KR20210106124A

KR20210106124A - 고효율 발현 벡터 및 이의 용도

Info

Publication number: KR20210106124A
Application number: KR1020200020879A
Authority: KR
Inventors: 이상진; 신승필; 정유석
Original assignee: 국립암센터
Priority date: 2020-02-20
Filing date: 2020-02-20
Publication date: 2021-08-30
Also published as: KR102346159B1

Abstract

본 발명은 고효율 발현 벡터 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 작동 가능하게 연결된 CMV 인핸서; EF1α 프로모터/HTLV 프로모터; 및 CMV 프로모터를 포함하는 발현 벡터, 상기 발현 벡터로 형질전환된 세포 및 이를 이용한 목적 단백질 대량 생산 방법에 관한 것이다.
본 발명의 목적 단백질 또는 유전자 발현이 증가한 고효율의 발현 벡터는 CMV 발현 벡터 시스템, CMV-CMV 발현 벡터 시스템을 포함하는 기존 발현 벡터 시스템에 비해 유전자 발현 효율이 높은 것을 확인하였으므로, 고효율 항체 생산 또는 단백질 생산에 적용할 수 있으며, 나아가 치료용 유전자를 탑재한 항암 바이러스 또는 특정 질병 예방 또는 치료용 유전자 치료제 개발에 유용하게 활용할 수 있다.

Description

고효율 발현 벡터 및 이의 용도{High Efficiency Expression Vector and Uses thereof}

본 발명은 고효율 발현 벡터 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 작동 가능하게 연결된 CMV 인핸서; EF1α 프로모터/HTLV 프로모터; 및 CMV 프로모터를 포함하는 발현 벡터, 상기 발현벡터로 형질전환된 세포 및 이를 이용한 목적 단백질 대량 생산 방법에 관한 것이다.

유전자 재조합 기술을 이용하여 다양한 인간 유래 단백질들이 발현되고 있으나, 진핵세포 특유의 당화, 인산화 등과 같은 일련의 과정으로 인하여 포유동물세포를 이용할 경우에만 정상적으로 생물학적 활성을 갖는 단백질이 합성되는 경우가 많다. 유전자 재조합 단백질을 생산하기 위하여 주로 포유동물세포를 이용하며, 포유동물 세포에서 보다 강력하고 안정된 유전자 발현을 유도할 수 있는 재조합 발현 벡터를 제조하기 위해 사용되고 있는 여러 가지 전략들 중에서 대표적인 방법은 강력한 프로모터를 선별하여 유전자 발현률을 증대시키는 방법이다.

프로모터는 여러가지 전사 인자(transcription factor)의 결합 위치와 TATA box가 존재하여, RNA 중합효소가 결합하여 mRNA 합성이 시작되는 DNA 상의 요소로서 프로모터의 성능에 따라 유전자 발현량이 크게 좌우된다.

재조합 단백질 생산 효율을 증가 시키기 위해, 종래는, EF1α(elongation factor 1) 프로모터나 SRα 프로모터 등이, 발현 벡터에 사용되어 왔으며, 최근에는 발현 벡터가 개량되어, CAG 프로모터(인간 CMV 인핸서(human CMV enhancer)에 닭의 β 액틴 프로모터를 조합한 것)나, CEF 프로모터(인간 CMV 인핸서에 인간 EF1α 프로모터) 등의 프로모터 등이 개발되었다.

최근, CMV 프로모터- 목적 유전자 - CMV 프로모터(또는 CMV 인핸서) 구조로 이루어진 발현 벡터가 가장 높은 발현을 유도한다는 연구가 이루어졌으나, 이러한 시스템은 세포내에서 봉입체 (inclusion body) 또는 응집(aggregation)을 만들기 때문에 기능을 가진 단백질을 만들기에 적합하지 못하는 단점이 있으므로, 기능을 유지하는 (soluble) 단백질을 효율적으로 생산할 수 있는 발현 벡터의 개발이 요구되고 있다.

한편, 유전자 치료란 유전자 재조합 기술을 이용하여 치료 유전자를 환자의 세포 안에 이입시켜 대상세포의 유전적 변형을 통하여 암, 감염성 질환, 자가면역질환과 같은 유전적 질환을 치료하거나 예방하는 방법을 말한다. 유전자 치료제 개발의 필수적인 요건은 치료 유전자의 개발, 치료 유전자의 효과적인 발현과 치료 유전자를 전달하는 벡터의 선정 및 조작에 있다.

세포 또는 조직 특이적으로 치료유전자를 도입하고 기능을 가진 단백질을 고효율로 발현시킬 수 있는 벡터 시스템의 개발은 효과적으로 경제적인 유전자 치료 요법을 위해 매우 필요한 연구 분야이며, 특히 암세포를 타겟으로 하여 인체의 여러 곳으로 전이된 암을 치료하거나 암의 전이를 억제할 수 치료제 개발에 응용할 수 있다.

이에, 본 발명에서는 재조합 단백질 생산뿐만 아니라, 지속적인 유전자 발현이 가능한 고효율 발현 벡터 시스템을 개발하기 위해 예의 노력한 결과, CMV 인핸서; EF1 α 프로모터/HTLV 프로모터; 목적 유전자; 및 CMV 프로모터로 구성된 발현 벡터 시스템을 개발하였으며 이를 CMVHYBRID 벡터로 명명하였다. 또한, 본 발명의 발현 벡터가 기존 CMV 시스템, CMV-CMV 시스템에 비해 유전자 발현 효율이 현저하게 증가한 것을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 재조합 단백질 또는 유전자 발현이 증가한 고효율의 발현 벡터를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 발현 벡터를 포함하는 세포 및 이를 이용한 재조합 단백질 생산 방법을 제공하는 데 있다.

상술한 목적을 달성하기 위해,

본 발명은 작동 가능하게 연결된 CMV 인핸서; EF1α 프로모터/HTLV 프로모터; 및 CMV 프로모터를 포함하는 발현 벡터를 제공한다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 있어서, 상기 EF1α 프로모터/HTLV 프로모터와 CMV 프로모터 사이에 목적 유전자가 작동 가능하게 연결되도록 삽입될 수 있다.

본 발명의 바람직한 또 다른 일실예에서, 상기 CMV 프로모터의 3' 말단 부분에 polyA를 포함하는 전사 종결인자가 추가로 포함될 수 있다.

본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 있어서, 상기 CMV 인핸서는 서열번호 1의 염기서열로, 상기 EF1α 프로모터/HTLV 프로모터는 서열번호 2의 염기서열로, 상기 CMV 프로모터는 서열번호 3의 염기서열을 포함할 수 있다.

본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 있어서, 상기 발현 벡터는 도 1의 개열지도를 가질수 있으며, 서열번호 4의 염기서열로 표시될 수 있다.

다른 목적을 달성하기 위해,

본 발명은 상기 발현 벡터로 형질전환 된 재조합 세포를 제공한다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 있어서, 상기 세포는 동물세포 또는 줄기세포일 수 있다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 있어서, 상기 동물세포는 NTERA-2 세포, CHO-K1 세포, CHO-DG44 세포, CHO-S 세포, CHO DUK-BII 세포, COS7 세포, COS3 세포, COS1 세포, NSO 세포, HeLa 세포, Vero 세포, PER-C6 세포, HepG2 세포 및 BHK 세포로 구성된 군에서 선택될 수 있다.

