъ СОК 2.3 и (У_ъ СОК 2.4; 8ЕЕ) ГО N0:5), ЬУ8 (У_ъСОК 2.16; 8ЕЕ) ГО N0:53) и УККОО8н (У_ъ СОК 2.19; 8ЕЕ) ГО N0:54);

(ΐΐΐ) У_ъ СОК3 является выбранным из ΡΕ)Ο8ΙΙ\ΤΡΤ (У СОН 3.3; 8ЕО ГО N0:6), 8Ε)8ΤΙΙΥΙΨΤ (У_ЬСОК 3.4; 8ЕЕ) ГО N0: 11), ν'ΟΟΤΙ 18ΕΥΤ (У_ъ СОК 3.16; 8ЕО ГО N0:57) и ОУОПУКОСЕУРУ (Уь СОК 3.19; 8ЕО ГО N0:58);

(ίν) У_н СОК1 является выбранным из ΟΥΙΡΤ8Υν (У_н СОК 1.3; 8ЕО ГО N0:1), ΟΥΤΡ888ν (У_нСОК 1.4; 8ЕО ГО N0:7), ΟΥΤΡΤ8ΥΥ (У_н СОК 1.16; 8ЕО ГО N0:39) и ОУ8ЕЕ8ОУА (У_н СОК 1.19; 8ЕО ГО N0:40);

(ν) У_н СОК2 является выбранным из РУРО\8О8 (У_н СОК 2.3; 8ЕО ГО N0:2), РЕРО8О8Т (У_нСОК 2.4; 8ЕО ГО N0:8), Ι^^ΟΤ (У_н СОК 2.16; 8ЕО ГО N0:43) и Ι8Ρ8ΟΥΤ (У_н СОК 2.19; 8ЕО ГО N0:44); и (νί) У_н СОК3 является выбранным из ΤКК^8Р^Υ (У_н СОК 3.3; 8ЕО ГО N0:3), .У1ВО\У1ЖР/\У (У_н СОК 3.4 8ЕО ГО N0:9), Τ^ΟΥΥΓΡΟΥ (У_н СОК 3.16; 8ЕО ГО N0:47) и ΆКΕУNΥ0^8ΥΗΡ^Υ (У_н СОК 3.19; 8ЕО ГО N0:48);

(б) антитела, имеющие У_ь, который соответствует по последовательности У_ЪМАЬ1, МАЬ2, МАЬ3, МАЬ4, МАЬ15, МАЬ16, МАЬ17, МАЬ18, МАЬ19 или МАЬ20, и У_н, который соответствует по последовательности У_н МАЬ1, МАЬ2, МАЬ3, МАЬ4, МАЬ15, МАЬ16, МАЬ17, МАЬ18, МАЬ19 или МАЬ20; и (е) антитела, имеющие У_ъ И У_н, которые соответствуют по последовательности У_ъ и У_н МАЬ1, МАЬ2, МАЬ3, МАЬ4, МАЬ15, МАЬ16, МАЬ17, МАЬ18, МАЬ19 или МАЬ20.

Со ссылкой на табл. 1В специфические С-терминальные анти-ЬРО антитела, включают, но без ограничения таковыми, следующие:

(ί) антитела, имеющие Уь СОК8, которые соответствуют по последовательности У_ъ СОК8 МАЬ5, МАЬ6, МАЬ7, МАЬ8, МАЬ9, МАЬ10, МАЬ11, МАЬ12, МАЬ13, МАЬ14, МАЬ21, МАЬ22 или МАЬ23, и У_нС.ОК5. которые соответствуют по последовательности У_н СОК8 МАЬ5, МАЬ6, МАЬ7, МАЬ8, МАЬ9, МАЬ10, МАЬ11, МАЬ12, МАЬ13, МАЬ14, МАЬ21, МАЬ22 или МАЬ23;

(д) антитела, имеющие У_ъ СОК8 И У_н СОК8, которые соответствуют по последовательности У_ъ и У_нСОК5 МАЬ5, МАЬ6, МАЬ7, МАЬ8, МАЬ9, МАЬ10, МАЬ11, МАЬ12, МАЬ13, МАЬ14, МАЬ21, МАЬ22 или МАЬ23;

(Ь) антитела, в которых:

(νίί) У_ъ СОК1 является выбранным из К8ЕК1 РЕКСИТ (У_ъ СОК 1.8; 8ЕО ГО N0:49) и О8ЕЕИ8ИСКТУ (Уь СОК 1.13; 8ЕО ГО N0:50);

(νίίί) Уь СОК2 является выбранным из ОМ8 (У_ЪСОК 2.8; 8ЕО ГО N0:52) и ЬУ8 (У_ъ СОК 2.13; 8ЕО ГО N0:53);

(ΐχ) Уь СОК3 является выбранным из АОКЕЕЕРЕТ (У_ъ СОК 3.8; 8ЕЕ) ГО N0:55) и ν'ΟΟΤΙ ΙΡΕΟΤ (Уь СОК 3.13; 8ЕО ГО N0:56);

(χ) У_н СОК1 является выбранным из ΟΡΤΡΤΤΥА (У_н СОК 1.8; 8ЕЕ) ГО N0:37) и ΟΡΙΡ88ΥΟ (У_нСОК 1.13; 8ЕО ГО N0:38);

(χί) У_н СОК2 является выбранным из Ι88ΟΟΤΥΤ (У_н СОК 2.8; 8ЕО ГО N0:41) и ΙΥΕΡΟυ·//· (У_нСОК 2.13; 8ЕО ГО N0:42); и (χίί) У_н СОК3 является выбранным из .УЕОО\У8ЕИР' (У_н СОК 3.8; 8ЕЕ) ГО N0:45) и ΆΡΟΤΟΤΥ (У_н СОК 3.13; 8ЕО ГО N0:46);

(ί) антитела, имеющие У_ь, который соответствует по последовательности У_ъ МАЬ5, МАЬ6, МАЬ7, МАЬ8, МАЬ9, МАЬ1О, МАЬ11, МАЬ12, МАЬ13, МАЬ14, МАЬ21, МАЬ22 или МАЬ23, и У_н, который соответствует по последовательности У_н МАЬ5, МАЬ6, МАЬ7, МАЬ8, МАЬ9, МАЬ10, МАЬ11, МАЬ12, МАЬ13, МАЬ14, МАЬ21, МАЬ22 или МАЬ23; и (ί) антитела, имеющие Уь И У_н, которые соответствуют по последовательности У_ъ и У_н, которые соответствуют по последовательности У_ь, и У_н МАЬ5, МАЬ6, МАЬ7, МАЬ8, МАЬ9, МАЬ10, МАЬ11, МАЬ12, МАЬ13, МАЬ14, МАЬ21, МАЬ22 или МАЬ23.

Как будет оценено квалифицированными специалистами в данной области техники, анти-ЬРО антитела, полезные в диагностических способах, могут иметь любое происхождение, включая, например, от млекопитающего (например, человека, примата, грызуна, козы или кролика), от животного, отличного от млекопитающего, или быть химерными по своей природе (иметь происхождение от более чем одного вида). Антитела, приемлемые для терапевтических применений у животных, включая людей, предпочтительно имеют происхождение от тех же видов, для лечения которых они предназначаются, или были модифицированы или сконструированы для того, чтобы быть неиммуногенными или иметь сниженную иммуногенность у животного, которого подвергают лечению. Специфический класс анти-ЬРО антител, полезных для терапевтических применений у людей, представляет собой класс гуманизированных антител, которые обсуждаются более подробно ниже. Анти-ЬРО антитела, полезные в способах и наборах, описанных в данной заявке, могут также быть или иметь происхождение от любого изотипа, включая, например, ^А (например, ^А1 или ^А^), Ι§Ο, Ι§Ε, Ι§Ο (например, Ι§Ο1, Ι§Ο2, Ι§Ο3 или Ι§Ο4) или ^М. Анти-ЬРО антитела, предназначенные для терапевтических применений, предпочтительно являются такими Ι§Ο изотипа.

- 18 026944

Анти-ЬРО антитела, полезные для терапевтических способов, описанных в данной заявке, могут быть гуманизированными. В общем случае, гуманизированные антитела включают существенно все из, по крайней мере, один и типично два, вариабельных домена, в которых все или существенно все СОК участки соответствуют таковым не-человеческого иммуноглобулина, и все или существенно все каркасные участки являются таковыми с консенсусными последовательностями человеческого иммуноглобулина, и могут обозначаться как СОК-привитые. Гуманизированное антитело может также включать, по крайней мере, часть константного участка иммуноглобулина (Рс), типично такие с консенсусной последовательностью человеческого иммуноглобулина. Способы гуманизации антител, включая способы конструирования гуманизированных антител, являются хорошо известными в области техники. Смотри, например, ЬеРгаис и др., 2003, Оеу. Сотр. 1ттипо1. 27:55-77; Ье&аис и др., 2009, Ыис1. АсЛз Кез. 37: 010061012; ЬеРгаис, 2008, Мо1. Вю1есЬио1. 40: 101-111; ШесЬтаии и др., 1988, №Лиге 332:323-7; патенты США №№ 5530101, 5585089, 5693761, 5693762 и 6180370, которые относятся к Оиееи и др., ЕР239400; РСТ публикация А0 91/09967; патент США № 5225539; ЕР592106; ЕР519596; РаЛаи, 1991, Мо1. 1ттиио1. 28:489-498; 81ийтска и др., 1994, РгоЬ Еид. 7:805-814; Кодизка и др., 1994, Ргос. ЫаЙ. Асай. 8ск 91:969973; и патент США № 5565332, раскрытие которых является введенным в данную заявку в своей целостности.

Гуманизированные варианты антител, имеющих СОК последовательности, соответствующую СОК не-человеческих анти-ЬРО антител, включая в качестве примера и без ограничения, различные Νтерминальные анти-ЬРО моноклональные антитела, которые обеспечиваются в табл. 1А, и различные Стерминальные анти-ЬРО моноклональные антитела, которые обеспечиваются в табл. 1В, могут быть получены при использовании этих хорошо известных способов. Прогнозируемые последовательности для гуманизированных У и У_Н цепей выбранных анти-ЬРО антител обеспечиваются в табл. 1А и 1В.

Специфические примеры гуманизированных антител включают антитела включающие:

(k) какие-либо три У СОКз и какие-либо три ν_Η СОКз, раскрытые в данной заявке;

(l) вариабельный участок тяжелой цепи, включающий аминокислотную последовательность, соответствующую 8ЕО ГО N0:21, и вариабельный участок легкой цепи, включающий аминокислотную последовательность, соответствующую 8ЕО ГО N0:22;

(т) вариабельный участок тяжелой цепи, включающий аминокислотную последовательность, соответствующую 8ЕО ГО N0:23, и вариабельный участок легкой цепи, включающий аминокислотную последовательность, соответствующую 8Е0 ГО N0:24;

(и) вариабельный участок тяжелой цепи, включающий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, которая состоит из 8Е0 ГО N0:75, 77, и 79, и вариабельный участок легкой цепи, включающий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, которая состоит из 8Е0 ГО N0:76 и 78;

(o) вариабельный участок тяжелой цепи, включающий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, которая состоит из 8Е0 ГО N0:80 и 82, и вариабельный участок легкой цепи, включающий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, которая состоит из 8Е0 ГО N0:81 и 83;

(p) вариабельный участок тяжелой цепи, включающий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, которая состоит из 8Е0 ГО N0:84, 86, и 88 и вариабельный участок легкой цепи, включающий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, которая состоит из 8Е0 ГО N0:85, 87, и 89; и (μ) вариабельный участок тяжелой цепи, включающий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, которая состоит из 8Е0 ГО N0:90, 92 и 94, и вариабельный участок легкой цепи, включающий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, которая состоит из 8Е0 ГО N0:91, 93 и 95.

Как будет признано квалифицированными специалистами, анти-ЬРО антитела, обладающие свойствами специфического связывания, такими, как способность к связыванию специфического эпитопа, представляющего интерес, могут быть легко получены при использовании различных антигенов и иммуногенов, описанных в данной заявке, и будут подвергаться анализу на их способность конкурировать за связывание ЬРО со ссылкой на антитело, которое представляет интерес. Любое из анти-ЬРО антител, описанных в данной заявке, может использоваться как эталонное антитело в таком конкурентном анализе. Специфический анализ, полезный для оценки способности антитела конкурировать за связывание ЬРО с биотинилированным эталонным анти-ЬРО антителом, которое представляет интерес, обеспечивается в примере 24.

При проведении исследования конкуренции антитела между эталонным анти-ЬРО антителом и любым исследуемым антителом (вне зависимости от видов или изотипа), следует сначала пометить эталонное антитело с помощью метки, которая определяется либо непосредственно, например, с помощью радиоизотопа или флуорофора, или опосредованно, например, с помощью биотина (является способным к определению посредством связывания с флуоресцентно-меченным стрептавидином) или фермента (ферментативной реакции), для того, чтобы позволить осуществить последующую идентификацию. В этом случае меченное референтное анти-ЬРО антитело (в фиксированных или повышающихся концентрациях)

- 19 026944 инкубируют с известным количеством ЬРО, образующим комплекс ЬРО:меченное анти-ЬРО антитело. Немеченное исследуемое антитело потом прибавляют к комплексу. Измеряют интенсивность комплексированной метки. Если исследуемое антитело конкурирует с меченным эталонным анти-ЬРО антителом за ЬРО путем связывания с перекрывающимся эпитопом, то интенсивность комплексированной метки будет снижаться по сравнению с контрольным экспериментом, который осуществляют при отсутствии исследуемого антитела.

Многочисленные способы для осуществления анализов конкурентного связывания являются известными и могут быть адаптированы для получения результатов, сравнимых с такими для анализа, описанного выше и в примере 24.

Считается, что антитело конкурирует за связывание ЬРО с эталонным анти-ЬРО антителом, и таким образом, считается таким, которое связывает приблизительно тот же или перекрывающийся эпитоп ЬРО, что и эталонное анти-ЬРО антитело, если оно снижает связывание эталонного анти-ЬРО антитела с ЬРО в конкурентном анализе связывания, и в частности, конкурентном анализе связывания примера 24 по крайней мере на 50%, при концентрации исследуемого антитела в интервале 0,01-100 мкг/мл (например, 0,01, 0,08, 0,4, 2, 10, 50 или 100 мкг/мл или другая концентрация в пределах указанного интервала), несмотря на то, что более высокие уровни снижения, например, 60, 70, 80, 90 или даже 100%, могут быть желательными.

Антитела настоящей заявки могут также быть дериватизированы, ковалентно модифицированы или конъюгированы с другими молекулами для изменения их свойств или улучшения их функции. Например, но не в качестве ограничения, дериватизированные антитела включают антитела, которые были модифицированы, например, путем гликозилирования, фукозилирования, ацетилирования, пэгилирования, фосфорилирования, амидирования, формилирования, дериватизации с помощью известных защитных/блокирующих групп, связи с клеточным лигандом или с другим белком и тому подобное. Альтернативно, специфические аминокислоты в вариабельных или константных участках могут быть изменены для замены или улучшения функции. В одном неограничивающем примере аминокислотные остатки в Рс участке антитела могут подвергаться изменениям для повышения периода полувыведения антитела из сыворотки путем повышения его связывания с РсКп.

Анти-ЬРО моноклональные антитела включают антитела, меченные с помощью способного к определению остатка. Такая метка может быть конъюгирована непосредственно или опосредованно с антиЬРО моноклональным антитело в соответствии с данной заявкой. Метка может быть сама по себе определяемой (например, радиоизотопные метки, изотопные метки или флуоресцентные метки) или в случае ферментативной метки может катализировать ферментное изменение субстратного соединения или композиции, которые являются определяемыми. Примеры способных к определению веществ включают разнообразные ферменты, простетические группы, флуоресцентные материалы, люминесцентные материалы, биолюминисцентные материалы, радиоактивные материалы, позитронно активные металлы при использовании различных видов томографии на основе позитронного излучения, и ионы нерадиоактивных парамагнитных металлов.

Несмотря на то, что различные анти-ЬРО антитела, полезные в способах и наборах, описанных в данной заявке, были представлены антителом полной длины, квалифицированные специалисты смогут оценить, что связывающие фрагменты, или суррогатные сконструированные антитела или такие, которые имеют происхождение от антитела полной длины или связывающих фрагментов, могут также использоваться. Приемлемые фрагменты, суррогаты и тому подобное включают, но без ограничения таковыми, РаЬ', Р(аЬ')₂, РаЬ, Ρν, νΙβΟ, всРу фрагменты и сурротела, г1дО, дисульфид-стабилизированные Ρν антитела (άδΡν), диатела, триатела и однодоменные антитела, такие как кемелизированное антитело или нанотело.

