CN104862250B - 一种嗜酸铁氧化微生物复合菌剂及其制备方法 - Google Patents

一种嗜酸铁氧化微生物复合菌剂及其制备方法 Download PDF

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Abstract

一种嗜酸铁氧化微生物复合菌剂，其群落组成包含嗜酸铁质菌菌株、耐冷嗜酸铁氧化菌菌株、嗜酸氧化亚铁硫杆菌菌株、嗜铁钩端螺旋杆菌菌株和嗜酸硫化芽孢杆菌菌株；该复合菌剂的制备方法包括：将前述五种菌株置于特定含铁基本盐/营养培养基中依次经过温度梯度复配培养、耐受混合重金属梯度压力式驯化、温度循环梯度式驯化、亚铁氧化活性提高和耐受高铁驯化步骤，即配制得到嗜酸铁氧化微生物复合菌剂。本发明的复合菌剂配方简单、经济性好、适应性强且通用高效，可用于高效浸提电镀污泥中的重金属。

Description

一种嗜酸铁氧化微生物复合菌剂及其制备方法
技术领域
本发明属于环保领域中污泥无害化生物处理技术领域，具体涉及一种可用于电镀污泥无害化处理的微生物菌剂及其应用。
背景技术
电镀污泥是表面处理行业的终极固体废物，成分十分复杂且毒性大，已被列为国家重点危险废物(《国家危险废物名录》)，但其富含的Cu、Zn、Ni、Cr等重金属含量远高于矿产开发品位，再利用潜在价值高，因而成为一种不可多得的、廉价的可再生有色金属资源。
传统电镀污泥资源化回收利用主要包括火法冶炼、化学湿法浸提或两者联用，但其存在能耗大、成本高、二次污染严重、处理对象简单等局限性。近年来，生物浸出(浸提)法在电镀污泥资源化回收处理中愈加受到关注。生物浸提法是近年来在生物湿法冶金的基础上发展起来的资源化利用新技术，其是利用微生物的氧化、生物酸溶、代谢产物螯合等作用使矿物中的金属溶解，从而达到浸提金属目的的技术。生物冶金技术由于具有成本低、环境友好，对物料组成没有严格限制，尤其适合处理复杂、低品位含金属的矿石等特点，已成为世界上矿物资源加工利用的前沿技术，并已规模化应用于Cu、Co、Ni、Zn、U等低品位、分散、难处理的金属硫化矿物或其氧化矿物的浸出，或用以去除阻碍与金属接触的表面杂质(如生物氧化预处理金矿)。生物浸提法由于其独特的优势，已逐步改进甚至取代传统化学浸出法，为不同来源的难处理含重金属污泥提供了新的无害化处理途径。
电镀污泥中的重金属(如铜、锌、镍、铬及总铁(亚铁)等金属)含量高，主要以金属氧化物或氢氧化物形式存在，部分以硫化物形式存留。生物浸出过程中，电镀污泥中大量存在的亚铁伴随其他金属的浸出而溶出，溶出的亚铁(Fe2+)被嗜酸铁氧化微生物迅速氧化转变成高铁(Fe3+)，如反应方程式(1)所示。浸出液中大量存在Fe3+，一方面与Fe2+配合造成浸出体系高氧化还原电位(ORPFe 3+ /Fe 2+≥420mV)环境加速了其他金属氧化物的溶出，同时氧化硫化物而溶出金属(如反应方程式(2)所示)；另一方面大量存在的Fe3+不稳定，容易形成铁矾等沉淀但同时释放H+(如反应方程式(3)所示)，进而协助微生物加速金属溶出(如反应方程式(4)所示)。而具有硫氧化功能的微生物通过氧化还原态硫等途径促进污泥中金属的溶出，如反应方程式(4)～(6)所示。此外，嗜酸微生物代谢产物如丙酮酸、草酰乙酸等有机酸通过螯合等作用溶出金属。因而，生物法浸提电镀污泥过程中，不同功能(如硫氧化、铁氧化等)的嗜酸微生物将发挥重要作用，而优良菌种选育及功能菌群优化复合对提 高微生物浸提电镀污泥效率，实现有价金属高效浸出起到关键作用。
MS+2Fe3+→M2++S0+2Fe2+ (2)；
3Fe3++A++2HSO4 －+6H2O→AFe3(SO4)2(OH)6+8H+ (3)；
MS+2H+→M2++H2S (4)；
以上方程式中，M＝Ni2+、Zn2+、Cu2+等；A＝K+、Na+、NH4 +或H3O+等。
实际工业应用中，生物浸提电镀污泥工艺处于一个开放的、不断变化的环境，如环境温度和污泥来源变化等，因而唯有具有性能优良的菌株及其复合组成的功能菌群才能发挥最佳的浸出效应。
目前，虽然对生物法浸提污泥中重金属的微生物已有大量报道，但研究结果主要集中于常温嗜酸铁/硫氧化微生物，如中国专利文献CN 101760619 A和CN 102719657 A等主要采用常温培养的嗜酸氧化亚铁硫杆菌和嗜酸氧化硫硫杆菌等，因而获得的菌株及其组成的群落结构和功能相对简单，不利于高温和低温条件下复合菌剂的培养制备及污泥浸出处理，也不利于复杂来源电镀污泥的高效生物处理。此外，中国专利文献CN 103451437 A公开了高温古菌为主的细菌辅助含铜钴镍的有价金属泥渣的回收方法，该高温古菌复合物同样面临不适于常温和低温条件下的培养制备及电镀污泥高效生物处理等问题。为了适用于常年不同环境压力条件，同时实现不同来源污泥中的金属高效浸出，现有专利文献中介绍的生物浸提工艺必须额外增加一定的培养控温设备及长期污泥适应性驯化流程，这导致工艺流程长、效率低及成本高，不利于生物法浸提工艺的广泛工业应用。鉴于目前生物法浸提污泥的微生物种群结构及其功能应用的局限性，研究一种“通用型高效”浸提电镀污泥中重金属的嗜酸微生物菌剂及其制备方法具有重要意义，而目前此类报道较少。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，克服以上背景技术中提到的不足和缺陷，提供一种配方简单、经济性好、适应性强且通用高效的嗜酸铁氧化微生物复合菌剂，还相应提供一种前述嗜酸铁氧化微生物复合菌剂的制备方法。
