CN107418913A - 一种高效转化污染土壤中重金属镉的微生物制剂的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种高效转化污染土壤中重金属镉的微生物制剂的应用。所述的菌剂由以下两个菌群混合后富集培养得到：(1)假丝酵母菌、单胞瓶霉菌、圆红东孢酵母菌、隐球菌组成菌群1；(2)嗜酸氧化硫硫杆菌、氧化亚铁钩端螺旋菌、喜温酸硫杆菌、嗜热硫氧化硫化杆菌，嗜酸氧化亚铁硫杆菌、噬热铁质菌组成菌群2。使用该菌剂处理镉污染土壤，金属镉由难溶态转化为可溶态之后的去除率为70‐82％，该菌剂具有转化效率高、周期短、费用低、无二次污染，易于推广等优势。

Description

一种高效转化污染土壤中重金属镉的微生物制剂的应用
技术领域
本发明属于微生物治理重金属污染技术领域，具体涉及一种能高效生物转化污染土壤中镉形态的微生物菌剂的应用。
背景技术
近年我国在经济发展上取得了举世瞩目的成就，但是，过度的工业活动带来了严重的环境污染，对居民健康造成严重威胁，并对社会、经济和环境的可持续发展带来了巨大隐患。我国农村环境面临多种环境问题，主要包括土壤重金属污染、土壤肥力减退、耕地盐碱化、河流水体富营养化、农药、化肥、杀虫剂等滥用造成的环境污染等。
据国家相关数据显示，目前，中国重金属污染耕地占总耕地的1/5，约为2000万公顷，其中工业“三废”污染农田1000万hm2，重金属污染的土地面积占污染总面积的64.8％。当前的土壤重金属污染主要集中在镉、汞、铅、铬、砷等生物毒性显著元素的污染,而在所有的污染土壤的重金属元素中，镉以移动性大、毒性高、污染面积最大被称为“五毒之首”而成为最为关注的元素。2001年我国污水灌溉省份生产的大米中Cd含量超出标准值，我国每年由于粮食重金属含量超标直接给国家带来巨大的经济损失，农作物产量锐减，被重金属污染过的农作物达1200万吨。
重金属污染对于环境和人类都有着重大危害，传统处理重金属污染的方法归纳起来主要有4种：分别是化学方法、物理方法、物理化学方法和农艺措施。目前，治理重金属的途径主要有两条，一是去除土壤中的重金属，二是减少Cd在生态系统中的生物可利用性和流动性。我国重金属污染存在地区性和特异性，治理方法需要按照多层次、多方法综合治理的方式，全面推进重金属防治工作。相关研究表明，微生物治理土壤镉污染具有无污染、见效快、成本低等众多优点，不会造成二次污染等不良后果。目前研究表明微生物治理重金属污染的机制是微生物本身对重金属具有富集性，这极大地为生物防治污染提供了理论支持。微生物积累并转换水稻田中的重金属镉，发生细胞外沉淀和胞内累积作用，镉元素的化合物在生物体的不同部位上发生沉积作用，通过细胞本身的分解代谢途径主要有两种去向：第一是某些重金属离子被生物降解，第二是与细胞中的多聚物发生螯合作用，某些微生物生成的酶蛋白能和镉发生亲和作用从而还原镉离子。
在国内已申请的相关专利中,专利《一种重金属污染土壤的微生物修复方法》(申请号：201110122739.6，公开日：2011‐11‐16)公开了一种利用球形红细菌制剂配合淹水治理土壤的方法,其工作原理主要为利用球形红细菌在富水厌氧环境下大量繁殖后吸附重金属,再经由水渗入地下降低土壤中的重金属浓度,但其在治理过程中土壤不能用于种植作业,经济成本高,另一方面,菌种过于单一,普适性差,适用范围小,能治理的重金属种类及程度均较低。专利《重金属污染土壤微生物修复剂及其应用》(申请号201410682558.2，公开日：2015‐04‐22)公开了一种采用枯草芽抱杆菌和热带假丝酵母作为有效成份的重金属污染土壤治理剂,该发明的生物修复剂可以吸附一定比例的重金属,并可在土壤中存留一段时间,但热带假丝酵母属厌氧菌类,在干燥通风的土壤中无法长期存活,而枯草芽抱杆菌作为需氧菌则无法在湿性土壤中长久存活,两种有效菌种生存环境相冲突,另一方面,有效菌株类太少,由于每种微生物都有其局限,因此其治理土壤的效果既不长效、也不全面。
生态系统中微生物具有种类多、代谢旺盛且途径多样等特征，且微生物处理法技术成熟操作简单，在土壤镉污染治理中有较为明显的优势，因此被广泛采纳，如何找寻到能够共同生长、且协同作用强、能够很好的在污染土壤中生存的复配菌剂将是未来科研发展的方向。
发明内容
本发明的目的是提供一种微生物菌剂的应用，该微生物菌剂能将重金属污染土壤中难利用镉高效转化成可溶态，随着溶液流出，实现快速有效治理镉污染的目的。