본 발명은 또한, 상기 발현 벡터로 형질전환 된 재조합 세포를 유효성분으로 포함하는 유전자 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 있어서, 상기 발현 벡터는 목적 유전자로 발암 억제 유전자, 암조직 분해 유전자 또는 면역세포 활성화 유전자를 포함하며,

상기 재조합 세포는 발암 억제 유전자, 암조직 분해 유전자 또는 면역세포 활성화 유전자가 발현될 수 있다.

본 발명은 또한, 상기 발현 벡터로 형질전환 된 세포를 배양하여 목적 단백질을 생산한 다음, 생산된 단백질을 수득하는 단계를 포함하는 재조합 단백질의 생산방법을 제공한다.

본 발명의 목적 단백질 또는 유전자 발현이 증가한 고효율의 발현 벡터는 CMV 발현 벡터 시스템, CMV-CMV 발현 벡터 시스템을 포함하는 기존 발현 벡터 시스템에 비해 유전자 발현 효율이 높은 것을 확인하였으므로, 고효율 항체 생산 또는 단백질 생산에 적용할 수 있으며, 나아가 치료용 유전자를 탑재한 항암 바이러스 또는 특정 질병 예방 또는 치료용 유전자 치료제 개발에 유용하게 활용할 수 있다.

도 1은 본 발명의 발현 벡터(pCMVHYBRID)를 나타낸 개열지도이다.
도 2는 본 발명의 발현 벡터의 유전자 발현 효율을 측정하기 위해 제조한 다양한 CMV 기반 발현 벡터의 구조를 나타낸 모식도이다.
도 3은 본 발명의 발현 벡터와 다양한 CMV 기반 발현 벡터의 유전자 발현 효율을 비교한 데이터이다.
도 4는 본 발명의 발현 벡터)의 유전자 발현 효율을 측정하기 위해 제조한 다양한 EF1α기반 발현 벡터의 구조를 나타낸 모식도이다.
도 5는 본 발명의 발현 벡터와 다양한 EF1α기반 발현 벡터의 유전자 발현 효율을 비교한 데이터이다.

이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.

본 발명은 일관점에서, 작동 가능하게 연결된 CMV 인핸서; EF1α 프로모터/HTLV 프로모터; 및 CMV 프로모터를 포함하는 발현 벡터에 관한 것이다.

본 발명에서, "발현 벡터(expression vector)"는 적당한 숙주세포 내에서 목적 유전자가 발현할 수 있도록 프로모터 등의 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 제조물이다. 벡터는 플라스미드, 파지 입자 또는 간단하게 잠재적 게놈 삽입물일 수 있다. 적당한 숙주로 형질전환되면, 벡터는 숙주 게놈과 무관하게 복제하고 기능할 수 있거나, 또는 일부 경우에 게놈 그 자체에 통합될 수 있다.

본 발명에서 "프로모터 (promoter)" 및 "인핸서 (enhancer)"는 코딩 서열의 RNA로의 전사과정을 유도하는 부위로서, 통상적으로 프로모터는 중합효소와 전사인자들이 결합하는 부위를, 인핸서는 중합효소의 활성요소들이 결합하는 부위를 일컫는다.

또한, 상기 프로모터는 외래 유전자인 목적 유전자의 발현을 유도하도록 작동 가능하게 연결되어 있으며 여기서, "작동 가능하게 연결된(operably linked)"은 일반적 기능을 수행하도록 핵산 발현조절 서열과 목적하는 단백질을 코딩하는 핵산 서열이 기능적으로 연결되어 있는 것을 말한다. 재조합 벡터와의 작동적 연결은 당해 기술분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당해 기술분야에서 일반적으로 알려진 효소 등을 사용한다. 본 발명에서는 CMV 프로모터 CMV 인핸서, EF1α 프로모터/HTLV 프로모터를 사용하였으며, 이들의 변이체 또한 본 발명에 포함될 수 있다. 여기서의 변이체는, 유전자 발현 증가를 위해, 프로모터 서열의 일부를 부가, 결실, 또는 치환한 변이체를 의미한다.

본 발명에 있어서, 목적 유전자는 상기 EF1α 프로모터/HTLV 프로모터와 CMV 프로모터 사이에 작동 가능하게 연결되도록 삽입될 수 있다.

상기 목적 유전자는 발현하고자 하는 외래 산물을 코딩하는 유전자로서, 재조합 단백질로 발현 가능한 모든 종류의 단백질을 암호화하는 유전자일 수 있다. 이러한 목적 유전자는 상기 벡터에 삽입할 수 있도록 제한 효소 절단 부위가 도입되어 있는 핵산 서열인 "다중 클로닝 부위(multiple cloning site, MCS)"를 포함한다.

상기 목적 유전자는 암 또는 특정 질병 예방 또는 치료를 위한 유전자 일 수 있으며, 대량 생산을 필요로 하는 단백질 또는 항체를 코딩하는 유전자 일 수 있다.

상기 목적 유전자는 사이토카인(인터루킨, 종양괴사인자, 인터페론, 콜로니자극인자, 케모카인 등)를 코딩하는 염기서열, 발암 억제 유전자, 암조직 분해 유전자 또는 면역세포 활성화 유전자일 수 있다.

또한, 상기 목적 유전자는 인슐린, 에리트로포이에틴, α-페토프로테인, α-글루코시다제, α1-안티트립신, 안티트롬빈, 리포프로테인, 세룰로플라즈민, 피브리노겐, 글루코세레브로시다제, 합토글로빈, 플라즈미노겐, 프로트롬빈 및 트랜스페린으로 이루어진 군에서 선택된 단백질을 코딩하는 염기서열일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 발현 벡터는 종래 알려진 임의의 전사 종결인자가 포함될 수 있으며, 바람직하게는, polyA가 연결된 것으로서, 상기 CMV 프로모터의 3' 말단 부분에 poly A가 포함될 수 있다.

상기 CMV 인핸서는 바람직하게 서열번호 1의 염기서열을 포함할 수 있으며, 필요에 따라 상기 서열번호 1의 염기서열과 90% 이상, 93% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상 동일한 서열을 포함할 수 있다.

상기 EF1α 프로모터/HTLV 프로모터(EF1α/HTLV)는 바람직하게 EF1α 프로모터의 변이체/HTLV 프로모터의 변이체가 결합된 것으로, 상기 EF1α 프로모터의 변이체는 EF1α 프로모터의 일부분, HTLV 프로모터의 변이체는 HTLV 프로모터의 일부분에 해당한다. 바람직하게 EF1α 프로모터 변이체/HTLV 프로모터 변이체는 서열번호 2의 염기서열을 포함할 수 있으며, 필요에 따라 상기 서열과 90% 이상, 93% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상 동일한 서열을 포함할 수 있다.

또한, 상기 CMV 프로모터는 바람직하게 서열번호 3의 염기서열을 포함할 수 있으며, 필요에 따라 상기 서열번호 3의 염기서열과 90% 이상, 93% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상 동일한 서열을 포함할 수 있다.

종래의 기술에서, CMV 프로모터- 목적 유전자 - CMV 프로모터(또는 CMV 인핸서) 구조로 이루어진 발현 벡터가 가장 높은 발현을 유도한다는 연구가 이루어졌으나, 이러한 시스템은 봉입체(inclusionbody) 또는 응집(aggregation)을 만들기 때문에 세포내에서 기능을 가진 단백질을 만들기에 적합하지 못하는 단점이 있다.

