ES2428067T3 - Introducción selectiva de genes para la vacunación con células dendríticas - Google Patents

Introducción selectiva de genes para la vacunación con células dendríticas Download PDF

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Abstract

Método in vitro para introducir un vector lentivírico que codifica un antígeno en una célula dendrítica queexpresa la DC-SIGN (no-integrina fijadora de ICAM-3 [moléculas de adhesión intracelular de tipo 3] específica de lascélulas dendríticas), en donde el método comprende: transducir la célula dendrítica con un virus recombinante, en donde el virus recombinante comprende dicho vectorlentivírico, en donde el virus recombinante comprende una glucoproteína de alfavirus que reconoce selectivamente dicha célulaque expresa la DC-SIGN, en donde dicha glucoproteína es una glucoproteína E2 de alfavirus mutada en un sitio defijación al sulfato de heparano para disminuir o eliminar su fijación al sulfato de heparano.

Description

Introduccion selectiva de genes para la vacunacion con celulas dendriticas
Antecedentes de invenci6n
La invencion se refiere de forma general a la introduccion selectiva de genes, y mas en particular, al uso de un virus 5 recombinante que comprende una molecula de reconocimiento selectivo que se dirige selectivamente a las celulas dendriticas y se fija a ellas, y puede, por lo tanto, utilizarse para vacunacion con celulas dendriticas.
La inmunizacion es una de las herramientas mas productivas en la practica medica moderna, pero permanece plagada de limitaciones. Algunas enfermedades infecciosas, tales como el VIH/sida, la malaria y la tuberculosis, siguen sin poderse controlar del todo mediante inmunizacion, mientras que otras enfermedades infecciosas estan 10 controladas por pautas complejas de inmunizacion. El cancer es una diana prometedora para los tratamientos inmunoterapicos, pero los resultados clinicos en los ensayos experimentales han sido desalentadores (Rosenberg, S.
A. et al, 2004, Nat. Med. 10: 909-915). Se necesitan nuevos metodos de inmunizacion, por ejemplo, para inducir de forma fiable la inmunidad antitumoral.
Las celulas dendriticas (CD) desempefan funciones criticas en la inmunidad innata y en la adaptativa. Las CD son
15 celulas presentadoras de antigeno especializadas con la (nica capacidad de capturar y procesar los antigenos, migrar desde la periferia hacia un organo linfatico y presentar los antigenos a los linfocitos T en reposo de una manera restringida por el complejo mayor de histocompatibilidad (CMH) (Banchereau, J. & Steinman, R. M. 1998. Nature 392: 245-252; Steinman, R. M. et al., 2003. Ann. Rev. Immunol. 21: 685-711). Estas celulas proceden de la medula osea (MO) y se caracterizan por la forma dendritica y su gran movilidad. Las CD inmaduras son duchas en
20 la ingestion de antigenos y se distribuyen a modo de centinelas por los tejidos perifericos de todo el cuerpo. Sin embargo, es necesario que las CD maduren para montar una respuesta inmunitaria eficaz (Steinman, R. M. et al. 2003. vease mas arriba). Las CD maduras expresan una gran cantidad del complejo CMH-antigeno y otras moleculas coestimuladoras (tales como CD40, B7-1, B7-2 y CD1a) (Steinman, R. M., 1991. Ann. Rev. Immunol. 9: 271-296, que se incorpora en la presente memoria por referencia en su totalidad; Banchereau, J. y R. M. Steinman,
25 1998, vease mas arriba). Estas moleculas desempefan funciones importantes a la hora de estimular los linfocitos T.
El descubrimiento de que las CD funcionan como celulas presentadoras de antigeno (CPA) especializadas ha impulsado la investigacion sobre la inmunizacion/vacunacion basada en las CD que implican cargar las CD con antigenos especificos (Banchereau, J. y Palucka, A. K. 2005. Nat. Rev. Immunol. 5: 296-306; Figdor, C. G. et al. 2004, Nat. Med. 10: 475-480). Sin embargo, todos estos estudios implican hay que cargar ex vivo las CD con los
30 antigenos especificos. A continuacion, las CD generadas ex vivo se administran al paciente. La generacion ex vivo de las CD para cada paciente es un procedimiento muy laborioso.
En comparacion, la presente invencion se refiere, entre otros, al reconocimiento selectivo, la carga de antigenos y la activacion de las CD in vivo, lo que da lugar al tratamiento in vivo de enfermedades mediante la generacion de una respuesta inmunitaria beneficiosa en el paciente. Asi pues, la invencion satisface una antigua necesidad de
35 tratamientos eficaces y efectivos para la inmunizacion/vacunacion.
La patente internacional WO00/61772 se refiere a las composiciones y a los metodos para generar una respuesta inmunitaria mediante el empleo de sistemas de vectores basados en alfavirus. La patente internacional WO2005/118802 se refiere a la seudotipia de vectores retroviricos para la accion selectiva.
Compendio de la invenci6n
40 La invencion da a conocer un metodo in vitro de introduccion de un vector lentivirico, que codifica un antigeno, en una celula dendritica que expresa la DC-SIGN (no-integrina fijadora de ICAM-3 [moleculas de adhesion intracelular de tipo 3] especifica de las celulas dendriticas), en donde el metodo comprende: la transduccion de la celula dendritica con un virus recombinante, en donde el virus recombinante comprende dicho vector lentivirico,
en donde el virus recombinante comprende una glucoproteina de alfavirus que reconoce selectivamente dicha celula
45 que expresa la DC-SIGN, en donde dicha glucoproteina es una glucoproteina E2 de alfavirus que esta mutada en un sitio de fijacion del sulfato de heparano para disminuir o eliminar su fijacion al sulfato de heparano.
La invencion da a conocer adicionalmente un virus recombinante que comprende un vector lentivirico que codifica un antigeno y una glucoproteina de alfavirus que reconoce selectivamente las celulas que expresan la DC-SIGN, en donde dicha glucoproteina es una glucoproteina E2 de alfavirus que esta mutada en un sitio de fijacion del sulfato de
50 heparano para disminuir o eliminar su fijacion al sulfato de heparano, para el uso en la estimulacion de una respuesta inmunitaria contra dicho antigeno en un mamifero.
La glucoproteina E2 de alfavirus que esta mutada en un sitio de fijacion del sulfato de heparano puede ser una glucoproteina E2 del Sindbis que esta mutada en un sitio de fijacion del sulfato de heparano. 2
En la explicacion de las realizaciones de la invencion de la presente memoria que viene a continuacion, la referencia a una «molecula de reconocimiento selectivo» o a una «molecula de reconocimiento selectivo que se fija a la DC-SIGN» se debe saber e interpretar que significa una glucoproteina E2 de alfavirus que esta mutada en un sitio de fijacion del sulfato de heparano para disminuir o eliminar su fijacion al sulfato de heparano.
5 La invencion se define adicionalmente en las reivindicaciones que la acompafan.
En algunas realizaciones, la molecula de reconocimiento selectivo es SINmu, tambien conocida como SVGmu (SEQ ID n.D 11).
En algunas realizaciones, el antigeno puede ser un antigeno tumoral o un antigeno del VIH.
El virus recombinante se puede producir mediante la transfeccion de una linea celular de empaquetamiento con un
10 vector virico que comprende el polinucleotido a introducir y un vector que comprende un gen que codifica la molecula de reconocimiento selectivo; el cultivo de la linea celular de empaquetamiento; y la recuperacion del virus recombinante a partir del cultivo de las celulas de empaquetamiento. En algunas realizaciones, la linea celular de empaquetamiento es una linea celular 293.
En algunas realizaciones de la invencion, el vector se introduce in vitro en una celula dendritica, mientras que en
15 otras realizaciones el vector puede utilizarse para introducirlo in vivo en una celula dendritica de un sujeto. El sujeto es tipicamente un mamifero, tal como un humano, un raton o un conejillo de Indias.
La invencion puede utilizarse para metodos de estimulacion de una respuesta inmunitaria en un mamifero. Un polinucleotido que codifica un antigeno contra el cual se desea estimular una respuesta inmunitaria se introduce en las celulas dendriticas que expresan la DC-SIGN al poner en contacto las celulas dendriticas con un vector
20 lentivirico que comprende el polinucleotido y una molecula de reconocimiento selectivo que se fija a la DC-SIGN.
El vector puede adicionalmente codificar uno o varios genes de interes, tal como un gen que codifica un antigeno y/o un gen que codifica un factor de maduracion de las celulas dendriticas.
La invencion se puede utilizar para metodos de tratamiento de un paciente con una enfermedad. Al paciente se le administra un virus recombinante, en donde el virus recombinante comprende un vector lentivirico que codifica un
25 antigeno relacionado con la enfermedad y una molecula de reconocimiento selectivo que se fija a la DC-SIGN. La molecula de reconocimiento selectivo puede proceder de una glucoproteina virica. En algunas realizaciones, la molecula de reconocimiento selectivo es SVGmu (SEQ ID n.D 11).
La enfermedad a tratar es por lo general una para la cual se conoce o se puede identificar un antigeno. En algunas realizaciones de la invencion, la enfermedad a tratar es cancer. En otras realizaciones, la enfermedad es VIH/sida.
30 Tambien se dan a conocer las celulas dendriticas transducidas con un virus recombinante tal y como se define mas arriba en la presente memoria. En algunas realizaciones, la molecula de reconocimiento selectivo es SVGmu (SEQ ID n.D 11).
La invencion puede utilizarse para la inmunizacion de un mamifero mediante la introduccion de un polinucleotido, que codifica un antigeno, en las celulas dendriticas que expresan la DC-SIGN. En algunas realizaciones, las celulas
35 dendriticas se ponen en contacto ex vivo con el virus recombinante. En otras realizaciones, las celulas dendriticas se ponen en contacto in vivo con el virus recombinante.
Los metodos descritos en la presente memoria tambien pueden utilizarse para estimular una respuesta inmunitaria contra un antigeno especifico en un mamifero mediante la introduccion de un vector lentivirico que codifica el antigeno en las celulas dendriticas mediante un virus recombinante que comprende el polinucleotido y una molecula
40 de reconocimiento selectivo que se fija a la DC-SIGN. La respuesta inmunitaria se puede modular mediante la dotacion de otro polinucleotido mas cuya expresion en la celula dendritica modula la respuesta inmunitaria. Por ejemplo, se puede introducir un polinucleotido que codifica un factor de maduracion de las celulas dendriticas.
Breve descripci6n de los dibujos
La figura 1 es una representacion esquematica de una estrategia general para dirigirse selectivamente a las celulas
45 dendriticas (CD) para la introduccion de antigenos. La glucoproteina de tipo silvestre del virus de Sindbis esta mutada en el sitio de fijacion del sulfato de heparano para destruir su capacidad de fijacion. La glucoproteina mutante que se obtiene (SVGmu) se fija a la DC-SIGN, pero no se fija al sulfato de heparano. DC-SIGN: no-integrina fijadora de ICAM-3 [moleculas de adhesion intracelular de tipo 3] especifica de las celulas dendriticas.
La figura 2 ilustra imagenes de microscopia laser confocal de particulas de virus recogidas de celulas productoras
50 del virus transfectadas transitoriamente con vector lentivirico, plasmidos que codifican GFP-vpr y SVGmu, y otras construcciones de empaquetamiento necesarias. Las particulas del virus estan marcadas con GFP (verde). La incorporacion de SVGmu en la superficie se detecto mediante inmunotincion con un anticuerpo contra la etiqueta HA (rojo) que marca la SVGmu. En el portaobjetos «GFP», las particulas viricas marcadas con GFP son verdes. En el portaobjetos «SVGmu», las particulas viricas que han incorporado la SVGmu en la superficie se tifen de rojo. En el portaobjetos «Combinacion», las particulas viricas donde solo se expresa la GFP son verdes, las particulas viricas
5 donde solo se incorpora la SVGmu en la superficie son rojas y las particulas viricas que expresan la GFP y que contienen la SVGmu son amarillas. La superposicion de los colores verde y rojo (amarillo) sefala las particulas viricas que contienen SVGmu, y representan la mayor parte de las particulas de virus. La barra de escala representa 2 1m.
La figura 3A muestra el analisis por citometria de flujo de lineas construidas de celulas diana 293T.hDCSIGN que
10 expresan la DC-SIGN humana, y 293T.mDCSIGN que expresan DC-SIGN murina. Linea continua: expresion de la DC-SIGN en las lineas de celulas diana; area sombreada: tincion de fondo de las celulas 293T.
La figura 3B muestra los resultados de la citometria de flujo para la deteccion de la GFP expresada en las celulas 293T transducidas con el lentivector envuelto con la glucoproteina de Sindbis de tipo silvestre (FUGW/SVG) o la glucoproteina de Sindbis mutante (FUGW/SVGmu). Se utilizo 1 ml de los sobrenadantes viricos recien obtenidos de 15 FUGW/SVG y FUGW/SVGmu para transducir las celulas 293T (2 x 105) que expresan la DC-SIGN humana (293T.hDCSIGN) o la DC-SIGN murina (293T.mDCSIGN). Las celulas 293T originales que no expresan la DC-SIGN se incluyeron como control. Tal y como se puede observar, el lentivector envuelto con la glucoproteina mutante del virus de Sindbis (SVGmu) es capaz de transducirse especificamente en las celulas 293T que expresan la DC-SIGN de humano o de raton. El titulo de la transduccion especifica de FUGW/SVGmu se estimo que era aproximadamente
20 1 x 106 UT/ml para 293T.hDC-SIGN y aproximadamente 0,8 x 106 UT/ml para 293T.mDC-SIGN.
La figura 4A muestra los resultados de citometria de flujo que ilustran la capacidad que tiene el lentivirus FUGW envuelto con la glucoproteina de Sindbis mutante(FUGW/SVGmu) a la hora de transducir especificamente las celulas dendriticas de raton que expresan la DC-SIGN en un cultivo primario mixto de medula osea. Las celulas de la medula osea completa aisladas de los ratones B6 se expusieron al sobrenadante virico recien preparado de
25 FUGW/SVGmu. El lentivector FUGW seudotipificado con la glucoproteina ecotropa (FUGW/Eco) se incluyo a modo de control sin capacidad de reconocimiento selectivo. Los antigenos de superficie de las celulas que expresan GFP se valoraron mediante tincion con los anticuerpos anti-CD11c y anti-DC-SIGN.
La figura 4B muestra los resultados de citometria de flujo que indican que el lentivirus FUGW envuelto con la glucoproteina mutante de Sindbis (FUGW/SVGmu) no se transduce en otros tipos de celulas, entre ellos los
30 linfocitos T primarios (CD3+, panel superior) y los linfocitos B (CD19+, panel inferior). Los linfocitos T CD3+ primarios y los linfocitos B CD19+ se aislaron de bazo de raton y se transdujeron con el sobrenadante virico recien preparado del vector con reconocimiento selectivo FUGW/SVGmu o del vector sin reconocimiento selectivo FUGW/Eco. La expresion de la GFP se analizo por citometria de flujo. Linea continua: celulas expuestas al vector lentivirico indicado; area sombreada: celulas sin transduccion (a modo de control negativo).
35 La figura 5 muestra los resultados de citometria de flujo que ilustran la capacidad que tiene el lentivirus FUGW envuelto con la glucoproteina mutante de Sindbis (FUGW/SVGmu) para transducirse especificamente en las CD procedentes de la medula osea (CDMO). Las CDMO se generaron mediante el cultivo de celulas de la medula osea recien aisladas en presencia de la citocina GM-CSF durante 6 dias. A continuacion, las celulas se transdujeron con el sobrenadante virico recien preparado del vector con reconocimiento selectivo FUGW/SVGmu, o bien del vector
40 sin reconocimiento selectivo FUGW/Eco. La expresion de GFP y de CD11c se midio mediante citometria de flujo.
La figura 6 muestra la activacion de las CDMO tras la transduccion selectiva con FUGW/SVGmu. La activacion de las CD se valoro con el analisis de la expresion de CD86 y de I-Ab en la superficie mediante citometria de flujo. La adicion de LPS (1 1g/ml) durante una noche se utilizo como estimulador sinergico para la activacion de las CDMO transducidas. Area sombreada: sin GFP (sin transducir); linea continua: con GFP (transducidas).
45 Las figuras 7A, 7B y 7C ilustran el reconocimiento selectivo in vivo de las CD mediante el uso del lentivirus FUGW/SVGmu. A los ratones B6 se les inyectaron 50 x 106 UT de FUGW/SVGmu y se analizaron 3 dias despues. A modo de control se incluyeron ratones no inmunizados. En la figura 7A, las imagenes muestran el tamafo de un ganglio linfatico inguinal representativo cercano al sitio de inyeccion en comparacion con el del ganglio linfatico equivalente lejano al sitio de inyeccion. La figura 7B ilustra el n(mero total de celulas de los ganglios linfaticos
50 indicados en la figura 7A. La figura 7C ilustra el analisis representativo por citometria de flujo de las celulas CD11c+ de los dos ganglios linfaticos mostrados en la figura 7A. Las cifras indican la fraccion de la poblacion de CD que es GFP+.
La figura 8 da a conocer una representacion esquematica del lentivector que codifica el antigeno OVA (FOVA) (arriba) y el lentivector que codifica la GFP (FUGW) como control (abajo).
55 La figura 9 ilustra la estimulacion in vitro de linfocitos T OT1 CD8+ debida a las celulas dendriticas que estan transducidas con el lentivector FOVA/SVGmu (DC/FOVA) o el lentivector FUGW/SVGmu (DC/FUGW) o mediante CDMO sin transducir y sensibilizadas con el peptido OVAp (SIINFEKL) (DC/OVAp). Los patrones de los marcadores de activacion de la superficie de los linfocitos T OT1 cocultivados con CDMO se valoraron mediante tincion con anticuerpos contra CD25, CD69, CD62L y CD44. Area sombreada: linfocitos T OT1 indiferenciados recogidos de animales transgenicos; linea continua: linfocitos T OT1 cocultivados con las CDMO indicadas.
5 La figura 10A ilustra la medicion del IFN-y mediante ELISA en los linfocitos T OT1 mezclados con diferentes diluciones de CDMO transducidas con FOVA/SVGmu (.), FUFW/SVGmu (e) o sensibilizadas con el peptido OVAp (.) y cultivadas durante 3 dias.
La figura 10B ilustra la respuesta de proliferacion de los linfocitos T OT1 de la figura 10A medida mediante el ensayo de incorporacion de [3H]-timidina durante 12 horas.
10 La figura 11 ilustra la estimulacion in vitro de los linfocitos T OT2 CD4+ debida a las celulas dendriticas que estan transducidas con el lentivector FOVA/SVGmu (DC/FOVA) o FUGW/SVGmu (DC/FUGW) o mediante CDMO sin transducir y sensibilizadas con el peptido OVAp* (ISQAVHAAHAEINEAGR) (DC/OVAp*). Los patrones de los marcadores de activacion de la superficie de los linfocitos T OT2 transgenicos cocultivados con CDMO se valoraron mediante tincion con anticuerpos contra CD25, CD69, CD62L y CD44. Area sombreada: linfocitos T OT2
15 indiferenciados recogidos de animales transgenicos; linea continua: linfocitos T OT2 cocultivados con CDMO.
La figura 12 ilustra la medicion del IFN-y mediante ELISA en la mezcla de linfocitos T OT2 con diferentes diluciones de CDMO transducidas con FOVA/SVGmu (.), FUGW/SVGmu (e) o sensibilizadas con el peptido OVAp* (.) y cultivadas durante 3 dias.
La figura 13A da a conocer una representacion esquematica del vector retrovirico MIG-OT1 utilizado para la 20 modificacion genetica de celulas madre hematopoyeticas de raton (HSC, por su nombre en ingles).
La figura 13B ilustra como los linfocitos T OT1 CD8+ procedentes de las HSC modificadas con MIG-OT1 en los ratones reconstituidos se identificaron mediante la coexpresion de GFP y TCR Va2 o V�5. Las HSC de los ratones B6 se infectaron con MIG-OT1 seudotipificado con Eco (MIG-OT1/Eco) y transferido al interior de los ratones B6 destinatarios irradiados. Los linfocitos T OT1 CD8+ se identificaron por citometria de flujo ocho semanas despues de
25 la transferencia.
La figura 14A ilustra la valoracion de los patrones de los marcadores de activacion de la superficie de los linfocitos T OT1+ GFP+ aislados del bazo de ratones inmunizados y reconstituidos. Las HSC modificadas murinas reconstituidas con MIG-OT1 se inmunizaron mediante inyeccion subcutanea directa de 10 x 106 UT de bien FOVA/SVGmu o bien FUGW/SVGmu (como control) y se analizaron siete dias despues. Se llevo a cabo la deteccion de la tincion
30 superficial para CD69, CD62L y CD44. Linea continua: linfocitos T OT1+ GFP+ de los ratones inmunizados con FOVA/SVGmu; linea discontinua; linfocitos T OT1+ GFP+ de los ratones inmunizados con FUGW/SVGmu de control; area sombreada: linfocitos T OT1+ GFP+ de ratones sin inmunizar.
La figura 14B ilustra el n(mero total de linfocitos OT1 recogidos de los ganglios linfaticos (GL,o) o de bazo (BZ, .) de ratones sin inmunizar (sin inm) o de ratones inmunizados con FUGW/SVGmu o FOVA/SVGmu.
35 La figura 15 ilustra la estimulacion in vivo de los linfocitos T especificos de antigeno y la respuesta mediante anticuerpos en los ratones de tipo silvestre tras la inyeccion subcutanea del lentivector FOVA/SVGmu que reconoce selectivamente las CD. Los ratones B6 se inmunizaron por via subcutanea con 50 X 106 UT de FOVA/SVGmu o bien de FUGW/SVGmu (como control). Los ratones sin inmunizar (sin inm) se incluyeron como control negativo. Se recogieron los esplenocitos 14 dias despues de la inmunizacion y se analizaron para detectar la presencia de
40 linfocitos T especificos de OVA mediante la medicion del tetramero H-2Kb-SIINFEKL-PE y tincion para CD44. Los porcentajes indicados son el porcentaje de los linfocitos T CD8+ totales.
Las figuras 16A y 16B ilustran las respuestas in vivo de los linfocitos T especificos de OVA que se observan en los ratones que reciben diferentes dosis subcutaneas de FOVA/SVGmu. Los linfocitos T especificos de OVA se identificaron mediante tincion de tetrameros como en la figura 17. La figura 16A muestra el porcentaje medido de
45 linfocitos T especificos de OVA tras la inmunizacion con 100 x 106 UT de FOVA/SVGmu. La figura 16B muestra la respuesta a la dosis que presentan los linfocitos T especificos de OVA tras la inyeccion de las dosis indicadas de FOVA/SVGmu.
La figura 17A ilustra los patrones de los marcadores de activacion de la superficie de los linfocitos T CD8+ especificos de OVA (identificados como celulas positivas para el tetramero) que se aislaron de ratones inmunizados
50 con FOVA/SVGmu a las 2 semanas de la inyeccion. Los marcadores de activacion de superficie se valoraron mediante tincion con anticuerpos contra CD25, CD69, CD62L y CD44. Linea continua: linfocitos T CD8+ tetramero+ de los ratones inmunizados con FOVA/SVGmu; area sombreada: linfocitos T CD8+ indiferenciados de los ratones sin inmunizar.
La figura 17B ilustra el titulo de IgG en el suero especifica de OVA que hay en los ratones B6 tras la inmunizacion con 50 x 106 UT de FOVA/SVGmu. Se recogio suero a los 7 y 14 dias de la inmunizacion y se les determino el titulo de IgG especificas de OVA mediante ELISA con diluciones seriadas 10x, comenzando en 1:100. Los valores del titulo se determinaron mediante la dilucion mas alta en la cual la densidad optica era 2X desviaciones estandares mas alta que la del suero basal en la dilucion equivalente.
5 La figura 18 ilustra el tamafo del tumor en funcion del tiempo en un modelo murino E.G7 de tumor. Los ratones B6 se inmunizaron con la inyeccion subcutanea de 50 x 106 UT de FOVA/SVGmu (.) o bien del vector vacio FUW/SVGmu (e). Se incluyo como control la ausencia de inmunizacion (.). En cada grupo se incluyeron cuatro ratones. El dia 14 tras la inmunizacion, los ratones se expusieron por via subcutanea a 5 x 106 de, o bien celulas tumorales E.G7 (que expresan el antigeno OVA, panel izquierdo), o bien las celulas tumorales EL4 originales (que
10 carecen del antigeno OVA, como control, panel derecho). El crecimiento tumoral se midio con un calibrador muy preciso y se muestra como el producto de los dos diametros perpendiculares mas largos (mm2).
La figura 19 ilustra la cinetica del crecimiento in vivo de los tumores en un modelo murino de erradicacion del tumor E.G7. Una cepa albina de ratones B6 se implanto con 5 x 106 celulas tumorales E.G7 que expresaban de forma estable un gen basado en la luciferasa de luciernaga (E.G7.luc) para la adquisicion de imagenes. A modo de control
15 se incluyo un raton (#1) sin implantacion de tumor. Los ratones portadores de tumores se trataron sin inmunizacion (#2) o con inmunizacion mediante la inyeccion de 50 x 106 UT de FOVA/SVGmu los dias 3 y 10 (#3, #4) tras la exposicion al tumor. La cinetica del crecimiento de los tumores se observo mediante la adquisicion de imagenes en vivo de los animales por BLI. La unidad p/s/cm2/sr representa fotones por segundo por cm2 y estereorradian.
La figura 20 muestra la cuantificacion de las sefales de luminiscencia generadas por los tumores E.G7 en la figura 20 19. (o) para el raton #2; (e) para el raton #3; (.) para el raton #4.
La figura 21 ilustra el porcentaje de linfocitos T especificos de OVA presentes tras la inmunizacion con 100 x 106 UT de FOVA/SVGmu en la cepa albina de ratones B6. Los ratones B6 albinos se inmunizaron por via subcutanea con 50 x 106 UT de FOVA/SVGmu. Los ratones sin inmunizacion (sin inm) se incluyeron como control negativo. Los esplenocitos se recogieron 14 dias despues de la inmunizacion y se analizaron para detectar la presencia de
25 linfocitos T especificos de OVA y medirlos mediante el tetramero H-2Kb-SIINFEKL-PE y tincion para CD44. Los porcentajes indicados corresponden al porcentaje de linfocitos T CD8+ totales.
La figura 22A da a conocer una representacion esquematica de un lentivector que reconoce selectivamente las CD y que codifica un gen basado en la luciferasa de luciernaga (Luc) para la adquisicion de imagenes, que se denomina Fluc/SVGmu.
30 La figura 22B ilustra las imagenes de bioluminiscencia de los ratones inyectados por via subcutanea con 50 x 106 UT de, o bien el lentivector Fluc/SVGmu que reconoce selectivamente las CD (mostrado en la figura 25A), o bien el lentivector Fluc/VSVG que no es selectivo. La imagen representativa se obtuvo al cabo de 30 dias de la inyeccion con IVIS200® (Xenogen).
La figura 23 ilustra que la administracion de una (nica dosis del lentivector recombinante FOVA/SVGmu especifico
35 de las CD puede generar linfocitos T CD8+ IFN-y+ en los ratones B6. Los ratones B6 que no se han sometido previamente a experimentacion se inmunizaron con una inyeccion subcutanea de 50 x 106 UT del lentivector FOVA/SVGmu, o la misma dosis de FUGW/SVGmu como control. Los ratones B6 sin inmunizar (sin inm) se incluyeron como control negativo. Dos semanas despues se recogieron los esplenocitos de los ratones del experimento y se les analizo la produccion de IFN-y intracelular por citometria de flujo con o sin la reestimulacion
40 con el peptido OVAp. Los porcentajes indicados son el porcentaje de linfocitos T CD8+ IFN-y+ del total de linfocitos T CD8+.
La figura 24 ilustra una representacion esquematica de las construcciones lentiviricas para la preparacion de los virus recombinantes que reconocen selectivamente las CD.
La figura 25 muestra una representacion esquematica de una realizacion de la vacunacion in situ contra el VIH/sida.
