JP2019505213A

JP2019505213A - ベクター

Info

Publication number: JP2019505213A
Application number: JP2018537662A
Authority: JP
Inventors: メラブコカイア
Original assignee: コンビジーンエービー
Priority date: 2016-02-12
Filing date: 2017-02-10
Publication date: 2019-02-28
Also published as: AU2017218583A1; RU2749479C1; CA3012276A1; CN109069669A; US11072804B2; EP3413925A1; JP2023022196A; US20190024116A1; AU2017218583B2; WO2017137585A1; KR20180105708A

Abstract

本発明は、神経ペプチドＹ（ＮＰＹ）コード配列と神経ペプチドＹ２受容体（ＮＰＹ２Ｒ）コード配列とを含む組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターに関する。本発明は、前記ベクターを含むＡＡＶ粒子であって、ベクターがアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシドタンパク質により封入される、ＡＡＶ粒子にさらに関する。また、哺乳動物のてんかん等の神経障害の予防または処置に使用するための、前記ＡＡＶ粒子を含む医薬組成物。【選択図】なし

Description

本発明は、特定のベクター要素と一緒にＮＰＹおよびその受容体Ｙ２（ＮＰＹ２Ｒ）をエンコードするある核酸配列を含むベクターに関する。さらに、本発明は、ＡＡＶ粒子を形成するアデノ随伴ウイルス血清型１、２および８からのカプシドタンパク質に封入された前記ベクターに関する。最後に、本発明は、哺乳動物のてんかん等の神経障害の処置のための薬剤の調製に使用される前記ベクターまたは前記ＡＡＶ粒子に関する。

世界保健機関（ＷＨＯ；ＷｏｒｌｄＨｅａｌｔｈＯｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ）によれば、中枢神経系に関係する障害は大きな社会経済的健康問題を構成し、現在利用可能な治療選択肢は不十分である。これらの障害は、てんかんおよびパーキンソン病を含むがこれらに限定されない。

てんかんは、世界で最も古くから認められている神経学的状態の一つであり、書面による記録は紀元前４０００年にさかのぼる。恐怖、誤解、差別、社会的汚名が、何世紀にもわたりてんかんを取り巻いている。この汚名は、今日多くの国々で続いており、障害をもつ人々やその家族の生活の質に影響を与えうる。世界中の約１％の人がてんかんを患っており、てんかんは世界で最も一般的な神経疾患の一つとなっている。

てんかん発作は、短時間でほとんど検出不可能なものから長期間の激しい震えまで変動しうる症状の発現である。てんかんでは、発作が繰り返される傾向があり、特定可能な根本的原因がないことが多い。

発作の発現は、同期した脳細胞群における過剰放電の結果である。脳の様々な部分が、このような放電の部位になりうる。この障害を患う１０人の対象中６人に影響を及ぼす最も一般的なタイプのてんかんは、特発性てんかんと呼ばれ、特定可能な原因はない。既知の原因を有するてんかんは、二次性てんかんまたは症候性てんかんと呼ばれる。二次性（または症候性）てんかんの原因には、出生前または周産期の傷害による脳損傷、脳奇形を伴う先天性異常または遺伝的状態、重度の頭部損傷、脳への酸素の量を制限する卒中、髄膜炎、脳炎、神経嚢虫症等の脳の感染、ある遺伝的症候群、または脳腫瘍を含む。

てんかん症例の最大７０％が日常の投薬で処置できると推定されている。しかし、この処置への反応が悪い人々は、処置されないままでいるか、てんかん手術や、深部脳刺激（ＤＢＳ；ｄｅｅｐｂｒａｉｎｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ）、迷走神経刺激（ＶＮＳ；ｖａｇｕｓｎｅｒｖｅｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ）、または食事等の非薬理学的処置に頼らざるを得ない可能性がある。

ＷＨＯによれば、てんかんは、早死にすることにより失われる生活年数と完全に健康ではない状態で生活する時間とを組み合わせた時間ベースの測定値である世界疾病負荷の０．７５％を占める。２０１２年には、てんかんが原因で、約２０６０万障害調整生存年数（ＤＡＬＹ；ｄｉｓａｂｉｌｉｔｙ‐ａｄｊｕｓｔｅｄｌｉｆｅｙｅａｒｓ）が失われた。てんかんは、医療の必要性、早期死亡および労働生産性の喪失の点で重要な経済的影響を有する。

したがって、てんかんを処置するための新たなアプローチおよびそれに続く新しい方法が必要とされている。特許文献１には、一つまたはいくつかの神経ペプチドがそれらの対応する受容体の一つ以上と一緒に神経系の細胞に過剰発現される、神経系の障害の処置のための有望なアプローチが記載される。神経伝達物質の放出の増加は、神経伝達物質の作用を媒介する受容体の代償的なダウンレギュレーションにつながることが多く、したがって対応する受容体の発現は、経時的な治療効果の制限を回避するのに役立つ。神経ペプチドおよび受容体過剰発現のコンセプトを用いる改良されたアプローチは、新たなてんかんの処置に、特に現在の薬品処置アプローチが所望の治療効果につながらないタイプのてんかんである薬剤抵抗性てんかんの処置に有用であろう。

欧州特許出願公開第２０４６３９４（Ａ１）号

したがって、本発明の態様は、神経ペプチドＹ（ＮＰＹ；ｎｅｕｒｏｐｅｐｔｉｄｅＹ）コード配列と神経ペプチドＹ２受容体（ＰＹ２Ｒ；ｎｅｕｒｏｐｅｐｔｉｄｅＹ２ｒｅｃｅｐｔｏｒ）コード配列とを含む組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ；ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔａｄｅｎｏ‐ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｖｉｒａｌ）ベクターを提供することにより、好ましくは、以上に特定された当技術の欠陥および欠点の一つ以上を単独でまたは任意の組み合わせにおいて緩和、軽減または除去し、少なくとも上述の問題を解決することを目的とする。

本発明の一態様によれば、ベクターは、ＡＡＶ２逆方向末端反復配列（ＩＴＲ；ＩｎｖｅｒｔｅｄＴｅｒｍｉｎａｌＲｅｐｅａｔ）、ハイブリッドサイトメガロウイルスエンハンサー／ニワトリβ‐アクチンＣＡＧプロモーター（ＣＡＧ）、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ；ｉｎｔｅｒｎａｌｒｉｂｏｓｏｍｅｅｎｔｒｙｓｉｔｅ）、ウッドチャック肝炎翻訳後調節要素（ＷＰＲＥ；ｗｏｏｄｃｈｕｃｋｈｅｐａｔｉｔｉｓｐｏｓｔ‐ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌｒｅｇｕｌａｔｏｒｙｅｌｅｍｅｎｔ）、および／またはウシ成長ホルモンポリアデニル化（ｂＧＨ‐ｐｏｌｙＡ；ｂｏｖｉｎｅｇｒｏｗｔｈｈｏｒｍｏｎｅｐｏｌｙａｄｅｎｙｌａｔｉｏｎ）シグナル配列の機能的要素の少なくとも一つ、好ましくは全てをさらに含む。

本発明の一態様では、ＡＡＶ粒子は前記ベクターを含み、ベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ；ａｄｅｎｏ‐ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｖｉｒｕｓ）カプシドタンパク質により封入される。

本発明のさらに別の態様によれば、医薬組成物は、哺乳動物のてんかんまたはパーキンソン病等の神経障害の予防、抑制または処置用の前記ＡＡＶ粒子を含む。

本発明の一態様では、対象の神経障害を処置、抑制または改善するための方法は、てんかんまたはパーキンソン病等の神経障害を患う哺乳動物またはヒト対象等の対象の中枢神経系の細胞に、薬学的に有効な量の前記組成物を投与するステップを含む。

本発明の別の態様によれば、ＮＰＹおよびＹ２ゲノムの哺乳動物細胞への送達の方法は、前記ＡＡＶ粒子を細胞に導入するステップを含む。さらに別の実施形態では、ＮＰＹおよびＹ２ゲノムを哺乳動物またはヒト対象等の対象に投与する方法は、対象に前記細胞を投与するステップを含む。

本発明の一態様では、ＮＰＹおよびＹ２ゲノムの対象への送達の方法は、対象における哺乳動物細胞に前記ＡＡＶ粒子を投与するステップであって、ウイルス粒子が対象の海馬に投与される、ステップを含む。

本発明の別の態様によれば、ＮＰＹが治療効果を有するかまたはＮＰＹ欠乏により引き起こされる疾患を低減する方法であって、疾患はてんかんまたはパーキンソン病より選択される方法は、神経障害を患う対象の中枢神経系の細胞に、薬学的に有効な量の前記組成物を投与するステップを含む。

本発明のさらに別の態様によれば、例えばＥＥＧおよび／またはてんかんもしくはパーキンソン病の臨床診断等の臨床評価または診断検査によりＮＰＹ欠乏を有するものとして選択された対象等のＮＰＹを必要とする対象にＮＰＹを提供する方法は、ＮＰＹ欠乏を有する対象等のＮＰＹを必要とする対象を選択するステップと、前記対象に薬学的に有効な量の前記組成物を提供するステップとを含む。

本発明の他の態様は、本出願の特許請求の範囲に見られる代替物にも関する。

本発明に可能なこれらおよびその他の態様、特徴および利点は、添付の図面を参照した本発明の実施形態の以下の説明から明らかになり、解明されるであろう。

本明細書に記載の実施形態のいくつかで使用されるベクターの概略図であり、図１Ａは、神経ペプチドＹ（ＮＰＹ）および神経ペプチド受容体２（ＮＰＹ２Ｒ）の導入遺伝子順序が、ＮＰＹがＮＰＹ２Ｒの上流にあるものであり、図１Ｂは、神経ペプチドＹ（ＮＰＹ）および神経ペプチド受容体２（ＮＰＹ２Ｒ）の導入遺伝子順序が、ＮＰＹ２ＲがＮＰＹの上流にあるものである。ｄｄＰＣＲによるトランスフェクションされたＨＥＫ２９３細胞における導入遺伝子発現をまとめたグラフである。ＮＰＹおよびＮＰＹ２Ｒ標的配列の数がｄｄＰＣＲにより測定された。対照として、非処置細胞またはＮＰＹおよびＮＰＹ２Ｒをエンコードする配列（ＩＲＥＳ）を含まないＡＡＶ発現プラスミドを使用する。対応スチューデントｔ検定、ｔ_３＝３．９２７、^＊Ｐ＝０．０２９４。データポイント／バーは、平均+ＳＥＭを表す（処置当たりｎ＝４）。ラットからの海馬スライスにおけるＮＰＹ発現を示したグラフである。片側ＡＡＶベクター処置の三週間後の背側海馬のＣＡ１領域のＮＰＹレベル。観察されたＮＰＹ陽性免疫蛍光シグナルに対応してＮＰＹレベルが評価された：１（内因性レベルに対応するＮＰＹレベル）、２（内因性レベルを上回る低いＮＰＹ発現）、３（内因性レベルを上回る中程度のＮＰＹ発現）、および４（内因性レベルを上回る高いＮＰＹ発現）。データは平均値±ｓ．ｅ．ｍとして示し、Ｍａｎｎ‐ＷｈｉｔｎｅｙＵ検定を用いて分析した。^＊未処置ナイーブ対照動物と比較してＰ＜０．０５。片側ＡＡＶ‐ＮＰＹ／Ｙ２ベクター処置の三週間後の背側海馬のＮＰＹ発現を示した画像である。ＤＡＢ染色が濃くなるほどＮＰＹ様免疫反応レベルが高くなる。ＡＡＶ‐Ｙ２／ＮＰＹベクターで処置したラット（図示せず）は、図に見られる発現の９〜１７％に対応するＮＰＹ発現を有した。ラットからの海馬スライスにおけるＮＰＹ２Ｒの機能性を示し、５Ａは、片側ＡＡＶベクター処置の三週間後の背側海馬のＣＡ１領域の機能的ＮＰＹ２Ｒ結合のレベルを示したグラフである。データは平均値±ｓ．ｅ．ｍとして示し、独立両側スチューデントｔ検定を用いて分析した。未処置ナイーブ対照動物と比較して^＊はＰ＜０．０５、^＊＊＊はＰ＜０．００１。５Ｂは、Ａに示される機能的ＮＰＹ２Ｒ結合の代表的な画像である。ラットからの海馬スライスのＮＰＹ２Ｒ発現を示し、６Ａは、片側ＡＡＶベクター処置の三週間後の背側海馬におけるＮＰＹ２Ｒ結合のレベルを示すグラフである。海馬ＣＡ１領域のＹ２受容体結合を評価し、Ｙ２受容体シグナルに対応する値を与えた：１（内因性レベルに対応するＹ２受容体発現）、２（内因性レベルを上回る低いＹ２受容体発現）、３（内因性レベルを上回る中程度のＹ２受容体発現）、および４（内因性レベルを上回る高いＹ２受容体発現）。データは平均値±ｓ．ｅ．ｍとして示し、Ｍａｎｎ‐ＷｈｉｔｎｅｙＵ検定を用いて分析した。^＊は未処置ナイーブ対照動物と比較してＰ＜０．０５。６Ｂは、６Ａに示される機能的ＮＰＹ２Ｒ結合の代表的な画像である。ＡＡＶ誘導性導入遺伝子過剰発現のレベルとの関係における単回カイニン酸注射（ｓ．ｃ．）後の２時間の観察中の発作の発症を示したグラフである。図７Ａは、発作の発症とＡＡＶ誘導性ＮＰＹ導入遺伝子過剰発現との間の関係を示す。対照：内因性レベルに対応するＮＰＹレベル（図３の値１に対応する）。低：低いＮＰＹ導入遺伝子発現レベル（図３の値２に対応する）。高：高いＮＰＹ導入遺伝子発現レベル（図３の値３〜４に対応する）。ａ）最初の運動発作（ＭＳ；ｍｏｔｏｒｓｅｉｚｕｒｅ）までの潜伏時間、ｂ）てんかん重積状態（ＳＥ；ｓｔａｔｕｓｅｐｉｌｅｐｔｉｃｕｓ）までの潜伏時間、およびｃ）発作の時間はいずれも、内因性レベルに等しいＮＰＹ発現を有するラットと比較して、高い導入遺伝子ＮＰＹ発現を有する処置ラットにおいて有意に異なっており、抗発作効果が示された。ｄ）発作回数はいずれのカテゴリーにおいても影響がなかった。図７Ｂは、発作の発症とＡＡＶ誘導性ＮＰＹ２Ｒ（Ｙ２）導入遺伝子過剰発現との間の関係を示す。対照：内因性レベルに対応するＮＰＹ２Ｒレベル（図３の値１に対応する）、低：低いＮＰＹ２Ｒ導入遺伝子発現レベル（図３の値２に対応する）、高：高いＮＰＹ２Ｒ導入遺伝子発現レベル（図３の値３〜４に対応する）。ａ）最初の運動発作（ＭＳ）までの潜伏時間、ｂ）てんかん重積状態（ＳＥ）までの潜伏時間、ｃ）発作の時間、およびｄ）発作回数は、いずれのＮＰＹ２Ｒ発現カテゴリーにおいても有意に変化しなかった。しかし、高ＮＰＹ２Ｒ発現カテゴリーでは特にｃ）発作の時間の減少の強い傾向が観察された。データは平均値±ｓ．ｅ．ｍとして示し、有意一方向ＡＮＯＶＡの後、Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ多重比較事後検定を用いて分析した。^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊Ｐ＜０．０１。ＫＡ誘発発作に対する両側海馬内ＡＡＶベクター注射の効果を示す。図８Ａは、ＫＡ誘発発作に対する両側海馬内ＡＡＶ１ベクター注射の効果を示す。ａ）最初の運動発作までの潜伏時間およびｄ）発作の合計回数は、対照（ＡＡＶ１空）と比較して、ＡＡＶ１ベクター媒介性ＮＰＹおよびＹ２過剰発現の後に影響がなかった。ｂ）てんかん重積状態（ＳＥ）までの潜伏期間およびｃ）発作の合計時間はいずれもＡＡＶ１‐ＮＰＹ／Ｙ２処置後に対照（ＡＡＶ１空）と比較して有意に減少したが、ＡＡＶ１‐Ｙ２／ＮＰＹには有意な効果がなかった。データは平均±ＳＥＭである（各群でｎ＝７〜８）。^＊対照（ＡＡＶ１空）に対してＰ＜０．０５、有意一方向ＡＮＯＶＡの後、Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ多重比較事後検定。図８Ｂは、ＫＡ誘発発作に対する両側海馬ＡＡＶ２ベクター注射の効果を示す。ＡＡＶ２ベクター媒介性ＮＰＹおよびＹ２過剰発現後にＫＡ誘発発作に対する効果は観察されなかった。これには、ａ）最初の運動発作までの潜伏時間、ｂ）てんかん重積状態（ＳＥ）までの潜伏時間、ｃ）発作の合計時間、およびｄ）発作の合計回数の観察が含まれた。データは平均±ＳＥＭである（各群でｎ＝８）。有意一方向ＡＮＯＶＡの後、Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ多重比較事後検定。図８Ｃは、ＫＡ誘発発作に対する両側海馬ＡＡＶ８ベクター注射の効果を示す。ＡＡＶ８ベクター媒介性ＮＰＹおよびＹ２過剰発現後にＫＡ誘発発作に対する効果は観察されなかった。これには、ａ）最初の運動発作までの潜伏時間、ｂ）てんかん重積状態（ＳＥ）までの潜伏時間、ｃ）発作の合計時間、およびｄ）発作の合計回数の観察が含まれた。データは平均±ＳＥＭである（各群でｎ＝８〜１２）。有意一方向ＡＮＯＶＡの後、Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ多重比較事後検定。ハロペリドール誘発性のパーキンソン病様症状のカタレプシーにおける、マウスの両側線条体内ＡＡＶ１‐ＮＰＹ／Ｙ２またはＡＡＶ空（対照）ベクター注射の効果を示す。Ａ）ＡＡＶ１‐ＮＰＹ／Ｙ２ベクターによる処置は、ＡＡＶ１空と比較して、カタレプシー状態が起きている時間の有意な減少を誘導した。データは平均値±ｓ．ｅ．ｍとして示し、双方向反復測定ＡＮＯＶＡを用いて分析した。^＊Ｐ＜０．０５は、ＡＡＶ１空ベクター処置とＡＡＶ１‐ＮＰＹ／Ｙ２ベクター処置との間で全体として有意な処置効果を示す。Ｂ）ＡＡＶ１‐ＮＰＹ／Ｙ２ベクターでの処置は、ＡＡＶ１空と比較して、１５分間隔で観察したカタレプシー状態が起きている平均時間の有意な減少を誘導した。データは平均値±ｓ．ｅ．ｍとして示し、二方向スチューデントｔ検定を用いて分析した。^＊Ｐ＜０．０５。