为解决上述技术问题，本发明提出的技术方案为一种嗜酸铁氧化微生物复合菌剂，所述嗜酸铁氧化微生物复合菌剂的群落组成包含嗜酸铁质菌(Ferroplasmaacidiphilum)菌株、耐 冷嗜酸铁氧化菌(Acidithiobacillus ferrivorans)菌株、嗜酸氧化亚铁硫杆菌(Acidithiobacillus ferrooxidans)菌株、嗜铁钩端螺旋杆菌(Leptospirillum ferriphilum)菌株和嗜酸硫化芽孢杆菌(Sulfobacillus acidophilus)菌株。本发明的嗜酸铁氧化微生物复合菌剂含有能适应宽温度范围、能抗重金属毒性的铁/硫氧化的化能自养或兼性自养的细/古菌复合菌群。
上述本发明的嗜酸铁氧化微生物复合菌剂中，优选的，所述嗜酸铁质菌菌株为保藏号CCTCC NO:M 2015017的嗜酸铁质菌，其命名为嗜酸铁质菌CS1(Ferroplasmaacidiphilum CS1)，其于2015年1月5日被保藏于中国典型培养物保藏中心(地址位于中国湖北武汉的武汉大学校内)。该嗜酸铁质菌菌株能够以亚铁和有机物酵母粉兼性自养，生长温度范围为10℃～50℃，最适合生长温度约为35℃，生长pH值范围1.0～3.0，最适pH值约2.0，是常温浸出环境下的优势古菌。
上述本发明的嗜酸铁氧化微生物复合菌剂中，优选的，所述耐冷嗜酸铁氧化菌菌株为保藏号CCTCC NO:M 2015009的耐冷嗜酸铁氧化菌，其命名为耐冷嗜酸铁氧化菌CS12(Acidithiobacillus ferrivorans CS12)，其于2015年1月5日被保藏于中国典型培养物保藏中心(地址位于中国湖北武汉的武汉大学校内)。该耐冷嗜酸铁氧化菌菌株能够以亚铁或还原态硫氧化为能源化能自养，生长温度范围为10℃～35℃，最适合生长温度为15℃～20℃，生长pH值范围2.0～3.5，最适合生长pH值为2.0，是低温浸出环境下的优势菌种。
上述本发明的嗜酸铁氧化微生物复合菌剂中，优选的，所述嗜酸氧化亚铁硫杆菌菌株为保藏号CCTCC NO: M 2015007的嗜酸氧化亚铁硫杆菌，其命名为嗜酸氧化亚铁硫杆菌CS9(Acidithiobacillus ferrooxidans CS9)，其于2015年1月5日被保藏于中国典型培养物保藏中心(地址位于中国湖北武汉的武汉大学校内)。该嗜酸氧化亚铁硫杆菌菌株能够以亚铁和还原态硫为能源化能自养，生长温度范围为10℃～50℃，最适合生长温度为30℃～35℃，生长pH值范围1.3～4.5，最适合生长pH值为2.0～2.5，是常温浸出环境下的优势铁/硫氧化菌种。
上述本发明的嗜酸铁氧化微生物复合菌剂中，优选的，所述嗜铁钩端螺旋杆菌菌株为保藏号CCTCC NO:M 2015010的嗜铁钩端螺旋杆菌，其命名为嗜铁钩端螺旋杆菌CS13(Leptospirillum ferriphilum CS13)，其于2015年1月5日被保藏于中国典型培养物保藏中心(地址位于中国湖北武汉的武汉大学校内)。该嗜铁钩端螺旋杆菌菌株以亚铁为唯一能源进行化能自养，生长温度范围为10℃～50℃，最适合生长温度为～40℃，生长pH范围1.0～2.8，最适合生长pH为1.2～2.2，是中等高温浸出环境下的优势铁氧化菌种。
上述本发明的嗜酸铁氧化微生物复合菌剂中，优选的，所述嗜酸硫化芽孢杆菌菌株为保藏号CCTCC NO: M 2015006的嗜酸硫化芽孢杆菌，其命名为嗜酸硫化芽孢杆菌CS5(Sulfobacillus acidophilus CS5)，其于2015年1月5日被保藏于中国典型培养物保藏中心(地址位于中国湖 北武汉的武汉大学校内)。该嗜酸硫化芽孢杆菌菌株能够氧化亚铁或还原态硫，生长温度范围为15℃～50℃，最适温度为45℃～55℃，生长pH值范围1.0～2.8，最适合生长pH值为2.0，是中高温浸出环境下的优势铁/硫氧化菌种。
上述的各优选菌株是在特定含铁基本盐/营养培养基中依次经过铁能源氧化和温度梯度筛选富集后获得的。在特定含铁基本盐/营养培养基中经过铁能源氧化和温度梯度筛选富集，主要是指以亚铁能源和温度梯度(例如15℃、30℃和45℃)作为选择压力，筛选富集获得上述多种具有不同理化及代谢特征、且高效氧化亚铁的嗜酸微生物菌株(如嗜酸铁质菌菌株、耐冷嗜酸铁氧化菌菌株、嗜酸氧化亚铁硫杆菌菌株、嗜铁钩端螺旋杆菌菌株和嗜酸硫化芽孢杆菌菌株等)。更优选的，用于筛选富集培养的所述特定含铁基本盐/营养培养基中包含以下浓度的组分：(NH4)2SO4，2.5～3.5g/L；MgSO4·7H2O，0.3～0.6g/L；K2HPO4，0.3～0.7g/L；KCl，0.1～0.3g/L；Ca(NO3)2，0.01～0.05g/L；FeSO4·7H2O，20～60g/L；酵母粉提取物，0.1～0.6g/L。
