CN116940372A - 流感嗜血杆菌疫苗和使用方法 - Google Patents

流感嗜血杆菌疫苗和使用方法 Download PDF

Info

Publication number
CN116940372A
CN116940372A CN202180075971.0A CN202180075971A CN116940372A CN 116940372 A CN116940372 A CN 116940372A CN 202180075971 A CN202180075971 A CN 202180075971A CN 116940372 A CN116940372 A CN 116940372A
Authority
CN
China
Prior art keywords
ala
lys
leu
gly
glu
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202180075971.0A
Other languages
English (en)
Inventor
M·皮奇凯罗
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Rochester General Hospital Res Inst
Original Assignee
Rochester General Hospital Res Inst
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Rochester General Hospital Res Inst filed Critical Rochester General Hospital Res Inst
Publication of CN116940372A publication Critical patent/CN116940372A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/102—Pasteurellales, e.g. Actinobacillus, Pasteurella; Haemophilus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/285—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Pasteurellaceae (F), e.g. Haemophilus influenza
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6018—Lipids, e.g. in lipopeptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/10—Plasmid DNA
    • C12N2800/101—Plasmid DNA for bacteria

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本公开涉及包含选自由Omp26、P6、P4、PD和PF组成的组的两种或更多种流感嗜血杆菌(Hi)蛋白的全部或部分的融合蛋白，其中其Hi蛋白中的至少一种Hi蛋白包含脂质部分，并且涉及包含此类融合蛋白的疫苗和免疫原性组合物。还提供了治疗或预防受试者中与Hi感染相关联的疾病的方法。