以下の説明は、遺伝子療法のためのＡＡＶベクターに、特に哺乳動物のてんかん等の神経障害の処置のための前記ベクターのＡＡＶ粒子に適用可能な本発明の実施形態に焦点を当てる。

神経障害には、脳、脊髄および他の神経を含むがこれらに限定されない神経系の障害の大きな群、とりわけ構造的、生化学的および／またはシグナル伝達異常が含まれる。神経障害は、ヒトに限定されず、本明細書において「対象」と呼ばれるウマ、イヌおよびネコなどの他の哺乳動物にも見られる。例えば、一般的なイヌの集団におけるイヌてんかん発症率は、０．５％〜５．７％の間であると推定される。

神経ペプチドＹ（ＮＰＹ）は、３６アミノ酸長のペプチド神経伝達物質であり、哺乳動物の中枢神経系において最も豊富に発現されるものの一つである。ＮＰＹは、アルツハイマー病（Ｒｏｓｅｅｔａｌ，２００９）、ハンチントン病、およびパーキンソン病等の神経変性疾患の動物モデルにおいて神経保護を及ぼすことが示されている。ＮＰＹは、ラットの海馬スライスにおいてシャッファー側枝ＣＡ１シナプスの興奮を減少させることが最初に示され、続いてシナプス前のグルタミン酸放出のＹ２受容体依存性抑制に関与することが示されている。グルタミン酸は、脳の主要な興奮性神経伝達物質であり、したがって発作活動下に見られる開始、拡散、および無秩序なシナプス伝達の原因となる。一貫して、ＮＰＹ欠乏変異マウスは発作感受性がより高く、ＮＰＹの脳室内投与は、ラットの実験発作モデルにおいてｉｎｖｉｖｏで抗てんかん様効果を及ぼす。重要なことに、ＮＰＹは、ヒトのてんかん性海馬における興奮性シナプス伝達も抑制する（Ｐａｔｒｙｌｏｅｔａｌ．，１９９９；Ｌｅｄｒｉｅｔａｌ．，２０１５）。海馬では、ＮＰＹの抗てんかん効果は、主にＹ２またはＹ５受容体への結合を介して媒介され（Ｗｏｌｄｂｙｅｅｔａｌ．，１９９７，２００５；ＥｌＢａｈｈｅｔａｌ．，２００５；Ｂｅｎｍａａｍａｒｅｔａｌ．，２００５）、一方でＹ１受容体の活性化は発作を促進する（Ｂｅｎｍａａｍａｒｅｔａｌ．，２００３）。

ＮＰＹは、その抗てんかん効果により、標的化遺伝子療法に応用されている。したがって、ＮＰＹのｒＡＡＶ媒介性海馬過剰発現は、ラットにおける刺激誘発性急性発作に対して、およびてんかん重積状態の発作の三ヵ月後の自発発作に対して、抑制効果を及ぼす。異なるＮＰＹ受容体サブタイプに特異的な関与を利用するために、単独のまたはＮＰＹと組み合わせたＹ１、Ｙ２、またはＹ５受容体の過剰発現による遺伝子療法も行われている。したがって、ＮＰＹおよびＹ２またはＹ５を組み合わせた海馬過剰発現は、ＮＰＹまたは受容体の単独過剰発現と比較して、ラットにおける刺激誘発性急性発作に対して優れた発作抑制効果があった（Ｗｏｌｄｂｙｅｅｔａｌ．，２０１０；Ｇｏｔｚｓｃｈｅｅｔａｌ．，２０１２）。

対照的に、Ｙ１受容体の海馬過剰発現は、後の研究により予測されるように、発作促進効果につながる（Ｂｅｎｍａａｍａｒｅｔａｌ．，２００３；Ｏｌｅｓｅｎｅｔａｌ．，２０１２）。類似のアプローチにおいて、Ｙ２選択性アゴニストＮＰＹ１３‐３６のｒＡＡＶベクター媒介性過剰発現も、抗てんかん効果を及ぼした（Ｆｏｔｉｅｔａｌ．，２００７）。その後、ＮＰＹおよびＹ２受容体のｒＡＡＶベクター媒介性過剰発現の抗てんかん効果のトランスレーショナルな価値は、臨床的に関連するラットの長期慢性てんかんモデルで試験されるとさらなる支持を得ている（Ｌｅｄｒｉｅｔａｌ．，２０１６）。

本明細書には、てんかんおよび／またはパーキンソン病を必要な対象において処置または抑制するためにＡＡＶベクターを利用する遺伝子療法のいくつかのアプローチが記載される。さらに、ＡＡＶベクターは現在、神経疾患の処置における治療用導入遺伝子の送達に安全に使用できると考えられている（ＭｃＣｏｗｎ，２０１１；Ｂａｒｔｕｓｅｔａｌ．，２０１４）。しかし、治療用導入遺伝子を安全に発現するのに有効な組み換えウイルスベクターの開発は、いくつかの障害に直面しており、これがヒト遺伝子療法での広範な使用に存在する障害である。したがって、ｒＡＡＶベクターを含む新たな遺伝子療法の設計は、特定の組織および遺伝子療法標的のために高度にカスタマイズされた独特な構築物を創出する多くの異なる要素の慎重な選択を伴う。

単一のｒＡＡＶによりエンコードされるＮＰＹおよびＹ２受容体の過剰発現を含む新規な遺伝子療法は、本明細書に記載のベクターの配置および機能的要素の特定の選択（例えば構築物における遺伝子要素の順序および／またはある遺伝子要素間の距離）を考慮すれば、特定のＡＡＶ血清型のカプシドタンパク質とともに使用されたときに効率的なｉｎｖｉｖｏ発現を生成することが予想された。以下に提示する開示は、てんかんもしくはパーキンソン病またはこれらに関連する発作活動等の疾病を処置または改善する薬剤を必要とする対象のてんかんおよび／またはパーキンソン病を処置および／または抑制するための、これらの組成物ならびにこれらの組成物を作製および使用する方法をさらに詳細に記載する。

ｒＡＡＶＮＰＹおよびＮＰＹ２Ｒベクター
同じベクター中にＮＰＹおよびＮＰＹ２Ｒコード配列を有することにより、ＮＰＹ２ＲおよびＮＰＹが相同的に拡散され、エフェクター分子ＮＰＹおよびその標的の発作抑制性受容体ＮＰＹ２Ｒの発現の近接性が確保される。さらに、同じベクター中にＮＰＹおよびＮＰＹ２Ｒコード配列を有することにより、一つの細胞におけるＮＰＹおよびＮＰＹ２Ｒのゲノム挿入数を相同とすることができ、挿入されるＮＰＹおよびＮＰＹ２Ｒ遺伝子の比率の制御が可能になる。

したがって、第一実施形態では、組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターは、神経ペプチドＹ（ＮＰＹ；配列番号１５参照）コード配列と神経ペプチドＹ２受容体（ＮＰＹ２Ｒ；配列番号１６参照）コード配列とを含む。

ベクター中の神経ペプチドＹ（ＮＰＹ）コード配列は、配列番号１に対応する配列を有するか、または配列番号１と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性等、少なくとも９０％の配列同一性（％ＳＩ）を共有しうる。神経ペプチドＹ（ＮＰＹ）コード配列は、機能的神経ペプチドＹをエンコードする限り、例えば分子がその受容体に結合できる限り、短縮型であってもよい。短縮型配列は、（２９４個中）２６５個、２７５個、２８５個、２９０個等、少なくとも２５５個の塩基を含み、配列番号１と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性等、少なくとも９０％の配列同一性（％ＳＩ）を共有し、機能的神経ペプチドＹをエンコードしうる、例えば分子がその受容体に結合できる。

ベクター中の神経ペプチドＹ２受容体（ＮＰＹ２Ｒ）コード配列は、配列番号２に対応する配列を有するか、または配列番号２と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性等、少なくとも９０％の配列同一性（％ＳＩ）を共有しうる。神経ペプチドＹ２受容体（ＮＰＹ２Ｒ）コード配列は、機能的神経ペプチドＹ２受容体である限り、例えば分子がそのリガンドに結合できる限り、短縮型であってもよい。短縮型配列は、（１１４６個中）１０００個、１１１５個、１１３０個、１１４０個等、少なくとも９７５個の塩基を含み、配列番号２と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性等、少なくとも９０％の配列同一性（％ＳＩ）を共有し、機能的神経ペプチドＹ２受容体をエンコードしうる、例えば分子がそのリガンドに結合できる。

受容体の存在量は組織特異的発現の一因子であるが、ＡＡＶベクターの他の要素が組織特異的発現に影響しうる。以下に記載するように、導入遺伝子の配置、すなわちベクター中のＮＰＹおよびＮＰＹ２Ｒ遺伝子の順序、ならびに／あるいは、ＮＰＹおよび／またはＮＰＹ２Ｒをエンコードする遺伝子からのプロモーター要素および／またはエンハンサー要素に対する距離の制御により、ベクター設計においてさらなる発現制御が与えられる。内因性遺伝子プロモーターにより生じるまたはプロモーター要素またはエンハンサー要素からの転写干渉は、遺伝子座での導入遺伝子発現に影響する。したがってベクターは、改変を欠く従来のベクター設計と比較して選択されたベクターのプロモーター要素および／またはエンハンサー要素に関して導入遺伝子発現を向上させるように、改変されている。第一実施形態では、ベクター中のＮＰＹおよびＮＰＹ２Ｒをエンコードする遺伝子の導入遺伝子配置は、プロモーターへの近接性の点でＮＰＹをエンコードする遺伝子がＮＰＹ２Ｒをエンコードする遺伝子に先行するものである（例えばＮＰＹをエンコードする遺伝子は、ＮＰＹ２Ｒをエンコードする遺伝子よりもプロモーターに近接するように、ベクター上のＮＰＹ２Ｒをエンコードする遺伝子の上流に提示される）。前記神経ペプチドＹ（ＮＰＹ）をエンコードする配列は、配列番号１に対応する配列、または前記配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性等、少なくとも９０％の配列同一性（％ＳＩ）を有する配列を有しうる。前記神経ペプチドＹ２受容体（ＮＰＹ２Ｒ）をエンコードする配列は、配列番号２に対応する配列、または前記配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％等、少なくとも９０％の配列同一性（％ＳＩ）を有する配列を有しうる。遺伝子発現を通じて、神経ペプチドＹ（ＮＰＹ）コード配列がプロ神経ペプチドＹプレプロタンパク質（配列番号１５）の合成において用いられ、神経ペプチドＹ２受容体（ＮＰＹ２Ｒ）コード配列が神経ペプチドＹ受容体２型（配列番号１６）の合成において用いられる。当業者に知られるように、代替的配列が同じペプチド配列をエンコードすることも可能である。したがって、組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターは、配列番号１５によるタンパク質をエンコードする配列、または前記配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性等、少なくとも９０％の配列同一性（％ＳＩ）を有する配列、および、配列番号１６によるタンパク質をコードする配列、または前記配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性等、少なくとも９０％の配列同一性（％ＳＩ）を有する配列も含みうる。ＮＰＹをエンコードする遺伝子は、前記プロモーターと並置されうる。ＮＰＹをエンコードする遺伝子は、プロモーター領域の末端から５〜６０、５〜５０、５〜４０、５〜３０、５〜２０、５〜１５または５〜１０ヌクレオチド以内で開始しうる（例えばＮＰＹをエンコードする遺伝子は、プロモーター領域の末端から５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、または６０ヌクレオチドで開始し、またはＮＰＹをエンコードする遺伝子は、プロモーターから前述のヌクレオチド数の位置のうちの任意の二つにより定義される範囲内で開始する）。プロモーターは、サイトメガロウイルスエンハンサー／ニワトリβ‐アクチン（ＣＡＧ）プロモーターでありうる。ベクター中のＣＡＧプロモーター配列は、配列番号４と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性等、少なくとも９０％の配列同一性（％ＳＩ）を共有しうる。ＣＡＧプロモーター配列は、機能的である（例えば遺伝子の発現を誘導する）限り短縮型でもよく、短縮型ＣＡＧプロモーター配列は、（９３６個中）８７５個、９００個、９２５個、９３５個等、少なくとも８５０個の塩基を含み、配列番号４と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性等、少なくとも９０％の配列同一性（％ＳＩ）を共有し、前記プロモーターに作動可能に連結された遺伝子の発現を誘導しうる。ＣＡＧプロモーターは、配列番号４に対応する配列、または配列番号４と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性等、少なくとも９０％の配列同一性（％ＳＩ）を有する配列を有しうる。ＩＲＥＳ配列は、ベクター中のＮＰＹおよびＮＰＹ２Ｒをエンコードする遺伝子の間に配置されうる。ＩＲＥＳ配列は、ＮＰＹをエンコードする遺伝子の末端から５〜５０、５〜４０、５〜３０、５〜２０、５〜１５または５〜１０ヌクレオチド以内で開始しうる（例えば、ＩＲＥＳ配列は、ＮＰＹをエンコードする遺伝子末端から５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０ヌクレオチドで開始し、またはＩＲＥＳ配列は、ＮＰＹをエンコードする配列から前述のヌクレオチド数の位置のうちの任意の二つにより定義される範囲内で開始する）。ＩＲＥＳ配列は、ＮＰＹ２Ｒをエンコードする遺伝子の開始から５〜５０、５〜４０、５〜３０、５〜２０、５〜１５または５〜１０ヌクレオチド以内で終了しうる（例えば、ＩＲＥＳ配列は、ＮＰＹ２Ｒをエンコードする遺伝子の開始から５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０ヌクレオチドで終了し、またはＩＲＥＳ配列は、ＮＰＹ２Ｒをエンコードする配列の開始から前述のヌクレオチド数の位置のうちの任意の二つにより定義される範囲内で終了する）。ＩＲＥＳ配列は、Ａ７ＥＭＣＶＩＲＥＳ配列でありうる。ベクター中のＡ７ＥＭＣＶＩＲＥＳ配列は、配列番号３と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性等、少なくとも９０％の配列同一性（％ＳＩ）を共有しうる。Ａ７ＥＭＣＶＩＲＥＳ配列は、機能的である（例えば遺伝子発現を誘導する）限り短縮型でもよく、短縮型Ａ７ＥＭＣＶＩＲＥＳ配列は、（５８２個中）少なくとも５２５個、５４５個、５６０個、５７０個、または５７５個の塩基を含み、配列番号３と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性等、少なくとも９０％の配列同一性（％ＳＩ）を共有しうる。ＩＲＥＳは、配列番号３に対応する配列、または配列番号３と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性等、少なくとも９０％の配列同一性（％ＳＩ）を有する配列を有しうる。ベクター中のＮＰＹおよびＮＰＹ２Ｒをエンコードする遺伝子の下流にウッドチャック肝炎転写後調節要素（ＷＰＲＥ）が配置されることができ、任意にＷＰＲＥは、ＮＰＹ２Ｒをエンコードする遺伝子の近位にあり、および／またはＮＰＹ２Ｒをエンコードする遺伝子に並置される。ＷＰＲＥ配列は、ベクター中のＮＰＹ２Ｒをエンコードする遺伝子の下流に配置されうる。ＷＰＲＥ配列は、ＮＰＹ２Ｒをエンコードする遺伝子の末端から５〜８０、５〜７０、５〜６０、５〜５０、５〜４０、５〜３０、５〜２０、５〜１５または５〜１０ヌクレオチド以内で開始しうる（例えば、ＷＰＲＥ配列は、ＮＰＹ２Ｒをエンコードする遺伝子の末端から５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、または８０ヌクレオチドで開始し、またはＷＰＲＥ配列は、ＮＰＹ２Ｒをエンコードする配列から前述のヌクレオチド数の位置のうちの任意の二つにより定義される範囲内で開始する）。ベクター中のＷＰＲＥ配列は、配列番号５と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性等、少なくとも９０％の配列同一性（％ＳＩ）を共有しうる。この配列は、ウッドチャックＢ型肝炎ウイルス（ＷＨＶ８）ゲノムの塩基対１０９３〜１６８４と１００％の相同性を有する。ＷＰＲＥ配列は、機能的である限り短縮型でもよく、短縮型ＷＰＲＥ配列は、（５９３個中）少なくとも５２５個、５４５個、５５５個、５６５個、５７５個、または５８５個の塩基を含み、配列番号５と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％等、少なくとも９０％の配列同一性（％ＳＩ）を共有しうる。ＷＲＰＥは、配列番号５に対応する配列、または配列番号５と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性等、少なくとも９０％の配列同一性（％ＳＩ）を有する配列を有しうる。ベクターは、ベクター中のＮＰＹおよびＮＰＹ２Ｒをエンコードする遺伝子の下流に配置され、任意にＷＰＲＥの近位にあり、および／またはＷＰＲＥに並置される、ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル（ＢＧＨｐＡ；ｂｏｖｉｎｅｇｒｏｗｔｈｈｏｒｍｏｎｅｐｏｌｙａｄｅｎｙｌａｔｉｏｎ）を含みうる。ＢＧＨｐＡ配列は、ＷＰＲＥの下流に配置されうる。ＢＧＨｐＡ配列は、ＷＰＲＥ配列の末端から５〜５０、５〜４０、５〜３０、５〜２０、５〜１５または５〜１０ヌクレオチド以内で開始しうる（例えば、ＢＧＨｐＡ配列は、ＷＰＲＥ配列の末端から５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０ヌクレオチドで開始し、またはＢＧＨｐＡ配列は、ＷＰＲＥ配列から前述のヌクレオチド数の位置のうちの任意の二つにより定義される範囲内で開始する）。