上述本发明的嗜酸铁氧化微生物复合菌剂中，优选的，所述嗜酸铁氧化微生物复合菌剂中嗜酸铁质菌菌株、耐冷嗜酸铁氧化菌菌株、嗜酸氧化亚铁硫杆菌菌株、嗜铁钩端螺旋杆菌菌株和嗜酸硫化芽孢杆菌菌株是按2～4∶2～4∶1.5～2.5∶1.0～3∶1.5～2.0的菌浓数量比例共混后配制而成。各菌株制成复合菌剂前分别单独纯培养，达到各自对数生长后期后离心收集菌体，血球计数法显微镜检计数，然后按照前述优选菌浓数量比例混合形成嗜酸铁氧化微生物复合菌剂。
作为一个总的技术构思，本发明还提供一种上述嗜酸铁氧化微生物复合菌剂的制备方法，包括以下步骤：
将所述嗜酸铁氧化微生物复合菌剂中嗜酸铁质菌菌株、耐冷嗜酸铁氧化菌菌株、嗜酸氧化亚铁硫杆菌菌株、嗜铁钩端螺旋杆菌菌株和嗜酸硫化芽孢杆菌菌株置于特定含铁基本盐/营养培养基中依次经过温度梯度复配培养、耐受混合重金属梯度压力式驯化、温度循环梯度式驯化、亚铁氧化活性提高和耐受高铁驯化步骤，即配制得到嗜酸铁氧化微生物复合菌剂。
上述的制备方法中，所述温度梯度复配培养优选是指：将上述本发明筛选富集的嗜酸铁质菌CS1、耐冷嗜酸铁氧化菌CS12、嗜酸氧化亚铁硫杆菌CS9、嗜铁钩端螺旋杆菌CS13和嗜酸硫化芽孢杆菌CS5先分别于特定含铁基本盐/营养培养基中单独培养，达到各自对数生长后期后离心收集菌体，血球计数法显微镜检计数，然后优选按照菌浓数量2～4∶2～4∶1.5～2.5∶1.0～3∶1.5～2.0的比例混合形成复合菌群；再以亚铁作为关键能源，将按比例配制后的复合菌群分别于15℃～20℃、30℃～35℃和45℃～50℃三种温度梯度下培养，分别获得复合菌群I(15℃～20℃)、复合菌群II(30℃～45℃)和复合菌群III(45℃～50℃)。更优选 的，所述特定含铁基本盐/营养培养基中包含以下浓度的组分：(NH4)2SO4，2.5～3.5g/L；MgSO4·7H2O，0.3～0.6g/L；K2HPO4，0.3～0.7g/L；KCl，0.1～0.3g/L；Ca(NO3)2，0.01～0.05g/L；FeSO4·7H2O，20～60g/L；酵母粉提取物，0.1～0.6g/L。
上述的制备方法中，所述耐受混合重金属梯度压力式驯化优选是指将上述三种不同温度培养获得的三种高效铁氧化嗜酸微生物复合菌群I、II和III置于混合重金属(例如Cu、Zn、Cr、Ni、Fe等)浓度压力梯度为5～200mmol/L的溶液中逐步提高驯化。更优选的，每轮梯度驯化中，重金属浓度增加幅度为5～30mmol/L。
上述的制备方法中，所述温度循环梯度式驯化优选是指将经过耐受混合重金属梯度压力式驯化后获得的三种耐受重金属的嗜酸铁氧化微生物复合菌群，按菌浓数量比例约为1∶1∶1混合后，再于10℃～50℃温度范围内进行温度循环梯度驯化。更优选的，每个梯度采用的温度增幅为5℃，每一轮温度梯度的循环驯化次数优选3～5次，得到适应宽温度范围的嗜酸铁氧化微生物复合菌剂。
上述的制备方法中，所述亚铁氧化活性提高和耐受高铁驯化优选是指：利用连续培养方式，通过亚铁能源负荷提高和缩短水力停留时间，提高上述获得嗜酸铁氧化微生物复合菌剂的亚铁氧化活性和耐受高铁能力。其中，更优选的，FeSO4·7H2O的负荷可从30g/L逐渐增加至90g/L，水力停留时间则可由72～96h缩短至36～48h。
经过上述步骤，最终获得通用型高效浸提电镀污泥的嗜酸铁氧化微生物复合菌剂。
本发明的上述技术方案充分考查了生物法浸提电镀污泥工艺的实际情况，针对环境温度变化压力和污泥来源复杂性等影响生物浸提的关键性因素，提供了一种通用型、高效型的可用于浸提电镀污泥中重金属的嗜酸铁氧化微生物复合菌剂及其制备工艺。本发明提供的嗜酸铁氧化微生物复合菌剂(特别是优选出的五种菌株)中包含低温、常温和中度高温等不同培养类型和生理特性的微生物菌株，这些菌株的获得不仅是我们长期的实验研究和观察对比后筛选出的，而且这些菌株的组合相比其中的任何一种或两种都具有不可替代的显著的技术效果，这些菌株的功能优势互补和有机结合，不仅大大提高了本发明嗜酸铁氧化微生物复合菌剂的通用性和适应性，而且高效、经济地实现了电镀污泥中重金属的浸出和回收，大大缩短工艺周期，降低了湿法浸出工艺成本。
作为一个总的技术构思，本发明还提供一种上述的嗜酸铁氧化微生物复合菌剂的应用，利用所述的嗜酸铁氧化微生物复合菌剂浸提电镀污泥中的重金属。所述电镀污泥可以为含铜、镍、锌或铬等分质或综合高/低品位电镀污泥。更优选的，所述电镀污泥中同时含有重金属铜、镍、锌和铬。
与现有技术相比，本发明的优点在于：
1)本发明嗜酸铁氧化微生物复合菌剂的制备方法简单，成本低；
2)本发明所获得的嗜酸铁氧化微生物复合菌剂群落结构及功能相对完善，它易培养制备，能够高效浸提电镀污泥中的重金属，实现电镀污泥的无害化和资源化，同时保证浸出渣污泥达标排放，具有较好的经济和环境效益；