본 발명에서는 목적 단백질 또는 유전자 발현이 증가한 고효율의 발현 벡터를 제조하기 위해, 도 1의 개열지도 같이 CMV 인핸서, EF1 α 프로모터 일부분/HTLV 프로모터 일부분를 이용하여 목적 단백질 또는 유전자 발현이 증가한 고효율의 발현 벡터 시스템을 개발하였으며 이를 pCMVHYBRID 벡터(서열번호 4)로 명명하였다.

본 발명의 구체적인 일구현예에서, pCMVHYBRID 발현 벡터의 발현 효율을 확인하기 위해, 도 2와 같이 기존 CMV 시스템을 이용한 발현 벡터를 제조하여 목적 단백질(GFP)의 발현 정도를 확인하였다. 그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이, CMV 발현 벡터 시스템(C.G; GFP 발현율 12%), CMV-CMV 발현 벡터 시스템(C.G.C; GFP 발현율 7%) 및 CMV-CMV 인핸서 발현 벡터 시스템(C.G.E_CMV; GFP 발현율 7%)에 비해 본 발명의 발현 벡터 시스템(pCMVHYBRID; GFP 발현율 31%)의 발현율이 현저하게 증가한 것을 확인하였다.

또한, EF1 α 프로모터 기반 발현 벡터 시스템과의 비교를 위해, 도 4와 같은 EF1 α 프로모터 기반 발현 벡터를 제조하여 목적 단백질(GFP)의 발현 정도를 확인하였다. 그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이 과발현 벡터로 개량되어 보고된 EF1 α 프로모터/HTLV 프로모터를 포함하는 발현 벡터(EF1α/HTLV.G; GFP 발현율 24.8%), CMV 인핸서/EF1 α 프로모터를 포함하는 발현 벡터(E_CMV/EF1α.G; GFP 발현율 27.9%)와 비교하여 본 발명의 발현 벡터 시스템(pCMVHYBRID; GFP 발현율 24.2%)의 발현율이 유사한 것을 확인하였다.

특히 E_CMV/EF1α.G 발현 벡터의 전사조절체 크기는 1486bp인 반면, pCMVHYBRID 발현 벡터의 전사조절체 크기는 870 bp로, 전사조절체의 크기가 줄였음에도 불구하고 본 발명의 발현 벡터는 EF1 α 프로모터 기반 발현 벡터와 유사한 발현율을 보이는 것을 확인하였다.

따라서, 본 발명의 고효율 발현 벡터는 기존 발현 벡터에 비해 목적 유전자의 발현 효율이 높고 EF1α 혹은 CMV 프로모터 계열의 발현 특이성을 모두 수용하는 것을 확인하였으므로, 다양한 세포에서 고효율 항체 생산 또는 단백질 생산에 적용할 수 있으며, 나아가 치료용 유전자를 탑재한 항암 바이러스 또는 특정 질병 예방 또는 치료용 유전자 치료제 개발에 유용하게 활용할 수 있다.

본 발명은 다른 관점에서, 상기 재조합 발현 벡터로 형질전환된 재조합 세포에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 세포는 일반적으로 알려진 동물세포 또는 줄기세포일 수 있으며, 동물세포의 경우, NTERA-2 세포, CHO-K1 세포, CHO-DG44 세포, CHO-S 세포, CHO DUK-BII 세포, COS7 세포, COS3 세포, COS1 세포, NSO 세포, HeLa 세포, Vero 세포, PER-C6 세포, HepG2 세포 및 BHK 세포로 이루어진 군에서 선택되는 세포일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 발현 벡터로 형질전환된 재조합 세포를 유효성분으로 포함하는 유전자 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.

상기 발현 벡터는 목적 유전자로 발암 억제 유전자, 암조직 분해 유전자 또는 면역세포 활성화 유전자를 포함할 수 있으며, 이런 발현 벡터로 형질전환된 재조합 세포는 암의 유전자 치료용 약학적 조성물로 사용될 수 있다.

본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 발현 벡터로 형질전환된 세포를 배양하여 목적 단백질을 생산한 다음, 생산된 단백질을 수득하는 단계를 포함하는 목적 단백질의 생산방법에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 방법은 예를 들어 (a) 상기 발현 벡터의 EF1α 프로모터 일부분/HTLV 프로모터 일부분과 CMV 프로모터 사이에 작동 가능하게 연결되도록 목적 유전자를 삽입하는 단계; (b) 상기 목적 유전자가 삽입된 발현 벡터로 세포를 형질 전환시키는 단계; 및 (c) 상기 형질전환된 세포를 배양하여 목적 단백질을 발현시켜 회수하는 단계를 포함할 수 있다.

본 발명의 방법에서, 목적 유전자를 삽입하고, 세포를 형질전환하고, 이를 배양하여 목적 단백질을 발현시켜 회수하는 방법 등은 당해 기술분야에서 잘 알려진 기술을 이용하여 수행할 수 있다.

본 발명은 또 다른 관점에서, 작동 가능하게 연결된 CMV 인핸서; EF1α 프로모터/HTLV 프로모터; 목적 유전자; 및 CMV 프로모터를 포함하는 재조합 바이러스에 관한 것이다.

상기 재조합 바이러스는 당업계에 공지된 재조합 바이러스 제조방법을 사용하여 제조할 수 있으며, 바람직하게는 상술한 본 발명의 발현 벡터를 이용한 공감염(cotransfection) 방법으로 제조될 수 있다.

구체적으로 목적 유전자가 작동 가능하게 연결된 발현 벡터를 바이러스의 게놈을 포함하는 보조 벡터를 동물세포에 당업계에 공지된 방법으로 공감염시키면, 공감염된 세포에서 생체내 재조합(in vivo recombination)에 의해 CMV 인핸서; 상기 프로모터에 작동 가능하게 연결된 EF1α 프로모터 및 HTLV 프로모터 일부분; 목적 유전자; 및 CMV 프로모터를 포함하는 재조합 바이러스가 형성된다.

상기 "재조합 바이러스"는 게놈이 염기의 결실 및/또는 삽입 및/또는 치환에 의해 변형된 바이러스를 말한다. 따라서, 재조합 바이러스는 좀 더 구체적으로 말하면, 일반적으로 감염성이고 재조합 아데노바이러스 게놈을 포함하는 바이러스 입자이다. 게놈에 가해진 변형에 따라, 재조합 바이러스는 정상세포에서는 복제 결손형일 수도 있으며, 즉 정상세포에서의 자가복제 및/또는 증식 불능이다. 재조합 바이러스는 레트로바이러스(retrovirus), 아데노바이러스(adenovirus), 렌티바이러스(lentivirus), 파르보바이러스(parvovirus) 또는 헤르페스 바이러스(herpes simplex virus)로 이루어진 군에서 선택될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명은 또한, 상기 재조합 바이러스를 포함하는 암의 유전자 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 재조합 바이러스는 치료 적용에 사용될 수 있다. 이러한 목적을 위해서, 목적 유전자로 암 또는 특정 질병 예방 또는 치료를 위한 치료 유전자 및/또는 항원 펩타이드를 암호화하는 하나 이상의 유전자를 포함할 수 있다.

치료 유전자는 표적 세포 내에서 유전자의 발현 또는 세포 내에서 mRNA의 전사를 조절할 수 있게 하는 유전자 또는 안티센스 서열일 수 있다. 이러한 성질의 서열은 예를 들면, 표적 세포에서 세포 mRNA에 상보적인 RNA로 전사될 수 있고 이에 따라 mRNA의 단백질로의 번역을 차단할 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

기본 발현 벡터 제작

발현 벡터의 기본 구조는 pZAP1.1(OD260 Inc, cat.No ZP-01)으로, bGH poly A(서열번호 5)를 SpeI과 HpaI의 제한효소를 이용하여 결합시켜 pZAP1.1.pA 벡터를 완성하였다.

