KR20130028049A - 직장암의 치료 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 항-프로가스트린 항체를 포함하는 조성물을 사용하여 직장암 전이 또는 직장암의 재발을 치료하고 예방하기 위한 방법에 관한 것이다.

Description

직장암의 치료 방법{METHODS FOR TREATING COLORECTAL CANCER}

1. 관련 출원의 상호 참조

본 출원은 35 U.S.C. § 119(e) 하에 2010년 1월 8일 출원된 가출원 제61/293,612호, 및 2010년 7월 26일 출원된 가출원 제61/367,855호의 이익을 주장하는바, 상기 모든 내용은 전체로서 본 명세서에 참조로 병합된다.

2. 염기서열, 표 또는 컴퓨터 프로그램 관련

염기서열은 본 명세서에 함께 제출되었다.

3. 발명의 분야

본 개시내용은 그 중에서도 프로가스트에 특이적인 항체를 포함하는 조성물을 투여함으로써 직장암 전이 및 재발을 치료하고 예방하기 위한 방법에 관한 것이다.

4. 배경기술

수십년 동안의 기초 임상 연구에도 불구하고, 직장암은 인간의 가장 치명적인 비-전염성 질병 중 하나로 남아있다. 세계 보건 기구의 국제 암 연구 기관의 GLOBOCAN 프로젝트에 따르면, 2008년 직장암 발생은 1.2 백만명 이상으로 같은 연도에 600 천명의 사람이 상기 질병에 의해 사망한 것으로 추정된다. 최근, 분자 수준에서 직장암이 어떻게 작용하는지에 대한 연구가 많이 이루어지고 있으나, 임상 의들은 여전히, 한 세대 전의 종양학자들에게 알려져 있는 수술, 방사선 및 화학요법과 같은 치료 방법에 의존하고 있다. 이미지 기술 및 분자 진단이 발전함에 따라 가능해진, 초기 진단은 치료의 성공에 있어서 가장 중요한 요인이다. 비록 모든 치료의 효능이 수년 동안 개선되고 있지만, 치유율의 개선 및 수명의 연장은 증가하고 있다. 분자 종양학에서의 큰 변혁에 의한 새로운 표적화된 치료요법의 경우에도, 대부분의 경우, 평범하게 개선된 결과를 가진다.

직장암 환자를 관리하기 위한 2개의 가장 도전적인 측면은 전이와 재발이다.

전이는 직장암이 일차 종양으로부터 원거리 기관으로 퍼질 때 발생한다. 그것은 종종 일차 종양을 절제하는 것을 가능하게 하는 반면, 전이는 그것이 너무 많거나 수술로 치료하기 위한 건강한 숙주 조직과 꼬여있기 때문에 결국 환자는 죽음에 이르게 된다. 미국 암 학회에 따르면, 1998년과 2000년 사이의 단계 IIIC 직장암으로 진단된 환자 중 미국에서의 5년 생존율은 28%로서, 단계 IV (즉, 전이성 직장암)에서 단지 6% 떨어진 것이다.

재발은 치료에 초기에 반응하고 명백히 사라진 이후에 직장암으로 다시 되돌아가는 현상을 의미한다. 환자들 및 그들의 가족에게 고통을 주는 정신적인 피해 외에도, 재발은 복귀한 암이 일차 암과 싸우기에 유효한 요법 또는 치료요법에 대해 낮은 반응성을 가질 수 있다는 문제가 있다. 다른 환자의 경우, 일차 암에 대한 치료 이전에 심장 또는 신경 손상과 같은 비가역적 부작용을 야기할 수도 있다. 그러한 환자에서, 동일한 치료요법의 사용은 재발 암과 싸우는 위험이 너무 클 수도 있다. 그러한 상황 하에, 환자는 사망의 위험을 매우 크게 수반하는 소수의 치료 선택권을 가질 수도 있다.

방사선 치료의 개선, 화학요법 및 표적화된 치료요법의 출현이 직장암에 의해 고통을 받고 있는 환자의 수명을 증가시키는 반면, 많은 환자들은 그들의 진단 이후에 수개월에서 수년 내에 계속 죽고 있다. 따라서, 전이성 직장암 및 직장암의 재발에 유효한 새로운 치료에 대한 긴급한 요구가 존재한다.

5. 요약

본 발명은 프로가스트린에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 조성물의 치료적 유효량을 투여함으로써 전이성 직장암의 치료가 요구되는 환자를 치료하기에 유용한 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 치료될 전이성 직장암은 간, 폐, 뇌 또는 림프절에 위치하고 있다.

일부 다른 구현예에서, 상기는 전이성 직장암의 절제 수술 이전에 항-프로가스트린 항체 조성물을 투여함으로써 환자를 치료하기에 유용하다. 다른 구현예에서, 상기는 그러한 종양의 절제 수술 이후에 항체 조성물을 투여함으로써 상기 환자를 치료하기에 유용하다.

일부 구현예에서, 상기는 환자에 방사선 요법을 제공하기 전에 항-프로가스트린 항체 조성물을 투여함으로써 환자를 치료하기에 유용하다. 다른 구현예에서, 상기는 방사선 요법 이후에 항체 조성물을 투여함으로써 상기 환자를 치료하기에 유용하다.

일부 다른 구현예에서, 상기는 화학요법제 이전에, 상기와 동시에 또는 상기 이후에 항-프로가스트린 항체 조성물을 투여함으로써 환자를 치료하기에 유용하다. 본 목적에 유용한 화합요법제로는 포레이트 길항제, 퓨린 길항제, 피리미딘 길항제, DNA 알킬화제, DNA 가교제, 항생제, 백금 착화제, 프로테아좀 억제제, 유사분열 방추 독소, 토포이소머라제 억제제, 타이로신 키나제 억제제 등을 포함하나, 상기에 제한되는 것은 아니다.

일부 구현예에서, 상기는 전이성 직장암에 대한 효능을 갖는 여러 유형의 항체 이전에, 상기와 동시에 또는 상기 이후에 항-프로가스트린 항체 조성물을 투여함으로써 환자를 치료하기에 유용하다. 상기 항체는 세투시맵 또는 파니투무맵와 같은 EGFR를 표적으로 하는 항제, 및 베바시주맵와 같은 VEGF를 표적으로 하는 항체를 포함하나, 상기에 제한되는 것은 아니다.

전이성 직장암을 치료하기 위한 방법에서 사용하기 위한, 치료적 항체는 전이성 직장암 세포의 증식을 억제시기거나 분화 또는 세포사멸 비율을 증가시키거나 직장 전이의 평균 개수 또는 크기를 감소시키거나, 표적 환자 내 프로가스트린의 혈액 농도를 감소시키기에 유용하다.

본 발명의 방법에서 사용하기 위한 항체 조성물은 비경구 투여, 경막내 투여, 피하 투여, 정맥내 투여, 근육 투여, 복막 투여, 주입 투여, 또는 볼루스 투여를 포함하나, 이에 제한되지 않는 다양한 투여 경로로 투여하기 위하여, 다른 제형으로 제조될 수 있는바, 이는 수성 현탁액을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 상기 조성물은 비경구 투여, 특정 구현예에서, 주입물에 의한 정맥 주입를 위해 제형화된다.

일부 구현예에서, 본 발명의 항-프로가스트린 항체의 유효 용량은 0.001 mg/kg 내지 약 250 mg/kg의 범위로서, 단일 투여, 또는 다중 투여, 분할 투여로 제공될 수도 있다.

본 발명은 또한 환자에 항-프로가스트린 항체 조성물의 투여를 촉진시키기 위하여 임상의 등이 사용하기 위한 약제학적 키트를 제공한다. 일부 구현예에서, 키트는 동결건조 형태 또는 약제학적 등급수 또는 완충액과 같은 수용액, 희석액으로서 본 발명의 항-프로가스트린 항체, 및 주사기 및 바늘과 같은 항-프로가스트린 항체의 투여 장치를 포함한다. 다른 구현예에서, 키트는 본 발명의 화학요법제, 본 발명의 제2의 항-프로가스트린 항체 등과 같은 제2의 치료제를 추가로 포함할 수도 있지만, 상기에 제한되는 것은 아니다 .

전이성 직장암을 예방하기에 유용한 양으로 프로가스트린에 특이적으로 결합하는 항체를 전이성 직장암의 예방이 요구되는 환자에 투여함으로써 전이성 직장암을 예방하기 위한 방법이 제공된다. 다수의 구현예에서, 상기 조성물의 항체는 전이성 직장암 세포의 증식을 감소시키거나 분화 또는 세포 사멸 비율을 증가시키거나, 또는 치료 받은 환자 내의 프로가스트린의 혈액 농도를 감소시키기에 유효하다.

일부 구현예에서, 상기 조성물은 일차(primary) 직장암을 위한 수술 또는 방사선 요법 이전에 또는 상기 이후에, 또는 전이성 직장암을 예방하기에 유효한 화학요법제의 투여와 동시에 또는 투여 이후에 투여될 수 있다. 상기 조성물은 또한 프로가스트린 이외의 특이성을 갖는 전이성 직장암을 예방하기에 유효한 제2의 치료적 항체와 동시에 또는 이후에 투여될 수 있다.

또한, 직장암의 재발을 예방하기에 유효한 양으로 프로가스트린에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 조성물을 직장암의 재발의 예방이 요구되는 환자에 투여함으로써 직장암의 재발을 예방하기 위한 방법이 제공된다. 특정 방법에서, 환자는 직장암이 명백히 사라진 이후에, 수술, 방사선 요법, 생물학적 요법, 면역요법 및 화학요법과 같은 직장암을 위한 치료를 사전에 받는다.

다수의 구현예에서, 상기 조성물의 항체는 전이성 직장암 세포의 증식을 감소시키거나 분화 또는 세포 사멸 비율을 증가시키거나, 또는 치료 받은 환자 내의 프로가스트린의 혈액 농도를 감소시키기에 유효하다. 다른 구현예에서, 상기 조성물은 전이성 직장암을 예방하기에 유효한 제2의 치료제, 예를 들면 프로가스트린 이외의 특이성을 갖는 항체와 동시에 또는 상기 이후에 투여될 수 있다.

상기 직장암 줄기 세포를 억제하기에 유효한 양으로 프로가스트린에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 조성물을 직장암 줄기 세포의 성장 억제가 요구되는 환자에게 투여함으로써 환자 내의 직장암 줄기 세포의 성장을 억제하기 위한 방법이 제공된다.

다른 구현예에서, 상기 조성물의 항체는 직장암 줄기 세포의 증식을 감소시키거나 분화 또는 세포 사멸 비율을 증가시키거나, 또는 치료 받은 환자 내의 프로가스트린의 혈액 농도를 감소시키기에 유효하다. 다른 구현예에서, 직장암 줄기 세포의 성장을 억제하기에 유효한 제2의 치료제, 예를 들면 프로가스트린 이외의 특이성을 갖는 항체와 동시에 또는 상기 이후에 투여될 수 있다.

또한, 화학요법, 생물학적 요법, 면역요법 또는 항체 요법과 같은, 환자 내의 전이성 직장암의 치료 효능을 관찰하기 위한 방법을 제공하는바, 상기 방법은 전이성 직장암의 치료 전에 환자로부터 입수된, 전이성 직장암의 체액 또는 생검과 같은 제1시료 내의 프로가스트린의 농도를 측정하는 단계, 및 제1시료 내의 프로가스트린의 농도를 치료 후의 동일한 환자로부터 얻은 제2시료 내의 농도와 비교하는 단계를 포함하고, 상기 제1시료와 비교할 때, 제2시료 내의 프로가스트린의 농도의 감소는 치료가 유효한 것임을 나타낸다.

본 방법의 일부 구현예에서, 프로가스트린에 특이적인 항체를 이용하는, RIA 또는 ELISA와 같은 검정법이 제1 및 제2시료 내의 프로가스트린의 농도를 측정하기 위하여 사용된다.

또한, 환자 내의 직장암의 존재를 진단하기 위한 방법을 제공하는바, 상기 방법은 직장암을 갖는 것으로 의심되는 환자로부터 수득된, 체액과 같은 시료 내의 프로가스트린의 농도를 측정하는 단계, 및 상기 시료 내의 프로가스트린의 농도를 미리결정된 값과 비교하는 단계를 포함하고, 여기서 상기 미리결정된 수준에 비해 시료 내의 프로가스트린의 증가된 수준은 환자 내에 직장암이 존재함을 나타낸다. 일부 구현예에서, 상기 미리결정된 수준은 환자가 직장암이 없을 경우 얻어지는 시료 수준의 평균을 기초로 하고, 다른 경우 상기 미리결정된 값은 집단 평균을 기초로 한다.

본 방법의 일부 구현예에서, 환자는 이전에 직장암 치료를 받았고 시료 수득 시에 경감 상태이 있다. 다른 구현예에서, 상기 방법은 혈액 테스트, 메디칼 이미지 테스트 또는 유전자 테스트를 포함하는 직장암의 존재를 확인하기 위하여 환자에서 수행되는 제2진단 테스트를 수행하는 단계를 더욱 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 혈액 테스트는 암 배아 항원을 검출하기 위한 것이고 다른 구현예에서 상기 유전자 테스트는 선종성 폴립증 (adenomatous polyposis coli, APC) 유전자 내의 돌연변이를 검출하기 위한 것이다. 다른 구현예에서, 프로가스트린에 특이적인 항체를 이용하는 RIA 또는 ELISA과 같은 검정법이 시료 내의 프로가스트린의 농도를 측정하기 위하여 사용된다.

프로가스트린에 특이적으로 결합하는 많은 종류의 항원이 전이성 직장암의 치료에 유효할 수 있다. 이는 인간화 될 수도 있는 다중클론 항체, 단일클론 뿐만 아니라 키메라 항체, IgAl, IgA2, IgD, IgE, IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, 및 IgM의 동종형을 갖는 항체, 및 단쇄 항체를 포함하나, 상기에 제한되는 것은 아니다. 일부 구현예에서, 본 발명의 방법에 유용한 항체는 그들의 기능 또는 특징을 유용하게 바꾸는 모이어티에 컨쥬게이트된 항체를 포함하는바, 예를 들면 혈청 반감기를 증가시키는 항체를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 다른 구현예에서, 아미노산 변경은 유사한 목적 또는 다른 목적에 영향을 미칠 수 있다.

일부 구현예에서, 상기 항체는 프로가스트린의 하나의 에피토프 만을 인식한다. 다른 구현예에서, 프로가스트린의 다른 에피토프에 특이적인 항체의 혼합물이 사용될 수 있다.

전이성 직장암의 치료 방법에서 사용하기 위한 항체는 프로가스트린의 결합 친화도의 범위, 예를 들면, 약 5000 nM, 또는 그 이상, 예를 들면, 적어도 약 4000 nM, 3000 nM, 2000 nM, 1000 nM, 900 nM, 800 nM, 700 nM, 600 nM, 500 nM, 400 nM, 300 nM, 200 nM, 100 nM, 90 nM, 80 nM, 70 nM, 60 nM, 50 nM, 40 nM, 30 nM, 25 nM, 20 nM, 15 nM, 10 nM, 7 nM, 6 nM, 5 nM, 4 nM, 3 nM, 2 nM, 1 nM, 0.1 nM, 0.01 nM 또는 0.001 nM을 가질을 수 있다.

상기 개시된 방법의 특정 구현예에서, 본원에 개시된 단일클론 항체가 사용될 수도 있는바, 예를 들면, MAbl , MAb2, MAb3, MAb4, MAb5, MAb6, MAb7, MAb8, MAb9, MAblO, MAbl1, MAbl2, MAbl3, MAbl4, MAbl5, MAbl6, MAbl7, MAbl8, MAbl9, MAb20, MAb21, MAb22, MAb23 등을 포함한다.

상기 개시된 방법의 다른 구현예에서, 본원에 개시된 단일클론 항체로는 예를 들면, 제1 CDR이 V_H CDR 1.3, V_H CDR 1.4, V_H CDR 1.8, V_H CDR 1.13, V_H CDR 1.16, V_H CDR 1.19로부터 선택되고, 제2 CDR이 V_H CDR 2.3, V_H CDR 2.4, V_H CDR 2.8, V_H CDR 2.13, V_H CDR 2.16, V_H CDR 2.19로부터 선택되고 그리고 제3 CDR이 V_H CDR 3.3, V_H CDR 3.4, V_H CDR 3.8, V_H CDR 3.13, V_H CDR 3.16, V_H CDR 3.19로부터 선택되는 중쇄 가변 영역 (V_H)을 가지는 단일클론 항체가 사용될 수도 있다. 상기 CDR의 특정 염기서열은 하기에 기술되어 있다. 다른 유용한 항체는 제1 CDR이 V_L CDR 1.3, V_L CDR 1.4, V_L CDR 1.8, V_L CDR 1.13, V_L CDR 1.16, V_L CDR 1.19로부터 선택되고, 제 2CDR이 V_L CDR 2.3, V_L CDR 2.4, V_L CDR 2.8, V_L CDR 2.13, V_L CDR 2.16, V_L CDR 2.19로부터 선택되고, 그리고 제3 CDR이 V_L CDR 3.3, V_L CDR 3.4, V_L CDR 3.8, V_L CDR 3.13, V_L CDR 3.16, V_L CDR 3.19로부터 선택되는 경쇄 영역(V_L)을 가진다.

6.도면의 간단한 설명
도 1은 다른 인간 일차 및 전이성 직장암 세포주 사이의 가스트린 유전자 발현 수준을 비교한 그래프를 제공한다.
도 2는 11명의 다른 환자 각각으로부터의 전이성 직장 종양 내의 상대적인 가스트린 유전자 발현 수준을 비교한 그래프를 제공한다. 각각의 환자로부터의 전이성 직장 종양(들) 내의 발현 수준을 동일한 환자로부터의 매칭되는 초기의 직장 종양 내의 발현 수준으로 표준화하였다.
도 3은 3개의 다른 전이성 직장암 세포주에 의해 성장된 배지로 분비되는 프로가스트린의 양을 비교한 그래프를 제공한다.
도 4는 건강한 대조군과 비교한, 초기 직장암, 전이성 직장암, 및 초기 종양이 절제된 전이성 직장암을 갖는 환자 내의 혈장 또는 혈청 프로가스트린 농도를 나타내는 그래프를 제공한다.
도 5는 배지 내의 SW620 전이성 직장암 세포의 성장에 미치는 대조군 및 항-hPG 다중클론 항체의 효과를 비교한 그래프를 제공한다.
도 6A는 배지 내의 SW620 전이성 직장암 세포의 성장에 미치는 대조군 및 4개의 다른 항-hPG 단일클론 항체 (MAbl-MAb4)의 효과를 비교한 그래프를 제공한다.
도 6B는 대조군 항체와 비교한 19개의 다른 항-hPG 단일클론 항체 (MAb5-MAb23)로의 치료가 배지 내의 SW620 전이성 직장암 세포의 성장이 미치는 효과는 비교한 그래프를 제공한다.
도 7은 배지 내의 T84 전이성 직장암 세포의 성장에 미치는 대조군 및 항-hPG 단일클론 항체의 효과를 비교한 그래프를 제공한다.
도 8A는 항-hPG 다중클론 항체로 치료받은 누드 마우스로부터 제거된 가시적 전이가 존재하지 않는 간의 사진을 제공한다. SW620 세포를 누드 마우스의 비장에 주입한 후 항-hPG 다중클론 항체, 대조군 다중클론 항체 또는 인산 완충액으로 6 주 동안 처리하였다.
도 8B는 대조군 다중클론 항체로 치료받은 누드 마우스로부터 제거된 가시적 전이를 갖는 간의 사진을 제공한다. SW620 세포를 누드 마우스의 비장에 주입한 후 인산 완충액으로 6 주 동안 처리하였다.
도 9는 누드 마우스의 비장으로 SW620 세포를 주입하고, 항-hPG 다중클론 항체, 대조군 다중클론 항체 또는 인산 완충액으로 6주 동안 처리한 이후의 가시적 간 전이의 수를 비교한 그래프를 제공한다.
도 10은 SW620 세포를 대조군 누드 마우스의 비장에 주입하고, 대조군 다중클론 항체 또는 인산 완충액으로 6 주 동안 처리한 이후의 예시적인 간 미세전이의 현미경사진을 제공한다.
도 11은 SW620 세포를 누드 마우스의 비장에 주입하고 6 주 동안 항-hPG 단일클론 항체와 대조군 항체로 처리한 이후의 가시적 간 전이의 수를 비교한 그래프를 제공한다.
도 12는 초기 및 전이성 직장암 세포주, 뿐만 아니라 초기 인간 직장암의 생검 시료로부터 수득한 세포에 의한 줄기 세포 마커 LGR5의 발현에 미치는 낮은 부작 배지 조건 하의 성장 효과를 입증하는 그래프를 제공한다.
도 13은 초기 및 전이성 직장암 세포주, 뿐만 아니라 초기 인간 직장암의 생검 시료로부터 입수한 세포에 의해 발현되는 가스트린 mRNA의 양에 미치는 낮은 부착성 배양물 조건 하의 성장 효과를 입증하는 그래프를 제공한다.
도 14는 낮은 부착성 배지 조건 하에 성장된, 초기 및 전이성 직장암 세포주, 뿐만 아니라 초기 인간 직장암의 생검 시료로부터 입수된 세포에 의해 배양물로 분비되는 프로가스트린의 양을 입증하는 그래프를 제공한다.
도 15는 낮은 부착성 배지 조건 하에 성장된, HT-29 초기 직장암 세포에 의한 스페로이드의 형성에 미치는 항-프로가스트린 다중클론 항체의 효과를 입증하는 그래프를 제공한다.
도 16은 낮은 부착성 배지 조건 하에서 성장된, HCTl16 초기 직장암 세포에 의한 스페로이드의 형성에 미치는 항-프로가스트린 다중클론 항체의 효과를 입증하는 그래프를 제공한다.
도 17은 낮은 부착성 배지 조건 하에 성장된, 초기 인간 직장암의 생검 시료로부터 입수된 세포에 의한 스페로이드의 형성에 미치는 항-프로가스트린 다중클론 항체의 효과를 입증하는 그래프를 제공한다.
도 18A는 14일 동안 낮은 부착성 배지 조건 하에 인큐베이션된, LGR5-양성 HT29 초기 직장암 세포에 의한 스페로이드의 형성에 미치는 2개의 항-프로가스트린 단일클론 항체의 효과를 입증하는 그래프를 제공한다.
도 18B는 항체가 제거된 이후 적어도 17일 동안 낮은 부착성 조건 하의 LGR5-양성 HT29 초기 직장암 세포에 의한 스페어 형성에 미치는 항-프로가스트린 단일클론 항체로 치료의 억제 효과가 지속됨을 입증하는 그래프를 제공한다.
도 19A는 14일 동안 낮은 부착성 배지 조건에서 인큐베이션된, LGR5-양성 HCT1 16 초기 직장암 세포에 의한 스페로이드의 형성에 미치는 2개의 항-프로가스트린 단일클론 항체의 효과를 입증하는 그래프를 제공한다.
도 19B는 항체가 제거된 이후 적어도 17일 동안 낮은 부착성 배양물 내의 LGR5-양성 HCT1 16 초기 직장암 세포에 의한 스페어 형성에 미치는 항-프로가스트린 단일클론 항체의 치료 억제 효과가 지속됨을 입증하는 그래프를 제공한다.
도 20은 낮은 부착 배양물 조건 하에 성장된, CRCl 초기 직장암 세포에 의한 스페로이드의 형성에 미치는 4개의 다른 항-프로가스트린 단일클론 항체의 치료의 효과를 입증하는 그래프를 제공한다.
도 21은 낮은 부착 배양물 조건 하에 성장된 T84 전이성 직장암 세포에 의한 스페로이드의 형성에 미치는 항-프로가스트린 단일클론 항체의 효과를 입증하는 그래프를 제공한다.
도 22는 통상적인 조직 배양 조건 하에 성장된, LDH1 양성 초기 직장암 세포의 성장에 미치는 4개의 다른 항-프로가스트린 단일클론 항체의 치료의 효과를 입증하는 그래프를 제공한다.
도 23은 낮은 부착성 배지 조건 하에 성장될 때 스페로이드로서 초기 직장암 세포의 성장에 미치는 4개의 다른 항-프로가스트린 단일클론 항체로 선-치료의 효과를 입증하는 그래프를 제공한다.
도 24는 T84 전이성 직장암 세포 내의 암 줄기 세포 마커 ALDH1의 발현에 미치는 항-프로가스트린 단일클론 항체로 전처리의 효과를 입증하는 그래프를 제공한다.
도 25는 SW620 전이성 직장암 세포 내의 암 줄기 세포 마커 ALDH1의 발현에 미치는 항-프로가스트린 단일클론 항체로 전처리의 효과를 입증하는 그래프를 제공한다.
도 26은 낮은 부착성 배지 조건 하에 성장된, T84 전이성 직장암 세포에 의한 스페로이드의 형성에 미치는 항-프로가스트린 단일클론 항체로 전처리의 효과를 입증하는 그래프를 제공한다.
도 27은 낮은 부착성 배지 조건 하에 성장된, SW620 전이성 직장암 세포에 의한 스페로이드의 형성에 미치는 항-프로가스트린 단일클론 항체로 전처리의 효과를 입증하는 그래프를 제공한다.
도 28은 낮은 부착성 배지 조건 하에 스페로이드로서 성장하기 위한 이종이식(xenograft)으로부터 단리된 전이성 직장암 세포의 능력에 미치는 항-프로가스트린 단일클론 항체로 인간 전이성 직장암 이종이식을 받은 마우스의 치료 효과를 입증하는 그래프를 제공한다.
도 29는 다른 마우스로 이식될 때 새로운 종양 성장을 개시하기 위한 이종이식으로부터 단리된 전이성 직장암 세포의 능력에 미치는 항-프로가스트린 단일클론 항체로 인간 전이성 직장암 이종이식을 받은 마우스의 치료 효과를 입증하는 그래프를 제공한다.
도 30은 인간 전프로가스트린 (SEQ ID NO: 100)의 아미노산 염기서열을 제공하는바, 시그날 펩티드 염기서열은 밑줄쳐 있고, 성숙 인간 프로가스트린 (SEQ ID NO: 101) 및 프로가스트린 공정의 특정 생산물은 여기서 G34 (SEQ ID NO: 102), G34-Gly (SEQ ID NO: 103), G17 (SEQ ID NO: 104), G17-Gly (SEQ ID NO: 105) 및 CTFP (SEQ ID NO: 106)를 포함한다.
도 31은 특정 예시적인 뮤린 항-hPG 단일클론 항체의 가변 경쇄 및 가변 중쇄의 폴리뉴클레오티드 및 아미노산 염기서열을 제공한다. 각각의 경우, 3개의 CDR를 굵은 선으로 밑줄친 텍스트로 나타내었다. 구체적으로:
도 31A는 뮤린 항-hPG MAb3의 V_H 사슬의 폴리펩티드 염기서열 (SEQ ID NO: 12) 및 그것을 코드화하는 폴리뉴클레오티드 염기서열 (SEQ ID NO: 16)을 제공하고;
도 31B는 뮤린 항-hPG MAb3의 V_L 사슬의 폴리펩티드 염기서열 (SEQ ID NO: 13) 및 그것을 코드화하는 폴리뉴클레오티드 염기서열 (SEQ ID NO: 17)를 제공하고;
도 31C는 뮤린 항-hPG MAb4의 V_H 사슬의 폴리펩티드 염기서열 (SEQ ID NO: 14) 및 그것을 코드화하는 폴리뉴클레오티드 염기서열 (SEQ ID NO: 18)을 제공하고;
도 31D는 뮤린 항-hPG MAb4의 V_L 사슬의 폴리펩티드 염기서열 (SEQ ID NO: 15) 및 그것을 코드화하는 폴리뉴클레오티드 염기서열 (SEQ ID NO: 19)을 제공하고;
도 31E은 뮤린 항-hPG MAb8의 V_H 사슬의 폴리펩티드 염기서열 (SEQ ID NO:59) 및 그것을 코드화하는 폴리뉴클레오티드 염기서열 (SEQ ID NO:67)을 제공하고;
도 31F는 뮤린 항-hPG MAb8의 V_L 사슬의 폴리펩티드 염기서열 (SEQ ID NO:63) 및 그것을 코드화하는 폴리뉴클레오티드 염기서열 (SEQ ID NO:71)을 제공하고;
도 31G는 뮤린 항-hPG MAbl3의 V_H 사슬의 폴리펩티드 염기서열 (SEQ ID NO:60) 및 그것을 코드화하는 폴리뉴클레오티드 염기서열 (SEQ ID NO:68)을 제공하고;
도 31H는 뮤린 항-hPG MA3의 V_L 사슬의 폴리펩티드 염기서열 (SEQ ID NO:64) 및 그것을 코드화하는 폴리뉴클레오티드 염기서열 (SEQ ID NO:72)을 제공하고;
도 311는 뮤린 항-hPG MA6의 V_H 사슬의 폴리펩티드 염기서열 (SEQ ID NO:61) 및 그것을 코드화하는 폴리뉴클레오티드 염기서열 (SEQ ID NO:69)을 제공하고;
도 31J는 뮤린 항-hPG MAbl6의 V_L 사슬의 폴리펩티드 염기서열 (SEQ ID NO:65) 및 그것을 코드화하는 폴리뉴클레오티드 염기서열 (SEQ ID NO:73)을 제공하고;
도 31K는 뮤린 항-hPG MAbl9의 V_H 사슬의 폴리펩티드 염기서열 (SEQ ID NO:62) 및 그것을 코드화하는 폴리뉴클레오티드 염기서열 (SEQ ID NO:70)을 제공하고;
도 31L은 뮤린 항-hPG MAbl9의 V_L 사슬의 폴리펩티드 염기서열 (SEQ ID NO:66) 및 그것을 코드화하는 폴리뉴클레오티드 염기서열 (SEQ ID NO:74)을 제공한다.
도 32는 본 명세서에 기술된 선택된 항-hPG 단일클론 항체의 인간화된 가변 중쇄 및 경쇄를 위해 계획된 폴리펩티드 염기서열을 제공한다. 각각의 경우, 3개의 CDR는 굵게 밑줄로 그은 텍스트로 나타내었다. 구체적으로:
도 32A은 인간화된 MAb3의 V_H 사슬의 계획된 아미노산 염기서열을 제공한다 (SEQ ID NO:21);
도 32B는 인간화된 MAb3의 V_L 사슬의 계획된 아미노산 염기서열을 제공한다 (SEQ ID NO:22);
도 32C는 인간화된 MAb4의 V_H 사슬의 계획된 아미노산 염기서열 (SEQ ID NO:23)을 제공한다;
도 32D는 인간화된 MAb4의 V_L 사슬의 계획된 아미노산 염기서열 (SEQ ID NO:24)을 제공한다;
도 32E는 인간화된 MAb8(a)의 V_H 사슬의 계획된 아미노산 염기서열 (SEQ ID NO:75)을 제공한다;
도 32F는 인간화된 MAb8(a)의 V_L 사슬의 계획된 아미노산 염기서열 (SEQ ID NO:76)을 제공한다;
도 32G는 인간화된 MAb8(b)의 V_H 사슬의 계획된 아미노산 염기서열 (SEQ ID NO:77)을 제공한다;
도 32H는 인간화된 MAb8(b)의 V_L 사슬의 계획된 아미노산 염기서열 (SEQ ID NO:78)을 제공한다;
도 321는 인간화된 MAb8(c)의 V_H 사슬의 계획된 아미노산 염기서열 (SEQ ID NO:79)을 제공한다;
도 32J는 인간화된 MAb8(c)의 V_L 사슬의 계획된 아미노산 염기서열 (SEQ ID NO:76)을 나타낸다;
도 32K는 인간화된 MAb13(a)의 V_H 사슬의 계획된 아미노산 염기서열 (SEQ ID NO: 80)을 제공한다;
도 32L는 인간화된 MAbl3(a)의 V_L 사슬의 계획된 아미노산 염기서열 (SEQ ID NO:81)을 제공한다;
도 32M는 인간화된 MAbl3(b)의 V_H 사슬의 계획된 아미노산 염기서열 (SEQ ID NO:82)을 제공한다;
도 32N는 인간화된 MAbl3(b)의 V_L 사슬의 계획된 아미노산 염기서열 (SEQ ID NO:83)을 제공한다;
도 320는 인간화된 MAb16(a)의 V_H 사슬의 계획된 아미노산 염기서열 (SEQ ID NO: 84)을 제공한다;
도 32P는 인간화된 MAb16(a)의 V_L 사슬의 계획된 아미노산 염기서열 (SEQ ID NO: 85)을 제공한다;
도 32Q는 인간화된 MAb16(b)의 V_H 사슬의 계획된 아미노산 염기서열 (SEQ ID NO: 86)을 제공한다;
도 32R는 인간화된 MAb16(b)의 V_L 사슬의 계획된 아미노산 염기서열 (SEQ ID NO: 87)을 제공한다;
도 32S는 인간화된 MAbl6(c)의 V_H 사슬의 계획된 아미노산 염기서열 (SEQ ID NO:88)을 제공한다;
도 32T는 인간화된 MAb16(c)의 V_L 사슬의 계획된 아미노산 염기서열 (SEQ ID NO: 89)을 제공한다;
도 32U는 인간화된 MAbl9(a)의 V_H 사슬의 계획된 아미노산 염기서열 (SEQ ID NO:90)을 제공한다;
도 32V는 인간화된 MAb19(a)의 V_L 사슬의 계획된 아미노산 염기서열 (SEQ ID NO:91)을 제공한다;
도 32W는 인간화된 MAb19(b)의 V_H 사슬의 계획된 아미노산 염기서열 (SEQ ID NO:92)을 제공한다;
도 32X는 인간화된 MAbl9(b)의 V_L 사슬의 계획된 아미노산 염기서열 (SEQ ID NO:93)을 제공한다;
도 32Y는 인간화된 MAb19(c)의 V_H 사슬의 계획된 아미노산 염기서열 (SEQ ID NO:94)을 제공한다; 그리고
도 32Z는 인간화된 MAb19(c)의 V_L 사슬의 계획된 아미노산 염기서열 (SEQ ID NO:95)을 제공한다.

7. 상세한 설명

7.1 . 직장암 전이

전이는 암이 퍼지는 과정을 나타낸다. 간단히, 종양 세포는 일차 종양으로부터 혈액 순환 또는 림프계를 통해 새로운 조직 부위에 도달하여 2차 종양을 형성한다. 새로운 조직 부위에 있는 종양을 전이성 종양이라 하며, 통상적으로 일차 종양의 출처를 확인한다. 예를 들면, 다른 조직으로 퍼진 직장암은 2차 전이성 종양의 조직 부위에 있음에도 불구하고, "전이성 직장암"이라 한다. 직장암이 전이되는 가장 흔한 기관은 간과 폐이나, 직장암은 다른 기관들에도 퍼질 수도 있다.

암 세포는 종종 초기 종양 근처의 림프절로 퍼지므로, 이를 림프절 관련 또는 부위 질병이라고도 한다.