3)本发明所获得的嗜酸铁氧化微生物复合菌剂具有“处理对象的高适应性”，即适合处理含铜、镍、锌、铬等分质或综合的高/低品位电镀污泥；
4)本发明获得的嗜酸铁氧化微生物复合菌剂具有“应用温度的宽泛性”，即适合常年不同季节温度下的培养制备并可高效浸提电镀污泥中的重金属；
5)本发明获得的嗜酸铁氧化微生物复合菌剂具有“高效性”，即能够在短时间内实现电镀污泥中重金属的高效浸出。
总的来说，本发明为相关电镀行业或表面处理工业园提供了一种经济高效的、可用于电镀污泥生物法资源化回收的嗜酸铁氧化微生物复合菌剂；该嗜酸铁氧化微生物复合菌剂具有很强的通用性、高效性和经济性，在常年不同季节温度环境条件下，该复合菌剂能够高活性快速培养制备且能够高效浸提含铜、镍、锌、铬等分质或综合高/低品位电镀污泥中的重金属，解决了生物法实际应用中遇到的电镀污泥来源和环境温度等不稳定及生物浸提耗时长的难题，具有重要的意义。
生物材料保藏情况说明：
一株嗜酸铁质菌菌株，该菌株为保藏号CCTCC NO:M 2015017的嗜酸铁质菌菌株，其命名为嗜酸铁质菌CS1(Ferroplasma acidiphilum CS1)，其于2015年1月5日被保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)，地址位于中国湖北武汉的武汉大学校内。
一株耐冷嗜酸铁氧化菌菌株，该菌株为保藏号CCTCC NO:M 2015009的耐冷嗜酸铁氧化菌菌株，其命名为耐冷嗜酸铁氧化菌CS12(Acidithiobacillus ferrivorans CS12)，其于2015年1月5日被保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)，地址位于中国湖北武汉的武汉大学校内。
一株嗜酸氧化亚铁硫杆菌菌株，该菌株为保藏号CCTCC NO:M 2015007的嗜酸氧化亚铁硫杆菌菌株，其命名为嗜酸氧化亚铁硫杆菌CS9(Acidithiobacillus ferrooxidansCS9)，其于2015年1月5日被保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)，地址位于中国湖北武汉的武汉大学校内。
一株嗜铁钩端螺旋杆菌菌株，该菌株为保藏号CCTCC NO:M 2015010的嗜铁钩端螺旋杆菌菌株，其命名为嗜铁钩端螺旋杆菌CS13(Leptospirillum ferriphilum CS13)，其于2015年1月5日被保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)，地址位于中国湖北武汉的武汉大 学校内。
一株嗜酸硫化芽孢杆菌菌株，该菌株为保藏号CCTCC NO:M 2015006的嗜酸硫化芽孢杆菌菌株，其命名为嗜酸硫化芽孢杆菌CS5(Sulfobacillus acidophilus CS5)，其于2015年1月5日被保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)，地址位于中国湖北武汉的武汉大学校内。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例1中嗜酸铁氧化微生物复合菌剂培养制备菌剂过程中菌浓、亚铁及亚铁氧化率随时间变化。
图2为本发明实施例1中嗜酸铁氧化微生物复合菌剂浸提电镀污泥过程中Cu、Zn、Ni及Cr等浸出率随时间变化。
图3为本发明实施例2中获得的嗜酸铁氧化微生物复合菌剂于不同温度下培养制备过程中菌浓、亚铁及亚铁氧化率随时间变化。
图4为本发明实施例2中不同温度培养制备下的嗜酸铁氧化微生物复合菌剂浸提电镀污泥中重金属的浸提效果。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下文将结合说明书附图和较佳的实施例对本发明作更全面、细致地描述，但本发明的保护范围并不限于以下具体的实施例。
除非另有定义，下文中所使用的所有专业术语与本领域技术人员通常理解的含义相同。本文中所使用的专业术语只是为了描述具体实施例的目的，并不是旨在限制本发明的保护范围。
除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。
实施例：
一种本发明的嗜酸铁氧化微生物复合菌剂，该所述嗜酸铁氧化微生物复合菌剂的群落组成包含嗜酸铁质菌菌株、耐冷嗜酸铁氧化菌菌株、嗜酸氧化亚铁硫杆菌菌株、嗜铁钩端螺旋杆菌菌株和嗜酸硫化芽孢杆菌菌株。