이후 리포터 유전자인 eGFP(서열번호 6)는 pMSCV-GFP벡터(addgene, cat.No. 86537)를 주형으로 하기 eGFP 증폭용 프라이머 세트를 이용하여 증폭시킨 다음, SalI과 EcoRI으로 절단한 pZAP1.1.pA 벡터와 인퓨전 클로닝 라이게이션(in-fusion cloning ligation)하여 발현 벡터의 기본 구조인 pZAP1.1.eGFP.pA(서열번호 7)를 제작하였다.

eGFP 증폭용 프라이머 세트

정방향 프라이머 : 5'-AGC GGC CGC TGT CGA CGC CAC CAT GGT GAG CAA GG-3' (서열번호 8)

역방향 프라이머 : 5'-TAG TGA TAT CGA ATT CCT ACT TGT ACA GCT CGT CCA TGC C-3' (서열번호 9)

CMV 기반 발현 벡터 및 pCMVHYBRID 발현 벡터 제작

2-1 : CMV - GFP 발현 벡터 ( C.G 발현 벡터)

CMV-GFP 발현 벡터(서열번호 10)는 상기 실시예 1-1에서 제작한 pZAP1.1.eGFP.pA 벡터를 BglII로 절단한 후 pCMV-3Tag-3a 벡터(Agilent Technologies, Inc., cat.No. 240197)의 CMV 프로모터(인핸서+프로모터)(서열번호 11)를 하기 CMV 프로모터 증폭용 프라이머 세트를 이용하여 증폭시킨 다음, 증폭된 유전자를 BglII 절단 부위에 라이게이션시켜 제작하였다.

CMV 프로모터(인핸서+프로모터) 증폭용 프라이머 세트(5' 방향, BglII 절단)

정방향 프라이머 : 5'-TTG TCT AGG GTG ATC TAG TTA TTA ATA GTA ATC AAT TAC G-3' (서열번호 12)

역방향 프라이머 : 5'-CGG GTC TAG AAG ATC TAG CTC TGC TTA TAT AGA CC-3' (서열번호 13)

2-2 : CMV - GFP - CMV 발현 벡터 ( C.G.C 발현 벡터)

CMV-GFP-CMV 발현 벡터(서열번호 14)는 상기 CMV-GFP 발현 벡터를 KpnI으로 절단한 후 pCMV-3Tag-3a 벡터의 CMV 프로모터(인핸서+프로모터)(서열번호 11)를 하기기 CMV 프로모터 증폭용 프라이머 세트를 이용하여 증폭시킨 다음, 증폭된 유전자를 KpnI 절단 부위에 라이게이션시켜제작하였다.

CMV 프로모터(인핸서+프로모터) 증폭용 프라이머 세트(3' 방향, KpnI 절단)

정방향 프라이머 : 5'-AGA ACC AGG TTA ACG GGT ACC TAG TTA TTA ATA GTA ATC AAT TAC G-3' (서열번호 15)

역방향 프라이머 : 5'-CTG GCC ACC TCG TGG AGC TCT GCT TAT ATA GAC C-3' (서열번호 16)

2-3 : CMV - GFP - CMV인핸서 발현 벡터 ( C.G .eC 발현 벡터)

CMV-GFP-CMV인핸서 발현 벡터(서열번호 17)는 상기 CMV-GFP 발현 벡터를 HpaI과 KpnI으로 절단한 후 pCMV-3Tag-3a 벡터의 CMV 프로모터(인핸서)(서열번호 18)를 하기 CMV 프로모터(인핸서) 증폭용 프라이머 세트를 이용하여 증폭시킨 다음, 증폭된 유전자를 HpaI과 KpnI 절단 부위에 라이게이션시켜 제작하였다.

CMV 프로모터(인핸서)를 증폭용 프라이머 세트

정방향 프라이머 : 5'-GGA AAG AAC CAG GTT AAC TAG TTA TTA ATA GTA ATC AAT TAC G-3' (서열번호 19)

역방향 프라이머 : 5'-CTG GCC ACC TCG TGG GTA CCA TGG TAA TAG CGA TGA CT-3' (서열번호 20)

2-4 : pCMVHYBRID 발현 벡터

본 발명의 pCMVHYBRID 발현 벡터의 제작을 위해, 먼저 상기 CMV-GFP 발현 벡터를 HpaI과 KpnI으로 절단한 후 pCMV-3Tag-3a 벡터의 CMV 프로모터(프로모터)(서열번호 3)를 하기 CMV 프로모터 증폭용 프라이머 세트를 이용하여 증폭시킨 다음, 증폭된 유전자를 HpaI과 KpnI 절단 부위에 라이게이션시켜 CMV-GFP-CMV 프로모터 발현 벡터를 제작하였다.

CMV 프로모터(프로모터) 증폭용 프라이머 세트(3' 방향)

정방향 프라이머 : 5'-GGA AAG AAC CAG GTT AAC GGT GAT GCG GTT TTG GCA G-3' (서열번호 21)

역방향 프라이머 : 5'-CTG GCC ACC TCG TGG GTA CCG CTT ATA TAG ACC TCC CAC CG-3' (서열번호 22)

그 다음, pFUSE-mIgG2A-Fc1 벡터(InvivoGen, Cat.No. pfuse-mg2afc1)의 partial EF1α/partial HTLV 프로모터(서열번호 2)를 하기 EF1α/HTLV 증폭용 프라이머 세트를 이용하여 증폭시켰다.

partial EF1α/partial HTLV 프로모터 증폭용 프라이머 세트

정방향 프라이머 : 5'-ATC GCT ATT ACC ATG GAA GTT GGG GGG AGG GGT-3' (서열번호 23)

역방향 프라이머 : 5'-AGA AGA TCT AGC TCT GGC GGA CGC AGT TCA GGA-3' (서열번호 24)

마지막으로, 상기에서 제작된 CMV-GFP-CMV프로모터 발현 벡터의 5' 방향 CMV 프로모터(인핸서+프로모터)의 프로모터 영역에 부분을 제외한 나머지 부분을 하기 프라이머 세트를 이용하여 증폭시켜 발현 벡터를 선형으로 제조한 다음, 상기 증폭된 partial EF1α/partial HTLV 프로모터를 상기의 선형의 발현 벡터와 라이게이션시켜 pCMVHYBRID 발현 벡터(서열번호 4)를 제작하였다.

발현 벡터를 선형으로 만들기 위한 프라이머 세트

정방향 프라이머 : 5'-AGA GCT AGA TCT TCT AGA CCC GGG-3' (서열번호 25)

역방향 프라이머 : 5'-CAT GGT AAT AGC GAT GAC TAA TAC G-3' (서열번호 26)

CMV 기반 발현 벡터와 본 발명의 발현 벡터의 유전자 발현 효율 비교

상기 실시예 2에서 제작한 CMV 기반 발현 벡터와 본 발명의 발현 벡터(pCMVHYBRID)의 유전자 발현을 확인하기 위해 다능성 인간 배아 암종 세포주인 NTERA-2를 사용하였다.

먼저, 6-웰 배양 접시에 NTERA-2 세포가 각 웰당 1 x 10⁵ 세포가 되도록 접종한 다음, 24시간 동안 배양하였다. 'C.G', 'C.G.C', 'C.G.eC','pCMVHIBRID' 발현 벡터는 각각 2 x 10⁸ copies/웰이 되도록 리포펙타민 2000(lipofectamine 2000)을 이용하여 NTERA-2 세포에 형질전환시켰다. 형질전환 24 시간 후 형질전환된 세포를 수확하여 GFP 양성 세포에 대한 유세포 분석(flow coytomatry) 하였다.

