JP5930972B2 - 結腸直腸癌を処置するための方法 - Google Patents
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Description
本願は、仮出願第61/293,612号(2010年1月8日出願)及び仮出願第61/367,855号(2010年7月26日出願)の35 U.S.C. § 119(e)下の利益を主張し、全ての内容がその全体において参照により本明細書において組み入れられる。
配列リストを本明細書と同時に提出する。
本開示は、とりわけ、プロガストリンについて特異的な抗体を含む組成物を投与することにより結腸直腸癌の転移及び再発を処置及び防止する方法に向けられる。
数十年の基礎及び臨床研究にもかかわらず、結腸直腸癌は人類の最も致命的な非伝染性疾患の1つのままである。世界保健機関の国際がん研究機関のGLOBOCANプロジェクトによれば、2008年に結腸直腸癌の発生は120万を上回っており、同年に60万を超える人々がこの疾患により殺されたと推定された。多くのことが、近年、結腸直腸癌が分子レベルでどのように作用するかについて学ばれてきたが、臨床医は、依然として、一世代前の癌専門医が精通してきたであろう治療様式(例えば手術、放射線、及び化学療法など)に頼っている。早期診断が、画像テクノロジー及び分子診断における進歩(任意の処置の成功における大きな要因)により可能になった。全てのこれらの処置の効力が長年にわたり改善されてきたが、治癒率における改善及び寿命における増加は漸進的である。分子腫瘍学における革命に起因する新たな標的治療さえ、大半の部分について、適度にだけ転帰を改善してきた。
本開示は、プロガストリンに特異的に結合する抗体を含む組成物の治療的に効果的な量を投与することにより、転移性結腸直腸癌のための処置を必要とする患者を処置するために有用な方法を提供する。一部の実施態様において、処置される転移性結腸直腸癌は、肝臓、肺、脳、又はリンパ節に位置する。
7.1. 結腸直腸癌転移
転移は、癌が広がるプロセスを指す。簡単には、腫瘍細胞は、原発腫瘍を離れ、血液循環又はリンパ系を介して新たな組織部位へ移動し、二次腫瘍を形成する。新たな組織部位の腫瘍は転移性腫瘍として言及され、典型的には、原発腫瘍の供給源を同定する。例えば、他の組織に広がっている結腸直腸癌は、二次性の転移性腫瘍の組織部位にもかかわらず、「転移性結腸直腸癌」として言及される。結腸直腸癌が転移する最も共通の臓器は肝臓及び肺であるが、しかし、結腸直腸癌は他の臓器にも広がりうる。
結腸直腸癌の再発は、結腸直腸癌を見かけ上消失させた処置の後での結腸直腸癌の戻りとして定義される。戻りの結腸直腸癌が最初の癌と同じ場所にある、又はそれに非常に近接している場合、それは局所再発として公知である。戻りの結腸直腸癌が、最初の癌の場所の近くのリンパ節又は組織において成長する場合、それは局所再発として公知であり、戻りの結腸直腸癌が、最初の癌の場所から遠い臓器又は組織に転移した場合、それは遠隔再発として公知である。
固形腫瘍は必ずしも均質な組織ではない。むしろ、一部の腫瘍は、別々の表現型特性及び機能特性を有する複数の異常な細胞型を含む。この点において、そのような腫瘍は異常な臓器に類似する。固形腫瘍を含む細胞の間での1つの重要な違いは、同じ宿主中の新たな部位に、又は同じもしくは異なる種の新たな宿主に移植した場合に新たな腫瘍の形成を開始することが可能である範囲である。この特性を有する細胞は、腫瘍又は癌を開始する細胞、又は、あるいは、腫瘍又は癌幹細胞として公知である。対照的に、腫瘍を構成する他の細胞は、より多くの細胞が使用される場合でさせ、移植後の新たな腫瘍を開始するずっと低下した潜在力を有する。1つの非限定的な例において、ヒト腫瘍に由来する数百の結腸癌幹細胞が、マウス中への移植後に新たな腫瘍を開始するのに十分であったのに対し、腫瘍からの10,000個の非幹細胞はそのようにするには不十分であった。Dalerba, P., et al., 2007, "Phenotypic characterization of human colorectal cancer stem cells," Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 104: 10158-10163.
癌幹細胞の特性を伴う腫瘍細胞が同定されており、放射線及び/又は化学療法剤に対して増強した抵抗性を示す。異なる分子機構が、放射線又は化学療法剤に対する癌幹細胞の抵抗性を説明するために提案されている。例えば、特定の癌幹細胞が遺伝毒性傷害後にそれらのDNAをより容易に修復することができうるのに対し、他の癌幹細胞は、高レベルの抗アポトーシスタンパク質又はそのような細胞に入る化学療法剤を除去するために効果的な分子ポンプを発現すると報告されている。Eyler, C.E., and J.N. Rich, J. Clin.Oncol., 26: 2839-2845 (2008).癌幹細胞が前駆細胞よりも遅く増殖することも、また、塊の腫瘍細胞を殺しうる放射線及び毒性化学療法剤への暴露で生き残る幹細胞の比較上の能力を説明しうる。
驚くべきことに、プロガストリン感受性の転移性結腸直腸癌細胞及び結腸直腸癌幹細胞が存在することが発見されており、プロガストリン(「PG」)に特異的に結合し、インビトロ又はインビボでそのような細胞の成長を阻害する特定の抗体の能力により実証される通りである。
本明細書に開示する方法及びキットにおいて有用な抗体は、ガストリン遺伝子の他の産物を上回りヒトプロガストリンに特異的に結合するものである。図30に例証する通り、ガストリン遺伝子は、101アミノ酸ポリペプチド(プレプロガストリンと呼ばれる)に翻訳され、それは、切断されて、プロガストリン(80アミノ酸ポリペプチド)を生じるシグナル配列(下線)を含む。プロガストリンは、順に、切断されて、34アミノ酸産物(配列において、プロガストリンの残基38−71に対応する)を生成し、それは、次に、グリシン残基を用いてそのカルボキシ末端で伸長されて、グリシン伸長G34(「G34−Gly」)を生成する。この切断の副産物は、6アミノ酸ペプチド(C末端隣接ペプチド、又はCTFPと呼ばれる)であり、それは、配列において、プロガストリンの残基75−80に対応する。G34−Glyは、次に、さらに切断されて、配列において、プロガストリンの残基55−71に対応し、G17−Glyとして言及される17残基ポリペプチドを生成する。G34−Gly及びG17−GlyのC末端グリシンの除去、それに続くC末端アミド化は、それぞれG34及びG17をもたらし、それらの両方がC末端アミド化されている。
(a)配列において、MAb1、MAb2、MAb3、MAb4、MAb15、MAb16、MAb17、MAb18、MAb19、又はMAb20のVL CDRに対応するVL CDR、及び、配列において、MAb1、MAb2、MAb3、MAb4、MAb15、MAb16、MAb17、MAb18、MAb19、又はMAb20のVH CDRに対応するVH CDRを有する抗体;
(b)配列において、MAb1、MAb2、MAb3、MAb4、MAb15、MAb16、MAb17、MAb18、MAb19、又はMAb20のVL及びVH CDRに対応するVL CDR及びVH CDRを有する抗体;
(c)抗体、それにおいて:
(i)VL CDR 1はQSIVHSNGNTY(「VL CDR 1.3」;配列番号4)、QSLVHSSGVTY(「VL CDR 1.4」;配列番号10)、QSLLDSDGKTY(「VL CDR 1.16」;配列番号50)、及びSQHRTYT(「VL CDR 1.19」;配列番号51)より選択される;
(ii)VL CDR2はKVS(「VL CDR 2.3」及び「VL CDR 2.4」;配列番号5)、LVS(「VL CDR 2.16」;配列番号53)、及びVKKDGSH(「VL CDR 2.19」;配列番号54);