특정 이론에 구애됨이 없이, 전이는 침윤 및 이동, 침윤과정, 혈액순환, 혈관외유출 및 군체형성, 증식화 및 혈관신생을 포함하는, 각각의 단계를 통해 진행되는 것으로 알려져 있다. 침윤 및 이동 동안, 각각의 세포는 일차 종양으로부터 탈착되고 인접한 건강한 세포에 침입한다. 이를 달성하기 위하여, 암 세포는 상피세포-중간엽세포로의 전이 현상이라 불리는 표현형 전환을 겪는 것으로 가설화되어 있다. 문헌 [Kalluri, R., et al., J. Clin. Invest., 1 19(6) (2009), 1420-28] 참고. 그러한 세포는 세포외 기질을 분해할 수 있는 효소를 생산할 수 있으므로 일차 종양으로부터 나와서 주변의 건강한 세포로의 이동이 촉진될 수 있다. 이동하는 암 세포가 혈액 또는 림프 혈관에 도달하면, 스스로 혈관을 연결하는 상피 세포 사이에 들어가고 혈류 또는 림프계를 관통한다. 그 다음, 상기 이상 세포는 순환계 또는 림프계를 통해 새로운 기관으로 이동한다. 상기 암 세포는 그 다음 새로운 기관의 모세관 또는 림프관 내에 머무를 수 있으며, 내피를 통과함으로써 조직 공간으로 삼출될 수도 있다. 최종적으로, 군집화, 증식 및 혈관신생 동안, 상기 전이성 암 세포는 그것의 새로운 숙주 조직 내에 머무르게 되고 성장하기 시작한다. 새로운 전이성 종양이 충분한 크기에 도달하면, 그것은 VEGF와 같은 성장 인자를 분비함으로써 종양으로의 새로운 혈관의 성장을 자극하고, 종양의 빠른 성장에 요구되는 산소 및 영양분을 공급할 수도 있다.

7.2. 직장암 재발

직장암 재발은 직장암을 명백하게 사라지게 하는 치료 이후의 직장암의 복귀로 정의된다. 복귀된 직장암이 원래의 암과 동일한 장소에 있거나 그것과 매우 가까운 곳에 있는 경우, 그것은 국소적 재발이라 한다. 복귀된 직장암이 원래의 암의 위치에 가까운 림프절 또는 조직에서 성장하는 경우, 그것은 국부적 재발이라 하고, 복귀된 직장암이 원래의 암의 위치로부터 먼 거리의 기관 또는 조직에 전이되는 경우, 이는 원거리 재발이라 한다.

7.3. 암 줄기 세포 및 직장암

고형 종양은 동종 조직을 필요로 하지 않는다. 오히려, 일부 조직은 별개의 표현형 및 기능적 특성을 갖는 다수의 이상 세포를 포함한다. 이와 관련하여, 그러한 종양은 비정상 기관과 유사하다. 고형 종양을 포함하는 세포들 사이에 중요한 차이는 동일한 숙주 내의 새로운 위치, 또는 동일하거나 다른 종의 새로운 숙주에 이식될 때 새로운 종양의 형성을 개시할 수 있다는 점이다. 그러한 특성을 갖는 세포는 종양 도는 암 개시 세포 또는 선택적으로, 종양 또는 암 줄기 세포로 알려져 있다. 반면, 종양을 포함하는 다른 세포는 더 많은 세포가 사용되는 경우에도, 이식 이후에 새로운 종양을 개시할 가능성이 꽤 감소한다. 일 비-제한적 예로서, 인간 종양으로부터 유래된 수백 개의 직장 암 줄기 세포는 마우스로 이식된 이후에 새로운 종양을 개시하기에는 충분하지만, 상기 종양으로부터의 10,000개의 비-줄기 세포는 그렇게 하기에 불충분하다. 문헌 [Dalerba, P., et al., 2007, "Phenotypic characterization of human colorectal cancer stem cells" Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 104: 10158-10163.] 참고.

많은 종양에서, 암 줄기 세포는 종양 내에 존재하는 상대적으로 작은 비율의 모든 생존가능한 세포를 포함한다. 반면, 종양 덩어리을 포함하는 대수의 종양 세포는 이식될 때 새로운 종양을 개시할 수 없다. 일부 종양에서, 그러나, 암 줄기 세포는 상기 종양을 포함하는 대다수의, 심지어 모든 세포를 구성할 수도 있다. 본원에 기술된 바와 같이, 종양 덩어리 세포는 많은 수의 상기 세포가 사용되지 않는 경우, 이식시 새로운 종양을 개시할 수 없는 종양 세포를 나타낸다. 암 줄기 세포는 또한 자기-재생 능력 및 상대적으로 적은 수의 암 줄기 세포의 이식시 새로운 종양 형성 능력, 및 형광성 활성화된 세포 분류 (fluorescence activated cell sorting, FACS) 또는 다른 검정법에 의해 측정가능한 다른 마커의 발현을 포함하는 덩어리 종양 세포와는 다른 표현형 특징을 가진다. 암 줄기 세포와 덩어리 종양 세포 사이의 다른 구별이 또한 가능하다.

특정 이론에 구애됨이 없이, 암 줄기 세포는 암 줄기 세포의 맥락에서 종양을 증가시킬 수 있는 그들의 능력에 공헌하는 보통의 줄기 세포와 특정 특성을 공유하는 것으로 알려져 있다. 특히, 암 줄기 세포는 비대칭 세포 분열을 겪으면서 2 종류의 딸 세포를 생산한다. 제1딸세포는 미분화된 상태로 남아있으면서 스스로 무한적으로 재생할 수 있는 그의 부모의 줄기 세포 특징을 보유한다. 전구 세포라 불리는, 다른 딸세포는 비정상적으로, 분열하고 분화하여 많은 고형 종양 내에서 발견되는 더 분화된 세포의 스펙트럼을 증가시킬 수 있다. 전구 세포는 줄기 세포 보다 더 빨리 번식하므로 종양의 신체적 성장에 공헌하는 반면, 줄기 세포는 종양의 능력에 따라 새로운 전구물질을 생성함으로써 무분별하게 성장한다.

이러한 특성들은 암 줄기 세포가 성장하고 있는 종양 세포를 포함하는 많은 수의 세포를 무제한적으로 증식시킬 수 있다. 따라서, 새로운 동물로 이식될 때, 암 줄기 세포는 심지어 다수의 일련의 이식 이후에도, 그들이 생성된 곳으로부터 여러 종류의 종양을 재형성할 수 있다. 암 줄기 세포는, 그러나 보통의 줄기 세포와 달리 유전적 돌연변이 및/또는 후성적인 변화를 숨기고 있음으로써, 변화된 증식 패턴 및/또는 많은 비율의 아포프토시스를 초래할 뿐만 아니라 종양 덩어리를 구성할 수도 있는 비정상 세포의 축적을 야기하는 이상 분화를 초래할 수 있다.

암 줄기 세포는 덩어리 종양 세포로부터 그들을 구별하는 다수의 표현형의 특징에 따라 확인될 수 있다. 우선, 상기 기술한 바와 같이, 암 줄기 세포는 새로운 숙주로 이식될 때 새로운 종양을 개시할 수 있는 능력을 가진다. 반면, 덩어리 종양 세포는 새로운 종양을 개시할 수 없거나 새로운 종양 개시를 달성하기 위하여 암 줄기 세포 보다 더 많은 세포가 요구된다. 암 줄기 세포는 또한 특정 마커의 발현 또는 비-발현에 의해 확인가능한 반면, 동일한 종양 세포로부터의 덩어리 종양 세포는 다른 패턴의 마커 발현을 가진다. 암 줄기 세포는 또한 무-혈청 저-부착 배지 조건 하에 성장하고 소위 스페로이드를 형성하기 위하여, 덩어리 종양 세포에 비해 선택적 능력을 가진다. 덩어리 종양 세포로부터 암 줄기 세포를 구별할 수 있는 다른 표현형 차이가 가능하다.

상기 기술한 바와 같이, 암 줄기 세포는 또한 특정 마커 단독으로 또는 다른 것들과 조합하여 발현 패턴에 따라 확인될 수도 있다. 다른 종양으로부터의 암 줄기 세포는, 그러나, 다른 마커 표현형을 나타낼 수도 있다. 그러한 마커는 세포 내에, 또는 세포 표면 상에 발현되는 단백질을 포함하고, 면역조직화학법, 면역형광법 및 FACS 분석법을 포함하는 다양한 기술을 사용하여 검출될 수 있으나, 상기에 제한되는 것은 아니다. 상기 마커를 검출할 수 있는 다른 기술이 또한 당해 기술분야에서 당업자의 지식에 의해 가능할 수 있다. 상기 마커는 또한 암 줄기 세포에서 기능적으로 분석될 수 있는 활성을 포함하는 단백질이다. 마커 종류의 비-제한적 예로는 세포로부터 물질을 방출하거나 세포로 물질을 흡수시키는 것과 같은 트랜스포터 단백질, 독성 제거 효소와 같은 효소를 포함한다.

직장암 줄기 세포를 동정하기 위하여 사용될 수도 있는 예시적인 마커로는 CD133, CD44, CD166, EpCAM 및 LGR5를 포함하나, 상기에 제한되는 것은 아니다. 직장암 줄기 세포를 동정하기에 유용한 다른 마커가 또한 가능하다. 일부 구현예에서, 마커의 발현 부재는 암 줄기 세포 표현형을 표시한다. 게다가, 알데하이드 데하이드로게나제 1 (Aldehyde dehydrogenase 1, ALDHl)은 독성 제거 효소이며 암 세포는 암 줄기 세포의 다른 마커로서, 증가된 ALDHl 활성을 검출할 수 있다.

본 발명의 일부 구현예에서, 직장암 줄기 세포는 FACS, 또는 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 알려진 다른 기술을 사용하여, 하기의 마커 표현형: EpCAM(hi)CD44(+), EpCAM(hi)CD44(+)CD166(+), CD133(+), ALDHl(+), CD133(-)/ALDHl(+), CD44(+)/CD24(+) 또는 LGR5(+)에 의해 동정될 수도 있다. 다른 마커의 발현, 및 그것의 조합 및 패턴이 상기 암 뿐만 아니라 다른 종류의 암 내의 암 줄기 세포를 동정하기 위해 사용될 수도 있다.

본 발명의 다른 구현예에서, 암 줄기세포는 특정 염료를 배제하는 그들의 선택적 능력에 따라 소위 종속 개체군(side population)으로 분류되는 세포들처럼 FACS 분석법을 사용하여 동정될 수도 있다. 그러한 염료의 일 비-제한적 예로는 Hoechst dye 33342가 있다.

상기한 바와 같이, 암 줄기 세포는 또한 새로운 숙주로의 이식 이후에 새로운 종양 성장을 개시할 수 있는 그들의 증가된 능력으로서, 덩어리 종양 세포로부터 구별될 수 있다. 따라서, 암 줄기 세포로 감염된 세포의 집단의 동정을 동정하기 위한 일 방법은 덩어리 종양 세포와 비교하여 그러한 세포의 상대적인 소 집단의 비-인간 수혜 동물로의 이식 이후에 종양 성장을 개시할 수 있는 그들의 능력을 실험하기 위한 것이다.

종양 또는 세로주가 암 줄기 세포를 함유하고 있는지 여부를 평가하기에 유용한 이식 방법은 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 알려져 있다. 비-제한적인 예로서, 암 줄기 세포를 함유하는 것으로 의심되는, 종양 또는 그들의 부분을 단리하는 것으로, 예를 들면 외과수술적 절제이 있다. 그 이후에, 상기 종양 조직은 잘게 절단되고 효소, 또는 종양을 분해하고 그것의 구성 세포를 제거하기에 유효한, 다른 처리제로 처리된다. 선택적으로, 세포주가 분석 중인 경우, 효소적 또는 화학적 처리를 사용하여 세포를 분리하는 것만이 요구될 수도 있다.

세포 현탁액이 제조된 이후에, 상기 세포는 원심분리에 의해 수거되고, 암 줄기 세포에 해당하는 것으로 알려진 소집단은 당해 기술분야에서 공지된 방법에 따라 단리된다. 상기 논의한 바와 같이, 일 비-제한적 예에서, 그러한 세포는 암 줄기 세포를 표시하는 마커의 특정 패턴을 발현하는바, 이는 특정 항체 및 형광성 활성화된 세포 분류 (FACS)를 사용하여 검출가능하다. 다른 구현예에서, 암 줄기 세포를 함유하는 것으로 의심되는 소집단은 특정 염료를 배제하는 그들의 능력과 같은, 다른 표현형 특징에 따라 단리될 수 있다.

관련 세포 소집단을 단리한 이후에, 미리결정된 세포는 수혜 동물 내의 일 이상의 조직 또는 기관으로 이식된다. 일부 구현예에서, 상기 수혜 동물은 면역결핍성 마우스로서, 누드 마우스, 중증 복합 면역결핍성(severe combined immunodeficiency, SCID)을 갖는 마우스, 및 자연발증-당뇨병(nonobese-diabetic SCID, OD-SCID) 마우스를 포함하지만, 상기 제한되는 것은 아니다. 다른 종들이 당업자의 지식에 따라, 사용될 수 있다.

세포는 지방 패드 (예를 들면, 마우스의 유선 지방 패드)로, 뇌, 맹장, 췌장 또는 간으로, 또는 신장 (예를 들면, 신피막)으로 피하 이식될 수 있다. 세포는 다른 기관 및 조직으로도 이식될 수 있다. 일부 구현예에서, 표적 조직 또는 기관은 분석시 종양의 기원 조직 또는 기관을 복제하기 위하여 선택된다. 그러나, 다른 구현에서는, 별개의 조직 또는 기관이 숙주로 이식된 세포로 선택된다. 비-제한적 예로서, 직장 암 줄기 세포가 NOD-SCID 마우스의 신피박으로 이식됨으로써 새로운 종양을 개시할 수 있는 그들의 능력이 평가될 수 있다.

당업자에게 알려진 기술을 사용하여 달성되는, 이식 이후에, 상기 세포를 그대로 남겨둠으로써 새로운 종양이 이식 지점에서 성장하는지 여부가 측정된다. 피하로 이식된 세포의 경우, 종양 성장은 시각적 검사 및 이식 부위의 촉진에 의해 평가될 수 있다. 종양이 성장하는 경우, 그것의 크기는 캘리퍼를 사용하는 시간을 통해 측정될 수 있다. 세포가 내부 기관으로 이식되는 경우, 종양이 존재하는 경우, 만약 그런 경우 그것의 크기를 측정하기 위하여 동물은 미리결정된 이식-후 시간에서 희생될 수도 있다. 대체적으로, 당업자들의 지식에 따라, 비-침유성 기술이 종양 성장을 평가하기 위하여 사용될 수 있다.

암 줄기 세포 표현형은 또한 무-혈청, 저 부착성 배지 조건 하에 스페로이드로 성장하기 위한 암 줄기 세포의 선택적 능력을 특징으로 하는 반면, 덩어리 종양 세포는 동일한 조건 하에 스페로이드로 성정할 가능성이 낮다. 스페로이드는 분해된 현택액으로서 시딩된 이후에 배지에서 특정 세포 성장으로서 형성하는 세포의 압축된 볼이다. 그러한 스페로이드의 형성은 일반적으로 세포가 특정 성장 인자 (상피세포 성장 인자 (EGF) 및 염기성 섬유아세포 성장인자 (bFGF)를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다)의 존재 하에, 무-혈청 배지 및 포유동물 세포가 불충분하게 부착하는 표면을 갖는 조직 배양 디쉬에서 성장이 촉진된다. 보통의 조직으로부터의 줄기 세포와 마찬가지로, 암 줄기 세포는 선택적으로 적당한 배양 조건 하에서 스페로이드로 성장한다는 것이 알려져있다. 문헌 [Rappa, G., et al., Exp. Cell Res., 314:21 10 (2008); Singh, S.K., et al., Cancer Res., 63:5821 (2003); Fang, D., et al., 암 Res., 65:9328 (2005)] 참고. 반면, 더 많이 분화되는 경향이 있는, 덩어리 종양 세포는 동일한 배지 조건 하에서 스페로이드를 형성할 가능성이 낮다. 덩어리 종양 세포가 스페로이드를 형성할 수 있는 경우, 그들은 유사한 수의 암 줄기 세포에 의해 형성되는 것들과 비교하여 더 적거나 및/또는 극소수인 경향이 있다.

7.4. 암 줄기 세포 및 직장암 재발

암 줄기 세포의 특성을 갖는 종양 세포는 방사선 및/또는 화학 요법에 강한 내성을 나타내는 것으로 확인되었다. 다른 분자 메카니즘이 방사선 또는 화학요법에 대한 암 줄기 세포의 내성을 설명하기 위하여 제안되어 있다. 예를 들면, 특정 암 줄기 세포는 유전독성 인설트 이후에 그들의 DNA를 더 용이하게 복구할 수도 있으나, 다른 암 줄기 세포는 항-아포프토틱 단백질 또는 그러한 세포에 들어가는 화학요법을 제거하기에 유용한 분자 펌프를 높은 수준으로 발현한다. 문헌 [Eyler, C.E., and J.N. Rich, J. Clin. Oncol, 26:2839-2845 (2008)] 참고. 그러한 암 줄기 세포는 또한 전구물질 보다 느리게 증식하므로 세포는 덩어리 종양 세포를 죽이는 방사선 및 독성 화학요법에 노출에 살아남기 위한 줄기 세포의 상당한 능력을 설명할 수도 있다.

특정 이론에 구애됨이 없이, 암 줄기 세포가 방사선 및 화학요법에 내성이 있다는 발견은 그러한 요법으로 치료 받은 암 환자에서의 재발 현상으로 설명될 수도 있다. 상기 문헌 [Eyler] 참고. 그러한 환자에서, 치료는 처음에는 종양을 진단 스캔에서 외관상 사라지게 하기에 유효하지만, 종양은 치료 중단 이후에 일정 시간이 흐르면 다시 나타난다.

재발의 매케니즘에서 암 줄기 세포의 역할과 관련하여, 대부분의 또는 심지어 모든 덩어리 종양 세포는 치료요법에 의해 죽지만, 방사선 또는 화학요법의 효과를 저항하는 그들의 강화된 능력으로 인해 생존하는 생존가능한 암 줄기 세포가 남아있는 것으로 가설화되어 있다. 치료요법이 완료된 이후에, 이러한 생존 세포는 계속적으로 성장함으로써 원래의 종양을 재형성하거나 새로운 종양을 형성한다. 이론과 일치하게, 화학요법제로의 마우스의 치료는 인간 직장암 세포로부터 개시된 종양을 감소시키지만, 종양 내부의 암 줄기 세포의 비율은 증가시킨다. 문헌 [Dylla, S.J., et al., 2008, "Colorectal Cancer Stem Cells Are Enriched in Xenogeneic Tumors Following Chemotherary," PLoS ONE, 3 (6):e2428] 참고.

7.5. 직장암 내의 프로가스트린의 역할에 대한 이해력 증진

놀랍게도 인비트로 또는 인비보에서 그러한 세포의 성장을 억제하는 프로가스트린 ("PG")에 특이적으로 결합하는 특정 항체의 능력으로 입증된 바와 같이, 프로가스트린 민감성 전이성 직장암 세포 및 직장암 줄기 세포가 존재하는 것으로 발견되었다.

PG-민감성 직장암 세포는 직접적으로 또는 간접적으로, 그것의 생존 및/또는 성장을 위해 프로가스트린에 적어도 부분적으로 의존한다. 임의의 특정 이론에 구애됨이 없이, 특정 항-PG 항체는 PG에 결합하고 PG-의존성 시그날링을 차단하는 세포의 생존 및/또는 성장을 억제하기에 유효한 것으로 가설화되어 있다. 따라서, 프로가스트린은 그것의 생존 및/또는 성장-촉진 효과를 중재하는 것을 예방한다. 항-PG 항체가 직장암 세포의 생존 및/또는 성장을 억제하는 다른 메카니즘이 존재하고, 특정 작용 메카니즘으로 본 발명의 범위가 제한되는 것을 의도하지 않는다.

실시예에서 더 자세히 기술되는 바와 같이, 본 출원인은 놀랍게도 가스트린 유전자 (GAST)가 6개의 다른 인간 일차 직장암 세포주, HT29, HCTl16, RKO, SW480, DLDl 및 CRCl 세포에서, 그리고 2개의 다른 인간 전이성 직장암 세포주, SW620 및 T84 세포에서 발현된다는 것을 발견하였다. 인 비보 실험으로부터의 데이터와 관련하여, 본 출원인은 놀랍게도 상기 가스트린 유전자가 초기 직장 종양 및 11명의 다른 환자 각각으로부터 얻어진 매칭되는 직장 전이에서 비록 초기 종양에서의 수준에 비해 매칭되는 전이에서의 발현 수준은 환자에 따라 다양하였지만, 발현됨을 발견하였다. 프로가스트린은 (동일한 유전자 생성물로부터 후-전사 처리된 다른 펩티드와 함께) 가스트린 유전자의 산물이기 때문에, 이러한 데이터는 초기 및 전이성 직장 종양이 프로가스트린을 분비한다는 것을 나타낸다. 하기 설명한 바와 같이, 추가적인 실험으로 이를 확인하였다.

우선, 본 출원인은 PG 단백질의 검출가능한 양이 SW620 및 T84 세포(비록Colo-205 세포에 의해서는 아니지만)에 의해 성장 배지로 분비됨을 확인하였다. 추가적으로, 본 출원인은 초기 직장암 만을 갖는 환자, 초기 및 전이성 직장암을 동시에 갖는 환자, 및 초기 종양의 절제 이후에 전이성 직장암을 갖는 환자 모두는 건강한 대조군의 혈액과 비교해 볼 때, 통계적으로 혈액 내의 유의적으로 높은 PG 수치를 가짐을 입증하였다. 이러한 결과는 초기 및 전이성 직장 종양이 혈류로 직접적으로 또는 간접적으로 들어가는, PG를 분비한다는 것을 나타낸다. 따라서, 증가된 혈액 PG 수준은 초기 뿐만 아니라 전이성 직장암의 존재를 표시한다. 따라서, 본 발명의 방법은 다른 환자 집단에서 초기 뿐만 아니라 전이성 직장암의 존재를 검출하거나 진단하는 방법을 제공한다.

본 출원인들은 또한 놀랍게도, 특정 항-PG 항체, 즉, 중화 항체가 배지에서 전이성 직장암 세포의 성장을 억제할 수 있음을 발견하였다. 구체적으로, 본 출원인은 항-PG 다중클론 항체 및 4개의 다른 항-PG 단일클론 항체가 배지에서 성장하는 SW620 세포의 성장을 억제할 수 있음을 실험적으로 입증하였다. 이러한 데이터는 중화 항-PG 항체가 전이성 직장암 세포의 성장을 예방할 수 있으므로, 그러한 세포가 PG 특이적임을 입증한다. 이러한 데이터는 또한 상기 항체의 치료학적 유효량이 전이성 직장암의 치료가 요구되는 피검체에 투여되는 경우, 상기 전이가 치료되기에 유효함을 나타낸다.

추가의 실험은 누드 마우스 범위에서 수행하였으며 본 출원인이 인비트로 실험에 의해 확인하였다. 따라서, 본 출원인은 전이성 SW620 세포를 누드 마우스의 비장에 주사하였다. 그 이후에, 간략하게, 상기 비장을 절제하고, 시간의 흐름에 따라 상기 마우스에 항-PG 단일클론 항체를 투여하였다. 대조군 동물에서도 대조군 항체를 주입하는 것을 제외하고는 마찬가지로 진행하였다. 치료 6주 이후에, 상기 마우스를 죽이고, 간에서 형성된 전이의 수 및 중량을 측정하였다. 놀랍게도, 본 출원인은 전이의 평균 개수가 대조군 동물에 비해 치료받은 동물에서 통계적으로 유의적인 41%까지 떨어졌음을 발견하였다. 이 설득력있는 데이터는 중화 항-PG 항체가 인 비보에서 전이성 직장암의 성장을 억제할 수 있음을 확인하고, 그러한 항체의 치료적 유효량이 전이성 직장암의 치료가 요구되는 피검체에 투여되는 경우, 그러한 전이가 유효하게 치료됨을 입증한다.

본 출원인에 의해 인 비트로 및 인 비보에서 수행된 추가의 실험은 놀랍게도 초기 및 전이성 직장암이 PG 특어적인 직장암 줄기 세포를 함유하고, 중화 항-hPG 항체가 그러한 세포의 성장을 억제할 수 있음을 입증하였다.

일 구현예에서, 본 출원인들은 낮은 부착성 배지 조건 하에서 일차 (HT29, HCT116, CRC1) 및 전이성 (SW620 및 T84) 직장암 세포주가 직장암 줄기 세포의 표현형 마커인, LGR5를 발현하는 세포의 비율을 증가시킴을 입증하였다. 그러한 배지 조건은 선택적으로 비-줄기 세포 소집단에 비해 암 줄기 세포의 성장을 선택하고 LGR5의 증가된 발현은 초기 및 전이성 직장암이 암 줄기 세포를 함유함을 확인한다.

본 출원인은 낮은 부착성 조건이 통상적인 조건 하에 세포의 성장에 비해 동일한 세포에서의 가스트린 유전자 발현의 수준을 증가시킴을 발견하였다. 이러한 데이터는 가스트린 유전자 발현이 동일한 집단에서의 비-줄기 세포에 비해 일차 뿐만 아니라 전이성 직장암으로부터의 직장암 줄기 세포에서 더 높음을 나타내고, 그리고 또한 분비된 프로가스트린의 수준이 더 높은 것임을 나타낸다. 본 출원인은 낮은 부착성 조건 하에서 성장시 다른 수준으로 CRCl, HT29, SW620 및 T84 세포에서 프로가스트린 발현을 확인하였는바, 이는 상기 세포주가 PG 선택적 직장암 줄기 세포를 함유함을 제안한다.

본 출원인은 항-hPG 항체로 낮은 부착성 조건 하에 성장한 일차 및 전이성 직장암 세포를 처리함으로써 이를 확인하였고, 놀랍게도 소위 형성된 세포 스페로이드의 수가 대조군 항체로 처리한 것에 비해 감소된다는 것을 발견하엿다. 낮은 부착성 조건 하에 스페로이드의 형성은 직장암 줄기 세포 뿐만 아니라 비-줄기 세포 소집단의 특징이므로, 이 결과는 항-hPG 항체가 일차 뿐만 아니라 전이성 직장암 내의 직장암 줄기 세포의 성장을 억제하기에 유효함을 의미하는 것으로 해석된다.

예를 들면, 항-hPG 다중클론 항체를 사용하여, 모두 초기 직장암 세포인, HT29, HCT116 및 CRCl 세포의 처리는 감소된 스페어 형성을 초래하였다. 또한, HCT116 및 HT29 세포에 대한 실험은 2개의 다른 항-hPG 단일클론 항체를 사용하는 LGR5 양성 암 줄기 세포의 소집단에 의해 성장된 스페어에서 유사한 효과가 관찰되었다. 흥미롭게도, 첨가된 항체의 부재 하에 17 일 동안 연속 인큐베이션된 이후의, 세정에 의한 항체의 제거로 인해 스페어의 수가 증가하지 않았는바, 이는 직장암 줄기 세포 상의 항-hPG 항체의 억제 효과가 영구적이지만 그들의 계속된 존재에 의존하지 않음을 나타낸다. 4개의 다른 항-hPG 단일클론 항체로 CRCl 세포의 처리는 또한 스페어 형성을 감소시키기에 유효하였다, 추가로, 항-hPG 단일클론 항체의 동일한 세트로 통상적인 조건 하에 성장하는 CRCl 세포의 전처리는 ALDH1 양성 세포의 수 뿐만 아니라 전처리 세포가 낮은 부착성 배지 조건으로 전달될 이후에 형성되는 스페로이드의 수도 감소시켰다. 3개의 항체가 C-말단 부분 PG를 인식하는 반면, 하나의 항체는 N-말단 부분을 인식하였다.

유사한 결과가 전이성 직장암 세포주를 실험할 때 얻어졌다. 따라서, ALDH1에 대한 T84 세포양성의 소집된의 단리 이후에, 직장암 줄기 세포를 위한 다른 마커, 그러한 세포에 의해 형성되는 스페로이드의 수는 대조군 항체에 비해 항-hPG 단일클론 항체로 처리함으로써 용량 반응성 방법으로 감소되었다. 마찬가지로, 동일한 항-hPG 단일클론 항체로 통상적인 조건 하에 성장하는 T84 및 SW620 세포의 전처리는 ALDH 1 양성 세포의 수 뿐만 아니라 전처리된 세포가 낮은 부착성 배양 조건으로 전달된 이후에 형성되는 스페로이드의 수도 감소시켰다. 사실, 성장 억제 효과는 5-플루오로우라실, 화학치료 약물의 것보다 더 컸다. 이러한 데이터는 놀랍게도 전이성 직장암 세포가 프로가스트린 특이적 줄기 세포를 함유하는 결과, 특정 항-hPG 단일클론 항체로 처리됨으로써 상기의 성장이 억제될 수 있음을 확인하였다.

상기 논의한 바와 같이, 암 줄기 세포의 독특한 특성 중 하나는 전이 이후에 새로운 종양을 개시할 수 있는 그들의 능력이다. 직장암 줄기 세포를 억제하는 항-hPG 항체의 능력을 확인하기 위하여, 본 출원인들은 배지에서 스페로이드로 성장하고 이식 이후에 새로운 종양을 개시하기 위한 직장암 간 전이로부터의 세포의 능력에 미치는 특이적 항-hPG 단일클론 항체의 효과를 실험하였다. 실시예에서 추가로 설명한 바와 같이, 본 출원인들은 전이성 SW620를 누드 마우스의 비장에 주입하였다. 그 이후에, 상기 비장을 절제하고, 상기 마우스에 시간 과정에 따라 항-PG 단일클론 항체를 투여하였다. 대조군 동물들도 대조군 항체를 주입한 것을 제외하고는 동일하게 진행하였다.

치료의 6주 이후에, 상기 마우스를 희생시키고 간에서 형성된 직장 전이를 해부한 후 처리하여 생존가능한 전이성 직장암 세포를 추출하였다. 그 다음 상기 세포를 낮은 부착성 배지에서 스페로이드를 형성하고 새로운 마우스로의 이식 이후에 새로운 종양을 형성하는 그들의 능력을 실험하였다. 이러한 특성들은 모두 직장암 줄기 세포의 특징이다.

상기 결과로서 직장암 줄기 세포의 성장에 미치는 항-hPG 항체의 억제 효과를 확인하였다. 우선, 본 출원인은 소수의 스페로이드가 대조군의 경우에 비해 특이적으로 처리된 동물의 간으로부터 단리된 전이성 직장암 세포로부터 낮은 부착성 배지에서 형성됨을 발견하였였다. 또한, 본 출원인은 스페로이드로부터의 세포가 2개의 새로운 실험 동물로 피하 주입될 경우, 특이적으로 인비보에서 처리된 세포로부터 성장한 종양이 대조군 항체로서 인비보에서 처리된 세포로부터 성장한 것들에 비해 평균적으로 상당히 더 작음을 발견하였다. 이러한 설득력있는 결과는 hPG에 특이적인 항체로 인비보에서 전이성 직장암 세포의 처리는 전이성 종양 내의 직장암 줄기 세포의 수를 감소시킴을 입증한다.

상기 기술된 놀랍고도 설득력있는 결과를 바탕으로, 항-hPG 항체로 환자를 치료하는 것은 초기 또는 전이성 직장암의 재발을 예방하는데 유효하다는 것이 예상된다. 또한, 그러한 줄기 세포의 성장에 미치는 상기 항체의 억제 효과는 항-hPG 항체의 지속적인 존재를 요구하지 않을 수도 있다.

7.6. 항체

본원에 개시된 방법 및 키트에서 유용한 항체는 가스트린 유전자의 다른 생성물에 비해 인간 프로가스트린에 특이적으로 결합하는 것들이다. 도 30에 예시한 바와 같이, 상기 가스트린 유전자는 전-프로가스트린으로 불리는, 101-아미노산 폴리펩티드로 번역되는바, 프로가스트린, 80-아미노산 폴리펩티드를 제공하는, 절단된 시그날 염기서열 (밑줄침)을 함유한다. 그 다음, 프로가스트린이 절단되어 프로가스트린의 38-71 잔기 염기서열에 해당하는 34-아미노-산 생성물을 생성하고 그 다음 그것의 카르복시 말단에서 글라이신 잔기로 확장됨으로써 글라이신-확장된 G34 ("G34-Gly")가 생성된다. 이 절단의 부산물은 C-말단 인접 펩티드로 불리는, 6-아미노산 펩티드, 또는 프로가스트린의 잔기 75-80의 염기서열에 상응하는, CTFP이다. 그 다음, G34-Gly는 추가로 절단됨으로써 프로가스트린의 잔기 55-71의 염기서열에 해당하는 17-잔기 폴리펩티드를 생성하는바, 이를 G17-Gly라고도 한다. C-말단 아미드화 이후의, G34-Gly 및 G17-Gly의 C-말단 글라이신의 제거는 각각 G34 및 G17를 생산하고, 상기 모두는 C-말단 아미드화된다.

본원에서 사용된, 항체는 전장 프로가스트린에는 결합하지만 CTFP, 아미드화된 가스트린, 또는 글라이신-확장된 가스트린 모두에는 더 이상 결합하지 않는 경우, hPG에 "매우 특이적"이거나 hPG에 "매우 특이적으로 결합한다"라고 하고, 그것이 CTFP 및 표준 결합 검정법에서 측정된 가스트린 유전자의 다른 생성물에 비해 hPG에 적어도 약 5-배 이상의 결합을 나타내는 경우, hPG에 "특이적"이거나 hPG에 "특이적으로 결합한다"라고 한다. 특정 항-hPG 항체의 특이성을 평가하기 위하여 사용될 수 있는 특이적 ELISA 검정법을 실시예 21에 제공하였다.

그러한 높은 특이적 및/또는 특이적 항-hPG 항체 (본원에서 "항-hPG 항체"로도 나타냄)는 비록, 치료적 사용, 일부 경우에 진단적 또는 다른 인비트로 사용의 경우, 단일클론 항체가 바람직할 수는 있지만, 다중클론 ("항-hPG PAbs") 또는 단일클론 ("항-hPG MAbs")일 수도 있다.