Антитела в соответствии с настоящей заявкой могут быть получены в соответствии с любым способом, известным среднему специалисту в данной области техники. В одном неограничивающем примере антитела могут быть получены из природных источников, включающих любой вид, способный продуцировать антитела, такие как антитела, которые имеют происхождение от людей, обезьян, курей, коз, кролей и грызунов (например, крыс, мышей и хомяков). Другие виды также являются возможными. Антитела могут также быть получены и изолированы из систем, которые используют генетическую инженерию или методику рекомбинантной ДНК, таких как, но без ограничения таковыми, экспрессию рекомбинантных антител в клетках дрожжей, бактериальных клетках и клетках млекопитающих в культуре, таких, как клетки СНО. Антитела могут также быть полностью или частично синтетическими.

Моноклональные антитела (МАЬ) в соответствии с настоящей заявкой не являются ограниченными антителами, получаемые с помощью гибридомной технологии. Моноклональные антитело имеют происхождение от одного клона, включая любой эукариотический, прокариотический или фаговый клон, при использовании любых способов, доступных или известных в области техники. Моноклональные антитела могут быть получены при использовании широкого разнообразия методик, известных в области техники, включая применение гибридомной, рекомбинантной методики и способа фагового дисплея или их комбинации.

- 20 026944

Традиционные способы лечения метастатического колоректального рака

Метастатический колоректальный рак может подвергаться лечению с помощью биологической терапии, нацеленной терапии, терапии на основе антител, лучевой терапии, химиотерапии, хирургии, криохирургии или комбинаций этих способов терапии. Другие способы лечения для метастатического колоректального рака также являются возможными.

Биологическая терапия представляет собой лечение для стимуляции или восстановления способности иммунной системы бороться с раком. Агенты, которые используются в биологической терапии, включают модификаторы биологического ответа, такие как интерфероны, интерлейкины, колониестимулирующие факторы, моноклональные антитела, вакцины, генную терапию и неспецифические иммуномодулирующие агенты. Некоторые из этих агентов могут также обладать непосредственным противоопухолевым эффектом. Нацеленные противораковые терапии представляют собой лекарственные средства или другие вещества, которые блокируют рост и распространение рака путем нарушения специфических молекул, вовлеченных в рост и развитие.

Способы терапии на основе антител вовлекают введение антител, включая, но без ограничения таковыми, моноклональные антитела, которые непосредственно или опосредованно убивают клетки метастатического колоректального рака, замедляют или останавливают их рост. Такие антитела могут функционировать с помощью разнообразных отдаленных механизмов. Например, некоторые антитела могут метить раковые клетки для атаки с помощью иммунной системы пациента путем зависимой от антитела опосредованной клетками цитотоксичности (АЭСС) или других механизмов. Другие антитела связываются с и изменяют или ингибируют функцию антигенов, которые являются необходимыми раковым клеткам для выживания или роста. Ряд антител, как предполагается, функционирует, таким образом, включая, например, бевацизумаб (Авастин®), который связывается с ростовым фактором УБОР. Другие механизмы также являются возможными, и определенные антитела могут быть способными работать с помощью одного или более механизмов действия. Другие антитела могут быть конъюгированы с радиоактивными или цитотоксическими остатками и нацеливают их на раковые клетки, которые предпочтительно экспрессируют антигены, в частности, такие, которые узнаются антителами. Бевацизумаб, цетуксимаб и панитумумаб, представляют собой специфические примеры антител, полезных в лечении метастатического колоректального рака.

Лучевая терапия представляет собой применение излучения высоких энергий от рентгеновских лучей, гамма лучей, нейтронов, протонов и других источников для уничтожения раковых клеток и уменьшения размера опухолей. Излучение может исходить от устройства за пределами организма (дистанционная лучевая терапия), или оно может исходить от радиоактивного материала, помещенного в организм рядом с раковыми клетками (внутренняя лучевая терапия, или брахитерапия). Системная лучевая терапия использует радиоактивное вещество, такое как радиоактивно меченное моноклональное антитело, которое мигрирует через кровь к тканям в организме. Лучевая терапия может также именоваться облучением и радиотерапией. Другие способы радиационной терапии также включают пространственную конформную лучевую терапию (3Э-СРТ) и лучевую терапию с модулируемой интенсивностью (ΙΜΚΤ). Другие способы лучевой терапии также являются возможными.

Химиотерапия представляет собой применение лекарственных средств на основе малых молекул, которые уничтожают (цитотоксические или цитоцидные) или предотвращают рост (цитостатические) раковые клетки. Множество химиотерапевтических агентов, которые опосредуют свой противоопухолевый эффект посредством разнообразных механизмов, являются доступными для лечения метастатического колоректального рака.

Типичные химиотерапевтические агенты включают следующие: антагонисты фолата, включая метотрексат и пеметрексед; антагонисты пурина, включая кладрибин, клофарабин, флударабин, 6меркаптопурин, неларабин, пентостатин; антагонисты пиримидина, включая капецитабин, цитарабин, 5фторурацил, гемцитабин, гидроксимочевину; блеомицин; ДНК алкилирующие агенты, включая нитромочевины, кармустин, ломустин; лекарственные агенты для перекрестного сшивания ДНК и алкилирующие агенты, включая бендамустин, хлорамбуцил, циклофосфамид, ифосфамид, мехлорэтамин (азотистый иприт), мелфалан, дакарбазин, темозоломид, прокарбазин; аспарагиназу; антибиотики, включая митомицин; комплексы платины, включая карбоплатин, цисплатин, оксалиплатин; протеосомные ингибиторы, включая бортезомиб; яды, разрушающие веретено деления, такие, как таксаны (включая доцетаксел и паклитаксел) и алкалоиды барвинка (включая винбластин, винкристин, винорелбин); ингибиторы топоизомеразы, такие как антрациклины (включая даунорубицин, дауномицин, доксорубицин, эпирубицин), камптотецины (включая иринотекан и топотекан), подофиллотоксины (включая этопозид, тенипозид и митоксантрон). Другие химиотерапевтические агенты также являются возможными.

Метастатический колоректальный рак часто подвергается лечению при использовании химиотерапевтических агентов в комбинации с другими агентами и/или антителами. Примеры таких комбинаций включают 5-фторурацил (5РИ) в сочетании с лейковорином (фолиновая кислота или ЬУ); тегафур в сочетании с урацилом (ИРТ) и лейковорином; оксалиплатин в сочетании с 5РИ, или в дополнительной комбинации с капецитабином; иринотекан в сочетании с капецитабином; митомицин С в сочетании с 5Ри, иринотеканом или капецитабином; РОЬРОХ (лейковорин (фолиновая кислота), 5-РИ и оксалипла- 21 026944 тин) как таковой или в сочетании с бевацизумабом или цетуксимабом; РОЬР1К1 (лейковорин, 5-РИ и иринотекан) как таковой или в сочетании с бевацизумабом или цетуксимабом; СареОХ (капецитабин и оксалиплатин) как таковой или в сочетании с бевацизумабом или цетуксимабом; 5-РИ и лейковорин в сочетании с бевацизумабом; капецитабин в сочетании с бевацизумабом; РОЬРОХ1К1 (лейковорин, 5-РИ, оксалиплатин и иринотекан); иринотекан в сочетании с цетуксимабом. Другие комбинационные режимы включают 5Ри Мауо, 5РИ Но8\\е11 Рагк, ЬУРШ, РОРРОХ4. РОЬРОХб, ЬРОЬ, РИРОХ, 1РЬ, ХЕЬОХ, ΧΕΡΙΕΣ и СЛР1К1, которые являются описанными более подробно у СЬаи I. и СиптпдЬат Ό., Вг. Т Сапсег 100 (2009) 1704-19; и Не1б К. и Ыр!оп Ь., \Уог1б 1. Оа81гоеп!его1. 13 (2007) 3806-15, которые являются введенными в качестве ссылки. Другие комбинации химиотерапевтических агентов и других терапевтических агентов также являются возможными.

Терапевтические способы при использовании анти-РС антител

Настоящая заявка также раскрывает терапевтические способы, включающие введение анти-РО антитела в композиции субъекту с целью лечения и предотвращения метастатического колоректального рака, предотвращения рецидивов колоректального рака и предотвращения роста стволовых клеток колоректального рака.

Анти-РО антитела, как раскрыто в данной заявке, вводятся в композиции субъекту, который нуждаются в лечении метастатического колоректального рака, в терепевтически эффективном количестве в виде монотерапии или как комбинационная терапия. Такие субъекты включают, но без ограничения тех, которые диагностированы с метастатическим колоректальным раком.

Анти-РО антитела, как раскрыто в данной заявке, вводятся в композиции субъекту, который нуждается в предотвращении метастатического колоректального рака, в терапевтически эффективном количестве в виде монотерапии или как комбинационная терапия. Такие субъекты включают, но без ограничения тех, которые диагностированы как таковые, которые имеют первичный колоректальный рак, но у которых рак не является известным как такой, который распространился на отдаленные ткани или органы.

Анти-РО антитела, как раскрыто в данной заявке, вводятся в композиции субъекту, который нуждается в предотвращении рецидивов метастатического колоректального рака в терапевтически эффективном количестве в виде монотерапии или как комбинированная терапия. Такие субъекты включают, но без ограничения тех, которые ранее подвергались лечению от первичного или метастатического колоректального рака, и после такого лечения рак очевидным образом исчез.

Анти-РО антитела, как раскрыто в данной заявке, вводятся в композиции субъекту, который нуждается в ингибировании роста стволовых клеток колоректального рака, в терапевтически эффективном количестве в виде монотерапии или как комбинированная терапия. Такие субъекты включают, но без ограничения тех, которые имеют колоректальный рак, рост или метастазы которого, по крайней мере, частично связаны с присутствием в них раковых стволовых клеток. Предотвращение или ингибирование роста стволовых клеток колоректального рака возможно при контактактировании таких стволовых клеток с количеством композиции анти-РО антитела, эффективной для предотвращения или ингибирования роста таких клеток.

Нейтрализующие анти-РО антитела будут представлять собой первичные активные агенты в композициях терапевтического антитела, несмотря на то, что не-нейтрализующие анти-РО антитела могут присутствовать, если их присутствие существенным образом не ингибирует терапевтическую эффективность нейтрализующих антител.

Субъект, которому могут вводиться композиции анти-РО антител, может представлять собой млекопитающего, такого как не-примат (например, корова, свинья, лошадь, кот, собака, крыса и т.д.) или примат (например, обезьяна, шимпанзе, человекообразная обезьяна или человек). Субъект может представлять собой человека, такого, как взрослый пациент или педиатрический пациент.

Для целей лечения или предотвращения метастатического колоректального рака или предотвращения рецидивов колоректального рака композиции анти-РО антител могут вводиться отдельно субъектам в виде монотерапии, или как дополнительная терапия к одному или более первичных способов терапии, эффективных для лечения или предотвращения метастатического колоректального рака или для предотвращения рецидивов колоректального рака.

Таким образом, композиции анти-ЬРО антител могут вводиться субъекту, который нуждается в лечении или предотвращении метастатического колоректального рака, в качестве дополнения к химиотерапии, в качестве дополнения к лучевой терапии, в качестве дополнения к биологической терапии, в качестве дополнения к хирургической терапии или в качестве дополнения к другим типам терапии на основе антител, эффективных для лечения или предотвращения метастатического колоректального рака. Композиции анти-ЬРО антител могут вводиться субъекту, который нуждается в предотвращения рецидивов колоректального рака в качестве дополнения к другим способам терапии, эффективным для предотвращения таких рецидивов.

В качестве дополнительной терапии композиции анти-ЬРО антител могут вводиться одновременно, последовательно или раздельно со способом первичной терапии.

Композиции анти-ЬРО антител и первичная терапия вводятся одновременно тогда, когда вводятся в

- 22 026944 одно и то же время, даже тогда, когда соответствующие введения перекрываются, но начинаются или заканчиваются в различные моменты времени. Неограничивающие примеры одновременного введения представляют собой введение композиции анти-ЬРО антитела в то самое время, когда субъект получает химиотерапию от метастатического колоректального рака или подвергается хирургическому удалению первичной колоректальной опухоли.

Композиции анти-ЬРО антител и первичная терапия вводятся последовательно при введении субъекту в тот же день, например, во время того же визита в клинику, но не одновременно. Последовательное введение может осуществляться с промежутком времени 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 или более часов. Первичная терапия может вводиться первой, после чего следует введение композиции анти-ЬРО антитела. В альтернативно композиция анти-ЬРО антитела может вводиться первой, после чего осуществляют первичную терапию.

Композиции анти-ЬРО антител и первичная терапия вводятся раздельно тогда, когда вводятся субъекту в различные дни. Композиция анти-ЬРО антитела может вводиться и первичная терапия может осуществляться в пределах интервала в 1 день, 2 дня, 3 дня, 4 дня, 5 дней, 6 дней, одна неделя, 2 недели, 3 недели или месяц или более. Как и в случае последовательного введения, введение композиции анти-ЬРО антитела может предшествовать или следовать за отдельным введением первичной терапии.

Причем композиция анти-ЬРО антитела может вводиться и первичная терапия осуществляться циклически или в шахматном порядке, будь то последовательное или раздельное введение.

Введение композиция анти-ЬРО антитела в качестве дополнения к первичной терапии может обеспечивать синергетический эффект, предоставляя терапевтическое преимущество, когда ни одна терапия не может вводиться отдельно в количестве, которое было бы терапевтически эффективным при отсутствии неприемлемых побочных эффектов. При этих обстоятельствах композиция анти-ЬРО антитела и/или первичная терапия могут вводиться в более низких количествах, снижая, таким образом, возможность или тяжесть побочных эффектов. Однако синергетический эффект не является необходимым для дополнительной терапии для того, чтобы композиция анти-ЬРО антитела была терапевтически эффективной.

Способы мониторинга эффективности лечения метастатического колоректального рака

Как указано выше, пациенты с первичным и/или метастатическим колоректальным раком имеют повышенные уровни РО в плазме и/или сыворотке крови, в то время как базисным уровнем РО у здоровых индивидуумов можно пренебречь. Уровни РО в плазме и/или сыворотке крови у субъектов с первичным и/или метастатическим колоректальным раком являются способными к измерению и составляют приблизительно 25 пМ или более. На основе этого наблюдения уровни РО в сыворотке и/или плазме крови могут использоваться, среди прочего, для мониторинга эффективности лечения первичного или метастатического колоректального рака, определения и диагностики присутствия первичного или метастатического колоректального рака и отбора субъектов, которые могут получить преимущество от лечения с помощью анти-РО антитела.

Таким образом, настоящая заявка обеспечивает способы мониторинга субъекта, который подвергается лечению колоректального метастатического рака, для определения эффективности предыдущего цикла терапии для лечения метастатического колоректального рака. Эти способы могут использоваться для любого типа терапии, направленной против метастатического колоректального рака, взятой отдельно или в комбинации с другими, включая но без ограничения таковыми, введение композиции анти-ЬРО антитела, терапии при использовании других типов антител, химиотерапии, лучевой терапии, биологической терапии и других. После окончания цикла терапии команда врачей, которые отвечают за здоровье субъекта, нуждается в том, чтобы выяснить, было ли оно эффективным, для определения, следует ли или нет назначать новый цикл лечения и принимать другие клинические решения.

Концентрация РО в одной или более жидкостях тела, таких как кровь, плазма, сыворотка или другие, может измеряться перед началом лечения метастатического колоректального рака и потом сравниваться с уровнем РО, измеренным в том же типе жидкости организма через некоторое время после окончания лечения. Возможно измерение уровня РО в ткани, которая представляет интерес, такой как образцы биопсии колоректального рака.

Снижение концентрации РО является показателем эффективности. Типично, чем больше степень снижения РО после лечения, тем более эффективной была терапия. Не имея намерения связываться с какой-либо конкретной теорией операции, предполагается, что количество и/или размер метастазов у пациента снижается как результат эффективного лечения, общее количество РО, который вырабатывается метастазами, также снижается. В противовес этому отсутствие снижения или рост уровней РО после окончания лечения могут указывать на то, что терапия была неэффективной. На основе этой информации команда врачей может решать, следует ли начинать новый цикл терапии.

Приемлемые интервалы после завершения цикла терапии, в течение которых берут образцы для мониторинга, легко определяются средним специалистом в данной области техники и зависят от таких переменных, как тип терапии, которая рассматривается, пол, возраст субъекта и другие. Типичные интервалы включают 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или 11 недель и 3, 4, 5 или 6 месяцев после завершения курса терапии, течение которых берут образцы для мониторинга способов в соответствии с настоящей заявкой. Другие интервалы также являются возможными Могут измеряться многократные измерения при других

- 23 026944 интервалах, а потом вычерчивают график для определения существования тенденции. В одном неограничивающем примере уровни РО могут определяться еженедельно или ежемесячно в течение первых шести месяцев после окончания первого цикла терапии. Другие интервалы также являются возможными.

Уровни концентрации РО в жидкостях организма могут измеряться при использовании аналитических методик, известных среднему специалисту в данной области техники, таких как, но без ограничения таковыми, ΚΙΆ и ЕЬТЗЛ. Способы анализа, такие как те, что основываются на антителах, специфических для ЬРО, могут осуществляться при использовании не-нейтрализующих или нейтрализующих антител, таких как те, которые раскрыты в данной заявке, в соответствии со знаниями среднего специалиста в данной области техники.