그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이, CMV 발현 벡터 시스템(C.G; GFP 발현율 12%), CMV-CMV 발현 벡터 시스템(C.G.C; GFP 발현율 7%) 및 CMV-CMV 인핸서 발현 벡터 시스템(C.G.E_CMV; GFP 발현율 7%)에 비해 본 발명의 발현 벡터 시스템(CMVHYBRID; GFP 발현율 31%)의 발현율이 현저하게 증가한 것을 확인하였다.

EF1α 프로모터 기반 발현 벡터 제작

4-1 : EF1α 프로모터/ HTLV 프로모터- GFP 발현 벡터 (EF1α/ HTLV .G 발현 벡터)

EF1α/HTLV.G 발현 벡터(서열번호 27)는 pZAP1.1.pA 벡터를 BglII와 XbaI으로 절단한 후, pFUSE-mIgG2A-Fc1 벡터의 전체 EF1α/HTLV 프로모터(서열번호 28)를 하기 EF1α/HTLV 증폭용 프로모터를 이용하여 증폭한 다음, 증폭된 유전자를 BglII와 XbaI 절단 부위에 라이게이션시켜 제작하였다.

EF1α/HTLV 증폭용 프라이머 세트

정방향 프라이머 : 5'- TTG TCT AGG GAG ATC TGC TCC GGT GCC CGT CAG TG-3' (서열번호 29)

역방향 프라이머 : 5'- CGC TCC CGG GTC TAG AGT AGG CGC CGG TCA CAG C-3' (서열번호 30)

이후 리포터 유전자인 eGFP(서열번호 6)는 pMSCV-GFP벡터를 주형으로 상기 실시예 1의 eGFP 증폭용 프라이머 세트를 이용하여 증폭시킨 다음, SalI과 EcoRI 절단 부위에 라이게이션시켜 EF1α/HTLV.G 발현 벡터를 제작하였다.

4-2 : CMV 인핸서 / EF1α - GFP 발현 벡터 (eC/EF1α.G 발현 벡터)

eC/EF1α.G 발현 벡터(서열번호 31)를 제작하기 위해, 먼저 상기 실시예 2-1의 CMV-GFP 발현 벡터의 CMV 프로모터(인핸서+프로모터) 중 프로모터 부분을 제외한 나머지 염기서열을 하기 프라이머 세트를 이용하여 증폭시켜 CMV-GFP 발현 벡터를 선형으로 만들었다.

CMV-GFP 발현 벡터를 선형으로 만들기 위한 프라이머 세트

그 다음, pEF-GFP (addgene, Cat No. 11154) 벡터의 EF1α 프로모터(프로모터+인트론)(서열번호 32)를 하기 EF1α 프로모터(프로모터+인트론) 증폭용 프라이머 세트를 이용하여 증폭한 다음, 증폭된 유전자를 상기 선형의 CMV-GFP 발현 벡터와 라이게이션시켜 eC/EF1α.G 발현 벡터를 제작하였다.

EF1α 프로모터(프로모터+인트론) 증폭용 프라이머 세트

정방향 프라이머 : 5'-ATC GCT ATT ACC ATG GAG GGG TCG GCA ATT GAA CC-3' (서열번호 33)

역방향 프라이머 : 5'-AGA AGA TCT AGC TCT TCA CGA CAC CTG AAA TGG AAG-3' (서열번호 34)

EF1α 프로모터 기반 발현 벡터와 본 발명의 발현 벡터의 유전자 발현 효율 비교

상기 실시예 2에서 제작한 CMV 기반 발현 벡터와 본 발명의 발현 벡터(pCMVHYBRID) 및 상기 실시예 4에서 제작한 EF1α 프로모터 기반 발현 벡터의 유전자 발현을 확인하기 위해 다능성 인간 배아 암종 세포주인 NTERA-2를 사용하였다.

먼저, 6-웰 배양 접시에 NTERA-2 세포가 각 웰당 1 x 10⁵ 세포가 되도록 접종한 다음, 24시간 동안 배양하였다. 'C.G', 'EF1α/HTLV.G', 'eC/EF1α.G', pCMVHIBRID 발현 벡터가 각각 2 x 10⁸ copies/웰이 되도록 리포펙타민 2000(lipofectamine 2000)을 이용하여 NTERA-2 세포에 형질전환시켰다. 형질전환 24 시간 후 형질전환된 세포를 수확하여 GFP 양성 세포에 대한 유세포 분석(flow coytomatry) 하였다.

그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이 과발현 벡터로 개량되어 보고 된 EF1 α 프로모터/HTLV 프로모터를 포함하는 발현 벡터(EF1α/HTLV.G; GFP 발현율 24.8%), CMV 인핸서/EF1 α 프로모터를 포함하는 발현 벡터(E_CMV/EF1α.G; GFP 발현율 27.9%)와 비교하여 본 발명의 발현 벡터 시스템(pCMVHYBRID; GFP 발현율 24.2%)의 발현율이 유사한 것을 확인하였다.