(iii)VL CDR3はFQGSHVPFT(「VL CDR 3.3」; 配列番号6)、SQSTHVPPT(「VL CDR 3.4」;配列番号11)、WQGTHSPYT(「VL CDR 3.16」;配列番号57)、及びGVGDAIKGQSVFV(「VL CDR 3.19」;配列番号58)より選択される;
(iv)VH CDR1はGYIFTSYW(「VH CDR 1.3」;配列番号1)、GYTFSSSW(「VH CDR 1.4」;配列番号7)、GYTFTSYY(「VH CDR 1.16」;配列番号39)、及びGYSITSDYA(「VH CDR 1.19」;配列番号40)より選択される;
(v)VH CDR2はFYPGNSDS(「VH CDR 2.3」;配列番号2)、FLPGSGST(「VH CDR 2.4」;配列番号8)、INPSNGGT(「VH CDR 2.16」;配列番号43)、及びISFSGYT(「VH CDR 2.19」;配列番号44)より選択される;及び
(vi)VH CDR3はTRRDSPQY(「VH CDR 3.3」;配列番号3)、ATDGNYDWFAY(「VH CDR 3.4」;配列番号9)、TRGGYYPFDY(「VH CDR 3.16」;配列番号47)、及びAREVNYGDSYHFDY(「VH CDR 3.19」;配列番号48)より選択される;
(d)配列において、MAb1、MAb2、MAb3、MAb4、MAb15、MAb16、MAb17、MAb18、MAb19、又はMAb20のVLに対応するVL、及び、配列において、MAb1、MAb2、MAb3、MAb4、MAb15、MAb16、MAb17、MAb18、MAb19、又はMAb20のVHに対応するVHを有する抗体;及び
(e)配列において、MAb1、MAb2、MAb3、MAb4、MAb15、MAb16、MAb17、MAb18、MAb19、又はMAb20のVL及びVHに対応するVL及びVHを有する抗体
を含む。
(f)配列において、MAb5、MAb6、MAb7、MAb8、MAb9、MAb10、MAb11、MAb12、MAb13、MAb14、MAb21、MAb22又はMAb23のVL CDRに対応するVL CDR、及び、配列において、MAb5、MAb6、MAb7、MAb8、MAb9、MAb10、MAb11、MAb12、MAb13、MAb14、MAb21、MAb22、又はMAb23のVH CDRに対応するVH CDRを有する抗体;
(g)配列において、MAb5、MAb6、MAb7、MAb8、MAb9、MAb10、MAb11、MAb12、MAb13、MAb14、MAb21、MAb22、又はMAb23のVL及びVH CDRに対応するVL及びVH CDRを有する抗体;
(h)抗体、それにおいて:
(vii)VL CDR1はKSLRHTKGITF(「VL CDR 1.8」;配列番号49)及び QSLLDSDGKTY(「VL CDR 1.13」;配列番号50)より選択される;
(viii)VL CDR2はQMS(「VL CDR 2.8」;配列番号52)及び LVS(「VL CDR 2.13」;配列番号53)より選択される;
(ix)VL CDR3はAQNLELPLT(「VL CDR 3.8」;配列番号55)及び WQGTHFPQT(「VL CDR 3.13」;配列番号56)より選択される;
(x)VH CDR1はGFTFTTYA(「VH CDR 1.8」;配列番号37)及び GFIFSSYG(「VH CDR 1.13」;配列番号38)より選択される;
(xi)VH CDR2はISSGGTYT(「VH CDR 2.8」;配列番号41)及び INTFGDRT(「VH CDR 2.13」;配列番号42)より選択される;及び
(xii)VH CDR3はATQGNYSLDF(「VH CDR 3.8」;配列番号45)及び ARGTGTY(「VH CDR 3.13」;配列番号46)より選択される;
(i)配列において、MAb5、MAb6、MAb7、MAb8、MAb9、MAb10、MAb11、MAb12、MAb13、MAb14、MAb21、MAb22、又はMAb23のVLに対応するVL、及び、配列において、MAb5、MAb6、MAb7、MAb8、MAb9、MAb10、MAb11、MAb12、MAb13、MAb14、MAb21、MAb22、又はMAb23のVHに対応するVHを有する抗体;及び
(j)配列において、MAb5、MAb6、MAb7、MAb8、MAb9、MAb10、MAb11、MAb12、MAb13、MAb14、MAb21、MAb22、又はMAb23のVL及びVHに対応するVL及びVHを有する抗体
を含む。
(k)本明細書に開示される任意の3つのVL CDR及び任意の3つのVH CDR;
(l)配列番号21に対応するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号22に対応するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域;
(m)配列番号23に対応するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号24に対応するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域;
(n)配列番号75、77、及び79からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ならびに配列番号76及び78からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域;
(o)配列番号80及び82からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ならびに配列番号81及び83からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域;
(p)配列番号84、86、及び88からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ならびに配列番号85、87、及び89からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域;及び
(q)配列番号90、92、及び94からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ならびに配列番号91、93、及び95からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
を含む抗体を含む。
転移性結腸直腸癌は、生物学的治療、標的治療、抗体治療、放射線治療、化学療法、手術、凍結手術、又はこれらの組み合わせを用いて処置されうる。転移性結腸直腸癌のための他の処置も可能である。
本開示は、転移性結腸直腸癌を処置及び防止し、結腸直腸癌の再発を防止し、及び結腸直腸癌幹細胞の成長を防止する目的のために、被験者に組成物中で抗PG抗体を投与することを含む治療方法を提供する。特定の実施態様において、抗体はヒトプロガストリン(「hPG」)について特異的であり、他の実施態様において、そのような抗体はモノクローナル抗体である。
上に記述する通り、原発性及び/又は転移性結腸直腸癌を伴う患者は、上昇したPGの血漿及び/又は血清レベルを有するのに対し、健常個人におけるPGのベースラインレベルは無視できる。原発性及び/又は転移性結腸直腸癌を伴う被験者におけるPG血漿及び/又は血清レベルを測定可能であり、約25pM又はそれより大きい。この観察に基づき、PGの血漿及び/又は血清レベルを使用して、とりわけ、原発性又は転移性結腸直腸癌の処置の有効性をモニターし、原発性又は転移性結腸直腸癌の存在を検出及び診断し、抗PG抗体を用いた処置から利益を得うる被験者を選択することができる。