ベクター中の「ＢＧＨｐＡシグナル配列」とも呼ばれるＢＧＨｐＡ配列は、配列番号６と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性等、少なくとも９０％の配列同一性（％ＳＩ）を共有しうる。ＢＧＨｐＡシグナル配列は、機能的である限り短縮型でもよく、短縮型ＢＧＨｐＡシグナル配列は、（２６９個中）少なくとも２２５個、２３５個、２４５個、２５５個、または２６５個の塩基を含み、配列番号６と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性等、少なくとも９０％の配列同一性（％ＳＩ）を共有しうる。ＢＧＨｐＡシグナルは、配列番号６に対応する配列、または配列番号６と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性等、少なくとも９０％の配列同一性（％ＳＩ）を有する配列を有しうる。ベクターは、ベクター中のプロモーターの上流に配置された第一ＡＡＶ２逆方向末端反復（ＩＴＲ；ｉｎｖｅｒｔｅｄｔｅｒｍｉｎａｌｒｅｐｅａｔ）ドメインおよび／またはＮＰＹおよびＮＰＹ２Ｒをエンコードする遺伝子の下流に配置された第二ＩＴＲドメインも含むことができ、好ましくは第二ＩＴＲドメインはＢＧＨｐＡドメインの近位に配置される。ベクター中の５’末端ＩＴＲ配列は、配列番号７と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性等、少なくとも９０％の配列同一性（％ＳＩ）を共有しうる。５’末端ＩＴＲ配列は、機能的である限り短縮型でもよく、短縮型ＩＴＲ配列は、（１８３個中）１５５個、１６５個、１７５個、１８０個等、少なくとも１４５個の塩基を含み、配列番号７と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性等、少なくとも９０％の配列同一性（％ＳＩ）を共有しうる。ベクター中の３’末端ＩＴＲ配列は、配列番号８と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性等、少なくとも９０％の配列同一性（％ＳＩ）を共有しうる。３’末端ＩＴＲ配列は、機能的である限り短縮型でもよく、短縮型ＩＴＲ配列は、（１８３個中）１５５個、１６５個、１７５個、１８０個等、少なくとも１４５個の塩基を含み、配列番号８と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％等、少なくとも９０％の配列同一性（％ＳＩ）を共有しうる。５’末端ＩＴＲは、配列番号７に対応する配列、または配列番号７と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性等、少なくとも９０％の配列同一性（％ＳＩ）を有する配列を有することができ、３’末端ＩＴＲは、配列番号８に対応する配列、または配列番号８と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性等、少なくとも９０％の配列同一性（％ＳＩ）を有する配列を有する。上述の遺伝子のいずれか一つ以上は、ヒトにおける発現のためにコドン最適化されうる。後述のように、ＡＡＶ２、ＡＡＶ１およびＡＡＶ８の三つのＡＡＶ血清型が、本明細書に記載のベクターの遺伝子送達に有効であることが分かった。したがって、上述のベクターは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２およびＡＡＶ８からなる群より選択されるＡＡＶカプシドタンパク質によりパッケージングされうる。また、後述のように、ＡＡＶ１カプシドタンパク質によりパッケージングされたベクターは、てんかん発作モデルでの試験成績がより良好であり、したがってベクターの好ましいパッケージングは、ＡＡＶ１カプシドタンパク質によるものであることが分かった。

第二実施形態では、ベクター中のＮＰＹおよびＮＰＹ２Ｒをエンコードする遺伝子の導入遺伝子配置は、ＮＰＹ２Ｒをエンコードする遺伝子がプロモーターに対してより近位であるようにＮＰＹをエンコードする遺伝子に先行するものである（例えばＮＰＹ２Ｒをエンコードする遺伝子は、ＮＰＹをエンコードする遺伝子よりもプロモーターに近接するように、ベクター上のＮＰＹをエンコードする遺伝子の上流に提示される）。前記神経ペプチドＹ（ＮＰＹ）をエンコードする配列は、配列番号１に対応する配列、または前記配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性等、少なくとも９０％の配列同一性（％ＳＩ）を有する配列を有しうる。前記神経ペプチドＹ２受容体（ＮＰＹ２Ｒ）をエンコードする配列は、配列番号２に対応する配列、または前記配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％等、少なくとも９０％の配列同一性（％ＳＩ）を有する配列を有しうる。遺伝子発現を通じて、神経ペプチドＹ（ＮＰＹ）コード配列がプロ神経ペプチドＹプレプロタンパク質（配列番号１５）の合成において用いられ、神経ペプチドＹ２受容体（ＮＰＹ２Ｒ）コード配列が神経ペプチドＹ受容体２型（配列番号１６）の合成において用いられる。当業者に知られるように、代替的配列が同じペプチド配列をエンコードすることも可能である。したがって、組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターは、配列番号１５によるタンパク質をエンコードする配列、または前記配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性等、少なくとも９０％の配列同一性（％ＳＩ）を有する配列、および配列番号１６によるタンパク質をコードする配列、または前記配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性等、少なくとも９０％の配列同一性（％ＳＩ）を有する配列を含みうる。ＮＰＹをエンコードする遺伝子は、前記プロモーターと並置されうる。ＮＰＹ２Ｒをエンコードする遺伝子は、プロモーター領域の末端から５〜６０、５〜５０、５〜４０、５〜３０、５〜２０、５〜１５または５〜１０ヌクレオチド以内で開始しうる（例えばＮＰＹ２Ｒをエンコードする遺伝子は、プロモーター領域の末端から５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、または６０ヌクレオチドで開始し、またはＮＰＹ２Ｒをエンコードする遺伝子は、プロモーターから前述のヌクレオチド数の位置のうちの任意の二つにより定義される範囲内で開始する）。プロモーターは、サイトメガロウイルスエンハンサー／ニワトリβ‐アクチン（ＣＡＧ）プロモーターでありうる。ベクター中のＣＡＧプロモーター配列は、配列番号４と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性等、少なくとも９０％の配列同一性（％ＳＩ）を共有しうる。ＣＡＧプロモーター配列は、機能的である（例えば遺伝子の発現を誘導する）限り短縮型でもよく、短縮型ＣＡＧプロモーター配列は、（９３６個中）８７５個、９００個、９２５個、９３５個等、少なくとも８５０個の塩基を含み、配列番号４と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性等、少なくとも９０％の配列同一性（％ＳＩ）を共有し、前記プロモーターに作動可能に連結された遺伝子の発現を誘導しうる。ＣＡＧプロモーターは、配列番号４に対応する配列、または配列番号４と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性等、少なくとも９０％の配列同一性（％ＳＩ）を有する配列を有しうる。ＩＲＥＳ配列は、ベクター中のＮＰＹおよびＮＰＹ２Ｒをエンコードする遺伝子の間に配置されうる。ＩＲＥＳ配列は、ＮＰＹ２Ｒをエンコードする遺伝子の末端から５〜５０、５〜４０、５〜３０、５〜２０、５〜１５または５〜１０ヌクレオチド以内で開始しうる（例えば、ＩＲＥＳ配列は、ＮＰＹ２Ｒをエンコードする遺伝子末端から５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０ヌクレオチドで開始し、またはＩＲＥＳ配列は、ＮＰＹ２Ｒをエンコードする配列から前述のヌクレオチド数の位置のうちの任意の二つにより定義される範囲内で開始する）。ＩＲＥＳ配列は、ＮＰＹをエンコードする遺伝子の開始から５〜５０、５〜４０、５〜３０、５〜２０、５〜１５または５〜１０ヌクレオチド以内で終了しうる（例えば、ＩＲＥＳ配列は、ＮＰＹをエンコードする遺伝子の開始から５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０ヌクレオチドで終了し、またはＩＲＥＳ配列は、ＮＰＹをエンコードする配列の開始から前述のヌクレオチド数の位置のうちの任意の二つにより定義される範囲内で終了する）。ＩＲＥＳ配列は、Ａ７ＥＭＣＶＩＲＥＳ配列でありうる。ベクター中のＡ７ＥＭＣＶＩＲＥＳ配列は、配列番号３と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性等、少なくとも９０％の配列同一性（％ＳＩ）を共有しうる。Ａ７ＥＭＣＶＩＲＥＳ配列は、機能的である（例えば遺伝子発現を誘導する）限り短縮型でもよく、短縮型Ａ７ＥＭＣＶＩＲＥＳ配列は、（５８２個中）少なくとも５２５個、５４５個、５６０個、５７０個、または５７５個の塩基を含み、配列番号３と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性等、少なくとも９０％の配列同一性（％ＳＩ）を共有しうる。ＩＲＥＳは、配列番号３に対応する配列、または配列番号３と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性等、少なくとも９０％の配列同一性（％ＳＩ）を有する配列を有しうる。ベクター中のＮＰＹおよびＮＰＹ２Ｒをエンコードする遺伝子の下流にウッドチャック肝炎転写後調節要素（ＷＰＲＥ）が配置されることができ、任意にＷＰＲＥは、ＮＰＹをエンコードする遺伝子の近位にあり、および／またはＮＰＹをエンコードする遺伝子に並置される。ＷＰＲＥ配列は、ベクター中のＮＰＹをエンコードする遺伝子の下流に配置されうる。ＷＰＲＥ配列は、ＮＰＹをエンコードする遺伝子の末端から５〜８０、５〜７０、５〜６０、５〜５０、５〜４０、５〜３０、５〜２０、５〜１５または５〜１０ヌクレオチド以内で開始しうる（例えば、ＷＰＲＥ配列は、ＮＰＹをエンコードする遺伝子の末端から５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、または８０ヌクレオチドで開始し、またはＷＰＲＥ配列は、ＮＰＹをエンコードする配列から前述のヌクレオチド数の位置のうちの任意の二つにより定義される範囲内で開始する）。ベクター中のＷＰＲＥ配列は、配列番号５と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性等、少なくとも９０％の配列同一性（％ＳＩ）を共有しうる。この配列は、ウッドチャックＢ型肝炎ウイルス（ＷＨＶ８）ゲノムの塩基対１０９３〜１６８４と１００％の相同性を有する。ＷＰＲＥ配列は、機能的である限り短縮型でもよく、短縮型ＷＰＲＥ配列は、（５９３個中）少なくとも５２５個、５４５個、５５５個、５６５個、５７５個、または５８５個の塩基を含み、配列番号５と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％等、少なくとも９０％の配列同一性（％ＳＩ）を共有しうる。ＷＲＰＥは、配列番号５に対応する配列、または配列番号５と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性等、少なくとも９０％の配列同一性（％ＳＩ）を有する配列を有しうる。ベクターは、ベクター中のＮＰＹおよびＮＰＹ２Ｒをエンコードする遺伝子の下流に配置され、任意にＷＰＲＥの近位にあり、および／またはＷＰＲＥに並置される、ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル（ＢＧＨｐＡ）を含みうる。ＢＧＨｐＡ配列は、ＷＰＲＥの下流に配置されうる。ＢＧＨｐＡ配列は、ＮＰＹ２ＲをＷＰＲＥ配列の末端から５〜５０、５〜４０、５〜３０、５〜２０、５〜１５または５〜１０ヌクレオチド以内で開始しうる（例えば、ＢＧＨｐＡ配列は、ＷＰＲＥ配列の末端から５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０ヌクレオチドで開始し、またはＢＧＨｐＡ配列は、ＷＰＲＥ配列から前述のヌクレオチド数の位置のうちの任意の二つにより定義される範囲内で開始する）。

ベクター中の「ＢＧＨｐＡシグナル配列」とも呼ばれるＢＧＨｐＡ配列は、配列番号６と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性等、少なくとも９０％の配列同一性（％ＳＩ）を共有しうる。ＢＧＨｐＡシグナル配列は、機能的である限り短縮型でもよく、短縮型ＢＧＨｐＡシグナル配列は、（２６９個中）少なくとも２２５個、２３５個、２４５個、２５５個、または２６５個の塩基を含み、配列番号６と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性等、少なくとも９０％の配列同一性（％ＳＩ）を共有しうる。ＢＧＨｐＡシグナルは、配列番号６に対応する配列、または配列番号６と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性等、少なくとも９０％の配列同一性（％ＳＩ）を有する配列を有しうる。ベクターは、ベクター中のプロモーターの上流に配置された第一ＡＡＶ２逆方向末端反復（ＩＴＲ）ドメインおよび／またはＮＰＹおよびＮＰＹ２Ｒをエンコードする遺伝子の下流に配置された第二ＩＴＲドメインも含むことができ、好ましくは第二ＩＴＲドメインはＢＧＨｐＡドメインの近位に配置される。ベクター中の５’末端ＩＴＲ配列は、配列番号７と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性等、少なくとも９０％の配列同一性（％ＳＩ）を共有しうる。５’末端ＩＴＲ配列は、機能的である限り短縮型でもよく、短縮型ＩＴＲ配列は、（１８３個中）１５５個、１６５個、１７５個、１８０個等、少なくとも１４５個の塩基を含み、配列番号７と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性等、少なくとも９０％の配列同一性（％ＳＩ）を共有しうる。ベクター中の３’末端ＩＴＲ配列は、配列番号８と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性等、少なくとも９０％の配列同一性（％ＳＩ）を共有しうる。３’末端ＩＴＲ配列は、機能的である限り短縮型でもよく、短縮型ＩＴＲ配列は、（１８３個中）１５５個、１６５個、１７５個、１８０個等、少なくとも１４５個の塩基を含み、配列番号８と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％等、少なくとも９０％の配列同一性（％ＳＩ）を共有しうる。５’末端ＩＴＲは、配列番号７に対応する配列、または配列番号７と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性等、少なくとも９０％の配列同一性（％ＳＩ）を有する配列を有することができ、３’末端ＩＴＲは、配列番号８に対応する配列、または配列番号８と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性等、少なくとも９０％の配列同一性（％ＳＩ）を有する配列を有する。上述の遺伝子のいずれか一つ以上は、ヒトにおける発現のためにコドン最適化されうる。後述のように、ＡＡＶ２、ＡＡＶ１およびＡＡＶ８の三つのＡＡＶ血清型が、本明細書に記載のベクターの遺伝子送達に有効であることが分かった。したがって、上述のベクターは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２およびＡＡＶ８からなる群より選択されるＡＡＶカプシドタンパク質によりパッケージングされうる。また、後述のように、ＡＡＶ１カプシドタンパク質によりパッケージングされたベクターは、てんかん発作モデルでの試験成績がより良好であり、したがってベクターの好ましいパッケージングは、ＡＡＶ１カプシドタンパク質によるものであることが分かった。これらのベクターおよびパッケージングシステムの特定の要素に関するさらなる開示は、以下の節に提供される。