Description

流感嗜血杆菌疫苗和使用方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2020年9月10日提交的美国临时专利申请号63/076,461的优先权，该申请据此全文以引用方式并入。
技术领域
本公开属于流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)疫苗领域。
序列表以引用方式的并入
本申请包含计算机可读形式的序列表(文件名称：55894PCT_SeqListing.txt；83,018字节–ASCII文本文件；于2021年9月8日创建)，其全文以引用方式并入本文并且形成本公开的一部分。
背景技术
流感嗜血杆菌(Hi)是一种革兰氏阴性球杆菌，并且是严格的人共生细菌。Hi菌株被包封在多糖胶囊中或未被包封，并因此被分类为可分型(包封)和不可分型(未包封)菌株。
多糖包封的Hi具有血清型a、b、c、d、e和f。在发明Hib疫苗之前，Hi包封的b型是侵入性Hi感染的主要原因。由于成本和施用挑战，Hib疫苗无法在世界范围内获得。近年来出现了侵入性Hi表达胶囊类型a、c、d、e和f。不可分型的流感嗜血杆菌(Hi)代表大部分定殖菌株，并且尽管很少是侵入性的，但导致显著比例的粘膜疾病，包括中耳炎、窦炎、慢性结膜炎和慢性下呼吸道感染或下呼吸道感染的恶化。目前，约30％和多达62％的Hi对青霉素具有抗性。据估计，儿童携带率为44％，并且成人携带率为约5％，并且可持续数月。由Hi引起的中耳炎的发病机制和宿主免疫应答均未完全确定。
中耳炎是小于2岁的儿童中的常见病。其定义为中耳中存在液体，伴有急性局部或全身疾病的病征。急性病征包括耳痛、耳流脓和听力丧失，而全身病征包括发热、嗜睡、易怒、厌食、呕吐或腹泻。肺炎链球菌和Hi是引起该病症的最主要的细菌，分别占培养菌种的25％-50％和15％-30％。此外，Hi导致53％的复发性中耳炎。约60％和80％的儿童分别在1岁和3岁时至少有一次疾病发作(峰值在10个月左右)。
不可分型的Hi是慢性支气管炎急性恶化(AECB)的最常见原因，并且来自慢性支气管炎患者的痰的新Hi菌株的存在使恶化的相对危险增加两倍(Sethi等人，N.Engl.J.Med.，第347卷，第464-471页，2002年)。
细菌感染(包括Hi感染)也被发现与慢性阻塞性肺疾病(COPD)相关联。(Albertson等人，J.Am.Geriat.Soc.，第58卷，第570-579页，2010年)。COPD的综合征由慢性支气管炎(CB)、支气管扩张、肺气肿和可逆性气道疾病组成，其在个体患者中独特地组合。老年患者有患COPD及其并发症(肺气肿、慢性支气管炎(CB)和支气管扩张)的风险。细菌和病毒感染在没有COPD特征的情况下在COPD的急性恶化(AECOPD)和CB的急性恶化(AECB)中起作用。老年患者在AECOPD和AECB的发作期间有细菌感染(包括不可分型的Hi感染)的风险。
CB是特征在于慢性痰产生的进行性疾病，并且定义为在肺结核、肺癌和其他咳嗽原因消除后连续2年中每一年中至少3个月的咳嗽和痰(Balter等人，Can.Respir.J.，第10卷，第3B-32B页，2003年；Bronton等人，Am.J.Manage Care，第10卷，第689-696页，2004年)。据报道，大多数COPD患者出现CB(Balter，见上文)。AECB导致这些患者反复发作，伴有恶化的支气管炎症。
有证据表明确实存在对Hi的保护性免疫，然而在感染中天然涉及的表位(外膜蛋白P2、P4、P6)中的抗原漂移在Hi逃避宿主免疫防御的能力中起主要作用。
发明内容
在一个方面，本文描述了包含选自由Omp26、P6、P4、PD和PF组成的组的两种或更多种流感嗜血杆菌(Hi)蛋白的全部或部分的融合蛋白，其中Hi蛋白中的至少一种Hi蛋白是脂化的。在一些实施方案中，融合蛋白包含Omp26和P6，其中Omp26蛋白是脂化的。在一些实施方案中，融合蛋白包含Omp26和P6，其中P6蛋白是脂化的。在一些实施方案中，融合蛋白包含两种脂化的Hi蛋白。
在各种实施方案中，构建体是(SEQ ID NO:31)、LP6φOmp26(SEQID NO:29)、/>(SEQ ID NO:39)、/> (SEQ ID NO:40)、(SEQ ID NO:41)、/> (SEQ ID NO:42)、/>(SEQ ID NO:43)、/> (SEQ ID NO:44)或/>(SEQ ID NO:45)。示例性序列是/>粗体信号序列，下划线的接头。
在各种实施方案中，融合蛋白可包含选自由以下组成的组的信号序列：SS1：天然P6信号序列，MNKFVKSLLVAGSVAALAAC(SEQ ID NO:36)；SS2：Pal蛋白的大肠杆菌(E.coli)天然信号序列，MQLNKVLKGLMIALPVMAIAAC(SEQ ID NO:37)以及SSP4：P4蛋白的流感嗜血杆菌(H.influenzae)信号序列，MKTTLKMTALAALSAFVLAGC(SEQ ID NO:38)。可以想到，当信号序列用于融合蛋白序列中时，信号序列可以在C残基处被切割并且脂质部分被连接。
在一些实施方案中，至少一种Hi蛋白包含脂质部分，其包含C18、C16、C14、C12和C10脂肪酸中的一者或多者。在一些实施方案中，至少一种Hi蛋白包含选自二酰基和/或三酰基脂肪酸或它们的组合的脂质部分。在一些实施方案中，至少一种Hi蛋白包含选自N-酰化或O-酰化脂肪酸的脂质部分。在一些实施方案中，Hi蛋白在蛋白质的N末端处包含脂质部分。在一些实施方案中，融合蛋白中的两个Hi蛋白是脂化的。
在一些实施方案中，融合蛋白包含脂化Omp26和非脂化P6，其中脂质包含C16脂肪酸。在一些实施方案中，融合蛋白包含脂化P6和非脂化Omp26，其中脂质包含C16脂肪酸。
在一些实施方案中，Omp26包含SEQ ID NO:2中列出的氨基酸序列的全部或部分。在一些实施方案中，P6包含SEQ ID NO:4中列出的氨基酸序列的全部或部分。在一些实施方案中，P4蛋白包含SEQ ID NO:6中列出的氨基酸序列。在一些实施方案中，PD蛋白包含SEQID NO:8中列出的氨基酸序列。在一些实施方案中，PF蛋白包含SEQ ID NO:10中列出的氨基酸序列。
在各种实施方案中，融合蛋白任选地包含接头。在一些实施方案中，接头是肽接头。在一些实施方案中，肽接头是Gly-Ser接头。在一些实施方案中，肽接头是GlySerGlyGlyGlyGly(SEQ ID NO:12)。
在一些实施方案中，融合蛋白包含SEQ ID NO:29或31中列出的氨基酸。
还可以想到包含本文所述融合蛋白的疫苗和免疫原性组合物。
本公开还提供了用于制备融合蛋白的方法，该融合蛋白包含选自Omp26、P6、P4、PD和PF的两种或更多种流感嗜血杆菌(Hi)蛋白的全部或部分，其中Hi蛋白中的至少一种Hi蛋白包含脂质部分，该方法包括(i)提供编码脂质部分信号序列区的核酸序列；(ii)提供编码Hi蛋白Omp26、P6、P4、PD或PF的全部或部分的第一核酸序列；(iii)提供编码Hi蛋白Omp26、P6、P4、PD或PF的全部或部分的第二核酸序列，其中第二核酸编码与(ii)不同的Hi蛋白；(iv)任选地提供编码一种或多种附加Hi蛋白Omp26、P6、P4、PD或PF的全部或部分的第三或附加核酸序列，其中第三或更多核酸编码(ii)和(iii)的不同Hi蛋白；(v)将核酸序列(i)-(iv)插入能够表达核酸的质粒载体中；(vi)将质粒载体转染到能够表达核酸分子并表达融合蛋白的宿主细胞中；以及(vii)纯化在宿主细胞中表达的重组融合蛋白。在各种实施方案中，宿主细胞在基本培养基中生长。
在另一个实施方案中，本文想到制备融合蛋白的方法，该融合蛋白包含选自由Omp26、P6、P4、PD和PF组成的组的两种或更多种流感嗜血杆菌(Hi)蛋白的全部或部分，其中Hi蛋白中的至少一种Hi蛋白是脂化的，该方法包括：i)将在编码流感嗜血杆菌(Hi)蛋白Omp26、P6、P4、PD或PF的全部或部分的第一核酸的上游的编码脂质部分信号序列区的核酸插入质粒载体中；ii)将编码流感嗜血杆菌(Hi)蛋白Omp26、P6、P4、PD或PF的全部或部分的第二核酸插入质粒载体中；iii)任选地插入编码选自由Omp26、P6、P4、PD和PF组成的组的一种或多种附加Hi蛋白或其片段的第三或附加核酸序列；iv)将质粒载体转染到能够表达核酸分子的宿主细胞中；v)纯化由质粒表达的融合蛋白。在各种实施方案中，宿主细胞在基本培养基中生长。
在各种实施方案中，脂质部分信号序列选自由以下组成的组：MNKFVKSLLVAGSVAALAAC(SEQ ID NO:36)，具有或不具有末端C残基；MQLNKVLKGLMIALPVMAIAAC(SEQ ID NO:37)，具有或不具有末端C残基；MKTTLKMTALAALSAFVLAGC(SEQ ID NO:38)或MKTTLKMTALAALSAFVLAG(SEQ ID NO:11)。在各种实施方案中，脂质部分信号序列是P4信号序列MKTTLKMTALAALSAFVLAGC(SEQ ID NO:38)或MKTTLKMTALAALSAFVLAG(SEQ ID NO:11)。
在另一个方面，本文描述了制备融合蛋白的方法，该融合蛋白包含选自由Omp26、P6、P4、PD和PF组成的组的两种或更多种流感嗜血杆菌(Hi)蛋白的全部或部分，其中Hi蛋白中的至少一种Hi蛋白是脂化的，该方法包括i)：将在编码流感嗜血杆菌(Hi)蛋白Omp26、P6、P4、PD或PF的全部或部分的第一核酸的上游的编码P4脂质部分信号序列区的核酸插入质粒载体中；ii)将编码流感嗜血杆菌(Hi)蛋白Omp26、P6、P4、PD或PF的全部或部分的第二核酸插入质粒载体中；iii)任选地插入编码选自由Omp26、P6、P4、PD和PF组成的组的一种或多种附加Hi蛋白或其片段的第三或附加核酸序列；iv)将质粒载体转染到能够表达核酸分子的宿主细胞中；v)纯化由质粒表达的融合蛋白。
在另一个方面，本文描述了制备融合蛋白的方法，该融合蛋白包含选自由Omp26、P6、P4、PD和PF组成的组的两种或更多种流感嗜血杆菌(Hi)蛋白的全部或部分，其中Hi蛋白中的至少一种Hi蛋白是脂化的，该方法包括i)：提供编码P4脂质部分信号序列区的核酸；ii)提供编码Hi蛋白Omp26、P6、P4、PD或PF的全部或部分的第一核酸；iii)提供编码Hi蛋白Omp26、P6、P4、PD或PF的全部或部分的第二核酸，其中第二核酸编码与i)不同的Hi蛋白；iv)任选地提供编码选自由Omp26、P6、P4、PD和PF组成的组的一种或多种附加蛋白或其片段的第三或附加核酸序列；v)将核酸序列i)-iv)插入能够表达核酸的质粒载体中；vi)将iv)的质粒载体转染到能够表达核酸分子并表达融合蛋白的宿主细胞中；以及vii)纯化在宿主细胞中表达的重组融合蛋白。
在另一个方面，本文描述了治疗或预防与不可分型流感嗜血杆菌(Hi)感染相关联的疾病的方法，该方法包括施用包含本文描述的融合蛋白的疫苗或免疫原性组合物。与Hi感染相关联的疾病包括但不限于中耳炎、支气管炎、肺炎、窦炎、败血病、心内膜炎、会厌炎、脓毒性关节炎、脑膜炎、产后和新生儿感染、产后和新生儿败血症、急性和慢性输卵管炎、会厌、心包炎、蜂窝组织炎、骨髄炎、心内膜炎、胆囊炎、腹内感染、尿路感染、乳突炎、主动脉移植感染、结膜炎、巴西紫癜性热、隐匿性菌血症、慢性支气管炎、以及潜在肺疾病诸如慢性支气管炎的恶化(AECB)、支气管扩张或囊性纤维化、慢性阻塞性肺疾病(COPD)和COPD的急性恶化(AECOPD)。
在一些实施方案中，与不可分型的Hi感染相关联的疾病是中耳炎。在一些实施方案中，与不可分型的Hi感染相关联的疾病是慢性支气管炎的急性恶化(AECB)。在一些实施方案中，与不可分型的Hi感染相关联的疾病是慢性阻塞性肺疾病的急性恶化(AECOPD)。
还提供了用于治疗或预防与不可分型的流感嗜血杆菌(Hi)感染相关联的疾病的包含本文所述的融合蛋白，疫苗或免疫原性组合物的组合物。在各种实施方案中，本公开提供了包含本文所述的融合蛋白、疫苗或免疫原性组合物的组合物在制备用于治疗或预防与不可分型的流感嗜血杆菌(Hi)感染相关联的疾病的药物中的用途。
在各种实施方案中，疫苗或免疫原性组合物减少或防止在窦、肺和耳中的一者或多者中的定殖。
在各种实施方案中，疫苗或免疫原性组合物包含融合蛋白或LP6φOmp26融合蛋白。
在各种实施方案中，疫苗或免疫原性组合物通过口服、静脉内给药、肌内给药、鼻内给药或皮下给药施用。在各种实施方案中，疫苗或免疫原性组合物鼻内施用。
应当理解，本文所述的每个特征或实施方案或组合是本发明的方面中的任何方面的非限制性、说明性示例，并且因此意味着可与本文所述的任何其他特征或实施方案或组合相结合。例如，在用诸如“一个实施方案”，“一些实施方案”，“某些实施方案”，“另外实施方案”，“特定示例性实施方案”和/或“另一个实施方案”之类的语言描述特征的情况下，这些类型的实施方案中的每个实施方案都旨在与本文所述的任何其他特征或特征组合相结合而不必列出每种可能的组合的特征的非限制性示例。此类特征或特征的组合适用于本发明的方面中的任何方面。在公开落入范围内的值的示例的情况下，这些示例中的任一个示例被认为是范围的可能端点，此类端点之间的任何和所有数值都是可想到的，并且上端点和下端点的任何和所有组合都是可设想的。
本文中的标题是为了方便读者而不是为了限制。根据具体实施方式和/或附图和/或权利要求，本发明的附加方面、实施方案和变化将是显而易见的。
附图说明
图1是比较如通过ELISA确定的脂化和非脂化形式的蛋白P6和Omp26的IgG抗体滴度的图表。
图2描绘了比较如通过ELISA测定的脂化和非脂化融合蛋白的IgG抗体滴度的柱形图。
图3A和图3B是比较用3剂量(每种蛋白质10ug)的非脂化P6、脂化P6和作为对照的矾接种的小鼠的鼻灌洗液(图3A)和中耳灌洗液(图3B)中的Hi负荷的柱形图。在针对P6的研究中，每组使用4-5只成年小鼠。在对CFU计数进行对数转换后，使用组间学生t检验计算p值。
图4示出了如通过HEK-BLUETMTLR2-TLR1细胞刺激测量的在不同Hi脂化肽上发现的脂化类型，表示为％刺激。PAM3CSK4阳性对照是100％刺激。*P<0.0001。
图5示出如通过HEK-BLUETM细胞刺激的活化测量的用于将脂质附着于蛋白质的信号序列的分析。P值代表使用Anova在两种不同浓度下3个信号序列的差异。
图6A至图6C示出脂化的融合蛋白L-P6φNL-PD的免疫原性对体内免疫原性的影响，如通过对PD蛋白(图6A)和P6蛋白(图6B)的抗体应答所测量的(p值在组间使用对log2转换的抗体水平的学生t检验计算)。图6C示出融合诱导针对OMP26和P6的抗体的显著增加。使用组间学生t检验计算p值。
图7示出在动物模型B中用融合进行鼻内免疫后的抗体滴度。
图8A至图8B示出了与三酰基脂质部分相比，二酰基部分对免疫原性的影响，如通过抗体生产(图8A)或细胞因子诱导，例如CCL5(图8B)所测量的。
图9A至图9B是与在存在或不存在佐剂的情况下鼻内(图9A)或腹膜内(图9B)施用的融合蛋白的免疫原性的比较。使用动物模型B。
图10A至图10B示出脂化P6和OMP26以及融合L-P6φNL-OMP26和LOMP26φNL-P6防止鼻咽定植(图10A)和耳感染(图10B)。对CFU进行对数转换后，在组间使用学生t检验计算p值。
图11A至图11B示出在未施用流感感染的改性定殖模型中通过鼻内免疫(IN)进行L-PDφNL-PF融合。以CFU通过鼻咽(图11A)和在耳中(图11B)测量定殖。
图12A至图12D示出如通过鼻灌洗液(图12B、图12C)和耳水疱(图12A、图12D)测量的不同脂化蛋白在肌内(IM)免疫后的效果。图12C和图12D取自相同的实验，但示出与单独的对照相比的LPDφNL-OPM26。
具体实施方式
除非另外定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。以下参考文献为技术人员提供了本公开中使用的许多术语的一般定义：Singleton等人，DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY(第2版，1994年)。
本文中可互换使用的术语“多核苷酸”和“核酸”是指任何长度的核苷酸(核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸)的聚合形式。这些术语包括单链、双链或三链DNA、基因组DNA、cDNA、基因组RNA、mRNA、DNA-RNA杂交体，或包含嘌呤和嘧啶碱基或其他天然、化学、生物化学修饰、非天然或衍生的核苷酸碱基的聚合物。多核苷酸的主链可包含糖和磷酸基团(如通常可在RNA或DNA中发现的)，或者修饰或取代的糖或磷酸基团。另选地，多核苷酸的主链可包含合成亚基诸如氨基磷酸酯的聚合物，并且因此可以是寡脱氧核苷氨基磷酸酯(P-NH2)或混合的氨基磷酸酯-磷酸二酯低聚物。Peyrottes等人，(1996年)Nucleic Acids Res.，第24卷，第1841-1848页；Chaturvedi等人，(1996年)Nucleic Acids Res.，第24卷，第2318-2323页；Schultz等人，(1996年)Nucleic Acids Res.，第24卷，第2966-2973页。硫代磷酸酯键可用于代替磷酸二酯键。Braun等人，(1988年)J.Immunol.，第141卷，第2084-2089页；Latimer等人，(1995年)Molec.Immunol.，第32卷，第1057-1064页。此外，双链多核苷酸可从化学合成的单链多核苷酸产物中获得，通过合成互补链并在适当条件下使链退火，或者通过使用具有适当引物的DNA聚合酶从头合成互补链。提及多核苷酸序列(诸如提及SEQ ID NO)还包括互补序列。
如本文所用，“疫苗”指包含本文所述融合蛋白的组合物，其可用于在受试者中建立对Hi的免疫。可以想到疫苗包含药学上可接受的载体和/或佐剂。在各种实施方案中，疫苗包含含有融合蛋白的载体。可以想到疫苗是预防性的或治疗性的。
“预防性”治疗是出于降低发展病变的风险的目的而施用于不表现出疾病病征或仅表现出早期病征的受试者的治疗。本公开的化合物可作为预防性治疗给予以降低发展病变的可能性或最小化病变(如果发展的话)的严重性。在一些实施方案中，向受试者施用预防性疫苗以降低受试者发展中耳炎或窦炎的可能性。
“治疗性”治疗是出于减少或消除那些病征或症状的目的而施用于表现出病理病征或症状的受试者的治疗。病征或症状可以是生化的、细胞的、组织学的、功能的、主观的或客观的。
“保护性”免疫应答是指疫苗或免疫原性组合物能够引发体液和/或细胞介导的免疫应答以保护个体免受感染。如果与对照个体群体(诸如未施用疫苗或免疫原性组合物的感染受试者)相比保护在统计学上显著改善，则所提供的保护不需要是绝对保护性的，即不需要完全预防或根除感染。保护可限于减轻感染症状的严重程度或快速发作。一般来讲，“保护性免疫应答”包括在至少50％的个体中诱导对特定抗原特异性的抗体的量的增加，包括对每种抗原的可测量的功能性抗体应答的一定程度的增加。在某些情况下，“保护性免疫应答”可包括对特定抗原特异性的抗体的量增加至少2倍或4倍，包括对每种抗原的一定程度的可测量的功能性抗体应答。在某些实施方案中，抗体与保护性免疫应答相关联。可以通过使用本领域已知的测定法测定血清中抗原特异性抗体的存在来测量保护性免疫应答。保护性免疫应答还可以通过在血清杀菌活性(SBA)测定法中测量细菌计数减少的百分比来测定。此类测定法也是本领域已知的。在一些实施方案中，与不存在免疫原性组合物时的细菌计数相比，细菌计数减少至少10％、25％、50％、65％、75％、80％、85％、90％、95％或更多。
如本文所用，“纯化的”是指在减少或消除不相关材料(即，污染物，包括从中获得组合物的内源性材料)存在的条件下分离的融合蛋白或免疫原性组合物。例如但不限于，纯化的融合蛋白基本上不含宿主细胞或培养物组分，包括组织培养物或细胞蛋白和非特异性病原体。在各种实施方案中，基本上不含污染物的纯化材料是至少50％纯的；至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或甚至至少99％纯的。纯度可通过色谱法、凝胶电泳、免疫测定法、组成分析、生物测定法和本领域已知的其他方法来评价。
如本文所用，“药物组合物”是指适合施用于受试者动物(包括人和哺乳动物)的组合物。药物组合物包含药理学有效量的本公开的融合蛋白、疫苗或免疫原性组合物，并且还包含药学上可接受的载体。药物组合物涵盖包含以下的组合物：活性成分和构成药学上可接受的载体的惰性成分，以及由成分中的任何两种或更多种成分的组合、络合或聚集直接或间接产生的任何产物。因此，本公开的药物组合物涵盖通过将本公开的融合蛋白、免疫原性组合物或疫苗与药学上可接受的载体混合而制备的任何组合物。
如本文所用，“药学上可接受的”或“药理学上可接受的”是指不是生物学上或在其他方面不期望的材料，即，该材料可施用于个体而不引起任何不期望的生物效应或以有害方式与其中含有该材料的组合物的组分中的任何组分相互作用，或者当使用本领域中众所周知的途径施用时，如下所述。
如本文所用，“药学上可接受的载体”包括任何和所有临床上有用的溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗和吸收延迟剂、缓冲剂和赋形剂，诸如磷酸盐缓冲盐水溶液、右旋糖或甘露醇的5％水性溶液，以及乳剂，诸如油/水或水/油乳剂，以及各种类型的润湿剂和/或佐剂。合适的药物载体和制剂描述于Remington's PharmaceuticalSciences，第19版，(Mack Publishing Co.,Easton，1995年)中。可用于组合物的药物载体取决于活性剂的预期施用模式。典型的施用模式包括但不限于，肠内(例如，口服)或胃肠外(例如，皮下、肌内、静脉内或腹膜内注射；或局部、经皮或经粘膜施用)。“药学上可接受的盐”是可配制成用于药物用途的化合物或缀合物的盐，包括例如金属盐(钠、钾、镁、钙等)以及氨或有机胺的盐。
流感嗜血杆菌(Hi)
流感嗜血杆菌是一种小的、不活动的革兰氏阴性细菌。一些Hi菌株是多糖包封的，并且胶囊类型被指定为a、b、c、d、e和f。不可分型的Hi菌株缺乏多糖胶囊并且有时表示为“未包封的”。未包封的Hi菌株在遗传上不同于包封的菌株，并且比b型流感嗜血杆菌分离物更异质。Hi向人类宿主呈递一系列复杂的抗原。可引发保护的可能抗原包括外膜蛋白(OMP)、脂多糖、脂蛋白、粘附蛋白和非胶囊蛋白。在这些抗原中，存在包封和非包封菌株共有的组分，包括蛋白Omp26、P6、P4、PD和PF。
人是流感嗜血杆菌的唯一宿主。Hi菌株通常存在于上呼吸道(包括鼻咽和后口咽)、下呼吸道和女性生殖道中。Hi在人类中引起广谱疾病，包括但不限于中耳炎、肺炎、窦炎、败血病、心内膜炎、会厌炎、脓毒性关节炎、脑膜炎、产后和新生儿感染、产后和新生儿败血症、急性和慢性输卵管炎、会厌、心包炎、蜂窝组织炎、骨髄炎、心内膜炎、胆囊炎、腹内感染、尿路感染、乳突炎、主动脉移植感染、结膜炎、巴西紫癜性热、隐匿性菌血症、以及潜在肺疾病(诸如慢性支气管炎、支气管扩张或囊性纤维化)的恶化。
抗原Hi蛋白包括Omp26、P6、P4、PD和PF。在一些实施方案中，OMP26蛋白包含SEQ IDNO:2中列出的氨基酸序列。在一些实施方案中，P6蛋白包含SEQ ID NO:4中列出的氨基酸序列。在一些实施方案中，P4蛋白包含SEQ ID NO:6中列出的氨基酸序列。在一些实施方案中，PD蛋白包含SEQ ID NO:8中列出的氨基酸序列。在一些实施方案中，PF蛋白包含SEQ ID NO:10中列出的氨基酸序列。还可以想到引发免疫应答的SEQ ID NO:2、4、6、8或10中任一者的片段。
融合蛋白
本公开提供了包含选自由OMP26、P6、P4、PD和PF组成的组的两种或更多种流感嗜血杆菌(Hi)蛋白的全部或部分的融合蛋白，其中Hi蛋白中的至少一种Hi蛋白或其片段是脂化的。所考虑的融合蛋白包括LP6φOmp26、 和/>
如本文所用，术语“脂化的”是指包含脂质部分的蛋白质。可以想到，融合蛋白是脂化的，例如通过包含含有脂质部分的一种或多种Hi蛋白。如本文所用，术语“脂化的Hi蛋白”是指包含脂质部分的Hi蛋白或其片段。“非脂化的”Hi蛋白或其片段缺乏脂质部分。“L”是指脂化的，“NL”是指非脂化的。示例性脂质部分包括下表A中提供的脂肪酸。
表A.
在各种实施方案中，脂化的融合蛋白包含脂化和非脂化的Hi蛋白的混合物。如本文所用，术语“脂质部分”是指链长为C10至C18(例如C10、C11、C12、C13、C14、C15、C16、C17或C18)的饱和、不饱和或支链脂肪酸。在一些实施方案中，脂质部分包含C18、C16、C14、C12或C10脂肪酸。在一些实施方案中，脂质部分包含二酰基和/或三酰基脂肪酸。在一些实施方案中，脂质部分是N-酰化和/或O-酰化脂肪酸。在各种实施方案中，脂质部分包含二酰基脂肪酸和三酰基脂肪酸的混合物。在各种实施方案中，二酰基脂肪酸和三酰基脂肪酸的混合物的比率为1:1、1.5:1、2:1、2.5:1或3:1。
在一些实施方案中，融合蛋白包含Omp26或其片段以及P6或其片段，其中P6或其片段是脂化的而Omp26是非脂化的。在一些实施方案中，融合蛋白包含Omp26或其片段以及P6或其片段，其中Omp26或其片段是脂化的而P6是非脂化的。
在一些实施方案中，融合蛋白包含两种或更多种脂化的Hi蛋白或其片段。
在一些实施方案中，融合蛋白包含Omp26和P6的全部或部分，其中Omp26包含一种或多种C16脂肪酸。在一些实施方案中，融合蛋白包含Omp26和P6的全部或部分，其中P6包含一种或多种C16脂肪酸。
在一些实施方案中，融合蛋白包含脂化Omp26，其包含SEQ ID NO:14中列出的氨基酸序列的全部或部分。在一些实施方案中，融合蛋白包含脂化P6，其包含SEQ ID NO:16中列出的氨基酸序列的全部或部分。在一些实施方案中，融合蛋白包含脂化的PD，其包含SEQ IDNO:18中列出的氨基酸序列的全部或部分。在一些实施方案中，融合蛋白包含脂化的PF，其包含SEQ ID NO:20中列出的氨基酸序列的全部或部分。
在一些实施方案中，两种或更多种Hi蛋白或其片段是连接的。在一些实施方案中，两种或更多种Hi蛋白或其片段通过肽接头连接。如本文所用，“接头”是指位于两个多肽序列之间并连接两个多肽的氨基酸或肽序列。接头的长度可以是1-80个氨基酸。在一些实施方案中，接头可以是2-40、3-40、3-30或3-20个氨基酸长。在一些实施方案中，接头可以是18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4或3个氨基酸长的肽。在其他实施方案中，接头可以是3-25、3-18、5-20、6-18或10-20个氨基酸长。在其他实施方案中，接头可以是约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个氨基酸长。在许多情况下，接头缺乏游离的半胱氨酸残基(即，并且因此不参与二硫键)并且也不包含N-糖基化位点(即，Asn-Xxx-Ser/Thr，其中X可以是除脯氨酸之外的任何氨基酸)。其他合适的接头的示例包括G2、G3、G3S、G3P、G3q、G5、G5S等。前述接头中的每个大写字母是指氨基酸的常规单字母代码，并且每个数字是指接头中氨基酸的串联重复的数量。例如，“G3SG2”是指具有序列Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly的接头。“G4S”是指具有序列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser的接头。在各种实施方案中，接头是具有Gly和Ser残基的组合的GS接头。在一些实施方案中，接头包含GlySerGlyGlyGlyGly(SEQ ID NO:12)。
在一些实施方案中，融合蛋白包含SEQ ID NO:29或31中列出的氨基酸序列。
还可以想到包含本文所述融合蛋白中的一种或多种融合蛋白的免疫原性组合物。在一些实施方案中，免疫原性组合物包含脂化融合蛋白的混合物。例如，在一些实施方案中，免疫原性组合物中至少10％的融合蛋白包含二酰基脂肪酸。在一些实施方案中，免疫原性组合物中至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多的融合蛋白包含二酰基脂肪酸。在一些实施方案中，免疫原性组合物中至少10％的融合蛋白包含三酰基脂肪酸。在一些实施方案中，免疫原性组合物中至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多的融合蛋白包含三酰基脂肪酸。
还可以想到包含本文所述融合蛋白中的一种或多种融合蛋白的疫苗。在一些实施方案中，疫苗包含脂化的融合蛋白的混合物。例如，在一些实施方案中，疫苗中至少10％的融合蛋白包含二酰基脂肪酸。在一些实施方案中，疫苗中至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多的融合蛋白包含二酰基脂肪酸。在一些实施方案中，疫苗中至少10％的融合蛋白包含三酰基脂肪酸。在一些实施方案中，疫苗中至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多的融合蛋白包含三酰基脂肪酸。
制备方法
本公开还提供了用于制备融合蛋白的方法，该融合蛋白包含选自Omp26、P6、P4、PD和PF的两种或更多种流感嗜血杆菌(Hi)蛋白的全部或部分，其中Hi蛋白中的至少一种Hi蛋白包含脂质部分，该方法包括(i)提供编码脂质部分信号序列区的核酸序列；(ii)提供编码Hi蛋白Omp26、P6、P4、PD或PF的全部或部分的第一核酸序列；(iii)提供编码Hi蛋白Omp26、P6、P4、PD或PF的全部或部分的第二核酸序列，其中第二核酸编码与(ii)不同的Hi蛋白；(iv)任选地提供编码一种或多种附加Hi蛋白Omp26、P6、P4、PD或PF的全部或部分的第三或附加核酸序列，其中第三或更多核酸编码(ii)和(iii)的不同Hi蛋白；(v)将核酸序列(i)-(iv)插入能够表达核酸的质粒载体中；(vi)将质粒载体转染到能够表达核酸分子并表达融合蛋白的宿主细胞中；以及(vii)纯化在宿主细胞中表达的重组融合蛋白。在各种实施方案中，宿主细胞在基本培养基中生长。
在另一个实施方案中，本文想到制备融合蛋白的方法，该融合蛋白包含选自由Omp26、P6、P4、PD和PF组成的组的两种或更多种流感嗜血杆菌(Hi)蛋白的全部或部分，其中Hi蛋白中的至少一种Hi蛋白是脂化的，该方法包括：i)将在编码流感嗜血杆菌(Hi)蛋白Omp26、P6、P4、PD或PF的全部或部分的第一核酸的上游的编码脂质部分信号序列区的核酸插入质粒载体中；ii)将编码流感嗜血杆菌(Hi)蛋白Omp26、P6、P4、PD或PF的全部或部分的第二核酸插入质粒载体中；iii)任选地插入编码选自由Omp26、P6、P4、PD和PF组成的组的一种或多种附加Hi蛋白或其片段的第三或附加核酸序列；iv)将质粒载体转染到能够表达核酸分子的宿主细胞中；v)纯化由质粒表达的融合蛋白。在各种实施方案中，宿主细胞在基本培养基中生长。
在各种实施方案中，脂质部分信号序列选自由以下组成的组：MNKFVKSLLVAGSVAALAAC(SEQ ID NO:36)，具有或不具有末端C残基；MQLNKVLKGLMIALPVMAIAAC(SEQ ID NO:37)，具有或不具有末端C残基；MKTTLKMTALAALSAFVLAGC(SEQ ID NO:38)或MKTTLKMTALAALSAFVLAG(SEQ ID NO:11)。在各种实施方案中，脂质部分信号序列是P4信号序列MKTTLKMTALAALSAFVLAGC(SEQ ID NO:38)或MKTTLKMTALAALSAFVLAG(SEQ ID NO:11)。
本公开还提供了用于制备融合蛋白的方法，该融合蛋白包含选自Omp26、P6、P4、PD和PF的两种或更多种流感嗜血杆菌(Hi)蛋白的全部或部分，其中Hi蛋白中的至少一种Hi蛋白包含脂质部分，该方法包括(i)提供编码P4脂质部分信号序列区的核酸序列；(ii)提供编码Hi蛋白Omp26、P6、P4、PD或PF的全部或部分的第一核酸序列；(iii)提供编码Hi蛋白Omp26、P6、P4、PD或PF的全部或部分的第二核酸序列，其中第二核酸编码与(ii)不同的Hi蛋白；(iv)任选地提供编码一种或多种附加Hi蛋白Omp26、P6、P4、PD或PF的全部或部分的第三或附加核酸序列，其中第三或更多核酸编码(ii)和(iii)的不同Hi蛋白；(v)将核酸序列(i)-(iv)插入能够表达核酸的质粒载体中；(vi)将质粒载体转染到能够表达核酸分子并表达融合蛋白的宿主细胞中；以及(vii)纯化在宿主细胞中表达的重组融合蛋白。在各种实施方案中，宿主细胞在基本培养基中生长。
在另一个实施方案中，本文想到制备融合蛋白的方法，该融合蛋白包含选自由Omp26、P6、P4、PD和PF组成的组的两种或更多种流感嗜血杆菌(Hi)蛋白的全部或部分，其中Hi蛋白中的至少一种Hi蛋白是脂化的，该方法包括：i)将在编码流感嗜血杆菌(Hi)蛋白Omp26、P6、P4、PD或PF的全部或部分的第一核酸的上游的编码P4脂质部分信号序列区的核酸插入质粒载体中；ii)将编码流感嗜血杆菌(Hi)蛋白Omp26、P6、P4、PD或PF的全部或部分的第二核酸插入质粒载体中；iii)任选地插入编码选自由Omp26、P6、P4、PD和PF组成的组的一种或多种附加Hi蛋白或其片段的第三或附加核酸序列；iv)将质粒载体转染到能够表达核酸分子的宿主细胞中；v)纯化由质粒表达的融合蛋白。在各种实施方案中，宿主细胞在基本培养基中生长。
在一些实施方案中，编码Hi蛋白的核酸序列包含与SEQ ID NO:1、3、5、7或9至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列。在一些实施方案中，编码Omp26的核酸序列包含SEQ ID NO:1。在一些实施方案中，编码P6的核酸序列包含SEQ ID NO:3。在一些实施方案中，编码P4的核酸序列包含SEQ ID NO:5。在一些实施方案中，编码PD的核酸序列包含SEQ ID NO:7。在一些实施方案中，编码PF的核酸序列包含SEQID NO:9。还可以想到编码能够引发免疫应答的Hi蛋白的SEQ ID NO:1、3、5、7或9中任一者的片段。
在一些实施方案中，编码脂化Hi蛋白的核酸序列包含与SEQ ID NO:13、15、17或19至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列。在一些实施方案中，编码脂化Omp26的核酸序列包含SEQ ID NO:13。在一些实施方案中，编码脂化P6的核酸序列包含SEQ ID NO:15。在一些实施方案中，编码脂化PD的核酸序列包含SEQ ID NO:17。在一些实施方案中，编码脂化P4的核酸序列包含SEQ ID NO:19。还考虑了编码融合蛋白(SEQ ID NO:31)、LP6φOmp26(SEQ ID NO:29)、/>(SEQ ID NO:39)、/>(SEQ ID NO:40)、/>(SEQ ID NO:41)、/>(SEQ ID NO:42)、/>(SEQ ID NO:43)、/>(SEQ IDNO:44)或/>(SEQ ID NO:45)中的任一者的核酸。
在一些实施方案中，编码P4脂质部分信号序列的核酸被插入到质粒载体中第一核酸序列的上游，并且第二核酸序列以及任选的第三和附加核酸序列被插入到质粒载体中第一核酸序列的下游。在一些实施方案中，P4脂质部分信号序列包含SEQ ID NO:11中列出的核苷酸序列。在一些实施方案中，P4脂质部分信号序列包含SEQ ID NO:38中列出的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码P4脂质部分信号序列的核酸被插入到质粒载体中第二核酸序列的上游，并且第一核酸序列以及任选的第三和附加核酸序列被插入到质粒载体中第二核酸序列的上游。在一些实施方案中，编码P4脂质部分信号序列的核酸被插入到质粒载体中第二核酸序列的上游，并且第一核酸序列被插入到质粒载体中第二核酸序列的上游，并且质粒载体任选地包含第三和附加核酸序列。
在一些实施方案中，该方法还包括在第一核酸序列和第二核酸序列以及任选的第三和附加核酸序列之间插入编码肽接头的核酸序列。本文想到编码本文所述的任何肽接头的核酸。在一些实施方案中，接头序列编码GlySerGlyGlyGlyGly(SEQ ID NO:12)。
在一些实施方案中，第一核酸序列编码P6蛋白或其片段，并且第二核酸序列编码Omp26蛋白或其片段。在一些实施方案中，第一核酸序列编码Omp26蛋白或其片段，并且第二核酸序列编码P6蛋白或其片段。
在一些实施方案中，编码融合蛋白的核苷酸序列包含SEQ ID NO:28或30。
在各种实施方案中，根据本发明的另外方面，将本文提供的第一核酸序列、第二核酸序列和接头核酸序列(以及任选的第三和随后的核酸序列)组装到表达载体中，优选在用于表达成熟脂蛋白的合适启动子的控制下，这在合适的宿主生物诸如大肠杆菌中引起融合mRNA的初始翻译，并且重组成熟脂化融合蛋白的表达在宿主生物中表达。
可以将本公开的核酸克隆到载体(诸如质粒、粘粒、杆粒、噬菌体、人工染色体(BAC、YAC)或病毒)中，可以将另一种遗传序列或元素(DNA或RNA)插入到该载体中，从而引起所附着的序列或元素的复制。在一些实施方案中，表达载体包含组成型活性启动子序列(诸如但不限于CMV、SV40、延伸因子或LTR序列)或诱导型启动子序列诸如类固醇诱导型pInD载体(Invitrogen)，其中核苷酸的表达可以被调节。本发明的表达载体还可包含调控序列，例如内部核糖体进入位点。例如，可通过转染将表达载体引入细胞中。
分泌信号肽序列也可任选地由表达载体编码，与所关注编码序列可操作地连接，使得表达的多肽可由重组宿主细胞分泌，如果需要的话，用于更容易地从细胞中分离所关注多肽。
还提供了包含此类载体并表达本文所述融合蛋白的重组宿主细胞。重组宿主细胞可以是原核细胞，例如大肠杆菌细胞或真核细胞，例如哺乳动物细胞或酵母细胞。酵母细胞包括酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)和毕赤酵母(Pichia pastoris)细胞。哺乳动物细胞包括VERO、HeLa、中国仓鼠卵巢(CHO)、W138、幼仓鼠肾(BHK)、COS-7、MDCK、人胚肾系293、正常狗肾细胞系、正常猫肾细胞系、猴肾细胞、非洲绿猴肾细胞、COS细胞和非致瘤性小鼠成肌细胞G8细胞、成纤维细胞系、骨髓瘤细胞系、小鼠NIH/3T3细胞、LMTK31细胞、小鼠支持细胞、人宫颈癌细胞、水牛鼠肝细胞、人肺细胞、人肝细胞、小鼠乳腺肿瘤细胞、TRI细胞、MRC 5细胞和FS4细胞。本公开的重组蛋白生产细胞还包括任何已知的昆虫表达细胞系，例如草地贪夜蛾(Spodopterafrugiperda)细胞。在一个实施方案中，细胞是哺乳动物细胞。在某个实施方案中，哺乳动物细胞是CHO细胞。
可以想到宿主细胞在适用于特定细胞类型生长的培养基中生长。例如，可以在LB、TB、SXYT肉汤或基本培养基中培养细菌。在各种实施方案中，宿主细胞是细菌并且在基本培养基中生长。在各种实施方案中，基本培养基是M9培养基。
蛋白质纯化方法是本领域已知的并且在本文中用于从细胞培养基中回收重组蛋白质。例如，蛋白质纯化的方法是本领域已知的，并且可用于生产本公开的融合蛋白。在一些实施方案中，用于蛋白质纯化的方法包括过滤、亲和柱色谱法、阳离子交换色谱法、阴离子交换色谱法和浓缩。过滤步骤可以包括超滤，以及任选超滤和渗滤。过滤优选地进行至少约5次-50次，更优选地10次-30次，并且最优选地14次-27次。亲和柱色谱法可使用例如亲和色谱法(Millipore,Billerica,Mass.)进行。在各种实施方案中，亲和色谱法步骤包括/>-vA柱色谱法。洗脱液可以在溶剂洗涤剂中洗涤。阳离子交换色谱法可包括例如SP-琼脂糖阳离子交换色谱法。阴离子交换色谱法可包括例如但不限于Q-琼脂糖快速流动阴离子交换。阴离子交换步骤优选是非结合的，从而允许移除包括DNA和BSA的污染物。优选地对融合蛋白进行纳米过滤，例如使用Pall DV 20纳米过滤器。例如，可以使用超滤和渗滤来浓缩融合蛋白。该方法还可包括尺寸排阻色谱法的步骤。
疫苗和免疫原性组合物以及施用途径
本公开涵盖包含融合蛋白、免疫原性组合物或疫苗和药学上可接受的载体的组合物。示例性药学上可接受的载体包括任何和所有临床上有用的溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗和吸收延迟剂、缓冲剂和赋形剂，诸如磷酸盐缓冲盐水溶液、右旋糖或甘露醇的5％水性溶液，以及乳剂，诸如油/水或水/油乳剂，以及各种类型的润湿剂和/或佐剂。合适的药物载体和制剂描述于Remington's Pharmaceutical Sciences，第19版，(Mack Publishing Co.,Easton，1995年)中。可用于组合物的药物载体取决于活性剂的预期施用模式。
待施用的融合蛋白或载体的量将取决于若干因素，诸如施用途径、个体的状况、恶性肿瘤的侵袭性程度和所采用的特定载体。此外，该载体可与其他治疗模式结合使用。
