ES2658512T3 - Proteínas de fusión y vacunas de combinación que comprenden la Proteína E y Pilina A de Haemophilus influenzae - Google Patents
Proteínas de fusión y vacunas de combinación que comprenden la Proteína E y Pilina A de Haemophilus influenzae Download PDFInfo
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Abstract
Una proteína de fusión de fórmula I: (X)m-(R1)n-A-(Y)o-B-(Z)p (fórmula I) en la que X es un péptido señal o MHHHHHH (SEQ ID NO. 2); m es 0 o 1; R1 es un aminoácido; n es 0, 1, 2, 3, 4, 5 o 6; A es un fragmento inmunogénico de la Proteína E seleccionado de SEQ ID NO. 122, SEQ ID NO. 123, SEQ ID NO. 124, SEQ ID NO. 125, SEQ ID NO. 126, SEQ ID NO. 179 o SEQ ID NO. 180 o una secuencia que tiene al menos un 95 % de identidad de secuencia con una cualquiera de SEQ ID NO. 122, SEQ ID NO. 123, SEQ ID NO. 124, SEQ ID NO. 125, SEQ ID NO. 126, SEQ ID NO. 179 o SEQ ID NO. 180; Y se selecciona del grupo que consiste en GG, SG, SS, GGG y (G)h en el que h es 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10; o es 0 o 1; B es un fragmento inmunogénico de PilA, al menos un 95 % idéntico a los aminoácidos 40-149 de cualquiera de SEQ ID NO. 58 a SEQ ID NO. 121; Z es GGHHHHHH (SEQ ID NO. 3); y p es 0 o 1.
Description
aminoácido n.º 166 está ausente) o como se expone en SEQ ID NO. 16.
Tabla 1: Secuencias de aminoácidos de la Proteína E de 53 cepas de Haemophilus influenzae (SEQ ID NO. 5 -SEQ ID NO. 57. -indica que el aminoácido está ausente.
- Nombre de la cepa
- Secuencia de la proteína E
- 3224A
- RdKW20
-
imagen5
- 86-028NP
- R2846
- R2866
- 3655
-
imagen6
- PittAA
- PittEE
- PittHH
- PittII
- R3021
- 22.4-21
- 3219C
- 3185
(continuación)
- Nombre de la cepa
- Secuencia de la proteína E
- 3241A
- 038144S1
- 810956
- 821246
- 840645
- 902550Z19
- A840177
- A860514
- A950014
- 306543X4
- A930105
- 901905U
- A920030
- 3221B
- 27W116791N
(continuación)
- Nombre de la cepa
- Secuencia de la proteína E
- N218
- N163
- N162
- N107
- N91
- D211PG
- D211PD
- D201PG
-
imagen7
- D201PD
- D198PG
- D198PD
- D195PD
-
imagen8
- D189PG
- D189PD
- D129CG
(continuación)
- Nombre de la cepa
- Secuencia de la proteína E
- D124PG
- D124PD
- D58PG
- D330D
- BS433
- BS432
- 1714
- 1128
-
imagen9
- BS430
La proteína E puede ser la Proteína E de H. influenzae cepas 3224A, RdKW20, 86-028NP, R2846, R2866, 3655, PittAA, PittEE, PittHH, Pittll, R3021, 22.4-21, 3219C, 3185, 3241A, 038144S1, 810956, 821246, 840645, 902550Z19, A840177, A860514, A950014, 306543X4, A930105, 901905U, A920030, 3221B, 27W116791N, N218, N163, N162,
5 N107, N91, D211PG, D211PD, D201PG, D201PD, D198PG, D198PD, D195PD, D189PG, D189PD, D129CG, D124PG, D124PD, D58PG, D330D, BS433, BS432, 1714, 1128 o BS430. La Proteína E puede ser la Proteína E como se expone en cualquiera de SEQ ID NO. 5 -SEQ ID NO. 57.
La proteína E puede ser una secuencia con al menos un 95 % de identidad, sobre la longitud completa, de cualquiera de SEQ ID NO. 4 -SEQ ID NO. 57.
10 Los fragmentos inmunogénicos de la Proteína E comprenden fragmentos inmunogénicos de al menos 7, 10, 15, 20, 25, 30 o 50 aminoácidos contiguos de SEQ ID NO. 4. Los fragmentos inmunogénicos pueden activar anticuerpos que puedan unirse a SEQ ID NO. 4.
Los fragmentos inmunogénicos de la Proteína E pueden comprender fragmentos inmunogénicos de al menos 7, 10, 15, 20, 25, 30 o 50 aminoácidos contiguos de SEQ ID NO. 4 -SEQ ID NO. 57. Los fragmentos inmunogénicos
15 pueden activar anticuerpos que puedan unirse a la longitud completa de la que deriva el fragmento.
Los fragmentos inmunogénicos de la Proteína E comprenden fragmentos inmunogénicos de al menos 7, 10, 15, 20, 25, 30 o 50 aminoácidos contiguos de SEQ ID NO. 5 -SEQ ID NO. 57. Los fragmentos inmunogénicos pueden activar anticuerpos que pueden unirse a la secuencia de longitud completa de la que deriva el fragmento.
Como se usa en el presente documento “PilA” significa Pilina A de H. influenzae. PilA puede consistir en o
20 comprender la secuencia de proteína de SEQ ID NO. 58 MKLTTQQTLK KGFTLIELMI VIAIIAILAT IAIPSYQNYT KKAAVSELLQ ASAPYKADVE LCVYSTNETT NCTGGKNGIA ADITTAKGYV KSVTTSNGAI TVKGDGTLAN
(continuación)
- Nombre de la cepa
- Secuencia de PilA
- NTHi44
- NTHi67
- 1054MEE
-
imagen11
- 1729MEE
- 1728MEE
- 1885MEE
- 1060MEE
- RdKW20
- 214NP
- 1236MEE
- 1714MEE
- 1128MEE
- R2846
- R2866
- 3655
(continuación)
- Nombre de la cepa
- Secuencia de PilA
- PittAA
- PittGG
- PittII
- R3021
- 22.4-21
- 3185A
- 3221B
- 3241A
- 038144S1
- 821246
- 840645
-
imagen12
- 902550Z19
- A840177
- A920030
- A950014
-
imagen13
(continuación)
- Nombre de la cepa
- Secuencia de PilA
- 901905U
- A920029
- A930105
- 306543X4
- N218
- N163
- N162
- N120
- N107
- N92
- N91
-
imagen14
- D219PG
- D211PG
- D211PD
- D204CD
-
imagen15
(continuación)
- Nombre de la cepa
- Secuencia de PilA
- D198PG
- D198PD
- D195PD
- D195CD
- D189PG
- D189PD
- D124PG
- D124PD
- D124CG
- D58PG
- BS433
-
imagen16
- BS432
- BS430
- 1714
- 1128
-
imagen17
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
En una realización, se definen las proteínas de fusión de fórmula (I) en la que Y se selecciona del grupo que consiste en GG, SG y SS. En otra realización, se definen las proteínas de fusión de fórmula (I) en la que Y es GG o SG. En una realización, Y es GG.