45 Descripci6n detallada de la realizaci6n preferida
La ingenieria genetica ha resultado ser un medio eficaz y potente para convertir las celulas dendriticas (CD) en celulas inmunitarias especiales para inducir las respuestas inmunitarias especificas de antigeno. Se hah invertido muchos esfuerzos de investigacion en relacion con la manipulacion in vitro de las CD para la vacunacion/inmunizacion contra el cancer, el VIH y otras enfermedades. Sin embargo, hasta ahora, no ha sido
50 posible introducir especifica y eficazmente un gen de interes, tal como un gen que codifica un antigeno, en las celulas dendriticas in vitro e in vivo. Los inventores han descubierto nuevos metodos y composiciones para el reconocimiento selectivo, eficaz y especifico de las CD in vitro e in vivo. Los metodos y composiciones se pueden utilizar para inducir respuestas inmunitarias especificas de antigeno, por ejemplo para inmunoterapia.
Las realizaciones de la invencion incluyen metodos y composiciones para el reconocimiento selectivo de las celulas
dendriticas (CD) mediante el uso de un virus recombinante que introduce un polinucleotido en las CD. Esto se consigue mediante el reconocimiento selectivo de la molecula DC-SIGN (no-integrina fijadora de ICAM-3 [moleculas de adhesion intracelular de tipo 3] especifica de las celulas dendriticas; tambien se conoce como CD209) que es especifica de la superficie de las CD. La DC-SIGN es un receptor de tipo lectina de tipo C capaz de de llevar a cabo 5 rapidamente la fijacion y la endocitosis de los materiales (Geijtenbeek, T. B. et al., 2004. Annu. Rev. Inmunol. 22: 3354). Los virus recombinantes estan envueltos en una molecula de reconocimiento selectivo de disefo que es especifica del reconocimiento de la DC-SIGN, como se define en las reivindicaciones. El polinucleotido codifica un antigeno. En algunas realizaciones, el virus recombinante introduce mas de un gen en las CD. Por ejemplo, se podrian introducir genes que codifican dos o mas antigenos. La administracion de mas de un gen se puede
10 conseguir, por ejemplo, conectando los genes con un sitio interno de entrada del ribosoma (IRES, por su nombre en ingles) y/o con secuencias 2A, e impulsando la expresion mediante un (nico promotor/potenciador.
Tal y como se explica con mas detalle mas adelante, la invencion se basa en el uso de virus recombinantes, a saber, lentivirus, porque estos virus son capaces de incorporar en su cubierta una gran n(mero de proteinas que se encuentran en la superficie de las celulas productoras del virus. Por lo general, una linea de celulas de 15 empaquetamiento esta transfectada con un vector virico que codifica un polinucleotido de interes (que tipicamente codifica un antigeno), con al menos un plasmido que codifica componentes de empaquetamiento del virus (tal como gag y pol) y con una molecula de reconocimiento selectivo que esta modificada geneticamente para que se fije a las celulas dendriticas. La molecula de reconocimiento selectivo esta modificada geneticamente para que se fije especificamente al marcador de la superficie celular DC-SIGN de las celulas dendriticas. Durante la gemacion del
20 virus, la molecula de reconocimiento selectivo, que se expresa en la membrana de las celulas de empaquetamiento, se incorpora a la envoltura virica. Como resultado, las particulas retroviricas comprenden un n(cleo que incluye el polinucleotido de interes y una envoltura que comprende la molecula de reconocimiento selectivo en su superficie.
La molecula de reconocimiento selectivo es capaz de fijarse a la DC-SIGN de una celula dendritica, y el virus es capaz de introducir el gen de interes en la celula dendritica. Sin desear comprometerse con la teoria, se cree que la 25 fijacion induce la endocitosis, lo que mete al virus en un endosoma, desencadena la fusion de la membrana y permite que el n(cleo del virus pase al citosol. Tras la transcripcion inversa y la migracion del producto al n(cleo, el genoma del virus se integra en el genoma de la celula diana, con lo que se incorpora el polinucleotido de interes en el genoma de la celula diana. Entonces, la CD expresa el el polinucleotido de interes (que codifica un antigeno). Despues, el antigeno se procesa y las CD se lo presentan a los linfocitos B y T, lo que genera una respuesta
30 inmunitaria especifica del antigeno. No de necesita la via especifica que se acaba de describir siempre que la celula dendritica sea capaz de estimular una respuesta inmunitaria especifica del antigeno.
La presente invencion se utiliza para dar a conocer metodos y composiciones para enviar in vitro e in vivo de forma selectiva y directa un gen de interes a las CD. En algunas realizaciones preferidas in vivo, el gen de interes se administra a las CD sin el cultivo in vitro de las CD. Por ejemplo, el gen de interes se puede administrar a las CD 35 mediante una administracion directa del virus de reconocimiento selectivo a un sujeto vivo. El gen de interes codifica un antigeno contra el cual se desea estimular una respuesta inmunitaria. Los antigenos de ejemplo incluyen: antigenos especificos de tumores, antigenos asociados a tumores, antigenos especificos de tejidos, antigenos bacterianos, antigenos viricos, antigenos de levadura, antigenos de hongos, antigenos de protozoos, antigenos de parasitos, mitogenos y similares. Otros antigenos seran evidentes para el experto en la tecnica y se pueden utilizar
40 sin demasiada experimentacion.
Los metodos descritos en la presente memoria se pueden adaptar facilmente para utilizar las moleculas de reconocimiento selectivo que son especificas de las CD y que se pueden manipular para proporcionar la especificidad deseada. La molecula de reconocimiento selectivo es una glucoproteina E2 de alfavirus, mutada en un sitio de fijacion del sulfato de heparano, que se fija a la DC-SIGN de las celulas dendriticas y que facilita la
45 introduccion del gen de interes en las celulas dendriticas. Las moleculas de reconocimiento selectivo de ejemplo incluyen, pero sin limitarse a ellas, glucoproteinas procedentes del virus de Sindbis.
Para modificar geneticamente la molecula de reconocimiento selectivo y proporcionar la especificidad deseada, puede utilizarse cualquier metodo conocido en la tecnica. Los metodos de ejemplo incluyen, pero sin limitarse a ellos, la modificacion genetica racional de proteinas y el barajado de ADN. Por lo general, para modificar geneticamente 50 una molecula de reconocimiento selectivo que sea especifica de las CD, se proporciona una glucoproteina virica que interacciona con un marcador de superficie especifico de las celulas dendriticas. La glucoproteina E2 de alfavirus interacciona con la DC-SIGN. La glucoproteina virica tambien puede interaccionar con al menos un segundo marcador de la superficie celular tal como, por ejemplo, sulfato de heparano (SH), que se expresa en la superficie de tipos celulares diferentes a las CD. La glucoproteina virica esta modificada de tal forma que se mantiene su 55 capacidad para interaccionar con el marcador de superficie especifico de las CD mientras que tiene disminuida o eliminada su capacidad para interaccionar con el sulfato de heparano. La modificacion puede ser una mutacion en al menos un resto de la secuencia de aminoacidos de la glucoproteina virica. La mutacion puede ser una delecion, adicion o sustitucion del resto, y se puede llevar a cabo mediante los metodos estandares conocidos en la tecnica. La especificidad deseada puede confirmarse con facilidad. Por ejemplo, una vez que la glucoproteina virica esta
modificada, se puede utilizar para preparar un virus recombinante mediante la contransfeccion con un vector virico que contiene un gen indicador y al menos un plasmido que codifica componentes de empaquetamiento del virus en una linea celular de empaquetamiento. La glucoproteina se incorpora en la envoltura virica durante la gemacion del virus. El virus puede utilizarse para transfectar una poblacion pura de CD asi como una poblacion mixta de celulas
5 que contiene las CD, y la especificidad de la transduccion virica de las CD puede confirmarse mediante el analisis de las celulas para detectar la expresion del gen indicador en las CD, pero en una cantidad no significativa en otros tipos de celulas. Si la especificidad no es suficientemente rigurosa (por ejemplo, si se observa una cantidad indeseada de infeccion de los otros tipos de celulas), la glucoproteina virica se puede modificar adicionalmente y analizarla como se describe hasta que se consigue la especificidad deseada.
10 Las realizaciones de la presente invencion incluyen la introduccion, en las CD, de activadores y/o factores de maduracion de las CD junto con los antigenos. Los activadores y los factores de maduracion de las CD de ejemplo incluyen, pero sin limitarse a ellos, moleculas de estimulacion, citocinas, quimiocinas, anticuerpos y otros agentes tales como ligandos Flt-3. Por ejemplo, los factores de maduracion de las CD pueden incluir al menos uno de los siguientes: GM-CSF, IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-15, IL-21, IL-23, TNFa, B7.1, B7.2, 4-1BB, ligando de CD40 (CD40L) y
15 CD40 inducible por farmacos (iCD40) (Hanks, B. A., et al., 2005. Nat. Med. 11: 130-137).
Las realizaciones de la presente invencion tambien incluyen metodos y composiciones relacionadas con la introduccion en los pacientes del virus recombinante tal y como se describe mas arriba, o de CD infectadas con el virus recombinante, para estimular respuestas inmunitarias especificas del antigeno tales como, por ejemplo, respuestas de linfocitos T (respuestas inmunitarias celulares) y respuestas de linfocitos B (respuestas inmunitarias 20 humorales). Por ejemplo, los linfocitos T CD4 activados pueden coordinar y orquestar que los linfocitos T citotoxicos CD8+ y los linfocitos B intervengan en una respuesta especifica del antigeno. En las realizaciones preferidas, el virus recombinante y/o las CD infectadas con el virus recombinante se utilizan para estimular respuestas inmunitarias para la prevencion y el tratamiento de enfermedades tales como, pero sin limitarse a ellas, el cancer y el sida/VIH. Cualquier enfermedad puede tratarse, con tal de que una respuesta inmunitaria contra un antigeno particular sea
25 beneficiosa, e incluye, pero sin limitarse a ellas, enfermedad neoplasica, enfermedad infecciosa y enfermedades relacionadas con la inmunidad.
Tal y como se describe en la presente memoria, se llevaron a cabo estudios que dieron lugar al descubrimiento de metodos y composiciones que pueden utilizarse para dirigir los virus recombinantes al interior de las CD para que proporcionen genes que codifican antigenos concretos. La modificacion genetica de las CD para que desencadenen
30 respuestas inmunitarias productivas puede utilizarse para la prevencion y el tratamiento de enfermedades y ofrece un metodo eficaz para inducir con eficacia inmunidad celular de linfocitos T, asi como una fuerte produccion de anticuerpos. Los metodos y composiciones descritos en la presente memoria pueden proporcionar medios potentes para la inmunizacion con los antigenos deseados. Tal inmunizacion puede prevenir y tratar enfermedades tales como, por ejemplo, el cancer y el sida/VIH.
35 Definiciones
A menos que se defina de otra manera, las terminologias tecnica y cientifica utilizadas en la presente memoria tienen el mismo significado que suele adjudicarles el experto en la tecnica al cual pertenece esta invencion. Vease, p. ej., Singleton et al., DictionaryofMicrobiology and Molecular Biology, 2.a ed., J. Wiley & Sons (Nueva York, NY 1994); Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor Press (Cold Springs Harbor, NY,
40 1989). En la practica de esta invencion se pueden utilizar cualquier metodo, dispositivo y material similares o equivalentes a los descritos en la presente memoria.
Tal y como se utilizan en la presente memoria, la terminologia acido nucleico, polinucleotido y nucleotido son intercambiables y se refieren a cualquier acido nucleico, ya sea compuestos de enlaces fosfodiester o enlaces modificados tales como fosfotriester, fosforamidato, siloxano, carbonato, carboximetilester, acetamidato, carbamato,
45 tioeter, fosforamidato puenteado, fosfonato de metileno puenteado, fosforamidato puenteado, fosforamidato puenteado, fosfonato de metileno puenteado, fosforotioato, metilfosfonato, fosforoditioato, fosforotioato puenteado o enlaces sulfona, y combinaciones de tales enlaces.
La terminologia acido nucleico, polinucleotido y nucleotido tambien incluyen especificamente acidos nucleicos compuestos de bases diferentes de las cinco bases que se aparecen en la biologia (adenina, guanina, timina,
50 citosina y uracilo).
Tal y como se utiliza en la presente memoria, se dice que una molecula de acido nucleico esta «aislada» cuando la molecula de acido nucleico se ha separado sustancialmente de las moleculas de acido nucleico contaminantes que codifican otros polipeptidos.
La «inmunizacion» se refiere a la provision del antigeno a un hospedador. En algunas realizaciones, el antigeno se
55 proporciona a las celulas presentadoras del antigeno, tal como las celulas dendriticas. Tal y como se describe a continuacion, el virus recombinante que comprende un gen que codifica un antigeno se puede dirigir selectivamente a las celulas dendriticas con una molecula que tiene afinidad especifica por la DC-SIGN de las celulas dendriticas. Asi pues, el antigeno para el cual se desea estimular una respuesta inmunitaria se puede introducir en las celulas dendriticas. Otros metodos de inmunizacion se conocen bien en la tecnica.
La terminologia respuesta «inmunologica» o «inmunitaria» es el desarrollo de una respuesta beneficiosa humoral
5 (mediada por anticuerpos) y/o celular (mediada por linfocitos T especificos del antigeno o sus productos de secrecion) dirigida contra un peptido amiloide en un paciente destinatario. Tal respuesta puede ser una respuesta activa inducida por la administracion de inmunogeno o una respuesta pasiva inducida por la administracion de anticuerpos o linfocitos T sensibilizados. Se desencadena una respuesta inmunitaria celular mediante la presentacion de epitopos polipeptidicos asociados a moleculas del CMH de clase I o de clase II para activar los
10 linfocitos especificos del antigeno T cooperadores CD4+ y/o T citotoxicos CD8+. La respuesta tambien puede implicar la activacion de monocitos, macrofagos, linfocitos citoliticos naturales, basofilos, celulas dendriticas, astrocitos, celulas de microglia, eosinofilos u otros componentes de la inmunidad innata. La presencia de una respuesta inmunologica mediada por celulas se puede determinar mediante ensayos de proliferacion (linfocitos T CD4+) o ensayos de LTC (linfocitos T citotoxicos) (Burke et al., J. Inf. Dis. 170, 1110-19 (1994)), mediante muerte
15 dependiente de antigeno (ensayo de linfocitos T citotoxicos, Tigges et al., J. Immunol. 156, 3901-3910) o mediante la secrecion de citocinas. La contribucion relativa de las respuestas humoral y celular al efecto protector o terapeutico que tiene un inmunogeno puede diferenciarse aislando por separado las IgG y los linfocitos T de un animal singenico inmunizado y midiendo el efecto protector o terapeutico en un segundo sujeto.
Un «agente inmunogeno» o «inmunogeno» es capaz de inducir una respuesta inmunologica contra si mismo cuando 20 se administra a un paciente, opcionalmente con un adyuvante.
La terminologia «adyuvante» se refiere a un compuesto que, cuando se administra junto a un antigeno, aumenta, refuerza y/o amplifica la respuesta inmunitaria al antigeno, pero cuando se administra solo, no genera una respuesta inmunitaria contra el antigeno. Puede administrarse un adyuvante con el virus recombinante de la invencion como una (nica composicion o puede administrarse antes, a la vez, o despues de la administracion del virus recombinante
25 de la invencion. Los adyuvantes pueden mejorar una respuesta inmunitaria mediante varios mecanismos, entre ellos la incorporacion de linfocitos, la estimulacion de linfocitos B y/o T y la estimulacion de macrofagos.
Los «anticuerpos» (Ac) y las «inmunoglobulinas» (Ig) son glucoproteinas que tienen las mismas caracteristicas estructurales. Mientras que los anticuerpos muestran una especificidad de fijacion por un antigeno especifico, las inmunoglobulinas incluyen tanto anticuerpos como otras moleculas de tipo anticuerpo que carecen de especificidad
30 antigenica. Los polipeptidos de la (ltima clase, por ejemplo, los producen el sistema linfatico en poca cantidad y los mielomas los producen en gran cantidad.
La terminologia «anticuerpo» se utiliza en el sentido mas amplio y abarca especificamente los anticuerpos humanos, no humanos (p. ej., murino), quimericos y monoclonales humanizados (entre ellos los anticuerpos monoclonales completos), anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecificos (p. ej., anticuerpos biespecificos), anticuerpos de
35 una sola cadena y fragmentos de anticuerpo, siempre y cuando presenten la actividad biologica deseada. Tipicamente, los fragmentos compiten por la fijacion especifica a un antigeno con el anticuerpo intacto del cual proceden.
La terminologia «epitopo» o «determinante antigenico» se refiere a un sitio en un antigeno al cual responden los linfocitos B y/o T. Los epitopos de linfocitos B pueden estar formados por aminoacidos contiguos o aminoacidos no 40 contiguos yuxtapuestos en la estructura terciaria de una proteina. Es tipico que los epitopos formados por aminoacidos contiguos se mantengan al exponerlos a disolventes desnaturalizantes, mientras que los epitopos formados por el plegamiento terciario tipicamente se pierden con el tratamiento con los disolventes desnaturalizantes. Un epitopo incluye tipicamente al menos 3, y con mas frecuencia, al menos 5 u 8-10 aminoacidos en una (nica conformacion espacial. Los metodos para determinar la conformacion espacial de los epitopos incluyen, 45 por ejemplo, la cristalografia de rayos x y la resonancia magnetica nuclear bidimensional. Vease, p. ej., Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, vol. 66, Glenn. E. Morris, Ed. (1996). Los anticuerpos que reconocen el mismo epitopo se pueden identificar en un inmunoensayo simple que muestra la capacidad de un anticuerpo para bloquear la fijacion de otro anticuerpo a un antigeno deseado. Los linfocitos T reconocen los epitopos continuos de aproximadamente nueve aminoacidos en los linfocitos CD8 o de aproximadamente 13-15
50 aminoacidos en los linfocitos CD4. Los linfocitos T que reconocen el epitopo se pueden identificar por ensayos in vitro que miden la proliferacion dependiente del antigeno, tal y como se determina por la incorporacion de 3H-timidina en los linfocitos T sensibilizados en respuesta a un epitopo (vease Burke, vease mas arriba; Tigges, vease mas arriba).
Las «celulas diana» son toda celula en la que se desea introducir un polinucleotido o expresar un gen de interes.
55 Preferiblemente, las celulas diana son celulas dendriticas, en particular celulas dendriticas que expresan la DC-SIGN.
La terminologia «mamifero» se define como un individuo que pertenece a la clase de Mammalia e incluye, sin limitacion, humanos, animales domesticos y de granja, y animales de zoologico, para deporte y mascotas, tales
como ovejas, perros, caballos, gatos y vacas.
La terminologia «sujeto» o «paciente» incluye sujetos humanos y otros mamiferos que reciben un tratamiento o bien
preventivo o bien terapeutico.
5 Tal y como se utiliza en la presente memoria, «tratamiento» es una intervencion clinica que puede ser terapeutica o preventiva. En las aplicaciones terapeuticas, a un paciente que se sospecha que tiene, o que ya padece, una tal enfermedad se le administran las composiciones farmaceuticas o medicamentos en una cantidad suficiente para curar, o al menos detener parcialmente, los sintomas de la enfermedad y sus complicaciones. En las aplicaciones preventivas, las composiciones farmaceuticas o medicamentos se administran a un paciente sensible a, o que si no
10 corre el riesgo de padecer, una enfermedad determinada en una cantidad suficiente para eliminar o reducir el riesgo,
o retrasar el comienzo, de la enfermedad. Una cantidad adecuada para cumplir esto se define como una dosis terapeutica o farmaceuticamente eficaz. Tal cantidad se puede administrar como una dosis (nica o se puede administrar de acuerdo a una pauta posologica, por medio de lo cual resulta eficaz. La cantidad puede curar una enfermedad, pero, tipicamente, se administra para mejorar los sintomas de una enfermedad, o para prevenir el
15 desarrollo de una enfermedad o trastorno. Tanto en los tratamientos terapeuticos como en los profilacticos, los farmacos normalmente se administran en varias dosis hasta que se logra una respuesta inmunitaria suficiente. Tipicamente, la respuesta inmunitaria se supervisa y se repiten las dosis si la respuesta inmunitaria comienza a desvanecerse. El «tratamiento» no necesita eliminar por completo una enfermedad, ni necesita impedir por completo que un sujeto enferme con la enfermedad o el trastorno.
20 «Tumor», tal y como se utiliza en la presente memoria, se refiere a toda proliferacion y crecimiento celulares neoplasicos, bien malignos o benignos, y toda celula y tejido precanceroso y canceroso.
La terminologia «cancer» se refiere a una enfermedad o trastorno que se caracteriza por el crecimiento celular sin desregulado. Ejemplos de cancer incluyen, pero sin limitarse a ellos, carcinoma, linfoma, blastoma y sarcoma. Ejemplos de canceres especificos incluyen, pero sin limitarse a ellos, cancer de pulmon, cancer de colon, cancer de 25 mama, cancer de testiculo, cancer de estomago, cancer de pancreas, cancer de ovario, cancer de higado, cancer de vejiga, cancer colorrectal y cancer de prostata. Los expertos en la tecnica conocen bien otros canceres, que incluyen, pero sin limitarse a ellos: leucemia, linfoma, cancer cervical, gliomas tumorales, adenocarcinomas y cancer de piel. Canceres de ejemplo incluyen, pero sin limitarse a ellos, tumor de vejiga, tumor de mama, tumor de prostata, carcinoma de celulas basales, cancer de las vias biliares, cancer de vejiga, cancer de huesos, cancer de cerebro y 30 del SNC (p. ej., glioma tumoral), cancer cervical, coriocarcinoma, cancer de colon y de recto, cancer del tejido conjuntivo, cancer del aparato digestivo; cancer endometrial, cancer de esofago; cancer de ojo; cancer de cabeza y cuello; cancer de estomago; neoplasia intraepitelial; cancer de rifon; cancer de laringe; leucemia; cancer de higado; cancer de pulmon (p. ej., microcitico y no microcitico); linfoma que incluye linfoma de Hodgkin y no de Hodgkin; melanoma; mieloma, neuroblastoma, cancer de la cavidad bucal (p. ej., labios, lengua, boca y faringe); cancer de
35 ovario; cancer de pancreas; retinoblastoma; rabdomiosarcoma; cancer rectal; cancer renal, cancer del aparato respiratorio; sarcoma; cancer de piel; cancer de estomago; cancer de testiculo; cancer de tiroides; cancer de (tero; cancer del aparato urinario, asi como otros carcinomas y sarcomas. El cancer tambien incluye neoplasias y trastornos malignos en los mamiferos que se conocen bien en la tecnica.
Un «vector» es un acido nucleico que es capaz de trasportar otro acido nucleico. Los vectores pueden ser, por
40 ejemplo, plasmidos, cosmidos o fagos. Un «vector de expresion» es un vector que es capaz de dirigir la expresion de una proteina o proteinas codificadas por uno o varios genes que lleva el vector cuando esta presente en el entorno apropiado.
La terminologia «elemento regulador» y «elemento de control de la expresion» se utilizan indistintamente y se refieren a moleculas de acido nucleico que pueden influir en la transcripcion y/o traduccion de una secuencia 45 codificante unida operativamente en un entorno concreto. Esta terminologia se utiliza ampliamente y cubre todos los elementos que promueven o regulan la transcripcion, entre ellos promotores, elementos minimos necesarios para la interaccion basica de la ARN polimerasa y los factores de transcripcion, elementos secuencia arriba, potenciadores y elementos de respuesta (vease, p. ej., Lewin, «Genes V» (Oxford University Press, Oxford) paginas 847-873). Los elementos reguladores de ejemplo en los procariotas incluyen promotores, secuencias operadoras y sitios de fijacion
50 del ribosoma. Los elementos reguladores que se utilizan en las celulas eucariotas pueden incluir, sin limitacion, promotores, potenciadores, sefales de ayuste y sefales de poliadenilacion.
La terminologia «transfeccion» se refiere a la introduccion de un acido nucleico en una celula hospedadora.
Los «retrovirus» son virus que tienen un genoma de ARN.
«Lentivirus» se refiere a un genero de retrovirus que son capaces de infectar las celulas en division y las que no
55 estan dividiendose. Varios ejemplos de lentivirus incluyen el VIH (virus de la inmunodeficiencia humana: que incluye el VIH de tipo 1 y el VIH de tipo 2), que es el agente etiologico del sindrome de inmunodeficiencia adquirida de los humanos (sida); el visna-maedi, que provoca la encefalitis (visna) o la neumonia (maedi) en las ovejas; el virus de la artritis-encefalitis caprina, que provoca inmunodeficiencia, artritis y encefalopatia en las cabras; el virus de la anemia infecciosa equina, que provoca anemia hemolitica autoinmunitaria y encefalopatia en los caballos; el virus de la inmunodeficiencia felina (VIF), que provoca inmunodeficiencia en los gatos: el virus de la inmunodeficiencia bovina
5 (VIB), que provoca linfadenopatia, linfocitosis y posiblemente infeccion del sistema nervioso central en el ganado; y el virus de la inmunodeficiencia del simio (VIS), que provoca inmunodeficiencia y encefalopatia en los primates subhumanos.
Un genoma lentivirico esta organizado generalmente en una repeticion terminal larga (LTR, por su nombre en ingles) en 5', el gen gag, el gen pol, el gen env, los genes accesorios (neft vift vprt vpu) y una LTR en 3'. La LTR virica se 10 divide en tres regiones denominadas U3, R y U5. La region U3 contiene los elementos potenciador y promotor. La region U5 contiene las sefales de poliadenilacion. La region R (repeticion) separa las regiones U3 y U5 y las secuencias transcritas de la region R aparecen en ambos extremos 5' y 3' del ARN virico. Vease, por ejemplo, «RNA viruses: A practical approach» (Alan J. Cann, Ed. Oxford University Press, (2000)), O. Narayan y Clements J. Gen. Virology 70: 1617-1639 (1989), Fields et al. Fundamental Virologyt Raven Press (1990), Miyoshi H., Blomer U.,
15 Takahashi M., Gage F. H., Verma I. M. J. Virol. 72(10): 8150-7 (1998) y patente de los EE.UU. n.D 6.013.516.
«Gammarretrovirus» se refiere al genero de la familia Retroviridae. Los gammarretrovirus de ejemplo incluyen, pero sin limitarse a ellos, el virus de las celulas madre de raton, el virus de la leucemia murina, el virus de la leucemia felina, el virus del sarcoma felino y los virus de la reticuloendoteliosis aviar.
Un «virus hibrido» tal y como se utiliza en la presente memoria se refiere a un virus que tiene componentes de uno o
20 varios vectores viricos diferentes, entre ellos, elemento de vectores no retroviricos, por ejemplo, hibridos adenovirico-retrovirico. Tal y como se utiliza en la presente memoria, los vectores hibridos que tienen un componente retrovirico se deben considerar dentro del alcance de los retrovirus.
«Virion», «particula virica» y «particula retrovirica» se utilizan en la presente memoria para referirse a un (nico virus que comprende un genoma de ARN, proteinas procedentes del gen polt proteinas procedentes del gen gag y una
25 bicapa lipidica que muestra una (gluco)proteina de la envoltura. El genoma de ARN suele ser un genoma de ARN recombinante y, asi pues, puede contener una secuencia de ARN que es exogena al genoma virico nativo. El genoma de ARN tambien puede comprender una secuencia virica endogena defectuosa.
Un retrovirus «seudotipificado» es una particula retrovirica que tiene una proteina de envoltura que procede de un virus diferente al virus del cual procede el genoma de ARN. La proteina de envoltura puede ser, por ejemplo y sin 30 limitacion, de un retrovirus diferente o de un origen no retrovirico. La proteina de la envoltura puede ser una proteina de la envoltura en estado nativo o una proteina de envoltura que esta modificada, mutada o alterada geneticamente tal y como se describe en la presente memoria. En algunas realizaciones, una proteina de envoltura es una glucoproteina virica especifica de DC-SIGN que procede de una glucoproteina de uno de los siguientes: virus de Sindbis, virus de la gripe, virus de la fiebre de Lassa, virus de la encefalitis transmitida por garrapatas, virus del
35 dengue, virus de la hepatitis B, virus de la rabia, virus de la selva de Semliki, virus del rio Ross, virus de Aura, virus de la enfermedad de Borna, virus de Hantaan y coronavirus del SARS.