Уровни РО могут измеряться при использовании сэндвич ЕЬРЗЛ с одним анти-РО антителом, нацеленным на Ν-терминальный конец прогастрина, и вторым анти-РО антителом, нацеленным на Стерминальный конец прогастрина. Типичные Ν- и С-терминальные анти-РО антитела, полезные для такого сэндвич-анализа, описываются в разделе, приведенном ниже. В таком анализе готовят поверхность, такую как ячейки в планшете на 96 ячеек, с которой связывается известное количество первого, иммобилизованного Ν-терминального или С-терминального анти-РО антитела. Исследуемый образец потом применяют к поверхности и выдерживают в течение периода инкубации. Поверхность потом промывают для удаления несвязанного антигена и применяют раствор, содержащий второе идентифицирующее анти-РО антитело, где идентифицирующее антитело связывает отличный эпитоп РО (например, иммобилизованное антитело представляет собой С-терминальное анти-РО антитело, а Ν-терминальное анти-РО антитело используют как идентифицирующее антитело, и наоборот). Уровни РО потом измеряют либо непосредственно (если, например, идентифицирующее антитело является конъюгированным со способной к определению меткой) или опосредованно (с помощью меченного вторичного антитела, которое связывает идентифицирующее анти-РО антитело). Специфический сэндвич-анализ для измерения уровней РО в плазме/сыворотке крови обеспечивается в примере 20.

Эффективность введения композиция анти-ЬРО антитела субъекту определяется с применением понижающихся уровней РО в жидкости организма, который представляет интерес. В этих способах образцы могут быть взяты в течение периода времени, и концентрации РО выстраивают в виде графика для оценки тенденции. Тогда, когда присутствуют остаточные анти-ЬРО антитела, данные могут демонстрировать снижение уровней РО благодаря секвестрации РО антителом, за которым следует повышение, поскольку этот эффект снижается, после этого происходит последующее снижение, если лечение было эффективным для лечения метастатического колоректального рака.

Если концентрация РО в крови, сыворотке или плазме ниже предварительно определенного порогового значения менее чем приблизительно 50, 40, 30, 20, 10, 5, 2, 1 пМ или меньше, это указывает на эффективность лечения метастатического колоректального рака. Другие пороговые значения концентрации РО, которые являются показательными, также являются возможными и легко определяются средним специалистом в данной области техники.

Способы определения присутствия колоректального рака

Субъекты могут подвергаться анализу для определения, имеют ли они повышенные уровни РО в жидкостях организма, таких как кровь, плазма, сыворотка или другие, по сравнению с приемлемой базовой линией, для целей определения присутствия первичного или метастатического колоректального рака или рецидивов колоректального рака после лечения.

При этом субъект может представлять собой такого, для которого является желательным определить, какой колоректальный рак, первичный или метастатический, присутствует у субъекта. У таких субъектов повышенные уровни РО по сравнению с базовой линией свидетельствуют о присутствии колоректального рака. Не имея намерения связывать себя какой-либо конкретной теорией операции, предполагается, что поскольку размер и/или степень колоректального рака у субъекта повышается, то системные и/или локализованные уровни РО также повышаются у субъекта.

Субъект также может представлять собой такого, который ранее подвергался лечению от первичного колоректального рака, для которого является желательным определить, метастазировал ли колоректальный рак к отдаленным тканям или органам. У таких субъектов повышенные уровни РО по сравнению с базовой линией свидетельствуют о присутствии метастатического колоректального рака. Также для таких субъектов способы в соответствии с настоящей заявкой являются полезными, среди прочего, для определения, было ли или нет назначенное лечение эффективным для предотвращения метастатического колоректального рака. Не имея намерения связывать себя какой-либо конкретной теорией операции, предполагается, что поскольку количество и/или размер метастазов у субъекта повышается, то системные и/или локализованные уровни РО также повышаются у субъекта.

Кроме того, он может представлять собой такого, который ранее подвергался лечению от колоректального рака, первичного или метастатического, у которого рак очевидным образом исчез и для которого является желательным определить, излечился ли колоректальный или появился вновь. У таких субъектов повышенные уровни РО по сравнению с базовой линией свидетельствуют о том, что колоректальный рак возник вновь. Не имея намерения связывать себя какой-либо конкретной теорией операции, предполагается, что поскольку размер и/или степень рецидивирующего колоректального рака у субъекта

- 24 026944 повышается, то системные и/или локализованные уровни Р0 также повышаются у субъекта.

С учетом открытий, описанных в данной заявке, касающихся того, что метастатический колоректальный рак секретирует Р0 и является чувствительным к Р0, настоящая заявка также обеспечивает способы отбора субъектов, которые могут получить преимущества от лечения путем введения анти-Р0 антитела. Таким образом, субъекты могут подвергаться скринингу с целью определения, имеют ли они повышенный уровни Р0 в плазме и/или сыворотке по сравнению с базовой линией. После идентификации субъектов лечащие врачи могут назначить дополнительные исследования для подтверждения присутствия метастатического колоректального рака у субъекта. Если метастатический колоректальный рак подтверждается, то лечение, включая введение анти-№0 антитела, может быть инициировано.

Скрининг может осуществляться как часть обычной проверки лечащим врачом субъекта или как часть инициатив общественных организаций по охране здоровья, которые являются нацеленными на большие популяции субъектов. Эти субъекты являются членами определенных субпопуляций с более высоким, чем средний, риском развития метастатического колоректального рака. Такие группы включают, но без ограничения таковыми, субъектов, имеющих близких родственников (родители, братья, сестры или дети), которые имели колоректальный рак, субъектов, которые имеют историю колоректальных полипов, субъектов, которые являются тучными, субъектов, которые курят, и субъектов, которые являются физически неактивными. Другие такие субъекты представляют собой тех, которые были диагностированы как такие, которые имеют язвенный колит, болезнь Крона или наследственный аденоматозный полипоз (ЕАР), или те, которые имеют мутации в гене НМРСС, мутации в гене АРС, или других генах, ассоциированных с повышенным риском колоректального рака. Другие группы включают субъектов, ранее диагностированных и подвергнутых успешному лечению колоректального рака.

Концентрации Р0 могут измеряться при использовании методик, известных среднему специалисту, таких как, но без ограничения таковыми, К1А и ЕЫ8А. Способы анализа, такие как те, что основаны на антителах, специфических для №0, могут осуществляться при использовании не-нейтрализующих или нейтрализующих антител, таких как те, что раскрытые в данной заявке, в соответствии со знанием среднего специалиста в области техники.

На основе определения повышенных уровней Р0 при использовании способов в соответствии с настоящей заявкой команда врачей может потом решить, предпринимать ли дополнительные исследования для подтверждения присутствия колоректального рака или рецидивов колоректального рака после лечения, или непосредственно перейти к лечению субъекта.

Могут использоваться различные базовые линии, с которыми сравнивают уровни Р0, измеренные у субъекта. Базовая линия устанавливается, например путем измерения уровней Р0 в жидкости тела, которая представляет интерес, образцы которой были взяты у того же субъекта ранее. Могут быть взяты такие образцы, и уровни Р0 измеряются при предварительно определенных интервалах времени. В неограничивающем примере уровни Р0 измеряются еженедельно или ежемесячно в течение первых шести месяцев после окончания лечения, потом один раз в три месяца до второй годовщины окончания лечения и потом каждые шесть месяцев или каждый год после этого. Другие предварительно определенные интервалы также являются возможными.

Базовая линия может быть установлена из среднего значения уровней Р0 в популяции индивидуумов с характеристиками, подобными таковым для субъекта, у которого берут образец для определения метастазов колоректального рака или рецидивов. Такие характеристики могут включать, но не обязательно являются ограниченными полом, возрастом, стадией первичной колоректальной опухоли перед воздействием таких способов лечения, их комбинаций или других факторов. Причем в оценке состояния субъекта может использоваться как специфическая для субъекта базовая линия, так и базовая линия, полученная для популяции.

В соответствии со знаниями среднего специалиста в данной области техники уровни Р0 в образцах от субъекта, которые превышают определенный порог по отношению к базовой линии, считаются такими, которые являются показательными для колоректального рака или колоректального рака, который повторно появился после лечения. Команда врачей может после этого провести анализы для подтверждения колоректального рака. Неограничивающие примеры таких анализов включают эксплоративную хирургию для определения колоректального рака, рентгенографический анализ для определения колоректального рака, анализ стула субъекта для определения скрытой крови, колоноскопию, анализ образца, полученного от субъекта на присутствие генных мутаций, таких как в гене НМРСС или АРС гене, которые являются показательными для повышенного риска колоректального рака, и анализ образца, полученного от субъекта, на присутствие биологического фактора, такого как канцероэмбриональный антиген (СЕА), что является показательным для колоректального рака.

Поскольку пища обычно повышает синтез и секрецию гастрина, пища может приводить к временным повышениям уровней Р0 в крови, что может препятствовать правильному измерению Р0, который продуцируется метастазами колоректального рака или рецидивирующим колоректальным раком. Для того чтобы избежать этого эффекта, особенно тогда, когда уровни Р0 измеряются в плазме и/или сыворотке, образцы могут быть взяты от субъектов после голодания в течение достаточного периода времени, как может быть легко определено средним специалистом в данной области техники.

- 25 026944

Фармацевтические композиции

Анти-ЬРО антитела для применения в способах в соответствии с настоящей заявкой могут быть рецептированы в виде композиции. Необязательно, композиции могут включать один или более дополнительных терапевтических агентов, таких как химиотерапевтические агенты или другие антитела с терапевтической эффективностью против метастатического колоректального рака или рецидивов колоректального рака. Композиции обычно будут поставляться как часть стерильной фармацевтической композиции, которая в норме будет включать фармацевтически приемлемый носитель. Такая композиция может находиться в любой приемлемой форме в зависимости от желаемого способа введения ее пациенту.

Анти-РО антитела могут вводиться субъекту разнообразными путями, типично парентерально, например, путем подкожной, внутривенной, интраперитонеальной или внутримышечной инъекции. Введение может осуществляться в виде одной или более болюсных инъекций, или в виде одной или более инфузий. Другие пути введения также являются возможными в соответствии со знаниями специалиста в данной области техники. Наиболее приемлемый путь для введения в любом конкретном случае будет зависеть от частной композиции, которая вводится, и характеристик субъекта, таких как возраст или пол.

Фармацевтические композиции могут быть традиционно представлены в виде единичных доз, содержащих предварительно определенное количество анти-ЬРО антитела в соответствии с данной заявкой на дозу. Такая единица может содержать, например, но не ограничиваясь, от 5 мг до 5 г, например, от 10 мг до 1 г, или от 20 до 50 мг. Фармацевтически приемлемые носители для применения в заявке могут приобретать разнообразные формы в зависимости, например, от способа введения.

Фармацевтические композиции в соответствии с данной заявкой могут быть получены для хранения в виде лиофилизированных композиций или водных растворов путем смешивания антитела, обладающего достаточной степенью чистоты, с необязательными фармацевтически приемлемыми носителями, наполнителями или стабилизаторами, которые типично используются в области техники (они все обозначаются в данной заявке как носители), то есть, буферными агентами, стабилизирующими агентами, консервантами, изотоническими агентами, неионными детергентами, антиоксидантами и другими вспомогательными добавками. См. КепипдЮп'в РЬагтасеиБса1 8с1епсев, 16-ое издание (0во1, ред. 1980). Такие добавки должны быть нетоксическими для реципиентов в используемых дозировках и концентрациях.

Буферные агенты помогают поддерживать рН в интервале, который приближен к физиологическим условиям. Они могут присутствовать при концентрации, которая колеблется в интервале от приблизительно 2 мМ до приблизительно 50 мМ. Приемлемые буферные агенты для применения в настоящей заявке включают как органические, так и неорганические кислоты и их соли, такие как цитратные буферы (например, смесь цитрат мононатрия - цитрат динатрия, смесь лимонная кислота - цитрат тринатрия, смесь лимонная кислота - цитрат мононатрия и т.д.), сукцинатные буферы (например, смесь янтарная кислота - сукцинат мононатрия, смесь янтарная кислота - гидроокись натрия, смесь янтарная кислота сукцинат динатрия, и т.д.), тартратные буферы (например, смесь винная кислота - тартрат натрия, смесь винная кислота - тартрат калия, смесь винная кислота - гидроокись натрия, и т.д.), фумаратные буферы (например, смесь фумаровая кислота - фумарат мононатрия, смесь фумаровая кислота - фумарат динатрия, смесь фумарат мононатрия - фумарат динатрия и т.д.), глюконатные буферы (например, смесь глюконовая кислота - глюконат натрия, смесь глюконовая кислота - гидроокись натрия, смесь глюконовая кислота - глюконат калия и т.д.), оксалатный буфер (например, смесь щавелевая кислота - оксалат натрия, смесь щавелевая кислота -гидроокись натрия, смесь щавелевая кислота - оксалат калия и т.д.), лактатные буферы (например, смесь молочная кислота - лактат натрия, смесь молочная кислота - гидроокись натрия, смесь молочная кислота - лактат калия, и т.д.) и ацетатные буферы (например, смесь уксусная кислота - ацетат натрия, смесь уксусная кислота - гидроокись натрия, и т.д.). Дополнительно могут использоваться фосфатные буферы, гистидиновые буферы и соли триметиламина, такие как Трис.

Консерванты могут прибавляться для задержки микробного роста, они могут прибавляться в количествах, которые колеблются в интервале 0,2-1% (вес./об.).

Приемлемые консерванты для применения в настоящей заявке включают фенол, бензиловый спирт, мета-крезол, метил парабен, пропил парабен, октадецилдиметилбензил аммоний хлорид, галиды бензалкония (например, хлорид, бромид и иодид), хлорид гексаметония и алкил парабены, такие как метил или пропил парабен, катехол, резорцинол, циклогексанол и 3-пентанол. Изотонические агенты, иногда известные как стабилизаторы могут прибавляться для обеспечения изотоничности жидких композиций в соответствии с настоящей заявкой и включают многоатомные сахарные спирты, например, трехатомные или более высокие сахарные спирты, такие как глицерин, эритритол, арабитол, ксилитол, сорбитол и маннитол. Стабилизаторы относятся к широкой категории наполнителей, которые могут варьировать по своей функции от объемообразующего агента до добавки, которая солюбизирует терапевтический агент или помогает предотвратить денатурацию или приклеивание к стенке контейнера. Типичные стабилизаторы могут представлять собой многоатомные сахарные спирты (перечислены выше); аминокислоты, такие как аргинин, лизин, глицин, глутамин, аспарагин, гистидин, аланин, орнитин, Ь-лейцин, 2фенилаланин, глутаминовая кислота, треонин и т.д., органические сахара или сахарные спирты, такие как лактоза, трегалоза, стахилоза, маннитол, сорбитол, ксилитол, рибитол, миоинозитол, галактитол, глице- 26 026944 рол и тому подобное, включая циклитолы, такие как инозитол; полиэтиленгликоль; аминокислотные полимеры; содержащие серу восстанавливающие агенты, такие, как мочевина, глутатион, липоевая кислота, тиогликолат натрия, тиоглицерол, а-монотиоглицерол и тиосульфат натрия; полипептиды с низким молекулярным весом (например, пептиды из 10 остатков или меньше); белки, такие как человеческий сывороточный альбумин, бычий сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулины; гидрофильные полимеры, такие как поливинилпирролидон; моносахариды, такие как ксилоза, манноза, фруктоза, глюкоза; дисахариды, такие как лактоза, мальтоза, сахароза и трисахариды, такие как раффиноза; и полисахариды, такие как декстран. Стабилизаторы могут присутствовать в интервале от 0,1 до 10000 весовых частей на весовую часть активного белка.

Неионные поверхностно-активные вещества или детергенты (также известные как смачивающие агенты) могут прибавляться для того, чтобы помочь солюбилизировать терапевтический агент, а также для того, чтобы защитить терапевтический белок от индуцированной перемешиванием агрегации, что также помогает композиции подвергаться сдвигу поверхности без денатурации белка. Приемлемые неионные поверхностно-активные вещества включают полисорбаты (20, 80 и т.д.), полиоксамеры (184, 188, и т.д.), полиолы Плюроника, моноэтеры полиоксиэтилен сорбитана (ТВИН®-20, ТВИН®-80, и т.д.). Неионные поверхностно-активные вещества могут присутствовать в интервале от приблизительно 0,05 до приблизительно 1,0 мг/мл, например, приблизительно от 0,07 до приблизительно 0,2 мг/мл. Однако поверхностно-активные вещества имеют тенденцию к связыванию с антителами, и могут нарушать их конформацию. Таким образом, при использовании стабилизирующие концентрации должны быть низкими и устанавливаются экспериментально.