一种高效转化污染土壤中重金属镉的微生物制剂的应用，将所述的菌剂与镉污染土壤混合进行处理；具体是将微生物菌剂菌浓稀释到4.0×107个/mL—7.0×107个/mL，按镉污染土壤质量与稀释后的菌液体积(0.06—1.0)kg:1L的比例投入该微生物菌剂，经过速率为150‐200rpm的搅拌处理9—120h。
所述的菌剂由以下两个菌群混合后富集培养得到：
(1)假丝酵母菌(Candida)、单胞瓶霉菌(Phialemonium)、圆红东孢酵母菌(Rhodosporidium toruloides)、隐球菌(Cryptococcus)组成菌群1；
(2)嗜酸氧化硫硫杆菌(Acidithiobacillus thiooxidans)、喜温酸硫杆菌(Acidithiobacillus caldus)、氧化亚铁钩端螺旋菌(Leptospirum ferrooxidans)、嗜热硫氧化硫化杆菌(Sulfobacillus thermosulfidooxidans)，嗜酸氧化亚铁硫杆菌(Acidithiobacillus ferrooxidans)、噬热铁质菌(Ferroplasma thermophilum)组成菌群2。
作为进一步的改进，由65‐75％假丝酵母菌(Candida)、10‐15％单胞瓶霉菌(Phialemonium)、5‐15％圆红东孢酵母菌(Rhodosporidium toruloides)、2‐6％隐球菌(Cryptococcus)的数量比例组成菌群1；嗜酸氧化硫硫杆菌(Acidithiobacillusthiooxidans)、喜温酸硫杆菌(Acidithiobacillus caldus)、氧化亚铁钩端螺旋菌(Leptospirum ferrooxidans)、嗜热硫氧化硫化杆菌(Sulfobacillusthermosulfidooxidans)，嗜酸氧化亚铁硫杆菌(Acidithiobacillus ferrooxidans)、噬热铁质菌(Ferroplasma thermophilum)按1:(1-1.7):(1-1.9):(1-2):(1-2.4):(1-3)的数量比例组成菌群2。
假丝酵母菌(Candida)包括近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis)、热带假丝酵母(Candida tropicalis)以及粗壮假丝酵母(Candida valida)，三种菌的数量比例为(4‐5):(2‐3):3；
隐球菌(Cryptococcus)包括罗伦特隐球菌(Cryptococcus laurentii)、维多利亚隐球酵母菌(Cryptococcus victoriae)和新型隐球菌(Filobasidiella bacillispora)，三种菌的数量比例为3:(2‐4):(2‐3)；
作为进一步的改进，菌群中的各种菌在混合之前在含有镉的培养基中进行驯化；驯化的具体步骤及条件如下：将菌置于100mL灭菌的含有0.5％‐1.5％9K培养基、4‰-12‰葡萄糖、4‰-9‰硫粉以及CdSO4的培养基中，在转速为150-200rpm温度为22-27℃条件下驯化至少30代，驯化时CdSO4的浓度梯度为0.5mmol/L，培养基中CdSO4含量从0.5增加到15.0mmol/L。
作为进一步的改进，将菌群1、菌群2接种到富集培养基中，曝气培养后，经过8—12次转接培养后获得微生物菌剂。
作为进一步的改进，将菌浓均为2.0×107-3.5×107个/mL的菌群1、菌群2和水按照3:(2-4):(5-6)的体积比例混合，初始接种量为2％‐5％到富集培养基中，曝气培养后，将所培养的富集物以8％—15％的体积比例转接到新鲜的培养基中，继续曝气培养，经过8—12次转接培养后获得微生物菌剂。
所述的富集培养基组成如下：7％-11％9K培养基+4‰-9‰酵母粉+4‰-12‰葡萄糖+4‰-9‰硫粉+0.3‰‐0.8‰磁黄铁矿，将体系定容到50L；
所述的9K培养基成分如下：蒸馏水1000mL，(NH4)2SO4(0.3g/L)，K2HPO4(0.05g/L)，KCl(0.01g/L)，Ca(NO3)2(0.001g/L)，MgSO4·7H2O(0.05g/L)；
培养基不做高压灭菌处理，直接将各组成成分加入曝气柱中。
曝气培养条件为：初始pH2.5—3.0，温度20—30℃，曝气量DO2条件下富集培养1—3天。培养后富集物菌浓达5.0×108个/mL‐8.0×108个/mL，pH降至1.3-1.5。