«Transformacion», tal y como se define en la presente memoria, describe un proceso mediante el cual el ADN exogeno entra en una celula diana. La transformacion puede realizarse mediante cualquier metodo conocido para la insercion de secuencias foraneas de acido nucleico en una celula hospedadora procariota o eucariota y puede incluir,
40 pero sin limitarse a ellos, infeccion virica, electroporacion, choque termico, lipofeccion y bombardeo de particulas. Las celulas «transformadas» incluyen celulas transformadas de forma estable en las cuales el acido nucleico insertado es capaz de replicarse, bien como un plasmido de replicacion autonoma, o bien como parte del cromosoma del hospedador. Tambien se incluyen las celulas que expresan un gen de interes de forma transitoria.
Una «molecula para fusion», tal y como se describe en la presente memoria, es cualquier molecula que puede
45 desencadenar la fusion de las membranas cuando esta presente en la superficie de un virus y permite que el n(cleo de un virus atraviese la membrana y, tipicamente, entre en el citosol de una celula diana. Las moleculas para fusion pueden ser, por ejemplo, glucoproteinas viricas. Las glucoproteinas viricas de ejemplo contempladas como moleculas para fusion incluyen, pero sin limitarse a ellas, hemaglutinina, hemaglutinina mutante, SIN, y glucoproteinas viricas de los virus siguientes: virus de Sindbis, virus de la gripe, virus de la fiebre de Lassa, virus de
50 la encefalitis transmitida por garrapatas, virus del dengue, virus de la hepatitis B, virus de la rabia, virus de la selva de Semliki, virus del rio Ross, virus de Aura, virus de la enfermedad de Borna, virus de Hantaan y coronavirus del SARS. Las glucoproteinas pueden ser nativas o estar modificadas para que tengan la actividad deseada.
Con «transgen» se hace referencia a cualquier secuencia nucleotidica, en particular una secuencia de ADN, que esta integrada en uno o varios cromosomas de una celula hospedadora por intervencion humana, tal como mediante
55 los metodos de la presente invencion. El transgen comprende preferiblemente un «gen de interes».
Un «gen de interes» no esta limitado de ning(n modo y puede ser todo acido nucleico, sin limitacion, que se desee administrar, integrar, transcribir, traducir y/o expresar en una celula diana. El gen de interes puede codificar un producto funcional, tal como una proteina o una molecula de ARN. Preferiblemente, el gen de interes codifica una proteina u otra molecula cuya expresion se desea que se produzca en la celula diana. El gen de interes esta unido operativamente, por lo general, a otras secuencias que son (tiles para obtener la expresion deseada del gen de
5 interes, tal como secuencias reguladoras de la transcripcion. En algunas realizaciones, un gen de interes es preferiblemente uno que codifica un antigeno contra el cual se desea estimular una respuesta inmunitaria. Otros genes de interes que se pueden utilizar en algunas realizaciones son los genes que codifican activadores y/o factores de maduracion de las celulas dendriticas.
Una «relacion funcional» y «unido operativamente» significan, con respecto al gen de interes, que el gen esta en la
10 posicion y orientacion correctas con respecto al promotor y/o potenciador, y que la expresion del gen se vera afectada cuando el promotor y/o potenciador este en contacto con las moleculas adecuadas.
Elementos o «secuencias 2A» son peptidos pequefos que se introducen como conectores entre dos proteinas, lo que permite el autoprocesamiento intrarribosomico autonomo de las poliproteinas (de Felipe. Genetic Vaccines and Ther. 2: 13 (2004); de Felipe et al. Traffic 5: 616-626 (2004)). Los peptidos pequefos permiten la coexpresion de
15 muchas proteinas desde un (nico vector, tal como la coexpresion de una molecula para fusion y de una molecula de afinidad desde el mismo vector. Asi pues, en algunas realizaciones, los polinucleotidos que codifican los elementos 2A estan incorporados en un vector entre los polinucleotidos que codifican las proteinas a expresar.
Los «factores de maduracion de las CD» (tambien conocidos como «activadores de las CD») son compuestos que pueden inducir la activacion o estimulacion de las CD de tal forma que las CD facilitan la induccion de las respuestas 20 inmunitarias humoral y celular. Se conocen en la tecnica los factores de maduracion de las CD tipicos e incluyen, pero sin limitarse a ellos, moleculas de estimulacion, citocinas, quimiocinas, anticuerpos y otros agentes tales como los ligandos Flt-3 (Figdor, C. G et al,. 2004. Nat. Med. 10: 475-480; Pulendran, B. et al., 2000. J. Immunol. 165: 566572; Maraskovsky, E. et al. 2000. Blood 96: 878-884). Los factores de maduracion de las CD de ejemplo pueden incluir, pero sin limitarse a ellos, GM-CSF, IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-15. IL-21, IL-23, TNF-a, B7.1, B7.2, 4-1BB, ligando
25 de CD40 (CD40L) y CD40 inducible por farmacos (iCD40).
Moleculas de reconocimiento selectivo
Tal y como se explico mas arriba, una molecula de reconocimiento selectivo es una glucoproteina E2 de alfavirus mutada en un sitio de fijacion del sulfato de heparano, que se incorpora en un virus recombinante para enviar selectivamente el virus hacia las celulas dendriticas que expresan la DC-SIGN.
30 En algunas realizaciones se incorpora una secuencia etiquetadora en una molecula de reconocimiento selectivo para que en las particulas viricas se pueda detectar la expresion de la molecula de reconocimiento selectivo y la presencia de la molecula de reconocimiento selectivo.
Los alfavirus, tales como el virus de la selva de Semliki (VSS), virus del rio Ross (VRR) y el virus de Aura (VA) comprenden glucoproteinas de superficie tales como E1, E2 y E3. La glucoproteina E2 procedente del virus de 35 Sindbis (SIN) es una glucoproteina no retrovirica que se fija especificamente a una molecula particular de la superficie celular (glucosaminoglucano de sulfato de heparano para E2, acido sialico para HA) y se puede utilizar para crear moleculas de reconocimiento selectivo en algunas realizaciones. Su fusion es relativamente independiente de la fijacion a las moleculas del receptor, y la activacion de la fusion se lleva a termino a traves de la acidificacion en el endosoma (Skehel y Wiley, Annu. Rev. Biochem. 69, 531-569 (2000); Smit, J. et al. J. Virol. 73,
40 8746-8484 (1999)). Ademas, puede tolerar algunas modificaciones geneticas y permanecer ensamblada con eficacia en la superficie retrovirica (Morizono et al., J. Virol. 74, 8016-8020).
El gen que codifica la molecula de reconocimiento selectivo esta clonado preferiblemente en un vector de expresion, tal como pcDNA3 (Invitrogen). Las celulas de empaquetamiento, tales como las celulas 293T, se cotransfectan entonces con el vector virico que codifica un gen de interes (que codifica tipicamente un antigeno), al menos un 45 plasmido que codifica componentes para el empaquetamiento del virus, y un vector para la expresion de la molecula de reconocimiento selectivo. Si la funcion de reconocimiento selectivo se separa de la funcion de fusion, tambien se proporcionan uno o varios vectores que codifican una molecula de afinidad y otros componentes asociados. La molecula de reconocimiento selectivo se expresa en la membrana de la celula de empaquetamiento y se incorpora en el virus recombinante. La expresion de las moleculas de reconocimiento selectivo sobre la superficie de las
50 celulas de empaquetamiento se puede analizar, por ejemplo, mediante FACS.
A partir de la informacion obtenida, por ejemplo, de estudios estructurales y de modelizacion molecular, se puede emplear la mutagenesis para generar las formas mutantes de la glucoproteina que mantienen su capacidad de fusion, pero que tienen la especificidad de fijacion y/o el nivel de fijacion deseados. Se pueden crear varios mutantes para cada glucoproteina y analizarlos con los metodos descritos mas adelante, u otros metodos conocidos en la 55 tecnica, para identificar las MF con las caracteristicas mas deseables. Por ejemplo, a las moleculas de reconocimiento selectivo se les puede analizar la capacidad para introducir antigenos especificamente en las celulas
dendriticas mediante la determinacion de su capacidad para estimular una respuesta inmunitaria sin ocasionar efectos secundarios indeseados en un mamifero. Tambien se puede comprobar directamente la capacidad de reconocimiento selectivo sobre las celulas dendriticas, por ejemplo, en los cultivos celulares tal y como se describe a continuacion.
5 Para seleccionar las moleculas de reconocimiento selectivo adecuadas (bien de tipo silvestre o mutantes), se preparan virus que portan la molecula de reconocimiento selectivo (y una molecula de afinidad cuando sea adecuado) y se les analiza su selectividad y/o su capacidad para facilitar la penetracion de la membrana de la celula diana. Los virus que muestran una glucoproteina de tipo silvestre se pueden utilizar como controles para examinar el efecto del titulo en los mutantes. Las celulas que expresan el compafero de fijacion de la molecula de
10 reconocimiento selectivo (o molecula de afinidad, cuando sea apropiado) son transducidas por el virus mediante un ensayo de infeccion estandar. Despues un tiempo determinado, por ejemplo 48 despues de la transduccion, se pueden recoger las celulas y se puede determinar el porcentaje de celulas infectadas por el virus que comprenden la molecula de reconocimiento selectivo (o molecula de afinidad y molecula para fusion) mediante, por ejemplo, FACS. La selectividad se pude puntuar calculando el porcentaje de celulas infectadas por el virus. De igual forma, el efecto
15 de las mutaciones sobre el titulo del virus se puede cuantificar dividiendo el porcentaje de celulas infectadas por el virus que comprende una molecula de reconocimiento selectivo mutante entre el porcentaje de celulas infectadas por el virus que comprende la correspondiente molecula de reconocimiento selectivo de tipo silvestre. Un mutante preferido dara la mejor combinacion de selectividad y de titulo infeccioso. Una vez que se selecciona una molecula de reconocimiento selectivo, se pueden realizar ensayos de concentracion virica para confirmar que se pueden
20 concentrar los virus envueltos por la MF. Los sobrenadantes viricos se recogen y concentran mediante ultracentrifugacion. El titulo de los virus se puede determinar mediante la dilucion limite de la solucion madre de virus y la transduccion de las celulas que expresan el compafero de fijacion de la molecula de afinidad.
En algunas realizaciones puede utilizarse la proteina para fusion BlaM-Vpr para evaluar la penetracion virica y de esta forma tambien la eficacia de una molecula para fusion (de tipo silvestre o mutante). Los virus se pueden 25 preparar, por ejemplo, mediante transfeccion transitoria de las celulas de empaquetamiento con uno o mas vectores que comprenden los elementos viricos, BlaM-Vpr, y la MF interes (y una molecula de afinidad si es apropiado). Los virus resultantes se pueden utilizar para infectar las celulas que expresan una molecula, en donde la molecula de reconocimiento selectivo (o molecula de afinidad) se fija especificamente en ausencia o presencia del inhibidor libre de fijacion (tal como un anticuerpo). A continuacion, las celulas se lavan con medio independiente de CO2 y se
30 cargan con el colorante CCF2 (Aurora Bioscience). Tras la incubacion a temperatura ambiente para permitir que se termine la reaccion de escision, las celulas se pueden fijar mediante paraformaldehido y se pueden analizar mediante FACS y microscopia. La presencia de celulas azules indica la penetracion de virus en el citoplasma; se esperarian menos celulas azules cuando se afade el anticuerpo de bloqueo.
Para investigar si la penetracion es dependiente de un pH bajo, y seleccionar moleculas de reconocimiento selectivo
35 (o moleculas para fusion) con la dependencia de pH deseada, en la etapa de infeccion se puede afadir NH4Cl u otro compuesto que altere el pH (el NH4Cl neutralizara los compartimentos acidos de los endosomas). En el caso del NH4Cl, la desaparicion de las celulas azules indicara que la penetracion de los virus es dependiente de un pH bajo.
Ademas, para confirmar que la actividad depende del pH, en el tampon de incubacion se pueden afadir agentes lisosomotropos, tales como cloruro de amonio, cloroquina, concanamicina, bafilomicina A1, monensina, nigericina,
40 etc. Estos agentes pueden elevar el pH dentro de los compartimentos endosomicos (p. ej., Drose y Altendorf, J. Exp. Biol. 200, 1-8, 1997). El efecto inhibidor de estos agentes revelara la importancia del pH para la fusion y la entrada del virus. Se pueden comparar las diferentes cineticas de entrada entre los virus que exponen diferentes moleculas para fusion y se pueden seleccionar las mas adecuadas para una aplicacion particular.
Los ensayos de entrada por PCR se pueden utilizar para seguir por transcripcion inversa y, por lo tanto, medir la
45 cinetica de la sintesis del ADN virico como una indicacion de la cinetica de la entrada del virus. Por ejemplo, las particulas viricas que comprenden una molecula de reconocimiento selectivo concreta se pueden incubar con las celulas de empaquetamiento, tales como las celulas 293T, que expresan el analogo apropiado para la molecula de reconocimiento selectivo (o una molecula de afinidad distinta en algunas realizaciones). Bien inmediatamente o bien tras la incubacion (para permitir que se produzca la infeccion), se retiran los virus sin fijar y se analizan alicuotas de
50 las celulas. A continuacion, se puede extraer el ADN de estas alicuotas y se puede realizar una PCR semicuantitativa con los cebadores especificos de las LTR. La aparicion de productos de ADN especificos de la LTR indicara el exito de la entrada del virus y no de la cubierta.
Vectores
En una realizacion preferida se utilizan uno o varios vectores para introducir secuencias polinucleotidicas en una
55 linea de celulas de empaquetamiento para preparar un virus recombinante tal y como se describe en la presente memoria. Los vectores pueden contener secuencias polinucleotidicas que codifican los diferentes componentes del virus recombinante, entre ellos la molecula de reconocimiento selectivo especifica de las CD, uno o varios genes de interes (que codifican tipicamente un antigeno) y los componentes necesarios para producir el virus que no proporciona la celula de empaquetamiento. En algunas realizaciones, los vectores que contienen las secuencias polinucleotidicas que codifican una molecula de afinidad especifica de las CD y una molecula para fusion distinta sustituyen a un vector que codifica una molecula de reconocimiento selectivo especifica de las CD en la preparacion del virus. Los vectores de expresion de las celulas eucariotas se conocen bien en la tecnica y estan disponibles de
5 una serie de fuentes comerciales.
En un aspecto de la invencion tambien se utilizan para la preparacion del virus los vectores que contienen las secuencias polinucleotidicas que codifican los factores de maduracion de las CD. Estos polinucleotidos estan tipicamente bajo el control de uno o mas elementos reguladores que dirigen la expresion de las secuencias codificantes en la celula de empaquetamiento y en la celula diana, cuando sea apropiado. Varias lineas de 10 resultados han demostrado que el exito de la vacunacion con CD depende del estado de maduracion de las CD (Banchereau J. y Palucka, A. K. Nat. Rev. Immunol. 5: 296-306 (2005); Schuler, G. et al. Curr. Opin. Immunol. 15: 138-147 (2003); Figdor, C. G. et al. Nat. Med. 10: 475-480 (2004)). La maduracion puede transformar las CD desde celulas implicadas activamente en la captura del antigeno a celulas especializadas para la sensibilizacion de los linfocitos T. En un aspecto de la invencion, el vector incluye genes que codifican las moleculas estimuladoras que
15 inducen la maduracion deseada de las CD. Tales moleculas estimuladoras tambien se denominan factores de maduracion o factores de estimulacion de la maduracion.
En algunas realizaciones, las celulas de empaquetamiento se cotransfectan con un vector virico que codifica un antigeno y uno o varios vectores mas. Por ejemplo, ademas del vector virico que codifica un antigeno, un segundo vector lleva preferiblemente un gen que codifica una molecula de reconocimiento selectivo que se fija a las celulas 20 dendriticas, tal como SVGmu, tal y como se describe en otro lugar de la solicitud. La molecula de reconocimiento selectivo codifica una glucoproteina E2 virica modificada que es especifica de la DC-SIGN. La glucoproteina virica modificada procede preferiblemente del virus de Sindbis. En algunas realizaciones, el vector virico que codifica un antigeno tambien incluye una secuencia polinucleotidica que codifica un factor de maduracion de las CD. En algunas realizaciones, la secuencia polinucleotidica que codifica un factor de maduracion de las CD esta contenida en un
25 tercer vector que esta cotransfectado con el vector virico que codifica un antigeno y uno o varios vectores mas en las celulas de empaquetamiento.
En otras realizaciones se utilizan uno o varios vectores de expresion multicistronicos que incluyen dos o mas de los elementos (p. ej., los genes viricos, el o los genes de interes, la molecula de reconocimiento selectivo, los factores de maduracion de las CD) necesarios para la produccion del virus recombinante deseado en las celulas de 30 empaquetamiento. El uso de vectores multicistronicos reduce el n(mero total de vectores requeridos y asi elude las posibles dificultades asociadas a la coordinacion de la expresion de varios vectores. En un vector multicistronico, los diferentes elementos a expresar estan operativamente unidos a uno o mas promotores (y otros elementos de control de la expresion que sean necesarios). En otras realizaciones se utiliza un vector multicistronico que comprende un gen de interes, un gen indicador y elementos viricos. El gen de interes codifica un antigeno y, opcionalmente, un
35 factor de maduracion de las CD. Tal vector se puede contransfectar, por ejemplo, junto con un vector que codifica una molecula de reconocimiento selectivo o, en algunas realizaciones, un vector multicistronico que codifica tanto una MF como una molecula de afinidad. En algunas realizaciones, el vector multicistronico comprende un gen que codifica un antigeno, un gen que codifica un factor de maduracion de las CD y elementos viricos.
Cada componente a expresar en un vector de expresion multicistronico puede estar separado, por ejemplo,
40 mediante un elemento IRES o un elemento 2A virico, para permitir la expresion independiente de las diferentes proteinas a partir del mismo promotor. Los elementos IRES y los elementos 2A se conocen en la tecnica (patente de los EE.UU. n.D 4.937.190; de Felipe et al. 2004. Traffic 5: 616-626). En una realizacion, los oligonucleotidos que codifican las secuencias del sitio de escision (RAKR) de la furina (Fang et al. 2005. Nat. Biotech. 23: 584-590), unido a secuencias de tipo 2A del virus de enfermedades de pies y boca (VEPB), virus A de la rinitis equina (VARE) y virus
45 de Thosea asigna (TaV) (Szymczak et al. 2004. Nat. Biotechnol. 22: 589-594) se utilizan para separar los elementos geneticos en un vector multicistronico. La eficacia de un vector multicistronico determinado para el uso a la hora de sintetizar el virus recombinante deseado se puede analizar facilmente mediante la deteccion de la expresion de cada uno de los genes con los protocolos estandares.
La generacion del o de los vectores puede llevarse a cabo con cualquier tecnica adecuada de ingenieria genetica
50 conocida en la tecnica, entre ellas, pero sin limitarse a ellas, las tecnicas estandares de digestion con endonucleasas de restriccion, ligacion, transformacion, purificacion de plasmidos y secuenciacion del ADN, por ejemplo como se describe en Sambrook et al., (1989. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press,
N. Y.), Coffin et al. (Retroviruses. Col Spring Harbor Laboratory Press, N. Y. (1997)) y «RNA Viruses: A Practical Approach» (Alan J. Cann, Ed., Oxford University Press, (2000)).
55 El vector o vectores pueden incorporar secuencias del genoma de cualquier organismo conocido. Las secuencias pueden incorporarse en su forma nativa o pueden estar modificadas de alg(n modo. Por ejemplo, las secuencias pueden comprender inserciones, deleciones o sustituciones.
En la tecnica se conocen los elementos de control de la expresion que pueden utilizarse para regular la expresion de los componentes e incluyen, pero sin limitarse a ellos, promotores inducibles, promotores constitutivos, sefales de secrecion, potenciadores y otros elementos reguladores.
En una realizacion, un vector puede incluir un replicon procariota, a saber, una secuencia de ADN que tiene la capacidad de dirigir la replicacion autonoma y el mantenimiento de la molecula de ADN recombinante de forma
5 extracromosomica en una celula hospedadora procariota, tal como una celula hospedadora bacteriana, transformada con este. Tales replicones se conocen bien en la tecnica. Ademas, los vectores que incluyen un replicon procariota pueden incluir tambien un gen cuya expresion confiere un marcador detectable tal como una resistencia a farmaco. Los genes bacterianos tipicos de resistencia a farmacos son los que confieren resistencia a la ampicilina o a la tetraciclina.
10 El vector o vectores pueden incluir uno mas genes de marcadores de seleccion que son eficaces en una celula eucariota, tal como un gen de un marcador de seleccion de resistencia a farmaco. Este gen codifica un factor necesario para la supervivencia o crecimiento de las celulas hospedadoras transformadas que crecen en un medio de cultivo selectivo. Las celulas hospedadoras que no estan transformadas con el vector que contiene el gen de seleccion no sobreviviran en el medio de cultivo. Los genes de seleccion tipicos codifican proteinas que confieren
15 resistencia a antibioticos o a otras toxinas, p. ej., ampicilina, neomicina, metotrexato o tetraciclina, complementan deficiencias auxotrofas, o suministran nutrientes criticos retirados del medio. El marcador de seleccion puede opcionalmente estar presente en un plasmido distinto e introducirse mediante cotransfeccion.
Los vectores contendran normalmente un promotor que es reconocido por la celula de empaquetamiento y que esta unido operativamente al polinucleotido o polinucleotidos que codifican la molecula de reconocimiento selectivo, 20 componentes viricos y similares. Un promotor es un elemento de control de la expresion formado por una secuencia de acido nucleico que permite que se de la fijacion de la ARN polimerasa y la transcripcion. Los promotores son secuencias sin traducir que se localizan secuencia arriba (5') del codon de inicio de un gen estructural (por lo general a menos de unos 100 a 1000 pb) y controlan la transcripcion y la traduccion de la secuencia polinucleotidica especifica del antigeno a la cual estan unidos operativamente. Los promotores pueden ser inducibles o constitutivos. 25 La actividad de los promotores inducibles es inducida por la presencia o ausencia de factores bioticos o abioticos. Los promotores inducibles pueden ser una herramienta (til en la ingenieria genetica porque la expresion de los genes a los cuales estan operativamente unidos se puede encender o apagar en determinadas etapas del desarrollo de un organismo o en un tejido concreto. Los promotores inducibles se pueden agrupar como promotores regulados quimicamente y promotores regulados fisicamente. Los promotores regulados quimicamente tipicos incluyen, pero 30 sin limitarse a ellos, promotores regulados por alcohol (p. ej., el promotor del gen de la alcohol deshidrogenasa I (alcA)), promotores regulados por la tetraciclina (p. ej., el promotor que responde a la tetraciclina), promotor regulado por esteroides (p. ej., promotor basado en el receptor de glucocorticoides (RG) de rata, promotor basado en el receptor de estrogenos (RE) humano, promotor basado en el receptor de la ecdisona de polilla, y los promotores basados en la superfamilia de receptores de esteroides/retinoides/hormonas tiroideas), promotores regulados por 35 metales (p. ej., promotores basados en el gen de la metalotioneina) y promotores relacionados con la patogenia (p. ej., promotores basados en la proteina relacionada con patogenos (RP) del maiz y de Arabidopsis). Los promotores tipicos entre los regulados fisicamente incluyen, pero sin limitarse a ellos, los promotores regulados por la temperatura (p. ej., promotores del choque termico) y los promotores regulados por la luz (p. ej., promotor SSU de la soja). Otros promotores de ejemplo se describen en otros textos, por ejemplo, en el protocolo de transferencia de
40 hipertexto://www.patentlens.net/daisy/promoters/768/271.html.
El experto en la tecnica sera capaz de seleccionar un promotor adecuado basandose en las circunstancias especificas. Se conocen bien en la tecnica muchos promotores diferentes, al igual que lo son los metodos para unir operativamente el promotor al gen a expresar. Para dirigir la expresion en la celula de empaquetamiento y en la celula diana se pueden utilizar tanto las secuencias promotoras nativas como muchos promotores heterologos. Sin
45 embargo, se prefieren los promotores heterologos, ya que suelen permitir una mayor transcripcion y dan un mayor rendimiento de la proteina deseada en comparacion con el promotor nativo.
El promotor se puede obtener, por ejemplo, del genoma de muchos virus tal como el virus del polioma, virus de la difteroviruela aviar, adenovirus, virus del papiloma bovino, virus del sarcoma aviar, citomegalovirus, un retrovirus, virus de la hepatitis B y virus 40 de los simios (SV40). El promotor puede ser tambien, por ejemplo, un promotor
50 heterologo de mamifero, p. ej., el promotor de la actina o un promotor de inmunoglobulina, un promotor del choque termico, o el promotor que suele estar asociado a la secuencia nativa, siempre y cuando tales promotores sean compatibles con la celula diana. En una realizacion, el promotor es el promotor virico que aparece de forma natural en un sistema de expresion virico. En algunas realizaciones, el promotor es un promotor especifico de las celulas dendriticas. El promotor especifico de las celulas dendriticas puede ser, por ejemplo, el promotor de CD11c.
55 La transcripcion se puede incrementar mediante la introduccion de una secuencia potenciadora en el vector o vectores. Los potenciadores son tipicamente elementos de ADN que act(an en cis, normalmente de aproximadamente 10 a 300 pb de longitud, que act(an sobre un promotor para incrementar su transcripcion. En la actualidad se conocen muchas secuencias potenciadoras de genes de mamiferos (globina, elastasa, alb(mina, afetoproteina e insulina). Preferiblemente se utilizara un potenciador de un virus de celula eucariota. Los ejemplos incluyen el potenciador de SV40 de la parte tardia del origen de replicacion (pb 100-270), el potenciador del promotor temprano del citomegalovirus, el potenciador del polioma en la parte tardia del origen de replicacion y potenciadores de adenovirus. El potenciador se puede empalmar en el vector en la posicion 5' o 3' de la secuencia
5 polinucleotidica especifica del antigeno, pero preferiblemente se localiza en el sitio 5' del promotor.
Los vectores de expresion contendran tambien las secuencias necesarias para la terminacion de la transcripcion y para estabilizar el ARNm. Estas secuencias a menudo se encuentran en las regiones sin traducir en 5' y, de vez en cuando, en 3' de los ADN o los ADNc viricos o eucariotas, y se conocen bien en la tecnica.
Los vectores plasmidicos que contienen uno o mas de los componentes descritos mas arriba se construyen 10 facilmente mediante las tecnicas estandares bien conocidas en la tecnica.
Para el analisis de confirmacion de que las secuencias en los plasmidos construidos son correctas, el plasmido se puede replicar en E. coli, purificar y analizar mediante digestion con endonucleasas de restriccion, y/o secuenciar mediante los metodos convencionales.
Tambien se pueden utilizar los vectores que proporcionan la expresion transitoria en las celulas de mamifero. La
15 expresion transitoria implica el uso de un vector de expresion que es capaz de replicarse con eficacia en una celula hospedadora, de tal forma que la celula hospedadora acumula muchas copias del vector de expresion y, a su vez, sintetiza una gran cantidad del polipeptido codificado por el polinucleotido especifico del antigeno en el vector de expresion. Vease Sambrook et al., vease mas arriba, pags. 16.17-16.22.
Se conocen bien en la tecnica otros vectores y metodos adecuados para la adaptacion a la expresion de los 20 polipeptidos viricos y resulta facil adaptarlos a las circunstancias especificas.
Mediante las ensefanzas dadas a conocer en la presente memoria, el experto en la tecnica reconocera que la eficacia de un sistema de expresion concreto se puede analizar mediante la transformacion de las celulas de empaquetamiento con un vector que comprende un gen que codifica una proteina indicadora y mediante la medicion de la expresion con una tecnica adecuada, por ejemplo, medir la fluorescencia de un conjugado con la proteina
25 fluorescente verde. Se conocen bien en la tecnica los genes indicadores adecuados.