本实施例上述的嗜酸铁氧化微生物复合菌剂中，具体选用的嗜酸铁质菌菌株为保藏号 CCTCC NO:M 2015017的嗜酸铁质菌CS1(Ferroplasma acidiphilum CS1)，其于2015年1月5日被保藏于中国典型培养物保藏中心；选用的耐冷嗜酸铁氧化菌为保藏号保藏号CCTCC NO:M 2015009的耐冷嗜酸铁氧化菌CS12(Acidithiobacillus ferrivorans CS12)，其于2015年1月5日被保藏于中国典型培养物保藏中心；选用的嗜酸氧化亚铁硫杆菌为保藏号CCTCC NO:M 2015007的嗜酸氧化亚铁硫杆菌CS9(Acidithiobacillus ferrooxidansCS9)，其于2015年1月5日被保藏于中国典型培养物保藏中心；选用的嗜铁钩端螺旋杆菌为CCTCC NO:M 2015010的嗜铁钩端螺旋杆菌CS13(Leptospirillum ferriphilum CS13)，其于2015年1月5日被保藏于中国典型培养物保藏中心；选用的嗜酸硫化芽孢杆菌为保藏号CCTCC NO: M 2015006的嗜酸硫化芽孢杆菌CS5(Sulfobacillus acidophilus CS5)，其于2015年1月5日被保藏于中国典型培养物保藏中心。
上述本实施例的嗜酸铁氧化微生物复合菌剂中，嗜酸铁质菌菌株、耐冷嗜酸铁氧化菌菌株、嗜酸氧化亚铁硫杆菌菌株、嗜铁钩端螺旋杆菌菌株和嗜酸硫化芽孢杆菌菌株是按2～4∶2～4∶1.5～2.5∶1.0～3∶1.5～2.0的菌浓数量比例共混后配制而成。
本实施例上述的嗜酸铁质菌CS1、耐冷嗜酸铁氧化菌CS12、嗜酸氧化亚铁硫杆菌CS9、嗜铁钩端螺旋杆菌CS13和嗜酸硫化芽孢杆菌CS5分别从不同环境中通过亚铁氧化和温度梯度筛选获得，在复配前先分别纯培养至各自对数生长后期，然后收集菌体，按照一定菌浓数量比例混合，再在特定含铁基本盐/营养培养基中依次经过温度梯度复配培养、耐受混合重金属梯度压力式驯化、温度循环梯度式驯化、亚铁氧化活性提高和耐受高铁驯化等步骤后获得最终的嗜酸铁氧化微生物复合菌剂。
本实施例的嗜酸铁氧化微生物复合菌剂的制备方法具体包括以下步骤：
1.筛选高效铁氧化嗜酸微生物
1.1菌源样品采集
我们分别从湖南某废铁矿坑、云南腾冲某温泉及江苏无锡某表面处理工业园等三地采集酸性含重金属的水样及周围表层土壤，于当地用0.2μm滤膜过滤水样，将含有微生物的滤纸和土样分别置于无菌塑料器皿中，4℃密封条件下保存，并于一周内进行下一步菌株筛选实验。
1.2亚铁氧化和温度梯度筛选嗜酸铁氧化微生物
用100mL无菌水洗脱滤纸上吸附的菌，然后与同一来源的土样(10～20g)混合，室温下振荡10min，取50mL上述混合液加于450mL新鲜灭菌的含铁基本盐/营养培养基中，调节初始pH至1.0～2.5，分别于15±5℃、30±5℃和45±5℃三种温度条件下，180rpm进行摇床培养至体系上清液变为红褐色，体系氧化还原电位≥550mV，亚铁氧化殆尽，此时获得第一代嗜酸铁氧化富集菌群培养液。
经过第一代富集培养后，将第一代富集获得的嗜酸铁氧化菌群培养液按照5％～20％的接种量接入到新鲜的含铁基本盐/营养培养基中，其他培养条件同第一代富集培养过程，恒温振荡培养至体系上清液变为红褐色，体系氧化还原电位≥550mV，亚铁氧化殆尽，此时获得第二代筛选富集的嗜酸铁氧化菌群培养液，菌浓约1×108～1×109cells/mL。
将上述第二代筛选富集获得的不同嗜酸铁氧化微生物菌液分别于含铁基本盐/营养培养基中进行梯度稀释分离纯化，获得多种不同温度条件下培养的嗜酸铁氧化菌株，其中不同温度下铁氧化能力最强的五株菌分别为嗜酸铁质菌CS1、耐冷嗜酸铁氧化菌CS12、嗜酸氧化亚铁硫杆菌CS9、嗜铁钩端螺旋杆菌CS13和嗜酸硫化芽孢杆菌CS5。
上述含铁基本盐/营养培养基的配制组成包括：(NH4)2SO4，2.5～3.5g/L；MgSO4·7H2O，0.3～0.6g/L；K2HPO4，0.3～0.7g/L；KCl，0.1～0.3g/L；Ca(NO3)2，0.01～0.05g/L；FeSO4·7H2O，20～60g/L；酵母粉提取物，0.1～0.6g/L。
2.温度梯度复合培养
将上述步骤1获得的五种嗜酸铁氧化菌株分别于含铁基本盐/营养培养基中纯培养，达到各自对数生长后期后离心收集菌体，血球计数法显微镜检计数，然后按照菌浓数量2～4∶2～4∶1.5～2.5∶1.0～3∶1.5～2.0比例混合形成复合菌群。然后将上述按比例配制的复合菌群分别于15℃～20℃、30℃～35℃和45℃～50℃三种温度梯度下培养，分别获得复合菌群I(15℃～20℃)、复合菌群II(30℃～45℃)和复合菌群III(45℃～50℃)。
3.耐受混合重金属梯度压力式驯化
首轮重金属驯化中，将上述复合菌群I(15℃～20℃)、复合菌群II(30℃～45℃)和复合菌群III(45℃～50℃)的菌液分别按照5％～20％接种量接入新鲜的含铁基本盐/营养培养基中，初始pH 1.0～2.5，Cu、Zn、Cr、Ni等重金属离子混合液初始驯化浓度设为5mmol/L，分别于各自复合培养的温度(15℃～20℃、30℃～45℃和45℃～50℃)、180rpm条件下培养至体系亚铁氧化完全，氧化还原电位600mV以上，获得第一代耐受混合重金属驯化的铁氧化嗜酸微生物复合菌液。