En una realización, se definen las proteínas de fusión de fórmula (I) en la que o es 1. En otra realización, o es 0.
En una realización, se definen las proteínas de fusión de fórmula (I) en la que B es un fragmento inmunogénico de PilA de H. influenzae cuando A es un fragmento inmunogénico de la Proteína E de H. influenzae. Por ejemplo, B es un fragmento inmunogénico de PilA de H. influenzae cepa 86-028NP. En otra realización, B es un fragmento inmunogénico de PilA en el que PilA es aproximadamente un 80 % a un 100 % idéntica a SEQ ID NO: 58. En otra realización, B es un fragmento inmunogénico de PilA en el que PilA tiene un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en SEQ ID NO. 58, SEQ ID NO. 59, SEQ ID NO. 60, SEQ ID NO. 61, SEQ ID NO. 62, SEQ ID NO. 63, SEQ ID NO. 64, SEQ ID NO. 65, SEQ ID NO. 66, SEQ ID NO. 67, SEQ ID NO. 68, SEQ ID NO. 69, SEQ ID NO. 70, SEQ ID NO. 71, SEQ ID NO.72, SEQ ID NO. 73, SEQ ID NO. 74, SEQ ID NO. 75, SEQ ID NO. 76, SEQ ID NO. 77, SEQ ID NO. 78, SEQ ID NO. 79, SEQ ID NO. 80, SEQ ID NO. 81, SEQ ID NO. 82, SEQ ID NO. 83, SEQ ID NO. 84, SEQ ID NO. 85, SEQ ID NO. 86, SEQ ID NO. 87, SEQ ID NO. 88, SEQ ID NO. 89, SEQ ID NO. 90, SEQ ID NO. 91, SEQ ID NO. 92, SEQ ID NO. 93, SEQ ID NO. 94, SEQ ID NO. 95, SEQ ID NO. 96, SEQ ID NO. 97, SEQ ID NO. 98, SEQ ID NO. 99, SEQ ID NO. 100, SEQ ID NO. 101, SEQ ID NO. 102, SEQ ID NO. 103, SEQ ID NO. 104, SEQ ID NO. 105, SEQ ID NO. 106, SEQ ID NO. 107, SEQ ID NO. 108, SEQ ID NO. 109, SEQ ID NO. 110, SEQ ID NO. 111, SEQ ID NO. 112, SEQ ID NO. 113, SEQ ID NO. 114, SEQ ID NO. 115, SEQ ID NO. 116, SEQ ID NO. 117, SEQ ID NO. 118, SEQ ID NO. 119, SEQ ID NO. 120 y SEQ ID NO. 121; o cualquier subconjunto desde SEQ ID NO. 58 hasta SEQ ID NO. 121. En otra realización, B es un fragmento inmunogénico de PilA en el que PilA es al menos un 95 % idéntica a cualquiera de SEQ ID NO. 58 -SEQ ID NO. 121. En una realización particular, B es un fragmento inmunogénico de PilA de H. influenzae en el que PilA tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO.
58. En otra realización, B es un fragmento inmunogénico de PilA que consiste en los aminoácidos 40-149 de cualquiera de SEQ ID NO. 58 -SEQ ID NO. 121. Más específicamente, en una realización B es el fragmento de PilA como se expone en SEQ ID NO. 127. En una realización adicional, B es un fragmento inmunogénico al menos un 95 % idéntico a los aminoácidos 40-149 de cualquiera de SEQ ID NO. 58 -SEQ ID NO. 121.
En una realización particular, B es un fragmento inmunogénico de PilA como se expone en SEQ ID NO. 127 y A es un fragmento inmunogénico de la Proteína E seleccionado del grupo que consiste en SEQ ID NO. 122, SEQ ID NO. 124, SEQ ID NO. 125 y SEQ ID NO. 126. Más particularmente, B es el fragmento de PilA como se expone en SEQ ID NO. 127 y A es el fragmento de la Proteína E como se expone en SEQ ID NO. 124, aminoácidos 19-160 de la Proteína E de SEQ ID NO. 4. En otra realización, B es el fragmento de PilA como se expone en SEQ ID NO. 127 y A es el fragmento de la Proteína E como se expone en SEQ ID NO. 125.
En otra realización, B es el fragmento de PilA en el que PilA es al menos un 95 % idéntica a cualquiera de SEQ ID NO. 58 -SEQ ID NO. 121 y A es un fragmento inmunogénico de PE en el que PE es al menos un 95 % idéntica a cualquiera de SEQ ID NO. 4 -SEQ ID NO. 57.
En una realización, se definen las proteínas de fusión de fórmula (I) en la que p es 0. En otra realización, se definen las proteínas de fusión de fórmula (I) en la que p es 1.
En una realización, la proteína de fusión de fórmula (I) se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID NO. 138, SEQ ID NO. 140, SEQ ID NO. 142, SEQ ID NO. 144, SEQ ID NO. 146, SEQ ID NO. 148, SEQ ID NO. 150, SEQ ID NO. 182, SEQ ID NO. 184, SEQ ID NO. 186, SEQ ID NO. 188, SEQ ID NO. 190, SEQ ID NO. 192, SEQ ID NO. 194, SEQ ID NO. 196, SEQ ID NO. 198, SEQ ID NO. 200, SEQ ID NO. 202 y SEQ ID NO. 204; o cualquier subconjunto de las mismas. En otra realización, la proteína de fusión de fórmula (I) es aproximadamente un 95 % idéntica a cualquiera de SEQ ID NO. 138, SEQ ID NO. 140, SEQ ID NO. 142, SEQ ID NO. 144, SEQ ID NO. 146, SEQ ID NO. 148, SEQ ID NO. 150, SEQ ID NO. 182, SEQ ID NO. 184, SEQ ID NO. 186, SEQ ID NO. 188, SEQ ID NO. 190, SEQ ID NO. 192, SEQ ID NO. 194, SEQ ID NO. 196, SEQ ID NO. 198, SEQ ID NO. 200, SEQ ID NO. 202 o SEQ ID NO. 204.
Las proteínas de fusión de fórmula (I) son útiles como inmunógenos en sujetos tales como mamíferos, particularmente humanos. En particular, las proteínas de fusión de fórmula (I) son útiles induciendo una respuesta inmune contra H. influenzae en sujetos, particularmente humanos. Más específicamente, las proteínas de fusión de fórmula (I) son útiles en el tratamiento o la prevención de otitis media y/o EAEPOC y/o neumonía.
La presente invención se refiere a composiciones inmunogénicas que comprenden proteínas de fusión de un fragmento inmunogénico de la Proteína E de H. influenzae y un fragmento inmunogénico de PilA de H. influenzae. La presente invención también se refiere a vacunas que comprenden dichas composiciones inmunogénicas y a los usos terapéuticos de las mismas.
En una realización, las composiciones inmunogénicas comprenden un fragmento inmunogénico de la Proteína E de
H. influenzae = y un fragmento inmunogénico de Pil A. de H. influenzae. La proteína E puede ser SEQ ID NO. 4 o una secuencia de la proteína E al menos un 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a SEQ ID NO. 4.