Дополнительные разнообразные наполнители могут включать хелатирующие агенты (например, ЭДТА), антиоксиданты (например, аскорбиновую кислоту, метионин, витамин Е) и сорастворители.

Анти-ЬРО антитела могут вводиться отдельно или в виде смесей одного или более отдельных анти№О антител, или в смеси или комбинации с другими агентами, полезными для предотвращения метастазов колоректального рака или рецидивов, включая, но без ограничения таковыми, химиотерапевтические агенты, агенты для биологической терапии и агенты для терапии на основе антитела (например, бевацизумаб).

Фармацевтические наборы

Фармацевтический набор представляет собой упаковку, включающую анти-ЬРО антитело в соответствии с данной заявкой (например, либо в лиофилизированной форме, либо в виде водного раствора) и один или более из следующих: по крайней мере, второй терапевтический агент, как описывается гделибо в данной заявке; устройство для введения анти-ЬРО антитела, например, иглу и/или шприц; и воду фармацевтической марки или буфер для ресуспендирования или разведения антитела, если антитело находится в лиофилизированной или концентрированной форме. Наборы могут также включать инструкции для получения композиции антител и/или введения композиции пациенту.

Каждая единичная доза композиции анти-ЬРО антитела может быть упакована отдельно, и набор может содержать одну или более единичных доз (например, две единичные дозы, три единичные дозы, четыре единичные дозы, пять единичных доз, семь единичных доз, восемь единичных доз, десять единичных доз или более). Одна или более единичных доз каждая может помещаться в шприц или содержаться в пакете или подобном резервуаре, приемлемом для присоединения к капельнице для внутривенного введения.

Эффективные дозировки

Композиции, включающие нейтрализующие анти-ЬРО антитела в соответствии с настоящей заявкой, в общем случае вводятся субъекту, который нуждается в лечении или предотвращении метастазов колоректального рака или предотвращении рецидивов колоректального рака, в дозировке, эффективной для достижения, по крайней мере, частично, желаемого результата.

В отношении лечения метастазов колоректального рака терапевтическое преимущество означает, среди прочего, любое облегчение метастатического колоректального рака, остановку или замедление роста метастазов колоректального рака, уменьшение количества и/или размера таких метастазов у субъекта, снижение притока крови к метастазам колоректального рака, снижение метаболизма метастазов колоректального рака, снижение тяжести метастатического колоректального рака, ингибирование пролиферации или повышение апоптоза клеток метастатического колоректального рака, остановку и отсрочку ухудшения симптомов и признаков, ассоциированных с метастатическим колоректальным раком у субъекта, позволяя осуществлять хирургическое удаление метастазов колоректального рака, где такое удаление не будет возможным перед осуществлением лечения, повышение средней продолжительности жизни, комфортности и качества жизни субъекта, имеющего метастатический колоректальный рак, или снижение боли у такого субъекта. Полное излечение от метастатического колоректального рака, хотя и является желательным, не является необходимым для существования терапевтического преимущества.

Терапевтическое преимущество может также измеряться с помощью беспрогрессивного выживания (РР8). В этом контексте можно измерять, сколько занимает у субъекта, который изначально имеет стадию II, III или IV колоректального рака, развивать более высокую стадию заболевания. Повышение РР8 на 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более месяцев считается таким, которое обеспечивают терапевтическое пре- 27 026944 имущество.

Размер опухоли, количество и метаболизм метастатического колоректального рака могут измеряться при использовании различных методик сканирования, включая, но без ограничения, СТ, МК1, функциональную МК1, 8РЕСТ и РЕТ, а также других способов, известных среднему специалисту в области техники.

Терапевтическое преимущество может также коррелировать с одним или более идентификаторов критических точек. В качестве примера, но не ограничения, продукция определенных белков или других факторов метастатического колоректального рака, таких, как прогастрин или канцероэмбриональный антиген (СЕА), может измеряться у субъекта в течение периода времени с помощью снижения уровней фактора, который является показательным для терапевтического преимущества.

В отношении предотвращения метастазов колоректального рака можно сказать, что эффективная дозировка является такой, которая является эффективной, по крайней мере, для частичного предотвращения метастатического колоректального рака, о чем свидетельствует, среди прочего, отсутствие метастазов колоректального рака, отсрочка, остановка или замедление роста метастазов колоректального рака, уменьшение количества и/или размера каких-либо метастазов, которые могут возникать в перспективе, и ингибирование или препятствующее воздействие на один или более механических этапов, с помощью которых клетки метастатического колоректального рака являются способными распространяться от первичной опухоли. Полное предотвращение метастазов колоректального рака, хотя и является желательным, не является необходимым для существования терапевтического преимущества.

В отношении предотвращения рецидивов колоректального рака можно сказать, что эффективная дозировка является такой, которая является эффективной, по крайней мере, для частичного предотвращения рецидивов колоректального рака, о чем свидетельствует, среди прочего, отсутствие рецидивов колоректального рака, поддержание ремиссии колоректального рака, отсрочка, остановка или замедление повторного появления или повторного роста колоректального рака, или роста новой колоректальной опухоли у субъекта после лечения, где начальный колоректальный рак стал неопределяемым или очевидным образом исчез. Эффективность для предотвращения рецидивов колоректального рака также подтверждается, среди прочего, с помощью уничтожения стволовых клеток колоректального рака, отсрочкой, остановкой, ингибированием или замедлением роста или пролиферации стволовых клеток колоректального рака, повышением апоптоза стволовых клеток колоректального рака, или возникновением дифференциации стволовых клеток колоректального рака в клетки, неспособные осуществлять свой вклад в формирование или рост колоректального рака. Как описывается где-либо в данной заявке, стволовые клетки колоректального рака идентифицируются как такие, которые имеют одно или более фенотипических свойств, характерных для таких клеток, включая, но без ограничения, экспрессию определенных клеточных маркеров, способность расти в виде сфероидов при условиях культивирования с низким прикреплением и способность инициировать новый опухолевый рост после трансплантации. Полное предотвращение рецидивов колоректального рака, хотя и является желательным, не является необходимым для существования терапевтического преимущества

Связывание всего прогастрина с необходимостью не требуется для достижения терапевтической эффективности. Скорее, снижение концентрации прогастрина в опухоли, системно, в частности, в жидкостях организма, таких как асцитная жидкость, жидкости из плевральных выпотов, цереброспинальная жидкость, лимфа, кровь, плазма, сыворотка, или другие, может также быть эффективным.

В соответствии со знания среднего специалиста в данной области техники доза композиции антиЬРО антитела может титроваться у пациента так, чтобы снизить концентрацию свободного ЬРО в ткани или жидкости организма, которая представляет интерес, в предварительно определенное время после введения по крайней мере приблизительно на 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 или 100%, или приблизительно 5-10%, приблизительно 10-15%, приблизительно 15-20%, приблизительно 20-25%, приблизительно 25-30%, приблизительно 30-35%, приблизительно 35-40%, приблизительно 40-45%, приблизительно 45-50%, приблизительно 50-55%, приблизительно 55-60%, приблизительно 60-65%, приблизительно 6570%, приблизительно 70-75%, приблизительно 75-80%, приблизительно 80-85%, приблизительно 85-90% или приблизительно 90-95%, или процентное снижение концентрации свободного ЬРО колеблется между какими-либо из указанных выше значений.

Количество вводимого анти-ЬРО антитела будет зависеть от разнообразных факторов, включая размер и вес субъекта, который подвергается лечению, формы, способа и сайта введения, терапевтического режима (например, используется ли второй терапевтический агент), возраста и состояния конкретного субъекта, который подвергается лечению, уровня РО, определенного в крови указанного субъекта перед началом лечения, чувствительности субъекта, которого подвергают лечению с помощью анти-РО антитела. Приемлемая дозировка может быть легко определена квалифицированным специалистом в области техники. В конечном итоге, лечащий врач будет определять приемлемые дозировки, которые используются. Эта дозировка может быть повторяемой так часто, как это является приемлемым. Если развиваются побочные эффекты, то количество и/или частота введения дозировки может изменяться или снижаться в соответствии с нормальной клинической практикой. Надлежащая дозировка и режим лечения могут устанавливаться путем мониторинга развития терапии при использовании способов в соответ- 28 026944 ствии с настоящей заявкой или других способов, известных среднему специалисту в области техники.

Эффективные дозировки могут оцениваться изначально из анализов ίη уйго. Например, начальная доза для применения у животных может быть рецептирована для достижения концентрации анти-ЬРО антитела в циркулирующей крови или сыворотке, которая находится на уровне или выше связывающей аффинности антитела для прогастрина, как измеряется ίη уйго. Подсчет дозировок для достижения таких концентраций в циркулирующей крови или сыворотке с учетом биодоступности конкретного антитела находится в пределах способностей среднего специалиста в области техники. Для руководства можно отослать читателя к Части 1: Сеиега1 Рг1ис1р1е5 в Оооάтаη аий ОПтап'5 ТЬе РЬагтасо1одюа1 Ва818 о£ ТЬегареиИск, 11-ое изд., Нагитам, Ю., и др., ред., МсСга\\-НП1 РюГе^ют-й, и ссылкам, которые там приводятся. Начальные дозировки могут также оцениваться из данных ίη У1уо, таких как животные модели. Средний специалист в области техники может обычным образом адаптировать эту информацию для определения дозировок, приемлемых для введения человеку.

Внутривенная доза может быть определена для индивидуального субъекта путем измерения концентрации РО в сыворотке или плазме индивидуума несколько раз на протяжении от нескольких дней до нескольких недель перед лечением и подсчета количества анти-РО антитела, которое будет насыщающим, то есть, количества, которое будет достаточным для связывания всего РО. Как будет оценено квалифицированными специалистами, количество какого-либо специфического антитела, необходимое для достижения насыщения для данной концентрации РО в плазме или сыворотке крови, будет зависеть, отчасти, от константы аффинности конкретного антитела. Способы подсчета насыщающих количеств для специфических анти-РО антител, которые представляют интерес, являются хорошо известными.

Для достижения насыщения может вводиться количество, которое является большим, чем подсчитанное насыщающее количество, например, по крайней мере, в 2-, 3-, 4-, 5-, 6-, 7-, 8-, 9- или даже 10 раз более высокое, чем подсчитанное насыщающее количество. Для способов введения, отличных от внутривенного, количество может доводиться на основе фармакокинетики и биодоступности, что является хорошо известным в данной области техники.

Эффективная доза композиции анти-ЬРО антитела может колебаться от приблизительно 0,001 мг/кг до приблизительно 250 мг/кг на одно (например, болюс) введение, множественное введение или беспрерывное (например, инфузия) введение, или может представлять любой эффективный интервал или значение в пределах этого интервала в зависимости от типа рака, рецидивы которого предполагаются для предотвращения, способа введения и возраста, веса и состояния субъекта. Каждая доза будет колебаться от приблизительно 0,1 до приблизительно 0,5 мг/кг; от приблизительно 0,25 до приблизительно 0,75 мг/кг; от приблизительно 0,5 до приблизительно 1 мг/кг; от приблизительно 2 мг/кг; от приблизительно 1,5 до приблизительно 2,5 мг/кг; от приблизительно 2 до приблизительно 3 мг/кг; от приблизительно 2,5 до приблизительно 3,5 мг/кг; от приблизительно 3 до приблизительно 4 мг/кг; от приблизительно 3,5 до приблизительно 4,5 мг/кг; от приблизительно 4 до приблизительно 5 мг/кг; от приблизительно 5 до приблизительно 7 мг/кг; от приблизительно 6 до приблизительно 8 мг/кг; от приблизительно 7 до приблизительно 9 мг/кг; от приблизительно 8 до приблизительно 10 мг/кг; от приблизительно 10 до приблизительно 15 мг/кг; от приблизительно 12,5 до приблизительно 17,5 мг/кг; от приблизительно 15 до приблизительно 20 мг/кг; от приблизительно 17,5 до приблизительно 22,5 мг/кг; от приблизительно 20 до приблизительно 25 мг/кг; от приблизительно 22,5 до приблизительно 27,5 мг/кг; от приблизительно 25 до приблизительно 30 мг/кг; от приблизительно 30 до приблизительно 40 мг/кг; от приблизительно 35 до приблизительно 45 мг/кг; от приблизительно 40 до приблизительно 50 мг/кг; от приблизительно 45 до приблизительно 55 мг/кг; от приблизительно 50 до приблизительно 60 мг/кг; от приблизительно 55 до приблизительно 65 мг/кг; от приблизительно 60 до приблизительно 70 мг/кг; от приблизительно 65 до приблизительно 75 мг/кг; от приблизительно 70 до приблизительно 80 мг/кг; от приблизительно 75 до приблизительно 85 мг/кг; от приблизительно 80 до приблизительно 90 мг/кг; от приблизительно 85 до приблизительно 95 мг/кг; от приблизительно 90 до приблизительно 100 мг/кг; от приблизительно 95 до приблизительно 105 мг/кг; от приблизительно 100 до приблизительно 150 мг/кг; от приблизительно 125 до приблизительно 175 мг/кг; от приблизительно 150 до приблизительно 200 мг/кг; от приблизительно 175 до приблизительно 225 мг/кг; от приблизительно 200 до приблизительно 250 мг/кг. Другие интервалы дозировок также являются возможными.

Количество, частота и длительность введений будут зависеть от разнообразных факторов, таких, как возраст, вес и состояние заболевания пациента. Таким образом, в неограничивающих примерах терапевтический режим для введения может длиться в течение 1 дня или более, 2 дней или более, 3 дней или более, 4 дней или более, 5 дней или более, 6 дней или более, 1 недели или более, 2 недель до неопределенного срока, в течение от 2 недель до 6 месяцев, от 3 месяцев до 5 лет, от 6 месяцев до 1 или 2 лет, от 8 месяцев до 18 месяцев, или тому подобное. Необязательно, терапевтический режим обеспечивает повторяемое введение, например один раз в день, два раза в день, через день, один раз в три дня, один раз в пять дней, один раз в неделю, один раз в две недели или один раз в месяц. Повторяемое введение может осуществляться при той же дозе или при отличной дозе. Введение может повторяться один раз, два раза, три раза, четыре раза, пять раз, шесть раз, семь раз, восемь раз, девять раз, десять раз или более. Терапевтически эффективное количество анти-ЬРО антитела может вводиться в виде единичной дозы или на

- 29 026944 протяжении курса терапевтического режима, например, в течение курса одной недели, двух недель, трех недель, одного месяца, трех месяцев, шести месяцев, одного года или более длительно.

Примеры

Пример 1. Экспрессия гастринового гена в клетках метастатического колоректального рака

Этот пример описывает экспрессию гастринового (ОА8Т) гена в клеточных линиях человеческого первичного колоректального рака НТ29, НСТ116, ККО, 8А480 и ΌΡΟ, и клеточных линиях метастатического колоректального рака 8А620 и Т84. Также подвергали анализу клетки, изолированные из образца биопсии от первичной колоректальной опухоли человека (СКС1). 8А620 клетки изначально имели происхождение от метастаза лимфатического узла пациента, диагностированного со стадией С колоректальной аденокарциномы Дюка. Т84 клетки изначально имели происхождение от метастаза легкого пациента, диагностированного с колоректальной карциномой.

A. Способы

При использовании стандартных методик экспрессию мРНК ОА8Т подвергали количественной оценке при использовании количественной ОТ-ПЦР из препаратов РНК линий клеток НТ29, НСТ116, ККО, 8А480. ΌΡΌ1, 8А620 и Т84. Данные выражали по сравнению с уровнем экспрессии мРНК гастрина, обнаруженного в клеточной линии ККО первичного колоректального рака. ККО клетки в норме экспрессировали низкий уровень прогастрина. Следует отметить, что относительные уровни мРНК гастрина являются представленными в логарифмической шкале.

B. Результаты

Уровни экспрессии гена гастрина, измеренные с помощью количественной ОТ-ПЦР являются представленными на фиг. 1. Все исследованные клетки первичного и метастатического колоректального рака экспрессировали продукт гастринового гена, но на различных уровнях. С помощью посттрансляционного процессинга продукт гена гастрина может быть превращен в прогастрин.

Подобный эксперимент осуществляли при использовании линии клеток Со1о-205 метастатического колоректального рака, но результаты не были повторяемыми.

Пример 2. Экспрессия гена гастрина в первичной и метастатической колоректальных опухолях, хирургически удаленных из пациентов

Этот пример описывает экспрессию гастринового (ОА8Т) гена в соответствующих первичной и метастатической колоректальных опухолях, хирургически удаленных из пациентов.

A. Способы

Первичные и метастатические колоректальные опухоли хирургически удаляли из пациентов в соответствии с приемлемыми этическими инструкциями. При использовании стандартных методик получали РНК из образцов опухолевой ткани и мРНК гастрина измеряли с помощью количественной ОТ-ПЦР. Экспрессию мРНК гастрина в метастатической опухоли нормализовали по отношению к уровню экспрессии в соответствующей первичной опухоли, взятой у того же пациента.