本開示は、また、いずれの被験者がテストされうるのかに従って、特定の実施態様を提供し、原発性又は転移性結腸直腸癌の存在あるいは処置後の結腸直腸癌の再発を検出する目的のために、適切なベースラインと比較して、それらが体液(例えば血液、血漿、血清、又はその他など)において上昇したPGレベルを有するか否かを決定する。
本発明の方法における使用のための抗hPG抗体は、組成物として製剤化することができる。場合により、組成物は、1つ又は複数の追加の治療用薬剤(例えば、転移性結腸直腸癌又は結腸直腸癌の再発に対する治療的効力を伴う化学療法剤又は他の抗体など)を含むことができる。組成物は、医薬的に許容可能な担体を通例含む無菌の医薬的組成物の部分として通常供給される。この組成物は、患者にそれを投与する所望の方法に依存して、任意の適した形態でありうる。
特定の実施態様において、本発明は、臨床医又は他のユーザーによる使用のための医薬的キットを提供する。医薬的キットは、開示の抗hPG抗体(例、凍結乾燥形態又は水溶液のいずれか)及び以下:本開示において他に記載する少なくとも第2の治療用薬剤;抗hPG抗体を投与するためのデバイス(例、ニードル及び/又はシリンジ);及び抗体が凍結乾燥又は濃縮形態である場合、抗体を再懸濁又は希釈するための医薬品グレードの水又は緩衝液の1つ又は複数を含むパッケージである。キットは、また、抗体組成物を調製する及び/又は組成物を患者に投与するための指示を含みうる。
本発明の中和性抗hPG抗体を含む組成物は、一般的に、少なくとも部分的に所望の結果を達成するために効果的な投与量で、結腸直腸癌転移を処置又は防止するあるいは結腸直腸癌の再発を防止することを必要とする被験者に投与される。
実施例1:転移性結腸直腸癌細胞におけるガストリン遺伝子の発現
この例では、ヒト原発性結腸直腸癌細胞株HT29、HCT116、RKO、SW480、及びDLD1、ならびに転移性結腸直腸癌細胞株SW620及びT84におけるガストリン(GAST)遺伝子の発現を記載する。ヒト原発性結腸直腸腫瘍からの生検サンプルから単離された細胞もテストした(CRC1)。SW620細胞は、元々は、デュークスステージC結腸直腸腺癌と診断された患者のリンパ節転移に由来した。T84細胞は、元々は、結腸直腸癌と診断された患者の肺転移に由来した。
標準的技術を使用して、GAST mRNAの発現は、HT29、HCT116、RKO、SW480、DLD1、SW620、及びT84細胞株のRNA調製物からの定量的RT−PCRを使用して定量した。データを、RKO原発性結腸直腸癌細胞株において見出されたガストリンmRNA発現レベルとの比較で表現する。RKO細胞は、通例、低レベルのプロガストリンを発現する。相対的なガストリンmRNAレベルは対数スケールで報告されていることに留意すること。
定量的RT−PCRにより測定したガストリン遺伝子発現レベルを図1に示す。検証した全ての原発性及び転移性結腸直腸癌細胞が、ガストリン遺伝子を発現したが、しかし、変動レベルであった。翻訳後プロセシングを通じて、ガストリン遺伝子産物はプロガストリンに変換されうる。
この実施例では、患者から外科的に切除した対応する原発性及び転移性結腸直腸腫瘍におけるガストリン遺伝子の発現を記載する。
原発性及び転移性結腸直腸腫瘍を、適用可能な倫理ガイドラインに従って、患者から外科的に切除した。標準的技術を使用して、RNAを腫瘍組織サンプルから調製し、ガストリンmRNAを定量的RT−PCRにより測定した。転移性腫瘍におけるガストリンmRNAの発現を、同じ患者から取った、対応する原発腫瘍における発現のレベルと比べて標準化した。
11人の患者からの転移性結腸直腸腫瘍において発現されたガストリンmRNAのレベルを、同じ患者からの対応する原発腫瘍における発現と比べて、図2に示す。試験した全ての原発性及び転移性結腸直腸腫瘍が、ガストリン遺伝子を発現したが、転移性腫瘍における発現レベルは、対応する原発腫瘍と比べて、異なる患者の間で広範に変動した。
この実施例では、3つの異なる転移性結腸直腸癌細胞によるプロガストリンの分泌の定量化を記載する。
細胞を60%コンフルエンスまで通常のプラスチック75cm2フラスコ中で成長させた。培地を次に除去し、細胞を、PBSを用いて1回リンスした。20mlのM11培地(フェノールレッドを伴わない)を次にフラスコに加えて、細胞を追加の48時間にわたりインキュベートした。培地を次に回収し、1,000gで5分間にわたり遠心し、細胞デブリを除去し、−80℃で凍結した。細胞を次にトリプシン処理し、カウントした。
図3は、3つの転移性結腸直腸癌細胞株により調整された培地中でのプロガストリンの濃度を示す。データを、プロガストリン濃度(pM)/100万個の細胞/48時間の成長として表現する。この実験において、Colo−205細胞は、使用されるアッセイの検出限界内でPGを産生しなかった。
この実施例では、原発性結腸直腸癌及び無転移を伴う患者、転移性結腸直腸癌を伴う患者、及び原発腫瘍を外科的に除去された転移性結腸直腸癌を伴う患者におけるプロガストリンの血漿及び血清レベルの定量化について記載する。
血漿又は血清プロガストリン濃度を、コントロールとして健常個人において、及び結腸直腸癌を伴う患者において測定した。健常コントロールサンプル(N=104)を血液バンクから得た。結腸直腸癌患者は3群を構成した。第1に、サンプリング時に原発癌と診断された転移を伴わない患者(T+M−;n=16)。第2に、サンプリング時に転移性疾患と診断された患者(T+M+;n=24)。及び、第3に、サンプリング時に転移性疾患と診断された患者であって、しかし、それらから、原発腫瘍は外科的に切除されていなかった(T−M+;n=46)。転移性疾患を伴う患者の大多数(即ち、24人のT+M+患者の15人及び46人のT−M+患者の41人)が、サンプリング時に化学療法を受けていた、又は、ちょうど受けた。
図4のボックスプロットは、健常コントロールと比較した、アッセイされた結腸直腸癌患者の3群における血清プロガストリン濃度の25パーセンタイル、中央値、及び75パーセンタイル血漿を示す。ウィスカーは、血漿又は血清プロガストリン濃度の5及び95パーセンタイルを示す。T+又はT−は、それぞれ、原発腫瘍がまだその場所ある又は切除されていることを示す;M+又はM−は、それぞれ、転移が患者において検出された又は検出されなかったことを示す。表4は、生データの統計分析の要約を含む。
この実施例では、培養中のSW620ヒト転移性結腸直腸癌細胞株の成長に対する抗hPGポリクローナル抗体の効果を記載する。
SW620細胞を6ウェルプレート中に播種し、一晩、血清飢餓させ、次に、12時間毎にPBS、3マイクログラム/mlコントロール抗体(ポリクローナルウサギ抗ヒトIgG, Affinity BioReagents, Ref #SA1-600)又は抗PGポリクローナル抗体を用いて処理した。実験を2通りに行い、技術者は、処理溶液の内容物に関して盲検化された。処置の開始から72時間後、各ウェル中の生存細胞の数を3回カウントした。
図5に示す通り、抗PGポリクローナル抗体を用いた処理によって、72時間の期間にわたりSW620細胞の成長における43.5%減少を起こした(p=0.0294、マンホイットニー検定;n=2)。この実験の結果は、PGに対するポリクローナル抗体が、インビトロでの転移性結腸直腸癌細胞の成長を低下させるために効果的であることを実証する。
この実施例では、培養中のSW620ヒト転移性結腸直腸癌細胞株の成長に対する抗hPGモノクローナル抗体の効果を記載する。
SW620細胞を6ウェルプレート中に播種し、一晩、血清飢餓させ、次に、12時間毎にPBS、3マイクログラム/mlコントロール抗体(マウス抗ヒトIgG1, Calbiochem, Ref #411451)又は4つの異なる抗PGモノクローナル抗体MAb3、MAb4、MAb2、及びMAb1を用いて処理した。実験を2通りに行い、技術者は、処理溶液の内容物に関して盲検化された。処置の開始から48時間後、各ウェル中の生存細胞の数を6回カウントし、平均した。