Péptido señal FlgI (ADN) -SEQ ID NO. 131:
atgattaaatttctctctgcattaattcttctactggtcacgacggcggctcaggct
Péptido señal FlghI (Aminoácido) -SEQ ID NO. 132:
MIKFLSALIL LLVTTAAQA
5 Péptido señal NadA (ADN) -SEQ ID NO. 133: atgaaacactttccatccaaagtactgaccacagccatccttgccactttctgtagcggcgcactggca
Péptido señal NadA (Aminoácido) -SEQ ID NO. 134:
MKHFPSKVLT TAILATFCSG ALA
SECUENCIAS DE CONSTRUCCIÓN DE PROTEÍNAS DE FUSIÓN:
10 La porción subrayada única de las secuencias de aminoácidos es de PilA de Haemophilus influenzae cepa 86028NP. La porción subrayada en negrita de las secuencias de aminoácido derivó de la Proteína E de Haemophilus influenzae cepa 772.
L VL312 (ADN) -SEQ ID NO. 135:
LVL312 (proteína): (flgI sp)(E)(PiIA aa 40-149)(GG)(ProtE aa 18-160)(GGHHHHHH) -SEQ ID NO. 136 (Ejemplo comparativo)
LVL291 (ADN) -SEQ ID NO. 137:
LVL291 (Proteína)(pelB sp)(ProtE aa 19-160)(GG)(PiIA aa40-149)(GGHHHHHH) -SEQ ID NO. 138
LVL268 (ADN) -SEQ ID NO. 139:
LVL268 (proteína): (pelB sp)(D)(ProtE aa 20-160)(GG)(PiIA aa40-149)(GGHHHHHH) -SEQ ID NO. 140:
LVL269 (ADN) -SEQ ID NO. 141:
LVL269 (proteína): (nadA sp)(ATNDDD)(ProtE aa 22-160)(GG)(PiIA aa 40-149)(GGHHHHHH) -SEQ ID NO.142
LVL270 (ADN) -SEQ ID NO. 143:
LVL270 (proteína): (MHHHHHH)(ProtE aa 17-160)(GG)(PiIA aa40-149) -SEQ ID NO. 144:
L VL315 (ADN) -SEQ ID NO. 145:
LVL315 (proteína): (pelB sp)(MD)(ProtE aa 22-160)(GG)(PiIA aa40-149)(GGHHHHHH) -SEQ ID NO. 146:
LVL317 (ADN) -SEQ ID NO. 147:
LVL317 (proteína): (pelB sp)(ProtE aa 19-160)(GG)(PilA aa40-149) -SEQ ID NO. 148:
LVL318 (ADN) -SEQ ID NO. 149:
LVL318 (proteína): (pelB sp)(MD)(ProtE aa 22-160)(GG)(PiIA aa40-149) -SEQ ID NO. 150:
LVL702 (ADN) -SEQ ID NO. 181:
LVL702 (proteína): (pelB sp)(ProtE aa 20-160)(GG)(PilA aa40-149)(GGHHHHHH) -SEQ ID NO. 182:
LVL736 (ADN) -SEQ ID NO. 183:
LVL736 (proteína): (pelB sp)(ProtE aa 17-160)(GG)(PilA aa40-149)(GGHHHHHH) -SEQ ID NO. 184:
LVL737 (ADN) -SEQ ID NO. 185:
LVL737 (proteína): (pelB sp)(ProtE aa 18-160)(GG)(PilA aa40-149)(GGHHHHHH) -SEQ ID NO. 186:
LVL738 (ADN) -SEQ ID NO. 187:
LVL738 (proteína): (pelB sp)(ProtE aa 22-160)(GG)(PilA aa40-149)(GGHHHHHH) -SEQ ID NO. 188:
LVL739 (ADN) -SEQ ID NO. 189:
LVL739 (proteína): (pelB sp)(ProtE aa 23-160)(GG)(PilA aa40-149)(GGHHHHHH) -SEQ ID NO. 190:
LVL740 (ADN) -SEQ ID NO. 191:
LVL740 (proteína): (pelB sp)(ProtE aa 24-160)(GG)(PilA aa40-149)(GGHHHHHH) -SEQ ID NO. 192:
LVL735 (ADN) -SEQ ID NO. 193:
LVL735 (proteína): (pelB sp)(ProtE aa 20-160)(GG)(PilA aa40-149) -SEQ ID NO. 194:
LVL778 (ADN) -SEQ ID NO. 195:
LVL778 (proteína): (pelB sp)(ProtE aa 17-160)(GG)(PilA aa40-149) -SEQ ID NO. 196:
LVL779 (ADN) -SEQ ID NO. 197:
LVL779 (proteína): (pelB sp)(ProtE aa 18-160)(GG)(PilA aa40-149) -SEQ ID NO. 198:
5
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25
30
35
40
45
Secuencia de Proteína para PE de H. influenzae cepa 772 (como se expone en: Microbes & Infection, Corrección de "Identification of a novel Haemophilus influenzae protein important for adhesion to epithelia cells" [Microbes Infect. 10 (2008) 87-97], disponible en línea 6 de julio, 2010, "Article in Press")) -SEQ ID NO. 154
Construcción del vector
Para generar LVL312, LVL291, LVL268, LVL269, LVL270, LVL702, LVL735, LVL778, LVL779, LVL780, LVL781 y LVL782, se preparó una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) de los siguientes componentes (los componentes específicos se ejemplifican posteriormente): se formularon 36,6 µl de agua desionizada, 5 µl de tampón n.º 1 10X, 5 µl de dNTP 2 mM, 2 µl de MgCl2 25 mM, 0,4 µl de cebador n.º 1 (50 µM), 0,4 µl de cebador n.º 2 (50 µM), 0,5 µl de molde (100 ng/µl) y 0,4 µl de ADN polimerasa KOD HiFi 2,5 unidades/µl (NOVAGEN®). La reacción en cadena de la polimerasa implicó 25 ciclos de 15 segundos de desnaturalización a 98 ºC, 2 segundos para hibridar a 55 ºC y 20 segundos de extensión de cebadores a 72 ºC. Los productos de PCR se purificaron usando el kit de purificación QIAQUICK® PCR (QIAGEN®). Este producto se usó en condiciones recomendadas por el proveedor que fueron: la adición de 5 volúmenes de Tampón PB, proporcionado en el kit de purificación QIAQUICK® PCR, a 1 volumen de la preparación de PCR. La preparación de PCR con Tampón PB se mezcló posteriormente con un vórtex. Se colocó una columna QIAQUICK® en un tubo de recogida de 2 ml. Para unir el ADN en la preparación de PCR a la columna, la muestra mixta se aplicó a la columna QIAQUICK® y se centrifugó durante 30-60 segundos a 14 000 RPM. El flujo a través se descartó y la columna QIAQUICK® se colocó de nuevo en el mismo tubo. Para lavar el ADN unido se añadieron 0,75 ml de Tampón PE, proporcionado en el kit de purificación QIAQUICK® PCR, a la columna QIAQUICK® y la columna se centrifugó durante 30-60 segundos a 14 000 RPM. El flujo a través se descartó y la columna QIAQUICK® se colocó de nuevo en el mismo tubo. La columna QIAQUICK® se centrifugó una vez más en el tubo de recolección de 2 ml durante 1 minuto para retirar el tampón de lavado residual. Cada columna QIAQUICK® se colocó en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml limpio. Para eluir el ADN, se añadieron 33 µl de agua al centro de la membrana QIAQUICK® y la columna se centrifugó durante 1 minuto a 14 000 RPM. Las enzimas de restricción y el tampón relacionado se obtuvieron de New England BioLabs. Por ejemplo, aproximadamente 5 µl de vector pET26b (100 ng/µl), 2 µl de NETampón2 (New England Biolabs, 1X NETampón2: 50 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl2, 1 mM ditiotreitol, pH 7,9 a 25 ºC), 1 µl de NdeI (20 000 unidades/ml), 1 µl of HindIII (20 000 unidades/ml) y 11 µl de agua desionizada se mezclaron e incubaron durante dos horas a 37 ºC para la digestión de ADN. En lo sucesivo, se realizó una segunda etapa de purificación usando el kit de purificación QIAQUICK® PCR (QIAGEN®) con el procedimiento descrito anteriormente.