アデノ随伴ウイルス
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、ヒト、霊長類および非霊長類動物種（ネコおよびイヌならびにその他多数）に感染することが知られているパルボウイルス科（Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ）の小さな非エンベロープＤＮＡウイルスの群を構成する。ＡＡＶが病気を引き起こすことは現在知られておらず、このウイルスは非常に軽度の免疫応答を引き起こす。ＡＡＶを利用した遺伝子療法ベクターは、分裂細胞および静止細胞（分裂していないときの細胞の状態）の両方に形質導入し、すなわち導入遺伝子を導入して発現を開始させ、宿主細胞のゲノムに組み込まれずに染色体外の状態で存続しうる（野生型ウイルスではウイルスにより担持される遺伝子のヒト１９番染色体の特定の部位での宿主ゲノムへの組み込みが生じる）。これらの特徴により、ＡＡＶは遺伝子療法用のウイルスベクターの作製に非常に魅力的になっている。

２００５年現在、ヒトおよび非ヒト霊長類由来の組織サンプルにおいて少なくとも１１０の重複しないＡＡＶ血清型が発見され、記載されている。血清型は、細胞表面抗原に基づいて一緒に分類された、細菌またはウイルスの種の中または異なる個体の免疫細胞の間での異なるバリエーションであり、生物の亜種レベルへの血清学的および疫学的分類を可能にする。既知のＡＡＶ血清型は全て、複数の多様な組織型からの細胞に感染しうる。組織特異性は、ＡＡＶベクターのカプシド血清型により決定され、これはシュードタイピングすなわち血清型特異的カプシドタンパク質を変更することにより、治療での使用に重要な指向性範囲を変えることにより変えることができる。これらのうち、血清型２（ＡＡＶ２）がこれまでに最も広範囲に検討されている。ＡＡＶ２は、骨格筋、ニューロン、血管平滑筋細胞および肝細胞への天然の指向性を示す。ＡＡＶ２に関しては、ヘパラン硫酸プロテオグリカン（ＨＳＰＧ；ｈｅｐａｒａｎｓｕｌｆａｔｅｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎ）、Ｖβ５インテグリンおよび線維芽細胞増殖因子受容体１（ＦＧＦＲ‐１；ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒｒｅｃｅｐｔｏｒ１）の三つの細胞受容体が記載されており、ヘパラン硫酸プロテオグリカンが一次受容体として機能すると考えられる。

ＡＡＶ２、ＡＡＶ１およびＡＡＶ８の三つのＡＡＶ血清型が、本明細書に記載のベクターの遺伝子送達に有効であることが分かった。脳においては、これらのＡＡＶ血清型はニューロン指向性を示す。

マーモセット、マウスおよびマカクの大脳皮質における、ＡＡＶ２ベースのゲノム構造体、ＡＡＶ血清型１、２または８由来のカプシドタンパク質によるシュードタイピング、および交換可能なプロモーター（ＣＭＶ、ＣａＭＫＩＩまたはＳｙｎＩ）からなるベクターを用いた比較研究から、形質導入および導入遺伝子発現の指向性、拡散性および効率における血清型特異的な異なる特徴が明らかになった（Ｗａｔａｋａｂｅｅｔａｌ．，２０１５）。

全体としてＡＡＶ２は、ベクターのより小さい拡散および天然発生的なニューロン指向性を有する点で他の血清型と異なった。しかし、いずれの血清型も、ニューロン特異的プロモーター（ＣａＭＫＩＩまたはＳｙｎ１）の下でニューロンにおける導入遺伝子発現を誘導することができ、血清型２を除いて他の血清型の間ではウイルス拡散に差はなかった。提案された血清型は全て、脳への導入遺伝子のＡＡＶベクター媒介性送達に適するように思われる。

血清型１および８は、拡散および導入遺伝子発現が同等であり、血清型２より効率的であるように思われる。血清型１、２および８はいずれもグリアおよびニューロンに形質導入できることが証明されており、異なるプロモーターの選択により細胞サブタイプ特異的制限がより良好に達成されるようである。

一実施形態では、ＡＡＶカプシドタンパク質は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２およびＡＡＶ８からなる群より選択される。

ＡＡＶベクターゲノム要素
導入遺伝子の発現を誘導するのに適したＡＡＶベクターを生産するために、ＡＡＶ発現カセットの要素が慎重に評価および選択されている。これには、ＩＴＲ配列、プロモーター、一つのベクターからの複数の導入遺伝子の発現のためのマルチシストロニック発現要素、およびエンハンサー要素が含まれる。

ＩＴＲ配列
逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列は、使用される野生型ゲノム由来の唯一保存された遺伝子要素であり、これらの配列は、第二ＤＮＡ鎖合成のためのセルフプライミングおよびＡＡＶ粒子におけるＤＮＡのカプシド形成を含む、いくつかのシス作用プロセスに必要である。逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列は、ＡＡＶゲノムの効率的な増殖に必要であると思われるそれらの対称性にちなんで命名された。逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列は、プライマーゼに依存しない第二ＤＮＡ鎖の合成を可能にする、いわゆるセルフプライミングに寄与するヘアピン形成能力によりこの特性を獲得する。ＩＴＲは、ＡＡＶＤＮＡの宿主細胞ゲノム（ヒト１９番染色体）への組み込み、ならびに完全に組み立てられたデオキシリボヌクレアーゼ耐性ＡＡＶの生成と組み合わせたＡＡＶＤＮＡの効率的なカプシド形成の両方に必要であることが示されている。利用可能なＩＴＲ配列の選択のうちＡＡＶ血清型２が本明細書に記載のベクターの多くで選択されており、これにより後述のようにＡＡＶ１、ＡＡＶ２またはＡＡＶ８カプシドのいずれかにベクターを効率的にパッキングしてビリオンを生成することが可能であった。末端反復である二つのＩＴＲ配列は、ベクターの５’末端および３’末端にそれぞれ位置する。

一実施形態では、二つのＩＴＲ配列は、ＮＰＹおよびＮＰＹ２Ｒのコード配列の上流および下流の、ベクターの５’末端および３’末端にそれぞれ位置する。

本発明のベクター中の５’末端ＩＴＲ配列は、配列番号７と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性等、少なくとも９０％の配列同一性（％ＳＩ）を共有しうる。５’末端ＩＴＲ配列は、機能的である限り短縮型でもよく、短縮型ＩＴＲ配列は、（１８３個中）１５５個、１６５個、１７５個、１８０個等、少なくとも１４５個の塩基を含み、配列番号７と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性等、少なくとも９０％の配列同一性（％ＳＩ）を共有しうる。

ベクター中の３’末端ＩＴＲ配列は、配列番号８と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性等、少なくとも９０％の配列同一性（％ＳＩ）を共有しうる。３’末端ＩＴＲ配列は、機能的である限り短縮型でもよく、短縮型ＩＴＲ配列は、（１８３個中）１５５個、１６５個、１７５個、１８０個等、少なくとも１４５個の塩基を含み、配列番号８と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％等、少なくとも９０％の配列同一性（％ＳＩ）を共有しうる。

一実施形態では、５’末端ＩＴＲは、配列番号７に対応する配列、または配列番号７と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性等、少なくとも９０％の配列同一性（％ＳＩ）を有する配列を有し、３’末端ＩＴＲは、配列番号８に対応する配列、または配列番号８と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性等、少なくとも９０％の配列同一性（％ＳＩ）を有する配列を有する。

ＣＡＧプロモーター
遺伝学において、プロモーターは、特定の遺伝子の転写を開始させるＤＮＡの領域である。プロモーターは、遺伝子の転写開始部位の近くの、当該ＤＮＡの同じ鎖上および（センス鎖の５’領域に向かって）上流に位置する。通常、プロモーターは１００〜１０００塩基対の長さである。一般に、プロモーターは二つの主なクラス、すなわちＴＡＴＡおよびＣｐＧに分類されている。しかし、転写因子の同じ組み合わせ構成を用いる遺伝子が、異なる遺伝子発現パターンを有する。さらに、ヒトにおいて、異なる組織が異なるクラスのプロモーターを用いることが分かっている。

形質導入率および遺伝子発現レベルに対する種々のプロモーター配列の効果は、細胞型の間で変動する。最適なプロモーターの選択を可能にするために、広範囲の利用可能なプロモーターが検査および評価されている。本発明においては、ＣＡＧプロモーターが、標的組織における適切な遺伝子発現のトリガ―を提供することが分かっている。遺伝子療法のためにＡＡＶベクターを使用して過去に行われた臨床試験のいくつかは、治療的に有益な効果のために十分に高い効能を得る上で問題に直面している。したがって、哺乳動物発現ベクターにおいて高レベルの遺伝子発現を駆動するために使用される強力な合成プロモーターとして知られるＣＡＧプロモーターが選択された。多くの組織型で、ＣＡＧプロモーターは、ＵＢＣおよびＰＧＫプロモーター等の他の一般に使用される細胞プロモーターよりも高いレベルの発現をもたらすことが分かっている。ＣＡＧプロモーターは以下の配列を含む：（Ｃ）サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）初期エンハンサー要素、（Ａ）プロモーター、ニワトリβ‐アクチン遺伝子の第一エクソンおよび第一イントロン、（Ｇ）ウサギβ‐グロビン遺伝子のスプライス受容体。したがってこれは、転写配列の一部（二つのエクソンおよびイントロン）およびエンハンサー要素を含むため、厳密な意味でのプロモーターではない。

一実施形態では、ＣＡＧプロモーター配列は、ＮＰＹおよびＮＰＹ２Ｒのコード配列の上流に位置する。

本発明のベクター中のＣＡＧプロモーター配列は、配列番号４と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性等、少なくとも９０％の配列同一性（％ＳＩ）を共有しうる。

ＣＡＧプロモーター配列は、機能的である（例えば遺伝子の発現を誘導する）限り短縮型でもよく、短縮型ＣＡＧプロモーター配列は、（９３６個中）８７５個、９００個、９２５個、９３５個等、少なくとも８５０個の塩基を含み、配列番号４と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性等、少なくとも９０％の配列同一性（％ＳＩ）を共有し、前記プロモーターに作動可能に連結された遺伝子の発現を誘導しうる。

一実施形態では、ＣＡＧプロモーターは、配列番号４に対応する配列、または配列番号４と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性等、少なくとも９０％の配列同一性（％ＳＩ）を有する配列を有する。

ＩＲＥＳ
ＩＲＥＳと略される内部リボソーム進入部位は、タンパク質合成のより大きなプロセスの一部としてメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）配列の途中での翻訳開始を可能にするヌクレオチド配列である。真核生物では通常、翻訳は、開始複合体の形成に５’キャップの認識が必要であるため、ｍＲＮＡ分子の５’末端でのみ開始されうる。ＩＲＥＳ配列をベクターに組み込むことにより、一つのベクターからの二つの遺伝子のバイシストロニック発現が可能となり、ここで第一遺伝子は通常の５’キャップで開始され、第二遺伝子はＩＲＥＳで開始される。

さらに、ＮＰＹおよびＮＰＹ２ＲｒＡＡＶベクターは、一つの細胞へのＮＰＹおよびＮＰＹ２Ｒの均一な挿入を可能にするが、ＩＲＥＳ要素の組み込みは、ＮＰＹおよびＮＰＹ２Ｒ遺伝子の不均一な発現を可能にする。さらに、上述のようにＮＰＹおよびＮＰＹ２Ｒ遺伝子の導入遺伝子配置を選択することにより、二つの導入遺伝子間で発現比を入れ替えることが可能である。これにより、標的組織および処置のためのＮＰＹおよびＮＰＹ２Ｒのｉｎｖｉｖｏ発現比の適切なバランスが達成されうる。

一実施形態では、ＩＲＥＳ配列は、ＮＰＹのコード配列とＮＰＹ２Ｒのコード配列との間に位置する。

ピコルナウイルスのＩＲＥＳ、異なる肝炎ウイルスのＩＲＥＳおよびクリパウイルスのＩＲＥＳ等のいくつかの異なるウイルスのＩＲＥＳ配列が現在知られている。

考えられる既知のＩＲＥＳ配列のうち、本発明者は、改変Ａ７配列を含む脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ；ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｏｃａｒｄｉｔｉｓｖｉｒｕｓ）由来の内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）がベクターに最も適することを発見した。

脳心筋炎ウイルス由来のＩＲＥＳは、真核細胞または無細胞抽出物にタンパク質を発現するために実験的および薬学的用途において一般的に使用され、適切に構成されたシストロンに高レベルのキャップ非依存性翻訳活性を与える。改変Ａ７配列（Ｒｅｅｓｅｔａｌ．，１９９６；ＢｏｃｈｋｏｖａｎｄＰａｌｍｅｎｂｅｒｇ，２００６）により、非改変ＥＭＣＶＩＲＥＳよりもＡ７ＥＭＣＶＩＲＥＳでより良好なシストロン翻訳が達成されることが示されている。

本発明のベクター中のＡ７ＥＭＣＶＩＲＥＳ配列は、配列番号３に存在する対応する長さのオリゴヌクレオチド配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％等、少なくとも９０％の配列同一性（％ＳＩ）を共有しうる。

Ａ７ＥＭＣＶＩＲＥＳ配列は、機能的である限り短縮型でもよく、短縮型Ａ７ＥＭＣＶＩＲＥＳ配列は、（５８２個中）５２５個、５４５個、５６０個、５７０個、または５７５個の塩基を含み、配列番号３に存在する対応する長さのオリゴヌクレオチド配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％等、少なくとも９０％の配列同一性（％ＳＩ）を共有しうる。

一実施形態では、ＩＲＥＳは、配列番号３に対応する配列、または配列番号３に存在する対応する長さのオリゴヌクレオチドフラグメントと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％等、少なくとも９０％の配列同一性（％ＳＩ）を有する配列を有する。

ＷＰＲＥ
標的細胞における遺伝子発現を確保するために、送達および転写レベルが最適化されうる。しかし、遺伝子発現を改善するために転写後方法を適用することもできる。本発明のベクターは、ウッドチャック肝炎転写後調節要素（ＷＰＲＥ）を組み込みうる。ＷＰＲＥは、特定の三次構造の形成により導入遺伝子の発現を増加させるのを助け、これにより転写後に異種遺伝子の発現を増強するＤＮＡ配列である。ＷＰＲＥはγ、α、およびβ成分を含む三部分調節要素である。本発明のベクターでは、完全なＷＰＲＥ活性のために、完全な三部分ＷＰＲＥが組み込まれている。

一実施形態では、ＷＰＲＥ配列は、ＮＰＹおよびＮＰＹ２Ｒのコード配列の下流に位置する。

本発明のベクター中のＷＰＲＥ配列は、配列番号５と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性等、少なくとも９０％の配列同一性（％ＳＩ）を共有しうる。この配列は、ウッドチャックＢ型肝炎ウイルス（ＷＨＶ８）ゲノムの塩基対１０９３〜１６８４と１００％の相同性を有する。

ＷＰＲＥ配列は、機能的である限り短縮型でもよく、短縮型ＷＰＲＥ配列は、（５９３個中）少なくとも５２５個、５４５個、５５５個、５６５個、５７５個、または５８５個の塩基を含み、配列番号５と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％等、少なくとも９０％の配列同一性（％ＳＩ）を共有しうる。