B. Результаты

Уровни мРНК гастрина, экспрессированные в метастатической колоректальной опухоли, полученной от 11 пациентов по отношению к экспрессии в соответствующей первичной опухоли от тех же пациентов, являются представленными на фиг. 2. Несмотря на то, что все изученные первичные и метастатические колоректальные опухоли экспрессировали ген гастрина, уровень экспрессии в метастатических опухолях по отношению к соответствующей первичной опухоли значительно варьировал для различных пациентов.

Пример 3. Секреция прогастрина клетками метастатического рака

Этот пример описывает количественную оценку секреции прогастрина тремя различными клетками метастатического колоректального рака.

A. Способы

Клетки выращивали в стандартных пластиковых флаконах на 75 см до достижения 60% конфлюэнтности. Потом среду удаляли и клетки один раз промывали с помощью РВ8. Потом к флаконам прибавляли двадцать мл среды Μ11 (без фенолового красного), и клетки инкубировали в течение дополнительных 48 ч. Потом среду собирали, центрифугировали при 1000 д в течение 5 мин для удаления клеточного дебриса и замораживали при -80°С. Потом клетки трипсинизировали и подсчитывали.

Для измерения секретированного прогастрина замороженную ростовую среду медленно оттаивали на льду и потом концентрировали 40-кратно до объема 500 мкл при использовании устройства для концентрации белка (1соп, Р1егсе) путем центрифугирования при 2,500 д в течение 45 мин. Концентрацию прогастрина потом измеряли при использовании методики сэндвич ЕЬ18А.

B. Результаты

Фиг. 3 показывает концентрацию прогастрина, продуцируемого в среде тремя линиями клеток метастатического колоректального рака. Данные являются выраженными в виде концентрации прогастрина в пМ на миллион клеток на 48 ч роста. В этом эксперименте Со1о-205 клетки не продуцировали РО в пределах используемых границ определения анализа.

- 30 026944

Пример 4. Концентрации прогастрина в плазме и крови у пациентов, диагностированных с первичный и метастатическим колоректальным раком

Этот пример описывает количественную оценку уровней прогастрина в плазме и сыворотке у пациентов с первичным колоректальным раком и при отсутствии метастазов, у пациентов с метастатическим колоректальным раком и у пациентов с метастатическим колоректальным раком, у которых первичная опухоль была удалена хирургическим путем.

С. Способы

Концентрации прогастрина в плазме и сыворотке измеряли у здоровых индивидуумов в качестве контроля и у пациентов с колоректальным раком. Здоровые контрольные образцы (п=104) получали из банка крови. Пациенты с колоректальным раком включали три группы. Первая, пациенты, диагностированные в момент взятия образца с первичным раком без метастазов (Т+М-; п=16). Вторая, пациенты, диагностированные в момент взятия образца с метастатическим заболеванием (Т+М+; п=24). И третья, пациенты, которые на момент взятия образца были диагностированы как такие с метастатическим заболеванием, но у которых первичная опухоль была удалена хирургически (Т-М+; п=46). Большинство пациентов с метастатическим заболеванием, то есть, 15 из 24 Т+М+ пациентов, и 41 из 46 Т-М+ пациентов, подвергались или уже были подвергнуты химиотерапии на момент взятия образцов.

Качественную оценку уровней прогастрина в плазме или сыворотке осуществляли при использовании специфической для прогастрина методики сэндвич ЕЫ8А, подобной той, что была описана ранее.

Ячейки №тс Мах18ОЕР планшетов на 96 ячеек покрывали с помощью первого специфического для прогастрина антитела так, как описано ниже. Анти-прогастриновые поликлональные антитела, специфические для карбокси-терминальных участок прогастрина, разводили до концентрации 3 мкг/мл в растворе 50 мМ, рН 9,6 буфера на основе карбоната натрия/бикарбоната в МИПО воде. В общей сложности 100 мкл раствора антитела прибавляли к каждой ячейке планшетов на 96 ячеек и инкубировали в течение ночи при 4°С. После связывания раствор антитела удаляли из ячеек, которые потом трижды промывали с помощью 100 мкл промывочного буфера (1Х РВ8 /0,1% Твин-20). Общий объем 100 мкл блокирующего буфера (1Х РВ8/0,1% Твин-20/0,1% В8А) потом прибавляли к каждой ячейке и инкубировали в течение 2 часов при 22°С. Блокирующий буфер потом удаляли и ячейки трижды промывали с помощью промывочного буфера. Образцы плазмы и сыворотки, изолированные от пациентов, потом прибавляли к ячейкам в объеме 100 мкл в сериях разведений, типично разведения 1:1, 1:2, 1:5 и 1:10 и потом инкубировали в течение 2 чпри 22°С. Образцы плазмы и сыворотки анализировали в двукратной повторности.

Оценки также включают две стандартные кривые. Первую стандартную кривую получают при использовании разведений рекомбинантного прогастрина до получения заключительного количества 1 нг, 0,5 нг, 0,25 нг, 0,1 нг, 0,05 нг, 0,01 нг, и 0 нг на Ячейку. Вторую стандартную кривую, которая служит в качестве негативного контроля, получают из негативной по прогастрину человеческой сыворотки, разведенной в блокирующем буфере при тех же разведениях, что и исследуемые образцы, то есть, 1:1, 1:2, 1:5 и 1:10. Альтернативно, когда образцы плазмы подвергают оценке, вторую стандартную кривую, которая служит в качестве негативного контроля, получают из негативной по прогастрину человеческой плазмы, разведенной в блокирующем буфере при тех же разведениях, что и исследуемые образцы, то есть, 1:1, 1:2, 1:5 и 1:10.

После завершения инкубации с образцами плазмы или сыворотки, содержимое ячейки удаляют, и ячейки трижды промывают с помощью промывочного буфера, 100 мкл/ячейка, после чего прогастрин, связанный с первым антителом, определяют при использовании второго антитела, специфического для прогастрина, так, как описано ниже.

Слитые с биотином антипрогастриновые поликлональные или моноклональные антитела, специфические для амино-терминального участка прогастрина, разводят в блокирующем буфере до концентрации от 0,1 до 10 мкг/мл, в зависимости от антитела. В общей сложности 100 мкл раствора антитела потом прибавляют к каждой ячейке и инкубируют в течение 1 часа при 22°С.

После завершения связывания вторичного антитела планшеты трижды промывают с помощью промывочного буфера, 100 мкл/ячейка, после чего 100 мкл раствора стрептавидин-НЕР (25 нг/мл в блокирующем буфере) прибавляют к каждой ячейке и инкубируют в течение 1 ч при 22°С. После завершения инкубации с раствором стрептавидин-НЕР планшеты трижды промывают с помощью промывочного буфера, 100 мкл/ячейка. После этого 100 мкл хемилюминесцентного субстрата, приготовленного при использовании набора

Р1егсе 8ирег81дпа1 ЕЫ8А РетЮ Махшит 8еп5ЮуПу СЬетЛиттексеп! 8иЬ51га1е прибавляют к каждой ячейке, инкубируют в течение 5 мин при комнатной температуре в темноте и потом считывают на люменометре.

На основе результатов считывания на люменометре используют анализ линейной регрессии для получения уравнения линий, соответствующих данным стандартной кривой. При использовании этого уравнения потом подсчитывают концентрацию прогастрина в различных образцах пациента.

Ό. Результаты

Диаграммы размаха (диаграмма ящик-с усами) фиг. 4 показывают 25-ый процентильный эквивалент, среднее значение и 75-ый процентильный эквивалент концентраций прогастрина в плазме сыво- 31 026944 ротки крови в трех подвергнутых анализу группах пациентов с колоректальным раком по сравнению со здоровыми контролями. Усы указывают на 5-ый и 95-ый процентильные эквиваленты концентраций прогастрина плазмы или сыворотки. Т+ или Т- указывает на то, что первичная опухоль осталась на месте или была удалена, соответственно; М+ или М- указывает на то, что метастазы определялись или не определялись у пациентов, соответственно. Табл. 4 содержит итоговые сведения статистического анализа первичных данных.

Эти данные демонстрируют, что пациенты как с первичным, так и метастатическим колоректального раком, имели повышенные уровни прогастрина в своей плазме или сыворотке по сравнению со здоровыми индивидуумами. Кроме того, уровни прогастрина оставались повышенными у пациентов с метастатическим колоректальным раком, у которых первичная опухоль была удалена хирургически. Это дает возможность предположить, что колоректальные метастазы вырабатывают прогастрин у таких пациентов.

ТАБЛИЦА 4
Анализируемая таблица	РС у СКС пациентов

Критерий Крускала-Уоллиса
Р значение	<0,0001
Точное или приблизительное Р значение 7	Гауссовская аппроксимация
Сводка по Р значению	***
В значительной ли степени варьируют средние значения (Р < 0,05)	Да
Количество групп	4
Статистика Крускала-Уоллиса	33.86

Критерий множественного сравнения Данна	Отличие в сумме рангов	Значимое ? Р < 0,05?	Сводка
Г+М- пациенты против контролен (банк крови)	51.45	Да
Г+М+ пациенты против кошролей (банк крови)	50,41	Да	4* 4*4·
Г-М+ пациенты против контролен (банк крови)	37,42	Да

Пример 5. Эффект антипрогастриновых поликлональных антител на рост 8А620 клеток метастатического колоректального рака в культуре

Этот пример описывает эффект анти-ЬРО поликлональных антител на рост клеточной линии 8А620 человеческого метастатического колоректального рака в культуре.

A. Способы

8А620 клетки, истощенные по сыворотке, высевали в планшеты на 6 ячеек, потом обрабатывали каждые 12 ч с помощью РВ8, 3 мкг/мл контрольного антитела (поликлональный кроличий античеловеческий 1дО, АГПпПу ВюКеадеШз, КеГ #8А1-600) или анти-РО поликлонального антитела. Эксперименты осуществляли в двукратной повторности, и лаборант, который осуществлял исследование, не знал содержимого растворов для обработки. Через семьдесят два часа после начала обработки количество жизнеспособных клеток в каждой ячейке подсчитывали три раза.

B. Результаты

Как показано на фиг. 5, обработка с помощью анти-РО поликлональных антител вызывала 43,5% снижение роста 8А620 клеток в течение периода времени 72 ч (р=0,0294, критерий Манна-Уитни; и=2). Результаты этого эксперимента демонстрируют, что поликлональные антитела против РО являются эффективными для снижения роста клеток метастатического колоректального рака ш νίΙΐΌ.

Пример 6. Эффект антипрогастриновых моноклональных антител на рост 8А620 клеток метастатического колоректального рака в культуре

Этот пример описывает эффект анти-ЬРО моноклональных антител на рост клеточной линии 8А620 человеческого метастатического колоректального рака в культуре.

А. Способы

8А620 клетки, истощенные по сыворотке в течение ночи, высевали в планшеты на 6 ячеек, потом обрабатывали каждые 12 ч с помощью РВ8, 3 мкг/мл контрольного антитела (мышиный античеловеческий 1дО1, СаЪюсЬет, кат. номер #411451) или четырьмя различными анти-РО моноклональными антителами, МАЪ3, МАЪ4, МАЪ2 и МАЪ1. Эксперименты осуществляли в двукратной повторности, и лаборант, который осуществлял исследование, не знал содержимого растворов для обработки. Через сорок восемь часов после начала обработки количество жизнеспособных клеток в каждой ячейке подсчитывали шесть раз и усредняли.

В отдельном эксперименте 8А620 клетки высевали в планшеты на 6 ячеек (100000 клеток на ячейку) и обрабатывали подобно тому, как описано выше, с помощью 5 мкг/мл анти-ЬРО моноклональных антител 5-23 (то есть, МАЪ5-МАЪ23) или 5 мкг/мл контрольного антитела. Через 48 ч подсчитывали ко- 32 026944 личество жизнеспособных клеток, от которого отнимали количество клеток в начале эксперимента (то есть, Т0). Количество выживших клеток в ячейках, обработанных с помощью специфического антитела, потом выражали как процент от контроля.

В. Результаты

Результаты обработки 8\¥620 клеток с помощью МАЬ1-МАЬ4, показанные на фиг. 6А, подсчитывали как среднее количество клеток на ячейку в конце эксперимента минус количество клеток, высеянных в начале эксперимента. Исходное количество и статистические данные (Критерий Манна-Уитни) являются представленными в табл. 5. Результаты этого эксперимента демонстрируют, что различные моноклональные антитела против РО являются эффективными для снижения роста 8\¥620 клеток метастатического колоректального рака ш νίΙΐΌ, по сравнению с контрольным антителом. Результаты также показывают, что в то время как все моноклональные антитела против РО были эффективными для снижения роста клеток по сравнению с контрольным антителом, два из этих антител, МАЬ3 и МАЬ4, были более эффективными, чем другие._

ТАБЛИЦА 5
Обработка антителом	Количество клеток	р-значение (обработанные против СТМаЬ)
СТ антитело-ТО	158556
МАЬЗ-ТО	50056	0,0009
МА64-Т0	52984	0,0014
МАЬЗ-ТО	115056	0,0156
МАЫ-ТО	108056	0,0009

Результаты обработки 8\¥620 клеток с помощью МАЬ5-МАЬ23, каждое из которых, в частности, способно к связыванию ЬРО, являются представленными на фиг. 6В. Как демонстрируют результаты, по сравнению с неспецифическим контрольным антителом проанализированные анти-ЬРО моноклональные антитела демонстрируют спектр эффективности для ингибирования роста клеточной линии 8\¥620 метастатического колоректального рака в культуре.

Осуществляли подобный эксперимент для определения влияния на рост обработанных с помощью МАЬ3 клеток Со1о-205 метастатического колоректального рака, однако эти результаты не были повторяемыми.

Пример 7. Эффект антипрогастриновых моноклональных антител на рост Т84 клеток метастатического колоректального рака в культуре

Этот пример описывает эффект анти-ЬРО моноклональных антител на рост клеточной линии Т84 человеческого метастатического колоректального рака в культуре.

A. Способы

Способы, которые использовали в этом эксперименте, являются подобными тем, которые использовали для измерения эффекта антипрогастриновых моноклональных антител на 8\¥620 клетки, за исключением того, что используемое анти-прогастриновое антитело представляло собой анти-ЬРО МАЬ3.

B. Результаты

Результаты, показанные на фиг. 7, подсчитывали как среднее количество клеток на ячейку в конце эксперимента минус количество клеток, высеянных в начале эксперимента. Изложение статистического анализа является представленным в табл. 6. Результаты этого эксперимента демонстрируют, что антиЬРО МАЬ3 является эффективным для снижения роста Т84 клеток метастатического колоректального рака ш νίΙΐΌ, по сравнению с контрольным антителом.

- 33 026944

Пример 8. Эффект антипрогастриновых поликлональных антител на формирование у голых мышей метастазов печени с помощью ксенотрансплантатов 8\У620 клеток

Этот пример описывает эффект анти-РО поликлональных антител на способность 8\У620 клеток формировать печеночные метастазы после трансплантации голым мышам.

A. Способы

Общее количество 5х10⁶ 8\У620 клеток вводили в селезенку каждой из 31 ВАЬВс/пиДе мышей в возрасте 6 недель. Через две минуты после инъекции клеток хирургически удаляли селезенки. Через четыре дня, необходимых для восстановления, мышей произвольным образом разделяли на три группы, каждую из которых подвергали одному из трех способов лечения. В частности, одиннадцати мышам вводили РВ8, десяти мышам вводили контрольное антитело, разведенное в РВ8, и десяти мышам вводили анти-РО поликлональные антитела, также разведенные в РВ8. Доза антитела составляла 8 мг/кг в объеме 150 мкл. Инъекции осуществляли интраперитонеально два раза в неделю в течение шести недель. Через шесть недель, после окончания курса инъекций мышей умерщвляли с помощью двуокиси углерода и удаляли печени, а количество присутствующих видимых метастазов подсчитывали. Печени и метастазы также подготавливали для заключения в парафин и иммуногистохимического анализа.

B. Результаты

Фотография печени без видимых метастазов, полученных от мышей, обработанных с помощью анти-ЬРО поликлональных антителах, является представленной на фиг. 8А. Фотографии печени с видимыми метастазами, полученные от мышей, обработанных с помощью контрольного поликлонального антитела, являются представленными на фиг. 8В. Табл. 7 показывает количество метастазов, подсчитанных в каждой печени мышей, обработанных с помощью анти-ЬРО поликлональных антител. Табл. 8 показывает количество метастазов, подсчитанных в каждой печени мышей, обработанных с помощью контрольного поликлонального антитела. Табл. 9 показывает количество метастазов, подсчитанных в каждой печени мышей, обработанных с помощью РВ8. Фиг. 9 является графическим представлением количества метастазов против группы обработки.

- 34 026944

Гистологический анализ выявил присутствие микрометастазов в срезах печени, полученных из обеих контрольных групп, которые не присутствовали в срезах, полученных из печени животных, обработанных с помощью анти-ЬРО антитела. Пример микрометастазов, обнаруженных в кровяных сосудах печени контрольного животного, является показанным на микрофоторафии, представленной на фиг. 10.