La ligación se realizó usando ADN ligasa T4 Quick y Tampón de Reacción de Ligación Quick de New England BioLabs. Por ejemplo, alrededor de 10 ng de vector y 30 ng de inserto en 10 µl de agua desionizada se mezclaron con 10 µl de Tampón de Reacción de Ligación Quick 2X (New England BioLabs, 132 mM Tris-HCl, 20 mM MgCl2, 2 mM ditiotreitol, 2 mM ATP, 15 % polietilenglicol, pH 7,6 a 25 1C) y 1 µl de ADN ligasa T4 Quick (New England BioLabs). La reacción enzimática se incubó durante 5 minutos a temperatura ambiente antes de la transformación.
Para generar LVL315, LVL317, LVL318, LVL736, LVL737, LVL738, LVL739 y LVL740, se preparó una preparación de PCR de los siguientes componentes: se formularon 40 µl de agua desionizada, 5 µl de tampón de reacción 10X, 1 µl de mezcla de dNTP, 1 µl de cebador n.º 1 (10 µM), 1 µl de cebador n.º 2 (10 µM), 1 µl de molde (25 ng/µl) y 1 µl de ADN polimerasa PfuUltra Alta Fidelidad 2,5 unidades/µl (Kit de Mutagénesis Dirigida al Sitio QuikChange II, Agilent Technologies, Stratagene Division). La reacción en cadena de la polimerasa implicó un ciclo de desnaturalización a 95 ºC durante 30 s, 18 ciclos de 30 s de desnaturalización a 95 ºC, 1 min para la hibridación a 55 ºC y 5 min 30 s de extensión de cebadores a 68 ºC. Los productos de PCR se digirieron usando 1 µl de enzima de restricción DpnI a 37 ºC durante una hora antes de la transformación.
En la Tabla 4 se ilustra una lista detallada de secuencias de cebadores de PCR usadas para las amplificaciones.
5
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15
20
25
30
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50
55
60
cadena de la polimerasa para amplificar los genes PE y PilA en fusión al péptido señal pelB en el N-terminal, un aminoácido ácido aspártico (D) entre el péptido señal pelB y PE, un conector GG entre las secuencias PE y PilA y un conector GG entre PilA y los aminoácidos 6xhis en el C-terminal. Para lograr esta amplificación, los productos de las dos reacciones en cadena de la polimerasa descritos anteriormente se usaron como molde con los cebadores CAN547 y CAN535. La secuencia de ADN que corresponde al sitio de restricción NdeI se incorporó en el cebador 5’ y el sitio de restricción HindIII se incorporó en el cebador 3’. El producto de PCR generado se insertó después en el vector de clonación pET-26b(+) (NOVAGEN®).
Para generar LVL269 (péptido señal NadA-ATNDDD-fragmento PE-GG-fragmento PilA-GG-6xhis), se realizó una reacción en cadena de la polimerasa para amplificar el gen PE (aminoácidos 22-160 de SEQ ID NO. 4) usando el vector pRIT16711 como un molde y los cebadores CAN548 y CAN546. La secuencia de ADN que corresponde a los aminoácidos del péptido señal (sp) pelB y los aminoácidos ATNDDD se incorporaron en el cebador 5’ (CAN548). Para conectar la secuencia PilA con la secuencia PE, la secuencia de ADN que corresponde al conector de aminoácidos GG y los aminoácidos PilA N-terminales se incorporaron en el cebador 3’ (CAN546). Se realizó otra reacción en cadena de la polimerasa para amplificar el gen PilA (aminoácidos 40-149 de SEQ ID NO. 58, SEQ ID NO. 127) usando el vector pRIT16671 como un molde y los cebadores CAN545 y CAN535. La secuencia de ADN que corresponde a los aminoácidos de PE C-terminales y los aminoácidos GG se incorporaron en el cebador 5’ para conectar la secuencia de PilA con la secuencia de PE (CAN545). La secuencia de ADN que corresponde al conector de aminoácidos GG y los aminoácidos 6xhis se incorporaron en el cebador 3’ (CAN535). Finalmente, para generar LVL269, se realizó una tercera reacción en cadena de la polimerasa para amplificar los genes PE y PilA en fusión al péptido señal NadA en el N-terminal, los aminoácidos ATNDDD entre el péptido señal NadA y PE, un conector GG entre las secuencias PE y PilA y un conector GG entre PilA y los aminoácidos 6xhis en el C-terminal. Para lograr esta amplificación, los productos de las dos reacciones en cadena de la polimerasa descritos anteriormente se usaron como molde con los cebadores CAN547 y CAN535. La secuencia de ADN que corresponde al sitio de restricción NdeI se incorporó en el cebador 5’ y el sitio de restricción HindIII se incorporó en el cebador 3’. El producto de PCR generado se insertó después en el vector de clonación pET-26b(+) (NOVAGEN®).