항-hPG 항체에 의해 결합되는 에피토프는 중요하지 않다. 유용한 항-hPG 항체는 hPG의 N-말단 영역, hPG의 C-말단 영역, 또는 hPG의 다른 영역에 결합할 수도 있다. 최근, 적어도 단일클론 항-hPG 항체의 경우, 항-hPG 항체를 증가시키기 위하여 사용되는 항원의 선별은 중요할 수도 있는 것으로 발견되었다 (2010년 10월 15일자 출원된 국제 출원 제PCT/EP2010/006329호 및 2010년 10월 15일자 출원된 U.S. 출원 제12/906,041호 참고, 상기의 개시내용 및 구체적으로 개시된 항-hPG 항체는 참조로서 본 명세서에 통합된다; 이하 각각 '329 및 '041라고도 한다). '329 및 '041 출원에서 개시된 바와 같이, hPG로부터 유도된 모든 항원이 생리학적 조건 하에 hPG에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체의 생성을 자극하는 것은 아니다. 사실, 전장 재조합 hPG (예를 들면, WO 08/076454, Singh 참고)와 같은 다중클론 항-hPG 항체 및 hPG (예를 들면, WO 07/135542, Hollande et al. 참고)의 C-말단부에 마지막 10개의 아미노산에 해당하는 펩티드를 성공적으로 발생시키기 위하여 사용되는 특정 항체는 단일클론 항체를 생성하지 못한다. '329 및 '041 출원에 기술된 바와 같이, hPG 염기서열 내부의 항원성 N-말단 및 C-말단 염기서열은 hPG에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체를 발생시키기 위하여 사용될 수 있음이 확인되었다. 흥미롭게도, 상기 항원성 염기서열은 그것에 독특한 hPG 염기서열의 영역에 제한될 필요가 없다. 가스트린 유전자, 예를 들면, G17, G34 및 CTFP의 다른 새로운 생산물과 공통의 염기서열의 영역을 갖는 펩티드 항원은 hPG에 결합할 뿐만 아니라 그것에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체를 생산한다.

hPG의 N-말단 영역에 상응하는 염기서열을 갖는 펩티드 항원을 사용하여 입수가능하고 및/또는 hPG의 N-말단 영역에 결합하는 항-hPG 항체를 본원에서 "N-말단 항-PG 항체"라고도 한다. hPG에 특이적인 다중클론 뿐만 아니라 단일클론 항체를 얻기에 적합한 면역원을 구성하기 위해 사용될 수 있는 hPG의 특정 예시적인 항원성 영역은 hPG의 잔기 1 내지 14: SWKPRSQQPDAPLG (SEQ ID NO:25)에 해당한다. 이러한 예시적인 면역원으로 얻어지는 N-말단 항-hPG 항체 뿐만 아니라, N-말단 항-hPG 단일클론 항체의 CDR 및 V_H 및 V_L 염기서열을 얻기에 유용한 예시적인 면역원을 하기의 표 1 A 및 실시예 부분에 나타내었다:

hPG의 C-말단 영역에 해당하는 염기서열을 갖는 펩티드 항원을 사용하여 입수가능하고, 및/또는 hPG의 C-말단 영역에 결합하는 항-hPG 항체를 본원에서 "C-말단 항-hPG 항체"라고도 한다. 다중클론 및 단일클론 C-말단 항-hPG 항체를 얻기에 유용한 면역원을 건설하기 위해 사용될 수 있는 특정 예시적인 항원성 영역은 hPG의 잔기 55 내지 80에 해당한다: QGPWLEEEEEAYGWMDFGRRSAEDEN (SEQ ID NO:27). C-말단 항-hPG 항체을 얻기에 유용한 항원을 포함하는 예시적인 항원, 뿐만 아니라 이러한 예시적인 항원으로 얻어지는 C-말단 항-hPG 단일클론 항체의 CDR 및 VH 및 VL 염기서열을 표 1B 및 실시예 부분에 나타내었다.

표 1 A 및 1 B에 제공된 예시적인 항-hPG 단일클론 항체 MAbl-MAb23에 의해 결합되는 특이적 에피토프를 문헌 [각각 Laune et al., 2002, J. Immunol. Methods 267:53-70 및 Laune, 1997, J. Biol. Chem. 272:30937-30944]에 기술된, SPOT 기술 및 알라닌 스캐닝을 사용하여 맵핑하였다 (또한, '329 출원의 실시예 6 참고).

SPOT 기술에서, 추정 에피토프를 스캐닝하는 15 개의 아미노산 펩티드 염기서열을 생성하고 니트로셀룰로오스 막으로 스포팅한 이후에 실험 항체로 프로브함으로써 항체에 의해 인식되는 최소한의 에피토프 염기서열을 측정하였다. 알라닌 스캐닝을 사용하여 항체 결합에 중요한 에피토프 내부의 잔기를 측정하였다. 추정 에피토프 내부의 각각의 잔기를 하나씩 알라닌으로 돌연변이화하고, 알라닌-함유 펩티드를 실험 항체로 브로브하였다.

N-말단 항-hPG 단일클론 항체 MAbsl-4 및 15-20의 경우, 에피토프는 하기의 표 2A에 나타낸 바와 같이, 적어도 하기의 염기서열을 포함한다: DAPLG (SEQ ID NO:28), PDAPLG (SEQ ID NO:29), PRSQQPD (SEQ ID NO:30), WKPRSQQPD (SEQ ID NO:31), 또는 WKPRSQQPDAPLG (SEQ ID NO:32).

C-말단 항-hPG 단일클론 항체 MAbs5-7, 9-12, 14 및 21-23의 경우, 에피토프는 적어도 하기의 표 2B에 나타낸 바와 같이, 하기의 염기서열을 포함한다: FGRR (SEQ ID NO:33), MDFGR (SEQ ID NO:34), AEDEN (SEQ ID NO:35), 및 GWMDFGRR (SEQ ID NO:36).

에피토프 맵핑 실험은 항-hPG MAb2 및 MAb4가 동일한 에피토프에 결합하고; 항-hPG MAbl 및 MAb3가 대체로 동일한 에피토프에 결합하고; MAbl7, MAbl8, MAbl9, 및 MAb20가 대체로 동일한 에피토프에 결합하고, MAbl5 및 MAbl6가 대체로 동일한 에피토프에 결합하고, 항-hPG MAb5, MAb6, MAb7, MAb9, 및 MAbl2가 대체로 동일한 에피토프에 결합하고 대체로 항-hPG MAblO와 동일한 에피토프에 결합하고; 그리고 항-hPG MAbl1 및 MAbl4가 대체로 동일한 에피토프에 결합함을 나타낸다.

본원에 기술된 방법 및 키트에서 사용하기에 유용한 N-말단 항-PG 항체의 특정 구현예는 hPG의 잔기 10 내지 14 (SEQ ID NO:28), hPG의 잔기 9 내지 14 (SEQ ID NO:29), hPG의 잔기 4 내지 10 (SEQ ID NO:30), hPG의 잔기 2 내지 10 (SEQ ID NO:31), 또는 hPG의 잔기 2 내지 14 (SEQ ID NO:32)를 포함하는 에피토프에 결합하는 항체를 포함한다.

본원에 기술된 방법 및 키트에서 유용한 C-말단 항-PG 항체의 특정 구현예는 hPG의 잔기 71 내지 74 (SEQ ID NO:33), hPG의 잔기 69 내지 73 (SEQ ID NO:34), hPG의 잔기 76 내지 80 (SEQ ID NO:35), 또는 hPG의 잔기 67 내지 74 (SEQ ID NO:36)를 포함하는 에피토프에 결합하는 항체를 포함한다.

표 1A & 1B에 제공된 것들 외에도, 본원에 개시된 방법 및 키트에서 유용한 N-말단 및 C-말단 항-hPG 항체는 예시적인 MAbs 1-23, 또는 N- 또는 C- 말단 에피토프에 결합하는 다른 참조 항체로 경쟁적인 결합 검정법으로 확인될 수 있는바, 이는 이후의 부분에서 더욱 상세히 기술될 것이다.

실시예에서 입증된 바와 같이, 심지어 hPG에 높은 특이성 및 친화도를 나타내는 항-hPG 항체 모두가 hPG의 생물학적 활성을 중화하는 것은 아니다. 예를 들면, 비록 항-hPG MAbl 4가 약 6 pM의 K_D를 갖는 hPG에 결합하더라도, 적어도 실험된 농도에서, 인비트로 검정법에서 직장암 세포의 성장을 억제하지 않았으나, 다른 항-hPG 단일클론 항체, 예를 들면 MAbl-MAbl 3 및 MAbl 5-MAb23는 다양한 정도의 억제 활성을 나타내었다. hPG에 특이적으로 결합하는 비-중화 및 중화 항체 모두가 본 발명의 진단 방법에서 유용하지만, 치료 방법에서 유용한 항-hPG 항체는 중화 활성을 나타내어야 한다.

본원에서 사용된 "중화 항-hPG 항체"는 비-특이적 항체로 처리된 대조군 시료와 비교해 볼 때, 항-hPG 항체로 처리된 실험 시료 내에서 살아있는 직장 암 세포의 수에서의 통계학적으로 유의적인 감소를 나타내는 항-hPG 항체를 의미한다. 임의의 특정 항-hPG 항체의 능력을 평가하기 위한 특정 검정법을 실시예 22에서 기술하였다. 상기 검정법에서 살아있는 직장암 세포의 수에서 적어도 50% 감소를 나타내는 항-hPG 항체는 비록 낮은 수준의 중화 활성, 예를 들면 본 검정법에서 살아있는 직장 세포의 수에서의 40%, 30%, 20%, 15%, 또는 심지어 10%의 통계적으로 유의한 감소를 나타내는 항-hPG 항체가 치료적 이점을 제공하는 것으로 예상되더라도, 직장암 치료에 특히 유용한 것으로 생각된다. 상기 검정법에서 사용하기 위한 예시적인 세포는 본원에 기술된 초기 및 전이성 직장암 세포주를 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.

따라서, 일부 구현예, 예를 들면, 치료적 구현예에서, 유용한 항-hPG 항체는 중화된다. 본원 및 '329 및 '041 출원에 기술된 바와 같이, 중화되는 항-hPG 단일클론 항체의 능력은 N-말단 및 C-말단 항-hPG 단일클론 항체 모두가 직장암 세포로의 검정에서 중화 활성을 나타내기 때문에, 에피토프에-의존적이 않다. 따라서, 일부 특정 구현예에서, 중화 항-hPG 항체는 N-말단 중화 항-hPG 항체이다. 다른 구현예에서, 중화 항-hPG 항체는 C-말단 중화 항-hPG 항체이다.

임의의 특정 항-hPG 항체의 친화도는 중요하지 않다. 그러나 일부 사용의 경우, 적어도 약 1 μM의 친화도를 나타내는 항체가 바람직할 수도 있다. 치료적 사용의 경우, 적어도 약 90 nM, 80 nM, 70 nM, 60 nM, 50 nM, 40 nM, 30 nM, 20 nM, 15 nM, 10 nM, 7 nM, 6 nM, 5 nM, 4 nM, 3 nM, 2 nM, 1 nM, 0.1 nM, 0.01 nM, 0.001 nM 또는 심지어 더 큰 친화도가 바람직할 수도 있다. 표 1A & 1B에서 확인된 항-hPG 단일클론 항체에 대한 측정 친화도는 하기의 표 3에 나타낸 바와 같이, 10^-6 내지 10^-12 M 범위이다:

특히 바람직한 적용에 특히 적합한 친화도를 갖는 항-PG 단일클론 항체는 상기로부터 쉽게 선택되거나, 본원에 기술된 다양한 면역원, 상보성 결정 영역 (CDR) 염기서열, 항-hPG 항체의 가변 중쇄 (V_H) 및 가변 경쇄 (V_L)을 사용하여 생성되거나 설계될 수 있다. 임의의 특정 항-PG 단일클론 항체의 친화도는 당해 기술분야에 공지되어 있거나 본원에 기술된 기술, 예를 들면 ELISA, 등온 적정 열량계 (isothermal titration calorimetry, ITC), BIAcore, 또는 형광 편광 검정법을 사용하여 측정될 수 있다. 특정 검정법을 실시예 23에 나타내었다.

표 1A & 1B에 나타낸 바와 같이, 다수의 N-말단 및 C-말단 단일클론 항-hPG 항체가 확인되었다. 상기 항체들 모두가 hPG에 특이적이고, MAb14을 제외하고, 나열된 것들 모두가 중화 활성을 나타내었다. 항체를 얻기에 유용한 다수의 히브리도마를 부다페스트 조약에 따라, Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM)에 2010년 10월 6일 기탁하였다. 항-hPG MAbsl-23를 생성하는 히브리도마의 기탁명과 상기 기탁된 히브리도마의 기탁 등록 번호를 표 1A & 1B에 나타내었다. 또한, 다수의 항체에서, 그들의 가변 중쇄 (V_H), 가변 경쇄 (V_L), V_L 상보성 결정 영역 (CDR) 및 V_H CDR의 아미노산 염기서열을 측정하였다. 이러한 아미노산 염기서열, 및 본 발명 전체에서 그들을 참조하기 위해 사용된 속기 명명법을 표 1A & 1B에 나타내었다. 간단히, 뮤린 중쇄 및 경쇄 가변 도메인은 본원에서 mV_H 및 mV_L로 나타내었고, 상응하는 단일클론 항체의 수, 예를 들면 항-hPG MAb3의 가변 경쇄 및 가변 중쇄의 경우 각각 mV_H.3 및 mV_L.3로 나타내었다. 마찬가지로, 인간 중쇄 및 경쇄 가변 도메인은 본원에서 상응하는 단일클론 항체의 수 다음에 hV_H 및 hV_L로 나타내었다. 3개의 가변 중쇄 CDR 및 3개의 가변 경쇄 CDR를 특정 항-hPG 단일클론 항체의 수 이후에, 각각 V_H CDR 1, 2, 또는 3, 및 V_L CDR 1, 2, 또는 3로 나타내었다. 예를 들면, MAb3의 V_H CDR 1는 V_H CDR 1.3로 표시되어 있고, MAb3의 V_L CDR 1은 V_L CDR 1.3로 표시되어 있다. MAb3의 V_H CDR 2는 V_H CDR 2.3으로 표시되어 있고, MAb3의 V_L CDR 2는 V_L CDR 2.3로 표시되어 있다.

대체로 동일한 에피토프에 결합하는 항-hPG 단일클론 항체의 상응하는 CDR 및/또는 V_H 및 V_L 사슬은 본원에 기술된 방법 및 키트에 유용한 새로운 항-hPG 단일클론 항체를 생산하기 위하여 서로 교환될 수 있을 것으로 예상된다. 예를 들면, 상기 기술한 바와 같이, 예시적인 항-hPG 단일클론 항체 MAb5 및 MAb6는 동일한 에피토프에 결합한다. 항-hPG 단일클론 항체는 그것의 V_L 사슬에서, 상기 2개의 항체의 V_L CDR의 다양한 조합 및/또는 그것의 V_H 사슬에서, 상기 2개의 항체의 V_H CDR의 다양한 조합을 포함한다. 가능한 다양한 조합을 예시하기 위한 특정 비-제한적 예로서, 그러한 항체는 그것의 V_L 사슬에서, MAb5의 CDR 1 및 2 (각각 V_L CDR 1.5 및 V_L CDR 2.5) 및 MAb6의 CDR 3 (V_L CDR 3.6), 및 그것의 V_H 사슬에서, MAb6의 CDR 1 (V_H CDR 1.6) 및 MAb5의 CDR 2 및 3 (각각 V_H CDR 2.5 및 V_H CDR 3.5)를 포함한다.

기탁된 히브리도마에 의해 생성된 항체의 CDR의 아미노산 염기서열은 통상적인 수단을 사용하여 얻어질 수 있다. 예를 들면, 히브리도마 6B5B11C10 및 20D2C3G2에 의해 생성된 항체의 관련 염기서열은 하기와 같이 측정되었다. 요약하면, 전체 RNA를 제조사의 사용지시에 따라 사용된, AMSBio 카다로그 제CS-104B호, RNABee 시약을 사용하여 동결된 세포 펠렛으로부터 단리하였다. V-영역에서 cDNA를 역-전사 폴리머라제 사슬 반응 (RT-PCR)를 사용하여 cDNA 말단의 5' 속력 증폭 (RACE) 이후에, mRNA로부터 제조하였다. cDNA 합성을 불변-영역-특이적 프라이머를 사용하여 수행하고, 그 이후에 제1가닥 생성물을 정제하고 말단 데옥시뉴클레오티드 트랜스퍼라제를 사용하여 cDNA의 3' 말단에 호모폴리머 꼬리를 첨가하였다 첨가하였다. 그 다음 "꼬리" cDNA 염기서열을 프라이머 쌍, 호모폴리머 꼬리에서 각각 및 V_H 또는 V_L 영역에서 하나의 프라이머를 사용하여 PCR으로 증폭하였다. 그 다음 중쇄 및 경쇄 가변 영역 PCR 산물을 "TA" 클로닝 벡터에 클로닝하고 (p-GEM-T easy, Promega cat. no A 1360) 표준 과정을 사용하여 시퀀싱하였다. 도 31 A-B (MAb 3), 도 31 C-D (MAb 4) 참고.

마찬가지로, 히브리도마 1C10D3B9, 2C6C3C7, 1B3B4F1, 및 1E9D9B61에 의해 생산된 항체의 관련 염기서열을 하기와 같이 측정하였다. 전체 RNA를 제조사의 사용지시에 따라 사용된 RNAqueous?-4PCR 키트 (Ambion cat. No. AMI 914)를 사용하여 동결된 세포 펠렛으로부터 단리하였다. 중쇄 V-영역 mRNA를 6개의 축퇴성 프라이머 풀 세트 (HA 내지 HF)를 사용하여 증폭하고, 경쇄 V-영역 mRNA를 8개의 축퇴성 프라이머 풀 세트, 7개의 κ 클러스터 (KA 내지 KG) 및 한 개의 λ 클러스터 (LA)를 사용하여 증복하였다. 가변 영역의 cDNA를 RT-PCR를 사용하여 mRNA로부터 제조하였다. cDNA 합성은 IgGVH, IgκVL 및 IgλVL의 각각의 5' 뮤린 시그날 염기서열을 위한 축퇴성 프라이머 및 3' 불변 영역을 위한 프라이머의 풀을 사용하여 PCR한 이후에, 불변-영역 특이적 프라이머를 사용하여 수행하였다 (Jones et al., 1991, Rapid PCR cloning of full-length mouse immunoglobulin variable regions, Bio/Technology 9:88-89). PCR 산물의 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 그 다음 "TA" 클로닝 벡터에 클로닝하고 (p-GEM-T easy, Promega cat. no A 1360) 표준 과정을 사용하여 시퀀싱하였다. 도 31 E-F (MAb 8), 31G-H (MAb 13), 31I-J (Mab 16), 및 31K-L (Mab 19) 참고.

표 1A와 관련하여, 본원에 기술된 방법 및 키트에서 유용한 N-말단 항-hPG 항체의 특정 구현예는 하기를 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다:

(a) MAbl, MAb2, MAb3, MAb4, MAb 15, MAb 16, MAb 17, MAb 18, MA19 또는 MAb20의 V_L CDR과 염기서열이 동일한 V_L CDR, 및 MAbl, MAb2, MAb3, MAb4, MAbl5, MAbl6, MAbl7, MAbl8, MAb19 또는 MAb20의 V_H CDR과 염기서열이 동일한 VH CDR를 갖는 항체;

(b) MAbl, MAb2, MAb3, MAb4, MAbl5, MAbl6, MAbl7, MAbl8, MAb19 또는 MAb20의 V_L 및 V_H CDR과 염기서열이 동일한 V_L CDR 및 V_H CDR를 갖는 항체;

(c) 항체로서:

(i) V_L CDR1가 QSIVHSNGNTY ("V_L CDR 1.3"; SEQ ID NO:4), QSLVHSSGVTY ("V_L CDR 1.4"; SEQ ID NO: 10), QSLLDSDGKTY ("V_L CDR 1.16"; SEQ ID NO:50), 및 SQHRTYT ("V_L CDR 1.19"; SEQ ID NO:51)로부터 선택되고;

(ii) V_L CDR2가 KVS ("V_L CDR 2.3" 및 ("V_L CDR 2.4"; SEQ ID NO:5), LVS ("V_L CDR 2.16"; SEQ ID NO:53), 및 VKKDGSH ("V_L CDR 2.19"; SEQ ID NO:54)로부터 선택되고;

(iii) V_L CDR3가 FQGSHVPFT ("V_L CDR\ 3.3"; SEQ ID NO:6), SQSTHVPPT ("V_L CDR 3.4"; SEQ ID NO:l1), WQGTHSPYT ("V_L CDR 3.16"; SEQ ID NO:57), 및 GVGDAIKGQSVFV ("V_L CDR 3.19"; SEQ ID NO:58)로부터 선택되고;

(iv) V_H CDRl가 GYIFTSYW ("V_H CDR 1.3"; SEQ ID NO: l), GYTFSSSW ("V_H CDR 1.4"; SEQ ID NO:7), GYTFTSYY ("V_H CDR 1.16"; SEQ ID NO:39), 및 GYSITSDYA ("V_H CDR 1.19"; SEQ ID NO:40)로부터 선택되고;

(v) V_H CDR2가 FYPGNSDS ("V_H CDR 2.3"; SEQ ID NO:2), FLPGSGST ("V_H CDR 2.4"; SEQ ID NO:8), INPSNGGT ("V_H CDR 2.16"; SEQ ID NO:43), 및 ISFSGYT ("V_H CDR 2.19"; SEQ ID NO:44)로부터 선택되고; 그리고

(vi) V_H CDR3가 TRRDSPQY ("V_H CDR 3.3"; SEQ ID NO:3), ATDGNYDWFAY ("V_H CDR 3.4" SEQ ID NO:9), TRGGYYPFDY ("Vv CDR 3.16"; SEQ ID NO:47), 및 AREVNYGDSYHFDY ("V_H CDR 3.19"; SEQ ID NO:48)로부터 선택되는, 항체;

(d) MAb1, MAb2, MAb3, MAb4, MAbl5, MAb16, MAb17, MAbl8, MAb19 또는 MAb20의 V_L의 염기서열에 동일한 V_L 및 MAbl, MAb2, MAb3, MAb4, MAbl5, MAbl6, MAbl7, MAb 18, MAb 19 또는 MAb20의 V_H와 염기서열이 동일한 V_H를 갖는 항체; 및

(e) MAbl, MAb2, MAb3, MAb4, MAb15, MAb16, MAbl7, MAbl8, MAb19 또는 MAb20의 V_L 및 V_H와 염기서열이 동일한 V_L 및 V_H를 갖는 항체.

표 1B와 관련하여, 본원에 기술된 방법 및 키트에서 유용한 C-말단 항-hPG 항체의 특정 구현예는 하기를 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다:

(f) MAb5, MAb6, MAb7, MAb8, MAb9, MAblO, MAbl1, MAb12, MAbl3, MAb14, MAb21, MAb22 또는 MAb23의 V_L CDR와 염기서열이 동일한 V_L CDR 및 MAb5, MAb6, MAb7, MAb8, MAb9, MAblO, MAbl1, MAb12, MAbl3, MAb14, MAb21, MAb22 또는 MAb23의 V_H CDR과 염기서열이 동일한 V_H CDR를 갖는 항체;

(g) MAb5, MAb6, MAb7, MAb8, MAb9, MAblO, MAbl1,MAbl2, MAbl3, MAbl4, MAb21, MAb22 또는 MAb23의 V_L 및 V_H CDR와 염기서열이 동일한 V_L CDR 및 V_H CDR를 갖는 항체;

(h) 항체로서:

(vii) V_L CDR1가 KSLRHTKGITF ("V_L CDR 1.8"; SEQ ID NO:49) 및 QSLLDSDGKTY ("V_L CDR 1.13"; SEQ ID NO:50)로부터 선택되고;

(viii) V_L CDR2가 QMS ("V_L CDR 2.8"; SEQ ID NO: 52) 및 LVS ("V_L CDR 2.13"; SEQ ID NO:53)로부터 선택되고;

(ix) V_L CDR3가 AQNLELPLT ("V_L CDR 3.8"; SEQ ID NO:55) 및 WQGTHFPQT ("V_L CDR 3.13"; SEQ ID NO:56)로부터 선택되고;

(x) V_H CDRl가 GFTFTTYA ("VH CDR 1.8"; SEQ ID NO:37) 및 GFIFSSYG ("V_H CDR 1.13"; SEQ ID NO:38)로부터 선택되고;

(xi) V_H CDR2가 ISSGGTYT ("V_H CDR 2.8"; SEQ ID NO:4 ) 및 INTFGDRT ("V_H CDR 2.13"; SEQ ID NO:42)로부터 선택되고; 그리고

(xii) V_H CDR3가 ATQGNYSLDF ("V_H CDR 3.8"; SEQ ID NO:45) 및 ARGTGTY ("V_H CDR 3.13"; SEQ ID NO:46)로부터 선택되는, 항체;

(i) MAb5, MAb6, MAb7, MAb8, MAb9, MAblO, MAbl1, MAbl2, MAbl3, MAbl4, MAb21, MAb22 또는 MAb23의 V_L와 염기서열이 동일한 V_L 및 MAb5, MAb6, MAb7, MAb8, MAb9, MAblO, MAbl1, MAbl2, MAbl3, MAbl4, MAb21, MAb22 또는 MAb23의 V_H와 염기서열이 동일한 V_H을 갖는 항체; 및

(j) MAb5, MAb6, MAb7, MAb8, MAb9, MAblO, MAbl1, MAbl2, MAbl3, MAbl4, MAb21, MAb22 또는 MAb23의 V_L 및 V_H와 염기서열이 동일한 V_L 및 V_H를 갖는 항체.

당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 진단 방법에서 유용한 항-hPG 항체는 임의의 기원 예를 들면, 포유동물 (예를 들면, 인간, 영장류, 설치류, 염소 또는 토기), 비-포유동물, 또는 (하나 이상의 종 기원으로부터 유래된) 천연의 키메라를 포함할 수 있다. 인간을 포함하는, 동물에서 사용시 치료적 사용에 적합한 항체는 바람직하게는 치료될 의도로 동일한 종으로부터 유래되거나, 비-면역원성으로 또는 치료된 동물 내에서의 감소된 면역원성을 갖는 것으로 변경되거나 설계된다. 인간에서의 치료적 사용에 유용한 항-hPG 항체의 특정 분류는 인간화된 항체 분류로서, 이는 하기에서 더 상세히 논의하도록 한다. 본원에서 기술된 방법 및 키트에서 유용한 항-hPG 항체는 또한 예를 들면, IgA (예를 들면, IgAl 또는 IgA2), IgD, IgE, IgG (예를 들면, IgGl, IgG2, IgG3 또는 IgG4) 또는 IgM를 포함하는, 임의의 동종형을 갖고 있거나 상기로부터 유도된 것일 수 있다. 치료적 사용을 위해 설계된 항-hPG 항체는 IgG 동종형을 갖는 것이 바람직하다.

일부 구현예에서, 본원에 기술된 치료 방법에 유용한 항-hPG 항체는 인간화된다. 일반적으로, 인간화된 항체는 실질적으로 적어도 하나의, 및 전형적으로 2개의 가변 도메인을 포함하는바, 모든 또는 실직적으로 모든 CDR 영역는 비-인간 면역글로불린의 것과 동일하고 모든 또는 실직적으로 모든 프레임워크 영역은 인간 면역글로불린 컨세서스 염기서열이고, 그리고 "CDR-그래프트"로 언급될 수 있다. 상기 인간화된 항체는 적어도 면역글로불린 불변 영역 (Fc)이 부분, 전형적으로 인간 면역글로불린 컨세서스 염기서열을 갖는 것을 포함할 수 있다. 인간화된 항체를 설계하기 위한 방법을 포함하는, 항체의 인간화 방법은 당해 기술분야에서 잘 알려져 있다. 예를 들면, 문헌 [Lefranc et al, 2003, Dev. Comp. Immunol. 27:55-77; Lefranc et al, 2009, Nucl. Acids Res. 37:D1006-1012; Lefranc, 2008, Mol. Biotechnol. 40: 101 -1 1 1 ; Riechmann et al, 1988, Nature 332:323-7; U.S. Patent Nos. 5,530,101, 5,585,089, 5,693,761, 5,693,762 및 6,180,370 to Queen et al ; EP239400; PCT publication WO 91/09967; U.S. Patent No. 5,225,539; EP592106; EP519596; Padlan, 1991, Mol. Immunol. 28:489-498; Studnicka et al, 1994, Prot. Eng. 7:805-814; Roguska et al, 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. 91 :969-973; 및 U.S. Patent No. 5,565,332] 참고. 상기의 개시내용은 전체로서 본원에 참조로 통합된다.

예로서 표 1A에 제공된 다양한 N-말단 항-hPG 단일클론 항체 및 표 1B에 제공된 다양한 C-말단 항-hPG 단일클론 항체를 포함하지만 제한적이지 않는, 비-인간 항-hPG 항체의 CDR와 동일한 CDR 염기서열을 갖는 항체의 인간화된 버전은 공지된 방법을 사용하여 얻어질 수 있다. 선택된 항-hPG 항체의 인간화된 V_L 및 V_H 사슬에서 계획된 염기서열을 1A 및 1B에 제공하였다. 인간화된 항체의 특정 예를 하기를 포함하는 항체를 포함한다:

(k) 본원에 개시된 임의의 3개의 V_L CDR 및 임의의 3개의 V_H CDR;

(1) SEQ ID NO:21에 해당하는 아미노산 염기서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO:22에 해당하는 아미노산 염기서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;

(m) SEQ ID NO:23에 해당하는 아미노산 염기서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO:24에 해당하는 아미노산 염기서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;

(n) SEQ ID NO:75, 77, 및 79로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 염기서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO:76 및 78로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 염기서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;

(o) SEQ ID NO: 80 및 82로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 염기서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO:81 및 83로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 염기서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;

(p) SEQ ID NO:84, 86, 및 88로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 염기서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO:85, 87, 및 89로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 염기서열을 포함하는 경쇄 가변 영역; 및

(q) SEQ ID NO:90, 92, 및 94로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 염기서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO:91, 93, 및 95로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 염기서열을 포함하는 경쇄 가변 영역.

당업자가 인식하고 있는 바와 같이, 관심의 특정 에피토프에 결합하는 능력과 같은 특정 결합 특성을 갖는 항-hPG 항체는 본원에 기술된 다양한 항원 및 면역원을 사용하여 관심의 참조 항체로 hPG를 결합하기 위해 경쟁하는 그들의 능력을 평가함으로써 쉽게 얻어질 수 있다. 본원에 기술된 임의의 항-hPG 항체는 그러한 경쟁 검정법에서 참조 항체로 유용할 수 있다. 관심의 비오틴화된 참조 항-hPG 항체로 hPG를 결합하기 위해 경쟁하는 항체의 능력을 평가하기에 유용한 특정 검정법을 실시예 4에서 제공하였다.

참조 항-hPG 항체 및 임의의 실험 항체 (종 또는 동종형과 관계 없음) 사이의 항체 경쟁 연구를 수행함에 있어서, 하나는 우선 후속의 확인을 가능하게 하기 위하여, 예를 들면, 방사성 동위원소 또는 형광 물질과 같이 직접적으로, 또는 예를 들면 비오틴 (형광-표지된 스트렙타비딘과 결합함으로써 검출가능함) 또는 효소 (효소 반응을 통해 검출가능함)와 같은 비간접적으로 검출가능한 표지와 관련하여 표지될 수도 있다. 이러한 경우, 표지된 참조 항-hPG 항체 (고정되거나 증가된 농도 내에서)는 hPG:표지된 항-hPG 항체 복합체를 형성하는, hPG의 공지의 양과 인큐베이션된다. 비표지된 실험 항체는 그 다음에 상기 복합체에 첨가된다. 복합된 표지의 강도를 측정한다. 실험 항체가 중복 에피토프에 결합함으로써 hPG에서 표지된 참조 항-hPG 항체와 경쟁하는 경우, 복합된 표지의 강도는 실험 항체의 부재시 수행되는 대조군 실험에 비해 감소할 것이다.

결합 경쟁 검정법을 수행하기 위한 다수의 방법이 공지되어 있는바, 상기 기술된 검정법 및 실시예 24에서와 동일한 결과를 생산하는 것이 적합할 수 있다.

항체는 참조 항-hPG 항체로 hPG에 결합하기 위하여 경쟁하는 것으로 고려되므로, 경쟁적 결합 검정법, 구체적으로 실시예 24의 경쟁적 결합 검정법에서 hPG로의 참조 항-hPG 항체의 결합이 비록 더 높은 수준의 검출 예를 들면, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 심지어 100%가 바람직할 수도 있으나, 0.01-100 μg/mL (예를 들면, 0.01 μg/mL, 0.08 μg/mL, 0.4 μg/mL, 2 μg/mL, 10 μg/mL, 50 μg/mL 또는 100 μg/mL 또는 상기 언급된 범위 내의 다른 농도)의 범위 내의 실험 항체 농도에서, 적어도 50 % 까지 감소하는 경우, 참조 항-hPG 항체와 동일하거나 상기의 hPG의 중복 에피토프에 대체로 결합할 것으로 고려된다.

본 발명의 항체는 또한 유도화되거나 공유 결합되거나 다른 분자에 결합됨으로써 그들의 특성을 변화시키거나 그들의 기능을 개선시킬 수 있다. 예를 들면, 유도화된 항체는 예를 들면, 글리코실화, 푸코실화, 아세틸화, 페길화, 인산화, 아미드화, 포르밀화, 공지된 보호 차단기 의한 유도체화, 세포 리간드 또는 다른 단백질에의 결합에 의해 변형되는 항체를 포함하나, 상기 방법으로 제한되는 것은 아니다. 선택적으로, 가변 또는 불변 영역 내의 특정 아미노산은 기능이 변경되거나 개선될 수 있도록 바뀌어 질 수 있다. 일 비-제한적 예에서, 항체의 Fc 영역 내의 아미노산 잔기는 FcRn로의 그것의 결합을 증가시킴으로써 항체의 혈청 반감기가 증가될 수 있도록 바뀌어질 수도 있다.

항-hPG 단일클론 항체는 검출가능한 모이어티로 표지된 항체를 포함한다. 그러한 표지는 본 발명의 항-hPG 단일클론 항체에 직접적으로 또는 간접적으로 결합될 수 있다. 상기 표지는 그 자체로 검출가능하거나 (예를 들면, 방사성 동위원소 표지, 동위원소 표지, 또는 형광 표지), 효소 표지의 경우에는, 기재 조성물 및 검출가능한 조성물의 화학적 변경을 촉진시킬 수 있다. 검출가능한 물질의 예로는 다양한 효소, 보결분자기, 형광 물질, 발광 물질, 생물형광 물질, 방사선 물질, 다양한 양전자 방출 촬영을 사용하는 양전자 방출 금속, 및 비방사선 상자성 금속 이온을 포함한다.

비록 본원에 기술된 방법 및 키트에서 유용한 다양한 항-hPG 항체가 전장 항체로 예시되어 있지만, 당업자들은 결합 단편, 또는 전장 항체 또는 결합 단편으로부터 설계되거나 유도되는 대용물도 사용될 수도 있음을 이해할 것이다. 적합한 항체, 대용물 등은 Fab', F(ab')₂, Fab, Fv, vlgG, scFv 단편 및 서로바디, rlgG, 디설피드-안정화된 Fv 항체 (dsFv), 디아보디, 트리아바디, 및 카멜화항체 또는 나노바디와 같은 단일 도메인 항체를 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 항체는 당해 기술분에에서 통상의 지식을 가진 자에게 알려진 임의의 방법에 따라 제조될 수 있다. 일 비-제한적 예에서, 항체는 인간, 원숭이, 닭, 염소, 토끼, 및 설치류 (예를 들면, 래트, 마우스 및 햄스터)로부터 유도된 항체와 같은, 항체를 제조할 수 있는 임의의 종으로부터 포함하는, 천연 원료로부터 얻어질 수도 있다. 다른 종들도 또한 가능하다. 항체는 또한 효모 세포, 박테리아 세포, 및 CHO 세포와 같은, 배양시 포유동물 세포에서의 재조합 항체의 발현과 같은 유전자 가공 또는 재조합 DNA 기술을 사용하는 시스템으로부터 생성되어 단리될 수도 있다. 항체는 또는 전체적으로 또는 부분적으로 합성될 수도 있다.