Результаты этого примера демонстрируют, что обработка с помощью анти-ЬРО антител голых мышей, которым трансплантировали клетки 8\У620. клеточной линии метастатического колоректального рака, снижала количество видимых печеночных метастазов по сравнению с мышами, которые получали контрольное антитело или только носитель. Несмотря на то, что степень снижения не достигала статистической значимости, тенденция количественных данных, а также отсутствие микрометастазов в печени обработанных с помощью анти-ЬРО антитела мышей, дает возможность предположить, что РО антитела являются эффективными при снижении частоты возникновения метастазов колоректального рака в этой модельной системе.

Пример 9. Эффект антипрогастриновых моноклональных антител на образование у голых мышей печеночных метастазов при использовании ксенотрансплантатов 8\У620 клеток

Этот пример описывает эффект анти-РО моноклональных антител на способность 8\У620 клеток формировать печеночные метастазы после трансплантации голым мышам.

A. Способы

Общее количество 5 х 10⁶ 8\У620 клеток вводили в селезенку каждой из 20 ВАЬВс/иийе мышей в возрасте 5 недель. Через две минуты после инъекции клеток хирургически удаляли селезенки. После восстановления мышей произвольным образом разделяли на две группы, каждую из которых подвергали одному из двух способов лечения. В частности, 10 мышам вводили контрольное антитело, разведенное в РВ8, и десяти мышам вводили анти-ЬРО моноклональное антитело МАЬ3, также разведенное в РВ8. Доза антитела составляла 8 мг/кг в объеме 150 микролитров. Инъекции осуществляли интраперитонеально два раза в неделю в течение шести недель. Один раз в неделю каждую мышь взвешивали. Через шесть недель после окончания курса инъекций мышей умерщвляли с помощью двуокиси углерода и удаляли печени, а количество присутствующих видимых метастазов подсчитывали. Печени и метастазы также подготавливали для заключения в парафин и иммуногистохимического анализа.

B. Результаты

Результаты являются представленными на фиг. 11. Среднее количество метастазов составляло 7,3 у мышей, которым вводили контрольное антитело, и 4,3, которых обрабатывали с помощью анти-ЬРО моноклонального антитела МАЬ3. Это соответствует снижению 41% и является статистически значимым при р = 0,0372. Статистический анализ является представленным на табл. 10, приведенной ниже. Среднее значение веса печеночных метастазов у обработанных мышей также снижалось до 96 мг, по сравнению с 167 мг у контрольных мышей несмотря на то, что это отличие не подсчитывали для статистической значимости.

Пример 10. Экспрессия ЬОК5 в клетках колоректального рака повышается при использовании роста в условиях культивирования при низком прикреплении

Этот пример описывает эффект на экспрессию маркера поверхности стволовых клеток ЬОК5 на клеточных линиях колоректального рака при росте в условиях культивирования при низком прикреплении. Анализируемые клетки включали клетки из клеточных линий первичного колоректального рака и метастатического колоректального рака и клетки, полученные из образца биопсии человеческого первичного колоректального рака. Условия культивирования при низком прикреплении можно улучшить для роста раковых стволовых клеток в виде сфероидов и обеспечить полезное средство анализа для стволовых клеток колоректального рака.

А. Способы

Исследуемые клетки представляли собой такие из клеточных линий НТ29 и НСТ116 первичного колоректального рака и клеточных линий 8\У620 и Т84 метастатического колоректального рака.

Также подвергали анализу клетки, изолированные из образца биопсии от первичной колоректальной опухоли человека (СКС1), так, как описано ниже. Образцы биопсии несколько раз промывали в стерильном растворе сбалансированных солей Хенкса (НВ88), потом помещали на 30 мин при комнатной

- 35 026944 температуре в 0,4% раствор гипохлорита натрия в ΗΒ88. После нескольких дополнительных промываний в ΗΒ88 образцы биопсии разрезали на кусочки размером 1 мм при использовании лезвия скальпеля и промывали. Потом кусочки инкубировали в течение 1 ч при 37°С в 50% растворе Асситах в М11 среде, содержащей сильные антибиотики и глюкозу (ΌΜΕΜ/Ρ12 с 20 нг/мл Е0Е, 10 нг/мл Е0Е, 20 мкг/мл инсулина, N2 добавка, 2 мкг/мл ципрофлаксина, 5 мкг/мл гентамицина и 3 мкг/мл глюкозы), при слабом встряхивании каждые 20 мин. Раствор Асситах, содержащий эти переваренные образцы, потом фильтровали на фильтре 100 микрометров. Жизнеспособность определяли на малой аликвоте отфильтрованного раствора при использовании методики трипанового голубого. Потом раствор центрифугировали при 200 д в течение 10 минут и осадки ресуспендировали в 2 мл М11 среды, содержащей 10% ЕВ8, для того, чтобы остановить реакцию Асситах. Потом клетки инкубировали во флаконах Согтпд низкого прикрепления в течение нескольких дней и после этого переносили в М11 среду без ЕВ8 для дальнейшего размножения. Клетки из СКС1 образца размножали в течение нескольких недель и замораживали/оттаивали непосредственно перед осуществлением эксперимента.

Клетки выращивали при двух различных условиях культивирования. В первом случае клетки выращивали в стандартном пластиковом сосуде для культивирования для роста клеток млекопитающих, который способствует прикреплению к поверхности. В частности, 200000 клеток высевали во флаконы на 75 см (Согтпд) в ΌΜΕΜ + 5% фетальной бычьей сыворотки (ЕВ8) +100 ед./мл пенициллина +100 ед./мл стрептомицина.

Во втором случае клетки выращивали в сосуде с низким прикреплением, к которому клетки млекопитающих типично плохо прикрепляются или не прикрепляются вообще. В частности, 30000 клеток высевали во флаконы на 75 см с ультранизким прикреплением (Согтпд) в М11 среде (ΌΜΕΜ/Ρ12 с 20 нг/мл Е0Е, 10 нг/мл Е0Е, 20 мкг/мл инсулина, N2 добавка, 2 мкг/мл ципрофлаксина, 5 мкг/мл гентамицина и 3 мкг/мл глюкозы). После периода роста клетки ресуспендировали и подвергали дезагрегации в одной клеточной суспензии при использовании реагента Асситах (Iηηоνаί^νе Се11 ТесЬпо1од1е8, 1пс.) в течение 45 мин при 37°С перед проведением ЕАС8 анализа. При использовании стандартных методик после этого клетки окрашивали с помощью антитела к ^терминальному участку маркера клеточной поверхности Ь0К5 (АЪдеШ, 1пс.), и подвергали сортировке путем ЕАС8 для определения процента клеток, экспрессирующих маркер. Все эксперименты проводили в трехкратной повторности.

В. Результаты

Относительное процентное содержание экспрессирующих Ь0К5 клеток колоректального рака, возникших в результате роста клеток при двух различных условиях культивирования, является представленным на фиг. 12. Для всех проанализированных клеточных линий процент клеток, экспрессирующих Ь0К5, был выше тогда, когда клетки выращивали в виде сфероидов при условиях культивирования с низким прикреплением (черные диаграммы) по сравнению с ростом при традиционных условиях (серые диаграммы). Модель была подобной для клеток, имеющих происхождение от клеточных линий первичного колоректального рака (НТ29 и НСТ116) и от клеточных линий метастатического колоректального рака (8X0620 и Т84).

СКС1 клетки, полученные из биопсии человеческого первичного колоректального рака, также экспрессировали Ь0К5 при выращивании в условиях культивирования при низком прикреплении. Поскольку в этом конкретном эксперименте СКС1 клетки не имели хорошего роста при традиционных условиях прикрепления, однако было возможным непосредственно сравнить уровень экспрессия Ь0К5 при выращивании клеток при условиях прикрепления против условий с плохим прикреплением.

Пример 11. Экспрессия гена гастрина повышается с помощью роста клеток колоректального рака при условиях культивирования с низким прикреплением

Этот пример описывает влияние на экспрессию гена гастрина в клеточных линиях первичного и метастатического колоректального рака, а также клеток из образца биопсии, полученных из человеческого первичного колоректального рака, выращенных при условиях культивирования с низким прикреплением. Такие условия роста обогащают культуру раковыми стволовыми клетками.

А. Способы

Анализируемые клетки представляли собой такие из клеточных линий НТ29, НСТ116, КК0, 8\Х480 и ΌΕΌ1 первичного колоректального рака и клеточных линий 8\Х620 и Т84 метастатического колоректального рака. Также подвергали анализу клетки, изолированные из образца биопсии первичной колоректальной опухоли человека (СКС1). Клетки выращивали при двух различных условиях культивирования. В первом случае клетки выращивали в стандартном сосуде для культивирования клеток млекопитающих, который способствует прикреплению клеток к пластиковой поверхности, так, как описано выше. Во втором случае клетки также выращивали в сосуде с низким прикреплением, к которому клетки млекопитающих типично плохо прикрепляются, так, как описано выше. После периода роста клетки ресуспендировали и лизировали, а мРНК изолировали при использовании стандартных методик. Потом измеряли экспрессию гена гастрина при использовании количественной ОТ-ПЦР в соответствии со стандартной методикой. Все эксперименты повторяли трижды.

Β. Результаты

Относительные уровни мРНК гастрина, экспрессированного в различных клетках, которые подвер- 36 026944 гали анализу при традиционных условиях и при условиях культивирования с низким прикреплением, являются представленными на фиг. 13. Уровни нормализовали по отношению к количеству мРНК гастрина, экспрессированному в клеточной линии ККО первичного колоректального рака. ККО клетки в норме экспрессировали низкие уровни прогастрина. Следует отметить, что относительные уровни мРНК гастрина являются представленными в логарифмической шкале. Для всех анализируемых клеточных линий, за исключением ККО клеток, экспрессия гена гастрина была выше, иногда в несколько раз выше, тогда, когда клетки выращивали при условиях культивирования с низким прикреплением (черные диаграммы) по сравнению с ростом при традиционных условиях (серые диаграммы). Модель была подобной для клеток, имеющих происхождение от клеточных линий первичного колоректального рака и от клеточных линий метастатического колоректального рака.

Пример 12. Клетки колоректального рака, выращенные в условиях культивирования при низком прикреплении экспрессировали белок прогастрина

Этот пример описывает экспрессию белка прогастрина клеточными линиями первичного и метастатического колоректального рака, а также клетками из образца биопсии, полученного из человеческого первичного колоректального рака, выращенными при условиях культивирования с низким прикреплением. Такие условия роста обогащают культуру раковыми стволовыми клетками.

A. Способы

Анализируемые клетки представляли собой такие из клеточной линии НТ29 первичного колоректального рака и клеточных линий 8А620 и Т84 метастатического колоректального рака. Также подвергали анализу клетки, изолированные из образца биопсии первичной колоректальной опухоли человека (СКС1). Клетки выращивали в сосуде с низким прикреплением в М11 среде (без фенолового красного). Через 48 ч среду собирали, центрифугировали при 1,000 д в течение 5 мин для удаления клеточного дебриса и замораживали при -80°С. Клетки подвергали дезагрегации при использовании реагента Асситах и подсчитывали. Для измерения секретированного прогастрина замороженную среду оттаивали на льду и потом концентрировали в 40 раз до получения объема 500 мкл путем центрифугирования при 2500 д в течение 45 мин при использовании устройств для концентрации белка (1соп, Р1егсе). Концентрацию прогастрина потом измеряли при использовании методики сэндвич ЕЫ8А. Каждый эксперимент повторяли трижды.

B. Результаты

Концентрация прогастрина, секретированного в ростовую среду клетками колоректального рака через 48 ч роста при условиях культивирования с низким прикреплением, является представленной на фиг. 14. Все клетки, которые подвергали анализу, включая одну клеточную линию первичного колоректального рака, две клеточные линии метастатического колоректального рака и клетки, полученные из образца биопсии человеческого первичного колоректального рака, секретировали прогастрин при выращивании в виде сфероидов в условиях культивирования с низким прикреплением. Однако 8А620 клетки секретировали существенно меньше прогастрина, чем другие клеточные линии, которые подвергали изучению. Данные являются выраженными в виде концентрации прогастрина в пМ на миллион клеток за 48 ч роста.

Пример 13. Эффект антипрогастринового поликлонального антитела на рост первичных клеток колоректального рака в виде сфероидов при условиях культивирования с низким прикреплением

Этот пример описывает эффект анти-прогастриновых поликлональных антител на рост в виде сфероидов клеточных линий первичного колоректального рака, а также клеток, полученных из образца биопсии человеческого первичного колоректального рака, выращенных при условиях культивирования с низким прикреплением. Такие условия роста обогащают культуру раковыми стволовыми клетками.

A. Способы

Анализируемые клетки представляли собой такие из клеточных линий НТ29 и НСТ116 первичного колоректального рака, а также клетки, изолированные из образца биопсии первичной колоректальной опухоли человека (СКС1). Клетки высевали в ячейки планшетов на 96 ячеек с низким прикреплением (Согишд) в М11 среде (ΌΜΕΜ/Ρ12 с 20 нг/мл ЕОР, 10 нг/мл РОР, 20 мкг/мл инсулина, N2 добавка, 2 мкг/мл ципрофлаксина, 5 мкг/мл гентамицина и 3 мкг/мл глюкозы). Для НТ29 и НСТ116 клеток прибавляли общее количество 500 клеток в 100 мкл к каждой из 3 ячеек на каждое условие обработки, в то время как для СКС1 клеток общее количество 500 клеток в 100 мкл к каждой из 10 ячеек на каждое условие обработки. Каждые 24 ч клетки обрабатывали с помощью 3 мкг/мл поликлональных антипрогастриновых антител или контрольного антитела (поликлональный кроличий анти-человеческий 1дО, АйшИу ВюКеадейь, кат. номер 8А1-600). Через 10 дней после обработки для НТ29 и НСТ116 клеток и 14 дней для СКС1 клеток, подсчитывали количество клеточных сфероидов в каждой ячейке, а также подсчитывали среднее значение на ячейку. Лаборант, который осуществлял эксперименты, не имел информации относительно состава растворов антител, которые подвергались исследованию. Каждый эксперимент повторяли дважды.

B. Результаты

Как показано на фиг. 15-17, по сравнению с контрольным антителом, антипрогастриновые поликлональные антитела существенно снижали количество клеточных сфероидов, которые образовывались

- 37 026944 клетками первичного колоректального рака, выращенными при условиях культивирования с низким прикреплением.

Пример 14. Эффект антипрогастриновых моноклональных антител на рост клеток первичного колоректального рака в виде сфероидов при условиях культивирования с низким прикреплением

Этот пример описывает эффект антипрогастриновых моноклональных антител на рост в виде сфероидов позитивных по ЬОК5 клеток из двух клеточных линий первичного колоректального рака, тогда, когда эти клетки выращивали при условиях культивирования с низким прикреплением. Такие условия роста обогащают культуру раковыми стволовыми клетками.

A. Способы

Анализируемые клетки представляли собой такие из клеточных линий НТ29 и НСТ116 первичного колоректального рака. Клетки сначала сортировали с помощью РАС8 (РАС8апа, ΒΌ Вюкаепсек) для изоляции тех, которые экспрессируют маркер ЬОК5 раковой стволовой клетки. Для РАС8 сортировали 2х10⁶ НТ29 клеток и 1х10⁶ НСТ116 клеток. Клетки метили с помощью 2 мг/1х10⁶ клеток антитела, специфического для ^терминального участка ЬОК5 (АЬдей, 1пс., N0. АР2745А). После осуществления РАС8 позитивные по ЬОК5 клетки высаживали в 30 ячеек планшета с низким прикреплением на 96 ячеек при плотности 10 клеток на ячейку в 100 мкл М1 1 среды (ЭМЕМ/Р12 с 20 нг/мл ЕОР, 10 нг/мл РОР, 20 мкг/мл инсулина, N2 добавкой, 2 мкг/мл ципрофлаксина, 5 мкг/мл гентамицина и 3 мкг/мл глюкозы). Каждые 24 ч в течение 14 дней клетки обрабатывали с помощью 0,3 мкг/мл одного из двух различных антипрогастриновых моноклональных антител (МАЬ2 и МАЬ3), или контрольного моноклонального антитела (моноклональный мышиный анти-человеческий 1дО1, Са1ЬюсЬеш, катал, номер 411451). В завершение обработки, подсчитывали количество клеточных сфероидов, которые сформировались в присутствии каждого типа антитела. Клетки потом оставляли для выращивания в течение дополнительных 17 дней, в течение которых среду еженедельно заменяли новой без дополнительной обработки антителом. Лаборант, который осуществлял эксперименты, не имел информации относительно состава растворов антител, которые подвергались исследованию.