Para generar LVL270 (M-6xHis-fragmento PE-GG-fragmento PilA), se realizó una reacción en cadena de la polimerasa para amplificar el gen PE (aminoácidos 17-160) usando el vector pRIT16711 como un molde con los cebadores CAN540 y CAN542. La secuencia de ADN que corresponde a los aminoácidos 6xhis se incorporaron en el cebador 5’ (CAN540). Para conectar la secuencia PilA con la secuencia PE, la secuencia de ADN que corresponde al conector de aminoácidos GG y los aminoácidos PilA N-terminales se incorporaron en el cebador 3’ (CAN542). Se realizó otra reacción en cadena de la polimerasa para amplificar el gen PilA (aminoácidos 40-149 / NTHi cepa 86-028NP) usando el vector pRIT16671 como un molde con los cebadores CAN541 y CAN543. La secuencia de ADN que corresponde a los aminoácidos de PE C-terminales y los aminoácidos GG se incorporaron en el cebador 5’ (CAN541) para conectar la secuencia de PilA con la secuencia de PE. Finalmente, para generar LVL270, se realizó una tercera reacción en cadena de la polimerasa para amplificar el gen 6-his-PE-GG-PilA en fusión. Para lograr esta amplificación, los productos de las dos reacciones en cadena de la polimerasa descritos anteriormente se usaron como molde con los cebadores CAN540 y CAN543. La secuencia de ADN que corresponde al sitio de restricción NdeI se incorporó en el cebador 5’ y el sitio de restricción HindIII se incorporó en el cebador 3’. El producto de PCR generado se insertó después en el vector de clonación pET-26b(+) (NOVAGEN®).
Para generar LVL315 (péptido señal pelB-MD-fragmento PE-GG-fragmento PilA-GG-6xhis), se realizó una mutagénesis dirigida al sitio para cambiar la secuencia de aminoácidos de PE N-terminales de QIQ a MD usando LVL291 como un molde con los cebadores CAN670 y CAN671 y el Kit de Mutagénesis Dirigida al Sitio QuikChange II (Agilent Technologies, Stratagene Division).
Para generar LVL317 (péptido señal pelB-fragmento PE-GG-fragmento PilA), se realizó una mutagénesis dirigida al sitio para incorporar un codón de parada entre el gen PilA y la secuencia de ADN que corresponde a los restos de aminoácidos GGHHHHHH (SEQ ID NO: 3) usando LVL291 como un molde con los cebadores CAN678 y CAN679 y el Kit de Mutagénesis Dirigida al Sitio QuikChange II (Agilent Technologies, Stratagene Division).
Para generar LVL318 (péptido señal pelB-MD-PE-GG-PilA), se realizó una mutagénesis dirigida al sitio para incorporar un codón de parada entre el gen PilA y la secuencia de ADN que corresponde a los restos de aminoácidos GGHHHHHH (SEQ ID NO: 3) usando LVL315 como un molde con los cebadores CAN678 y CAN679 y el Kit de Mutagénesis Dirigida al Sitio QuikChange II (Agilent Technologies, Stratagene Division).
Para generar LVL702 (LVL291 ΔQ), se realizó una reacción en cadena de la polimerasa usando el vector LVL291 como molde y los cebadores CAN1517 y CAN1518. La deleción de tres nucleótidos que corresponden al aminoácido Q en la posición 23 en la secuencia LVL291 se incorporó al cebador 5’. La única diferencia entre LVL702 y LVL291 es la deleción del aminoácido Q en la posición 23 en la secuencia LVL291. Los sitios de restricción NdeI y HindIII se incorporaron en los cebadores 5’ y 3’ respectivamente. El producto de PCR generado se insertó después en el vector de clonación pET-26b(+) (NOVAGEN®).
Para generar LVL735 (LVL317 ΔQ), se realizó una reacción en cadena de la polimerasa usando el vector LVL317 como molde y los cebadores CAN1517 y CAN1519. La deleción de tres nucleótidos que corresponden al aminoácido Q en la posición 23 en la secuencia LVL317 se incorporó al cebador 5’. La única diferencia entre LVL735 y LVL317
5
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50
500 mM de NaCl y 250 mM de imidazol a una velocidad de 10 ml/min, produciendo una “fracción de elución”.
Para mejorar la pureza de la proteína, las fracciones de elución positivas de IMAC se pusieron en conjunto y se cargaron en una columna de cromatografía de exclusión de tamaño (SEC) (HILOADTM SUPERDEXTM 200 06/60 de GE Healthcare) pre-equilibrada en tampón fosfato salino sin calcio o magnesio (NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM, Na2HPO4 8,1 mM, KH2PO4 1,47 mM, pH 7,4). Las muestras de las fracciones de elución se analizaron por electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecil sulfato sódico (SDS-PAGE). Las muestras se concentraron usando Centricon 10 000 MW (Millipore).
La concentración de proteína se determinó usando un espectrómetro.
Ejemplo 5: Análisis de SDS-PAGE y transferencia Western de construcciones etiquetadas con His y Análisis de SDS-PAGE de construcciones LVL317 y LVL318 no etiquetadas con His
Preparación de la fracción soluble e insoluble
Por ejemplo, 1 ml de cultivo después de la inducción, véase, por ejemplo, el Ejemplo 3 anterior) se centrifugó a 14 000 RPM durante 2 min. El sedimento se resolubilizó usando 40 µl de Reactivo de Extracción de Proteínas BUGBUSTER® (NOVAGEN®, EMD4 Biosciences, Merck), creando una suspensión celular. La suspensión celular se incubó en una plataforma rotatoria durante 10 min a temperatura ambiente. La suspensión celular se centrifugó después a 14 000 RPM durante 2 min para separar la fracción soluble. El sedimento resultante (fracción insoluble) se resolubilizó usando 70 µl de agua desionizada, 5 µl de ditiotreitol (DTT) 1 M y 25 µl de Tampón de Muestra NUPAGE® LDS (dodecil sulfato de litio) 4X (INVITROGENTM). La fracción soluble (sobrenadante de la suspensión celular del sedimento resolubilizado) se añadió a 30 µl de agua desionizada, 5 µl de DTT 1 M y 25 µl de Tampón de Muestra LDS 4X.
Preparación de la fracción de medios
Por ejemplo, para preparar la fracción de medios, se concentraron 100 µl del sobrenadante del cultivo celular entero inducido después de la centrifugación (véase, por ejemplo, el Ejemplo 3 anterior) añadiendo 500 µl de reactivo RC I (Bio-Rad Laboratories, Inc.); la muestra se mezcló y se incubó durante 1 min a temperatura ambiente. Después, se añadieron 500 µl de Reactivo II (Bio-Rad Laboratories, Inc.) a la muestra y se mezcló. Esta formulación se centrifugó a 14 000 RPM durante 10 min. El sedimento se resolubilizó usando 28 µl de agua desionizada, 2 µl de DTT 1 M y 10 µl de Tampón de Muestra LDS 4X.
Preparación de la fracción de purificación
Por ejemplo, las proteínas purificadas (por ejemplo, obtenidas como se describe en el Ejemplo 4) se prepararon para el análisis por SDS-PAGE añadiendo 70 µl de muestra, 5 µl de DTT 1 M y 25 µl de Tampón de Muestra LDS 4X.
Análisis de SDS-PAGE y transferencia a una membrana de nitrocelulosa
El análisis de SDS-PAGE y transferencia a una membrana de nitrocelulosa se realizaron de acuerdo con las recomendaciones del fabricante (Invitrogen) usando geles NUPAGE® Bis-Tris 4-12 %. Las preparaciones de las muestras, los tampones y las condiciones de migración se realizaron en condiciones recomendadas por los proveedores.
En un ejemplo, el gel se cargó con una muestra de 20 ul de una mezcla maestra que comprendía 70 µl de una fracción de proteína purificada, 5 µl de DTT 1 M y 25 µl de Tampón de Muestra LDS 4X.
