BRPI0714495B1 - Lentivírus deficiente para replicação recombinante pseudotipado - Google Patents

Lentivírus deficiente para replicação recombinante pseudotipado Download PDF

Info

Publication number
BRPI0714495B1
BRPI0714495B1 BRPI0714495-4A BRPI0714495A BRPI0714495B1 BR PI0714495 B1 BRPI0714495 B1 BR PI0714495B1 BR PI0714495 A BRPI0714495 A BR PI0714495A BR PI0714495 B1 BRPI0714495 B1 BR PI0714495B1
Authority
BR
Brazil
Prior art keywords
virus
cells
antigen
polypeptides
viral
Prior art date
Application number
BRPI0714495-4A
Other languages
English (en)
Inventor
Pin Wang
Lili Yang
David Baltimore
Original Assignee
California Institute Of Technology
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by California Institute Of Technology filed Critical California Institute Of Technology
Publication of BRPI0714495A2 publication Critical patent/BRPI0714495A2/pt
Publication of BRPI0714495B1 publication Critical patent/BRPI0714495B1/pt
Publication of BRPI0714495B8 publication Critical patent/BRPI0714495B8/pt

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
    • A61K35/76—Viruses; Subviral particles; Bacteriophages
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/177—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/177—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • A61K38/1774—Immunoglobulin superfamily (e.g. CD2, CD4, CD8, ICAM molecules, B7 molecules, Fc-receptors, MHC-molecules)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/177—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • A61K38/178—Lectin superfamily, e.g. selectins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/177—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • A61K38/1793—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/191—Tumor necrosis factors [TNF], e.g. lymphotoxin [LT], i.e. TNF-beta
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/193—Colony stimulating factors [CSF]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/20—Interleukins [IL]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/20—Interleukins [IL]
    • A61K38/2013—IL-2
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/20—Interleukins [IL]
    • A61K38/2026—IL-4
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/20—Interleukins [IL]
    • A61K38/204—IL-6
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/20—Interleukins [IL]
    • A61K38/2046—IL-7
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/20—Interleukins [IL]
    • A61K38/2086—IL-13 to IL-16
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/21—Retroviridae, e.g. equine infectious anemia virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/10—Antimycotics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P33/00—Antiparasitic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C12N15/867—Retroviral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5256—Virus expressing foreign proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/13011—Gammaretrovirus, e.g. murine leukeamia virus
    • C12N2740/13041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2740/13043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/13011—Gammaretrovirus, e.g. murine leukeamia virus
    • C12N2740/13041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2740/13045—Special targeting system for viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/15011—Lentivirus, not HIV, e.g. FIV, SIV
    • C12N2740/15041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/15011—Lentivirus, not HIV, e.g. FIV, SIV
    • C12N2740/15041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2740/15043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/15011—Lentivirus, not HIV, e.g. FIV, SIV
    • C12N2740/15041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2740/15045—Special targeting system for viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/36011—Togaviridae
    • C12N2770/36111—Alphavirus, e.g. Sindbis virus, VEE, EEE, WEE, Semliki
    • C12N2770/36122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/36011—Togaviridae
    • C12N2770/36111—Alphavirus, e.g. Sindbis virus, VEE, EEE, WEE, Semliki
    • C12N2770/36134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2810/00—Vectors comprising a targeting moiety
    • C12N2810/50—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein
    • C12N2810/60—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein from viruses
    • C12N2810/609—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein from viruses positive strand RNA viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2810/00—Vectors comprising a targeting moiety
    • C12N2810/50—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein
    • C12N2810/80—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein from vertebrates
    • C12N2810/85—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein from vertebrates mammalian
    • C12N2810/855—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein from vertebrates mammalian from receptors; from cell surface antigens; from cell surface determinants
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • AIDS & HIV (AREA)
  • Transplantation (AREA)

Abstract

método de liberação de polinucleotídio para célula dendrítica que expressa dc-sign, vetor, vírus recombinantes e célula dendrítica transduzida com os mesmos e seus usos. são proporcionados métodos e composições para a liberação de um polinucleotídio que codifica um gene de interesse, tipicamente um antígeno, para uma célula dendrítica (dc). o envelope de vírus compreende uma molécula alvo específica de dc-sign. os métodos e composições relacionados podem ser usados para tratar pacientes que sofrem de uma grande variedade de condições, incluindo infecção, tal como hiv/aids e vários tipos de câncer.