본 발명의 단일클론 항체 (MAb)는 히브리도마 기술을 통해 생성된 항체로 제한되는 것은 아니다. 단일클론 항체는 당해 기술분야에서 이용가능하거나 알려진 방법으로, 임의의 진핵, 원핵 또는 파지 클론을 포함하는, 단일 클론으로부터 유래된다. 단일클론 항체는 히브리도마, 재조합, 및 파지 디스플레이 기술, 또는 그것의 조합의 사용을 포함하는 당해 기술분야에서 알려진 다양한 방법을 사용하여 제조될 수 있다.

전이성 직장암의 통상적 치료

전이성 직장암은 생물학적 요법, 표적화된 요법, 항체 요법, 방사선 요법, 화학 요법, 수술, 동결 수술, 또는 이들을 조합하여 치료될 수도 있다. 전이성 직장암의 다른 치료도 가능하다 .

생물학적 요법은 암과 싸우는 면역 시스템의 능력을 증가시키거나 회복시키는 치료방법이다. 생물학적 요법에서 사용되는 작용제는 인터페론, 인터루킨, 직장-자극 인자, 단일클론 항체, 백신, 유전자 요법, 및 비특이적 면역유도제와 같은 생물학적 반응 변경제를 포함한다. 상기 작용제 중 일부는 또한 직접적인 항종양 효과를 가질 수도 있다. 표적화된 암 치료는 종앙 성장 및 진행과 관련된 특정 분자를 방해함으로써 암의 성장 및 전이를 차단하는 약물 또는 다른 물질이다.

항체 요법은 전이성 직장암 세포의 성장을 직접적으로 또는 간접적으로 죽이거나, 상기를 천천히 하게 하거나 중단시키는, 단일클론 항체를 포함하는 항체의 투여를 포함하나, 상기에 제한되는 것은 아니다. 그러한 항체는 다양한 별개의 메카니즘을 통해 작용될 수 있다. 예를 들면, 특정 항체는 항체-의존성 세포-매개 세포톡성 (ADCC) 또는 다른 메카니즘을 통해 환자의 면역 시스템에 의한 공격에 암 세포를 표시할 수 있다. 다른 항체는 암세포의 생존 또는 성장에 요구되는 항원에 결합하여 상기의 기능을 바꾸거나 억제시킨다. 다수의 항체는, 성장 인자 VEGF에 결합하는, 예를 들면 베바시주맵 (Avastin?)를 포함하여, 이와 같이 작용하는 것으로 알려져 있다. 다른 메카니즘이 또한 가능하고, 특히 항체는 일 이상의 작용 메카니즘을 통해 작용할 수도 있다. 다른 항체는 방사선 또는 화학독성 모이어티에 결합될 수 있고 항체에 의해 특이적으로 인식되는 항원을 선택적으로 발현하는 암 세포에 그들을 표적화할 수 있다. 베바시주맵, 세투시맵 및 파니투무맵가 특히 전이성 직장암의 치료에 유용한 항체의 특정 예이다.

방사선 요법은 x-선, 감마선, 중성자, 및 다른 원으로부터의 고-에너지 방사선을 사용함으로써, 다른 암 세포를 죽이고 종양 감소시킨다. 방사선은 신체의 외부에 있는 기구로부터 올 수도 있고 (외부-빔 방사선 요법), 또는 암 세포 근처의 신체 내에 위치한 방사선 물질로부터 올 수도 있다 (내부 방사선 요법, 또는 근접 요법). 전신적 방사선 요법은 혈액에서 전신 전체의 조직으로 이동하는, 방사선 표지된 단일클론 항체와 같은 방사선 물질을 사용한다. 방사선 요법은 또한 조사 및 방사선 요법으로도 불릴 수도 있다. 다른 방사선 요법은 3-차원 형상 방사선 요법 (3D-CRT) 및 세기 변조된 방사선 요법 (IMRT)을 포함한다. 다른 방사선 요법이 또한 가능하다.

화학요법은 암 세포를 죽이거나 (세포독성 또는 세포 자멸) 암 세포의 성장 (세포증식 억제)을 억제하는 소기관 분자 약물을 사용하는 것이다. 다양한 메카니즘을 통한 그들의 항-종양 효과를 매개하는, 많은 화학요법제가 전이성 직장암의 치료에 이용가능한다.

예시적인 화학요법제는 하기를 포함한다: 메토트렉사이드 및 페네트렉사이드를 포함하는 포레이트 길항제; 글라디리빈, 클로파라빈, 플루다라빈, 6-머캅토퓨린, 네라라빈, 펜토스타틴을 포함하는 퓨린 길항제; 카페시타빈, 시타라빈, 5-플루오로우라신, 젬시타빈, 하이드록시우레아를 포함하는 피리미딘 길장체; 니트로수레아즈, 카르무스틴, 로무스틴을 포함하는 DNA 알킬화제; 벤다무스틴, 클로라부실, 시클로포스파미드, 이포스파미드, 메클로레타민 (질소 무스타드), 멜파란, 아카르바진, 테모조로미드, 파로마바진을 포함하는, DNA 가교제 및 알킬화제; 아스파라지나게; 미토마이신을 포함하는 항생제; 카보플라틴, 시스플라틴, 옥살리플라틴을 포함하는 백금 착제; 보테조미브를 포함하는, 프로테오좀 억제제; 탁산 (예를 들면, 오세탁셀, 파크리탁셀) 및 빈카스 (예를 들면, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 비노레프빈)과 같은, 스핀들 포이존; 안트라시클린 (예를 들면, 다우노루비신, 다우노마이신, 독소루비신, 에피루비신)과 같은 토포이소머라제, 캄프토테신 (예를 들면, 이리노테칸 및 토포테칸), 포도필포톡신 (예를 들면, 에토포시드, 테니포시드 및 미토산트론)을 포함한다. 다른 화학요법제도 또한 가능하다.

전이성 직장암은 화학요법제를 서로 및/또는 항체와 조합하여 사용함으로써 치료된다. 그러한 조합의 예는 루코보린 (포린산 또는 LV)과 조합된 5-플루오로우라실 (5FU); 우라실과 조합된 티카푸르 (UFT) 및 루코보린; 5FU와 조합되거나, 카페시타빈과 추가로 조합된 옥살리플라틴; 카페시타빈과 조합된 이리노테칸; 5FU, 이리노테칸 또는 카페시타빈과 조합된 미토마이신 C; 단독이거나, 베바시주맵 또는 세투시맵과 조합된 FOLFOX (루코보린 (포린산), 5-FU, 및 올살리플라틴); 단독이거나 베바시주맵 또는 세투시맵와 조합된 FOLFIRI (루코보린, 5-FU, 및 이리노테칸); 단독이거나, 베바시주맵 또는 세투시맵와 조합된 CapeOX (카페시타빈 및 옥살리플라틴); 베바시주맵와 조합된, 5-FU 및 루코보린; 베바시주맵와 조합된 카페시타빈; FOLFOXIRI (루코보린, 5-FU, 옥살리플라틴, 및 이리노테칸); 세투시맵와 조합된 이리노테칸을 포함한다. 다른 조합 치료제로는 5FU Mayo, 5FU Roswell Park, LVFU2, FOLFOX4, FOLFOX6, bFOL, FUFOX, IFL, XELOX, XELIRI, 및 CAPIRI를 포함하는바, 상기는 참조로서 통합되는, 문헌 [Chau, I., and Cunningham, D., Br. J. cancer 100 (2009) 1704-19; and Field, K. and Lipton, L., World J. Gastroenterol. 13 (2007) 3806-15]에 상세히 개시되어 있다. 다른 화학요법제와 다른 치료제의 조합도 가능하다.

항-PG 항체를 사용한 치료 방법

본 발명은 전이성 직장암을 치료하고 예방하고, 직장암의 재발을 예방하고 직장암 줄기 세포의 성장을 예방하는 목적을 위해 피검체에 조성물로서 항-PG 항체를 투여하는 것을 포함하는 치료 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 상기 항체는 인간 프로가스트린 ("hPG") 에 특이적이고, 다른 구현예에서 상기 항체는 단일클론 항체이다.

특정 이러한 구현예에 따르면, 본원에 개시된 항-PG 항체는 단일 요법으로서 또는 조합 요법으로서 조성물 내에서 치료적 유효량으로 전이성 직장암의 치료가 요구되는 피검체에 투여된다. 그러한 피검체는 전이성 직장암으로 진단받은 자를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 이러한 방법의 특정 구현예에서, 상기 항체는 항-hPG 단일클론 항체이다.

다른 구현예에 따르면, 본원에 개시된 항-PG 항체는 단일 요법으로서 또는 조합 요법으로서 치료적 유효량으로 조상물 내에서 전이성 직장암의 예방이 요구되는 피검체에 투여된다. 그러한 피검체는 초기 직장암을 갖고 있지만 암이 원거리 조직 또는 기관으로 퍼진 것으로 알려지지 않은 것으로 판단된 자들을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이러한 방법의 특정 구현예에서, 상기 항체는 항-hPG 단일클론 항체이다.

다른 구현예에 따르면, 본원에 개시된 항-PG 항체는 단일 요법으로서 또는 조합 요법으로서 치료적 유효량으로 조성물 내에서 전이성 직장암의 재발의 예방이 요구되는 환자에게 투여된다. 그러한 환자는 그러한 암이 명백히 사라진 이후에, 초기 또는 전이성 직장암을 미리 치료받은 자들을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이러한 방법의 특정 구현예에서, 상기 항체는 항-hPG 단일클론 항체를 포함한다.

다른 구현예에서, 본원에 기술된 항-PG 항체는 단일 요법으로서 또는 조합 요법으로서 치료적 유효량으로 조성물 내에서 직장암 줄기 세포의 성장의 억제가 요구되는 피검체에게 투여된다. 그러한 피검체는 그 내부에 암 줄기 세포의 존재에 적어도 부분적으로 공헌하는 성장 직장암의 성장 또는 전이를 갖는 자들을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 다른 구현예는 그러한 세포의 성장을 예방하거나 억제하기에 유효한 항-PG 항체 조성물의 양으로 그러한 줄기 세포를 접촉시킴으로써 직장암 줄기 세포의 성장을 예방하거나 억제하기 위한 방법을 제공한다. 그러한 방법은 인비트로 또는 인비보에서 수행될 수 있다. 이러한 방법의 특정 구현예에서, 상기 항체는 항-hPG 단일클론 항체이다.

항-PG 항체를 중화하는 것은 비-중화 항-PG 항체가 그들의 존재가 중화 항체의 치료 효능을 실질적으로 억제하지 않는 경우 존재할 수도 있지만 치료적 항체 조성물 내의 초기 활성제일 것이다.

항-PG 항체 조성물이 투여될 수 있는 피검체는 비-영장류 (예를 들면, 소, 돼지, 말, 고양이, 개, 래트 등)과 같은 포유동물 또는 영장류 (예를 들면, 원숭이, 침팬지, 유인원 또는 인간)일 수도 있다. 상기 피검체는 성인 환자 또는 소아 환자와 같은, 인간일 수 있다.

전이성 직장암을 치료하거나 예방하거나, 직장암 재발을 예방하는 목적의 경우, 항-PG 항체 조성물은 단일요법으로서 단독으로 전이성 직장암을 치료하거나 예방하고 직장암 재발을 예방하기에 유효한 일 이상의 초기 치료제에 부가물로서 피검체에 투여될 수 있다.

따라서, 본 발명의 특정 구현예에서, 항-hPG 항체 조성물은 화학요법에 대한 부가물로서, 방사선 요법에 대한 부가물로서, 생물학적 요법에 대한 부가물로서, 수술 요법에 대한 부가물로서, 전이성 직장암을 치료하거나 예방하기에 유효한 그 밖의 항체 요법에 대한 부가물로서 전이성 직장암의 치료나 예방이 요구되는 피검체에 투여될 수 있다. 다른 구현예에서, 항-hPG 항체 조성물은 직장암의 재발의 예방이 요구되는 피검체에 그러한 예방을 예방하기에 유효한 다른 치료제의 부가물로서 투여될 수 있다.

부가적 요법으로서, 항-hPG 항체 조성물은 초기 요법과 동시에, 연속적으로 또는 분리되어 투여될 수 있다.

항-hPG 항체 조성물 및 초기 요법은 동일한 시간에서 투여될 때 심지어 각각의 투여가 겹치지만, 다른 기간에 시작하거나 끝나더라도, 동시에 투여된다. 동시 투여의 비-제한적 예는 피검체가 전이성 직장암에 대한 화학요법을 받고 있거나 초기 직장 종양에 대해 수술 절제를 겪을 때 같은 시간에 항-hPG 항체 조성물을 투여하는 것이다.

항-hPG 항체 조성물 및 초기 요법은 같은 날, 예를 들면, 동일한 진료소 방문 동안, 피검체에 투여될 때, 동시적으로가 아닌, 연속적으로 투여된다. 연속적 투여는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 그 이상의 시간 간격으로 발생할 수 있다. 초기 요법의 투여가 우선 이루어지고, 그 이후에 항-hPG 항체 조성물의 투여가 수행될 수도 있다. 대체적인 구현예에서, 상기 항-hPG 항체 조성물이 우선 투여되고, 그 다음 초기 요법이 이루어질 수도 있다.

항-hPG 항체 조성물 및 초기 요법은 다른 날 피검체에게 투여될 때 별개로 투여된다. 특정 구현예에서, 상기 항-hPG 항체 조성물 및 초기 요법은 1-일, 2-일, 3-일, 4-일, 5-일, 6-일, 1-주, 2-주, 3-주, 또는 1달 또는 그 이상의 간격으로 투여될 수 있다. 연속적 투여와 함께, 항-hPG 항체 조성물의 투여가 진행되거나 초기 요법의 분리적 투여 이후에 진행될 수 있다.

본 발명의 특정 다른 구현예에서, 항-hPG 항체 조성물 및 초기 요법은 연속적이거나 분리적으로 투여될 때, 교대의 패턴으로 반복적으로 투여될 수 있다.

특정 구현예에서, 초기 요법에 대한 부가물로서 항-hPG 항체 조성물를 투여하는 것은 요법이 받아들일 수 없는 부작용의 발생과 관계없이 치료적으로 유효한 양으로 단독으로 투여되지 않는 경우 치료적 이점을 제공하는 부가적 효과 이상 또는 상승적 효과를 생산할 수도 있다. 이러한 상황 하에서, 항-hPG 항체 조성물 및/또는 초기 요법은 소량으로 투여됨으로써 가능하거나 심각한 부작용을 감소시킬 수 있다. 그러나, 상승 효과는 치료적으로 유효한 항-hPG 항체 조성물로 부가적 요법이 요구되지 않는다.

7.7. 전이성 직장암 치료의 효능 관찰 방법

상기 기술한 바와 같이, 초기 및/또는 전이성 직장암을 갖는 환자는 PG의 혈장 및/또는 혈청 수준이 증가하는 반면, 건강한 개체 내의 PG의 기저 수준은 거의 없다. 초기 및/또는 전이성 직장암을 갖는 피검체 내의 PG 혈장 및/또는 혈청 수준은 측정가능한 것으로, 약 25 pM 또는 그 이상이다. 상기 발견을 기초로, PG의 혈장 및/또는 혈청 수준은, 그 중에서도, 초기 또는 전이성 직장암의 치료 효과를 관찰하고, 초기 또는 전이성 직장암의 존재를 발견하여 진단하고, 그리고 항-PG 항체로의 치료로부터의 이점을 갖는 피검체를 선별하기 위하여 사용될 수 있다.

따라서, 본 발명은 전이성 직장암의 요법의 이전 라운드의 효능을 측정하기 위하여 결정 전이성 암이 치료된 피검체의 관찰 방법을 제공한다. 이러한 방법은 전이성 직장암에 대해 임의의 유형의 요법을, 단독으로 또는 다른 것과 조합하여 사용될 수 있는바, 예를 들면 항-hPG 항체 조성물의 투여, 그 밖에 항체 요법, 화학요법, 방사선 요법, 생물학적 요법 등을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 요법 라운드가 완료된 이후에, 피검체의 치료에 책임이 있는 치료팀이 치료의 새로운 라운드의 투여하거나 다른 임상 결정을 하야 하는지 여부를 결정하기 위하여 그것이 유효한 경우 규명하는 것이 필요하다.

관찰 방법의 일부 구현예에서, 혈액, 혈장, 혈청 등과 같은 일 이상의 체액 내의 PG의 농도는 전이성 직장암의 치료가 시작하기 전에 측정됨으로써 치료가 완료된 이후의 일정 시간 동일한 체액 내에서 측정된 PG의 수준과 비교될 수 있다. 다른 구현예에서, 직장암 생검과 같은 관심의 조직 내의 PG 수준이 측정된다.

PG 농도의 감소는 효능을 가짐을 표시한다. 전형적으로, PG 치료 후-치료에서의 감소의 범위가 증가할수록, 더 효능적인 요법이다. 특정 이론에 구애됨이 없이, 효능성 치료의 결과로서 환자 내의 전이의 수 및/또는 크기가 감소될 수록, 전이에 의해 생성된 PG의 총양도 감소되는 것으로 알려져 있다. 반면, 치료가 완료된 이후의 PG 수준에서의 감소의 결핍 또는 증가는 상기 요법이 효능이 없음을 표시할 수도 있다. 이러한 정보를 바탕으로, 치료팀은 요법의 새로운 라운드를 개시할 지 여부를 결정할 수 있다.

요법 라운드가 시간 시료들이 모니터링을 위해 수거되기 전에 완료된 이후의 적합한 간격은 당해 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에 의해 용이하게 측정되고 피검체의 성별 및 나이를 고려하여 요법의 종류에 따라 달라진다. 예시적인 간격은 시료가 본 발명의 관찰 방법에서 사용되기 위해 수거되기 전에 요법 라운드가 완료된 이후에 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 11 주 및 3, 4, 5 또는 6 개월이다. 다른 간격도 가능하다. 일 구현예에서, 요법의 완료 이후의 다른 간격에서 다수의 측정이 수행되고 그래프화되어 동향이 존재하는지 여부가 측정될 수도 있다. 비-제한적인 예에서, PG 수준은 요법 라운드가 종료된 이후에 처음 6개월 동안 매주 또는 매달 측정될 수 있다. 다른 간격도 가능하다.

체액 내에서의 PG 농도 수준은 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 알려진 분석 기술을 사용하여 측정될 수 있는바, 예를 들면 RIA 및 ELISA를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. hPG에 특이적인 항체에 의존하는, 분석 방법은 당해 기술분야에서 통상의 지식에 따라, 본원에 개시된, 비-중화 또는 중화 항체를 사용하여 수행될 수 있다.

특정 구현예에서, PG 수준은 프로가스트린의 N-말단을 표적화하는 제1의 항-PG 항체 및 프로가스트린의 C-말단을 표적화하는 제2의 항-PG 항체로 샌드위치 ELISA를 사용하여 측정될 수도 있다. 그러한 샌드위치 검정법에 유용한 예시적인 N- 및 C-말단 항-PG 항체를 하기의 절에다가 기술하였다. 그러한 검정법에서, 96-웰 플레이트 내의 웰과 같은, 표면은 제1의 "포획" N-말단 또는 C-말단 항-PG 항체의 공지된 양을 결합시킴으로써 제조된다. 실험 시료는 인큐베이션 기간 이후에 그 다음 표면에 적용된다. 그 다음 상기 표면은 세정됨으로써 비결합 항원이 제거되고 제2의, "검출" 항-PG 항체를 함유하는 용액이 검출 항체가 PG의 다른 에피토프에 결합하는 경우에 적용된다 (예를 들면, 포획 항체가 C-말단 항-PG 항체인 경우, N-말단 항-PG 항체가 검출 항체로 사용되고, 그 반대의 경우도 마찬가지이다). 그 다음 PG 수준은 직접적으로 (예를 들면, 검출 항체가 검출가능한 표지에 컨쥬게이트된 경우) 또는 간접적으로 (검출 항-PG 항체에 결합하는 표지된 제2항체를 통해) 측정된다. 혈장 및/또는 혈청 PG 수준을 측정하기 위한 구체적인 샌드위치 검정법을 실시예 20에 나타내었다.

본 발명의 방법의 대체적인 구현예에서, 관심의 체액 내의 PG 수준의 감소에 미치는 피검체에 항-hPG 항체 조성물의 투여의 효능이 관찰될 수도 있다. 이러한 방법에서, 시료는 시간 경과 후 수거되어 PG 농도가 그래프화됨으로써 경향이 평가될 수도 있다. 잔류 항-hPG 항체가 존재하는 경우, 상기 데이터는 항체에 의한 PG의 분리로 인해 PG 수준에서의 감소가 나타나고, 그로 인해 이 효과가 약해지기 때문에 증가되고 치료가 전이성 직장암의 치료에 유효한 경우 그 다음에는 감소된다.

본 출원의 방법의 다른 구현예에 따르면, 약 50 pM, 40 pM, 30 pM, 20 pM, 10 pM, 5 pM, 2 pM, 1 pM 또는 그 미만의 미리결정된 역치 이하의 혈액, 혈청 또는 혈장 PG 농도는 전이성 직장암에 효능이 있음을 표시한다. 다른 PG 농도 역치 효능의 표시도 가능하고 당해 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에 의해 쉽게 측정된다.

7.8. 직장암의 존부 측정 방법

본 발명은 또한, 초기 또는 전이성 직장암 또는 치료 이후의 직장암 재발의 존재를 측정하기 위한 목적으로, 피검체가 적정한 기준선과 비교하여, 혈액, 혈장, 혈청 등과 같은, 체액 내의 증가된 PG 수준을 가지는지 여부가 측정될 수 있도록 실험될 수도 있는 방법에 따른 측정 구현예를 제공한다.

본 발명의 방법의 특정 구현예에서, 피검체는 직장암, 초기 또는 전이성이 피검체 내에 존재하는지 여부를 측정하기에 적합한 자 일 수도 있다. 그러한 피검체에서, 기준선에 비해 증가된 PG 수준은 직장암이 존재함을 표시한다. 특정 이론에 구애됨이 없이, 피검체 내의 직장암의 크기 및/또는 범위가 증가함에 따가, 전신적 및/또는 국소화된 PG 수준도 또한 피검체 내에서 증가하는 것으로 알려져 있다.

다른 구현예에서, 상기 피검체는 직장암이 원거리 조직 또는 기관까지 전이되었는지 여부를 측정하기에 바람직한 자의 초기 직장암이 사전이 치료된 자 일 수도 있다. 그러한 피검체에서, 기준선에 비해 증가된 PG 수준은 전이성 직장암이 존재함을 표시한다. 그러한 피검체의 경우도, 본 발명의 방법은 그 중에서도 전이성 직장암을 예방하기 위해 의도된 치료가 유효한지 여부를 측정하기에, 유효하다. 특정 이론에 구애됨이 없이, 피검체 내의 전이의 수 및/또는 크기가 증가함에 따라, 전신적 및/또는 국소화된 PG 수준도 피검체 내에서 증가하는 것으로 알려져 있다.

다른 구현예에 따르면, 상기 피검체는 암이 명백하게 사라지고 직장암이 재발하거나 다시 생성되었는지 여부를 측정하기에 바람직한 자 내의 직장암, 초기 또는 전이성이 사전에 치료된 자 일 수도 있다. 그러한 피검체에서, 기준선에 비해 증가된 PG 수준은 직장암이 재발하였음을 나타낸다. 특정 이론에 구애됨이 없이, 피검체 내의 재발 직장암의 크기 및/또는 범위가 증가함에 따라, 전신적 및/또는 국소화된 PG 수준도 피검체 내에서 증가하는 것으로 알려져 있다.

전이성 직장암이 PG를 분비하고 PG-민감성인 것으로 본원에 기술된 발견을 고려하면, 본 발명은 또한 항-PG 항체를 측정함으로써 요법으로부터 이점을 가진 피검체를 선별하는 방법을 제공한다. 따라서, 피검체는 그들이 기준선에 비해 증가된 혈장 및/또는 혈청 PG 수준을 가졌는지 여부를 측정하기 위하여 의료 제공자에 의해 스크리닝될 수도 있다. 그러한 피검체가 확인되면, 의료 제공자는 추가적인 실험을 주문함으로써 피검체 내의 전이성 직장암의 존재를 확인할 수 있다. 전이성 직장암이 확인되면, 그 다음 항-hPG 항체의 투여를 포함하는, 치료가 시작될 수 있다.

피검체를 선별하는 방법의 특정 구현예에서, 스크리닝은 피검체의 초기 의사에 의한 정기 검진의 일부로서 또는 피검체의 더 큰 집단을 표적화하는 공중 위생 구상의 일부로서 수행될 수도 있다. 다른 구현예에서, 스크리닝될 피검체는 진행성 전이성 직장암의 평균 위험 보다 높은 특정 소집단의 구성원이다. 그러한 그룹은 직장암을 갖는 친족들 (부모, 형제, 자매 또는 아이들)을 갖는 피검체, 직장 용종의 역사를 갖는 피검체, 또는 비만인 피검체, 흡연하는 피검체 및 물리적으로 반응하지 않는 피검체를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 피검체는 궤양성 대장염, 크론병, 또는 가족성 선종성 용종증 (familial adenomatous polyposis, FAP)을 진단받은 자, 또는 HNPCC 유전자 내의 돌연변이, APC 유전자 내의 돌연변이, 또는 직장암의 위험을 증가시키는데 관여하는 다른 유전자를 갖는 자이다. 다른 그룹은 직장암을 이전에 진단받고 성공적으로 치료받은 피검체를 포함한다.

PG 농도는 당업자들에게 알려진 기술을 사용하여 측정될 수 있는바, 이는 RIA 및 ELISA를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. hPG에 특이적인 항체에 의존하는, 상기와 같은, 검정 방법은 당해 기술분야에서 통상의 지식에 따라, 본원에 기술된 바와 같이, 비-중화 또는 중화 항체를 사용하여 수행될 수 있다.

본 발명의 방법을 사용하여 증가된 PG 수준의 측정을 기초로, 치료 팀은 그 다음 직장암의 존재 또는 치료 이후의 직장암의 재발을 확인하거나 피검체에 대한 치료를 바로 진행하기 위하여 부가적인 실험을 수행할지 여부를 결정할 수 있다.

다른 기준선은 피검체 내에서 측정된 PG 수준을 비교한 것에 대하여 사용될 수도 있다. 본 발명의 방법의 일부 구현예에서, 상기 기준선은 이전 시간에 동일한 피검체로부터 샘플링한 관심의 체액 내의 PG 수준을 측정함으로써 설정될 수 있다. 그러한 시료는 수거되어 미리결정된 간격으로 PG 수준이 측정될 수도 있다. 비-제한적인 예에서, PG 수준은 치료가 끝난 이후에 처음 6달 동안 매주 또는 매달, 치료가 끝난지 2년이 될 때까지 3개월에 한번, 그리고 그 이후로는 6개월 또는 1년에 한번씩 측정된다. 다른 미리결정된 간격도 가능하다.

본 개시내용의 방법의 다른 구현예에서, 상기 기준선은 직장암의 전이 또는 재발의 측정을 위해 샘플링을 겪은 피검체의 것들과 유사한 특징을 갖는 개체의 집단 내의 평균 PG 수준으로부터 설정될 수 있다. 그러한 특징은 특정 치료에 노출되기 이전에, 성별, 나이, 초기 직장 종양의 단계, 이들의 조합 또는 다른 인자들을 포함할 수도 있으나, 이에 제한하는 것을 요구하는 것은 아니다. 다른 구현예에서, 피검체-특이적 기준선 뿐만 아니라 집단-유도된 기준선이 피검체의 상태를 평가하는데 사용될 수 있다.

당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자의 지식에 따라, 기준선에 비해 특정 역치를 초과하는 피검체로부터의 시료 내의 PG 수준은 직장암 또는 치료 이후에 재발된 직장암을 갖는 것으로 결론지을 수 있다. 상기 치료 팀은 그 다음 확인 실험을 통하여 직장암의 존재를 확인받을 수도 있다. 상기 실험의 비-제한적 예는 직장암 검출을 위한 예비 수술, 직장암 검출을 위한 의료 이미지 실험, 잠혈을 검출하기 위한 피검체의 대변 검사, 직장 검사, 직장암의 증가된 위험을 표시하는 HNPCC 유전자 또는 APC 유전자에서와 같은, 유전자 돌연변이의 존재에 대한 피검체로부터 수득한 시료 실험 및 직장암을 표시하는 암태아항원 (CEA)과 같은, 생물학적 인자의 존재에 대한 피검체로부터 수득한 시료 실험을 포함한다.

섭취는 일반적으로 가스트린 합성 및 분비를 증가시키기 때문에, 섭취는 집장암 전이 또는 재발 직장암에 의해 생성된 PG의 정확한 측정을 방해할 수도 있는 혈액 PG 수준을 일시적인 증가를 초래할 수도 있다. 이러한 영향을 피하기 위하여, 특히, 혈장 및/또는 혈청 내의 PG 수준이 측정되는 경우, 시료는 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자들에 의해 쉽게 측정될 수 있는, 충분한 시간 동안의 공복 이후에 피검체로부터 채취될 수 있다.

7.9. 약제학적 조성물

본 발명의 방법에서 사용하기 위한 항-hPG 항체는 조성물로 제형화될 수 있다. 상기 조성물은 일 이상의 치료제, 예를 들면 화학 요법제 또는 전이성 직장암 또는 직장암 재발에 대해 치료적 효능을 갖는 다른 항체를 포함할 수 있다. 상기 조성물은 일반적으로 보통 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 멸균, 약제학적 조성물의 일부로서 공급될 것이다. 상기 조성물은 그것이 환자에 투여되는 원하는 방법에 따라 임의의 적합한 형태로 존재할 수 있다.

항-PG 항체는 전형적으로, 다양한 비경구적인 경로, 예를 들면 피하, 정맥, 복막 또는 근육 주입에 의해 피검체로 투여될 수 있다. 투여는 일 이상의 볼루스 주입으로, 또는 일 이상의 융합체로서 영향을 받을 수 있다. 다른 투여 경로가 당해 기술분야에서 당업자의 지식에 따라 가능하다. 미리결정된 경우에 가장 적합한 투여 경로는 특히 투여될 조성물 및 연령 또는 성별과 같은, 피검체의 특성에 의존할 수도 있다.

약제학적 조성물은 용량 당 발명의 항-hPG 항체의 미리결정된 양을 함유하는 단위 용량 형태로 편리하게 존재할 수 있다. 그러한 단위는 예를 들면 5 mg 내지 5 g, 예를 들면 10 mg 내지 1 g, 또는 20 내지 50 mg를 함유할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 개시내용에서 사용하기 위한 약제학적으로 허용가능한 담체 예를 들면, 투여 경로에 따라 다양한 형태로 섭취될 수 있다.

본 개시내용의 약제학적 조성물은 원하는 순도를 갖는 항체와 임의의 약제학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 당해 기술분야에서 사용되는 안정화제 (본원에서 상기는 모두 "담체"라고도 한다), 즉 완충제, 안정화제, 보존제, 비-이온성 세제, 항산화제, 및 다른 혼합 첨가제와 혼합됨으로써 동결건조화된 제형 또는 수용액으로 저장되기 위하여 제조될 수 있다. 문헌 [Remington 's Pharmaceutical Sciences, 16th edition (Osol, ed. 1980)] 참고. 그러한 첨가제는 사용되는 용량 및 농도에서 수혜자에게 비독성이어야 한다.

완충제는 대략적인 생리학적 상태의 범위 내에서 pH 를 유시키는 것이다. 그것들은 약 2 mM 내지 약 50 mM 범위의 농도로 존재할 수 있다. 본 발명에서 사용하기에 적합한 완충제는 시트레이트 완충제 (예를 들면, 모노소듐 시트레이트-디소듐 시트레이트 혼합물, 시트르산-트리소듐 시트레이트 혼합물, 시트르산-모노소듐 시트레이트 혼합물 등), 숙시네이트 완충제 (예를 들면, 숙신산-모노소듐 숙시네이트 혼합물, 숙신산-소듐 히드록사이드 혼합물, 숙신산-디소듐 숙시네이트 혼합물 등), 타르타르산염 완충액 (예를 들면, 타르타르산-소듐 타르타르산염 혼합물, 타르타르산-소듐 히드록사이드 혼합물 등), 푸마레이트산염 완충액 (예를 들면, 푸마르산-모노소듐 푸마레이트 혼합물, 푸마르산-디소듐 푸마레이트 혼합물, 모노소듐 푸마레이트-디소듐 푸마레이트 혼합물 등), 글루코네이트 완충액 (예를 들면, 글루콘산-소듐 글리코네이트 혼합물, 글루콘산-소듐 히드록사이드 혼합물, 글루콘산-포타슘 글리코네이트 혼합물 등), 옥살레이트 완충액 (예를 들면, 옥산산-소듐 옥살레이트 혼합물, 옥산살-소듐 히드록사이드 혼합물, 옥살산-포타슘 옥살레이트 혼합물 등), 락테이트 완충액 (예를 들면, 락트산-소듐 락테이트 혼합물, 락트산-소듐 히드록사이드 혼합물, 락트산-포타슘 락테이트 환합물 등) 및 아세테이트 완충액 (예를 들면, 아세트산-소듐 아세테이트 혼합물, 아세트산-소듐 히드록사이드 혼합물 등)과 같은 유기 또는 무기산을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 부가적으로, 포스페이트 완충액, 히스티딘 완충액 및 트리스와 같은 트리메틸아민 염이 사용될 수 있다.

보존제는 미생물의 성장을 지연시키기 위하여 첨가될 수 있고, 0.2%- 1 % (w/v)의 범위의 양으로 첨가될 수 있다. 본 발명에서 사용되기에 적합한 보존제는 페놀, 벤질 알코올, 메타-크레졸, 메틸 파라벤, 프로필 파라벤, 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드, 벤잘코늄 할라이드 (예를 들면, 클로라이드, 브로마이드, 및 요오드), 헥사메토늄 클로라이드, 및 메틸 또는 프로필 파라벤과 같은 알킬 파라벤, 카테콜, 세조르시놀, 시클로헥사놀, 및 3-펜타놀을 포함한다. "안정화제"로서 알려진 등장화제가 첨가됨으로써 본 발명의 액체 조성물의 등장성을 확보할 수 있는바, 이는 다가 당 알코올, 예를 들면 글리세린, 에리트리톨, 아라비톨, 자일리톨, 솔비톨 및 만니톨과 같은 삼가 또는 그 이상의 당 알코올을 포함한다. 안정화제는 치료제를 안정화시키고 변성 또는 용기 벽면에의 부착을 예방하는 첨가제에 대한 수분 조절제로부터의 기능을 하는 부형제의 넓은 범위를 나타낸다. 전형적인 안정화제는 다가 당 알코올 (상기 나열됨); 알기닌, 리신, 글리신, 글루타민, 아스파라진, 히스티닌, 알라닌, 오르니틴, L-루신, 2-페닐알라닌, 글루타민산, 트리오닌 등과 같은 아미노산; 락토오스, 트레할로스, 스타치오스, 만니톨, 소르비톨, 자일리톨, 리비톨, 미오이니시톨, 갈락티톨, 글리세롤 등, 예를 들면 이노지톨과 같은 시틀리톨과 같은 유기 당 또는 당; 폴리에틸렌 글리콜; 아미노산 중합체; 우레아, 글루타티온, 티오크틴산, 소듐 티오글리코레이트, 티오글리세롤, α-모노티오글리세롤 및 소듐 티오 설페이트와 같은 황 함유 저감제; 저 분자량 폴리펩티드 (예를 들면 10 개의 잔기 또는 그 이하의 펩티드); 인간 혈청 알부민, 보빈 혈청 알부민, 겔라틴 또는 면역글로불린과 같은 단백질; 폴리비닐피롤리돈과 같은 친수성 중합체, 자일로스, 만노스, 프럭토스, 글루코스와 같은 모노사카라이드; 락토스, 말토스, 수크로오스와 같은 디사카라이드 및 라피노스와 같은 트리사카라이드; 및 덱스트란과 같은 폴리사카라이드를 포함할 수 있다. 안정화제는 활성 단백질의 중량의 0.1 내지 10,000 중량부의 범위 내로 존재할 수 있다.