一実施形態では、ＷＲＰＥは、配列番号５に対応する配列、または配列番号５と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性等、少なくとも９０％の配列同一性（％ＳＩ）を有する配列を有する。

ウシ成長ホルモンポリアデニル化（ＢＧＨｐＡ）シグナル配列
ベクターは、ウシ成長ホルモンポリアデニル化（ＢＧＨｐＡまたはｂＧＨ‐ｐｏｌｙＡ）シグナル配列も組み込みうる。ＢＧＨｐＡシグナル配列は、導入遺伝子転写物の効率的かつ正確なポリアデニル化を確保する３’フランキング配列である（ＧｏｏｄｗｉｎａｎｄＲｏｔｔｍａｎ，１９９２）。二つの主な機能は、ＤＮＡ転写を終結させること、および核からリボソームへのＲＮＡの輸送に加えて転写されたＲＮＡの３’末端を分解から保護することである。したがって、ＢＧＨｐＡシグナル配列は、ベクター中の最後から二番目の要素として、３’末端のＩＴＲ配列のすぐ上流に位置する。

したがって、一実施形態では、（ｂＧＨ‐ｐｏｌｙＡ）シグナル配列は、前記ＮＰＹおよびＮＰＹ２Ｒのコード配列の下流に位置する。

ベクター中のＢＧＨｐＡシグナル配列は、配列番号６と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性等、少なくとも９０％の配列同一性（％ＳＩ）を共有しうる。

ＢＧＨｐＡシグナル配列は、機能的である限り短縮型でもよく、短縮型ＢＧＨｐＡシグナル配列は、（２６９個中）少なくとも２２５個、２３５個、２４５個、２５５個、または２６５個の塩基を含み、配列番号６に存在するのと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性等、少なくとも９０％の配列同一性（％ＳＩ）を共有しうる。

一実施形態では、ＢＧＨｐＡシグナルは、配列番号６に対応する配列、または配列番号６と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％等、少なくとも９０％の配列同一性（％ＳＩ）を有する配列を有する。

ベクターのまとめ
まとめると、プロモーターおよびエンハンサー要素、シス作用要素、ならびに導入遺伝子配置およびバイシストロニック要素に関する特定の選択の結果、例示的な実施形態により二つの設計が選択された：
ＩＴＲ−ＣＡＧ−ＮＰＹ−ＩＲＥＳ−ＮＰＹ２Ｒ−ＷＰＲＥ−ＢＧＨｐＡ−ＩＴＲ
ＩＴＲ−ＣＡＧ−ＮＰＹ２Ｒ−ＩＲＥＳ−ＮＰＹ−ＷＰＲＥ−ＢＧＨｐＡ−ＩＴＲ

したがって、一実施形態では、ベクターは、ＡＡＶ２逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）、ハイブリッドサイトメガロウイルスエンハンサー／ニワトリβ‐アクチンＣＡＧプロモーター（ＣＡＧ）、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、ウッドチャック肝炎翻訳後調節要素（ＷＰＲＥ）、およびウシ成長ホルモンポリアデニル化（ＢＧＨｐＡ）シグナル配列の機能的要素を含む。

一つのさらなる実施形態では、ベクターの機能的要素の配列は、操作可能に連結され、（上流から下流へ）
５’‐ＩＴＲ、ＣＡＧ、ＮＰＹ、ＩＲＥＳ、ＮＰＹ２Ｒ、ＷＰＲＥ、ＢＧＨｐＡおよびＩＴＲ‐３’、または
５’‐ＩＴＲ、ＣＡＧ、ＮＰＹ２Ｒ、ＩＲＥＳ、ＮＰＹ、ＷＰＲＥ、ＢＧＨｐＡ、およびＩＴＲ‐３’
の順序である。

完全配列のベクターは、機能的要素間のいくつかの塩基も含み、二つのこのような完全配列が、例示的な実施形態により組み立てられた。一実施形態では、ベクターは、配列番号９に対応する配列、もしくは配列番号９と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性等、少なくとも９０％の配列同一性（％ＳＩ）を有する配列を有し、またはベクターは、配列番号１０に対応する配列、もしくは配列番号１０と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性等、少なくとも９０％の配列同一性（％ＳＩ）を有する配列を有する。

ベクター配列（単数または複数）は、機能的である限り短縮型でもよく、短縮型ベクター配列（単数または複数）は、（４２８８個中）４２３０個、４２６０個、４２７０個、４２８０個等、少なくとも４２００個の塩基を含み、配列番号９と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性等、少なくとも９０％の配列同一性（％ＳＩ）を共有し、または短縮型ベクター配列（単数または複数）は、（４２８８個中）４２３０個、４２６０個、４２７０個、４２８０個等、少なくとも４２００個の塩基を含み、配列番号１０と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性等、少なくとも９０％の配列同一性（％ＳＩ）を共有しうる。

ベクターは、プロモーターまたは内部リボソーム進入部位配列とＮＰＹおよび／またはＮＰＹ２Ｒコード配列との間の距離等、ベクター内範囲で記載されることもできる。ＡＡＶは約４．７Ｋのパッケージング容量を有するため、ベクターの合計サイズも考慮事項である。

一実施形態では、ＣＡＧプロモーター配列と、ＣＡＧプロモーター配列の下流およびＩＲＥＳ配列の上流のＮＰＹまたはＮＰＹ２Ｒのコード配列との間の距離は、６０〜０塩基、好ましくは４０〜５塩基、最も好ましくは２０〜１０塩基の範囲内である。

一実施形態では、ＩＲＥＳ配列と下流のＮＰＹまたはＮＰＹ２Ｒのコード配列との間の距離は、６０〜０塩基、好ましくは４０〜２塩基、最も好ましくは１０〜４塩基の範囲内である。

当技術分野で知られるように、遺伝コードの縮重を利用した遺伝子最適化のためのいくつかのツールが存在する。縮重により、一つのタンパク質が多くの代替的な核酸配列によりエンコードされうる。コドン選好は各生物において異なり、これにより異種発現系における組み換えタンパク質の発現に困難が生じ、発現が低く不確かになりうる。これは、野生型配列が発現収量についても、分解、調節および他の特性についても最適化されない可能性のある同種発現についても当てはまりうる。したがって、転写、スプライシング、翻訳、およびｍＲＮＡ分解等の遺伝子発現の様々な局面に関与する多数の配列関連パラメータを用いてベクターがヒト発現のために最適化されうる。

したがって、一実施形態では、ベクターの配列は、ヒトにおける使用のためにコドン最適化されている。

ＡＡＶ粒子の生成
実験セクションでさらに説明するように、ベクターは、血清型１、２または８のカプシドタンパク質にパッキングされる。したがって、（上記の）二つのベクターから、以下にまとめる六つの異なるＡＡＶ粒子が生成されうる：
ＡＡＶ２．１−ＩＴＲ−ＣＡＧ−ＮＰＹ−ＩＲＥＳ−ＮＰＹ２Ｒ−ＷＰＲＥ−ＢＧＨｐＡ−ＩＴＲ
ＡＡＶ２．１−ＩＴＲ−ＣＡＧ−ＮＰＹ２Ｒ−ＩＲＥＳ−ＮＰＹ− ＷＰＲＥ−ＢＧＨｐＡ−ＩＴＲ
ＡＡＶ２．２−ＩＴＲ−ＣＡＧ−ＮＰＹ−ＩＲＥＳ−ＮＰＹ２Ｒ−ＷＰＲＥ−ＢＧＨｐＡ−ＩＴＲ
ＡＡＶ２．２−ＩＴＲ−ＣＡＧ−ＮＰＹ２Ｒ−ＩＲＥＳ−ＮＰＹ−ＷＰＲＥ−ＢＧＨｐＡ−ＩＴＲ
ＡＡＶ２．８−ＩＴＲ−ＣＡＧ−ＮＰＹ−ＩＲＥＳ−ＮＰＹ２Ｒ−ＷＰＲＥ−ＢＧＨｐＡ−ＩＴＲ
ＡＡＶ２．８−ＩＴＲ−ＣＡＧ−ＮＰＹ２Ｒ−ＩＲＥＳ−ＮＰＹ−ＷＰＲＥ−ＢＧＨｐＡ−ＩＴＲ

したがって、一実施形態では、ＡＡＶ粒子は、いわゆるシュードタイピングされたＡＡＶ粒子、つまり異なるＡＡＶ血清型由来のカプシドタンパク質でコーティングされたＡＡＶ粒子にパッケージングされたアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシドタンパク質により封入された本発明のベクターを含む。

ＡＡＶ粒子の送達
ＮＰＹおよびＮＰＹ２Ｒ遺伝子療法の送達は、好ましくは、ベクターを含むＡＡＶ粒子の部位特異的頭蓋内注射によるべきである。ＡＡＶ粒子を含む医薬組成物は、哺乳動物のてんかんまたはパーキンソン病等の神経障害の予防、抑制、改善または処置に使用される。主な標的は薬剤抵抗性（難治性、抗療性、医学的難治性、薬剤耐性）てんかんであり、それはこれらの形態のてんかんには処置効果のある方法がほとんど存在しないためである。薬剤抵抗性てんかんは、薬品処置に効果がないか、または薬品処置の結果に経時的な変動がある広範囲のタイプのてんかんを含む。非常に広く一般的に言えば、薬剤抵抗性は、発作を抗てんかん薬（ＡＥＤ；ａｎｔｉｅｐｉｌｅｐｔｉｃｄｒｕｇ）療法に応答して完全な制御下または許容される制御下におくことができないことであると言える。

一実施形態では、医薬組成物は、哺乳動物のてんかんまたはパーキンソン病等の神経障害の予防、抑制、改善または処置に使用するためのＡＡＶ粒子を含む。一つのさらなる実施形態では、前記神経障害はてんかんである。一つのさらなる実施形態では、前記てんかんは薬剤抵抗性てんかんである。一つのさらなる実施形態では、対象は、ヒト、ウマ、イヌまたはネコ対象等の哺乳動物対象である。一つのさらなる実施形態では、対象は、ヒト対象である。一つのさらなる実施形態において、神経障害はてんかんであり、組成物は、ＡＡＶ１‐ＮＰＹ／Ｙ２、ＡＡＶ１‐Ｙ２／ＮＰＹ、ＡＡＶ２‐ＮＰＹ／Ｙ２、ＡＡＶ２‐Ｙ２／ＮＰＹ、ＡＡＶ８‐ＮＰＹ／Ｙ２、またはＡＡＶ８‐Ｙ２／ＮＰＹ粒子、例えばＡＡＶ１‐ＮＰＹ／Ｙ２、ＡＡＶ１‐Ｙ２／ＮＰＹ、またはＡＡＶ８‐ＮＰＹ／Ｙ２粒子、例えばＡＡＶ１‐ＮＰＹ／Ｙ２粒子を含む。一つのさらなる実施形態では、神経障害はパーキンソン病であり、組成物は、ＡＡＶ１‐ＮＰＹ／Ｙ２、ＡＡＶ１‐Ｙ２／ＮＰＹ、ＡＡＶ２‐ＮＰＹ／Ｙ２、ＡＡＶ２‐Ｙ２／ＮＰＹ、ＡＡＶ８‐ＮＰＹ／Ｙ２、またはＡＡＶ８‐Ｙ２／ＮＰＹ粒子、好ましくはＡＡＶ１‐ＮＰＹ／Ｙ２、ＡＡＶ１‐Ｙ２／ＮＰＹ、またはＡＡＶ８‐ＮＰＹ／Ｙ２粒子、好ましくはＡＡＶ１‐ＮＰＹ／Ｙ２粒子を含む。

パーキンソン病の特徴は、線条体におけるドーパミン放出の喪失につながる、線条体に突出する黒質のドーパミンニューロンの喪失である。その結果、ドーパミン作動性伝達の低下および大脳基底核回路内の下流の異常発火が生じ、これにより筋固縮およびカタレプシー症状が起こる。ＮＰＹは、Ｙ２受容体活性化を通じてドーパミンの合成および放出を促進することによりこのドーパミン作動性伝達の低下を抑えるが、Ｙ１受容体の活性化は反対の効果を有する（Ａｄｅｗａｌｅｅｔａｌ．，２００５，２００７）。さらに、ＮＰＹは、ｉｎｖｉｔｒｏおよびｉｎｖｉｖｏの両方で６‐ヒドロキシドーパミン（６‐ＯＨＤＡ）誘導性の毒性に対してドーパミン作動性ニューロンにＹ２媒介性神経保護効果を及ぼす（Ｄｅｃｒｅｓｓａｃｅｔａｌ．，２０１１，２０１２）。さらに、パーキンソン病患者の死後脳には、健常対照と比較して尾状核および被殻におけるＮＰＹ陽性細胞数の増加がみられ（Ｃａｎｎｉｚｚａｒｏｅｔａｌ．，２００３）、これは内因性であるが連続的に不十分な神経保護応答を反映する可能性がある。これは、線条体および黒質のドーパミン作動性ニューロンが機能的Ｙ２受容体を発現すること（Ｓｈａｗｅｔａｌ．，２００３）および線条体６‐ＯＨＤＡ誘導性のドーパミン作動性ニューロンの喪失後の線条体および側坐核におけるＮＰＹ陽性ニューロン数の増加と整合する（Ｋｅｒｋｅｒｉａｎ‐ＬｅＧｏｆｆｅｔａｌ．，１９８６；Ｓａｌｉｎｅｔａｌ．，１９９０）。

一つのさらなる実施形態では、前記神経障害はパーキンソン病である。遺伝子療法は、ＡＡＶ血清型の組織指向性に依存して全身的に送達されてもよいが、頭蓋内注射により、高い効能および最小限の副作用での罹患脳領域への正確な標的化が得られる。このようにすれば、ウイルスベクターは、白質路に沿った周辺領域への予想される最小限の拡散で限定された領域内に含まれる。神経障害のタイプに応じて、ＡＡＶ送達アプローチは、非常に限定された脳領域へのものであるか、または適切な場合には大脳皮質のより広い領域をカバーする送達のいずれかでありうる。てんかんのタイプおよび単数または複数のてんかん病巣の位置に応じて、ＡＡＶ送達アプローチは、非常に限定された脳領域へのものであるか、または適切な場合には大脳皮質のより広い領域をカバーする送達のいずれかでありうる。したがって、脳室内、硝子体内、静脈内、皮下、筋肉内、鼻腔内、経粘膜、大脳内、腹腔内、くも膜下腔内、動脈内投与等、いくつかの可能な投与方法が存在する。

一実施形態では、ＡＡＶ粒子を含む医薬組成物は、部位特異的頭蓋内注射により送達される。

本発明の全てのＡＡＶ血清型は、グリア細胞およびニューロンに形質導入できることが証明されている。ＡＡＶ２血清型は、ベクターのより小さい拡散および天然発生的なニューロン指向性を示しており、そのためＡＡＶ２血清型カプシドタンパク質によるベクターが、より小さくより限定された脳領域への適切な送達でありうる。同様に、ＡＡＶ１またはＡＡＶ８血清型カプシドタンパク質によるベクターは、大脳皮質のより大きな領域をカバーする適切な送達でありうる。

ＡＡＶ粒子の用量は、単回用量、または一回もしくは複数回に与えられる複数回用量からなりうる。単回用量は、複数回の頭蓋内注射を避ける利点を有するが、複数回用量は、注射の合間に患者の用量応答を監視しながら各注射により低い用量を使用できる。通常、用量は０．１〜５０μｇまたは０．５〜２０μｇ等、０．０１〜１００μｇの範囲の機能的ＡＡＶ粒子であり得る。形質導入の効能は、注射中および注射後の対象の姿勢等、ベクターの拡散を促進するための他の要因によっても影響されうる。

一実施形態では、機能的ＡＡＶの有効用量は、０．１〜５０μｇまたは０．５〜２０μｇ等、０．０１〜１００μｇの間の機能的ＡＡＶ粒子の範囲である。一つのさらなる実施形態では、ＡＡＶ粒子は、単回用量または二回、三回、四回、五回用量等の複数回用量として投与するために処方される。

一実施形態では、対象の神経障害を処置、抑制、または改善するための方法は、神経障害を患う対象の中枢神経系の細胞に、薬学的に有効な量のこのような組成物を投与するステップを含む。一つのさらなる実施形態では、対象は、ヒト対象等の哺乳動物対象である。さらに、神経障害はてんかんまたはパーキンソン病である。この方法では、組成物は、部位特異的頭蓋内注射を通じて送達され、一つのさらなる実施形態では、神経障害はてんかんであり、組成物は単数または複数のてんかん病巣の位置に送達される。