Description

RELATÓRIO DESCRITIVO ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
[001] A invenção refere-se em geral à liberação de gene dirigido para alvo e, mais particularmente, ao uso de um vírus recombinante que compreende uma molécula direcionadora que localiza e se liga a células dendríticas e pode, assim, ser usado para vacinação em células dendríticas.
[002] A imunização é uma das mais produtivas ferramentas na prática médica moderna, mas permanece sobrecarregada de limitações. Certas doenças infecciosas tais como HIV/AIDS, malária e tuberculose não são atualmente de forma alguma controladas por imunização, enquanto outras doenças infecciosas são controladas por regimes de imunização complexos. O câncer é um objetivo promissor para tratamentos imuno-terapêuticos, mas as respostas clínicas de testes experimentais têm sido desapontadoras (Rosenberg, S.A. e colaboradores, 2004, Nat. Med. 10:909-915, que é aqui incorporado neste documento por referência em sua totalidade). Novos métodos de imunização são necessários, por exemplo, para com confiança induzir a imunidade antitumoral.
[003] As células dendríticas (DCs) têm um papel crítico em ambas a imunidade inata e adquirida. As DCs são células apresentadoras de antígenos especializadas com a capacidade única de capturar e processar antígenos, migrar de um órgão periférico para um linfóide e apresentar os antígenos ao restante das células T de um modo restrito ao complexo principal de histocompatibilidade (MHC) (Banchereau, J. & Steinman, R. M., 1998, Nature 392:245-252; Steinman, R. M. e colaboradores, 2003, Ann. Ver. Immunol., 21:685-711, cada um dos quais é aqui incorporado neste documento por referência em suas totalidades). Estas células são derivadas da medula óssea (BM) e são caracterizadas pela morfologia dendrítica e alta mobilidade. DCs imaturas são aptas à ingestão de antígenos e estão distribuídas como sentinelas no tecido periférico por todo o corpo. Todavia, a maturação das DCs é requerida de forma a se montar uma resposta imuno eficiente (Steinman, R. M. e colaboradores, 2003, supra). As DCs maduras expressam altos níveis do complexo antígeno MHC e outras moléculas de co-estimulação (tais como CD40, B7-1, B7-2 e CD1a) (Steinman, R. M., 1991, Ann. Rev. Immunol, 9:271-296, que é aqui incorporado neste documento por referência em sua totalidade; Banchereau, J. & Steinman, R. M., 1998, supra). Estas moléculas têm um papel chave na estimulação de células T.
[004] A descoberta do papel das DCS como células apresentadoras de antígenos especializadas (APCs) tem levado a tentativas na vacinação/imunização baseada em DCs que envolve a carga de DCs com antígenos específicos (Banchereau, J. & Palucka, A.K., 2005, Nat. Rev. Immunol., 5:296-306; Figdor, C.G. e colaboradores, 2004, Nat. Med., 10:475-480, cada um dos quais é aqui incorporado neste documento por referência em suas totalidades). Todavia, todas estas tentativas envolvem cargas ex vivo de DCs com antígenos específicos. DCs gerados ex vivosão então administrados ao paciente. A geração ex vivo de DCs para cada paciente é um processo intensivo extremamente trabalhoso.
[005] Pelo contrário, a presente invenção é dirigida inter alia ao direcionamento, carga de antígeno e ativação das DCs in vivo, o que resulta no tratamento in vivo de doenças pela geração de uma resposta imuno benéfica no paciente. A invenção preenche, assim, uma necessidade de longo tempo de regimes eficientes e efetivos de vacinação/imunização.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[006] Em um aspecto da invenção, são proporcionados métodos da invenção de liberação de um polinucleotídeo a uma célula dendrítica expressando a DC-SIGN. Em algumas modalidades, os métodos compreendem a transdução da célula dendrítica com um vírus recombinante, onde o vírus recombinante compreende o polinucleotídeo a ser liberado e uma molécula direcionadora que se liga à DC-SIGN. Em algumas modalidades, a molécula direcionadora é específica para a DC-SIGN.
[007] Em algumas modalidades da invenção, o vírus recombinante compreende sequências de um genoma lentivírus, tal como um genoma de HIV.
[008] Em outras modalidades, o vírus recombinante compreende sequências de um genoma de gamaretrovírus, tal como as sequências de um genoma de Vírus de Célula Tronco de Camundongo (MSCV) ou um genoma de Vírus de Leucemia Murina (MLV).
[009] Em algumas modalidades da invenção, os métodos utilizam uma molécula direcionadora compreendendo uma glicoproteína viral derivada de pelo menos um vírus selecionado a partir do grupo de: vírus Sindbis, vírus influenza, vírus da febre de Lassa, vírus da encefalite transmitido por carrapatos, vírus da dengue, vírus da hepatite B, vírus Rabies, vírus Semliki Forest, vírus Ross River, vírus Aura, vírus da doença de Borna, vírus Hantaan e vírus SARS-CoV. Em modalidades mais particulares, uma molécula direcionadora compreende uma glicoproteína viral modificada derivada do vírus Sindbis (SIN ou SVG). Em certas modalidades, a molécula direcionadora é SINmu também conhecida como SVGmu (SEQ ID NO:11).
[0010] Em algumas modalidades, o polinucleotídeo a ser liberado para uma célula dendrítica compreende pelo menos um dos seguintes: um gene codificando uma proteína de interesse, um gene que codifica um siRNA e um gene codificando um microRNA. O gene que codifica uma proteína de interesse pode codificar um antígeno, tal como um antígeno de tumor ou um antígeno de HIV.
[0011] O vírus recombinante pode ser produzido pela transfecção de uma linhagem de células de empacotamento com um vetor viral compreendendo o polinucleotídeo a ser liberado e um vetor compreendendo um gene codificando a molécula direcionadora; cultura da linhagem de célula de empacotamento transfectada e recuperação do vírus recombinante da cultura de célula de empacotamento. Em algumas modalidades, a linhagem de célula de empacotamento é uma linhagem de célula 293.
[0012] Em algumas modalidades da invenção, o polinucleotídeo é liberado para uma célula dendrítica in vitro, enquanto, em outras modalidades, o polinucleotídeo é liberado para uma célula dendrítica a um sujeito in vivo. O sujeito é tipicamente um mamífero, tal como uma Pessoa humana, camundongo ou porquinho da índia.
[0013] Em outro aspecto, são proporcionados um vírus recombinante que compreende: um polinucleotídeo de interesse e uma molécula direcionadora que se liga à DC-SIGN. Em algumas modalidades a molécula direcionadora especificamente se liga à DC- SIGN. O vírus recombinante pode compreender sequências de um genoma de lentivírus, tais como as sequências de um genoma de HIV. Em outras modalidades o vírus recombinante compreende sequências de um genoma de gamaretrovírus, tais como sequências de um genoma de Vírus de Célula Tronco de Camundongo (MSCV) ou genoma de um Vírus de Leucemia Murino (MLV).
[0014] A molécula direcionadora pode compreender uma glicoproteína viral derivada de pelo menos um vírus selecionado do grupo de: vírus Sindbis, vírus influenza, vírus da febre de Lassa, vírus da encefalite transmitido por carrapatos, vírus da dengue, vírus da hepatite B, vírus Rabies, vírus Semliki Forest, vírus Ross River, vírus Aura, vírus da doença de Borna, vírus Hantaan e vírus SARS-CoV. Em algumas modalidades a molécula direcionadora é uma glicoproteína viral derivada do vírus Sindbis. Em modalidades particulares, a molécula direcionadora é a SVGmu (SEQ ID NO:11).
[0015] O polinucleotídeo pode ser, por exemplo, pelo menos um dos seguintes: um gene codificando uma proteína de interesse, um gene codificando um siRNA e um gene codificando um microRNA de interesse. Em algumas modalidades o polinucleotídeo codifica um antígeno, tal como um antígeno de tumor ou um antígeno de HIV.
[0016] Em outro aspecto, são proporcionados métodos para estimular uma resposta imuno em um mamífero. Um polinucleotídeo que codifica um antígeno para o qual uma resposta imuno é desejada é liberado para células dendríticas expressando DC-SIGN pelo contato das células dendríticas com um vírus recombinante compreendendo o polinucleotídeo e uma molécula direcionadora que se liga à DC-SIGN. Em algumas modalidades, a molécula direcionadora é específica para DC-SIGN e não se liga apreciavelmente a outras moléculas. Em outras modalidades, a molécula direcionadora liga-se preferencialmente à DC- SIGN.
[0017] Num aspecto adicional, são providos vetores que codificam moléculas direcionadoras que se ligam à DC-SIGN. Em algumas modalidades, a molécula direcionadora é uma glicoproteína viral modificada. Em modalidades adicionais, a molécula direcionadora é SVGmu (SEQ ID NO: 11). A molécula direcionadora especificamente se liga à DC-SIGN em algumas modalidades. O vetor pode adicionalmente codificar um ou mais genes de interesse, tal como um gene codificando um antígeno e/ou um gene codificando um fator de maturação de célula dendrítica.
[0018] Ainda num aspecto adicional, são proporcionados métodos de tratamento de paciente com uma doença. Um vírus recombinante é administrado ao paciente, onde o vírus recombinante compreende um polinucleotídeo codificando um antígeno associado com a doença e uma molécula direcionadora que se liga à DC-SIGN. A molécula direcionadora pode ser derivada de uma glicoproteína viral. Em algumas modalidades, a molécula direcionadora é SVGmu (SEQ ID NO: 11).
[0019] A doença a ser tratada é geralmente uma para a qual o antígeno é conhecido ou pode ser identificado. Em algumas modalidades da invenção, a doença a ser tratada é câncer. Em outras modalidades, a doença é o HIV/AIDS.
[0020] São também proporcionadas células dendríticas transduzidas com um vírus recombinante, em que o vírus recombinante compreende um polinucleotídeo de interesse e uma molécula direcionadora que se liga à DC-SIGN. Em algumas modalidades, a molécula direcionadora compreende uma glicoproteína viral derivada de pelo menos um vírus selecionado a partir do grupo de: vírus Sindbis, vírus influenza, vírus da febre de Lassa, vírus da encefalite transmitido por carrapatos, vírus da dengue, vírus da hepatite B, vírus Rabies, vírus Semliki Forest, vírus Ross River, vírus Aura, vírus da doença de Borna, vírus Hantaan e vírus SARS-CoV. Em algumas modalidades, a molécula direcionadora é SVGmu (SEQ ID NO:11).
[0021] São também providos métodos de imunização de um mamífero pela liberação de um polinucleotídeo que codifica um antígeno a células dendríticas expressando a DC-SIGN em que as células dendríticas são contatadas com um vírus recombinante compreendendo um polinucleotídeo codificando um antígeno e uma molécula direcionadora que se liga à DC-SIGN. Em algumas modalidades, as células dendríticas são contatadas com o vírus recombinante ex vivo. Em outras modalidades, as células dendríticas são contatadas com o vírus recombinante in vivo.
[0022] Os métodos revelados aqui neste documento também podem ser usados para estimular uma resposta imuno a um antígeno específico em um mamífero pela liberação de um polinucleotídeo codificando o antígeno a células dendríticas usando um vírus recombinante compreendendo um polinucleotídeo e uma molécula direcionadora que se liga à DC-SIGN. A resposta imuno pode ser modulada ao fornecer um polinucleotídeo adicional cuja expressão na célula dendrítica modula a resposta imuno. Por exemplo, um polinucleotídeo codificando um fator de maturação dendrítico pode ser liberado.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[0023] A FIG. 1 é uma representação esquemática de uma estratégia geral células dendríticas (DCs) direcionadas para a liberação de antígeno. A glicoproteína do tipo selvagem do vírus Sindbis é levada à mutação no local de ligação do sulfato de heparana para abolir sua habilidade de se ligar. A glicoproteína mutante resultante (SVGmu) se liga à DC-SIGN mas não se liga ao sulfato de heparina. DC-SIGN: Não Integrina que se prende ao ICAM-3 (Moléculas de Adesão Intracelular 3) Específicas de Célula Dendrítica.
[0024] A FIG. 2 ilustra imagens de microscópio confocal a laser de partículas de vírus coletadas de células produtoras de vírus transfectadas de forma transiente com o vetor lentiviral, plasmídeos codificando GFP-vpr e SVGmu e outros construtos de empacotamento necessários. As partículas do vírus são rotuladas com GFP (verde). A incorporação da superfície da SVGmu foi detectada por imunotingimento com um anticorpo de identificação anti-HA (vermelho) para rotular a SVGmu. No slide “GFP”, partículas virais rotuladas com GFP são verdes. No slide “SVGmu”, partículas virais com incorporação de superfície de SVGmu são tingidas de vermelho. No slide “Misturado”, partículas virais em que apenas o GFP é expresso são verdes, partículas virais onde apenas a SVGmu é incorporada na superfície são vermelhas e partículas virais expressando ambos GFP e SVGmu contida são amarelas. A superposição das cores verde e vermelha (amarelo) indica as partículas virais contendo SVGmu, as quais representam a maioria das partículas de vírus total. A barra de escala representa 2 μm.
[0025] A FIG. 3A mostra uma análise citométrica de fluxo de linhagens de células alvo-dirigidas construídas 293T.hDCSIGN expressando DC-SIGN humano e 293T.mDCSIGN expressando DC- SIGN murino. A linha sólida: expressão da DC-SIGN em linhagens de células alvo-dirigidas; área sombreada: fundo tingido em células 293T.
[0026] A FIG. 3B mostra resultados da citometria de fluxo para detecção do GFP expresso em células 293T transduzidas com lentivetor envelopado com glicoproteína Sindbis do tipo selvagem (FUGW/SVG) ou glicoproteína Sindbis mutante (FUGW/SVGmu). Um mililitro dos sobrenadantes virais frescos de FUGW/SVG e FUGW/SVGmu foram usados para transdução de células 293T (2 x 105) expressando DC- SIGN humano (293T.hDCSIGN) ou DC-SIGN murino (293T.mDCSIGN). As células 293T originais sem a expressão da DC-SIGN foram incluídas como controles. Como ilustrado, lentivetor envelopado com a glicoproteína do vírus Sindbis mutante (SVGmu) é capaz de especificamente transduzir células 293T expressando a DC-SIGN de humano ou de camundongo. O título da transdução específica da FUGW/SVGmu foi estimado ser aproximadamente 1 x 106TU/ml para 293T.hDCSIGN e aproximadamente 0,8 x 106TU/ml para a 293T.mDCSIGN.
[0027] A FIG. 4A mostra os resultados da citometria de fluxo que ilustram a habilidade do lentivírus FUGW envelopado com o a glicoproteína Sindbis mutante (FUGW/SVGmu) para especificamente transduzir células dendríticas de camundongos expressando DC-SIGN em uma cultura de medula óssea misturada primária. A totalidade das células da medula óssea isoladas de camundongo B6 foram expostas ao sobrenadante viral fresco de FUGW/SVGmu. O lentivetor FUGW pseudotipado com a glicoproteína ecotrópica (FUGW/Eco) foi incluído como um controle não direcionador. Antígenos de superfície das células GFP-positivas foram acessadas pelo tingimento com anticorpos anti- CD11c e anti-DC-SIGN.
[0028] A FIG. 4B mostra os resultados da citometria de fluxo indicando que o lentivírus FUGW envelopado com a glicoproteína Sindbis mutante (FUGW/SVGmu) não transduz outros tipos de células incluindo células T primárias (CD3+, painel de topo) e células B (CD19+), painel de fundo). As células T CD3+primárias e células B CD19+foram isoladas a partir do baço de camundongo e transduzidas com o sobrenadante viral fresco seja do vetor direcionador FUGW/SVGmu ou não direcionador FUGW/Eco. A expressão GFP foi analisada por citometria de fluxo. Linha sólida: células expostas ao vetor lentiviral indicado; área sombreada: células sem transdução (como um controle negativo).
[0029] A FIG. 5 mostra os resultados da citometria de fluxo que ilustra a habilidade do lentivírus FUGW envelopado com uma glicoproteína Sindbis mutante (FUGW/SVGmu) para especificamente transduzir as DCs derivadas da medula óssea (BMDCs). As BMDCs foram geradas ao se por em cultura células da medula óssea isoladas frescas na presença da citocina GM-CSF por 6 dias. As células foram então transduzidas com o sobrenadante viral fresco seja do vetor FUGW/SVGmu direcionador ou FUGW/Eco não direcionador. As expressões da GFP e CD11c foram medidas por citometria de fluxo.
[0030] A FIG. 6 mostra a ativação de BMDCs após transdução direcionada com FUGW/SVGmu. A ativação DC foi acessada pela análise da expressão na superfície da CD86 e I-Abusando citometria de fluxo. A adição de LPS (1 μg/ml) durante a noite foi usada como um estimulador sinergético para a ativação de BMDCs transduzidas. Área sombreada: GFP negativo (não transduzido); linha sólida: GFP positivo (transduzido).
[0031] As FIGS. 7A, 7B e 7C ilustram o direcionamento de DCs in vivo lentivírus FUGW/SVGmu. Camundongos B6 foram injetados com 50 x 106TU de FUGW/SVGmu e analisados dias depois. Camundongos não imunizados foram incluídos como um controle. Na FIG. 7A, as imagens mostram o tamanho de um nódulo de linfa inguinal representativo próximo do local da injeção comparado com aquela do nódulo de linfa equivalente distante do local de injeção. A FIG. 7B ilustra a contagem do número de células totais dos nódulos de linfa indicado na Figura 7A. A FIG. 7C ilustra a análise de citometria de fluxo representativa de células CD11c+de dois nódulos de linfa mostrados na Figura 7A. Os números indicam a fração de populações de GFP+DC.
[0032] A FIG. 8 fornece uma representação esquemática de um lentivetor codificando o antígeno OVA (FOVA) (topo) e o lentivetor codificando GFP (FUGW) como um controle (fundo).
[0033] A FIG. 9 ilustra a estimulação in vitro de células T CD8+OT1 por células dendríticas que foram transduzidas com o lentivetor FOVA/SVGmu (DC/FOVA) ou FUGW/SVGmu (DC/FUGW) ou por BMDCs não transduzidas pulsadas com peptídeo OVAp (SIINFEKL) (DC/OVAp). Padrões de marcadores de ativação da superfície de células T OT1 em co-cultura com BMDCs foram acessadas por tingimento de anticorpo para CD25, CD69, CD62L e CD44. Área sombreada: células T OT1 não tocadas coletadas de animais transgênicos; linha sólida: células T OT1 em co-cultura com as BMDCs indicadas.
[0034] A FIG. 10A ilustra a medida de IFN-y por ELISA em células T OT1 misturadas com várias diluições de BMDCs transduzidas com FOVA/SVGmu (■), FUGW/SVGmu (•) ou pulsada com o peptídeo OVAp (▲) e em cultura por 3 dias.
[0035] A FIG. 10B ilustra as respostas proliferativas de células T OT1 tratadas a partir da Figura 10A medidas por um teste de incorporação de timidina [3H] por 12 horas.
[0036] A FIG. 11 ilustra a estimulação in vitro de células T OT2 CD4+por células dendríticas que foram transduzidas com o lentivetor FOVA/SVGmu (DC/FOVA) ou FUGW/SVGmu (DC/FUGW) ou por BMDCs não transduzidas pulsadas com o peptídeo OVAp* (ISQAVHAAHAEINEAGR) (DC/OVAp*). Padrões de marcadores de ativação da superfície de células T transgênicas OT2 em co-cultura com BMDCs foram acessadas por tingimento de anticorpo para CD25, CD69, CD62L e CD44. Área sombreada: células T OT2 não tocadas coletadas de animais transgênicos; linha sólida: células T OT1 em co-cultura com BMDCs.
[0037] A FIG. 12 ilustra a medida de IFN-y por ELISA em células T OT2 misturadas com várias diluições de BMDCs transduzidas com FOVA/SVGmu (■), FUGW/SVGmu (•) ou pulsada com o peptídeo OVAp (▲) e em cultura por 3 dias.
[0038] A FIG. 13A proporciona uma representação esquemática de um vetor retroviral MIG-OT1 usado para modificação genética de células tronco hematopoiéticas murinas (HSCs).
[0039] A FIG. 13B ilustra como as células T OT1 CD8+de HSCs modificadas MIG-OT1 em camundongos reconstituídos foram identificadas pela co-expressão de GFP e TCR Vα2 ou Vβ5. HSCs de camundongos B6 foram infectadas com MIG-OT1 pseudotipadas com Eco (MIG-OT1/Eco) e transferidas para dentro camundongos recipientes B6 irradiados. Oito semanas pós-transferência, as células T OT1 CD8+foram identificadas por citometria de fluxo.
[0040] A FIG. 14A ilustra o acesso de padrões de marcadores de ativação de superfície em células T GFP+OT1+isoladas a partir de baços de camundongos reconstituídos e imunizados. Camundongos reconstituídos por HSCs modificadas MIG-OT1 foram imunizados por injeção sub-cutânea direta de 10 x 106TU seja de FOVA/SVGmu ou FUGW/SVGmu (como um controle) e analisados sete dias depois. A detecção do tingimento da superfície para CD69, CD62L e CD44 foi conduzida. Linha sólida: células T GFP+OT1+de camundongos imunizados FOVA/SVGmu; linha pontilhada: células T GFP+OT1+de camundongos imunizados FOVA/SVGmu camundongos imunizados FUGWSVGmu de controle; área sombreada: células T GFP+OT1+de camundongos imunizados células T GFP+OT1+de camundongos não imunizados.
[0041] A FIG. 14B ilustra o número total de células OT 1 em coletadas de nódulos da linfa (LN, □) ou baços (SP, ■) de camundongos não imunizados (não imun) ou camundongos imunizados com FUGW/SVGmu ou FOVA/SVGmu.
[0042] A FIG. 15 ilustra a estimulação in vivo de respostas de célula T específica a antígeno e de anticorpo em camundongos do tipo normal após uma injeção sub-cutânea do lentivetor FOVA/SVGmu direcionador a DC. Camundongos B6 foram imunizados de forma subcutâneacom 50 x 106TU seja de FOVA/SVGmu ou FUGW/SVGmu (como um controle). Camundongos sem imunização (não imun.) foram incluídos como controle negativo. Quatorze dias pós-imunização, células do baço foram coletadas e analisadas quanto à presença de células T OVA específicas medido por tetrâmero SIINFEKL-PE e tingimento CD44. As porcentagens indicadas são a porcentagem total de células T CD8+.
[0043] As FIGS. 16A e 16B ilustram respostas de células T OVA específicas in vivo em camundongos recebendo diferentes doses sub-cutâneasde FOVA/SVGmu. Células T OVA específicas foram identificadas por tingimento com tetrâmero como na Figura 17. A FIG. 16A mostra a porcentagem medida de células T OVA específicas após a imunização com 100 x 106TU de FOVA/SVGmu. A FIG. 16B mostra as respostas das doses de células T OVA específicas após injeção das doses indicadas de FOVA/SVGmu.
[0044] A FIG. 17A ilustra os padrões dos marcadores de ativação de superfície de células T CD8+OVA específicas (identificadas como células positivas ao tetrâmero) isoladas de camundongos imunizados FOVA/SVGmu 2 semanas pós-injeção. Os marcadores de ativação de superfície foram acessados por tingimento de anticorpo para CD25, CD69, CD62L e CD44. Linha sólida: células T tetrâmero+CD8+de camundongos imunizados FOVA/SVGmu; área sombreada: células T CD8+não tocadas de camundongos não imunizados.
[0045] A FIG. 17B ilustra o título IgG de soro OVA específico de camundongos B6 após imunização com 50 x 106TU de FOVA/SVGmu. Os soros foram coletados no dia 7 e dia 14 pós-imunização e foram analisados para o título de IgG OVA específico usando ELISA em diluições seriais de 10x, começando em 1:100. Os valores do título foram determinados pela diluição mais alta na qual a densidade ótica era 2x derivações padrões maiores do que a linha base do soro numa diluição equivalente.
[0046] A FIG. 18 ilustra o tamanho do tumor como uma função do tempo em um modelo de tumor E.G7 murino. Camundongos B6 foram imunizados com injeção subcutânea de 50 x 106TU seja de FOVA/SVGmu (▲) ou vetor imitação FUW/SVGmu (•). Nenhuma imunização (■) foi incluída como um controle. Quatro camundongos foram incluídos em cada grupo. No dia 14 pós-imunização, os camundongos foram testados com 5 x 106seja de células de tumor E.G7 (expressando o antígeno OVA, painel esquerdo) ou células de tumor EL4 parental (sem o antígeno OVA, como um controle, painel direito) de forma sub-cutânea. O crescimento do tumor foi medido com um compasso de calibre fino e é mostrado como o produto dos dois diâmetros perpendiculares maiores (mm2).
[0047] A FIG. 19 ilustra o crescimento cinético in vivo de tumores em um modelo de erradicação de tumor E.G7 murino. Uma cepa albina de camundongos B6 foi implantada com 5 x 106de células de tumor E.G7 estáveis expressando um gene imagem de luciferase de vaga-lume (E.G7.luc). Um camundongo (# 1) com implante de tumor foi incluído como um controle. Camundongos com tumores foram tratados sem imunização (# 2) ou com imunização com injeção de 50 x 106TU de FOVA/SVGmu nos dias 3 e 10 (# 3, # 4) pós teste do tumor. O crescimento cinético dos tumores foi monitorado por imagem do animal vivo usando BLI. O p/s/cm2/sr representa fótons/seg/cm2/ esteradiano.
[0048] A FIG. 20 mostra a quantificação de sinais de luminescência gerados pelos tumores E.G7 na Figura 19. (□) para o camundongo # 2; (•) para o camundongo # 3; (▲) para o camundongo # 4.
[0049] A FIG. 21 ilustra a porcentagem de células T OVA específicas presentes após imunização com 100 x 106TU de FOVA/SVGmu na cepa albina dos camundongos B6. Os camundongos B6 albinos foram imunizados de forma sub-cutânea com 50 x 106TU de FOVA/SVGmu. Camundongos sem imunização (não imun.) foram incluídos como controle negativo. Quatorze dias pós-imunização, as células do baço foram coletadas e analisadas quanto a presença de células T OVA específicas medidas pelo tetrâmero H-2Kb-SIINFEKL-PE e tingimento CD44. As porcentagens indicadas estão em porcentagem do total de células T CD8+.
[0050] A FIG. 22A proporciona uma representação esquemática de lentivetor DC direcionado codificando um gene imagem de luciferase de vaga-lume (Luc), designado como Fluc/SVGmu.
[0051] A FIG. 22B ilustra a imagem de bioluminescência de camundongos injetados de forma sub-cutânea com 50 x 106TU seja de lentivetor Fluc/SVGmu DC direcionador (mostrado na Figura 25A) ou um lentivetor Fluc/VSVG não direcionador. A imagem representativa foi obtida no dia 30 pós-injeção usando IVIS200®(Xenogênio).
[0052] A FIG. 23 ilustra que a administração de uma dose única de lentivetor FOVA/SVGmu DC específico recombinante pode gerar células IFN-Y+CD8+ em camundongos B6. Camundongos B6 não tocados são imunizados por injeção sub-cutânea de 50 x 106TU de lentivetor FOVA/SVGmu ou a mesma dose de FUGW/SVGmu como um controle. Os camundongos B6 não imunizados (não imun.) foram incluídos como um controle negativo. Duas semanas depois, células do baço foram coletadas dos camundongos experimentais e foram analisadas quanto à produção IFN-y intracelular usando citometria de fluxo com ou sem re-estimulação do peptídeo OVAp. As porcentagens indicadas são as porcentagens de células T IFN-y+CD8+ do total de células T CD8+.
[0053] A FIG. 24 ilustra uma representação esquemática de construtos lentivirais para a preparação de vírus recombinante DC direcionadores.
[0054] A FIG. 25 mostra uma representação esquemática de uma realização de vacinação in situ contra HIV/AIDS.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA MODALIDADE PREFERIDA
[0055] A engenharia genética tem se mostrado ser um meio eficiente e potente para converter células dendríticas (DCs) em células imuno especiais para induzir resposta imunos antígeno específicas. Uma grande quantidade de pesquisas envolvendo manipulação in vitro para as DCs para vacinação/imunização contra o câncer, HIV e outras doenças têm sido conduzidas. Todavia, até agora, não tem sido possível liberaçãor especificamente e eficientemente um gene de interesse, tal como um gene codificando um antígeno, a células dendríticas in vitro e in vivo. Os inventores têm descoberto novos métodos e composições eficientes e alvo-dirigidas específicas de DCs in vitro e in vivo. Os métodos e as composições podem ser usados para induzir respostas imuno específicas de antígenos, por exemplo, para a imunoterapia.
[0056] As modalidades da invenção incluem métodos e composições para células dendríticas direcionadoras (DCs) pelo uso de um vírus recombinante para liberaçãor um polinucleotídeo às DCs. Isto é preferivelmente efetuado através do direcionamento da molécula de superfície DC-SIGN específica de DC (Célula Dendrítica Específica ICAM-3 (Moléculas de Adesão Intracelular-3)-se prendendo à não integrina; também conhecida como CD209). A DC-SIGN é um receptor tipo lectina tipo C capaz de rápida ligação e endocitose de materiais (Geijtenbeek, T.B. e colaboradores, 2004, Annu. Ver. Immunol., 22:3354, que é aqui incorporado neste documento por referência em sua totalidade). Em modalidades específicas, vírus recombinantes são envelopados com uma molécula direcionadora projetada que é específica em seu reconhecimento pela DC-SIGN. O polinucleotídeo pode incluir, mas sem limitação um gene de interesse, siRNA(s) e/ou microRNA(s). Em modalidades preferidas, o polinucleotídeo codifica um antígeno. Em algumas modalidades, o vírus recombinante liberação mais do que um gene às DCs. Por exemplo, genes codificando dois ou mais antígenos poderiam ser liberados. A liberação de mais de um gene pode ser alcançada, por exemplo, ao ligar os genes com um Local de Entrada Interno no Ribossomo (IRES) e/ou com sequências 2A e direcionando a expressão usando um promotor/aumentador único.
[0057] Como discutido em mais detalhes abaixo, modalidades da invenção são baseadas no uso de vírus recombinantes, tais como lentivírus e gamaretrovírus, porque estes vírus são capazes de incorporar sem seus envelopes um grande número de proteínas, são encontrados na superfície de células produtoras de vírus. Todavia, como também discutido abaixo, outros tipos de vírus podem ser usados e os métodos modificados de acordo. Geralmente, uma linhagem de célula de empacotamento é transfectada com um vetor viral codificando um polinucleotídeo de interesse (tipicamente codificando um antígeno), pelo menos um plasmídeo codificando componentes de empacotamento de vírus (tais como gag e pol) e uma molécula direcionadora que é projetada para se ligar a células dendríticas. Em modalidades preferidas, a molécula direcionadora é geneticamente projetada para especificamente se ligar ao marcador de superfície de célula DC-SIGN de células dendríticas. Durante o enxerto do vírus, a molécula direcionadora, a qual é expressa na membrana da célula de empacotamento, é incorporada no envelope viral. Como resultado, as partículas retrovirais compreendem um núcleo incluindo o polinucleotídeo de interesse e um envelope compreendendo a molécula direcionadora em sua superfície.
[0058] A molécula direcionadora é capaz de se ligar à DC-SIGN em uma célula dendrítica e o vírus é capaz de líber o gene de interesse para a célula dendrítica. Sem desejar ficar limitado à teoria, acredita-se que a ligação induz a endocitose, trazendo o vírus para dentro de um endossoma, disparando a fusão da membrana e permitindo o núcleo do vírus de entrar no citosol. Seguindo a transcrição reversa e migração do produto para o núcleo, o genoma do vírus integra-se no genoma da célula alvo, incorporando o polinucleotídeo de interesse no genoma da célula alvo. A DC, então, expressa o polinucleotídeo de interesse (tipicamente codificando um antígeno).,O antígeno é, então, processado e apresentado às células T e B pelas DCs, gerando uma resposta imuno antígeno específica. O caminho específico descrito acima não é requerido desde que a célula dendrítica seja capaz de estimular uma resposta imuno antígeno específica.
[0059] Modalidades da presente invenção incluem métodos e composições para direcionamento direto de um gene de interesse às DCs ambos in vitro e in vivo. Em algumas modalidades preferidas in vivo, o gene de interesse é liberado às DCs sem cultura in vitro das DCs. Por exemplo, o gene de interesse pode ser liberado às DCs via uma administração direta do vírus direcionador em um sujeito vivo. O gene de interesse preferivelmente codifica um antígeno contra o qual uma resposta imuno é desejada. Antígenos exemplares incluem: antígenos de tumores específicos, antígenos associados a tumores, antígenos específicos de tecidos, antígenos bacteriais, antígenos virais, antígenos de leveduras, antígenos de fungos, antígenos de protozoários, antígenos de parasitas, mitógenos e semelhantes. Outros antígenos serão aparentes para uma pessoa versada na técnica e podem ser utilizados sem experimentação indevida.
[0060] Os métodos revelados aqui neste documento podem ser prontamente adotados para utilizar moléculas direcionadoras que são específicas para DCs ou que podem ser manipuladas para fornecer a especificidade desejada. A molécula direcionadora é preferivelmente uma glicoproteína viral projetada que se liga à DC-SIGN em células dendríticas e que facilita a liberação do gene de interesse nas células dendríticas. Moléculas direcionadoras exemplares incluem, mas não estão limitadas, a glicoproteínas derivadas dos seguintes: vírus Sindbis, vírus influenza, vírus da febre de Lassa, vírus da encefalite transmitido por carrapatos, vírus da dengue, vírus da hepatite B, vírus Rabies, vírus Semliki Forest, vírus Ross River, vírus Aura, vírus da doença de Borna, vírus Hantaan e vírus SARS-CoV. A molécula direcionadora é preferivelmente ligada à membrana. Se necessário, a molécula direcionadora DC-SIGN específica que é designada ou derivada de uma glicoproteína viral para uso em um vírus recombinante pode ser modificada para uma forma de ligação de membrana.
[0061] Qualquer método conhecido na técnica pode ser usado para projetar a molécula direcionadora para fornecer a especificidade desejada. Os métodos exemplificativos incluem, mas, sem limitação, à engenharia de proteína racional e embaralhamento de DNA. Geralmente, para projetar uma molécula direcionadora específica para as DCs, é proporcionada uma glicoproteína viral que interage com um marcador de superfície específico da célula dendrítica. De preferência, a glicoproteína viral interage com a DC-SIGN. A glicoproteína viral pode também interagir com pelo menos um segundo marcador de superfície celular tal como, por exemplo, sulfato de heparina (HS), que é expressa em outras células que não as DCs. A glicoproteína viral é modificada de forma que sua habilidade de interagir com o marcador de superfície DC específico é mantida enquanto sua habilidade de interagir com marcadores celulares adicionais é diminuída ou eliminada. A modificação pode ser uma mutação em pelo menos um resíduo da sequência de aminoácido da glicoproteína viral. A mutação pode ser uma deleção, adição ou substituição do resíduo e ela pode ser levada a termo por métodos padrões conhecidos na técnica. A especificidade desejada pode ser prontamente confirmada. Por exemplo, uma vez que a glicoproteína viral seja modificada, ela pode ser usada para preparar um vírus recombinante por co-transfecção com um vetor viral contendo um gene relator e pelo menos um plasmídeo codificando componentes de empacotamento do vírus em uma linhagem de células de empacotamento. A glicoproteína é incorporada no envelope viral durante enxerto do vírus. O vírus pode ser usado para transfectar ambas uma população pura de DCs bem como uma população mista de células contendo DCs e a especificidade da transdução viral das DCs pode ser confirmada testando as células para expressão do gene relator nas DCs e não em uma extensão significativa em outros tipos de células. Se a especificidade não é suficientemente rigorosa (por exemplo, se níveis indesejados de infecção de outros tipos de células é observado), a glicoproteína viral pode ser modificada ainda mais e testada como descrito até que a especificidade desejada seja alcançada.
[0062] As modalidades da presente invenção incluem a liberação às DCs de ativadores e/ou fatores de maturação de DC em conjunto com antígenos. Ativadores e fatores de maturação de DC exemplares incluem, mas, sem limitação, a moléculas de estimulação, citocinas, quimiocinas, anticorpos e outros agentes tais como os ligantes Flt-3. Por exemplo, os fatores de maturação de DC podem incluir pelo menos um dos seguintes: GM-CSF, IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-15, IL-21, IL-23, TNF-α, B7.1, B7.2, 4-1BB, ligante CD40 (CD40L) e CD40 droga indutor (iCD40) (Hanks, e colaboradores, 2005, Nat. Med. 11:130-137, o qual é aqui incorporado neste documento por referência em sua totalidade).
[0063] As modalidades da presente invenção também podem incluir métodos e composições relacionados à administração de vírus recombinante como descrito acima ou DCs infectadas com vírus recombinante em pacientes para estimular respostas imunos antígeno específicas, tais como, por exemplo, respostas de células T (respostas imuno celulares) e respostas de células B (respostas imunos humorais). Por exemplo, células T CD4 ativadas podem coordenar e orquestrar células T citotóxicas CD8+e as células B em uma resposta antígeno específica. Em modalidades preferidas, o vírus recombinante e/ou DCs infectadas com vírus recombinantes são usados para estimular respostas imunos para a prevenção e tratamento de doenças tais como, mas não limitadas, ao câncer e AIDS/HIV. Qualquer doença pode ser tratada para a qual uma resposta imuno a um antígeno em particular é benéfica, incluindo, mas não limitada, à doença neoplástica, doenças infecciosas e doenças relacionadas à imunidade.
[0064] Com aqui descrito neste documento, foram conduzidos estudos que resultaram na descoberta de métodos e composições que podem ser usados para direcionar vírus recombinantes a fornecer genes codificando antígenos particulares em DCs. A modificação genética das DCs de forma a extrair respostas imunos produtivas pode ser usada na prevenção e tratamento de doenças e fornece um método efetivo de induzir imunidade em células T efetiva bem como forte produção de anticorpos. Os métodos e composições descritos aqui neste documento podem fornecer potentes meios para a imunização com antígenos desejados. Tal imunização pode prevenir e tratar doenças tais como, por exemplo, câncer e AIDS/HIV.
Definições
[0065] A menos que de outra forma definido, os termos técnicos e científicos usados aqui neste documento têm o mesmo significado como comumente compreendido por uma pessoa versada na técnica ao qual esta invenção pertence. Veja, por exemplo, Singleton e colaboradores, Dictionary of Microbiology and Molecular Biology,2aed., J. Wiley & Sons (New York, NY 1994); Sambrook e colaboradores, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor Press (Cold Springs Harbor, NY, 1989). Quaisquer métodos, dispositivos e materiais similares ou equivalentes àqueles descritos aqui neste documento podem ser usados na prática desta invenção.
[0066] Com aqui usado neste documento, os termos ácido nucléico, polinucleotídeo e nucleotídeo são intercambiáveis e referem-se a qualquer ácido nucléico, se composto de ligações fosfodiésteres ou ligações modificadas tais como fosfotriéster, fosforamidato, siloxano, carbonato, carboximetiléster, acetamidato, carbamato, tioéter, fosforamidato em ponte, metileno fosfonato em ponte, fosforamidato em ponte, fosforotioato, metilfosfonato, fosforoditioato, fosforotioato em ponte ou ligações sulfonas e combinações de tais ligações.
[0067] Os termos ácido nucléico, polinucleotídeo e nucleotídeo incluem também especificamente ácidos nucléicos compostos de bases outras que as cinco bases que ocorrem biologicamente (adenina, guanina, timina, citosina e uracila).
[0068] Como aqui usado neste documento, uma molécula de ácido nucléico é dita ser “isolada” quando a molécula de ácido nucléico é substancialmente separada de moléculas de ácido nucléico contaminantes codificando outros polipeptídeos.
[0069] “Imunização” refere-se à provisão de antígeno a um hospedeiro. Em algumas modalidades, é proporcionado o antígeno a células que apresentam antígeno, tais como as células dendríticas. Como descrito abaixo, o vírus recombinante compreendendo um gene codificando um antígeno pode ser direcionado a células dendríticas com uma molécula de afinidade específica para a DC-SIGN nas células dendríticas. Assim, o antígeno para o qual uma resposta imuno é desejada pode ser liberado às células dendríticas. Outros métodos de imunização são bem conhecidos na técnica.
[0070] O termo resposta “imunológica” ou “imuno” é o desenvolvimento de uma resposta humoral (mediada por anticorpo) e/ou celular (mediada por células T antígeno específicas ou seus produtos de secreção) benéfica direcionada contra um peptídeo amilóide em um paciente recipiente. Essa resposta pode ser uma resposta ativa induzida pela administração de imunógeno ou uma resposta passiva induzida pela administração de anticorpo ou células T condicionadas. Uma resposta imuno celular é induzida pela apresentação de epítopes de polipeptídeo em associação com moléculas MHC da Classe I ou Classe II para ativar células T auxiliares CD4+e/ou células T citotóxicas CD8+. A resposta pode também envolver a ativação de monócitos, macrófagos, células NK, basófilos, células dendríticas, astrócitos, células micróglias, eosinófilos ou outros componentes da imunidade inata. A presença de uma resposta imunológica mediada pela célula pode ser determinada por testes de proliferação (células T CD4+) ou testes CTL (linfócito T citotóxico) (Burke e colaboradores, J. Inf. Dis., 170, 1110-19 (1994)), por morte dependente do antígeno (teste de linfócito T citotóxico, Tigges e colaboradores, J. Immunol., 156, 3901 3910) ou por secreção de citocina. As contribuições relativas das respostas humoral e celular ao efeito protetor ou terapêutico de um imunógeno podem ser distinguidas ao isoladamente separar células T e IgG de um animal singenéico imunizado e medindo o efeito protetor ou terapêutico em um segundo sujeito.
[0071] Um “agente imunogênico” ou “imunógeno” é capaz de induzir uma resposta imunológica contra ele mesmo na administração a um paciente, opcionalmente em conjunto com um adjuvante.
[0072] O termo “adjuvante” se refere a um composto que quando administrado em conjunto com um antígeno aumenta, melhora e/ou implementa a resposta imuno para o antígeno, mas quando administrado sozinho não gera uma resposta imuno para o antígeno. Um adjuvante pode ser administrado com o vírus recombinante da invenção como uma composição única ou pode ser administrado antes, concorrentemente com ou após a administração do vírus recombinante da invenção. Adjuvantes podem aumentar uma resposta imuno por diversos mecanismos incluindo recrutamento de linfócito, estimulação de células B e/ou T e estimulação de macrófagos.
[0073] “Anticorpos” (Abs) e “imunoglobulinas” (Igs) são glicoproteínas tendo as mesmas características estruturais. Enquanto os anticorpos exibem especificidade de ligação a um antígeno específico, as imunoglobulinas incluem ambos os anticorpos e outras moléculas semelhantes a anticorpos que não possuem especificidade a um antígeno. Os polipeptídeos do último tipo são, por exemplo, produzidos em baixos níveis pelo sistema linfático e em níveis aumentados pelo mielomas.