La transformacion de las celulas de empaquetamiento con vectores de la presente invencion se lleva a cabo mediante metodos bien conocidos, y el metodo a utilizar no esta limitado de ninguna manera. Se conocen en la tecnica una serie de sistemas no viricos de introduccion, entre ellos, por ejemplo, electroporacion, sistemas de introduccion basados en lipidos que incluyen liposomas, introduccion de ADN «desnudo» e introduccion con 30 compuestos de policiclodextrina, tales como los descritos en Schatzlein A. G. (2001. «Non-viral vectors in cancer gene therapy: principles and progresses». Anticancer Drugs). Los metodos de tratamiento con sales o lipidos cationicos se emplean tipicamente, vease, por ejemplo, Graham et al. (1973. Virol. 52: 456); Wigler et al. (1979. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76. 1373-76). Se prefiere el metodo de precipitacion con fosfato del calcio. Sin embargo, tambien pueden utilizarse otros metodos para introducir el vector en las celulas, entre ellos la microinyeccion nuclear
35 y la fusion de protoplastos bacterianos.
Vector virico y celulas de empaquetamiento
Uno de los vectores codifica el n(cleo virico (el «vector virico»). Hay un gran n(mero de vectores viricos disponibles que son adecuados para el uso con la invencion, entre ellos los identificados para aplicaciones de genoterapia humana, tal como los descritos por Pfeifer y Verma (Pfeifer, A. y I. M. Verma. 2001. Annu. Rev. Genomics. Hum. 40 Genet. 2: 177-211). Los vectores viricos adecuados incluyen los vectores basados en virus de ARN, tales como vectores procedentes de retrovirus, p. ej, vectores procedentes del virus de la leucemia murina de Moloney (VLMM), e incluyen vectores mas complejos procedentes del retrovirus, p. ej, vectores procedentes de lentivirus. Los vectores procedentes del virus de inmunodeficiencia humana (VIH-1) pertenecen a esta categoria. Otros ejemplos incluyen vectores de lentivirus procedentes del VIH-2, virus de la inmunodeficiencia felina (VIF), virus de la anemia infecciosa
45 equina, virus de la inmunodeficiencia de los simios (VIS) y virus de maedi/visna.
El vector virico comprende preferiblemente uno o varios genes que codifican componentes del virus recombinante, asi como uno o mas genes de interes, tal como, por ejemplo, un antigeno y/o un factor de maduracion de las CD. El vector virico tambien puede comprender elementos geneticos que facilitan la expresion del gen de interes en una celula diana, tal como secuencias promotoras y potenciadoras. Para prevenir la replicacion en la celula diana, los
50 genes viricos endogenos requeridos para la replicacion se pueden retirar y proporcionarlos por separado a la linea celular de empaquetamiento.
En una realizacion preferida, el vector virico comprende una LTR retrovirica intacta en 5' y una LTR en 3' que se
puede autoinactivar.
Cualquier metodo conocido en la tecnica se puede utilizar para producir particulas retroviricas infecciosas cuyo genoma comprende una copia de ARN del vector virico. Para este fin, el vector virico (junto con otros vectores que codifican el gen de interes, la molecula de reconocimiento selectivo especifica de las CD, etc.) se introduce preferiblemente en una linea celular de empaquetamiento que empaqueta el ARN genomico virico basandose en el vector virico contenido en las particulas viricas.
5 La linea celular de empaquetamiento proporciona las proteinas viricas que se necesitan en trans para el empaquetamiento del ARN genomico del virus en las particulas viricas. La linea celular de empaquetamiento puede ser cualquier linea celular que es capaz de expresar proteinas retroviricas. Las lineas celulares de empaquetamiento preferidas incluyen 293 (ATCC CCL X), HeLa (ATCC CCL 2), D17 (ATCC CCL 183), MDCK (ATCC CCL 34), BHK (ATCC CCL-10) y Cf2Th (ATCC CRL 1430). La linea celular de empaquetamiento expresa de forma estable las
10 proteinas viricas necesarias. Tal linea celular de empaquetamiento se describe, por ejemplo, en la patente de los EE.UU. n.D 6.218.181. Alternativamente, una linea celular de empaquetamiento se puede transfectar transitoriamente con plasmidos que comprenden un acido nucleico que codifica una o varias proteinas viricas necesarias, entre ellas la molecula de reconocimiento selectivo especifica de las CD (o, alternativamente, una molecula con afinidad especifica por las CD y molecula para fusion) junto a los vectores viricos que codifican el gen
15 de interes, que tipicamente codifica un antigeno y puede adicionalmente codificar un factor de maduracion de las CD.
Se recogen las particulas viricas que comprenden un polinucleotido con el gen de interes y una molecula de reconocimiento selectivo que es especifica de las celulas dendriticas y se deja que infecten la celula diana. En algunas realizaciones preferidas, la seudotipia del virus ha conseguido darle especificidad por la celula diana. Los metodos para la seudotipia se conocen bien en la tecnica y tambien se describen en la tecnica.
20 En una realizacion, el virus recombinante utilizado para introducir el gen de interes es un lentivirus modificado y el vector virico se basa en un lentivirus. Como los lentivirus son capaces de infectar tanto las celulas que se dividen como las que no se dividen, en esta realizacion no es necesario que las celulas diana esten dividiendose (ni estimular a las celulas diana para que se dividan).
La construccion virica comprende secuencias de un genoma de lentivirus, tal como el genoma del VIH o el genoma
25 del VIS. La construccion virica comprende preferiblemente secuencias de las LTR en 5' y 3' de un lentivirus. Mas preferiblemente, la construccion virica comprende las secuencias R y U5 de la LTR en 5' de un lentivirus y una LTR en 3' de un lentivirus que esta inactivada o que es capaz de autoinactivarse. Las secuencias LTR pueden ser las secuencias de LTR de cualquier lentivirus de cualquier especie. Por ejemplo, pueden ser las secuencias LTR del VIH, VIS, VIF o VIB. Preferiblemente, las secuencias LTR son las secuencias LTR del VIH.
30 La construccion virica comprende preferiblemente una LTR en 3' que esta inactivada o que puede autoinactivarse. La LTR en 3' se puede autoinactivar mediante cualquier metodo conocido en la tecnica. En la realizacion preferida, el elemento U3 de la LTR en 3' contiene una delecion de su secuencia potenciadora, preferiblemente la caja TATA, y los sitios de Spl y NF-KB. Como resultado de la LTR en 3' que se puede inactivar, el provirus que se integra en el genoma de la celula hospedadora comprendera una LTR en 5' inactivada.
35 Opcionalmente, la secuencia de U3 de la LTR en 5' lentivirica se puede reemplazar con una secuencia del promotor en la construccion virica. Esto puede incrementar el titulo del virus recuperado de la linea celular de empaquetamiento. Tambien puede incluirse una secuencia potenciadora. Se puede utilizar cualquier combinacion de potenciador/promotor que incrementa la expresion del ARN genomico del virus en la linea celular de empaquetamiento. En una realizacion preferida, se utiliza la secuencia potenciadora/promotora del CMV.
40 En algunas realizaciones preferidas, la construccion virica comprende secuencias de un genoma de gammarretrovirus, tal como el genoma del virus de celulas madre de raton (VCMR) o el genoma del virus de la leucemia murina (VLM). La construccion virica comprende preferiblemente secuencias de las LTR en 5' y 3' de un gammarretrovirus. Las secuencias LTR pueden ser las secuencias LTR de cualquier gammarretrovirus de cualquier especie. Por ejemplo, pueden ser las secuencias LTR del virus de las celulas madre de raton (VCMR), del virus de la
45 leucemia murina (VLM), del virus de la leucemia felina (VLF), del virus del sarcoma felino (VSF) y del virus de la reticuloendoteliosis aviar (VRA). Preferiblemente, las secuencias LTR son las secuencias LTR del VCMR y del VLM.
En algunas realizaciones, la construccion virica comprende preferiblemente una LTR en 3' inactivada o que se puede autoinactivar. La LTR en 3' se puede volver autoinactivable mediante cualquier metodo conocido en la tecnica. En la realizacion preferida, el elemento U3 de la LTR en 3' contiene una delecion de su secuencia potenciadora,
50 preferiblemente de la caja TATA, y de los sitios de Spl y NF-KB. Como resultado de la autoinactivacion de la LTR en 3', el provirus que esta integrado en el genoma de la celula hospedadora comprendera una LTR en 5' inactivada.
Opcionalmente, la secuencia de U3 de la LTR en 5' gammarretrovirica se puede reemplazar con una secuencia promotora en la construccion virica. Esto puede incrementar el titulo del virus recuperado de la linea celular de empaquetamiento. Tambien se puede incluir una secuencia potenciadora. Se puede utilizar cualquier combinacion
55 de potenciador/promotor que incremente la expresion del ARN genomico del virus en la linea celular de empaquetamiento. En una realizacion preferida se utiliza la secuencia del potenciador/promotor del CMV.
La construccion virica comprende un gen que codifica un antigeno que se expresa deseablemente en una o varias celulas diana. Preferiblemente, el gen de interes se ubica entre la secuencia de la LTR en 5' y de la LTR en 3'. Ademas, el gen de interes esta preferiblemente en una relacion funcional con otros elementos geneticos, por ejemplo, secuencias reguladoras de la transcripcion tales como promotores y/o potenciadores, para regular la
5 expresion del gen de interes de una manera concreta una vez que el gen esta incorporado en la celula diana. En algunas realizaciones, las secuencias (tiles reguladoras de la transcripcion son las que estan muy reguladas con respecto a la actividad, tanto temporal como espacialmente.
En algunas realizaciones, el gen de interes se encuentra en una relacion funcional con las secuencias reguladoras promotoras/potenciadoras internas. Un promotor/potenciador «interno» es uno que esta localizado entre las
10 secuencias de la LTR en 5' y de la LTR en 3' en la construccion virica y esta unido operativamente al gen que se desea expresar.
El promotor/potenciador interno puede ser cualquier promotor, potenciador o combinacion de promotor/potenciador conocido por incrementar la expresion de un gen con el cual esta en una relacion funcional. Una «relacion funcional» y «unido operativamente» significan, sin limitacion, que el gen esta en una localizacion y orientacion correctas con
15 respecto al promotor y/o potenciador, en donde la expresion del gen resultara afectada cuando el promotor y/o potenciador se ponga en en contacto con las moleculas adecuadas.
El promotor/potenciador interno se selecciona preferiblemente basandose en el patron de expresion deseado del gen de interes y las propiedades especificas de los promotores/potenciadores conocidos. Asi pues, el promotor interno puede ser un promotor constitutivo. Los ejemplos no limitantes de promotores constitutivos que se pueden
20 utilizar incluyen el promotor de la ubicuitina, CMV (Karasuyama et al. 1989. J. Exp. Med. 169: 13), -actina (Gunning et al. 1989. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 4831-4835) y pgk (vease, por ejemplo, Adra et al, 1987, Gene. 60: 65-74; Singer-Sam et al. 1984. Gene. 32: 409-417; y Dobson et al. 1982. Nucleic Acids Res. 10: 2635-2637).
Alternativamente, el promotor puede ser un promotor especifico de tejido. En algunas realizaciones preferidas, el promotor es un promotor especifico de la celula diana. Por ejemplo, el promotor puede ser el promotor CD11c 25 especifico de las celulas dendriticas (Masood R. et al. 2001. Int. J. Mol. Med. 8: 335-343; Somia, N. V. et al. 1995. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 92: 7570-7574). Ademas, los promotores se pueden seleccionar para permitir la expresion inducible del gen. En la tecnica se conocen una serie de sistemas para la expresion inducible, que incluyen el sistema que responde a la tetraciclina y el sistema represor-operador de lac. Tambien se contempla que pueda utilizarse una combinacion de promotores para obtener la expresion deseada del gen de interes. El experto
30 en la tecnica sera capaz de seleccionar un promotor basandose en el patron de expresion deseado del gen en el organismo y/o en la celula diana de interes.
En algunas realizaciones, la construccion virica comprende preferiblemente al menos un promotor de la ARN polimerasa II o III. El promotor de la ARN polimerasa II o III esta unido operativamente al gen de interes y puede tambien estar unido a una secuencia de terminacion. Ademas, se pueden incorporar mas de un promotor de la ARN
35 polimerasa II o III.
Los promotores de la ARN polimerasa II y III los conoce bien el experto en la tecnica. Se pueden encontrar un abanico adecuado de promotores de la ARN polimerasa III, por ejemplo, en Paule y White, Nucleic Acids Research. Vol. 28, pags. 1283-1298 (2000). La definicion de los promotores de la ARN polimerasa II o III, respectivamente, tambien incluyen cualquier fragmento de ADN sintetico o manipulado geneticamente que puede conseguir que la 40 ARN polimerasa II o III, respectivamente, transcriba su secuencia codificante de ARN cadena abajo. Ademas, el promotor o promotores de la ARN polimerasa II o III (Pol II o III) utilizados como parte del vector virico pueden ser inducibles. Con los metodos de la invencion se puede utilizar cualquier promotor de Pol II o III inducible adecuado. Los promotores de Pol II o III particularmente adecuados incluyen los promotores que responden a la tetraciclina descritos en Ohkawa y Taira, Human Gene Therapy, vol. 11, pags. 577-585 (2000) y en Meissner et al. Nucleic
45 Acids Research, vol. 29, pags, 1672-1682 (2001).
En la construccion virica tambien puede estar presente un potenciador interno para incrementar la expresion del gen de interes. Por ejemplo, se puede utilizar el potenciador del CMV (Karasuyama et al. 1989. J. Exp. Med. 169: 13). En algunas realizaciones se puede utilizar el potenciador del CMV en combinacion con el promotor de la -actina de pollo. El experto en la tecnica sera capaz de seleccionar el potenciador apropiado basandose en el patron de
50 expresion deseado.
El polinucleotido que codifica un antigeno contra el cual se quiere estimular una respuesta inmunitaria no esta limitado de ning(n modo e incluye cualquier acido nucleico que el experto en la tecnica desee integrar, transcribir, traducir y/o expresar en la celula diana.
Ademas, en algunas realizaciones, el polinucleotido puede contener mas de un gen de interes, que pueden 55 colocarse en una relacion funcional con el promotor virico. El gen de interes puede codificar una proteina, un siRNA,
o un microRNA. En algunas realizaciones, el polinucleotido a introducir puede comprender varios genes que
codifican al menos una proteina, al menos un siRNA, al menos un microRNA o cualesquiera combinaciones de los mismos. Por ejemplo, el polinucleotido a introducir puede incluir uno o varios genes que codifican uno o varios antigenos contra los cuales se desea estimular una respuesta inmunitaria. El uno o varios antigenos pueden estar asociados a una (nica enfermedad o trastorno, o pueden estar asociados a varias enfermedades y/o trastornos. En 5 algunas realizaciones, se puede construir un gen que codifica una proteina reguladora inmunitaria con un gen primario que codifica un antigeno contra el cual se desea estimular una respuesta inmunitaria, y la combinacion puede desencadenar y regular la respuesta inmunitaria en la direccion y magnitud deseadas. En algunas realizaciones se puede construir un gen que codifica un siRNA o microRNA con un gen primario que codifica un antigeno contra el cual se desea estimular una respuesta inmunitaria, y la combinacion puede regular el alcance de 10 la respuesta inmunitaria (vease, por ejemplo, las realizaciones de los polinucleotidos de la figura 24c y de la figura 24d, con las secuencias acompafantes SEQ ID n.D 9 y SEQ ID n.D 10, respectivamente). En algunas realizaciones, un gen que codifica una proteina marcadora se puede colocar detras de un gen primario de interes para permitir la identificacion de las celulas que expresan la proteina deseada. En una realizacion, una proteina marcadora fluorescente, preferiblemente la proteina fluorescente verde (GFP), se incorpora en la construccion junto con el gen
15 de interes (que codifica tipicamente un antigeno). Si se incluye mas de un gen, tambien se incluyen preferiblemente las secuencias del sitio interno de entrada del ribosoma (IRES) o los elementos 2A, para separar el gen primario de interes de un gen indicador y/o cualquier otro gen de interes. Las IRES y las secuencias 2A pueden facilitar la expresion del gen indicador, o de otros genes.
La construccion virica tambien puede contener otros elementos geneticos. Los tipos de elementos que se pueden
20 incluir en la construccion no estan limitados de ning(n modo y los elegira el experto en la tecnica para conseguir un resultado determinado. Por ejemplo, se puede incluir una sefal que facilita la entrada del genoma viral en el n(cleo de la celula diana. Un ejemplo de tal sefal es la sefal del colgajo del VIH-1.
Ademas, se pueden incluir elementos que facilitan la caracterizacion del sitio de integracion del provirus en la celula diana. Por ejemplo, se puede incluir una secuencia del ARNt supresoror ambar en la construccion.
25 Ademas, la construccion puede contener uno o varios elementos geneticos disefados para estimular la expresion del gen de interes. Por ejemplo, se puede colocar en la construccion un elemento que responde al virus de la hepatitis de la marmota (WRE, por su nombre en ingles) (Zufferey et al. 1999. J. Virol. 74: 3668-3681; Deglon et al. 2000. Hum. Gene. Ther. 11: 179-190).
Tambien puede incluirse en la construccion virica un aislador de la -globina del pollo. Se ha demostrado que este
30 elemento reduce la posibilidad de silenciar el provirus integrado en la celula diana debido a los efectos de la metilacion y de la formacion de heterocromatina. Ademas, el aislador puede proteger al potenciador interno, al promotor interno y al gen exogeno de los efectos posicionales positivos o negativos del ADN que rodea al sitio de integracion en el cromosoma.
Cualquier otro elemento genetico se insertara preferiblemente en 3' del gen de interes.
35 En una realizacion especifica, el vector virico comprende: una secuencia del potenciador/promotor del citomegalovirus (CMV); las secuencias R y U5 de la LTR en 5' del VIH; la sefal del colgajo del VIH-1; un potenciador interno; un promotor interno; un gen de interes; el elemento que responde al virus de la hepatitis de la marmota (WRE); una secuencia del ARNt supresor ambar; un elemento U3 con una delecion de su secuencia potenciadora; el aislador de la �-globina de pollo; y las secuencias R y U5 de la LTR en 3' del VIH.
40 La construccion virica esta clonada preferiblemente en un plasmido que se puede transfectar en una linea celular de empaquetamiento. El plasmido preferido comprende preferiblemente secuencias (tiles para la replicacion del plasmido en las bacterias.
Introduccion del virus
El virus se puede introducir en una celula diana de cualquier manera que permita que el virus entre en contacto con
45 las celulas dendriticas (CD) destinatarias en las cuales se desea introducir un polinucleotido de interes. En las realizaciones preferidas se introduce directamente una cantidad adecuada del virus en un animal (in vivo), por ejemplo, mediante inyeccion en el cuerpo. En algunas realizaciones preferidas, las particulas viricas se inyectan en el torrente circulatorio periferico de un mamifero. En otras realizaciones preferidas, las particulas viricas se inyectan en un mamifero a traves de la inyeccion intradermica, inyeccion subcutanea, inyeccion en la cavidad intraperitoneal
50 o inyeccion intravenosa. El virus se puede administrar con un dispositivo de inyeccion subdermica tal como los dispositivos descritos en las patentes de los EE.UU. n.D 7.241.275, 7.115.108, 7.108.679, 7.083.599, 7.083.592, 7.047.070, 6.971.999, 6.808.506, 6.780.171, 6.776.776, 6.689.118, 6.670.349, 6.569.143, 6.494.865, 5.997.501, 5.848.991, 5.328.483, 5.279.552, 4.886.499. Otros sitios de inyeccion tambien son adecuados, tal como directamente en los organos que comprenden las celulas destinatarias. Por ejemplo, se puede utilizar la inyeccion en
55 el ganglio linfatico, la inyeccion en el bazo o la inyeccion en la medula osea para introducir el virus en el ganglio linfatico, en el bazo y en la medula osea, respectivamente. Seg(n las circunstancias concretas y la naturaleza de las celulas destinatarias, se puede llevar a cabo la introduccion por otros medios que incluyen, por ejemplo, la inhalacion
o el contacto directo con los tejidos epiteliales, por ejemplo, los del ojo, de la boca o de la piel.
En otras realizaciones se proporcionan las celulas diana y se ponen en contacto con el virus in vitro, tal como en las placas de cultivo. Las celulas diana son tipicamente celulas dendriticas obtenidas de un sujeto sano o de un sujeto 5 que necesita tratamiento. Preferiblemente, las celulas diana son celulas dendriticas obtenidas de un sujeto en quien se desea estimular una respuesta inmunitaria contra un antigeno. Los metodos para obtener celulas de un sujeto se conocen bien en la tecnica. El virus se puede suspender en los medios y afadir a los pocillos de una placa de cultivo, a un tubo o a otro contenedor. Los medios que contienen el virus se pueden afadir antes de la siembra de las celulas en la placa o despues de haber sembrado las celulas en las placas. Preferiblemente, las celulas se incuban
10 en una cantidad apropiada de los medios para proporcionar viabilidad y permitir concentraciones adecuadas del virus en los medios de tal forma que se produzca la infeccion de las celulas del hospedador.
Las celulas se incuban preferiblemente con el virus durante una cantidad de tiempo suficiente para permitir que el virus infecte las celulas. Preferiblemente, las celulas se incuban con el virus durante al menos 1 hora, mas preferiblemente al menos 5 horas e incluso mas preferiblemente al menos 10 horas.
15 En las realizaciones de introduccion in vivo e in vitro, puede utilizarse cualquier concentracion de virus que sea suficiente para infectar las celulas diana deseadas, como puede determinar facilmente el experto en la tecnica. Cuando se ha de cultivar la celula diana, la concentracion de las particulas viricas es de al menos 1 UFP/IL, mas preferiblemente al menos 10 UFP/Il, incluso mas preferiblemente al menos 400 UFP/Il e incluso mas preferiblemente al menos 1 x 104 UFP/Il.
20 En algunas realizaciones, tras la infeccion in vitro con el virus, se pueden introducir (o reintroducir) las celulas diana en un animal. En algunas realizaciones, las celulas se pueden introducir en la dermis, bajo la dermis o en el torrente circulatorio periferico. Las celulas introducidas en un animal son preferiblemente celulas procedentes de ese animal, para evitar una respuesta inmunitaria adversa. Tambien pueden utilizarse celulas que proceden de un animal donante que tiene una compatibilidad inmunitaria similar. Se pueden usar otras celulas, entre ellas las disefadas
25 para eludir una respuesta inmunogena adversa.
Se puede analizar las celulas diana, por ejemplo, para determinar si han integrado, transcrito y/o expresado el polinucleotido o gen(es) de interes, cual es el n(mero de copias del gen integrado y cual es la posicion de la integracion. Tal analisis se puede llevar a cabo en cualquier momento y se puede llevar a cabo mediante cualquier metodo conocido en la tecnica.
30 A los sujetos en los cuales se administra un virus recombinante o las CD infectadas por un virus se les puede analizar la posicion de las celulas infectadas, la expresion del polinucleotido o gen de interes introducido con el virus, la estimulacion de una respuesta inmunitaria y se les pueden vigilar los sintomas asociados a una enfermedad o trastorno mediante cualquier metodo conocido en la tecnica.
Los metodos para infectar las celulas descritos mas arriba no dependen de las caracteristicas especificas de cada
35 una de las celulas. Como resultado, se extienden facilmente a todos los mamiferos. En algunas realizaciones, el virus recombinante se introduce en un humano o en las celulas dendriticas humanas. En otras realizaciones, el virus recombinante se introduce en un raton o en las celulas dendriticas de raton. A(n en otras realizaciones, el virus recombinante se introduce en un animal que no es un humano ni un raton, o en las celulas dendriticas de un animal que no es un humano ni un raton.
40 Tal y como se explico mas arriba, el virus recombinante puede estar seudotipificado para conferirle un amplio abanico de huespedes, asi como especificidad por la celula diana. El experto en la tecnica tambien tendra presentes los promotores internos adecuados con los que se consigue la expresion deseada de un polinucleotido o gen de interes en una especie animal concreta. Asi pues, el experto en la tecnica sera capaz de modificar el metodo de infeccion de las celulas dendriticas procedentes de cualquier especie.
45 Se puede evaluar el virus recombinante para determinar la especificidad de la molecula de reconocimiento selectivo incorporada en el virus que reconoce selectivamente las celulas dendriticas. Por ejemplo, de un sujeto se puede obtener una poblacion mixta de celulas de la medula osea y cultivarla in vitro. El virus recombinante se puede administrar a la poblacion mixta de celulas de la medula osea, y en las celulas diana se puede analizar la expresion de un gen indicador incorporado en el virus. En algunas realizaciones, al menos aproximadamente el 50%, mas
50 preferiblemente al menos aproximadamente el 60%, 70%, 80% o 90%, a(n mas preferiblemente al menos aproximadamente el 95% de las celulas transducidas en la poblacion mixta de celulas son celulas dendriticas que expresan la DC-SIGN.
Tratamiento
Los metodos de la presente invencion se pueden utilizar para prevenir o tratar una amplia gama de enfermedades o trastornos, en particular aquellos para los cuales seria beneficiosa la activacion de una respuesta inmunitaria en un paciente. Muchas de estas enfermedades se conocen bien en la tecnica. Por ejemplo, las enfermedades o trastornos que se pueden tratar o prevenir con los metodos de la presente invencion incluyen, sin limitacion, canceres, enfermedades autoinmunitarias e infecciones, entre ellas infecciones viricas, bacterianas, micoticas y
5 parasitarias. En las realizaciones de la invencion, una enfermedad se trata con virus recombinantes para introducir un gen de interes en las celulas dendriticas, en donde la expresion del gen produce un antigeno especifico de la enfermedad y conduce a la estimulacion de respuestas inmunitarias celulares y respuestas inmunitarias humorales especificas del antigeno.
En las realizaciones de la invencion se utiliza un virus recombinante para introducir en celulas dendriticas
10 polinucleotidos que codifican un antigeno contra el cual se desea estimular una respuesta inmunitaria. En algunas realizaciones, la introduccion se puede conseguir poniendo en contacto in vitro las celulas dendriticas con el virus recombinante, despues de lo cual las celulas dendriticas transducidas se administran a un paciente. En algunas realizaciones, la introduccion se puede conseguir mediante la introduccion del virus en un sujeto para que entre en contacto in vivo con las celulas dendriticas. A continuacion, las celulas dendriticas estimulan los linfocitos T o los
15 linfocitos B especificos del antigeno en un paciente para inducir las respuestas inmunitarias celular y humoral contra el antigeno expresado. En tales realizaciones, un paciente que padece un trastorno o enfermedad se trata mediante la generacion de celulas inmunitarias con una especificidad deseada.
En las celulas dendriticas se puede introducir cualquier antigeno que esta asociado a una enfermedad o trastorno mediante el uso de los virus recombinantes tal y como se describe en la presente memoria. Se identifica un antigeno 20 que esta asociado a la enfermedad o trastorno para la preparacion de un virus recombinante que reconoce selectivamente las celulas dendriticas. Se conocen bien en la tecnica los antigenos asociados a muchas enfermedades y trastornos. Se puede saber con anterioridad que un antigeno esta asociado a la enfermedad o trastorno, o se puede identificar mediante cualquier metodo conocido en la tecnica. Por ejemplo, se puede saber que un antigeno esta asociado a un tipo de cancer como el que padece un paciente, tal como un antigeno asociado a un 25 tumor. En un aspecto, la invencion da a conocer un metodo para introducir in vivo genes que codifican antigenos tumorales y otras proteinas necesarias en las CD mediante lentivirus recombinantes modificados geneticamente. En otras realizaciones, en el paciente a tratar se identifica un antigeno relacionado con la enfermedad o trastorno. Por ejemplo, un antigeno asociado a un tumor puede identificarse en el propio tumor mediante cualquier metodo conocido en la tecnica. Los antigenos asociados a tumores no estan limitados de ninguna manera e incluyen, por
30 ejemplo, los antigenos que se identifican en las celulas cancerosas del paciente a tratar.