近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis)、热带假丝酵母(Candida tropicalis)以及粗壮假丝酵母(Candida valida)、罗伦特隐球菌(Cryptococcus laurentii)、喜温酸硫杆菌(Acidithiobacillus caldus)可在中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)购买，编号分别为31861、1316、32439、32267、24169；维多利亚隐球酵母菌(Cryptococcusvictoriae)和新型隐球菌(Filobasidiella bacillispora)、嗜热硫氧化硫化杆菌(Sulfobacillus thermosulfidooxidans)，嗜酸氧化亚铁硫杆菌(Acidithiobacillusferrooxidans)、噬热铁质菌(Ferroplasma thermophilum)；嗜酸氧化硫硫杆菌(Acidithiobacillus thiooxidans)、氧化亚铁钩端螺旋菌(Leptospirum ferrooxidans)单胞瓶霉菌(Phialemonium)、圆红东孢酵母菌(Rhodosporidium toruloides)可从北京莱耀生物科技有限公司购买。
与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明采用的菌群1通过将镉污染土壤中具有镉转化功能的微生物富集培养起来，最终通过测序获得主要微生物的种类和数量比例，然后据此复配得到菌群1，再与菌群2混合进行曝气培养，生成微生物菌剂，不仅突破了传统物理和化学方法面临的处理周期长，成本高，不能从根本上减少土壤中镉含量等缺点，也打破了植物和动物富集法所面临的生长周期长，不易存活等限制因素，具有培养周期短，成本低，操作简单易控，能有效将难利用镉转化成可溶态，加速镉溶出到溶液中来等优势，在土壤重金属镉修复方面具有广阔的应用前景。
本发明制备的复合微生物菌剂生长速度快，产酸能力强，接种培养第三天pH值降到1.5，菌浓达到5x108个/mL以上。
具体实施方式
以下结合实施例旨在进一步说明本发明，而非限制本发明。
实施例1：耐镉微生物的采集、培养和驯化
由71.5％假丝酵母菌(Candida)、13.5％单胞瓶霉菌(Phialemonium)、10％圆红东孢酵母菌(Rhodosporidium toruloides)、5％隐球菌(Cryptococcus)组成菌群1；假丝酵母菌(Candida)包括近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis)、热带假丝酵母(Candidatropicalis)以及粗壮假丝酵母(Candida valida)，三种菌的数量比例为5:2:3；隐球菌(Cryptococcus)包括罗伦特隐球菌(Cryptococcus laurentii)、维多利亚隐球酵母菌(Cryptococcus victoriae)和新型隐球菌(Filobasidiella bacillispora)，三种菌的数量比例为3:2:2；
混合之前各菌分别在含镉培养基中进行驯化，驯化的具体步骤及条件如下：将菌置于100mL灭菌的含有10％9K、8‰葡萄糖、4‰硫粉及浓度梯度为0.5mmol/L、1.0mmol/L、1.5mmol/L、2.0mmol/L、…、14.5mmol/L、15.0mmol/L CdSO4的培养基中，在转速为180rpm温度为25℃条件下驯化30代。
然后将嗜酸氧化亚铁硫杆菌(A.ferrooxidans,A.f)、嗜中高温嗜酸古菌(F.thermophilum)、嗜热硫氧化硫杆菌(S.thermosulfidooxidnas)、嗜铁钩端螺旋菌(L.ferriphilum)、氧化硫硫杆菌(A.thiooxidans，A.t)等6个菌种按1:1:1:1:1:1的比例组成菌群2；混合之前各菌分别在含镉培养基中进行驯化。驯化的具体步骤及条件如下：将菌置于100mL灭菌的含有10％9K、8‰葡萄糖、4‰硫粉及浓度梯度为0.5mmol/L、1.0mmol/L、1.5mmol/L、2.0mmol/L、…、14.5mmol/L、15.0mmol/L CdSO4的培养基中，在转速为180rpm温度为25℃条件下驯化30代。