[0074] O termo “anticorpo” é usado em seu sentido mais amplo e especificamente cobre anticorpos humanos, não humanos (por exemplo, murinos), quiméricos e anticorpos monoclonais humanizados (incluindo anticorpos monoclonais completos), anticorpos policlonais, anticorpos multi-específicos (por exemplo, anticorpos bi-específicos), anticorpos de cadeia simples e fragmentos de anticorpos desde que eles exibam a atividade biológica desejada. Tipicamente, os fragmentos competem com o anticorpo intacto do qual eles foram derivados para ligação específica a um antígeno.
[0075] O termo “epítope” ou “determinante antigênico” se refere a um local em um antígeno ao qual as células B e/ou T respondem. Os epítopes de células B podem ser formados de ambos os aminoácidos contíguos ou aminoácidos não contíguos justapostos pela estrutura terciária de uma proteína. Os epítopes formados de aminoácidos contíguos são tipicamente retidos na exposição a solventes desnaturantes enquanto epítopes formados pelo enovelamento terciário são tipicamente perdidos no tratamento com solventes desnaturantes. Um epítope tipicamente inclui pelo menos 3 e mais usualmente, pelo menos 5 ou 8-10 aminoácidos em uma conformação especial única. Métodos de determinação da conformação espacial de epítopes incluem, por exemplo, cristalografia de raio-X e ressonância magnética nuclear bi-dimensional. Veja, por exemplo, Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, vol. 66, Glenn E. Morris, Ed. (1996). Anticorpos que reconhecem o mesmo epítope podem ser identificados em um imuno teste simples mostrando a habilidade de um anticorpo de bloquear a ligação de outro anticorpo a um antígeno alvo. As células T reconhecem epítopes contínuos de cerca de nove aminoácidos para células CD8 ou cerca de 13-15 aminoácidos para células CD4. As células T que reconhecem o epítope podem ser identificadas por testes in vitro que medem a proliferação antígeno dependente, como determinado pela incorporação de 3H-timidina por células T condicionadas em resposta a um epítope (ver Burke, supra; Tigges, supra).
[0076] “Células alvo” são quaisquer células para as quais a liberação de um polinucleotídeo ou nas quais a expressão de um gene de interesse é desejada. Preferivelmente, células alvo são células dendríticas, particularmente células dendríticas que expressam a DC- SIGN.
[0077] O termo “mamífero” é definido como um indivíduo pertencendo à classe Mammalia e inclui, sem limitação, pessoas humanas, animais domésticos e de fazenda e animais de zoológico, esportes e animais de estimação, tais como ovelhas, cachorros, cavalos, gatos e vacas.
[0078] O termo “sujeito” ou “paciente” inclui sujeitos humanos e outros mamíferos que recebem seja o tratamento profilático ou terapêutico.
[0079] Como aqui usado neste documento, “tratamento” é uma intervenção clínica que pode ser terapêutica ou profilática. Em aplicações terapêuticas, composições farmacêuticas ou medicamentos são administrados a um paciente suspeito, ou já sofrendo de tal doença em uma quantidade suficiente para curar ou pelo menos parcialmente parar os sintomas da doença e suas complicações. Em aplicações profiláticas, composições farmacêuticas ou medicamentos são administrados a um paciente suscetível de, ou de outra forma em risco de, uma doença particular em uma quantidade suficiente para eliminar ou reduzir o risco ou atrasar o início da doença. Uma quantidade adequada para efetuar isto é definida como uma dose efetiva terapeuticamente ou farmaceuticamente. Essa quantidade pode ser administrada com uma dose única ou pode ser administrada de acordo com um regime, por meio do qual ela é efetiva. A quantidade pode curar uma doença, mas, tipicamente, é administrada de forma a melhorar os sintomas de uma doença ou afetar a profilaxia de uma doença ou desordem de se desenvolver. Em ambos os regimes terapêutico e profilático, os agentes são usualmente administrados em diversas dosagens até que uma resposta imuno suficiente tenha sido alcançada. Tipicamente, a resposta imuno é monitorada e repetidas dosagens são dadas se a resposta imuno começa a enfraquecer. O “tratamento” não precisa eliminar completamente a doença, nem precisa prevenir completamente que um sujeito fique doente com a doença ou desordem.
[0080] “Tumor”, como aqui usado neste documento, se refere a todo crescimento e proliferação celular neoplástico, se maligno ou benigno e todas as células pré-cancerosas e células e tecidos cancerosos.
[0081] O termo “câncer” se refere a uma doença ou desordem que é caracterizada pelo crescimento celular desregulado. Exemplos de câncer incluem, mas, sem limitação, a carcinoma, linfoma, blastoma e sarcoma. Exemplos de cânceres específicos incluem, mas, sem limitação, a câncer do pulmão, câncer do colo, câncer do seio, câncer testicular, câncer do estômago, câncer pancreático, câncer ovariano, câncer do fígado, câncer de bexiga, câncer colo-retal e câncer de próstata. Cânceres adicionais são bem conhecidos por aqueles versados na técnica e incluem, mas, sem limitação, a leucemia, linfoma, câncer cervical, tumores de glioma, adenocarcinomas e câncer de pele. Cânceres exemplares incluem, mas, sem limitação, a tumor na bexiga, tumor no seio, tumor na próstata, carcinoma celular basal, câncer do trato biliar, câncer de bexiga, câncer de osso, câncer no cérebro e CNS (por exemplo, tumor de glioma), câncer cervical, coriocarcinoma, câncer do colo e reto, câncer do tecido conectivo, câncer do sistema digestivo, câncer endometrial, câncer do esôfago, câncer do olho, câncer da cabeça e pescoço, câncer gástrico, neoplasma intraepitelial, câncer de rim, câncer de laringe, leucemia, câncer do fígado, câncer do pulmão (por exemplo, células pequenas e células não pequenas), linfoma, incluindo linfoma de Hodgkin e não Hodgkin, melanoma, mieloma, neuroblastoma, câncer da cavidade oral (por exemplo, lábio, língua, boca e faringe), câncer no ovário, câncer no pâncreas, retinoblastoma, rabdomiossarcoma, câncer retal, câncer renal, câncer do sistema respiratório, sarcoma, câncer de pele, câncer do estômago, câncer dos testículos, câncer da tireóide, câncer uterino, câncer do sistema urinário, bem como outros carcinomas e sarcomas. O câncer também inclui neoplasias e desordens malignas em mamíferos que são bem conhecidas da técnica.
[0082] Um “vetor” é um ácido nucléico que é capaz de transportar outro ácido nucléico. Os vetores podem ser, por exemplo, plasmídeos, cosmídeos ou fagos. Um “vetor expressão” é um vetor que é capaz de direcionar a expressão de uma proteína ou proteínas codificadas por um ou mais genes carregados pelo vetor quando ele está presente no ambiente apropriado.
[0083] Os termos “elemento regulatório” e “elemento de controle de expressão” são usados de forma intercambiável e se referem a moléculas de ácido nucléicos que podem influenciar a transcrição e/ou translação de uma sequência codificadora ligada operacionalmente em um ambiente particular. Estes termos são usados largamente e cobrem todos os elementos que promovem ou regulam a transcrição, incluindo promotores, elementos núcleos requeridos para a interação básica da RNA polimerase e fatores de transcrição, elementos a montante, aumentadores e elementos de resposta (ver, por exemplo, Lwein, “Genes V” (Oxford University Press, Oxford) páginas 847-873). Elementos regulatórios exemplares em procariotas incluem promotores, sequências operadoras e locais de ligação de ribossomo. Elementos regulatórios que são usados em células eucarióticas podem incluir, sem limitação, promotores, aumentadores, sinais de “splicing” e sinais de poliadenilação.
[0084] O termo “transfecção” se refere à introdução de um ácido nucléico em uma célula hospedeira.
[0085] “Retrovírus” são vírus tendo um genoma de RNA.
[0086] “Lentivírus” se refere a um gênero de retrovírus que são capazes de infectar células que se dividem e que não se dividem. Diversos exemplos de lentivírus incluem HIV (vírus da imunodeficiência humana: incluindo HIV tipo 1 e HIV tipo 2), o agente etiológico da síndrome da imunodeficiência adquirida humana (AIDS); visna-maedi, que causa encefalite (visna) ou pneumonia (maedi) em ovelhas, o vírus da encefalite-artrite caprina, que causa deficiência imuno, artrite e encefalopatia em bodes, vírus da anemia infecciosa equina, que causa anemia hemolítica auto-imuno e encefalopatia em cavalos, vírus da imunodeficiência felina (FIV), que causa deficiência imuno em gatos, vírus da deficiência imuno bovina (BIV), que causa linfadenopatia, linfocitose e possivelmente infecção no sistema nervoso central no gado e vírus da imuno deficiência simiana (SIV), que causa deficiência imuno e encefalopatia em primatas sub-humanos.
[0087] Um genoma lentiviral é geralmente organizado em um terminal repetido longo 5’ (LTR), o gene gag, o gene pol, o gene env, os genes acessórios (nef, vif, vpr, vpu) e um LTR 3’. O LTR viral é dividido em três regiões chamadas U3, R e U5. A região U3 contém os elementos aumentadores e promotores. A região U5 contém os sinais de poliadenilação. A região R (repetido) separa as regiões U3 e U5 e sequências transcritas da região R aparecem em ambas as extremidades 5’ e 3’ do RNA viral. Veja, por exemplo, “RNA Viruses: A Practical Approach” (Alan J. Cann., Ed, Oxford University Press, (2000)), O Narayan e Clements J. Gen. Virology 70:1617-1639 (1989), Fields e colaboradores, Fundamental Virology Raven Press., (1990), Miyoshi H., Blomer U., Takahashi, M., Gage, F.H., Verma I.M., J. Virol., 72(10):8150-7, (1998) e Patente US 6.013.516.
[0088] “Gamaretrovirus” refere-se a um gênero de uma família de retrovírus. Gamaretrovírus exemplares incluem, mas, sem limitação, a vírus de célula tronco de camundongo, vírus de leucemia de murino, vírus de leucemia felino, vírus de sarcoma felino e vírus reticuloendoteliose aviário.
[0089] Um “vírus híbrido” como aqui usado neste documento refere-se a um vírus tendo componentes de um ou mais outros vetores virais, incluindo elemento de vetores não retrovirais, por exemplo, híbridos adenoviral-retroviral. Como aqui usado neste documento vetores híbridos tendo um componente retroviral são para serem considerados dentro do escopo dos retrovírus.
[0090] “Vírion”, “partícula viral” e “partícula retroviral” são usados aqui neste documento para se referir a um vírus único compreendendo um genoma de RNA, proteínas derivadas de genes pol, proteínas derivadas de genes gag e uma camada dupla de lipídeo mostrando uma (glico) proteína de envelope. O genoma de RNA é usualmente um genoma de RNA recombinante e assim pode conter uma sequência de RNA que é exógena ao genoma viral nativo. O genoma de RNA pode também compreender uma sequência viral endógena defeituosa.
[0091] Um retrovírus “pseudotipado” é uma partícula retroviral tendo uma proteína de envelope que é de um vírus diferente do vírus do qual o genoma de RNA é derivado. A proteína de envelope pode ser, por exemplo, e sem limitação, de um retrovírus diferente ou de uma origem não retroviral. A proteína de envelope pode ser uma proteína de envelope nativa ou uma proteína d envelope que é modificada, que sofreu mutação ou projetada como descrita aqui neste documento. Em algumas modalidades, uma proteína de envelope é uma glicoproteína viral DC-SIGN específica que é derivada de uma glicoproteína de uma dos seguintes: vírus Sindbis, vírus influenza, vírus da febre de Lassa, vírus da encefalite transmitido por carrapatos, vírus da dengue, vírus da hepatite B, vírus Rabies, vírus Semliki Forest, vírus Ross River, vírus Aura, vírus da doença de Borna, vírus Hantaan e vírus SARS-CoV.
[0092] “Transformação”, como aqui definido, descreve um processo pelo qual o DNA exógeno entra em uma célula alvo. A transformação pode repousar em qualquer método conhecido para a inserção de sequências de ácido nucléico estranhas em uma célula hospedeira procariótica ou eucariótica e pode incluir, mas sem limitação, infecção viral, eletroporação, choque por calor, lipofecção e bombardeamento de partícula. Células “transformadas” incluem células transformadas estáveis na quais o ácido nucléico inserido é capaz de replicação mesmo como um plasmídeo replicante de forma autônoma ou como parte de um cromossomo hospedeiro. Também incluídas são células que de forma transiente expressam um gene de interesse.
[0093] Uma molécula “fusogênica”, como aqui descrita neste documento, é qualquer molécula que pode disparar a fusão da membrana quando presente na superfície de um vírus e permite um núcleo do vírus de passar através da membrana e, tipicamente, entrar no citosol de uma célula alvo. Moléculas fusogênicas podem ser, por exemplo, glicoproteínas virais. Glicoproteínas virais exemplares contempladas como moléculas fusogênicas incluem, mas, sem limitação, hemaglutinina, hemaglutinina mutante, glicoproteínas SIN e viral dos seguintes vírus: vírus Sindbis, vírus influenza, vírus da febre de Lassa, vírus da encefalite transmitido por carrapatos, vírus da dengue, vírus da hepatite B, vírus Rabies, vírus Semliki Forest, vírus Ross River, vírus Aura, vírus da doença de Borna, vírus Hantaan e vírus SARS-CoV. Glicoproteínas podem ser nativas ou modificadas para ter a atividade desejada.
[0094] Por “transgene” entende-se qualquer sequência de nucleotídeo, particularmente uma sequência de DNA, que é integrada em um ou mais cromossomos de uma célula hospedeira por intervenção humana, tal como por métodos da presente invenção. O transgene preferivelmente compreende um “gene de interesse”.
[0095] Um “gene de interesse” não é limitado de qualquer modo e pode ser qualquer ácido nucléico, sem limitação, que é desejado ser liberado, integrado, transcrito, traduzido e/ou expresso em uma célula alvo. O gene de interesse pode codificar um produto funcional, tal como uma proteína ou uma molécula de RNA. Preferivelmente o gene de interesse codifica uma proteína ou outra molécula, a expressão da qual é desejada na célula alvo. O gene de interesse é geralmente ligado operacionalmente a outras sequências que são úteis para obter a expressão desejada do gene de interesse, tal como sequências regulatórias transcricionais. Em algumas modalidades um gene de interesse é preferivelmente um que codifica um antígeno para o qual uma resposta imuno é desejada. Outros genes de interesse que podem ser usados em algumas modalidades são genes que codificam ativadores e/ou fatores de maturação de célula dendrítica.
[0096] Um “relacionamento funcional” e “ligado operacionalmente” significa, com respeito ao gene de interesse, que o gene está na localização e orientação corretas com respeito ao promotor e/ou aumentador que a expressão do gene será afetada quando o promotor e/ou aumentador é contatado com as moléculas apropriadas.
[0097] “Sequências 2A” ou elementos são peptídeos pequenos introduzidos como um ligante entre duas proteínas, permitindo o auto- processamento intraribossomal autônomo de poliproteínas (de Felipe, Genetic Vaccines and Ther., 2:13 (2004); de Felipe e colaboradores, Traffic, 5:616-626, (2004)). Os peptídeos curtos permitem a co- expressão de múltiplas proteínas a partir de um vetor único, tal como co-expressão de uma molécula fusogênica e molécula de afinidade a partir de um mesmo vetor. Assim, em algumas modalidades, polinucleotídeos codificando os elementos 2A são incorporados em um vetor entre polinucleotídeos codificando proteínas a serem expressas.
[0098] “Fatores de maturação de DC” (também conhecido como “ativadores de DC”) são compostos que podem induzir a ativação ou estimulação de DCs de forma que as DCs facilitam a ação de extração de respostas imunos celular e humoral. Fatores de maturação de DC típicos são conhecidos na técnica e incluem, mas, sem limitação, moléculas de estimulação, citocinas, quimiocinas, anticorpos e outros agentes tais como ligantes Flt-3 (Figdor, C.G. e colaboradores, 2004, Nat. Med., 10:475-480; Pulendran, B. e colaboradores, 2000 J. Immunol., 165:566-572; Maraskovsky, E. e colaboradores, 2000, Blood, 96:878-884, cada um dos quais é aqui incorporado neste documento em sua totalidade). Fatores de maturação de DC exemplares podem incluir, mas, sem limitação, GM-CSF, IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-15, IL-21, IL-23, TNF-α, B7.1, B7.2, 4-1BB, ligante CD40 (CD40L) e CD40 droga indutor (iCD40).
Moléculas Direcionadoras
[0099] Como discutido acima, uma molécula direcionadora é incorporada em um vírus recombinante para direcionar o vírus às células dendríticas que expressam a DC-SIGN. A molécula direcionadora preferivelmente também media a fusão com a membrana da célula e eficiente transdução e liberação do(s) polinucleotídeo(s) desejado(s) na célula dendrítica. Assim, a molécula direcionadora é tipicamente uma molécula fusogênica (FM) com a desejada especificidade de ligação. A molécula direcionadora é modificada, se necessário, de forma que ela se liga à DC-SIGN em células dendríticas. Em algumas modalidades, a molécula direcionadora especificamente se liga à DC-SIGN. Isto é, a molécula direcionadora preferencialmente direciona o vírus recombinante para as células dendríticas que expressam a DC-SIGN em relação aos outros tipos de células. Assim, em algumas modalidades, moléculas direcionadoras são criadas pela eliminação da habilidade de uma FM de se ligar a outros alvos, tais como hemaglutinina, enquanto retém a habilidade de se ligar à DC- SIGN. Em outras modalidades, a molécula direcionadora pode ser modificada para eliminar a especificidade de ligação nativa a moléculas não DC-SIGN e componentes da mesma e adicionar ou melhorar a especificidade de ligação à DC-SIGN. Enquanto algumas ligações não específicas a outras moléculas, e assim a outros tipos de células, podem ocorrer mesmo se a molécula direcionadora é específica para a DC- SIGN, moléculas direcionadoras são modificadas para ter suficiente especificidade para evitar efeitos colaterais indesejados, tais como efeitos colaterais que possam reduzir a resposta imuno desejada.
[00100] As moléculas direcionadoras são geralmente moléculas que são capazes de pseudotipagem e assim serem incorporadas no envelope de vírus recombinante, células dendríticas alvo e, sob as condições apropriadas, induzir a fusão da membrana e permitir a entrada de um gene de interesse para as células dendríticas. Moléculas direcionadoras preferidas são glicoproteínas virais. Além disso, moléculas direcionadoras são preferivelmente resistentes à ultracentrifugação para permitir a concentração, o que pode ser importante para liberação de gene in vivo.
[00101] As moléculas direcionadoras preferivelmente induzem a fusão de membranas em baixo pH, independentemente de ligação. Assim, em modalidades preferidas, a fusão da membrana induzida pela molécula direcionadora ocorre uma vez que o vírus compreendendo a molécula direcionadora está dentro do endossoma de uma célula alvo e o componente núcleo viral, incluindo um polinucleotídeo de interesse, é liberado para o citosol.
[00102] Em algumas modalidades, uma sequência de identificação é incorporada em uma molécula direcionadora para permitir a detecção da expressão da molécula direcionadora e a presença da molécula direcionadora nas partículas virais.
[00103] Existem duas classes reconhecidas de fusógenos virais e ambos podem ser usados como moléculas direcionadoras (D.S. Dimitrov, Nature Rev.. Microbio., 2, 109 (2004)). Os fusógenos da classe I disparam a fusão da membrana usando estruturas de rolo em espiral helicoidais enquanto os fusógenos da classe II disparam a fusão com barris β. Estas duas estruturas têm diferentes mecanismos e cinéticas (D.S. Dimitrov, Nature Rev. Microbio., 2, 109 (2004)). Em algumas modalidades, os fusógenos de classe I são usados. Em outras modalidades, fusógenos da classe II são usados. Ainda noutras modalidades, ambos os fusógenos da classe I e classe II são usados.
[00104] Alguns exemplos não limitantes de glicoproteínas de superfície que podem ser usadas como moléculas direcionadoras (ou como moléculas fusogênicas em modalidades onde a ligação viral e funções de fusão são separadas), seja no tipo original ou na forma modificada, incluem glicoproteínas de alfavírus, tais como vírus Semliki Forest (SFV), vírus Ross River (RRV) e vírus Aura (AV), que compreendem glicoproteínas de superfície tais como E1, E2 e E3. A glicoproteínas E2 derivada do vírus Sindbis (SIN) e a hemaglutinina (HA) do vírus influenza são glicoproteínas não virais que especificamente se ligam a moléculas particulares nas superfícies das células (sulfato de heparina glicosaminoglicano para E2, ácido siálico para HA) e podem ser usadas para criar moléculas direcionadoras em algumas modalidades. A fusão delas é relativamente independente da ligação às moléculas receptoras e a ativação da fusão é efetuada através da acidificação no endossoma (Skehel e Wiley, Annu. Ver. Biochem., 69, 531-569 (2000); Smit, J. e colaboradores, J. Virol., 73, 8476-8484 (1999)). Além disso, elas podem tolerar certas modificações genéticas e permanecerem eficientemente montadas na superfície retroviral (Morizono e colaboradores, J. Virol., 75, 8016-8020).
[00105] Em outras modalidades da invenção, as glicoproteínas de superfície do vírus da febre de Lassa, vírus da hepatite B, vírus Rabies, vírus da doença de Borna, vírus Hantaan ou vírus SARS-CoV podem ser utilizados como moléculas de fusão.
[00106] Em outras modalidades da invenção, glicoproteínas de superfície baseadas em flavi-vírus podem ser usadas como a base para moléculas direcionadoras. Como os alfavírus, os flavi-vírus usam a molécula de fusão de classe II para mediar a infecção (Mukhopadhyay e colaboradores, (2005) Rev. Microbio., 3, 13-22). A prM (cerca de 165 aminoácidos) e E (cerca de 495 aminoácidos) são as glicoproteínas dos flavi-vírus. Também, a bolsa ligação-ligante para um flavi-vírus, vírus da Dengue (DV), tem sido bem caracterizado. De interesse, a DC-SIGN tem sido sugerida a interagir especificamente com os resíduos carboidratos na proteína DV E para aumentar a entrada viral (Mukhopadhyay e colaboradores, (2005) Nat. Rev. Microbio., 3, 13-22). Assim, lentivírus envelopados apenas pela proteína DV E ou pela proteína DV E modificada, pode ser usado para direcionar DCs. As proteínas DV E e TB E, bem como outras moléculas de fusão descritas, podem ser projetadas para fornecer a especificidade de ligação desejada ou ser deficiente em ligação e competente em fusão se necessário.
[00107] Em algumas modalidades, uma forma de hemaglutinina (HA) da influenza A/vírus da praga de aves/Rosotckí/34 (FPV), um fusógeno classe I, é usado (T. Hatziioannou, S. Valsecia-Wittmann, S. J. Russel, F. L. Cosset, J. Virol., 72, 5313 (1998)). Em algumas modalidades, uma forma do FPV HA é usada (A. H. Lin e colaboradores, Hum. Gene. Ther., 12, 323 (2001)). A fusão mediada por HA é geralmente considerada ser independente da ligação do receptor (D. Lavillette, S.J. Russel, F.L. Cosset, Curr. Opin. Biotech., 12, 461 (2001)).
[00108] Em outras modalidades, uma FM da classe II é usada, preferivelmente a glicoproteína do vírus Sindbis da família alfavírus (K.S. Wang, R.J. Kuhn, E.G. Strauss, S. Ou, J.H. Strauss, J. Virol., 66, 4992 (1992)), aqui também referido neste documento como SVG. A SVG inclui duas proteínas trans-membrana (S. Mukhopadhyay, R.J. Kuhn, M.G. Rossmann, Nature Rev. Microbio., 3, 13 (2005)), a primeira proteína responsável pela fusão (E1) e uma segunda proteína pela ligação da célula (E2). A SVG é conhecida pseudotipar ambos os oncoretrovírus e lentivírus.
[00109] Como discutido abaixo, em algumas modalidades preferidas, uma SVG modificada que preferencialmente se liga à DC- SIGN é utilizada. Em outras modalidades, uma SVG deficiente em ligação e competente em fusão, SVGmu, pode ser usada como a molécula fusogênica em combinação com uma molécula direcionadora separada, tal como um anticorpo para a DC-SIGN ou outra proteína específica da célula dendrítica. Por exemplo, uma molécula fusogênica SVG pode ser usada na qual o domínio de ligação G da imunoglobulina da proteína A (domínio ZZ) é incorporado na proteína E2 e um ou mais mutações são feitas para desativar os locais de ligação dos receptores (K. Morizono e colaboradores, Nature Med., 11, 346 (2005)).
[00110] O gene codificando a molécula direcionadora é preferivelmente clonado em um vetor de expressão, tal como pcDNA3 (Invitrogen). Células de empacotamento, tais como as células 293T são então co-transfectadas com o vetor viral codificando um gene de interesse (tipicamente codificando um antígeno), pelo menos um plasmídeo codificando componentes de empacotamento de vírus e um vetor para a expressão da molécula direcionadora. Se a função direcionadora é separada da função fusogênica, são também proporcionados um ou mais vetores que codificam uma molécula de afinidade e quaisquer componentes associados. A molécula direcionadora é expressa na membrana da célula de empacotamento e incorporada no vírus recombinante. A expressão das moléculas direcionadoras na superfície da célula de empacotamento pode ser analisada, por exemplo, por FACS.
[00111] Baseado na informação obtida, por exemplo, dos estudos estruturais e modelagem molecular, a mutagênese pode ser empregada para gerar formas mutantes de glicoproteínas que mantenham suas habilidades fusogênicas, mas tem a especificidade de ligação desejada e/ou nível de ligação. Diversos mutantes podem ser criados para cada glicoproteína e testados usando os métodos descritos abaixo ou outros métodos conhecidos na técnica, para identificar FMs com as características mais desejáveis. Por exemplo, moléculas direcionadoras podem ser testadas quanto à habilidade de especificamente liberaçãor antígenos a células dendríticas pela determinação de suas habilidades de estimular uma resposta imuno sem causar efeitos colaterais indesejáveis em um mamífero. A capacidade de direcionar especificamente células dendríticas pode também ser testada diretamente, por exemplo, em cultura de célula como descrito abaixo.
[00112] Para selecionar moléculas direcionadoras apropriadas (seja do tipo original ou mutante), os vírus contendo a molécula direcionadora (e uma molécula de afinidade quando apropriado) são preparados e testados quanto a suas seletividades e/ou suas habilidades para facilitar a penetração da membrana da célula alvo. Os vírus que exibem uma glicoproteína do tipo original podem ser usados como controles para examinar efeitos de título em mutantes. As células expressando o parceiro de ligação da molécula direcionadora (ou molécula de afinidade, quando apropriado) são transduzidas pelo vírus usando um teste de infecção padrão. Após um período de tempo especificado, por exemplo, 48 horas pós-transdução, as células podem ser coletadas e a percentagem das células infectadas pelo vírus compreendendo a molécula direcionadora (ou molécula de afinidade e fusogênica) podem ser determinadas, por exemplo, por FACS. A seletividade pode ser contada ao calcular a percentagem de células infectadas pelo vírus. Similarmente, o efeito das mutações no título viral pode ser quantificado ao dividir a percentagem de células infectadas pelo vírus compreendendo uma molécula direcionadora mutante pela porcentagem de células infectadas pelo vírus compreendendo a correspondente molécula direcionadora do tipo original. Um mutante preferido dará a melhor combinação de seletividade e título infeccioso. Uma vez sem a molécula direcionadora selecionada, testes de concentração viral podem ser efetuados para confirmar que os vírus envelopados pela FM podem ser concentrados. Os sobrenadantes virais são coletados e concentrados por ultracentrifugação. Os títulos dos vírus podem ser determinados pela diluição limitada de solução estoque viral e transdução de células expressando o parceiro de ligação da molécula de afinidade.
[00113] Em algumas modalidades, a proteína de fusão BlaM-Vpr pode ser utilizada para avaliar a penetração viral e assim a eficácia de uma molécula de fusão (do tipo original ou mutante). O vírus pode ser preparado, por exemplo, por transfecção transiente de células empacotadoras com um ou mais vetores compreendendo os elementos virais, BlaM-Vpr, e a FM de interesse (e uma molécula de afinidade, se apropriado). Os vírus resultantes podem ser usados para infectar células expressando uma molécula, a molécula direcionadora (ou molécula de afinidade) especificamente se liga na ausência ou presença do inibidor livre de ligação (tal como um anticorpo). As células podem então ser lavadas com meio livre de CO2 e carregadas com corante CCF2 (Aurora Bioscience). Após incubação na temperatura ambiente para permitir a reação de clivagem de se completar, a células podem se fixas com paraformaldeído e analisadas por FACS e microscopia. A presença de células azuis indica a penetração do vírus no citoplasma; poucas células azuis seriam esperadas quando anticorpo de bloqueio é adicionado.
[00114] Para investigar se a penetração é dependente de um baixo pH, e moléculas direcionadoras selecionadas (ou moléculas fusogênicas) com a dependência do pH desejada, NH4Cl ou outro composto que altera o pH pode ser adicionado na etapa de infecção (NH4Cl neutralizará os compartimentos ácidos dos endossomas). No caso do NH4Cl, seu desaparecimento das células azuis indicará que a penetração dos vírus é pouco dependente do pH.
[00115] Além disso, para confirmar que a atividade é dependente do pH, agentes lisossomotrópicos, tais como cloreto de amônio, cloroquina, concanamicina, bafilomicina A1, monensina, nigericina, etc., podem ser adicionados no tampão de incubação. Estes agentes podem elevar o pH dentro dos compartimentos endossomais (por exemplo, Drose e Altendorf, J. Exp. Biol., 200, 1-8, 1997). O efeito inibitório destes agentes revelará o papel do pH para a fusão e entrada viral. As diferentes cinéticas de entrada entre os vírus mostrando diferentes moléculas fusogênicas podem ser comparadas e a mais apropriada selecionada para uma aplicação particular.
[00116] Testes de entrada PCR podem ser utilizados para monitorar a transcrição reversa e assim medir a cinética da síntese do DNA viral como uma indicação da cinética da entrada viral. Por exemplo, partículas virais compreendendo uma molécula direcionadora particular podem ser incubadas com células empacotadoras, tais como as células 293T, expressando o cognato apropriado para a molécula direcionadora (ou uma molécula de afinidade separada em algumas modalidades). Seja imediatamente ou após a incubação (para permitir a infecção de ocorrer) vírus não ligados são removidos e alíquotas das células são analisadas. O DNA pode então ser extraído destas alíquotas e semiquantitativa efetuada usando iniciadores LTR específicos. O aparecimento de produtos de DNA LTR específicos indicará o sucesso da entrada viral e não revestimento.
[00117] Embora a molécula direcionadora possa ter ambas as funções de ligação e fusão virais, em outro aspecto da invenção, as funções de ligação e fusão virais são separadas em dois componentes distintos. Tipicamente, o vírus recombinante compreende ambas (i) a molécula de afinidade que media a ligação viral e precisamente direciona o vírus para células dendríticas, e (ii) uma molécula fusogênica distinta (FM) que media a transdução eficiente e liberação o polinucleotídeo desejado para dentro das células dendríticas. Os métodos revelados aqui neste documento podem ser prontamente adotados para utilizar qualquer de uma variedade de moléculas de afinidade e moléculas fusogênicas. Em adição àquelas descritas aqui neste documento, outras moléculas fusogênicas exemplares e métodos relacionados são descritos, por exemplo, na aplicação de Patente US 11/071.785, depositada em 2 de março de 2005 (publicada como Publicação de Pedido de Patente Americana 2005-0238626) e na aplicação de Patente US 11/446.353, depositada em 1 de junho de 2006 (publicada como Publicação de Pedido de Patente Americana 2007/0020238), cada uma das quais é incorporada aqui neste documento por referência em sua totalidade.
[00118] A molécula de afinidade é uma que se liga a um marcador de superfície de célula dendrítica. Em modalidades preferidas, a molécula de afinidade se liga à DC-SIGN com especificidade. Isto é, a ligação da molécula de afinidade à DC-SIGN é preferivelmente específica o bastante para evitar efeitos colaterais indesejados devido à interação com marcadores em outros tipos de células. A molécula de afinidade pode ser, por exemplo, um anticorpo que especificamente se liga à DC- SIGN.
[00119] Em algumas modalidades preferidas, a molécula de fusão é uma glicoproteína viral que media a fusão ou de outra forma facilita a liberação do gene de interesse à célula dendrítica, preferivelmente em resposta ao baixo pH do ambiente do endossoma. A molécula de fusão preferivelmente exibe cinética rápida o bastante que o conteúdo viral pode ser descarregado para dentro do citosol antes da degradação da partícula viral. Além disso, a molécula de fusão pode ser modificada para reduzir ou eliminar qualquer atividade de ligação e, assim, reduzir ou eliminar qualquer ligação não específica. Isto é, pela redução da habilidade de ligação das moléculas de fusão, a ligação do vírus à célula alvo é determinada predominantemente ou inteiramente pela molécula de afinidade, permitindo alta especificidade de alvo e reduzindo efeitos indesejáveis. As moléculas de fusão exemplares incluem, mas, sem limitação, glicoproteínas virais derivadas de um dos seguintes vírus: vírus Sindbis, vírus influenza, vírus da febre de Lassa, vírus da encefalite transmitido por carrapatos, vírus da dengue, vírus da hepatite B, vírus Rabies, vírus Semliki Forest, vírus Ross River, vírus Aura, vírus da doença de Borna, vírus Hantaan e vírus SARS-CoV.
[00120] Os métodos revelados aqui neste documento podem ser prontamente adaptados para utilizar qualquer uma de uma variedade de moléculas como moléculas direcionadoras ou como moléculas fusogênicas em combinação com moléculas de afinidade. Em adição àquelas descritas aqui neste documento, outras moléculas exemplares e métodos relacionados são descritos, por exemplo, na Publicação da Aplicação da Patente Americana 2005/0238626 e na Publicação da Aplicação da Patente Americana 2007/0020238.
Vetores
[00121] Numa modalidade preferida, um ou mais vetores são usados para introduzir sequências de polinucleotídeos em uma linhagem de célula de empacotamento para a preparação de um vírus recombinante como descrito aqui neste documento. Os vetores podem conter sequências de polinucleotídeos codificando os vários componentes do vírus recombinante incluindo a molécula direcionadora DC específica, gene(s) de interesse (tipicamente codificando um antígeno) e quaisquer componentes necessários para a produção do vírus que não são fornecidos pela célula de empacotamento. Em algumas modalidades, vetores contendo sequências de polinucleotídeos que codificam a molécula de afinidade DC específica e uma molécula fusogênica separada são substituídos por um vetor que codifica uma molécula direcionadora DC específica na preparação do vírus. Vetores de expressão de células eucarióticas são bem conhecidos na técnica e estão disponíveis a partir de um número de fontes comerciais.
[00122] Num aspecto da invenção, vetores contendo sequências de polinucleotídeos que codificam fatores de maturação de DC são também usados na preparação do vírus. Estes polinucleotídeos estão tipicamente sob controle de um ou mais elementos regulatórios que direcionam a expressão das sequências codificantes na célula de empacotamento e na célula alvo, como apropriado. Diversas linhas de evidência têm mostrado o sucesso da vacinação DC é dependente do estado de maturação das DCs (Banchereau, J. e Palucka, A.K., Nat. Rev. Immunol., 5:296-306, (2005); Schuler, G. e colaboradores, Curr. Opin. Immunol., 15:138-147, (2003); Figdor, C.G. e colaboradores, Nat. Med., 10:475-480, (2004), cada um dos quais é aqui incorporado neste documento por referência). A maturação pode transformar DCs de células ativamente envolvidas na captura de antígeno em células especializadas pela iniciação de células T. Em um aspecto da invenção, o vetor inclui genes que codificam as moléculas estimulatórias para disparar a maturação da DC desejada. Tais moléculas estimulatórias são também referidas como fatores de maturação ou fatores estimulatórios de maturação.
[00123] Em algumas modalidades, células de empacotamento são co-transfectadas com um vetor viral codificando um antígeno e um ou mais vetores adicionais. Por exemplo, em adição ao vetor viral codificando um antígeno, um segundo vetor preferivelmente carrega um gene codificando uma molécula direcionadora que se liga às células dendríticas, tais como SVGmu, como descrito em outra parte na aplicação. Em algumas modalidades preferidas, a molécula direcionadora codifica uma glicoproteína viral modificada que é específica para a DC-SIGN. A glicoproteína modificada viral é preferivelmente uma derivada de pelo menos uma das seguintes: vírus Sindbis, vírus influenza, vírus da febre de Lassa, vírus da encefalite transmitido por carrapatos, vírus da dengue, vírus da hepatite B, vírus Rabies, vírus Semliki Forest, vírus Ross River, vírus Aura, vírus da doença de Borna, vírus Hantaan e vírus SARS-CoV. Em algumas modalidades, o vetor viral codificando um antígeno também inclui uma sequência de polinucleotídeo codificando um fator de maturação de DC. Em algumas modalidades, a sequência de polinucleotídeo codificando um fator de maturação de DC está contida em um terceiro vetor que é co-transfectado com o vetor viral codificando um antígeno e um ou mais vetores adicionais dentro das células de empacotamento.
[00124] Em outras modalidades, um ou mais vetores de expressão multicistrônico são utilizados que incluem dois ou mais dos elementos (por exemplo, genes virais, genes de interesse, molécula direcionadora, fatores de maturação DC) necessários para a produção do vírus recombinante desejado nas células de empacotamento. O uso de vetores multicistrônicos reduz o número total de vetores requeridos e assim evita as possíveis dificuldades associadas com a coordenação da expressão a partir de múltiplos vetores. Em um vetor multicistrônico os vários elementos a serem expressos são operacionalmente ligados a um ou mais promotores (e outros elementos de controle de expressão como necessário). Em outras modalidades, um vetor multicistrônico compreendendo um gene de interesse, um gene relator e elementos virais são usados. O gene de interesse tipicamente codifica um antígeno e, opcionalmente, um fator de maturação de DC. Tal vetor pode ser co- transfectado, por exemplo, junto com um vetor codificando uma molécula direcionadora ou, em algumas modalidades, um vetor multicistrônico codificando ambas as moléculas FM e uma molécula de afinidade. Em algumas modalidades, o vetor multicistrônicos compreende um gene codificando um antígeno, um gene codificando um fator de maturação de DC e elementos virais.
[00125] Cada componente para ser expresso em um vetor de expressão multicistrônico pode ser separado, por exemplo, por um elemento IRES ou um elemento 2A viral, para permitir expressão separada das várias proteínas a partir do mesmo promotor. Elementos IRES e elementos 2A são conhecidos na técnica (Patente US 4.937.190; de Felipe e colaboradores, 2004, Traffic, 5:616-626, cada um dos quais é aqui incorporado neste documento por referência em sua totalidade). Em uma realização, oligonucleotídeos codificando sequências de local de clivagem de furina (RAKR) (Fang e colaboradores, 2005, Nat. Biotech., 23:584-590, o qual é aqui incorporado neste documento por referência em sua totalidade) ligado com sequências semelhantes a 2A do vírus de doenças (FMDV) do pé e da boca, vírus da rinite equina A (ERAV) e vírus da thosea asigna (TaV) (Szymezak e colaboradores, 2004, Nat. Biotech., 22:589-594, o qual é aqui incorporado neste documento por referência em sua totalidade) são usados para separar elementos genéticos em um vetor multicistrônico. A eficácia de um vetor multicistrônico para uso na síntese do vírus recombinante desejado pode prontamente se testado pela detecção da expressão de cada um dos genes usando protocolos padrões.
[00126] A geração de vetor(es) pode ser efetuada usando quaisquer técnicas de engenharia genética apropriadas conhecidas na técnica, incluindo, sem limitação, as técnicas padrões de restrição com endonuclease de restrição, ligação, transformação, purificação de plasmídeo e sequenciamento de DNA, por exemplo, como descrito em Sambrook e colaboradores, (1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press NY), Coffin e colaboradores, (Retroviruses. Cold Spring Harbor Press, N.Y. (1997)) e “RNA Viruses: A Practical Approach” (Alan J. Cann., Ed. Oxford University Press, (2000), cada um dos acima citados os quais são incorporados aqui neste documento por referência em suas totalidades.
[00127] O(s) vetor(es) pode(m) incorporar sequências do genoma de qualquer organismo conhecido. As sequências podem ser incorporadas em suas formas nativas ou podem ser modificadas de qualquer modo. Por exemplo, as sequências podem compreender inserções, deleções ou substituições.
[00128] Os elementos de controle de expressão que podem ser usados para regular a expressão de componentes são conhecidos na técnica e incluem, mas sem limitação, promotores induzíveis, promotores constitutivos, sinais de secreção, aumentadores e outros elementos regulatórios.
[00129] Em uma realização, um vetor pode incluir um replicon procariótico, isto é, uma sequência de DNA tendo a habilidade de direcionar a replicação autônoma e manutenção da molécula de DNA recombinante extra-cromossomicamente em uma célula hospedeira procariótica, tal como uma célula hospedeira de bateria, transformada com isso. Tais replicons são bem conhecidos na técnica. Além disso, vetores que incluem um replicon procariótico podem também incluir um gene cuja expressão confere um marcador detectável tal como uma resistência à droga. Genes de resistência à droga de bactéria típicos são aqueles que conferem resistência à ampicilina ou tetraciclina.
[00130] O(s) vetor(es) pode incluir um ou mais genes de marcadores selecionáveis que são efetivos em uma célula eucariótica, tal como um gene para um marcador de seleção de resistência à droga. Este gene codifica um fator necessário para a sobrevivência ou crescimento de células hospedeiras transformadas crescendo em um meio de cultura seletivo. Células hospedeiras transformadas com o vetor contendo o gene de seleção não sobreviverão no meio de cultura. Genes de seleção típicos codificam proteínas que conferem resistência a antibióticos ou outras toxinas, por exemplo, ampicilina, neomicina, metotrexato ou tetraciclina, deficiências auxotróficas de complemento ou suprir nutrientes críticos mantidos do meio. O marcador selecionável pode opcionalmente estar presente em um plasmídeo separado e introduzido por co-transfecção.