ＮＰＹおよびＮＰＹ２Ｒの送達は、ベクターを含むＡＡＶ粒子の細胞への送達による、対象からの内因性細胞等の細胞への送達であってもよい。次いでこのような細胞が、ＡＡＶベクターにより感染または形質導入された細胞がその後移植されるｅｘｖｉｖｏ遺伝子療法のアプローチでみられるように、哺乳動物のてんかんまたはパーキンソン病等の神経障害の予防、抑制、改善または処置のために対象の部位に注射または移動させることなどにより投与されうる。このような対象は、ヒト対象等の哺乳動物でありうる。

一実施形態では、ＮＰＹおよびＹ２ゲノムの哺乳動物細胞への送達の方法は、前記ＡＡＶ粒子を細胞に導入するステップを含む。一つのさらなる実施形態では、細胞は、神経細胞、肺細胞、網膜細胞、上皮細胞、筋細胞、膵臓細胞、肝細胞、心筋細胞、骨細胞、脾臓細胞、ケラチノサイト、線維芽細胞、内皮細胞、前立腺細胞、生殖細胞、前駆細胞、および幹細胞からなる群より選択される。一実施形態では、ＮＰＹおよびＹ２ゲノムを対象に投与する方法は、（ＮＰＹおよびＹ２ゲノムを含む）前記細胞を対象に投与するステップを含む。一実施形態では、対象は、ヒト対象等の哺乳動物対象である。

一実施形態では、ＮＰＹおよびＹ２ゲノムの対象への送達の方法は、対象における哺乳動物細胞に前記ＡＡＶ粒子を投与するステップであって、ウイルス粒子が対象の海馬に投与される、ステップを含む。

一実施形態では、ＮＰＹおよびＹ２ゲノムの対象への送達の方法は、対象における哺乳動物細胞に前記ＡＡＶ粒子を投与するステップであって、ウイルス粒子が対象の線条体、側座核、黒質、腹側被蓋野、または内側前脳束に投与される、ステップを含む。

ＮＰＹおよびＮＰＹ２Ｒの送達は、ＮＰＹおよび／またはＮＰＹ２Ｒ活性化が治療効果を有するかまたはＮＰＹ欠乏により引き起こされる疾患を減少させるためのものであってもよく、疾患は、てんかんおよびパーキンソン病より選択される。したがって、一実施形態では、ＮＰＹが治療効果を有するかまたはＮＰＹ欠乏により引き起こされる疾患を減少させる方法であって、疾患は、てんかんおよびパーキンソン病より選択される、方法は、神経障害を患う対象の中枢神経系の細胞に、薬学的に有効な量の前記組成物を投与するステップを含む。

一実施形態では、ＮＰＹを必要な対象に提供する方法は、ＮＰＹ欠乏を有する対象等のＮＰＹを必要とする対象を選択するステップと、前記対象に薬学的に有効な量の前記組成物を提供するステップとを含む。一つのさらなる実施形態では、前記対象は、例えばＥＥＧおよび／またはてんかんもしくはパーキンソン病の臨床診断等の臨床評価または診断試験によりＮＰＹ欠乏を有する対象として選択される。

導入遺伝子発現の評価
本発明のベクターの、ＮＰＹおよびＮＰＹ２Ｒの発現を開始させる能力が試験された。図２に見られるように、ＮＰＹおよびＮＰＹ２Ｒの配列を含むＡＡＶ発現プラスミドによるＨＥＫ２９３細胞の一時的トランスフェクションにより、デュプレックスｄｄＰＣＲ反応におけるＮＰＹおよびＹ２標的配列の両方の量の上昇により測定して、両導入遺伝子をエンコードするｍＲＮＡ転写物のレベルの上昇が生じた。両方のプラスミドで、ＩＲＥＳの上流の導入遺伝子の標的配列の発現レベルは、下流の導入遺伝子の標的配列よりも豊富であった。

海馬におけるＮＰＹおよびＮＰＹ２Ｒの発現
ＮＰＹおよびＮＰＹ２Ｒ配列を含むＡＡＶ発現プラスミドの配列を実験的に検証した後、プラスミドがＡＡＶ血清型１、２または８由来のＡＡＶカプシド粒子にパッケージングされて、上述のように合計６つの独特なＡＡＶベクター粒子が生成された。これらの粒子が精製され、ラットにおけるｉｎｖｉｖｏ試験に進められた。成体雄Ｗｉｓｔａｒラットの背側海馬への頭蓋内注射の三週間後に、動物が安楽死させられ、脳が採取され、急速冷凍された。続いて、これらの脳からの脳スライスに対し、ＮＰＹを標的とする免疫組織化学的アッセイならびにＮＰＹ２Ｒの結合およびＧＰＣＲの機能的結合を可視化するオートラジオグラフィーアッセイを用いて、ＮＰＹおよびＮＰＹ２Ｒの導入遺伝子発現の評価が行われた。ＡＡＶ１‐ＮＰＹ／Ｙ２、ＡＡＶ１‐Ｙ２／ＮＰＹ、ＡＡＶ２‐ＮＰＹ／Ｙ２、またはＡＡＶ８‐ＮＰＹ／Ｙ２による処置はいずれも、ＮＰＹレベルの有意な増加をもたらした（図３および４）。ＮＰＹ発現を誘導するＡＡＶベクターの階層的順序は以下の通りであった：ＡＡＶ１‐ＮＰＹ／Ｙ２＝ＡＡＶ１‐Ｙ２／ＮＰＹ＝ＡＡＶ８‐ＮＰＹ／Ｙ２＞ＡＡＶ‐ＮＰＹ／Ｙ２＞ＡＡＶ８‐Ｙ２／ＮＰＹ＝ＡＡＶ２‐Ｙ２／ＮＰＹ。六つのベクターの全てが機能的ＮＰＹ２Ｒレベルの上昇をもたらし（図５Ａおよび５Ｂ）、ＡＡＶ１‐ＮＰＹ／Ｙ２、ＡＡＶ１‐Ｙ２／ＮＰＹ、ＡＡＶ２‐Ｙ２／ＮＰＹ、またはＡＡＶ８‐Ｙ２／ＮＰＹによる処置後にはＮＰＹ２Ｒ結合レベルの有意な増加も観察された（図６Ａおよび６Ｂ）。ＮＰＹ２Ｒ発現を誘導するＡＡＶベクターの階層的順序は以下の通りであった：ＡＡＶ１‐Ｙ２／ＮＰＹ＞ＡＡＶ８‐Ｙ２／ＮＰＹ＝ＡＡＶ１‐ＮＰＹ／Ｙ２＞ＡＡＶ２‐Ｙ２／ＮＰＹ＞ＡＡＶ８‐ＮＰＹ／Ｙ２＝ＡＡＶ２‐ＮＰＹ／Ｙ２。

したがって、両方のＡＡＶ発現プラスミド（ＡＡＶ‐ＮＰＹ／Ｙ２およびＡＡＶ‐Ｙ２／ＮＰＹ）が良好に転写され、ＮＰＹおよびＮＰＹ２Ｒタンパク質の発現をもたらした。さらに、全ての場合に、導入遺伝子発現のレベルは、ＩＲＥＳ配列の上流または下流に位置する導入遺伝子配列に依存し、ＩＲＥＳ配列の上流に位置する導入遺伝子は、ＩＲＥＳ配列の下流に位置する導入遺伝子よりも相対的に高いレベルで発現された。

ＡＡＶ血清型１からのカプシドタンパク質でシュードタイピングされたＡＡＶベクターは、ラット海馬に頭蓋内注射されたときに最も高い導入遺伝子発現効能を有した（ＡＡＶ１＞ＡＡＶ８＞ＡＡＶ２）。したがって、一実施形態では、ＡＡＶ粒子のＡＡＶカプシドタンパク質は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２およびＡＡＶ８からなる群、好ましくはＡＡＶ１およびＡＡＶ８より選択される。

驚くべきことに、ＡＡＶ血清型１からのカプシドタンパク質でシュードタイピングされたＡＡＶベクターは、ＡＡＶ血清型２および８からのカプシドタンパク質でシュードタイピングされた他のＡＡＶベクターが下流の導入遺伝子の相対的に低い発現を示したのと比較して、（図４Ａおよび４Ｂに見られるように）ＩＲＥＳ要素の下流に位置する導入遺伝子の非常に高い発現を示した。したがって、ＡＡＶ血清型１からのカプシドタンパク質でシュードタイピングされたＡＡＶベクターは、第一および第二導入遺伝子（すなわちＮＰＹおよびＮＰＹＲ２）の高い発現を示す。

臨床的ＡＡＶ遺伝子療法のより大きな障害の一つは、高い効能で安全な発現を確保することである。したがって、均一に高い発現が非常にプラスであるとみなされる。したがって、一実施形態では、ＡＡＶ粒子のＡＡＶカプシドタンパク質は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２およびＡＡＶ８からなる群より選択され、最も好ましくはＡＡＶ１である。一つのさらなる実施形態では、ＡＡＶ粒子は、両方の導入遺伝子（ＮＰＹおよびＮＰＹ２Ｒ）のより相同な過剰発現のためにＡＡＶ１カプシドタンパク質を有する。

対照的に、ＮＰＹおよびＮＰＹ２Ｒ導入遺伝子の非相同発現効能が望ましい場合には、ＡＡＶ血清型２および８からのカプシドタンパク質でシュードタイピングされたＡＡＶベクターが好ましい可能性がある。

一実施形態によれば、本明細書で使用されるところの配列同一性（％ＳＩ）は、任意の都合の良い方法により評価されうる。このような計算にはコンピュータプログラムを使用することが一般的であり、配列対の比較およびアライメントのための標準プログラムの組には、ＡＬＩＧＮ（ＭｙｅｒｓａｎｄＭｉｌｌｅｒ，ＣＡＢＩＯＳ，４：１１‐１７，１９８８）、ＦＡＳＴＡ（Ｐｅａｒｓｏｎ，ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１８３：６３‐９８，１９９０）およびギャップＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌｅｔａｌ．，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．，２５：３３８９‐３４０２，１９９７）、またはＢＬＡＳＴＰ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘｅｔａｌ．，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．，１２：３８７，１９８４）が含まれる。このようなリソースが手元にない場合、一実施形態によれば、配列同一性（％ＳＩ）は、（％ＳＩ）＝１００％^＊（ペアワイズアラインメントにおける同一残基数）／（最短配列の長さ）として計算されうる。

表１〜３に示すように、スコアリングを用いて発現結果がさらに分析されうる。表１では、導入遺伝子発現が血清型ごとにスコアリングされた。

表１は、ＮＰＹおよびＹ２過剰発現ＡＡＶ１、２および８ベクターで処置した動物におけるＮＰＹおよびＮＰＹ２Ｒタンパク質レベルを示す。観察されたＮＰＹまたはＮＰＹ２Ｒタンパク質シグナルに対応してタンパク質レベルが評価された：１（内因性レベルに対応するタンパク質レベル）、２（内因性レベルを上回る低いタンパク質発現）、３（内因性レベルを上回る中程度のタンパク質発現）、および４（内因性レベルを上回る高いタンパク質発現）。データは、平均値±ｓ．ｅ．ｍとして示される。続いて、異なるＡＡＶベクターに１〜３のランクが与えられ、１は最も高い発現レベルに等しく、３は最低に等しい。

したがって、ＡＡＶ血清型１からのカプシドタンパク質でシュードタイピングされたＡＡＶベクターは、ラット海馬に頭蓋内注射されたときに最も高い導入遺伝子発現効能を有した（ＡＡＶ１＞ＡＡＶ８＞ＡＡＶ２）ことが明らかである。

さらに、導入遺伝子発現は、表２に示すように、二つのベクターの配置（ＮＰＹ／Ｙ２またはＹ２／ＮＰＹ）に関しても評価されうる。

表２は、ＮＰＹ／Ｙ２またはＹ２／ＮＰＹＡＡＶベクターで処置した動物におけるＮＰＹおよびＮＰＹ２Ｒタンパク質レベルを示す。観察されたＮＰＹまたはＮＰＹ２Ｒタンパク質シグナルに対応してタンパク質レベルが評価された：１（内因性レベルに対応するタンパク質レベル）、２（内因性レベルを上回る低いタンパク質発現）、３（内因性レベルを上回る中程度のタンパク質発現）、および４（内因性レベルを上回る高いタンパク質発現）。データは、平均値±ｓ．ｅ．ｍとして示される。続いて、異なるＡＡＶベクターに１〜２のランクが与えられ、１は最も高い発現レベルに等しく、２は最低に等しい。

したがって、導入遺伝子発現のレベルは、ＩＲＥＳ配列の上流または下流に位置する導入遺伝子配列に依存し、ＩＲＥＳ配列の上流に位置する導入遺伝子は、ＩＲＥＳ配列の下流に位置する導入遺伝子よりも相対的に高いレベルで発現されたことが明らかである。

ＫＡ誘発発作に対するＡＡＶベクター媒介性効果
ラットにおけるカイニン酸誘発発作モデルを用いて、ＮＰＶおよびその受容体のＡＡＶベクター媒介性発現の発作抑制効果が評価された。このモデルは、最初の運動発作およびてんかん重積状態までの潜伏時間ならびに発作の頻度および持続期間の測定、ならびに一般的な修正された発作重症度スコアを含み、側頭葉てんかんにおける急性発作事象を反映すると考えられる。これは図７に示されており、図７は、ＡＡＶ誘導性導入遺伝子過剰発現のレベルとの関係での、単回カイニン酸注射（ｓ．ｃ．）後の２時間の観察期間中の発作発症のグラフ図を示す。高レベルのＡＡＶベクター誘導性ＮＰＹ発現レベルは、内因性レベルおよびより低レベルのＮＰＹ発現と比較して、最初の運動発作およびてんかん重積状態の両方までの潜伏時間の増加ならびに発作が起きている時間の減少をもたらした（図７Ａ）。高レベルのＡＡＶベクター誘導性ＮＰＹ２Ｒ発現レベルは、内因性レベルおよびより低レベルのＮＰＹ２Ｒ発現と比較して、有意なレベルには達しないものの、発作が起きている時間の減少傾向をもたらした（図７Ｂ）。

図８Ａでは、ＡＡＶ１‐ＮＰＹ／Ｙ２による処置は、てんかん重積状態（ＳＥ）の発症までの潜伏時間を増加させ、合計発作時間を減少させたが、ＡＡＶ１‐Ｙ２／ＮＰＹ処置後に観察された効果には、ＡＡＶ１空処置と比較して統計的有意性が見られなかった（図８Ａ）ことがさらに分かる。ＡＡＶ１‐ＮＰＹ／Ｙ２およびＡＡＶ１‐Ｙ２／ＮＰＹのいずれも、最初の運動発作までの潜伏時間または合計発作回数には影響しなかった（図８Ａ）。

図８Ｂに見られるように、ＡＡＶ２‐ＮＰＹ／Ｙ２またはＡＡＶ２‐Ｙ２／ＮＰＹによる処置は、ＡＡＶ２空と比較して発作の発症または重症度に有意な変化をもたらさなかった（図８Ｂ）。

図８Ｃに見られるように、ＡＡＶ８‐ＮＰＹ／Ｙ２による処置は、てんかん重積状態（ＳＥ）の発症までの潜伏時間の増加および合計発作時間の減少が見られたが、ＡＡＶ８‐Ｙ２／ＮＰＹにはＡＡＶ８空と比較して有意な効果は観察されなかった（図８Ｃ）。しかし、ＡＡＶ８‐ＮＰＹ／Ｙ２誘導性の合計発作時間の減少の、有意ではないが強い傾向は観察された（図８Ｃ）。

全てのベクター粒子の中で、ＡＡＶ１‐ＮＰＹ／Ｙ２による処置が、発作持続時間の減少およびＳＥの発症までの潜伏時間の増加の観察により明らかである抗発作効果をもたらすことが分かった。ＡＡＶ１‐Ｙ２／ＮＰＹ、ＡＡＶ２‐ＮＰＹ／Ｙ２、ＡＡＶ２‐Ｙ２／ＮＰＹ、ＡＡＶ８‐ＮＰＹ／Ｙ２、またはＡＡＶ８‐Ｙ２／ＮＰＹによる処置は、発作の発症または重症度の統計的に有意な抑制をもたらさなかった。ＡＡＶベクター粒子の拡散およびＮＰＹ導入遺伝子発現効能は、血清型に依存することが分かった（ＡＡＶ１＞ＡＡＶ８＞ＡＡＶ２）。ＮＰＹおよびＹ２の導入遺伝子発現は、ＮＰＹ免疫染色および機能的Ｙ２受容体結合アッセイによりそれぞれ確認された。頭蓋内注射およびＡＡＶベクター処置後の動物に異常行動または明らかな健康問題は観察されなかった。