可以想到施用有效量的融合蛋白、免疫原性组合物、疫苗。“有效量”是足以实现期望的生物效应(诸如诱导足够的体液或细胞免疫)的量。这可能取决于疫苗的类型、受体的年龄、性别、健康状况和体重。期望的生物效应的示例包括但不限于无症状的产生、症状的减少、组织或粘膜分泌物中细菌滴度的减少、针对流感嗜血杆菌感染的完全保护和针对流感嗜血杆菌感染的部分保护。
如果本公开的疫苗或免疫原性组合物的存在导致受体患者的生理学的可检测变化，其增强针对流感嗜血杆菌的至少一种初级或次级体液和/或细胞免疫应答，则该疫苗或免疫原性组合物具有生理学意义。在一个实施方案中，本公开的疫苗或免疫原性组合物在感染开始之前(以便预防或减弱预期的感染)或在实际感染开始之后提供，并且由此防止进一步的细菌感染。
药学上可接受的载体是本领域熟知的，并且包括但不限于盐水、缓冲盐水、右旋糖、水、甘油、无菌等渗水性缓冲液以及它们的组合。这样的可接受载体的一个示例是含有一种或多种稳定剂诸如稳定的水解的蛋白质、乳糖等的生理学平衡的培养基。载体优选地是无菌的。该制剂应适合施用模式。
如果需要，该组合物还可以含有少量的润湿剂或乳化剂或pH缓冲剂。组合物可以是液体溶液、悬浮液、乳剂、片剂、丸剂、胶囊、缓释制剂、吸入制剂或粉末。口服制剂可以包括标准载体，诸如药物级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。
通常，成分以单位剂型单独或混合在一起供应，例如作为在气密密封容器诸如安瓿或小袋中的干燥冻干粉末或无水浓缩物，指示活性剂的量。在组合物通过注射施用的情况下，可以提供无菌稀释剂的安瓿，使得成分可以在施用之前混合。
制剂中要采用的融合蛋白、免疫原性组合物或疫苗的精确剂量还将取决于施用途径和患者的性质，并且应根据医师的判断和根据标准临床技术的每个患者的情况来决定。在给定制剂中使用的载体或病毒的精确量不是关键的，前提条件是给出产生免疫活性所必需的病毒的最小量。可以想到剂量范围少至约10mg，多至毫克或更多。
本公开的融合蛋白、免疫原性组合物或疫苗的有效剂量还可以从来源于动物模型测试系统的剂量-应答曲线外推。在一些实施方案中，本文所述的免疫原性组合物或疫苗包含20μg-200μg范围内(例如，约20μg、约30μg、约40μg、约50μg、约60μg、约70μg、约80μg、约90μg、约100μg、约110μg、约120μg、约130μg、约140μg、约150μg、约160μg、约170μg、约180μg、约190μg或约200μg)的量的融合蛋白。
在各种实施方案中，免疫原性组合物还包含佐剂。示例性佐剂包括但不限于皂苷、非离子去污剂、植物油、矿物凝胶诸如氢氧化铝、磷酸铝、表面活性物质诸如溶血卵磷脂、多聚醇、聚阴离子、肽、油或烃乳剂、多糖诸如凝胶多糖、脱乙酰壳多糖、葡聚糖、甘露糖、钥孔血蓝蛋白、以及潜在有用的人佐剂诸如N-乙酰基-胞壁酰-L-苏氨酰-D-异谷氨酰胺(thr-MDP)、N-乙酰基-去甲-胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺、N-乙酰基胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺酰-L-丙氨酸-2-(1'-2'-二棕榈酰-sn-甘油-3-羟基磷酰氧基)-乙胺、BCG(卡介苗)、小棒杆菌、ISCOM、纳米珠、角鲨烯和嵌段共聚物，它们被考虑单独使用或组合使用。
ISCOM是免疫刺激复合物的首字母缩略词，最初描述于Morein等人，(Nature，第308卷，第457-460页，1984年)中。ISCOM是新的疫苗递送系统，并且与常规佐剂不同。ISCOM以两种方式形成。在一些实施方案中，抗原在其配制期间被物理掺入结构中。在其他实施方案中，ISCOM-基质(如由例如Isconova供应)不含抗原，但在免疫之前与最终用户选择的抗原混合。混合后，抗原与ISCOM-基质一起存在于溶液中，但没有物理掺入到结构中。
在一个实施方案中，佐剂是水包油乳剂。水包油乳剂在本领域中是众所周知的，并且已被建议可用作佐剂组合物(EP 399843；WO 95/17210，美国专利公布号20080014217)。在一个实施方案中，可代谢油以抗原组合物或分离的病毒的总体积的0.5％至20％(最终浓度)的量、以总体积的1.0％至10％的量或以总体积的2.0％至6.0％的量存在。
在一些实施方案中，可用作佐剂的水包油乳剂系统具有小油滴尺寸。在某些实施方案中，液滴尺寸将为直径在120nm至750nm，或120nm至600nm的范围内。
为了使任何水包油组合物适于人类施用，乳剂系统的油相包含可代谢油。油可以是任何植物油、鱼油、动物油或合成油，其对受体无毒并且能够通过代谢转化。坚果、种子和谷物是植物油的共同来源。合成油也是本公开的一部分，并且可以包括可商购获得的油诸如和其他油。特别合适的可代谢油是角鲨烯。角鲨烯(2,6,10,15,19,23-六甲基-2,6,10,14,18,22-二十四碳六烯)是不饱和油，其大量存在于鲨鱼肝油中，少量存在于橄榄油、小麦胚芽油、米糠油和酵母中，并且是特别适用于本发明的油。角鲨烯是可代谢的油，因为它是胆固醇生物合成的中间体(Merck index，第10版，条目号8619)。可用于水包油乳剂的示例性油包括但不限于甾醇、母育酚和α-生育酚。
在附加实施方案中，将免疫系统刺激剂添加到免疫原性组合物中。免疫刺激剂包括：细胞因子，生长因子，趋化因子，来自淋巴细胞、单核细胞或淋巴器官细胞的细胞培养物的上清液，来自植物的细胞制剂和/或提取物、细胞制剂和/或来自细菌(例如，BCG、分枝杆菌、棒状杆菌)、寄生虫或有丝分裂原的提取物，以及来自其他病毒或其他来源的新型核酸(例如，双链RNA、CpG)，多糖，嵌段共聚物，纳米珠或本领域已知的其他化合物，它们可单独或组合使用。
佐剂和其他免疫刺激剂的特定示例包括但不限于溶血卵磷脂；糖苷(例如，皂苷和皂苷衍生物，诸如Quil A(QS7和QS21)或GPI-0100)；阳离子表面活性剂(例如，DDA)；季烃铵卤化物；多聚醇；多阴离子和多原子离子；聚丙烯酸、非离子嵌段聚合物(例如，Pluronic F-127)；以及3D-MPL(3脱-O-酰化单磷酰脂质A)。参见例如美国专利公布号20080187546和20080014217。
在各种实施方案中，佐剂是免疫检查点抑制剂。在各种实施方案中，免疫检查点抑制剂是CTLA-4、PD-1、PD-L1或PD-L2的抑制剂。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是抗体。检查点抑制剂的抗体包括伊匹单抗、曲美单抗、派姆单抗、纳武单抗、阿特珠单抗、阿维单抗和德瓦鲁单抗。对CTLA-4特异的抗体包括曲美单抗和伊匹单抗其已被批准用于治疗黑素瘤。PD-1的抗体包括派姆单抗(/>Merck Sharp&DohmeCorp)和纳武单抗(/>Bristol-Myers Squibb)；并且靶向PD-L1的抗体包括阿特珠单抗/>阿维单抗重组冻干粉注射剂/>和德瓦鲁单抗
许多方法可用于将融合蛋白、免疫原性组合物、疫苗施用或引入到个体(即，包括受试者或患者)中，包括但不限于口服、皮内、肌内、腹膜内、静脉内、皮下和鼻内途径。
使用方法
本公开提供了治疗或预防与不可分型流感嗜血杆菌(Hi)感染相关联的疾病的方法，该方法包括施用包含本文描述的融合蛋白的疫苗或免疫原性组合物。与Hi感染相关联的疾病包括但不限于中耳炎、支气管炎、肺炎、窦炎、败血病、心内膜炎、会厌炎、脓毒性关节炎、脑膜炎、产后和新生儿感染、产后和新生儿败血症、急性和慢性输卵管炎、会厌、心包炎、蜂窝组织炎、骨髄炎、心内膜炎、胆囊炎、腹内感染、尿路感染、乳突炎、主动脉移植感染、结膜炎、巴西紫癜性热、隐匿性菌血症、慢性支气管炎、以及潜在肺疾病诸如慢性支气管炎的恶化(AECB)、支气管扩张和囊性纤维化、慢性阻塞性肺疾病(COPD)和COPD的急性恶化(AECOPD)。在一些实施方案中，与不可分型的Hi感染相关联的疾病是中耳炎。在一些实施方案中，与不可分型的Hi感染相关联的疾病是慢性支气管炎的急性恶化(AECB)。在一些实施方案中，与不可分型的Hi感染相关联的疾病是慢性阻塞性肺疾病的急性恶化(AECOPD)。
在一些实施方案中，免疫原性组合物与其他疫苗同时施用，例如与胃肠外疫苗诸如DTPw或DTPa疫苗(针对百日咳杆菌-百日咳、白喉、破伤风的疫苗)，针对流感嗜血杆菌b诱导的脑膜炎、乙型肝炎或麻疹、腮腺炎、风疹(MMR)的疫苗，针对肺炎链球菌的疫苗，以便优化到医生的就诊次数。
还提供了用于治疗或预防与不可分型的流感嗜血杆菌(Hi)感染相关联的疾病的包含本文所述的融合蛋白，疫苗或免疫原性组合物的组合物。在各种实施方案中，本公开提供了包含本文所述的融合蛋白、疫苗或免疫原性组合物的组合物在制备用于治疗或预防与不可分型的流感嗜血杆菌(Hi)感染相关联的疾病的药物中的用途。
在各种实施方案中，疫苗或免疫原性组合物减少或防止在窦、肺和耳中的一者或多者中的定殖。
包装和剂型
本文所述的融合蛋白、免疫原性组合物或疫苗可包装在单位剂量或多剂量(例如，2剂量、4剂量或多于4剂量)中。对于多剂量形式，小瓶通常但不一定优于预填充的注射器。合适的多剂量形式包括但不限于每容器2剂量至10剂量，每剂量0.1mL至2mL。在某些实施方案中，该剂量为0.5mL剂量。
组合物可以在小瓶或其他合适的储存容器中提供，或者可以在预填充转移装置中提供，诸如单组分或多组分注射器，其可以或可以不设置有针。注射器通常但不一定含有单剂量的本发明的含防腐剂的免疫原性组合物，但也可以想到多剂量预填充注射器。同样，小瓶可包括单剂量或可包括多剂量。
可以常规地建立有效剂量体积，但是可注射组合物的典型剂量具有0.5mL的体积。在某些实施方案中，剂量被配制用于施用于人受试者。在某些实施方案中，该剂量被配制用于施用于人、成人、青少年、婴儿或学步儿童(即，不超过一岁)的人受试者，并且在优选的实施方案中可以通过注射施用。
本文公开的液体免疫原性组合物还适于重构以冻干形式提供的其他免疫原性组合物。当免疫原性组合物旨在被重构以原样使用时，本发明提供具有两个或更多个小瓶、两个或更多个备用填充注射器、或者一个或更多个小瓶和另选填充注射器的试剂盒。组，其中注射器的内容物用于在注射之前恢复小瓶的内容物，或反之亦然。
另选地，可将本文公开的免疫原性组合物冻干并重构，例如使用本领域熟知的用于冷冻干燥的许多方法中的一种方法来形成干燥、规则(例如，球形)颗粒，诸如具有颗粒特性(诸如平均直径尺寸)的微粒或微球，该颗粒特性可通过改变用于制备颗粒的精确方法来选择和控制。免疫原性组合物可另外包含佐剂，其可根据需要与干燥、规则(例如，球形)颗粒(诸如微粒或微球)中的每一者一起制备或包含于其中。在这些实施方案中，本公开还提供了免疫原性组合物试剂盒，其包含第一组分，该第一组分包含稳定的干燥免疫原性组合物，视具体情况而定任选地包含一种或多种防腐剂；第二组分用于重构第一组分的无菌水性溶液。在某些实施方案中，水性溶液包含一种或多种防腐剂和任选至少一种佐剂(参见例如WO 2009/109550(以引用方式并入本文))。
在另一个实施方案中，多剂量形式的容器选自由以下组成的组但不限于以下中的一者或多者：普通实验室玻璃器皿、烧瓶、烧杯、量筒、倾析器、生物反应器、管道、管、袋、瓶、小瓶、小瓶封闭物(例如橡胶塞、螺帽)、安瓿、注射器、双室或多室注射器、注射器塞、注射器柱塞、橡胶紧固件、塑料紧固件、玻璃紧固件、药筒和一次性笔等。容器不受制造材料的限制，并且包括各种材料，诸如玻璃、金属(例如，钢、不锈钢、铝等)和聚合物(例如，热塑性塑料、弹性体、热塑性弹性体)。在特定实施方案中，这种形式的容器是带有丁基塞的5mLSchott 1型玻璃小瓶。本领域技术人员将理解，上述形式决不是详尽的列表，而仅仅是作为本领域技术人员关于可用于本发明的许多形式的指导。想到用于本发明的其他形式可以在实验室设备供应商和制造商中找到，诸如United States Plastic Corp.,Lima,OH，VWR出版物目录。
本公开的附加方面和细节将从以下实施例中显而易见，这些实施例旨在是说明性的而不是限制性的。
实施例
实施例1–重组HirV脂蛋白的克隆
在其天然流感嗜血杆菌宿主中的所有流感嗜血杆菌重组疫苗(HirV)候选物含有将蛋白质引导至膜的信号序列，但只有P6、PD和P4是天然脂蛋白。下述构建体的天然信号序列被P4脂质编码信号序列(SEQ ID NO.11)取代。克隆最初转化到DH5大肠杆菌细胞中。对重组分离的质粒DNA进行限制性分析和DNA测序以证实克隆。
脂化Omp26(LOmp26)：含有编码P4脂质的N-末端信号序列(SEQ ID NO:13)的成熟Omp26基因最初在GenScript,Piscataway,NJ处合成并克隆到pBAD18Cm中的Kpn1和Sph1位点中。引物被设计(参见表1)并用于对来自pBAD18Cm的Omp26基因进行PCR并克隆到pET21a载体中的Nde1和Xho1位点中，该载体在蛋白质的羧基末端处添加了聚His标签。全长LOmp26氨基酸序列在SEQ ID NO:14中提供。
脂化P6(LP6)：含有编码P4脂质的N-末端信号序列(SEQ ID NO:15)的成熟P6基因序列最初在GenScript,Piscataway,NJ处合成并克隆到pBAD18Cm中的Kpn1和Sph1位点中。引物被设计(参见表1)并用于对来自pBAD18Cm的P6基因进行PCR并克隆到pET21a载体中的Nde1和Xho1位点中，该载体在蛋白质的羧基末端处添加了聚His标签。全长LP6氨基酸序列在SEQ ID NO:16中提供。
脂化的PD(LPD)：含有编码P4脂质的N-末端信号序列(SEQ ID NO:17)的成熟PD基因序列最初在GenScript,Piscataway,NJ处合成并克隆到pBAD18Cm中的Kpn1和Sph1位点中。引物被设计(参见表1)并用于对来自pBAD18Cm的PD基因进行PCR并克隆到pET21a载体中的Nde1和Xho1位点中，该载体在蛋白质的羧基末端处添加了聚His标签。全长LPD氨基酸序列在SEQ ID NO:18中提供。
脂化的P4(LP4)：含有编码P4脂质的N-末端信号序列(SEQ ID N:19)的成熟P4基因序列在GenScript,Piscataway,NJ处合成并直接克隆到pET-21a(+)中的NdeI和Xho位点中。P4基因还含有N218Q突变以降低其磷酸单酯酶活性，如先前报道的。全长LP4氨基酸序列在SEQ ID NO:20中提供。
表1.PCR引物
Nde1-LP4 Fwd gatatacatATGAAGACCACCCTGAAAATG SEQ ID NO:21
Xho1 Omp26 Rev ctatatctcgagTTTCTTTTCTTGCACT SEQ ID NO:22
Nde1 Omp26 Fwd gatatacatATGGAGGAAAAGATCGCGTTC SEQ ID NO:23
Xho1 P6 Rev ctatatctcgagATACGCCAGAACCGCA SEQ ID NO:24
Nde1 P6 Fwd gatatacatATGAGCAGCAGCAACAACGATG SEQ ID NO:25
Xho1 PD Rev ctatatctcgagTTTGATACCCTTCAGAA SEQ ID NO:26
Nde1 PD Fwd gatatacatATGAGCAGCCACAGCAGCAAC SEQ ID NO:27
实施例2-重组蛋白的表达和纯化
将如实施例1所述产生的重组克隆转化到BL21或BLR表达细胞系中，该细胞系是B/r大肠杆菌并且缺乏细胞质lon蛋白酶。然后将脂蛋白克隆转化到C41(DE3)或C43(DE3)中，与BL21(DE3)相比，它们克服了过量产生的膜蛋白的毒性(Mirouz等人，J.Mol.Biol.，第260卷，第289-298页，1996年)；Dumon-Seignovert等人，Protein Exp.Purif.，第37卷，第203-206页，2004年；Chen等人，Vaccine，第27卷，第1400-1409页，2009年)。表2列出了各种大肠杆菌菌株的基因型。
表2.
(DE3)：插入λ噬菌体整合酶基因中的T7聚合酶(I基因)。T7聚合酶的表达受lacUV5控制(IPTG诱导型)，由λ-溶原产生。
细胞在50ml培养管中的Luria-Bertanni(LB)培养基+100μg/ml氨苄青霉素中于37℃下以200rpm振荡生长。过夜生长的细菌在新鲜LB培养基+100ug/ml氨苄青霉素中的1:100稀释液，其中生长至OD600约0.5(在37℃，200rpm下约2.5小时-3小时)，然后用0.4mM IPTG诱导。细胞在30℃生长4小时并通过以10Krpm离心收获。将球剂储存在-20℃下。使用上述条件表达所有的重组蛋白，除了以下修饰：
使用LP6：C43(DE3)细胞。
使用LPD：C41(DE3)pLysS细胞。此外，预生长、生长和孵育培养基还含有34μg/mL氯霉素。
使用LPF：C41(DE3)pLysS细胞。此外，预生长、生长和孵育培养基还含有34μg/mL氯霉素。生长和诱导培养基还含有1％葡萄糖。诱导在37℃下进行4小时。
使用LP4：C43(DE3)细胞。生长和诱导培养基还含有1％葡萄糖。
细胞裂解：对于从1L批次产生的每个解冻的蛋白质球剂，添加30ml含有50mMTris/300mM NaCl/100μg/ml溶酶体pH＝8的缓冲液。添加蛋白酶抑制剂PMSF至1mM浓度。在悬浮球剂后，在冰上以30个工作周期的超声波处理15秒×3-4个周期(W-225超声波仪，超声波W-225)裂解细胞，并在37℃水浴中孵育30分钟。以10Krpm旋转1小时。
接下来，对于从1L批次产生的每个解冻的蛋白质球剂，添加30ml含有50mM Tris/300mM NaCl/100μg/ml溶酶体pH＝8的缓冲液。添加蛋白酶抑制剂PMSF至1mM浓度。在悬浮球剂后，在冰上以30个工作周期的超声波处理15秒×3-4个周期(W-225超声波仪，超声波W-225)裂解细胞，并在37℃水浴中孵育30分钟。以10Krpm旋转1小时。对于从1L批次产生的每个解冻的蛋白质球剂，添加30ml含有50mM Tris/300mM NaCl/100μg/ml溶酶体pH＝8的缓冲液。添加蛋白酶抑制剂PMSF至1mM浓度。在悬浮球剂后，在冰上以30个工作周期的超声波处理15秒×3-4个周期(W-225超声波仪，超声波W-225)裂解细胞，并在37℃水浴中孵育30分钟。以10Krpm旋转1小时。
脂化重组蛋白的纯化：对于从1L批次产生的每个解冻的蛋白沉淀，添加30ml含有50mM Tris/300mM NaCl/100μg/ml溶酶体pH＝8的缓冲液。添加蛋白酶抑制剂PMSF至1mM浓度。在悬浮球剂后，在冰上以30个工作周期的超声波处理15秒×3-4个周期(W-225超声波仪，超声波W-225)裂解细胞，在37℃水浴中孵育30分钟并以10Krpm旋转1小时。
为了结合和洗脱His-标记的脂蛋白，将裂解的蛋白质提取物添加到平衡小珠中并收集流通液以用于通过SDS-PAGE凝胶进一步分析。用5×柱体积的洗涤缓冲液洗涤小珠。接下来，用1ml-5ml洗脱缓冲液(250mM咪唑+0.5％两性洗涤剂)洗脱脂蛋白，并且收集1ml级分。级分在Nanodrop上运行以测定蛋白质浓度。
通过SDS-PAGE分析级分的脂蛋白回收率和纯度。如果需要，进行尺寸排阻或离子交换以进一步纯化脂蛋白。
使用Millipore Centricon管式过滤器(3kDa或10kDa)来移除咪唑。基本上，将脂蛋白级分添加到过滤器中并以3Krpm旋转20分钟-30分钟。将含有0.05％两性洗涤剂的10ml-15ml的PBS缓冲液添加到1ml浓缩物中并再次旋转。将其重复2次。
使用Bradford测定法测定蛋白浓度，并用含有0.05％两性洗涤剂的PBD缓冲液稀释至>0.5mg/ml的最终浓度，并将等分试样储存在-80℃下。通过SDS-PAGE评估脂蛋白的大小和纯度(数据未示出)。脂蛋白的最终产率为每升诱导培养物1mg-4mg。
非脂化重组蛋白的纯化：使用与脂蛋白相同的条件表达所有非脂化蛋白。在裂解期间，不添加溶菌酶。然而，在超声处理之前添加1％ Triton。第一次离心后，使用上述Ni-珠方案纯化含有蛋白质的上清液，但在缓冲液中不添加两性洗涤剂。
非脂化蛋白的最终产率为每升诱导培养物5mg-15mg。
实施例3-质谱分析
通过还原和烷基化，随后蛋白质沉淀来制备脂化蛋白以用于LC-MS分析。在沉淀后，分别使用胰蛋白酶和糜蛋白酶将蛋白质消化成肽，并使用两种不同的梯度在nanoLC系统上运行小样品体积以确保高度脂化的肽被完全洗脱。随后使用HCD-IT(离子阱)和HCD-OT(轨道阱)产生质谱。使用Proteome Discoverer 2.2进行数据处理。使用胰蛋白酶、高有机溶剂梯度的消化和使用HCD-IT(离子阱)的MS的组合显示鉴定脂化肽的最佳结果。
运行对照三酰化肽PAM3CSK4以优化从重组脂化蛋白产生的三酰化肽的检测。结果显示了完全三酰化肽的高置信度检测。还检测到在碰撞/碎裂过程期间产生的O-连接的二酰化产物和N-连接的单酰化产物。
基于发表的文献，由Skyline和Proteome Discoverer软件在所产生的谱分析中使用预测脂质组合物(1、2、3、A、A'、B、B'、C、D、E)中的每一者的理论单一同位素和平均质量。修饰包括中性质量(M)、+1电荷(M+H)、+2电荷(M+2检测O-连接的二酰化(二酰甘油)，其中脂质结构1、2、3和B具有许多PSM。脂质结构D也对仅一种PSM产生高置信度，因为其峰值被清楚地限定(数据未显示)。用1PSM以中等置信度检测三酰化rLP6，仅检测脂质D结构。表3示出2个不同批号的LP6和LP4以及1个批号的LPF的概括MS分析。
表3.分析的MS样品的总结
/>
实施例4-添加N-乙酰基转移酶增强三酰化
在革兰氏阴性和某些革兰氏阳性菌中产生的脂蛋白同时具有O-酰化和N-酰化的脂肪酸。1,2添加N-酰化脂肪酸发生在甘油在N-末端半胱氨酸残基处的二酰化之后。3在大肠杆菌中，酶、N-酰基转移酶(Lnt，最初命名为CutE)4将磷脂酰乙醇胺的sn-1-酰基链转移至半胱氨酸的胺基团，从而产生三酰化脂蛋白。Lnt的晶体结构已被确定，并且是定位于内膜的单体8-跨膜蛋白。5
在大肠杆菌中产生的重组表达的三酰化与二酰化脂蛋白的水平可反映可用于催化脂蛋白成熟中的最后步骤的Lnt的量。
该方法是将来自大肠杆菌BLR21细胞的Lnt基因及其天然Shine Delgarno、核糖体结合区序列克隆到与pET21表达载体相容的质粒中。p15A质粒来源载体诸如pACYC184(其是低拷贝质粒)以及使用非诱导型启动子，在Lnt的过度表达是致死的情况下将被使用。pACYC184上的氯霉素抗性基因将被lnt基因取代，Lnt的表达将在氯霉素启动子的组成型控制下。pACYC184_Lnt质粒将被克隆到DH5感受态细胞中，并测试质粒编码的lnt RNA的表达。在确认正确的克隆和RNA表达后，然后将质粒转化到HirV重组脂蛋白氨苄青霉素抗性C41(DE3)或C43(DE3)菌株中并共同选择用于四环素抗性。HirV纯化脂化蛋白的三酰化水平将通过质谱(MS)来确定，诸如通过实施例2中描述的方法。
实施例4的参考文献：
1.Nguyen MT、Gotz F.，Lipoproteins of Gram-Positive Bacteria:KeyPlayers in the Immune Response and Virulence，Microbiol Mol Biol Rev 2016，第80卷，第3期，第891-903页。
2.Nakayama H、Kurokawa K、Lee BL.，Lipoproteins in bacteria:structuresand biosynthetic pathways，The FEBS journal，2012年，第279卷，第23卷，第4247-4268页。
3.Okuda S、Tokuda H.，Lipoprotein sorting in bacteria，Annu RevMicrobiol，2011年，第65卷，第239-259页。
4.Gupta SD、Gan K、Schmid MB、Wu HC.，Characterization of a temperature-sensitive mutant of Salmonella typhimurium defective in apolipoprotein N-acyltransferase，J Biol Chem，1993年，第268卷，第22期，第16551-16556页。
5.Noland CL、Kattke MD、Diao J等人，Structural insights into lipoproteinN-acylation by Escherichia coli apolipoprotein N-acyltransferase，Proc NatlAcad Sci U S A，2017年，第114卷，第30期，第E6044-e6053页。
6.Luo Y、Friese OV、Runnels HA等人，The Dual Role of Lipids of theLipoproteins in Trumenba,a Self-Adjuvanting Vaccine Against MeningococcalMeningitis B Disease，The AAPS journal，2016年，第18卷，第6期，第1562-1575页。
7.Martinon-Torres F、Gimenez-Sanchez F、Bernaola-Iturbe E、Diez-DomingoJ、Jiang Q、Perez JL.，A randomized,phase 1/2trial of the safety,tolerability,and immunogenicity of bivalent rLP2086 meningococcal B vaccine in healthyinfants，Vaccine，2014年，第32卷，第40期，第5206-5211页。
实施例5-重组脂化融合蛋白的克隆
以下实施例描述了产生LP6φOmp26和LOmp6φP6融合蛋白的过程。
LP6φOmp26融合蛋白：用于制备融合的P6和Omp26基因来自实施例1中所述的pET21克隆构建体。融合接头序列在SEQ ID NO:12中提供。为了制备LP6φOmp26构建体，使用Nde1-LP4 Fwd和Lnk-P6 Rev引物对LP6DNA片段进行PCR(对于引物序列参见表1)。在单独的反应中，使用Lnk-Omp26 Fwd和Xho1 Omp26 Rev引物对Omp26 DNA片段进行PCR。将纯化的DNA片段一起添加，并且在初始PCR反应后，将引物Nde1-LP4Fwd和Xho1Omp26添加到PCR反应中。用Nde1和Xho1消化纯化的最终融合PCR产物，并在Nde1和Xho1位点克隆到pET21中。克隆到pET21a中的核苷酸在SEQ ID NO:28中列出，并且编码的氨基酸序列在SEQ ID NO:29中列出。
LOmp26φP6融合蛋白：用于制备融合的LOmp26和P6基因来自实施例1中所述的pET21克隆构建体。融合接头序列在SEQ ID NO:12中提供。为了制备LOmp26φP6构建体，使用Nde1-LP4 Fwd和Lnk-Omp26 Rev引物对LOmp26 DNA片段进行PCR(对于引物序列参见表1)。在单独的反应中，使用Lnk-P6 Fwd和Xho1 P6 Rev引物对P6 DNA片段进行PCR。将纯化的DNA片段一起添加，并且在初始PCR反应后，将引物Nde1-LP4Fwd和Xho1 P6 Rev添加到PCR反应中。用Nde1和Xho1消化纯化的最终融合PCR产物，并在Nde1和Xho1位点克隆到pET21中。克隆到pET21a中的DNA序列在SEQ ID NO:30中列出，并且预测的全长His标签融合蛋白序列在SEQ ID NO:31中列出。
实施例6-重组非脂化融合蛋白的克隆
以下实施例描述了产生非脂化P6φOmp26和Omp6φP6融合蛋白的过程。
P6φOmp26：用于制备融合的P6和Omp26基因来自实施例1中所述的pET21克隆构建体。融合接头序列在SEQ ID NO:12中列出。为了制备P6φOmp26构建体，使用Nde1 P6 Fwd和Lnk-P6 Rev引物对P6 DNA片段进行PCR(对于引物序列参见表1)。在单独的反应中，使用Lnk-Omp26Fwd和Xho1 Omp26 Rev引物对Omp26 DNA片段进行PCR。将纯化的DNA片段一起添加，并且在初始PCR反应后，将引物Nde1 P6 Fwd和Xho1 Omp26 Rev添加到PCR反应中。用Nde1和Xho1消化纯化的最终融合PCR产物，并在Nde1和Xho1位点克隆到pET21中。克隆到pET21a中的DNA序列在SEQ ID NO:32中列出，并且预测的全长His标签融合蛋白序列在SEQID NO:33中列出。
Omp6φP6-用于制备融合的Omp26和P6基因来自该报告中所述的pET21克隆构建体。融合接头序列在SEQ ID NO:12中列出。为了制备Omp26φP6构建体，使用Nde1 Omp26Fwd和Lnk-Omp26 Rev引物对Omp26 DNA片段进行PCR(对于引物序列参见表1)。在单独的反应中，使用Lnk-P6 Fwd和Xho1 P6 Rev引物对P6 DNA片段进行PCR。将纯化的DNA片段一起添加，并且在初始PCR反应后，将引物Nde1 Omp26 Fwd和Xho1 P6 Rev添加到PCR反应中。用Nde1和Xho1消化纯化的最终融合PCR产物，并在Nde1和Xho1位点克隆到pET21中。克隆到pET21a中的DNA序列在SEQ ID NO:34中列出，并且预测的全长His标签融合蛋白序列在SEQID NO:35中列出。
实施例7-脂化形式相对于非脂化形式的P6和Omp26的免疫原性研究
小鼠(n＝4-5)在指定时间用每种蛋白质的10μg剂量接种，并且在第3剂量后2周收集血清。结果显示与非脂化型式的P6和OMP26相比，脂化诱导的小鼠血清-IgG抗体显著更高(图1)。
实施例8-脂化融合蛋白的免疫原性研究。
如实施例5所述产生OMP26φP6蛋白的融合构建体，其中信号序列连接至OMP26(LOmp26φP6)。小鼠(n＝4-5)在指定时间用10μg剂量的LOmp26φP6或非脂化Omp26φP6接种，并且在第3剂量后2周收集血清。结果表明LOmp26φP6增加了对OMP26和P6两者的IgG应答，即使P6未被脂化(图2)。IgG OMP26滴度表明LOMP26更具免疫原性，并且当其与其他蛋白质融合时在免疫原性上没有显示差异，表明融合构建物仍然保持其原始折叠和结构。有趣的是，当与LOMP26融合时，与非融合蛋白相比，观察到P6 IgG滴度的显著增加，证明了融合构建体的反式作用和类似功能。
实施例9-中耳炎动物模型
模拟天然人感染发病机理的小鼠Hi急性中耳炎(AOM)模型通过在Hi攻击前一周使用小鼠适应的流感菌株PR8/36(PR8)引入NP病毒感染来制备。数据显示Hi NP定殖密度超过建立AOM的致病阈值，并且我们已经在使用蛋白D的疫苗保护中验证了该模型。
使用热灭活的Hi作为免疫原(阳性对照)，结果显示NP定殖的非常显著的减少和针对AOM的完全保护。在该小鼠模型(n＝4-5只小鼠/组)中用脂化和非脂化P6蛋白进行的攻击实验中，脂化P6导致Hi的NP定殖的>1个对数减少(图3)。在鼻灌洗液和耳水疱样品中接受脂化P6的小鼠中Hi负荷最低。
实施例10-附加体内研究
分别在大肠杆菌菌株BLR21(DE3)和C43(DE3)中表达P6、OMP26、OMP26φP6和P6φOMP26融合的脂化和非脂化蛋白，并使用标准建立的方案进行纯化(Fletcher等人，Infection and Immunity，第74卷，第6383-6845页，2005年)。对于脂化蛋白的纯化，在细胞裂解期间使用1％两性洗涤剂从膜中提取蛋白质，并将最终的脂化构建蛋白在-80℃下储存在0.05％两性洗涤剂缓冲液中以保持蛋白质稳定。对所有4种脂化蛋白进行质谱分析以确认三酰化状态(完全棕榈酰化)。
在第0、7和21天，用两种不同浓度的疫苗制剂肌内免疫4周龄的C57BL/6小鼠(n＝10，5只雄性和5只雌性/组)，该疫苗制剂含有10ug和25μg的每种蛋白质(在计算中将考虑包括融合构建体的每种蛋白质的摩尔量)(脊椎动物切片)与磷酸铝佐剂。对照小鼠仅接受AlPO4(阴性对照)或HK-Hi(阳性对照)。在一组中，将P6和OMP26蛋白以脂化和非脂化型式混合(例如，L-OMP26+NL-P6、L-P6+NL-OMP26和NLP6+NLOMP26)，并测试与融合构建体相比在攻击中的协同效应。在第35天采集的血液样品和血清IgG和IgM通过针对单独非脂化P6和OMP26蛋白的标准化ELISA测量。在第35天，使用上述HiAOM33标准模型中的剂量用PR8病毒感染小鼠，并且在一周后，将用给予每个鼻孔的10μl的Hi菌株575鼻内攻击小鼠(菌株575来自已被表征用于蛋白质的表面表达和测序的全基因组的储库)。感染后三天，取耳灌洗液、耳水疱、鼻洗液(NW)、NP粘膜组织(包埋在石蜡中保存)、NALT、血液和脾脏。NW和中耳样品中的Hi细菌的测量通过在具有不同稀释度的巧克力板上铺板来枚举。
接下来，从鼻洗液(NW)和耳灌洗液流体确定粘膜IgG和IgA抗体水平。鼻相关淋巴组织(NALT)是分离的，它是呼吸道感染的主要粘膜部位和局部T细胞的储库。将脾脏匀浆并将分离的细胞储存在液氮中以用于T细胞分析。
使用Luminex(Biorad)确定鼻和耳灌洗液中由记忆Th17细胞产生的IL-17、IL-6和IL-22的水平。在人类中，Th17细胞不产生IL-6。为了测量Th17细胞应答，将从脾脏中分离CD4+T细胞(使用MACS微珠技术；miltenyibiotec)并且通过IL-17A的细胞内染色(ICS)定量Th17细胞。不进行重复测定法，因为每组中测试的小鼠数量是它们自己的方差对照。还通过标准ICS染色确定NALT中针对脂化和非脂化蛋白的抗致病性Th17应答(通过合并来自每组的2-3只小鼠的NALT以获得足够数量的细胞)。
不希望受任何特定理论束缚，可以想到将观察到与非脂化抗原相比，来自用如本文所述的脂化蛋白(单独或作为融合构建体)接种的小鼠的耳和NP样品中的降低的Hi。
接下来，从如上所述接种的小鼠的储存(-20℃)鼻和中耳灌洗液中，使用Luminex(Biorad)确定IL-8和TNF-α(嗜中性粒细胞的已知趋化因子)水平。嗜中性粒细胞浸润通过NP粘膜组织的组织病理学确定，如先前所述(Lu等人，PLoS Pathogens，第4卷，第e1000159页，2008年；van Rossum等人，Infect.Immun.，第73卷，第718-7726页，2005年)。为了证实嗜中性粒细胞是负责降低NP中的Hi的主要参与者，测定免疫的嗜中性粒细胞耗尽的小鼠的减少的保护。每组六只小鼠用脂化和非脂化P6和OMP26免疫，并在攻击时用单克隆抗体RB6-8C5治疗，如先前对于Spn携带率所描述的(Lu，上文)，并观察在NP和中耳中针对Hi的保护差异。抗体、细胞因子水平和嗜中性粒细胞数目与NP和ME灌洗液中Hi的细菌负荷相关。
不希望受任何特定理论的束缚，可以想到在用脂化疫苗抗原免疫的小鼠攻击后将观察到鼻洗液和粘膜中更高的IL-8和TNF-α水平和嗜中性粒细胞浸润。攻击时嗜中性粒细胞的消耗将降低保护作用。与脂化和非脂化蛋白疫苗接种相比，预期有类似结果。
实施例11-被动免疫
以下实施例提供了确定单独的免疫血清和/或免疫T细胞的被动转移是否赋予未经治疗婴儿和成年小鼠保护的方案。将10只成年小鼠/组用脂化和非脂化P6和OMP26蛋白接种(按照实施例9中所述的方案)。在第3剂量的接种后两周，使小鼠牺牲，收集血液和脾脏并处理血清和脾细胞。对抗体水平进行定量，并将对每种接种蛋白具有高滴度的血清样品合并。将含有10μg抗体的血清样品经由尾静脉过继转移至未经治疗小鼠。第二组未经治疗小鼠仅接受分离的免疫CD4+T细胞，并且第三组未经治疗小鼠接受组合的免疫血清和CD4+T细胞，并经由尾静脉给予婴儿(第14天)和成年(6周)小鼠。在转移前七天，小鼠(每组中n＝8)接受PR8//36，7天后用Hi 575菌株攻击(抗体和T细胞转移后4小时-6小时)。在攻击后第3天确定耳和鼻灌洗液中的细菌负载。
不希望受任何特定理论的束缚，可以想到成年小鼠的保护将仅需要CD4+T细胞。采用抗体和CD4+T细胞的转移将更好地被动保护婴儿小鼠免于定殖和AOM。
实施例12-三酰化或二酰化对免疫应答的影响
生产蛋白质的方法可导致不同水平的蛋白质脂化。为了确定脂化的类型是否对脂化的Hi蛋白的免疫原性具有任何影响，检验了在融合蛋白上脂化的类型和估计水平。
为了观察脂化的效果，根据制造商推荐的方案培养响应于高水平的三酰化肽的HEK-BLUETMhTLR2-TLR1细胞(表达人TLR2和TLR1基因的SEAP报道基因293细胞，(InvivoGen,San Diego,CA)。
图4示出各种肽以及用作100％刺激的阳性对照PAM3CSK4(三脂化肽)和阴性对照PAM2CSK4(二脂化肽)的细胞刺激水平(％)。在3种不同浓度的脂蛋白(10μg、1μg和0.1μg的蛋白质)下进行测试。显示1μg下的数据。通过该方法估计，与Pam3CSK4的阳性对照相比，脂化P6(LP6)是86％的三酰基脂蛋白，LOMP26是21％的三酰基，LPD是26％的三酰基，LPF是62％的三酰基，LP6φNLOMP26是21％的三酰基，LPDφNLPF是46％的三酰基。LOMP26φNLP6没有显示三酰基刺激，所有非脂化蛋白没有显示刺激(阴性对照)。
还评估了用于表达融合蛋白的信号序列的类型，以确定作为信号序列的结果，蛋白上酰化的类型或水平是否存在任何差异。信号序列用于制备构建体并在HEK-BLUETMhTLR2-TLR1细胞中测试。在相同条件下培养和纯化不同的构建体。在所有构建体中，信号序列在C残基处被切割并且脂质部分被连接。使用不同信号的序列：天然P6信号序列SS1：MNKFVKSLLVAGSVAALAAC…(SEQ ID NO:36)；Pal蛋白的大肠杆菌天然信号序列SS2：MQLNKVLKGLMIALPVMAIAAC…(SEQ ID NO:37)；P4蛋白的流感嗜血杆菌信号序列，SSP4：MKTTLKMTALAALSAFVLAGC…(SEQ ID NO:38)。
图5中的数据显示信号序列影响三酰脂化的量。使用P4信号序列的构建体具有与使用P6天然信号序列的构建体大致相同的三酰基脂化水平。
实施例13-脂化蛋白的表征
为了表征蛋白质脂化，对LOMP26、LP6和融合蛋白LOMP26P6进行质谱分析法。进行具有全扫描的DDA运行(与具有新梯度的实施例3中的先前运行相同，将前10个MS1前体进一步分段)以及对所选择的三棕榈前体m/zs的PRM(平行反应监测)分析。读出检测到三酰化修饰、半胱氨酸上的二酰基甘油修饰和半胱氨酸N-末端上的棕榈酰修饰。
二酰基和三酰基脂化部分可存在于质谱分析中的不同峰中，其表示脂质尾部碳长度和键数目(1或环)的变化。表中给出的各种组合物显示了名称修饰T1或D1、修饰TA或DA等的分析。
三酰基 修饰 二酰基 修饰
T1 C16:0、C16:0、C16:1 D1 C16:0、C16:1
T2 C16:0、C16:0、C17:环 D2 C16:0、C17:环
T3 C16:0、C16:0、C18:1 D3 C16:0、C18:1
TA C16:0、C14:0、C16:1 DA C14:0、C16:1
TA’ C16:0、C16:1、C16:1 DA’ C16:1、C16:1
TB C16:0、C15:0、C16:1 DB C15:0、C16:1
TB’ C16:0、C14:0、C16:0 DB’ C14:0、C16:0
TC C16:0、C16:1、C18:1 DC C16:1、C18:1
TD C16:0、C18:1、C18:1 DD C18:1，C18:1
TE C16:0、C16:0、C19:环 DE C16:0，C19:环
接下来，测试用于培养产生脂化蛋白的细胞的培养基是否影响脂化的类型和量。细胞在2XYT-肉汤与基本培养基(M9)中生长，并测量脂化水平。2XYT肉汤含有与普通LB培养基一样多的2X酵母提取物的培养基。M9基本培养基含有基本盐制剂和氮源(参见例如ThermoFisher Scientific目录)。当使用2XYT肉汤时观察到低脂化产率，而使用基本培养基(M9)时，二酰基和三酰基脂蛋白的产率提高。使用1％ Triton和1％两性离子洗涤剂从膜中提取脂化蛋白，并通过Ni柱色谱法纯化，并通过SDS-PAGE以及蛋白质印迹进行表征以进行确认。在2XYT和M9培养基中生长的L-OMP26的质谱比较表明，脂蛋白峰的高度和大小与特定二酰基或三酰基脂蛋白的量相关。
结果表明，与2XYT相比，当L-OMP26在基本培养基(M9)中生长时，存在显著更多的二酰基和/或三酰基产物。另外，基本培养基生长的L-OMP26显示出三酰化，而2XYT生长的L-OMP26不产生三酰化产物。与2XYT培养基相比，对于在基本培养基中生长的二酰基峰观察到更高的PSM。[PSM是肽谱匹配，其是指理论谱(基于蛋白质序列在计算机中产生)与来自样品的实际谱之间有多少匹配。匹配越多表明靶肽的丰度越高]。
实施例14-Hi融合蛋白在接种小鼠中的保护作用
使用两种Hi感染模型来评价脂化蛋白疫苗对动物感染和定殖的影响。在第一模型(模型A)中，用不同的脂化Hi蛋白构建体免疫小鼠D0、D7和D21。在3剂量的疫苗后，在第35天，如NTHi急性中耳炎(AOM)的标准模型(Michel等人，J Med Microbiol，2018年，第67卷，第10期，第1527-1532页)中所述，用PR8流感病毒感染小鼠，并且在一周后，用给予每个鼻孔的10μl的NTHi菌株575或86-028NP鼻内攻击小鼠(菌株575已被表征用于靶蛋白表面表达和测序的全基因组)。感染后三天，收集耳灌洗液、耳水疱、鼻洗液(NW)和血液。NW和中耳样品中的NTHi细菌的测量通过在巧克力板上铺板来枚举。