富集培养基的配制：10％9K培养基+4‰酵母粉+8‰葡萄糖+4‰硫粉+0.8‰磁黄铁矿，将体系定容到50L。9K培养基成分如下：蒸馏水1000mL，(NH4)2SO43g/L，K2HPO40.5g/L，KCl0.1g/L，Ca(NO3)20.01g/L，MgSO4·7H2O0.5g/L。由于此富集培养基体系为50L，属于大体系，故培养基不做高压灭菌处理，直接将各组成成分加入曝气柱中。
将菌浓均为3.0×107个/mL菌群1、菌群2和自来水按照3:2:5的体积比例混合，再按照2％‐5％接种到富集培养基中，在30℃，曝气量为DO2的条件下培养3天，pH降到1.5，菌浓为2×108个/mL。
将第一次富集的微生物以10％的浓度接种于培养基中，调节pH2.8，在相同条件下培养。重复传代8次后得到生长周期短，活性好的菌群。pH值在最后一次传代培养的第三天降到1.5，菌浓达到5x108个/mL。
实施例2：无菌土壤去除镉实验
土壤同样采自于湖南省北山镇环境治理VIP实验示范区污染农田土壤，编号1、2、3。将土壤风干后磨碎过100目筛，然后封装灭菌。
实验设计：用培养基将微生物菌剂菌浓稀释到4.0×107个/mL—7.0×107个/mL，按镉污染土壤质量与稀释后的菌液体积0.5kg:1L的比例投入该微生物菌剂为实验组，每种样品设置3个平行实验组和1个空白对照组(加入同样比例的镉污染土壤，不加菌剂)，初始pH为2.75，在30℃，150rpm条件下培养。每天测定pH、Eh，浸出4.5天后离心收渣，风干过100目筛，测定土壤中镉含量。结果表明：1组土壤对照组的去除率为31.09％，实验组的去除率为74.83％；2组土壤对照组的去除率为29.88％，实验组的去除率为79.06％；3组土壤对照组的去除率为24.77％，实验组的去除率为80.13％。目前微生物去除重金属镉污染土壤的最高去除率为64.2％，而本发明中的方法去除率可达70％—82％，经对比具有明显的优势。
实施例3
本实施例在实验土壤里进行实地效果验证，情况如下，取湖南省长沙市北山镇环境治理VIP实验示范区污染农田土壤，对土壤内的Cd含量进行3次测量后取平均值为2.31ppm，应用本发明微生物制剂的具体步骤如下：①在被污染的土壤表面积按照40L/亩‐60L/亩的比例均匀施加微生物制剂。②用农用翻耕机翻地1小时，沉降过夜后排水至回收池，测定土壤中的镉含量。③每1‐2天重复步骤①②一次，微生物制剂可用回收处理过的，即溶液中的镉已被回收处理微生物制剂。如此反复处理3次，即可将被重金属污染的土壤修复成相对良性的土壤。经检测：处理后的土壤Cd(镉)含量为0.11pmm，国家标准为Cd(镉)含量不大于0.20ppm。
本发明适用于富水、温润地域或洼地,尤其适用于水稻种植区域。
对所公开的实施例的上述说明,仅为了使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的。因此,本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例,而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (9)

1.一种高效转化污染土壤中重金属镉的微生物制剂的应用，其特征在于，将所述的菌剂与镉污染土壤混合进行处理；所述的菌剂由以下两个菌群混合后富集培养得到：
(1)假丝酵母菌(Candida)、单胞瓶霉菌(Phialemonium)、圆红东孢酵母菌(Rhodosporidium toruloides)、隐球菌(Cryptococcus)组成菌群1；
(2)嗜酸氧化硫硫杆菌(Acidithiobacillus thiooxidans)、喜温酸硫杆菌(Acidithiobacillus caldus)、氧化亚铁钩端螺旋菌(Leptospirum ferrooxidans)、嗜热硫氧化硫化杆菌(Sulfobacillus thermosulfidooxidans)，嗜酸氧化亚铁硫杆菌(Acidithiobacillus ferrooxidans)、噬热铁质菌(Ferroplasma thermophilum)组成菌群2。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，将微生物菌剂菌浓稀释到4.0×107个/mL—7.0×107个/mL，按镉污染土壤质量与稀释后的菌液体积(0.06—1.0)kg:1L的比例投入该微生物菌剂，经过速率为150‐200rpm的搅拌处理9—120h。