[00131] Os vetores usualmente conterão um promotor que é reconhecido pela célula de empacotamento e que é operacionalmente ligado ao polinucleotídeo(s) codificando a molécula direcionadora, componentes virais e semelhantes. Um promotor é um elemento de controle de expressão formado por uma sequência de ácido nucléico que permite a ligação da polimerase do RNA e transcrição de ocorrer. Os promotores são sequências não traduzidas que são localizadas a montante (5’) do códon de partida de um gene estrutural (geralmente dentro de cerca de 100 a 1000 bp) e controlam a transcrição e translação da sequência de polinucleotídeo antígeno específica à qual eles estão operacionalmente ligados. Os promotores podem ser induzíveis ou constitutivos. A atividade dos promotores induzíveis é induzida pela presença ou ausência de fatores bióticos ou abióticos. Promotores induzíveis podem ser uma ferramenta útil na engenharia genética por que a expressão dos genes aos quais eles estão operacionalmente ligados pode ser ligada e desligada em certos estágios do desenvolvimento de um organismo ou em um tecido particular. Promotores induzíveis podem ser agrupados com promotores regulados quimicamente e promotores regulados fisicamente. Promotores regulados quimicamente típicos incluem, mas, sem limitação, promotores regulados por álcool (por exemplo, promotor do gene (alcA) álcool dehidrogenase I), promotores regulados por tetraciclina (por exemplo, promotor que responde à tetraciclina), promotor regulado por esteróide (por exemplo, promotor baseado no receptor glucocorticóide (GR) de rato, promotor baseado no receptor estrogênio (ER) humano, promotor baseado no receptor ecdisona da boca e os promotores baseados na super família de receptores esteróide/retinóide/tiróide), promotores regulados por metais (por exemplo, promotores baseados no gene metalotioneína) e promotores relacionados a patogêneses (por exemplo, promotores baseado em proteína relacionada a patógeno (PR) de milho e arabidopsis). Promotores regulados fisicamente tipicamente incluem, mas, sem limitação, promotores regulados por temperatura (por exemplo, promotores de choque térmico) e promotores regulados pela luz (por exemplo, promotor SSU da soja). Outros promotores exemplares são descritos em outros lugares, por exemplo, no protocolo de transferência de hipertexto: //www.patentlens.net/daisy/promoters/768/271.html, que é aqui incorporado neste documento em sua totalidade.
[00132] Um técnico no assunto será capaz de selecionar um promotor apropriado baseado nas circunstâncias específicas. Muitos promotores diferentes são bem conhecidos na técnica, como são os métodos para operacionalmente ligar o promotor ao gene a ser expresso. Ambas as sequências de promotores nativos e muitos promotores heterólogos podem ser usados para direcionar a expressão na célula de empacotamento e célula alvo. Todavia, promotores heterólogos são preferidos, uma vez que eles geralmente permitem maior transcrição e maiores rendimentos da proteína desejada quando comparados com os promotores nativos.
[00133] O promotor pode ser obtido, por exemplo, de genomas de vírus tais como o vírus polioma, vírus fowlpox, adenovírus, vírus de papiloma bovino, vírus de sarcoma de aves, citomegalovírus, um retrovírus, vírus da hepatite B e vírus Simian 40 (SV40). O promotor pode também ser, por exemplo, um promotor mamífero heterólogo, por exemplo, o promotor de actina ou um promotor de imunoglobulina, um promotor de choque térmico ou um promotor normalmente associado com a sequência nativa, desde que tais promotores sejam compatíveis com a célula alvo. Numa realização, o promotor é o promotor viral que ocorre naturalmente em um sistema de expressão viral. Em algumas modalidades, o promotor é um promotor específico para célula dendrítica. O promotor específico para célula dendrítica pode ser, por exemplo, o promotor CD11c.
[00134] A transcrição pode ser aumentada pela inserção de uma sequência aumentadora no(s) vetor(es). As aumentadoras são tipicamente elementos de ação cis de DNA, usualmente cerca de 10 a 300 bp em comprimento, que agem no promotor para aumentar sua transcrição. Muitas sequências de aumentadoras são agora conhecidas de genes de mamíferos (globina, elastase, albumina, a-fetoproteína e insulina). Preferivelmente uma aumentadora de um vírus de célula eucariótica será usada. Exemplos incluem a aumentadora SV40 no último lado da origem de replicação (bp 100-270), a aumentadora promotora precoce de citomegalovírus, a aumentadora de polioma no último lado da origem de replicação e aumentadoras de adenovírus. A aumentadora pode ser inserida no vetor em uma posição 5’ ou 3’ para a sequência de polinucleotídeo antígeno específica, mas é preferivelmente localizada no sítio 5’ do promotor.
[00135] Os vetores de expressão também conterão sequências necessárias para o término da transcrição e para estabilização do mRNA. Estas sequências são frequentemente encontradas nas regiões 5’ e, ocasionalmente 3’, não traduzidas de DNAs ou cDNAs eucarióticos ou virais e são bem conhecidos na técnica.
[00136] Os vetores de plasmídeos contendo um ou mais dos componentes descritos acima são prontamente construídos usando técnicas padrões bem conhecidas na técnica.
[00137] Para análise para confirmar sequências corretas construídas em plasmídeos, o plasmídeo pode ser replicado em E. coli, purificada e analisada por digestão de endonuclease de restrição e/ou sequenciada por métodos convencionais.
[00138] Os vetores que fornecem expressão transiente em células de mamíferos podem também ser usados. Expressão transiente envolve o uso de um vetor de expressão que seja capaz de replicar eficientemente em uma célula hospedeira, de forma que a célula hospedeira acumula muitas cópias do vetor de expressão e, desta forma, sintetiza altos níveis de um polipeptídeo codificado pelo polinucleotídeo antígeno específico em um vetor de expressão. Veja Sambrook e colaboradores, supra, pág. 16.17-16.22.
[00139] Outros vetores e métodos apropriados para adaptação para a expressão de polipeptídeos virais são bem conhecidos na técnica e são prontamente adaptados para circunstâncias específicas.
[00140] Usando os ensinamentos providos aqui neste documento, um técnico no assunto reconhecerá que a eficácia de um sistema de expressão particular pode ser testada por células de empacotamento de transformação com um vetor compreendendo um gene codificando uma proteína relatora e medindo a expressão usando uma técnica apropriada, por exemplo, medindo a fluorescência de um conjugado de proteína fluorescente verde. Genes relatores apropriados são conhecidos na técnica.
[00141] A transformação de células de empacotamento com vetores da presente invenção é efetuada por métodos bem conhecidos e o método a ser usado não é limitado de qualquer modo. Um número de sistemas de liberação não viral é conhecido na técnica, incluindo, por exemplo, eletroporação, sistema de liberação baseado em lipídeos incluindo lipossomas, liberação de DNA “desprotegido” e liberação usando compostos de policiclodextrina, tais como aqueles descritos em Schatzlein AG. (2001, Non-Viral Vectors in Cancer Gene Therapy: Principles and Progresses, Anticancer Drugs, o qual é aqui incorporado neste documento por referência em sua totalidade). Métodos de tratamentos com lipídeos catiônicos ou sal são tipicamente empregados, ver, por exemplo, Graham e colaboradores, (1973, Virol., 52:456; Wigler e colaboradores, (1979, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 76:1373-76), cada um dos previamente citados os quais são incorporados aqui neste documento por referência em suas totalidades. O método de precipitação com fosfato de cálcio é o preferido. Todavia, outros métodos para introdução do vetor em células podem também ser usados, incluindo micro injeção nuclear e fusão protoplasto bacteriana.
Vetor Viral e Células de Empacotamento
[00142] Um dos vetores codifica o vírus núcleo (o “vetor viral”). Existe um grande número de vetores virais disponíveis que são apropriados para uso com a invenção, incluindo aqueles identificados para aplicações em terapia de genes para pessoas humanas, tais como aqueles descritos por Pfeifer e Verma (Pfeifer, A. e I.M. Verma, 2001, Annu. Rev. Genomics Hum. Genet., 2:177-211, o qual é aqui incorporado neste documento por referência em sua totalidade). Vetores virais apropriados incluem vetores baseados nos vírus RNA, tais como vetores derivados de retrovírus, por exemplo, vetores derivados do vírus da leucemia murina de Moloney (MLV) e incluem vetores derivados de retrovírus mais complexos, por exemplo, vetores derivados de lentivírus. Vetores derivados do vírus da imunodeficiência humana (HIV-1) pertencem a esta categoria. Outros exemplos incluem vetores de lentivírus derivados da HIV-2, vírus da imunodeficiência felina (FIV), vírus da anemia infecciosa equina, vírus da imunodeficiência de símio (SIV) e vírus maedi/visna.
[00143] O vetor viral preferivelmente compreende um ou mais genes codificando componentes de um vírus recombinante bem como um ou mais genes de interesse, tais como, por exemplo, um antígeno e/ou um fator de maturação de DC. O vetor viral pode também compreender elementos genéticos que facilitam a expressão do gene de interesse em uma célula alvo, tais como sequências promotoras e aumentadoras. De forma a prevenir a replicação na célula alvo, podem ser removidos e fornecidos separadamente genes virais endógenos requeridos para a replicação na linhagem de células de empacotamento.
[00144] Numa realização preferida, o vetor viral compreende um LTR retroviral intacto 5’ e um LTR auto-inativante 3’.
[00145] Qualquer método conhecido na técnica pode ser usado para produzir partículas retrovirais infecciosas cujo genoma compreende uma cópia de RNA do vetor viral. Para este fim, o vetor viral (junto com outros vetores codificando o gene de interesse, a molécula direcionadora DC específica, etc.) é preferivelmente introduzido em uma linhagem de células de empacotamento que empacota o RNA genômico viral baseado no vetor viral em partículas virais.
[00146] A linhagem de células de empacotamento fornece as proteínas virais que são requeridas em trans para o empacotamento do RNA genômico viral em partículas virais. A linhagem de células de empacotamento pode qualquer célula que é capaz de expressar proteínas retrovirais. Linhagens de células de empacotamento preferidas incluem a 293 (ATCC CCL X), HeLa (ATCC CCL 2), D17 (ATCC CCL 183), MDCK (ATCC CCL 34), BHK (ATCC CCL-10) e Cf2Th (ATCC CRL 1430). A linhagem de células de empacotamento pode estavelmente expressar as proteínas virais necessárias. Tal linhagem de células empacotadas é descrita, por exemplo, na Patente US 6.218.181, que é aqui incorporada neste documento por referência em sua totalidade. Alternativamente uma linhagem de células de empacotamento pode ser transientemente transfectada com plasmídeos compreendendo ácido nucléico que codifica uma ou mais das proteínas virais necessárias, incluindo a molécula direcionadora DC específica (ou alternativamente, a molécula de afinidade DC específica e molécula fusogênica) junto com os vetores virais codificando o gene de interesse, o qual tipicamente codifica um antígeno e pode adicionalmente codificar um fator de maturação de DC.
[00147] Partículas virais compreendendo um polinucleotídeo com o gene de interesse e uma molécula direcionadora que é específica para células dendríticas são coletadas e permitidas infectar a célula alvo. Em algumas modalidades preferidas, o vírus é pseudotipado para alcançar a especificidade da célula alvo. Os métodos de pseudotipagem são bem conhecidos na técnica e também descritos aqui neste documento.
[00148] Em uma realização, o vírus recombinante usado para liberaçãor o gene de interesse é um lentivírus modificado e o vetor viral é baseado em um lentivírus. Como lentivírus são capazes de infectar ambas as células que se dividem e não se dividem, nesta realização não é necessário para células alvo serem células que se dividem (ou estimular células alvo a se dividirem).
[00149] Em outra realização, o vírus recombinante usado para liberaçãor o gene de interesse é um gamaretrovírus modificado e o vetor viral é baseado em um gamaretrovírus.
[00150] Em outra realização, o vetor é baseado no vírus de célula tronco de murino (MSCV; (Hawley, R.G. e colaboradores, (1996), Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 93:10297-10302; Keller G. e colaboradores, (1998), Blood, 92: 877-887; Hawley, R.G. e colaboradores, (1994), Gene Ther., 1:136-138, cada um dos precedentes os quais são incorporados aqui neste documento em suas totalidades). O vetor MSCV fornece expressão estável de longa duração em células alvo, particularmente célula precursoras hematopoiéticas e suas progenias diferenciadas.
[00151] Em outra realização, o vetor é baseado em um vírus de Moloney modificado, por exemplo, um Vírus de Leucemia Murina de Moloney. O vetor viral pode também ser baseado em um vírus híbrido tal como aquele descrito em Choi, J.K. e colaboradores, (2001, Stem Cells, 19, n° 3, 236-246, o qual é aqui incorporado neste documento por referência em sua totalidade).
[00152] Um vetor viral de DNA pode ser usado, incluindo, por exemplo, vetores baseados em adenovirus e vetores baseados em vírus adeno associados (AAV). De forma semelhante, vetores retrovirais também podem ser usados com os métodos da invenção.
[00153] Outros vetores também podem ser usados para a liberação de polinucleotídeos incluindo vetores derivados dos vírus do herpes simplex (HSVs), incluindo vetores amplicon, HSV defeituosos em replicação e HDV atenuado (Krisky, D.M., Marconi P.C., Oligino T.J., Rouse R.J., Fink D.J. e colaboradores, 1998. Development of herpes simplex vírus replication-defective multigene vectors for combination gene therapy applications, Gene Ther., 5:1517-30, o qual é aqui incorporado neste documento em sua totalidade).
[00154] Outros vetores que têm sido recentemente desenvolvidos para usos na terapia de gene podem também ser usados com os métodos da invenção. Tais vetores incluem aqueles derivados de baculovirus e alfavírus. (Jolly D.J., 1999, Emerging viral vectors, pág. 209-40, em Friedmann T., ed. 1999. The development of human gene therapy. New York: Col Spring Harbor Lab, o qual é aqui incorporado neste documento por referência em sua totalidade).
[00155] Em algumas modalidades preferidas, o construto viral compreende sequências de um genoma de lentivírus, tal como um genoma de HIV ou o genoma de SIV. O construto viral preferivelmente compreende sequências de LTRs 5’ e 3’ de um lentivírus. Mais preferivelmente o construto viral compreende as sequências R e U5 do LTR 5’ de um lentivírus e um LTR desativado ou auto-desativante 3’ de um lentivírus. As sequências LTR podem ser sequências LTR de qualquer lentivírus de qualquer espécie. Por exemplo, elas podem ser sequências de LTR de HIV, SIV, FIV ou BIV. Preferivelmente as sequências LTR são sequências LTR de HIV.
[00156] O construto viral preferivelmente compreende um LTR 3’ desativado ou auto-desativante. O LTR 3’ pode ser feito auto- desativante por qualquer método conhecido na técnica. Na realização preferida o elemento U3 do LTR 3’ contém uma deleção de sua sequência aumentadora, preferivelmente a caixa TATA, locais Spl e NF- kapa. Como um resultado do LTR 3’ auto-desativante, o pró-virus que é integrado no genoma da célula hospedeira compreende um LTR 5’ desativado.
[00157] Opcionalmente, a sequência U3 de um LTR 5’ lentiviral pode ser substituída com uma sequência do promotor no construto viral. Isto pode aumentar o título do vírus recuperado da linhagem de células empacotadoras. Uma sequência aumentadora pode também ser incluída. Qualquer combinação aumentadora/promotora que aumente a expressão do genoma do RNA viral na linhagem de células empacotadoras pode ser usada. Em uma realização preferida, a sequência aumentadora/promotora CMV é usada.
[00158] Em algumas modalidades preferidas, o construto viral compreende sequências de um genoma de gamaretrovírus, tais como o genoma do vírus de célula tronco de camundongo (MSCV) ou o genoma do vírus de leucemia murina (MLV). O construto viral preferivelmente compreende sequências de LTRs 5’ e 3’ de um gamaretrovírus. As sequências LTR podem ser sequências LTR de qualquer gamaretrovírus de qualquer espécie. Por exemplo, elas podem ser sequências LTR de vírus de célula tronco de camundongo (MSCV), vírus de leucemia murina (MLV), vírus de leucemia felina (FLV), vírus de sarcoma felino (FAV) e vírus reticuloendoteliose aviária (ARV). Preferivelmente, as sequências LTR são sequências LTR MSCV e MLV.
[00159] Em algumas modalidades, o construto viral preferivelmente compreende um LTR desativado ou auto-desativante 3’. O LTR 3’ pode ser feito auto-desativante por qualquer método conhecido na técnica. Na realização preferida o elemento U3 do LTR 3’ contém uma deleção de sua sequência aumentadora, preferivelmente a caixa TATA, locais Spl e NF-kapa. Como um resultado do LTR 3’ auto-desativante, o pró-virus que é integrado no genoma da célula hospedeira compreenderá um LTR 5’ desativado.
[00160] Opcionalmente, a sequência U3 de um LTR 5’ gamaretroviral pode ser substituída com uma sequência do promotor no construto viral. Isto pode aumentar o título do vírus recuperado da linhagem de células empacotadoras. Uma sequência aumentadora pode também ser incluída. Qualquer combinação incrementadora/promotora que aumente a expressão do genoma do RNA viral na linhagem de células empacotadoras pode ser usada. Em uma realização preferida, a sequência aumentadora/promotora CMV é usada.
[00161] O construto viral geralmente compreende um gene que codifica um antígeno que é desejavelmente expresso em uma ou mais células alvo. Preferivelmente o gene de interesse está localizado entre as sequências LTR 5’ e LTR 3’. Ainda, o gene de interesse está preferivelmente em uma relação funcional com outros elementos genéticos, por exemplo, sequências regulatórias de transcrição, tais como promotores e/ou aumentadores, para regular a expressão do gene de interesse de um modo particular uma vez que o gene é incorporado na célula alvo.
[00162] Em certas modalidades, o gene de interesse está em uma relação funcional com sequências regulatórias promotoras/ incrementadoras internas. Uma promotora/aumentadora “interna” é uma que está localizada entre as sequências LTR5’ e LTR 3’ no construto viral e está operacionalmente ligada ao gene que é desejado expressar.
[00163] A promotora/incrementadora pode ser qualquer promotora, aumentadora ou combinação promotora/aumentadora conhecida para aumentar a expressão de um gene com o qual está em uma relação funcional. Uma “relação funcional” e “ligada operacionalmente” significa, sem limitação, que o gene está na localização e orientação correta com respeito à promotora e/ou aumentadora que a expressão do gene será afetada quando a promotora e/ou aumentadora é contatada com as moléculas apropriadas.
[00164] O promotor/incrementador interno é preferivelmente selecionado baseado no padrão de expressão desejado para o gene de interesse e as propriedades específicas dos promotores/aumentadores conhecidos. Assim, o promotor interno pode ser um promotor constitutivo. Exemplos não limitantes de promotores constitutivos que podem ser usados incluem o promotor para ubiquitina, CMV (Karasuyama e colaboradores, 1989, J. Exp. Med., 169:13, o qual é aqui incorporado neste documento por referência em sua totalidade), betaactinia (Gunning e colaboradores, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 84:4831-4835, o qual é aqui incorporado neste documento por referência em sua totalidade) e pgk (ver, por exemplo, Adra e colaboradores, 1987, Gene 60:65-74; Singer-Sam e colaboradores, 1984, Gene, 32:409-417; e Dobson e colaboradores, 1982, Nucleic Acids Res., 10:2635-2637, cada um dos precedentes os quais são incorporados aqui neste documento em suas totalidades).
[00165] Alternativamente, o promotor pode ser um promotor específico de tecido. Em algumas modalidades preferidas, o promotor é um promotor específico de célula. Por exemplo, o promotor pode ser o promotor CD11c específico de célula dendrítica (Massod, R. e colaboradores, 2001, Int. J. Mol. Med., 8:335-343; Somia, N.V. e colaboradores, 1995, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 92:7570-7574, cada um do qual é aqui incorporado neste documento por referência em sua totalidade). Além disso, promotores podem ser selecionados para permitir a expressão induzível do gene. Um número de sistemas para a expressão induzível é conhecido na técnica, incluindo o sistema responsivo da tetraciclina e o sistema operador-repressor lac. É também contemplado que a combinação de promotores pode ser usada para obter a expressão desejada do gene de interesse. O técnico no assunto será capaz de selecionar um promotor baseado no padrão de expressão desejado do gene no organismo e/ou célula alvo de interesse.
[00166] Em algumas modalidades, o construto viral preferivelmente compreende pelo menos um promotor de RNA polimerase II ou III. O promotor de RNA polimerase II ou III é operacionalmente ligado ao gene de interesse e pode também ser ligado a uma sequência de terminação. Além disso, mais do que um promotor de RNA polimerase II ou III pode ser incorporado.
[00167] Promotores de RNA polimerase II ou III são bem conhecidos para o técnico no assunto. Uma faixa apropriada de promotores de RNA polimerase III pode ser encontrada, por exemplo, em Paule e White, Nucleic Acids Research, vol. 28, pág. 1283-1298 (2000), o qual é aqui incorporado neste documento por referência em sua totalidade. A definição de promotores de RNA polimerase II ou III, respectivamente, também inclui qualquer fragmento de DNA sintético ou projetado que possa direcionar a RNA polimerase II ou III, respectivamente, para transcrever suas sequências de codificação de RNA a jusante. Ainda, o promotor de RNA polimerase II ou III (Pol II ou III) ou promotores usados com parte do vetor viral pode ser induzível. Qualquer promotor Pol II ou III induzível apropriado pode ser usado com os métodos da invenção. Promotores Pol II ou III particularmente apropriados incluem os promotores responsivos da tetraciclina fornecidos em Ohkawa e Taira, Human Gene Therapy, vol. 11, pág 577-585 (2000) e em Meissner e colaboradores, Nucleic Acids Research, vol. 29, pág. 1672-1682 (2001), cada um do qual é aqui incorporado neste documento por referência em sua totalidade.
[00168] Um aumentador interno pode também estar presente no construto viral para aumentar a expressão do gene de interesse. Por exemplo, o aumentar CMV (Karasuyama e colaboradores, 1989, J. Exp. Med., 169:13, o qual é aqui incorporado neste documento por referência em sua totalidade) pode ser usado. Em algumas modalidades, o aumentador CMV pode ser usado em combinação com o promotor β-actina de frango. Uma pessoa versada na técnica será capaz de selecionar o aumentador apropriado baseado no padrão de expressão apropriado.
[00169] O polinucleotídeo ou gene de interesse não é limitado de qualquer modo e inclui qualquer ácido nucléico que o técnico no assunto deseje ter integrado, transcrito, traduzido e/ou expresso na célula alvo. Em algumas modalidades, o polinucleotídeo pode ser um gene que codifica um antígeno contra o qual uma resposta imuno é desejada. Em algumas modalidades, o polinucleotídeo pode ser um gene codificando um Rna de inibição pequeno (siRNA) ou microRNA (miRNA) de interesse que regula para baixo a expressão de uma molécula. por exemplo, o gene codificando um siRNA ou microRNA pode ser usado para regular para baixo a expressão de reguladores negativos em uma célula, incluindo aqueles que inibem a ativação ou maturação de células dendríticas. siRNAs e microRNAs são conhecidos na técnica e descritos em qualquer lugar (Shen, L. e colaboradores, 2004, Nat Biotech, 22(12): 1546-1553; Zhou, H. e colaboradores, 2006, Biochemical and Biophysical Research Communications, 347:200-207; Song, X-T. e colaboradores, 2006, PLoS Medicine 3(1):e11; Kobayashi, T. e A. Yoshimura, 2005, TRENDS in Immunology, 26(4):177-179; Taganov, K. e colaboradores, 2007, Immunity, 26:133-137; Dahlberg, J.E. e E. Lund, 2007, Sci. STKE, 287:pg. 25, cada um dos quais é aqui incorporado neste documento por referência em suas totalidades).
[00170] Além disso, em algumas modalidades, o polinucleotídeo pode conter mais do que um gene de interesse, o qual pode ser colocado em relação funcional com o promotor viral. O gene de interesse pode codificar uma proteína, um siRNA ou um microRNA. Em algumas modalidades, o polinucleotídeo a ser liberado pode compreender múltiplos genes codificando pelo menos uma proteína, pelo menos um siRNA, pelo menos um micro RNA ou combinações dos mesmos. Por exemplo, o polinucleotídeo a ser liberado pode incluir um ou mais genes que codificam um ou mais antígenos contra os quais uma resposta imuno é desejada. O um ou mais antígenos podem ser associados com uma doença ou desordem única, ou ele pode estar associado com múltiplas doenças e/ou desordens. Em algumas modalidades, um gene codificando uma proteína regulatória imuno pode ser construído com um gene primário codificando um antígeno contra o qual uma resposta imuno é desejada e a combinação pode extrair e regular a resposta imuno para a desejada direção e magnitude. Em algumas modalidades, um gene codificando um siRNA ou microRNA pode ser construído com um gene primário codificando um antígeno contra o qual uma resposta imuno é desejada e a combinação pode regular o escopo da resposta imuno. (Veja, por exemplo, modalidades, de polinucleotídeos na Figura 24c e Figura 24d, com as sequências que as acompanham SEQ ID NO:9 e SEQ ID NO:10, respectivamente). Em algumas modalidades, um gene codificando uma proteína marcadora pode ser colocado após um gene primário de interesse para permitir a identificação de células que estão expressando a proteína desejada. Em uma realização, uma proteína marcadora fluorescente, preferencialmente proteína fluorescente verde (GFP), é incorporada no construto junto com o gene de interesse (tipicamente codificando um antígeno). Se mais do que um gene é incluído, sequências de local de entrada interno no ribossomo (IRES), ou elementos 2A são também preferivelmente incluídos, separando o gene primário de interesse de um gene relator e/ou qualquer outro gene de interesse. As sequências IRES ou 2A podem facilitar a expressão do gene relator ou outros genes.
[00171] O construto viral pode também conter elementos genéticos adicionais. Os tipos de elementos que podem ser incluídos no construto não são limitados de qualquer modo e serão escolhidos pelo técnico no assunto para alcançar um resultado particular. Por exemplo, um sinal que facilita a entrada nuclear do genoma viral na célula alvo pode ser incluído. Um exemplo de tal sinal é o sinal “flap” de HIV-1.
[00172] Ainda, elementos podem ser incluídos que facilitam a caracterização do local de integração do pró-vírus na célula alvo. Por exemplo, uma sequência supressora âmbar tRNA pode ser incluída no construto.
[00173] Além disso, o construto pode conter um ou mais elementos genéticos projetados para aumentar a expressão do gene de interesse. Por exemplo, um elemento responsivo de vírus de hepatite da marmota (WRE) pode ser colocado no construto (Zufferey e colaboradores, 1999, J. Virol., 74:3668-3681; Deglon e colaboradores, 2000, Hum. Gene Ther., 11:179-190, cada um dos quais é aqui incorporado neste documento por referência em suas totalidades).
[00174] Um isolante β-globina de frango pode também ser incluído no construto viral. Este elemento tem sido mostrado reduzir a chance de silenciar o pró-vírus integrado na célula alvo devido à metilação e efeitos de heterocromatinização. Além disso, o isolante pode proteger o aumentador interno, promotor e gene exógeno de efeitos posicionais positivos e negativos do DNA envolvente na local de integração do cromossomo.
[00175] Quaisquer elementos genéticos adicionais são preferivelmente inseridos 3’ do gene de interesse.
[00176] Em uma realização específica, o vetor viral compreende: uma sequência incrementadora/promotora (CMV) de citomegalovírus; as sequências R e U% do LTR 5’ HIV; o sinal “flap” HIV-1; um aumentador interno; um promotor interno; um gene de interesse; o elemento responsivo do vírus da hepatite da marmota; uma sequência supressora âmbar tRNA; um elemento U3 com uma deleção de sua sequência aumentadora; o isolante beta-globina de frango e as sequências R e U5 do LTR 3’ HIV.
[00177] O construto viral é preferivelmente clonado no plasmídeo que pode ser transfectado na linhagem de célula de empacotamento. O plasmídeo preferido preferivelmente compreende sequências úteis para replicação do plasmídeo na bactéria.
Liberação do Vírus
[00178] O vírus pode ser liberado para uma célula alvo de qualquer modo que permita o vírus a contatar as células dendríticas alvo (DCs) nas quais a liberação de um polinucleotídeo de interesse é desejada. Em modalidades preferidas, uma quantidade apropriada de vírus é introduzida no animal diretamente (in vivo), por exemplo, através de injeção no corpo. Em algumas modalidades preferidas, as partículas virais são injetadas na corrente sanguínea periférica de um mamífero. Em outras modalidades preferidas, as partículas virais são injetadas no mamífero através de injeção intradermal, injeção subcutânea, injeção na cavidade intraperitoneal ou injeção intravenal. O vírus pode ser liberado usando um dispositivo de injeção sub-dermal tais como os dispositivos revelados nas Patentes US 7.241.275, 7.115.108, 7.108.679, 7.083.599, 7.083.592, 7.047.070, 6.971.999, 6.808.506, 6.780.171, 6.776.776, 6.689.118, 6.670.349, 6.569.143, 6.494.865, 5.997.501, 5.848.991, 5.328.483, 5.279.552, 4.886.499, todas as quais são incorporadas por referência em suas totalidades para todos os propósitos. Outros locais de injeção são também apropriados, tais como diretamente nos órgãos compreendendo células alvo. Por exemplo, injeção de nódulo intralinfa, injeção intrabaço ou injeção intramedula óssea podem ser usadas para liberaçãor o vírus ao nódulo da linfa, o baço e a medula óssea, respectivamente. Dependendo das circunstâncias em particular e natureza das células alvo, a introdução pode ser efetuada através de outros meios incluindo, por exemplo, inalação ou contato direto com tecidos epiteliais, por exemplo, aqueles no olho, boca e pele.
[00179] Em outras modalidades, são providas células alvo e contatadas com o vírus in vitro, tal como em placas de cultura. As células alvo são tipicamente células dendríticas obtidas de um sujeito saudável ou um sujeito em necessidade de tratamento. Preferivelmente, as células alvo são células dendríticas obtidas de um sujeito em quem é desejado estimular uma resposta imuno a um antígeno. Métodos de obter células de um sujeito são bem conhecidos na técnica. O vírus pode ser suspenso em meio e adicionado aos poços de uma placa de cultura, tubo ou outro recipiente. O meio contendo o vírus pode ser adicionado à placa das células ou após as células terem sido colocadas na placa. Preferivelmente, as células são incubadas em uma quantidade apropriada do meio para fornecer viabilidade e para permitir concentrações apropriadas do vírus no meio de forma que a infecção das células hospedeiras ocorre.
[00180] As células são preferivelmente incubadas com o vírus pro uma quantidade suficiente de tempo para permitir ao vírus infectar as células. Preferivelmente, as células são incubadas com vírus por pelo menos 1 hora, mais preferivelmente por pelo menos 5 horas e ainda mais preferivelmente por pelo menos 10 horas.
[00181] Em ambas as modalidades de liberação in vivo e in vitro, qualquer concentração de vírus que é suficiente para infectar as células alvo desejadas pode ser usada, como pode ser prontamente determinado pelo técnico no assunto. Quando a célula alvo é para ser em cultura, a concentração de partículas virais é de pelo menos 1 PFU/μL, mais preferivelmente de pelo menos 10 PFU/μL, ainda mais preferivelmente pelo menos 400 PFU/μL e ainda mais preferivelmente pelo menos 1 x 104PFU/μL.
[00182] Em algumas modalidades, após a infecção com o vírus in vitro, as células alvo podem ser introduzidas (ou re-introduzidas) no animal. Em algumas modalidades, as células podem ser introduzidas na derme, sob a derme ou na corrente sanguínea periférica. As células introduzidas no animal são preferivelmente células derivadas daquele animal, para evitar uma resposta imuno adversa. As células que podem também ser usadas são derivadas de um animal doador tendo um antecedente imuno similar. Outras células também podem ser usadas, incluindo aquelas projetadas para evitar uma resposta imunogênica adversa.
[00183] As células alvo podem ser analisadas, por exemplo, por integração, transcrição e/ou expressão do polinucleotídeo ou gene(s) de interesse, o número de cópias do gene integrado e a localização da integração. Tais análises podem ser efetuadas a qualquer tempo e podem ser efetuadas por quaisquer métodos conhecidos na técnica.
[00184] Sujeitos nos quais um vírus recombinante ou DCs infectadas com vírus são administrados podem ser analisados para localização das células infectadas, expressão do polinucleotídeo de liberação do vírus ou gene de interesse, estímulo de uma resposta imuno e monitorado quanto aos sintomas associados com uma doença ou desordem por quaisquer métodos conhecidos na técnica.
[00185] Os métodos de infecção de células revelados acima não dependem das características específicas individuais das células. Como um resultado, eles são prontamente estendidos para todos os mamíferos. Em algumas modalidades, o vírus recombinante é liberado para uma pessoa humana ou células dendríticas de pessoa humana. Em outras modalidades, o vírus recombinante é liberado para um camundongo ou célula dendríticas de um camundongo. Em ainda outras modalidades, o vírus recombinante é liberado para um animal diferente de uma pessoa humana ou um camundongo, ou a células dendríticas de um animal diferente de uma pessoa humana ou camundongo.
[00186] Como discutido acima, o vírus recombinante pode ser pseudotipado para conferir a ele uma faixa de hospedeiro ampla bem como a especificidade da célula alvo.Uma pessoa versada na técnica também estaria avisada de promotores internos apropriados para alcançar a expressão desejada de um polinucleotídeo ou gene de interesse em uma espécie animal em particular. Assim, uma pessoa versada na técnica será capaz de modificar o método de infecção de células dendríticas derivadas de qualquer espécie.
[00187] O vírus recombinante pode ser avaliado para determinar a especificidade da molécula direcionadora incorporada no vírus que se direciona a células dendríticas. Por exemplo, uma população misturada de células de medula óssea pode ser obtida de um sujeito e postas em cultura in vitro. O vírus recombinante pode ser administrado à população misturada de células de medula óssea, e a expressão de um gene relator incorporada no vírus pode ser testada nas células em cultura. Em algumas modalidades, pelo menos cerca de 50%, mais preferivelmente pelo menos cerca de 60%, 70%, 80% ou 90%, ainda mais preferivelmente pelo menos cerca de 95% de células transduzidas na população de células misturadas são células dendrítica que expressam a DC-SIGN.
Terapia
[00188] Os métodos da presente invenção podem ser usados para prevenir ou tratar uma ampla variedade de doenças ou desordens, particularmente aquelas nas quais uma resposta imuno em um paciente seria benéfica. Muitas de tais doenças são bem conhecidas na técnica. Por exemplo, doenças e desordens que são sensíveis ao tratamento ou prevenção pelos métodos da presente invenção incluem, sem limitação, cânceres, doenças auto-imunos e infecções, incluindo infecções virais, bacterianas, fúngicas e parasíticas. Em modalidades da invenção, uma doença é tratada ao usar vírus recombinantes para liberaçãor um gene de interesse às células dendríticas, onde a expressão do gene produz um antígeno específico para a doença e comanda o estímulo de respostas imunos celulares antígeno específicas e respostas imuno humorais.
[00189] Em modalidades da invenção, um vírus recombinante é usado para liberaçãor polinucleotídeos codificando um antígeno contra o qual uma resposta imuno é desejada para as células dendríticas. Em algumas modalidades, a liberação pode ser atingida ao contatar as células dendríticas com o vírus recombinante in vitro, depois do que as células dendríticas transduzidas são fornecidas a um paciente. Em algumas modalidades, a liberação pode ser alcançada ao se liberaçãor o vírus a um sujeito por contato com células dendríticas in vivo. As células dendríticas então estimulam células T ou células B antígeno específicas em um paciente para introduzir respostas imunos celulares e humorais para o antígeno expresso. Em tais modalidades, um paciente que está sofrendo de uma doença ou desordem é tratado pela geração de células imunos com uma especificidade desejada.
[00190] Qualquer antígeno que é associado com uma doença ou desordem pode ser liberado às células dendríticas usando vírus recombinantes como descrito aqui neste documento. Um antígeno que é associado com uma doença ou desordem é identificado para a preparação de um vírus recombinante que se direciona para células dendríticas. Antígenos associados com muitas doenças e desordens são bem conhecidos na técnica. Um antígeno pode ser previamente conhecido para ser associado com a doença ou desordem, ou pode ser identificado por qualquer método conhecido na técnica. Por exemplo, um antígeno para um tipo de câncer do qual um paciente está sofrendo pode ser conhecido, tal como um antígeno associado a um tumor. Em um aspecto, a invenção fornece um método para liberação de genes codificando antígenos de tumores e outras proteínas necessárias para DCs in vivo usando lentivírus recombinante projetado. Em outras modalidades, um antígeno relacionado à doença ou desordem é identificado do paciente a ser tratado. Por exemplo, um antígeno associado com um tumor pode ser identificado do próprio tumor por qualquer método conhecido na técnica. Antígenos associados a tumores não são limitados de qualquer modo e incluem, por exemplo, antígenos que são identificados em células cancerígenas do paciente a ser tratado.
[00191] Antígenos associados a tumores são conhecidos para uma variedade de cânceres, incluindo, por exemplo, câncer de próstata e câncer de seio. Em alguns cânceres de seio, por exemplo, o receptor Her-2 é superexpresso na superfície de células cancerosas. Antígenos de tumores exemplares incluem, mas, sem limitação: MAGE, BAGE, RAGE e NY-ESO, os quais são antígenos que não sofreram mutação expressos nas áreas imuno privilegiadas dos testes e em uma variedade de células de tumor; antígenos de tumor específico de linhagem tais como os antígenos da linhagem melanócito-melanoma MART-1/Melan- A, gp100, gp75, mda-7, tirosinase e proteína relacionada a tirosinase ou o antígeno de membrana específico da próstata (PSMA) e antígeno específico da próstata (PSA), os quais são antígenos expressos em células normais e neoplásticas derivadas do mesmo tecido; epítope proteínas/peptídeos derivados de genes com mutação em células tumorais ou genes transcritos em diferentes níveis no tumor comparado à células normais, tal como ras com mutação, re-arranjo bcr/abl, Os exemplos Her2/neu, p53 com mutação ou do tipo original, citocromo P450 1B1 e sequências intron expressas anormalmente tal como a N- acetilglu-cosaminiltransferase-V; re-arranjos clonais de genes de imunoglobulina gerando idiotipos únicos em mieloma e linfoma de célula B; epítope proteínas/peptídeos derivados de processos oncovirais, tal como proteínas E6 e E7 do vírus papiloma humano; proteínas oncofetais que não sofreram mutação com uma expressão seletiva a tumor, tal como o antígeno carcinoembriônico e alfa- fetoproteína. Um número de antígenos associados a tumor tem sido revisto (ver, por exemplo, “Tumor-Antigens Recognized By T- Lymphocytes”, Boon, T, Cerottini, J C, Vandeneyde, B., Vanderbruggen, P., Vanpel, A., Annual Review of Immunology, 12:337-365, 1994; “A listing of human tumor antigens recognized by T cells”, Renkvist, N., Castelli, C., Robbins, P.F., Parmiani, G., Cancer Immunology Immunotherapy, 50(1), 3-15, março de 2001, cada um dos quais é aqui incorporado neste documento por referência em sua totalidade).
[00192] O antígeno pode também ser um antígeno associado com uma doença infecciosa, tal como, por exemplo, HIV/AIDS. O antígeno pode ser, por exemplo, gp120 (Klimstra, W.B. e colaboradores, 2003, J Virol, 77:12022-12032; Bernard, K.A. e colaboradores, 2000, Virology, 276:93-103; Byrnes, A.P. e colaboradores, 1998, J. Virol., 72:73497356, cada um do qual é aqui incorporado neste documento por referência em sua totalidade). Outros exemplos de antígenos incluem, mas, sem limitação: gag, pol, env, tat, nef e rev (Liebermann, J. e colaboradores, 1997, AIDS Res Hum Retroviruses, 13(5): 383-392; Menendez-Arias, L. e colaboradores, 1998, Viral Immunol., 11(4): 167181, cada um dos quais é aqui incorporado neste documento por referência em sua totalidade).
[00193] Exemplos de antígenos virais incluem, mas, sem limitação, polipeptídeos de adenovirus, polipeptídeos de alfavirus, polipeptídeos de calicivirus, por exemplo, um antígeno capsídeo calicivirus, polipeptídeos de coronavirus, polipeptídeos de virus de cinomose, polipeptídeos de vírus Ebola, polipeptídeos de enterovirus, polipeptídeos de flavivirus, polipeptídeos de vírus da hepatite (AE), por exemplo, um antígeno de superfície ou núcleo de hepatite B, polipeptídeos de vírus do herpes, por exemplo, um vírus simplex do herpes ou glicoproteína de vírus zoster varicela, polipeptídeos de vírus de imunodeficiência, por exemplo, envelope ou protease de vírus da imunodeficiência humana, polipeptídeos do vírus de peritonite infecciosa, polipeptídeos de virus de influenza, por exemplo, uma hemaglutinina influenza A, neuraminidase ou nucleoproteína, polipeptídeos de virus da leucemia, polipeptídeos do vírus de Marbug, polipeptídeos de ortomixovirus, polipeptídeos de vírus de papiloma, polipeptídeos de vírus parainfluenza, por exemplo, a hemaglutinina/neuraminidase, polipeptídeos de paramixovirus, polipeptídeos de parvovirus, polipeptídeos de pestivirus, polipeptídeos de vírus picorna, por exemplo, um polipeptídeo capsídeo de poliovirus, polipeptídeos de vírus pox, por exemplo, um polipeptídeo de vírus vaccinia, polipeptídeos de vírus rabies, por exemplo, glicoproteína G de virus rabies, polipeptídeos de reovirus, polipeptídeos de retrovirus e polipeptídeos de rotavirus.