まとめると、図８は、ＡＡＶ１‐ＮＰＹ／Ｙ２、ＡＡＶ１‐Ｙ２／ＮＰＹ、ＡＡＶ８‐ＮＰＹ／Ｙ２に、発作持続時間の減少およびＳＥの発症までの潜伏時間の増加の観察により明らかな抗発作効果の明確な傾向がみられ、ＡＡＶ１‐ＮＰＹ／Ｙ２では明確な統計的有意性があることを示す。ＡＡＶ２構築物では結果はそれほど明確ではなく、ＡＡＶ８‐Ｙ２／ＮＰＹも抗発作効果の明確な傾向はみられなかった。ｉｎｖｉｖｏ系では、発現は効能と同じではないが、発現は依然としてベクター機能にとって必須であることが明らかである。

ＮＰＹおよびＮＰＹ２Ｒの導入遺伝子を単一の構築物から発現させることにより、本発明のベクターは、動物モデルにおいてＮＰＹ／ＮＰＹ２Ｒタンパク質の両方の発現レベルが医学的効果と相関付けられるのを目にする以前にはみられなかった機会を提供する。全ての形質導入細胞は、全ての移入遺伝子が同じ位置に局在化され、ＮＰＹ／ＮＰＹ２Ｒの比率が固定されベクターに依存する（そのため全ての形質転換細胞でも比率が一貫する）、同数のＮＰＹおよびＮＰＹ２Ｒ遺伝子を有する構築物で感染させている。ＮＰＹとＮＰＹ２Ｒ遺伝子の拡散および分布も異ならず、これらは全く同じ細胞内に局在する。これらの効果は、ＮＰＹおよびＮＰＹ２Ｒ遺伝子をそれぞれ含む二つのベクターを用いて達成することは不可能である。このことによるプラスの効果には、非常に一貫した処置結果が含まれる。統計的には、これにより個々のベクターの効果をスコアリングすることも容易になる。表３に示すように、ベクターの様々な品質（発現およびカイニン酸誘発発作抑制効能）をスコアリングすることにより、いずれのベクターが処置に最も優れているかを強調することがより容易になる。

表３は、導入遺伝子発現および急性カイニン酸誘発発作モデルにおける抗発作処置としての効能の両方に基づく六つのＡＡＶベクターの総合ランキングを示す。ランクは１から６まで与えられ、１は最高ランクに等しく、６は最低ランクに等しい。総合ランクは、発現および効能ランキングの平均ランクを表す。総合ランキングによれば、ＡＡＶ１‐ＮＰＹ／Ｙ２＝ＡＡＶ１‐Ｙ２／ＮＰＹ＝ＡＡＶ８‐ＮＰＹ／Ｙ２＞ＡＡＶ８‐Ｙ２／ＮＰＹ＝ＡＡＶ２‐ＮＰＹ／Ｙ２＞ＡＡＶ２‐Ｙ２／ＮＰＹである。

したがって、一実施形態では、ＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ１‐ＮＰＹ／Ｙ２、ＡＡＶ１‐Ｙ２／ＮＰＹ、またはＡＡＶ８‐ＮＰＹ／Ｙ２である。一実施形態では、ＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ１‐ＮＰＹ／Ｙ２である。

ＡＡＶ１‐ＮＰＹ／Ｙ２、ＡＡＶ１‐Ｙ２／ＮＰＹ、ＡＡＶ２‐ＮＰＹ／Ｙ２、またはＡＡＶ８‐ＮＰＹ／Ｙ２での処置はいずれも、ＮＰＹレベルの有意な増加をもたらした（図３および４）。六つのベクター全てによる処置が、機能的ＮＰＹ２Ｒレベルの増加をもたらした（図５Ａおよび５Ｂ）が、ＡＡＶ１‐Ｙ２／ＮＰＹで最も高い発現がもたらされた。六つのベクター全てでＮＰＹ２Ｒ結合レベルが増加し、ＡＡＶ１‐ＮＰＹ／Ｙ２、ＡＡＶ１‐Ｙ２／ＮＰＹ、ＡＡＶ２‐Ｙ２／ＮＰＹ、またはＡＡＶ８‐Ｙ２／ＮＰＹでの処置後には有意に増加した（図６Ａおよび６Ｂ）。ＮＰＹ発現を誘導するＡＡＶベクターの階層的順序は以下の通りであった：ＡＡＶ１‐ＮＰＹ／Ｙ２＝ＡＡＶ１‐Ｙ２／ＮＰＹ＝ＡＡＶ８‐ＮＰＹ／Ｙ２＞ＡＡＶ‐ＮＰＹ／Ｙ２＞ＡＡＶ８‐Ｙ２／ＮＰＹ＝ＡＡＶ２‐Ｙ２／ＮＰＹ。ＮＰＹ２Ｒ発現を誘導するＡＡＶベクターの階層的順序は以下の通りであった：ＡＡＶ１‐Ｙ２／ＮＰＹ＞ＡＡＶ８‐Ｙ２／ＮＰＹ＝ＡＡＶ１‐ＮＰＹ／Ｙ２＞ＡＡＶ２‐Ｙ２／ＮＰＹ＞ＡＡＶ８‐ＮＰＹ／Ｙ２＝ＡＡＶ２‐ＮＰＹ／Ｙ２。これは、共局在化したＮＰＹ２Ｒ発現を伴う高いＮＰＹ発現がｉｎｖｉｖｏの効能に好ましいと思われることを示唆する。

ハロペリドール誘発カタレプシーグリッドテスト
マウスにおけるハロペリドール誘発カタレプシーモデルを用いて、カタレプシー状態に対するＮＰＹおよびその受容体のＡＡＶベクター媒介性発現の影響が評価された。このモデルは、ドーパミンＤ２受容体に拮抗し、線条体のドーパミン含有量を減少させることが知られるハロペリドールの投与を利用する。これによりドーパミン作動性伝達のブロックおよび大脳基底核回路内の下流の異常発火がもたらされ、パーキンソン病で観察される運動症状を再現した筋固縮およびカタレプシーの症状として現れる。

図９Ａに見られるように、マウスへのＡＡＶ１‐ＮＰＹ／Ｙ２ベクターの注射は、ＡＡＶ１空と比較して、カタレプシー状態が起きている時間の有意な減少が誘導された。さらに、図９Ｂは、ＡＡＶ１‐ＮＰＹ／Ｙ２ベクターによる処置は、ＡＡＶ１空と比較して、１５分間隔で観察したカタレプシー状態が起きている平均時間の有意な減少も誘導したことを示す。

本発明は、単数または複数の特定の実施形態を参照して以上に説明されているが、本明細書に記載された特定の形態に限定されることは意図されない。むしろ、本発明は、添付の特許請求の範囲によってのみ限定され、上記の特定のもの以外の、例えば上述したものとは異なる他の実施形態が、これらの添付の特許請求の範囲内で等しく可能である。

特許請求の範囲において、「含む／含んでいる」という用語は、他の要素またはステップの存在を排除するものではない。さらに、個々にリストされているが、複数の手段、要素または方法ステップが、例えば単一のユニットまたはプロセッサにより実施されうる。加えて、個々の特徴が異なる請求項に含まれうるが、これらは有利に組み合わせられる可能性があり、異なる請求項に含まれることは、特徴の組み合わせが実現可能および／または有利ではないことを意味しない。加えて、単数刑での言及は複数形を排除するものではない。「一つの（ａ）」、「一つの（ａｎ）」、「第一」、「第二」等の用語は、複数形を排除しない。特許請求の範囲の参照符号は、明確のための例として提供されるにすぎず、特許請求の範囲をいかなる点でも限定するものと解釈されてはならない。

以下の実施例は単なる例であり、決して本発明の範囲を限定するものと解釈されてはならない。むしろ、本発明は、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される。

ベクター
ヒトＮＰＹ（ＮＭ＿０００９０５．３）およびＮＰＹ２Ｒ（ＮＭ＿０００９１０．２）オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ；ｏｐｅｎｒｅａｄｉｎｇｆｒａｍｅ）ならびに内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ配列、Ａ７バージョン）を、０．９ｋｂハイブリッドサイトメガロウイルスエンハンサー／ニワトリβ‐アクチン（ＣＡＧ）プロモーターの制御下の、ウッドチャック肝炎転写後調節要素（ＷＰＲＥ）およびＡＡＶ２逆方向末端反復が隣接するウシ成長ホルモンポリアデニル化（ｂＧＨ）シグナルを含むＡＡＶ発現プラスミドにクローニングした。得られたベクターが図１Ａおよび１Ｂに概略的にまとめられる。

ＡＡＶ粒子へのＡＡＶベクターゲノムのパッケージング
ベクターＤＮＡを、相補ＡＡＶゲノム（ｐＡＶ２（ＡＴＣＣ）等）または組み換えＡＡＶプラスミドの存在下で許容性真核細胞（ヒト２９３細胞等）にトランスフェクションする。細胞を（ＬＢ＋アンピシリンで３７℃で）２〜４日間培養した後、複数の凍結／解凍サイクルによりウイルス粒子を放出させ、その後６０℃に加熱することによりアデノウイルスヘルパーウイルスを不活性化する。得られた細胞可溶化物は、ＡＡＶ粒子にパッケージングされたＡＡＶベクターを有するＡＡＶ粒子を含む。上記の二つのベクター、およびＡＡＶ１、２、８ヘルパーウイルスを使用して、六つの異なるＡＡＶ粒子が得られる。生産された全てのベクターが、いわゆるシュードタイピングされたＡＡＶ粒子、つまりＡＡＶ血清型１、２および８由来のカプシドタンパク質でコーティングされたＡＡＶ粒子にパッケージングされた、ＡＡＶ血清型２由来のＩＴＲを含む上記のＡＡＶプラスミド構築物からなる。

ラット海馬へのＡＡＶベクターの注射
ＡＡＶベクターを麻酔し、成体雄Ｗｉｓｔａｒラットの背側海馬に片側注射（座標セット１：前後−３．３ｍｍ、内外１．８ｍｍ、背腹硬膜から−２．６ｍｍ、または座標セット２：前後−４．０ｍｍ、内外−２．１ｍｍ、背腹頭蓋表面から−４．３ｍｍ）、または背腹側海馬に両側注射（前後−３．３ｍｍ、内外＋／−１．８ｍｍ、背腹−２．６ｍｍ、ＡＰ−４．８ｍｍ、ＭＬ±５．２ｍｍ、ＤＶ−６．４および−３．８ｍｍ）した。前後軸ではブレグマ、内外軸では中線を基準点とした。半球あたり１または３μｌの体積のウイルスベクター懸濁液（１．１×１０^１２ゲノム粒子／ｍｌ）を注入した。

ラットにおけるカイニン酸誘発発作
ＡＡＶベクター注射の三週間後、ラットにカイニン酸（ＫＡ；１０ｍｇ／ｋｇ；０．９％等張生理食塩水に希釈；ｐＨ７．４）を皮下注射し、個別のプレキシガラスボックス（３０×１９×２９ｃｍ）に入れ、２時間ビデオ録画した。続いて、処置条件を知らない観察者が、最初の運動発作およびてんかん重積状態までの潜伏時間、運動発作が起きている時間、ならびに発作の回数を評価した。運動発作は、少なくとも１５秒間の前肢および／または後肢の間代性運動として定義された。

安楽死およびラットからの組織回収
ＫＡ注射の三時間後、動物を深く麻酔し、断頭した。脳を迅速に回収し、ドライアイス上で急速凍結し、その後、さらなる処理まで−８０℃で保存した。

ラットにおけるＡＡＶベクター媒介性導入遺伝子発現の評価
ＡＡＶベクター処置後の発現レベルを、対応する未処置対照ラットにおける発現レベルと比較した。二つの導入遺伝子ＮＰＹおよびＮＰＹ２Ｒの発現レベルおよび分布パターンを、処置した動物からの細胞または海馬脳スライスでのｄｄＰＣＲアッセイ、免疫組織化学的アッセイおよびオートラジオグラフィーアッセイを用いて評価した。

ドロップレットデジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ；ＤｒｏｐｌｅｔｄｉｇｉｔａｌＰＣＲ）アッセイ：ＡＡＶ‐ＮＰＹ／Ｙ２またはＡＡＶ‐Ｙ２／ＮＰＹベクターでトランスフェクションしたヒト胚性腎臓２９３細胞からＲＮＡを単離した。ｉＳｃｒｉｐｔＡｄｖａｎｃｅｄｃＤＮＡＳｙｎｔｈｅｓｉｓｋｉｔｆｏｒＲＴ‐ｑＰＣＲ（Ｂｉｏ‐Ｒａｄ）を用いてｃＤＮＡを合成した。ＩｎｔｅｇｒａｔｅｄＤＮＡＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓＲｅａｌＴｉｍｅｑＰＣＲＡｓｓａｙ設計ツールを使用してｄｄＰＣＲ用のプライマーおよびプローブアッセイ（ＩｎｔｅｇｒａｔｅｄＤＮＡＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）が設計された：ＮＰＹ（順方向：ＣＴＣＡＴＣＡＣＣＡＧＧＣＡＧＡＧＡＴＡＴＧ（配列番号１１）；逆方向：ＡＣＣＡＣＡＴＴＧＣＡＧＧＧＴＣＴＴＣ（配列番号１２））、ＮＰＹ２Ｒ（順方向：ＣＴＧＧＡＣＣＴＧＡＡＧＧＡＧＴＡＣＡＡＡＣ（配列番号１３）；逆方向：ＧＴＴＣＡＴＣＣＡＧＣＣＡＴＡＧＡＧＡＡＧＧ（配列番号１４））。Ｂｉｏ‐ＲａｄＱＸ２００プラットフォームを使用して、ＦＡＭ標識ＮＰＹ標的配列およびＨＥＸ標識ＮＰＹ２Ｒ標的配列を測定する二本鎖ｄｄＰＣＲアッセイを行った。プローブ用の１ｘｄｄＰＣＲＳｕｐｅｒｍｉｘ（ｄＵＴＰを含まない）（Ｂｉｏ‐Ｒａｄ）、ＮＰＹプライマー／ＦＡＭプローブ（９００ｎＭ／２５０ｎＭ）、ＮＰＹ２Ｒプライマー／ＨＥＸプローブ（９００ｎＭ／２５０ｎＭ）および１：５０００希釈された２μｌのｃＤＮＡを含む２０μｌの反応物を、ドロップレット生成およびＰＣＲに使用した。アニーリング／伸長温度６０℃のドロップレットデジタルＰＣＲの標準サイクル条件（ＢｉｏＲａｄＣ１０００Ｔｏｕｃｈサーマルサイクラー）を使用した。ＱｕａｎｔａＳｏｆｔ（商標）ソフトウェア（ＢｉｏＲａｄ）を使用してＱＸ２００ｄｒｏｐｌｅｔｒｅａｄｅｒ（ＢｉｏＲａｄ）でサンプルを分析した。

ＮＰＹ免疫組織化学的アッセイ：ウサギ抗ＮＰＹ抗体（１：５００／１：１０，０００；Ｓｉｇｍａ‐Ａｌｄｒｉｃｈ）でのインキュベーション後、Ｃｙ３コンジュゲートロバ抗ウサギ抗体（１：２００、ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ，ＵＳＡ）またはビオチン化ロバ抗ウサギ二次抗体でのインキュベーションおよび３，３‐ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）を用いて、海馬スライスにおけるＮＰＹ発現を可視化した。ＯｌｙｍｐｕｓＢＸ６１顕微鏡およびＣｅｌｌＳｅｎｓソフトウェアを用いてデジタル化された画像を得た。定性的評価の後、背側海馬ＣＡ１（錐体層ならびに上昇層および放線状層）のＮＰＹレベルを評価し、ＮＰＹ陽性シグナルに対応する値を与えた：１（内因性レベルに対応するＮＰＹレベル）、２（内因性レベルを上回る低いＮＰＹ発現）、３（内因性レベルを上回る中程度のＮＰＹ発現）、および４（内因性レベルを上回る高いＮＰＹ発現）。データは平均値±ｓ．ｅ．ｍとして示し、Ｍａｎｎ‐ＷｈｉｔｎｅｙＵ検定を用いて分析する。^＊未処置ナイーブ対照動物と比較してＰ＜０．０５。