Los antigenos asociados a tumores se conocen en muchos canceres distintos, entre ellos, por ejemplo, el cancer de prostata y el cancer de mama. En algunos canceres de mama, por ejemplo, el receptor Her-2 esta sobreexpresado en la superficie de las celulas cancerosas. Los antigenos tumorales de ejemplo incluyen, pero sin limitarse a ellos: MAGE, BAGE, RAGE y NY-ESO, que son antigenos no mutados que se expresan en las regiones 35 inmunoprivilegiadas de los testiculos y en una serie de celulas tumorales; antigenos tumorales especificos de estirpe ceular, tales como los antigenos de la estirpe de melanoma-melanocitos MART-1/Melan-A, gp100, gp75, mda-7, tirosinasa y proteina relacionada con la tirosinasa, o el antigeno de membrana especifico de la prostata (PSMA, por su nombre en ingles) y antigeno especifico de la prostata (PSA, por su nombre en ingles), que son antigenos que se expresan en las celulas neoplasicas y normales procedentes del mismo tejido; proteinas/peptidos con epitopos 40 procedentes de genes mutados en las celulas tumorales o genes transcritos a diferentes niveles entre los tumores y las celulas normales, tal como ras mutado, reorganizacion bcr/abl, Her2/neu, p53 de tipo silvestre o mutado, citocromo P450 IB1, y secuencias intronicas que se expresan anormalmente, tal como Nacetilglucosaminiltransferasa-V; reorganizaciones clonales de los genes de inmunoglobulina que generan idiotipos (nicos en los mielomas y linfomas de linfocitos B; proteinas/peptidos con epitopos procedentes de procesos 45 oncoviricos, tal como las proteinas E6 y E7 del virus del papiloma humano; proteinas oncofetales sin mutar con una expresion selectiva en el tumor, tal como el antigeno carcinoembrionario y la a-fetoproteina. Se han revisado una serie de antigenos asociados a tumores (vease, por ejemplo, «Tumor-antigens recognized by T-lymphocytes», Boon T., Cerottini J. C., Vandeneynde B., Vanderbruggen P., Vanpel A,. Annual Reviewof Immunology, 12: 337-365, 1994; «A listing of human tumor antigens recognized by T cells», Renkvist N., Castelli C., Robbins P. F., Parmiani G.
50 Cancer Immunology Immunotherapy 50: (1) 3-15 marzo de 2001).
El antigeno puede ser tambien un antigeno asociado con una enfermedad infecciosa, tal como, por ejemplo,
VIH/sida. El antigeno puede ser, por ejemplo, gp120 (Klimstra, W. B. et al. 2003. J. Virol. 77: 12022-12032; Bernard,
K. A., et al. 2000. Virology 276: 93-103; Bymes, A. P et al. 1998. J. Virol. 72: 7349-7356). Otros antigenos de
ejemplo incluyen, pero sin limitarse a ellos: gag, pol, env, tat, nef y rev (Lieberman, J. et al. 1997. AIDS Res Hum 55 Retroviruses 13 (5): 383-392; Menendez-Arias, L. et al. 1998. Viral Immunol 11(4): 167-181).
Los ejemplos de antigenos viricos incluyen, pero sin limitarse a ellos, polipeptidos de adenovirus, polipeptidos de alfavirus, polipeptidos de calicivirus, p. ej., un antigeno de la capsida de calicivirus, polipeptidos de coronavirus,polipeptidos del virus del moquillo, polipeptidos del virus del Ebola, polipeptidos de enterovirus, polipeptidos de flavivirus, polipeptidos (AE) de virus de la hepatitis, p, ej., un antigeno de la superficie o del n(cleo de la hepatitis B, polipeptidos del virus del herpes, p. ej., virus del herpes simple o glucoproteina del virus de la varicela zoster, polipeptidos de virus de la inmunodeficiencia, p. ej., la envoltura o la proteasa del virus de la inmunodeficiencia humana, polipeptidos del virus de la peritonitis infecciosa, polipeptidos del virus de la gripe, p, ej., una hemaglutinina, neuraminidasa o nucleoproteina de la gripe A, polipeptidos del virus de la leucemia, polipeptidos del virus de
5 Marburg, p. ej., polipeptidos de ortomixovirus, polipeptidos del virus del papiloma, polipeptido del virus paragripal, p. ej., la hemaglutinina/neuraminidasa, polipeptidos de paramixovirus, polipeptidos de parvovirus, polipeptidos de pestivirus, polipeptidos de picornavirus, p. ej., un polipeptido de la capsida del virus de la polio, polipeptidos del virus de la viruela, p. ej., polipeptido del virus de la variolovacuna, polipeptidos del virus de la rabia, p. ej., glucoproteina G del virus de la rabia, polipeptidos de reovirus, polipeptidos de retrovirus y polipeptidos de rotavirus.
10 Ejemplos de antigenos bacterianos incluyen, pero sin limitarse a ellos, polipeptidos de Actinomyces, polipeptidos de Bacillus, polipeptidos de Bacterioides, polipeptidos de Bordetella, polipeptidos de Bartonella, polipeptidos de Borrelia,
p. ej. OspA de B. bugdorferi, polipeptidos de Brucella, polipeptidos de Campylobacter, polipeptidos de Capnocytophaga, polipeptidos de Chlamydia, polipeptidos de Clostridium, polipeptidos de Corynebacterium, polipeptidos de Coxiella, polipeptidos de Dermatophilus, polipeptidos de Enterococcus, polipeptidos de Ehrlichia, 15 polipeptidos de Escherichia, polipeptidos de Francisella, polipeptidos de Fusobacterium, polipeptidos de Haemobartonella, polipeptidos de Haemophilus, p. ej., proteina de la membrana externa de tipo b de H. influenzae, polipeptidos de Helicobacter, polipeptidos de Klebsiella, polipeptidos de bacterias con forma de L, polipeptidos de Leptospira, polipeptidos de Listeria, polipeptidos de Mycobacteria, polipeptidos de Mycoplasma, polipeptidos de Neisseria, polipeptidos de Neorickettsia, polipeptidos de Nocardia, polipeptidos de Pasteurella, polipeptidos de
20 Peptococcus, polipeptidos de Peptostreptococcus, polipeptidos de Pneumococcus, polipeptidos de Proteus, polipeptidos de Pseudomonas, polipeptidos de Rickettsia, polipeptidos de Rochalimaea, polipeptidos de Salmonella, polipeptidos de Shigella, polipeptidos de Staphylococcus, polipeptidos de Streptococcus, p. ej., proteinas M de S. pyogenes, polipeptidos de Treponema y polipeptidos de Yersinia, p. ej., antigenos F1 y V de Y. pestis.
Ejemplos de antigenos de hongos incluyen, pero sin limitarse a ellos, polipeptidos de Absidia, polipeptidos de
25 Acremonium, polipeptidos de Alternaria, polipeptidos de Aspergillus, polipeptidos de Basidiobolus, polipeptidos de Bipolaris, polipeptidos de Blastomyces, polipeptidos de Candida, polipeptidos de Coccidioides, polipeptidos de Conidiobolus, polipeptidos de Cryptococcus, polipeptidos de Curvalaria, polipeptidos de Epidermophyton, polipeptidos de Exophiala, polipeptidos de Geotrichum, polipeptidos de Histoplasma, polipeptidos de Madurella, polipeptidos de Malassezia, polipeptidos de Microsporum, polipeptidos de Moniliella, polipeptidos de Mortierella,
30 polipeptidos de Mucor, polipeptidos de Paecilomyces, polipeptidos de Penicillium, polipeptidos de Phialemonium, polipeptidos de Phialophora, polipeptidos de Prototheca, polipeptidos de Pseudallescheria, polipeptidos de Pseudomicrodochium, polipeptidos de Pythium, polipeptidos de Rhinosporidium, polipeptidos de Rhizopus, polipeptidos de Scolecobasidium, polipeptidos de Sporothrix, polipeptidos de Stemphylium, polipeptidos de Trichophyton, polipeptidos de Trichosporon y polipeptidos de Xylohypha.
35 Ejemplos de antigenos de parasitos protozoarios incluyen, pero sin limitarse a ellos, polipeptidos de Babesia, polipeptidos de Balantidium, polipeptidos de Besnoitia, polipeptidos de Cryptosporidium, polipeptidos de Eimeria, polipeptidos de Encephalitozoon, polipeptidos de Entamoeba, polipeptidos de Giardia, polipeptidos de Hammondia, polipeptidos de Hepatozoon, polipeptidos de Isospora, polipeptidos de Leishmania, polipeptidos de Microsporidia, polipeptidos de Neospora, polipeptidos de Nosema, polipeptidos de Pentatrichomonas, polipeptidos de Plasmodium,
40 p. ej., circunesporozoito de P, falciparum (PfCSP), proteina 2 de la superficie de esporozoito (PfSSP2), extremo del carboxilo del antigeno 1 del estado del higado (PfLSA1 c-term) y proteina 1 exportada (PfExp-1), polipeptidos de Pneumocystis, polipeptidos de Sarcocystis, polipeptidos de Schistosoma, polipeptidos de Theileria, polipeptidos de Toxoplasma y polipeptidos de Trypanosoma.
Ejemplos de antigenos de parasitos helminticos incluyen, pero sin limitarse a ellos, polipeptidos de
45 Acanthocheilonema, polipeptidos de Aelurostrongylus, polipeptidos de Ancylostoma, polipeptidos de Angiostrongylus, polipeptidos de Ascaris, polipeptidos de Brugia, polipeptidos de Bunostomum, polipeptidos de Capillaria, polipeptidos de Chabertia, polipeptidos de Cooperia, polipeptidos de Crenosoma, polipeptidos de Dictyocaulus, polipeptidos de Dioctophyme, polipeptidos de Dipetalonema, polipeptidos de Diphyllobothrium, polipeptidos de Diplydium, polipeptidos de Dirofilaria, polipeptidos de Dracunculus, polipeptidos de Enterobius, polipeptidos de Filaroides,
50 polipeptidos de Haemonchus, polipeptidos de Lagochilascaris, polipeptidos de Loa, polipeptidos de Mansonella, polipeptidos de Muellerius, polipeptidos de Nanophyetus, polipeptidos de Necator, polipeptidos de Nematodirus, polipeptidos de Oesophagostomum, polipeptidos de Onchocerca, polipeptidos de Opisthorchis, polipeptidos de Ostertagia, polipeptidos de Parafilaria, polipeptidos de Paragonimus, polipeptidos de Parascaris, polipeptidos de Physaloptera, polipeptidos de Protostrongylus, polipeptidos de Setaria, polipeptidos de Spirocerca, polipeptidos de
55 Spirometra, polipeptidos de Stephanofilaria, polipeptidos de Strongyloides, polipeptidos de Strongylus, polipeptidos de Thelazia, polipeptidos de Toxascaris, polipeptidos de Toxocara, polipeptidos de Trichinella, polipeptidos de Trichostrongylus, polipeptidos de Trichuris, polipeptidos de Uncinaria y polipeptidos de Wuchereria.
Ejemplos de antigenos de ectoparasitarios incluyen, pero sin limitarse a ellos, polipeptidos (entre ellos los antigenos
protectores asi como los alergenos) de pulgas; garrapatas, entre ellas garrapatas duras y garrapatas blandas; moscas, tales como mosquitos pequefos, mosquitos zancudos, mosquito transmisor de la leishmaniosis, moscas negras, tabanos, moscas de los cuernos, tabanos, moscas tse-tse, moscas mordedoras, moscas que provocan miasis y insectos chupadores; hormigas; arafas; piojos; acaros; y chinches, tales como las de la cama y las chupasangre.
5 Una vez que se ha identificado y/o seleccionado un antigeno, se identifica un polinucleotido que codifica el antigeno deseado. Preferiblemente, el polinucleotido comprende un ADNc. Los polinucleotidos que codifican el antigeno se introducen preferiblemente en las celulas dendriticas diana mediante un virus recombinante, mas preferiblemente un lentivirus o gammarretrovirus recombinante, que incluye una molecula de reconocimiento selectivo que se fija a la DC-SIGN como se describe mas arriba. El virus recombinante se fija primero a la membrana de las celulas
10 dendriticas por medio de la molecula de reconocimiento selectivo de la DC-SIGN, y el n(cleo virico que contiene un polinucleotido que codifica el antigeno pasa posteriormente al citosol. El polinucleotido (p. ej., uno que codifica el antigeno) a continuacion se integra preferiblemente en el genoma de la celula y se expresa. Si se pone en contacto ex vivo, las celulas dendriticas diana se devuelven luego al paciente, por ejemplo mediante inyeccion, en donde interaccionan con las celulas inmunitarias que son capaces de generar una respuesta inmunitaria contra el antigeno
15 deseado. En las realizaciones preferidas, el virus recombinante se inyecta en el paciente y se transduce en las celulas dendriticas diana in situ. A continuacion, las celulas dendriticas expresan el antigeno concreto asociado a una enfermedad o trastorno a tratar, y el paciente es capaz de montar una respuesta inmunitaria eficaz contra la enfermedad o trastorno.
En algunas realizaciones, el virus recombinante contiene una secuencia polinucleotidica que codifica mas de un
20 antigeno, y tras la transduccion de una celula dendritica diana, genera respuestas inmunitarias contra la multitud de antigenos introducidos en la celula. En algunas realizaciones, los antigenos estan relacionados con una (nica enfermedad o trastorno. En otras realizaciones, los antigenos estan relacionados con varias enfermedades o trastornos.
En las realizaciones de la invencion, los factores de maduracion de las CD que activan y/o estimulan la maduracion
25 de las CD se introducen junto con el virus recombinante que lleva el polinucleotido o gen de interes. En algunas realizaciones, las CD se activan mediante la introduccion de los factores de maduracion de las CD antes de la introduccion del virus. En algunas realizaciones, las CD se activan mediante la introduccion de los factores de maduracion de las CD tras la introduccion del virus. En algunas realizaciones, las CD se activan mediante la introduccion de los factores de maduracion de las CD a la vez que se introduce el virus. En algunas realizaciones,
30 los factores de maduracion de las CD se proporcionan junto con la administracion del virus. En otras realizaciones, los factores de maduracion de las CD se proporcionan de forma independiente a la administracion del virus.
En algunas realizaciones, uno o mas factores de maduracion de las CD pueden estar codificados por uno o mas genes que estan contenidos en el virus y que se expresan despues de que el virus se transduce en una celula dendritica. En algunas realizaciones, el uno o los varios genes que codifican los factores de maduracion de las CD
35 se pueden incluir en un vector virico que codifica un antigeno. En otras realizaciones, el gen o los varios genes que codifican los factores de maduracion de las CD se pueden proporcionar en un vector distinto que se cotransfecta con el vector virico que codifica uno o varios antigenos en una linea celular de empaquetamiento.
En algunas realizaciones, los metodos de la presente invencion se pueden utilizar para la inmunoterapia adoptiva en un paciente. Tal y como se describe mas arriba, se identifica un antigeno contra el cual se desea estimular una
40 respuesta inmunitaria. Se obtiene un polinucleotido que codifica el antigeno deseado y se empaqueta en un virus recombinante. Las celulas dendriticas diana se obtienen del paciente y se transducen con un virus recombinante que contiene un polinucleotido que codifica el antigeno deseado. A continuacion, las celulas dendriticas se transfieren de vuelta al paciente.
Vacunacion
45 Tal y como se explica mas arriba, para el uso en la produccion de un virus recombinante que introduce un gen que codifica un antigeno en las CD, se contemplan distintas moleculas de reconocimiento selectivo manipuladas geneticamente que se fijan al marcador de superficie de las celulas dendriticas DC-SIGN. El virus puede utilizarse para transducir las CD in vitro o in vivo para la prevencion de una enfermedad o trastorno. Por ejemplo, la glucoproteina de la envoltura del virus de Sindbis puede manipularse geneticamente para que se fije preferiblemente
50 a la DC-SIGN y puede utilizarse para la seudotipia de un virus recombinante. Un gen que codifica un antigeno contra el cual se desea estimular una respuesta inmunitaria, tal como contra el cancer (por ejemplo, Mart-1) u otra enfermedad/trastorno (tal como una infeccion virica), puede introducirse en las CD mediante los metodos descritos en la presente memoria. En algunas realizaciones se pueden introducir en las CD varios genes que codifican varios antigenos mediante los metodos descritos en la presente memoria, mediante el uso de varios vectores viricos o,
55 preferiblemente, un sistema de vector multicistronico. El uno o varios genes para el uno o varios antigenos puede estar acompafado por los genes que codifican moleculas estimuladoras (tales como GM-CSF, IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-15, IL-21, IL-23, TNF-a, B7.1, B7.2, 4-1BB, ligando de CD40 (CD40L), CD40 inducible por farmacos (iCD40) y similares) y/o una molecula indicadora (tal como GFP, luciferasa y similares) mediante varios vectores o, preferiblemente, un sistema de vector multicistronico.
En algunas realizaciones de la invencion, las CD humanas se generan obteniendo progenitores hematopoyeticos humanos CD34a+ y utilizando un metodo de cultivo in vitro como el descrito en otro documento (p. ej., Banchereau et al. Cell 106, 271-274 (2001)). Los virus que llevan una molecula de reconocimiento selectivo que se fija a la DC
5 SIGN se sintetizan comprendiendo un gen que codifica un antigeno contra el cual se desea estimular una respuesta inmunitaria y se utilizan para transducir las CD humanas. La especificidad y eficacia de la transduccion se pueden cuantificar por FACS. La maduracion de las CD puede caracterizarse mediante el analisis por FACS de la induccion de marcadores de superficie tal como el CMH II.
En otras realizaciones, el virus puede inyectarse in vivo, donde entra en contacto con las CD naturales e introduce
10 un polinucleotido de interes, tipicamente un gen que codifica un antigeno. La cantidad de particulas viricas es de al menos 50 x 106 UT, y puede ser de al menos 1 x 107 UT, al menos 2 x 107 UT, al menos 3 x 107 UT, al menos 4 x 107 UT o al menos 5 x 107 UT. A determinados intervalos, las CD de los organos linfaticos del destinatario se pueden utilizar para medir la expresion, por ejemplo, mediante la observacion de la expresion de marcadores, tal como la GFP o la luciferasa. Los linfocitos T de los ganglios linfaticos y del bazo de los pacientes tratados con el virus se
15 pueden medir a partir de la magnitud y durabilidad de la respuesta a la estimulacion del antigeno. En las celulas del tejido que no son las CD, tal como las celulas epiteliales y las celulas linfociticas, se puede analizar la especificidad de la introduccion genica in vivo.
Hay amplio acuerdo en que el metodo posiblemente mas eficaz para acabar con la epidemia del sida (u otras enfermedades viricas) es una vacuna. Hasta la fecha, ning(n metodo de vacunacion contra el VIH ha pasado con 20 exito un estudio de fase III. Asi pues, hay una necesidad urgente de nuevas y eficaces estrategias de vacunacion. En algunas realizaciones de la invencion se utiliza la vacunacion con las CD. Se clona un gen que codifica una proteina virica, tal como las descritas mas arriba, en un vector virico. Los pacientes se infectan con virus que comprenden una molecula de reconocimiento selectivo que se fija a la DC-SIGN en las CD, preferiblemente con una especificidad tal que se eluden los efectos secundarios indeseados. La molecula de reconocimiento selectivo puede 25 ser, por ejemplo, una glucoproteina de la envoltura del virus de Sindbis manipulada geneticamente, y la administracion del virus puede llevarse a cabo, por ejemplo, mediante inyeccion. En un modelo animal, los virus indicadores del VIH clonados molecularmente (NFNSZ-r-HSAS, NL-r-HSAS) y los aislados clinicos se pueden utilizar para sensibilizar a los animales mediante una inyeccion en la vena de la cola. Que la infeccion ha tenido lugar se puede seguir en el tiempo en los esplenocitos, en los ganglios linfaticos y en la sangre periferica. La PCR de la
30 proteina HIV-gag y el FACS de HAS en los virus indicadores se pueden utilizar para comprobar la integracion y replicacion viricas. La vacunacion productiva con CD in situ puede incrementar la resistencia a una prueba de provocacion con el VIH. Veanse los ejemplos 17-20.
En algunas realizaciones, se dan a conocer las celulas dendriticas transducidas con un virus recombinante tal y como se describe en la presente memoria para la prevencion o el tratamiento de una enfermedad o trastorno. En las 35 realizaciones preferidas, las celulas dendriticas expresan un antigeno contra el cual se desea estimular una respuesta inmunitaria. El antigeno es tipicamente uno que normalmente no se expresa en una celula dendritica, sino que se expresa despues de que la celula diana se haya transducido con el virus recombinante que contiene un polinucleotido que codifica el antigeno. En algunas realizaciones, las celulas dendriticas expresan ademas un factor de maduracion de las CD que se proporciona a la celula dendritica mediante un virus recombinante tal y como se
40 describe en la presente memoria.
En algunos aspectos de la invencion, se administra un adyuvante junto con un virus recombinante de la invencion. El adyuvante se puede administrar con el virus recombinante, antes del virus recombinante o despues del virus recombinante.
Se pueden utilizar una gama de adyuvantes en combinacion con el virus recombinante de la invencion para
45 desencadenar una respuesta inmunitaria contra el antigeno codificado por el virus recombinante. Los adyuvantes preferidos aumentan la respuesta intrinseca a un antigeno sin ocasionar cambios conformacionales en el antigeno que afectan a la forma cualitativa de la respuesta. Los adyuvantes preferidos incluyen alumbre, lipido A monofosforilado y 3-des-O-acilado (MPL, por su nombre en ingles) (vease la patente del Reino Unido GB 2220211). El QS21 es un glucosido triterpenico o saponina aislado de la corteza del arbol �uilla�a saponaria Molina encontrado
50 en America del Sur (vease Kensil et al., en Vaccine Design: The subunit and ad�uvant approach (eds. Powell & Newman, Plenum Press, NY, 1995); patente de los EE.UU. n.D 5.057.540). Otros adyuvantes son emulsiones de aceite en agua (tal como escualeno o aceite de cacahuete), opcionalmente en combinacion con estimulantes inmunitarios, tal como el lipido A monofosforilado (vease Stoute et al., N. Engl. J. Med. 336, 86-91 (1997)). Otro adyuvante es CpG (Bioworld Today, 15 de noviembre de 1998). Otra posibilidad seria conjugar A a un adyuvante.
55 Por ejemplo, una version lipopeptidica de A� se puede preparar conjugando acido palmitico u otros lipidos directamente al extremo amino de A� como se describe para la vacunacion del antigeno de la hepatitis B (Livingston,
J. Immunol, 159, 1383-1392 (1997)). No obstante, tal conjugacion no debe cambiar sustancialmente la conformacion de A� de modo que no se afectara la naturaleza de la respuesta inmunitaria contra este. Los adyuvantes se pueden administrar como un componente de una composicion terapeutica con un agente activo o se pueden administrar por separado, antes, a la vez o despues de la administracion del agente terapeutico.
Una clase preferida de adyuvantes son las sales de aluminio (alumbre), tal como el hidroxido de aluminio, fosfato de aluminio, sulfato de aluminio. Tales adyuvantes pueden utilizarse con o sin otros agentes inmunoestimuladores 5 especificos, tales como MPL o 3-DMP, QS21, aminoacidos polimericos o monomericos, tal como acido poliglutamico
o polilisina. Otra clase de adyuvantes son las formulaciones de emulsiones de aceite en agua. Tales adyuvantes se pueden usar con o sin otros agentes inmunoestimuladores especificos tales como peptidos de muramilo (p. ej., Nacetilmuramil-L-treonil-D-isoglutamina (thr-MDP), N-acetil-normuramil-L-alanil-D-isoglutamina (nor-MDP), Nacetimuramil-L-alanil-D-isoglutaminil-L-alanina-2-(1'-2'-dipalmitoil-sn-glicero-3-hidroxifosforiloxi)-etilamina (MTP-PE), 10 N-acetilglucosaminil-N-acetilmuramil-L-Al-D-isoglu-L-Ala-diplamitoxi-propilamida (DTP-DPP) teramidaTM), u otros componentes de la pared de las celulas bacterianas. Las emulsiones de aceite en agua incluyen (a) MF59 (patente internacional WO 90/14837), que contiene escualeno al 5%, Tween 80 al 0,5% y Span 85 al 0,5% (que contiene opcionalmente distintas cantidades de MTP-PE) formuladas en particulas de rango submicrometrico mediante un microfluidificador tal como el microfluidificador de modelo 110Y (Microfluidics, Newton MA), (b) SAF, que contiene 15 escualeno al 10%, Tween 80 al 0,4%, polimero L121 bloqueado con pluronico al 5% y thr-MDP, bien microfluidificado en una emulsion de rango submicrometrico o agitado vorticialmente para generar una emulsion con un tamafo de particulas mas grande, y (c) sistema adyuvante RibiTM (RAS), (Ribi Immunochem, Hamilton, MT) que contiene escualeno al 2%, Tween 80 al 0,2% y uno o varios componentes de la pared celular bacteriana del grupo que consiste en lipido A monofosforilado (MPL, por su nombre el ingles), dimicolato de trehalosa (TDM, por su 20 nombre en ingles) y esqueleto de la pared celular (CWS, por su nombre en ingles), preferiblemente MPL + EPC (DetoxTM). Otra clase de adyuvantes preferidos son los adyuvantes de saponina, tal como StimulonTM (QS21, Aquila, Worcester, MA) o las particulas generadas de estos, tal como ISCOM (complejos inmunoestimuladores) e ISCOMATRIX. Otros adyuvantes incluyen adyuvante completo de Freund (ACF) y adyuvante incompleto de Freund (AIF). Otros adyuvantes incluyen citocinas, tales como interleucinas (IL-1, IL-2 e IL-12), factor estimulador de las
25 colonias de macrofagos (M-CSF, por su nombre en ingles), factor de la necrosis tumoral (TNF, por su nombre en ingles).
Se puede administrar un adyuvante con el virus recombinante de la invencion como una (nica composicion, o se puede administrar antes, a la vez o despues de la administracion del virus recombinante de la invencion. El inmunogeno y el adyuvante se pueden envasar y suministrar en el mismo vial o se pueden envasar en viales 30 distintos y mezclarlos antes de su uso. El inmunogeno y el adyuvante se envasan tipicamente con una etiqueta que indica la aplicacion terapeutica para la que se han disefado. Si el inmunogeno y el adyuvante se envasan por separado, el envase incluye tipicamente las instrucciones para el mezclado antes de su uso. La eleccion de un adyuvante y/o vehiculo depende de la estabilidad de la vacuna cuando contiene el adyuvante, la via de administracion, la pauta posologica, la eficacia del adyuvante para las especies que hay que vacunar y, en los 35 humanos, un adyuvante farmaceuticamente aceptable es uno que se ha autorizado o que se puede autorizar para la administracion humana por las autoridades reguladoras pertinentes. Por ejemplo, el adyuvante completo de Freund no es adecuado para la administracion a los humanos. Se prefieren alumbre, MPL y QS21. Opcionalmente, se pueden utilizar simultaneamente dos o mas adyuvantes diferentes. Las combinaciones preferidas incluyen alumbre con MPL, alumbre con QS21, MPL con QS21, y alumbre, QS21 y MPL juntos. De igual forma, se puede utilizar el
40 adyuvante incompleto de Freund (Chang et al., Advanced Drug Delivery Reviews 32, 173-186 (1998)), opcionalmente en combinacion con cualquiera de alumbre, QS21 y MPL y todas las combinaciones de los mismos.
Composiciones farmaceuticas y kits
Tambien se contemplan en la presente memoria las composiciones farmaceuticas y kits que contienen un virus recombinante dado a conocer en la presente memoria y uno o mas componentes. Las composiciones farmaceuticas
45 pueden incluir un virus recombinante dado a conocer en la presente memoria y un vehiculo farmaceutico. Los kits pueden incluir las composiciones farmaceuticas y/o las combinaciones dadas a conocer en la presente memoria, y uno o mas componentes, tal como las instrucciones de uso, un dispositivo para administrar un compuesto a un sujeto y un dispositivo para administrar un compuesto a un sujeto.
En la presente memoria se dan a conocer las composiciones farmaceuticas que contienen un virus dado a conocer
50 en la presente memoria y un vehiculo farmaceutico adecuado. Las composiciones farmaceuticas dadas a conocer en la presente memoria pueden estar en varias formas, p. ej., en forma de solido, liquido, polvo, acuosa o liofilizada. En la tecnica se conocen ejemplos de vehiculos farmaceuticos adecuados. Tales vehiculos y/o aditivos se pueden formular mediante los metodos convencionales y se puede administrar al sujeto en una dosis adecuada. Los estabilizantes tales como lipidos, inhibidores de nucleasas, polimeros y quelantes pueden preservar las
55 composiciones de la degradacion cuando estan dentro del cuerpo.