[00194] Os exemplos de antígenos bacterianos incluem, mas, sem limitação, polipeptídeos Actinomyces, polipeptídeos Bacillus, polipeptídeos Bacteroides, polipeptídeos Bordetella, polipeptídeos Bartonella, polipeptídeos Borrelia, por exemplo, B. burgdorferi OspA, polipeptídeos Brucella, polipeptídeos Campilobacter, polipeptídeos Capnocitofaga, polipeptídeos Clamidia, polipeptídeos Clostridium, polipeptídeos Corinebacterium, polipeptídeos Coxiella, polipeptídeos Dermatofilus, polipeptídeos Enterococus, polipeptídeos Ehrlichia, polipeptídeos Escherichia, polipeptídeos Francisella, polipeptídeos Fusobacterium, polipeptídeos Hemobartonella, polipeptídeos Hemófilus, por exemplo, proteína da membrana externa tipo b H. influenzae, polipeptídeos Helicobacter, polipeptídeos Klebsiella, polipeptídeos de bactéria em forma de L, polipeptídeos Leptospira, polipeptídeos Listeria, polipeptídeos de Micobacteria, polipeptídeos de Micoplasma, polipeptídeos de Neisseria, polipeptídeos de Neorickettsia, polipeptídeos de Nocardia, polipeptídeos de Pasteurella, polipeptídeos de Peptococus, polipeptídeos de Peptostreptococus, polipeptídeos de Pneumococcus, polipeptídeos de Proteus, polipeptídeos de Pseudomonas, polipeptídeos de Rickettsia, polipeptídeos de Rochalimea, polipeptídeos de Salmonela, polipeptídeos de Sigela, polipeptídeos de Stafilococus, polipeptídeos de Streptococus, por exemplo, proteínas M de S. piogenes, polipeptídeos de Treponema e polipeptídeos de Iersinia, por exemplo, antígenos V e F1 de Y. pestis.
[00195] Os exemplos de antígenos fúngicos incluem, mas, sem limitação, polipeptídeos Absidia, polipeptídeos Acremonio, polipeptídeos Alternaria, polipeptídeos de Aspergilus, polipeptídeos de Basidiobolus, polipeptídeos de Bipolares, polipeptídeos de Blastomices, polipeptídeos de Candida, polipeptídeos de Cocidioides, polipeptídeos de Conidiobolus, polipeptídeos de Criptococus, polipeptídeos de Curvalaria, polipeptídeos de Epidermofiton, polipeptídeos de Exofiala, polipeptídeos Geotrichum, polipeptídeos de Histoplasma, polipeptídeos de Madurela, polipeptídeos de Malassezia, polipeptídeos de Microsporum, polipeptídeos de Moniliela, polipeptídeos de Mortierela, polipeptídeos de Mucor, polipeptídeos de Paecilomices, polipeptídeos de Penicilium, polipeptídeos de Fialemonio, polipeptídeos de Fialofora, polipeptídeos de Prototeca, polipeptídeos de Pseudalescheria, polipeptídeos de Pseudomicrodochium, polipeptídeos de Pitium, polipeptídeos de Rinosporidium, polipeptídeos de Rizopus, polipeptídeos de Scolecobasidium, polipeptídeos de Sporotrix, polipeptídeos de Stemfilium, polipeptídeos de Tricofiton, polipeptídeos de Tricosporon e polipeptídeos de Xilohifa.
[00196] Os exemplos de antígenos de parasitas protozoários incluem, mas, sem limitação, polipeptídeos Babesia, polipeptídeos Balantidium, polipeptídeos Besnoitia, polipeptídeos Criptosporidium, polipeptídeos Eimeria, polipeptídeos Encefalitozoon, polipeptídeos Entamoeba, polipeptídeos Giardia, polipeptídeos Hammondia, polipeptídeos Hepatozoon, polipeptídeos Isospora, polipeptídeos Leishmania, polipeptídeos Microsporidia, polipeptídeos Neospora, polipeptídeos Nosema, polipeptídeos Pentatricomonas, polipeptídeos Plasmodium, por exemplo, P. falciparum circunsporozoite (PfCSP), proteína de superfície sporozoite 2 (PfSSP2), antígeno 1 do estado do fígado de término carboxil (PfLSA1 c-term) e proteína exportada 1 (PfExp-1), polipeptídeos Pneumocistis, polipeptídeos Toxoplasma e polipeptídeos Tripanosoma.
[00197] Os exemplos de antígenos de parasitas de helmintos incluem, mas, sem limitação, polipeptídeos de Acantoqueilonema, polipeptídeos de Aelurostrongilus, polipeptídeos de Ancilostoma, carpolipeptídeos de Angiostrongilus, polipeptídeos de Ascaris, polipeptídeos de Brugia, polipeptídeos de Bunostomum, polipeptídeos de Capilaria, polipeptídeos de Chabertia, polipeptídeos de Cooperia, polipeptídeos de Crenosoma, polipeptídeos de Dictiocaulus, polipeptídeos de Dioctofime, polipeptídeos de Dipetalonema, polipeptídeos de Difilobotrium, polipeptídeos de Diplidium, polipeptídeos de Dirofilaria, polipeptídeos de Dracunculus, polipeptídeos de Enterobius, polipeptídeos Filaroides, polipeptídeos de Hemonchus, polipeptídeos de Lagoquilascaris, polipeptídeos de Loa, polipeptídeos de Mansonela, polipeptídeos de Muelerius, polipeptídeos de Nanofietus, polipeptídeos de Necator, polipeptídeos de Nematodirus, polipeptídeos de Oesofagostomum, polipeptídeos de Onchocerca, polipeptídeos de Opistorchis, polipeptídeos de Ostertagia, polipeptídeos de Parafilaria, polipeptídeos de Paragonimus, polipeptídeos de Parascaris, polipeptídeos de Fisaloptera, polipeptídeos de Protostrongilus, polipeptídeos de Setaria, polipeptídeos de Spirocerca, polipeptídeos de Spirometra, polipeptídeos de Stefanofilaria, polipeptídeos de Strongiloides, polipeptídeos de Strongilus, polipeptídeos de Telazia, polipeptídeos de Toxascaris, polipeptídeos de Toxocara, polipeptídeos de Trichinela, polipeptídeos de Tricostrongilus, polipeptídeos deTrichuris, polipeptídeos de Uncinaria e polipeptídeos de Wuchereria.
[00198] Os exemplos de antígenos de ectoparasitas incluem, mas, sem limitação, polipeptídeos (incluindo antígenos protetores bem como alergênicos) de pulgas; carrapatos, incluindo carrapatos duros e carrapatos macios; moscas, tais como mosquito-pólvora, mosquitos, moscas de areia, moscas negras, moscas de cavalo, moscas do chifre, moscas de veados, moscas tsé-tsé, moscas de estábulos, moscas causadoras de miases e mosquito picadores; formigas; aranhas; piolhos; mitas e besouros verdadeiros, tais como besouros de cama e besouros de conenose.
[00199] Uma vez que o antígeno tenha sido identificado e/ou selecionado, um polinucleotídeo que codifica o antígeno desejado é identificado. Preferivelmente, o polinucleotídeo compreende um cDNA. Os polinucleotídeos codificando o antígeno são preferivelmente introduzidos nas células dendríticas alvo usando um virus recombinante, mais preferivelmente um lentivirus ou gamaretrovirus recombinante, incluindo uma molécula direcionadora que se liga à DC- SIGN como descrito acima. O virus recombinante primeiro se liga à membrana da célula dendrítica por meio da molécula direcionadora DC- SIGN, e o núcleo viral contendo um polinucleotídeo codificando o antígeno subsequentemente entra no citosol. O polinucleotídeo (por exemplo, um codificando o antígeno) é então preferivelmente integrado no genoma da célula e expresso. Se contatado ex vivo, as células dendríticas alvo são então transferidas de volta para o paciente, por exemplo, por injeção, onde elas interagem com células imunos que são capazes de gerar uma resposta imuno contra o antígeno desejado. Em modalidades preferidas, o virus recombinante é injetado no paciente onde ele transduz as células dendríticas direcionadas in situ. As células dendríticas então expressam o antígeno particular associado com a doença ou desordem a ser tratada e o paciente está capaz de montar uma resposta imuno efetiva contra a doença ou desordem.
[00200] Em algumas modalidades, o vírus recombinante contém uma sequência de polinucleotídeo codificando mais do que um antígeno, e sob a transdução de uma célula dendrítica direcionada, gera respostas imunos para a multitude de antígenos liberados à célula. Em algumas modalidades, os antígenos são relacionados a uma doença ou desordem única. Em outras modalidades, os antígenos são relacionados a múltiplas doenças ou desordens.
[00201] Em modalidades da invenção, fatores de maturação de DC que ativam e/ou estimulam a maturação de DCs são liberados em conjunto com o vírus recombinante carregando o polinucleotídeo ou gene de interesse. Em algumas modalidades, as DCs são ativadas pela liberação de fatores de maturação de DC antes da liberação do vírus. Em algumas modalidades, as DCs são ativadas pela liberação de fatores de maturação de DC após a liberação do vírus. Em algumas modalidades, as DCs são ativadas pela liberação dos fatores de maturação de DC simultaneamente com a liberação do vírus. Em algumas modalidades, os fatores de maturação de DC são providos junto com a administração do vírus. Em outras modalidades, os fatores de maturação de DC são proporcionados separadamente da administração do vírus.
[00202] Em certas modalidades, um ou mais fatores de maturação de DC podem ser codificados por um ou mais genes que estão contidos no vírus e expressos após o vírus transduzir a célula dendrítica. Em algumas modalidades, o um ou mais genes codificando os fatores de maturação de DC podem ser incluídos no vetor viral codificando um antígeno. Em modalidades adicionais, o um ou mais genes codificando os fatores de maturação de DC podem ser incluídos em um vetor viral que codifica mais do que um antígeno. Em algumas modalidades, podem ser proporcionados um ou mais genes que codificam os fatores de maturação de DC providos num vetor separado que é co-transfectado com o vetor viral codificando um ou mais antígenos em uma linhagem de células de empacotamento.
[00203] Em algumas modalidades, os métodos da presente invenção podem ser usados para imunoterapia adotiva em um paciente. Como descrito acima, um antígeno contra o qual uma resposta imuno é desejada é identificado. Um polinucleotídeo codificando o antígeno desejado é obtido e empacotado em um virus recombinante. Células dendríticas alvo são obtidas do paciente e transduzidas com u virus recombinante contendo um polinucleotídeo que codifica o antígeno desejado. As células dendríticas são então transferidas de volta para o paciente.
Vacinação
[00204] Como discutido acima, várias moléculas direcionadoras projetadas que se ligam ao marcador da célula dendrítica de superfície DC-SIGN são contemplados para uso na produção de vírus recombinante que liberação um gene codificando um antígeno às DCs. O vírus pode ser usado para transduzir DCs in vitro ou in vivo para prevenção de uma doença ou desordem. Por exemplo, a glicoproteína do envelope do vírus Sindbis pode ser projetada para se ligar preferencialmente à DC-SIGN e usada para pseudotipar um vírus recombinante. Um gene codificando um antígeno contra o qual uma resposta imuno é desejada, tal como para câncer (por exemplo, Mart-1) ou outra doença/desordem (tal como uma infecção viral) pode ser liberado às DCs usando métodos descritos aqui neste documento. Em algumas modalidades, múltiplos genes codificando múltiplos antígenos podem ser liberados às DCs usando métodos descritos aqui neste documento, através do uso de múltiplos vetores virais, ou, preferencialmente, um sistema de vetor multicistrônico. O um ou mais genes para o um ou mais antígenos podem ser acompanhados por genes codificando moléculas estimulatórias (tal como GM-CSF, IL-2, IL- 4, IL-6, IL-7, IL-15, IL-21, IL-23, TNF-α, B7.1, B7.2, 4-1BB, ligante CD40 (CD40L) e CD40 droga indutor (iCD40) (Hanks, e colaboradores, 2005, Nat Med. 11:130-137, o qual é aqui incorporado neste documento por referência em sua totalidade) e/ou uma molécula relatora (tal como GFP, luciferase e semelhantes) usando múltiplos vetores ou, preferivelmente, um sistema de vetor multicistrônico.
[00205] Em algumas modalidades da invenção, DCs humanas são geradas pela obtenção de progenitores hematopoiéticos humanos CD34α+ e usando um método de cultura in vitrocomo descrito em qualquer lugar (por exemplo, Banchereau e colaboradores, Cell, 106, 271-274 (2001)). Os vírus tendo uma molécula direcionadora que se liga à DC-SIGN são gerados compreendendo um gene codificando um antígeno contra o qual uma resposta imuno é desejada e são usados para transduzir DCs de humanos. A especificidade e eficiência da transdução podem ser quantificadas pela FACS. A maturação das DCs pode ser caracterizada pela análise FACS de regulação para cima do marcador de superfície tal como o MHC II.
[00206] Em outras modalidades, o vírus pode ser injetado in vivo, onde ele contata DCs naturais e liberação um polinucleotídeo de interesse, tipicamente um gene codificando um antígeno. A quantidade de partículas virais é pelo menos 50 x 106TU, e pode ser pelo menos 1 x 107TU, pelo menos 2 x 107TU, pelo menos 3 x 107TU, pelo menos 4 x 107TU ou pelo menos 5 x 107TU. Em intervalos selecionados, as DCs de órgãos linfóide de recipiente podem ser usadas para medir a expressão, por exemplo, pela observação da expressão do marcador, tal como um GFP ou luciferase. As células T dos nódulos linfáticos e baço dos recipientes tratados com virus podem ser medidas pela magnitude e durabilidade da resposta ao estímulo do antígeno. Células do tecido outras que as DCs, tais como as células epiteliais e células linfóides, podem ser analisadas quanto à especificidade da liberação de gene in vivo.
[00207] É amplamente aceito que o método potencial mais efetivo para terminar a epidemia da AIDS (e outras doenças virais) é uma vacina. Até hoje, nenhum método de vacinação contra o HIV passou com sucesso de um teste na fase III. Assim, existe uma urgente necessidade para novas e efetivas estratégias de vacinação. Em algumas modalidades da invenção, a vacinação DC é usada. Um gene é clonado codificando uma proteína viral, tais como aquelas descritas acima, em um vetor viral. Pacientes infectados com os vírus compreendendo uma molécula direcionadora que se liga à DC-SIGN nas DCs, preferivelmente com uma especificidade tal que efeitos colaterais indesejáveis são evitados. A molécula direcionadora pode ser, por exemplo, uma glicoproteína de envelope de vírus de Sindbis projetada e a administração do vírus pode ser efetuada, por exemplo, por injeção. Em um modelo animal, vírus relatores HIV clonados molecularmente (NFNSZ-r-HSAS, NL-r-HSAS) e isolados clínicos podem ser usados para testar os animais por injeção por veia final. A evidência da infecção pode ser monitorada durante o tempo em esplenócitos, nódulos linfáticos e sangue periférico. O PCR para a proteína HIV-gag e FCAS para a HAS nos vírus relatores podem ser usados para testar a integração e replicação viral. A vacinação de DC in situ produtiva pode aumentar a resistência a um teste de HIV. Veja Exemplos 17-20.
[00208] Em algumas modalidades, são proporcionadas as células dendríticas transduzidas com um virus recombinante como descrito aqui neste documento para a prevenção ou tratamento de uma doença ou desordem. Em modalidades preferidas, as células dendríticas expressam um antígeno contra o qual uma resposta imuno é desejada. O antígeno é tipicamente um que não é normalmente expresso em uma célula dendrítica, mas é expresso após a célula alvo ser transduzida com o vírus recombinante contendo um polinucleotídeo codificando um antígeno. Em algumas modalidades, as células dendríticas ainda expressam um fator de maturação de DC que é fornecido para a célula dendrítica por um vírus recombinante como descrito aqui neste documento.
[00209] Em alguns aspectos da invenção, um adjuvante é administrado em conjunto com um vírus recombinante da invenção. O adjuvante pode ser administrado com o vírus recombinante, antes do vírus recombinante ou após o vírus recombinante.
[00210] Uma variedade de adjuvantes pode ser usada em combinação com o vírus recombinante da invenção para induzir uma resposta imuno ao antígeno codificado para o virus recombinante. Adjuvantes preferidos aumentam a resposta intrínseca para um antígeno sem causar mudanças conformacionais no antígeno que afetem a forma qualitativa da resposta. Adjuvantes preferidos incluem alume, 3 De-O-acilado monofosforil lipídeo A (MPL) (ver GB 2.220.211). A QS21 é um triterpeno glicosídeo ou saponina isolada da casca da árvore Quillaja Saponaria Molina encontrada na América do Sul (ver, Kensil e colaboradores, in Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach (eds. Powell & Newman, Plenum Press, NY, 1995); Patente US 5.057.540). Outros adjuvantes são emulsões óleo em água (tal como esqualeno ou óleo de amendoim), opcionalmente em combinação com estimulantes imunos, tais como um lipídeo monofosforil A (ver Stoute e colaboradores, N. Engl. J. Med., 336, 86-91(1997)). Outro adjuvante é o CpG (Bioworld Today, nov. 15, 1998). Alternativamente, Aβ pode ser acoplado a um adjuvante. Por exemplo, uma versão lipopeptídeo de Aβ pode ser preparado pelo acoplamento de ácido palmítico ou outros lipídeos diretamente ao terminal-N de Aβ como descrito para a vacinação com antígeno da hepatite B (Livingston, J. Immunol., 159, 1383-1392 (1997)). Todavia, tal acoplamento não mudaria substancialmente a conformação de Aβ de forma a afetar a natureza da resposta imuno ao mesmo. Adjuvantes podem ser administrados como um componente de uma composição terapêutica com um agente ativo ou pode ser administrado separadamente, antes, concorrentemente com ou após a administração do agente terapêutico.
[00211] Uma classe preferida de adjuvantes são os sais de alumínio (alume), tais como hidróxido de alumínio, fosfato de alumínio, sulfato de alumínio. Tais adjuvantes podem ser usados com ou sem outros agentes imunoestimulantes tais como MPL ou 3-DMP, QS21, aminoácidos poliméricos e monoméricos tais como ácido poliglutâmico ou polilisina. Outra classe de adjuvantes são formulações de emulsão óleo em água. Tais adjuvantes podem ser usados com ou sem outros agentes imunoestimulanmtes específicos tais como peptídeos de muramil (por exemplo, N-acetilmuramil-L-treonil-D-isoglutamina (thr- MDP), N-acetil-normuramil-L-alanil-D-isoglutamina (nor-MDP), N- acetilmuramil-L-alanil-D-isoglutaminil-L-alanina-2-(1'-2'dipalmitoil-sn- glicero-3-hidroxi-fosforiloxi)-etilamina (MTP-PE), N-acetilglucsaminil-N- acetilmuramil-L-A1-D-isoglu-L-Ala-dipalmitoxi propilamida (DTP-DPP) teramida®, ou outros componentes da parede celular bacteriana. Emulsões óleo em água incluem (a) MF59 (WO90/14837), contendo 5% de Esqualeno, 0,5% de Tween 80 e 0,5% de Span 85 (opcionalmente contendo vária quantidades de MTP-PE) formulada em partículas submicrônicas usando um microfluidizador tal como o microfluidizador Model 110Y (Microfluidics, NewtonMA), (b) SAF, contendo 10% de Esqualeno, 0,4% de Tween 80, 5% de polímero pluronic bloqueado L121 e thr-MDP, seja microfluidizado em emulsão submicron ou posto em vortex para gerar uma emulsão com tamanho de partícula maior, e (c) sistema adjuvante Ribi®(RAS), (Ribi Immunochem, Hamilton, MT) contendo 2% de esqualeno, 0,2% de Tween 80 e um ou mais componentes da parede celular bacteriana do grupo consistindo de monofosforilipideo A (MPL), trealose dimicolato (TDM) e esqueleto da parede celular (CWS), preferivelmente MPL + CWS (Detox®). Outra classe de adjuvantes preferidos é adjuvante de saponina, tais como Stimulon® (QS21, Aquila, Worcester, MA) ou partículas geradas dos mesmos tais como ISCOMs (complexos imunoestimulantes) e ISCOMATRIX. Outros adjuvantes incluem Adjuvante de Freund Completo (CFA) e Adjuvante de Freund Incompleto (IFA). Outros adjuvantes incluem citocinas, tais como as interleucinas (IL-1, IL-2 e IL- 12), fator de estímulo de colônia de macrófago (M-CSF), fator de necrose de tumor (TNF).
[00212] Um adjuvante pode ser administrado com o vírus recombinante da invenção como uma composição única ou pode ser administrado antes, concorrentemente ou após a administração do vírus recombinante da invenção. Imunogênio e adjuvante podem ser empacotados e supridos no mesmo frasco ou podem ser empacotados em frascos separados e misturados antes do uso. O imunogênio e adjuvante são tipicamente empacotados com um rótulo indicando a aplicação terapêutica pretendida. Se o imunogênio e adjuvante são empacotados separadamente, o pacote tipicamente inclui instruções para mistura antes do uso. A escolha de um adjuvante e/ou veículo depende da estabilidade da vacina contendo o adjuvante, a rota de administração, o programa de dosagem, a eficácia do adjuvante para as espécies sendo vacinadas e, em humanos, um adjuvante aceitável farmaceuticamente é um que tenha sido aprovado ou está aprovável para administração humana pelos corpos regulatórios pertinentes. Por exemplo, o adjuvante de Freund Completo não é apropriado para administração humana. Alume, MPL e QS21 são preferidos. Opcionalmente, dois ou mais adjuvantes diferentes podem ser usados simultaneamente. Combinações preferidas incluem alume com MPL, alume com QS21, MPL com QS21 e alume, QS21 e MPL juntos. Também, adjuvante de Freund Incompleto pode ser usado (Chang e colaboradores, Advanced Drug Delivery Reviews, 32, 173-186 (1998)), opcionalmente em combinação com qualquer de alume, QS21 e MPL e todas as combinações dos mesmos.
Composições Farmacêuticas e Kits
[00213] Também contemplado aqui neste documento estão composições farmacêuticas e kits contendo um vírus recombinante fornecido aqui neste documento e um ou mais componentes. As composições farmacêuticas podem incluir um vírus recombinante provido aqui neste documento e um veículo farmacêutico. Os kits podem incluir as composições farmacêuticas e/ou combinações fornecidas aqui neste documento e um ou mais componentes, tais como instruções para uso e um dispositivo para administrar um composto a um sujeito.
[00214] São proporcionadas aqui neste documento composições farmacêuticas contendo um vírus fornecido aqui neste documento e um veículo farmacêutico apropriado. As composições farmacêuticas providas aqui neste documento podem ser de várias formas, por exemplo, na forma sólida, líquida, em pó, aquosa ou liofilizada. Exemplos de veículos farmacêuticos apropriados são conhecidos na técnica. Tais veículos e/ou aditivos podem ser formulados por métodos convencionais e podem ser administrados ao sujeito em uma dose apropriada. Agentes de estabilização tais como lipídeos, inibidores de nuclease, polímeros e agentes quelantes podem preservar as composições da degradação dentro do corpo.
[00215] O vírus recombinante provido aqui neste documento pode ser empacotado como kits. Kits podem opcionalmente incluir um ou mais componentes tais como instruções para uso, dispositivos e reagentes adicionais e componentes, tais como tubos, containeres e seringas para a prática do método. Kits exemplares podem incluir os vírus proporcionados aqui neste documento e podem opcionalmente fornecer instruções para uso, um dispositivo para detecção de um vírus em um sujeito, um dispositivo para administração do vírus a um sujeito e um dispositivo para administração de um composto a um sujeito.
[00216] Os kits compreendendo polinucleotídeos que codificam um gene de interesse (tipicamente um antígeno) são também contemplados aqui neste documento. Em algumas modalidades, o kit inclui pelo menos um plasmídeo codificando componentes de empacotamento de vírus e vetor codificando uma molécula direcionadora que é projetada para se ligar às células dendríticas, preferivelmente com especificidade. Em algumas modalidades, o kit inclui pelo menos um plasmídeo codificando componentes de empacotamento de vírus, um vetor codificando uma molécula direcionadora que é projetada para se ligar a células dendríticas e um vetor codificando pelo menos um fator de maturação de DC.
[00217] Os kits compreendendo um vetor viral que codifica um gene de interesse (tipicamente um antígeno) e opcionalmente, uma sequência de polinucleotídeo codificando um fator de maturação de DC são também contemplados aqui neste documento. Em algumas modalidades, o kit inclui pelo menos um plasmídeo codificando componentes de empacotamento de vírus e vetor codificando uma molécula direcionadora que é projetada para se ligar às células dendríticas.
[00218] Num exemplo, um kit pode conter instruções. As instruções tipicamente incluem uma expressão tangível descrevendo o vírus e, opcionalmente, outros componentes incluídos no kit e métodos para a administração, incluindo métodos para determinar o estado apropriado do sujeito, a quantidade de dosagem apropriada e o método de administração apropriado, para a administração do vírus. As instruções podem também incluir um guia para monitoramento do sujeito durante a duração do tempo de tratamento.
[00219] Os kits fornecidos aqui neste documento podem incluir um dispositivo para administração do vírus a um sujeito. Qualquer uma de uma variedade de dispositivos conhecidos na técnica para a administração de medicamentos ou vacinas pode ser incluída nos kits fornecidos aqui neste documento. Dispositivos exemplares incluem, mas, sem limitação, uma agulha hipodérmica, uma agulha intravenosa, um cateter, um dispositivo de injeção sem agulha, um inalador, um dispensador de líquido, tal como um colírio. Tipicamente, o dispositivo para a administração do vírus do kit será compatível com o vírus do kit; por exemplo, um dispositivo de injeção sem agulha tal como um dispositivo de injeção a alta pressão pode ser incluído nos kits com os vírus não danificados pela injeção a alta pressão, mas é tipicamente não incluído em kits com vírus danificados por injeção a alta pressão.
[00220] Os kits providos aqui neste documento também podem incluir um dispositivo para administração de um composto, tal como um ativador ou estimulador de DC, a um sujeito. Qualquer uma de uma variedade de dispositivos conhecidos na técnica para a administração de medicamentos a um sujeito pode ser incluída nos kits fornecidos aqui neste documento. Dispositivos exemplares incluem uma agulha hipodérmica, uma agulha intravenosa, um cateter, uma injeção sem agulha, mas, sem limitação, uma agulha hipodérmica, uma agulha intravenosa, um cateter, um dispositivo de injeção sem agulha, um inalador, um dispensador de líquido, tal como um colírio. Tipicamente, o dispositivo para a administração do composto do kit será compatível com o método desejável de administração do composto.
[00221] Os seguintes exemplos são oferecidos com propósitos ilustrativos apenas e não se pretende que limitem o escopo da presente invenção de qualquer modo. Na verdade, várias modificações da invenção em adição àquelas mostradas e descritas aqui neste documento se tornarão aparentes àqueles versados na técnica a partir da descrição precedente caem dentro do escopo das Reivindicações anexadas.
[00222] Todas as patentes e literaturas de referências citadas na presente especificação são aqui incorporadas por referência em suas totalidades.
EXEMPLO 1 PROJETANDO UMA MOLÉCULA DIRECIONADORA DC ESPECÍFICA
[00223] Os vetores lentivirais podem ser racionalmente projetados para fazê-los capazes de transduzir DCs de um modo célula específica. Certos sob-conjuntos de DCs possuem em suas superfícies a proteína DC-SIGN (Geijtenbeek, T.B. e colaboradores, 2000; Geijtenbeek, T.B. e colaboradores, 2000, supra), um receptor semelhante à lectina tipo C capaz de rápida ligação e endocitose de materiais (Geijtenbeek, T.B. e colaboradores, 2004, supra), o qual pode ser usada como um receptor direcionador em DCs. O vírus Sindbis (SV) - um membro do gênero Alfavírus e da família Togaviridae - é capaz de infectar DCs através da DC-SIGN (Klimstra, W.B. e colaboradores, 2003, J. Virol., 77: 12022 12032, o qual é aqui incorporado neste documento por referência em sua totalidade). Todavia, o receptor viral canônico para a cepa de laboratório do SV é o sulfato de heparana de superfície de célula (HS), o qual é expresso por muitos tipos de células (Strauss, J.H. e colaboradores, 1994, Arch. Virol., 9: 473-484; Byrnes, A.P. e D.E. Griffin, 1998, J. Virol., 72: 7349-7356, cada um dos quais é aqui incorporado neste documento por referência em sua totalidade). Levando vantagem da separação física dos dois sítios de ligação- receptor na glicoproteína de envelope SV (daqui em diante designada como SVG), o receptor foi projetado para se cego ao seu alvo de ligação canônico HS e para deixar intacta sua habilidade de interagir com a DC-SIGN (Figura 1). Uma vez que ela é incorporada na superfície viral, esta glicoproteína mutante é capaz de mediar a infecção de DCs, mas não as outras células.
[00224] O cDNA para o tipo original SVG foi obtido do laboratório do Dr. J.H. Strauss, laboratório no California Institute of Technology e clonado no vetor pcDNA3 (Invitrogen) pelo PCR para gerar o plasmídeo pSVG. Uma sequência identificadora de dez resíduos (MYPYDVPDYA) foi inserida na proteína E2 entre os aminoácidos 71 e 74 pela mutagênese do PCR para quebrar o sítio de ligação da HS (Karavans, G. e colaboradores, 1998, Crit. Rev. Oncol. Hemat., 28: 7-30; Lavillete, D. e colaboradores, 2001, Curr. Opin. Biotech., 12: 461-466; Russel, S.J. e F.L. Cosset, 1999, J. Gene. Med., 1: 300,311; Sandrin, V. e colaboradores, 2003, Curr. Top Microbiol., 281: 137-178; Verhoeyen, E. e F.L. Cosset, 2004, J. Gene Med., 6: S83-S94, cada um dos quais é aqui incorporado neste documento por referência em sua totalidade). Um anticorpo disponível contra a sequência identificadora inserida fornecia a habilidade para monitorar a expressão do SVG modificado. De forma a diminuir adicionalmente a infecção HS específica, diversos resíduos críticos foram identificados como sendo envolvidos na ligação a moléculas HS (Coffin, J.M. e colaboradores, 1997, Retrovírus, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press; Battini, J.L. e colaboradores, 1998, J. Virol., 72: 428-435; Valsesiawittmann, S. e colaboradores, 1994, J. Virol., 68: 4609-4619; Wu, B.W. e colaboradores, 2000, Virology, 269: 7-17; Cosset, F.L. e colaboradores, 1995, J. Virol. 69: 6314-6322; Kayman, S.C. e colaboradores, 1999, J. Virol., 73: 1802 1808; Lorimar, I.A.J. e S.J. Lavictoire, 2000, J. Immunol Methods, 237: 147-157; Barnett, A.L. e colaboradores, 2001, Proc Nat Acad Sci USA, 98: 4113-4118; Benedict, C. A. e colaboradores, 2002, Hum. Gene Ther., 10: 545-557; Gollan, T.J. e M.R. Green, 2002, J. Virol., 76:35583563, cada um dos quais é aqui incorporado neste documento em sua totalidade. Dois de tais resíduos foram mudados para alaninas (157KE158 a 157AA158).
[00225] Uma deleção adicional foi introduzida para a glicoproteína E3 do SVG para remover aminoácidos 61-64. Este SVG modificado foi designado como SVGmu (SEQ ID NO: 11). O cDNA para o SVGmu foi clonado a jusante do promotor CMV no vetor pcDNA3 (designado como pSVGmu, SEQ ID NO: 3).
EXEMPLO 2 PREPARAÇÃO DE VÍRUS RECOMBINANTE CONTENDO UMA MOLÉCULA DIRECIONADORA DC ESPECÍFICA
[00226] A preparação do lentivírus pseudotipado SVGmu recombinante foi conduzida pela transfecção transiente mediado por fosfato de cálcio padrão de células 293T com o vetor lentiviral FUGW (SEQ ID NO: 1) ou seus derivados, os construtos de empacotamento codificando genes gag, pol e rev e pSVGmu (Exemplo 1). O FUGW é um vetor lentiviral auto-inativante carregando o promotor ubiquitina-C humano para direcionar a expressão de um gene relator GFP (Lois, C. e colaboradores, 2002, Science, 295: 868-872, que é aqui incorporado por referência em sua totalidade). Os vetores de transferência lentivirais (FUGW e seus derivados) usados nestes estudos são vetores lentivirais baseados no HIV de terceira geração, nos quais a maior parte da região U3 do LTR 3'é deletado, resultante em um LTR-3'auto-inativante (SIN).
[00227] Para a transfecção transiente das células 293T, as células 293T foram postas em cultura em pratos de cultura de tecido de 6 cm (Corning ou BD Biosciences) foram transfectadas com o plasmídeo de vetor de transferência lentiviral apropriado (5 μg), junto com 2,5 μg cada do plasmídeo de envelope (SVG, SVGmu, Eco ou VSVG) e os plasmídeos de empacotamento (pMDLg/pRRE e pRSV-Rev). Os sobrenadantes virais foram coletados 48 e 72 horas pós-transfecção e filtrados através de um filtro de 0,45 μm (Corning). Para preparar vetores virais concentrados para estudo in vivo, os sobrenadantes virais foram ultra centrifugados (Optima L-80 K ultra centrífuga preparativa, Beckman Coulter) a 50.000 x g por 90 min. As pelotas foram então re-suspensas e um volume apropriado de PBS frio.
[00228] Os vírus pseudotipados resultantes com SVGmu são daqui em diante referidos como FUGW/SVGmu. Os vírus de controle envelopados com a glicoproteína SVG do tipo original são daqui em diante referidos como FUGW/SVG.
EXEMPLO 3 IMAGEM CONFOCAL DO VÍRUS RECOMBINANTE EMPACOTADO
[00229] Lentivetores rotulados vpr-GFP foram produzidos como descrito no Exemplo 2, exceto com o uso do lentivetor FUW (o qual não contém o gene relator GFP) e com um plasmídeo separado codificando vpr-GFP (2,5 μg). Sobrenadante viral fresco foi repousado em coberturas revestidas com polilisina em um prato de cultura de 6 poços e centrifugado a 3.700 x g a 4°C por 2 horas usando uma centrífuga Sorvall Legend RT. As coberturas foram rinsadas com PBS frio duas vezes e imuno tingidas com anticorpo anti-HA-biotina (Miltenyi Bioetc) e Cy5-streptavidina (Invitrogen). Imagens fluorescentes foram tomadas com um microscópio confocal de varredura a laser Zeiss LSM 510 equipado com conjuntos de filtros para fluoresceína e Cy5. Uma objetiva de imersão em óleo plano-apocromático (63x/1.4) foi usado para imagem.
[00230] A Figura 2 mostra os resultados da imagem confocal do vírus recombinante produzido pelo protocolo. (A barra de escala representa 2 μm). Partículas no slide “GFP” foram tingidas de verde, partículas no slide “SVGmu” são tingidas de vermelho e partículas no slide “Misturado” foram tingidas de verde onde apenas GFP é expresso, vermelho onde apenas SVGmu é expresso onde é amarelo/amarelo- laranja onde GFP e SVGmu são ambos expressados. Mais do que 90% das partículas rotuladas de GFP continham SVGmu. Assim, a produção de partículas lentivirais mostrando SVGmu foi confirmada através da imagem confocal.
EXEMPLO 4 PREPARAÇÃO DE LINHAGENS DE CÉLULAS DC-SIGN
[00231] Para facilitar o estudo da transdução direcionada, linhagens de células DC-SIGN expressando DC-SIGN humano (daqui para a frente referido como 293T.hDCSIGN) e DC-SIGN murino (daqui em diante referido como 293T.mDCSIGN) foram elaboradas. As linhagens de células 293T.hDCSIGN e 293T.mDCSIGN foram geradas pela transdução estável de células 293T originais com um lentivetor VSVG pseudotipado. Os cDNAs para DC-SIGN humano e DC-SIGN murino foram amplificados dos plasmídeos pUNO-hDCSIGNN1Aa e pUNO- mDCSIGN (InvivoGene) e clonados a jusante do promotor ubiquitina-C humano no plasmídeo lentiviral FUW para gerar FUW-hDCSIGN (SEQ ID NO: 5) e FUW-mDCSIGN (SEQ ID NO: 6), respectivamente. Os lentivetores foram então submetidos a tingimento de anticorpo (anticorpo DC-SIGN anti-humano da BD Biosciences e DC-SIGN anti- murino da eBioscience) e classificação de células para produzir uma população uniforme de linhagens de células DC-SIGN+293T.hDCSIGN e mDC-SIGN+293T.mDCSIGN.
[00232] A citometria de fluxo mostrou que a DC-SIGN foi expressa em virtualmente todas as células 293T.hDCSIGN e 293T.mDCSIGN da linhagem de células (Figura 3A). Em cada diagrama, as linhas sólidas (área não preenchida) representam a expressão da DC-SIGN nas linhagens de células 293T DC-SIGN e a área sombreada representa o tingimento de fundo das células 293T não transduzidas.
EXEMPLO 5 AVALIAÇÃO DO VÍRUS RECOMBINANTE DC-SIGN ESPECÍFICO POR TRANSDUÇÃO DE LINHAGENS DE CÉLULAS DC-SIGN
[00233] Para acessar a eficiência e especificidade de transdução da FUGW/SVG ou FUGW/SVGmu (Exemplo 2), os vírus foram usados para transduzir as linhagens de células 293T.hDCSIGN e 293T.mDC- SIGN (Exemplo 4). A eficiência de transdução foi medida pela expressão da GFP dentro das linhagens de células.
[00234] As células alvo (células 293T.hDCSIGN, 293T.mDCSIGN ou 293T; 0,2 x 106por poço) foram postas em um prato de cultura de 24 poços (Corning ou BD Biosciences) e infectadas por rotação com os sobrenadantes virais (1 ml por poço) a 2.500 rpm e 30°C por 90 min usando uma centrífuga Sorvall Legend. Subsequentemente, os sobrenadantes foram substituídos com meio de cultura fresco e incubados por 3 dias a 37°C com 5% de CO2. A percentagem de células GFP+foi medida por citometria de fluxo. O título da transdução foi determinado pelas faixas de diluições que exibiram uma resposta linear.
[00235] A citometria de fluxo mostrou que a FUGW/SVG (contendo a glicoproteína de envelope SVG do tipo original) tinha uma eficiência de transdução (11~16% transdução) em direção das três linhagens de células alvo (293T, 293T.hDCSIGN e 293T.mDCSIGN) (Figura3B). Isto indica que a SVG tem ampla especificidade e a presença da DC-SIGN na superfície da célula não altera marcadamente a habilidade de transdução de um vetor lentiviral SVG pseudotipado. Pelo contrário, o vetor FUGW/SVGmu (contendo a glicoproteína de envelope SVG mutante) poderia especificamente transduzir as células 293T.hDCSIGN e 293T.mDCSIGN com uma eficiência de transdução de 42% e 34%, respectivamente, mas não as células 293T (Figura 3B). Estes resultados demonstram que um vetor lentiviral pseudotipado mostrando SVGmu pode especificamente transduzir células expressando seja DC-SIGN humano ou murino. Além disso, o SVG mutante deu transdução mais eficiente das células expressando DC- SIGN do que a SVG do tipo original.
[00236] A integração estável do vetor lentiviral FUGW nas células transduzidas foi confirmada por análise de PCR da integração genômica do gene relator GFP. Para demonstrar que a transdução específica foi mediada pela DC-SIGN, a adição de anticorpo DC-SIGN anti-humano solúvel para o sobrenadante viral FUGW/SVGmu antes de sua exposição às células 293T.hDCSIGN reduziu a eficiência de transdução (dados não mostrados). O título específico do FUGW/SVGmu para a 293T.mDCSIGN foi estimado ser 1 x 106TU (Unidades de Transdução)/ml. O título da FUGW/SVGmu para a 293T.mDCSIGN foi estimado ser 1-2 x 106TU/ml.
EXEMPLO 6 AVALIAÇÃO DO VÍRUS RECOMBINANTE IN VITRO
[00237] Para investigar a especificidade do lentivetor projetado para a transdução de células dendríticas (DCs) expressando a DC-SIGN, células da medula óssea total (BM) foram isoladas de camundongos e transduzidas diretamente com o vetor viral FUGW/SVGmu (Exemplo 2). Um protocolo para gerar DCs de camundongos de progenitores crescidos em culturas BM foi adaptado para uso no experimento (Buchholz, C.J. e colaboradores, 1998, Nat. Biotech., 16: 951-954, o qual é aqui incorporado neste documento por referência em sua totalidade).
[00238] As células de medula óssea total foram coletadas de camundongos fêmeas B6 (Charles River Breeding Laboratories), e BMDCs foram geradas como descrito em qualquer lugar (Yang, L. e D. Baltimore, 2005, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 102:4518-4523, o qual é aqui incorporado neste documento por referência em sua totalidade). Ou as células BM totais ou BMDCs foram postas em um prato de cultura de 24 poços (2 x 106células por poço) e infectadas por rotação com o sobrenadante viral (1 ml por poço) a 2.500 rpm e 30°C por 90 min usando uma centrífuga Sorvall RT7. Após a rotação, o sobrenadante foi removido e substituído com meio RPMI fresco contendo 10% de FBS e GM-CSF (1:20 J558L meio condicionado). As células foram postas em cultura por 3 dias e foram analisadas quanto a expressão de GFP usando citometria de fluxo.
[00239] As células BM isoladas de camundongos foram transduzidas diretamente seja com o vetor viral FUGW/SVGmu ou com um vetor de controle. Para o controle, um lentivetor (FUGW/EcO) (Eco) envelopado de glicoproteína do vírus de leucemia murina ecotrópica foi usado; o vetor envelopado com Eco pode infectar células de roedores com uma ampla especificidade. Três dias pós-infecção, a eficiência de transdução foi analisada por citometria de fluxo (Figura 4A). Aproximadamente 9% das células nas culturas BM misturadas foram DCs (como indicado pela expressão da CD11c), das quais a maioria (aproximadamente 80%) eram DC-SIGN altas (dados não mostrados). Foi observado que 12% das células BM totais foram GFP positivas (GFP+) na transdução FUGW/SVGmu (Figura 4A). Quando limitados a células GFP+, foi observado que até 95% das células transduzidas foram duplo-positivo para DC-SIGN e CD11c (DC-SIGN+CD11c+), indicando que a FUGW/SVGmu especificamente transduz DCs expressando a DC-SIGN e não outros tipos de células na medula óssea. Pelo contrário, embora 68% das células da BM totais fossem GFP positivas após exposição à FUGW/Eco, apenas 9% das células transduzidas foram DCs, dentro das quais 6,5% foram DC-SIGN+.
[00240] A transdução estável da FUGW/SVGmu foi verificada por análise Alu PCR (Butler, S.L. e colaboradores, 2001, Nat. Med., 7: 631634, o qual é aqui incorporado neste documento por referência em sua totalidade) da integração genômica do LTR do suporte principal lentivetor. Além disso, nós usamos a FUGW/SVGmu para transduzir células T e B coletadas do baço de camundongo e virtualmente nenhuma transdução foi observada (Figura 4B), indicando notável especificidade de transdução.
[00241] A eficiência do lentivetor contendo SVGmu para transduzir DCs derivadas da medula óssea (BM), postas em cultura in vitro (BMDCs) foi também testada. As DCs derivadas da medula óssea (BM) (BMDCs) foram geradas como descrito acima postas em cultura na presença do fator de estimulação de colônia macrófago-granulócito (GM- CSF) por 6 dias. As células foram então expostas ou ao lentivetor FUGW/SVGmu ou FUGW/Eco. A citometria de fluxo das BMDCs no dia 3 pós-transdução mostrou que a FUGW/Eco transduziu ambas as células DCs CD11c+(33%) e CD11c-(7,6%) (Figura 5), o que é consistente com o tropismo amplo da Eco. Ao contrário, a FUGW/SVGmu apenas transduziu células DCs CD11c+ (32,7%) e nenhuma das células GFP+foram detectadas entre as células CD11c- (Figura 5), indicando que a FUGW/SVGmu pode especificamente modificar as BMDCs.
[00242] Estes resultados assim coletivamente demonstram que lentivetores recombinantes projetados contendo SVGmu especificamente transduzem DCs in vitro e que a transdução direcionada é correlacionada com a expressão da DC-SIGN na superfície das DCs.
EXEMPLO 7 EFEITO DO VÍRUS RECOMBINANTE NA ATIVAÇÃO DE CÉLULAS DENDRÍTICAS IN VITRO