SW620細胞を、MAb1−MAb4を用いて処理した結果(図6Aに示す)を、実験の終了時での平均細胞数/ウェル−実験の開始時に播種した細胞数として算出した。生の数値及び統計値(マンホイットニー検定)を表5に示す。この実験の結果は、PGに対する異なるモノクローナル抗体が、コントロール抗体と比較して、インビトロでSW620転移性結腸直腸癌細胞の成長を低下させるために効果的であることを実証する。結果は、また、PGに対する全てのモノクローナル抗体が、コントロール抗体と比較して、細胞の成長を低下させるために効果的であったが、2つの抗体MAb3及びMAb4は、他よりも効果的であったことを示す。
この実施例では、培養中のT84ヒト転移性結腸直腸癌細胞株の成長に対する抗hPGモノクローナル抗体の効果を記載する。
この実験のために用いられた方法は、使用された抗プロガストリン抗体が抗hPG MAb3であったことを除き、SW620細胞に対する抗プロガストリンモノクローナル抗体の効果を測定するために使用されたものと同様であった。
結果(図7に示す)を、実験の終了時での平均細胞数/ウェル−実験の開始時に播種した細胞数として算出した。統計分析の要約を表6に示す。この実験の結果は、抗hPG MAb3が、コントロール抗体と比較して、インビトロでのT84転移性結腸直腸癌細胞の成長を低下させるために効果的であることを実証する。
この実施例では、ヌードマウス中への移植後に肝臓転移を形成するSW620細胞の能力に対する抗PGポリクローナル抗体の効果が記載される。
合計5×106個のSW620細胞を、6週齢の31匹のBALBc/ヌードマウスの各々の脾臓中に注射した。細胞の注射から2分後、脾臓を外科的に除去した。4日間の回復後、マウスを無作為に3群に分け、その各々を3つの異なる処置の1つに供した。具体的には、11匹のマウスに、PBSを用いて注射し、10匹に、PBS中に希釈したコントロール抗体を用いて注射し、10匹のマウスに、抗PGポリクローナル抗体(またPBS中に希釈した)を用いて注射した。抗体の用量は、容積150マイクロリットル中8mg/kgであった。注射を腹腔内に6週間にわたり2回/週行った。6週間後、注射のコースが終わった後、マウスを、二酸化炭素を用いて安楽死させ、肝臓を除去し、存在する目に見える転移の数をカウントした。肝臓及び転移もパラフィン包埋及び免疫組織化学分析のために調製した。
抗hPGポリクローナル抗体を用いて処置したマウスから目に見える転移を伴わない肝臓の写真を図8Aに示す。コントロールポリクローナル抗体を用いて処置したマウスからの目に見える転移を伴う肝臓の写真を図8Bに示す。表7は、抗hPGポリクローナル抗体を用いて処置したマウスからの各肝臓においてカウントされた転移の数を示す。表8は、コントロールポリクローナル抗体を用いて処置したマウスからの各肝臓においてカウントされた転移の数を示す。表9は、PBSを用いて処置したマウスからの各肝臓においてカウントされた転移の数を示す。図9は、転移の数対治療群のグラフィカルな表示である。
この実施例では、ヌードマウス中への移植後に肝臓転移を形成するSW620細胞の能力に対する抗PGモノクローナル抗体の効果が記載される。
合計5×106個のSW620細胞を、5週齢の20匹のBALBc/ヌードマウスの各々の脾臓中に注射した。細胞の注射から2分後、脾臓を外科的に除去した。回復後、マウスを無作為に2群に分け、その各々を2つの異なる処置の1つに供した。具体的には、10匹のマウスに、PBS中に希釈したコントロール抗体(抗ヒトIgG1Fc)を用いて注射し、10匹のマウスに、抗hPGモノクローナル抗体MAb3(またPBS中に希釈した)を用いて注射した。抗体の用量は、容積150マイクロリットル中8mg/kgであった。注射を腹腔内に6週間にわたり2回/週行った。1週間に1回、各マウスの体重を量った。6週間後、注射のコースが終わった後、マウスを、二酸化炭素を用いて安楽死させ、肝臓を除去し、存在する目に見える転移の数をカウントした。
結果を図11に示す。転移の平均数は、コントロール抗体を投与されたマウスにおいて7.3であり、抗hPGモノクローナル抗体MAb3を用いて処置されたマウスにおいて4.3であった。これは41%の減少に対応し、p=0.0372で統計的に有意である。統計分析を以下の表10に示す。処置マウスにおける肝臓転移の平均重量は、また、コントロールマウスにおける167mgと比較して、96mgに減少したが、この差は統計的な有意性に達するように算出されなかった。
この実施例では、結腸直腸癌細胞株での結腸幹細胞表面マーカーLGR5の発現に対する低付着培養条件下での成長の効果を記載する。テストした細胞は、原発性結腸直腸癌及び転移性結腸直腸癌細胞株からの細胞、ヒト原発性結腸直腸癌から得られた生検サンプルからの細胞を含んだ。低付着培養条件は、スフェロイドとしての癌幹細胞の成長のために濃縮し、結腸直腸癌幹細胞のための有用なアッセイツールを提供することができる。
テストした細胞は、原発性結腸直腸癌細胞株HT29及びHCT116、及び転移性結腸直腸癌細胞株SW620及びT84からであった。
2つの培養条件下での細胞の成長に起因するLGR5発現結腸直腸癌細胞の相対的なパーセンテージを図12に示す。テストした全ての細胞株について、LGR5発現細胞のパーセンテージは、細胞が、従来の条件(灰色バー)下での成長と比較して、低付着培養条件(黒色バー)下でスフェロイドとして成長させた場合により大きかった。パターンは、原発性結腸直腸癌細胞株(HT29及びHCT116)、ならびに転移性結腸直腸癌細胞株(SW620及びT84)に由来する細胞について同様であった。
この実施例では、原発性及び転移性結腸直腸癌細胞株、ならびに低付着培養条件下で成長させたヒト原発性結腸直腸癌から得られた生検サンプルからの細胞におけるガストリン遺伝子の発現に対する効果について記載する。そのような成長条件によって癌幹細胞が濃縮される。
テストした細胞は、原発性結腸直腸癌細胞株HT29、HCT116、RKO、SW480、及びDLD1、ならびに転移性結腸直腸癌細胞株SW620及びT84からであった。ヒト原発性結腸直腸腫瘍からの生検サンプルから単離された細胞もテストした(CRC1)。細胞を、2つの異なる培養条件下で成長させた。第1に、細胞を、哺乳動物細胞の成長のための従来のカルチャウェア(プラスチック表面への細胞付着を促進する)において、上に記載する通りに成長させた。第2に、細胞を、また、低付着カルチャウェア(哺乳動物細胞は、典型的には、不十分に付着する)において成長させた。成長の期間後、細胞を再懸濁及び溶解し、mRNAを、標準的技術を使用して単離した。ガストリン遺伝子の発現を、次に、標準技術に従って定量的RT−PCRを使用して測定した。各実験を3回反復した。
従来の低付着培養条件下でテストした異なる細胞において発現されるガストリンmRNAの相対的レベルを図13に報告する。レベルを、RKO原発性結腸直腸癌細胞株において発現されるガストリンmRNAの量と比べて標準化した。RKO細胞は、通例、低レベルのプロガストリンを発現する。相対的なガストリンmRNAレベルは対数スケールで報告されていることに留意すること。テストした全ての細胞株(RKO細胞を除く)について、ガストリン遺伝子発現は、細胞が、従来の条件(灰色バー)下での成長と比較して、低付着培養条件(黒色バー)下で成長させた場合により高かった(時折、何倍もより高かった)。パターンは、原発性結腸直腸癌細胞株、ならびに転移性結腸直腸癌細胞株に由来する細胞について同様であった。