Los virus recombinantes dados a conocer en la presente memoria se pueden envasar como kits. Los kits pueden incluir opcionalmente uno o varios componentes tal como las instrucciones de uso, dispositivos y otros reactivos, y componentes, tales como tubos, recipientes y jeringuillas para la practica de los metodos. Los kits de ejemplo incluyen los virus dados a conocer en la presente memoria y pueden incluir opcionalmente las instrucciones de uso, un dispositivo para detectar un virus en un sujeto, un dispositivo para administrar el virus a un sujeto y un dispositivo para administrar un compuesto a un sujeto.
En la presente memoria tambien se contemplan los kits que comprenden polinucleotidos que codifican un gen de
5 interes (tipicamente un antigeno). En algunas realizaciones, el kit incluye al menos un plasmido que codifica componentes de empaquetamiento del virus y un vector que codifica una molecula de reconocimiento selectivo que esta manipulada geneticamente para que se fije a celulas dendriticas, preferiblemente con especificidad. En algunas realizaciones, el kit incluye al menos un plasmido que codifica componentes de empaquetamiento del virus, un vector que codifica una molecula de reconocimiento selectivo que esta manipulada geneticamente para que se fije a
10 las celulas dendriticas y un vector que codifica al menos un factor de maduracion de las CD.
Tambien se contemplan en la presente memoria los kits que comprenden un vector virico que codifica un gen de interes (tipicamente un antigeno) y, opcionalmente, una secuencia polinucleotidica que codifica un factor de maduracion de las CD. En algunas realizaciones, el kit incluye al menos un plasmido que codifica componentes de empaquetamiento del virus y un vector que codifica una molecula de reconocimiento selectivo que esta manipulada
15 geneticamente para que se fije a las celulas dendriticas.
En un ejemplo, un kit puede contener instrucciones. Las instrucciones incluyen tipicamente una expresion tangible que describe el virus y, opcionalmente, otros componentes incluidos en el kit, y los metodos para la administracion, que incluyen los metodos para determinar el estado correcto del paciente, la cantidad de dosis correcta y el metodo de administracion correcto, para administrar el virus. Las instrucciones pueden tambien incluir la guia para el
20 seguimiento del sujeto a lo largo de la duracion del tratamiento.
Los kits dados a conocer en la presente memoria tambien pueden incluir un dispositivo para administrar un virus a un paciente. Se puede incluir en los kits dados a conocer en la presente memoria cualquiera entre una gama de dispositivos conocidos en la tecnica que sirven para administrar medicacion o vacunas. Los dispositivos de ejemplo incluyen, pero sin limitarse a ellos, una aguja hipodermica, una aguja intravenosa, un cateter, un dispositivo de
25 inyeccion sin aguja, un inhalador y un dispensador liquido, tal como un cuentagotas. Tipicamente, el dispositivo del kit para administrar un virus sera compatible con el virus del kit; por ejemplo, un dispositivo de inyeccion sin aguja tal como un dispositivo de inyeccion de alta presion puede estar incluido en los kits con virus que no resultan dafados por la inyeccion a alta presion, pero tipicamente no estara incluido en los kits con virus que resultan dafados por la inyeccion a alta presion.
30 Los kits dados a conocer en la presente memoria tambien pueden incluir un dispositivo para administrar a un sujeto un compuesto, tal como un activador o estimulador de las CD. En los kits dados a conocer en la presente memoria se pueden incluir cualquiera de una gama de dispositivos conocidos en la tecnica para administrar farmacos a un sujeto. Los dispositivos de ejemplo incluyen una aguja hipodermica, una aguja intravenosa, un cateter, un dispositivo de inyeccion sin aguja, pero no se limitan a ellos, una aguja hipodermica, una aguja intravenosa, un cateter, un
35 dispositivo de inyeccion sin aguja, un inhalador y un dispensador liquidos tal como un cuentagotas. Tipicamente, el dispositivo para administrar el compuesto del kit sera compatible con el metodo de administracion del compuesto que se desea.
Los ejemplos siguientes se ofrecen solo a efectos ilustrativos, y no pretenden limitar el alcance de la presente invencion de ning(n modo. De hecho, a partir de la descripcion que viene a continuacion, a los expertos en la
40 tecnica les resultaran evidentes una serie de modificaciones de la invencion, ademas de las mostradas y descritas en la presente memoria, y que caen dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas.
Ejemplos
Ejemplo 1
Manipulacion genetica de una molecula de reconocimiento selectivo especifica de las CD
45 Los vectores lentiviricos se pueden manipular geneticamente de forma racional para hacerlos capaces de transducirse en las CD de una manera especifica de celula. Algunos grupos de CD llevan en la superficie la proteina DC-SIGN (Geijtenbeek, T. B., et al. 2000; Geijtenbeek, T. B., et al., 2000, vease mas arriba), un receptor de tipo lectina C capaz de fijarse y endocitar rapidamente los materiales (Geijtenbeek, T. B., et al. 2004, vease mas arriba), que puede utilizarse en las CD a modo de receptor diana. El virus de Sindbis (VS) -un miembro del genero
50 Alphavirus y de la familia Togaviridae- es capaz de infectar las CD a traves de la DC-SIGN (Klimstra, W. B., et al. 2003. J. Virol. 77: 12022-12032). Sin embargo, el receptor virico canonico para la cepa de laboratorio del VS es el sulfato de heparano (SH) de la superficie celular, que expresan muchos tipos de celulas (Strauss, J. H., et al. 1994. Arch. Virol. 9: 473-484; Byrnes, A. P. y D. E. Griffin. 1998. J. Virol. 72: 7349-7356). Aprocehando que los dos sitios de fijacion al receptor estan separados en la glucoproteina de la envoltura del VS (de aqui en adelante se
55 denominara SVG por su nombre en ingles), se manipulo geneticamente el receptor para que no se fijara a su diana de fijacion canonica SH y quedase intacta su capacidad para interaccionar con la DC-SIGN (figura 1). Una vez que se incorpora en una superficie virica, esta glucoproteina mutante puede intervenir en la infeccion de las CD, pero no en la de otras celulas.
El ADNc para la SVG de tipo silvestre se obtuvo del laboratorio del Dr. J. H. Strauss en el Instituto de Tecnologia de
5 California y se clono en el vector pcDNA3 (Invitrogen) por PCR para generar el plasmido pSVG. Una etiqueta con diez restos (MYPYDVPDYA) se introdujo en la proteina E2 entre los aminoacidos 71 y 74 mediante mutagenesis por PCR para romper el sitio de fijacion al SH (Karavans, G., et al. 1998. Crit. Rev. Oncol. Hemat. 28: 7-30; Lavillete, D., et al. 2001. Curr. Opin. Biotech. 12: 461-466; Russell, S. J., y F. L. Cosset. 1999. J. Gene Med 1: 300-311; Sandrin, V., et al. 2003. Curr Top Microbiol 281: 137-178; Verhoeyen, E. y F. L. Cosset. 2004. J. Gene Med 6: S83-S94). Un
10 anticuerpo disponible contra la secuencia de etiqueta insertada proporciono la capacidad de seguimiento de la expresion de la SVG modificada. Para disminuir mas la infeccion especifica del SH, se identificaron varios restos criticos que estaban implicados en la fijacion a las moleculas de SH (Coffin, J. M., et al. 1997. Retroviruses. Nueva York: Cold Spring Harbor Laboratory Press; Battini, J. L., et al. 1998. J. Virol 72: 428-435; Valsesiawittmann, S., et al. 1994. J Virol 68: 4609-4619; Wu, B. W., et al. 2000. Virology 269: 7-17; Cosset, F. L. et al. 1995. J. Virol. 69: 6314
15 6322; Kayman, S. C., et al. 1999. J. Virol 73: 1802-1808; Lorimar, I. A. J. y S. J. Lavictoire. 2000. J. Immunol Methods 237: 147-157; Barnett, A. L. et al. 2001. Proc. Nat Acad Sci USA 98: 4113-4118; Benedict, C. A. et al. 2002. Hum Gene Ther 10: 545-557; Gollan, T. J. y M. R. Green. 2002. J. Virol. 76: 3558-3563). Dos de tales restos se mutaron en alaninas (157KE158 a 157AA158).
Se introdujo una delecion adicional en la glucoproteina E3 de la SVG para retirar los aminoacidos 61-64. Esta SVG
20 modificada se denomino SVGmu (SEQ ID n.D 11). El ADNc de la SVGmu se clono cadena abajo del promotor del CMV en el vector pcDNA3 (denominado pSVGmu, SEQ ID n.D 3).
Ejemplo 2
Preparacion de virus recombinantes que contienen la molecula de reconocimiento selectivo especifica de las CD
La preparacion del lentivirus recombinante seudotipificado con SVGmu se llevo a cabo mediante transfeccion 25 transitoria estandar mediada por fosfato de calcio de las celulas 293T con el vector lentivirico FUGW (SEQ ID n.D 1)
o con sus derivados, en donde las construcciones empaquetadas codifican los genes gag, pol y rev, y pSVGmu (ejemplo 1). FUGW es un vector lentivirico que se puede autoinactivar que lleva el promotor de la ubicuitina C humana para impulsar la expresion de un gen indicador, la GFP (Lois, C. et al. 2002. Science. 295: 868-872). Los vectores lentiviricos de transferencia (FUGW y sus derivados) utilizados en estos estudios son vectores lentiviricos
30 basados en el VIH de tercera generacion, en los cuales se ha eliminado la mayor parte de la region U3 de la LTR en 3', lo que da lugar a la capacidad de autoinactivacion de la LTR en 3' (SIN, por su nombre en ingles).
Para la transfeccion transitoria de las celulas 293T, las celulas 293T cultivadas en placas de cultivo de tejidos de 6 cm (Corning o BD Biosciences) se transfectaron con el plasmido del vector de transferencia lentivirico adecuado (5 1g) junto con 2,5 1g cada uno de los plasmidos de envoltura (SVG, SVGmu, Eco o VSVG) y los plasmidos de
35 empaquetamiento (pMDLg/pRRE y pRSV-Rev). Los sobrenadantes viricos se recogieron 48 y 72 horas tras la transfeccion y se filtraron por un filtro de 0,45 1m (Corning). Para preparar vectores viricos concentrados para el estudio in vivo, se ultracentrifugaron los sobrenadantes viricos (ultracentrifuga preparativa Optima L-80 K, Beckman Coulter) a 50.000 x g durante 90 min. A continuacion, los sedimentos se resuspendieron en un volumen apropiado de PBS frio.
40 Los virus resultantes pseudotipificados con SVGmu se denominaran de aqui en adelante FUGW/SVGmu. Los virus de control envueltos con la glucoproteina SVG de tipo silvestre se denominaran de aqui en adelante FUGW/SVG.
Ejemplo 3
Adquisicion de imagenes confocales de los virus recombinantes empaquetados
Se produjeron lentivectores marcados con GFP-vpr tal y como se describio en el ejemplo 2, excepto que se utilizo el
45 lentivector FUW (que no contiene el gen indicador de GFP) y que se uso un plasmido distinto que codifica la GFPvpr (2,5 1g). El sobrenadante virico recien preparado se deposito sobre cubreobjetos de vidrio recubiertos con polilisina en una placa de cultivo de 6 pocillos y se centrifugo a 3700 x g a 4 DC durante 2 horas en una centrifuga Sorvall Legend RT. Los cubreobjetos de vidrio se enjuagaron con PBS frio dos veces y se inmunotiferon con un anticuerpo anti-HA-biotina (Miltenyi Biotec) y Cy5-estrepatividina (Invitrogen). Se tomaron imagenes fluorescentes
50 mediante un microscopio confocal de barrido con laser Zeiss LSM 510 equipado con conjuntos de filtros para fluoresceina y Cy5. Se utilizo un objetivo apocromatico plano de inmersion en aceite (63x/1,4) para la adquisicion de las imagenes.
La figura 2 muestra los resultados de la adquisicion de imagenes confocales del virus recombinante producido por el protocolo (la barra de escala representa 2 1m). Las particulas del portaobjetos «GFP» se tifen de verde, las particulas del portaobjetos «SVGmu» se tifen de rojo y las particulas del portaobjetos «Combinacion» se tifen de verde si (nicamente se expresa la GFP, de rojo si (nicamente se expresa la SVGmu y de amarillo/amarilloanaranjado si se expresan la GFP y la SVGmu. Mas del 90% de las particulas marcadas con GFP contenian SVGmu. Asi pues, la produccion de las particulas lentiviricas que muestran SVGmu se confirmo mediante la
5 adquisicion de imagenes confocales.
Ejemplo 4
Preparacion de lineas celulares con DC-SIGN
Para facilitar el estudio de la transduccion de reconocimiento selectivo, se construyeron lineas celulares con DC-SIGN que expresan la DC-SIGN humana (de aqui en adelante se denominara 293T.hDCSIGN) y la DC-SIGN murina 10 (de aqui en adelante se denominara 293T.mDCSIGN). Las lineas celulares 293T.hDCSIGN y 293T.mDCSIGN se generaron mediante la transduccion estable de las celulas 293T parentales con un lentivector seudotipificado con VSVG. Los ADNc para la DC-SIGN humana y la DC-SIGN murina se amplificaron a partir de los plasmidos pUNOhDCSIGN1Aa y pUNO-mDCSIGN (InvivoGene) y se clonaron cadena abajo del promotor de la ubicuitina C humana en el plasmido lentivirico FUW para generar el FUW-hDCSIGN (SEQ ID n.D 5) y el FUW-mDCSIGN (SEQ ID n.D 6),
15 respectivamente. A continuacion se realizo la seudotipia de los lentivectores con VSVG y se utilizaron para transducir las celulas 293T. Las celulas resultantes se sometieron a tincion con anticuerpos (anticuerpo contra la DC-SIGN humana de BD Biosciences y contra la DC-SIGN murina de eBioscience) y a clasificacion celular para producir una poblacion uniforme de lineas celulares DC-SIGN+ 293T.hDCSIGN y mDC-SIGN+ 293T.mDCSIGN.
La citometria de flujo mostro que la DC-SIGN se expresaba en practicamente todas las celulas 293T.hDCSIGN y
20 293T.mDCSIGN de las lineas celulares (figura 3A). En cada diagrama, las lineas continuas (region sin rellenar) representan la expresion de DC-SIGN en las lineas celulares 293T.hDCSIGN, y la region sombreada representa la tincion de fondo de las celulas 293T sin transducir.
Ejemplo 5
Evaluacion del virus recombinante especifico de DC-SIGN mediante la transduccion de las lineas celulares con DC25 SIGN
Para valorar la eficacia y la especificidad de la transduccion con FUGW/SVG o FUGW/SVGmu (ejemplo 2), los virus se usaron para transducir las lineas celulares 293T.hDCSIGN y 293T.mDCSIGN (ejemplo 4). La eficacia de la transduccion se midio mediante la expresion de GFP dentro de las lineas celulares.
Las celulas diana (celulas 293T.hDCSIGN, 293T.mDCSIGN o 293T; 0,2 x 106 por pocillo) se inocularon en una placa
30 de cultivo de 24 pocillos (Corning o BD Biosciences) y se infectaron por centrifugacion con sobrenadantes viricos (1 ml por pocillo) a 2500 rpm y 30 DC durante 90 min utilizando una centrifuga Sorvall Legend. Posteriormente, los sobrenadantes se reemplazaron con un medio de cultivo nuevo y se incubaron durante 3 dias a 37 DC con CO2 al 5%. El porcentaje de celulas GFP+ se midio por citometria de flujo. El titulo de la transduccion se determino mediante el margen de dilucion que mostro una respuesta lineal.
35 La citometria de flujo demostro que el FUGW/SVG (que contiene la glucoproteina de envoltura SVG de tipo silvestre) tenia una eficacia de transduccion similar (transduccion del 11�16%) en las tres lineas celulares destinatarias (293T, 293T.hDCSIGN y 293T.mDCSIGN) (figura 3B). Esto indica que esa SVG tenia una amplia especificidad y la presencia de DC-SIGN en la superficie celular no alteraba notablemente la capacidad de transduccion de un vector lentivirico seudotipificado con SVG. En cambio, el vector FUGW/SVGmu (que contiene la glucoproteina SVG
40 mutante de la envoltura) podria transducir especificamente las celulas 293T.hDCSIGN y 293T.mDCSIGN con una eficacia de transduccion del 42% y el 34%, respectivamente, pero no las celulas 293T (figura 3B). Estos resultados demuestran que un vector lentivirico seudotipificado que presenta la SVGmu en su superficie puede transducir especificamente las celulas que expresan tanto la DC-SIGN humana como la murina. Ademas, la SVG mutante proporciono una transduccion mas eficaz de las celulas que expresaban la DC-SIGN que la SVG de tipo silvestre.
45 La integracion estable del vector lentivirico FUGW en las celulas transducidas se confirmo mediante analisis por PCR de la integracion genomica del gen indicador GFP. Para demostrar que la transduccion especifica se debia a la DC-SIGN, la adicion del anticuerpo soluble contra la DC-SIGN humana al sobrenadante virico de FUGW/SVGmu antes de su exposicion a las celulas 293T.hDCSIGN redujo la eficacia de la transduccion (no se muestran los datos). El titulo especifico de FUGW/SVGmu para 293T.mDCSIGN se estimo que era de 1 x 106 UT (unidades de
50 transduccion)/ml. El titulo de FUGW/SVGmu para 293T.hDCSIGN se estimo que era de 1-2 x 106 UT/ml.
Ejemplo 6
Evaluacion del virus recombinante in vitro
Para investigar la especificidad del lentivector modificado geneticamente a la hora de transducir las celulas dendriticas (CD) que expresan la DC-SIGN, se aislaron de los ratones las celulas totales de la medula osea (MO) y se transdujeron directamente con el vector virico FUGW/SVGmu (ejemplo 2). Para el uso en el experimento, se adapto un protocolo para generar CD de raton a partir de progenitores que se hicieron crecer en cultivos de MO (Buchholz, C. J., et al. 1998. Nat Biotech 16: 951-954).
5 Las celulas totales de la medula osea se recogieron de ratonas hembra B6 (Charles River Breeding Laboratories) y se generaron CDMO tal y como se describe en otro documento (Yang, L. y D. Baltimore. 2005. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102: 4518-4523). O bien las celulas totales de la MO o bien las CDMO se sembraron en una placa de cultivo de 24 pocillos (2 x 106 celulas por pocillo) y se infectaron por centrifugacion con el sobrenadante virico (1 ml por pocillo) a 2500 rpm y 30 DC durante 90 min utilizando una centrifuga Sorvall RT7. Tras la centrifugacion, se retiro el
10 sobrenadante y se reemplazo por medio RPMI nuevo que contiene FBS al 10% y GM-CSF (medio acondicionado J558L a 1:20). Las celulas se cultivaron durante 3 dias y se les analizo la expresion de GFP por citometria de flujo.
Las celulas de la MO aisladas de los ratones se transdujeron directamente con el vector virico FUGW/SVGmu o con un vector de control. Para el control se utilizo un lentivector cuya envoltura llevaba la glucoproteina (Eco) del virus ecotropo de la leucemia murina (FUGW/Eco); el vector envuelto con Eco puede infectar las celulas de los roedores 15 con una amplia especificidad. Tres dias despues de la infeccion se analizo la eficacia de la transduccion mediante citometria de flujo (figura 4A). Aproximadamente el 9% de las celulas en los cultivos mixtos de MO eran CD (como indicaba la expresion de CD11c), de las cuales la mayoria (aproximadamente el 80%) expresaban DC-SIGN en una cantidad elevada (no se muestran los datos). Se observo que el 12% de las celulas totales de la MO expresaban la GFP (GFP+) tras la transduccion con FUGW/SVGmu (figura 4A). Cuando se sincroniza para las celulas GFP+, se
20 observo que hasta el 95% de las celulas transducidas expresaban tanto DC-SIGN como CD11c (DC-SIGN+CD11c+), lo que indica que FUGW/SVGmu transduce especificamente las CD que expresan la DC-SIGN y no otros tipos de celulas de la medula osea. Por el contrario, aunque el 68% de las celulas totales de la MO expresaban la GFP tras la exposicion al FUGW/Eco, solo el 9% de las celulas transducidas eran CD, de las cuales el 6,5% eran DC-SIGN+.
La transduccion estable de FUGW/SVGmu se verifico mediante analisis por PCR de Alu (Butler, S. L., et al. 2001.
25 Nat. Med. 7: 631-634) de la integracion genomica de la LTR del esqueleto del lentivector. Ademas, se utilizo el FUGW/SVGmu para transducir los linfocitos B y T primarios recogidos del bazo de los ratones y no se detecto virtualmente ninguna transduccion (figura 4B), lo que indica una especificidad de transduccion notable.
Tambien se ensayo la eficacia del lentivector que lleva SVGmu para la transduccion de las CD procedentes de medula osea (MO) (CDMO) cultivadas in vitro. Las CD procedentes de la medula osea (MO) (CDMO) se generaron 30 tal y como se describe mas arriba mediante el cultivo en presencia del factor estimulador de colonias de macrofagos y granulocitos (GM-CSF, por su nombre en ingles) durante 6 dias. A continuacion se expusieron las celulas al lentivector FUGW/SVGmu o al FUGW/Eco. La citometria de flujo de las CDMO el dia 3 despues de la transduccion demostro que FUGW/Eco se transducia en las CD CD11c+ (33%) y en las celulas CD11c� (7,6%) (figura 5), lo que esta en concordancia con el amplio tropismo de Eco. Por al contrario, el FUGW/SVGmu solo se transdujo en las CD
35 CD11c+ (32,7%) y no se detecto ninguna celula GFP+ entre las celulas CD11c-(figura 5), lo que indica que el FUGW/SVGmu modifica especificamente las CDMO.
Asi pues, estos resultados en su conjunto demuestran que los lentivectores recombinantes manipulados geneticamente que llevan SVGmu pueden transducirse especificamente en las CD in vitro y que la transduccion selectiva se correlaciona con la expresion de la DC-SIGN en la superficie de las CD.
40 Ejemplo 7
Efecto del virus recombinante sobre la activacion in vitro de las celulas dendriticas
El lentivirus recombinante se examino adicionalmente para determinar si podria, especificamente, reconocer selectivamente, transducirse y activar las CD en CD maduras. En las CD expuestas al virus recombinante se midio la induccion en la superficie de la molecula coestimuladora B7.2 (CD86) y de la molecula del CMH de clase II I-Ab, que
45 se considera que son distintivos de la activacion de las CD (Steinman, R. M., et al. 2003. Annu. Rev. Immunol. 21: 685-711). Las CDMO se generaron y se infectaron con FUGW/SVGmu tal y como se describe en el ejemplo 6. Para otra activacion de las CDMO transducidas tambien se afadio LPS a una concentracion de 1 1g/ml durante una noche.
La citometria de flujo de las CDMO 3 dias despues de la transduccion demostro que el tratamiento con
50 FUGW/SVGmu aumentaba la expresion de los marcadores de activacion de las CD, CD86 y I-Ab , en las CD que expresan la GFP, en comparacion con las CD que no expresan la GFP (figura 6, panel superior). La region sombreada indica las celulas que no expresan la GFP (sin transducir) y la linea continua (region sin relleno) indica las celulas que expresan la GFP (transducidas). Se observo que la transduccion selectiva de las CDMO entraba en sinergia con el tratamiento con el lipopolisacarido (LPS) para la maduracion adicional de las CD (figura 6, panel
55 inferior). Esto indica que, para inducir la activacion de las CD, la transduccion selectiva puede funcionar sola o bien en combinacion con otros factores de maduracion de las CD.
Ejemplo 8
El virus recombinante reconoce selectivamente las celulas dendriticas in vivo
La prueba de si esta metodologia puede utilizarse para la vacunacion se puede examinar mediante experimentacion in vivo. Para comprobar si los lentivectores manipulados geneticamente que llevan SVGmu podian actuar 5 selectivamente sobre las CD in vivo, el lentivector recombinante y concentrado FUGW/SVGmu (50 x 106 UT resuspendido en 200 1l de PBS) se inyecto por via subcutanea en el lado izquierdo de las ratonas hembra C57BL/6 (B6, Charles River Breeding Laboratories) cerca de un ganglio linfatico inguinal (a menos de 1 cm). El ganglio linfatico inguinal izquierdo y el ganglio linfatico equivalente del lado opuesto se aislaron 3 dias despues de la inyeccion para la evaluacion de su tamafo. Las celulas se recogieron de estos ganglios y se conto su n(mero total.
10 El porcentaje de las CD GFP+ se analizo mediante citometria de flujo en las celulas tefidas con el anticuerpo anti-CD11c (BD Biosciences).
El dia 3 se observo un aumento de tamafo significativo del ganglio linfatico inguinal izquierdo proximo al sitio de la inyeccion (figura 7A, imagen izquierda), y el n(mero de celulas de este ganglio linfatico se incremento mas de 10 veces en comparacion con el ganglio linfatico equivalente del lado contrario o con los ganglios linfaticos de un raton
15 no sometido previamente a experimentacion (figura 7B). Esto indica que la administracion del vector puede reforzar el trafico y la proliferacion de los linfocitos en un ganglio linfatico cercano.
La citometria de flujo indico que aproximadamente el 3,8% del total de los linfocitos CD11c+ de las celulas del ganglio linfatico inguinal izquierdo eran CD GFP+ (figura 7C) que parecen haber migrado desde el sitio de la inyeccion. Esto se considera un efecto notablemente grande para una inyeccion subcutanea del vector y demuestra
20 que el virus recombinante infecta con eficacia las CD in vivo.
Ejemplo 9
Evaluacion de la especificidad del virus recombinante mediante transduccion in vivo
Para examinar la especificidad in vivo del lentivector que reconoce selectivamente las CD, se construyo un vector lentivirico que codificaba una luciferasa de luciernaga. El ADNc de la luciferasa de luciernaga se amplifico a partir del
25 pGL4.2LucP (Promega) y se clono en el FUGW (Lois, C. et al. 2002. vease mas arriba) para reemplazar la GFP, lo que produjo la construccion Fluc (SEQ ID n.D 4) (figura 22A). A continuacion se utilizo el gen de la luciferasa como indicador para visualizar la transduccion in vivo de las celulas del tejido mediante los protocolos estandares de adquisicion de imagenes de bioluminiscencia (BLI).
El lentivector recombinante (de aqui en adelante denominado Fluc/SVGmu) se inyecto por via subcutanea en el
30 costado izquierdo del raton. En otro raton, un lentivector seutotipificado con la glucoproteina del virus de la estomatitis vesicular (de aqui en adelante denominada Fluc/VSVG) se inyecto como control de vector inespecifico. A continuacion, se tomaron imagenes de los ratones tratados con el vector de forma no invasiva mediante BLI. Los ratones tratados con Fluc/VSVG tenian una sefal fuerte y permanente en el sitio de la inyeccion, lo que indica que habia tejidos inespecificos transducidos que expresaban la luciferasa (figura 22B). Esto esta en concordancia con el
35 hecho de que el virus en cuya envoltura esta la VSVG tiene una amplia especificidad. En cambio, no se detecto ninguna sefal significativa en el sitio de inyeccion de los ratones tratados con Fluc/SVGmu (figura 22B), lo que indica que el lentivector que lleva SVGmu tenia una especificidad de diana relativamente rigurosa. En ning(n momento se pudo detectar la sefal de luminiscencia en los ratones diana, probablemente debido a la distribucion rara y escasa de las CD, que esta fuera del alcance de la sensibilidad del metodo actual de BLI.
40 Despues de un mes, los ratones inyectados con Fluc/SVGmu se sometieron a un analisis de biodistribucion mediante RT-PCR cuantitativa y no se observo ninguna copia detectable del lentivector en ninguno de los organos aislados (corazon, higado, bazo, rifon, gonada, pulmon, piel, ganglio linfatico), lo que verifica la ausencia de infeccion inespecifica en los animales y, asi pues, que el vector selectivo es especifico de las CD.