비-이온성 개면활성제 또는 세제 ("습윤제"로도 알려짐)이 첨가됨으로써 치료제를 안정화시킬 뿐만 아니라 교반-유발 응집에 대해 치료적 단백질을 보호하여, 단백질을 변성시킴 없이 상기 제형을 표면 응력된 전단 표면에 노출시킨다. 안정한 비-이온성 개면활성제는 폴리솔베이트 (20, 80 등), 폴리옥사머 (184, 188 등), 플루로닉 폴리올, 폴리옥시에틸렌 오르비탄 모노에테르 (TWEEN?-20, TWEEN?-80 등)를 포함한다. 비-이온성 계면확성제는 약 0.05 mg/ml 내지 약 1.0 mg/ml, 예를 들면 약 0.07 mg/ml 내지 약 0.2 mg/ml의 범위 내로 존재할 수 있다. 계면활성제는 그러나 항체에 결합하려는 경향을 가지므로 그들의 형태에 영향을 미칠 수 있다. 따라서, 사용시, 안정한 농도는 낮아야 하며 실험적으로 인식되어야 한다.

부가적인 갖가지 부형제는 킬레이트제 (예를 들면, EDTA), 항산화제 (예를 들면, 아스코르브산, 메티오닌, 비타민 E), 및 공용매를 포함할 수 있다.

항-hPG 항체는 단일하게 또는 일 이상의 항-hPG 항체 단독의 혼합물로, 또는 직장암 전이 또는 재발을 예방하기에 유용한 다른 작용제와 조합하여 투여될 수 있는바, 상기는 화학요법제, 생물학적 요법제, 및 항체 요법제 (예를 들면, 베바시주맵)를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.

7.10. 약제학적 키트

특정 구현예에서, 본 발명은 임상의 등에 의해 사용되기 위한 약제학적 키트를 제공한다. 약제학적 키트는 본 개시내용의 항-hPG 항체 (예를 들면, 동결건조된 형태로서 또는 수용액으로서) 및 일 이상의 하기의: 본 발명에서 기술된 적어도 제2의 치료제; 항-hPG 항체를 투여하기 위한 장치, 예를 들면, 바늘 및/또는 주사기; 및 항체가 동결건조되거나 농축된 형태일 경우 항체를 재부유하거나 희석하기 위한 약제학적 등급수 또는 완충액을 포함하는 패키지이다. 키트는 항체 조성물을 제조하고 및/또는 환자에게 상기 조성물을 투여하기 위한 사용지시를 포함한다.

항-hPG 항체 조성물의 각각의 단위 용량이 분리적으로 패키지될 수 있고, 키트는 일 이상의 단위 용량 (예를 들면, 2 단위 용량, 3 단위 용량, 4 단위 용량, 5 단위 용량, 7 단위 용량, 8 단위 용량, 10 단위 용량 또는 그 이상)을 함유할 수 있다. 일 구현예에서, 일 이상의 단위 용량이 주사기 내로 각각 제공되었고, 다른 구현예에서 일 이상의 단위 용량이 각각 백 또는 I.V. 라인에 연결하기에 적합한 유사 용기에 함유되었다.

7.1 1. 유효 용량

본 발명의 중화 항-hPG 항체를 포함하는 조성물은 직장암 전이를 치료하거나 예방하거나 직장암의 재발을 예방하는 것에 요구되는 피검체에 투여됨으로써, 적어도 부분적으로, 원하는 결과를 달성하기 위한 것이다 .

직장암 전이를 치료하는 것과 관련하여, 치료적 이점은, 상기 중에서, 전이성 직장암의 개선, 직장암 전이의 성장의 중지 또는 감소, 피검체 내의 전이의 수 및/또는 크기의 감소, 직장암 전이의 혈류 감소, 직장암 전이의 대사 감소, 직장암 전이성 암의 중증도 감소, 전이성 직장암 세포의 증식 억제 또는 아포프토시스 증가, 피검체 내의 전이성 직장암과 관련된 증후 또는 중상의 악화 중지 또는 지연을 의미하는 것으로, 치료시에 절제가 가능하지 않은 경우 직장암 전이의 수술 절제를 가능하게 함으로써 전이성 직장암을 갖는 환자의 삶의 기대, 안정 또는 질을 증가시키고, 피검체의 고통을 경감시킬 수 있다. 전이성 직장암의 완전 치료는 바람직하지만 존재하기 위하여 치료적 이점을 요구하지 않는다.

치료적 이점은 또한 무-진행 생존 (progression-free survival, PFS)로서 측정될 수 있다. 이와 관련하여, 단계 II, III 또는 IV 직장암을 갖는 초기의 피검체에서 그것이 질병의 더 진보된 상태로 진행하려면 얼마나 걸리는지가 측정된다. 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 이상의 개월의 PFS 내의 증가는 치료적 이점을 제공하는 것으로 고려된다.

전이성 직장암 종양 크기, 수 및 대사가 다양한 스캐닝 기술을 사용하여 측정될 수 있는바, 이는 CT, MRI, 기능적 MRI, SPECT 및 PET 뿐만 아니라 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 알려진 다른 방법을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.

치료적 이점은 또한 일 이상의 대용물 끝점과 관련될 수 있다. 예로서, 프로가스트린 또는 암태아항원 (CEA)과 같은, 전이성 직장암에 의한 일 이상의 특정 단백질 또는 다른 인자들의 생산은 치료적 이점을 표시하는 인자의 수준 내의 감소로 시간에 따른 피검체 내에서 측정될 수 있다.

직장암 전이의 예방과 관련하여, 유효한 용량은 그 중에서도 직장암 전이의 부재, 직장암 전이의 성장의 중지 또는 지연, 최후로 발생할 수도 있는 임의의 직장 전이의 수 및/또는 크기의 감소, 및 전이성 직장암 세포가 초기 종양으로부터 번질 수 있는 임의의 대사 단계의 억제 또는 방해에 의해 입증되는, 적어도 부분적으로 전이성 직장암을 예방하는데 유효한 것을 의미한다. 직장암 전이의 완전한 예방이 바람직하지만 존재를 위한 효능에 요구되는 것은 아니다.

직장암 재발의 예방과 관련하여, 유효한 양은 그 중에서도, 직장암 재발의 부재, 직장암의 경감 유지, 또는 직장암의 재출현 또는 재성장, 또는 초기 직장암이 검출불가능하여 명백히 사라진 경우 치료 이후의 피펌체 내의 새로운 직장 종양의 성장의 중지 또는 감소에 의해 입증되는, 직장암 재발을 적어도 부분적으로 예방하기에 유효한 것을 의미한다. 직장암 재발을 예방하기 위한 효능은 또한 그 중에서도 직장암 줄기 세포의 사멸, 직장암 줄기 세포의 성장 또는 증식의 지연, 중지, 억제 또는 지연, 직장암 줄기 세포 아포프토시스의 증가, 또는 직장암 줄기 세포의 분화를 직장암의 형성 또는 성장에 공헌하지 않는 세포로 유도함으로서 입증된다. 또한 본원에 기술된 바와 같이, 직장암 줄기 세포는 특정 세포 마커의 발현, 낮은 부착성 배지 조건 하에 스페로이드로 성장 능력 및 이식 이후의 새로운 종양 성장의 개시 능력을 포함하나, 이에 제한되지 않는 일 이상의 표현형 속성을 갖는 것으로 확인가능하다. 직장암 재발의 완전한 예방이 바람직하지만 존재하기 위한 효능이 요구되는 것은 아니다.

모든 프로가스트린의 결합은 치료적 효능을 달성하기에 반드시 요구되는 것은 아니다. 오히려 전신적으로, 복수, 가슴막 삼출로부터의 용액, 뇌척수액, 림프, 혈액, 혈장, 혈청 등과 같은 체액 내의 종양에 있는 프로가스트린의 농도의 감소가 유효할 수도 있다.

당해 기술분야에서 당업자의 지식에 따르면, 항-hPG 항체 조성물의 용량은 적어도 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90, 또는 100%, 또는 약 5%-10%, 약 10%-15%, 약 15%-20%, 약 20%-25%, 약 25%-30%, 약 30%-35%, 약 35%-40%, 약 40%-45%, 약 45%-50%, 약 50%-55%, 약 55%-60%, 약 60%-65%, 약 65%-70%, 약 70%-75%, 약 75%-80%, 약 80%-85%, 약 85%-90%, 또는 약 90%-95%, 또는 상기 수치 내에서의 유리 hPG 농도의 퍼센트 감소를 투여한 이후에 미리결정된 시간에서 목적의 조직 또는 세액 내의 유리 hPG 농도가 감소되도록 환자 내에서 적정될 수 있다.

투여되는 항-hPG 항체의 양은 치료 받을 피검체의 크기 및 무게, 투여 형태, 경로 및 위치, 치료 요법 (예를 들면, 제2의 치료제가 사용되는지 여부), 치료 받을 특정 피검체의 연령 및 상태, 치료 전의 상기 피검체의 혈액 내에서 검출되는 PG의 수치, 항-PG 항체로 치료받는 피검체의 민감도를 포함하는, 다양한 요인들에 의존할 것이다. 적당한 용량은 당해 당업자에 의해 쉽게 측정될 수 있다. 궁극적으로, 임상의는 사용될 적당한 용량을 결정할 것이다. 상기 용량은 적당한 횟수로 반복될 수 있다. 부작용이 발생하는 경우, 투여 용량 및 횟수는 통상의 임상 진료에 따라 변경하거나 감소시킬 수 있다. 적절한 용량 및 치료 요법은 본 발명의 방법 또는 당업자에게 알려진 다른 방법을 사용하여 요법의 진행을 모니터링함으로써 결정될 수 있다.

유효 용량은 인비트로 검정법으로부터 초기에 측정될 수 있는바, 예를 들면 동물에서 사용하기 위한 초기 용량은 인 비트로에서 측정된 프로가스트린에 대한 항체의 결합 친화도에서 또는 상기 이상의 항-hPG 항체의 순환 혈액 또는 혈청 농도를 확립하게 위하여 결정될 수도 있다. 특정 항체의 생체이용성을 고려하여 순환 혈액 또는 혈청 농도를 달성하기 위해 용량을 측정하는 것은 당업자의 능력 범위 내에 있을 것이다. 참조로서, 문헌 [Part 1: General Principles in "Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics," 11^th Ed., Hardman, J.G., et al, Eds., McGraw-Hill Professional] 및 본원에 인용된 문헌들 참고. 초기 용량은 또한 동물 모델과 같은 인비보 데이터로부터 측정될 수 있다. 당업자들은 인간 투여에 적합한 용량을 측정하기 위하여 상기 정보들을 적합하게 변경할 수 있다.

특정 구현예에서, i.v. 용량은 치료 받기 몇 일 내지 몇 주 동안 몇 시간 동안 개체의 혈청 또는 혈장 PG 농도를 측정하고, 포화되는 항-PG 항체의 양, 즉 모든 PG에 결합하기에 충분한 양을 계산함으로써 각각의 피검체에서 측정될 수도 있다. 당업자에게 이해되는 바와 같이, PG의 주어진 혈청 또는 혈장 농도를 포화시키기 위해 요구되는 임의의 특정 항체의 양은, 부분적으로, 특정 항체의 친화도에 따라 달라질 것이다. 관심의 특정 항-PG 항체의 포화량을 계산하기 위한 방법은 잘 알려져 있다.

포화를 보장하기 위하여, 계산된 포화량보다 많은 양이 투여될 수 있는바, 예를 들면 계산된 포화량보다 적어도 2-, 3-, 4-, 5-, 6-, 7-, 8-, 9- 또는 심지어 10-배 많은 양이 투여될 수도 있다. i.v. 이외에 투여 방법의 경우, 상기 양은 당해 기술분야에 알려진 바와 같이, 약물동태학 및 생물이용성을 기초로 조절될 수 있다.

항-hPG 항체 조성물의 유효량은 암의 재발이 예방될 것이 기대되는 암의 종류에 투여 경로 및 피검체의 연령, 무게 및 상태에 따라, 단일 (예를 들면, 볼루스) 투여, 다수 투여 또는 연속 (예를 들면, 융합) 투여 당 약 0.001 mg/kg 내지 약 250 mg/kg의 범위, 또는 임의의 유효한 수치 또는 상기 범위 내의 수치 일 수 있다. 특정 구현예에서, 각각의 용량은 약 0.1 mg/kg 내지 약 0.5 mg kg; 약 0.25 mg/kg 내지 약 0.75 mg kg; 약 0.5 mg/kg 내지 약 1 mg/kg; 약 2 mg/kg; 약 1.5 mg/kg 내지 약 2.5 mg/kg; 약 2 mg/kg 내지 약 3 mg/kg; 약 2.5 mg/kg 내지 약 3.5 mg/kg; 약 3 mg/kg 내지 약 4 mg/kg; 약 3.5 mg/kg 내지 약 4.5 mg/kg; 약 4 mg/kg 내지 약 5 mg/kg; 약 5 mg/kg 내지 약 7 mg/kg; 약 6 mg/kg 내지 약 8 mg/kg; 약 7 mg/kg 내지 약 9 mg/kg; 약 8 mg/kg 내지 약 10 mg/kg; 약 10 mg/kg 내지 약 15 mg/kg; 약 12.5 mg/kg 내지 약 17.5 mg/kg; 약 15 mg/kg 내지 약 20 mg/kg; 약 17.5 mg/kg 내지 약 22.5 mg/kg; 약 20 mg/kg 내지 약 25 mg/kg; 약 22.5 mg/kg 내지 약 27.5 mg/kg; 약 25 mg/kg 내지 약 30 mg/kg; 약 30 mg/kg 내지 약 40 mg/kg; 약 35 mg/kg 내지 약 45 mg/kg; 약 40 mg/kg 내지 약 50 mg/kg; 약 45 mg/kg 내지 약 55 mg/kg; 약 50 mg/kg 내지 약 60 mg/kg; 약 55 mg/kg 내지 약 65 mg/kg; 약 60 mg/kg 내지 약 70 mg/kg; 약 65 mg/kg 내지 약 75 mg/kg; 약 70 mg/kg 내지 약 80 mg/kg; 약 75 mg/kg 내지 약 85 mg/kg; 약 80 mg/kg 내지 약 90 mg/kg; 약 85 mg/kg 내지 약 95 mg/kg; 약 90 mg/kg 내지 약 100 mg/kg; 약 95 mg/kg 내지 약 105 mg/kg; 약 100 mg/kg 내지 약 150 mg/kg; 약 125 mg/kg 내지 약 175 mg/kg; 약 150 mg/kg 내지 약 200 mg/kg; 약 175 mg/kg 내지 약 225 mg/kg; 약 200 mg/kg 내지 약 250 mg/kg의 범위일 수 있다. 다른 용량 범위도 가능하다.

투여 양, 빈도 및 기간은 환자의 연령, 무게, 및 질병의 조건과 같은 다양한 요인에 따라 달라질 것이다. 따라서, 비-제한적 예에서, 투여의 치료적 요법은 2 주 내지 6 개월, 3 개월 내지 5 년, 6 개월 내지 1 또는 2 년, 8 개월 내자 18 개월 등 동안, 1 일 이상, 2 일 이상, 3 일 이상, 4 일 이상, 5 일 이상, 6 일 이상, 1 주 이상, 2 주 내지 무기한으로 지속될 수 있다. 추가적으로, 치료 요법은 반복투여 예를 들면, 매일, 하루에 1번, 2일, 3일, 5일, 1주, 2주, 또는 1달에 한번 제공된다. 반복 투여는 동일 용량으로 또는 다른 용량으로 이루어질 수 있다. 상기 투여는 일회, 2회, 3회, 4회, 5회, 6회, 7회, 8회, 9회, 10회, 또는 그 이상 반복될 수 있다. 항-hPG 항체의 치료적 유효량은 단일 용량으로서 또는 치료 요법의 과정 동안, 예를 들면 2주, 2주, 3주, 1달, 3달, 6달, 1년 또는 그 이상 걸쳐 투여될 수 있다.

8. 실시예

실시예 1 : 전이성 직장암 세포 내의 가스트린 유전자의 발현

본 실시예는 인간 초기 직장암 세포주 HT29, HCT116, RKO, SW480, 및 DLD1, 및 전이성 직장암 세포주 SW620 및 T84 내의 가스트린 (GAST) 유전자의 발현을 기술한다. 인간 초기 직장 종양의 생검 시료로부터 단리된 세포를 실험하였다. SW620 세포는 원래 Dukes의 단계 C 직장 설암종을 진단받은 환자의 림프절 전이로부터 유래되었다. T84 세포는 원래 직장 암종으로 진단받은 환자의 폐 전이로부터 유래되었다.

A. 방법

표준 기술로서, 정량적인 RT-PCR를 사용하여 HT29, HCT116, RKO, SW480, DLD1, SW620 및 T84 세포주의 RNA 제조물로부터 GAST mRNA의 발현을 정량화하였다. 데이터는 RKO 초기 직장암 세포주 내에서 발견되는 가스트린 mRNA 발현 수준과 비교한 것으로 표현하였다. RKO 세포는 보통 낮은 수준의 프로가스트린을 발현한다. 상대적인 가스트린 mRNA 수준을 로그 크기로 나타내었다.

B. 결과

정량적인 RT-PCR에 의해 측정된 가스트린 유전자 발현 수준을 도 1에 나타내었다. 실험된 모든 초기 및 전이성 직장암 세포는 가스트린 유전자를 발현하였으나, 가변 수준이었다. 번역-후 공정을 통해, 상기 가스트린 유전자 산물은 프로가스트린으로 전환될 수도 있다.

전이성 직장암 세포주 Colo-205를 사용하여 단일 실험을 수행하였으나, 결과는 반복되지 않았다.

실시예 2: 환자로부터 외과수술에 의해 제거된 초기 및 전이성 직장 종양 내의 가스트린 유전자의 발현

본 실시예는 환자로부터 외과수술로 제거된 매칭된 초기 및 전이성 직장 내의 가스트린 (GAST) 유전자의 발현을 기술한다.

A. 방법

적용가능한 윤리적 가이드라인에 따라 환자로부터 초기 및 전이성 직장 종양을 수술로 절제하였다. 표준 기술을 사용하여, 종양 조직 시료로부터 RNA를 제조하고 가스트린 mRNA을 정량적인 RT-PCR로 측정하였다. 전이성 종양 내의 가스트린 mRNA의 발현을 동일한 환자로부터 채취한 매칭되는 초기 종양에서의 발현 수준을 기준으로 표준화하였다.

B. 결과

11 명의 환자로부터의 전이성 직장 종양 내에서 발현되는 가스트린 mRNA 수준을 동일한 환자로부터의 매칭되는 초기 종양 내의 발현을 기준으로 하여 도 2에 나타내었다. 비록 연구된 모든 초기 및 전이성 직장 종양이 가스트린 유전자를 발현하지만, 매칭되는 초기 죵양을 기준으로 전이성 종양 내의 발현 수준은 다른 환자들 사이에서 매우 다양하였다.

실시예 3 : 전이성 암 세포에 의한 프로가스트린의 분비

본 실시예는 3개의 다른 전이성 직장암 세포에 의한 프로가스트린의 분비의 정량화를 기술한다.

A. 방법

60% 합류점까지 보통의 플라스틱 75 cm² 플라스크 내에서 세포를 성장시켰다. 그 다음 배양물을 제거하고 세포를 PBS로 1회 헹구었다. (페놀 레드 비함유) Ml1 배지 20 ml를 그 다음 플라스크에 첨가하고, 세포를 추가 48 시간 동안 인큐베이션하였다. 그 다음 배지를 수거하고 5 분 동안 1,000 g에서 원심분리함으로써 세포 파쇄물을 제거한 다음 -80℃에서 동결시켰다. 그 다음 세포를 트립신화하고 카운트하였다.

분비된 프로가스트린을 측정하기 위하여, 동결된 성장 배지를 아이스 상에서 녹인 후 그 다음 42분 동안 2,500 g에서 원심분리함으로써 단백질 농축기 (Icon, Pierce)를 사용하여 500 ㎕의 부피까지 40-배 농축시켰다. 가스트린 농도는 그 다음 샌드위치 ELISA를 사용하여 측정하였다.

B. 결과

도 3은 3개의 전이성 직장암 세포주에 의해 컨디셔닝된 배양물 내의 프로가스트린의 농도는 나타낸다. 데이터는 성장 48 시간 마다 밀리온 세포 당 pM 로 프로가스르티 농도를 표현하였다. 본 실험에서, 상기 Colo-205 세포는 사용된 검정법의 검출의 한계 내에서 PG를 생산하지 않았다.

실시예 4: 초기 및 전이성 직장암을 진단받은 환자 내의 혈장 또는 혈청 프로가스트린 농도

본 실시예는 초기 직장암은 있으나 전이되지 않은 환자, 전이성 직장암을 갖는 환자 및 전이성 직장암을 갖으며 초기 종양이 수술로 제거된 환자 내의 프로가스트린의 혈장 또는 혈청 수준의 정량화를 기술한다.

C. 방법

혈장 또는 혈청 프로가스트린 농도를 대조군으로서, 건강한 개체 내에서, 그리고 직장암을 갖는 환자 내에서 측정하였다. 건강한 대조군 시료 (n=104)은 혈액 은행으로부터 입수하였다. 직장암 환자는 3 그룹으로 이루어진다. 첫번째, 샘플링시 초기 암을 가지나 전이되지 않은 것으로 진단받은 환자 (T+M-; n=16). 둘째, 샘플링시 전이성 질병을 진단받은 환자 (T+M+; n=24). 그리고, 샘플링시 이미 초기 종양이 수술로 제거되었으나 전이성 질병을 진단받은 환자 (T-M+; n=46). 전이성 질병을 갖는 다수의 환자, 즉, 15명의 24 T+M+ 환자 및 41 명의 46 T-M+ 환자는 샘플링시 화학요법을 받고 있거나 직전에 받았다.

하기에 예언적으로 기술한 것과 유사한 프로가스트린-특이적 샌드위치 ELISA 기술을 사용하여 혈장 또는 혈청 프로가스트린 수준의 정량화를 수행하였다.

Nunc MaxiSORP 96-웰 플레이트의 웰을 하기와 같이 제1의 프로가스트린-특이적 항체로 코팅하였다. 프로가스트린의 카복시-막단 영역에 특이적인 항-프로가스트린 다중클론 항체를 MilliQ 수에서 50mM, pH 9.6 소듐 카보네이트/비카보네이트 완충액으로 3 μg/ml의 농도까지 희석하였다. 전체 항체 용액 100 ㎕를 96-웰 플레이트의 각각의 웰에 첨가하고 4℃에서 하룻밤 인큐베이션하였다. 결합 이후에, 상기 항체 용액을 100 ㎕ 세정 완충액 (IX PBS / 0.1 % Tween-20)을 사용하여 3회 세척함으로서, 웰로부터 제거하였다. 전체 100 ㎕ 차단 완충액 (IX PBS / 0.1 % Tween-20 / 0.1 % BSA)을 각각의 웰에 첨가하고 22℃에서 2 시간 동안 인큐베이션하였다. 차단 완충액을 그 다음 제거하고 상기 웰을 세정 완충액을 사용하여 3회 세척하였다. 환자로부터 단리된 혈장 또는 혈청 시료를 그 다음 연속 희석물, 통상적으로 1:1, 1:2, 1:5 및 1:10 희석하여 100 ㎕의 부피로 웰에 첨가한 후, 22℃에서 2 시간 동안 인큐베이션하였다. 혈장 또는 혈청 시료를 이중 분석하였다.

검정법은 또한 2개의 표준 곡선을 포함한다. 제1의 표준 곡선은 웰 당 1 ng, 0.5 ng, 0.25 ng, 0.1 ng, 0.05 ng, 0.01 ng, 및 0 ng의 최종 농도까지 재조합 프로가스트린의 희석물을 사용하여 제조하였다. 제2의 표준 곡선은, 음성 대조군으로서, 실험 시료와 동일한 희석, 즉, 1:1, 1:2, 1:5 및 1:10에서 차단 완충액으로 희석된 프로가스트린-음성 인간 혈청으로부터 제조하였다. 대안적으로, 혈장 시료가 분석될 때, 음성 대조군으로서 역할을 하는, 제2의 표준 곡선을 실험 시료와 동일한 희석, 즉, 1:1, 1:2, 1:5 및 1:10에서 차단 완충액 내에 희석된 프로가스트린-음성 인간 혈장으로부터 제조하였다.

혈장 또는 혈청 시료로 인큐베이션을 완료한 이후에, 상기 웰 내용물을 제거하고 제1항체에 결합된 프로가스트린이 하기와 같이, 제2의 프로가스트린에 특이적인 항체를 사용하여 검출된 이후에, 상기 웰을 세정 완충액 100 ㎕/웰로 3회 세척하였다.

프로가스트린의 아미노-말단 영역에 특이적인 비오틴-결합된 항-프로가스트린 다중클론 또는 단일클론 항체를 차단 완충액으로 항체에 따라, 0.1 내지 10μg/ml의 농도까지 희석하였다. 항체 용액의 전체 100 ㎕을 그 다음 각각의 웰에 첨가하고, 22℃에서 1 시간 동안 인큐베이션하였다.

제2차 항체 결합이 완료된 이후에, 상기 플레이트를 세정 완충액으로 3회 세척하고, 그 다음에 스트렙타빈-HRP의 용액 100 ㎕ (차단 완충액 내의 25ng/ml)를 각각의 웰에 첨가하고 22℃에서 1 시간 동안 인큐베이션하였다. 스트렙타빈-HRP 용액으로의 인큐베이션이 완료된 이후에, 상기 플레이트를 세정 완충액, 100 ㎕/웰로 3회 세척하였다. 그 다음에 Pierce SuperSignal ELISA Femto Maximum Sensitivity Chemiluminescent Substrate 키트를 사용하여 제조된 화학발광 물질 100 ㎕을 각각의 웰에 첨가하고 어둠 하에 실온에서 5 분 동안 인큐베이션한 후 발광측정기로 기록하였다.

루미네이터 기록을 기초로, 선형 회귀 분석을 사용함으로써 표준 곡선 데이터에 상응하는 선의 공식을 유도하였다. 상기 곡식을 사용함으로써 다양한 환자 시료 내의 프로가스트린의 농도를 계산하였다.

D. 결과

도 4의 박스 플롯은 분석된 직장암 환자의 3개의 그룹 내의 혈청 프로가스트린의 농도의 25 퍼센트, 중간값, 및 75 퍼센트 혈장을 나타낸다. 상기 휘스커는 혈장 또는 혈청 프로가스트린 농도의 5 및 95 퍼센트를 표시한다. T+ 또는 T-는 각각 초기 종양이 여전히 같은 위치게 있거나 절제되었음을 표시한다; M+ 또는 M-는 환자에서 각각 전이되거나 전이가 검출되지 않았음을 표시한다. 표 4는 미가공 데이터의 통계학적 분석의 요약을 함유한다.

본 데이트는 초기 및 전이성 직장암이 건강한 개체와 비교해볼 때 그들의 혈장 또는 혈청 내의 프로가스트린의 상승된 수준을 가짐을 입증한다. 게다가, 프로가스트린의 수준은 전이성 직장암을 갖는 초기 종양이 수술로 제거된 환자에서 상승된 채로 존재하였다. 이는 직장 전이가 상기 환자에서 프로가스트린을 생산함을 제안한다.

실시예 5: 배지 내의 SW620 전이성 직장암 세포의 성장에 미치는 항-프로가스트린 다중클론 항체의 효과

본 실시예는 배양시 SW620 인간 전이성 직장암 세포주의 성장에 미치는 항-hPG 다중클론 항체의 효과를 기술한다.

A. 방법

SW620 세포를 혈청이 결핍된 6-웰 플레이트에 하룻밤 시딩하고, 그 다음 3 ㎍/ml 대조군 항체 (다중클론 토끼 항-인간 IgG, Affinity BioReagents, Ref #SAl-600) 또는 항-PG 다중클론 항체를 PBS로 12 시간 마다 처리하였다. 본 실험은 이중으로 수행하고 기술자는 처리 용액의 함량과 관련하여 블라인드되었다. 실험의 시작 후 72 시간에, 각각의 웰 내의 생존 세포의 수를 3회 카운트하였다.

B. 결과

도 5에 나타낸 바와 같이, 항-PG 다중클론 항체로의 처리는 72 시간 기간 동안 SW620 세포의 성장에서 43.5 % 감소를 야기하였다 (p=0.0294, Mann Whitney 실험; n=2). 본 실험의 결과는 PG에 대한 다중클론 항체가 인비트로에서 전이성 직장암 세포의 성장을 감소시키기에 유효함을 입증한다.

실시예 6: 배지 내의 SW620 전이성 직장암 세포의 성장에 미치는 항-프로가스트린 단일클론 항체의 효과

본 실시예는 배지 내의 SW620 인간 전이성 직장암 세포주의 성장에 미치는 항-hPG 단일클론 항체의 효과를 기술한다.

A. 방법

SW620 세포를 혈청-결핍 6-웰 플레이트에 하룻밤 시딩하고, 대조군 항체 (마우스 항-인간 IgGl, Calbiochem, Ref #41 1451) 또는 4개의 다른 항-PG 단일클론 항체, MAb3, MAb4, MAb2, 및 MAbl를 PBS, 3 ㎍/ml로 매 12 시간 마다 처리하였다. 실험은 이중으로 수행되었고, 기술자들은 처리 용액의 함량과 관련하여 블라인드되었다. 48시간 이후에, 생존가능한 세포의 수를 카운트하고, 평균화하였다.

각각의 실험에서, SW620 세포를 6-웰 플레이트 (웰 당 100,000 세포)로 시딩하고 상기와 마찬가지로 항-hTG 단일클론 항체 5-23 (즉, MAb5-MAb23) 5 ㎍/ml 또는 ㎍/ml 대조군 항체로 처리하였다. 48시간 이후에, 생존 가능한 세포의 수를 실험의 시작시 세포의 수(즉, T0)로부터 카운트하고, 특이적 항체 처리된 웰 내의 생존 세포의 수를 뺄셈하였다. 특이적 항체-처리된 웰 내의 생존 세포의 수를 대조군에 대한 백분율로 표현하였다.

B. 결과

도 6 A에 나타낸, MAbl-MAb4로 SW620 세포를 처리한 결과를 실험의 시작시 시딩된 세포의 수에서 실험의 종결시 웰 당 세포의 평균 개수를 뺄셈함으로써 계산하였다. 미가공 수 및 통계 (Mann Whitney 실험)를 표 5에 나타내었다. 상기 실험 결과는 PG에 대한 다른 단일클론 항체가 대조군 항체와 비교하여, SW620 전이성 직장암 세포의 성장을 감소시키기에 유효함을 입증한다. 본 결과는 또한 PG에 대한 단일클론 항체는 대조군에 비해 세포의 성장을 감소시키기에 유효하지만, 2개의 항체, MAb3 및 MAb4는 다른 것들보다 더 유효함을 나타낸다.

각각 hPG에 특이적으로 결합할 수 있는, MAb5-MAb23로 SW620 세포를 처리한 결과를 도 6B에 나타내었다. 비-특이적 대조군 항체와 비교한 결과, 실험된 항-hPG 단일클론 항체는 배지에서 SW620 전이성 직장암 세포주의 성장을 억제하기에 유효한 범위를 나타냄이 입증되었다.

MAb3로 처리한 Colo-205 전이성 직장암 세포의 성장에 미치는 영향을 측정하기 위한 관련 실험을 수행하였으나, 그 결과는 반복되지 않았다 .

실시예 7: 배지 내의 T84 전이성 직장암 세포의 성장에 미치는 항-프로가스트린 단일클론 항체의 효과

A. 방법

본 실험에 사용된 방법은 사용된 항-프로가스트린 항체가 항-hPG MAb3인 것을 제외하고는, SW620 세포 상에 미치는 항-프로가스트린 단일클론 항체의 효과를 측정하기 위해 사용한 것과 동일하였다.

B. 결과

도 7에 나타낸, 결과는 실험의 시작시 시딩된 세포의 수에서 실험의 종료시 각 웰 당 세포의 평균 개수를 뺄셈함으로써 계산하였다. 통계학적 분석 요약을 표 6에 나타내었다. 본 실험 결과는 항-hPG MAb3가 대조군 항체에 비해, 인비트로에서 T84 전이성 직장암 세포의 성장을 감소시킴에 유효함을 입증한다.

MAb3로 Colo-205 전이성 직장암 세포를 처리시 성장이 미치는 효과를 측정하기 위하여 관련 실험을 수행하였으나, 결과가 반복되지 않았다.

실시예 8: SW620 세포 이종이식에 의한 간 전이를 갖는 누드 마우스 내에 형성에 미치는 항-프로가스트린 다중클론 항체의 효과

본 실시예는 누드 마우스로 이식한 이후에 간 전이를 형성하기 위한 SW620 세포의 능력에 미치는 항-PG 다중클론 항체의 효과를 기술한다.

A. 방법

전체 5xl0⁶ SW620 세포를 각각의 31 BALBc/6주령 누드마우스의 비장에 주입하였다. 세포 주입 2분 후에, 상기 비장을 외과수술로 제거하였다. 회수 4시간 이후에, 마우스를 무작위로 3 그룹으로 나누고, 상기 각각을 3개의 다른 처리 중 하나에 제공하였다. 구체적으로, 11 마리의 마우스에는 PBS를 주입하고, 10 마리의 마우스에는 PBS로 희석된 대조군 항체를 주입하고, 그리고 10 마리의 마우스에는 또한, PBS로 희석된, 항-PG 다중클론 항체를 주입하였다. 항체의 용량은 150 마이크로리터의 부피 내에서 8 mg kg이었다. 주입은 6주 동안 각 일주일에 2회 복막으로 이루어졌다. 6주 이후에, 주입 과정이 종료된 후, 마우스를 이산화 탄소로 안락사시키고 간을 제거하여 존재하는 가시적인 전이의 수를 세었다. 간 및 전이는 또한 파라핀 삽입 및 면역조직화학법으로 제거하였다.

B. 결과

항-hPG 다중클론 항체로 치료받은 마우스로부터 가시적 전이 없는 간의 사진을 도 8 A에 나타내었다. 표 7은 항-hPG 다중클론 항체로 치료받은 마우스로부터의 각각의 카운트된 전이의 수를 나타낸다. 표 9는 PBS로 처리된 마우스로부터의 각각의 간에서 카운트된 전이의 수를 나타낸다. 도 9는 전이 수 대 처리 암을 나타내는 그래프이다.