この実施例では、原発性及び転移性結腸直腸癌細胞株、ならびに低付着培養条件下で成長させたヒト原発性結腸直腸癌から得られた生検サンプルからの細胞におけるプロガストリンタンパク質の発現について記載する。そのような成長条件によって癌幹細胞が濃縮される。
テストした細胞は、原発性結腸直腸癌細胞株HT29、及び転移性結腸直腸癌細胞株SW620及びT84からであった。ヒト原発性結腸直腸腫瘍からの生検サンプルから単離された細胞もテストした(CRC1)。細胞を低付着カルチャウェアにおいてM11培地(フェノールレッドを伴わない)中で成長させた。48時間後、培地を回収し、1,000gで5分間にわたり遠心し、細胞デブリを除去し、−80℃で凍結した。細胞を、Accumaxを使用して脱凝集し、カウントした。分泌されたプロガストリンを測定するために、凍結した培地を氷上で解凍し、次に、タンパク質コンセントレータ(Icon, Pierce)を使用して、2,500gで45分間にわたる遠心により容積500μlまで40倍濃縮した。プロガストリン濃度を、次に、サンドイッチELISA技術を使用して測定した。各実験を2回反復した。
低付着培養条件下での48時間の成長後に結腸直腸癌細胞により成長培地中に分泌されたプロガストリンの濃度を図14に示す。テストした全ての細胞(1つの原発性結腸直腸癌細胞株、2つの転移性結腸直腸癌細胞株、及びヒト原発性結腸直腸癌から得られた生検サンプルからの細胞を含む)は、低付着培養条件においてスフェロイドとして成長させた場合、プロガストリンを分泌した。しかし、SW620細胞は、試験下の他の細胞株よりも実質的に少ないプロガストリンを分泌した。データを、プロガストリン濃度(pM)/100万個細胞/48時間の成長として表現した。
この実施例では、原発性結腸直腸癌細胞株、ならびに低付着培養条件下で成長させたヒト原発性結腸直腸癌から得られた生検サンプルからの細胞のスフェロイドとしての成長に対する抗プロガストリンポリクローナル抗体の効果について記載する。そのような成長条件によって癌幹細胞が濃縮される。
テストした細胞は、原発性結腸直腸癌細胞株HT29及びHCT116、ならびにヒト原発性結腸直腸腫瘍(CRC1)からの生検サンプルから単離された細胞からであった。細胞を、低付着96ウェルプレート(Corning)のウェルにおいて、M11培地(20ng/ml EGF、10ng/ml FGF、20μg/mlインスリン、N2サプリメント、2μg/mlシプロフラキシン(cyproflaxin)、5μg/mlゲンタマイシン、及び3μg/mlグルコースを伴うDMEM/F12)中に播種した。HT29及びHCT116細胞について、100μl中の合計500個の細胞を、3ウェル/処理条件の各々に加えたのに対し、CRC1細胞について、100μl中の合計500個の細胞を、10ウェル/処理条件の各々に加えた。24時間毎に、細胞を、3μg/mlのポリクローナル抗プロガストリン抗体、又はコントロール抗体(ポリクローナルウサギ抗ヒトIgG、Affinity BioReagents, Ref #SA1-600)を用いて処理した。HT29及びHCT116細胞について10日間の処理、ならびにCRC1細胞について14日間の処理後、各ウェル中の細胞スフェロイドの数をカウントし、1ウェル当たりの平均を算出した。実験を実施する技術者は、テストされている抗体溶液の内容物に関して盲検化された。各実験を2回反復した。
図15〜17に示す通り、コントロール抗体と比較して、抗プロガストリンポリクローナル抗体は、低付着培養条件下で成長させた原発性結腸直腸癌細胞により形成された細胞スフェロイドの数を実質的に低下させた。
この実施例では、そのような細胞を低付着培養条件下で成長させた場合での2つの原発性結腸直腸癌細胞株からのLGR5陽性細胞のスフェロイドとしての成長に対する抗プロガストリンモノクローナル抗体の効果を記載する。そのような成長条件によって癌幹細胞が濃縮される。
テストした細胞は原発性結腸直腸癌細胞株HT29及びHCT116からであった。細胞を、最初に、FACS(FACSaria, BD Biosciences)により選別し、癌幹細胞マーカーLGR5を発現する細胞を単離した。FACSのために、2×106個のHT29細胞を選別し、1×106個のHCT116細胞を選別した。細胞を、2mg/1×106個細胞のLGR5のN末端について特異的な抗体(Abgent, Inc., No.AP2745A)を用いて標識した。FACS後、LGR5陽性細胞を、低付着96ウェルプレートの30ウェルにおいて、密度10個細胞/ウェルで、100μlのM11培地(20ng/ml EGF、10ng/ml FGF、20μg/mlインスリン、N2サプリメント、2μg/mlシプロフラキシン(cyproflaxin)、5μg/mlゲンタマイシン、及び3μg/mlグルコースを伴うDMEM/F12)中に蒔いた。14日間にわたり24時間毎に、細胞を、0.3μg/mlの2つの異なる抗プロガストリンモノクローナル抗体(MAb2及びMAb3)の1つ、又はコントロールモノクローナル抗体(モノクローナルマウス抗ヒトIgG1、Calbiochem, Ref #411451)を用いて処理した。処理の終了時、各抗体型の存在において形成された細胞スフェロイドの数をカウントした。細胞を、次に、追加の17日間成長することを許し、その間に、培地を、さらなる抗体処理を伴わず、毎週新しくした。実験を実施する技術者は、テストされている抗体溶液の内容物に関して盲検化された。
図18A及び図19Aにそれぞれ示す通り、2つの原発性結腸直腸癌細胞株(HCT116及びHT29)からのLGR5陽性細胞がスフェロイドとして14日間にわたり低付着培養において成長する能力は、コントロールモノクローナル抗体と比較して、プロガストリンに対する2つの別々のモノクローナル抗体を用いた処理により低下した。
この実施例では、そのような細胞を低付着培養条件下で成長させた場合でのCRC1細胞のスフェロイドとしての成長に対する4つの異なる抗プロガストリンモノクローナル抗体の効果を記載する。そのような成長条件によって癌幹細胞が濃縮される。
CRC1細胞は、標準的な手順に従って、ヒト結腸癌生検から得られた。Accumax(Sigma)中での37℃で45分間にわたり解離させた後、細胞を、低付着96ウェルプレート(Corning)において、密度100個細胞/ウェルで、M11培地(20ng/ml EGF、10ng/ml FGF、20μg/mlインスリン、N2サプリメント、2μg/mlシプロフラキシン(cyproflaxin)、5μg/mlゲンタマイシン、及び3μg/mlグルコースを伴うDMEM/F12)中に蒔いた。各処理群について、10ウェルを使用した。
結果を図20に示す。テストした抗hPGモノクローナル抗体の各々が、低付着培養条件において原発性結腸直腸癌細胞により形成されたスフェロイドの数を低下させるために効果的であった。非特異的モノクローナル抗体及び培地単独と比較して、テストした全ての抗体についての阻害効果は、ボンフェローニの事後検定を用いた一元配置ANOVAを使用し、p<0.05で統計的に有意であった。MAb5、MAb8、及びMAb13が全てhPGのC末端エピトープを認識するのに対し、MAb16はhPGのN末端エピトープに結合する。
この実施例では、そのような細胞を低付着培養条件下で成長させた場合での転移性結腸直腸癌細胞株からのALDH1陽性細胞のスフェロイドとしての成長に対する抗プロガストリンモノクローナル抗体の効果を記載する。