Ejemplo 10
45 Introduccion del antigeno in vitro mediante el virus recombinante
Para determinar si la transduccion selectiva de las CD debida al lentivector recombinante podia utilizarse para introducir con eficacia genes de antigeno en las CD para estimular las respuestas de linfocitos T CD8+ y CD4+ especificos del antigeno, se construyo un lentivector que expresaba el antigeno modelo, la ovalb(mina de pollo (OVA). En los ratones C57BL/6J (B6), la OVA es un antigeno diana bien caracterizado para el receptor OT1 de los
50 linfocitos T CD8+, que se fija especificamente a la OVA257-269 (denominada OVAp) y al receptor OT2 de los linfocitos T CD4+, que se fija especificamente a la OVA323-339 (denominada OVAp*) (Yang, L. y D. Baltimore. 2005. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102: 4518-4523). El lentivector que expresa la OVA (FOVA (SEQ ID n.D 2), figura 8, arriba) se construyo a partir del FUGW (figura 8, abajo) mediante el reemplazo de la GFP con el ADNc de la ovalb(mina de pollo. 30
Las CDMO (ejemplo 6) se transdujeron el dia 6 de cultivo bien con el lentivirus recombinante FOVA/SVGmu o bien con el lentivirus recombinante de control FUGW/SVGmu (que codifica un gen indicador irrelevante de GFP). El dia 6, las CDMO se infectaron por centrifugacion con el sobrenadante virico, y se cultivaron durante 3 dias mas. El dia 9, las celulas no adherentes se recogieron y se volvieron a cultivar en el medio RPMI con FBS al 10%, GM-CSF (medio 5 condicional J558L a 1:20) y LPS a 1 1g/ml (Sigma). El dia 10 se recogieron las celulas y se utilizaron para la estimulacion de los linfocitos T. Las CDMO modificadas se denominaron DC/FOVA y DC/FUGW, seg(n el lentivector utilizado para la transduccion. En paralelo, las celulas no adherentes se recogieron del cultivo de CDMO el dia 9 sin transducir y se volvieron a cultivar en el mismo medio (RPMI que contiene FBS al 10%, GM-CSF y LPS). El dia 10, las celulas se recogieron y se cargaron bien con OVAp (OVA257-269, especificamente fijada por los receptores OT1 de 10 los linfocitos T, de aqui en adelante denominadas DC/OVAp) o bien OVAp* (OVA323-339, especificamente fijada por los receptores OT2 de los linfocitos T, de aqui en adelante denominadas DC/OVAp*) y se utilizaron como controles positivos para estimular los linfocitos T. Para examinar la capacidad que tienen las CDMO transducidas con el vector para procesar y presentar el antigeno de OVA transgenico, se recogieron esplenocitos de ratones transgenicos con OT1 y OT2 y se cultivaron con las CDMO transducidas con el lentivector, o con las CDMO cargadas con OVAp o
15 bien con OVAp*, en la proporcion indicada. Tres dias despues se recogio el sobrenadante y se le ensayo por ELISA la produccion de IFN-y, y se recogieron las celulas y se les analizaron sus marcadores de activacion de superficie por citometria de flujo. La proliferacion de linfocitos T se analizo por la incorporacion de [3H]-timidina.
Tras un cocultivo de tres dias con diferentes proporciones de DC/FOVA y linfocitos T transgenicos, los linfocitos T OT1 respondieron vigorosamente cuando se midio mediante la liberacion de IFN-y (figura 10A) y la proliferacion de 20 los linfocitos T (figura 10B). Como se esperaba, no se detecto ninguna respuesta obvia a la OVA cuando se uso DC/FUGW (figuras 10A y 10B). Tambien se observo que la expresion transgenica de la OVA era incluso mas eficaz que la carga de peptidos para estimular una respuesta de los linfocitos T OT1, lo que esta en concordancia con la nocion de que el CMH de clase I favorece la presentacion de los peptidos producidos de modo endogeno. La citometria de flujo mostro que los linfocitos T OT1 activados mostraban el fenotipo tipico de linfocitos T citotoxicos
25 efectores(CD25+ CD69+ CD62Lbajo CD44alto) tras laestimulacion con DC/FOVA obien con DC/OVAp (figura 9).
Cuando las CD se cocultivaron con los linfocitos T CD4+ OT2, tambien se observo la activacion de los linfocitos T, como indicaban los cambios de los marcadores de superficie (figura 11) y la produccion de IFN-y (figura 12). Sin embargo, la estimulacion de los linfocitos CD4+ no fue tan pronunciada como la de los linfocitos CD8+, supuestamente debido a la presentacion menos eficaz de los peptidos del antigeno endogeno a las moleculas del
30 CMH de clase II. Al modificar la localizacion celular del antigeno OVA para dirigirlo a la via de presentacion del CMH de clase II, se reforzo la estimulacion de CD4 que era incluso mejor que la de las CD sensibilizadas con los peptidos (no se muestran los datos).
Estos resultados muestran que el metodo de accion selectiva sobre las CD a traves de la infeccion con el lentivector puede introducir con eficacia antigenos en las CD y estimular las respuestas de los linfocitos T tanto CD8+ como
35 CD4+.
Ejemplo 11
Introduccion in vivo del antigeno por el virus recombinante
Para determinar si las CD destinatarias de los lentivectores podian activar in vivo a los linfocitos T especificos del antigeno, se utilizo un metodo de transferencia genica del receptor de los linfocitos T (TCR, por su nombre en ingles)
40 a las celulas madre hematopoyeticas (HSC) murinas para generar en los ratones linfocitos T especificos del antigeno y con el TCR manipulado geneticamente, tal y como se describe en otro documento (Yang, L. y D. Baltimore, D. 2005. vease mas arriba). Se construyo un vector retrovirico tricistronico MIG-OT1 que coexpresaba OT1, TCRa y TCR , junto con el marcador GFP (figura 13A).
Brevemente, las ratonas hembra B6 (Charles River Breeding Laboratories) se trataron con 250 Ig de 5-fluorouracilo
45 (Sigma). Cinco dias despues, las celulas de la medula osea (MO) enriquecidas con HSC se recogieron de la tibia y el femur y se cultivaron en una placa de cultivo de 24 pocillos (2 x 106 celulas por pocillo) en un medio de cultivo de MO (RPMI que contiene FBS al 10%, 20 ng/ml de rmIL-3, 50 ng/ml de rmIL-6 y 50 ng/ml de rmSCF (PeproTech)). El dia 1 y el dia 2 del cultivo, las celulas se infectaron por centrifugacion con el vector retrovirico MIG-OT1 seudotipificado con Eco (2 ml de sobrenadante virico por pocillo) a 2500 rpm y 30 DC durante 90 min. Tras cada
50 centrifugacion, se retiraba el sobrenadante y se reemplazaba con un medio de cultivo de MO nuevo. El dia 3, las celulas de MO transducidas se recogieron y se transfirieron a los ratones B6 destinatarios que recibieron 1200 rads de irradiacion corporal total. Ocho semanas despues de la transferencia, los ratones se utilizaron para el estudio de inmunizacion in vivo. Cada raton recibio una dosis de inyeccion subcutanea de 10 x 106 UT del lentivector de accion selectiva. Siete dias despues se recogieron celulas del bazo y de los ganglios linfaticos y se analizo la presencia de
55 linfocitos T OT1 y sus marcadores de activacion de la superficie por citometria de flujo.
Ocho semanas despues de la transferencia, el analisis de los linfocitos T perifericos de los ratones reconstituidos mostroque aproximadamenteel 5% de los linfocitos TCD8+eran GFP+ OT1+(figura 13B). Algunos de los ratones reconstituidos se inmunizaron mediante inyeccion subcutanea con la misma dosis (10 x 106 UT) de FOVA/SVGmu (ejemplo 10) o bien FUGW/SVGmu (ejemplo 2). El analisis de los linfocitos T GFP+ OT1+ recogidos de los organos linfaticos perifericos 7 dias mas tarde demostro que la inmunizacion de las CD diana por el FOVA/SVGmu doblaba el n(mero de linfocitos T OT1 respecto a los ratones de control, que o bien no estaban inmunizados o bien estaban
5 inmunizados con FUGW/SVGmu (figura 14B). Los linfocitosTGFP+ OT1+procedentesde los ratones inmunizados con FOVA/SVGmu mostraron un fenotipo de memoria efectora (CD69bajo CD62alto CD44alto), lo que indica que estos linfocitos han experimentado una respuesta inmunitaria productiva (figura 14A).
Estos resultados demuestran que un lentivector recombinante que lleva la SVGmu en la superficie puede dirigirse selectivamente a las CD in vivo para estimular con eficacia los linfocitos T especificos del antigeno e inducir una
10 respuesta inmunitaria fuerte.
Ejemplo 12
Induccion respuestas in vivo de LTC y de anticuerpos mediante la administracion directa del virus recombinante
Se llevaron a cabo estudios sobre la eficacia del reconocimiento selectivo in vivo de las CD para inducir una respuesta de linfocitos T citotoxicos (LTC) CD8+ especifica del antigeno y una respuesta de anticuerpos mediante la
15 administracion del lentivector de reconocimiento selectivo a ratones de tipo silvestre que no se han sometido previamente a experimentacion.
A los ratones B6 de tipo silvestre (Charles River Breeding Laboratories) se les dio una sola inyeccion del lentivector de reconocimiento selectivo (50 x 106 UT de FUGW/SVG o de FOVA/SVGmu) por via subcutanea en el costado derecho a la dosis indicada. El dia 7 y el dia 14 despues de la inmunizacion se recogio sangre de los ratones
20 inmunizados por extraccion de sangre de la cola, y se midio la IgG anti-OVA del suero por ELISA. El dia 14 se recogieron celulas del bazo y de ganglios linfaticos y se analizo por citometria de flujo la presencia de linfocitos T especificos de OVA y sus marcadores de activacion de la superficie.
La presencia de los linfocitos T especificos de OVA se midio mediante la medicion de la secrecion de citocinas y la tincion del tetramero. El dia 14 despues de la inyeccion se analizaron los linfocitos T recogidos de los organos 25 linfaticos perifericos. El lentivector que reconoce selectivamente las CD nativas fue capaz de inducir los linfocitos T CD8+ que responden a la OVA en el ganglio linfatico (no se muestran los datos) y en el bazo (figura 23). La administracion de una (nica dosis de FOVA/SVGmu recombinante fue suficiente para generar los linfocitos T CD8+, que se podrian sensibilizar para que secretaran el IFN-y tras la reestimulacion con OVAp (figura 23). La administracion del vector de control FUGW/SVGmu no consiguio generar ninguna respuesta especifica de OVAp 30 (figura 23). Para evaluar adicionalmente la magnitud de las respuestas, los linfocitos T CD8+ especificos de OVAp se midieron mediante la tincion del tetramero del CMH de clase I. Se obtuvo una alta frecuencia de linfocitos T especificos de OVAp (gt; 6%) tras la inyeccion de una (nica dosis (figura 15); no se detectaron celulas positivas para el tetramero en los ratones tratados con FUGW/SVGmu (figura 15). Los datos generados por la cuantificacion de tetrameros se correlacionaban bien con el analisis de los linfocitos efectores CD8+ analizados mediante tincion del
35 IFN-y intracelular (figura 23). El analisis del fenotipo de estos linfocitos T positivos para OVAp demostro que estas celulas presentaban en la superficie las caracteristicas de los linfocitos T efectores de memoria (CD25bajo CD69bajo CD62Lalto CD44alto) (figura 17A).
Para investigar la respuesta a la dosis de la administracion del lentivector, se inyectaron dosis de FOVA/SVGmu que oscilaban de 100 x 106 UT a 3 x 106 UT por via subcutanea y el dia 14 despues de la inyeccion se midieron los
40 linfocitos T especificos de OVAp del bazo. Se detecto una frecuencia excepcionalmente alta (12%) de linfocitos T CD8+ especificos de OVAp con la dosis de 100 x 106 UT (figura 16A). El porcentaje de linfocitos especificos de OVAp se correlaciono proporcionalmente con la cantidad del vector recombinante administrado (figura 16B). No se consiguio un valor meseta en la respuesta a la dosis con las dosis que se utilizaron, lo que indica que se puede mejorar todavia mas mediante el incremento de la cantidad de vector inyectado y/o la frecuencia de la inyeccion.
45 Ademas, la cantidad de IgG serica especifica de OVA en los ratones se examino los dias 7 y 14 despues de la inmunizacion con FOVA/SVGmu (50 x 106 UT). El titulo de IgG en el suero fue de 1:10.000 el dia 7 y 1:30.000 el dia 14 (figura 17B). Se trata de una respuesta de anticuerpos mas bien impresionante para la inyeccion de una (nica dosis sin mas adyuvante ni otros estimulos, lo que indica que la inmunizacion con el lentivector selectivo tambien puede desencadenar una secrecion significativa de anticuerpos especificos del antigeno desde los linfocitos B.
50 Estos resultados demuestran que la administracion in vivo de un lentivector que reconoce selectivamente las CD puede inducir respuestas inmunitarias tanto humoral como celular contra el antigeno introducido.
Ejemplo 13
Generacion de inmunidad antitumoral: proteccion preventiva
Se evaluo la inmunidad antitumoral generada tras una administracion in vivo del lentivector selectivo de las CD. Se utilizo un modelo tumoral E.G7 (Wang, L .y D. Baltimore. 2005. vease mas arriba) en el cual la OVA sirve de
antigeno tumoral.
Para la exposicion de los ratones al tumor se utilizaron las lineas celulares tumorales EL4 (C57BL/6J, H-2b, timoma) y E.G7 (celulas EL4 que expresan de forma estable una copia del ADNc de la OVA de pollo). Para el experimentos 5 de proteccion contra el tumor, los ratones B6 (Charles River Breeding Laboratories) recibieron una (nica inyeccion de 50 x 106 UT del lentivector selectivo (FOVA/SVGmu o FUGW/SVGmu) en el costado derecho. Dos semanas despues, 5 x 106 celulas EL4 o E.G7 se inyectaron por via subcutanea en la costado izquierdo de los ratones. Se midio el tamafo del tumor en dias alternos con compas calibrador de precision y se muestra como el producto de los dos diametros perpendiculares mas largos a x b (mm2). Se sacrificaron los ratones cuando los tumores alcanzaron
10 los 400 mm2.
La vacunacion con 50 x 106 UT de FOVA/SVGmu protegio completamente a los ratones expuestos al tumor E.G7 (figura 18, izquierda), mientras que los tumores crecieron con rapidez en los ratones que recibian una vacunacion falsa con un lentivector que carecia del transgen de OVA (figura 18, izquierda). Esta proteccion era especifica de OVA porque los ratones vacunados desarrollaron tumores EL4 de control que no expresaban la OVA (figura 18,
15 derecha), independientemente del lentivector utilizado para la inmunizacion.
Ejemplo 14
Generacion de inmunidad antitumoral: tratamiento del tumor
La inmunidad antitumoral generada tras una administracion in vivo del lentivector selectivo de las CD se evaluo donde se introdujeron las celulas tumorales antes de la administracion del lentivector. Las etapas de la inyeccion 20 tumoral y la administracion del lentivector estaban invertidas respecto a las del ejemplo 13 para comprobar si se podia eliminar un tumor establecido, en un ensayo de «vacunacion terapeutica». Con esta finalidad, las celulas tumorales E.G7 que expresan el gen de la luciferasa de luciernaga (E.G7.luc) se utilizaron para la exposicion de los ratones, lo que permite el estrecho seguimiento de la cinetica del crecimiento del tumor por BLI en los animales vivos. Para facilitar la adquisicion de imagenes, se utilizo una cepa albina de ratones B6 (The Jackson Laboratory). Estos 25 ratones carecen de pigmentacion y, por lo tanto, tienen una absorcion de fondo baja a la sefal de luminiscencia. La inyeccion de 100 x 106 UT de FOVA/SVGmu (ejemplo 10) a estos ratones mostro una respuesta similar a la observada en los ratones B6 canonicos (figura 21). Celulas tumorales E.G7.luc (5 x 106) se implantaron subcutaneamente en los ratones B6 albinos. Los ratones se inmunizaron con FOVA/SVGmu (50 x 106 UT por raton por vez) dos veces los dias 3 y 10 despues de la exposicion al tumor mediante una inyeccion subcutanea. El
30 experimento se repitio tres veces, y en las figuras 19 y 20 se muestra un experimento representativo.
Los ratones que recibieron la inmunizacion con el lentivector selectivo de las CD mostraron un declive del crecimiento de los tumores comenzando el dia 9, a lo que seguia una regresion tumoral y una reduccion de la luminiscencia por debajo del nivel de deteccion el dia 11 (figuras 19 y 20). Aunque se observo una recurrencia minima del tumor desde el dia 12 al dia 16, los ratones tratados con FOVA/SVGmu estaban libres de la enfermedad 35 al final del dia 18 y de ahi en adelante; no se observo ninguna recidiva del tumor mientras duro el experimento (gt; 60 dias). En cambio, los tumores crecieron progresivamente en los ratones que no recibieron tratamiento y los ratones tuvieron que ser eliminados del experimento despues del dia 16 debido al gran tamafo que tenian los tumores. Fue interesante observar que la regresion tumoral se observo que comenzaba a los 7 dias de la inmunizacion del lentivector. La cinetica de la regresion del tumor se correlaciona bien con la cinetica de una respuesta inmunitaria
40 especifica de antigeno inducida por la vacunacion.
Ejemplo 15
Introduccion in vitro del antigeno y de factores de maduracion mediante un virus recombinante
El exito de la vacunacion con CD puede depender del estado de maduracion de las CD (Banchereau, J. y A. K. Palucka. 2005. Nat Rev Immunol 5: 296-306; Schuler, G. et al. 2003. Curr Opin Immunol 15: 138-147; Figdor, C. G. 45 et al. 2004. Nat Med 10: 475-480). Por consiguiente, en los vectores lentiviricos se pueden incluir genes que codifican las moleculas estimuladoras que desencadenan la maduracion deseada de las CD. Las citocinas que pueden utilizarse incluyen, pero sin limitarse a ellas, GM-CSF, IL-4, TNFa, IL-6 y similares. En algunas realizaciones, el agente de maduracion que se utiliza es el ligando de CD40 (CD40L), que se expresa tipicamente en los linfocitos T CD4 y sirve de ligando para el receptor CD40 de las CD (Matano, T. et al. 1995. J Gen Virol 76: 3165-3169; 50 Nguyen, T. H. et al. 1998. Hum Gene Ther 9: 2469-2479). Para manipular adicionalmente las CD para que sean una potente vacuna para tratamientos, se acomoda un receptor CD40 inducible por farmaco (iCD40) en el sistema de introduccion genica en algunas realizaciones. Tal y como se describe en otro documento, se disefo el iCD40 y consistia en un dominio citoplasmatico de CD40 fusionado a los dominios de fijacion al ligando y una secuencia de localizacion membranaria (Hanks, B. A. et al. 2005. Nat Med 11: 130-137). Cuando se expresa el iCD40, la
55 maduracion y la activacion de las CD se regula con un farmaco liposoluble capaz de dimerizarse.
Para examinar el efecto de incluir los factores de maduracion de las CD, se obtuvieron los ADNc para la ovalb(mina (OVA, como se describe en el ejemplo 10), GM-CSF, IL-4, TNFa, IL-6 y CD40L. El iCD40 se construye como se describe en otro documento (Hanks, B. A. et al. 2005. vease mas arriba). Gracias a la IRES y a las secuencias de tipo 2A, se construyen vectores lentiviricos multicistronicos capaces de traducir con eficacia hasta cuatro proteinas. 5 Este sistema se adapta para construir vectores lentiviricos que coexpresan los genes siguientes: la OVA y una molecula de factor de maduracion (GM-CSF, IL-4, TNFa, IL-6, CD40L o iCD40) (figura 24a, rotulada como «FUOIM»). Una secuencia de vector de ejemplo se da a conocer en la SEQ ID n.D 7. Se preparan lentivirus cuya envoltura lleva SVGmu (tal y como se describe en el ejemplo 2) y los lentivirus se transducen in vitro en las CDMO de raton cultivadas (generadas como se describe en el ejemplo 6) para introducir especificamente estos genes en 10 las celulas. La maduracion de las CDMO se mide mediante analisis por FACS en forma de induccion de varias moleculas clave que tienen funciones esenciales en el proceso de estimulacion de los linfocitos T. Los marcadores representativos tipicos son ICAM-1 (CD54), B7.1 (CD80), CMH de clase I, CMH de clase II y CD40 endogeno. Las CDMO transducidas con lentivirus que codifican solo los genes de OVA y GFP sirven de control para el experimento. Se observa que la induccion de los marcadores de maduracion se consigue cuando las CD modificadas con iCD40
15 se exponen a una cantidad eficaz del farmaco dimerico AP20187.
Ademas, dos rasgos caracteristicos de las CD maduras son la menor capacidad de endocitosis y una mejor capacidad de activacion de los linfocitos T. La captacion del dextrano etiquetado con FITC se utiliza para cuantificar la endocitosis de las CD transducidas. Las CD maduras tambien se utilizan para estimular los linfocitos T que expresan los receptores de los linfocitos T OT1 (TCR) (como se describe en el ejemplo 10) para evaluar su 20 capacidad para montar una respuesta inmunitaria. Se observa que cuando las CD modificadas con iCD40 se exponen a una cantidad eficaz del farmaco dimerico AP20187, la captacion del dextrano etiquetado con FITC se reduce respecto al captado por las CD modificadas sin iCD40. Ademas, se observa que tras el cocultivo con proporciones diferentes de CD modificadas con iCD40 (tratadas con el farmaco dimerico) por linfocitos T transgenicos, los linfocitos T OT1 responden mas vigorosamente, seg(n se mide por la liberacion del IFN-y y la
25 proliferacion de los linfocitos T, que los que se cocultivan con CD modificadas sin iCD40.
Longevidad de las CD es otro parametro que determina la inmunidad dependiente de los linfocitos T. Los efectos de las moleculas estimuladoras sobre la supervivencia de las CD mediante un ensayo in vitro de ayuno de suero se compararan mediante el metodo que se describe en Hanks et al. (Hanks, B. A. et al. 2005. vease mas arriba).
Sin fuera necesario, se pueden introducir dos moleculas de factor de maduracion en las CD diana mediante el vector 30 lentivirico, ya que la configuracion del vector tiene la capacidad de expresar cuatro proteinas.
Ejemplo 16
Introduccion in vivo del antigeno y de los factores de maduracion mediante un virus recombinante
Los virus recombinantes empaquetados con el vector lentivirico FUOIM (SEQ ID n.D 7) se preparan tal y como se describe en el ejemplo 15. Los virus se administran a ratones B6 que no se han sometido previamente a
35 experimentacion para introducir el antigeno OVA y las moleculas de factor de maduracion en las CD, y la induccion de la inmunidad a dosis escalonadas de virus se eval(a tal y como se describe en el ejemplo 11.
Se observa que la inmunizacion selectiva de las CD por los lentivirus que contienen iCD40 incrementa el n(mero de linfocitos T que responden a la OVA en comparacion con los ratones de control, que o bien no estan inmunizados, o bien estan inmunizados con un lentivirus que no contiene OVA (p. ej., FUGW/SVGmu) o bien estan inmunizados con
40 el lentivirus que no contiene iCD40 (p. ej., FOVA/SVGmu).
Ademas, la resistencia de los animales a una exposicion tumoral se valora con los lentivectores que contienen iCD40, tal y como se describe en el ejemplo 13. A los ratones se les inyectan los siguientes lentivectores en el experimento de exposicion tumoral: FUOIM/SVGmu, FOVA/SVGmu o FUGW/SVGmu. Las siguientes lineas celulares se utilizan para la exposicion tumoral: EL4 (C57BL/6J, H-2b, timoma) y E.G7 (celulas EL4 que expresan 45 establemente una copia del ADNc de la OVA de pollo). Se observa que los ratones que reciben la inmunizacion mediante los lentivectores selectivos de las CD FUOIM/SVGmu y FOVA/SVGmu estan protegidos ante la exposicion al tumor. En cambio, se observa que los tumores crecen con rapidez en los ratones que reciben una vacunacion falsa con un lentivector que carece del transgen de la OVA (FUGW/SVGmu). Esta proteccion es especifica de OVA porque los ratones vacunados desarrollan tumores EL4 de control que no expresan la OVA, independientemente del
50 lentivector utilizado para la inmunizacion.
Finalmente, el potencial de este metodo para erradicar un tumor establecido se eval(a con los lentivectores que contienen iCD40, como se describe en el ejemplo 14. Los lentivectores siguientes se utilizan para la inmunizacion en el experimento: FUOIM/SVGmu y FOVA/SVGmu. Las siguientes lineas celulares se utilizan para el tratamiento tumoral: EL4 y E.G7. Se observa que los ratones inyectados con celulas tumorales que reciben inmunizacion 55 mediante los lentivectores selectivos de las CD (FUOIM/SVGmu y FOVA/SVGmu) muestran un declive del crecimiento tumoral, seguido de regresion tumoral y una reduccion de la luminiscencia por debajo del nivel de
deteccion. Ademas, no se observo ninguna recidiva del tumor mientras duro el experimento (gt; 60 dias). En cambio, los tumores van creciendo en los ratones que no reciben el tratamiento.
Ejemplo 17
Presentacion del antigeno del VIH/sida mediante virus recombinantes in vitro
5 Para tratar el VIH/sida, se generan CD «funcionales duales» basandose en la estrategia de introduccion genica descrita. Las CD «funcionales duales» son eficaces a la hora de desencadenar anticuerpos neutralizantes (AcN) e inducir inmunidad celular de linfocitos T (figura 25). Para desencadenar con eficacia los AcN, en las CD se introduce un gen que codifica la gp120 quimerica que se fija a la membrana (gp120m). La gp120 es una glucoproteina de la envoltura del VIH y se considera que es el inmunogeno mas potente (Klimstra, W. B. et al. 2003. J. Virol. 77: 12022
10 12032; Bernard, K. A. et al. 2000. Virology 276: 93-103; Byrnes, A. P., et al,. 1998. J. Virol 72: 7349-7356). Tal y como se describe en otro documento, la gp120 fusionada con el dominio transmembranario de la glucoproteina del virus de la estomatitis vesicular se puede expresar en la superficie celular en forma de trimero, imitando el trimero maduro de la superficie del virion del VIH (Klimstra, W. B. et al. 1998. J. Virol. 72: 7357-7366). Esta forma de inmunogeno se expondra en la superficie de las CD. Ademas de la expresion en la superficie, las CD pueden
15 tambien presentar a los linfocitos T peptidos de epitopos procedentes de la gp120 de forma restringida por el CMH.
Dado que la infeccion con el VIH puede deteriorar significativamente el funcionamiento de las CD a traves de la desaparicion de los linfocitos T CD4, resulta deseable manipular geneticamente las CD para que funcionen con independencia de los linfocitos T. La expresion de CD40L o iCD40 puede dar lugar a la maduracion y activacion de las CD en ausencia de los linfocitos T CD4. Asi pues, el CD40L o iCD40 manipulado geneticamente, tal y como se
20 describe en el ejemplo 16, que funciona como una molecula estimuladora y de maduracion, se incorpora en el virus que reconoce selectivamente las CD.
La construccion lentivirica para modificar geneticamente las CD se ilustra en la figura 24b y se rotula como FUGmID (SEQ ID n.D 8). Se obtienen ADNc de la gp120 con los codones optimizados del Programa de Reactivos de Referencia e Investigacion del Sida del NIH. La secuencia con los codones optimizados puede conseguir expresar el
25 gen a un nivel excepcionalmente alto fuera del contexto del genoma del VIH-1. La construccion se prepara mediante la fusion de la gp120 con el dominio transmembranario de la glucoproteina del virus de la estomatitis vesicular.
Se llevan a cabo ensayos in vitro para evaluar la eficacia que tienen las CD con genes modificados a la hora de desencadenar AcN. Se aislan linfocitos B CD19+ del bazo de ratones B6 que no se han sometido previamente a experimentacion mediante microperlas anti-CD19 (MiHenyi Biotech, Auburn, CA) y se cocultivan con las CD 30 modificadas en presencia de IL-4 e IL-6. El vector lentivirico FUmGID se contransfecta con SVGmu en las lineas celulares para preparar el virus FUmGID/SVGmu, tal y como se describe en el ejemplo 2. Los virus resultantes se transducen en las CD procedentes de la medula osea (CDMO). Las CD transducidas se irradian (3000 rad) y se utilizan como celulas presentadoras de antigeno (CPA) en cocultivo con los linfocitos B. Se mide la cinetica de la proliferacion de los linfocitos B en respuesta a las CDMO transducidas. Se observa que los linfocitos B proliferan
35 mas en cocultivo con las CDMO transducidas que cuando se cocultivan con las CDMO transducidas sin nada.