B. Результаты

Как показано на фиг. 18А и 19А, соответственно, способность позитивных по ЬОК5 клеток из двух клеточных линий первичного колоректального рака, НСТ116 и НТ29, расти в виде сфероидов в течение 14 дней при культивировании в условиях с низким прикреплением снижалась путем обработки с помощью двух отдельных моноклональных антител против прогастрина, по сравнению с контрольным моноклональным антителом.

Кроме того, как показано на фиг. 18В и 19В, количество сфероидов не увеличивалось после дополнительной инкубации НСТ116 и НТ29 клеток в течение 17 дней в культуре при отсутствии экзогенно прибавляемых антител. Эти данные означают, что супрессия образования сфероидов с помощью антиЬРО антител продолжалась даже после удаления специфических антител.

Пример 15. Эффект антипрогастриновых моноклональных антител на рост клеток первичного колоректального рака в виде сфероидов при условиях культивирования с низким прикреплением

Этот пример описывает эффект четырех различных анти-прогастриновых моноклональных антител на рост в виде сфероидов СКС1 клеток тогда, когда эти клетки выращивали при условиях культивирования с низким прикреплением. Такие условия роста обогащают культуру раковыми стволовыми клетками.

А. Способы

СКС1 клетки получали из биопсии человеческой карциномы толстого кишечника в соответствии со стандартными процедурами. После разобщения клеток в Асситах (81дта) в течение 45 мин при 37°С клетки высаживали в планшеты на 96 ячеек с низким прикреплением (Согтпд) при плотности 100 клеток на ячейку в М11 среде (ОМЕМ/Р12 с 20 нг/мл ЕОР, 10 нг/мл РОР, 20 мкг/мл инсулина, N2 добавкой, 2 мкг/мл ципрофлаксина, 5 мкг/мл гентамицина и 3 мг/мл глюкозы). Для каждой ветки исследования использовали 10 ячеек.

Начиная с первого дня, клетки обрабатывали два раза в день с помощью одного из четырех различных антипрогастриновых моноклональных антител, МАЬ5, МАЬ8, МАЬ13 или МАЬ16 (3 мкг/мл) или той же концентрации моноклонального антитела Р3Х63Ад8 (АТСС, Ке£ Т1В-9), или в среде, в которой отсутствовало антитело, в качестве контроля. После этого осуществляли обработку один раз в день в течение 8 дней. Сферы фотографировали ежедневно для последующего подсчета. Все эксперименты осуществляли слепым методом. После завершения эксперимента подсчитывали количество сфер для каждой ветки обработки.

Β. Результаты

Результаты являются представленными на фиг. 20. Каждое из проанализированных анти-ЬРО моноклональных антител было эффективным для снижения количества сфероидов, которые образовывались клетками первичного колоректального рака в условиях культивирования при низком прикреплении. По сравнению с не-специфическим моноклональным антителом и средой, взятой отдельно, ингибиторный эффект для всех проанализированных антител был статистически значимым при р < 0,05 при использовании одностороннего АN0VА с апостериорным критерием Бонфферони. МАЬ5, МАЬ8 и МАЬ13 все

- 38 026944 узнавали С-терминальные эпитопы ЬРО, в то время как МАЬ16 связывался с Ν-терминальным эпитопом ЬРО.

Пример 16. Эффект антипрогастринового моноклонального антитела на рост клеток метастатического колоректального рака в виде сфероидов при условиях культивирования с низким прикреплением

Этот пример описывает эффект антипрогастринового моноклонального антитела на рост в виде сфероидов позитивных по АБОН1 клеток из клеточных линий метастатического колоректального рака, тогда, когда эти клетки выращивали при условиях культивирования с низким прикреплением.

А. Способы

Анализируемые клетки представляли собой такие из клеточной линии Т84 метастатического колоректального рака. Клетки сначала сортировали с помощью РАС8 (РАС8апа, ΒΌ Вювиепсев) для изоляции тех, которые экспрессируют маркер раковой стволовой клетки АБОН1. при использовании набора АЬОЕРЬиОК (81етсе11 ТесЬпо1од1ев). Для РАС8 сортировали 2х10⁶ НТ29 клеток и 1x10 НСТ116 клеток. После осуществления РАС8 позитивные по АБОН1 клетки высаживали в ячейки планшета с низким прикреплением на 96 ячеек при плотности 100 клеток на ячейку в 100 мкл М1 1 среды (ΌΜΕΜ/Ρ12 с 20 нг/мл ЕОР, 10 нг/мл РОР, 20 мкг/мл инсулина, N2 добавкой, 2 мкг/мл ципрофлаксина, 5 мкг/мл гентамицина и 3 мкг/мл глюкозы). Каждые 24 ч в течение 11 дней клетки обрабатывали с помощью одной из трех различных концентраций (0,01, 0,1 или 1 мкг/мл) антипрогастринового моноклонального антитела (МАЬ3), или 1 мкг/мл контрольного моноклонального антитела (моноклональный мышиный античеловеческий 1дО1, Са1ЬюсЬет, катал, номер 411451). В завершение обработки подсчитывали количество клеточных сфероидов, которые сформировались в присутствии каждого из антител. Лаборант, который осуществлял эксперименты, не имел информации относительно состава растворов антител, которые подвергались исследованию.

Β. Результаты

Как показано на фиг. 21, способность позитивных по АБОН1 клеток из клеточной линии Т84 метастатического колоректального рака расти в виде сфероидов при культивировании в условиях низкого прикрепления снижалась зависимым от дозы образом путем обработки с помощью моноклонального антитела против прогастрина по сравнению с контрольным моноклональным антителом.

Пример 17. Эффект предварительной обработки с помощью антипрогастриновых моноклональных антител на рост клеток первичного колоректального рака в виде сфероидов при условиях культивирования с низким прикреплением Этот пример описывает эффект предварительной обработки при использовании четырех различных анти-прогастриновых моноклональных антител на рост позитивных по АБОН1 СКС1 клеток при традиционных условиях культивирования и рост в виде сфероидов тогда, когда клетки переносили в условия культивирования при низком прикреплении.

А. Способы

СКС1 клетки получали из биопсии человеческой карциномы толстого кишечника в соответствии со стандартными процедурами. После разобщения клеток в Асситах (81дта) в течение 45 мин при 37°С, СКС1 клетки (100000 клеток/ячейка) выращивали при традиционных условиях культивирования в свободной от сыворотки ОМЕМ среде в течение 72 ч в присутствии или при отсутствии анти-ЬРО моноклональных антител МАЬ5, МАЬ8, МАЬ13 или МАЬ16. Эксперименты осуществляли слепым способом.

В конце периода обработки на клетках осуществляли два различных анализа. В первом анализе процент клеток, экспрессирующих АБОН1. маркер стволовых клеток колоректального рака, определяли с помощью РАС8. Во втором анализе для каждой группы обработки 200 клетки/ячейка высаживали в шесть ячеек планшета с низким прикреплением на 24 ячейки в 500 мкл свободной от сыворотки М1 1 среды с добавлением ЬРОР и ЕОР и выращивали в течение 7 дней без дополнительной обработки. В конце этого периода осуществляли фотографирование и подсчитывали количество сфер на ячейку и измеряли площадь поверхности сфер.

Β. Результаты

Результаты являются представленными на фиг. 22 и 23. Каждое из четырех проанализированных анти-ЬРО моноклональных антител было эффективным спустя три дня в культуре с традиционным прикреплением для снижения количества СКС1 клеток первичного колоректального рака, экспрессирующих АБОН1. по сравнению с контролем. Каждое из этих антитела было также эффективным для снижения количества сфероидов, сформированных с помощью клеток первичного колоректального рака в условиях культивирования при низком прикреплении после удаления антител и когда клетки выращивали в течение дополнительных 7 дней. По сравнению с контролем, ингибиторный эффект МАЬ5, МАЬ8 и МАЬ16 был статистически значимым при р < 0,05 при использовании одностороннего анализа АNОVА с постериорным критерием Бонферрони. Несмотря на то, что МАЬ13 также снижали количество сфероидов по сравнению с контролем, этот эффект не достигал статистической значимости.

Пример 18. Эффект предварительной обработки с помощью анти-прогастриновых моноклональных антител на рост клеток метастатического колоректального рака в виде сфероидов при условиях культивирования с низким прикреплением

Этот пример описывает эффект предварительной обработки при использовании анти- 39 026944 прогастринового моноклонального антитела на рост позитивных по ΑΣΌΗ1 клеток в виде сфероидов из двух клеточных линий метастатического колоректального рака при условиях культивирования с низким прикреплением.

A. Способы

Анализируемые клетки представляли собой такие из клеточных линий Т84 и 8\У620 метастатического колоректального рака. Клетки выращивали сначала в сосудах для культивирования культуры клеток с традиционным прикреплением в течение 72 ч в присутствии антипрогастринового моноклонального антитела МАЬЗ (1 мкг/мл), контрольного моноклонального антитела, химиотерапевтического агента 5-фторурацила (5РИ 10 мкМ) или растворителя диметилсульфоксида (ДМСО). После обработки клетки подвергали двум анализам. В первом анализе процент раковых стволовых клеток, позитивных по маркеру ΑΣΌΗ1, определяли при использовании набора АЬПЕРЬиОК (§1етсе11 ТесЬпо1од1е§). Во втором анализе для каждой группы обработки клетки высаживали в шесть ячеек планшета с низким прикреплением на 96 ячеек при плотности в 500 клеток на ячейку в 100 мкл свободной от сыворотки М1 1 среды, содержащей ЬРОР, и выращивали в течение 11 дней без дополнительной обработки. После окончания этого периода подсчитывали количество сфероидов на ячейку.

B. Результаты

Как показано на фиг. 24 и 25, соответственно, количество позитивных по АЬОШ клеток Т84 и 8\У620 метастатического колоректального рака снижалось в результате предварительной обработки в течение 72 ч с помощью антипрогастринового моноклонального антитела МАЬЗ, по сравнению с обработкой при использовании контрольного моноклонального антитела.

Как показано на фиг. 26 и 27, соответственно, способность клеток Т84 и 8\У620 метастатического колоректального рака расти в виде сфероидов при культивировании в условиях низкого прикрепления снижалась с помощью предварительной обработки в течение 72 ч при использовании моноклонального антитела против прогастрина по сравнению с контрольным моноклональным антителом.

Пример 19. Антипрогастриновые антитела снижают инициацию новых опухолей ш νίνο

Этот пример описывает влияние моноклональных антител, специфических для человеческого прогастрина, на способность клеток, изолированных из человеческого метастатического колоректального рака, расти у голых мышей с образованием новых опухолей после трансплантации.

A. Способы

При использовании стандартных методик иммунодефектным ВАЬВс/голым мышам осуществляли инъекции в селезенки клеток человеческого метастатического 8\У620 колоректального рака. Потом мышам вводили анти-ЬРО моноклональное антитело МАЬ3 или контрольное моноклональное антитело два раза в неделю в общей сложности в течение шести недель. Для каждого антитела доза составляла 8мг/кг. В конце периода лечения вычленяли ткань из метастазов как мышей, подвергнутых обработке, так и контрольных мышей. Опухолевые клетки подвергали дезагрегации путем обработки изъятой ткани с помощью Асситах, фильтровали и подсчитывали. В общей сложности получали 23800 жизнеспособных опухолевых клеток из метастатической ткани мышей, обработанных при использовании МАЬ3, и 36400 жизнеспособных опухолевых клеток получали от контрольных мышей.

Изолированные клетки потом анализировали для определения, демонстрируют ли они фенотипически характеристики раковых стволовых клеток путем исследования, могут ли клетки расти в виде сфероидов при условиях культивирования с низким прикреплением и могут ли они инициировать образование новых опухолей тогда, когда трансплантируются новым хозяевам. Для анализа образования сфероидов для обработанных и контрольных клеток 2000 клеток на ячейку высевали в пять ячеек сосуда для культивирования с низким прикреплением в М1 1 среде с добавлением ЬРОР и ЕОР. Клетки выращивали в течение 7 дней, а потом количество образовавшихся сфероидов в каждой ячейке подсчитывали. Для теста на трансплантацию сфероиды, которые развились из клеток, изолированных обработанных и контрольных метастазов, их объединяли в пулы, подвергали дезагрегации и подсчитывали. В общей сложности было получено 20000 клеток из сфероидов, которые имели происхождение от обработанных метастазов, и 110000 клеток было получено из сфероидов, которые имели происхождение от контрольных метастазов. Потом двум новым ВАЬВс/голым мышам трансплантировали равное количество обработанных или контрольных клеток. В частности, 6500 опухолевых клеток, которые имели происхождение от обработанных метастазов, вводили подкожно в левое бедро, в то время как такое же количество контрольных клеток вводили подкожно в правое бедро. Таким образом, каждая мышь служила в качестве своего собственного контроля. Объем опухоли потом подсчитывали в течение периода времени у обоих животных.

B. Результаты

Как показано на фиг. 28, рост в виде сфероидов в условиях культивирования при низком прикреплении человеческих клеток метастатического колоректального рака, изолированных из ш νίνο метастазов, снижался путем обработки животных с помощью анти-прогастринового моноклонального антитела МАЬ3 по сравнению с обработкой при использовании той же дозы контрольного моноклонального антитела.

Как показано на фиг. 29, способность инициировать рост новых опухолей после трансплантации

- 40 026944 клеток метастатического колоректального рака, изолированных из ίη νίνο метастазов, также снижалась путем обработки клеток с помощью анти-прогастринового моноклонального антитела МЛЬЗ, по сравнению с обработкой при использовании той же дозы контрольного моноклонального антитела. На этой диаграмме ось Υ соответствует объему опухоли в мм³. Заштрихованные квадраты представляют данные объема опухоли для одной из голых мышей, которым подкожно вводили клетки метастатического колоректального рака, полученные из метастазов, которые росли у мышей, обработанных при использовании контрольного моноклонального антитела. В противовес этому, незаштрихованные квадраты представляют собой данные для той же мыши, которой вводили в противоположную лапу клетки метастатического колоректального рака, полученные из метастазов, которые росли у мышей, обработанных при использовании МАЬЗ антипрогастринового моноклонального антитела. Заштрихованные и незаштрихованные ромбы соответствуют подобным данным, полученным от второй голой мыши, которую использовали в эксперименте.

Пример 20. Количественная оценка уровней РО в плазме и сыворотке крови

Уровни РО в сыворотке и/или плазме крови могут быть традиционно определены при использовании следующего анализа. Микротитровальные планшеты на 96 ячеек покрывали с помощью 0,5-10 мкг/мл С-терминального анти-ЬРО антитела, например, кроличьего С-терминального анти-ЬРО поликлонального антитела, или С-терминального анти-ЬРО антитела, описанного в данной заявке, и потом инкубировали в течение ночи. Потом планшеты три раза промывали с помощью РВ8-Твин (0,05%) и блокировали при использовании 2% (вес./об.) обезжиренного высушенного молока в РВ8-Твин (0,05%). Отдельно готовили исследуемые образцы, контрольные образцы (чистые или негативные по РО образцы плазмы или сыворотки) и от приблизительно 5 пМ (0,5 х 10^-11 М) до приблизительно 0,1 нМ (1х 10^-10 М) ЬРО эталонного стандарта (лиофилизированный ЬРО, разведенный в негативной по РО плазме или сыворотке) в приемлемом разбавителе (например, РВ8-Твин 0,05%). Образцы инкубировали на покрытых планшетах в течение 2-4 ч при 37°С или альтернативно от 12 до 16 ч при 21°С. После инкубации планшеты три раза промывали с помощью РВ8-Твин (0,05%) и инкубировали с 0,001-0,1 мкг/мл Νтерминального анти-ЬРО антитела, например, поликлонального Ν-терминального анти-ЬРО антитела или Ν-терминального моноклонального анти-ЬРО антитела, как описано в данной заявке, слитого с пероксидазой хрена (ИКР) (см., ΝαΚΗηβ и др., 1974, 1. ИбЮсЬеш. СуЮсЬет. 22(12): 1084-1091)) в течение 30 мин при 21°С. Потом планшеты три раза промывали в РВ8-Твин (0,05%) и прибавляли НКР субстрат и осуществляли реакцию в течение 15 мин при 21°С. Реакцию останавливали путем прибавления 100 мкл 0,5М серной кислоты и измерение оптической плотности осуществляли при 405 нм. Уровни ЬРО исследуемого образца определяли путем сравнения со стандартной кривой, построенной по результатам измерений, полученных из ЬРО эталонного стандарта.