テストした細胞は、転移性結腸直腸癌細胞株T84からであった。細胞を、最初に、FACS(FACSaria, BD Biosciences)により選別し、ALDEFLUORキット(Stemcell Technologies)を使用して癌幹細胞マーカーALDH1を発現する細胞を単離した。FACS後、ALDH1陽性細胞(即ち、検出可能なALDH1酵素活性を示す細胞)を、低付着96ウェルプレートのウェルにおいて、密度100個細胞/ウェルで、100μlのM11培地(20ng/ml EGF、10ng/ml FGF、20μg/mlインスリン、N2サプリメント、2μg/mlシプロフラキシン(cyproflaxin)、5μg/mlゲンタマイシン、及び3μg/mlグルコースを伴うDMEM/F12)中に蒔いた。11日間にわたり24時間毎に、細胞を、3つの異なる濃度(0.01μg/ml、0.1μg/ml、又は1μg/ml)の1つの抗プロガストリンモノクローナル抗体(MAb3)、又は1μg/mlのコントロールモノクローナル抗体(モノクローナルマウス抗ヒトIgG1、Calbiochem, Ref #411451)を用いて処理した。処理の終了時、各抗体の存在において形成された細胞スフェロイドの数をカウントした。実験を実施する技術者は、テストされている抗体溶液の内容物に関して盲検化された。
図21に示す通り、T84転移性結腸直腸癌細胞株からのALDH1陽性細胞が低付着培養においてスフェロイドとして成長する能力は、コントロールモノクローナル抗体と比較して、プロガストリンに対するモノクローナル抗体を用いた処理により用量依存的な様式で低下した。
この実施例では、細胞を低付着培養条件に移した場合、スフェロイドとしての従来の培養条件下でのALDH1陽性CRC1細胞の成長に対する4つの異なる抗プロガストリンモノクローナル抗体を使用した前処理の効果を記載する。
CRC1細胞は、標準的な手順に従って、ヒト結腸癌生検から得られた。37℃で45分間にわたりAccumax(Sigma)中で解離された後、CRC1細胞(100,000個細胞/ウェル)を、抗hPGモノクローナル抗体MAb5、MAb8、MAb13、又はMAb16の存在又は非存在における72時間にわたる無血清DMEM培地中での従来の付着性培養条件下で成長させた。実験を盲検化様式で行った。
結果を図22及び図23に示す。テストした4つの抗hPGモノクローナル抗体の各々は、コントロールと比較して、ALDH1を発現するCRC1原発性結腸直腸癌細胞の数を低下させるために、従来の付着性培養において3日後に効果的であった。これらの抗体の各々は、また、抗体を除去し、細胞を追加の7日間にわたり成長させた後、低付着培養条件における原発性結腸直腸癌細胞により形成されるスフェロイドの数を低下させるために効果的であった。コントロールと比較して、MAb5、MAb8、及びMAb16の阻害効果は、ボンフェローニの事後検定を用いた一元配置ANOVAを使用し、p<0.05で統計的に有意であった。MAb13は、また、コントロールと比較して、スフェロイドの数を低下させたが、効果は統計的有意性に達しなかった。
この実施例では、そのような細胞を低付着培養条件下で成長させた場合での2つの転移性結腸直腸癌細胞株からのALDH1陽性細胞のスフェロイドとしての成長に対する抗プロガストリンモノクローナル抗体を使用した前処理の効果を記載する。
テストした細胞は、転移性結腸直腸癌細胞株T84及びSW620からであった。細胞は、最初に、従来の付着性カルチャウェア中で、抗プロガストリンモノクローナル抗体MAb3(1μg/ml)、コントロールモノクローナル抗体、化学療法剤5フルオロウラシル(5FU 10μM)、又は溶剤ジメチルスルホキシド(DMSO)の存在において72時間にわたり成長させた。処理後、細胞を2つのアッセイに供した。第1において、癌幹細胞マーカーALDH1について陽性の細胞のパーセンテージを、ALDEFLUORキット(Stemcell Technologies)を使用して決定した。第2のアッセイにおいて、各処理群について、細胞を、低付着96ウェルプレートの6ウェル中に、密度500個細胞/ウェルで、bFGF及びEGFを含む100μlの無血清培地中に蒔き、さらなる処理を伴わずに11日間にわたり成長させた。この期間の終了後、1ウェル当たりのスフェロイドの数をカウントした。
図24及び図25にそれぞれ示す通り、ALDH1陽性T84及びSW620転移性結腸直腸癌細胞の数は、コントロールモノクローナル抗体を用いた処理と比較して、抗プロガストリンモノクローナル抗体MAb3を用いた72時間にわたる前処理の結果として低下した。
この実施例では、ヌードマウスにおいて成長するヒト転移性結腸直腸癌から単離された細胞が移植後に新たな腫瘍を形成する能力に対するヒトプロガストリンに特異的なモノクローナル抗体の効果を記載する。
標準的な技術を使用して、免疫不全/BALBcヌードマウスに、ヒト転移性SW620結腸直腸癌細胞の脾臓内注射を与えた。マウスに、次に、抗hPGモノクローナル抗体MAb3又はコントロールモノクローナル抗体を合計6週間にわたり週2回投与した。各抗体について、用量は8mg/kgであった。処置期間の終わりに、組織を、処置及びコントロールの両方のマウスからの転移から解剖した。腫瘍細胞を、Accumaxを用いた解剖組織の処理により脱凝集し、濾過し、カウントした。合計23,800個の生存可能な腫瘍細胞がMAb3を用いて処理したマウスからの転移組織から得られ、36,400個がコントロールマウスから得られた。
図28に示す通り、インビボ転移から単離されたヒト転移性結腸直腸癌細胞の低付着培養におけるスフェロイドとしての成長は、同じ用量のコントロールモノクローナル抗体を用いた処置と比較して、抗プロガストリンモノクローナル抗体MAb3を用いて動物を処置することにより低下した。
PGの血漿及び/又は血清レベルは、以下のアッセイを使用して便利に決定することができる。96ウェルマイクロタイタープレートを、0.5〜10μg/mlのC末端抗hPG抗体、例えば、ウサギC末端抗hPGポリクローナル抗体、又はC末端抗hPG抗体(本明細書に記載する)を用いてコーティングし、次に、一晩インキュベートする。プレートを、次に、PBS−TWEEN(0.05%)中で3回洗浄し、PBS−TWEEN(0.05%)中の2%脱脂乾燥ミルク(w/v)を用いてブロックする。別々に、テストサンプル、コントロールサンプル(ブランク又はPG陰性血漿又は血清サンプル)、及び約5pM(0.5×10−11M)〜約0.1nM(1×10−10M)のhPG参照基準(PG陰性血漿又は血清中で希釈した凍結乾燥hPG)を適切な希釈剤(例、PBS−TWEEN 0.05%)中で調製する。サンプルを、コーティングしたプレート上で2〜4時間にわたり37℃で、又は、あるいは、12〜16時間21℃でインキュベートする。インキュベーション後、プレートを、PBS−TWEEN(0.05%)を用いて3回洗浄し、0.001〜0.1μg/mlのN末端抗hPG抗体、例えば、ポリクローナルN末端抗hPG抗体又はN末端モノクローナル抗hPG抗体(本明細書に記載する)を用いてインキュベートし、21℃で30分間にわたり西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)(Nakane et al., 1974, J. Histochem. Cytochem. 22(12): 1084-1091を参照のこと)に結合させる。プレートを次にPBS−TWEEN(0.05%)中で3回洗浄し、HRP基質を21℃で15分間にわたり加える。反応を、100μlの0.5M硫酸を加えることにより停止させ、光学密度測定値を405nMで取る。テストサンプルhPGレベルを、hPG参照基準に由来する測定値から構築された標準曲線との比較により決定する。