Para investigar el efecto de las CD modificadas geneticamente sobre la diferenciacion de los linfocitos B en las celulas secretoras de inmunoglobulinas especificas, se emplea el metodo de cocultivo que se describe mas arriba con la excepcion de que no se irradian las CD. Despues de 14 dias, el titulo de los distintos isotipos de anticuerpo especifico contra el VIH en los sobrenadantes de cultivo se determina mediante ELISA con la gp120 recombinante
40 (disponible del NIB: Programa de Reactivos de Referencia e Investigacion del Sida) como antigeno. La expresion de los diferentes isotipos del anticuerpo especifico contra el VIH es mayor en los linfocitos B cocultivados con las CDMO transducidas que en los cocultivados con las CDMO transducidas sin nada.
Para evaluar la eficacia de las CD modificadas geneticamente a la hora de activar los linfocitos T in vitro, se aislan linfocitos T CD3+ de ratones B6 que no se han sometido previamente a experimentacion y se cocultivan con CD
45 irradiadas e infectadas con lentivirus. Se mide la cinetica de la proliferacion de los linfocitos T. La proliferacion de los linfocitos T se encuentra que es mayor en los cultivos de linfocitos T cocultivados con CD irradiadas y transducidas que en los cocultivados con CD transducidas sin nada.
Los resultados en su conjunto se espera que demuestren que las CDMO transducidas con el lentivector FUmGID/SVGmu son eficaces tanto para estimular a los linfocitos B que producen anticuerpos neutralizantes (AcN)
50 como para inducir inmunidad celular de linfocitos T contra el VIH/sida.
Ejemplo 18
Presentacion in vivo del antigeno del VIH/sida mediante virus recombinantes
Para evaluar la activacion de los linfocitos B in vivo, los ratones B6 se inmunizan mediante una inyeccion subcutanea con los lentivirus recombinantes preparados tal y como se describe en el ejemplo 17. Los controles incluyen ratones inyectados con lentivirus que solo codifican antigenos, lentivirus que solo codifican moleculas de maduracion y ratones sin ning(n tratamiento que no se han sometido previamente a experimentacion. Dos semanas despues de la inyeccion del virus, los anticuerpos contra el VIH del suero se miden por ELISA. El titulo del anticuerpo se encuentra que es mas alto en los ratones en los que se inyecto el virus FUmGID/SVGmu, asi como en
5 los que se inyecto el lentivirus que solo codifica antigenos. En cambio, el titulo del anticuerpo es relativamente bajo en los ratones inmunizados con el lentivirus que solo codifica moleculas de maduracion y en los ratones que no se han sometido previamente a experimentacion.
Para la activacion in vivo de los linfocitos T, en los ratones B6 se inyectan los virus recombinantes que se han descrito. Los linfocitos T se aislan 7 dias despues y se mide su proliferacion y la secrecion de citocinas, tras la 10 reestimulacion in vitro con las CD modificadas geneticamente, tal y como se describe en el ejemplo 12. Tambien se sigue la duracion de las respuestas de linfocitos T efectores. El lentivector que reconoce selectivamente las CD nativas es capaz de desencadenar linfocitos T que responden al VIH tanto en el ganglio linfatico como en el bazo. La administracion de FUmGID/SVGmu recombinante es suficiente para generar linfocitos T que secretan IFN-y. En cambio, la administracion de un vector de control vacio (p. ej., FUGW/SVGmu) no logra desencadenar una
15 respuesta especifica contra el VIH.
Ejemplo 19
Vacunacion in situ contra el VIH/sida mediante virus recombinantes: proteccion contra la exposicion al VIH
Para comprobar la estrategia de vacunacion in situ con CD para enfrentarse al VIH, se desarrolla un nuevo modelo de raton de patogenia del VIH que implica quimeras humano/raton. Tal y como se describe en otro documento, el 20 raton RAG2�/� yc�/� se puede reconstituir con un sistema inmunitario adaptativohumano (Strauss, J. H., et al. 1994. Archives of Virology 9: 473-484). Los ratones RAG2�/� yc�/� carecen de linfocitos B, T y citotoxicos (Morizono, K. et al. 2001. J. Virol. 75: 8016-8020). La inyeccion de sangre de cordon umbilical humano CD34+ en el higado de los ratones irradiados parcialmente de un dia de edad conduce a la generacion y maduracion de CD , linfocitos B y linfocitos T humanos funcionalmente diversos con restriccion del CMH humano. Adicionalmente, este modelo
25 gobierna el desarrollo de organos linfaticos primarios y secundarios, y la produccion de una respuesta inmunitaria celular de linfocitos T CD8+ funcionales contra una exposicion al virus. Ademas, la observacion del cambio de isotipo de Ig desde IgM a IgG indica la existencia de inmunidad celular de linfocitos T CD4+ funcionales.
Para determinar la eficacia de la proteccion preventiva contra el VIH mediante la inmunizacion que reconoce selectivamente las CD, las quimeras humano/raton son virus recombinantes que se administran envueltos con 30 SVGmu mediante inyeccion. Los virus recombinantes codifican el antigeno gp120m (ejemplo 17) junto con un estimulador de la maduracion (por ejemplo, CD40L o iCD40 como en el ejemplo 15), y se preparan y concentran como se describe en el ejemplo 2. A continuacion, los ratones inmunizados se inoculan con el VIH de acuerdo con los metodos bien conocidos en la tecnica, tal como, por ejemplo, por las vias intraperitoneal o intravenosa. Ya que los ratones reconstituidos mantienen los linfocitos T CD4 humanos, los animales se exponen a virus indicadores del
35 VIH clonados molecularmente, NFNSX-r-HSAS (CCR5-tropo), NL-r-HSAS (CXCR4-tropo) y aislados clinicos (Baezinger et al. 2006. Proc Natl Acad Sci USA 103: 15951-15956). Los virus indicadores capaces de replicarse tambien contienen el antigeno termoestable (HSA, por su nombre en ingles) en la region vpr. Ademas, para establecer una infeccion productiva antes de la inoculacion, los linfocitos mononucleares de la sangre periferica (LMSP) singenicos infectados se inyectan en el espacio peritoneal de la quimera humano/raton reconstituida.
40 Las pruebas de la infeccion del VIH se obtienen a lo largo del tiempo de bazo, ganglios linfaticos, CMSP y sangre periferica. El FACS para el HSA en los virus indicadores del VIH se utiliza para analizar la integracion y la replicacion del VIH. Tambien se mide por RT-PCR la carga virica del VIH a partir del plasma. Mediante la evaluacion de la infeccion del VIH con estos metodos, se observa que la vacunacion productiva in situ con las CD hace que los ratones inmunizados sean mas resistentes a la exposicion al VIH que los que no estan inmunizados.
45 Ejemplo 20
Vacunacion del VIH/sida in situ mediante virus recombinantes: eliminacion de la infeccion del VIH
Para comprobar la capacidad que tiene la estrategia de vacunacion in situ con las CD a la hora de eliminar una infeccion activa del VIH, las quimeras humano/raton se exponen primero al virus indicador del VIH molecularmente clonado, NFNSX-r-HSAS (CCR5-tropo), tal y como se describe en el ejemplo 19. La infeccion activa del VIH se sigue 50 analizando por FACS la expresion del HSA en los linfocitos T CD4 humanos. Una vez que se ha confirmado el exito de la infeccion del VIH, los virus recombinantes manipulados geneticamente (ejemplo 19) se inyectan en los animales mediante una inyeccion subcutanea o mediante una via optima determinada por un experto en la tecnica (por ejemplo, s.c., i.d., i.v. , o i.p). A continuacion, la carga virica del VIH se sigue mediante RT-PCR, y se cuentan los CD4 perifericos. Se observa que la vacunacion con las CD es capaz de disminuir la carga virica del VIH y de 55 eliminar una infeccion establecida del VIH en los ratones inmunizados en comparacion con los controles sin vacunar.
El tratamiento antirretrovirico de gran actividad (TARGA), que utiliza una estrategia con tres farmacos, ha mejorado significativamente la morbimortalidad del sida. La estrategia esquematizada mas arriba se puede adaptar a este paradigma mediante la transducion simultanea de las celulas CD in vivo con virus recombinantes manipulados geneticamente. Los estudios anteriores se repiten junto con el TARGA para evaluar la capacidad para prevenir o
5 reducir la infeccion tras la exposicion al VIH (ejemplo 19) y para eliminar una infeccion activa del VIH.
Ejemplo 21
Tratamiento de un tumor maligno en un humano mediante un virus recombinante
An un paciente humano se le diagnostica un tumor maligno. Al paciente se le administra una cantidad adecuada del virus recombinante que contiene un gen que codifica un antigeno especifico del tumor y en cuya envoltura hay una 10 molecula de reconocimiento selectivo especifica de la DC-SIGN, tal como, por ejemplo, SVGmu. El virus contiene opcionalmente un gen que codifica un factor de maduracion de las CD, tal y como se describe en el ejemplo 15. El virus se administra mediante una inyeccion intravenosa semanal mientras dura del tratamiento. Con periodicidad regular durante y tras la pauta posologica del tratamiento, se valora la carga tumoral mediante la adquisicion de imagenes de resonancia magnetica nuclear (RMN). Se encuentra una reduccion significativa del tamafo del tumor a
15 medida que progresa el tratamiento.
Ejemplo 22
Prevencion de la formacion del tumor en un humano mediante un virus recombinante
A un grupo de pacientes humanos se les administra una cantidad adecuada de virus recombinante que contiene al menos un gen que codifica un antigeno que esta asociado habitual y especificamente a las celulas tumorales y que
20 contiene opcionalmente un gen que codifica un factor de maduracion de las CD, como se describe en el ejemplo 15. El virus se envuelve con una molecula de reconocimiento selectivo especifica de la DC-SIGN, tal como, por ejemplo, SVGmu (ejemplo 2). A los pacientes del grupo experimental y del grupo de control se les observa el crecimiento tumoral con regularidad. Se observa que la incidencia de la formacion del tumor maligno es mas baja en los pacientes a los que se administra el virus que en el grupo de control.
25 Ejemplo 23
Tratamiento del sida/VIH en un humano mediante un virus recombinante
Un paciente humano se diagnostica con VIH/sida. Al paciente se le administra una cantidad adecuada del virus recombinante que contiene un gen que codifica la Gp120 (ejemplo 17) y que esta envuelto con una molecula de reconocimiento selectivo especifica de la DC-SIGN, tal como, por ejemplo, SVGmu (ejemplo 2). El virus contiene 30 opcionalmente un gen que codifica un factor de maduracion de las CD, tal y como se describe en el ejemplo 15. El virus se administra mediante una inyeccion intravenosa semanal mientras dura el tratamiento. A intervalos regulares durante y tras la pauta posologica del tratamiento, se valora por ELISA la carga virica del VIH midiendo los anticuerpos de la sangre del paciente contra el VIH. Tambien se valora el n(mero de linfocitos T del paciente. Se observa que se consigue una reduccion significativa de la carga virica del VIH a medida que avanza el tratamiento.
35 Ademas, se observa que el n(mero de linfocitos T del paciente deja de disminuir a medida que progresa el tratamiento.
Ejemplo 24
Prevencion del VIH/sida en un humano mediante un virus recombinante
A un grupo de pacientes humanos que se considera que corren el riesgo de contraer una infeccion del VIH se le
40 administra una cantidad adecuada del virus recombinante que contiene un gen que codifica la GP120 (ejemplo 17) y que contiene opcionalmente un gen que codifica un factor de maduracion de las CD, como se describe en el ejemplo
15. El virus esta envuelto con una molecula de reconocimiento selectivo especifica de la DC-SIGN, tal como, por ejemplo, SVGmu (ejemplo 2). A los pacientes del grupo experimental y del grupo de control se les analiza cada 6 meses la infeccion del VIH, y si dan positivo, se comprueba la carga virica del VIH y el n(mero de linfocitos T. En los
45 pacientes infectados positivamente dentro del grupo vacunado se observa que la carga virica del VIH permanece baja y que el n(mero de linfocitos T permanece alto respecto a los pacientes infectados positivamente del grupo de control.
Aunque la invencion anterior se ha descrito en detalle con el proposito de facilitar la comprension, sera obvio que se pueden practicar determinadas modificaciones dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas.
LISTA DE SECUENCIAS
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lt;170gt; FastSEQ para Windows, version 4.0
lt;210gt; 1
lt;211gt; 9941 15 lt;212gt; ADN
lt;213gt; Secuencia artificial
lt;220gt;
lt;223gt; Construccion de vector plasmidico
lt;400gt; 1
lt;210gt; 2
lt;211gt; 9206 lt;212gt; ADN
lt;213gt; Secuencia artificial
lt;220gt;
lt;223gt; Construccion de vector plasmidico 5 lt;400gt; 2
lt;210gt; 3
lt;211gt; 8435
lt;212gt;
ADN 5 lt;213gt; Secuencia artificial
lt;220gt;
lt;223gt; Construccion de vector plasmidico
lt;400gt; 3
lt;210gt; 4
lt;211gt; 11092
lt;212gt;
ADN 5 lt;213gt; Secuencia artificial
lt;220gt;
lt;223gt; Construccion de vector plasmidico
lt;400gt; 4
lt;210gt; 5
lt;211gt; 10401
lt;212gt;
ADN 5 lt;213gt; Secuencia artificial
lt;220gt;
lt;223gt; Construccion de vector plasmidico
lt;400gt; 5
lt;210gt; 6
lt;211gt; 9903
lt;212gt;
ADN 5 lt;213gt; Secuencia artificial
lt;220gt;
lt;223gt; Construccion de vector plasmidico
lt;400gt; 6
lt;210gt; 7
lt;211gt; 11586
lt;212gt;
ADN 5 lt;213gt; Secuencia artificial
lt;220gt;
lt;223gt; Construccion de vector plasmidico
lt;220gt;
lt;221gt; misc�feature 10 lt;222gt; 3907
lt;223gt; n � a, t, c o g
lt;400gt; 7
lt;210gt; 8
lt;211gt; 11893
lt;212gt;
ADN 5 lt;213gt; Secuencia artificial
lt;220gt;
lt;223gt; Construccion de vector plasmidico
lt;400gt; 8
lt;210gt; 9
lt;211gt; 9569
lt;212gt;
ADN 5 lt;213gt; Secuencia artificial
lt;220gt;
lt;223gt; Construccion de vector plasmidico
lt;220gt;
lt;221gt; misc�feature 10 lt;222gt; 4189
lt;223gt; n � a, t, c o g
lt;400gt; 9
lt;210gt; 10
lt;211gt; 9394
lt;212gt; ADN
lt;213gt; Secuencia artificial 5 lt;220>
lt;223gt; Construccion de vector plasmidico
lt;220gt;
lt;221gt; misc�feature
lt;222gt; 7971 10 lt;223gt; n � a, t, c o g
lt;400gt; 10
lt;210gt; 11
lt;213gt; Secuencia artificial
lt;220gt;
lt;223gt; Glucoproteina mutada del virus de Sindbis
lt;400gt; 11

Claims (14)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Metodo in vitro para introducir un vector lentivirico que codifica un antigeno en una celula dendritica que expresa la DC-SIGN (no-integrina fijadora de ICAM-3 [moleculas de adhesion intracelular de tipo 3] especifica de las celulas dendriticas), en donde el metodo comprende:
    transducir la celula dendritica con un virus recombinante, en donde el virus recombinante comprende dicho vector lentivirico,
    en donde el virus recombinante comprende una glucoproteina de alfavirus que reconoce selectivamente dicha celula que expresa la DC-SIGN, en donde dicha glucoproteina es una glucoproteina E2 de alfavirus mutada en un sitio de fijacion al sulfato de heparano para disminuir o eliminar su fijacion al sulfato de heparano.
  2. 2.
    Metodo de acuerdo con la reivindicacion 1, en donde dicha glucoproteina es una glucoproteina E2 del Sindbis mutada en un sitio de fijacion al sulfato de heparano.
  3. 3.
    Metodo de acuerdo con la reivindicacion 2, en donde el virus comprende una proteina E1 del Sindbis y dicha proteina E2 del Sindbis y opcionalmente (a) comprende secuencias de un genoma del virus de la leucemia murina (VLM) o de un genoma del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), y/o (b) codifica un antigeno tumoral o un antigeno del VIH.
  4. 4.
    Virus recombinante seg(n se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, o una composicion farmaceutica que comprende dicho virus recombinante.
  5. 5.
    Virus recombinante que comprende un vector lentivirico que codifica un antigeno y una glucoproteina de alfavirus que reconoce selectivamente las celulas que expresan la DC-SIGN, en donde dicha glucoproteina es una glucoproteina E2 de alfavirus mutada en un sitio de fijacion al sulfato de heparano para disminuir o eliminar su fijacion al sulfato de heparano, para uso en la estimulacion de una respuesta inmunitaria contra dicho antigeno en un mamifero.
  6. 6.
    Virus recombinante para el uso de acuerdo con la reivindicacion 5, en donde dicha glucoproteina es una glucoproteina E2 del Sindbis mutada en un sitio de fijacion al sulfato de heparano.
  7. 7.
    Virus recombinante para uso de acuerdo con la reivindicacion 5 o 6, en donde el mamifero es humano.
  8. 8.
    Virus recombinante para uso de acuerdo con las reivindicaciones 5, 6 o 7, en donde el virus comprende una proteina E1 del Sindbis y dicha proteina E2 del Sindbis.
  9. 9.
    Virus recombinante para uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 5 a 8, en donde el vector lentivirico comprende secuencias de un genoma de virus de la leucemia murina (VLM) o de un genoma de VIH.
  10. 10.
    Virus recombinante para uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 5 a 9, en donde el antigeno es un antigeno tumoral o un antigeno de VIH.
  11. 11.
    Virus recombinante para uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 5 a 10, en donde el virus recombinante codifica un segundo gen de interes, tal como un factor de maduracion seleccionado del grupo que consiste en GM-CSF, IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-15, IL-21, IL-23, TNFa, B7.1, B7.2, 4-1BB, ligando de CD40 (CD40L) y CD40 inducible por farmaco (iCD40).
  12. 12.
    Celula dendritica transducida con un virus recombinante, en donde el virus recombinante se define seg(n cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.
  13. 13.
    Virus recombinante para uso de acuerdo con la reivindicacion 5, en donde el antigeno es un antigeno asociado a tumor, antigeno virico, antigeno bacteriano, antigeno de hongo, antigeno de parasito protozoario, antigeno del parasito helmintico o antigeno de ectoparasito.
  14. 14.
    Virus recombinante para uso de acuerdo con la reivindicacion 13,
    en donde dicho antigeno asociado a tumor se selecciona del grupo que consiste en receptor Her-2, MAGE, BAGE, RAGE, y NY-ESO, MART-1/Melan-A, gp100, gp75, mda-7, tirosinasa y proteina relacionada con la tirosinasa, antigeno membranario especifico de la prostata (PSMA, por su nombre en ingles), antigeno especifico de la prostata (PSA, por su nombre en ingles), ras mutado, reorganizacion de bcr/abl, Her2/neu, p53 de tipo silvestre o mutado, citocromo P450 1B1, N-acetilglucosaminiltransferasa V; proteinas E6 y E7 del virus del papiloma humano; antigeno carcinoembrionario y a-fetoproteina;
    en donde dicho antigeno virico se selecciona del grupo que consiste en polipeptidos de adenovirus, polipeptidos de alfavirus, polipeptidos de calicivirus, antigeno de la capsida de calicivirus, polipeptidos de coronavirus, polipeptidos del virus del moquillo, polipeptidos del virus del Ebola, polipeptidos de enterovirus, polipeptidos de flavivirus, polipeptidos del virus de la hepatitis (AE), antigeno de la superficie o del n(cleo de la hepatitis B, polipeptidos de virus del herpes, glucoproteina del virus del herpes simple, glucoproteina del virus de la varicela zoster, polipeptidos de virus de la inmunodeficiencia, envoltura o proteasa del virus de la inmunodeficiencia humana, polipeptidos del virus de la peritonitis infecciosa, polipeptidos del virus de la gripe, hemaglutinina de la gripe A, neuraminidasa de la gripe A, nucleoproteina de la gripe A, polipeptidos del virus de la leucemia, polipeptidos del virus de Marburg, polipeptidos de ortomixovirus, polipeptidos del virus del papiloma, polipeptidos del virus de la paragripe, hemaglutinina/neuraminidasa del virus de la paragripe, polipeptidos de paramixovirus, polipeptidos de parvovirus, polipeptidos de pestivirus, polipeptidos de picornavirus, polipeptido de la capsida del virus de la polio, polipeptidos del virus de la viruela, polipeptido del virus de la variolovacuna, polipeptidos del virus de la rabia, glucoproteina G del virus de la rabia, polipeptidos de reovirus, polipeptidos de retrovirus y polipeptidos de rotavirus;
    en donde dicho antigeno bacteriano se selecciona del grupo que consiste en polipeptidos de Actinomyces, polipeptidos de Bacillus, polipeptidos de Bacteroides, polipeptidos de Bordetella, polipeptidos de Bartonella, polipeptidos de Borrelia, OspA de B. burgdorferi, polipeptidos de Brucella, polipeptidos de Campylobacter, polipeptidos de Capnocytophaga, polipeptidos de Chlamydia, polipeptidos de Clostridium, polipeptidos de Corynebacterium, polipeptidos de Coxiella, polipeptidos de Dermatophilus, polipeptidos de Enterococcus, polipeptidos de Ehrlichia, polipeptidos de Escherichia, polipeptidos de Francisella, polipeptidos de Fusobacterium, polipeptidos de Haemobartonella, polipeptidos de Haemophilus, proteina de la membrana externa de tipo b de H. influenzae, polipeptidos de Helicobacter, polipeptidos de Klebsiella, polipeptidos de bacterias con forma de L, polipeptidos de Leptospira, polipeptidos de Listeria, polipeptidos de Mycobacteria, polipeptidos de Mycoplasma, polipeptidos de Neisseria, polipeptidos de Neorickettsia, polipeptidos de Nocardia, polipeptidos de Pasteurella, polipeptidos de Peptococcus, polipeptidos de Peptostreptococcus, polipeptidos de Pneumococcus, polipeptidos de Proteus, polipeptidos de Pseudomonas, polipeptidos de Rickettsia, polipeptidos de Rochalimaea, polipeptidos de Salmonella, polipeptidos de Shigella, polipeptidos de Staphylococcus, polipeptidos de Streptococcus, proteinas M de
    S. pyogenes, polipeptidos de Treponema y polipeptidos de Yersinia, antigeno F1 de Y. pestis y antigeno V de Y. pestis;
    en donde dicho antigeno de hongo se selecciona del grupo que consiste en polipeptidos de Absidia, polipeptidos de Acremonium, polipeptidos de Alternaria, polipeptidos de Aspergillus, polipeptido de Basidiobolus, polipeptidos de Bipolaris, polipeptidos de Blastomyces, polipeptidos de Candida, polipeptidos de Coccidioides, polipeptidos de Conidiobolus, polipeptidos de Cryptococcus, polipeptidos de Curvalaria, polipeptidos de Epidermophyton, polipeptidos de Exophiala, polipeptidos de Geotrichum, polipeptidos de Histoplasma, polipeptidos de Madurella, polipeptidos de Malassezia, polipeptidos de Microsporum, polipeptidos de Moniliella, polipeptido de Mortierella, polipeptidos de Mucor, polipeptidos de Paecilomyces, polipeptidos de Penicillium, polipeptidos de Phialemonium, polipeptidos de Phialophora, polipeptidos de Prototheca, polipeptidos de Pseudallescheria, polipeptidos de Pseudomicrodochium, polipeptidos de Pythium, polipeptidos de Rhinosporidium, polipeptidos de Rhizopus, polipeptidos de Scolecobasidium, polipeptidos de Sporothrix, polipeptidos de Stemphylium, polipeptidos de Trichophyton, polipeptidos de Trichosporon y polipeptidos de Xylohypha;
    en donde dicho antigeno de protozoo se selecciona del grupo que consiste en polipeptidos de Babesia, polipeptidos de Balantidium, polipeptidos de Besnoitia, polipeptidos de Cryptosporidium, polipeptidos de Eimeria, polipeptidos de Encephalitozoon, polipeptidos de Entamoeba, polipeptidos de Giardia, polipeptidos de Hammondia, polipeptidos de Hepatozoon, polipeptidos de Isospora, polipeptidos de Leishmania, polipeptidos de Microsporidia, polipeptidos de Neospora, polipeptidos de Nosema, polipeptidos de Pentatrichomonas, polipeptidos de Plasmodium, circunesporozoito de P. falciparum (PfCSP), proteina 2 de la superficie de esporozoito (PfSSP2), extremo carboxilo del antigeno 1 del estado del higado (PfLSA1 c-term), proteina 1 exportada (PfExp-1), polipeptidos de Pneumocystis, polipeptidos de Sarcocystis, polipeptidos de Schistosoma, polipeptidos de Theileria, polipeptidos de Toxoplasma y polipeptidos de Trypanosoma;
    en donde dicho antigeno de helminto se selecciona del grupo que consiste en polipeptidos de Acanthocheilonema, polipeptidos de Aelurostrongylus, polipeptidos de Ancylostoma, polipeptidos de Angiostrongylus, polipeptidos de Ascaris, polipeptidos de Brugia, polipeptidos de Bunostomum, polipeptidos de Capillaria, polipeptidos de Chabertia, polipeptidos de Cooperia, polipeptidos de Crenosoma, polipeptidos de Dictyocaulus, polipeptidos de Dioctophyme, polipeptidos de Dipetalonema, polipeptidos de Diphyllobothrium, polipeptidos de Diplydium, polipeptidos de Dirofilaria, polipeptidos de Dracunculus, polipeptidos de Enterobius, polipeptido de Filaroides, polipeptidos de Haemonchus, polipeptidos de Lagochilascaris, polipeptidos de Loa, polipeptidos de Mansonella, polipeptidos de Muellerius, polipeptidos de Nanophyetus, polipeptidos de Necator, polipeptidos de Nematodirus, polipeptidos de Oesophagostomum, polipeptidos de Onchocerca, polipeptidos de Opisthorchis, polipeptidos de Ostertagia, polipeptidos de Parafilaria, polipeptidos de Paragonimus, polipeptidos de Parascaris, polipeptidos de Physaloptera, polipeptidos de Protostrongylus, polipeptidos de Setaria, polipeptidos de Spirocerca, polipeptidos de Spirometra, polipeptidos de Stephanofilaria, polipeptidos de Strongyloides, polipeptidos de Strongylus, polipeptidos de Thelazia, polipeptidos de Toxascaris, polipeptidos de Toxocara, polipeptidos de Trichinella, polipeptidos de Trichostrongylus, polipeptidos de Trichuris, polipeptidos de Uncinaria y polipeptidos de Wuchereria; y en donde dicho antigeno de ectoparasito se selecciona del grupo que consiste en polipeptidos de pulga; polipeptidos de garrapatas, polipeptidos de garrapatas duras, polipeptidos de garrapatas blandas; polipeptidos de moscas, polipeptidos de mosquito pequefo, polipeptidos de mosquito zancudo, polipeptidos de mosquito transmisor de la leishmaniosis, polipeptidos de moscas negras, polipeptidos del tabano, polipeptido de la mosca del cuerno,
    5 polipeptido de tabanidos, polipeptidos de la mosca tse-tse, polipeptidos de la mosca mordedora, polipeptidos de la mosca que ocasiona la miasis y polipeptidos de la mosca zancuda chupadora; polipeptidos de la mosca de la hormiga; polipeptidos de la mosca de la arafa, polipeptidos de la mosca de los piojos; polipeptidos de la mosca de los acaros, polipeptidos de la mosca de las chinches de la cama y polipeptido de la mosca de los insectos chupasangre.
    10 15. Virus recombinante para uso de acuerdo con la reivindicacion 5, en donde el virus recombinante se administra por via subcutanea o intradermica.
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