将上述获得的第一代驯化铁氧化嗜酸微生物菌液按5％～20％比例重新接入新鲜的含铁基本盐/营养培养基中，增加Cu、Zn、Cr、Ni等重金属离子混合液的浓度至20mmol/L，其他培养条件同上，培养至菌群生长进入对数中后期，此时体系中的亚铁氧化完全，菌浓约1×108～1×109cells/mL。
重复上述驯化步骤，但每进行新一轮耐受重金属驯化，重金属离子混合液浓度则相应提高，根据菌群生长情况重金属离子的提高幅度为5～30mmol/L，直至三种嗜酸铁氧化微生物复合菌群耐受200mmol/L的Cu、Zn、Cr、Ni等重金属离子混合液。
将获得的耐受200mmol/L重金属离子混合液的嗜酸铁氧化微生物复合菌群进行铁氧化能力提高培养。将上述获得的耐受200mmol/L重金属离子混合液的嗜酸铁氧化微生物菌液按5％～20％的接种量接入新鲜的含铁基本盐/营养培养基中，其中添加200mmol/L混合重金属，调节培养液初始pH至1.0～2.5，于各自复合培养温度(15℃～20℃、30℃～45℃和45℃～50℃)、180rpm条件下培养至菌群生长对数中后期，此时体系氧化还原电位≥600mV，亚铁氧化殆尽。经过3～5次传代培养后，在200mmol/L的混合重金属胁迫压力条件下，三种嗜酸铁氧化微生物复合菌群的亚铁氧化速率被提高，且铁完全氧化培养时间缩短至36～96h。
4.耐受温度循环梯度式驯化
将经上述步骤3后获得的耐受混合重金属的复合菌群I(15℃～20℃)、复合菌群II(30℃～45℃)和复合菌群III(45℃～50℃)按照菌浓等量混合，得到嗜酸铁氧化微生物复合菌液IV，重新复合后的嗜酸铁氧化微生物复合菌液IV按5％～20％的接种量接入新鲜的含铁基本盐/营养培养基中，其中添加200mmol/L的混合重金属，调节初始pH 1.0～2.5，起始于10℃低温条件下振荡培养至体系电位≥600mV，亚铁氧化完全，复合菌群处于对数生长中后期，菌浓约为菌浓约1×108～1×109cells/mL；重复前述驯化过程，每重复进行一次耐受温度驯化时，除了培养温度逐步提高至15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃和50℃外，其他培养条件同上，直至八次驯化过程全部完成，完成第一轮耐受温度的梯度循环式驯化。
重复上述第一轮温度的梯度循环式驯化过程3～4次，最终获得同时耐受重金属和温度梯度的嗜酸铁氧化微生物复合菌剂。
5.亚铁氧化活性提高和耐受高铁驯化
5.1序批式培养启动
将上述步骤4获得的耐受重金属和温度梯度的嗜酸铁氧化微生物复合菌剂接入3L恒温柱形搅拌槽中进行序批式培养，总装液量为2L，其中菌液与新鲜含铁基本盐/营养培养基的比例为1～2∶10，加入200mmol/L混合重金属，调节初始pH 1.0～2.5，在30℃±5℃、400～500rpm搅拌速度、10～20L/h充气强度条件下，培养至复合菌剂对数生长中后期，此时体系氧化还原电位≥600mV，亚铁氧化殆尽，菌浓约为1×108～1×109cells/mL。
重复上述步骤2～3次，此时获得稳定的嗜酸铁氧化微生物复合菌剂，且铁完全氧化时间缩短至36～96h。
5.2亚铁能源负荷提高连续培养驯化
序批式培养启动完成后，开始向上述步骤5.1中3L恒温柱形搅拌槽中以0.5～0.67L/天的流速从搅拌槽底部连续流加新鲜的含铁基本盐/营养培养基(pH 1.0～2.5，含有200mmo/L 混合重金属和不同浓度亚铁能源负荷)，同时等速从搅拌槽上部溢流出等量菌液，整个连续驯化体系水力停留时间为72～96h。初始FeSO4·7H2O能源负荷为30g/L，连续流加至体系运行稳定后24～48h，即体系亚铁氧化率恒定在90％以上；其他运行条件不变，提高FeSO4·7H2O能源负荷分别至35g/L、45g/L、55g/L、65g/L、75g/L、85g/L和90g/L，每提高一次FeSO4·7H2O能源负荷，均待系统运行稳定24～48h后，开始下一轮负荷提高驯化。经过连续负荷驯化后，嗜酸铁氧化微生物复合菌剂能够在72～96h内完成近90g/L FeSO4·7H2O的氧化，且耐受约10～18g/L的高铁浓度。
5.3缩短停留时间连续培养驯化
保持流入新鲜的含铁基本盐/营养培养基组成恒定不变(pH 1.0～2.5，FeSO4·7H2O 90g/L，混合重金属浓度200mmol/L等)；改变水力停留时间，即由96h逐步缩短至60h。每改变一次运行条件，水力停留时间缩短3～9h，待体系稳定(亚铁氧化率稳定在90％以上)后再运行24～48h，开始下一轮缩短停留时间驯化。经过连续驯化后，嗜酸铁氧化微生物复合菌剂铁氧化活性进一步提高，90％以上亚铁氧化时间缩短至36～60h。
6.嗜酸铁氧化微生物培养制备及保存备用