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，由65‐75％假丝酵母菌(Candida)、10‐15％单胞瓶霉菌(Phialemonium)、5‐15％圆红东孢酵母菌(Rhodosporidium toruloides)、2‐6％隐球菌(Cryptococcus)的数量比例组成菌群1；嗜酸氧化硫硫杆菌(Acidithiobacillus thiooxidans)、喜温酸硫杆菌(Acidithiobacillus caldus)、氧化亚铁钩端螺旋菌(Leptospirum ferrooxidans)、嗜热硫氧化硫化杆菌(Sulfobacillusthermosulfidooxidans)，嗜酸氧化亚铁硫杆菌(Acidithiobacillus ferrooxidans)、噬热铁质菌(Ferroplasma thermophilum)按1:(1-1.7):(1-1.9):(1-2):(1-2.4):(1-3)的数量比例组成菌群2；
假丝酵母菌(Candida)包括近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis)、热带假丝酵母(Candida tropicalis)以及粗壮假丝酵母(Candida valida)，三种菌的数量比例为(4‐5):(2‐3):3；
隐球菌(Cryptococcus)包括罗伦特隐球菌(Cryptococcus laurentii)、维多利亚隐球酵母菌(Cryptococcus victoriae)和新型隐球菌(Filobasidiella bacillispora)，三种菌的数量比例为3:(2‐4):(2‐3)。
4.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，菌群中的各种菌在混合之前在含有镉的培养基中进行驯化；驯化的具体步骤及条件如下：将菌置于100mL灭菌的含有0.5％‐1.5％9K培养基、4‰-12‰葡萄糖、4‰-9‰硫粉以及CdSO4的培养基中，在转速为150-200rpm温度为22-27℃条件下驯化至少30代，驯化时CdSO4的浓度梯度为0.5mmol/L，培养基中CdSO4含量从0.5增加到15.0mmol/L。
5.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，
将菌群1、菌群2接种到富集培养基中，曝气培养后，经过8—12次转接培养后获得微生物菌剂。
6.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，将菌浓均为2.0×107-3.5×107个/mL的菌群1、菌群2和水按照3:(2-4):(5-6)的体积比例混合，初始接种量为2％‐5％到富集培养基中，曝气培养后，将所培养的富集物以8％—15％的体积比例转接到新鲜的培养基中，继续曝气培养，经过8—12次转接培养后获得微生物菌剂。
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：富集培养基组成如下：7％-11％9K培养基+4‰-9‰酵母粉+4‰-12‰葡萄糖+4‰-9‰硫粉+0.3‰‐0.8‰磁黄铁矿，将体系定容到50L；
所述的9K培养基成分如下：蒸馏水1000mL，(NH4)2SO4(0.3g/L)，K2HPO4(0.05g/L)，KCl(0.01g/L)，Ca(NO3)2(0.001g/L)，MgSO4·7H2O(0.05g/L)；
培养基不做高压灭菌处理，直接将各组成成分加入曝气柱中。
8.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，曝气培养条件为：初始pH2.5—3.0，温度20—30℃，曝气量DO2条件下富集培养1—3天。
9.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，培养后富集物菌浓达5.0×108个/mL‐8.0×108个/mL，pH降至1.3-1.5。
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