조직학적 분석은 항-hPG 항체로 처리된 동물의 간으로부터 수득된 절제부 내에 존재하지 않는, 두 대조군 그룹으로부터의 간 절단부 내의 마이크로전이의 존재를 나타낸다. 대조군 동물의 간 내부에 혈관에서 검출되는 마이크로전이의 예를 도 10에 도시한 현미경사진으로 나타내었다.

본 실시예의 결과는 SW620 세포, 직장암 전이성 세포주로 이식된 누드 마우스의 항-hPG 항체 처리가 대조군 항체 또는 운반체 만을 공급받은 마우스에 비해 가시적인 간 전이의 전체 수를 감소시켰음을 입증한다. 비록 감소의 범위가 통계학적 유의성에 도달하지는 못했지만, 수치 데이터 내의 경향, 뿐만 아니라 항-hPG 항체 처리된 마우스의 간 내의 마이크로전이의 부재는 PG 항체가 본 모델 시스템 내의 직장암의 전이의 발생을 감소시키기에 유효하다는 것을 제안한다.

실시예 9: SW620 세포 이종이식에 의한 간 전이를 갖는 누드 마우스에 형성에 미치는 항-프로가스트린 단일클론 항체의 효과

A. 방법

전체 5x10⁶ SW620 세포를 각각의 20 BALBc/5주령 누드 마우스의 비장에 주입하였다. 세포의 주입 2분 후에, 상기 비장을 외과 수술로 제거하였다. 회수 이후에, 마우스를 무작위로 2 그룹으로 나누고, 상기의 각각을 2개의 다른 처리 중 하나에 제공하였다. 구체적으로, 10 마리의 마우스에는 PBS로 희석된 대조군 항체 (항-인간 IgGlFc)를 주입하고, 10 마리의 마우스는 또한 PBS로 희석된 항-hPG 단일클론 항체 MAb3를 주입하였다. 항체의 용량은 150 마이크로리터의 부피 내에서 8 mg/kg이었다. 주입은 6주 동안 매주 2회씩 복막으로 이루어졌다. 일단 각각의 마우스를 매주 무게를 재었다. 6주 이후에, 주입 과정을 종결하고, 상기 마우스를 이산화탄소로 안락사시키고 간을 제거하고 가시적으로 존재하는 가시적인 전이의 수를 카운트하였다.

B. 결과

결과를 도 11에 나타내었다. 전이의 평균 개수는 대조군 항체가 투입된 마우스에서 7.3 및 항-hPG 단일클론 항체 MAb3로 치료받은 마우스에서는 4.3개 이었다. 이것은 41%의 감소에 해당하고 p = 0.0372에서 통계학적으로 유의하다. 통계학적 분석을 하기의 표 10에 나타내었다. 치료 받은 마우스 내의 간 전이의 평균 중량은 비록 이러한 차이는 통계적 유의성에 도달하지는 못하지만, 대조군 마우스의 167 mg와 비교해볼 때, 96 mg 까지 감소하였다.

실시예 10: 직장암 세포 내의 LGR5의 발현은 낮은 부착성 배지 조건 하에서 성장됨으로써 증가한다.

본 실시예는 직장암 세포주 상의 직장 줄기 세포 표면 마커 LGR5의 발현에 미치는 낮은 부착성 배지 조건 하의 성장의 효과를 기술한다. 실험된 세포는 초기 직장암 및 전이성 직장암 세포주로부터의 세포, 인간 초기 직장암으로부터 수득된 생검 시료로부터의 세포를 포함한다. 낮은 부착성 배양 조건은 스페로이드로서 암 줄기 세포을 풍부하게 하고 직장암 줄기 세포의 유용한 검정 툴을 제공한다.

A. 방법

실험된 세포는 초기 직장암 세포주 HT29 및 HCTl16, 및 전이성 직장암 세포주 SW620 및 T84로부터 얻은 것이다.

인간 초기 직장 종양으로부터의 생검 시료로부터 단리된 세포를 하기와 같이 실험하였다 (CRC1). 생검 시료를 멸균 Hanks Balanced Salts (HBSS)에서 수회 헹굼한 후 HBSS 내에 0.4% 차아염소산 나트륨 내에 실온에서 30 분 동안 두었다. HBSS로의 몇회의 추가 헹굼 이후에, 상기 생검을 외과용 메스날을 사용하여 1 mm 조각으로 절단하고 헹굼하였다. 그 다음 조각들을 강한 항생제 및 글루코오스 (20 ng/ml EGF, 10 ng/ml FGF, 20 μg/ml인슐린, N₂ 보충물, 2 μg/ml 시프로플락신, 5 μg/ml 젠타마이신 및 3 μg/ml 글루코오스를 갖는 DMEM/F12)를 함유하는 Ml1 배지 내의 50% Accumax 용액으로 37℃에서 lh 동안 인큐베이션하고, 20 분에 한번씩 온화하게 교반하였다. 상기 분해된 시료를 함유하는 Accumax 용액을 100 마이크로미터 체를 이용하여 여과하였다. 생존력을 트리판 블루 기술을 사용하여 여과된 용액의 소량의 분취액상에서 측정하였다. 상기 용액을 그 다음 10 분 동안 200 g에서 원심분리하고 펠렛을 10% FBS를 함유하는 2 ml Ml1 배지에 재부유함으로써 Accumax 반응을 종결시켰다. 세포를 수 일 동안 Corning 울트라 낮은 부착력 플라스트 내에서 인큐베이션 한 후 추가 증폭을 위해 FBS 무함유 Ml1 배지로 옮겼다. CRCl 시료로부터의 세포를 수 주 동안 증폭시키고, 동결건조시키고 본 실험을 수행하기 직전에 해동시켰다.

세포를 2개의 다른 배양 조건 하에 성장시켰다. 우선, 세포를 포유동물 세포의 성장을 위한 표준 플라스틱 배지물에서 성장키고, 표면에 대한 세포 부착력을 향상시켰다. 구체적으로, 200,000 개의 세포를 DMEM + 5% 소 태아 혈청 (FBS) + 100 U/ml 페니실린 + lOOU/ml 스트렙토마이신 내의 75 cm² 플라스크 (Corning)에 시딩하였다.

2번째, 세포를 포유동물 세포가 전형적으로 미흡하게 결합하거나 전혀 결합하지 않는 낮은 부착력 배지물에서 성장시켰다. 구체적으로, 30,000 세포를 Ml1 배지 (20 ng/ml EGF, 10 ng/ml FGF, 20 μg/ml 인슐린, N₂ 공급물, 2 μg/ml 시프로플락신, 5 μg/ml 젠타마이신 및 3 μg/ml 글루코오스를 갖는 DMEM/F12) 내의 울트라 저 부착력 75 cm₂ 플라스크 (Corning)에서 성장시켰다. 성장 기간 이후에, 세포를 Accumax (Innovative Cell Technologies, Inc.)를 사용하여 FACS 분석 이전에 37℃에서 45분 동안 단일 세포 현탁액으로 재부유하여 분해시켰다. 표준 기술을 사용하여 세포를 그 다음 세포 표면 마커 LGR5 (Abgent, Inc.)의 N-말단 영역까지 항체로 염색하고, 상기 마커를 발현하는 세포의 퍼센트를 측정하기 위하여 FACS로 분류하였다. 모든 실험은 3회 수행되었다.

B. 결과

2개의 배양 조건 하에서의 세포의 성장에 의한 직장암 세포를 발현하는 LGR5의 상대적 백분률을 도 12이 나타내었다. 실험된 모든 세포주의 경우, 세포를 발현하는 LGR5의 백분률은 세포가 통상적인 조건 하에 성장된 것에 비해 (회색 막대) 낮은 부착성 배지 조건 (블랙 막대) 하의 스페로이드로서 성장될 경우, 더 높았다. 상기 패턴은 초기 직장암 세포주 (HT29 및 HCT116)로부터 유래한 세포 뿐만 아니라 전이성 직장암 세포주 (SW620 및 T84)에서도 마찬가지였다.

인간 초기 직장암의 생검으로부터 얻어진, CRC1 세포는 또한 낮은 부착성 배지 조건 하에서 성장시 LGR5를 발현하였다. 특정 실험의 경우, CRC1 세포는 통상적인 부착 조건 하에서 잘 성장하지 못하기 때문에, 세포가 부착 대 비-부착 조건 하에서 성장할 때 LGR5 발현의 수준을 직접 비교하는 것은 불가능하였다.

실시예 11 : 가스트린 유전자의 발현은 낮은 부착성 배지 조건 하에 직장암 세포가 성장함으로써 증가된다.

본 실시예는 낮은 부착성 배지 조건 하에 성장된, 초기 및 전이성 직장암 세포주 뿐만 아니라 생검 시료로부터의 세포 내의 가스트린 유전자의 발현에 미치는 효과를 기술한다. 그러한 조건 하에 암 줄기 세포는 풍부하다.

A. 방법

실험 세포를 초기 직장암 세포주 HT29, HCT116, RKO, SW480, 및 DLD1, 및 전이성 직장암 세포주 SW620 및 T84로부터 얻었다. 세포를 2개의 다른 배양 조건 하에 성장시켰다. 첫번째, 세포를 상기 기술된 바와 같이, 플라스틱에 대한 세포 표면을 증가시키는, 포유동물 세포의 성장을 위해 통사적인 배양물에서 성장시켰다. 두번째, 세포를 또한 상기 기술한 바와 같이, 포유동물 세포가 통상적으로 미흡하게 부착하는, 낮은 부착 배양물에서 성장시켰다. 성장 기간 이후에, 세포를 재부유하고, 용리시키고, 표준 기술을 사용하여 mRNA를 단리하였다. 가스트린 유전자의 발현을 그 다음 표준 기술에 따라 정량적인 RT-PCR를 사용하여 측정하였다. 각각의 실험을 3회 반복하였다.

B. 결과

통상적인 및 낮은 부착성 배지 조건 하에 실험된 3개의 세포에서 측정된 가스트린 mRNA의 상대적 수준을 도 13에 보고하였다. 수준은 RKO 초기 직장암 세포주 내에서 발현된 가스트린 mRNA의 양을 기준으로 표준화하였다. RKO 세포는 보통 낮은 수준의 프로가스트린을 발현한다. 상대적인 가스트린 mRNA 수준을 로그 크기로 보고하였음을 주목하다. 실험된 모든 세포주의 경우, RKO 세포를 제외하고는, 가스트린 유전자 발현이 세포가 통상적인 조건 (회색 막대)하에서의 성장과 비교할 때 낮은 부착성 배지 조건 하에서의 성장시 (블랙 막대), 더 많았으며, 때로는 몇 배 더 높았다.

실시예 12: 낮은 부착성 조건 하에 성장된 직장암 세포는 프로가스트린 단백질을 발현한다.

본 실시예는 낮은 부착성 배지 조간 하에 성장된, 초기 및 전이성 직장암 세포주, 뿐만 아니라 인간 초기 직장암으로부터 얻어진 생검 시료로부터 세포에 의한 프로가스트린 단백질의 발현을 기술한다.

A. 방법

실험된 세포는 초기 직장암 세포주 HT29, 및 전이성 직장암 세포주 SW620 및 T84로부터의 것이다. 인간 초기 직장 종양의 생검 세포로부터 단리된 세포를 실험하였다 (CRC1). 세포를 Ml1 배지 (페놀 레드 비함유) 내의 낮은 부착성 배지물에서 성장시켰다. 48 시간 후에, 상기 배지를 수거하고 5 분 동안 1,000 g에서 원심분리함으로써 세포 파쇄물을 제거하고, -80℃에서 동결시켰다. 세포를 Accumax를 사용하여 분해하고 카운트하였다. 분비된 프로가스크린을 측정하기 위하여, 동결된 배지를 아이스상에서 해동한 후 단백질 농축기(Icon, Pierce)를 사용하여 45분 동안 2,500 g에서 원심분리함으로써 500 ㎕의 부피까지 40-배 농축시켰다. 프로가스트린 농도를 샌드위치 ELISA 기술을 사용하여 측정하였다. 각각의 실험은 2회 반복하였다.

B. 결과

낮은 부착성 배지 조건 하에서의 성장 48 시간 이후에 직장 암세포에 의한 성장 배지로 분비된 프로가스트린의 농도를 도 14에 나타내었다. 하나의 초기 직장암 세포주, 2개의 전이성 직장암 세포주, 및 인간 초기 직장암으로부터 얻어진 생검 시료로부터의 세포를 포함하는, 모든 실험된 세포들은 낮은 부착성 배지 조건 하에서 스페로이드로서 성장될 때 프로가스트린을 분비하였다.

그러나, 상기 SW620 세포는 연구 하에 다른 세포주보다 프로가스트린을 실질적으로 덜 분비하였다. 데이터는 성장의 48 시간 마다 백만의 세포주 당 pM로 프로가스트린 농도로서 표현된 것이다.

실시예 13: 낮은 부착성 배지 조건 하에서 스페로이드로서 초기 직장암 세포의 성장에 미치는 항-프로가스트린 다중클론 항체의 효과

본 실시예는 낮은 부착성 배지 조건 하에 성장한, 초기 직장암 세포주, 뿐만 아니라 인간 초기 직장암으로부터 얻어진 생검 시료의 스페로이드로서 성장에 미치는 항-프로가스트린 다중클론 항체의 효과를 기술한다. 그러한 성장 조건은 암 줄기 세포를 풍부하게 한다.

A. 방법

실험된 세포는 초기 직장암 세포주 HT29 및 HCTl16, 뿐만 아니라 인간 초기 직장 종양 (CRC1)의 생검 시료로부터 단리된 세포로부터 수득하였다. 세포를 Ml1 배지 (20 ng ml EGF, 10 ng/ml FGF, 20 μg/ml 인슐린, N₂ 보충물질t, 2 μg/ml 시프로플락신, 5 μg/ml 젠타마이신 및 3 μg/ml 글루코오스를 갖는 DMEM/F12)의 낮은 부착 96-웰 플레이트 (Corning)의 웰 들에 시딩하였다. HT29 및 HCTl16 세포의 경우, 100 ㎕ 전체 500개의 세포를 처리 조건 마다 각각의 3 웰에 첨가한 반면, CRC1 세포의 경우 전체 500개의 세포를 100 ㎕로 처리 조건 당 각 10 개의 웰에 첨가하였다. 매 24시간 마다, 세포를 3 μg/ml의 다중클론 항-프로가스트린 항체, 또는 대조군 항체 (다중클론 토끼 항-인간 IgG, Affinity BioReagents, Ref #SA 1-600)로 처리하였다. HT29 및 HCTl16 세포에 처리한 지 10일, 및 CRC1 세포의 처리 14일 이후에, 각각의 웰 내의 세포 스페로이드의 수를 카운트하고, 각 웰 당 평균을 계산하였다. 실험을 수행한 기술자들은 실험되는 항체 용액의 함량과 관련하여 블라인드되었다. 각각의 실험은 2회 반복되었다.

B. 결과

도 15-17에 나타낸 바와 같이, 대조군 항체에 비해, 항-프로가스트린 다중클론 항체는 낮은 부착성 배양 조건 하에 성장된 초기 직장암 세포에 의해 형성된 세포 스페로이드의 수가 실질적으로 감소하였다.

실시예 14: 낮은 부착성 배양 조건 하에 스페로이드로서 초기 직장암 세포의 성장에 미치는 항-프로가스트린 단일클론 항체의 효과

본 실시예는 세포가 낮은 부착성 배양 조건 하에 성장될 때 2개의 초기 직장암 세포주로부터의 LGR5 양성 세포의 스페로이드로서 성장에 미치는 항-프로가스트린 단일클론 항체의 효과를 기술한다. 그러한 성장 조건은 암 줄기 세포를 풍부하게 한다.

A. 방법

실험 세포는 초기 직장암 세포주 HT29 및 HCTl16로부터의 것이다. 세포를 우선 FACS (FACSaria, BD Biosciences)에 의해 분류함으로써 암 줄기 세포 마커 LGR5를 발현하는 것들을 단리하였다. FACS의 경우, 2 x 10⁶ HT29 세포를 분류하고, 1 x 10⁶ HCTl16 세포를 분류한다. 세포를 LGR5의 N-말단에 특이적인 항체의 2 mg/1 x 10⁶ 세포로 표지하였다 (Abgent, Inc., No. AP2745A). FACS 이후에, LGR5 양성 세포를 100 ㎕ Ml 1 배지 (20 ng/ml EGF, 10 ng/ml FGF, 20 μg/ml 인슐린, N2 보충물, 2 μg/ml 시프로플락신, 5 μg/ml 젠타마이신 및 3 μg/ml 글루코오스를 갖는 DMEM/F12)내의 웰 마다 10 개의 세포 밀도로 낮은 부착 96-웰 플레이트의 30 웰에 배양하였다. 14일 동안 24시간 마다, 세포를 2개의 다른 항-프로가스트린 단일클론 항체 (MAb2 및 MAb3), 또는 대조군 단일클론 항체 (단일클론 마우스 항-인간 IgGl, Calbiochem, Ref #41 1451 ) 중 하나를 0.3 μg/ml로 처리하였다. 처리 종결시, 각각의 항체 종류의 존재시 형성된 세포 스페로이드의 수를 카운트하였다. 그 다음 세포를 배지가 추가 항체 처리 없이 매주 새로워지는 동안, 추가 17일 동안 성장시켰다. 기술자들은 실험되는 항체 용액의 함량과 관련하여 블라인드되었다.

B. 결과

각각 도 18A 및 도 19A에 나타낸 바와 같이, 낮은 부착성 배양 하에 14일에 걸쳐 스페로이드로서 성장시키기 위한 초기 직장암 세포주, HCTl16 및 HT29로부터의 LGR5 양성 세포의 능력은 대조군 단일클론 항체와 비교할 때 프로가스트린에 대한 2개의 별개의 단일클론 항체로 치료에 의해 감소되었다.

또한, 도 18B 및 도 19B에 나타낸 바와 같이, 스페로이드의 수는 외부적으로 첨가된 항체의 부재로 배양시 17일 동안 HCTl16 및 HT29 세포의 추가 인큐베이션 이후에 증가하지 않았다. 이 데이터는 항-hPG 항체에 의한 스페어 형성의 억제가 특정 항체가 제거된 이후에 지속됨을 의미한다.

실시예 15: 낮은 부착성 배지 조건 하에 스페로이드로서 초기 직장암 세포의 성장에 미치는 항-프로가스트린 단일클론 항체의 효과

본 실시예는 세포가 낮은 부착성 배지 조건 하에 성장시 CRC1 세포의 스페로이드로서 성장에 미치는 4개의 다른 항-프로가스트린 단일클론 항체의 효과를 기술한다. 그러한 성장 조건은 암 줄기 세포를 풍부하게 한다.

A. 방법

CRC1 세포를 표준 과정에 따른 인간 직장 암종 생검으로부터 수득하였다. 37℃에서 45 분 동안 Accumax (Sigma)에서 분해된 이후에, 세포를 Ml1 배지 (20 ng/ml EGF, 10 ng/ml FGF, 20 μg/ml 인슐린, N₂ 보충물, 2 μg/ml 시프로플락신, 5 μg/ml 젠타마이신 및 3 mg/ml 글루코오스를 갖는 DMEM/F12)의 웰 당 100개의 세포 밀도로 낮은 부착 96-웰 플레이트 (Corning)에 배양하였다. 각각의 처리 암 당, 10개의 웰을 사용하였다.

첫날 시작하고, 세포를 4개의 다른 항-프로가스트린 단일클론 항체, MAb5, MAb8, MAbl3 또는 MAbl6 (3 μg/ml)를 갖는 것 또는 동일한 농도의 단일클론 항체 P3X63Ag8 (ATCC, Ref TIB-9) 또는 대조군으로서 무첨가된 항체를 갖는 배지로 매일 2회씩 처리하였다. 그 이후에, 처리를 8일 동안 매일 수행하였다.

스페로이드를 후속의 카운트를 위해 사진찍었다. 모든 실험은 블라인드된 방법으로 수행하였다. 실험 종결 이후에, 각각의 처리 기술로부터의 스페로이드의 수를 카운트하였다.

B. 결과

결과를 도 20에 나타내었다. 각각의 항-hPG 단일클론 항체는 낮은 부착성 배지 조건 하에서 초기 직장암 세포에 의해 형성된 스페로이드의 수를 감소시키기에 유효하였다. 비-특이적 단일클론 항체 및 배지 단독과 비교하여, 모든 실험된 항체의 억제 효과는 Bonferroni post-hoc 실험으로 원-웨이 ANOVA를 사용하여 p < 0.05에서 통계학적으로 유의하였다. MAb5, MAb8 및 MAbl 3개는 모두 hPG의 C-말단 에피토프를 인식한 반면, MAbl6는 hPG의 N-말단 에피토프에 결합하였다 .

실시예 16: 낮은 부착성 배양 조건 하에 스페로이드로서 전이성 직장암 세포의 서장에 미치는 항-프로가스트린 단일클론 항체의 효과

본 실시예는 세포가 낮은 부착성 배지 조건 하에 성장될 때 전이성 직장암 세포주로부터 ALDH1 양성 세포의 스페로이드로서 성장에 미치는 항-프로가스트린 단일클론 항체의 효과를 기술한다.

A. 방법

실험된 세포는 전이성 직장암 세포주 T84로부터의 것이다. 세포를 우선 FACS (FACSaria, BD Biosciences)로 분류함으로써 ALDEFLUOR 키트 (Stemcell Technologies)를 사용하여 암 줄기 세포 마커 ALDH1를 발현하는 것들을 단리하였다.

FACS 이후에, ALDH1 양성 세포(즉, 검출가능한 ALDHl 효소 활성을 나타나는 것들)을 100 ㎕ Ml1 배지 (20 ng/ml EGF, 10 ng/ml FGF, 20 μg/ml 인슐린, N₂ 보충물, 2 μg/ml 시프로플락신, 5 μg/ml 젠타마이신 및 3 μg ml 글루코오스를 가지는 DMEM/F12) 내의 웰 마다 100 세포의 밀도로 낮은 부착 96-웰 플레이트의 웰에 배양하였다. 11일 동안 매 24시간 마다, 세포를 항-프로가스트린 단일클론 항체 (MAb3)의 3개의 다른 농도 (0.01 μg/ml, 0.1 μg/ml 또는 1 μg/ml), 또는 대조군 단일클론 항체 (단일클론 마우스 항-인간 IgGl, Calbiochem, Ref #41 1451)의 1 μg/ml 중 하나로 처리하였다. 처리의 종료시, 각 항체의 존재 하에 형성된 세포 스페로이드의 수를 카운트하였다. 본 실험을 수행한 기술자들은 실험된 항체 용액의 함량과 관련하여 블라인드되었다.

B. 결과

도 21에 나타낸 바와 같이, 낮은 부착성 배지 내의 스페로이드로서의 성장에 대한 T84 전이성 직장암 세포주로부터의 ALDHl 양성 세포의 능력은 대조군 단일클론 항체에 비해, 프로가스트린에 대한 단일클론 항체로 처리함으로써 용량 의존적 방법으로 감소하였다.

실시예 17: 낮은 부착성 배양 조건 하에 스페로이드로서 초기 직장암 세포에 미치는 항-프로가스트린 단일클론 항체의 전-처리 효과

본 실시예는 통상적인 배양 조건 하에 ALDHl 양성 CRCl 세포의 성장 및 세포를 낮은 부착성 배양 조건으로 옮겼을 때의 스페로이드로서의 성장에 미치는 4개의 다른 항-프로가스트린 단일클론 항체를 사용하여 전처리한 효과를 기술한다.

A. 방법

CRCl 세포를 표준 방법에 따라 인간 직장 암종 생검으로부터 수득하였다. 37℃에서 45분 동안 Accumax (Sigma)에서 분해된 이후에, CRCl 세포(100,000 세포/웰)를 항-hPG 단일클론 항체 MAb5, MAb8, MAbl3 또는 MAbl6의 존재 또는 부재 하에 72 시간 동안 혈청 무함유 DMEM 배지 내의 통상적인 부착 배치 조건 하에 성장시켰다. 실험은 블라인드 방식으로 수행하였다.

처리 기간의 종료시, 2개의 다른 검정법을 상기 세포 상에 수행하였다. 첫째, ALDHl를 발현하는 세포, 직장암 줄기 세포의 마커의 백분율을 FACS로 측정하였다. 2번째 검정법에서, 각각의 처리 그룹의 경우, 200 세포/웰을 bFGF 및 EGF가 보충된 혈청-무함유 M1l 배지 500 ㎕ 내의 낮은 부착 24-웰 플레이트 중 6개의 웰에서 배양하고, 추가 처리 없이 7일 동알 성장시켰다. 이 기간의 종료시, 사진을 찍고 각 웰 당 스페로의 수를 카운트한 후 스페어 표면 영역을 측정하였다.

B. 결과

상기 결과를 도 22 및 도 23에 나타내었다. 실험된 4개의 항-hPG 단일클론 항체 각각은 대조군과 비교하여 ALDH1를 발현하는 CRC1 초기 직장암 세포의 수를 감소시시기 위하여 통상적인 부착 배지 내에서 3일 이후에 유효하였다. 상기 각각의 항체는 또한 항체가 제거되고 상기 세포가 추가 7일 동안 성장한 이후에 낮은 부착성 배지 조건에서 초기 직장암 세포에 의해 형성된 스페로이드의 수를 감소시키기에 유효하였다. 대조군과 비교해보면, MAb5, MAb8 및 MAbl6의 억제 효과는 Bonferroni post-hoc 실험으로 원-웨이 ANOVA를 사용하여 p < 0.05에서 통계적으로 유의하였다. 비록 MAbl3가 또한 대조군에 비해 스페로이드의 수가 감소하였지만, 그것의 효과는 통계적인 유의도에 도달하지 않았다.

실시예 18: 낮은 부착성 배지 조건 하에 스페로이드로서 전이성 직장암 세포의 성장에 미치는 항-프로가스트린 단일클론 항체의 전-처리 효과

본 실시예는 세포가 낮은 부착성 배지 조건 하에서 성장할 때 2개의 전이성 직장암 세포주로부터의 ALDH1 양성 세포의 스페로이드로서 성장에 항-프로가스트린 단일클론 항체를 사용한 전처리의 효과를 기술한다.

A. 방법

실험 세포는 전이성 직장암 세포주 T84 및 SW620로부터의 것이었다. 세포를 항-프로가스트린 단일클론 항체 MAb3 (1 μg/ml), 대조군 단일클론 항체, 화학요법제 5-플루오로우라실 (5FU 10μΜ), 또는 용매 디메틸 설폭사이드 (DMSO)의 존재 하에 72 시간 동안 통상적인 부착 배양물에서 우선 성장시켰다. 처리 이후에, 세포를 2개의 검정법에 제공하였다. 우선, 암 줄기 세포 마커 ALDH1에서의 세포 양성 백분율을 ALDEFLUOR 키트 (Stemcell Technologies)를 사용하여 측정하였다. 제2검정법에서, 각각의 처리 그룹의 경우, 세포를 bFGF 및 EGF를 함유하는 혈청-무함유 배지 100 ㎕에서 각 웰 마다 500개의 세포의 밀도에서 낮은 부착 96 웰-플레이트의 7개의 웰로 배양하고, 추기 처리 없이 11일 동안 성장시켰다. 상기 기간의 종결 이후에, 각 웰 당 스페로이드의 수를 카운트하였다.

B. 결과

각각, 도 24 및 도 25에 나타낸 바와 같이, ALDH1 양성 T84 및 SW620 전이성 직장암 세포의 수는 대조군 단일클론 항체로 처리한 것에 비해, 항-프로가스트린 단일클론 항체로 72 시간 동안 전-처리 결과로서 감소하였다.

각각, 도 26 및 도 27에 나타낸 바와 같이, 낮은 부착성 배지에서 스페로이드로서 성장하기 위한 T84 및 SW620 전이성 직장암 세포의 능력은 대조군 단일클론 항체에 비해 프로가스트린에 대한 단일클론 항체로 72 시간 동안 전-처리에 의해 감소되었다.

실시예 19: 항-프로가스트린 항체는 인비보에서 새로운 종양의 개시를 감소시킨다.

본 실시예는 이식 이후의 새로운 종양을 형성하기 위한 누드 마우스에서 성장하는 인간 전이성 직장암으로부터 단리된 세포의 능력에 미치는 인간 프로가스트린에 특이적인 단일클론 항체의 효과를 기술한다.

A. 방법

표준 기술 하에, 면역결핍 BALBc/누드 마우스를 면역결핍 BALBc/누드 마우스의 유전자내(intra-splenic) 주입으로 제공하였다. 상기 마우스에 그 다음 전체 6주 동안 매 주 2회씩 항-hPG 단일클론 항체 MAb3 또는 대조군 단일클론 항체를 투여하였다. 각각의 항체의 경우, 상기 용량은 8mg/kg이었다. 처리 기간의 종료시, 상기 조직을 처리된 것뿐만 아니라 대조군 마우스의 전이로부터 절단하였다. 종양 세포를 Accumax로 절단된 조직의 처리에 의해 분해하고 여과한 후 카운트하였다. 전체 23,800개의 생존가능한 종양 세포를 MAb3로 처리된 마우스의 전이성 조직으로부터 수득하고, 36,400 개를 대조군 마우스로부터 수득하였다.

상기 단리된 세포를 그 다음 상기 세포가 낮은 부착성 배지 조건 하에서 스페로이드로서 성장할 수 있고 그들이 새로운 숙주로 이식될 경우 새로운 종양을 개시할 수 있으면 실험에 의해 암 줄기 세포의 표현형 특성을 보이는지 여부를 측정하기 위하여 실험하였다. 스페로이드 실험에서, 처리된 것과 대조군 세포 각각의 경우, 2,000 세포/웰을 bFGF 및 EGF가 보충된 Ml1 배지에서 낮은 부착 배양물의 5개의 웰로 시딩하였다. 세포를 7일 동안 성장시킨 후 각각의 웰에 형성된 스페로이드의 수를 카운트하였다. 이식 실험의 경우, 처리 및 대조군 전이로부터 단리된 세포로부터 발전한 스페로이드를 풀링하고 분해하여 카운트하였다. 전체 20,000 개의 세포를 처리된 전이로부터 유도된 스페로이드로부터 얻었고, 110,000 개의 세포를 대조군 전이로부터 유도된 스페로이드로부터 얻었다. 새로운 BALBc/누드 마우스를 그 다음 처리 또는 대조군 세포의 동일한 수로 이식하였다. 구체적으로, 처리된 전이로부터 유도된 6,500 개의 종양 세포를 마우스의 왼쪽 허벅지에 피하로 주입한 반면, 동일한 대조군 세포를 오른쪽 허벅지에 피하 주입하였다. 이 방법에서, 각각의 마우스는 그것의 고유의 대조군을 제공받았다. 종양 부피는 그 다음 두 동물에서 시간의 흐름에 따라 계산되었다.

B. 결과

도 28에 나타낸 바와 같이, 인 비보로부터 단리된 인간 전이성 직장암 세포의 낮은 부착성 배지에서 스페로이드로서 성장은 대조군 단일클론 항체의 동일한 용량으로 처리한 경우에 비해 항-프로가스트린 단일클론 항체 MAb3으로 동물을 처리함으로써 감소되었다.

도 29에 나타낸 바와 같이, 인 비보 전이로부터 단리된 전이성 직장암 세포의 이식 이후에 성장된 새로운 종양의 개시하기 위한 능력은 대조군 단일클론 항체의 동일한 용량으로 처리한 경우에 비해, 항-프로가스트린 단일클론 항체 MAb3로 세포를 처리함으로써 감소되었다. 그래프에서, Y-축은 mm³ 단위의 종양 부피를 나타낸다. 필드된 스페어는 대조군 단일클론 항체로 처리된 마우스에서 성장한 전이성으로부터 유도된 전이성 직장암 세포로 피하 주입된 누드 마우스 중 하나의 종양 부피 데이터 포인트를 나타낸다. 반면, 오픈된 스페어는 MAb3 항-프로가스트린 단일클론 항체로 처리된 마우스에서 성장한 전이로부터 유도된 전이성 직장암 세포로 반대 허벅지에서 주입된 동일한 마우스의 데이터 포인트를 나타낸다. 필드되고 오픈된 다이아몬드는 실험에서 사용된 제2의 누드 마우스로부터 수거한 동일한 데이터를 나타낸다.

실시예 20: 혈장 또는 혈청 PG 수준의 정량화

PG의 혈장 및/또는 혈청 수준은 하기의 검정법을 사용하여 통상적으로 측정될 수 있다. 96-웰 미세역사 플레이트를 본원에 기술된 C-말단 항-hPG 항체, 예를 들면, 토끼 C-말단 항-hPG 다중클론 항체, 또는 C-말단 항-hPG 항체를 0.5 내지 10 μg/mL로 코팅하고, 그 다음 하룻밤 인큐베이션하였다. 플레이트를 PBS-Tween (0.05%) 로 3회 세정하고 PBS-Tween (0.05%)에서 2% (w/v) 무지방 건조유로 차단하였다. 각각, 실험 시료, 대조군 시료 (블랭크 또는 PG-음성 혈장 또는 혈청 시료), 및 hPG 참조 표준 약 5 pM (0.5 x 10^-11 M) 내지 약 0.1 nM (1x10^-10 M) (PG-음성 혈장 또는 혈청에서 희석된 동결건조 hPG)를 적절한 희석제 (예를 들면, PBS-Tween 0.05%)로 제조하였다. 시료를 37℃에서 2 내지 4 시간, 또는 선택적으로 21 ℃에서 12 내지 16 시간 동안 코팅된 플레이트 상에서 인큐베이션하였다. 인큐베이션 이후에, 상기 플레이트를 PBS-Tween (0.05%)로 3회 세정하고 본원에 기술된 N-말단 항-hPG 항체, 예를 들면, 다중클론 N-말단 항-hPG 항체 또는 N-말단 단일클론 항-hPG 항체 0.001 내지 0.1 μg/mL로 인큐베이션한 후, 21 ℃에서 30분 동안 호스라디시 퍼옥사이드 (horseradish peroxidase, HRP)에 결합하였다 (문헌 [Nakane et al., 1974, J. Histochem. Cytochem. 22(12): 1084-1091] 참고). 플레이트를 그 다음 PBS-Tween (0.05%에서 3회 세정하고 HRP 기재를 21 ℃에서 15분 동안 첨가하였다. 상기 반응을 0.5M 설폰산 100 ㎕을 첨가함으로써 종료하고 광 밀도 측정을 405 nm에서 수행하였다. 실험 시료의 hPG 수준을 hPG 참조 기준으로부터 유도된 측정값으로부터 생성된 표준 곡선과 비교함으로써 측정하였다.