将经过上述5个步骤驯化最终所获得的耐受重金属和宽温度梯度且高效氧化亚铁的嗜酸铁氧化微生物复合菌剂按5％～25％的比例接入新鲜的含铁基本盐/营养培养基中，调控含铁基本盐/营养培养基的初始pH值为1.0～2.5，FeSO4·7H2O 60g/L，添加Cu、Zn、Cr、Ni等重金属混合液终浓度200mmol/L，培养过程控制温度为30℃±5℃，培养至体系菌剂进入对数生长后期，此时体系亚铁氧化完全，氧化还原电位ORP≥550mV，获得的嗜酸铁氧化微生物复合菌剂的菌浓(约1×108～1×109cells/mL)和活性均最高。该嗜酸铁氧化微生物复合菌剂可于4℃长期保存，为了保持菌剂的活性，定期0.5～1个月进行活化，再保存。
应用实施例1：
将本实施例上述的嗜酸铁氧化微生物复合菌剂进行应用，利用嗜酸铁氧化微生物复合菌剂浸提电镀污泥中的重金属。本实施例所用的电镀污泥来自湖南某电镀厂，外表呈现绿色，其中以含锌铬铁为主，铜镍次之，含水率约为65.41％。该电镀污泥干基主要组成金属元素及含量分别为：Fe 12.16％、Zn 4.4％、Cr 4.39％、Cu 1.01％和Ni 1.16％等。
采用本实施例的嗜酸铁氧化微生物复合菌剂浸提电镀污泥具体步骤包括：
(1)适应性预处理：将上述实施例最终获得的嗜酸铁氧化微生物复合菌剂在特定含铁基本盐/营养培养基中进行预浸提电镀污泥适应性预处理连续扩大培养；培养时的pH值为1.8±0.3，温度为30±5℃，特定含铁基本盐/营养培养基包括以下组分(NH4)2SO4，3g/L；MgSO4·7H2O，0.5g/L；K2HPO4，0.5g/L；KCl，0.1g/L；Ca(NO3)2，0.01g/L；FeSO4·7H2O，44.7g/L；酵母粉提取物，0.2g/L；在该混合体系中电镀污泥干重(干基含量)为2％～20％(w/v，即每升混合浆液总体积中电镀污泥干基含量为20-200g)；连续振荡培养后体系氧化还原电位≥600mV，微生物总浓度至少达到1×108～1×109cells/mL。
(2)重复预处理操作
重复上述步骤(1)的适应性预处理操作2～5次，获得稳定的耐受预处理电镀污泥特性的嗜酸铁氧化微生物复合菌剂。将获得的耐受预处理电镀污泥特性的嗜酸铁氧化微生物复合菌剂于室温下培养制备复合菌剂，其菌浓、亚铁浓度及亚铁氧化率随时间变化参见图1。
(3)浸提电镀污泥
将上述步骤(2)后获得的嗜酸铁氧化微生物复合菌剂与电镀污泥、pH为2±0.2的酸性水(用浓硫酸调节自来水pH至为2±0.2)或萃余液(萃余液为浸出液体系萃取金属后的剩余液，工业中水循环)混合得到混合料浆，然后开始进行搅拌浸出，浸出过程中采用空气压缩机在底部通气，连续搅拌浸出10h，完成浸提。混合料浆中嗜酸铁氧化微生物复合菌剂的接种量以体积分数计为10％(v/v)，污泥干基含量(干重)为20％(w/v)，浸出液pH值为1.0～2.5。
经最终检测，本实施例中不同温度条件下制备的复合菌剂对电镀污泥中Cu、Zn、Cr和Ni的浸出率均在90％以上(参见图2)。
应用实施例2：
将上述本实施例的嗜酸铁氧化微生物复合菌剂进行应用，利用嗜酸铁氧化微生物复合菌剂浸提电镀污泥中的重金属。本实施例所用的电镀污泥来自广东某电镀工业园，外表呈现墨绿色，其中以含铜镍铬等重金属为主，含水率约为73.2％％。该电镀污泥干基中主要组成金属元素成分包括：Cu 9.02％、Ni 5.72％、Cr 10.22％、Zn 1.12％和Fe 5.35％。
采用本实施例的嗜酸铁氧化微生物复合菌剂浸提电镀污泥具体步骤包括：
(1)适应性预处理：将上述实施例最终获得的嗜酸铁氧化微生物复合菌剂在特定含铁基本盐/营养培养基中进行预浸提电镀污泥适应性预处理连续扩大培养；培养时的pH值为1.8±0.3，温度为30±5℃，特定含铁基本盐/营养培养基包括以下组分(NH4)2SO4，3g/L；MgSO4·7H2O，0.5g/L；K2HPO4，0.5g/L；KCl，0.1g/L；Ca(NO3)2，0.01g/L；FeSO4·7H2O，44.7g/L；酵母粉提取物，0.2g/L；；在该混合体系中电镀污泥添加量为2％～20％(w/v)；连续振荡培养后体系氧化还原电位≥600mV，微生物总浓度至少达到1×108～1×109cells/mL。
(2)重复预处理操作
重复上述步骤(1)的适应性预处理操作2～5次，获得稳定的耐受预处理电镀污泥特性的嗜酸铁氧化微生物复合菌剂。
将上述获得的稳定的耐受预处理电镀污泥特性的嗜酸铁氧化微生物复合菌剂分别于低温(10℃～15℃)、常温(20℃～30℃)和中等高温(40℃～45℃)三种温度条件下培养制备复合菌剂，铁氧化菌浓、体系亚铁及氧化率随时间变化参见图3。其中低温(10℃～15℃)、常温(20℃～30℃)和中等高温(40℃～45℃)三种温度条件可代表一年四季不同季节环境温度变化，图3显示获得的复合菌剂能够耐受不同温度条件，且能高效快速制备。
(3)浸提电镀污泥
将上述步骤(2)后获得的三种不同温度条件下培养制备的嗜酸铁氧化微生物复合菌剂与电镀污泥、pH为2±0.2的酸性水(用浓硫酸调节自来水pH至为2±0.2)或萃余液(萃余液为浸出体系萃取金属后的剩余液，工业中水循环)混合得到混合料浆，然后开始进行搅拌浸出，浸出过程中采用空气压缩机在底部通气，连续搅拌浸出10h，完成浸提。混合料浆中嗜酸铁氧化微生物复合菌剂的接种量以体积分数计为20％(v/v)，污泥干基含量为15％(w/v)，浸出液pH值为1.0～2.5。