[00243] O lentivírus recombinante foi adicionalmente examinado para determinar se ele poderia especificamente direcionar, transduzir e ativar as DCs em DCs maduras. A sobrerregulação da superfície da molécula co-estimulatória B7.2 (CD86) e a molécula I-AbMHC classe II, as quais são consideradas ser as assinaturas da ativação da DC (Steinman, R.M. e colaboradores, 2003, Annu. Rev. Immunol., 21: 685711, o qual é aqui incorporado neste documento por referência em sua totalidade), foi medida em DCs expostas ao vírus recombinante. As BMDCs foram geradas e infectadas com FUGW/SVGmu como descrito no Exemplo 6. LPS em uma concentração de 1 μg/ml foi também adicionado durante a noite para ativação adicional das BMDCs transduzidas.
[00244] A citometria de fluxo das BMDCs 3 dias após a transdução mostrou que o tratamento com FUGW/SVGmu elevou a expressão dos marcadores de ativação da DC, CD86 e I-Ab, nas DCs GFP positivas, quando comparado com as DCs GFP negativas (Figura 6, painel de topo). A área sombreada indica células GFP negativas (não transduzidas) e a linha sólida (área não preenchida) indica células GFP positivas (transduzidas). Foi observado que a transdução direcionada das BMDCs apresentou sinergia com o tratamento com lipopolissacarídeo (LPS) para adicionalmente amadurecer as DCs (Figura 6, painel de baixo). Isto indica que a transdução direcionada pode tanto trabalhar sozinha como em combinação com outros fatores de maturação de DC para induzir a ativação de DC.
EXEMPLO 8 DIRECIONAMENTO DE CÉLULAS DENDRÍTICAS IN VIVO PELO VÍRUS RECOMBINANTE
[00245] A prova de que se esta metodologia pode ser usada para vacinação pode ser examinada por experimentação in vivo. Para testar se os lentivetores projetados contendo SVGmu poderiam direcionar DCs in vivo, o lentivetor recombinante e concentrado FUGW/SVGmu (50 x 106 TU re-suspenso em 200 μl de PBS) foi injetado de modo subcutâneo no flanco esquerdo de camundongos fêmeas C57BL/6 (B6, Charles River Breeding Laboratories) próximo do nódulo linfático inguinal (dentro da faixa de 1 cm). O nódulo linfático inguinal esquerdo e o nódulo linfático equivalente no lado oposto foram isolados para exame do tamanho no dia 3 pós-injeção. As células foram coletadas destes nódulos e os seus números totais foram contados. A percentagem de DCs GFP+foi analisada por citometria de fluxo em células tingidas anticorpo anti-CD11c (BD Biosciences).
[00246] No dia 3, um significante aumento do nódulo linfático inguinal esquerdo próximo ao local da injeção foi observado (Figura 7a, imagem da esquerda) e o número de células neste nódulo linfático aumentou mais do que 10 vezes, comparado com o nódulo linfático equivalente no lado oposto ou nódulos linfáticos de um camundongo não experimentado (Figura 7B). Isto indica que a administração do vetor pode aumentar o trânsito e proliferação de linfócitos em um nódulo linfático próximo.
[00247] A citometria de fluxo indicou que aproximadamente 3,8% das células CD11c+totais no nódulo linfático inguinal esquerdo foram DCs GFP+(Figura 7C), que parecem ter migrado do local de injeção. Isto é considerado um efeito maior notável de uma injeção sub-cutânea do vetor e demonstra que o vírus recombinante está efetivamente infectando DCs in vivo.
EXEMPLO 9 AVALIAÇÃO DA ESPECIFICIDADE DO VÍRUS RECOMBINANTE POR TRANSDUÇÃO IN VIVO
[00248] Para examinar a especificidade in vivo do lentivetor DC direcionado, um vetor lentiviral codificando uma luciferase de vaga- lume foi construído. O cDNA da luciferase do vaga-lume foi amplificado da pGL4.2LucP (Promega) e clonado na FUGW (Lois, C. e colaboradores, 2002, supra) para substituir a GFP, produzindo o construto Fluc (SEQ ID NO: 4) (Figura 22A). O gene relator da luciferase foi então utilizado para visualizar a transdução in vivo das células do tecido usando protocolos padrões de imagem de bioluminescência (BLI).
[00249] O lentivetor recombinante (daqui em diante referido como Fluc/SVGmu) foi injetado de forma sub-cutânea no flanco esquerdo do camundongo. Em outro camundongo, o lentivetor pseudotipado com glicoproteína viral de estomatite vesicular (daqui em diante referida como Fluc/VSVG) foi injetado com um vetor de controle não específico. Os camundongos tratados com o vetor foram então visto na imagem não invasiva usando BLI. Os camundongos tratados com Fluc/VSVG tinham um sinal forte e permanente no local de injeção, indicando que tecidos não específicos foram transduzidos para expressar a luciferase (Figura 22B). Isto é consistente com o fato de que o vírus VSVG envelopado tem ampla especificidade. Pelo contrário, nenhum sinal significante foi detectado no local de injeção dos camundongos tratados com Fluc/SVGmu (Figura 22B), indicando que o lentivetor contendo SVGmu tinha uma especificidade de alvo relativamente precisa. Em nenhum momento o sinal de luminescência foi capaz de ser detectado nos camundongos direcionados, provavelmente devido à distribuição rara e esparsa das DCs, que está além da sensibilidade do método BLI atual.
[00250] Após um mês, os camundongos injetados com Fluc/SVGmu foram submetidos à análise de biodistribuição por RT-PCR quantitativa e nenhuma cópia detectável do lentivetor foi observada em todos os órgãos isolados (coração, fígado, baço, rim, gônada, pulmão, pele, nódulo linfático), verificando a falta de infecção não específica nos animais e assim a especificidade do vetor direcionado para as DCs.
EXEMPLO 10 LIBERAÇÃO DE ANTÍGENO IN VITRO PELO VÍRUS RECOMBINANTE
[00251] Para determinar se a transdução direcionada das DCs por um lentivetor recombinante poderia ser usada para efetivamente liberaçãor genes de antígenos para as DCs por estimulação de respostas de células T antígeno específicas CD8+e CD4+, um lentivetor expressando o antígeno modelo, ovalbumina de frango (OVA), foi construído. Em camundongos C57BL/6J (B6), a OVA é um antígeno alvo bem caracterizado para o receptor OT1 de célula T CD8+, o qual especificamente se liga à OVA257-269 (designada como OVAp), e o receptor OT2 da célula T CD4+, que especificamente se liga à OVA323-339 (designada como OVAp*) (Yang, L. e D. Baltimore, 2005, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 102:4518-4523, o qual é aqui incorporado neste documento por referência em sua totalidade). O lentivetor expressando a OVA (FOVA (SEQ ID NO: 2), Figura 8, topo) foi construído da FUGW (Figura 8, fundo) pela substituição da GFP com o cDNA da ovalbumina de frango.
[00252] As BMDCs (Exemplo 6) foram transduzidas no dia 6 da cultura ou com o lentivírus recombinante FOVA/SVGmu ou lentivírus recombinante de controle FUGW/SVGmu (codificando um gene relator não relevante GFP). No dia 6 as BMDCs foram infectadas por rotação com o sobrenadante viral e postas em cultura por 3 dias adicionais. No dia 9, as células não aderentes foram coletadas e postas em cultura novamente em meio RPMI contendo 10% de FBS, GM-CSF (meio condicionante 1:20 J558L), e 1 μg/ml de LPS (Sigma). No dia 10, as células foram coletadas e usadas para a estimulação das células T. As BMDCs modificadas foram designadas como DC/FOVA e DC/FUGW, dependendo do lentivetor usado para a transdução. Em paralelo, células não aderentes foram coletadas da cultura de BMDC do dia 9 não transduzidas e foram postas em cultura novamente no mesmo meio (RPMI contendo 10% de PBS, GM-CSF e LPS). No dia 10, as células foram coletadas e carregadas ou com OVAp (OVA257-269, especificamente ligadas pelos receptores da célula T OT1, daqui em diante referidas como DC/OVAp) ou OVAp* (OVA323-339, especificamente ligada pelos receptores de célula T OT2, daqui em diante referidas como DC/OVAp*) e usadas como controles positivos para a estimulação da célula T. Para examinar a habilidade das BMDCs transduzidas pelo vetor para processar e apresentar o antígeno OVA transgênico, células do baço foram coletadas de camundongos transgênicos OT1 e OT2 e postas em cultura com as BMDCs transduzidas pelo lentivetor ou BMDCs carregadas ou com OVAp ou OVAp*, na razão indicada. Três dias depois, o sobrenadante foi analisado quanto aos marcadores de ativação de superfície usando citometria de fluxo. A proliferação de célula T foi testada usando a incorporação de [3H] timidina.
[00253] Após uma co-cultura de três dias com várias razões de DC/FOVA para células T transgênicas, as células T OT1 responderam vigorosamente como medido pela liberação daIFN-y (Figura 10A) e a proliferação de células T (Figura 10B). Como esperado, nenhuma resposta OVA óbvia foi detectada usando a DC/FUGW (Figuras 10A e 10B). Foi também observado que a expressão transgênica da OVA foi ainda mais eficiente do que a carga de peptídeo para estimulação de uma resposta da célula T OT1, o que é consistente com a noção de que a MHC classe I favorece a apresentação dos peptídeos produzidos endogenamente. A citometria de fluxo mostrou que as células T OT1 ativadas exibiram o fenótipo de célula T citotóxico executor típico (CD25+CD69+CD62LbaixoCD44alto) após estimulação ou por DC/FOVA ou DC/OVAp (Figura 9).
[00254] Quando as DCs foram postas em co-cultura com células T CD4+OT2, a ativação de células T foi observada, como indicado pelas mudanças nos marcadores de superfície (Figura 11) e a produção de IFN-y (Figura 12). Todavia, a estimulação de células CD4+ não foi tão pronunciada quanto as das células CD8+, presumivelmente devido à apresentação menos eficiente de peptídeos antígenos endógenos para as moléculas MHC classe II. Pela modificação da localização celular do antígeno OVA para direcioná-lo para o caminho da apresentação da MHC classe II, um aumento da estimulação da CD4 foi alcançado que foi ainda melhor do que aquela das DCs pulsadas com peptídeo (dados não mostrados).
[00255] Estes resultados mostram que o método do direcionamento da DC através da infecção por lentivetor pode efetivamente liberação antígenos às DCs e estimular ambas as respostas da célula T CD8+e CD4+.
EXEMPLO 11 LIBERAÇÃO DE ANTÍGENO IN VIVO PELO VÍRUS RECOMBINANTE
[00256] Para determinar se as DCs direcionadas com lentivetores poderiam ativar células T antígeno específicas in vivo, um método de transferência de gene receptor de célula T (TCR) em células troncos hematopoiéticas de murino (HSCs) foi usado para gerar células T antígeno específicas e TCR projetadas em camundongos, como descrito em qualquer lugar (Yang, L. e D. Baltimore, 2005, supra). Um vetor retroviral tricistrônico MIG-OT1 co-expressando OT1 TCRα e TCRβ, junto com o marcador GFP (Figura 13A) foi construído.
[00257] Brevemente, camundongos fêmeas B6 (Charles River Breeding Laboratories) foram tratados com 250 μg de 5-fluoracila (Sigma). Cinco dias depois, células da medula óssea (BM) enriquecidas com HSCs foram coletadas da tíbia e fêmur e postas em cultura em uma placa de cultura de 24 poços (2 x 106células por poço) em meio de cultura de BM (RPMI contendo 10% de FBS, 20 ng/ml de rmIL-3, 50 ng/ml de rmIL-6 e 50 ng/ml de rmSCF (PeproTech)). Nos dias 1 e 2 da cultura, as células foram infectadas por rotação com o vetor retroviral MIG-OT1 pseudotipado com Eco (2 ml de sobrenadante viral por poço) a 2.500 rpm e 30°C por 90 min. Após cada rotação, o sobrenadante foi removido e substituído com meio de cultura de BM fresco. No dia 3, as células BM transduzidas foram coletadas e transferidas para camundongos recipientes B6 recebendo 1200 rads de irradiação corporal total. Oito semanas pós-transferência, os camundongos foram usados para o estudo de imunização in vivo. Cada camundongo recebeu uma dose de injeção sub-cutânea de 10 x 106TU do lentivetor direcionador. Sete dias após, células do baço e nódulo linfático foram coletadas e analisadas quanto à presença de células T OT1 e seus marcadores de ativação de superfície usando citometria de fluxo.
[00258] Oito semanas pós-transferência, a análise das células T periféricas dos camundongos reconstituídos mostrou que aproximadamente 5% das células T CD8+foram GFP+OT1+(Figura 13B). Alguns dos camundongos reconstituídos foram imunizados via injeção sub-cutânea da mesma dose (10 x 106TU) ou de FOVA/SVGmu (Exemplo 10) ou FUGW/SVGmu (Exemplo 2). A análise das células GFP+OT1+coletadas dos órgãos linfóides periféricos 7 dias após mostrou que a imunização da DC direcionada pela FOVA/SVGmu dobrou o número de células T OT1 quando comparado com os camundongos de controles, o quais ou não imunizados ou imunizados com FUGW/SVGmu (Figura 14B). As células T GFP+OT1+derivadas de camundongos FOVA/SVGmu imunizados exibiram um fenótipo de memória executor (CD69baixoCD62altoCD44alto), indicando que estas células passaram por uma resposta imuno produtiva (Figura 14A).
[00259] Estes resultados demonstram que um lentivetor recombinante contendo SVGmu de superfície pode direcionar DCs in vivo para eficientemente estimular células T antígeno específicas e induzir uma resposta imuno forte.
EXEMPLO 12 INDUÇÃO DAS RESPOSTAS DO CTL E ANTICORPO IN VIVO PELA ADMINISTRAÇÃO DIRETA DO VÍRUS RECOMBINANTE
[00260] Os estudos foram conduzidos quanto a eficácia do direcionamento DC in vivo para induzir uma resposta do linfócito T citotóxico CD8+antígeno específico (CTL) e resposta do anticorpo através da administração do lentivetor direcionador a camundongos do tipo original não testados.
[00261] Camundongos B6 do tipo original (Charles River Breeding Laboratories) receberam uma injeção única do lentivetor direcionador (50 x 106de FUGW/SVG ou FOVA/SVGmu) de forma sub-cutânea no flanco direito na dose indicada. No dia 7 e dia 14 pós-imunização, o sangue foi coletado dos camundongos imunizados através de sangramento do rabo e o soro IgG anti-OVA foi medido usando ELISA. No dia 14, células do baço e nódulo linfático foram coletadas e analisadas quanto a presença de células T OVA específicas e seus marcadores de ativação de superfície usando citometria de fluxo.
[00262] A presença de células T OVA específicas foi medida ao se medir a secreção de citocina e tingimento do tetrâmero. No dia 14 pós- injeção, as células T coletadas dos órgãos linfóides periféricos foram analisadas. O lentivetor direcionando para DCs nativas foi capaz de extrair células T CD8+respondendo a OVA em ambos os nódulos linfáticos (dados não mostrados) e baço (Figura 23). A administração de uma dose única de FOVA/SVGmu recombinante foi suficiente para gerar células T CD8+, que poderiam ser iniciadas a secretar IFN-y sob re-estimulação da OVAp (Figura 23). A administração do vetor de controle FUGW/SVGmu falhou em gerar quaisquer respostas OVAp específicas (Figura 23). Para adicionalmente avaliar a magnitude das respostas, as células T CD8+OVAp específicas foram medidas por tingimento de tetrâmero MHC classe I. Uma frequência elevada de células T OVAp específicas (>6%) foi obtida após a injeção em dose única (Figura 15); nenhuma célula tetrâmero positiva foi detectada nos camundongos tratados com FUGW/SVGmu (Figura 15). Os dados gerados pela quantificação do tetrâmero correlacionaram bem com a análise de células executoras CD8+testadas por tingimento IFN-y intracelular (Figura 23). A análise de fenótipo destas células T OVAp positivas mostrou que estas células mostraram as características de superfície de células T de memória executora (CD24baixoCD69baixoCD62LaltoCD44alto) (Figura 17A).
[00263] Para investigar a resposta da dose da administração do lentivetor, doses de FOVA/SVGmu variando de 100 x 106TU a 3 x 106 TU foram injetadas de forma sub-cutânea e células T OVAp específicas no baço foram medidas no dia 14 pós-injeção. Uma alta frequência excepcional (12%) de células T CD8+OVAp específicas foram detectadas na dose de 100 x 106TU (Figura 16A). A porcentagem de células OVAp específicas correlacionaram proporcionalmente com a quantidade de vetor recombinante administrado (Figura 16B). Um platô na resposta da dose não foi alcançado ao aumentar a quantidade de vetor injetado e/ou a frequência de injeção.
[00264] Além disso, os níveis de IgG no soro específicos para a OVA em camundongos foram examinados no 7oe 14° dias após imunização com FOVA/SVGmu (50 x 106TU). O título do IgG no soro foi 1:10.000 no dia 7 e 1:30.000 no dia 14 (Figura 17B). Esta é uma resposta de anticorpo bastante impressionante para uma injeção em dose única sem adjuvante adicional ou outros estímulos, indicando que a imunização com lentivetor direcionado pode também extrair significante secreção de célula B de anticorpos antígeno específicos.
[00265] Estes resultados mostram que a administração in vivo de um lentivetor direcionador a DC pode induzir ambas as respostas imunos celular e humoral contra o antígeno liberado.
EXEMPLO 13 GERAÇÃO DE IMUNIDADE ANTITUMOR: PROTEÇÃO PREVENTIVA
[00266] A imunidade antitumoral gerada após a administração in vivo do lentivetor DC direcionado foi avaliada. Um modelo de tumor E.G7 (Wang, L. e D. Baltimore, 2005, supra) foi usado no qual a OVA serve como o antígeno do tumor.
[00267] As linhagens de células de tumor EL4 (C57BL/6J, H-2b, timoma) e E.G7 (células EL4 estavelmente expressando uma cópia do cDNA da OVA de frango) foram usadas para o teste do tumor de camundongos. Para o experimento de proteção do tumor, camundongos B6 (Charles River Breeding Laboratories) receberam uma injeção única de 50 x 106TU do lentivetor direcionador (FOVA/SVGmu ou FUGW/SVGmu) no flanco direito. Duas semanas após, 5 x 106células EL4 ou E.G7 foram injetadas de forma sub-cutânea no flanco esquerdo dos camundongos. O tamanho do tumor foi medido a cada outro dia usando compassos de calibre finos e foi mostrado como o produto dos dois diâmetros perpendiculares maiores a x b (mm2). Os camundongos foram mortos quando os tumores alcançaram 400 mm2.
[00268] A vacinação com 50 x 106TU de FOVA/SVGmu protegeu completamente os camundongos do teste do tumor E.G7 (Figura 18, esquerda), enquanto os tumores cresceram rapidamente nos camundongos recebendo uma vacinação de imitação com o lentivetor sem o transgene OVA (Figura 18, esquerda). Esta proteção era OVA específica porque nos camundongos vacinados cresceram tumores EL4 de controle que não expressavam a OVA (Figura 18, direita), independente do lentivetor usado para a imunização.
EXEMPLO 14 GERAÇÃO DE IMUNIDADE ANTITUMOR: TRATAMENTO DE TUMOR
[00269] A imunidade antitumoral gerada após uma administração in vivo do lentivetor DC direcionado foi avaliada onde as células do tumor foram introduzidas antes da administração do lentivetor. As etapas da injeção do tumor e administração do lentivetor foram reversas em relação àquelas do Exemplo 3 para testar se um tumor estabelecido poderia ser eliminado, em um teste de “vacinação terapêutica”. Para este fim, células de tumor E.G7 expressando o gene luciferase do vaga- lume (E.G7.luc) foram usadas para testar os camundongos, permitindo monitoramento constante da cinética de crescimento do tumor em animais vivos usando BLI. Para facilitar a imagem, uma cepa albina de camundongos B6 (The Jackson Laboratory) foi usada. Estes camundongos não possuem pigmentação e desta forma tem baixa absorção de fundo do sinal de luminescência. A injeção destes camundongos com 100 x 106TU de FOVA/SVGmu (Exemplo 10) mostrou uma resposta similar àquela observada em camundongos B6 canônicos (Figura 21). Células de tumor E.G7.luc (5 x 106) foram implementadas de forma sub-cutânea nos camundongos B6 albinos. Os camundongos foram imunizados com FOVA/SVGmu (50 x 106TU por camundongos por tempo) duas vezes nos dias 3 e 10 pós-teste do tumor via injeção sub-cutânea. O experimento foi repetido três vezes com um experimento representativo mostrado nas Figuras 19 e 20.
[00270] Os camundongos que receberam a imunização do lentivetor DC direcionador mostraram um declínio do crescimento do tumor começando no dia 9, seguido pela regressão do tumor e uma redução de luminescência abaixo do nível de detecção no dia 11 (Figuras 19 e 20). Embora uma recorrência mínima do tumor tenha sido observada do dia 12 ao dia 16, os camundongos tratados com FOVA/SVGmu estiveram livres da doença ao final do dia 18 e depois disso; nenhuma reincidência do tumor foi observada enquanto durou o experimento (> 60 dias). Pelo contrário, os tumores cresceram progressivamente nos camundongos não recebendo tratamento e os camundongos tiveram que ser removidos do experimento após o dia 16 devido ao tamanho grande dos tumores. Foi interessante notar que a regressão do tumor foi observada começando 7 dias após a imunização com o lentivetor. O tempo de regressão do tumor se correlaciona com a cinética da resposta imuno antígeno específica induzida pela vacinação.
EXEMPLO 15 LIBERAÇÃO IN VITRO DE ANTÍGENO E FATORES DE MATURAÇÃO POR VÍRUS RECOMBINANTE
[00271] O sucesso da vacinação DC pode depender do estado de maturação das DCs (Banchereau, J. & Palucka, A.K., 2005, Nat. Rev. Immunol., 5:296-306; Schuler, G. e colaboradores, 2003, Curr. Opin. Immunol., 15:138-147; Figdor, C.G. e colaboradores, 2004, Nat. Med., 10:475-480, cada um dos quais é aqui incorporado neste documento por referência em suas totalidades). Desta forma, os genes podem ser incluídos nos vetores lentivirais que codificam as moléculas estimulatórias a disparar a maturação desejada da DC. As citocinas que podem ser usadas incluem, mas, sem limitação, GM-CSF, IL-4, TNF-a, IL-6 e semelhantes. Em algumas modalidades, o agente de maturação que é usado é o ligante CD40 (CD40L), o qual é tipicamente expresso em células T CD4 e serve como um ligante para o receptor CD40 nas DCs (Matano, T. e colaboradores, 1995, J. Gen. Virol., 76: 3165-3169; Nguyen, T.H., e colaboradores, 1998, Hum. Gene Ther., 9: 2469-2479, cada um dos quais é aqui incorporado neste documento por referência em suas totalidades). Para manipular adicionalmente as DCs de forma a serem uma vacina potente para terapia, um receptor CD40 droga induzível (iCD40) é adaptado no sistema de liberação do gene em algumas modalidades. Como descrito em qualquer lugar, o iCD40 foi projetado e consiste de um domínio citoplasmático do CD40 fundido a domínios ligação de ligante e uma sequência direcionadora de membrana (Hanks, B.A., e colaboradores, 2005, Nat. Med., 11:130-137, o qual é aqui incorporado neste documento por referência em sua totalidade). Quando o iCD40 é expresso, a maturação e ativação das DCs é regulada com uma droga permeável ao lipídeo, dimerizante.
[00272] Para examinar o efeito da inclusão de fatores de maturação de DC, o cDNA para ovalbumina (OVA, como descrito no Exemplo 10), GM-CSF, IL-4, TNFa, IL-6 e CD40L são obtidos. O iCD40 é construído como descrito em qualquer lugar (Hanks, B.A., e colaboradores, 2005, supra). Usando sequência IRES e semelhantes a 2A, vetores lentivirais multicistrônicos capazes de eficientemente transladar até quatro proteínas são construídos. Este sistema é adaptado para construir vetores lentivirais co-expressando os seguintes genes: OVA e uma molécula de fator de maturação (GM-CSF, IL-4, TNFα, IL-6, CD40L ou iCD40) (Figura 24A, rotulada como “FUOIM”). Uma sequência de vetor exemplar é proporcionada pela SEQ ID NO: 7. Lentivírus de SVGmu envelopados são preparados (como descrito no Exemplo 2) e os lentivírus são transduzidos in vitro em BMDCs de camundongos colocadas em cultura (gerado como descrito no Exemplo 6) para especificamente liberaçãor estes genes nas células. A maturação das BMDCs é medida pela análise FACS para sobrerregulação de diversas moléculas chaves que tem papéis essenciais no processo de estimulação da célula T. Marcadores representativos típicos são ICAM-1 (CD54), B7.1 (CD80), MHC classe I, MHC classe II e CD40 endógeno. As BMDCs transduzidas com lentivírus codificando apenas os genes OVA e GFP servem como controles para o experimento. É observado que a sobrerregulação dos marcadores de maturação é alcançada quando DCs iCD40 modificadas são expostas a uma quantidade efetiva da droga dimérica AP20187.
[00273] Além disso, dois aspectos característicos de DCs maduras são a redução da capacidade para a endocitose e o potencial melhorado para a ativação da célula T. A ingestão de dextrana FITC rotulada é usado para quantificar a endocitose de DCs transduzidas. As DCs maduras são também usadas para estimular as células T a expressar os receptores de célula T OT1 (TCRs) (como descrito no Exemplo 10), de forma a avaliar suas capacidades de montar uma resposta imuno. É observado que quando as DCs iCD40 modificadas são expostas a uma quantidade efetiva da droga dimérica AP20187, a ingestão de dextrana FITC rotulada é reduzida em relação àquela de DCs não iCD40 modificadas. Além disso, é observado que após a co-cultura com várias razões de DCs iCD40 modificadas (tratadas com a droga dimérica) para as células T transgênicas, as células T OT1 respondem mais vigorosamente como medido pela liberação de IFN-y e a proliferação da célula do que aquelas em co-cultura com DCs não iCD40 modificadas.
[00274] A longevidade de DCs é outro parâmetro que determina a imunidade dependente da célula T. Os efeitos de moléculas estimuladoras na sobrevivência da DC usando um teste de carência de soro in vitro serão comparados usando o método como descrito em Hanks e colaboradores, ((Hanks, B.A., e colaboradores, 2005, supra).
[00275] Se necessário, duas moléculas de fator de maturação podem ser liberadas pelo vetor lentiviral para DCs direcionadas, uma vez que a configuração do vetor tem a capacidade de expressar quatro proteínas.
EXEMPLO 16 LIBERAÇÃO IN VIVO DE ANTÍGENO E FATORES DE MATURAÇÃO POR VÍRUS RECOMBINANTE
[00276] Vírus recombinantes empacotados com o vetor lentiviral FUOIM (SEQ ID NO: 7) são preparados como descrito no Exemplo 15. Os vírus são administrados a camundongos B6 não testados para liberação do antígeno OVA e moléculas do fator de maturação a DCs e indução da imunidade a doses graduadas de vírus é avaliada como descrito no Exemplo 11.
[00277] É observado que a imunização da DC direcionada por lentivírus contendo iCD40 aumenta o número de células T que respondem à OVA quando comparado aos camundongos de controle, os quais são ou não imunizados, imunizados com um lentivírus contendo não OVA (por exemplo, FUGW/SVGmu) ou imunizados com lentivírus contendo não iDC40 (por exemplo, FOVA/SVGmu).
[00278] Além disso, a resistência dos animais ao teste do tumor é acessada com os lentivetores contendo iCD40, como descrito no Exemplo 13. Os camundongos são injetados com os seguintes lentivetores no experimento do teste do tumor: FUOIM/SVGmu, FOVA/SVGmu ou FUGW/SVGmu. As seguintes linhagens de células são usadas para o teste do tumor: EL4 (C57BL/6J, H-2b, timoma) e E.G7 (células EL4 estáveis expressando uma cópia do cDNA de OVA de frango). É observado que os camundongos recebendo imunização pelos lentivetores DC direcionadores FUOIM/SVGmu e FOVA/SVGmu são protegidas do teste do tumor. Pelo contrário, é observado que os tumores crescem rapidamente em camundongos recebendo uma vacinação de imitação com um lentivetor sem o transgene OVA (FUGW/SVGmu). Esta proteção é OVA específica porque os camundongos vacinados crescem tumores EL4 de controle que não expressam a OVA, independente do lentivetor usado para imunização.
[00279] Finalmente, o potencial deste método para erradicar um tumor estabelecido é acessado com os lentivetores contendo iCD40, como descrito no Exemplo 14. Os seguintes lentivetores são usados para a imunização no experimento: FUOIM/SVGmu e FOVA/SVGmu. As seguintes linhagens de células são usadas para o tratamento do tumor: EL4 e E.G7. É observado que os camundongos injetados com célula do tumor receberam imunização pelos lentivetores DC direcionadores (FUOIM/SVGmu e FOVA/SVGmu) mostram um declínio do crescimento. Pelo contrário do tumor, seguido pela regressão do tumor e uma redução da luminescência abaixo do nível de detecção. Ainda, nenhuma reincidência do tumor é observada durante o tempo do experimento (> 60 dias), os tumores crescem progressivamente em camundongos não recebendo tratamento.
EXEMPLO 17 APRESENTAÇÃO DE ANTÍGENO HIV/AIDS PELO VÍRUS RECOMBINANTE IN VITRO
[00280] Para tratar HIV/AIDS, DCs de “funcionalidade dupla” são geradas baseadas na estratégia da liberação do gene descrita. As DCs de “funcionalidade dupla” são eficazes em ambas extrações de anticorpos neutralizantes (Nabs) e indução de imunidade de célula T (Figura 25). Para eficientemente extrair Nabs, um gene codificando uma ligação de membrana quimérica gp120 (gp120m) é liberado às DCs. A gp120 é uma glicoproteína de envelope para HIV e é considerada ser o imunógeno mais potente (Klimstra, W.B. e colaboradores, 2003, J. Virol., 77: 12022-12032; Bernard, K.A. e colaboradores, 2000, Virology, 276: 93-103; Byrnes, A.P., e colaboradores, 1998, J. Virol., 72: 73497356, cada um dos quais é aqui incorporado neste documento por referência em suas totalidades). Como descrito em qualquer lugar, a gp120 fundida com o domínio de trans-membrana da glicoproteína de vírus da estomatite vesicular pode ser expressa na superfície da célula em uma forma trimérica, mimetizando o trímero maduro na superfície do virion HIV (Klimstra, W.B. e colaboradores, 1998, J. Virol., 72: 73577366, que é aqui incorporado neste documento por referência em sua totalidade). Esta forma de imunógeno será mostrada na superfície da DC. Em adição à expressão da superfície, as DCs podem também apresentar peptídeos epítopes derivados da gp120 em modo restrito em MHC para células T.
[00281] Visto que a infecção de HIV pode significantemente impedir a função da DC através da depleção das células T CD4, é desejável projetar DCs que funcionem independentemente das células T. A expressão do CD40L ou iCD40 pode resultar na maturação e ativação das DCs na ausência de células T CD4. Assim, CD40L ou iCD40 projetadas, como descrito no Exemplo 16, que funciona como uma molécula de maturação e estimulatória, são incorporadas no vírus DC direcionador.
[00282] O construto lentiviral para geneticamente modificar as DCs é ilustrado na Figura 24b e é rotulado como FUGmID (SEQ ID NO: 8). São obtidos cDNAs códon otimizados para gp120 da NIH AIDS Research & Reference Reagent Program. A sequência códon otimizada pode alcançar excepcionalmente altos níveis de expressão de gene fora do contexto do genoma HIV-1. O construto é preparado por fusão da gp120 com o domínio da trans-membrana da glicoprotreína do vírus da estomatite vesicular.
[00283] São conduzidos testes in vitro para acessar a eficácia das DCs gene modificadas para extrair Nabs. As células B CD19+são isoladas de baços de camundongos B6 não testados usando microcontas anti-CD19 (MiHenyi Biotech, Auburn, CA) e postas em co- cultura com DCs modificadas na presença de IL-4 e IL-6. O vetor lentiviral FUmGID é co-transfectado com SVGmu nas linhagens de células para preparar o vírus FUmGID/SVGmu, como descrito no Exemplo 2. Os vírus resultantes são transduzidos em DCs derivadas de medula óssea (BMDCs). As DCs transduzidas são irradiadas (3.000) rad e usadas como células apresentando antígeno (APCs) na co-cultura com células B. A duração do tempo da proliferação das células B em resposta a BMDCs transduzidas é medido. É observado que as células B proliferam em uma maior extensão em co-cultura com BMDCs transduzidas do que aquelas que são postas em co-cultura com BMDCs transduzidas por imitação.
[00284] Para investigar o efeito de geneticamente modificar DCs na diferenciação de células B em células secretando imunoglobulinas específicas, o método de co-cultura como previamente descrito é empregado com a exceção de que as DCs não são irradiadas. Após 14 dias, o título de vários isotipos de anticorpo HIV específico em sobrenadantes em cultura é determinado por ELISA usando gl120 recombinante (disponível da NIB: AIDS Research & Reference Reagent Program) como o antígeno. As expressões dos vários isotipos de anticorpos HIV específicos são maiores em células B em co-cultura com BMDCs transduzidas do que aquelas em co-cultura com BMDCs transduzidas em imitação.
[00285] Para acessar a eficácia das DCs modificadas geneticamente para ativar as células T in vitro, células T CD3+ foram isoladas de camundongos B6 não testados e postas em co-cultura com DCs infectadas com lentivírus e irradiadas. A duração do tempo da proliferação da célula T foi medida. A proliferação da célula T é encontrada ser maior em culturas de célula T em co-cultura com DCs transduzidas e irradiadas do que aquelas em co-cultura com DCs transduzidas em imitação.
[00286] Os resultados são esperados coletivamente demonstrar que a BMDCs transduzidas com o lentivetor FUmGID/SVGmu é efetivo em ambas a estimulação de células B para produzir anticorpos de neutralização (Nabs) e na indução da imunidade da célula T contra HIV/AIDS.
EXEMPLO 18 APRESENTAÇÃO DE ANTÍGENO HIV/AIDS PELO VÍRUS RECOMBINANTE IN VIVO
[00287] Para avaliar a ativação de células B in vivo, camundongos B6 são imunizados por injeção sub-cutânea com o lentivírus recombinante preparado como descrito no Exemplo 17. Os controles incluem camundongos injetados com lentivírus codificando antígenos apenas, lentivírus codificando moléculas de maturação apenas e camundongos não testados sem qualquer tratamento. Duas semanas após a injeção do vírus, anticorpos do soro contra HIV são medidos por ELISA. O título do anticorpo é encontrado ser maior naqueles camundongos injetados com o vírus FUmGID/SVGmu bem como naqueles injetados com lentivírus codificando antígenos apenas. Pelo contrário, o título do anticorpo é relativamente baixo naqueles camundongos imunizados com o lentivírus codificando moléculas de maturação apenas e em camundongos não testados.
[00288] Para a ativação in vivo de células T, os vírus recombinantes descritos são injetados em camundongos B6. Sete dias depois, as células T são isoladas e suas proliferações e secreção de citocinas, após re-estimulação in vitro com DCs geneticamente modificadas, é medida como descrito no Exemplo 12. A durabilidade das respostas da célula T executoras é também monitorada. O lentivetor direcionado para DCs nativas é capaz de extrair células T que respondem ao HIV em ambos o nódulo linfático e o baço. A administração de FUmGID/SVGmu recombinante é suficiente para gerar células T que secretam IFN-y. Pelo contrário, a administração de um vetor de controle de imitação (por exemplo, FUGW/SVGmu) falha em extrair uma resposta HIV específica.
EXEMPLO 19 VACINAÇÃO CONTRA HIV/AIDS IN SITU PELO VÍRUS RECOMBINANTE: PROTEÇÃO CONTRA O TESTE DE HIV
[00289] De forma a testar in situ a abordagem da vacinação DC para tratar com o HIV, um novo modelo de camundongo de patogênese HIV envolvendo quimeras humano/camundongo é desenvolvido. Como descrito em qualquer lugar, o camundongo RAG2-/-yc-/-pode ser reconstituído com um sistema imuno adaptado ao humano (Strauss, J.H. e colaboradores, 1994, Archives of Virology, 9: 473-484, que é aqui incorporado neste documento por referência em sua totalidade). O camundongo RAG2-/-yc-/-não tem células B, T e NK (Morizono, K. e colaboradores, 2001, J. Virol., 75: 8016-8020, o qual é aqui incorporado neste documento por referência em sua totalidade). A injeção de sangue do cordão humano CD34+ no fígado de camundongos de um dia de idade parcialmente irradiados leva a geração e maturação de DCs, células B e células T humanas com funcionalidade diversa com restrição MHC humana. Além disso, este modelo direciona o desenvolvimento de órgãos linfóides primários e secundários e a produção de uma resposta imuno de célula T CD8+funcional contra um teste viral. Além disso, a observação do isotipo Ig mudando de IgM para IgG indica a existência de imunidade de célula T CD4+funcional.
[00290] Para determinar a efetividade da proteção preventiva contra o HIV por imunização DC direcionada, as quimeras humano/ camundongo são administradas vírus recombinantes envelopados com SVGmu por injeção. Os vírus recombinantes codificam o antígeno gp120m (exemplo 17) em conjunto com um estimulador de maturação (por exemplo, CD40L ou iCD40 como no Exemplo 15), e eles são preparados e concentrados como descrito no Exemplo 2. Os camundongos imunizados são então inoculados com HIV de acordo com os métodos bem conhecidos na técnica, tal como, por exemplo, via rota intraperitoneal ou intravenosa. Desde que os camundongos reconstituídos mantêm células T CD4 humanas, os animais são testados com vírus relatores HIV clonados molecularmente, NFNSX-r- HSAS (CCR5-trópico), NL-r-HSAS (CXCR4-trópico) e isolados clínicos (Baenzinger e colaboradores, 2006, Proc Natl. Acad. Sci. USA, 103:15951-15956, o qual é aqui incorporado neste documento por referência em sua totalidade). O vírus relator competente para replicação também contém o antígeno estável ao calor (HSA) na região vpr. Ainda, para estabelecer uma infecção produtiva antes da inoculação, células mononucleares do sangue periférico singênico infectadas (PBMCs) são injetadas no espaço peritoneal da quimera humano/camundongo reconstituída.
[00291] A evidência da infecção de HIV é monitorada durante o tempo nos baços, nódulos linfáticos, PBMCs e sangue periférico. A FACS para HSA nos vírus relatores HIV é usada para testar quanto a integração e replicação viral HIV. A carga viral HIV é também medida do plasma usando RT-PCR. Através da avaliação da infecção de HIV por estes métodos, é observado que a vacinação DC in situ produtiva torna os camundongos imunizados mais resistentes ao teste do HIV do que aqueles que não foram imunizados.
EXEMPLO 20 VACINAÇÃO CONTRA HIV/AIDS IN SITU PELO VÍRUS RECOMBINANTE: REMOÇÃO DA INFECÇÃO DE HIV
[00292] Para testar a habilidade da abordagem da vacinação in situ de remover uma infecção de HIV, quimeras humano/camundongo são primeiro testadas com vírus relator HIV clonado molecularmente, NFNSX-r-HSAS (CCR5-trópico), como descrito no Exemplo 19. A infecção de HIV ativa é monitorada pela análise FACS da expressão HSA em células T CD4 humanas. Uma vez que a infecção de HIV é confirmada com sucesso, os vírus recombinantes projetados (Exemplo 19) são injetados em animais via injeção sub-cutânea ou por qualquer rota ótima determinada por uma pessoa versada na técnica (por exemplo, s.c., i.d., i.v. ou i.p.). A carga viral de HIV é então monitorada por RT-PCR e as contagens de CD4 periféricas são feitas. É observado que a vacinação é capaz de baixar a carga viral de HIV e remover uma infecção de HIV estabelecida em camundongos imunizados comparado com controles não vacinados.
[00293] A terapia anti-retroviral altamente ativa (HAART), utilizando uma estratégia de três drogas, tem aumentado significantemente a morbidade e mortalidade devido à AIDS. A estratégia esboçada acima pode ser adaptada para este paradigma pela transdução simultaneamente de células DC in vivo com vírus recombinantes projetados. Em conjunto com a HAART, os estudos acima são repetidos para avaliar a habilidade de prevenir ou reduzir a infecção após o teste de HIV (Exemplo 19) e para remover uma infecção de HIV ativa.
EXEMPLO 21 TRATAMENTO DE TUMOR MALÍGNO EM PESSOA HUMANA USANDO VÍRUS RECOMBINANTE
[00294] Um paciente humano é diagnosticado com um tumor maligno. Ao paciente é administrada uma quantidade apropriada de vírus recombinante contendo um gene que codifica um antígeno específico para o tumor e envelopado com uma molécula direcionadora DC-SIGN, tal como, por exemplo, SVGmu. O vírus opcionalmente contém um gene codificando um fator de maturação de DC, como descrito no Exemplo 15. O vírus é administrado por injeção intravenosa semanalmente pela duração do tratamento. Em tempos periódicos durante e após o regime de tratamento, a carga de tumor é acessada por imagem de ressonância magnética (MRI). Reduções significantes no tamanho do tumor são achadas enquanto o tratamento progride.
EXEMPLO 22 PREVENÇÃO DA FORMAÇÃO DO TUMOR EM PESSOA HUMANA USANDO VÍRUS RECOMBINANTE
[00295] Um grupo de pacientes humanos é administrado com uma quantidade apropriada de vírus recombinante contendo pelo menos um gene codificando um antígeno que é comumente e especificamente associado com as células do tumor e opcionalmente contendo um gene codificando um fator de maturação de DC, como descrito no Exemplo 15. O vírus é envelopado com uma molécula direcionadora DC-SIGN específica, tal como, por exemplo, SVGmu (Exemplo 2). Os pacientes no grupo experimental e no grupo de controle são monitorados periodicamente quanto ao crescimento do tumor. É observado que a incidência da formação do tumor maligno é diminuída em relação ao grupo de controle para pacientes a quem o vírus é administrado.
EXEMPLO 23 TRATAMENTO DE HIV/AIDS EM PESSOA HUMANA USANDO VÍRUS RECOMBINANTE
[00296] Um paciente humano é diagnosticado com HIV/AIDS. O paciente é administrado com uma quantidade apropriada de vírus recombinante contendo um gene que codifica Gp120 (Exemplo 17) e envelopado com uma molécula direcionadora específica para DC-SIGN, tal como, por exemplo, SVGmu (Exemplo 2). O vírus opcionalmente contém um gene codificando um fator de maturação de DC, como descrito no Exemplo 15. O vírus é administrado por injeção intravenosa semanalmente pela duração do tratamento. Em tempos periódicos durante e após o regime de tratamento, a carga viral de HIV é acessada pela medida dos anticorpos no sangue do paciente contra HIV usando ELISA. A contagem das células T do paciente é também avaliada. É observado que uma redução significante na carga viral de HIV é alcançada enquanto o tratamento progride. Além disso, é observado que a contagem das células T do paciente pára de diminuir, enquanto o tratamento progride.
EXEMPLO 24 PREVENÇÃO DE HIV/AIDS EM PESSOA HUMANA USANDO UM VÍRUS RECOMBINANTE
[00297] Um grupo de pacientes humanos considerados em risco para a infecção de HIV é administrado uma quantidade apropriada de vírus recombinante contendo um gene codificando GP120 (Exemplo 17) e opcionalmente contendo um gene codificando um fator de maturação de DC, como descrito no Exemplo 15. O vírus é envelopado com uma molécula direcionadora específica para DC-SIGN, tal como, por exemplo, SVGmu (Exemplo 2). Os pacientes no grupo experimental e no grupo de controle são testados a cada 6 meses para a infecção de HIV e se positivos, monitorados quanto a carga viral de HIV e contagem de células T. Se positivamente infectados pacientes dentro do grupo vacinado, é observado que a carga viral de HIV permanece baixa e a contagem de células T permanece relativamente alta para os pacientes positivamente infectados no grupo de controle.
[00298] Embora a invenção precedente tenha sido descrita em detalhes para propósitos de clareza de compreensão, será óbvio que certas modificações podem ser praticadas dentro do escopo das Reivindicações anexadas. Todas as publicações e documentos de patentes citados aqui neste documento são aqui incorporados por referência em suas totalidades para todos os propósitos na mesma extensão como se cada um fosse individualmente denotado.