실시예 21 : 항-hPG 항체의 특이성을 평가하기 위한 ELISA 검정법

항-hPG 항체의 특이성은 하기와 같이 ELISA 검정법을 사용하여 통상적으로 측정할 수 있다. 96-웰 플레이트를 포스페이트-완충된 살린 (PBS)에서 실험 폴리펩티드 (예를 들면, 25 및 50 ng 재조합 인간 PG, 및 50 및 250 ng CTFP 또는 다른 가스트린-유도된 유전자 산물)의 적절한 농도(들)로 4℃에서 하룻밤 인큐베이션하고, 그 이후에 상기 웰들을 세정 용액 (PBS 및 0.1 % Tween-20)으로 3회 세척한 후 웰 당 100 ㎕차단 용액 (PBS, 0.1 % Tween-20, 0.1% 보빈 혈청 알부민 또는 카제인 가수분해물)로 22℃에서 2 시간 동안 인큐베이션하였다. 차단 이후에, 상기 웰들을 3회 세척하고, 검정된 항체 (실험 항체)를 첨가하였다. PBS 및 0.1% Tween-20 내의 실험 항체 100 ㎕(0.3 내지 1 ng/mL)를 각 웰에 첨가하였다. 그 다음 플레이트를 22℃에서 2 시간 동안 인큐베이션하고, 그 다음 실험 항체 용액을 버린 후, 세정 단계 (상기 기술한, 3X 100 ㎕ 세정 용액) 이후에 호스라디시 퍼올사이드에 결합된 제2항체, 염소 항-마우스 IgG (Fc) 항체를 함유하는 차단 용액으로, 교체하였다. 제2항체로 1-시간 인큐베이션 한 이후, 기재 용액 (예를 들면, 제조사의 사용지시에 따라 제조된, Sigma-Aldrich Co.로부터 입수가능한, Fast OPD, 또는 O-페닐렌디아민 디히드로클로라이드 ) 100 ㎕를 각 웰에 첨가하고 22℃에서 20분 동안 어둠에서 인큐베이션하였다. 상기 반응을 4N 설폰산 50 ㎕를 첨가함으로써 종결하고, 촉진된 기재의 양을 광 밀도 (O.D.)를 사용하여 492 nm에서 측정하였다. 기재 전환은 항원에 결합된 초기 (실험) 항체의 양에 비례하였다. 실험은 2번 수행되었고 OD 측정값은 항원 농도의 함수로서 플롯팅하였다. 실험 항체는 측정된 O.D.가 hPG에서 0.2 내지 1.5인 경우 PG에 특이적인 것으로 점수화되었고, 백그라운드가 PBS 만을 함유하는 대조군 웰로부터 평균 시그날인 경우, CTFP 또는 펩티드로부터 유도된 다른 가스트린-유전자로 상기 백그라운드 이상의 통계적으로 유의성이 없었다.

실시예 22: 항-hPG 항체 의 중화 활성을 평가하기 위함 검정법

특이적 항-hPG 항체가 중화되는지 여부를 평가하기 위한 특정 실험은 하기와 같이 수행될 수 있다. 직장암 세포를 대략적으로 웰 당 50,000 내지 100,000 세포로, 6-웰 플레이트에 시딩하였다. 그 다음, 세포를 약 5 μg/mL의 항체 농도에서, 실험 항-hPG 항체 또는 대조군 항체로 48 시간 동안 12 시간의 간격으로 시험하였다. 실험 항체를 2-꼬리 Mann-Whitney 실험 (차이점은 p<0.05일 때 유의도로서 고려된다)를 사용하여, 시험 항체로 처리된 세포의 수가 대조군, 비-특이적 항체로 처리된 세포의 통계적 유의적 감소를 나타내는 경우 검정법에서 중성으로 정의하였다. 전체 세포의 수를 처리 기간의 시작시 세포의 수에서 수거하고, 이를 To로 나타내었다. 본 검정법에서 사용하기 위한 예시적인 직장암 세포는 본원에 기술된 초기 및 전이성 직장암 세포주를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.

실시예 23: 항-hPG 항체의 친화도를 평가하기 위한 검정법

항-hPG 항체의 친화도는 문헌 [Nahshol et al., 2008, Analytical Biochemistry 383:52-60]에 따라, Proteon Technique (BioRad)를 사용하여 측정될 수 있으며, 상기 문헌의 전체 내용은 참조로서 본원에 통합된다. 간단히, 뮤린 항-PG 항체의 경우, 우선 항-마우스 IgG 항체 (50 μg/ml)를 센서 칩 상에 코팅함으로써 항체의 주입이 10,000 내지 11,500 반응 단위 (response unit, RU)로 이루어진 이후에 상기 칩에 의해 검출된 시그날을 확인하였다. 그 다음 관심의 뮤린 항-hPG 항체 (실험 항체)를 (전형적인 농도 30 μg/ml로) 주입하였다. 실험 항체가 충분히 결합하는 경우, 적어도 500 RU의 추가적 신호가 관찰될 것이다. 실험 항체와 hPG 사이의 결합의 시간-과정은 그 다음 hPG의 농도를 달리하여, 예를 들면 200 nM, 100 nM, 50 nM, 25 nM, 및 12.5 nM를 주입하고, 결합 수준을 검출함으로써 얻어진다. 전형적으로, 다수의 채널이 단일 실험 내에서 평행한 다수의 항체를 실험하기 위하여 이용됨으로써 평행한 hPG의 다른 농도에서 단일 실험 항체의 결합을 검정하는 것이 가능하다. 일 채널에는 비-특이적 결합에서 대조군으로서 hPG에 특이적이지 않은 뮤린 단일클론 항체가 주입되어야 하고 다른 채널은 백그라운드 시그날에서 기준선으로서 희석 완충액 만이 주입되어야 한다. 일반적으로, 어떤 결합도 비-특이적 뮤린 항체가 주입된 채널에서는 검출불가능하다. hPG에 의해 포획된 단일클론 항체를 포화시킬 수도 있는, 본 설정과 관련된 높은 수준을 나타내는 항체는 낮은 hPG 농도 (50 nM, 25 nM, 12.5 nM, 6.25 nM 및 3.125 nM)로 실험될 수 있으므로, 더 정확한 측정을 가능하게 한다.

친화도 (Affinity constant, K_D)는 해리 상수(dissociation constant, K_D)와 결합 상수 (association constant, K_a)의 비율로서 계산될 수 있다. 실험값은 결합 측정을 기초로 한 실험 곡선과 이론적 프로파일 사이의 통계적인 관련 유사도를 분석함으로써 입증된다.

비-뮤린 항-hPG 항체의 친화도는 항-hPG 실험 항체의 기원 종에 특이적인 IgG를 사용하여 유사한 방법으로 평가될 수 있다.

실시예 24: 참조 항-hPG 항체로 경쟁 결합을 평가하기 위한 검정법

관심의 항체 (실험 항체)가 비오틴화된 참조 항-hPG 항체와 hPG에 결합하기 위해 경쟁하는지 여부를 평가하기 위한 특이적 검정법은 하기와 같이 수행될 수 있다. 96-웰 플레이트를 4℃ (0.1 내지 1 μg/웰)에서 하룻밤, 1-10 μg/ml의 범위 내에서 선택된 농도에서, 포획 항-hPG 항체 (비오틴화된 참조 항-hPG 항체에 의해 인식되는 에피토프와 다른 hPG의 N- 또는 C-말단 영역을 인식하는 다중클론 또는 단일클론 항체)로 코팅하였다. 22℃에서 2 hr 동안 차단 완충액 (PBS 내의 0.1% Tween-20, 0.1 % BSA)으로 차단된 이후에, 재조합 hPG를 10 pM 내지 1 nM (10 내지 1000 pg/웰) 사이의 범위의 농도로 첨가하고 22℃에서 2 hr 동안 인큐베이션하였다. 그 이후에, 비오틴화된 참조 항-hPG 항체 (또는 비오틴화된 참조 항-hPG 항체를 함유하는 혼합물)을 비표지된 실험 항체의 농도를 증가시키면서, 첨가하고 22℃에서 1 hr 동안 인큐베이션하였다. 비결합된 항체를 제거하기 위하여 세정한 이후에, 결합된 표지 참조 항-hPG 항체를 검출하기 위하여 호스라디시 퍼옥사이드를 형광 기재로 인큐베이션한 후, 22℃에서 1 hr 동안 스텝타비딘-HRP 50 ng/ml와 상기 혼합물을 인큐베이션하고, 발광측정기에서 상대적 광 단위(relative light unit, RLU)를 정량화하였다. 검정법은 이중으로 수행하였다.

참조 항-hPG 항체와 경쟁하는 항체는 hPG에 대한 참조 항체의 결합을 억제한다. 실질적으로 동일한 에피토프에 결합하거나, 또는 참조 항체로서, 중복되는 에피토프를 갖는 항체는 관찰된 RLU 감소로 입증된 바와 같이, 결합된 참조 항-hPG 항체의 양을 유의적으로 감소시켰다 (예를 들면, 적어도 50% 까지).

높은 대조군 수치는 실험 항체 없이 재조합 hPG를 갖는 표지된 참조 항체를 인큐베이션함으로써 수행하였다. 낮은 대조군 수치는 비표지된 참조 항체 (hPG에 결합하기 위하여 표지된 항체와 결합하는 비표지된 참조 항체)의 과량의 농도의 존재 하에 표지된 참조 항체를 재조합 hPG와 인큐베이션함으로써 수행한 대조군 실험으로부터 얻었다. 참조 항-hPG 항체와 경쟁하는 실험 항체의 능력은 그 다음 비표지된 실험 항체의 증가된 농도의 존재 하에 표지된 참조 항체를 재조합 hPG와 인큐베이션함으로써 측정되었다.

실험 검정법에서, 실험 항체의 존재 하에 관찰된 RLU의 유의적 감소는 실험 항체가 참조 항-hPG 항체와 실질적으로 동일한 에피토프를 인식함을 나타낸다.

결합 억제는 하기의 공식에 따라 계산되는 억제 상수, K_i로 표현될 수 있다:

K_i = IC₅₀ / (1 + ([참조 항-hPG Ab 농도]/K_D ^{참조 항- hPG Ab}))

상기 식에서, "IC₅₀"은 참조 항체의 결합에서의 50% 감소를 생산하는 실험 항체의 농도를 의미하고, K_D ^{참조 항- hPG Ab 는} 참조 항-hPG 항체의 해리 상수, hPG에 대한 그것의 친화도의 측정값을 나타낸다. 참조 항-hPG 항체와 경쟁하기에 유용한 실험 항체 (예를 들면, 본원에 기술된 항-hPG 항체 중 하나)는 전형적으로 본원에 기술된 검정 조건 하에서 10 pM 내지 100 nM 범위의 K_i를 가질 것이다.

본 출원에 인용된 모든 간행물, 특허, 특허출원 및 다른 문서들은 각각의 간행물, 특허, 특허출원 및 다른 문서들이 개별적으로 모든 목적을 위하여 참조로서 통합됨을 나타내는 것과 동일한 정도로 모든 목적을 위하여 그들의 전체 내용은 참조로서 본원에 통합된다.

다양한 구체적인 구현예가 예시되거 기술되어 있지만, 다양한 변형들이 본 발명(들)의 정신 및 범위를 벗어남이 이루어질 수 있는 것으로 이해될 것이다.

SEQUENCE LISTING <110> Biorealites Erkilic, Nejla Floch, Jean-Francois Framery, B?r?nice Hollande, Fr?d?ric Houhou, Le?la Joubert, Dominique Pannequin, Julie <120> METHODS FOR TREATING COLORECTAL CANCER <130> 382657-002WO (105306) <150> 61/293,612 <151> 2010-01-08 <150> 61/367,855 <151> 2010-07-26 <160> 106 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1 Gly Tyr Ile Phe Thr Ser Tyr Trp 1 5 <210> 2 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 2 Phe Tyr Pro Gly Asn Ser Asp Ser 1 5 <210> 3 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 3 Thr Arg Arg Asp Ser Pro Gln Tyr 1 5 <210> 4 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 4 Gln Ser Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr 1 5 10 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Phe Gln Gly 85 90 95 tca cat gtt ccg ttc acg ttc gga ggg ggg acc aag ctg gaa ata aaa 336 Ser His Val Pro Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 18 <211> 354 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <221> CDS <222> (1)..(354) <400> 18 cag gtt cag ttg cag cag tct gga gct gag ctg atg aag cca ggg gcc 48 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Met Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 tca gtg aag ata tcc tgc aag gct act ggc tac aca ttc agt agc tcc 96 Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Thr Gly Tyr Thr Phe Ser Ser Ser 20 25 30 tgg ata gag tgg tta aaa cag agg cct gga cat ggc ctt gag tgg att 144 Trp Ile Glu Trp Leu Lys Gln Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 gga gag ttt tta cct gga agt ggt agt aca gac tac aat gag aag ttc 192 Gly Glu Phe Leu Pro Gly Ser Gly Ser Thr Asp Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 aag ggc aag gcc aca ttc act gca gac aca tcc tcc gac aca gcc tac 240 Lys Gly Lys Ala Thr Phe Thr Ala 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aaa gtt tcc aac cga ttt tct ggg gtc cca 192 Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 gac agg ttc agt ggc agt gga tca ggg aca gat ttc aca ctc aag atc 240 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 agc aga gtg gag gct gag gat ctg gga gtt tat ttc tgc tct caa agt 288 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Ser 85 90 95 aca cat gtt cct ccc acg ttc ggc tcg ggg aca aag ttg gaa ata aaa 336 Thr His Val Pro Pro Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 20 <211> 80 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 20 Ser Trp Lys Pro Arg Ser Gln Gln Pro Asp Ala Pro Leu Gly Thr Gly 1 5 10 15 Ala Asn Arg Asp Leu Glu Leu Pro Trp Leu Glu Gln Gln Gly Pro Ala 20 25 30 Ser His His Arg Arg Gln Leu Gly Pro Gln Gly Pro Pro His Leu Val 35 40 45 Ala Asp Pro Ser Lys Lys Gln Gly Pro Trp Leu Glu Glu Glu Glu Glu 50 55 60 Ala Tyr Gly Trp Met Asp Phe Gly Arg Arg Ser Ala Glu Asp Glu Asn 65 70 75 80 <210> 21 <211> 115 <212> PRT 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<213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 24 Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser 20 25 30 Ser Gly Val Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Ser 85 90 95 Thr His Val Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 25 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 25 Ser Trp Lys Pro Arg Ser Gln Gln Pro Asp Ala Pro Leu Gly 1 5 10 <210> 26 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (15)..(15) <223> Ahx <400> 26 Ser Trp Lys Pro Arg Ser Gln Gln Pro Asp Ala Pro Leu Gly Xaa Cys 1 5 10 15 <210> 27 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<220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 37 Gly Phe Thr Phe Thr Thr Tyr Ala 1 5 <210> 38 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 38 Gly Phe Ile Phe Ser Ser Tyr Gly 1 5 <210> 39 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 39 Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Tyr 1 5 <210> 40 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 40 Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp Tyr Ala 1 5 <210> 41 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 41 Ile Ser Ser Gly Gly Thr Tyr Thr 1 5 <210> 42 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 42 Ile Asn Thr Phe Gly Asp Arg Thr 1 5 <210> 43 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 43 Ile Asn Pro Ser Asn Gly Gly Thr 1 5 <210> 44 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 44 Ile Ser Phe Ser Gly Tyr Thr 1 5 <210> 45 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 45 Ala Thr Gln Gly Asn Tyr Ser Leu Asp Phe 1 5 10 <210> 46 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 46 Ala Arg Gly Thr Gly Thr Tyr 1 5 <210> 47 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 47 Thr Arg Gly Gly Tyr Tyr Pro Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 48 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 48 Ala Arg Glu Val Asn Tyr Gly Asp Ser Tyr His Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 49 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 49 Lys Ser Leu Arg His Thr Lys Gly Ile Thr Phe 1 5 10 <210> 50 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 50 Gln Ser Leu Leu Asp Ser Asp Gly Lys Thr Tyr 1 5 10 <210> 51 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 51 Ser Gln His Arg Thr Tyr Thr 1 5 <210> 52 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 52 Gln Met Ser 1 <210> 53 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 53 Leu Val Ser 1 <210> 54 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 54 Val Lys Lys Asp Gly Ser His 1 5 <210> 55 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 55 Ala Gln Asn Leu Glu Leu Pro Leu Thr 1 5 <210> 56 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 56 Trp Gln Gly Thr His Phe Pro Gln Thr 1 5 <210> 57 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 57 Trp Gln Gly Thr His Ser Pro Tyr Thr 1 5 <210> 58 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 58 Gly Val Gly Asp Ala Ile Lys Gly Gln Ser Val Phe Val 1 5 10 <210> 59 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 59 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Thr Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Thr Ile Ser Ser Gly Gly Thr Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ala Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Thr Gln Gly Asn Tyr Ser Leu Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr Ser 100 105 110 Leu Thr Val Ser Ser 115 <210> 60 <211> 114 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 60 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ile Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ser Pro Asp Arg Arg Leu Glu Leu Val 35 40 45 Ala Ser Ile Asn Thr Phe Gly Asp Arg Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Thr Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Thr Gly Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val 100 105 110 Ser Ser <210> 61 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 61 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Tyr Met Tyr Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Glu Ile Asn Pro Ser Asn Gly Gly Thr Asn Phe Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Ser Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Arg Gly Gly Tyr Tyr Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr 100 105 110 Leu Thr Val Ser Ser 115 <210> 62 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 62 Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Ser Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp 20 25 30 Tyr Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp 35 40 45 Met Gly Tyr Ile Ser Phe Ser Gly Tyr Thr Ser Tyr Asn Pro Ser Leu 50 55 60 Lys Ser Arg Ile Ser Val Thr Arg Asp Thr Ser Arg Asn Gln Phe Phe 65 70 75 80 Leu Gln Leu Thr Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Val Asn Tyr Gly Asp Ser Tyr His Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Ile Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 63 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 63 Asp Ile Val Met Thr Gln Ala Ala Ser Ser Asn Pro Val Thr Leu Gly 1 5 10 15 Thr Ser Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Arg His Thr 20 25 30 Lys Gly Ile Thr Phe Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Gln Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Ser Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Arg Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Ala Gln Asn 85 90 95 Leu Glu Leu Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105 110 <210> 64 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 64 Asp Val Val Leu Thr Gln Thr Pro Leu Thr Leu Ser Val Thr Ile Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser 20 25 30 Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly 85 90 95 Thr His Phe Pro Gln Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 65 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 65 Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Thr Leu Ser Val Thr Ile Gly 1 5 10 15 Arg Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser 20 25 30 Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Tyr Trp Leu Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Glu Leu Asp Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Ile Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly 85 90 95 Thr His Ser Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 66 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 66 Gln Leu Ala Leu Thr Gln Ser Ser Ser Ala Ser Phe Ser Leu Gly Ala 1 5 10 15 Ser Ala Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser Gln His Arg Thr Tyr Thr 20 25 30 Ile Glu Trp Tyr Gln Gln Gln Ser Leu Lys Pro Pro Lys Tyr Val Met 35 40 45 Glu Val Lys Lys Asp Gly Ser His Ser Thr Gly His Gly Ile Pro Asp 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Ala Asp Arg Tyr Leu Ser Ile Ser 65 70 75 80 Asn Ile Gln Pro Glu Asp Glu Ala Ile Tyr Ile Cys Gly Val Gly Asp 85 90 95 Ala Ile Lys Gly Gln Ser Val Phe Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val 100 105 110 Thr Val Leu 115 <210> 67 <211> 351 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <221> CDS <222> (1)..(351) <400> 67 gaa gtg cag ctg gtg gag tct ggg gga ggc tta gtg aag cct gga ggg 48 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 tcc ctg aaa ctc tcc tgt gca gcc tct gga ttc act ttc act acc tat 96 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Thr Tyr 20 25 30 gcc atg tct tgg gtt cgc cag act ccg gag aag agg ctg gag tgg gtc 144 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val 35 40 45 gca acc att agt agt ggt ggt act tac acc tac tat cca gac agt gtg 192 Ala Thr Ile Ser Ser Gly Gly Thr Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val 50 55 60 aag ggt cga ttc acc atc tcc aga gac aat gcc aag aac gcc cta tac 240 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ala Leu Tyr 65 70 75 80 ctg caa atg agc agt ctg agg tct gag gac acg gcc atg tat tac tgt 288 Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 gca aca cag ggg aat tac tct ttg gac ttc tgg ggc caa ggc acc tct 336 Ala Thr Gln Gly Asn Tyr Ser Leu Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr Ser 100 105 110 ctc aca gtc tcc tca 351 Leu Thr Val Ser Ser 115 <210> 68 <211> 342 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <221> CDS <222> (1)..(342) <400> 68 gag gtg cag ctg gtg gag tct ggg gga ggc ttg gtg cag cct gga ggg 48 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 tcc ctg aaa ctc tcc tgt gca gcc tct gga ttc att ttc agt agc tat 96 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ile Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 ggc atg tct tgg gtt cgc cag tct cca gac agg agg ctg gag ttg gtc 144 Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ser Pro Asp Arg Arg Leu Glu Leu Val 35 40 45 gca agt att aat act ttt ggt gat aga acc tat tat cca gac agt gtg 192 Ala Ser Ile Asn Thr Phe Gly Asp Arg Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val 50 55 60 aag ggc cga ttc acc atc tcc aga gac aat gcc aag aac acc ctg tac 240 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 ctg caa atg acc agt ctg aag tct gag gac aca gcc att tat tac tgt 288 Leu Gln Met Thr Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys 85 90 95 gca aga ggg acc gga acc tac tgg ggc caa ggc acc act ctc aca gtc 336 Ala Arg Gly Thr Gly Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val 100 105 110 tcc tca 342 Ser Ser <210> 69 <211> 351 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <221> CDS <222> (1)..(351) <400> 69 cag gtc caa ctg cag cag tct ggg gct gaa ctg gtg aag cct ggg gct 48 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 tca gtg aag ttg tcc tgc aag gct tct ggc tac acc ttc acc agc tac 96 Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 tat atg tac tgg gtg aag cag agg cct gga caa ggc ctt gag tgg att 144 Tyr Met Tyr Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 gga gag att aat cct agc aat ggt ggt act aac ttc aat gag aag ttc 192 Gly Glu Ile Asn Pro Ser Asn Gly Gly Thr Asn Phe Asn Glu Lys Phe 50 55 60 aag agc aag gcc aca ctg act gta gac aaa tcc tcc agc aca gca tac 240 Lys Ser Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 atg caa ctc agc agc ctg aca tct gag gac tct gcg gtc tat tac tgt 288 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 aca aga ggc ggt tac tac ccc ttt gac tac tgg ggc caa ggc acc act 336 Thr Arg Gly Gly Tyr Tyr Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr 100 105 110 ctc aca gtc tcc tca 351 Leu Thr Val Ser Ser 115 <210> 70 <211> 363 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <221> CDS <222> (1)..(363) <400> 70 gat gtg cag ctt cag gag tcg gga cct ggc ctg gtg aaa cct tct cag 48 Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 tct ctg tcc ctc aca tgc act gtc act ggc tac tca atc acc agt gat 96 Ser Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp 20 25 30 tat gcc tgg aat tgg atc cgg cag ttt cca gga aac aaa ctg gag tgg 144 Tyr Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp 35 40 45 atg ggc tac ata agc ttc agt ggt tac act agt tac aac cca tct ctc 192 Met Gly Tyr Ile Ser Phe Ser Gly Tyr Thr Ser Tyr Asn Pro Ser Leu 50 55 60 aaa agt cga atc tct gtc act cgg gac aca tcc agg aac caa ttc ttc 240 Lys Ser Arg Ile Ser Val Thr Arg Asp Thr Ser Arg Asn Gln Phe Phe 65 70 75 80 ctc cag ttg act tct gtg act act gag gac aca gcc aca tat tac tgt 288 Leu Gln Leu Thr Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys 85 90 95 gca aga gag gtc aac tat ggg gac tcc tac cac ttt gac tac tgg ggc 336 Ala Arg Glu Val Asn Tyr Gly Asp Ser Tyr His Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 caa ggc acc att gtc aca gtc tcc tca 363 Gln Gly Thr Ile Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 71 <211> 336 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <221> CDS <222> (1)..(336) <400> 71 gac att gtg atg acg cag gct gca tcc tct aat cca gtc act ctt gga 48 Asp Ile Val Met Thr Gln Ala Ala Ser Ser Asn Pro Val Thr Leu Gly 1 5 10 15 aca tcc gct tcc atc tcc tgc agg tct agt aag agt ctc cga cat act 96 Thr Ser Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Arg His Thr 20 25 30 aaa ggc atc act ttt ttg tat tgg tat ctg cag aag cca ggc cag tct 144 Lys Gly Ile Thr Phe Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 cct cag ctc ctg att tat cag atg tcc aac ctt gcc tca gga gtc cca 192 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Gln Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro 50 55 60 gac agg ttc agt agc agt ggg tca gga act gat ttc aca ctg aga atc 240 Asp Arg Phe Ser Ser Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Arg Ile 65 70 75 80 agc aga gtg gag gct gag gat ttg ggt gtt tat tac tgt gct caa aat 288 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Ala Gln Asn 85 90 95 cta gaa ctt ccg ctc acg ttc ggt gct ggg acc aag ctg gag ctg aaa 336 Leu Glu Leu Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105 110 <210> 72 <211> 336 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <221> CDS <222> (1)..(336) <400> 72 gat gtt gtg ctg acc cag act cca ctc act ttg tcg gtt acc att gga 48 Asp Val Val Leu Thr Gln Thr Pro Leu Thr Leu Ser Val Thr Ile Gly 1 5 10 15 caa cca gcc tcc atc tcc tgc aag tca agt cag agc ctc tta gat agt 96 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser 20 25 30 gat gga aag aca tat ttg aat tgg ttg tta cag agg cca ggc cag tct 144 Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser 35 40 45 cca aag cgc cta atc tat ctg gtg tct aaa ctg gac tct gga gtc cct 192 Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro 50 55 60 gac agg ttc act ggc agt gga tca ggg aca gat ttc aca ctg aaa atc 240 Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 agc aga gtg gag gct gag gat ttg gga gtt tat tat tgc tgg caa ggt 288 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly 85 90 95 aca cat ttt cct cag acg ttc ggt gga ggc acc aag ctg gaa atc aaa 336 Thr His Phe Pro Gln Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 73 <211> 336 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <221> CDS <222> (1)..(336) <400> 73 gat gtt gtg atg acc cag act cca ctc act ttg tcg gtt acc att ggg 48 Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Thr Leu Ser Val Thr Ile Gly 1 5 10 15 cgc cca gcc tcc atc tct tgc aag tca agt cag agc ctc tta gac agt 96 Arg Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser 20 25 30 gat gga aag aca tat ttg tat tgg ttg tta cag agg cca ggc cag tct 144 Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Tyr Trp Leu Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser 35 40 45 cca aag cgc cta atc tat ctg gtg tct gag ctg gac tct gga gtc cct 192 Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Glu Leu Asp Ser Gly Val Pro 50 55 60 gac agg atc act ggc agt ggg tcg ggg aca gat ttc aca ctg aag atc 240 Asp Arg Ile Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 agc aga gtg gag gct gag gat ttg gga gtt tat tat tgc tgg caa gga 288 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly 85 90 95 aca cat tct ccg tac acg ttc gga ggg ggg acc aag ctg gaa ata aaa 336 Thr His Ser Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 74 <211> 345 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <221> CDS <222> (1)..(345) <400> 74 caa ctt gcg ctc act cag tca tct tca gcc tct ttc tcc ctg gga gcc 48 Gln Leu Ala Leu Thr Gln Ser Ser Ser Ala Ser Phe Ser Leu Gly Ala 1 5 10 15 tca gca aaa cta acg tgc act ttg agt agt caa cac aga acg tac acc 96 Ser Ala Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser Gln His Arg Thr Tyr Thr 20 25 30 att gaa tgg tat cag caa cag tca ctc aag cct cct aag tat gtg atg 144 Ile Glu Trp Tyr Gln Gln Gln Ser Leu Lys Pro Pro Lys Tyr Val Met 35 40 45 gag gtt aag aaa gat gga agc cac agc aca ggt cat ggg att cct gat 192 Glu Val Lys Lys Asp Gly Ser His Ser Thr Gly His Gly Ile Pro Asp 50 55 60 cgc ttc tct gga tcc agt tct ggt gct gat cgc tac ctc agc att tcc 240 Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Ala Asp Arg Tyr Leu Ser Ile Ser 65 70 75 80 aac atc cag cct gaa gat gaa gca ata tac atc tgt ggt gtg ggt gat 288 Asn Ile Gln Pro Glu Asp Glu Ala Ile Tyr Ile Cys Gly Val Gly Asp 85 90 95 gca att aag gga caa tct gtg ttt gtt ttc ggc ggt ggc acc aag gtc 336 Ala Ile Lys Gly Gln Ser Val Phe Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val 100 105 110 act gtc cta 345 Thr Val Leu 115 <210> 75 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 75 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Thr Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Ser Ser Gly Gly Thr Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Thr Gln Gly Asn Tyr Ser Leu Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr Thr 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 76 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 76 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Arg His Thr 20 25 30 Lys Gly Ile Thr Phe Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Gln Met Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ala Gln Asn 85 90 95 Leu Glu Leu Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 77 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 77 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Thr Tyr 20 25 30 Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Ser Ser Gly Gly Thr Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Thr Gln Gly Asn Tyr Ser Leu Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr Thr 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 78 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 78 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Arg His Thr 20 25 30 Lys Gly Ile Thr Phe Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Gln Met Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ala Gln Asn 85 90 95 Leu Glu Leu Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 79 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 79 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Thr Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Thr Ile Ser Ser Gly Gly Thr Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Thr Gln Gly Asn Tyr Ser Leu Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr Thr 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 80 <211> 114 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 80 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ile Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Asn Ile Asn Thr Phe Gly Asp Arg Thr Tyr Tyr Val Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Thr Gly Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val 100 105 110 Ser Ser <210> 81 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 81 Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser 20 25 30 Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Arg Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Asn Arg Asp Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly 85 90 95 Thr His Phe Pro Gln Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 82 <211> 114 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 82 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ile Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Ser Ile Asn Thr Phe Gly Asp Arg Thr Tyr Tyr Val Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Thr Gly Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val 100 105 110 Ser Ser <210> 83 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 83 Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser 20 25 30 Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Arg Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Arg Asp Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly 85 90 95 Thr His Phe Pro Gln Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 84 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 84 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Tyr Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Ile Ile Asn Pro Ser Asn Gly Gly Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Arg Gly Gly Tyr Tyr Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 85 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 85 Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser 20 25 30 Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Arg Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Asn Arg Asp Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly 85 90 95 Thr His Ser Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 86 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 86 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Ile Ile Asn Pro Ser Asn Gly Gly Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Arg Gly Gly Tyr Tyr Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 87 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 87 Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser 20 25 30 Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Arg Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Asn Arg Asp Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly 85 90 95 Thr His Ser Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 88 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 88 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Tyr Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Glu Ile Asn Pro Ser Asn Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Arg Gly Gly Tyr Tyr Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 89 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 89 Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser 20 25 30 Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Arg Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Glu Arg Asp Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly 85 90 95 Thr His Ser Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 90 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 90 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp 20 25 30 Tyr Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 35 40 45 Ile Gly Tyr Ile Ser Phe Ser Gly Tyr Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu 50 55 60 Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser 65 70 75 80 Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Val Asn Tyr Gly Asp Ser Tyr His Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 91 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 91 Gln Leu Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ala Ser Ala Ser Leu Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser Gln His Arg Thr Tyr Thr 20 25 30 Ile Glu Trp His Gln Gln Gln Pro Glu Lys Gly Pro Arg Tyr Leu Met 35 40 45 Lys Val Lys Lys Asp Gly Ser His Ser Lys Gly Asp Gly Ile Pro Asp 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Ala Glu Arg Tyr Leu Thr Ile Ser 65 70 75 80 Ser Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Val Gly Asp 85 90 95 Ala Ile Lys Gly Gln Ser Val Phe Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val 100 105 110 Glu Ile Lys 115 <210> 92 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 92 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp 20 25 30 Tyr Ala Trp Ser Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 35 40 45 Ile Gly Tyr Ile Ser Phe Ser Gly Tyr Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu 50 55 60 Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser 65 70 75 80 Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Val Asn Tyr Gly Asp Ser Tyr His Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 93 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 93 Gln Leu Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ala Ser Ala Ser Leu Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser Gln His Arg Thr Tyr Thr 20 25 30 Ile Ala Trp His Gln Gln Gln Pro Glu Lys Gly Pro Arg Tyr Leu Met 35 40 45 Lys Val Lys Lys Asp Gly Ser His Ser Lys Gly Asp Gly Ile Pro Asp 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Ala Glu Arg Tyr Leu Thr Ile Ser 65 70 75 80 Ser Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Val Gly Asp 85 90 95 Ala Ile Lys Gly Gln Ser Val Phe Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val 100 105 110 Glu Ile Lys 115 <210> 94 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 94 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp 20 25 30 Tyr Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 35 40 45 Ile Gly Tyr Ile Ser Phe Ser Gly Tyr Thr Ser Tyr Asn Pro Ser Leu 50 55 60 Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser 65 70 75 80 Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Val Asn Tyr Gly Asp Ser Tyr His Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 95 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 95 Gln Leu Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ala Ser Ala Ser Leu Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser Gln His Arg Thr Tyr Thr 20 25 30 Ile Glu Trp His Gln Gln Gln Pro Glu Lys Gly Pro Arg Tyr Leu Met 35 40 45 Glu Val Lys Lys Asp Gly Ser His Ser Lys Gly Asp Gly Ile Pro Asp 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Ala Glu Arg Tyr Leu Thr Ile Ser 65 70 75 80 Ser Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Val Gly Asp 85 90 95 Ala Ile Lys Gly Gln Ser Val Phe Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val 100 105 110 Glu Ile Lys 115 <210> 96 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(3) <223> Ahx <400> 96 Cys Xaa Xaa Gln Gly Pro Trp Leu Glu Glu Glu Glu Glu Ala Tyr Gly 1 5 10 15 Trp Met Asp Phe Gly Arg Arg Ser Ala Glu Asp Glu Asn 20 25 <210> 97 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(3) <223> Ahx <400> 97 Cys Xaa Xaa Phe Gly Arg Arg Ser Ala Glu Asp Glu Asn 1 5 10 <210> 98 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (11)..(12) <223> Ahx <400> 98 Phe Gly Arg Arg Ser Ala Glu Asp Glu Asn Xaa Xaa Cys 1 5 10 <210> 99 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 99 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 <210> 100 <211> 101 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 100 Met Gln Arg Leu Cys Val Tyr Val Leu Ile Phe Ala Leu Ala Leu Ala 1 5 10 15 Ala Phe Ser Glu Ala Ser Trp Lys Pro Arg Ser Gln Gln Pro Asp Ala 20 25 30 Pro Leu Gly Thr Gly Ala Asn Arg Asp Leu Glu Leu Pro Trp Leu Glu 35 40 45 Gln Gln Gly Pro Ala Ser His His Arg Arg Gln Leu Gly Pro Gln Gly 50 55 60 Pro Pro His Leu Val Ala Asp Pro Ser Lys Lys Gln Gly Pro Trp Leu 65 70 75 80 Glu Glu Glu Glu Glu Ala Tyr Gly Trp Met Asp Phe Gly Arg Arg Ser 85 90 95 Ala Glu Asp Glu Asn 100 <210> 101 <211> 80 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 101 Ser Trp Lys Pro Arg Ser Gln Gln Pro Asp Ala Pro Leu Gly Thr Gly 1 5 10 15 Ala Asn Arg Asp Leu Glu Leu Pro Trp Leu Glu Gln Gln Gly Pro Ala 20 25 30 Ser His His Arg Arg Gln Leu Gly Pro Gln Gly Pro Pro His Leu Val 35 40 45 Ala Asp Pro Ser Lys Lys Gln Gly Pro Trp Leu Glu Glu Glu Glu Glu 50 55 60 Ala Tyr Gly Trp Met Asp Phe Gly Arg Arg Ser Ala Glu Asp Glu Asn 65 70 75 80 <210> 102 <211> 34 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 102 Gln Leu Gly Pro Gln Gly Pro Pro His Leu Val Ala Asp Pro Ser Lys 1 5 10 15 Lys Gln Gly Pro Trp Leu Glu Glu Glu Glu Glu Ala Tyr Gly Trp Met 20 25 30 Asp Phe <210> 103 <211> 35 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 103 Gln Leu Gly Pro Gln Gly Pro Pro His Leu Val Ala Asp Pro Ser Lys 1 5 10 15 Lys Gln Gly Pro Trp Leu Glu Glu Glu Glu Glu Ala Tyr Gly Trp Met 20 25 30 Asp Phe Gly 35 <210> 104 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 104 Gln Gly Pro Trp Leu Glu Glu Glu Glu Glu Ala Tyr Gly Trp Met Asp 1 5 10 15 Phe <210> 105 <211> 18 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 105 Gln Gly Pro Trp Leu Glu Glu Glu Glu Glu Ala Tyr Gly Trp Met Asp 1 5 10 15 Phe Gly <210> 106 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 106 Ser Ala Glu Asp Glu Asn 1 5