<110> NATIONAL CANCER CENTER <120> High Efficiency Expression Vector and Uses thereof <130> 1066937 <160> 34 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 363 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CMV enhancer <400> 1 tagttattaa tagtaatcaa ttacggggtc attagttcat agcccatata tggagttccg 60 cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc cccgcccatt 120 gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc attgacgtca 180 atgggtggag tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt atcatatgcc 240 aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt atgcccagta 300 catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca tcgctattac 360 cat 363 <210> 2 <211> 307 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> partial EF1a/partial HTLV <400> 2 gaagttgggg ggaggggtcg gcaattgaac gggtgcctag agaaggtggc gcggggtaaa 60 ctgggaaagt gatgtcgtgt actggctccg cctttttccc gagggtgggg gagaaccgta 120 tataagtgca gtagtcgccg tgaacgttct ttttcgcaac gggtttgccg ccagaacaca 180 gctgaagctt cgaggggctc gcatctctcc ttcacgcgcc cgccgcccta cctgaggccg 240 ccatccacgc cggttgagtc gcgttctgcc gcctcccgcc tgtggtgcct cctgaactgc 300 gtccgcc 307 <210> 3 <211> 199 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CMV promoter <400> 3 ggtgatgcgg ttttggcagt acatcaatgg gcgtggatag cggtttgact cacggggatt 60 tccaagtctc caccccattg acgtcaatgg gagtttgttt tggcaccaaa atcaacggga 120 ctttccaaaa tgtcgtaaca actccgcccc attgacgcaa atgggcggta ggcgtgtacg 180 gtgggaggtc tatataagc 199 <210> 4 <211> 5343 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pCMVHYBRID vector <400> 4 ttaacatcat caataatata ccttattttg gattgaagcc aatatgataa tgagggggtg 60 gagtttgtga cgtggcgcgg ggcgtgggaa cggggcgggt gacgtagtag tgtggcggaa 120 gtgtgatgtt gcaagtgtgg cggaacacat gtaagcgacg gatgtggcaa aagtgacgtt 180 tttggtgtgc gccggtgtac acaggaagtg acaattttcg cgcggtttta ggcggatgtt 240 gtagtaaatt tgggcgtaac cgagtaagat ttggccattt tcgcgggaaa actgaataag 300 aggaagtgaa atctgaataa ttttgtgtta ctcatagcgc gtaatatttg tctagggtga 360 tctagttatt aatagtaatc aattacgggg tcattagttc atagcccata 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tccgtaagat gcttttctgt gactggtgag tactcaacca agtcattctg agaatagtgt 3840 atgcggcgac cgagttgctc ttgcccggcg tcaatacggg ataataccgc gccacatagc 3900 agaactttaa aagtgctcat cattggaaaa cgttcttcgg ggcgaaaact ctcaaggatc 3960 ttaccgctgt tgagatccag ttcgatgtaa cccactcgtg cacccaactg atcttcagca 4020 tcttttactt tcaccagcgt ttctgggtga gcaaaaacag gaaggcaaaa tgccgcaaaa 4080 aagggaataa gggcgacacg gaaatgttga atactcatac tcttcctttt tcaatattat 4140 tgaagcattt atcagggtta ttgtctcatg agcggataca tatttgaatg tatttagaaa 4200 aataaacaaa taggggttcc gcgcacattt ccccgaaaag tgccacctgc gaaaacgttt 4260 gaattgataa ttattatcat ttgcgggtca attcttagaa aaactcatcg agcatcaaat 4320 gaaactgcaa tttattcata tcaggattat caataccata tttttgaaaa agccgtttct 4380 gtaatgaagg agaaaactca ccgaggcagt tccataggat tgcaagatcc tggtatcggt 4440 ctgcgattcc gactcgtcca acatcaatac aacctattaa tttcccctcg tcaaaaataa 4500 ggttatcaag tgagaaatca ccatgagtga cgactgaatc cggtgagaat ggcaaaagct 4560 tatgcatttc tttccagact tgttcaacag gccagccatt acgctcgtca tcaaaatcac 4620 tcgcatcaac caaaccgtta ttcattcgtg attgcgcctg agcgagacga aatacgcgat 4680 cgctgttaaa aggacaatta caaacaggaa tcgaatgcaa ccggcgcagg aacactgcca 4740 gcgcatcaac aatattttca cctgaatcag gatattcttc taatacctgg aatgctgttt 4800 tcccggggat cgcagtggtg agtaaccatg catcatcagg agtacggata aaatgcttga 4860 tggtcggaag aggcataaat tccgtcagcc agtttagtct gaccatctca tctgtaacat 4920 cattggcaac gctacctttg ccatgtttca gaaacaactc tggcgcatcg ggcttcccat 4980 acaatcgata gattgtcgca cctgattgcc cgacattatc gcgagcccat ttatacccat 5040 ataaatcagc atccatgttg gaatttaatc gcggcctcga gcaagacgtt tcccgttgaa 5100 tatggctcat aacacccctt gtattactgt ttatgtaagc agacagtttt attgttcatg 5160 cgaaaacgtt tgaattgata attattatca tttgcgggtc ctgaaagcga gctttttggc 5220 ctctgtcgtt tcctttctct gtttttgtcc gtggaatgaa caatggaagt cggcctcgtg 5280 atacgcctat ttttataggt taatgtcatg ataataatgg tttcttagcg atatttaaat 5340 taa 5343 <210> 5 <211> 224 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> bGH poly A <400> 5 ctgtgccttc tagttgccag ccatctgttg tttgcccctc ccccgtgcct tccttgaccc 60 tggaaggtgc cactcccact gtcctttcct aataaaatga ggaaattgca tcgcattgtc 120 tgagtaggtg tcattctatt ctggggggtg gggtggggca ggacagcaag ggggaggatt 180 gggaagacaa tagcaggcat gctggggatg cggtgggctc tatg 224 <210> 6 <211> 726 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> eGFP <400> 6 gccaccatgg tgagcaaggg cgaggagctg ttcaccgggg tggtgcccat cctggtcgag 60 ctggacggcg acgtaaacgg ccacaagttc agcgtgtccg gcgagggcga gggcgatgcc 120 acctacggca agctgaccct gaagttcatc tgcaccaccg gcaagctgcc cgtgccctgg 180 cccaccctcg tgaccaccct gacctacggc gtgcagtgct tcagccgcta ccccgaccac 240 atgaagcagc acgacttctt caagtccgcc atgcccgaag gctacgtcca ggagcgcacc 300 atcttcttca aggacgacgg caactacaag acccgcgccg aggtgaagtt cgagggcgac 360 accctggtga accgcatcga gctgaagggc atcgacttca aggaggacgg caacatcctg 420 gggcacaagc tggagtacaa ctacaacagc cacaacgtct atatcatggc cgacaagcag 480 aagaacggca tcaaggtgaa cttcaagatc cgccacaaca tcgaggacgg cagcgtgcag 540 ctcgccgacc actaccagca gaacaccccc atcggcgacg gccccgtgct gctgcccgac 600 aaccactacc 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cgcggcctcg agcaagacgt 4740 ttcccgttga atatggctca taacacccct tgtattactg tttatgtaag cagacagttt 4800 tattgttcat gcgaaaacgt ttgaattgat aattattatc atttgcgggt cctgaaagcg 4860 agctttttgg cctctgtcgt ttcctttctc tgtttttgtc cgtggaatga acaatggaag 4920 tcggcctcgt gatacgccta tttttatagg ttaatgtcat gataataatg gtttcttagc 4980 gatatttaaa ttaa 4994 <210> 28 <211> 532 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EF1a/HTLV <400> 28 gctccggtgc ccgtcagtgg gcagagcgca catcgcccac agtccccgag aagttggggg 60 gaggggtcgg caattgaacg ggtgcctaga gaaggtggcg cggggtaaac tgggaaagtg 120 atgtcgtgta ctggctccgc ctttttcccg agggtggggg agaaccgtat ataagtgcag 180 tagtcgccgt gaacgttctt tttcgcaacg ggtttgccgc cagaacacag ctgaagcttc 240 gaggggctcg catctctcct tcacgcgccc gccgccctac ctgaggccgc catccacgcc 300 ggttgagtcg cgttctgccg cctcccgcct gtggtgcctc ctgaactgcg tccgccgtct 360 aggtaagttt aaagctcagg tcgagaccgg gcctttgtcc ggcgctccct tggagcctac 420 ctagactcag ccggctctcc acgctttgcc tgaccctgct tgctcaactc tacgtctttg 480 tttcgttttc tgttctgcgc cgttacagat ccaagctgtg accggcgcct ac 532 <210> 29 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EF1a/HTLV forward primer <400> 29 ttgtctaggg agatctgctc cggtgcccgt cagtg 35 <210> 30 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EF1a/HTLV reverse primer <400> 30 cgctcccggg tctagagtag gcgccggtca cagc 34 <210> 31 <211> 5971 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CMV enhancer/EF1a-GFP vector <400> 31 ttaacatcat caataatata ccttattttg gattgaagcc aatatgataa tgagggggtg 60 gagtttgtga cgtggcgcgg ggcgtgggaa cggggcgggt gacgtagtag tgtggcggaa 120 gtgtgatgtt gcaagtgtgg cggaacacat gtaagcgacg gatgtggcaa aagtgacgtt 180 tttggtgtgc gccggtgtac acaggaagtg acaattttcg cgcggtttta ggcggatgtt 240 gtagtaaatt tgggcgtaac cgagtaagat ttggccattt tcgcgggaaa actgaataag 300 aggaagtgaa atctgaataa ttttgtgtta ctcatagcgc gtaatatttg tctagggtga 360 tctagttatt aatagtaatc aattacgggg tcattagttc atagcccata tatggagttc 420 cgcgttacat aacttacggt aaatggcccg cctggctgac cgcccaacga cccccgccca 480 ttgacgtcaa taatgacgta tgttcccata gtaacgccaa tagggacttt ccattgacgt 540 caatgggtgg agtatttacg gtaaactgcc cacttggcag tacatcaagt gtatcatatg 600 ccaagtacgc cccctattga cgtcaatgac ggtaaatggc ccgcctggca ttatgcccag 660 tacatgacct tatgggactt tcctacttgg cagtacatct acgtattagt catcgctatt 720 accatggagg ggtcggcaat tgaaccggtg cctagagaag gtggcgcggg gtaaactggg 780 aaagtgatgt cgtgtactgg ctccgccttt ttcccgaggg tgggggagaa ccgtatataa 840 gtgcagtagt cgccgtgaac gttctttttc gcaacgggtt tgccgccaga acacaggtaa 900 gtgccgtgtg tggttcccgc gggcctggcc tctttacggg ttatggccct