Después de que las muestras se corrieran en geles NUPAGE® Bis-Tris 4-12 %, las proteínas se transfirieron a membranas de nitrocelulosa.
Las membranas de nitrocelulosa se bloquearon durante 30 minutos a 37 ºC, 60 RPM usando leche al 3 % / solución fresca de PBS 1X. Después de bloquear la incubación, se añadieron Anticuerpos Primarios (Anticuerpo 6X His Tag®, Abcam PLC, número de catálogo: ab9108) a una dilución de: 1:1000 en leche al 3 % / solución fresca de PBS 1X durante 1 hora a 37 ºC, 60 RPM. Después de esto, las membranas se lavaron tres veces, durante 5 minutos cada una, a temperatura ambiente usando polisorbato 20 al 0,02 % (por ejemplo, TWEEN™ 20) / PBS 1X. Se añadieron Anticuerpos Secundarios (fosfatasa alcalina (AP) de conejo anti-IgG (H+L) de conejo, Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.) a una dilución 1:14 000 usando leche al 3 % / solución fresca de PBS 1X. Las membranas se incubaron durante 1 hora a 37 ºC, 60 RPM. Después de esto, las membranas se lavaron tres veces durante 5 minutos a temperatura ambiente usando polisorbato 20 al 0,02 % (por ejemplo, TWEEN™ 20) / PBS 1X antes de las exposiciones de membrana a 5-bromo-4-cloro-3-indolil fosfato/nitro azul de tetrazolio (por ejemplo, BCIP®/NBT de Sigma-Aldrich®, 1 comprimido / 10 ml de agua).
Véase la Figura 1 para SDS-PAGE de los extractos bacterianos inducidos para las construcciones de proteínas de fusión LVL291, LVL268 y LVL269. La Fracción Insoluble (I), Fracción Soluble (S) y Fracción medio de cultivo (M) se cargaron para LVL291, LVL268 y LVL269 antes y después de la inducción (ind).
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Véase la Figura2 para SDS-PAGE y transferencia Western con respecto a los extractos de purificación para las construcciones de proteínas de fusión LVL291, LVL268 y LVL269. La Fracción de flujo a través (Ft), fracción de lavado (W) y Fracción de elución (E) se cargaron para la purificación de LVL291, LVL268 y LVL269. Se usó Antietiqueta his para sondar los extractos.
Véase la Figura 3 para SDS-PAGE de los extractos bacterianos inducidos y de purificación para las construcciones de proteínas de fusión LVL291 y LVL315. La Fracción del medio de cultivo (M), la Fracción soluble (Sol), la Fracción insoluble (Ins), la Fracción de flujo a través (Ft), la Fracción de lavado n.º 1 (W1), la Fracción de lavado n.º 2 (W2) y la Fracción de elución (E) se cargaron para LVL291 y LVL315.
Véase la Figura 4 para SDS-PAGE de los extractos bacterianos inducidos y de purificación para la construcción de proteínas de fusión LVL312. La Fracción del medio de cultivo (M), la Fracción soluble (Sol), la Fracción insoluble (Ins), la Fracción de flujo a través (Ft), la Fracción de lavado n.º 1 (W1), la Fracción de lavado n.º 2 (W2) y la Fracción de elución (E) se cargaron para LVL312.
Véase la Figura 25 para SDS-PAGE de las fracciones solubles de extractos bacterianos inducidos para las construcciones de proteínas de fusión LVL291, LVL702, LVL736, LVL737, LVL738, LVL739, LVL740 y el vector pET26b (control negativo). (a) Experimento 1 (b) Experimento 2 (c) Experimento 3. Proteína de fusión PE-PilA indicada por una flecha.
Véase la Figura 26 para el porcentaje de banda promedio de la proteína de fusión en la fracción soluble de los Experimentos 1, 2 y 3.
Los extractos bacterianos LVL317 y LVL318 usados en el análisis SDS-PAGE en la Figura 5 y la Figura 6, respectivamente, se prepararon generalmente como se describe anteriormente.
Figura 5. SDS-PAGE de extractos bacterianos inducidos (1 mM y 10 µM IPTG) para la construcción de proteínas de fusión LVL317. Extractos de antes (NI) y después (In) de la inducción, Fracción soluble (S), Fracción insoluble (I).
Figura 6. SDS-PAGE de extractos bacterianos inducidos (1 mM y 10 µM IPTG) para la construcción de proteínas de fusión LVL318. Extractos de antes (NI) y después (In) de la inducción, Fracción del medio de cultivo (M), Fracción soluble (S), Fracción insoluble (I).
Las proteínas separadas por SDS-PAGE se transfirieron a una membrana Immobilon-P. Las bandas de proteínas teñidas con Azul Coomassie se cortaron y se colocaron en un reactor secuenciador. La secuenciación se llevó a cabo de acuerdo con el protocolo del fabricante usando un Secuenciador de Proteínas PROCISE® de Applied Biosystems, modelo 494-cLC.
Tabla 5: Perfiles de expresión de proteínas de matraz de agitación y escisión del péptido señal para las construcciones de proteínas de fusión.
- ID de la Construcción de proteína de fusión
- Descripción N-term → C-term Perfil de expresión proteica Escisión del péptido señal
- LVL312
- Flgl sp -E -Fragmento PilA -GG -Fragmento PE -GGHHHHHH In: +++ So: + Se: + Confirmada
- LVL291
- PelB sp-Fragmento PE -GG -Fragmento PilA -GGHHHHHH In : +++ So: ++ Se: + Confirmada
- LVL268
- PelB sp -D -Fragmento PE -GG -Fragmento PilA -GGHHHHHH In : +++ So: ++ Se: + Confirmada
- LVL269
- NadA sp -ATNDDD -Fragmento PE -GG -Fragmento PilA -GGHHHHHH In : +++ So: ++ Se: + Confirmada
- LVL270
- MHHHHHH -Fragmento PE -GG -Fragmento PilA In: + So:-Se: - No ensayada
- LVL315
- PelB sp -MD -Fragmento PE -GG -Fragmento PilA -GGHHHHHH In: +++ So:++ Se: + Confirmada
- LVL317
- PelB -Fragmento PE -GG -Fragmento PilA In : +++ So: + Se: Nt Confirmada
(continuación)
- ID de la Construcción de proteína de fusión
- DescripciónN-term → C-term Perfil de expresiónproteica Escisión del péptido señal
- LVL318
- PelB sp -MD -Fragmento PE -GG -Fragmento PilA In: +++ So: + Se: -
- LVL702
- PelB sp -Fragmento PE -GG -Fragmento PilA -GGHHHHHH In: +++ So: ++ Se: Nt Confirmada
- LVL736
- PelB sp -Fragmento PE -GG -Fragmento PilA -GGHHHHHH In: +++ So: ++ Se: Nt Confirmada
- LVL737
- PelB sp -Fragmento PE -GG -Fragmento PilA -GGHHHHHH In: +++ So: ++ Se: Nt Confirmada
- LVL738
- PelB sp -Fragmento PE -GG -Fragmento PilA -GGHHHHHH In: +++ So: ++ Se: Nt Confirmada
- LVL739
- PelB sp -Fragmento PE -GG -Fragmento PilA -GGHHHHHH In: +++ So: ++ Se: Nt Confirmada
- LVL740
- PelB sp -Fragmento PE -GG -Fragmento PilA -GGHHHHHH In: +++ So: ++ Se: Nt Confirmada
- So = Fracción soluble. In = Fracción Insoluble. Se = Proteína secretada en la fracción de medios. Nt = No ensayado. La siguiente clasificación se basó en una inspección visual (coomassie) + : expresión baja; ++ : expresión media; +++ : expresión alta; -: sin expresión
Ejemplo 6: Caracterización de la proteína de fusión LVL291
PROPIEDADES FÍSICAS DE LVLS291: Plegamiento de PE y PilA en LVL291 y Punto de fusión
5 Dicroísmo circular:
Análisis de la estructura secundaria
El dicroísmo circular (DC) se usa para determinar la composición de la estructura secundaria de una proteína midiendo la diferencia en la absorción de la luz polarizada a mano izquierda frente a la luz polarizada a mano derecha que se debe a la asimetría circular. La forma y la magnitud de los espectros de DC en la región UV lejana
10 (190-250 nm) son diferentes si una proteína exhibe una estructura de lámina beta, de hélice alfa o de enrollamiento aleatorio. La abundancia relativa de cada tipo de estructura secundaria en una muestra de proteína dada puede calcularse por comparación con los espectros de referencia.