Пример 21. ЕЫ8А анализ для оценки специфичности анти-ЬРО антитела

Специфичность анти-ЬРО антител может быть традиционно определена при использовании анализов ЕЫ8А так, как описано далее. Планшеты на 96 ячеек инкубировали в течение ночи при 4°С с приемлемой(ыми) концентрацией(ями) исследуемого полипептида (например, 25 и 50 нг рекомбинантного человеческого РО, и 50 и 250 нг СТРР или других продуктов, которые происходят от гена гастрина) в забуференном фосфатом физиологическом растворе (РВ8), после чего ячейки три раза промывали с помощью промывочного раствора (РВ8 и 0,1% Твин-20) и потом инкубировали в течение 2 ч при 22°С с 100 мкл блокирующего раствора (РВ8, 0,1% Твин-20, 0,1% бычьего сывороточного альбумина или гидролизата казеина) на ячейку. После блокирования ячейки три раза промывали и прибавляли антитело, которое подвергается анализу (исследуемое антитело). К каждой ячейке прибавляли 100 мкл исследуемого антитела (при концентрации 0,3-1 нг/мл) в РВ8 и 0,1% Твин-20. Потом планшеты инкубировали в течение 2 ч при 22°С, после чего раствор исследуемого антитела выбрасывали и заменяли, после этапа промывания (3Х 100 мкл промывочного раствора, как указано выше), при использовании блокирующего раствора, содержащего вторичное антитело, козий анти-мышиный !дС (Рс) антитело, слитое с перокисдазой хрена. После инкубации в течение одного часа с вторичным антителом 100 мкл раствора субстрата (например, Ρ;·ΐδΙ ОРЭ или О-фенилендиамин дигидрохлорид, доступные от §1§та-А1бг1сЬ Со., приготовленные в соответствии с указаниями производителя) прибавляли к каждой ячейке и инкубировали в темноте в течение 20 мин при 22°С. Реакцию останавливали путем прибавления 50 мкл 4Ν серной кислоты, и количество катализированного субстрата определяли путем измерения оптической плотности (Ο.Ό.) при 492 нм. Превращение субстрата является пропорциональным количеству первичного (исследуемого) антитела, связанного с антигеном. Эксперименты осуществляли в двукратной повторности и измерения ΟΌ выстраивали как функцию от концентраций антигена. Исследуемые антитела оценивали как специфические для РО, если измеренное значение Ο.Ό. составляло от 0,2 до 1,5 для ЬРО и не существовало статистически значимого сигнала, превышающего фоновое значение, при использовании СТРР или любого другого из пептидов, имеющих происхождение от гена гастрина, где фоновое значение представляет собой средний сигнал от контрольных ячеек, содержащих только РВ8.

Пример 22. Анализ для оценки нейтрализующей активности анти-ЬРО антитела

Специфический тест для оценки, является ли специфическое анти-ЬРО антитело нейтрализующим, может быть осуществлен так, как описано ниже. Клетки колоректального рака высевали в планшет на 6

- 41 026944 ячеек при концентрации приблизительно от 50000 до 100000 клеток на ячейку. Клетки потом подвергали обработке с 12-часовыми интервалами в течение 48 ч с помощью исследуемого анти-ЬРО антитела или контрольного антитела при концентрациях антитела приблизительно 5 мкг/мл. Исследуемое антитело определяется как нейтрализующее в анализе, если количество клеток, обработанных с помощью исследуемого антитела, демонстрирует статистически значимое снижение по крайней мере 10% в количестве выживших клеток по сравнению с количеством клеток, обработанных с помощью контроля, неспецифического антитела, при использовании двустороннего критерия Манна-Уитни (с различиями, которые считаются достоверными тогда, когда р<0,05). Общее количество клеток подвергали корректировки с учетом количества клеток в начале периода обработки, которое обозначалось как Т₀. Типичные клетки колоректального рака для применения в этом анализе включают, но без ограничения таковыми, клеточные линии первичного и метастатического колоректального рака, раскрытые в данной заявке.

Пример 23. Анализ для оценки аффинности анти-ЬРО антитела

Константы аффинности анти-ЬРО антитела могут измеряться при использовании методики Рго!еои (ВюКай) в соответствии с №-1ЬзЬо1 и др., 2008, Аиа1уЬса1 ВюсЬепизйу 383: 52-60, этот источник является введенным в данную заявку в качестве ссылки в своей целостности. Кратко, для мышиных анти-РО антител анти-мышиное 1дО антитело (50 мкг/мл) сначала наносили на сенсорный чип, убедившись, что сигнал, определяемый с помощью чипа, после введения антитела находится в интервале от 10000 до 11500 единиц ответа (КИ). Потом вводили мышиное анти-ЬРО антитело, которое представляет интерес (исследуемое антитело) (при типичной концентрация 30 мкг/мл). Если исследуемое антитело имеет достаточное связывание, то будет наблюдаться дополнительный сигнал, который составляет по крайней мере 500 Ки. Динамику связывания исследуемого антитела и ЬРО потом получали путем введения варьирующих концентраций ЬРО, например, 200, 100, 50, 25 и 12,5 нМ, и определения уровня ассоциации. Типично, несколько каналов являются доступными для исследования множества антител параллельно в одном эксперименте, что делает возможным анализ связывания одного исследуемого антитела при различных концентрациях ЬРО параллельно. В один канал следует вводить мышиное моноклональное антитело, которое не является специфическим для ЬРО, в качестве контроля для неспецифического связывания, а в другой канал следует вводить только буфер для разведения в качестве базовой линии для фонового сигнала. В общем случае, никакого связывания не определяют в канале, в который вводится неспецифическое мышиное антитело. Антитела, демонстрирующие высокий уровень ассоциации в этой настройке, которая может приводить к насыщению захваченного моноклонального антитела с помощью ЬРО, может подвергаться анализу против более низких концентраций ЬРО (50, 25, 12,5, 6,25 и 3,125 нМ), позволяя осуществлять более точное измерение.

Константы аффинности (К_с) подсчитывают как соотношение между константой диссоциации (к_й) и константой ассоциации (к_а). Экспериментальные значения могут быть подтверждены путем анализа статистически релевантного подобия между экспериментальными кривыми на основе измерений связывания и теоретических профилей.

Константы аффинности не-мышиных анти-ЬРО антител могут подвергаться оценке в подобном формате при использовании 1дО, специфического для видов происхождения анти-ЬРО исследуемого антитела.

Пример 24. Анализ для оценки конкурентного связывания с эталонным анти-ЬРО антителом

Специфический анализ для оценки, конкурирует ли антитело, которое представляет интерес (исследуемое антитело) за связывание ЬРО с биотинилированным эталонным анти-ЬРО антителом, может осуществляться так, как описано ниже. Планшеты на 96 ячеек покрывали с помощью иммобилизованного анти-ЬРО антитела (поликлональное или моноклональное антитело, узнающее N или С-терминальный участок ЬРО, который отличается от эпитопа, который узнается биотинилированным эталонным антиЬРО антителом), при концентрации, которая является выбранной в пределах интервала 1-10 мкг/мл, в течение ночи при 4°С (от 0,1 до 1 мкг/ячейка). После блокирования с помощью блокирующего буфера (0,1% Твин-20, 0,1% В8А в РВ8) в течение 2 ч при 22°С, прибавляли рекомбинантный ЬРО при концентрации, которая колеблется от 10 пМ до 1 нМ (от 10 до 1000 пг/ячейка), и инкубировали в течение 2 ч при 22°С. После этого прибавляли биотинилированное эталонное анти-ЬРО антитело (или смесь, содержащую биотинилированное эталонное анти-ЬРО антитело), вместе с повышающимися концентрациями немеченного исследуемого антитела и инкубировали в течение 1 ч при 22°С. После промывания для удаления несвязанного антитела определение связанного меченного эталонного анти-ЬРО антитела осуществляли путем инкубации смеси с 50 нг/мл страптавидин-НКР в течение 1 ч при 22°С, после чего проводили инкубацию с фторорганическим субстратом для пероксидазы хрена и потом осуществляли количественную оценку относительных световых единиц (КЬИ) в люменометре. Анализы осуществляли в двукратной повторности.

Антитела, которые конкурируют с эталонным анти-ЬРО антителом, ингибируют связывание эталонного антитела с ЬРО. Антитело, которое связывается с существенно тем же эпитопом или с перекрывающимся эпитопом, что и эталонное антитело, существенно снижает (например, по крайней мере, на 50%) количество связанного эталонного анти-ЬРО антитела, как становиться очевидным с помощью снижения наблюдаемых КЬИ.

- 42 026944

Высокое контрольное значение получают из контрольного эксперимента, который осуществляется путем инкубации меченного эталонного антитела с рекомбинантным ЬРО без исследуемого антитела. Низкое контрольное значение получают из контрольного эксперимента, который осуществляется путем инкубации меченного эталонного антитела с рекомбинантным ЬРО в присутствии избыточных концентраций немеченного эталонного антитела (немеченное эталонное антитело, таким образом, конкурирует с меченным антителом за связывание с ЬРО). Способность исследуемого антитела конкурировать с эталонным анти-ЬРО антителом потом определяют путем инкубации меченного эталонного антитела с рекомбинантным ЬРО в присутствии повышающихся концентраций немеченного исследуемого антитела.

В тестовом анализе значительное снижение наблюдаемых уровней КЬИ в присутствии исследуемого антитела свидетельствует о том, что исследуемое антитело узнает существенно тот же эпитоп, что и эталонное анти-ЬРО антитело.

Ингибирование связывания может выражаться как ингибирование константы, или К₁, которая подсчитывается в соответствии со следующей формулой:

К₁ = 1С₅₀ / (1 + ([концентрация эталонного анти-ЬРО АЬ]/К_С ^{эталонного} ^т[|-|||'° ^АЬ)) где1С₅₀ представляет собой концентрацию исследуемого антитела, которая обеспечивает 50% снижение связывания эталонного антитела, а

К э^тал^онного ан^ти-ЬР^О аъ представляет собой константу диссоциации эталонного анти-ЬРО антитела, меру его аффинности для ЬРО. Полезные исследуемые антитела, которые конкурируют с эталонным антиЬРО антителом (например, одним из анти-ЬРО антител, описанных в данной заявке), будут типично иметь значения К₁, которые колеблются от 10 пМ до 100 нМ при условиях проведения анализа, описанных в данной заявке.

Все публикации, патенты, патентные заявки и другие документы, приведенные в данной заявке, являются введенными в качестве ссылки в своей целостности для всех целей до такой степени, как если бы каждая индивидуальная публикация, патент, патентная заявка и другой документ были индивидуально указаны для включения в качестве ссылки для всех целей.

Несмотря на то, что различные специфические воплощения были проиллюстрированы и описаны, понятно, что могут быть внесены различные изменения без отступления от сути и объема данного(ых) изобретения(ий).

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Применение антитела к человеческому прогастрину (ЬРО) для получения лекарственного средства для лечения метастатического колоректального рака, где антитело к ЬРО включает:

(а) вариабельную область тяжелой цепи, в которой СГОК1 включает аминокислотную последовательность ν_Η СЭК1.3 (8Е0 ГО ΝΟ:1), СЭК2 включает аминокислотную последовательность ν_Η СЭК2.3 (8Е0 ГО ΝΟ:2) и СЭК3 включает аминокислотную последовательность ν_Η СЭК3.3 (8Е0 ГО ΝΟ:3), и вариабельную область легкой цепи, в которой СГОК1 включает аминокислотную последовательность ν₃СГОКЕ3 (8Е0 ГО ΝΟ:4), СЭК2 включает аминокислотную последовательность ν₃ СЭК2.3 (8Е0 ГО ΝΟ:5) и СГОК3 включает аминокислотную последовательность ν₃ СЭК3.3 (8Е0 ГО ΝΟ:6); или (б) вариабельную область тяжелой цепи, в которой СГОК1 включает аминокислотную последовательность ν_Η СГОК1.8 (8Е0 ГО ΝΟ:37), СГОК2 включает аминокислотную последовательность ν_Η СГОК2.8 (8Е0 ГО ΝΟ:41) и СГОК3 включает аминокислотную последовательность ν_Η СГОК3.8 (8Е0 ГО ΝΟ:45), и вариабельную область легкой цепи, в которой СГОК1 включает аминокислотную последовательность ν₃СГОК1.8 (8Е0 ГО ΝΟ:49), СГОК2 включает аминокислотную последовательность ν,, СГОК2.8 (8Е0 ГО ΝΟ:52) и СГОК3 включает аминокислотную последовательность ν,, СГОК3.8 (8Е0 ГО ΝΟ:55); или (в) вариабельную область тяжелой цепи, в которой СГОК1 включает аминокислотную последовательность ν_Η СГОКЕ13 (8Е0 ГО ΝΟ:38), СГОК2 включает аминокислотную последовательность ν_ΗСГОК2.13 (8Е0 ГО ΝΟ:42) и СГОК3 включает аминокислотную последовательность ν_Η СГОК3.13 (8Е0 ГО ΝΟ:46), и вариабельную область легкой цепи, в которой СГОК1 включает аминокислотную последовательность ν СГОКЕ13 (8Е0 ГО ΝΟ:50), СГОК2 включает аминокислотную последовательность ν₃СГОК2.13 (8Е0 ГО ΝΟ:53) и СГОК3 включает аминокислотную последовательность ν₃ СГОК3.13 (8Е0 ГО ΝΟ:56); или (г) вариабельную область тяжелой цепи, в которой СГОК1 включает аминокислотную последовательность ν_Η СГОК1.16 (8Е0 ГО ΝΟ:39), СГОК2 включает аминокислотную последовательность ν_ΗСГОК2.16 (8Е0 ГО ΝΟ:43) и СГОК3 включает аминокислотную последовательность ν_Η СГОК3.16 (8Е0 ГО ΝΟ:47), и вариабельную область легкой цепи, в которой СГОК1 включает аминокислотную последовательность ν,, СГОК1.16 (8Е0 ГО ΝΟ:50), СГОК2 включает аминокислотную последовательность ν,.

- 116 026944

СОК2.16 (8ΕΡ ΙΌ N0:53) и С1Ж3 включает аминокислотную последовательность У_ь СОК3.16 (8ЕР ГО N0:57); или (д) вариабельную область тяжелой цепи, в которой С1Ж1 включает аминокислотную последовательность У_Н СЭК.1.19 (8ЕР ГО N0:40), С1Ж2 включает аминокислотную последовательность У_НСОК2.19 (8ЕР ГО N0:44) и С1Ж3 включает аминокислотную последовательность У_Н СЭК3.19 (8ЕР ГО N0:48), и вариабельную область легкой цепи, в которой СОК1 включает аминокислотную последовательность У_ь СЭК1.19 (8ЕР ГО N0:51), С1Ж2 включает аминокислотную последовательность У_ьСОК2.19 (8ЕР ГО N0:54) и С1Ж3 включает аминокислотную последовательность У_ь СОК3.19 (8ЕР ГО N0:58).
2. Применение по п.1, где антитело к ЬРО включает:

(а) последовательность вариабельной области тяжелой цепи 8ЕР ГО N0:12 и последовательность вариабельной области легкой цепи 8ЕР ГО N0:13;

(б) последовательность вариабельной области тяжелой цепи 8ЕР ГО N0:61 и последовательность вариабельной области легкой цепи 8ЕР ГО N0:65;

(в) последовательность вариабельной области тяжелой цепи 8ЕР ГО N0:62 и последовательность вариабельной области легкой цепи 8ЕР ГО N0:66;

(г) последовательность вариабельной области тяжелой цепи 8ЕР ГО N0:59 и последовательность вариабельной области легкой цепи 8ЕР ГО N0:63;

(д) последовательность вариабельной области тяжелой цепи 8ЕО ГО N0:60 и последовательность вариабельной области легкой цепи 8ЕР ГО N0:64.
3. Применение по п.1 или 2, в котором указанное антитело к ЬРО представляет собой гуманизированное антитело.
4. Применение по п.3, где указанное гуманизированное антитело имеет аффинность связывания прогастрина в пределах от приблизительно 0,001 до приблизительно 5000 нМ.
5. Применение по п.1, где метастатический колоректальный рак локализован в печени, легких, мозге или лимфатическом узле.
6. Способ лечения метастатического колоректального рака, включающий введение антитела к ЬРО согласно пп.1-5, где указанное антитело к ЬРО вводится до или после хирургического удаления метастатической колоректальной опухоли.
7. Способ лечения метастатического колоректального рака, включающий введение антитела к ЬРО согласно пп.1-5, где указанное антитело к ЬРО вводят дополнительно к химиотераперапии или радиотерапии.
8. Способ по п.7, где указанная химиотерапия включает химиотерапевтический агент, выбранный из группы, состоящей из антагонистов фолата, антагонистов пурина, антагонистов пиримидина, ДНК алкилирующих агентов, ДНК перекрестно связывающих лекарств, антибиотиков, комплексов платины, ингибиторов протеосомы, митотических веретеновидных ядов, ингибиторов топоизомеразы и ингибиторов тирозинкиназы.
9. Способ лечения метастатического колоректального рака, включающий введение антитела к ЬРО согласно пп.1-5, где указанное антитело к ЬРО вводится дополнительно со вторым антителом, которое специфически связывает УЕОР или ЕОРК.
10. Способ по пп.6-9, где антитело к ЬРО вводится в дозе в переделах от приблизительно 0,001 до приблизительно 250 мг/кг.
11. Способ по п. 10, где доза антитела к ЬРО вводится в виде множества доз, разделенных периодом времени.