在第二种动物模型(模型B)中，在D0、D7和D21上用不同的脂化Hi蛋白构建体免疫小鼠。在第35天，在3剂量的疫苗后，给予NTHi接种以建立定殖，然后施用flu X31流感病毒(103ED50)。与以前使用的菌株相比，已知流感的菌株X31诱导更温和的感染。NTHi接种(106cfu/小鼠)和流感接种之间的时间为6小时。感染后五天，收集耳灌洗液、耳水疱、鼻洗液(NW)和血液。
分析脂化蛋白的免疫原性(模型B)。使用矾氢氧化物作为佐剂。每组N＝6只小鼠。腹膜内(IP)施用疫苗。在免疫期间考虑摩尔量，并且对于IP注射，每只小鼠施用10μg融合蛋白，7μg PD和3μg蛋白P6。结果示于图6中。
当施用与脂化P6融合的非脂化蛋白D时，观察到蛋白D应答的反式作用。反式作用是指当与疫苗中的脂化蛋白融合时，疫苗构建体的非脂化组分的增强的免疫原性。在3剂量之后，与具有矾的NL-PD相比，在没有矾的情况下对于融合中的PD测量抗体增加超过10倍。
观察到3剂量比2剂量增加了免疫原性。另外，融合可减少诱导的脂化蛋白抗体应答。例如，对于融合，与单独施用L-P6蛋白时相比，观察到P6抗体减少2倍。/>
另外，在存在或不存在矾的情况下测试脂化融合构建体的蛋白D免疫原性，并且未测量到抗体水平的差异。对于P6抗体，有/没有矾的 融合和L-P6疫苗在2剂量和3剂量后没有显示差异。
在另一个实验中，施用包含LOMP26的融合，给予10μg蛋白质剂量/小鼠图6C中列出的蛋白质。经由腹膜内(IP)注射，使用矾氢氧化物作为佐剂，每组N＝4只小鼠。图6C示出与当蛋白质由矾氢氧化物构成时相比，当在没有矾的情况下给予脂化蛋白时，融合产生针对OMP26的抗体的显著增加。与之前的结果一致，与2个剂量相比，3个剂量的疫苗增加了抗体水平。此外，矾降低OMP26抗体水平，但对P6抗体水平没有不利影响。
在用有或没有凝胶多糖佐剂的情况下用OMP26或P6(10只μg蛋白质剂量/小鼠)免疫小鼠(N＝3-4只小鼠/组)。结果示于图7中。用融合蛋白鼻内(IN)免疫诱导显著的抗体应答，其中3剂量的疫苗使抗体水平增加超过2剂量。当使用佐剂时，脂化蛋白构建体的IN免疫也有改善。
分析关于免疫原性的脂化水平。图8A示出二酰基部分与三酰基脂质部分相比产生更多抗体。与二酰基-LOMP26相比，主要含有三酰基部分的L-OMP26显示出较少的抗体应答。L-OMP26的二酰化和三酰化状态通过基于显示10倍高的三脂化的峰比率的质谱法来确认(图中的黑条)。
还分析了免疫原性标记。在无矾第1剂量、第2剂量和第3剂量的L-OMP26免疫后，在炎症标记物IL-8、IL-6、IL-17或TNF-a方面没有测量到差异，比较三酰基占优势的组合物与二酰基占优势的组合物，这与两种构建体的非常低的反应原性一致。分析了CLL5细胞因子(其是炎症的替代标志物)，并且观察到在第2剂量和第3剂量下在接种后24小时在CCL5中没有显著差异(图8B)。
研究了在鼻内免疫后接种对定殖的影响。如在模型B中，用具有或不具有凝胶多糖佐剂的接种小鼠。结果如图9A所示，显示了用融合蛋白鼻内免疫防止耳感染。/>融合提供针对NTHi耳感染的显著保护(图9B)。然而，组合物中的矾氢氧化物似乎降低了对耳感染的保护作用。
在模型B免疫中使用附加融合蛋白构建体：NLOMP26+NLP6、LOMP26NLP6、LP6NLOMP26和LP6+LOMP26。与跟含矾氢氧化物的非脂化OMP26组合的非脂化P6相比，与不含矾的脂化OMP26和与非脂化OMP26融合的脂化P6组合的脂化P6防止鼻咽定殖，如鼻灌洗液和耳水疱定殖水平所证实的。与跟含矾氢氧化物的非脂化OMP26组合的非脂化P6相比，与不含明矾的脂化LOMP26组合的脂化LP6防止耳感染(图10A)。
L-PDφNL-PF融合显示在IN免疫后防止NTHi定殖的保护作用(图11A、图11B)。Balbc小鼠(n＝4/组)用14-02-575(NTHi的内部临床菌株)攻击，每剂量使用10μg蛋白质并且给予3剂量。在定殖模型中，攻击后12小时在耳中可检测到CFU，并且用融合LPDφPF观察到定殖水平的显著差异。
还测试了肌内免疫。对于经由IM免疫(10μg/剂量)的L-PDφNL-OMP26融合，在耳感染和鼻咽定植中观察到保护作用(图12A、图12B)。分别施用L-PD和NL-OMP26没有显示出保护作用。在单独的实验中，在模型B中使用Hi蛋白的不同组合，10μg/剂量，共3剂量(n＝5-6只小鼠/组)。图12C和图12D示出了通过IM免疫施用的L-PDφNL-OMP26融合蛋白(10μg蛋白质/剂量)防止鼻咽定植和耳感染。
对于本领域的技术人员来说，如在上述说明性实施例中所阐述的本发明的许多修改和变化是预期会发生的。因此，本发明应受到所附权利要求中所出现的限制。
序列表
<110> 罗切斯特综合医院
<120> 流感嗜血杆菌疫苗和使用方法
<130> 33253/55894/PCT
<150> US 63/076,461
<151> 2020-09-10
<160> 45
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 552
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 1
atggaggaaa agatcgcgtt cattaacgcg ggttacatct ttcaacatca cccggaccgt 60
caagcggtgg cggacaaact ggatgcggag ttcaagccgg ttgcggaaaa actggcggcg 120
agcaagaaag aggtggacga taagattgcg gcggcgcgta agaaagtgga ggcgaaggtt 180
gcggcgctgg aaaaagacgc gccgcgtctg cgtcaggcgg atatccagaa gcgtcaagag 240
gaaattaaca aactgggtgc ggcggaggac gcggaactgc aaaaactgat gcaggagcaa 300
gataagaaag ttcaggagtt ccaggcgcaa aacgaaaagc gtcaagcgga ggaacgtggc 360
aaactgctga acagcatcca gaccgcgacc aacaacctgg cgaaggcgaa aggttacacc 420
tatgttctgg acgcgaacag cgtggttttt gcggtggaag gcaaggatat caccgaggaa 480
gttctgaaga gcattccggc gagcgagaaa gtgcaagaaa agaaactcga gcaccaccac 540
caccaccact ga 552
<210> 2
<211> 184
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 2
Met Glu Glu Lys Ile Ala Phe Ile Asn Ala Gly Tyr Ile Phe Gln His
1 5 10 15
His Pro Asp Arg Gln Ala Val Ala Asp Lys Leu Asp Ala Glu Phe Lys
20 25 30
Pro Val Ala Glu Lys Leu Ala Ala Ser Lys Lys Glu Val Asp Asp Lys
35 40 45
Ile Ala Ala Ala Arg Lys Lys Val Glu Ala Lys Val Ala Ala Leu Glu
50 55 60
Lys Asp Ala Pro Arg Leu Arg Gln Ala Asp Ile Gln Lys Arg Gln Glu
65 70 75 80
Glu Ile Asn Lys Leu Gly Ala Ala Glu Asp Ala Glu Leu Gln Lys Leu
85 90 95
Met Gln Glu Gln Asp Lys Lys Val Gln Glu Phe Gln Ala Gln Asn Glu
100 105 110
Lys Arg Gln Ala Glu Glu Arg Gly Lys Leu Leu Asn Ser Ile Gln Thr
115 120 125
Ala Thr Asn Asn Leu Ala Lys Ala Lys Gly Tyr Thr Tyr Val Leu Asp
130 135 140
Ala Asn Ser Val Val Phe Ala Val Glu Gly Lys Asp Ile Thr Glu Glu
145 150 155 160
Val Leu Lys Ser Ile Pro Ala Ser Glu Lys Val Gln Glu Lys Lys Lys
165 170 175
Leu Glu His His His His His His
180
<210> 3
<211> 429
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 3
atgagcagca gcaacaacga tgcggcgggt aacggtgcgg cgcagacctt tggtggctac 60
agcgtggcgg atctgcagca acgttacaac accgtttact tcggtttcga caagtacgat 120
atcaccggcg aatatgtgca aattctggac gcgcacgcgg cgtatctgaa cgcgaccccg 180
gcggcgaagg tgctggttga gggtaacacc gatgaacgtg gcaccccgga gtacaacatt 240
gcgctgggtc agcgtcgtgc ggatgcggtt aagggctatc tggcgggtaa aggcgtggat 300
gcgggcaagc tgggcaccgt tagctacggc gaggaaaaac cggcggtgct gggtcatgat 360
gaggcggcgt acagcaagaa ccgtcgtgcg gttctggcgt atctcgagca ccaccaccac 420
caccactga 429
<210> 4
<211> 143
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 4
Met Ser Ser Ser Asn Asn Asp Ala Ala Gly Asn Gly Ala Ala Gln Thr
1 5 10 15
Phe Gly Gly Tyr Ser Val Ala Asp Leu Gln Gln Arg Tyr Asn Thr Val
20 25 30
Tyr Phe Gly Phe Asp Lys Tyr Asp Ile Thr Gly Glu Tyr Val Gln Ile
35 40 45
Leu Asp Ala His Ala Ala Tyr Leu Asn Ala Thr Pro Ala Ala Lys Val
50 55 60
Leu Val Glu Gly Asn Thr Asp Glu Arg Gly Thr Pro Glu Tyr Asn Ile
65 70 75 80
Ala Leu Gly Gln Arg Arg Ala Asp Ala Val Lys Gly Tyr Leu Ala Gly
85 90 95
Lys Gly Val Asp Ala Gly Lys Leu Gly Thr Val Ser Tyr Gly Glu Glu
100 105 110
Lys Pro Ala Val Leu Gly His Asp Glu Ala Ala Tyr Ser Lys Asn Arg
115 120 125
Arg Ala Val Leu Ala Tyr Lys Leu Glu His His His His His His
130 135 140
<210> 5
<211> 783
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 5
atgggtagcc accaaatgaa gagcgagggt cacgcgaaca tgcaactgca gcaacaggcg 60
gtgctgggtc tgaactggat gcaagacagc ggcgagtaca aagcgctggc gtaccaggcg 120
tataacgcgg cgaaggtggc gttcgatcac gcgaaagttg cgaagggcaa gaaaaaggcg 180
gtggttgcgg acctggatga aaccatgctg gacaacagcc cgtatgcggg ttggcaagtg 240
cagaacaaca aaccgtttga cggcaaggat tggacccgtt gggttgatgc gcgtcaaagc 300
cgtgcggtgc cgggtgcggt tgagttcaac aactacgtga acagccacaa cggcaaagtg 360
ttttatgtta ccaaccgtaa agacagcacc gaaaagagcg gcaccatcga cgatatgaag 420
cgtctgggtt tcaacggcgt tgaggaaagc gcgttttacc tgaaaaagga caaaagcgcg 480
aaggcggcgc gttttgcgga gatcgaaaaa caaggttacg agattgtgct gtatgttggc 540
gataacctgg acgatttcgg taacaccgtg tatggcaagc tgaacgcgga ccgtcgtgcg 600
tttgttgatc aaaaccaggg taaattcggc aagaccttta ttatgctgcc gcaggcgaac 660
tatggtggct gggagggtgg cctggcggaa ggttatttta aaaaggatac ccaaggccag 720
atcaaagcgc gcctggacgc ggttcaagcg tgggacggca agcatcatca ccatcatcac 780
taa 783
<210> 6
<211> 280
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 6
Met Lys Thr Thr Leu Lys Met Thr Ala Leu Ala Ala Leu Ser Ala Phe
1 5 10 15
Val Leu Ala Gly Cys Gly Ser His Gln Met Lys Ser Glu Gly His Ala
20 25 30
Asn Met Gln Leu Gln Gln Gln Ala Val Leu Gly Leu Asn Trp Met Gln
35 40 45
Asp Ser Gly Glu Tyr Lys Ala Leu Ala Tyr Gln Ala Tyr Asn Ala Ala
50 55 60
Lys Val Ala Phe Asp His Ala Lys Val Ala Lys Gly Lys Lys Lys Ala
65 70 75 80
Val Val Ala Asp Leu Asp Glu Thr Met Leu Asp Asn Ser Pro Tyr Ala
85 90 95
Gly Trp Gln Val Gln Asn Asn Lys Pro Phe Asp Gly Lys Asp Trp Thr
100 105 110
Arg Trp Val Asp Ala Arg Gln Ser Arg Ala Val Pro Gly Ala Val Glu
115 120 125
Phe Asn Asn Tyr Val Asn Ser His Asn Gly Lys Val Phe Tyr Val Thr
130 135 140
Asn Arg Lys Asp Ser Thr Glu Lys Ser Gly Thr Ile Asp Asp Met Lys
145 150 155 160
Arg Leu Gly Phe Asn Gly Val Glu Glu Ser Ala Phe Tyr Leu Lys Lys
165 170 175
Asp Lys Ser Ala Lys Ala Ala Arg Phe Ala Glu Ile Glu Lys Gln Gly
180 185 190
Tyr Glu Ile Val Leu Tyr Val Gly Asp Asn Leu Asp Asp Phe Gly Asn
195 200 205
Thr Val Tyr Gly Lys Leu Asn Ala Asp Arg Arg Ala Phe Val Asp Gln
210 215 220
Asn Gln Gly Lys Phe Gly Lys Thr Phe Ile Met Leu Pro Gln Ala Asn
225 230 235 240
Tyr Gly Gly Trp Glu Gly Gly Leu Ala Glu Gly Tyr Phe Lys Lys Asp
245 250 255
Thr Gln Gly Gln Ile Lys Ala Arg Leu Asp Ala Val Gln Ala Trp Asp
260 265 270
Gly Lys His His His His His His
275 280
<210> 7
<211> 1065
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 7
atgagcagcc acagcagcaa catggcgaac acccagatga agagcgataa aatcattatt 60
gcgcaccgtg gcgcgagcgg ttacctgccg gagcacaccc tggaaagcaa agcgctggcg 120
tttgcgcagc acgcggatta tctggagcaa gacctggcga tgaccaaaga cggccgtctg 180
gtggttattc acgaccactt cctggatggt ctgaccgacg tggcgaagaa atttccgcac 240
cgtcaccgta aggatggccg ttactatgtt attgacttca ccctgaaaga aatccaaagc 300
ctggaaatga ccgagaactt tgaaaccaag gatggtaaac aggcgcaagt gtacccgaac 360
cgtttcccgc tgtggaagag ccacttccgt attcacacct ttgaggacga aattgagttt 420
atccagggcc tggagaagag caccggcaag aaagttggta tttatccgga aatcaaagcg 480
ccgtggttcc accaccaaaa cggcaaggac atcgcggcgg agaccctgaa agtgctgaag 540
aaatacggtt atgataagaa aaccgacatg gtttacctgc agaccttcga ttttaacgag 600
ctgaagcgta ttaaaaccga actgctgccg cagatgggta tggacctgaa gctggtgcaa 660
ctgatcgcgt acaccgattg gaaagagacc caagaaaagg acccgaaagg ctattgggtt 720
aactacaact atgattggat gtttaagccg ggtgcgatgg cggaagtggt taaatacgcg 780
gacggtgtgg gcccgggttg gtatatgctg gttaacaaag aggagagcaa accggataac 840
attgtgtaca ccccgctggt taaggagctg gcgcagtaca acgtggaact gcacccgtat 900
accgttcgta aagacgcgct gccggagttc tttaccgatg tgaaccaaat gtatgacacc 960
ctgctgaaca aaagcggcgc gaccggtgtg ttcaccgact ttccggatac cggcgttgaa 1020
tttctgaagg gtatcaaact cgagcaccac caccaccacc actga 1065
<210> 8
<211> 354
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 8
Met Ser Ser His Ser Ser Asn Met Ala Asn Thr Gln Met Lys Ser Asp
1 5 10 15
Lys Ile Ile Ile Ala His Arg Gly Ala Ser Gly Tyr Leu Pro Glu His
20 25 30
Thr Leu Glu Ser Lys Ala Leu Ala Phe Ala Gln His Ala Asp Tyr Leu
35 40 45
Glu Gln Asp Leu Ala Met Thr Lys Asp Gly Arg Leu Val Val Ile His
50 55 60
Asp His Phe Leu Asp Gly Leu Thr Asp Val Ala Lys Lys Phe Pro His
65 70 75 80
Arg His Arg Lys Asp Gly Arg Tyr Tyr Val Ile Asp Phe Thr Leu Lys
85 90 95
Glu Ile Gln Ser Leu Glu Met Thr Glu Asn Phe Glu Thr Lys Asp Gly
100 105 110
Lys Gln Ala Gln Val Tyr Pro Asn Arg Phe Pro Leu Trp Lys Ser His
115 120 125
Phe Arg Ile His Thr Phe Glu Asp Glu Ile Glu Phe Ile Gln Gly Leu
130 135 140
Glu Lys Ser Thr Gly Lys Lys Val Gly Ile Tyr Pro Glu Ile Lys Ala
145 150 155 160
Pro Trp Phe His His Gln Asn Gly Lys Asp Ile Ala Ala Glu Thr Leu
165 170 175
Lys Val Leu Lys Lys Tyr Gly Tyr Asp Lys Lys Thr Asp Met Val Tyr
180 185 190
Leu Gln Thr Phe Asp Phe Asn Glu Leu Lys Arg Ile Lys Thr Glu Leu
195 200 205
Leu Pro Gln Met Gly Met Asp Leu Lys Leu Val Gln Leu Ile Ala Tyr
210 215 220
Thr Asp Trp Lys Glu Thr Gln Glu Lys Asp Pro Lys Gly Tyr Trp Val
225 230 235 240
Asn Tyr Asn Tyr Asp Trp Met Phe Lys Pro Gly Ala Met Ala Glu Val
245 250 255
Val Lys Tyr Ala Asp Gly Val Gly Pro Gly Trp Tyr Met Leu Val Asn
260 265 270
Lys Glu Glu Ser Lys Pro Asp Asn Ile Val Tyr Thr Pro Leu Val Lys
275 280 285
Glu Leu Ala Gln Tyr Asn Val Glu Leu His Pro Tyr Thr Val Arg Lys
290 295 300
Asp Ala Leu Pro Glu Phe Phe Thr Asp Val Asn Gln Met Tyr Asp Thr
305 310 315 320
Leu Leu Asn Lys Ser Gly Ala Thr Gly Val Phe Thr Asp Phe Pro Asp
325 330 335
Thr Gly Val Glu Phe Leu Lys Gly Ile Lys Leu Glu His His His His
340 345 350
His His
<210> 9
<211> 849
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 9
agcagcggca agttcaaagt ggttaccacc tttaccgtga tccaggacat tgcgcaaaac 60
gttgcgggtg atgcggcgac cgtggagagc atcaccaagc cgggtgcgga aattcacgag 120
tacgaaccga ccccgaagga catcgttaaa gcgcagagcg cggatctgat tctgtggaac 180
ggtctgaacc tggagcgttg gtttgaacgt ttctttcaga acgtgaagga caaaccggcg 240
gtggttgtga ccgagggtat ccaaccgctg agcatttacg aaggcccgta taaagatgcg 300
ccgaacccgc acgcgtggat gagcccgagc aacgcgctga tctacattga gaacatcaag 360
aacgcgctgg ttaaatatga cccgcagaac gcggcggtgt acgagaagaa cgcggcggac 420
tatgcgcaga agatcaaaca actggatgaa ccgctgcgtg cgaaactggc gcagattccg 480
gaggcgcaac gttggctggt taccagcgaa ggcgcgttca gctacctggc gaaggactat 540
aacctgaaag agggttacct gtggccgatc aacgcggaac agcaaggcac cccgcagcaa 600
gttcgtaagg tgatcgatct ggttcgtaaa aacaacattc cggttgtgtt tagcgagagc 660
accattagcg cgaagccggc gcagcaagtg gcgaaggaaa gcggtgcgaa atacggtggc 720
gttctgtatg tggacagcct gagcgcgaaa aacggcccgg ttccgaccta tatcgatctg 780
ctgaacgtta ccgtgagcac cattgtgaag ggtttcggca aactcgagca ccaccaccac 840
caccactga 849
<210> 10
<211> 282
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 10
Ser Ser Gly Lys Phe Lys Val Val Thr Thr Phe Thr Val Ile Gln Asp
1 5 10 15
Ile Ala Gln Asn Val Ala Gly Asp Ala Ala Thr Val Glu Ser Ile Thr
20 25 30
Lys Pro Gly Ala Glu Ile His Glu Tyr Glu Pro Thr Pro Lys Asp Ile
35 40 45
Val Lys Ala Gln Ser Ala Asp Leu Ile Leu Trp Asn Gly Leu Asn Leu
50 55 60
Glu Arg Trp Phe Glu Arg Phe Phe Gln Asn Val Lys Asp Lys Pro Ala
65 70 75 80
Val Val Val Thr Glu Gly Ile Gln Pro Leu Ser Ile Tyr Glu Gly Pro
85 90 95
Tyr Lys Asp Ala Pro Asn Pro His Ala Trp Met Ser Pro Ser Asn Ala
100 105 110
Leu Ile Tyr Ile Glu Asn Ile Lys Asn Ala Leu Val Lys Tyr Asp Pro
115 120 125
Gln Asn Ala Ala Val Tyr Glu Lys Asn Ala Ala Asp Tyr Ala Gln Lys
130 135 140
Ile Lys Gln Leu Asp Glu Pro Leu Arg Ala Lys Leu Ala Gln Ile Pro
145 150 155 160
Glu Ala Gln Arg Trp Leu Val Thr Ser Glu Gly Ala Phe Ser Tyr Leu
165 170 175
Ala Lys Asp Tyr Asn Leu Lys Glu Gly Tyr Leu Trp Pro Ile Asn Ala
180 185 190
Glu Gln Gln Gly Thr Pro Gln Gln Val Arg Lys Val Ile Asp Leu Val
195 200 205
Arg Lys Asn Asn Ile Pro Val Val Phe Ser Glu Ser Thr Ile Ser Ala
210 215 220
Lys Pro Ala Gln Gln Val Ala Lys Glu Ser Gly Ala Lys Tyr Gly Gly
225 230 235 240
Val Leu Tyr Val Asp Ser Leu Ser Ala Lys Asn Gly Pro Val Pro Thr
245 250 255
Tyr Ile Asp Leu Leu Asn Val Thr Val Ser Thr Ile Val Lys Gly Phe
260 265 270
Gly Lys Leu Glu His His His His His His
275 280
<210> 11
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 11
Met Lys Thr Thr Leu Lys Met Thr Ala Leu Ala Ala Leu Ser Ala Phe
1 5 10 15
Val Leu Ala Gly
20
<210> 12
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 12
Gly Ser Gly Gly Gly Gly
1 5
<210> 13
<211> 621
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 13
atgaagacca ccctgaaaat gaccgcgctg gcggcgctga gcgcgttcgt tctggcgggt 60
tgcagcagcg gcgaggaaaa gatcgcgttc attaacgcgg gttacatctt tcaacatcac 120
ccggaccgtc aagcggtggc ggacaaactg gatgcggagt ttaagccggt tgcggaaaaa 180
ctggcggcga gcaagaaaga ggtggacgat aagattgcgg cggcgcgtaa gaaagtggag 240
gcgaaggttg cggcgctgga aaaagacgcg ccgcgtctgc gtcaggcgga tatccagaag 300
cgtcaagagg aaattaacaa actgggtgcg gcggaggacg cggaactgca aaaactgatg 360
caggagcaag ataagaaagt gcaggagttc caggcgcaaa acgaaaagcg tcaagcggag 420
gaacgtggca aactgctgaa cagcatccag accgcgacca acaacctggc gaaggcgaaa 480
ggttacacct atgttctgga cgcgaacagc gtggtttttg cggtggaagg caaggatatc 540
accgaggaag ttctgaagag cattccggcg agcgagaaag tgcaagaaaa gaaactcgag 600
caccaccacc accaccactg a 621
<210> 14
<211> 206
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 14
Met Lys Thr Thr Leu Lys Met Thr Ala Leu Ala Ala Leu Ser Ala Phe
1 5 10 15
Val Leu Ala Gly Cys Ser Ser Gly Glu Glu Lys Ile Ala Phe Ile Asn
20 25 30
Ala Gly Tyr Ile Phe Gln His His Pro Asp Arg Gln Ala Val Ala Asp
35 40 45
Lys Leu Asp Ala Glu Phe Lys Pro Val Ala Glu Lys Leu Ala Ala Ser
50 55 60
Lys Lys Glu Val Asp Asp Lys Ile Ala Ala Ala Arg Lys Lys Val Glu
65 70 75 80
Ala Lys Val Ala Ala Leu Glu Lys Asp Ala Pro Arg Leu Arg Gln Ala
85 90 95
Asp Ile Gln Lys Arg Gln Glu Glu Ile Asn Lys Leu Gly Ala Ala Glu
100 105 110
Asp Ala Glu Leu Gln Lys Leu Met Gln Glu Gln Asp Lys Lys Val Gln
115 120 125
Glu Phe Gln Ala Gln Asn Glu Lys Arg Gln Ala Glu Glu Arg Gly Lys
130 135 140
Leu Leu Asn Ser Ile Gln Thr Ala Thr Asn Asn Leu Ala Lys Ala Lys
145 150 155 160
Gly Tyr Thr Tyr Val Leu Asp Ala Asn Ser Val Val Phe Ala Val Glu
165 170 175
Gly Lys Asp Ile Thr Glu Glu Val Leu Lys Ser Ile Pro Ala Ser Glu
180 185 190
Lys Val Gln Glu Lys Lys Leu Glu His His His His His His
195 200 205
<210> 15
<211> 489
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 15
atgaagacca ccctgaaaat gaccgcgctg gcggcgctga gcgcgtttgt gctggcgggt 60
tgcagcagca gcaacaacga tgcggcgggt aacggtgcgg cgcagacctt tggtggctac 120
agcgtggcgg atctgcagca acgttacaac accgtttact tcggtttcga caagtacgat 180
atcaccggcg aatatgtgca aattctggac gcgcacgcgg cgtatctgaa cgcgaccccg 240
gcggcgaagg tgctggttga gggtaacacc gatgaacgtg gcaccccgga gtacaacatt 300
gcgctgggtc agcgtcgtgc ggatgcggtt aagggctatc tggcgggtaa aggcgtggat 360
gcgggcaagc tgggcaccgt tagctacggc gaggaaaaac cggcggtgct gggtcatgat 420
gaggcggcgt acagcaagaa ccgtcgtgcg gttctggcgt atctcgagca ccaccaccac 480
caccactga 489
<210> 16
<211> 162
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 16
Met Lys Thr Thr Leu Lys Met Thr Ala Leu Ala Ala Leu Ser Ala Phe
1 5 10 15
Val Leu Ala Gly Cys Ser Ser Ser Asn Asn Asp Ala Ala Gly Asn Gly
20 25 30
Ala Ala Gln Thr Phe Gly Gly Tyr Ser Val Ala Asp Leu Gln Gln Arg
35 40 45
Tyr Asn Thr Val Tyr Phe Gly Phe Asp Lys Tyr Asp Ile Thr Gly Glu
50 55 60
Tyr Val Gln Ile Leu Asp Ala His Ala Ala Tyr Leu Asn Ala Thr Pro
65 70 75 80
Ala Ala Lys Val Leu Val Glu Gly Asn Thr Asp Glu Arg Gly Thr Pro
85 90 95
Glu Tyr Asn Ile Ala Leu Gly Gln Arg Arg Ala Asp Ala Val Lys Gly
100 105 110
Tyr Leu Ala Gly Lys Gly Val Asp Ala Gly Lys Leu Gly Thr Val Ser
115 120 125
Tyr Gly Glu Glu Lys Pro Ala Val Leu Gly His Asp Glu Ala Ala Tyr
130 135 140
Ser Lys Asn Arg Arg Ala Val Leu Ala Tyr Leu Glu His His His His
145 150 155 160
His His
<210> 17
<211> 1125
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 17
atgaagacca ccctgaaaat gaccgcgctg gcggcgctga gcgcgtttgt gctggcgggt 60
tgcagcagcc acagcagcaa catggcgaac acccagatga agagcgataa aatcattatt 120
gcgcaccgtg gcgcgagcgg ttacctgccg gagcacaccc tggaaagcaa agcgctggcg 180
tttgcgcagc acgcggatta tctggagcaa gacctggcga tgaccaaaga cggccgtctg 240
gtggttattc acgaccactt cctggatggt ctgaccgacg tggcgaagaa atttccgcac 300
cgtcaccgta aggatggccg ttactatgtt attgacttca ccctgaaaga aatccaaagc 360
ctggaaatga ccgagaactt tgaaaccaag gatggtaaac aggcgcaagt gtacccgaac 420
cgtttcccgc tgtggaagag ccacttccgt attcacacct ttgaggacga aattgagttt 480
atccagggcc tggagaagag caccggcaag aaagttggta tttatccgga aatcaaagcg 540
ccgtggttcc accaccaaaa cggcaaggac atcgcggcgg agaccctgaa agtgctgaag 600
aaatacggtt atgataagaa aaccgacatg gtttacctgc agaccttcga ttttaacgag 660
ctgaagcgta ttaaaaccga actgctgccg cagatgggta tggacctgaa gctggtgcaa 720
ctgatcgcgt acaccgattg gaaagagacc caagaaaagg acccgaaagg ctattgggtt 780
aactacaact atgattggat gtttaagccg ggtgcgatgg cggaagtggt taaatacgcg 840