Claims (7)

1. Lentivírus Deficiente Para Replicação Recombinante Pseudotipado, com uma glicoproteína de alfavírus E2 modificada, compreendendo uma modificação que reduz a ligação do referido E2 ao sulfato de heparano, caracterizado por que o lentivírus transduz de forma mais eficiente células dendríticas que expressam DC-SIGN em relação aos tipos de células que deixam de expressar DC-SIGN; em que o lentivírus compreende um polinucleotídeo que codifica um antígeno no qual o referido polinucleotídeo é exógeno ao genoma do lentivírus e em que o referido lentivírus é capaz de induzir uma resposta de anticorpo ou resposta de célula T específica do antígeno para o antígeno.
2. Lentivírus Deficiente Para Replicação Recombinante Pseudotipado, de acordo com a Reivindicação 1, caracterizado por que o lentivírus recombinante compreende uma sequência de um genoma de HIV.
3. Lentivírus Deficiente Para Replicação Recombinante Pseudotipado, de acordo com a Reivindicação 1, caracterizado por que o lentivírus recombinante compreende um LTR 3’ inativado ou auto- inativado.
4. Lentivírus Deficiente Para Replicação Recombinante Pseudotipado, de acordo com a Reivindicação 1, caracterizado por que a glicoproteína do alfavírus E2 compreende a sequência definida pela SEQ ID NO: 11.
5. Lentivírus Deficiente Para Replicação Recombinante Pseudotipado, de acordo com a Reivindicação 1, caracterizado por que o antígeno é um antígeno tumoral.
6. Lentivírus Deficiente Para Replicação Recombinante Pseudotipado, de acordo com a Reivindicação 1, caracterizado por que compreende ainda uma glicoproteína de alfavírus E1.
7. Lentivírus Deficiente Para Replicação Recombinante Pseudotipado, de acordo com a Reivindicação 1, caracterizado por que a glicoproteína do alfavírus E2 é uma glicoproteína E2 do Vírus Sindbis.
BRPI0714495A 2006-07-21 2007-07-23 lentivírus deficiente para replicação recombinante pseudotipado BRPI0714495B8 (pt)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US83249706P 2006-07-21 2006-07-21
US60/832,497 2006-07-21
US92026007P 2007-03-27 2007-03-27
US60/920,260 2007-03-27
PCT/US2007/074142 WO2008011636A2 (en) 2006-07-21 2007-07-23 Targeted gene delivery for dendritic cell vaccination