Los espectros de UV lejanos se miden usando un camino óptico de 0,01 cm de 178 a 250 nm, con una resolución de 1 nm y anchura de banda en un espectropolarímetro Jasco J-720. La temperatura de la célula se mantiene a 23 ºC
15 por un bloqueante de células RTE-111 con termostato Peltier. Se mantiene un flujo de nitrógeno de 10 l/min durante las mediciones.
Resultados:
Los espectros de DC de UV lejano obtenidos para las proteínas PE (a partir de la construcción pRIT16762), PilA (a partir de la construcción pRIT 16790) y PEPilA son característicos de proteínas plegadas que contienen una mezcla
20 de estructuras alfa y beta, pero PE es significativamente más rica en hélices alfa que PilA y PE-PilA (Figura 7, espectros DC de las proteínas de fusión PE, PilA y PE-PilA).
Para evaluar la integridad del plegamiento de las proteínas PE y PilA individuales una vez unidas juntas en una proteína quimérica y después verificar una posible interacción entre ambas, se calcularon los espectros de diferencia.
25 • Cuando se combinan los espectros UV lejanos de PE y PilA, el espectro resultante se superpone al espectro de la quimera PE-PilA (Figura 8, combinación del espectro de DC de PE y PilA). Este resultado sugiere que la quimera PE-PilA contiene todas las estructuras secundarias que se detectan en los componentes individuales. También sugiere que la fusión de las proteínas no tiene mayor impacto en las estructuras secundarias de los componentes individuales y en consecuencia que el plegamiento de PE y PilA no es significativamente diferente
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lisado en la IMAC a 2,5ml/min. El flujo a través se recogió en fracciones de 50 ml para análisis futuros. La columna se lavó con 3 CV de tampón de unión para retirar la proteína sin unir. La muestra que contenía proteínas sin unir se recogió en una alícuota de 15 ml en un tubo de 50 ml. La columna se lavó con 2 CV de tampón de lavado (20 mM HEPES, 20 mM imidazol, 500 mM NaCl, pH 8,01) recogido en fracciones de 2 ml en una placa de 96 pocillos. La proteína unida se eluyó después con 6 CV de tampón de elución al 100 % (20 mM HEPES, 250 mM imidazol, 500 mM NaCl, pH 8,01). La proteína eluida se recogió en fracciones de 2 ml en placas de 96 pocillos. El lavado y la elución se realizaron a 5 ml/min.
Cromatografía de exclusión de tamaño (SEC) del conjunto IMAC de PE QIQ
La columna SEC (GE healthcare, HILOAD™ 26/60 SUPERDEX™ 75 clasificación prep, 60 cm de altura aprox. 319 ml de volumen) se equilibró con 3 CV de tampón SEC (20 mM HEPES, 150 mM NaCl, pH 8,49). Se cargaron 11 ml de eluido IMAC en la columna a un caudal de 2,5 ml/min. Se recogieron fracciones de 2 ml de 0,3 CV a 0,9 CV. Se realizaron dos ejecuciones después las fracciones se analizaron por SDS-PAGE. Las fracciones de las dos ejecuciones que contienen la proteína Prot E se pusieron juntos ("conjunto SEC ", 48 ml de volumen total aprox.). Se añadieron 500 mM de Arginina al conjunto SEC.
Dosificación de las muestras puestas en conjunto PE QIQ generadas en el protocolo SEC anterior
El conjunto SEC se dosificó con el procedimiento RCDC (Agente reductor y detergente compatible, por sus siglas en inglés) del kit Bio-Rad RC DC™ siguiendo el protocolo del fabricante:
Para cada muestra ensayada y patrón, se distribuyeron 25 µl en tubos de microfuga por duplicado. Se añadieron 125 µl de Reactivo I Bio-Rad RC en cada tubo; cada tubo se sometió a vórtex y se incubó durante 1 minuto a temperatura ambiente. Se añadieron 125 µl de Reactivo II Bio-Rad RC en cada tubo; cada tubo se sometió a vórtex y se centrifugó después a 14.000 xg durante 5 minutos. Los sobrenadantes se descartan invirtiendo los tubos en papel de tejido absorbente permitiendo que el líquido se drene completamente de los tubos. Se añaden 25,4 µl de Reactivo A (ya preparado mezclando 20 µl de Reactivo S por 1 ml de Reactivo A) a cada tubo; cada tubo se sometió a vórtex y se incubó durante 5 minutos a temperatura ambiente o hasta que el precipitado se disuelva completamente. Se somete a vórtex antes de avanzar a la siguiente etapa. Añadir 200 µl de reactivo B de CD a cada tubo y someter a vórtex inmediatamente. Incubar a temperatura ambiente durante 15 minutos. Transferir todas las muestras a una placa de 96 pocillos y leer la absorbancia a 750 nm para determinar la concentración de proteína para cada muestra de proteína desconocida.
La concentración de ProtE fue 1,069 mg/ml.