经最终检测，本实施例中不同温度条件下制备的复合菌剂对电镀污泥中Cu、Zn、Cr和Ni的浸出率基本都在90％以上(参见图4)。

Claims (5)

1. 一种嗜酸铁氧化微生物复合菌剂，其特征在于，所述嗜酸铁氧化微生物复合菌剂的群落组成包含嗜酸铁质菌（Ferroplasma acidiphilum）菌株、耐冷嗜酸铁氧化菌（Acidithiobacillus ferrivorans）菌株、嗜酸氧化亚铁硫杆菌（Acidithiobacillusferrooxidans）菌株、嗜铁钩端螺旋杆菌（Leptospirillum ferriphilum）菌株和嗜酸硫化芽孢杆菌（Sulfobacillus acidophilus）菌株；
所述嗜酸铁质菌菌株为保藏号CCTCC M 2015017的嗜酸铁质菌，其命名为嗜酸铁质菌CS1，其于2015年1月5日被保藏于中国典型培养物保藏中心；
所述耐冷嗜酸铁氧化菌菌株为保藏号CCTCC M 2015009的耐冷嗜酸铁氧化菌，其命名为耐冷嗜酸铁氧化菌CS12，其于2015年1月5日被保藏于中国典型培养物保藏中心；
所述嗜酸氧化亚铁硫杆菌菌株为保藏号CCTCC M 2015007的嗜酸氧化亚铁硫杆菌，其命名为嗜酸氧化亚铁硫杆菌CS9，其于2015年1月5日被保藏于中国典型培养物保藏中心；
所述嗜铁钩端螺旋杆菌菌株为保藏号CCTCC M 2015010的嗜铁钩端螺旋杆菌，其命名为嗜铁钩端螺旋杆菌CS13，其于2015年1月5日被保藏于中国典型培养物保藏中心；
所述嗜酸硫化芽孢杆菌菌株为保藏号CCTCC M 2015006的嗜酸硫化芽孢杆菌，其命名为嗜酸硫化芽孢杆菌CS5，其于2015年1月5日被保藏于中国典型培养物保藏中心。
2.根据权利要求1所述的嗜酸铁氧化微生物复合菌剂，其特征在于，所述嗜酸铁氧化微生物复合菌剂中嗜酸铁质菌菌株、耐冷嗜酸铁氧化菌菌株、嗜酸氧化亚铁硫杆菌菌株、嗜铁钩端螺旋杆菌菌株和嗜酸硫化芽孢杆菌菌株是按2～4∶2～4∶1.5～2.5∶1.0～3∶1.5～2.0的菌浓数量比例共混后配制而成。
3.一种如权利要求2所述的嗜酸铁氧化微生物复合菌剂的制备方法，包括以下步骤：将所述嗜酸铁氧化微生物复合菌剂中嗜酸铁质菌菌株、耐冷嗜酸铁氧化菌菌株、嗜酸氧化亚铁硫杆菌菌株、嗜铁钩端螺旋杆菌菌株和嗜酸硫化芽孢杆菌菌株置于特定含铁基本盐/营养培养基中依次经过温度梯度复配培养、耐受混合重金属梯度压力式驯化、温度循环梯度式驯化、亚铁氧化活性提高和耐受高铁驯化步骤，即配制得到嗜酸铁氧化微生物复合菌剂；
所述特定含铁基本盐/营养培养基中包含以下浓度的组分：(NH4)2SO4，2.5～3.5 g/L；MgSO4·7H2O，0.3～0.6 g/L；K2HPO4，0.3～0.7 g/L；KCl，0.1～0.3 g/L；Ca(NO3)2，0.01～0.05 g/L；FeSO4·7H2O，20～60 g/L；酵母粉提取物，0.1～0.6 g/L。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：
所述温度梯度复配培养包括以下操作：将所述嗜酸铁质菌菌株、耐冷嗜酸铁氧化菌菌株、嗜酸氧化亚铁硫杆菌菌株、嗜铁钩端螺旋杆菌菌株和嗜酸硫化芽孢杆菌菌株先分别于特定含铁基本盐/营养培养基中单独培养，达到各自对数生长后期后离心收集菌体，然后按照所述菌浓数量比例混合形成复合菌群；再将按比例配制后的复合菌群分别于不同温度梯度下培养，分别获得不同温度下的多个复合菌群；
所述耐受混合重金属梯度压力式驯化包括以下操作：将上述获得的不同温度下的多个复合菌群分别置于混合重金属浓度压力梯度为5～200 mmol/L的溶液中逐步提高驯化，每轮梯度驯化中，重金属浓度增加幅度为5～30 mmol/L；
所述温度循环梯度式驯化包含以下操作：将经过上述耐受混合重金属梯度压力式驯化后获得的耐受重金属嗜酸铁氧化微生物复合菌群按照菌浓数量等比例混合，再于10℃～50℃温度范围内进行温度循环梯度驯化，每一轮温度梯度采用的温度增幅为3℃～10℃，每一轮温度梯度的循环驯化次数为至少3次；得到适应宽温度范围的嗜酸铁氧化微生物复合菌剂；
所述亚铁氧化活性提高和耐受高铁驯化包括以下操作：利用连续培养方式，通过亚铁能源负荷提高和缩短水力停留时间，提高上述适应宽温度范围的嗜酸铁氧化微生物复合菌剂的亚铁氧化活性和耐受高铁能力；其中，FeSO4·7H2O的负荷可从30 g/L逐渐增加至90 g/L，水力停留时间则可由72～96 h缩短至36～48 h。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：
所述温度循环梯度式驯化中，每一轮温度梯度采用的温度增幅为5℃，每一轮温度梯度的循环驯化次数为3～5次。
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