ＮＰＹＹ２受容体結合オートラジオグラフィーアッセイ：海馬スライスを、１０ｎＭのＬｅｕ３１、Ｐｒｏ３４‐神経ペプチドＹ（Ｙ１／Ｙ４／Ｙ５選択性アゴニスト；＃Ｈ‐３３０６，ＢａｃｈｅｍＡＧ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）とともに０．１ｎＭの［^１２５Ｉ］［Ｔｙｒ３６］モノヨード‐ＰＹＹ（４０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ；＃ＩＭ２５９；ＡｍｅｒｓｈａｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）でインキュベートして、Ｙ２結合を可視化した。非特異的結合を可視化するために、１μＭ非標識ＮＰＹ（ヒト／ラット合成、Ｓｃｈａｆｅｒ‐Ｎ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を加えた。その後、スライスを１２５Ｉ感受性ＫｏｄａｋＢｉｏｍａｘＭＳフィルム（ＡｍｅｒｓｈａｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に露光し、現像した。定性的評価の後、背側海馬ＣＡ１（錐体層ならびに上昇層および放線状層）のＹ２受容体結合を評価し、Ｙ２受容体シグナルに対応する値を与えた：１（内因性レベルに対応するＹ２受容体発現）、２（内因性レベルを上回る低いＹ２受容体発現）、３（内因性レベルを上回る中程度のＹ２受容体発現）、および４（内因性レベルを上回る高いＹ２受容体発現）。データは平均値±ｓ．ｅ．ｍとして示し、Ｍａｎｎ‐ＷｈｉｔｎｅｙＵ検定を用いて分析する。^＊未処置ナイーブ対照動物と比較してＰ＜０．０５。

ＮＰＹＹ２機能的受容体結合オートラジオグラフィーアッセイ：Ｙ２受容体の機能的結合の可視化のために、海馬スライスを４０μＭの［^３５Ｓ］‐ＧＴＰγＳ（１２５０Ｃｉ／ｍｍｏｌ；ＮＥＧ０３０Ｈ２５０ＵＣ；ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，ＤＫ）、１μＭのＮＰＹ（Ｓｃｈａｆｅｒ‐Ｎ，Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ，ＤＫ）、１μＭのＹ１受容体アンタゴニストＢＩＢＰ３２２６（＃Ｅ３６２０，ＢａｃｈｅｍＡＧ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、および１０μＭのＹ５受容体アンタゴニストＬ‐１５２，８０４（＃１３８２，ＴｏｃｒｉｓＣｏｏｋｓｏｎ，ＵＫ）でインキュベートした。Ｙ２受容体の結合を確認するために、ＢＩＢＰ３２２６およびＬ‐１５２，８０４と一緒に１μＭのＹ２受容体アンタゴニストＢＩＩＥ０２４６（＃１７００，ＴｏｃｒｉｓＣｏｏｋｓｏｎ，ＵＫ）をＮＰＹに加えた。４０μＭの［^３５Ｓ］‐ＧＴＰγＳおよび１０μＭの非標識ＧＴＰγＳ（＃８９３７８；Ｓｉｇｍａ‐Ａｌｄｒｉｃｈ）を含むバッファーＢ中でのインキュベーションにより、非特異的結合を決定する。続いて、スライスをＫｏｄａｋＢｉｏＭａｘＭＲフィルムに露光し、現像した。ＩｍａｇｅＪソフトウェア（ＮａｔｉｏｎａｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＨｅａｌｔｈ，ＵＳＡ）を用いて、背側海馬ＣＡ１（錐体層ならびに上昇層および放線状層）のＹ２受容体の機能的結合を評価した。データを平均値±ｓ．ｅ．ｍとして示し、両側スチューデントｔ検定を用いて分析する。未処置ナイーブ対照動物と比較して^＊はＰ＜０．０５、^＊＊＊はＰ＜０．００１。

マウス線条体へのＡＡＶベクターの注射
マウスを麻酔し、ブレグマに対して以下の座標の三部位にウイルスベクター（１．１×１０^１２ゲノム粒子／ｍｌ）を注射した：外頭蓋を基準点として用いて前後：＋０．８５ｍｍ；内外：±１．８５ｍｍ；背腹：−３．００ｍｍ（１μｌ）、−３．４ｍｍ（０．５μｌ）、−３．８５ｍｍ（１μｌ）。

マウスにおけるハロペリドール誘発カタレプシーグリッドテスト
この一般的に使用されるパーキンソン病の症状の薬理学的モデルは、ドーパミンＤ２受容体に拮抗し、線条体のドーパミン含有量を減少させることが知られるハロペリドールの投与を利用する（ＤｕｔｙａｎｄＪｅｎｎｅｒ，２０１１）。これによりドーパミン作動性伝達のブロックおよび大脳基底核回路内の下流の異常発火がもたらされ、パーキンソン病で観察される運動症状を再現した筋固縮およびカタレプシーの症状として現れる。

マウスにハロペリドールを注射し（１．０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）、マウスを金属グリッド上に６０秒間置いて試験し、不動化時間を記録した。これは、ハロペリドールの注射後に、処置条件を知らない観察者により、２時間の観察期間中３０分毎に６０秒間の観察期間にわたって行った。

Claims

神経ペプチドＹ（ＮＰＹ）コード配列と神経ペプチドＹ２受容体（ＮＰＹ２Ｒ）コード配列とを含む、組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクター。
前記神経ペプチドＹ（ＮＰＹ）コード配列は、配列番号１に対応する配列、または前記配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性等、少なくとも９０％の配列同一性（％ＳＩ）を有する配列を有する、請求項１に記載のベクター。
前記神経ペプチドＹ２受容体（ＮＰＹ２Ｒ）コード配列は、配列番号２に対応する配列、または前記配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性等、少なくとも９０％の配列同一性（％ＳＩ）を有する配列を有する、請求項１または２に記載のベクター。
前記ベクターは、ＡＡＶ２逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）、ハイブリッドサイトメガロウイルスエンハンサー／ニワトリβ‐アクチンＣＡＧプロモーター（ＣＡＧ）、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、ウッドチャック肝炎翻訳後調節要素（ＷＰＲＥ）、およびウシ成長ホルモンポリアデニル化（ｂＧＨ‐ｐｏｌｙＡ）シグナル配列の機能的要素の少なくとも一つ、好ましくは全てをさらに含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載のベクター。
前記ベクターはハイブリッドサイトメガロウイルスエンハンサー／ニワトリβ‐アクチンＣＡＧプロモーター（ＣＡＧ）を含み、前記ＣＡＧプロモーター配列は前記ＮＰＹおよびＮＰＹ２Ｒのコード配列の上流に位置する、請求項４に記載のベクター。
前記ベクターは内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を含み、前記ＩＲＥＳ配列は前記ＮＰＹおよびＮＰＹ２Ｒのコード配列の間に位置する、請求項４または５のいずれか一項に記載のベクター。
前記ベクターはウッドチャック肝炎翻訳後調節エレメント（ＷＰＲＥ）を含み、前記ＷＰＲＥ配列は前記ＮＰＹおよびＮＰＹ２Ｒのコード配列の下流に位置する、請求項４〜６のいずれか一項に記載のベクター。
前記ベクターはウシ成長ホルモンポリアデニル化（ＢＧＨｐＡ）シグナル配列を含み、前記（ＢＧＨｐＡ）シグナル配列は前記ＮＰＹおよびＮＰＹ２Ｒのコード配列の下流に位置する、請求項４〜７のいずれか一項に記載のベクター。
前記ベクターは二つのＩＴＲ配列を含み、第一ＩＴＲ配列は前記ＮＰＹおよびＮＰＹ２Ｒのコード配列の上流の前記ベクターの５’末端に位置し、第二ＩＴＲ配列は前記ＮＰＹおよびＮＰＹ２Ｒのコード配列の下流の前記ベクターの３’末端に位置する、請求項４〜８のいずれか一項に記載のベクター。
前記配列は、
５’‐ＩＴＲ、ＣＡＧ、ＮＰＹ、ＩＲＥＳ、ＮＰＹ２Ｒ、ＷＰＲＥ、ＢＧＨｐＡおよびＩＴＲ‐３’、または
５’‐ＩＴＲ、ＣＡＧ、ＮＰＹ２Ｒ、ＩＲＥＳ、ＮＰＹ、ＷＰＲＥ、ＢＧＨｐＡおよびＩＴＲ‐３’
の順に操作可能に連結される、請求項４〜９のいずれか一項に記載のベクター。
前記５’末端ＩＴＲは、配列番号７に対応する配列、または配列番号７に存在する対応する長さのオリゴヌクレオチドフラグメントと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性等、少なくとも９０％の配列同一性（％ＳＩ）を有する配列を有し、前記３’末端ＩＴＲは、配列番号８に対応する配列、または配列番号８に存在する対応する長さのオリゴヌクレオチドフラグメントと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％等、少なくとも９０％の配列同一性（％ＳＩ）を有する配列を有する、請求項４〜１０のいずれか一項に記載のベクター。
前記ＣＡＧは、配列番号４に対応する配列、または配列番号４に存在する対応する長さのオリゴヌクレオチドフラグメントと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性等、少なくとも９０％の配列同一性（％ＳＩ）を有する配列を有する、請求項４〜１１のいずれか一項に記載のベクター。
前記ＩＲＥＳは、配列番号３に対応する配列、または配列番号３に存在する対応する長さのオリゴヌクレオチドフラグメントと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性等、少なくとも９０％の配列同一性（％ＳＩ）を有する配列を有する、請求項４〜１２のいずれか一項に記載のベクター。
前記ＷＰＲＥは、配列番号５に対応する配列、または配列番号５に存在する対応する長さのオリゴヌクレオチドフラグメントと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性等、少なくとも９０％の配列同一性（％ＳＩ）を有する配列を有する、請求項４〜１３のいずれか一項に記載のベクター。
前記ＢＧＨｐＡは、配列番号６に対応する配列、または配列番号６に存在する対応する長さのオリゴヌクレオチドフラグメントと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性等、少なくとも９０％の配列同一性（％ＳＩ）を有する配列を有する、請求項４〜１４のいずれか一項に記載のベクター。
前記ベクターは、配列番号９に対応する配列、または配列番号９に存在する対応する長さのオリゴヌクレオチドフラグメントと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性等、少なくとも９０％の配列同一性（％ＳＩ）を有する配列を有するか、または前記ベクターは、配列番号１０に対応する配列、または配列番号１０に存在する対応する長さのオリゴヌクレオチドフラグメントと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性等、少なくとも９０％の配列同一性（％ＳＩ）を有する配列を有する、請求項４〜１５のいずれか一項に記載のベクター。
前記ベクターの配列は、ヒトにおける発現のためにコドン最適化される、請求項４〜１６のいずれか一項に記載のベクター。
前記ＮＰＹ２Ｒコード配列は、前記ＮＰＹコード配列の下流にある、請求項４〜１６のいずれか一項に記載のベクター。
前記ＣＡＧプロモーター配列と、前記ＣＡＧプロモーター配列の下流および前記ＩＲＥＳ配列の上流の前記ＮＰＹまたはＮＰＹ２Ｒのコード配列との間の距離は、６０〜０塩基、好ましくは４０〜５塩基、最も好ましくは２０〜１０塩基の範囲内である、請求項４〜１５のいずれか一項に記載のベクター。
前記ＩＲＥＳ配列と下流のＮＰＹまたはＮＰＹ２Ｒのコード配列との間の距離は、６０〜０塩基、好ましくは４０〜２塩基、最も好ましくは１０〜４塩基の範囲内である、請求項４〜１５のいずれか一項に記載のベクター。
請求項１〜２０のいずれか一項に記載のベクターを含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子であって、前記ベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシドタンパク質により封入される、ＡＡＶ粒子。
前記ＡＡＶカプシドタンパク質は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２およびＡＡＶ８からなる群より、好ましくはＡＡＶ１またはＡＡＶ８より選択され、最も好ましくはＡＡＶ１である、請求項２１に記載のＡＡＶ粒子。
ＡＡＶ１‐ＮＰＹ／Ｙ２、ＡＡＶ１‐Ｙ２／ＮＰＹ、またはＡＡＶ８‐ＮＰＹ／Ｙ２である、請求項２１〜２２のいずれか一項に記載のＡＡＶ粒子。
ＡＡＶ１‐ＮＰＹ／Ｙ２である、請求項２１〜２３のいずれか一項に記載のＡＡＶ粒子。
請求項２１〜２４のいずれか一項に記載のＡＡＶ粒子を含む医薬組成物であって、哺乳動物の神経障害の予防、抑制、改善または処置における使用のための、医薬組成物。
前記神経障害はてんかんまたはパーキンソン病である、請求項２５に記載の使用のための医薬組成物。
前記てんかんは薬剤抵抗性てんかんである、請求項２５に記載の使用のための医薬組成物。
前記神経障害はパーキンソン病である、請求項２５に記載の使用のための医薬組成物。
前記組成物は部位特異的頭蓋内注射により投与される、請求項２５〜２８のいずれか一項に記載の使用のための医薬組成物。
前記ＡＡＶ粒子は、単回用量または二回、三回、四回、五回用量等の複数回用量としての投与のために処方される、請求項２５〜２９のいずれか一項に記載の使用のための医薬組成物。
機能的ＡＡＶの有効用量は、０．１〜５０μｇまたは０．５〜２０μｇ等、０．０１〜１００μｇの間の機能的ＡＡＶ粒子の範囲である、請求項２５〜３０のいずれか一項に記載の使用のための医薬組成物。
対象の神経障害を処置、抑制、または改善するための方法であって、
神経障害を患う対象の中枢神経系の細胞に、薬学的に有効な量の請求項２５〜３１のいずれか一項に記載の組成物を投与するステップ
を含む、方法。
前記対象は哺乳動物対象である、請求項３２に記載の方法。
前記対象は、ヒト、イヌ、ネコまたはウマ対象である、請求項３２に記載の方法。
前記対象はヒト対象である、請求項３２に記載の方法。
前記神経障害はてんかんまたはパーキンソン病である、請求項３２〜３５のいずれか一項に記載の方法。
前記組成物は部位特異的頭蓋内注射を通じて送達される、請求項３２〜３６のいずれか一項に記載の方法。
前記神経障害はてんかんであり、前記組成物は単数または複数のてんかん病巣の位置に送達される、請求項３２〜３７のいずれか一項に記載の方法。
ＮＰＹおよびＹ２ゲノムの哺乳動物細胞への送達の方法であって、請求項２１〜２４に記載のＡＡＶ粒子を細胞に導入するステップを含む、方法。
前記細胞は、神経細胞、肺細胞、網膜細胞、上皮細胞、筋細胞、膵臓細胞、肝細胞、心筋細胞、骨細胞、脾臓細胞、ケラチノサイト、線維芽細胞、内皮細胞、前立腺細胞、生殖細胞、前駆細胞、および幹細胞からなる群より選択される、請求項３９に記載の送達の方法。
ＮＰＹおよびＹ２ゲノムを対象に投与する方法であって、前記対象に請求項３９または４０に記載の細胞を投与するステップを含む、方法。
前記対象は哺乳動物対象である、請求項４１に記載の核酸を対象に投与する方法。
前記対象はヒト対象である、請求項４１に記載の核酸を対象に投与する方法。
ＮＰＹおよびＹ２ゲノムの対象への送達の方法であって、対象における哺乳動物細胞に請求項２１〜２４のいずれか一項に記載のＡＡＶ粒子を投与するステップであって、前記ウイルス粒子が前記対象の海馬に投与される、ステップを含む、方法。
ＮＰＹが治療効果を有するかまたはＮＰＹ欠乏により引き起こされる疾患を軽減する方法であって、前記疾患は、てんかんまたはパーキンソン病より選択され、前記方法は、神経障害を患う対象の中枢神経系の細胞に、薬学的に有効な量の請求項１９〜２４のいずれか一項に記載の組成物を投与するステップを含む、方法。
ＮＰＹを必要な対象に提供する方法であって、
ＮＰＹ欠乏を有する対象等のＮＰＹを必要とする対象を選択するステップと；
前記対象に薬学的に有効な量の請求項１９〜２４のいずれか一項に記載の組成物を提供するステップと
を含む、方法。
前記対象は、例えばＥＥＧおよび／またはてんかんもしくはパーキンソン病の臨床診断等の臨床評価または診断試験によりＮＰＹ欠乏を有する対象として選択される、請求項４６に記載の方法。