gacggtgtgg gcccgggttg gtatatgctg gttaacaaag aggagagcaa accggataac 900
attgtgtaca ccccgctggt taaggagctg gcgcagtaca acgtggaact gcacccgtat 960
accgttcgta aagacgcgct gccggagttc tttaccgatg ttaaccaaat gtatgacacc 1020
ctgctgaaca aaagcggcgc gaccggtgtg ttcaccgact ttccggatac cggcgttgaa 1080
ttcctgaagg gtatcaaact cgagcaccac caccaccacc actga 1125
<210> 18
<211> 374
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 18
Met Lys Thr Thr Leu Lys Met Thr Ala Leu Ala Ala Leu Ser Ala Phe
1 5 10 15
Val Leu Ala Gly Cys Ser Ser His Ser Ser Asn Met Ala Asn Thr Gln
20 25 30
Met Lys Ser Asp Lys Ile Ile Ile Ala His Arg Gly Ala Ser Gly Tyr
35 40 45
Leu Pro Glu His Thr Leu Glu Ser Lys Ala Leu Ala Phe Ala Gln His
50 55 60
Ala Asp Tyr Leu Glu Gln Asp Leu Ala Met Thr Lys Asp Gly Arg Leu
65 70 75 80
Val Val Ile His Asp His Phe Leu Asp Gly Leu Thr Asp Val Ala Lys
85 90 95
Lys Phe Pro His Arg His Arg Lys Asp Gly Arg Tyr Tyr Val Ile Asp
100 105 110
Phe Thr Leu Lys Glu Ile Gln Ser Leu Glu Met Thr Glu Asn Phe Glu
115 120 125
Thr Lys Asp Gly Lys Gln Ala Gln Val Tyr Pro Asn Arg Phe Pro Leu
130 135 140
Trp Lys Ser His Phe Arg Ile His Thr Phe Glu Asp Glu Ile Glu Phe
145 150 155 160
Ile Gln Gly Leu Glu Lys Ser Thr Gly Lys Lys Val Gly Ile Tyr Pro
165 170 175
Glu Ile Lys Ala Pro Trp Phe His His Gln Asn Gly Lys Asp Ile Ala
180 185 190
Ala Glu Thr Leu Lys Val Leu Lys Lys Tyr Gly Tyr Asp Lys Lys Thr
195 200 205
Asp Met Val Tyr Leu Gln Thr Phe Asp Phe Asn Glu Leu Lys Arg Ile
210 215 220
Lys Thr Glu Leu Leu Pro Gln Met Gly Met Asp Leu Lys Leu Val Gln
225 230 235 240
Leu Ile Ala Tyr Thr Asp Trp Lys Glu Thr Gln Glu Lys Asp Pro Lys
245 250 255
Gly Tyr Trp Val Asn Tyr Asn Tyr Asp Trp Met Phe Lys Pro Gly Ala
260 265 270
Met Ala Glu Val Val Lys Tyr Ala Asp Gly Val Gly Pro Gly Trp Tyr
275 280 285
Met Leu Val Asn Lys Glu Glu Ser Lys Pro Asp Asn Ile Val Tyr Thr
290 295 300
Pro Leu Val Lys Glu Leu Ala Gln Tyr Asn Val Glu Leu His Pro Tyr
305 310 315 320
Thr Val Arg Lys Asp Ala Leu Pro Glu Phe Phe Thr Asp Val Asn Gln
325 330 335
Met Tyr Asp Thr Leu Leu Asn Lys Ser Gly Ala Thr Gly Val Phe Thr
340 345 350
Asp Phe Pro Asp Thr Gly Val Glu Phe Leu Lys Gly Ile Lys Leu Glu
355 360 365
His His His His His His
370
<210> 19
<211> 843
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 19
atgaagacca ccctgaaaat gaccgcgctg gcggcgctga gcgcgttcgt tctggcgggt 60
tgcggtagcc accaaatgaa gagcgagggt cacgcgaaca tgcaactgca gcaacaggcg 120
gtgctgggtc tgaactggat gcaagacagc ggcgagtaca aagcgctggc gtaccaggcg 180
tataacgcgg cgaaggtggc gttcgatcac gcgaaagttg cgaagggcaa gaaaaaggcg 240
gtggttgcgg acctggatga aaccatgctg gacaacagcc cgtatgcggg ttggcaagtg 300
cagaacaaca aaccgtttga cggcaaggat tggacccgtt gggttgatgc gcgtcaaagc 360
cgtgcggtgc cgggtgcggt tgagttcaac aactacgtga acagccacaa cggcaaagtg 420
ttttatgtta ccaaccgtaa agacagcacc gaaaagagcg gcaccatcga cgatatgaag 480
cgtctgggtt tcaacggcgt tgaggaaagc gcgttttacc tgaaaaagga caaaagcgcg 540
aaggcggcgc gttttgcgga gatcgaaaaa caaggttacg agattgtgct gtatgttggc 600
gataacctgg acgatttcgg taacaccgtg tatggcaagc tgaacgcgga ccgtcgtgcg 660
tttgttgatc aaaaccaggg taaattcggc aagaccttta ttatgctgcc gcaggcgaac 720
tatggtggct gggagggtgg cctggcggaa ggttatttta aaaaggatac ccaaggccag 780
atcaaagcgc gcctggacgc ggttcaagcg tgggacggca agcatcatca ccatcatcac 840
taa 843
<210> 20
<211> 280
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 20
Met Lys Thr Thr Leu Lys Met Thr Ala Leu Ala Ala Leu Ser Ala Phe
1 5 10 15
Val Leu Ala Gly Cys Gly Ser His Gln Met Lys Ser Glu Gly His Ala
20 25 30
Asn Met Gln Leu Gln Gln Gln Ala Val Leu Gly Leu Asn Trp Met Gln
35 40 45
Asp Ser Gly Glu Tyr Lys Ala Leu Ala Tyr Gln Ala Tyr Asn Ala Ala
50 55 60
Lys Val Ala Phe Asp His Ala Lys Val Ala Lys Gly Lys Lys Lys Ala
65 70 75 80
Val Val Ala Asp Leu Asp Glu Thr Met Leu Asp Asn Ser Pro Tyr Ala
85 90 95
Gly Trp Gln Val Gln Asn Asn Lys Pro Phe Asp Gly Lys Asp Trp Thr
100 105 110
Arg Trp Val Asp Ala Arg Gln Ser Arg Ala Val Pro Gly Ala Val Glu
115 120 125
Phe Asn Asn Tyr Val Asn Ser His Asn Gly Lys Val Phe Tyr Val Thr
130 135 140
Asn Arg Lys Asp Ser Thr Glu Lys Ser Gly Thr Ile Asp Asp Met Lys
145 150 155 160
Arg Leu Gly Phe Asn Gly Val Glu Glu Ser Ala Phe Tyr Leu Lys Lys
165 170 175
Asp Lys Ser Ala Lys Ala Ala Arg Phe Ala Glu Ile Glu Lys Gln Gly
180 185 190
Tyr Glu Ile Val Leu Tyr Val Gly Asp Asn Leu Asp Asp Phe Gly Asn
195 200 205
Thr Val Tyr Gly Lys Leu Asn Ala Asp Arg Arg Ala Phe Val Asp Gln
210 215 220
Asn Gln Gly Lys Phe Gly Lys Thr Phe Ile Met Leu Pro Gln Ala Asn
225 230 235 240
Tyr Gly Gly Trp Glu Gly Gly Leu Ala Glu Gly Tyr Phe Lys Lys Asp
245 250 255
Thr Gln Gly Gln Ile Lys Ala Arg Leu Asp Ala Val Gln Ala Trp Asp
260 265 270
Gly Lys His His His His His His
275 280
<210> 21
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 21
gatatacata tgaagaccac cctgaaaatg 30
<210> 22
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 22
ctatatctcg agtttctttt cttgcact 28
<210> 23
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 23
gatatacata tggaggaaaa gatcgcgttc 30
<210> 24
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 24
ctatatctcg agatacgcca gaaccgca 28
<210> 25
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 25
gatatacata tgagcagcag caacaacgat g 31
<210> 26
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 26
ctatatctcg agtttgatac ccttcagaa 29
<210> 27
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 27
gatatacata tgagcagcca cagcagcaac 30
<210> 28
<211> 1029
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 28
atgaagacca ccctgaaaat gaccgcgctg gcggcgctga gcgcgtttgt gctggcgggt 60
tgcagcagca gcaacaacga tgcggcgggt aacggtgcgg cgcagacctt tggtggctac 120
agcgtggcgg atctgcagca acgttacaac accgtttact tcggtttcga caagtacgat 180
atcaccggcg aatatgtgca aattctggac gcgcacgcgg cgtatctgaa cgcgaccccg 240
gcggcgaagg tgctggttga gggtaacacc gatgaacgtg gcaccccgga gtacaacatt 300
gcgctgggtc agcgtcgtgc ggatgcggtt aagggctatc tggcgggtaa aggcgtggat 360
gcgggcaagc tgggcaccgt tagctacggc gaggaaaaac cggcggtgct gggtcatgat 420
gaggcggcgt acagcaagaa ccgtcgtgcg gttctggcgt atggtagtgg cggcggggga 480
gaggaaaaga tcgcgttcat taacgcgggt tacatctttc aacatcaccc ggaccgtcaa 540
gcggtggcgg acaaactgga tgcggagttt aagccggttg cggaaaaact ggcggcgagc 600
aagaaagagg tggacgataa gattgcggcg gcgcgtaaga aagtggaggc gaaggttgcg 660
gcgctggaaa aagacgcgcc gcgtctgcgt caggcggata tccagaagcg tcaagaggaa 720
attaacaaac tgggtgcggc ggaggacgcg gaactgcaaa aactgatgca ggagcaagat 780
aagaaagtgc aggagttcca ggcgcaaaac gaaaagcgtc aagcggagga acgtggcaaa 840
ctgctgaaca gcatccagac cgcgaccaac aacctggcga aggcgaaagg ttacacctat 900
gttctggacg cgaacagcgt ggtttttgcg gtggaaggca aggatatcac cgaggaagtt 960
ctgaagagca ttccggcgag cgagaaagtg caagaaaaga aactcgagca ccaccaccac 1020
caccactga 1029
<210> 29
<211> 342
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 29
Met Lys Thr Thr Leu Lys Met Thr Ala Leu Ala Ala Leu Ser Ala Phe
1 5 10 15
Val Leu Ala Gly Cys Ser Ser Ser Asn Asn Asp Ala Ala Gly Asn Gly
20 25 30
Ala Ala Gln Thr Phe Gly Gly Tyr Ser Val Ala Asp Leu Gln Gln Arg
35 40 45
Tyr Asn Thr Val Tyr Phe Gly Phe Asp Lys Tyr Asp Ile Thr Gly Glu
50 55 60
Tyr Val Gln Ile Leu Asp Ala His Ala Ala Tyr Leu Asn Ala Thr Pro
65 70 75 80
Ala Ala Lys Val Leu Val Glu Gly Asn Thr Asp Glu Arg Gly Thr Pro
85 90 95
Glu Tyr Asn Ile Ala Leu Gly Gln Arg Arg Ala Asp Ala Val Lys Gly
100 105 110
Tyr Leu Ala Gly Lys Gly Val Asp Ala Gly Lys Leu Gly Thr Val Ser
115 120 125
Tyr Gly Glu Glu Lys Pro Ala Val Leu Gly His Asp Glu Ala Ala Tyr
130 135 140
Ser Lys Asn Arg Arg Ala Val Leu Ala Tyr Gly Ser Gly Gly Gly Gly
145 150 155 160
Glu Glu Lys Ile Ala Phe Ile Asn Ala Gly Tyr Ile Phe Gln His His
165 170 175
Pro Asp Arg Gln Ala Val Ala Asp Lys Leu Asp Ala Glu Phe Lys Pro
180 185 190
Val Ala Glu Lys Leu Ala Ala Ser Lys Lys Glu Val Asp Asp Lys Ile
195 200 205
Ala Ala Ala Arg Lys Lys Val Glu Ala Lys Val Ala Ala Leu Glu Lys
210 215 220
Asp Ala Pro Arg Leu Arg Gln Ala Asp Ile Gln Lys Arg Gln Glu Glu
225 230 235 240
Ile Asn Lys Leu Gly Ala Ala Glu Asp Ala Glu Leu Gln Lys Leu Met
245 250 255
Gln Glu Gln Asp Lys Lys Val Gln Glu Phe Gln Ala Gln Asn Glu Lys
260 265 270
Arg Gln Ala Glu Glu Arg Gly Lys Leu Leu Asn Ser Ile Gln Thr Ala
275 280 285
Thr Asn Asn Leu Ala Lys Ala Lys Gly Tyr Thr Tyr Val Leu Asp Ala
290 295 300
Asn Ser Val Val Phe Ala Val Glu Gly Lys Asp Ile Thr Glu Glu Val
305 310 315 320
Leu Lys Ser Ile Pro Ala Ser Glu Lys Val Gln Glu Lys Lys Leu Glu
325 330 335
His His His His His His
340
<210> 30
<211> 1038
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 30
atgaagacca ccctgaaaat gaccgcgctg gcggcgctga gcgcgttcgt tctggcgggt 60
tgcagcagcg gcgaggaaaa gatcgcgttc attaacgcgg gttacatctt tcaacatcac 120
ccggaccgtc aagcggtggc ggacaaactg gatgcggagt ttaagccggt tgcggaaaaa 180
ctggcggcga gcaagaaaga ggtggacgat aagattgcgg cggcgcgtaa gaaagtggag 240
gcgaaggttg cggcgctgga aaaagacgcg ccgcgtctgc gtcaggcgga tatccagaag 300
cgtcaagagg aaattaacaa actgggtgcg gcggaggacg cggaactgca aaaactgatg 360
caggagcaag ataagaaagt gcaggagttc caggcgcaaa acgaaaagcg tcaagcggag 420
gaacgtggca aactgctgaa cagcatccag accgcgacca acaacctggc gaaggcgaaa 480
ggttacacct atgttctgga cgcgaacagc gtggtttttg cggtggaagg caaggatatc 540
accgaggaag ttctgaagag cattccggcg agcgagaaag tgcaagaaaa gaaaggtagt 600
ggcggcgggg gaagcagcag caacaacgat gcggcgggta acggtgcggc gcagaccttt 660
ggtggctaca gcgtggcgga tctgcagcaa cgttacaaca ccgtttactt cggtttcgac 720
aagtacgata tcaccggcga atatgtgcaa attctggacg cgcacgcggc gtatctgaac 780
gcgaccccgg cggcgaaggt gctggttgag ggtaacaccg atgaacgtgg caccccggag 840
tacaacattg cgctgggtca gcgtcgtgcg gatgcggtta agggctatct ggcgggtaaa 900
ggcgtggatg cgggcaagct gggcaccgtt agctacggcg aggaaaaacc ggcggtgctg 960
ggtcatgatg aggcggcgta cagcaagaac cgtcgtgcgg ttctggcgta tctcgagcac 1020
caccaccacc accactga 1038
<210> 31
<211> 345
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 31
Met Lys Thr Thr Leu Lys Met Thr Ala Leu Ala Ala Leu Ser Ala Phe
1 5 10 15
Val Leu Ala Gly Cys Ser Ser Gly Glu Glu Lys Ile Ala Phe Ile Asn
20 25 30
Ala Gly Tyr Ile Phe Gln His His Pro Asp Arg Gln Ala Val Ala Asp
35 40 45
Lys Leu Asp Ala Glu Phe Lys Pro Val Ala Glu Lys Leu Ala Ala Ser
50 55 60
Lys Lys Glu Val Asp Asp Lys Ile Ala Ala Ala Arg Lys Lys Val Glu
65 70 75 80
Ala Lys Val Ala Ala Leu Glu Lys Asp Ala Pro Arg Leu Arg Gln Ala
85 90 95
Asp Ile Gln Lys Arg Gln Glu Glu Ile Asn Lys Leu Gly Ala Ala Glu
100 105 110
Asp Ala Glu Leu Gln Lys Leu Met Gln Glu Gln Asp Lys Lys Val Gln
115 120 125
Glu Phe Gln Ala Gln Asn Glu Lys Arg Gln Ala Glu Glu Arg Gly Lys
130 135 140
Leu Leu Asn Ser Ile Gln Thr Ala Thr Asn Asn Leu Ala Lys Ala Lys
145 150 155 160
Gly Tyr Thr Tyr Val Leu Asp Ala Asn Ser Val Val Phe Ala Val Glu
165 170 175
Gly Lys Asp Ile Thr Glu Glu Val Leu Lys Ser Ile Pro Ala Ser Glu
180 185 190
Lys Val Gln Glu Lys Lys Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Ser Asn
195 200 205
Asn Asp Ala Ala Gly Asn Gly Ala Ala Gln Thr Phe Gly Gly Tyr Ser
210 215 220
Val Ala Asp Leu Gln Gln Arg Tyr Asn Thr Val Tyr Phe Gly Phe Asp
225 230 235 240
Lys Tyr Asp Ile Thr Gly Glu Tyr Val Gln Ile Leu Asp Ala His Ala
245 250 255
Ala Tyr Leu Asn Ala Thr Pro Ala Ala Lys Val Leu Val Glu Gly Asn
260 265 270
Thr Asp Glu Arg Gly Thr Pro Glu Tyr Asn Ile Ala Leu Gly Gln Arg
275 280 285
Arg Ala Asp Ala Val Lys Gly Tyr Leu Ala Gly Lys Gly Val Asp Ala
290 295 300
Gly Lys Leu Gly Thr Val Ser Tyr Gly Glu Glu Lys Pro Ala Val Leu
305 310 315 320
Gly His Asp Glu Ala Ala Tyr Ser Lys Asn Arg Arg Ala Val Leu Ala
325 330 335
Tyr Leu Glu His His His His His His
340 345
<210> 32
<211> 969
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 32
atgagcagca gcaacaacga tgcggcgggt aacggtgcgg cgcagacctt tggtggctac 60
agcgtggcgg atctgcagca acgttacaac accgtttact tcggtttcga caagtacgat 120
atcaccggcg aatatgtgca aattctggac gcgcacgcgg cgtatctgaa cgcgaccccg 180
gcggcgaagg tgctggttga gggtaacacc gatgaacgtg gcaccccgga gtacaacatt 240
gcgctgggtc agcgtcgtgc ggatgcggtt aagggctatc tggcgggtaa aggcgtggat 300
gcgggcaagc tgggcaccgt tagctacggc gaggaaaaac cggcggtgct gggtcatgat 360
gaggcggcgt acagcaagaa ccgtcgtgcg gttctggcgt atggtagtgg cggcggggga 420
gaggaaaaga tcgcgttcat taacgcgggt tacatctttc aacatcaccc ggaccgtcaa 480
gcggtggcgg acaaactgga tgcggagttt aagccggttg cggaaaaact ggcggcgagc 540
aagaaagagg tggacgataa gattgcggcg gcgcgtaaga aagtggaggc gaaggttgcg 600
gcgctggaaa aagacgcgcc gcgtctgcgt caggcggata tccagaagcg tcaagaggaa 660
attaacaaac tgggtgcggc ggaggacgcg gaactgcaaa aactgatgca ggagcaagat 720
aagaaagtgc aggagttcca ggcgcaaaac gaaaagcgtc aagcggagga acgtggcaaa 780
ctgctgaaca gcatccagac cgcgaccaac aacctggcga aggcgaaagg ttacacctat 840
gttctggacg cgaacagcgt ggtttttgcg gtggaaggca aggatatcac cgaggaagtt 900
ctgaagagca ttccggcgag cgagaaagtg caagaaaaga aactcgagca ccaccaccac 960
caccactga 969
<210> 33
<211> 322
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 33
Met Ser Ser Ser Asn Asn Asp Ala Ala Gly Asn Gly Ala Ala Gln Thr
1 5 10 15
Phe Gly Gly Tyr Ser Val Ala Asp Leu Gln Gln Arg Tyr Asn Thr Val
20 25 30
Tyr Phe Gly Phe Asp Lys Tyr Asp Ile Thr Gly Glu Tyr Val Gln Ile
35 40 45
Leu Asp Ala His Ala Ala Tyr Leu Asn Ala Thr Pro Ala Ala Lys Val
50 55 60
Leu Val Glu Gly Asn Thr Asp Glu Arg Gly Thr Pro Glu Tyr Asn Ile
65 70 75 80
Ala Leu Gly Gln Arg Arg Ala Asp Ala Val Lys Gly Tyr Leu Ala Gly
85 90 95
Lys Gly Val Asp Ala Gly Lys Leu Gly Thr Val Ser Tyr Gly Glu Glu
100 105 110
Lys Pro Ala Val Leu Gly His Asp Glu Ala Ala Tyr Ser Lys Asn Arg
115 120 125
Arg Ala Val Leu Ala Tyr Gly Ser Gly Gly Gly Gly Glu Glu Lys Ile
130 135 140
Ala Phe Ile Asn Ala Gly Tyr Ile Phe Gln His His Pro Asp Arg Gln
145 150 155 160
Ala Val Ala Asp Lys Leu Asp Ala Glu Phe Lys Pro Val Ala Glu Lys
165 170 175
Leu Ala Ala Ser Lys Lys Glu Val Asp Asp Lys Ile Ala Ala Ala Arg
180 185 190
Lys Lys Val Glu Ala Lys Val Ala Ala Leu Glu Lys Asp Ala Pro Arg
195 200 205
Leu Arg Gln Ala Asp Ile Gln Lys Arg Gln Glu Glu Ile Asn Lys Leu
210 215 220
Gly Ala Ala Glu Asp Ala Glu Leu Gln Lys Leu Met Gln Glu Gln Asp
225 230 235 240
Lys Lys Val Gln Glu Phe Gln Ala Gln Asn Glu Lys Arg Gln Ala Glu
245 250 255
Glu Arg Gly Lys Leu Leu Asn Ser Ile Gln Thr Ala Thr Asn Asn Leu
260 265 270
Ala Lys Ala Lys Gly Tyr Thr Tyr Val Leu Asp Ala Asn Ser Val Val
275 280 285
Phe Ala Val Glu Gly Lys Asp Ile Thr Glu Glu Val Leu Lys Ser Ile
290 295 300
Pro Ala Ser Glu Lys Val Gln Glu Lys Lys Leu Glu His His His His
305 310 315 320
His His
<210> 34
<211> 969
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 34
atggaggaaa agatcgcgtt cattaacgcg ggttacatct ttcaacatca cccggaccgt 60
caagcggtgg cggacaaact ggatgcggag tttaagccgg ttgcggaaaa actggcggcg 120
agcaagaaag aggtggacga taagattgcg gcggcgcgta agaaagtgga ggcgaaggtt 180
gcggcgctgg aaaaagacgc gccgcgtctg cgtcaggcgg atatccagaa gcgtcaagag 240
gaaattaaca aactgggtgc ggcggaggac gcggaactgc aaaaactgat gcaggagcaa 300
gataagaaag tgcaggagtt ccaggcgcaa aacgaaaagc gtcaagcgga ggaacgtggc 360
aaactgctga acagcatcca gaccgcgacc aacaacctgg cgaaggcgaa aggttacacc 420
tatgttctgg acgcgaacag cgtggttttt gcggtggaag gcaaggatat caccgaggaa 480
gttctgaaga gcattccggc gagcgagaaa gtgcaagaaa agaaaggtag tggcggcggg 540
ggaagcagca gcaacaacga tgcggcgggt aacggtgcgg cgcagacctt tggtggctac 600
agcgtggcgg atctgcagca acgttacaac accgtttact tcggtttcga caagtacgat 660
atcaccggcg aatatgtgca aattctggac gcgcacgcgg cgtatctgaa cgcgaccccg 720
gcggcgaagg tgctggttga gggtaacacc gatgaacgtg gcaccccgga gtacaacatt 780
gcgctgggtc agcgtcgtgc ggatgcggtt aagggctatc tggcgggtaa aggcgtggat 840
gcgggcaagc tgggcaccgt tagctacggc gaggaaaaac cggcggtgct gggtcatgat 900
gaggcggcgt acagcaagaa ccgtcgtgcg gttctggcgt atctcgagca ccaccaccac 960
caccactga 969
<210> 35
<211> 322
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 35
Met Glu Glu Lys Ile Ala Phe Ile Asn Ala Gly Tyr Ile Phe Gln His
1 5 10 15
His Pro Asp Arg Gln Ala Val Ala Asp Lys Leu Asp Ala Glu Phe Lys
20 25 30
Pro Val Ala Glu Lys Leu Ala Ala Ser Lys Lys Glu Val Asp Asp Lys
35 40 45
Ile Ala Ala Ala Arg Lys Lys Val Glu Ala Lys Val Ala Ala Leu Glu
50 55 60
Lys Asp Ala Pro Arg Leu Arg Gln Ala Asp Ile Gln Lys Arg Gln Glu
65 70 75 80
Glu Ile Asn Lys Leu Gly Ala Ala Glu Asp Ala Glu Leu Gln Lys Leu
85 90 95
Met Gln Glu Gln Asp Lys Lys Val Gln Glu Phe Gln Ala Gln Asn Glu
100 105 110
Lys Arg Gln Ala Glu Glu Arg Gly Lys Leu Leu Asn Ser Ile Gln Thr
115 120 125
Ala Thr Asn Asn Leu Ala Lys Ala Lys Gly Tyr Thr Tyr Val Leu Asp
130 135 140
Ala Asn Ser Val Val Phe Ala Val Glu Gly Lys Asp Ile Thr Glu Glu
145 150 155 160
Val Leu Lys Ser Ile Pro Ala Ser Glu Lys Val Gln Glu Lys Lys Gly
165 170 175
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Ser Asn Asn Asp Ala Ala Gly Asn Gly
180 185 190
Ala Ala Gln Thr Phe Gly Gly Tyr Ser Val Ala Asp Leu Gln Gln Arg
195 200 205
Tyr Asn Thr Val Tyr Phe Gly Phe Asp Lys Tyr Asp Ile Thr Gly Glu
210 215 220
Tyr Val Gln Ile Leu Asp Ala His Ala Ala Tyr Leu Asn Ala Thr Pro
225 230 235 240
Ala Ala Lys Val Leu Val Glu Gly Asn Thr Asp Glu Arg Gly Thr Pro
245 250 255
Glu Tyr Asn Ile Ala Leu Gly Gln Arg Arg Ala Asp Ala Val Lys Gly
260 265 270
Tyr Leu Ala Gly Lys Gly Val Asp Ala Gly Lys Leu Gly Thr Val Ser
275 280 285
Tyr Gly Glu Glu Lys Pro Ala Val Leu Gly His Asp Glu Ala Ala Tyr
290 295 300
Ser Lys Asn Arg Arg Ala Val Leu Ala Tyr Leu Glu His His His His
305 310 315 320
His His
<210> 36
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 36
Met Asn Lys Phe Val Lys Ser Leu Leu Val Ala Gly Ser Val Ala Ala
1 5 10 15
Leu Ala Ala Cys
20
<210> 37
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 37
Met Gln Leu Asn Lys Val Leu Lys Gly Leu Met Ile Ala Leu Pro Val
1 5 10 15
Met Ala Ile Ala Ala Cys
20
<210> 38
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 38
Met Lys Thr Thr Leu Lys Met Thr Ala Leu Ala Ala Leu Ser Ala Phe
1 5 10 15
Val Leu Ala Gly Cys
20
<210> 39
<211> 505
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 39
Met Lys Thr Thr Leu Lys Met Thr Ala Leu Ala Ala Leu Ser Ala Phe
1 5 10 15
Val Leu Ala Gly Cys Ser Ser Ser Asn Asn Asp Ala Ala Gly Asn Gly
20 25 30
Ala Ala Gln Thr Phe Gly Gly Tyr Ser Val Ala Asp Leu Gln Gln Arg
35 40 45