抗hPG抗体の特異性を、以下の通りにELISAアッセイを使用して便利に決定することができる。96ウェルプレートを、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)中の適切な濃度のテストポリペプチド(例、25及び50ngの組換えヒトPG、ならびに50及び250ngのCTFP又は他のガストリン由来の遺伝子産物)を用いて4℃で一晩インキュベートした。その後、ウェルを、洗浄溶液(PBS及び0.1%TWEEN−20)を用いて3回洗浄し、次に100μlのブロッキング溶液(PBS、0.1%TWEEN−20、0.1%ウシ血清アルブミン又はカゼイン加水分解物)を用いて22℃で2時間にわたりインキュベートした。ブロッキング後、ウェルを3回洗浄し、アッセイする抗体(テスト抗体)を加える。100μlのPBS中のテスト抗体(0.3〜1ng/ml)及び0.1%TWEEN−20を各ウェルに加える。プレートを次に22℃で2時間にわたりインキュベートし、その後、テスト抗体溶液を捨て、洗浄工程(3×100μlの洗浄溶液、上に記述する通り)後、二次抗体、西洋ワサビペルオキシダーゼに結合させたヤギ抗マウスIgG(Fc)抗体を含むブロッキング溶液を用いて置換する。二次抗体を用いた1時間のインキュベーション後、100μlの基質溶液(例、Fast OPD、又はO−フェニレンジアミン二塩酸塩、Sigma-Aldrich Co.から入手可能、製造者の指示に従って調製した)を各ウェルに加え、暗所で、22℃で20分間にわたりインキュベートした。反応は、50μlの4N硫酸を加えることにより停止させ、触媒された基質の量を、492nmでの光学密度(OD)を測定することにより決定する。基質変換は、抗原に結合した一次(テスト)抗体の量に比例する。実験を2通りに実行し、OD測定値を抗原濃度の関数としてプロットする。テスト抗体は、測定されたODがhPGについて0.2〜1.5の間であり、CTFP又は他のガストリン遺伝子由来ペプチドのいずれかを用いて、バックグラウンドを上回る統計的に有意なシグナルはない場合、PGについて特異的であるとスコア化される(ここで、バックグラウンドはPBSだけを含むコントロールウェルからの平均シグナルである)。
特異的な抗hPG抗体が中和性であるか否かを評価するための特定のテストを、以下の通りに実行することができる。結腸直腸癌細胞を6ウェルプレート中に約50,000〜100,000個細胞/ウェルで播種する。細胞を、次に、テスト抗hPG抗体又はコントロール抗体を用いて、約5μg/mlの抗体濃度で48時間にわたり12時間間隔で処理する。テスト抗体は、テスト抗体を用いて処理した細胞の数が、コントロールの非特異的抗体を用いて処理した細胞の数と比較して、生存細胞の数における少なくとも10%の統計的に有意な低下を示す場合(両側マンホイットニー検定(差は、p<0.05の場合に有意と考えられる)を使用する)、アッセイにおいて中和性であるとして定義される。全細胞数は、処理期間の開始時での細胞数について補正され、T0として言及される。このアッセイにおける使用のための例示的な結腸直腸癌細胞は、しかし、限定しないが、本明細書に開示する原発性及び転移性結腸直腸癌細胞株を含む。
抗hPG抗体の親和性定数は、Proteon Technique(BioRad)を使用して、Nahshol et al., 2008, Analytical Biochemistry 383: 52-60(その全体において参照により本明細書により組み入れられる)に従って測定することができる。簡単には、マウス抗PG抗体について、抗マウスIgG抗体(50μg/ml)を最初にセンサーチップ上にコーティングし、抗体の注射後にチップにより検出されたシグナルが10,000〜11,500応答単位(RU)の間に入ることを確認する。目的のマウス抗hPG抗体(テスト抗体)を次に注射する(30μg/mlの典型的な濃度で)。テスト抗体が十分に結合する場合、少なくとも500RUの追加シグナルが観察される。テスト抗体とhPGの間での結合の時間経過を、次に、hPGの変動濃度、例えば、200nM、100nM、50nM、25nM、及び12.5nMを注射し、結合のレベルを検出することにより得る。典型的には、いくつかのチャンネルが、単一の実験において並行して複数の抗体をテストするために利用可能であり、hPGの異なる濃度で並行して単一のテスト抗体の結合をアッセイすることを可能にする。1つのチャネルを、非特異的結合についてのコントロールとして、hPGに特異的ではないマウスモノクローナル抗体を用いて注射すべきである。別のチャネルを、バックグラウンドシグナルについてのベースラインとして、希釈緩衝液単独を用いて注射すべきである。一般的に、結合は、非特異的マウス抗体を用いて注射したチャネルにおいて検出可能ではない。この設定において高レベルの結合を示す抗体は、hPGによる捕捉モノクローナル抗体の飽和をもたらしうるが、より低いhPG濃度(50nM、25nM、12.5nM、6.25nM、及び3.125nM)に対してテストすることができ、より洗練された測定を許す。
目的の抗体(テスト抗体)が、hPG結合について、ビオチン化参照抗hPG抗体と競合するか否かを評価するための特定のアッセイを、以下の通りに実施することができる。96ウェルプレートを、捕捉抗hPG抗体 (ビオチン化参照抗hPG抗体により認識されるエピトープとは異なるhPGのN又はC末端領域を認識するポリクローナル又はモノクローナル抗体)を用いて、1〜10μg/mlの範囲内で選ばれる濃度で、4℃で一晩コーティングする(0.1〜1μg/ウェル)。22℃で2時間にわたるブロッキングバッファー(PBS中の0.1% TWEEN−20、0.1%BSA)を用いたブロッキング後、組換えhPGを、10pM〜1nM(10〜1000pg/ウェル)の間の範囲の濃度で加え、22℃で2時間にわたりインキュベートする。その後、ビオチン化参照抗hPG抗体(又はビオチン化参照抗hPG抗体を含む混合物)を、増加濃度の非標識テスト抗体濃度と共に加え、22℃で1時間にわたりインキュベートする。非結合抗体を除去するための洗浄後、結合した標識参照抗hPG抗体の検出を、混合物を、50ng/mlのストレプトアビジン(steptavidin)−HRPを用いて22℃で1時間にわたりインキュベートすることにより実施し、西洋ワサビペルオキシダーゼ用の蛍光基質とのインキュベーション、及び、次に、ルミノメーターにおける相対的な光単位(RLU)の定量化が続く。アッセイを2通りに実施した。
Ki=IC50/(1+([参照抗hPG Ab濃度]/KD 参照抗hPG Ab))
の式に従って算出される。
式中、「IC50」は、参照抗体の結合における50%低下をもたらすテスト抗体の濃度であり、KD 参照抗hPG Abは参照抗hPG抗体の解離定数(hPGについてのその親和性の測定値)である。参照抗hPG抗体(例えば、本明細書に記載する抗hPG抗体の1つ)と競合する有用なテスト抗体は、典型的には、本明細書に記載するアッセイ条件下で10pM〜100nMの範囲のKisを有する。
Claims (14)
- 転移性結腸直腸癌を予防、再発予防又は処置するための方法において使用するための、ヒトプロガストリンに特異的に結合する抗hPGモノクローナル抗体を含む組成物であって、該抗hPGモノクローナル抗体は、
a)CDR1がVHCDR1.3(配列番号1)のアミノ酸配列を含み、CDR2がVHCDR2.3(配列番号2)のアミノ酸配列を含み、そしてCDR3がVHCDR3.3(配列番号3)のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、CDR1がVLCDR1.3(配列番号4)のアミノ酸配列を含み、CDR2がVLCDR2.3(配列番号5)のアミノ酸配列を含み、そしてCDR3がVLCDR3.3(配列番号6)のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とか、
b)CDR1がVHCDR1.8(配列番号37)のアミノ酸配列を含み、CDR2がVHCDR2.8(配列番号41)のアミノ酸配列を含み、そしてCDR3がVHCDR3.8(配列番号45)のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、CDR1がVLCDR1.8(配列番号49)のアミノ酸配列を含み、CDR2がVLCDR2.8(配列番号52)のアミノ酸配列を含み、そしてCDR3がVLCDR3.8(配列番号55)のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とか、