tgcgtgcctt 960 gaattacttc cacgcccctg gctgcagtac gtgattcttg atcccgagct tcgggttgga 1020 agtgggtggg agagttcgag gccttgcgct taaggagccc cttcgcctcg tgcttgagtt 1080 gaggcctggc ctgggcgctg gggccgccgc gtgcgaatct ggtggcacct tcgcgcctgt 1140 ctcgctgctt tcgataagtc tctagccatt taaaattttt gatgacctgc tgcgacgctt 1200 tttttctggc aagatagtct tgtaaatgcg ggccaagatc tgcacactgg tatttcggtt 1260 tttggggccg cgggcggcga cggggcccgt gcgtcccagc gcacatgttc ggcgaggcgg 1320 ggcctgcgag cgcggccacc gagaatcgga cgggggtagt ctcaagctgg ccggcctgct 1380 ctggtgcctg gcctcgcgcc gccgtgtatc gccccgccct gggcggcaag gctggcccgg 1440 tcggcaccag ttgcgtgagc ggaaagatgg ccgcttcccg gccctgctgc agggagctca 1500 aaatggagga cgcggcgctc gggagagcgg gcgggtgagt cacccacaca aaggaaaagg 1560 gcctttccgt cctcagccgt cgcttcatgt gactccacgg agtaccgggc gccgtccagg 1620 cacctcgatt agttctcgag cttttggagt acgtcgtctt taggttgggg ggaggggttt 1680 tatgcgatgg agtttcccca cactgagtgg gtggagactg aagttaggcc agcttggcac 1740 ttgatgtaat tctccttgga atttgccctt tttgagtttg gatcttggtt cattctcaag 1800 cctcagacag tggttcaaag tttttttctt ccatttcagg tgtcgtgaag agctagatct 1860 tctagacccg ggagcggccg ctgtcgacgc caccatggtg agcaagggcg aggagctgtt 1920 caccggggtg gtgcccatcc tggtcgagct ggacggcgac gtaaacggcc acaagttcag 1980 cgtgtccggc gagggcgagg gcgatgccac ctacggcaag ctgaccctga agttcatctg 2040 caccaccggc aagctgcccg tgccctggcc caccctcgtg accaccctga cctacggcgt 2100 gcagtgcttc agccgctacc ccgaccacat gaagcagcac gacttcttca agtccgccat 2160 gcccgaaggc tacgtccagg agcgcaccat cttcttcaag gacgacggca actacaagac 2220 ccgcgccgag gtgaagttcg agggcgacac cctggtgaac cgcatcgagc tgaagggcat 2280 cgacttcaag gaggacggca acatcctggg gcacaagctg gagtacaact acaacagcca 2340 caacgtctat atcatggccg acaagcagaa gaacggcatc aaggtgaact tcaagatccg 2400 ccacaacatc gaggacggca gcgtgcagct cgccgaccac taccagcaga acacccccat 2460 cggcgacggc cccgtgctgc tgcccgacaa ccactacctg agcacccagt ccgccctgag 2520 caaagacccc aacgagaagc gcgatcacat ggtcctgctg gagttcgtga ccgccgccgg 2580 gatcactctc ggcatggacg agctgtacaa gtaggaattc gatatcacta gtctgtgcct 2640 tctagttgcc agccatctgt tgtttgcccc tcccccgtgc cttccttgac cctggaaggt 2700 gccactccca ctgtcctttc ctaataaaat gaggaaattg catcgcattg tctgagtagg 2760 tgtcattcta ttctgggggg tggggtgggg caggacagca agggggagga ttgggaagac 2820 aatagcaggc atgctgggga tgcggtgggc tctatggctt ctgaggcgga aagaaccagg 2880 ttaacggtaa atcactaggt acccacgagg tggccagaga ggccgaggtg gcaggagctg 2940 catcgatgtc gcttcctcgc tcactgactc gctgcgctcg gtcgttcggc tgcggcgagc 3000 ggtatcagct cactcaaagg cggtaatacg gttatccaca gaatcagggg ataacgcagg 3060 aaagaacatg tgagcaaaag gccagcaaaa ggccaggaac cgtaaaaagg ccgcgttgct 3120 ggcgtttttc cataggctcc gcccccctga cgagcatcac aaaaatcgac gctcaagtca 3180 gaggtggcga aacccgacag gactataaag ataccaggcg tttccccctg gaagctccct 3240 cgtgcgctct cctgttccga ccctgccgct taccggatac ctgtccgcct ttctcccttc 3300 gggaagcgtg gcgctttctc atagctcacg ctgtaggtat ctcagttcgg tgtaggtcgt 3360 tcgctccaag ctgggctgtg tgcacgaacc ccccgttcag cccgaccgct gcgccttatc 3420 cggtaactat cgtcttgagt ccaacccggt aagacacgac ttatcgccac tggcagcagc 3480 cactggtaac aggattagca gagcgaggta tgtaggcggt gctacagagt tcttgaagtg 3540 gtggcctaac tacggctaca ctagaaggac agtatttggt atctgcgctc tgctgaagcc 3600 agttaccttc ggaaaaagag ttggtagctc ttgatccggc aaacaaacca ccgctggtag 3660 cggtggtttt tttgtttgca agcagcagat tacgcgcaga aaaaaaggat ctcaagaaga 3720 tcctttgatc ttttctacgg ggtctgacgc tcagtggaac gaaaactcac gttaagggat 3780 tttggtcatg agattatcaa aaaggatctt cacctagatc cttttaaatt aaaaatgaag 3840 ttttaaatca atctaaagta tatatgagta aacttggtct gacagttacc aatgcttaat 3900 cagtgaggca cctatctcag cgatctgtct atttcgttca tccatagttg cctgactccc 3960 cgtcgtgtag ataactacga tacgggaggg cttaccatct ggccccagtg ctgcaatgat 4020 accgcgagac ccacgctcac cggctccaga tttatcagca ataaaccagc cagccggaag 4080 ggccgagcgc agaagtggtc ctgcaacttt atccgcctcc atccagtcta ttaattgttg 4140 ccgggaagct agagtaagta gttcgccagt taatagtttg cgcaacgttg ttgccattgc 4200 tacaggcatc gtggtgtcac gctcgtcgtt tggtatggct tcattcagct ccggttccca 4260 acgatcaagg cgagttacat gatcccccat gttgtgcaaa aaagcggtta gctccttcgg 4320 tcctccgatc gttgtcagaa gtaagttggc cgcagtgtta tcactcatgg ttatggcagc 4380 actgcataat tctcttactg tcatgccatc cgtaagatgc ttttctgtga ctggtgagta 4440 ctcaaccaag tcattctgag aatagtgtat gcggcgaccg agttgctctt gcccggcgtc 4500 aatacgggat aataccgcgc cacatagcag aactttaaaa gtgctcatca ttggaaaacg 4560 ttcttcgggg cgaaaactct caaggatctt accgctgttg agatccagtt cgatgtaacc 4620 cactcgtgca cccaactgat cttcagcatc ttttactttc accagcgttt ctgggtgagc 4680 aaaaacagga aggcaaaatg ccgcaaaaaa gggaataagg gcgacacgga aatgttgaat 4740 actcatactc ttcctttttc aatattattg aagcatttat cagggttatt gtctcatgag 4800 cggatacata tttgaatgta tttagaaaaa taaacaaata ggggttccgc gcacatttcc 4860 ccgaaaagtg ccacctgcga aaacgtttga attgataatt attatcattt gcgggtcaat 4920 tcttagaaaa actcatcgag catcaaatga aactgcaatt tattcatatc aggattatca 4980 ataccatatt tttgaaaaag ccgtttctgt aatgaaggag aaaactcacc gaggcagttc 5040 cataggattg caagatcctg gtatcggtct gcgattccga ctcgtccaac atcaatacaa 5100 cctattaatt tcccctcgtc aaaaataagg ttatcaagtg agaaatcacc atgagtgacg 5160 actgaatccg gtgagaatgg caaaagctta tgcatttctt tccagacttg ttcaacaggc 5220 cagccattac gctcgtcatc aaaatcactc gcatcaacca aaccgttatt cattcgtgat 5280 tgcgcctgag cgagacgaaa tacgcgatcg ctgttaaaag gacaattaca aacaggaatc 5340 gaatgcaacc ggcgcaggaa cactgccagc gcatcaacaa tattttcacc tgaatcagga 5400 tattcttcta atacctggaa tgctgttttc ccggggatcg cagtggtgag taaccatgca 5460 tcatcaggag tacggataaa atgcttgatg gtcggaagag gcataaattc cgtcagccag 5520 tttagtctga ccatctcatc tgtaacatca ttggcaacgc tacctttgcc atgtttcaga 5580 aacaactctg gcgcatcggg cttcccatac aatcgataga ttgtcgcacc tgattgcccg 5640 acattatcgc gagcccattt atacccatat aaatcagcat ccatgttgga atttaatcgc 5700 ggcctcgagc aagacgtttc ccgttgaata tggctcataa caccccttgt attactgttt 5760 atgtaagcag acagttttat tgttcatgcg aaaacgtttg aattgataat tattatcatt 5820 tgcgggtcct gaaagcgagc tttttggcct ctgtcgtttc ctttctctgt ttttgtccgt 5880 ggaatgaaca atggaagtcg gcctcgtgat acgcctattt ttataggtta atgtcatgat 5940 aataatggtt tcttagcgat atttaaatta a 5971 <210> 32 <211> 1122 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EF1a promoter(promoter+intron) <400> 32 gaggggtcgg caattgaacc ggtgcctaga gaaggtggcg cggggtaaac tgggaaagtg 60 atgtcgtgta ctggctccgc ctttttcccg agggtggggg agaaccgtat ataagtgcag 120 tagtcgccgt gaacgttctt tttcgcaacg ggtttgccgc cagaacacag gtaagtgccg 180 tgtgtggttc ccgcgggcct ggcctcttta cgggttatgg cccttgcgtg ccttgaatta 240 cttccacgcc cctggctgca gtacgtgatt cttgatcccg agcttcgggt tggaagtggg 300 tgggagagtt cgaggccttg cgcttaagga gccccttcgc ctcgtgcttg agttgaggcc 360 tggcctgggc gctggggccg ccgcgtgcga atctggtggc accttcgcgc ctgtctcgct 420 gctttcgata agtctctagc catttaaaat ttttgatgac ctgctgcgac gctttttttc 480 tggcaagata gtcttgtaaa tgcgggccaa gatctgcaca ctggtatttc ggtttttggg 540 gccgcgggcg gcgacggggc ccgtgcgtcc cagcgcacat gttcggcgag gcggggcctg 600 cgagcgcggc caccgagaat cggacggggg tagtctcaag ctggccggcc tgctctggtg 660 cctggcctcg cgccgccgtg tatcgccccg ccctgggcgg caaggctggc ccggtcggca 720 ccagttgcgt gagcggaaag atggccgctt cccggccctg ctgcagggag ctcaaaatgg 780 aggacgcggc gctcgggaga gcgggcgggt gagtcaccca cacaaaggaa aagggccttt 840 ccgtcctcag ccgtcgcttc atgtgactcc acggagtacc gggcgccgtc caggcacctc 900 gattagttct cgagcttttg gagtacgtcg tctttaggtt ggggggaggg gttttatgcg 960 atggagtttc cccacactga gtgggtggag actgaagtta ggccagcttg gcacttgatg 1020 taattctcct tggaatttgc cctttttgag tttggatctt ggttcattct caagcctcag 1080 acagtggttc aaagtttttt tcttccattt caggtgtcgt ga 1122 <210> 33 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EF1a promoter(promoter+intron) forward primer <400> 33 atcgctatta ccatggaggg gtcggcaatt gaacc 35 <210> 34 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EF1a promoter(promoter+intron) reverse primer <400> 34 agaagatcta gctcttcacg acacctgaaa tggaag 36