Tyr Asn Thr Val Tyr Phe Gly Phe Asp Lys Tyr Asp Ile Thr Gly Glu
50 55 60
Tyr Val Gln Ile Leu Asp Ala His Ala Ala Tyr Leu Asn Ala Thr Pro
65 70 75 80
Ala Ala Lys Val Leu Val Glu Gly Asn Thr Asp Glu Arg Gly Thr Pro
85 90 95
Glu Tyr Asn Ile Ala Leu Gly Gln Arg Arg Ala Asp Ala Val Lys Gly
100 105 110
Tyr Leu Ala Gly Lys Gly Val Asp Ala Gly Lys Leu Gly Thr Val Ser
115 120 125
Tyr Gly Glu Glu Lys Pro Ala Val Leu Gly His Asp Glu Ala Ala Tyr
130 135 140
Ser Lys Asn Arg Arg Ala Val Leu Ala Tyr Gly Ser Gly Gly Gly Gly
145 150 155 160
Ser Ser His Ser Ser Asn Met Ala Asn Thr Gln Met Lys Ser Asp Lys
165 170 175
Ile Ile Ile Ala His Arg Gly Ala Ser Gly Tyr Leu Pro Glu His Thr
180 185 190
Leu Glu Ser Lys Ala Leu Ala Phe Ala Gln His Ala Asp Tyr Leu Glu
195 200 205
Gln Asp Leu Ala Met Thr Lys Asp Gly Arg Leu Val Val Ile His Asp
210 215 220
His Phe Leu Asp Gly Leu Thr Asp Val Ala Lys Lys Phe Pro His Arg
225 230 235 240
His Arg Lys Asp Gly Arg Tyr Tyr Val Ile Asp Phe Thr Leu Lys Glu
245 250 255
Ile Gln Ser Leu Glu Met Thr Glu Asn Phe Glu Thr Lys Asp Gly Lys
260 265 270
Gln Ala Gln Val Tyr Pro Asn Arg Phe Pro Leu Trp Lys Ser His Phe
275 280 285
Arg Ile His Thr Phe Glu Asp Glu Ile Glu Phe Ile Gln Gly Leu Glu
290 295 300
Lys Ser Thr Gly Lys Lys Val Gly Ile Tyr Pro Glu Ile Lys Ala Pro
305 310 315 320
Trp Phe His His Gln Asn Gly Lys Asp Ile Ala Ala Glu Thr Leu Lys
325 330 335
Val Leu Lys Lys Tyr Gly Tyr Asp Lys Lys Thr Asp Met Val Tyr Leu
340 345 350
Gln Thr Phe Asp Phe Asn Glu Leu Lys Arg Ile Lys Thr Glu Leu Leu
355 360 365
Pro Gln Met Gly Met Asp Leu Lys Leu Val Gln Leu Ile Ala Tyr Thr
370 375 380
Asp Trp Lys Glu Thr Gln Glu Lys Asp Pro Lys Gly Tyr Trp Val Asn
385 390 395 400
Tyr Asn Tyr Asp Trp Met Phe Lys Pro Gly Ala Met Ala Glu Val Val
405 410 415
Lys Tyr Ala Asp Gly Val Gly Pro Gly Trp Tyr Met Leu Val Asn Lys
420 425 430
Glu Glu Ser Lys Pro Asp Asn Ile Val Tyr Thr Pro Leu Val Lys Glu
435 440 445
Leu Ala Gln Tyr Asn Val Glu Leu His Pro Tyr Thr Val Arg Lys Asp
450 455 460
Ala Leu Pro Glu Phe Phe Thr Asp Val Asn Gln Met Tyr Asp Thr Leu
465 470 475 480
Leu Asn Lys Ser Gly Ala Thr Gly Val Phe Thr Asp Phe Pro Asp Thr
485 490 495
Gly Val Glu Phe Leu Lys Gly Ile Lys
500 505
<210> 40
<211> 642
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 40
Met Lys Thr Thr Leu Lys Met Thr Ala Leu Ala Ala Leu Ser Ala Phe
1 5 10 15
Val Leu Ala Gly Cys Ser Ser His Ser Ser Asn Met Ala Asn Thr Gln
20 25 30
Met Lys Ser Asp Lys Ile Ile Ile Ala His Arg Gly Ala Ser Gly Tyr
35 40 45
Leu Pro Glu His Thr Leu Glu Ser Lys Ala Leu Ala Phe Ala Gln His
50 55 60
Ala Asp Tyr Leu Glu Gln Asp Leu Ala Met Thr Lys Asp Gly Arg Leu
65 70 75 80
Val Val Ile His Asp His Phe Leu Asp Gly Leu Thr Asp Val Ala Lys
85 90 95
Lys Phe Pro His Arg His Arg Lys Asp Gly Arg Tyr Tyr Val Ile Asp
100 105 110
Phe Thr Leu Lys Glu Ile Gln Ser Leu Glu Met Thr Glu Asn Phe Glu
115 120 125
Thr Lys Asp Gly Lys Gln Ala Gln Val Tyr Pro Asn Arg Phe Pro Leu
130 135 140
Trp Lys Ser His Phe Arg Ile His Thr Phe Glu Asp Glu Ile Glu Phe
145 150 155 160
Ile Gln Gly Leu Glu Lys Ser Thr Gly Lys Lys Val Gly Ile Tyr Pro
165 170 175
Glu Ile Lys Ala Pro Trp Phe His His Gln Asn Gly Lys Asp Ile Ala
180 185 190
Ala Glu Thr Leu Lys Val Leu Lys Lys Tyr Gly Tyr Asp Lys Lys Thr
195 200 205
Asp Met Val Tyr Leu Gln Thr Phe Asp Phe Asn Glu Leu Lys Arg Ile
210 215 220
Lys Thr Glu Leu Leu Pro Gln Met Gly Met Asp Leu Lys Leu Val Gln
225 230 235 240
Leu Ile Ala Tyr Thr Asp Trp Lys Glu Thr Gln Glu Lys Asp Pro Lys
245 250 255
Gly Tyr Trp Val Asn Tyr Asn Tyr Asp Trp Met Phe Lys Pro Gly Ala
260 265 270
Met Ala Glu Val Val Lys Tyr Ala Asp Gly Val Gly Pro Gly Trp Tyr
275 280 285
Met Leu Val Asn Lys Glu Glu Ser Lys Pro Asp Asn Ile Val Tyr Thr
290 295 300
Pro Leu Val Lys Glu Leu Ala Gln Tyr Asn Val Glu Leu His Pro Tyr
305 310 315 320
Thr Val Arg Lys Asp Ala Leu Pro Glu Phe Phe Thr Asp Val Asn Gln
325 330 335
Met Tyr Asp Thr Leu Leu Asn Lys Ser Gly Ala Thr Gly Val Phe Thr
340 345 350
Asp Phe Pro Asp Thr Gly Val Glu Phe Leu Lys Gly Ile Lys Gly Ser
355 360 365
Gly Gly Gly Gly Lys Phe Lys Val Val Thr Thr Phe Thr Val Ile Gln
370 375 380
Asp Ile Ala Gln Asn Val Ala Gly Asp Ala Ala Thr Val Glu Ser Ile
385 390 395 400
Lys Pro Gly Ala Glu Ile His Glu Tyr Glu Pro Thr Pro Lys Asp Ile
405 410 415
Val Lys Ala Gln Ser Ala Asp Leu Ile Leu Trp Asn Gly Leu Asn Leu
420 425 430
Glu Arg Trp Phe Glu Arg Phe Phe Gln Asn Val Lys Asp Lys Pro Ala
435 440 445
Val Val Val Thr Glu Gly Ile Gln Pro Leu Ser Ile Tyr Glu Gly Pro
450 455 460
Tyr Lys Asp Ala Pro Asn Pro His Ala Trp Met Ser Pro Ser Asn Ala
465 470 475 480
Leu Ile Tyr Ile Glu Asn Ile Lys Asn Ala Leu Val Lys Tyr Asp Pro
485 490 495
Gln Asn Ala Ala Val Tyr Glu Lys Asn Ala Ala Asp Tyr Ala Gln Lys
500 505 510
Ile Lys Gln Leu Asp Glu Pro Leu Arg Ala Lys Leu Ala Gln Ile Pro
515 520 525
Glu Ala Gln Arg Trp Leu Val Thr Ser Glu Gly Ala Phe Ser Tyr Leu
530 535 540
Ala Lys Asp Tyr Asn Leu Lys Glu Gly Tyr Leu Trp Pro Ile Asn Ala
545 550 555 560
Glu Gln Gln Gly Thr Pro Gln Gln Val Arg Lys Val Ile Asp Leu Val
565 570 575
Arg Lys Asn Asn Ile Pro Val Val Phe Ser Glu Ser Thr Ile Ser Ala
580 585 590
Lys Pro Ala Gln Gln Val Ala Lys Glu Ser Gly Ala Lys Tyr Gly Gly
595 600 605
Val Leu Tyr Val Asp Ser Leu Ser Ala Lys Asn Gly Pro Val Pro Thr
610 615 620
Tyr Ile Asp Leu Leu Asn Val Thr Val Ser Thr Ile Val Lys Gly Phe
625 630 635 640
Gly Lys
<210> 41
<211> 505
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 41
Met Lys Thr Thr Leu Lys Met Thr Ala Leu Ala Ala Leu Ser Ala Phe
1 5 10 15
Val Leu Ala Gly Cys Ser Ser His Ser Ser Asn Met Ala Asn Thr Gln
20 25 30
Met Lys Ser Asp Lys Ile Ile Ile Ala His Arg Gly Ala Ser Gly Tyr
35 40 45
Leu Pro Glu His Thr Leu Glu Ser Lys Ala Leu Ala Phe Ala Gln His
50 55 60
Ala Asp Tyr Leu Glu Gln Asp Leu Ala Met Thr Lys Asp Gly Arg Leu
65 70 75 80
Val Val Ile His Asp His Phe Leu Asp Gly Leu Thr Asp Val Ala Lys
85 90 95
Lys Phe Pro His Arg His Arg Lys Asp Gly Arg Tyr Tyr Val Ile Asp
100 105 110
Phe Thr Leu Lys Glu Ile Gln Ser Leu Glu Met Thr Glu Asn Phe Glu
115 120 125
Thr Lys Asp Gly Lys Gln Ala Gln Val Tyr Pro Asn Arg Phe Pro Leu
130 135 140
Trp Lys Ser His Phe Arg Ile His Thr Phe Glu Asp Glu Ile Glu Phe
145 150 155 160
Ile Gln Gly Leu Glu Lys Ser Thr Gly Lys Lys Val Gly Ile Tyr Pro
165 170 175
Glu Ile Lys Ala Pro Trp Phe His His Gln Asn Gly Lys Asp Ile Ala
180 185 190
Ala Glu Thr Leu Lys Val Leu Lys Lys Tyr Gly Tyr Asp Lys Lys Thr
195 200 205
Asp Met Val Tyr Leu Gln Thr Phe Asp Phe Asn Glu Leu Lys Arg Ile
210 215 220
Lys Thr Glu Leu Leu Pro Gln Met Gly Met Asp Leu Lys Leu Val Gln
225 230 235 240
Leu Ile Ala Tyr Thr Asp Trp Lys Glu Thr Gln Glu Lys Asp Pro Lys
245 250 255
Gly Tyr Trp Val Asn Tyr Asn Tyr Asp Trp Met Phe Lys Pro Gly Ala
260 265 270
Met Ala Glu Val Val Lys Tyr Ala Asp Gly Val Gly Pro Gly Trp Tyr
275 280 285
Met Leu Val Asn Lys Glu Glu Ser Lys Pro Asp Asn Ile Val Tyr Thr
290 295 300
Pro Leu Val Lys Glu Leu Ala Gln Tyr Asn Val Glu Leu His Pro Tyr
305 310 315 320
Thr Val Arg Lys Asp Ala Leu Pro Glu Phe Phe Thr Asp Val Asn Gln
325 330 335
Met Tyr Asp Thr Leu Leu Asn Lys Ser Gly Ala Thr Gly Val Phe Thr
340 345 350
Asp Phe Pro Asp Thr Gly Val Glu Phe Leu Lys Gly Ile Lys Gly Ser
355 360 365
Gly Gly Gly Gly Ser Ser Ser Asn Asn Asp Ala Ala Gly Asn Gly Ala
370 375 380
Ala Gln Thr Phe Gly Gly Tyr Ser Val Ala Asp Leu Gln Gln Arg Tyr
385 390 395 400
Asn Thr Val Tyr Phe Gly Phe Asp Lys Tyr Asp Ile Thr Gly Glu Tyr
405 410 415
Val Gln Ile Leu Asp Ala His Ala Ala Tyr Leu Asn Ala Thr Pro Ala
420 425 430
Ala Lys Val Leu Val Glu Gly Asn Thr Asp Glu Arg Gly Thr Pro Glu
435 440 445
Tyr Asn Ile Ala Leu Gly Gln Arg Arg Ala Asp Ala Val Lys Gly Tyr
450 455 460
Leu Ala Gly Lys Gly Val Asp Ala Gly Lys Leu Gly Thr Val Ser Tyr
465 470 475 480
Gly Glu Glu Lys Pro Ala Val Leu Gly His Asp Glu Ala Ala Tyr Ser
485 490 495
Lys Asn Arg Arg Ala Val Leu Ala Tyr
500 505
<210> 42
<211> 505
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 42
Met Lys Thr Thr Leu Lys Met Thr Ala Leu Ala Ala Leu Ser Ala Phe
1 5 10 15
Val Leu Ala Gly Cys Ser Ser Ser Asn Asn Asp Ala Ala Gly Asn Gly
20 25 30
Ala Ala Gln Thr Phe Gly Gly Tyr Ser Val Ala Asp Leu Gln Gln Arg
35 40 45
Tyr Asn Thr Val Tyr Phe Gly Phe Asp Lys Tyr Asp Ile Thr Gly Glu
50 55 60
Tyr Val Gln Ile Leu Asp Ala His Ala Ala Tyr Leu Asn Ala Thr Pro
65 70 75 80
Ala Ala Lys Val Leu Val Glu Gly Asn Thr Asp Glu Arg Gly Thr Pro
85 90 95
Glu Tyr Asn Ile Ala Leu Gly Gln Arg Arg Ala Asp Ala Val Lys Gly
100 105 110
Tyr Leu Ala Gly Lys Gly Val Asp Ala Gly Lys Leu Gly Thr Val Ser
115 120 125
Tyr Gly Glu Glu Lys Pro Ala Val Leu Gly His Asp Glu Ala Ala Tyr
130 135 140
Ser Lys Asn Arg Arg Ala Val Leu Ala Tyr Gly Ser Gly Gly Gly Gly
145 150 155 160
Ser Ser His Ser Ser Asn Met Ala Asn Thr Gln Met Lys Ser Asp Lys
165 170 175
Ile Ile Ile Ala His Arg Gly Ala Ser Gly Tyr Leu Pro Glu His Thr
180 185 190
Leu Glu Ser Lys Ala Leu Ala Phe Ala Gln His Ala Asp Tyr Leu Glu
195 200 205
Gln Asp Leu Ala Met Thr Lys Asp Gly Arg Leu Val Val Ile His Asp
210 215 220
His Phe Leu Asp Gly Leu Thr Asp Val Ala Lys Lys Phe Pro His Arg
225 230 235 240
His Arg Lys Asp Gly Arg Tyr Tyr Val Ile Asp Phe Thr Leu Lys Glu
245 250 255
Ile Gln Ser Leu Glu Met Thr Glu Asn Phe Glu Thr Lys Asp Gly Lys
260 265 270
Gln Ala Gln Val Tyr Pro Asn Arg Phe Pro Leu Trp Lys Ser His Phe
275 280 285
Arg Ile His Thr Phe Glu Asp Glu Ile Glu Phe Ile Gln Gly Leu Glu
290 295 300
Lys Ser Thr Gly Lys Lys Val Gly Ile Tyr Pro Glu Ile Lys Ala Pro
305 310 315 320
Trp Phe His His Gln Asn Gly Lys Asp Ile Ala Ala Glu Thr Leu Lys
325 330 335
Val Leu Lys Lys Tyr Gly Tyr Asp Lys Lys Thr Asp Met Val Tyr Leu
340 345 350
Gln Thr Phe Asp Phe Asn Glu Leu Lys Arg Ile Lys Thr Glu Leu Leu
355 360 365
Pro Gln Met Gly Met Asp Leu Lys Leu Val Gln Leu Ile Ala Tyr Thr
370 375 380
Asp Trp Lys Glu Thr Gln Glu Lys Asp Pro Lys Gly Tyr Trp Val Asn
385 390 395 400
Tyr Asn Tyr Asp Trp Met Phe Lys Pro Gly Ala Met Ala Glu Val Val
405 410 415
Lys Tyr Ala Asp Gly Val Gly Pro Gly Trp Tyr Met Leu Val Asn Lys
420 425 430
Glu Glu Ser Lys Pro Asp Asn Ile Val Tyr Thr Pro Leu Val Lys Glu
435 440 445
Leu Ala Gln Tyr Asn Val Glu Leu His Pro Tyr Thr Val Arg Lys Asp
450 455 460
Ala Leu Pro Glu Phe Phe Thr Asp Val Asn Gln Met Tyr Asp Thr Leu
465 470 475 480
Leu Asn Lys Ser Gly Ala Thr Gly Val Phe Thr Asp Phe Pro Asp Thr
485 490 495
Gly Val Glu Phe Leu Lys Gly Ile Lys
500 505
<210> 43
<211> 549
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 43
Met Lys Thr Thr Leu Lys Met Thr Ala Leu Ala Ala Leu Ser Ala Phe
1 5 10 15
Val Leu Ala Gly Cys Ser Ser Gly Glu Glu Lys Ile Ala Phe Ile Asn
20 25 30
Ala Gly Tyr Ile Phe Gln His His Pro Asp Arg Gln Ala Val Ala Asp
35 40 45
Lys Leu Asp Ala Glu Phe Lys Pro Val Ala Glu Lys Leu Ala Ala Ser
50 55 60
Lys Lys Glu Val Asp Asp Lys Ile Ala Ala Ala Arg Lys Lys Val Glu
65 70 75 80
Ala Lys Val Ala Ala Leu Glu Lys Asp Ala Pro Arg Leu Arg Gln Ala
85 90 95
Asp Ile Gln Lys Arg Gln Glu Glu Ile Asn Lys Leu Gly Ala Ala Glu
100 105 110
Asp Ala Glu Leu Gln Lys Leu Met Gln Glu Gln Asp Lys Lys Val Gln
115 120 125
Glu Phe Gln Ala Gln Asn Glu Lys Arg Gln Ala Glu Glu Arg Gly Lys
130 135 140
Leu Leu Asn Ser Ile Gln Thr Ala Thr Asn Asn Leu Ala Lys Ala Lys
145 150 155 160
Gly Tyr Thr Tyr Val Leu Asp Ala Asn Ser Val Val Phe Ala Val Glu
165 170 175
Gly Lys Asp Ile Thr Glu Glu Val Leu Lys Ser Ile Pro Ala Ser Glu
180 185 190
Lys Val Gln Glu Lys Lys Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser His Ser
195 200 205
Ser Asn Met Ala Asn Thr Gln Met Lys Ser Asp Lys Ile Ile Ile Ala
210 215 220
His Arg Gly Ala Ser Gly Tyr Leu Pro Glu His Thr Leu Glu Ser Lys
225 230 235 240
Ala Leu Ala Phe Ala Gln His Ala Asp Tyr Leu Glu Gln Asp Leu Ala
245 250 255
Met Thr Lys Asp Gly Arg Leu Val Val Ile His Asp His Phe Leu Asp
260 265 270
Gly Leu Thr Asp Val Ala Lys Lys Phe Pro His Arg His Arg Lys Asp
275 280 285
Gly Arg Tyr Tyr Val Ile Asp Phe Thr Leu Lys Glu Ile Gln Ser Leu
290 295 300
Glu Met Thr Glu Asn Phe Glu Thr Lys Asp Gly Lys Gln Ala Gln Val
305 310 315 320
Tyr Pro Asn Arg Phe Pro Leu Trp Lys Ser His Phe Arg Ile His Thr
325 330 335
Phe Glu Asp Glu Ile Glu Phe Ile Gln Gly Leu Glu Lys Ser Thr Gly
340 345 350
Lys Lys Val Gly Ile Tyr Pro Glu Ile Lys Ala Pro Trp Phe His His
355 360 365
Gln Asn Gly Lys Asp Ile Ala Ala Glu Thr Leu Lys Val Leu Lys Lys
370 375 380
Tyr Gly Tyr Asp Lys Lys Thr Asp Met Val Tyr Leu Gln Thr Phe Asp
385 390 395 400
Phe Asn Glu Leu Lys Arg Ile Lys Thr Glu Leu Leu Pro Gln Met Gly
405 410 415
Met Asp Leu Lys Leu Val Gln Leu Ile Ala Tyr Thr Asp Trp Lys Glu
420 425 430
Thr Gln Glu Lys Asp Pro Lys Gly Tyr Trp Val Asn Tyr Asn Tyr Asp
435 440 445
Trp Met Phe Lys Pro Gly Ala Met Ala Glu Val Val Lys Tyr Ala Asp
450 455 460
Gly Val Gly Pro Gly Trp Tyr Met Leu Val Asn Lys Glu Glu Ser Lys
465 470 475 480
Pro Asp Asn Ile Val Tyr Thr Pro Leu Val Lys Glu Leu Ala Gln Tyr
485 490 495
Asn Val Glu Leu His Pro Tyr Thr Val Arg Lys Asp Ala Leu Pro Glu
500 505 510
Phe Phe Thr Asp Val Asn Gln Met Tyr Asp Thr Leu Leu Asn Lys Ser
515 520 525
Gly Ala Thr Gly Val Phe Thr Asp Phe Pro Asp Thr Gly Val Glu Phe
530 535 540
Leu Lys Gly Ile Lys
545
<210> 44
<211> 546
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 44
Met Lys Thr Thr Leu Lys Met Thr Ala Leu Ala Ala Leu Ser Ala Phe
1 5 10 15
Val Leu Ala Gly Cys Ser Ser His Ser Ser Asn Met Ala Asn Thr Gln
20 25 30
Met Lys Ser Asp Lys Ile Ile Ile Ala His Arg Gly Ala Ser Gly Tyr
35 40 45
Leu Pro Glu His Thr Leu Glu Ser Lys Ala Leu Ala Phe Ala Gln His
50 55 60
Ala Asp Tyr Leu Glu Gln Asp Leu Ala Met Thr Lys Asp Gly Arg Leu
65 70 75 80
Val Val Ile His Asp His Phe Leu Asp Gly Leu Thr Asp Val Ala Lys
85 90 95
Lys Phe Pro His Arg His Arg Lys Asp Gly Arg Tyr Tyr Val Ile Asp
100 105 110
Phe Thr Leu Lys Glu Ile Gln Ser Leu Glu Met Thr Glu Asn Phe Glu
115 120 125
Thr Lys Asp Gly Lys Gln Ala Gln Val Tyr Pro Asn Arg Phe Pro Leu
130 135 140
Trp Lys Ser His Phe Arg Ile His Thr Phe Glu Asp Glu Ile Glu Phe
145 150 155 160
Ile Gln Gly Leu Glu Lys Ser Thr Gly Lys Lys Val Gly Ile Tyr Pro
165 170 175
Glu Ile Lys Ala Pro Trp Phe His His Gln Asn Gly Lys Asp Ile Ala
180 185 190
Ala Glu Thr Leu Lys Val Leu Lys Lys Tyr Gly Tyr Asp Lys Lys Thr
195 200 205
Asp Met Val Tyr Leu Gln Thr Phe Asp Phe Asn Glu Leu Lys Arg Ile
210 215 220
Lys Thr Glu Leu Leu Pro Gln Met Gly Met Asp Leu Lys Leu Val Gln
225 230 235 240
Leu Ile Ala Tyr Thr Asp Trp Lys Glu Thr Gln Glu Lys Asp Pro Lys
245 250 255
Gly Tyr Trp Val Asn Tyr Asn Tyr Asp Trp Met Phe Lys Pro Gly Ala
260 265 270
Met Ala Glu Val Val Lys Tyr Ala Asp Gly Val Gly Pro Gly Trp Tyr
275 280 285
Met Leu Val Asn Lys Glu Glu Ser Lys Pro Asp Asn Ile Val Tyr Thr
290 295 300
Pro Leu Val Lys Glu Leu Ala Gln Tyr Asn Val Glu Leu His Pro Tyr
305 310 315 320
Thr Val Arg Lys Asp Ala Leu Pro Glu Phe Phe Thr Asp Val Asn Gln
325 330 335
Met Tyr Asp Thr Leu Leu Asn Lys Ser Gly Ala Thr Gly Val Phe Thr
340 345 350
Asp Phe Pro Asp Thr Gly Val Glu Phe Leu Lys Gly Ile Lys Gly Ser
355 360 365
Gly Gly Gly Gly Glu Glu Lys Ile Ala Phe Ile Asn Ala Gly Tyr Ile
370 375 380
Phe Gln His His Pro Asp Arg Gln Ala Val Ala Asp Lys Leu Asp Ala
385 390 395 400
Glu Phe Lys Pro Val Ala Glu Lys Leu Ala Ala Ser Lys Lys Glu Val
405 410 415
Asp Asp Lys Ile Ala Ala Ala Arg Lys Lys Val Glu Ala Lys Val Ala
420 425 430
Ala Leu Glu Lys Asp Ala Pro Arg Leu Arg Gln Ala Asp Ile Gln Lys
435 440 445
Arg Gln Glu Glu Ile Asn Lys Leu Gly Ala Ala Glu Asp Ala Glu Leu
450 455 460
Gln Lys Leu Met Gln Glu Gln Asp Lys Lys Val Gln Glu Phe Gln Ala
465 470 475 480
Gln Asn Glu Lys Arg Gln Ala Glu Glu Arg Gly Lys Leu Leu Asn Ser
485 490 495
Ile Gln Thr Ala Thr Asn Asn Leu Ala Lys Ala Lys Gly Tyr Thr Tyr
500 505 510
Val Leu Asp Ala Asn Ser Val Val Phe Ala Val Glu Gly Lys Asp Ile
515 520 525
Thr Glu Glu Val Leu Lys Ser Ile Pro Ala Ser Glu Lys Val Gln Glu
530 535 540
Lys Lys
545
<210> 45
<211> 433
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 45
Met Lys Thr Thr Leu Lys Met Thr Ala Leu Ala Ala Leu Ser Ala Phe
1 5 10 15
Val Leu Ala Gly Cys Ser Ser Gly Lys Phe Lys Val Val Thr Thr Phe
20 25 30
Thr Val Ile Gln Asp Ile Ala Gln Asn Val Ala Gly Asp Ala Ala Thr
35 40 45
Val Glu Ser Ile Thr Lys Pro Gly Ala Glu Ile His Glu Tyr Glu Pro
50 55 60
Thr Pro Lys Asp Ile Val Lys Ala Gln Ser Ala Asp Leu Ile Leu Trp
65 70 75 80
Asn Gly Leu Asn Leu Glu Arg Trp Phe Glu Arg Phe Phe Gln Asn Val
85 90 95
Lys Asp Lys Pro Ala Val Val Val Thr Glu Gly Ile Gln Pro Leu Ser
100 105 110
Ile Tyr Glu Gly Pro Tyr Lys Asp Ala Pro Asn Pro His Ala Trp Met
115 120 125
Ser Pro Ser Asn Leu Ile Tyr Ile Glu Asn Ile Lys Asn Ala Leu Val
130 135 140
Lys Tyr Asp Pro Gln Asn Ala Ala Val Tyr Glu Lys Asn Ala Ala Asp
145 150 155 160
Tyr Ala Gln Lys Ile Lys Gln Leu Asp Glu Pro Leu Arg Ala Lys Leu
165 170 175
Ala Gln Ile Pro Glu Ala Gln Arg Trp Leu Val Thr Ser Glu Gly Ala
180 185 190
Phe Ser Tyr Leu Ala Lys Asp Tyr Asn Leu Lys Glu Gly Tyr Leu Trp
195 200 205
Pro Ile Asn Ala Glu Gln Gln Gly Thr Pro Gln Gln Val Arg Lys Val
210 215 220
Ile Asp Leu Val Arg Lys Asn Asn Ile Pro Val Val Phe Ser Glu Ser
225 230 235 240
Thr Ile Ser Ala Lys Pro Ala Gln Gln Val Ala Lys Glu Ser Gly Ala
245 250 255
Lys Tyr Gly Gly Val Leu Tyr Val Asp Ser Leu Ser Ala Lys Asn Gly
260 265 270
Pro Val Pro Thr Tyr Ile Asp Leu Leu Asn Val Thr Val Ser Thr Ile
275 280 285
Val Lys Gly Phe Gly Lys Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Ser Asn
290 295 300
Asn Asp Ala Ala Gly Asn Gly Ala Ala Gln Thr Phe Gly Gly Tyr Ser
305 310 315 320
Val Ala Asp Leu Gln Gln Arg Tyr Asn Thr Val Tyr Phe Gly Phe Asp
325 330 335
Lys Tyr Asp Ile Thr Gly Glu Tyr Val Gln Ile Leu Asp Ala His Ala
340 345 350
Ala Tyr Leu Asn Ala Thr Pro Ala Ala Lys Val Leu Val Glu Gly Asn
355 360 365
Thr Asp Glu Arg Gly Thr Pro Glu Tyr Asn Ile Ala Leu Gly Gln Arg
370 375 380
Arg Ala Asp Ala Val Lys Gly Tyr Leu Ala Gly Lys Gly Val Asp Ala
385 390 395 400
Gly Lys Leu Gly Thr Val Ser Tyr Gly Glu Glu Lys Pro Ala Val Leu
405 410 415
Gly His Asp Glu Ala Ala Tyr Ser Lys Asn Arg Arg Ala Val Leu Ala
420 425 430
Tyr