Claims (135)

1. 프로가스트린에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 조성물의 유효량을 전이성 직장암의 치료가 요구되는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 전이성 직장암의 치료 방법.
2. 제1항에 있어서,
   상기 전이성 직장암은 간, 폐, 뇌 또는 림프절에 위치하는 방법.
3. 제1항에 있어서,
   상기 항-프로가스트린 항체 조성물을 투여하는 단계는 전이성 직장 종양의 수술에 의한 절제 이전에 이루어지는 방법.
4. 제1항에 있어서,
   상기 항-프로가스트린 항체 조성물을 투여하는 단계는 전이성 직장 종양의 수술에 의한 절제 이후에 이루어지는 방법.
5. 제1항에 있어서,
   상기 항-프로가스트린 항체 조성물을 투여하는 단계는 전이성 직장 종양의 방사선 치료요법의 선량의 투여 이전에 이루어지는 방법.
6. 제1항에 있어서,
   상기 항-프로가스트린 항체 조성물을 투여하는 단계는 전이성 직장 종양의 방사선 요법의 선량의 투여 이후에 이루어지는 방법.
7. 제1항에 있어서,
   상기 항-프로가스트린 항체 조성물을 투여하는 단계는 전이성 직장 종양의 치료를 위한 화학요법제의 투여 이전에 이루어지는 방법.
8. 제1항에 있어서,
   상기 항-프로가스트린 항체 조성물을 투여하는 단계는 전이성 직장 종양의 치료를 위한 화학요법제의 투여와 함께 이루어지는 방법.
9. 제1항에 있어서,
   상기 항-프로가스트린 항체 조성물을 투여하는 단계는 전이성 직장 종양의 치료를 위한 화학요법제의 투여 이후에 이루어지는 방법.
10. 제7항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 화학요법제는 포레이트 길항체, 퓨린 길항제, 피리미딘 길항제, DNA 알킬화제, DNA 가교제, 항생제, 백금 착제, 프로테오좀 억제제, 유사분열 방추 독소, 토포이소머라제 억제제, 및 타이로신 키나제 억제제로 이루어지는 화학요법제의 군 중에서 선택되는 방법.
11. 제1항에 있어서,
    상기 항-프로가스트린 항체 조성물을 투여하는 단계는 프로가스트린과 상이한 특이성을 갖는 제2의 치료 항체의 투여 이전에 이루어지는 방법.
12. 제1항에 있어서,
    상기 항-프로가스트린 항체 조성물을 투여하는 단계는 프로가스트린과 상이한 특이성을 갖는 제2의 치료 항체의 투여와 동시에 이루어지는 방법.
13. 제1항에 있어서,
    상기 항-프로가스트린 항체 조성물을 투여하는 단계는 프로가스트린과 상이한 특이성을 갖는 제2의 치료 항체의 투여 이후에 이루어지는 방법.
14. 제11항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제2의 항체는 VEGF 또는 EGFR에 특이적으로 결합하는 방법.
15. 제11항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제2의 항체는 세투시맵, 파니투무맵 및 베바시주맵로 이루어진 단일클론 항체의 군 중에서 선택되는 방법.
16. 제1항에 있어서,
    상기 항-프로가스트린 항체는 다중클론 항체, 단일클론 항체, 인간화된단일클론 항체, 키메라 항체, 단쇄 항체, 카멜화 항체, IgAl 항체, IgA2 항체, IgD 항체, IgE 항체, IgGl 항체, IgG2 항체, IgG3 항체, IgG4 항체, 및 IgM 항체로 이루어진 군 중에서 선택되는 방법.
17. 제1항에 있어서,
    상기 항체는 모이어티에 결합되는 방법.
18. 제17항에 있어서,
    상기 모이어티는 비-단백질성인 방법.
19. 제17항에 있어서,
    상기 모이어티는 상기 항체에 대한 혈청 반감기를 증가시키기에 유효한 방법.
20. 제1항에 있어서,
    상기 항체는 FcRn에 대한 그것의 결합을 증가시키기 위해 변경된 방법.
21. 제1항에 있어서,
    상기 항체는 적어도 약 0.001 nM 내지 적어도 약 5000 nM의 프로가스트린 결합 친화도를 갖는 방법.
22. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 프로가스트린의 별개의 에피토프에 특이성을 갖는 다수의 항체를 포함하는 방법.
23. 제1항에 있어서,
    상기 프로가스트린 특이적 항체는 MAbl, MAb2, MAb3, MAb4, MAb5, MAb6, MAb7, MAb8, MAb9, MAblO, MAbl1, MAbl2, MAbl3, MAbl4, MAbl5, MAbl6, MAbl7, MAbl8, MAbl9, MAb20, MAb21, MAb22 및 MAb23로 이루어지는 군 중에서 선택되는 단일클론 항체인 방법.
24. 제23항에 있어서,
    상기 단일클론 항체는 인간화된 방법.
25. 제1항에 있어서,
    상기 프로가스트린 특이적 항체는 상보성 결정 영역 1 (CDR1)이 V_H CDR 1.3, V_H CDR 1.4, V_H CDR 1.8, V_H CDR 1.13, V_H CDR 1.16, V_H CDR 1.19로부터 선택되고, CDR2가 V_H CDR 2.3, V_H CDR 2.4, V_H CDR 2.8, V_H CDR 2.13, V_H CDR 2.16, V_H CDR 2.19로부터 선택되고, CDR3가 V_H CDR 3.3, V_H CDR 3.4, V_H CDR 3.8, V_H CDR 3.13, V_H CDR 3.16, V_H CDR 3.19로부터 선택되는 중쇄 가변 영역 (V_H)을 포함하는 단일클론 항체인 방법.
26. 제1항에 있어서,
    상기 프로가스트린 특이적 항체는 상보성 결정 영역 1 (CDR1)이 V_L CDR 1.3, V_L CDR 1.4, V_L CDR 1.8, V_L CDR 1.13, V_L CDR 1.16, V_L CDR 1.19로부터 선택되고, CDR2가 V_L CDR 2.3, V_L CDR 2.4, V_L CDR 2.8, V_L CDR 2.13, V_L CDR 2.16, V_L CDR 2.19로부터 선택되고, CDR3가 V_L CDR 3.3, V_L CDR 3.4, V_L CDR 3.8, V_L CDR 3.13, V_L CDR 3.16, V_L CDR 3.19로부터 선택되는 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함하는 단일클론 항체인 방법.
27. 제1항에 있어서,
    상기 항체는 프로가스트린 민감성 전이성 직장암 세포의 증식을 감소시킬 수 있는 방법.
28. 제1항에 있어서,
    상기 항체는 프로가스트린 민감성 전이성 직장암 세포의 세포 사멸의 비율을 증가시킬 수 있는 방법.
29. 제1항에 있어서,
    상기 치료는 치료받은 피검체 내의 직장암 전이의 평균 개수를 감소시키기에 유효한 방법.
30. 제1항에 있어서,
    상기 치료는 치료받은 피검체 내의 직장 암 전이의 평균 크기를 감소시키기에 유효한 방법.
31. 제1항에 있어서,
    상기 치료는 치료받은 피검체 내의 프로가스트린의 혈액 농도를 감소시키기에 유효한 방법.
32. 제1항에 있어서,
    상기 항체 조성물은 비경구 투여, 경막내 투여, 피하 투여, 정맥내 투여, 근육 투여, 복막 투여, 주입 투여, 및 볼루스 투여로 이루어지는 군 중에서 선택되는 투여 방법으로 투여되는 방법.
33. 제1항에 있어서,
    상기 항-프로가스트린 항체는 약 0.001 mg/kg 내지 약 250 mg/kg의 용량으로 투여되는 방법.
34. 제33항에 있어서,
    상기 항-프로가스트린 항체의 용량은 다수의 시간 간격을 둔(temporally spaced) 투여에 따라 투여되는 방법.
35. 항-프로가스트린 항체 및 희석제의 단위 용량을 포함하는, 전이성 직장암의 치료를 위한 키트.
36. 제35항에 있어서,
    전이성 직장암의 치료가 요구되는 환자에 상기 항-프로가스트린 항체를 투여하기 위한 사용설명서를 추가로 포함하는 키트.
37. 전이성 직장암을 예방하기 위한 유효량으로 프로가스트린에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 조성물을 전이성 직장암의 예방이 요구되는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 전이성 직장암의 예방 방법.
38. 제37항에 있어서,
    상기 항-프로가스트린 항체 조성물을 투여하는 단계는 일차 직장 종양의 수술에 의한 절제 이전에 이루어지는 방법.
39. 제37항에 있어서,
    상기 항-프로가스트린 항체 조성물을 투여하는 단계는 일차 직장 종양의 수술에 의한 절제 이후에 유효한 방법.
40. 제37항에 있어서,
    상기 항-프로가스트린 항체 조성물을 투여하는 단계 일차 직장 종양의 방사선 치료요법의 선량의 투여 이전에 이루어지는 방법.
41. 제37항에 있어서,
    상기 항-프로가스트린 항체 조성물을 투여하는 단계는 일차 직장 종양의 방사선 요법의 선량의 투여 이후에 이루어지는 방법.
42. 제37항에 있어서,
    상기 항-프로가스트린 항체 조성물을 투여하는 단계는 전이성 직장암의 예방에 유효한 제2의 작용제의 투여 이전에, 상기 투여와 동시에 또는 상기의 투여 이후에 이루어지는 방법.
43. 제42항에 있어서,
    상기 제2의 작용제는 전이성 직장암을 예방하기에 유효한 화학요법제인 방법.
44. 제43항에 있어서,
    상기 화학요법제는 포레이트 길항체, 퓨린 길항제, 피리미딘 길항제, DNA 알킬화제, DNA 가교제, 항생제, 백금 착제, 프로테오좀 억제제, 유사분열 방추 독소, 토포이소머라제 억제제, 및 타이로신 키나제 억제제로 이루어지는 화학요법제의 군 중에서 선택되는 방법.
45. 제42항에 있어서, 상기 제2의 작용제는 프로가스트린과 상이한 특이성을 갖는 치료 항체인 방법.
46. 제37항에 있어서,
    상기 항-프로가스트린 항체는 다중클론 항체, 단일클론 항체, 인간화된단일클론 항체, 키메라 항체, 단쇄 항체, 카멜화 항체, IgAl 항체, IgA2 항체, IgD 항체, IgE 항체, IgGl 항체, IgG2 항체, IgG3 항체, IgG4 항체, 및 IgM 항체로 이루어진 군 중에서 선택되는 방법.
47. 제37항에 있어서,
    상기 항체는 모이어티에 결합되는 방법.
48. 제47항에 있어서,
    상기 모이어티는 비-단백질성인 방법.
49. 제47항에 있어서,
    상기 모이어티는 상기 항체의 혈청 반감기를 증가시키기에 유효한 방법.
50. 제37항에 있어서,
    상기 항체는 FcRn에 대한 그것의 결합을 증가시키기 위해 변경된 방법.
51. 제37항에 있어서,
    상기 항체는 적어도 약 0.001 nM 내지 적어도 약 5000 nM의 프로가스트린 결합 친화도를 갖는 방법.
52. 제37항에 있어서,
    상기 조성물은 프로가스트린의 별개의 에피토프에 특이성을 갖는 다수의 항체를 포함하는 방법.
53. 제37항에 있어서,
    상기 프로가스트린 특이적 항체는 MAbl, MAb2, MAb3, MAb4, MAb5, MAb6, MAb7, MAb8, MAb9, MAblO, MAbl1, MAbl2, MAbl3, MAbl4, MAbl5, MAbl6, MAbl7, MAbl8, MAbl9, MAb20, MAb21, MAb22 및 MAb23로 이루어지는 군 중에서 선택되는 단일클론 항체인 방법.
54. 제53항에 있어서
    상기 단일클론 항체는 인간화된 방법.
55. 제37항에 있어서,
    상기 프로가스트린 특이적 항체는 상보성 결정 영역 1 (CDR1)이 V_H CDR 1.3, V_H CDR 1.4, V_H CDR 1.8, V_H CDR 1.13, V_H CDR 1.16, V_H CDR 1.19로부터 선택되고, CDR2가 V_H CDR 2.3, V_H CDR 2.4, V_H CDR 2.8, V_H CDR 2.13, V_H CDR 2.16, V_H CDR 2.19로부터 선택되고, 그리고 CDR3가 V_H CDR 3.3, V_H CDR 3.4, V_H CDR 3.8, V_H CDR 3.13, V_H CDR 3.16, V_H CDR 3.19로부터 선택되는 중쇄 가변 영역 (V_H)을 포함하는 단일클론 항체인 방법.
56. 제37항에 있어서,
    상기 프로가스트린 특이적 항체는 상보성 결정 영역 1 (CDR1)이 V_L CDR 1.3, V_L CDR 1.4, V_L CDR 1.8, V_L CDR 1.13, V_L CDR 1.16, V_L CDR 1.19로부터 선택되고, CDR2가 V_L CDR 2.3, V_L CDR 2.4, V_L CDR 2.8, V_L CDR 2.13, V_L CDR 2.16, V_L CDR 2.19로부터 선택되고, 그리고 CDR3가 V_L CDR 3.3, V_L CDR 3.4, V_L CDR 3.8, V_L CDR 3.13, V_L CDR 3.16, V_L CDR 3.19로부터 선택되는 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함하는 단일클론 항체인 방법.
57. 제37항에 있어서,
    상기 항체는 프로가스트린 민감성 전이성 직장암 세포의 증식을 감소시킬 수 있는 방법.
58. 제37항에 있어서,
    상기 항체는 프로가스트린 민감성 전이성 직장암 세포의 세포 사멸의 비율을 증가시킬 수 있는 방법.
59. 제37항에 있어서,
    상기 항체의 투여는 치료받은 피검체 내의 프로가스트린의 혈액 농도를 감소시키기에 유효한 방법.
60. 제37항에 있어서,
    상기 항체 조성물은 비경구 투여, 경막내 투여, 피하 투여, 정맥내 투여, 근육 투여, 복막 투여, 주입 투여, 및 볼루스 투여로 이루어지는 군 중에서 선택되는 투여 방법으로 투여되는 방법.
61. 제37항에 있어서,
    상기 항-프로가스트린 항체는 약 0.001 mg/kg 내지 약 250 mg/kg의 용량으로 투여되는 방법.
62. 제61항에 있어서,
    상기 항-프로가스트린 항체의 용량은 다수의 시간 간격을 둔(temporally spaced) 투여에 따라 투여되는 방법.
63. 직장암의 재발을 예방하기 위한 유효량으로 프로가스트린에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 조성물을 직장암의 재발의 예방이 요구되는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 직장암의 재발의 예방 방법.
64. 제63항에 있어서,
    상기 항-프로가스트린 항체 조성물을 투여하는 단계는 직장암의 재발을 예방하기에 유효한 제2의 작용제의 투여 이전에, 상기 투여와 동시에 또는 상기 투여 이후에 이루어지는 방법.
65. 제64항에 있어서,
    상기 제2의 작용체는 프로가스트린 이외에 특이성을 갖는 치료 항체인 방법.
66. 제63항에 있어서,
    상기 항-프로가스트린 항체는 다중클론 항체, 단일클론 항체, 인간화된단일클론 항체, 키메라 항체, 단쇄 항체, 카멜화 항체, IgAl 항체, IgA2 항체, IgD 항체, IgE 항체, IgGl 항체, IgG2 항체, IgG3 항체, IgG4 항체, 및 IgM 항체로 이루어진 군 중에서 선택되는 방법.
67. 제63항에 있어서,
    상기 항체는 모이어티에 결합되는 방법.
68. 제67항에 있어서,
    상기 모이어티는 비-단백질성인 방법.
69. 제67항에 있어서,
    상기 모이어티는 상기 항체의 혈청 반감기를 증가시키기에 유효한 방법.
70. 제63항에 있어서,
    상기 항체는 FcRn에 대한 그것의 결합을 증가시키기 위해 변경된 방법.
71. 제63항에 있어서,
    상기 항체는 적어도 약 0.001 nM 내지 적어도 약 5000 nM의 프로가스트린 결합 친화도를 갖는 방법.
72. 제63항에 있어서,
    상기 조성물은 프로가스트린의 별개의 에피토프에 특이성을 갖는 다수의 항체를 포함하는 방법.
73. 제63항에 있어서,
    상기 프로가스트린 특이적 항체는 MAbl, MAb2, MAb3, MAb4, MAb5, MAb6, MAb7, MAb8, MAb9, MAblO, MAbl1, MAbl2, MAbl3, MAbl4, MAbl5, MAbl6, MAbl7, MAbl8, MAbl9, MAb20, MAb21, MAb22 및 MAb23로 이루어지는 군 중에서 선택되는 단일클론 항체인 방법.
74. 제73항에 있어서
    상기 단일클론 항체는 인간화된 방법.
75. 제63항에 있어서,
    상기 프로가스트린 특이적 항체는 상보성 결정 영역 1 (CDR1)이 V_H CDR 1.3, V_H CDR 1.4, V_H CDR 1.8, V_H CDR 1.13, V_H CDR 1.16, V_H CDR 1.19로부터 선택되고, CDR2가 V_H CDR 2.3, V_H CDR 2.4, V_H CDR 2.8, V_H CDR 2.13, V_H CDR 2.16, V_H CDR 2.19로부터 선택되고, 그리고 CDR3가 V_H CDR 3.3, V_H CDR 3.4, V_H CDR 3.8, V_H CDR 3.13, V_H CDR 3.16, V_H CDR 3.19로부터 선택되는 중쇄 가변 영역 (V_H)을 포함하는 단일클론 항체인 방법.
76. 제63항에 있어서,
    상기 프로가스트린 특이적 항체는 상보성 결정 영역 1 (CDR1)이 V_L CDR 1.3, V_L CDR 1.4, V_L CDR 1.8, V_L CDR 1.13, V_L CDR 1.16, V_L CDR 1.19로부터 선택되고, CDR2가 V_L CDR 2.3, V_L CDR 2.4, V_L CDR 2.8, V_L CDR 2.13, V_L CDR 2.16, V_L CDR 2.19로부터 선택되고, 그리고 CDR3가 V_L CDR 3.3, V_L CDR 3.4, V_L CDR 3.8, V_L CDR 3.13, V_L CDR 3.16, V_L CDR 3.19로부터 선택되는 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함하는 단일클론 항체인 방법.
77. 제63항에 있어서,
    상기 항체는 프로가스트린 민감성 직장암 세포의 증식을 억제시킬 수 있는 방법.
78. 제63항에 있어서,
    상기 항체는 프로가스트린 민감성 직장암 세포의 세포 사멸의 비율을 증가시킬 수 있는 방법.
79. 제63항에 있어서,
    상기 항체의 투여는 치료받은 피검체 내의 프로가스트린의 혈액 농도를 감소시키기에 유효한 방법.
80. 제63항에 있어서,
    상기 항체 조성물은 비경구 투여, 경막내 투여, 피하 투여, 정맥내 투여, 근육 투여, 복막 투여, 주입 투여, 및 볼루스 투여로 이루어지는 군 중에서 선택되는 투여 방법으로 투여되는 방법.
81. 제63항에 있어서,
    상기 항-프로가스트린 항체는 약 0.001 mg/kg 내지 약 250 mg/kg의 용량으로 투여되는 방법.
82. 제81항에 있어서,
    상기 항-프로가스트린 항체의 용량은 다수의 시간 간격을 둔(temporally spaced) 투여에 따라 투여되는 방법.
83. 제63항에 있어서,
    상기 환자는 이전에 직장암 치료를 받았고 그 이후에 상기 직장암이 명백히 사라진 방법.
84. 제83항에 있어서,
    상기 치료는 외과수술, 방사선 요법, 생물학적 요법, 면역요법 및 화학요법으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 방법.
85. 환자 내의 직장암 줄기 세포의 성장을 억제하기 위한 방법으로, 상기 방법은 상기 직장암 줄기 세포를 억제하기 위한 유효량으로 프로가스트린에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 조성물을 직장암 줄기 세포의 성장의 억제가 요구되는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
86. 제85항에 있어서,
    상기 항-프로가스트린 항체 조성물을 투여하는 단계는 직장암 줄기 세포의 성장을 억제하기에 유효한 제2의 작용제의 투여 이전에, 상기 투여와 동시에 또는 상기 투여 이후에 이루어지는 방법.
87. 제86항에 있어서,
    상기 제2의 작용제는 프로가스트린 이외에 특이성을 갖는 치료 항체인 방법.
88. 제85항에 있어서,
    상기 항-프로가스트린 항체는 다중클론 항체, 단일클론 항체, 인간화된단일클론 항체, 키메라 항체, 단쇄 항체, 카멜화 항체, IgAl 항체, IgA2 항체, IgD 항체, IgE 항체, IgGl 항체, IgG2 항체, IgG3 항체, IgG4 항체, 및 IgM 항체로 이루어진 군 중에서 선택되는 방법.
89. 제85항에 있어서,
    상기 항체는 모이어티에 결합되는 방법.
90. 제89항에 있어서,
    상기 모이어티는 비-단백질성인 방법.
91. 제89항에 있어서,
    상기 모이어티는 상기 항체에 대한 혈청 반감기를 증가시키기에 유효한 방법.
92. 제85항에 있어서,
    상기 항체는 FcRn에 대한 그것의 결합을 증가시키기 위해 변경된 방법.
93. 제85항에 있어서,
    상기 항체는 적어도 약 0.001 nM 내지 적어도 약 5000 nM의 프로가스트린 결합 친화도를 갖는 방법.
94. 제85항에 있어서,
    상기 조성물은 프로가스트린의 별개의 에피토프에 특이성을 갖는 다수의 항체를 포함하는 방법.
95. 제85항에 있어서,
    상기 프로가스트린 특이적 항체는 MAbl, MAb2, MAb3, MAb4, MAb5, MAb6, MAb7, MAb8, MAb9, MAblO, MAbl1, MAbl2, MAbl3, MAbl4, MAbl5, MAbl6, MAbl7, MAbl8, MAbl9, MAb20, MAb21, MAb22 및 MAb23로 이루어지는 군 중에서 선택되는 단일클론 항체인 방법.
96. 제95항에 있어서,
    상기 단일클론 항체는 인간화된 방법.
97. 제85항에 있어서,
    상기 프로가스트린 특이적 항체는 상보성 결정 영역 1 (CDR1)이 V_H CDR 1.3, V_H CDR 1.4, V_H CDR 1.8, V_H CDR 1.13, V_H CDR 1.16, V_H CDR 1.19로부터 선택되고, CDR2가 V_H CDR 2.3, V_H CDR 2.4, V_H CDR 2.8, V_H CDR 2.13, V_H CDR 2.16, V_H CDR 2.19로부터 선택되고, 그리고 CDR3가 V_H CDR 3.3, V_H CDR 3.4, V_H CDR 3.8, V_H CDR 3.13, V_H CDR 3.16, V_H CDR 3.19로부터 선택되는 중쇄 가변 영역 (V_H)을 포함하는 단일클론 항체인 방법.
98. 제85항에 있어서,
    상기 프로가스트린 특이적 항체는 상보성 결정 영역 1 (CDR1)이 V_L CDR 1.3, V_L CDR 1.4, V_L CDR 1.8, V_L CDR 1.13, V_L CDR 1.16, V_L CDR 1.19로부터 선택되고, CDR2가 V_L CDR 2.3, V_L CDR 2.4, V_L CDR 2.8, V_L CDR 2.13, V_L CDR 2.16, V_L CDR 2.19로부터 선택되고, 그리고 CDR3가 V_L CDR 3.3, V_L CDR 3.4, V_L CDR 3.8, V_L CDR 3.13, V_L CDR 3.16, V_L CDR 3.19로부터 선택되는 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함하는 단일클론 항체인 방법.
99. 제85항에 있어서,
    상기 항체의 투여는 치료받은 피검체 내의 프로가스트린의 혈액 농도를 감소시키기에 유효한 방법.
100. 제85항에 있어서,
     상기 항체 조성물은 비경구 투여, 경막내 투여, 피하 투여, 정맥내 투여, 근육 투여, 복막 투여, 주입 투여, 및 볼루스 투여로 이루어지는 군 중에서 선택되는 투여 방법으로 투여되는 방법.
101. 제85항에 있어서,
     상기 항-프로가스트린 항체는 약 0.001 mg/kg 내지 약 250 mg/kg의 용량으로 투여되는 방법.
102. 제101항에 있어서,
     상기 항-프로가스트린 항체의 용량은 다수의 시간 간격을 둔(temporally spaced) 투여에 따라 투여되는 방법.
103. 환자 내의 전이성 직장암의 치료에 대한 효능을 관찰 위한 방법으로, 상기 방법은 (i) 전이성 직장암의 치료 이전에 환자로부터 얻은 제1시료 내의 프로가스트린의 농도를 측정하는 단계, 및 (ii) 전이성 직장암의 치료 이후에 동일한 환자로부터 얻은 제2시료 내의 프로가스트린의 농도를 상기 제2시료 내의 것과 비교하는 단계를 포함하고, 상기 제1시료에 비해 상기 제2시료 내의 프로가스트린의 농도의 감소는 상기 치료가 유효함을 나타내는 것인 방법.
104. 제103항에 있어서,
     상기 시료는 체액으로부터 얻어지는 방법.
105. 제104항에 있어서,
     상기 체액은 혈액, 혈청 및 혈장으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 방법.
106. 제103항에 있어서.
     상기 시료는 전이성 직장 종양의 생검으로 얻어지는 방법.
107. 제103항에 있어서,
     상기 전이성 직장암의 치료는 수술, 화학요법, 생물학적 요법, 면역요법 및 항체 요법으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 방법.
108. 제103항에 있어서,
     상기 제1시료 내의 프로가스트린의 농도를 측정하는 방법은 프로가스트린에 특이적으로 결합하는 항체를 사용하는 검정법을 이용하여 이루어지는 방법.
109. 제108항에 있어서,
     상기 항체는 비-중성화된 방법.
110. 제108항에 있어서,
     상기 항체는 다중클론 항체, 단일클론 항체, 인간화된단일클론 항체, 키메라 항체, 단쇄 항체, 카멜화 항체, IgAl 항체, IgA2 항체, IgD 항체, IgE 항체, IgGl 항체, IgG2 항체, IgG3 항체, IgG4 항체, 및 IgM 항체로 이루어진 군 중에서 선택되는 방법.
111. 제108항에 있어서,
     상기 항체는 적어도 약 0.001 nM 내지 적어도 약 5000 nM의 프로가스트린 결합 친화도를 갖는 방법.
112. 제108항에 있어서,
     상기 조성물은 프로가스트린의 별개의 에피토프에 특이성을 갖는 다수의 항체를 포함하는 방법.
113. 제108항에 있어서,
     상기 프로가스트린 특이적 항체는 MAbl, MAb2, MAb3, MAb4, MAb5, MAb6, MAb7, MAb8, MAb9, MAblO, MAbl1, MAbl2, MAbl3, MAbl4, MAbl5, MAbl6, MAbl7, MAbl8, MAbl9, MAb20, MAb21, MAb22 및 MAb23로 이루어지는 군 중에서 선택되는 단일클론 항체인 방법.
114. 제108항에 있어서,
     상기 프로가스트린 특이적 항체는 상보성 결정 영역 1 (CDR1)이 V_H CDR 1.3, V_H CDR 1.4, V_H CDR 1.8, V_H CDR 1.13, V_H CDR 1.16, V_H CDR 1.19로부터 선택되고, CDR2가 V_H CDR 2.3, V_H CDR 2.4, V_H CDR 2.8, V_H CDR 2.13, V_H CDR 2.16, V_H CDR 2.19로부터 선택되고, 그리고 CDR3가 V_H CDR 3.3, V_H CDR 3.4, V_H CDR 3.8, V_H CDR 3.13, V_H CDR 3.16, V_H CDR 3.19로부터 선택되는 중쇄 가변 영역 (V_H)을 포함하는 단일클론 항체인 방법.
115. 제108항에 있어서,
     상기 프로가스트린 특이적 항체는 상보성 결정 영역 1 (CDR1)이 V_L CDR 1.3, V_L CDR 1.4, V_L CDR 1.8, V_L CDR 1.13, V_L CDR 1.16, V_L CDR 1.19로부터 선택되고, CDR2가 V_L CDR 2.3, V_L CDR 2.4, V_L CDR 2.8, V_L CDR 2.13, V_L CDR 2.16, V_L CDR 2.19로부터 선택되고, 그리고 CDR3가 V_L CDR 3.3, V_L CDR 3.4, V_L CDR 3.8, V_L CDR 3.13, V_L CDR 3.16, V_L CDR 3.19로부터 선택되는 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함하는 단일클론 항체인 방법.
116. 제108항에 있어서,
     상기 검정법은 방사선면역검정법 (radioimmunoassay, RIA) 또는 효소-결합 면역 흡착법 (enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)인 방법.
117. 환자 내의 직장암의 존재를 진단하기 위한 방법으로, 상기 방법은 (i) 직장암을 갖는 것으로 의심되는 환자로부터 얻어진 시료 내의 프로가스트린의 농도를 측정하는 단계, 및 (ii) 상기 시료 내의 프로가스트린의 농도를 미리결정된 값과 비교하는 단계를 포함하고, 상기 미리결정된 값에 비해 시료 내의 프로가스트린의 증가된 수치는 상기 환자 내에 직장암이 존재함을 나타내는 방법.
118. 제117항에 있어서,
     상기 시료는 체액으로부터 얻어지는 방법.
119. 제117항에 있어서,
     상기 체액은 혈액, 혈청 및 혈장으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 방법.
120. 제117항에 있어서,
     상기 시료 내의 프로가스트린의 농도를 측정하는 단계는 프로가스트린에 특이적으로 결합하는 항체를 사용하는 검정법을 이용하여 이루어지는 방법.
121. 제120항에 있어서,
     상기 항체는 비-중화된 방법.
122. 제120항에 있어서,
     상기 항체는 다중클론 항체, 단일클론 항체, 인간화된단일클론 항체, 키메라 항체, 단쇄 항체, 카멜화 항체, IgAl 항체, IgA2 항체, IgD 항체, IgE 항체, IgGl 항체, IgG2 항체, IgG3 항체, IgG4 항체, 및 IgM 항체로 이루어진 군 중에서 선택되는 방법.
123. 제120항에 있어서,
     상기 항체는 적어도 약 0.001 nM 내지 적어도 약 5000 nM의 프로가스트린 결합 친화도를 갖는 방법.
124. 제120항에 있어서,
     상기 조성물은 프로가스트린의 별개의 에피토프에 특이성을 갖는 다수의 항체를 포함하는 방법.
125. 제120항에 있어서,
     상기 프로가스트린 특이적 항체는 MAbl, MAb2, MAb3, MAb4, MAb5, MAb6, MAb7, MAb8, MAb9, MAblO, MAbl1, MAbl2, MAbl3, MAbl4, MAbl5, MAbl6, MAbl7, MAbl8, MAbl9, MAb20, MAb21, MAb22 및 MAb23로 이루어지는 군 중에서 선택되는 단일클론 항체인 방법.
126. 제120항에 있어서,
     상기 프로가스트린 특이적 항체는 상보성 결정 영역 1 (CDR1)이 V_H CDR 1.3, V_H CDR 1.4, V_H CDR 1.8, V_H CDR 1.13, V_H CDR 1.16, V_H CDR 1.19로부터 선택되고, CDR2가 V_H CDR 2.3, V_H CDR 2.4, V_H CDR 2.8, V_H CDR 2.13, V_H CDR 2.16, V_H CDR 2.19로부터 선택되고, 그리고 CDR3가 V_H CDR 3.3, V_H CDR 3.4, V_H CDR 3.8, V_H CDR 3.13, V_H CDR 3.16, V_H CDR 3.19로부터 선택되는 중쇄 가변 영역 (V_H)을 포함하는 단일클론 항체인 방법.
127. 제120항에 있어서,
     상기 프로가스트린 특이적 항체는 상보성 결정 영역 1 (CDR1)이 V_L CDR 1.3, V_L CDR 1.4, V_L CDR 1.8, V_L CDR 1.13, V_L CDR 1.16, V_L CDR 1.19로부터 선택되고, CDR2가 V_L CDR 2.3, V_L CDR 2.4, V_L CDR 2.8, V_L CDR 2.13, V_L CDR 2.16, V_L CDR 2.19로부터 선택되고, 그리고 CDR3가 V_L CDR 3.3, V_L CDR 3.4, V_L CDR 3.8, V_L CDR 3.13, V_L CDR 3.16, V_L CDR 3.19로부터 선택되는 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함하는 단일클론 항체인 방법.
128. 제120항에 있어서,
     상기 검정법은 방사선면역검정법 (radioimmunoassay, RIA) 또는 효소-결합 면역 흡착법 (enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)인 방법.
129. 제117항에 있어서,
     상기 방법은 상기 피검체에서 진단 테스트를 수행함으로써 직장암의 존재를 확인하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
130. 제129항에 있어서,
     상기 진단 테스트는 직장암 검출을 위한 예비 수술, 직장암 검출을 위한 의료 이미지 검사, 잠혈을 검출하기 위한 환자의 대변 검사, 직장 검사, 직장암을 표시하는 유전자 물질을 검출하기 위한 환자의 대변 검사, 상기 환자로부터 얻어진 시료 내에 직장암의 존재를 표시하는 인자의 존재 검사 및 직장암의 진행 경향을 검출하기 위한 유전자 검사로 이루어지는 군 중에서 선택되는 방법.
131. 제129항에 있어서, 상기 직장암의 존재를 표시하는 인자는 암태아항원 (CEA)인 방법.
132. 제129항에 있어서,
     직장암의 진행 경향을 검출하기 위한 유전자 검사는 선종성 폴립증 (APC) 유전자 내의 돌연변이를 검출하기 위한 유전자 검사인 방법.
133. 제117항에 있어서,
     상기 환자는 이전에 직장암 치료를 받았고 상기 시료가 얻어질 때 경감된 방법.
134. 제117항에 있어서,
     상기 미리결정된 값은 직장암이 없는 인간의 집단으로부터 얻은 동일한 종류의 시료 내의 평균 프로가스트린 농도를 기초로 하는 방법.
135. 제117항에 있어서,
     상기 미리결정된 값은 상기 환자가 직장암이 없을 때 상기 환자로부터 얻은 동일한 종류의 시료 내의 과거 평균 프로가스트린 농도를 기초로 하는 방법.

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