Purificación de proteína PilA etiquetada conHis
PilA se purificó siguiendo el procedimiento general a continuación:
Las células de E. coli que contienen una construcción que codifica PilA o un fragmento de la misma se suspenden en BUGBUSTER® y nucleasa BENZONASE® (NOVAGEN®), por ejemplo 10 ml de BUGBUSTER® y 10 ul de nucleasa BENZONASE®. El lisado celular se mezcla a temperatura ambiente en una plataforma rotatoria, por ejemplo, durante 15 minutos. El lisado celular se centrifuga a 4 ºC, por ejemplo a 16.000 g durante 20 minutos. El sobrenadante que contiene la proteína se añade a una columna Ni NTA que contiene una resina Ni NTA HIS·BIND® y se mezcla a 4 ºC, por ejemplo durante 1 hora. La columna puede consistir en 2 ml de resina Ni NTA HIS·BIND® (NOVAGEN®) y 10 ml de tampón de unión 1X (del kit de NOVAGEN® de tampón Ni-NTA). Después se recoge el flujo a través de la columna. La resina se lava dos veces con tampón de lavado 1X, por ejemplo, que contiene 300 mM NaCl, 50 mM NaH2PO4, 25 mM imidazona, pH 8,0). El lavado se recoge por flujo de gravedad. La proteína se elyue de la columna con tampón de elución 1X, por ejemplo, 300 mM NaCl, 50 mM NaH2PO4, 250 mM imidazona, pH 8,0. La proteína puede purificarse adicionalmente por diálisis con el tampón de unión y reejecutarse sobre una columna Ni NTA como se ha descrito anteriormente.
Escisión de trombina de PilA
PilA se incuba después con trombina (diluida 1/50) a temperatura ambiente durante 16 h, para retirar la etiqueta de histidina.
Cromatografía de exclusión de tamaño (SEC) en PilA escindida con trombina.
La columna SEC (GE healthcare, HILOAD™ 26/60 SUPERDEX™ 75 clasificación prep., 60 cm de altura aprox. 319 ml de volumen) se equilibró con 5 CV de tampón SEC (20 mM HEPES, 150 mM NaCl, pH 8,52). Se cargaron aproximadamente 10 ml de PilA escindida en la columna a un caudal de 2,5 ml/min. Se recogieron fracciones de 2 ml de 0,3 CV a 0,9 CV. Se realizaron dos ejecuciones después las fracciones se analizaron por SDS-PAGE. Las fracciones de las dos ejecuciones que contenían la proteína PilA escindida se pusieron juntas (“conjunto SEC”, 52 ml de volumen aprox. total).
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Dosificación de PilA, conjunto SEC.
El conjunto SEC se dosificó con el procedimiento RCDC como se describe anteriormente. La concentración de PilA escindida estuvo en 5,37 mg/ml.
Diálisis del conjunto SEC PilA con PBS 1x pH 7,4 (factor de diálisis = 1600) y dosificación por RCDC
La concentración post-diálisis determinada por RCDC estuvo en 3,0 mg/ml.
Purificación de LVL317
Choque osmótico
Ya que la proteína de fusión LVL317 se expresa y procesa en el periplasma bacteriano, la proteína se extrajo por choque osmótico.
Una pasta celular de E. coli B2448 recolectada congelada (-20 ºC) que contenía LVL317 de 4 l de cultivo fermentador se puso en conjunto y se resuspendió en un tampón hipertónico que consiste en 24 mM Tris-HCl, 16 % (p/v) sacarosa, 9,9 % (p/v) glucosa, 10 mM EDTA, pH 8,0 hasta un volumen final de 4 l. La suspensión se mezcló cuidadosamente durante 30 min a temperatura ambiente usando un propulsor de 3 hojas instalado en un agitador básico RW 16, a velocidad media. La suspensión se centrifugó a 15.900 x g durante 30 minutos a temperatura ambiente. El sobrenadante (SN1) se guardó para el análisis en gel.
El sedimento resultante se resuspendió en una solución hipotónica; 38 mM MgCl2, y se mezcló durante 30 min a temperatura ambiente. LA mezcla se centrifugó a 15.900 x g durante 30 minutos a temperatura ambiente y el antígeno se recuperó en el sobrenadante (SN2).
Se realizó una clarificación del SN2 por filtración a través de un filtro Sartorius Sartopore 2 MidiCap de polietersulfona 0,45/0,2 µm, a 600 ml/min de caudal.
El SN2 se diluyó 1:3 con 20 mM NaH2PO4-Na2HPO4, pH 7,0, el pH se ajustó a 7,0 si fuera necesario y se realizó otra clarificación por filtración a través de un filtro Sartorius Sartopore 2 MidiCap de polietersulfona 0,45/0,2 µm, a 600 ml/min de caudal.
Cromatografía SP SEPHAROSE™ de flujo rápido (SP FF)
El SN2 diluido/filtrado se cargó y se capturó en una resina intercambiadora catiónica fuerte (SP SEPHAROSE™ FF -GE Healthcare) en una columna de 14 cm DI (diámetro interno) x 20 cm (volumen de la columna 3100 ml) equilibrada con 2 CV de tampón 20 mM NaH2PO4 / Na2HPO4 pH 7,0. Después de lavar la columna con 5 CV de tampón 20 mM NaH2PO4 / Na2HPO4 pH 7,0, el antígeno (contenido dentro de LVL317) se eluyó aumentando la concentración de NaCl hasta 100 mM en el mismo tampón de lavado.
Véase la Figura 12 para un cromatograma típico de SP SEPHAROSE™ de Flujo Rápido.
Cromatografía Q SEPHAROSE™ de flujo rápido (Q FF)
El antígeno presente en el Eluido de SP FF se diluyó 1:4 con un 20 mM Tris pH 8,5, el pH se ajustó a 8,5 si fuera necesario y se pasó a través de una resina intercambiadora catiónica fuerte (Q SEPHAROSE™ FF -GE Healthcare) en una columna de 14 cm DI x 11,8 cm (volumen de la columna 1800 ml) equilibrada con 2 CV de tampón 20 mM Tris pH 8,5. El antígeno se recuperó en la fracción de flujo a través.
Véase la Figura 13 para un cromatograma típico de Q SEPHAROSE™ de Flujo Rápido.
Concentración, diafiltración, adición de polisorbato 80 y filtración estéril
El flujo a través Q FF que contenía el antígeno se concentró hasta 0,7-0,8 mg/ml a base del cromatograma UV y se diafiltró con 5 DV de tampón 10 mM KH2PO4 / K2HPO4 pH 6,5 usando una membrana Pellicon-2™ de 10 kDa de corte (Millipore).
Usando una solución madre al 5 %, se añadió polisorbato 80 (por ejemplo, TWEEN™ 80) al retenido de ultrafiltración y se agitó durante 30 minutos con un agitador magnético a 130 rpm a 4 ºC. La concentración final del polisorbato 80 fue el 0,04 %. El retenido de ultrafiltración se esterilizó por filtración a través de una membrana de Acetato de Celulosa 0,45/0,2 µm (Sartobran 300, Sartorius). El volumen purificado se almacenó a -20 ºC o -80 ºC. La concentración absoluta de proteína se midió por AAA (Análisis de aminoácidos) a 0,737 mg/ml.
Ejemplo 9: Uso de Polisorbato 80
Un experimento de titulación indicó que la adición de polisorbato 80, específicamente, TWEENTM 80 a una concentración final del 0,04 % (p/v) al volumen purificado antes de la filtración estéril redujo la formación de partículas filamentosas y la agregación.
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