Claims (54)

1.一种包含选自由Omp26、P6、P4、PD和PF组成的组的两种或更多种流感嗜血杆菌(Hi)蛋白的全部或部分的融合蛋白，其中所述Hi蛋白中的至少一种Hi蛋白是脂化的。
2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其包含Omp26和P6，其中所述Omp26蛋白或其片段是脂化的。
3.根据权利要求1所述的融合蛋白，其包含Omp26和P6，其中所述P6蛋白或其片段是脂化的。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的融合蛋白，其中所述至少一种Hi蛋白包含选自C18、C16、C14、C12或C10脂肪酸的脂质部分。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的融合蛋白，其中所述至少一种Hi蛋白包含选自二酰基和/或三酰基脂肪酸的脂质部分。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的融合蛋白，其中所述至少一种Hi蛋白包含选自N-酰化或O-酰化脂肪酸的脂质部分。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白中的两种Hi蛋白是脂化的。
8.根据权利要求1至6中任一项所述的融合蛋白，其包含脂化Omp26和非脂化P6，其中所述脂质包含C16脂肪酸。
9.根据权利要求1至6中任一项所述的融合蛋白，其包含脂化P6和非脂化Omp26，其中所述脂质是C16脂肪酸。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白选自由以下组成的组：(SEQ ID NO:31)、LP6φOmp26(SEQ ID NO:29)、/>(SEQID NO:39)、/> (SEQ ID NO:40)、/>(SEQ ID NO:41)、 (SEQ ID NO:42)、/>(SEQ ID NO:43)、/> (SEQ ID NO:44)或/>(SEQ ID NO:45)。
11.根据权利要求8至10中任一项所述的融合蛋白，其中Omp26包含SEQ ID NO:2中列出的氨基酸序列的全部或部分。
12.根据权利要求8至10中任一项所述的融合蛋白，其中P6包含SEQID NO:4中列出的氨基酸序列的全部或部分。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的融合蛋白，其中所述至少一种Hi蛋白在所述蛋白质的N末端处包含脂质部分。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的融合蛋白，其中所述Hi蛋白通过肽接头连接。
15.根据权利要求14所述的融合蛋白，其中所述肽接头是GlySerGlyGlyGlyGly(SEQ IDNO:12)。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的融合蛋白，其包含SEQ ID NO:29或31中列出的氨基酸序列。
17.根据权利要求1至16中任一项所述的融合蛋白，还包含药学上可接受的载体或赋形剂。
18.一种包含根据权利要求1至17中任一项所述的融合蛋白的疫苗。
19.根据权利要求18所述的疫苗，其中所述疫苗中的所述融合蛋白引发针对脂化Hi蛋白和至少一种非脂化Hi蛋白的抗体应答。
20.根据权利要求18或权利要求19所述的疫苗，其中所述疫苗中至少10％的所述融合蛋白包含二酰基脂肪酸。
21.根据权利要求18至20中任一项所述的疫苗，其中所述疫苗中至少10％的所述融合蛋白包含三酰基脂肪酸。
22.一种包含根据权利要求1至17中任一项所述的融合蛋白的免疫原性组合物。
23.根据权利要求22所述的免疫原性组合物，其中所述免疫原性组合物中至少10％的所述融合蛋白包含二酰基脂肪酸。
24.根据权利要求22或权利要求23所述的免疫原性组合物，其中所述免疫原性组合物中至少10％的所述融合蛋白包含三酰基脂肪酸。
25.一种治疗或预防受试者中与流感嗜血杆菌(Hi)感染相关联的疾病的方法，所述方法包括向所述受试者施用根据权利要求18至20中任一项所述的疫苗或根据权利要求22至24中任一项所述的免疫原性组合物。
26.根据权利要求25所述的方法，其中与Hi感染相关联的所述疾病是中耳炎、支气管炎、肺炎、窦炎、败血病、心内膜炎、会厌炎、脓毒性关节炎、脑膜炎、产后和新生儿感染、产后和新生儿败血症、急性和慢性输卵管炎、会厌、心包炎、蜂窝组织炎、骨髄炎、心内膜炎、胆囊炎、腹内感染、尿路感染、乳突炎、主动脉移植感染、结膜炎、巴西紫癜性热、隐匿性菌血症、以及潜在肺疾病诸如慢性支气管炎、支气管扩张或囊性纤维化的恶化、慢性阻塞性肺疾病(COPD)和COPD的急性恶化(AECOPD)。
27.根据权利要求25或权利要求26所述的方法，其中所述疫苗或所述免疫原性组合物通过口服、静脉内给药、肌内给药、鼻内给药或皮下给药施用。
28.根据权利要求25至27中任一项所述的方法，其中所述疫苗或所述免疫原性组合物减少或防止在窦、肺和耳中的一者或多者中的定殖。
29.根据权利要求25至28中任一项所述的方法，其中所述疫苗或所述免疫原性组合物包含或LP6φOmp26。
30.一种制备包含选自由Omp26、P6、P4、PD和PF组成的组的两种或更多种流感嗜血杆菌(Hi)蛋白的全部或部分的融合蛋白的方法，其中所述Hi蛋白中的至少一种Hi蛋白是脂化的，所述方法包括：
i)将在编码流感嗜血杆菌(Hi)蛋白Omp26、P6、P4、PD或PF的全部或部分的第一核酸的上游的编码脂质部分信号序列区的核酸插入质粒载体中；
ii)将编码流感嗜血杆菌(Hi)蛋白Omp26、P6、P4、PD或PF的全部或部分的第二核酸插入所述质粒载体中；
iii)任选地插入编码选自由Omp26、P6、P4、PD和PF组成的组的一种或多种附加Hi蛋白或其片段的第三或附加核酸序列；
iii)将所述质粒载体转染到能够表达核酸分子的宿主细胞中；以及
iv)纯化由所述质粒表达的所述融合蛋白。
31.一种制备包含选自由Omp26、P6、P4、PD和PF组成的组的两种或更多种流感嗜血杆菌(Hi)蛋白的全部或部分的融合蛋白的方法，其中所述Hi蛋白中的至少一种Hi蛋白是脂化的，所述方法包括：
i)提供编码脂质部分信号序列区的核酸；
ii)提供编码Hi蛋白Omp26、P6、P4、PD或PF的全部或部分的第一核酸；
iii)提供编码Hi蛋白Omp26、P6、P4、PD或PF的全部或部分的第二核酸，其中所述第二核酸编码与i)不同的Hi蛋白；
iv)任选地提供编码选自由Omp26、P6、P4、PD和PF组成的组的一种或多种附加蛋白或其片段的第三或附加核酸序列；
v)将所述核酸序列i)-iv)插入能够表达所述核酸的质粒载体中；
vi)将iv)的所述质粒载体转染到能够表达核酸分子并表达所述融合蛋白的宿主细胞中；以及
vii)纯化在所述宿主细胞中表达的重组融合蛋白。
32.根据权利要求30或31所述的方法，其中编码所述脂质部分信号序列的所述核酸被插入到所述质粒载体中第一核酸分子的上游，并且所述第二核酸以及任选的第三和附加核酸被插入到所述质粒载体中所述第一核酸的下游。
33.根据权利要求30或31所述的方法，其中编码所述脂质部分信号序列的所述核酸被插入到所述质粒载体中第二核酸分子的上游，并且所述第一核酸被插入到所述脂质部分信号序列的上游，并且任选的第三或附加核酸被插入到所述质粒载体中所述第二核酸的下游。
34.根据权利要求30至33中任一项所述的方法，其中所述脂质部分信号序列选自由以下组成的组：MNKFVKSLLVAGSVAALAAC(SEQ ID NO:36)，具有或不具有末端C残基；MQLNKVLKGLMIALPVMAIAAC(SEQ ID NO:37)，具有或不具有末端C残基；MKTTLKMTALAALSAFVLAGC(SEQ ID NO:38)或MKTTLKMTALAALSAFVLAG(SEQ ID NO:11)。
35.根据权利要求30至34中任一项所述的方法，其中所述脂质部分信号序列是P4信号序列MKTTLKMTALAALSAFVLAGC(SEQ ID NO:38)或MKTTLKMTALAALSAFVLAG(SEQ ID NO:11)。
36.根据权利要求30至35中任一项所述的方法，还包括编码插入在所述第一核酸与所述第二核酸之间，和/或所述第二核酸与所述任选的第三和附加核酸之间的肽接头序列的核酸。
37.根据权利要求36所述的方法，其中所述接头是GlySerGlyGlyGlyGly(SEQ ID NO:12)。
38.根据权利要求30至37中任一项所述的方法，还包括在编码选自由Omp26、P6、P4、PD和PF组成的组的Hi蛋白或其片段的核酸上游的编码脂质部分信号序列的附加核酸。
39.根据权利要求30至38中任一项所述的方法，其中所述第一核酸编码P6蛋白或其片段，并且所述第二核酸编码Omp26蛋白或其片段。
40.根据权利要求30至39中任一项所述的方法，其中所述第一核酸编码Omp26蛋白或其片段，并且所述第二核酸编码P6蛋白或其片段。
41.根据权利要求30至40中任一项所述的方法，其中所述脂质部分包含C18、C16、C14、C12或C10脂肪酸。
42.根据权利要求30至41中任一项所述的方法，其中所述脂质部分包含二酰基和/或三酰基脂肪酸。
43.根据权利要求30至42中任一项所述的方法，其中所述脂质部分是N-酰化或O-酰化脂肪酸。
44.根据权利要求30至43中任一项所述的方法，其中编码Omp26的所述核酸包含SEQ IDNO:1中列出的核酸序列的全部或部分。
45.根据权利要求30至44中任一项所述的方法，其中编码P6的所述核酸包含SEQ IDNO:3中列出的核酸序列的全部或部分。
46.根据权利要求30至45中任一项所述的方法，其中所述脂质部分在脂化蛋白的N末端处。
47.根据权利要求40至46中任一项所述的方法，其中所述融合蛋白选自由以下组成的组：(SEQ ID NO:31)、LP6φOmp26(SEQ ID NO:29)、/>(SEQ IDNO:39)、/> (SEQ ID NO:40)、/>(SEQ ID NO:41)、/> (SEQ ID NO:42)、/>(SEQ ID NO:43)、/> (SEQID NO:44)或/>(SEQ ID NO:45)。
48.根据权利要求30至47中任一项所述的方法，包括SEQ ID NO:13或15中列出的核酸序列。
49.根据权利要求30至48中任一项所述的方法，其中所述宿主细胞是细菌细胞。
50.根据权利要求49所述的方法，其中所述宿主细胞是大肠杆菌。
51.根据权利要求30至50中任一项所述的方法，其中在摇瓶中培养所述宿主细胞。
52.根据权利要求30至51中任一项所述的方法，其中在纯化所述融合蛋白之前对所述细胞进行超声处理。
53.一种包含通过根据权利要求30至52中任一项所述的方法生产的融合蛋白的疫苗。
54.一种包含通过根据权利要求30至52中任一项所述的方法生产的融合蛋白的免疫原性组合物。
CN202180075971.0A 2020-09-10 2021-09-10 流感嗜血杆菌疫苗和使用方法 Pending CN116940372A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US202063076461P 2020-09-10 2020-09-10
US63/076461 2020-09-10
PCT/US2021/049765 WO2022056195A1 (en) 2020-09-10 2021-09-10 Haemophilus infuluenzae vaccine and methods of use