Claims

작동 가능하게 연결된 CMV 인핸서; EF1α 프로모터/HTLV 프로모터; 및 CMV 프로모터를 포함하는 발현 벡터.
제1항에 있어서, 상기 EF1α 프로모터/HTLV 프로모터와 CMV 프로모터 사이에 목적 유전자가 작동 가능하게 연결되도록 삽입되는 것을 특징으로 하는 발현 벡터.
제1항에 있어서, 상기 CMV 인핸서는 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 발현 벡터.
제1항에 있어서, 상기 EF1α 프로모터/HTLV 프로모터는 서열번호 2로 표시되는 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 발현 벡터.
제1항에 있어서, 상기 CMV 프로모터는 서열번호 3으로 표시되는 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 발현 벡터.
제1항에 있어서, 상기 발현 벡터는 CMV 프로모터의 3' 말단 부분에 전사 종결 인자가 추가로 포함되는 것을 특징으로 하는 발현 벡터.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 발현 벡터로 형질전환된 재조합 세포.
제7항에 있어서, 상기 세포는 동물세포 또는 줄기세포인 것을 특징으로 하는 재조합 세포.
제8항에 있어서, 상기 동물세포는 NTERA-2 세포, CHO-K1 세포, CHO-DG44 세포, CHO-S 세포, CHO DUK-BII 세포, COS7 세포, COS3 세포, COS1 세포, NSO 세포, HeLa 세포, Vero 세포, PER-C6 세포, HepG2 세포 및 BHK 세포로 이루어진 군에서 선택된 것을 특징으로 하는 재조합 세포.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 발현 벡터로 형질전환된 재조합 세포를 유효성분으로 포함하며,
상기 발현 벡터는 목적 유전자로 발암 억제 유전자, 암조직 분해 유전자 또는 면역세포 활성화 유전자를 포함하는 것을 특징으로 하는 유전자 치료용 약학적 조성물.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 발현 벡터로 형질전환된 세포를 배양하여 목적 단백질을 생산한 다음, 생산된 단백질을 수득하는 단계를 포함하는 재조합 단백질의 생산방법.