c)CDR1がVHCDR1.13(配列番号38)のアミノ酸配列を含み、CDR2がVHCDR2.13(配列番号42)のアミノ酸配列を含み、そしてCDR3がVHCDR3.13(配列番号46)のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、CDR1がVLCDR1.13(配列番号50)のアミノ酸配列を含み、CDR2がVLCDR2.13(配列番号53)のアミノ酸配列を含み、そしてCDR3がVLCDR3.13(配列番号56)のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とか、
d)CDR1がVHCDR1.16(配列番号39)のアミノ酸配列を含み、CDR2がVHCDR2.16(配列番号43)のアミノ酸配列を含み、そしてCDR3がVHCDR3.16(配列番号47)のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、CDR1がVLCDR1.16(配列番号50)のアミノ酸配列を含み、CDR2がVLCDR2.16(配列番号53)のアミノ酸配列を含み、そしてCDR3がVLCDR3.16(配列番号57)のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とかを含む、組成物。 - 前記抗hPGモノクローナル抗体は、
(a)配列番号12からなる重鎖可変領域と、配列番号13からなる軽鎖可変領域とか、
(b)配列番号61からなる重鎖可変領域と、配列番号65からなる軽鎖可変領域とか、
(c)配列番号59からなる重鎖可変領域と、配列番号63からなる軽鎖可変領域とか、
(d)配列番号60からなる重鎖可変領域と、配列番号64からなる軽鎖可変領域とかを含む、請求項1記載の使用のための組成物。 - 前記抗hPGモノクローナル抗体はヒト化抗体である、請求項1又は2記載の使用のための組成物。
- 転移性結腸直腸癌が、肝臓、肺、脳、又はリンパ節に位置する、請求項1〜3のいずれか1項記載の使用のための組成物。
- 抗hPGモノクローナル抗体組成物の投与が、転移性結腸直腸腫瘍の外科的切除の前又は後に実行される、請求項1〜3のいずれか1項記載の使用のための組成物。
- 抗hPGモノクローナル抗体組成物の投与が、放射線治療または化学療法の補助として投与される、請求項1〜3のいずれか1項記載の使用のための組成物。
- 抗hPGモノクローナル抗体組成物の投与が、VEGFまたはEGFRに特異的に結合する第2の治療用抗体の投与の前、同時又は後に実行される、請求項1〜3のいずれか1項記載の使用のための組成物。
- 抗hPGモノクローナル抗体が、0.001nM〜5000nMのヒトプロガストリン結合親和性を有する、請求項1〜3のいずれか1項記載の使用のための組成物。
- 組成物が、ヒトプロガストリンの別のエピトープについての特異性を有する複数の抗体を含む、請求項1〜3のいずれか1項記載の使用のための組成物。
- 抗hPGモノクローナル抗体が0.001mg/kg〜250mg/kgの用量で投与される、請求項1〜3のいずれか1項記載の使用のための組成物。
- 患者において転移性結腸直腸癌のための処置における請求項1〜10記載の組成物の効力をモニターするためのデータを提供するための方法であって、以下の工程:(i)転移性結腸直腸癌のための処置前に患者から得られた第1サンプルにおいてプロガストリンの濃度を決定すること、及び、(ii)該第1サンプル中のプロガストリンの濃度を、転移性結腸直腸癌のための処置後に同じ患者から得られた第2サンプル中のそれと比較することを含み、ここで、該第1サンプルと比較した、該第2サンプル中のプロガストリンの濃度における低下は、処置が効果的であったことを示す、方法。
- サンプルにおいてプロガストリンの濃度を決定する工程が、プロガストリンに特異的に結合する抗体を用いたアッセイを使用して実行される、請求項11記載の方法。
- 転移性結腸直腸癌幹細胞をその増殖を阻害するために効果的な量の抗hPG抗体に暴露することを含む転移性結腸直腸癌幹細胞の増殖を阻害するための方法において使用するための、抗hPGモノクローナル抗体を含む組成物であって、該抗hPGモノクローナル抗体が、
a)CDR1がVHCDR1.3(配列番号1)のアミノ酸配列を含み、CDR2がVHCDR2.3(配列番号2)のアミノ酸配列を含み、そしてCDR3がVHCDR3.3(配列番号3)のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、CDR1がVLCDR1.3(配列番号4)のアミノ酸配列を含み、CDR2がVLCDR2.3(配列番号5)のアミノ酸配列を含み、そしてCDR3がVLCDR3.3(配列番号6)のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とか、
b)CDR1がVHCDR1.8(配列番号37)のアミノ酸配列を含み、CDR2がVHCDR2.8(配列番号41)のアミノ酸配列を含み、そしてCDR3がVHCDR3.8(配列番号45)のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、CDR1がVLCDR1.8(配列番号49)のアミノ酸配列を含み、CDR2がVLCDR2.8(配列番号52)のアミノ酸配列を含み、そしてCDR3がVLCDR3.8(配列番号55)のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とか、
c)CDR1がVHCDR1.13(配列番号38)のアミノ酸配列を含み、CDR2がVHCDR2.13(配列番号42)のアミノ酸配列を含み、そしてCDR3がVHCDR3.13(配列番号46)のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、CDR1がVLCDR1.13(配列番号50)のアミノ酸配列を含み、CDR2がVLCDR2.13(配列番号53)のアミノ酸配列を含み、そしてCDR3がVLCDR3.13(配列番号56)のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とか、
d)CDR1がVHCDR1.16(配列番号39)のアミノ酸配列を含み、CDR2がVHCDR2.16(配列番号43)のアミノ酸配列を含み、そしてCDR3がVHCDR3.16(配列番号47)のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、CDR1がVLCDR1.16(配列番号50)のアミノ酸配列を含み、CDR2がVLCDR2.16(配列番号53)のアミノ酸配列を含み、そしてCDR3がVLCDR3.16(配列番号57)のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とかを含む、組成物。 - N末端抗hPGモノクローナル抗体が、
(a)配列番号12の重鎖可変領域配列および配列番号13の軽鎖可変領域配列を含むモノクローナル抗体;
(b)配列番号61の重鎖可変領域配列および配列番号65の軽鎖可変領域配列を含むモノクローナル抗体;
(c)配列番号59の重鎖可変領域配列および配列番号63の軽鎖可変領域配列を含むモノクローナル抗体;および
(d)配列番号60の重鎖可変領域配列および配列番号64の軽鎖可変領域配列を含むモノクローナル抗体
から選択される参照抗体とhPGに対する結合について競合する、請求項13記載の組成物。
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