Publications (3)

Publication Number Publication Date
BRPI0714495A2 BRPI0714495A2 (pt) 2013-04-24
BRPI0714495B1 true BRPI0714495B1 (pt) 2021-05-11
BRPI0714495B8 BRPI0714495B8 (pt) 2021-05-25

Family

ID=38957694

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
BRPI0714495A BRPI0714495B8 (pt) 2006-07-21 2007-07-23 lentivírus deficiente para replicação recombinante pseudotipado

Country Status (16)

Country Link
US (9) US8329162B2 (pt)
EP (3) EP2526774A3 (pt)
JP (3) JP5539718B2 (pt)
KR (2) KR101421312B1 (pt)
AU (1) AU2007275010B2 (pt)
BR (1) BRPI0714495B8 (pt)
CA (1) CA2659529C (pt)
DK (2) DK2048955T3 (pt)
ES (2) ES2459192T3 (pt)
HK (1) HK1175365A1 (pt)
IL (1) IL196639A (pt)
PL (1) PL2048955T3 (pt)
PT (2) PT2048955E (pt)
SG (1) SG173337A1 (pt)
WO (1) WO2008011636A2 (pt)
ZA (1) ZA200900530B (pt)

Families Citing this family (65)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20070065906A1 (en) * 2003-03-05 2007-03-22 Juridical Foundation The Chemo-Sero-Therapeutic Research Institute Process for producing heterologous protein in e. coli
EP2963118B1 (en) * 2005-06-01 2017-08-09 California Institute of Technology Method of targeted gene delivery using viral vectors
KR101421312B1 (ko) * 2006-07-21 2014-07-31 캘리포니아 인스티튜트 오브 테크놀로지 수지상 세포 백신접종을 위한 표적화된 유전자의 전달
US8119772B2 (en) 2006-09-29 2012-02-21 California Institute Of Technology MART-1 T cell receptors
US20090257982A1 (en) * 2008-04-11 2009-10-15 Scheiber Lane Bernard medical device for treating diabetes mellitus, obesity, chronic fatigue, aging, and other medical conditions by utilizing modified virus virions to insert messenger ribonucleic acid molecules into cells
US20090257983A1 (en) * 2008-04-11 2009-10-15 Scheiber Lane Bernard Medical treatment device for treating aids by utilizing modified human immunodeficiency virus virions to insert anti-viral medications into t-helper cells
US20090258879A1 (en) * 2008-04-12 2009-10-15 Scheiber Lane Bernard Method for treating cancer, rheumatoid arthritis and other medical diseases by utilizing modified virus virions to insert medications into targeted cells
AU2009303690B2 (en) * 2008-09-26 2014-06-19 Tocagen Inc. Gene therapy vectors and cytosine deaminases
WO2010117786A1 (en) 2009-03-30 2010-10-14 Mount Sinai School Of Medicine Of New York University Influenza virus vaccines and uses thereof
AU2010254136B2 (en) 2009-05-26 2016-09-29 Mount Sinai School Of Medicine Monoclonal antibodies against influenza virus generated by cyclical administration and uses thereof
SI2456786T2 (sl) * 2009-07-24 2017-08-31 Immune Design Corp. Lentiviralni vektorji psevdo-tipizirani z glikoproteinom ovojnice virusa Sindbis
KR20120132506A (ko) 2010-02-18 2012-12-05 마운트 시나이 스쿨 오브 메디슨 인플루엔자 바이러스 질환의 예방 및 치료에 사용되는 백신
WO2011119628A2 (en) 2010-03-23 2011-09-29 The Regents Of The University Of California Compositions and methods for self-adjuvanting vaccines against microbes and tumors
KR20130075732A (ko) 2010-03-30 2013-07-05 마운트 시나이 스쿨 오브 메디슨 인플루엔자 바이러스 백신 및 이의 용도
EP3632463A1 (en) 2011-04-08 2020-04-08 Immune Design Corp. Immunogenic compositions and methods of using the compositions for inducing humoral and cellular immune responses
AU2012312529B2 (en) 2011-09-20 2018-01-04 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Influenza virus vaccines and uses thereof
DK2831095T3 (en) * 2012-03-30 2019-02-18 Immune Design Corp LENTIVIRAL VECTOR PARTICLES WITH IMPROVED TRANSDUCTION EFFICIENCY FOR CELL EXPRESSING DC SIGN
US9713635B2 (en) * 2012-03-30 2017-07-25 Immune Design Corp. Materials and methods for producing improved lentiviral vector particles
US8323662B1 (en) 2012-03-30 2012-12-04 Immune Design Corp. Methods useful for generating highly mannosylated pseudotyped lentiviral vector particles comprising a Vpx protein
CN102702356B (zh) * 2012-07-18 2013-12-25 上海大学 鼠源dcf1特异性多克隆抗体及其制备方法
EP2909324B1 (en) 2012-10-25 2020-02-26 Tocagen Inc. Retroviral vector with mini-promoter cassette
WO2014099931A1 (en) 2012-12-18 2014-06-26 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Influenza virus vaccines and uses thereof
CA2906587C (en) * 2013-03-13 2023-02-14 Health Research, Inc. Compositions and methods for use of recombinant t cell receptors for direct recognition of tumor antigen
WO2014159960A1 (en) 2013-03-14 2014-10-02 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Antibodies against influenza virus hemagglutinin and uses thereof
EP2981284A1 (en) * 2013-04-05 2016-02-10 Kyushu University National University Corporation Anti-tumor dna vaccine
CA2939093A1 (en) * 2014-02-14 2015-08-20 Immune Design Corp. Immunotherapy of cancer through combination of local and systemic immune stimulation
CN103933558B (zh) * 2014-05-13 2015-11-18 无锡伊琳生物技术有限公司 一种新型、广谱的治疗性肿瘤疫苗的制备和使用方法
WO2015191508A1 (en) 2014-06-09 2015-12-17 Voyager Therapeutics, Inc. Chimeric capsids
RU2716991C2 (ru) 2014-11-05 2020-03-17 Вояджер Терапьютикс, Инк. Полинуклеотиды aadc для лечения болезни паркинсона
IL292999A (en) 2014-11-14 2022-07-01 Voyager Therapeutics Inc Preparations and methods for the treatment of amyotrophic lateral sclerosis
JP6863891B2 (ja) 2014-11-14 2021-04-21 ボイジャー セラピューティクス インコーポレイテッドＶｏｙａｇｅｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ． 調節性ポリヌクレオチド
WO2016094783A1 (en) 2014-12-12 2016-06-16 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods for the production of scaav
CA2974699A1 (en) 2015-01-23 2016-07-28 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Influenza virus vaccination regimens
CN104830786A (zh) * 2015-05-05 2015-08-12 杨光华 基于her-2/neu抗原的dc细胞、靶向性免疫细胞群及其制备方法和用途
US10849985B2 (en) 2015-05-20 2020-12-01 Yeda Research And Development Co. Ltd. Method of targeting senescent cells
JP2018532386A (ja) 2015-09-09 2018-11-08 イミューン デザイン コーポレイション Ｎｙ−ｅｓｏ−１特異的ｔｃｒおよびそれらの使用方法
CN106916791B (zh) * 2015-12-25 2021-05-04 中国医学科学院医学生物学研究所 人轮状病毒毒种ztr-18毒株及其分离，培养及鉴定
CA3015220A1 (en) 2016-02-23 2017-08-31 Immune Design Corp. Multigenome retroviral vector preparations and methods and systems for producing and using same
CN109715657A (zh) 2016-04-15 2019-05-03 高山免疫科学股份有限公司 Cd80变体免疫调节蛋白及其用途
KR20230051602A (ko) 2016-04-15 2023-04-18 알파인 이뮨 사이언시즈, 인코포레이티드 Icos 리간드 변이체 면역조절 단백질 및 그의 용도
US11326182B2 (en) 2016-04-29 2022-05-10 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions for the treatment of disease
US11299751B2 (en) 2016-04-29 2022-04-12 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions for the treatment of disease
BR112018073472A2 (pt) 2016-05-18 2019-08-27 Voyager Therapeutics Inc composições e métodos de tratamento da doença de huntington
IL302748A (en) 2016-05-18 2023-07-01 Voyager Therapeutics Inc modulatory polynucleotides
BR112018075032A2 (pt) 2016-06-15 2019-03-26 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai proteínas de hemaglutinina do vírus influenza e seus uso
US11471488B2 (en) 2016-07-28 2022-10-18 Alpine Immune Sciences, Inc. CD155 variant immunomodulatory proteins and uses thereof
WO2018022945A1 (en) 2016-07-28 2018-02-01 Alpine Immune Sciences, Inc. Cd112 variant immunomodulatory proteins and uses thereof
CA3032120A1 (en) 2016-07-28 2018-02-01 Alpine Immune Sciences, Inc. Cd155 variant immunomodulatory proteins and uses thereof
CA3035522A1 (en) 2016-08-30 2018-03-08 The Regents Of The University Of California Methods for biomedical targeting and delivery and devices and systems for practicing the same
CN110352245A (zh) 2016-10-20 2019-10-18 高山免疫科学股份有限公司 可分泌变体免疫调节蛋白和工程化细胞疗法
WO2018148180A2 (en) 2017-02-07 2018-08-16 Immune Design Corp. Materials and methods for identifying and treating cancer patients
CN110809581A (zh) 2017-03-16 2020-02-18 高山免疫科学股份有限公司 Pd-l2变体免疫调节蛋白及其用途
JP2020509776A (ja) 2017-03-16 2020-04-02 アルパイン イミューン サイエンシズ インコーポレイテッド Ｐｄ−ｌ１バリアント免疫調節タンパク質及びその使用
WO2018170026A2 (en) 2017-03-16 2018-09-20 Alpine Immune Sciences, Inc. Cd80 variant immunomodulatory proteins and uses thereof
EP3606555A4 (en) 2017-04-07 2021-08-04 Icahn School of Medicine at Mount Sinai INFLUENZA VIRUS TYPE B ANTI-NEURAMINIDASE ANTIBODIES AND THEIR USES
AU2018261790A1 (en) 2017-05-05 2019-11-28 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods of treating amyotrophic lateral sclerosis (ALS)
CN111108198A (zh) 2017-05-05 2020-05-05 沃雅戈治疗公司 治疗亨廷顿病的组合物和方法
JOP20190269A1 (ar) 2017-06-15 2019-11-20 Voyager Therapeutics Inc بولي نوكليوتيدات aadc لعلاج مرض باركنسون
US20210139889A1 (en) * 2017-06-19 2021-05-13 Yale University Compositions and Methods for Multiplexed Genome Editing and Screening
US11497576B2 (en) 2017-07-17 2022-11-15 Voyager Therapeutics, Inc. Trajectory array guide system
US20200237799A1 (en) 2017-10-16 2020-07-30 Voyager Therapeutics, Inc. Treatment of amyotrophic lateral sclerosis (als)
WO2019079240A1 (en) 2017-10-16 2019-04-25 Voyager Therapeutics, Inc. TREATMENT OF AMYOTROPHIC LATERAL SCLEROSIS (ALS)
TW201925223A (zh) 2017-10-18 2019-07-01 美商艾爾潘免疫科學有限公司 變異型icos 配位體免疫調節蛋白及相關組合物及方法
US20210363219A1 (en) 2018-06-15 2021-11-25 Alpine Immune Sciences, Inc. Pd-1 variant immunomodulatory proteins and uses thereof
WO2020113141A2 (en) 2018-11-30 2020-06-04 Alpine Immune Sciences, Inc. Cd86 variant immunomodulatory proteins and uses thereof

Family Cites Families (70)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5168062A (en) * 1985-01-30 1992-12-01 University Of Iowa Research Foundation Transfer vectors and microorganisms containing human cytomegalovirus immediate-early promoter-regulatory DNA sequence
CA1283827C (en) 1986-12-18 1991-05-07 Giorgio Cirelli Appliance for injection of liquid formulations
US5057540A (en) 1987-05-29 1991-10-15 Cambridge Biotech Corporation Saponin adjuvant
US4937190A (en) 1987-10-15 1990-06-26 Wisconsin Alumni Research Foundation Translation enhancer
US4912094B1 (en) 1988-06-29 1994-02-15 Ribi Immunochem Research Inc. Modified lipopolysaccharides and process of preparation
JPH0832638B2 (ja) 1989-05-25 1996-03-29 カイロン コーポレイション サブミクロン油滴乳剤を含んで成るアジュバント製剤
US5298420A (en) * 1990-08-03 1994-03-29 Tanox Biosystems, Inc. Antibodies specific for isotype specific domains of human IgM and human IgG expressed or the B cell surface
TW279133B (pt) 1990-12-13 1996-06-21 Elan Med Tech
US5328483A (en) 1992-02-27 1994-07-12 Jacoby Richard M Intradermal injection device with medication and needle guard
JPH08504091A (ja) * 1992-09-22 1996-05-07 メディカル・リサーチ・カウンシル 外部表面に非ウィルス性ポリペプチドを提示する組換えウィルス
US6534051B1 (en) 1992-11-20 2003-03-18 University Of Medicine And Dentistry Of New Jersey Cell type specific gene transfer using retroviral vectors containing antibody-envelope fusion proteins and wild-type envelope fusion proteins
US5279552A (en) 1993-01-11 1994-01-18 Anton Magnet Intradermal injection device
US5997501A (en) 1993-11-18 1999-12-07 Elan Corporation, Plc Intradermal drug delivery device
WO1996017072A2 (en) 1994-11-30 1996-06-06 Chiron Viagene, Inc. Recombinant alphavirus vectors
US5660835A (en) 1995-02-24 1997-08-26 East Carolina University Method of treating adenosine depletion
JPH11510050A (ja) * 1995-07-25 1999-09-07 イントロヘーネ ベスローテン フェンノートシャップ 標的遺伝子送達のための方法および手段
US6013516A (en) * 1995-10-06 2000-01-11 The Salk Institute For Biological Studies Vector and method of use for nucleic acid delivery to non-dividing cells
US5910434A (en) * 1995-12-15 1999-06-08 Systemix, Inc. Method for obtaining retroviral packaging cell lines producing high transducing efficiency retroviral supernatant
US6734014B1 (en) * 1996-02-08 2004-05-11 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Methods and compositions for transforming dendritic cells and activating T cells
FR2747046B1 (fr) * 1996-04-05 1998-06-19 Univ Paris Curie Nouveaux vaccins issus de plasmovirus
US6432699B1 (en) * 1997-03-28 2002-08-13 New York University Viral vectors having chimeric envelope proteins containing the IgG-binding domain of protein A
CA2286819A1 (en) * 1997-04-17 1998-10-22 Flossie Wong-Staal Use of lentiviral vectors for antigen presentation in dendritic cells
US6531123B1 (en) * 1997-05-01 2003-03-11 Lung-Ji Chang Lentiviral vectors
US6099847A (en) * 1997-05-15 2000-08-08 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Chimeric Gag pseudovirions
ZA988446B (en) 1997-09-18 2000-03-22 Res Dev Foundation Production of vaccines using arthropod vectored viruses.
AU9399498A (en) * 1997-09-18 1999-04-05 Trustees Of The University Of Pennsylvania, The Receptor-binding pocket mutants of influenza a virus hemagglutinin for use in targeted gene delivery
US6218181B1 (en) * 1998-03-18 2001-04-17 The Salk Institute For Biological Studies Retroviral packaging cell line
US7078483B2 (en) * 1998-04-29 2006-07-18 University Of Southern California Retroviral vectors including modified envelope escort proteins
WO2000055378A1 (en) * 1999-03-16 2000-09-21 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Lentiviral vector system for high quantity screening
WO2000061772A2 (en) * 1999-04-14 2000-10-19 Chiron Corporation Compositions and methods for generating an immune response utilizing alphavirus-based vector systems
EP1046651A1 (en) * 1999-04-19 2000-10-25 Koninklijke Universiteit Nijmegen Composition and method for modulating dendritic cell-T interaction
CA2392010A1 (en) 1999-08-27 2001-03-08 Regents Of The University Of California Use of lentiviral vectors for antigen presentation in dendritic cells
WO2001016324A2 (en) 1999-08-31 2001-03-08 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods and compositions of a novel serine protease inhibitor
JP2003511420A (ja) * 1999-10-13 2003-03-25 カイロン コーポレイション タンパク質から細胞性免疫応答を得る方法
US6569143B2 (en) 1999-10-14 2003-05-27 Becton, Dickinson And Company Method of intradermally injecting substances
US6776776B2 (en) 1999-10-14 2004-08-17 Becton, Dickinson And Company Prefillable intradermal delivery device
US20020193740A1 (en) 1999-10-14 2002-12-19 Alchas Paul G. Method of intradermally injecting substances
US6494865B1 (en) 1999-10-14 2002-12-17 Becton Dickinson And Company Intradermal delivery device including a needle assembly
US7241275B2 (en) 1999-10-14 2007-07-10 Becton, Dickinson And Company Intradermal needle
US6627442B1 (en) * 2000-08-31 2003-09-30 Virxsys Corporation Methods for stable transduction of cells with hiv-derived viral vectors
EP1201750A1 (en) * 2000-10-26 2002-05-02 Genopoietic Synthetic viruses and uses thereof
EP1368058A4 (en) * 2001-03-02 2005-01-12 Merck & Co Inc VIRAL RAPPORTEUR PARTICLES
US7195916B2 (en) * 2001-09-13 2007-03-27 California Institute Of Technology Method for expression of small antiviral RNA molecules within a cell
US7737124B2 (en) * 2001-09-13 2010-06-15 California Institute Of Technology Method for expression of small antiviral RNA molecules with reduced cytotoxicity within a cell
ES2601141T3 (es) * 2001-09-13 2017-02-14 California Institute Of Technology Método para la expresión de moléculas de ARN pequeño dentro de una célula
EP1451316B1 (en) * 2001-09-13 2014-08-06 California Institute Of Technology Method for producing transgenic birds
US6971999B2 (en) 2001-11-14 2005-12-06 Medical Instill Technologies, Inc. Intradermal delivery device and method
DK1478428T3 (da) 2002-02-04 2009-09-14 Becton Dickinson Co Indretning og fremgangsmåde til aflevering eller udtagning af en substans gennem huden
US7047070B2 (en) 2002-04-02 2006-05-16 Becton, Dickinson And Company Valved intradermal delivery device and method of intradermally delivering a substance to a patient
US7115108B2 (en) 2002-04-02 2006-10-03 Becton, Dickinson And Company Method and device for intradermally delivering a substance
US6780171B2 (en) 2002-04-02 2004-08-24 Becton, Dickinson And Company Intradermal delivery device
US6863884B2 (en) * 2002-05-01 2005-03-08 Cell Genesys, Inc. Pseudotyped retroviral vectors
US7455833B2 (en) * 2002-07-15 2008-11-25 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods and compositions for treating viral infections using antibodies and immunoconjugates to aminophospholipids
WO2004016280A1 (ja) * 2002-08-16 2004-02-26 Japan Science And Technology Agency 組換えｂｃｇワクチン
US7250251B2 (en) * 2002-09-09 2007-07-31 The J. David Gladstone Institutes Virion-based fusion assay
AU2003297474A1 (en) 2002-12-18 2004-07-14 Salk Institute For Biological Studies Methods of inhibiting gene expression by rna interference
WO2004067710A2 (en) 2003-01-21 2004-08-12 Salk Institute For Biological Studies Compositions and methods for tissue specific targeting of lentivirus vectors
US7556814B2 (en) * 2003-10-23 2009-07-07 Karp Nelson M Immunogenic compositions comprising UV-irradiated, psoralen-inactivated, desialated human immunodeficiency virus (HIV) devoid of CD55 and CD59 in the viral membrane
US7108679B2 (en) 2004-03-11 2006-09-19 Becton, Dickinson And Company Intradermal syringe and needle assembly
JP2005291001A (ja) 2004-03-31 2005-10-20 Isuzu Motors Ltd ディーゼルエンジン
US20050238626A1 (en) 2004-04-01 2005-10-27 Lili Yang Antigen specific T cell therapy
WO2005113584A1 (en) * 2004-04-29 2005-12-01 Board Of Regents, University Of Texas System Methods and compositions comprising protein l immunoglobulin binding domains for cell-specific targeting
WO2005118802A2 (en) * 2004-06-03 2005-12-15 The Regents Of The University Of California Targeting pseudotyped retroviral vectors
GB0417494D0 (en) * 2004-08-05 2004-09-08 Glaxosmithkline Biolog Sa Vaccine
US7429481B2 (en) * 2004-09-14 2008-09-30 University Of Pittsburgh Targeting viruses using a modified sindbis glycoprotein
EP2963118B1 (en) 2005-06-01 2017-08-09 California Institute of Technology Method of targeted gene delivery using viral vectors
US7888465B2 (en) * 2006-06-29 2011-02-15 The Invention Science Fund, I, LLC Methods for arbitrary peptide synthesis
KR101421312B1 (ko) * 2006-07-21 2014-07-31 캘리포니아 인스티튜트 오브 테크놀로지 수지상 세포 백신접종을 위한 표적화된 유전자의 전달
FR2917303B1 (fr) * 2007-06-12 2015-04-03 Imv Technologies Element filtrant et paillette munie d'un bouchon comportant un tel element filtrant
EP2222861B1 (en) 2007-12-11 2017-12-06 The University of North Carolina At Chapel Hill Polypurine tract modified retroviral vectors

Also Published As

Publication number Publication date
EP2520168A1 (en) 2012-11-07
US20180179555A1 (en) 2018-06-28
PT2048955E (pt) 2013-09-20
WO2008011636A2 (en) 2008-01-24
JP2009544328A (ja) 2009-12-17
KR20140035537A (ko) 2014-03-21
US8906359B2 (en) 2014-12-09
DK2048955T3 (da) 2013-09-02
ES2459192T3 (es) 2014-05-08
US20100120122A1 (en) 2010-05-13
US8329162B2 (en) 2012-12-11
EP2048955B1 (en) 2013-08-21
US20130230554A1 (en) 2013-09-05
EP2520168B1 (en) 2014-03-19
SG173337A1 (en) 2011-08-29
EP2048955A2 (en) 2009-04-22
US20190316153A1 (en) 2019-10-17
KR20090038914A (ko) 2009-04-21
ES2428067T3 (es) 2013-11-05
IL196639A (en) 2015-03-31
JP2015226548A (ja) 2015-12-17
US20100120140A1 (en) 2010-05-13
JP2014158497A (ja) 2014-09-04
US9303072B2 (en) 2016-04-05
US8273345B2 (en) 2012-09-25
ZA200900530B (en) 2009-12-30
US20080019998A1 (en) 2008-01-24
US8715640B2 (en) 2014-05-06
PT2520168E (pt) 2014-04-29
BRPI0714495A2 (pt) 2013-04-24
US8372390B2 (en) 2013-02-12
US10266847B2 (en) 2019-04-23
DK2520168T3 (da) 2014-04-14
PL2048955T3 (pl) 2013-11-29
KR101421312B1 (ko) 2014-07-31
HK1175365A1 (en) 2013-07-05
WO2008011636A3 (en) 2008-05-08
US9840721B2 (en) 2017-12-12
CA2659529C (en) 2016-11-01
BRPI0714495B8 (pt) 2021-05-25
US10696984B2 (en) 2020-06-30
AU2007275010B2 (en) 2013-06-20
JP5833701B2 (ja) 2015-12-16
AU2007275010A1 (en) 2008-01-24
JP5539718B2 (ja) 2014-07-02
EP2526774A2 (en) 2012-11-28
US20160340692A1 (en) 2016-11-24
CA2659529A1 (en) 2008-01-24
IL196639A0 (en) 2009-11-18
EP2048955A4 (en) 2009-11-25
EP2526774A3 (en) 2013-03-06
JP6283005B2 (ja) 2018-02-21
US20150175667A1 (en) 2015-06-25
US20120070462A1 (en) 2012-03-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US10696984B2 (en) Packaging cell for making a pseudotyped lentivirus
JP6170952B2 (ja) シンドビスウイルスエンベロープ糖タンパク質により偽型化したレンチウイルスベクター
US10584356B2 (en) Multigenome retroviral vector preparations and methods and systems for producing and using same
CN101516199B (zh) 用于树突状细胞免疫的靶向基因输送
AU2013224658A1 (en) Targeted gene delivery for dendritic cell vaccination

Legal Events

Date Code Title Description
B07D Technical examination (opinion) related to article 229 of industrial property law [chapter 7.4 patent gazette]
B07E Notification of approval relating to section 229 industrial property law [chapter 7.5 patent gazette]
B06U Preliminary requirement: requests with searches performed by other patent offices: procedure suspended [chapter 6.21 patent gazette]
B09A Decision: intention to grant [chapter 9.1 patent gazette]
B16A Patent or certificate of addition of invention granted [chapter 16.1 patent gazette]

Free format text: PRAZO DE VALIDADE: 20 (VINTE) ANOS CONTADOS A PARTIR DE 23/07/2007, OBSERVADAS AS CONDICOES LEGAIS. PATENTE CONCEDIDA CONFORME MEDIDA CAUTELAR DE 07/04/2021 - ADI 5.529/DF

B16C Correction of notification of the grant [chapter 16.3 patent gazette]

Free format text: PRAZO DE VALIDADE: 20 (VINTE) ANOS CONTADOS A PARTIR DE 23/07/2007 OBSERVADAS AS CONDICOES LEGAIS. PATENTE CONCEDIDA CONFORME ADI 5.529/DF

B21F Lapse acc. art. 78, item iv - on non-payment of the annual fees in time

Free format text: REFERENTE A 17A ANUIDADE.