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN116940372A true CN116940372A (zh) 2023-10-24

Family

ID=80629882

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202180075971.0A Pending CN116940372A (zh) 2020-09-10 2021-09-10 流感嗜血杆菌疫苗和使用方法

Country Status (5)

Country Link
US (1) US20230414738A1 (zh)
EP (1) EP4210739A1 (zh)
JP (1) JP2023544250A (zh)
CN (1) CN116940372A (zh)
WO (1) WO2022056195A1 (zh)

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2005532789A (ja) * 2002-03-15 2005-11-04 ワイス・ホールデイングス・コーポレーシヨン 減少した酵素活性を有する型別不能なインフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓｉｎｆｌｕｅｎｚａ）のＰ４タンパク質の変異体
TWI457133B (zh) * 2005-12-13 2014-10-21 Glaxosmithkline Biolog Sa 新穎組合物

Also Published As

Publication number Publication date
EP4210739A1 (en) 2023-07-19
JP2023544250A (ja) 2023-10-23
WO2022056195A1 (en) 2022-03-17
US20230414738A1 (en) 2023-12-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11198707B2 (en) Fusion proteins and combination vaccines comprising Haemophilus influenzae Protein E and Pilin A
JP6585085B2 (ja) Ｕｓｐａ２タンパク質構築物およびそれらの使用
CN107056901B (zh) 脑膜炎双球菌组合物及其方法
EP2910634A1 (en) Vaccine for preventing porcine edema disease
TW201731866A (zh) 脂化之肺炎鏈球菌抗原組合物、製備方法及用途
CN113227125A (zh) 用于o-连接的糖基化的修饰的载体蛋白
US20230414738A1 (en) Haemophilus influenzae vaccine and methods of use
CN117957017A (zh) 包含重组重叠肽和天然蛋白质的疫苗制剂
NZ615328B2 (en) Fusion proteins and combination vaccines comprising haemophilus influenzae protein e and pilin a

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination