KR20180105708A - 벡터 - Google Patents

Abstract

본 발명은 뉴로펩티드 Y(NPY) 코딩 서열 및 뉴로펩티드 Y2 수용체(NPY2R) 코딩 서열을 포함하는 재조합 아데노-관련 바이러스(r AAV) 벡터에 관한 것이다. 추가로 본 발명은 상기 벡터를 포함하는 AAV 입자에 관한 것이며, 여기에서 벡터는 아데노-관련 바이러스(AAV) 캡시드 단백질에 의해 캡슐화된다. 또한, 뇌전증과 같은 포유류에서의 신경학적 장애의 예방 또는 치료에 사용하기 위한, 상기 AAV 입자를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.

Description

벡터

본 발명은 특이적 벡터 요소와 함께 NPY 및 그의 수용체 Y2(NPY2R)를 암호화하는 소정의 핵산 서열을 포함하는 벡터에 관한 것이다. 추가로 본 발명은, AAV 입자를 형성하는 아데노-관련 바이러스 혈청형 1, 2, 및 8로부터의 캡시드 단백질 내에 캡슐화되는 상기 벡터에 관한 것이다. 본 발명은 최종적으로, 포유류에서 뇌전증과 같은 신경학적 장애의 치료를 위한 의약의 제조에 사용되는 상기 벡터 또는 상기 AAV 입자에 관한 것이다.

세계 보건 기구(WHO: World Health Organization)에 따르면 중추 신경계에 관련된 장애는 지대한 사회경제적 보건 문제를 구성하며, 현재 이용가능한 치료 선택권은 불충분하다. 이들 장애는 뇌전증 및 파킨슨병을 포함하지만 이로 제한되지 않는다.

뇌전증은 세계에서 가장 오래 전에 알려진 신경학적 병태 중의 하나이며, 문서 기록은 4000 BC까지 거슬러 올라간다. 수 세기 동안 뇌전증을 둘러싼 공포, 오해, 차별, 및 사회적 오명이 있어 왔다. 이 오명은 현재 여러 나라에서 계속되고 있으며, 장애를 가진 사람들 및 그들의 가족의 삶의 질에 영향을 줄 수 있다. 전세계의 약 1%의 사람들이 뇌전증을 앓으며, 이는 그것이 세계적으로 가장 통상적인 신경학적 질환 중 하나가 되게 한다.

뇌전증 발작은 짧고 거의 감지할 수 없는 경련으로부터 장기간의 격렬한 경련까지 변동될 수 있는 삽화이다. 뇌전증에서, 발작은 반복되는 경향이 있으며, 흔히 특정가능한 근본 원인이 없다.

발작 삽화는 동조된 뇌 세포(synchronized brain cell) 그룹 내의 과도한 전기 방전의 결과이다. 뇌의 상이한 부분이 이러한 방전의 부위일 수 있다. 장애를 앓는 10명의 대상 중 6명에서 발생하는 가장 통상적인 유형의 뇌전증은 특발성 뇌전증이라고 불리며, 특정가능한 원인이 없다. 알려진 원인이 있는 뇌전증은 2차성 뇌전증 또는 증상성 뇌전증이라고 불린다. 2차성(또는 증상성) 뇌전증의 원인은 산전 또는 주산기 손상으로부터의 뇌 손상, 뇌 기형과 연계된 선천성 이상 또는 유전적 병태, 중증 두부 손상, 뇌로의 산소량을 제한하는 뇌졸중, 뇌의 감염, 예컨대 수막염, 뇌염, 신경낭미충증, 소정의 유전적 증후군, 또는 뇌종양을 포함한다.

뇌전증 사례의 최대 70%를 매일 투약으로 치료할 수 있는 것으로 추산되었다. 그러나, 치료에 불량하게 반응하는 사람들의 경우, 그들은 치료되지 않은 채로 남아 있거나 뇌전증 수술 또는 비-약리학적 치료, 예컨대 뇌심부 자극(DBS: deep brain stimulation), 미주 신경 자극(VNS: vagus nerve stimulation), 또는 식이에 의존해야 한다.

WHO에 따르면, 뇌전증은 조기 사망으로 인한 수명 손실 연수와 완전히 건강하지 못한 상태로 생활하는 시간을 조합하는 시간-기반의 측정값인 세계적 질환 부담의 0.75%를 차지한다. 2012년에, 뇌전증은 대략 2060만 장애-보정 생존 연수(DALY: disability-adjusted life years) 손실의 원인이었다. 뇌전증은 보건-의료 수요, 조기 사망, 및 노동 생산성 손실의 관점에서 유의적인 경제적 영향을 나타낸다.

따라서, 뇌전증 치료를 위한 새로운 접근법 및 후속의 새로운 방법에 대한 필요성이 존재한다. 제EP 2046394 Al호에는 신경계 장애의 치료를 위한 유망한 접근법이 기재되어 있으며, 여기에서는 하나 또는 몇몇 뉴로펩티드가 신경계의 세포 내에서 그들의 상응하는 수용체 중 하나 이상과 함께 과발현된다. 신경전달물질의 증가된 방출은 흔히 신경전달물질의 효과를 매개하는 수용체의 보상성 하향조절을 유발하므로, 상응하는 수용체의 발현은 시간 경과에 따른 치료 효과의 제한을 방지하는 데에 도움이 된다. 뉴로펩티드 및 수용체 과발현의 개념을 사용하는 개선된 접근법은, 뇌전증을 위한 새로운 치료에, 특히 현재의 약제학적 치료 접근법이 목적하는 치료 효과를 유발하지 않는 뇌전증의 유형인 약물내성 뇌전증의 치료에 유리할 것이다.

따라서, 본 발명의 태양은, 뉴로펩티드 Y(NPY) 코딩 서열 및 뉴로펩티드 Y2 수용체(NPY2R) 코딩 서열을 포함하는 재조합 아데노-관련 바이러스(rAAV) 벡터를 제공함으로써, 당업계에 상기-특정된 결핍 및 단점 중 하나 이상을 단독으로 또는 임의의 조합으로 완화하거나 경감시키거나 제거하고 적어도 상기 언급된 문제를 해결하는 것을 바람직하게 추구한다.

본 발명의 일 태양에 따라, 벡터는 AAV2 반전 말단 반복 서열(ITR), 혼성 사이토메갈로바이러스 인핸서/닭 베타-액틴 CAG 프로모터(CAG), 내부 리보솜 진입 부위(IRES), 우드척(woodchuck) 간염 번역-후 조절 요소(WPRE), 및/또는 소 성장 호르몬 폴리아데닐화(bGH-폴리A) 신호 서열의 작용성 요소 중 적어도 하나, 바람직하게 전부를 추가로 포함한다.

본 발명의 일 태양에서, AAV 입자는 상기 벡터를 포함하며, 여기에서 벡터는 아데노-관련 바이러스 (AAV) 캡시드 단백질에 의해 캡슐화된다.

본 발명의 또 다른 태양에 따라, 약제학적 조성물은 포유류에서의 신경학적 장애, 예컨대 뇌전증 또는 파킨슨병의 예방, 저해, 또는 치료에 사용하기 위한 상기 AAV 입자를 포함한다.

본 발명의 일 태양에서, 대상에서 신경학적 장애를 치료, 저해, 또는 개선하는 방법은, 뇌전증 또는 파킨슨병과 같은 신경학적 장애를 앓는 포유류 또는 인간 대상과 같은 대상의 중추 신경계의 세포 내로 상기 조성물의 약제학적 유효량을 투여하는 단계를 포함한다.

본 발명의 다른 태양에 따라, NPY 및 Y2 유전체를 포유류 세포에 전달하는 방법은, 세포 내로 상기 AAV 입자를 도입하는 단계를 포함한다. 또 다른 실시 형태에서, NPY 및 Y2 유전체를 포유류 또는 인간 대상과 같은 대상에게 투여하는 방법은, 상기 세포를 대상에게 투여하는 단계를 포함한다.

본 발명의 일 태양에서, NPY 및 Y2 유전체를 대상에게 전달하는 방법은, 대상 내의 포유류 세포에 상기 AAV 입자를 투여하는 단계를 포함하며, 여기에서 바이러스 입자는 대상의 해마에 투여된다.

본 발명의 다른 태양에 따라, NPY가 치료 효과를 나타내거나 NPY-결핍에 의해 야기되는 질환을 감소시키며, 여기에서 질환은 뇌전증 또는 파킨슨병 중에서 선택되는 방법은, 신경학적 장애를 앓는 대상의 중추 신경계의 세포 내로 상기 조성물의 약제학적 유효량을 투여하는 단계를 포함한다.

본 발명의 또 다른 태양에 따라, NPY를 필요로 하는 대상, 예컨대, 예를 들어 뇌전증 또는 파킨슨병의 EEG 및/또는 임상 진단과 같은 임상 평가 또는 진단 시험에 의해 NPY 결핍을 나타내는 것으로 선택된 대상에게 NPY를 제공하는 방법은, NPY를 필요로 하는 대상, 예컨대 NPY 결핍을 나타내는 대상을 선택하는 단계, 및 상기 조성물의 약제학적 유효량을 상기 대상에게 제공하는 단계를 포함한다.

본 발명의 다른 태양은 또한 본 출원의 청구범위에서 확인되는 소정의 대안에 관한 것이다.

본 발명이 가능한 이들 및 다른 태양, 특징, 및 이점은, 첨부 도면을 참조하여 본 발명의 실시 형태의 하기 설명으로부터 자명해지고 해명될 것이다.
도 1a 및 도 1b는 본 명세서에 기재된 몇몇 실시 형태에 사용된 벡터의 도식적 표현이며, 여기에서 뉴로펩티드 Y(NPY) 및 뉴로펩티드 수용체 2(NPY2R)의 형질전환 순서는 NPY가 NPY2R의 업스트림에 있거나(도 1a) NPY2R이 NPY의 업스트림에 있다(도 1b).
도 2는 ddPCR에 의해 형질감염된 HEK293 세포에서의 형질전환 유전자 발현을 요약하는 그래프를 나타낸다. NPY 및 NPY2R 표적 서열의 수는 ddPCR에 의해 측정된 다. 비-처리 세포 또는 NPY 및 NPY2R 암호화 서열이 없는 AAV 발현 플라스미드(IRES)가 대조군으로 사용된다. 대응 스튜던트 t-검정, t₃=3.927, *P=0.0294. 데이터 점/막대는 평균 + SEM을 나타낸다(처리당 n=4).
도 3은 랫트로부터의 해마 슬라이스에서의 NPY 발현을 예시하는 그래프를 나타낸다. 편측(unilateral) AAV 벡터 치료 후 3 주에 배측 해마의 CA1 지역 내의 NPY 수준. NPY 수준은 관찰된 NPY-양성 면역형광 신호에 상응하여 평가하였다: 1(내인성 수준에 상응하는 NPY 수준), 2(내인성 수준을 초과하는 낮은 NPY 발현), 3(내인성 수준을 초과하는 보통의 NPY 발현), 및 4(내인성 수준을 초과하는 높은 NPY 발현). 데이터는 평균값 ± s.e.m으로 제공되며 맨-휘트니 U 검정을 사용하여 분석한다. 치료하지 않은 무경험(naive) 대조군 동물에 비교하여 *P<0.05.
도 4는 편측 AAV-NPY/Y2 벡터 치료 후 3 주에 배측 해마 내의 NPY 발현을 예시하는 영상을 나타낸다. DAB-염색이 더 짙을수록 NPY-유사 면역반응성 수준이 더 높다. AAV-Y2/NPY 벡터로 치료한 랫트(나타내지 않음)는 도면에 나타난 발현의 9-17%에 상응하는 NPY 발현을 나타냈다.
도 5a 및 도 5b는 랫트로부터의 해마 슬라이스에서의 NPY2R 작용성을 예시하며, 여기에서 5a는 편측 AAV 벡터 치료 후 3 주에 배측 해마의 CA1 지역 내의 작용성 NPY2R 결합의 수준을 예시하는 그래프를 나타낸다. 데이터는 평균값 ± s.e.m으로 제공되며 독립 양측 스튜던트 검정을 사용하여 분석한다. 치료하지 않은 무경험 대조군 동물에 비교하여 *P<0.05, ***P<0.001. 5b는 a에 나타낸 작용성 NPY2R 결합의 대표적인 영상을 나타낸다.
도 6은 랫트로부터의 해마 슬라이스에서의 NPY2R 발현을 예시하며, 여기에서 6a는 편측 AAV 벡터 치료 후 3 주에 배측 해마 내의 NPY2R 결합의 수준을 예시하는 그래프를 나타낸다. Y2 수용체 결합은 해마 CA1 지역에서 평가되었으며 Y2 수용체 신호에 상응하는 값이 제공되었다: 1(내인성 수준에 상응하는 Y2 수용체 발현), 2(내인성 수준을 초과하는 낮은 Y2 수용체 발현), 3(내인성 수준을 초과하는 보통의 Y2 수용체 발현), 및 4(내인성 수준을 초과하는 높은 Y2 수용체 발현). 데이터는 평균 값 ± s.e.m으로 제공되며 맨-휘트니 U 검정을 사용하여 분석한다. 치료하지 않은 무경험 대조군 동물에 비교하여 *P<0.05. 6b는 6a에 나타낸 작용성 NPY2R 결합의 대표적인 영상을 나타낸다.
도 7은 AAV-유도 형질전환 유전자 과발현의 수준과 관련하여 단일 카이네이트 주사(s.c.) 후 2 시간 기간의 관찰 중의 발작 발생을 예시하는 그래픽을 나타낸다. 도 7a는 발작 발생과 AAV-유도 NPY 형질전환 유전자 과발현 사이의 관계를 나타낸다. 대조군: 내인성 수준에 상응하는 NPY 수준(도 3의 값 1에 상응함); 낮음: 낮은 NPY 형질전환 유전자 발현 수준(도 3의 값 2에 상응함); 높음: 높은 NPY 형질전환 유전자 발현 수준(도 3의 값 3-4에 상응함). a) 최초 운동 발작(MS)까지의 잠복, b) 뇌전증 지속상태(SE)까지의 잠복, 및 c) 발작 시간은 모두 내인성 수준과 동일한 NPY 발현을 나타내는 랫트에 비교하여 높은 형질전환 유전자 NPY 발현을 나타내는 치료한 랫트에서 유의적으로 상이했으며, 이는 항-발작 효과를 의미한다. d) 발작 횟수는 모든 카테고리에서 영향을 받지 않았다. 도 7b는 발작 발생과 AAV-유도 NPY2R(Y2) 형질전환 유전자 과발현 사이의 관계를 나타낸다. 대조군: 내인성 수준에 상응하는 NPY2R 수준(도 3의 값 1에 상응함); 낮음: 낮은 NPY2R 형질전환 유전자 발현 수준(도 3의 값 2에 상응함); 높음: 높은 NPY2R 형질전환 유전자 발현 수준(도 3의 값 3-4에 상응함). a) 최초 운동 발작(MS)까지의 잠복, b) 뇌전증 지속상태(SE)까지의 잠복, c) 발작 시간, 및 d) 발작 횟수는 NPY2R 발현 카테고리 중 임의의 것에서 유의적으로 변경되지 않았다. 그러나, 특히 높은 NPY2R 발현 카테고리에서 c) 발작 시간의 감소에 대한 강력한 경향이 관찰되었다. 데이터는 평균값 ± s.e.m으로 제공되며 유의적 일원 분산분석(significant one-way ANOVA) 후에 본페로니 다중 비교 사후 검정(Bonferroni's multiple comparison post-hoc test)을 사용하여 분석한다. *P<0.05, **P<0.01.
도 8은 KA-유도 발작에 대한 양측 해마내 AAV 벡터 주사의 효과를 예시한다: 8a는 KA-유도 발작에 대한 양측 해마내 AAV1 벡터 주사의 효과를 나타낸다. 대조군(AAVl-엠프티)에 비교하여 AAV1 벡터 매개 NPY 및 Y2 과발현 후에 a) 최초 운동 발작까지의 잠복 및 d) 발작의 총 횟수는 영향을 받지 않았다. 대조군(AAVl-엠프티)에 비교하여 AAV1-NPY/Y2 치료 후에 b) 뇌전증 지속상태(SE)까지의 잠복 및 c) 총 발작 시간은 양자 모두 유의적으로 감소된 반면에, AAV1-Y2/NPY는 유의적인 효과를 나타내지 않았다. 데이터는 평균 ± SEM이다(각각의 그룹에서 n=7-8). 대조군(AAVl-엠프티) 대비 *P<0.05, 유의적 일원 분산분석 후의 본페로니 다중 비교 사후 검정. 8b는 KA-유도 발작에 대한 양측 해마내 AAV2 벡터 주사의 효과를 나타낸다. AAV2 벡터-매개 NPY 및 Y2 과발현 후에 KA-유도 발작에 대한 효과가 관찰되지 않았다. 이는 a) 최초 운동 발작까지의 잠복, b) 뇌전증 지속상태(SE)까지의 잠복, c) 총 발작 시간, 및 d) 발작의 총 횟수의 관찰을 포함하였다. 데이터는 평균 ± SEM이다(각각의 그룹에서 n=8). 유의적 일원 분산분석 후의 본페로니 다중 비교 사후 검정. 8c는 KA-유도 발작에 대한 양측 해마내 AAV8 벡터 주사의 효과를 나타낸다. AAV8 벡터-매개 NPY 및 Y2 과발현 후에 KA-유도 발작에 대한 효과가 관찰되지 않았다. 이는 a) 최초 운동 발작까지의 잠복, b) 뇌전증 지속상태(SE)까지의 잠복, c) 총 발작 시간, 및 d) 발작의 총 횟수의 관찰을 포함하였다. 데이터는 평균 ± SEM이다(각각의 그룹에서 n=8-12). 유의적 일원 분산분석 후의 본페로니 다중 비교 사후 검정.
도 9는 파킨슨병 증상의 할로페리돌-유도 경직에 있어서 마우스에서의 양측 선조체내 AAV1-NPY/Y2 또는 AAV-엠프티(대조군) 벡터 주사의 효과를 예시한다. A) AAV1-NPY/Y2 벡터를 이용한 치료는 AAVl-엠프티에 비교하여 경직 상태에 소요되는 시간의 유의적인 감소를 유도했다. 데이터는 평균값 ± s.e.m으로 제공되며 이원 반복 측정 분산분석을 사용하여 분석한다. *P<0.05는 AAVl-엠프티와 AAV1-NPY/Y2 벡터 치료 사이의 유의적인 전체 치료 효과를 의미한다. B) AAV1-NPY/Y2 벡터를 이용한 치료는 AAVl-엠프티에 비교하여 15-분 간격으로 관찰된 경직 상태에 소요되는 평균 시간의 유의적인 감소를 유도했다. 데이터는 평균값 ± s.e.m으로 제공되며 이원 스튜던트 t-검정을 사용하여 분석한다. *P<0.05.

하기 설명은 유전자 요법을 위한 AAV 벡터 및 특히 포유류에서의 신경학적 장애, 예컨대 뇌전증의 치료를 위한 상기 벡터의 AAV 입자에 응용가능한 본 발명의 실시 형태에 집중한다.

신경학적 장애는, 특히 구조적 이상, 생화학적 이상, 및/또는 신호전달 이상을 나타내는, 뇌, 척수, 및 다른 신경을 포함하지만 이로 제한되지 않는 신경계의 장애의 큰 그룹을 포함한다. 신경학적 장애는 인간으로 제한되는 것이 아니라, 본 명세서에서 "대상"이라고 지칭되는 말, 개, 및 고양이와 같은 다른 포유류에서도 발견된다. 예를 들어, 일반적인 개 개체군에서 개 뇌전증의 발생률은 0.5% 내지 5.7%인 것으로 추산된다.

뉴로펩티드 Y(NPY)는 36개 아미노산 길이의 펩티드 신경전달물질이며 포유류 중추 신경계에서 가장 풍부하게 발현되는 것 중 하나이다. NPY는 알츠하이머병(문헌[Rose et al, 2009]), 헌팅톤병, 및 파킨슨병과 같은 신경퇴행성 질환의 동물 모델에서 신경보호를 수행하는 것으로 나타났다. 최초에 NPY는 랫트 해마 슬라이스에서 샤퍼 곁가지 CAl 시냅스(Schaffer collateral CAl synapse)의 흥분을 감소시키는 것으로 나타났으며, 이어서 시냅스전 글루타메이트 방출의 Y2 수용체-의존성 저해에 관여하는 것으로 나타났다. 글루타메이트는 뇌에서 주요 흥분성 신경전달물질이므로, 발작 활동 하에 관찰되는 개시, 확산, 및 불균형 시냅스 전달(out-of-scale synaptic transmission)의 원인이 된다. 이와 일관되게, NPY가 결핍된 돌연변이 마우스는 더 발작-감수성이며, 랫트의 실험적 발작 모델에서 NPY의 뇌실내 투여는 생체내에서 항-뇌전증양 효과를 발휘한다. 중요하게, NPY는 또한 인간 뇌전증 해마에서 흥분성 시냅스 전달을 저해한다(문헌[Patrylo et al, 1999]; 문헌[Ledri et al, 2015]). 해마에서 NPY의 항뇌전증 효과는 주로 Y2 또는 Y5 수용체에 대한 결합을 통해 매개되는 반면에(문헌[Woldbye et al, 1997, 2005]; 문헌[El Bahh et al., 2005]; 문헌[Benmaamar et al., 2005]), Yl 수용체의 활성화는 발작-촉진성이다(문헌[Benmaamar et al, 2003]).

그의 항-뇌전증 효과로 인해, NPY는 표적화 유전자 요법에 응용되어 왔다. 따라서 NPY의 rAAV-매개 해마 과발현은 랫트에서의 자극-유도 급성 발작 및 뇌전증 지속상태 인설트(status epilepticus insult) 후 3 개월의 자발적 발작에 대해 억제 효과를 발휘한다. 차별적 NPY 수용체 아형 특이적 관여를 활용하기 위해, 유전자 요법은 또한 Yl, Y2, 또는 Y5 수용체 단독 또는 NPY와의 조합의 과발현과 함께 수행되어 왔다. 따라서 NPY 및 Y2 또는 Y5의 조합된 해마 과발현은 NPY 또는 수용체 과발현 단독에 비교하여 랫트에서의 자극-유도 급성 발작에 대해 우월한 발작-억제 효과를 나타낸다(문헌[Wholdbye et al, 2010]; 문헌[Gotzsche et al, 2012]).

반면에, 후속 연구에 의해 예측된 바와 같이 Yl 수용체의 해마 과발현은 발작-촉진 효과를 유발한다(문헌[Benmaamar et al, 2003]; 문헌[Olesen et al., 2012]). 유사한 접근법에서 작용제 NPY 13-36을 선호하는 Y2의 rAAV 벡터 매개 과발현 또한 항-뇌전증 효과를 발휘했다(문헌[Foti et al, 2007]). 이어서, 랫트에서의 뇌전증의 임상적으로 적절한 장기 만성 모델에서 시험했을 때, NPY 및 Y2 수용체 rAAV 벡터-매개 과발현의 항-뇌전증 효과의 변환 값(translational value)은 추가의 지지를 얻었다(문헌[Ledri et al, 2016]). 뇌전증 및/또는 파킨슨병을 치료하거나 저해하기 위해 이를 필요로 하는 대상에서 AAV 벡터를 이용하는 유전자 요법을 위한 몇몇 접근법이 본 명세서에 기재되어 있다. 또한, AAV 벡터는 이제 신경학적 질환의 치료에서 치료 형질전환 유전자의 전달을 위해 사용하기에 안전한 것으로 간주된다(문헌[McCown, 2011]; 문헌[Bartus et al, 2014]). 그러나, 그들의 치료 형질전환 유전자를 안전한 방식으로 발현시킴에 있어서 효율적인 재조합 바이러스 벡터의 개발은 몇몇 장애물에 봉착했으며, 이는 인간 유전자 요법에서의 그들의 광범위한 사용에 있어서 현존하는 장애물이다. 따라서, rAAV 벡터가 관여하는 새로운 유전자 요법의 설계는 특이적 조직 및 유전자 요법 표적을 위한 고도로 맞춤형이고 독특한 작제물을 생성하는 여러 상이한 요소들의 신중한 선택을 수반한다.

특정 AAV 혈청형 캡시드 단백질과 합동으로 사용되는 경우에 본 명세서에 기술된 벡터 배열 및 작용성 요소(예를 들어, 작제물 내의 유전적 요소의 순서 및/또는 소정의 유전적 요소들 사이의 거리)의 특이적 선택을 고려하여, 단일 rAAV에 의해 암호화되는 NPY 및 Y2 수용체의 과발현을 포함하는 신규 유전자 요법은 효율적인 생체내 발현을 일으킬 것으로 예상되었다. 하기 제공되는 개시는, 뇌전증 또는 파킨슨병 또는 그들과 연계된 병폐, 예컨대 발작 활동을 치료 또는 개선하는 약제를 필요로 하는 대상에서 뇌전증 및/또는 파킨슨병을 치료 및/또는 저해하기 위한 이들 조성물 및 이들 조성물의 제조 및 사용 방법에 대한 더 상세한 사항을 제공한다.

rAAV NPY 및 NPY2R 벡터

NPY 및 NPY2R 코딩 서열을 동일한 벡터 내에 가짐으로써, NPY2R 및 NPY는 상응하는 방식으로 확산될 것이며, 이는 효과 분자 NPY 및 그의 표적 발작-저해 수용체 NPY2R의 발현의 밀접한 연계를 보장한다. 추가로, NPY 및 NPY2R 코딩 서열을 동일한 벡터 내에 가짐으로써, 하나의 세포에서 NPY 및 NPY2R의 유전체 삽입의 수가 상응할 수 있으며, 이는 삽입된 NPY 및 NPY2R 유전자의 제어된 비를 가능하게 한다.

따라서 제1 실시 형태에서, 재조합 아데노-관련 바이러스(rAAV) 벡터는 뉴로펩티드 Y(NPY; 서열 번호 15 참조) 코딩 서열 및 뉴로펩티드 Y2 수용체(NPY2R; 서열 번호 16 참조) 코딩 서열을 포함한다.

벡터 내의 뉴로펩티드 Y(NPY) 코딩 서열은 서열 번호 1에 상응하는 서열을 가지거나 서열 번호 1에 대해 적어도 90% 서열 동일성, 예컨대 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성(%SI)을 공유할 수 있다. 뉴로펩티드 Y(NPY) 코딩 서열은 그것이 작용성 뉴로펩티드 Y를 암호화하는 한, 예를 들어, 분자가 그의 수용체에 결합할 수 있는 한 절단될 수 있다. 절단된 서열은 적어도 255, 예컨대 265, 275, 285, 290개(294개 중에서)의 염기를 포함하며, 서열 번호 1에 대해 적어도 90% 서열 동일성, 예컨대 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성(%SI)을 공유하고, 작용성 뉴로펩티드 Y를 암호화할 수 있다(예를 들어, 분자가 그의 수용체에 결합할 수 있음).

벡터 내의 뉴로펩티드 Y2 수용체(NPY2R) 코딩 서열은 서열 번호 2에 상응하는 서열을 가지거나 서열 번호 2에 대해 적어도 90% 서열 동일성, 예컨대 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성(%SI)을 공유할 수 있다. 뉴로펩티드 Y2 수용체(NPY2R) 코딩 서열은 그것이 작용성 뉴로펩티드 Y2 수용체인 한, 예를 들어, 분자가 그의 리간드에 결합할 수 있는 한 절단될 수 있다. 절단된 서열은 적어도 975, 예컨대 1000, 1115, 1130, 1140개(1146개 중에서)의 염기를 포함하며, 서열 번호 2에 대해 적어도 90% 서열 동일성, 예컨대 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성(%SI)을 공유하고, 작용성 뉴로펩티드 Y2 수용체를 암호화할 수 있다(예를 들어, 분자가 그의 리간드에 결합할 수 있음).

수용체 풍부도(receptor abundance)가 조직-특이적 발현에서의 인자이지만, AAV 벡터의 다른 요소가 조직-특이적 발현에 영향을 줄 수 있다. 하기 기재된 바와 같이, 형질전환 유전자 배향, 즉, NPY 및 NPY2R 유전자의 순서 및/또는 벡터 내의 NPY 및/또는 NPY2R을 암호화하는 유전자로부터 프로모터 요소 및/또는 인핸서 요소에 대한 거리의 제어에 의해 추가의 발현 제어가 벡터 설계에 제공된다. 내인성 유전자 프로모터에 의해, 또는 프로모터 요소 또는 인핸서 요소로부터 야기되는 전사 간섭(transcriptional interference)은 유전자좌에서의 형질전환 유전자 발현에 영향을 준다. 따라서, 개질되지 않은 관용적인 벡터 설계에 비교하여, 선택된 벡터 프로모터 요소 및/또는 인핸서 요소에 관하여 형질전환 유전자 발현을 개선하도록 벡터가 개질되었다. 제1 실시 형태에서, 벡터 내의 NPY 및 NPY2R 암호화 유전자의 형질전환 유전자 배향은 프로모터에 대한 인접성의 관점에서 NPY 암호화 유전자가 NPY2R 암호화 유전자 앞에 오도록 하는 것이다(예를 들어, NPY 암호화 유전자는 그것이 NPY2R 암호화 유전자보다 프로모터에 더 인접하도록 벡터 상에서 NPY2R 암호화 유전자의 업스트림(upstream)에 제공됨). 상기 뉴로펩티드 Y(NPY) 암호화 서열은 서열 번호 l에 상응하는 서열 또는 상기 서열에 대해 적어도 90% 서열 동일성, 예컨대 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성(%SI)을 나타내는 서열을 가질 수 있다. 상기 뉴로펩티드 Y2 수용체(NPY2R) 암호화 서열은 서열 번호 2에 상응하는 서열 또는 상기 서열에 대해 적어도 90%, 예컨대 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성(%SI)을 나타내는 서열을 가질 수 있다. 유전자 발현을 통해, 뉴로펩티드 Y(NPY) 코딩 서열은 프로-뉴로펩티드 Y 전단백질 전구물질(서열 번호 15)의 합성에 사용되고, 뉴로펩티드 Y2 수용체(NPY2R) 코딩 서열은 뉴로펩티드 Y 수용체 유형 2(서열 번호 16)의 합성에 사용된다. 당업자에게 공지된 바와 같이, 대안적 서열 또한 동일한 펩티드 서열을 암호화할 수 있다는 것이 가능하다. 따라서, 재조합 아데노-관련 바이러스(rAAV) 벡터는 서열 번호 15에 따른 단백질을 암호화하는 서열, 또는 상기 서열에 대해 적어도 90% 서열 동일성, 예컨대 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성(%SI)을 나타내는 서열, 및 서열 번호 16에 따른 단백질을 코딩하는 서열, 또는 상기 서열에 대해 적어도 90% 서열 동일성, 예컨대 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성(%SI)을 나타내는 서열 또한 포함할 수 있다. NPY 암호화 유전자는 상기 프로모터에 병치될 수 있다. NPY 암호화 유전자는 프로모터 지역의 단부로부터 5-60, 5-50, 5-40, 5-30, 5-20, 5-15, 또는 5-10개 뉴클레오티드 이내에서 시작될 수 있다(예를 들어, NPY 암호화 유전자가 프로모터 지역의 단부로부터 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 또는 60개 뉴클레오티드에서 시작되거나, NPY 암호화 유전자가 프로모터로부터 전술한 수의 뉴클레오티드 위치 중 임의의 2개에 의해 정의되는 범위 이내에서 시작된다). 프로모터는 사이토메갈로바이러스 인핸서/닭 β-액틴(CAG) 프로모터일 수 있다. 벡터 내의 CAG 프로모터 서열은 서열 번호 4에 대해 적어도 90% 서열 동일성, 예컨대 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성(%SI)을 공유할 수 있다. CAG 프로모터 서열은 그것이 작용성인 한(예를 들어, 유전자의 발현을 유도함) 절단될 수 있으며, 절단된 CAG 프로모터 서열은 적어도 850, 예컨대 875, 900, 925, 935개(936개 중에서)의 염기를 포함하고, 서열 번호 4에 대해 적어도 90% 서열 동일성, 예컨대 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성(%SI)을 공유하며, 상기 프로모터에 작동적으로 연결된 유전자의 발현을 유도할 수 있다. CAG 프로모터는 서열 번호 4에 상응하는 서열 또는 서열 번호 4에 대해 적어도 90% 서열 동일성, 예컨대 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성(%SI)을 나타내는 서열을 가질 수 있다. IRES 서열은 벡터 내의 NPY와 NPY2R 암호화 유전자들 사이에 위치할 수 있다. IRES 서열은 NPY 암호화 유전자의 단부로부터 5-50, 5-40, 5-30, 5-20, 5-15, 또는 5-10개 뉴클레오티드 이내에서 시작될 수 있다(예를 들어, IRES 서열이 NPY 암호화 유전자의 단부로부터 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 또는 50개 뉴클레오티드에서 시작되거나, IRES 서열이 NPY 암호화 서열로부터 전술한 수의 뉴클레오티드 위치 중 임의의 2개에 의해 정의되는 범위 이내에서 시작된다). IRES 서열은 NPY2R 암호화 유전자의 시작으로부터 5-50, 5-40, 5-30, 5-20, 5-15, 또는 5-10개 뉴클레오티드 이내에서 끝날 수 있다(예를 들어, IRES 서열이 NPY2R 암호화 유전자의 시작으로부터 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 또는 50개 뉴클레오티드에서 끝나거나, IRES 서열이 NPY2R 암호화 서열의 시작으로부터 전술한 수의 뉴클레오티드 위치 중 임의의 2개에 의해 정의되는 범위 이내에서 끝난다). IRES 서열은 A7 EMCV IRES 서열일 수 있다. 벡터 내의 A7 EMCV IRES 서열은 서열 번호 3에 대해 적어도 90% 서열 동일성, 예컨대 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성(%SI)을 공유할 수 있다. A7 EMCV IRES 서열은 그것이 작용성인 한(예를 들어, 유전자 발현을 유도함) 절단될 수 있으며, 절단된 A7 EMCV IRES 서열은 적어도 525, 545, 560, 570, 또는 575개(582개 중에서)의 염기를 포함하고, 서열 번호 3에 대해 적어도 90% 서열 동일성, 예컨대 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성(%SI)을 공유할 수 있다. IRES는 서열 번호 3에 상응하는 서열 또는 서열 번호 3에 대해 적어도 90% 서열 동일성, 예컨대 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성(%SI)을 나타내는 서열을 가질 수 있다. 우드척 간염 전사후 조절 요소(WPRE)는 벡터 내의 NPY 및 NPY2R 암호화 유전자의 다운스트림에 위치할 수 있으며, 임의로 WPRE는 NPY2R 암호화 유전자에 인접하고/하거나 병치된다. WPRE 서열은 벡터 내의 NPY2R 암호화 유전자로부터 다운스트림에 위치할 수 있다. WPRE 서열은 NPY2R 암호화 유전자의 단부로부터 5-80, 5-70, 5-60, 5-50, 5-40, 5-30, 5-20, 5-15, 또는 5-10개 뉴클레오티드 이내에서 시작될 수 있다(예를 들어, WPRE 서열이 NPY2R 암호화 유전자의 단부로부터 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 또는 80개 뉴클레오티드에서 시작되거나, WPRE 서열이 NPY2R 암호화 서열로부터 전술한 수의 뉴클레오티드 위치 중 임의의 2개에 의해 정의되는 범위 이내에서 시작된다). 벡터 내의 WPRE 서열은 서열 번호 5에 대해 적어도 90% 서열 동일성, 예컨대 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성(%SI)을 공유할 수 있다. 이 서열은 우드척 간염 B 바이러스(WHV8) 유전체의 염기쌍 1093 내지 1684와 100% 상동성을 나타낸다. WPRE 서열은 그것이 작용성인 한 절단될 수 있으며, 절단된 WPRE 서열은 적어도 525, 545, 555, 565, 575, 또는 585개(593개 중에서)의 염기를 포함하고, 서열 번호 5에 대해 적어도 90%, 예컨대 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성(%SI)을 공유할 수 있다. WRPE는 서열 번호 5에 상응하는 서열 또는 서열 번호 5에 대해 적어도 90% 서열 동일성, 예컨대 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성(%SI)을 나타내는 서열을 가질 수 있다. 벡터는 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 신호(BGHpA)를 포함할 수 있으며, 이는 벡터 내의 NPY 및 NPY2R 암호화 유전자로부터 다운스트림에 위치하고, 임의로 WPRE에 인접하고/하거나 병치된다. BGHpA 서열은 WPRE 서열로부터 다운스트림에 위치할 수 있다. BGHpA 서열은 WPRE 서열의 단부로부터 5-50, 5-40, 5-30, 5-20, 5-15, 또는 5-10개 뉴클레오티드 이내에서 시작될 수 있다(예를 들어, BGHpA 서열이 WPRE 서열의 단부로부터 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 또는 50개 뉴클레오티드에서 시작되거나, BGHpA 서열이 WPRE 서열로부터 전술한 수의 뉴클레오티드 위치 중 임의의 2개에 의해 정의되는 범위 이내에서 시작된다). 벡터 내의 "BGHpA 신호 서열"이라고도 지칭되는 BGHpA 서열은 서열 번호 6에 대해 적어도 90% 서열 동일성, 예컨대 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성(%SI)을 공유할 수 있다. BGHpA 신호 서열은 그것이 작용성인 한 절단될 수 있으며, 절단된 BGHpA 신호 서열은 적어도 225, 235, 245, 255, 또는 265개(269개 중에서)의 염기를 포함하고, 서열 번호 6에 대해 적어도 90% 서열 동일성, 예컨대 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성(%SI)을 공유할 수 있다. BGHpA 신호는 서열 번호 6에 상응하는 서열 또는 서열 번호 6에 대해 적어도 90% 서열 동일성, 예컨대 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성(%SI)을 나타내는 서열을 가질 수 있다. 벡터는 또한 프로모터로부터 업스트림에 위치하는 제1 AAV2 반전 말단 반복(ITR) 도메인 및/또는 벡터 내의 NPY 및 NPY2R 암호화 유전자로부터 다운스트림에 위치하는 제2 ITR 도메인을 포함할 수 있으며, 바람직하게 제2 ITR 도메인은 BGHpA 도메인에 인접하여 위치한다. 벡터 내의 5'-단부 ITR 서열은 서열 번호 7에 대해 적어도 90% 서열 동일성, 예컨대 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성(%SI)을 공유할 수 있다. 5'-단부 ITR 서열은 그것이 작용성인 한 절단될 수 있으며, 절단된 ITR 서열은 적어도 145, 예컨대 155, 165, 175, 180개(183개 중에서)의 염기를 포함하고, 서열 번호 7에 대해 적어도 90% 서열 동일성, 예컨대 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성(%SI)을 공유할 수 있다. 벡터 내의 3'-단부 ITR 서열은 서열 번호 8에 대해 적어도 90% 서열 동일성, 예컨대 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성(%SI)을 공유할 수 있다. 3'-단부 ITR 서열은 그것이 작용성인 한 절단될 수 있으며, 절단된 ITR 서열은 적어도 145, 예컨대 155, 165, 175, 180개(183개 중에서)의 염기를 포함하고, 서열 번호 8에 대해 적어도 90%, 예컨대 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성(%SI)을 공유할 수 있다. 5' 단부 ITR은 서열 번호 7에 상응하는 서열 또는 서열 번호 7에 대해 적어도 90% 서열 동일성, 예컨대 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성(%SI)을 나타내는 서열을 가질 수 있고, 3' 단부 ITR은 서열 번호 8에 상응하는 서열 또는 서열 번호 8에 대해 적어도 90% 서열 동일성, 예컨대 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성(%SI)을 나타내는 서열을 가진다. 전술한 유전자 중 임의의 하나 이상을 인간에서의 발현을 위해 코돈 최적화할 수 있다. 하기 기재된 바와 같이, 3개의 AAV 혈청형이 본 명세서에 기재된 벡터의 유전자 전달에 효과적인 것으로 확인되었다: AAV2, AAV1, 및 AAV8. 따라서, 상기 기재된 벡터는 AAVl, AAV2, 및 AAV8로 구성된 그룹 중에서 선택된 AAV 캡시드 단백질로 포장될 수 있다. 또한, 하기 기재된 바와 같이, AAVl 캡시드 단백질로 포장된 벡터는 뇌전증 발작 모델에서의 시험에서 더 양호하게 기능했으며, 따라서 벡터의 바람직한 포장은 AAVl 캡시드 단백질을 이용한 것임이 확인되었다.

제2 실시 형태에서, 벡터 내의 NPY 및 NPY2R 암호화 유전자의 형질전환 유전자 배향은 NPY2R 암호화 유전자가 NPY 암호화 유전자 앞에 오도록 하여 그것이 프로모터에 더 인접하게 하는 것이다(예를 들어, NPY2R 암호화 유전자는 그것이 NPY 암호화 유전자보다 프로모터에 더 인접하도록 벡터 상에서 NPY 암호화 유전자의 업스트림에 제공된다). 상기 뉴로펩티드 Y(NPY) 암호화 서열은 서열 번호 l에 상응하는 서열 또는 상기 서열에 대해 적어도 90% 서열 동일성, 예컨대 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성(%SI)을 나타내는 서열을 가질 수 있다. 상기 뉴로펩티드 Y2 수용체(NPY2R) 암호화 서열은 서열 번호 2에 상응하는 서열 또는 상기 서열에 대해 적어도 90%, 예컨대 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성(%SI)을 나타내는 서열을 가질 수 있다. 유전자 발현을 통해, 뉴로펩티드 Y(NPY) 코딩 서열은 프로-뉴로펩티드 Y 전단백질 전구물질(서열 번호 15)의 합성에 사용되고, 뉴로펩티드 Y2 수용체(NPY2R) 코딩 서열은 뉴로펩티드 Y 수용체 유형 2(서열 번호 16)의 합성에 사용된다. 당업자에게 공지된 바와 같이, 대안적 서열 또한 동일한 펩티드 서열을 암호화할 수 있다는 것이 가능하다. 따라서, 재조합 아데노-관련 바이러스(rAAV) 벡터는 서열 번호 15에 따른 단백질을 암호화하는 서열, 또는 상기 서열에 대해 적어도 90% 서열 동일성, 예컨대 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성(%SI)을 나타내는 서열, 및 서열 번호 16에 따른 단백질을 코딩하는 서열, 또는 상기 서열에 대해 적어도 90% 서열 동일성, 예컨대 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성(%SI)을 나타내는 서열을 포함할 수 있다. NPY 암호화 유전자는 상기 프로모터에 병치될 수 있다. NPY2R 암호화 유전자는 프로모터 지역의 단부로부터 5-60, 5-50, 5-40, 5-30, 5-20, 5-15, 또는 5-10개 뉴클레오티드 이내에서 시작될 수 있다(예를 들어, NPY2R 암호화 유전자가 프로모터 지역의 단부로부터 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 또는 60개 뉴클레오티드에서 시작되거나, NPY2R 암호화 유전자가 프로모터로부터 전술한 수의 뉴클레오티드 위치 중 임의의 2개에 의해 정의되는 범위 이내에서 시작된다). 프로모터는 사이토메갈로바이러스 인핸서/닭 β-액틴(CAG) 프로모터일 수 있다. 벡터 내의 CAG 프로모터 서열은 서열 번호 4에 대해 적어도 90% 서열 동일성, 예컨대 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성(%SI)을 공유할 수 있다. CAG 프로모터 서열은 그것이 작용성인 한(예를 들어, 유전자의 발현을 유도함) 절단될 수 있으며, 절단된 CAG 프로모터 서열은 적어도 850, 예컨대 875, 900, 925, 935개(936개 중에서)의 염기를 포함하고, 서열 번호 4에 대해 적어도 90% 서열 동일성, 예컨대 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성(%SI)을 공유하며, 상기 프로모터에 작동적으로 연결된 유전자의 발현을 유도할 수 있다. CAG 프로모터는 서열 번호 4에 상응하는 서열 또는 서열 번호 4에 대해 적어도 90% 서열 동일성, 예컨대 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성(%SI)을 나타내는 서열을 가질 수 있다. IRES 서열은 벡터 내의 NPY와 NPY2R 암호화 유전자들 사이에 위치할 수 있다. IRES 서열은 NPY2R 암호화 유전자의 단부로부터 5-50, 5-40, 5-30, 5-20, 5-15, 또는 5-10개 뉴클레오티드 이내에서 시작될 수 있다(예를 들어, IRES 서열이 NPY2R 암호화 유전자의 단부로부터 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 또는 50개 뉴클레오티드에서 시작되거나, IRES 서열이 NPY2R 암호화 서열로부터 전술한 수의 뉴클레오티드 위치 중 임의의 2개에 의해 정의되는 범위 이내에서 시작된다). IRES 서열은 NPY 암호화 유전자의 시작으로부터 5-50, 5-40, 5-30, 5-20, 5-15, 또는 5-10개 뉴클레오티드 이내에서 끝날 수 있다(예를 들어, IRES 서열이 NPY 암호화 유전자의 시작으로부터 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 또는 50개 뉴클레오티드에서 끝나거나, IRES 서열이 NPY 암호화 서열의 시작으로부터 전술한 수의 뉴클레오티드 위치 중 임의의 2개에 의해 정의되는 범위 이내에서 끝난다). IRES 서열은 A7 EMCV IRES 서열일 수 있다. 벡터 내의 A7 EMCV IRES 서열은 서열 번호 3에 대해 적어도 90% 서열 동일성, 예컨대 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성(%SI)을 공유할 수 있다. A7 EMCV IRES 서열은 그것이 작용성인 한(예를 들어, 유전자 발현을 유도함) 절단될 수 있으며, 절단된 A7 EMCV IRES 서열은 적어도 525, 545, 560, 570, 또는 575개(582개 중에서)의 염기를 포함하고, 서열 번호 3에 대해 적어도 90% 서열 동일성, 예컨대 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성(%SI)을 공유할 수 있다. IRES는 서열 번호 3에 상응하는 서열 또는 서열 번호 3에 대해 적어도 90% 서열 동일성, 예컨대 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성(%SI)을 나타내는 서열을 가질 수 있다. 우드척 간염 전사후 조절 요소(WPRE)는 벡터 내의 NPY 및 NPY2R 암호화 유전자의 다운스트림에 위치할 수 있으며, 임의로 WPRE는 NPY 암호화 유전자에 인접하고/하거나 병치된다. WPRE 서열은 벡터 내의 NPY 암호화 유전자로부터 다운스트림에 위치할 수 있다. WPRE 서열은 NPY 암호화 유전자의 단부로부터 5-80, 5-70, 5-60, 5-50, 5-40, 5-30, 5-20, 5-15, 또는 5-10개 뉴클레오티드 이내에서 시작될 수 있다(예를 들어, WPRE 서열이 NPY 암호화 유전자의 단부로부터 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 또는 80개 뉴클레오티드에서 시작되거나, WPRE 서열이 NPY 암호화 서열로부터 전술한 수의 뉴클레오티드 위치 중 임의의 2개에 의해 정의되는 범위 이내에서 시작된다). 벡터 내의 WPRE 서열은 서열 번호 5에 대해 적어도 90% 서열 동일성, 예컨대 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성(%SI)을 공유할 수 있다. 이 서열은 우드척 간염 B 바이러스(WHV8) 유전체의 염기쌍 1093 내지 1684와 100% 상동성을 나타낸다. WPRE 서열은 그것이 작용성인 한 절단될 수 있으며, 절단된 WPRE 서열은 적어도 525, 545, 555, 565, 575, 또는 585개(593개 중에서)의 염기를 포함하고, 서열 번호 5에 대해 적어도 90%, 예컨대 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성(%SI)을 공유할 수 있다. WRPE는 서열 번호 5에 상응하는 서열 또는 서열 번호 5에 대해 적어도 90% 서열 동일성, 예컨대 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성(%SI)을 나타내는 서열을 가질 수 있다. 벡터는 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 신호(BGHpA)를 포함할 수 있으며, 이는 벡터 내의 NPY 및 NPY2R 암호화 유전자로부터 다운스트림에 위치하고, 임의로 WPRE에 인접하고/하거나 병치된다. BGHpA 서열은 WPRE 서열로부터 다운스트림에 위치할 수 있다. BGHpA 서열은 WPRE 서열의 단부로부터 5-50, 5-40, 5-30, 5-20, 5-15, 또는 5-10개 뉴클레오티드 이내에서 시작될 수 있으며(예를 들어, BGHpA 서열이 WPRE 서열의 단부로부터 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 또는 50개 뉴클레오티드에서 시작되거나, BGHpA 서열이 WPRE 서열로부터 전술한 수의 뉴클레오티드 위치 중 임의의 2개에 의해 정의되는 범위 이내에서 시작된다). 벡터 내의 "BGHpA 신호 서열"이라고도 지칭되는 BGHpA 서열은 서열 번호 6에 대해 적어도 90% 서열 동일성, 예컨대 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성(%SI)을 공유할 수 있다. BGHpA 신호 서열은 그것이 작용성인 한 절단될 수 있으며, 절단된 BGHpA 신호 서열은 적어도 225, 235, 245, 255, 또는 265개(269개 중에서)의 염기를 포함하고, 서열 번호 6에 대해 적어도 90% 서열 동일성, 예컨대 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성(%SI)을 공유할 수 있다. BGHpA 신호는 서열 번호 6에 상응하는 서열 또는 서열 번호 6에 대해 적어도 90% 서열 동일성, 예컨대 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성(%SI)을 나타내는 서열을 가질 수 있다. 벡터는 또한 프로모터로부터 업스트림에 위치하는 제1 AAV2 반전 말단 반복(ITR) 도메인 및/또는 벡터 내의 NPY 및 NPY2R 암호화 유전자로부터 다운스트림에 위치하는 제2 ITR 도메인을 포함할 수 있으며, 바람직하게 제2 ITR 도메인은 BGHpA 도메인에 인접하여 위치한다. 벡터 내의 5'-단부 ITR 서열은 서열 번호 7에 대해 적어도 90% 서열 동일성, 예컨대 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성(%SI)을 공유할 수 있다. 5'-단부 ITR 서열은 그것이 작용성인 한 절단될 수 있으며, 절단된 ITR 서열은 적어도 145, 예컨대 155, 165, 175, 180개(183개 중에서)의 염기를 포함하고, 서열 번호 7에 대해 적어도 90% 서열 동일성, 예컨대 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성(%SI)을 공유할 수 있다. 벡터 내의 3'-단부 ITR 서열은 서열 번호 8에 대해 적어도 90% 서열 동일성, 예컨대 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성(%SI)을 공유할 수 있다. 3'-단부 ITR 서열은 그것이 작용성인 한 절단될 수 있으며, 절단된 ITR 서열은 적어도 145, 예컨대 155, 165, 175, 180개(183개 중에서)의 염기를 포함하고, 서열 번호 8에 대해 적어도 90%, 예컨대 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성(%SI)을 공유할 수 있다. 5' 단부 ITR은 서열 번호 7에 상응하는 서열 또는 서열 번호 7에 대해 적어도 90% 서열 동일성, 예컨대 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성(%SI)을 나타내는 서열을 가질 수 있고, 3' 단부 ITR은 서열 번호 8에 상응하는 서열 또는 서열 번호 8에 대해 적어도 90% 서열 동일성, 예컨대 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성(%SI)을 나타내는 서열을 가진다. 전술한 유전자 중 임의의 하나 이상을 인간에서의 발현을 위해 코돈 최적화할 수 있다. 하기 기재된 바와 같이, 3개의 AAV 혈청형이 본 명세서에 기재된 벡터의 유전자 전달에 효과적인 것으로 확인되었다: AAV2, AAV1, 및 AAV8. 따라서, 상기 기재된 벡터는 AAVl, AAV2, 및 AAV8로 구성된 그룹 중에서 선택된 AAV 캡시드 단백질로 포장될 수 있다. 또한, 하기 기재된 바와 같이, AAVl 캡시드 단백질로 포장된 벡터는 뇌전증 발작 모델에서의 시험에서 더 양호하게 기능했으며, 따라서 벡터의 바람직한 포장은 AAVl 캡시드 단백질을 이용한 것임이 확인되었다. 이들 벡터의 특이적 요소 및 포장 시스템에 대한 더 많은 개시는 하기 문단에 제공되어 있다.

아데노 -관련 바이러스

아데노-관련 바이러스(AAV)는 인간, 영장류, 및 비-영장류 동물 종(예컨대 고양이 및 개 및 기타 다수)을 감염시키는 것으로 공지된 파르보비리다에(Parvoviridae) 패밀리로부터의 작은 비-외피형 DNA 바이러스의 그룹을 구성한다. AAV는 현재 질환을 야기하는 것으로 공지되어 있지 않으며, 바이러스는 매우 경미한 면역 반응을 야기한다. AAV를 사용하는 유전자 요법 벡터는 분열하는 세포 및 휴지기 세포(세포가 분열하고 있지 않을 때의 세포의 상태) 양자 모두를 형질도입(즉, 진입하여 형질전환 유전자 발현을 개시함)시키고 숙주 세포의 유전체 내로의 통합 없이 염색체외 상태로 지속될 수 있다(자생 바이러스(native virus)에서는 인간 염색체 19의 특이적 부위 상에서 숙주 유전체 내로의 바이러스 담지 유전자의 일부 통합이 일어남). 이들 특징은 유전자 요법을 위한 바이러스 벡터를 생성함에 있어서 AAV를 매우 매력적으로 만든다.

2005년 현재, 인간 및 비-인간 영장류로부터의 조직 샘플에서 적어도 110개의 비-중복성 AAV 혈청형이 확인되고 기재되었다. 혈청형은 박테리아 또는 바이러스의 종 내에서, 또는 상이한 개체의 면역 세포 중에서 구별되는 변이이며, 그들의 세포 표면 항원을 기준으로 함께 분류되어, 유기체의 혈청학적 분류 및 역학적 분류를 아종 수준까지 가능하게 한다. 공지의 모든 AAV 혈청형은 다중의 다양한 조직 유형으로부터의 세포를 감염시킬 수 있다. 조직-특이성은 AAV 벡터의 캡시드 혈청형에 의해 결정되고, 이는 위형화(pseudotyping), 즉, 혈청형-특이적 캡시드 단백질을 변화시켜 요법에서의 그들의 용도를 위해 중요한 그들의 향성(tropism) 범위를 변경함으로써 변경될 수 있다. 이들 중에서, 지금까지 혈청형 2(AAV2)가 가장 광범위하게 시험되었다. AAV2는 골격근, 신경세포, 혈관 평활근 세포, 및 간세포를 향한 천연 향성을 제공한다. AAV2에 대해 헤파란 설페이트 프로테오글리칸(HSPG), aVβ5 인테그린, 및 섬유모세포 성장 인자 수용체 1(FGFR-1)의 3개 세포 수용체가 기재되어 있으며, 첫번째가 주된 수용체로서 작용하는 것으로 생각된다.

AAV2, AAV1, 및 AAV8의 3개의 AAV 혈청형이 본 명세서에 기재된 벡터의 유전자 전달에 효과적인 것으로 확인되었다. 뇌에서, 이들 AAV 혈청형은 신경세포 향성을 나타낸다.

마모셋, 마우스, 및 마카크의 대뇌 피질에서의, AAV2-기반의 유전체 구조, AAV 혈청형 1, 2, 또는 8로부터의 캡시드 단백질을 이용한 위형화, 및 호환성 프로모터(CMV, CaMKII, 또는 Syn I)로 구성된 벡터를 이용한 비교 연구에 의해, 향성, 확산, 및 형질도입 및 형질전환 유전자 발현의 효율에 있어서의 혈청형-특이적인 구별되는 특징이 밝혀졌다(문헌[Watakabe et al, 2015]).

전체 AAV2는 벡터의 더 작은 확산 및 자연 발생 신경세포 향성에 의해 다른 혈청형으로부터 구별되었다. 그러나, 모든 혈청형이 신경세포-특이적 프로모터(CaMKII 또는 Synl) 하에 신경세포에서 형질전환 유전자 발현을 유도할 수 있었으며, 혈청형 2를 제외하고는 바이러스 확산은 다른 혈청형들 중에서 상이하지 않았다. 제안된 모든 혈청형은 뇌 내로의 형질전환 유전자의 AAV 벡터-매개 전달에 적합한 것으로 나타난다.

혈청형 1 및 8은 확산 및 형질전환 유전자 발현에 있어서 유사하며 혈청형 2보다 더 효율적인 것으로 나타난다. 혈청형 1, 2, 및 8은 모두 신경교 및 신경세포의 형질도입이 가능한 것으로 입증되었으며, 구별되는 프로모터 선택에 의해 세포 아형 특이적 제한이 더 양호하게 달성되는 것으로 보인다.

일 실시 형태에서, AAV 캡시드 단백질은 AAV1, AAV2, 및 AAV8로 구성된 그룹 중에서 선택된다.

AAV 벡터 유전체 요소

형질전환 유전자의 발현을 유도하기에 적합한 AAV 벡터를 제조하기 위해, AAV 발현 카세트 내의 요소를 신중하게 평가하고 선택하였다. 이는 ITR 서열, 프로모터, 하나의 벡터로부터 다중 형질전환 유전자를 발현시키기 위한 멀티-시스트로닉(multi-cistronic) 발현 요소, 및 인핸서 요소를 포함한다.

ITR 서열

반전 말단 반복(ITR) 서열은 사용된 야생형 유전체로부터의 유일한 보존된 유전적 요소이며, 이들 서열은 제2 DNA 가닥 합성을 위한 자가-프라이밍 및 AAV 입자 내의 DNA의 캡시드화를 포함하는 몇몇 시스-작용 과정에 필요하다. 반전 말단 반복(ITR) 서열은 그들의 대칭에 따라 명명되었으며, 이는 AAV 유전체의 효율적인 증식에 필요한 것으로 나타난다. 그들은 헤어핀을 형성하는 그들의 능력에 의해 이 특성을 획득하며, 이는 제2 DNA 가닥의 프리마아제-비의존성 합성을 가능하게 하는 소위 자가-프라이밍에 기여한다. ITR은 AAV DNA의 숙주 세포 유전체(인간에서 19번 염색체) 내로의 통합과 더불어, 완전히 조립된 데옥시리보뉴클레아제-내성 AAV 입자의 생성과 조합된 AAV DNA의 효율적인 캡시드화 양자 모두에 필요한 것으로 나타났다. 이용가능한 ITR-서열의 선택 중에서, 본 명세서에 기재된 벡터 중 다수에 대해 AAV 혈청형 2가 선택되었으며, 이는 하기 기재된 바와 같이 비리온을 생성하도록 AAV1, AAV2, 또는 AAV8 캡시드 내로의 벡터의 효율적인 패킹을 가능하게 했다. 말단 반복으로서, 2개의 ITR 서열이 벡터의 5'-단부 및 3'-단부에 각각 위치한다.

일 실시 형태에서는, 2개의 ITR 서열이 각각 벡터의 5'-단부 및 3'-단부에, NPY 및 NPY2R에 대한 코딩 서열의 업스트림 및 다운스트림에 위치한다.

본 발명의 벡터 내의 5'-단부 ITR 서열은 서열 번호 7에 대해 적어도 90% 서열 동일성, 예컨대 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성(%SI)을 공유할 수 있다. 5'-단부 ITR 서열은 그것이 작용성인 한 절단될 수 있으며, 절단된 ITR 서열은 적어도 145, 예컨대 155, 165, 175, 180개(183개 중에서)의 염기를 포함하고, 서열 번호 7에 대해 적어도 90% 서열 동일성, 예컨대 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성(%SI)을 공유할 수 있다.

벡터 내의 3'-단부 ITR 서열은 서열 번호 8에 대해 적어도 90% 서열 동일성, 예컨대 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성(%SI)을 공유할 수 있다. 3'-단부 ITR 서열은 그것이 작용성인 한 절단될 수 있으며, 절단된 ITR 서열은 적어도 145, 예컨대 155, 165, 175, 180개(183개 중에서)의 염기를 포함하고, 서열 번호 8에 대해 적어도 90%, 예컨대 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성(%SI)을 공유할 수 있다.

일 실시 형태에서, 5' 단부 ITR은 서열 번호 7에 상응하는 서열 또는 서열 번호 7에 대해 적어도 90% 서열 동일성, 예컨대 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성(%SI)을 나타내는 서열을 가지며, 3' 단부 ITR은 서열 번호 8에 상응하는 서열 또는 서열 번호 8에 대해 적어도 90% 서열 동일성, 예컨대 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성(%SI)을 나타내는 서열을 갖는다.

CAG 프로모터

유전학에서, 프로모터는 특정 유전자의 전사를 개시하는 DNA의 지역이다. 프로모터는 동일한 가닥 상에, 그리고 DNA 상의 업스트림에(센스 가닥의 5' 지역을 향해), 유전자의 전사 시작 부위 부근에 위치한다. 통상적으로, 프로모터의 길이는 100 내지 1000 염기쌍이다. 일반적으로, 프로모터는 2개의 주요 부류, 즉, TATA 및 CpG로 분류되었다. 그러나, 동일한 전사 인자의 조합 형성(combinatorial formation)을 사용하는 유전자가 상이한 유전자 발현 패턴을 나타낸다. 추가로, 인간에서 상이한 조직이 구별되는 부류의 프로모터를 사용한다는 것이 확인되었다.

형질도입 속도 및 유전자 발현 수준에 대한 다양한 프로모터 서열의 효과는 세포 유형들 사이에서 변동될 것이다. 최적의 하나의 선택을 가능하게 하기 위해 광범위한 이용가능한 프로모터가 시험되고 평가되었다. 본 발명에서는, CAG 프로모터가 표적 조직에서 적합한 유전자 발현 촉발을 제공한다는 것이 확인되었다. 유전자 요법에 AAV 벡터를 사용하는 이전에 수행된 몇몇 임상 시험은 유익한 치료 효과를 위해 충분히 높은 효능을 얻음에 있어서 문제에 직면하였다. 그러므로 포유류 발현 벡터에서 높은 수준의 유전자 발현을 추진하기 위해 사용되는 강력한 합성 프로모터로서 공지된 CAG 프로모터가 선택되었다. 다수의 조직 유형에 대해, CAG 프로모터는 UBC 및 PGK 프로모터와 같이 통상적으로 사용되는 다른 세포 프로모터보다 더 높은 수준의 발현을 제공하는 것으로 확인되었다. CAG 프로모터는 하기 서열을 포함한다: (C) 사이토메갈로바이러스(CMV) 초기 인핸서 요소, (A) 프로모터, 닭 베타-액틴 유전자의 제1 엑손 및 제1 인트론, (G) 토끼 베타-글로빈 유전자의 스플라이스 수용자(splice acceptor). 그러므로, 그것이 전사된 서열의 일부(2개의 엑손 및 인트론) 및 인핸서 요소를 포함하므로, 그것은 엄격한 의미에서 프로모터가 아니다.

일 실시 형태에서, CAG 프로모터 서열은 NPY 및 NPY2R에 대한 코딩 서열의 업스트림에 위치한다.

본 발명의 벡터 내의 CAG 프로모터 서열은 서열 번호 4에 대해 적어도 90% 서열 동일성, 예컨대 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성(%SI)을 공유할 수 있다.

CAG 프로모터 서열은 그것이 작용성인 한(예를 들어, 유전자의 발현을 유도함) 절단될 수 있으며, 절단된 CAG 프로모터 서열은 적어도 850, 예컨대 875, 900, 925, 935개(936개 중에서)의 염기를 포함하고, 서열 번호 4에 대해 적어도 90% 서열 동일성, 예컨대 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성(%SI)을 공유하며, 상기 프로모터에 작동적으로 연결된 유전자의 발현을 유도할 수 있다.

일 실시 형태에서, CAG 프로모터는 서열 번호 4에 상응하는 서열 또는 서열 번호 4에 대해 적어도 90% 서열 동일성, 예컨대 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성(%SI)을 나타내는 서열을 갖는다.

IRES

IRES라고 약칭되는 내부 리보솜 진입 부위는 단백질 합성의 더 큰 과정의 일부로서 전령 RNA(mRNA) 서열의 중간에서 변역 개시를 가능하게 하는 뉴클레오티드 서열이다. 통상적으로, 개시 복합체의 조립을 위해 5' 캡 인식이 필요하므로, 번역은 진핵생물에서 mRNA 분자의 5' 단부에서만 개시될 수 있다. IRES 서열을 벡터 내로 포함함으로써, 단일 벡터로부터 2개의 유전자에 대해 바이-시스트로닉 발현을 가능하게 하며, 여기에서 제1 유전자는 정상적인 5' 캡에서 개시되고 제2 유전자는 IRES에서 개시된다.

추가로, NPY 및 NPY2R rAAV 벡터는 하나의 세포 내에 NPY 및 NPY2R의 동종 삽입(homogenous insertion)을 가능하게 하는 반면에, IRES 요소의 포함은 NPY 및 NPY2R 유전자의 이종 발현(heterogeneous expression)을 가능하게 한다. 추가로, NPY 및 NPY2R 유전자의 형질전환 배향(transgenic orientation)을 선택함으로써, 상기 기재된 바와 같은 2개의 형질전환 유전자들 사이의 발현 비를 교번시키는 것이 가능하다. 이에 의해, 표적 조직 및 치료를 위한 NPY 및 NPY2R 생체내 발현의 비의 적합한 균형이 달성될 수 있다.

일 실시 형태에서, IRES 서열은 NPY 및 NPY2R에 대한 코딩 서열들 사이에 위치한다.

현재 공지된 몇몇 상이한 바이러스 IRES 서열, 예컨대 피코르나바이러스 IRES, 상이한 간염 바이러스 IRES, 및 크리파바이러스 IRES가 있다.

가능한 공지된 IRES 서열 중에서, 본 발명자들은 개질된 A7 서열을 보유하는 뇌심근염 바이러스(EMCV)로부터의 내부 리보솜 진입 부위(IRES)가 벡터로 가장 적합하다는 것을 확인하였다.

뇌심근염 바이러스로부터의 IRES는 진핵세포 또는 무세포 추출물에서 단백질을 발현시키기 위해 실험적 응용 및 약제학적 응용에 통상적으로 사용되며, 그것은 적절하게 구성된 시스트론에 높은 수준의 캡-비의존성 번역 활성을 부여한다. 개질된 A7 서열(문헌[Rees et al, 1996]; 문헌[Bochkov and Palmenberg, 2006])은 개질되지 않은 EMCV IRES보다 A7 EMCV IRES의 경우에 더 양호한 시스트론 번역을 달성하는 것으로 나타났다.

본 발명의 벡터 내의 A7 EMCV IRES 서열은 서열 번호 3 내에 존재하는 상응하는 길이의 올리고뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 90%, 예컨대 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성(%SI)을 공유할 수 있다.

A7 EMCV IRES 서열은 그것이 작용성인 한 절단될 수 있으며, 절단된 A7 EMCV IRES 서열은 적어도 525, 545, 560, 570, 또는 575개(582개 중에서)의 염기를 포함하고, 서열 번호 3 내의 상응하는 길이의 올리고뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 90%, 예컨대 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성(%SI)을 공유할 수 있다.

일 실시 형태에서, IRES는 서열 번호 3에 상응하는 서열 또는 서열 번호 3 내에 존재하는 상응하는 길이의 올리고뉴클레오티드 단편에 대해 적어도 90%, 예컨대 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성(%SI)을 나타내는 서열을 갖는다.

WPRE

표적 세포에서의 유전자 발현을 보장하기 위해, 전달 및 전사의 수준을 최적화할 수 있다. 그러나, 유전자 발현의 개선을 위한 전사-후 방법 또한 적용할 수 있다. 본 발명의 벡터는 우드척 간염 전사-후 조절 요소(WPRE)를 포함할 수 있다. WPRE는 특이적 3차 구조의 형성에 의해 형질전환 유전자 발현을 증가시킴으로써 전사 후에 이종기원 유전자의 발현을 향상시키는 것을 보조하는 DNA 서열이다. WPRE는 감마, 알파, 및 베타 구성요소를 가진 3부 조절 요소이다. 본 발명의 벡터에는, 완전한 WPRE 활성을 위해 전체 3부 WPRE가 포함되었다.

일 실시 형태에서, WPRE 서열은 NPY 및 NPY2R에 대한 코딩 서열로부터 다운스트림에 위치한다.

본 발명의 벡터 내의 WPRE 서열은 서열 번호 5에 대해 적어도 90% 서열 동일성, 예컨대 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성(%SI)을 공유할 수 있다. 이 서열은 우드척 간염 B 바이러스(WHV8) 유전체의 염기쌍 1093 내지 1684와 100% 상동성을 나타낸다.

WPRE 서열은 그것이 작용성인 한 절단될 수 있으며, 절단된 WPRE 서열은 적어도 525, 545, 555, 565, 575, 또는 585개(593개 중에서)의 염기를 포함하고, 서열 번호 5에 대해 적어도 90%, 예컨대 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성(%SI)을 공유할 수 있다.

일 실시 형태에서, WRPE은 서열 번호 5에 상응하는 서열 또는 서열 번호 5에 대해 적어도 90% 서열 동일성, 예컨대 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성(%SI)을 나타내는 서열을 갖는다.

소 성장 호르몬 폴리 - 아데닐화 ( BGHpA ) 신호 서열

벡터는 또한 소 성장 호르몬 폴리-아데닐화(BGHpA 또는 bGH-폴리A) 신호 서열을 포함할 수 있다. BGHpA 신호 서열은 형질전환 유전자 전사체의 효율적이고 정확한 폴리아데닐화를 보장하는 3'-인접 서열이다(문헌[Goodwin and Rottman, 1992]). 2개의 주요 작용은 전사를 종결시키는 것 및 핵으로부터 리보솜으로의 RNA 수송에 부가하여 전사된 RNA의 3' 단부를 분해에 대해 보호하는 것이다. 따라서 BGHpA 신호 서열은 벡터 내의 제2 최종 요소로서 3'-단부에서 ITR 서열의 바로 업스트림에 위치한다.

따라서, 일 실시 형태에서, (bGH-폴리A) 신호 서열은 NPY 및 NPY2R에 대한 상기 코딩 서열의 다운스트림에 위치한다.

벡터 내의 BGHpA 신호 서열은 서열 번호 6에 대해 적어도 90% 서열 동일성, 예컨대 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성(%SI)을 공유할 수 있다.

BGHpA 신호 서열은 그것이 작용성인 한 절단될 수 있으며, 절단된 BGHpA 신호 서열은 적어도 225, 235, 245, 255, 또는 265개(269개 중에서)의 염기를 포함하고, 서열 번호 6 내에 존재하는 것에 대해 적어도 90% 서열 동일성, 예컨대 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성(%SI)을 공유할 수 있다.

일 실시 형태에서, BGHpA 신호는 서열 번호 6에 상응하는 서열 또는 서열 번호 6에 대해 적어도 90%, 예컨대 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성(%SI)을 나타내는 서열을 갖는다.

벡터 요약

종합하면, 프로모터 및 인핸서 요소, 시스-작용 요소와 더불어, 형질전환 유전자 배향, 및 바이시스트로닉 요소에 관한 특이적 선택으로서, 2개의 생성되는 설계가 예시적인 실시 형태에 따라 선택되었다:

ITR-CAG-NPY-IRES-NPY2R-WPRE-BGHpA-ITR

ITR-CAG-NPY2R-IRES-NPY-WPRE-BGHpA-ITR

따라서, 일 실시 형태에서, 벡터는 AAV2 반전 말단 반복 서열(ITR), 혼성 사이토메갈로바이러스 인핸서/닭 베타-액틴 CAG 프로모터(CAG), 내부 리보솜 진입 부위(IRES), 우드척 간염 번역-후 조절 요소(WPRE), 및 소 성장 호르몬 폴리아데닐화(BGHpA) 신호 서열의 작용성 요소를 포함한다.

추가의 일 실시 형태에서, 벡터의 작용성 요소의 서열은 작동적으로 연결되며,

5'-ITR, CAG, NPY, IRES, NPY2R, WPRE, BGHpA, 및 ITR-3', 또는

5'-ITR, CAG, NPY2R, IRES, NPY, WPRE, BGHpA, 및 ITR-3'의 순서(업스트림으로부터 다운스트림으로)이다.

전체 서열 벡터는 또한 작용성 요소들 사이에 다수의 염기를 함유할 것이며, 2개의 이러한 전체 서열은 예시적인 실시 형태에 따라 제작되었다. 일 실시 형태에서, 벡터는 서열 번호 9에 상응하는 서열 또는 서열 번호 9에 대해 적어도 90% 서열 동일성, 예컨대 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성(%SI)을 나타내는 서열을 갖거나, 벡터는 서열 번호 10에 상응하는 서열 또는 서열 번호 10에 대해 적어도 90% 서열 동일성, 예컨대 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성(%SI)을 나타내는 서열을 갖는다.

벡터 서열(들)은 그것이 작용성인 한 절단될 수 있으며, 절단된 벡터 서열(들)은 적어도 4200, 예컨대 4230, 4260, 4270, 4280개(4288개 중에서)의 염기를 포함하고, 서열 번호 9에 대해 적어도 90% 서열 동일성, 예컨대 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성(%SI)을 공유할 수 있거나, 절단된 벡터 서열(들)은 적어도 4200, 예컨대 4230, 4260, 4270, 4280개(4288개 중에서)의 염기를 포함하고, 서열 번호 10에 대해 적어도 90% 서열 동일성, 예컨대 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성(%SI)을 공유할 수 있다.

벡터는 또한 벡터내 범위, 예컨대 프로모터 또는 내부 리보솜 진입 부위 서열과 NPY 및/또는 NPY2R 코딩 서열들 사이의 거리로 기재될 수 있다. AAV의 포장 용량이 ~4.7 K이므로, 벡터의 총 크기 또한 고려 대상이다.

일 실시 형태에서, CAG 프로모터 서열의 다운스트림 및 IRES 서열의 업스트림에 있는 NPY 또는 NPY2R에 대한 코딩 서열과 CAG 프로모터 서열들 사이의 거리는 60 내지 0개 염기, 바람직하게 40 내지 5개 염기, 가장 바람직하게 20 내지 10개 염기의 범위이다.

일 실시 형태에서, NPY 또는 NPY2R에 대한 다운스트림 코딩 서열과 IRES 서열들 사이의 거리는 60 내지 0개 염기, 바람직하게 40 내지 2개 염기, 가장 바람직하게 10 내지 4개 염기의 범위이다.

당업계에 공지된 바와 같이, 유전자 코드의 축중을 이용하는 유전자 최적화를 위한 몇몇 툴이 존재한다. 축중으로 인해, 하나의 단백질이 다수의 대안적인 핵산 서열에 의해 암호화될 수 있다. 코돈 선호도는 각각의 유기체에서 상이하며, 이는 이종기원 발현 시스템에서 재조합 단백질을 발현시킴에 있어서 난점을 초래하여 낮고 신뢰성 없는 발현을 유발할 수 있다. 이는 또한 자가기원 발현에 대해서도 적용될 수 있으며, 여기에서 야생형 서열은 발현 수율에 대해서뿐 아니라 분해, 조절, 및 다른 특성에 대해서도 최적화될 수 없다. 따라서, 유전자 발현의 상이한 측면, 예컨대 전사, 스플라이싱, 번역, 및 mRNA 분해에 관여하는 다수의 서열-관련 파라미터를 사용하여 인간 발현에 대해 벡터를 최적화할 수 있다.

따라서 일 실시 형태에서는, 인간에서의 사용을 위해 벡터의 서열을 코돈 최적화하였다.

AAV 입자 생성

실험 섹션에 추가로 기재된 바와 같이, 벡터는 혈청형 1, 2, 또는 8의 캡시드 단백질 내에 패킹된다. 따라서, 2개의 벡터(상기)로부터, 하기 요약된 바와 같이 6개의 상이한 AAV 입자가 생성될 수 있다:

AAV2.1-ITR-CAG-NPY-IRES-NPY2R-WPRE-BGHpA-ITR

AAV2.1-ITR-CAG-NPY2R-IRES-NPY-WPRE-BGHpA-ITR

AAV2.2-ITR-CAG-NPY-IRES-NPY2R-WPRE-BGHpA-ITR

AAV2.2-ITR-CAG-NPY2R-IRES-NPY-WPRE-BGHpA-ITR

AAV2.8-ITR-CAG-NPY-IRES-NPY2R-WPRE-BGHpA-ITR

AAV2.8-ITR-CAG-NPY2R-IRES-NPY-WPRE-BGHpA-ITR

따라서 일 실시 형태에서, AAV 입자는 아데노-관련 바이러스(AAV) 캡시드 단백질에 의해 캡슐화된, 소위 위형화된 AAV 입자 내에 패킹된 본 발명의 벡터를 포함하며, 이는 그들이 상이한 AAV 혈청형으로부터의 캡시드 단백질로 코팅됨을 의미한다.

AAV 입자 전달

NPY 및 NPY2R 유전자 요법의 전달은 벡터를 함유하는 AAV 입자의 부위-특이적 두개강내 주사를 통해 바람직하게 전달될 것이다. AAV 입자를 포함하는 약제학적 조성물은 포유류에서의 신경학적 장애, 예컨대 뇌전증 또는 파킨슨병의 예방, 저해, 개선, 또는 치료에 사용된다. 주된 표적은 약물내성(난치성, 불응성, 의학적 난치성(medical intractable), 약제 내성) 뇌전증이며, 이는 이들 형태의 뇌전증의 경우에 유효 치료 방법이 거의 존재하지 않기 때문이다. 약물내성 뇌전증은 약제학적 치료가 효과를 나타내지 않거나 약제학적 치료 결과에 있어서 시간 경과에 따라 가변성이 있는 광범위한 유형의 뇌전증을 포함한다. 매우 넓고 일반적인 용어로, 약물내성은 발작이 항뇌전증 약물(AED) 요법에 반응하여 완전한 제어 또는 허용가능한 제어를 받게 되는 것의 실패라고 말할 수 있다.

일 실시 형태에서, 약제학적 조성물은 포유류에서의 신경학적 장애, 예컨대 뇌전증 또는 파킨슨병의 예방, 저해, 개선, 또는 치료에 사용하기 위한 AAV 입자를 포함한다. 추가의 일 실시 형태에서, 상기 신경학적 장애는 뇌전증이다. 추가의 일 실시 형태에서, 상기 뇌전증은 약물내성 뇌전증이다. 추가의 일 실시 형태에서, 대상은 포유류 대상, 예컨대 인간, 말, 개, 또는 고양이 대상이다. 추가의 일 실시 형태에서, 대상은 인간 대상이다. 추가의 일 실시 형태에서, 신경학적 장애는 뇌전증이며, 조성물은 AAV1-NPY/Y2, AAV1-Y2/NPY, AAV2-NPY/Y2, AAV2-Y2/NPY, AAV8- NPY/Y2, 또는 AAV8-Y2/NPY 입자, 예컨대 AAV1-NPY/Y2, AAV1-Y2/NPY, 또는 AAV8-NPY/Y2 입자, 예컨대 AAV1-NPY/Y2 입자를 포함한다. 추가의 일 실시 형태에서, 신경학적 장애는 파킨슨병이며, 조성물은 AAV1-NPY/Y2, AAV1-Y2/NPY, AAV2-NPY/Y2, AAV2-Y2/NPY, AAV8-NPY/Y2, 또는 AAV8-Y2/NPY 입자, 바람직하게 AAV1-NPY/Y2, AAV1-Y2/NPY, 또는 AAV8-NPY/Y2 입자, 바람직하게 AAV1-NPY/Y2 입자를 포함한다.

파킨슨병의 특징은 선조체로 돌출되는 흑질 내의 도파민 신경세포의 손실이며, 이는 선조체 내로의 도파민 방출의 손실을 유발한다. 이는 강직 및 경직 증상을 일으키는 도파민성 신경전달의 감소 및 기저핵 회로 내부의 비정상적 다운스트림 발화(downstream firing)를 유발한다. NPY는 Y2 수용체 활성화를 통해 도파민의 합성 및 방출을 촉진함으로써 도파민성 신경전달의 이러한 침체에 대항하는 반면에, Yl 수용체의 활성화는 반대 효과를 나타낸다(문헌[Adewale et al, 2005, 2007). 또한, NPY는 시험관내 및 생체내 양자 모두에서 도파민성 신경세포에 6-하이드록시도파민(6-OHDA)-유도 독성에 대한 Y2-매개 신경보호 효과를 발휘한다(문헌[Decressac et al, 2011, 2012]). 또한, 파킨슨병 환자로부터의 사후 뇌는 건강한 대조군에 비교하여 미상 핵 및 피각 내의 NPY-양성 세포의 수의 증가를 나타내며(문헌[Cannizzaro et al, 2003]), 이는 내인성이지만 결과적으로 불충분한 신경보호 반응을 반영할 수 있다. 이는 작용성 Y2 수용체를 발현시키는 선조체 및 흑질 내의 도파민성 신경세포(문헌[Shaw et al, 2003]), 및 선조체 6-OHDA-유도 도파민성 신경세포 손실 후에 선조체 및 중격의지핵 내의 NPY-양성 신경세포의 증가된 수(문헌[Kerkerian-Le Goff et al, 1986]; 문헌[Salin et al, 1990])와 일치한다.

추가의 일 실시 형태에서, 상기 신경학적 장애는 파킨슨병이다. 유전자 요법은 또한 AAV 혈청형 조직 향성에 의존하여 전신 전달될 수 있을 것이나; 두개강내 주사에 의해 높은 효능 및 최소의 부작용을 동반하여 질환이 있는 뇌 지역으로의 정밀한 표적화가 얻어진다. 이 방식으로 바이러스 벡터는 한정된 지역 내에 제한될 것이며, 백질 신경로를 따라 주변 영역으로의 최소의 확산이 예상된다. 신경학적 장애의 유형에 따라 AAV 전달 접근법은 매우 국한된 뇌 지역에 대한 것이거나, 적절한 경우에는 대뇌 피질의 더 큰 영역을 덮는 전달일 수 있을 것이다. 뇌전증의 유형 및 뇌전증 병소 또는 병소들의 위치에 따라, AAV 전달 접근법은 매우 국한된 뇌 지역에 대한 것이거나, 적절한 경우에는 대뇌 피질의 더 큰 영역을 덮는 전달일 수 있을 것이다. 따라서, 몇몇 가능한 투여 방법, 예컨대 뇌실내, 유리체내, 정맥내, 피하, 근육내, 비내, 경점막, 뇌내, 복막내, 척수강내, 동맥내 투여가 존재한다.

일 실시 형태에서, AAV 입자를 포함하는 약제학적 조성물은 부위-특이적 두개강내 주사를 통해 전달된다.

본 발명의 모든 AAV 혈청형은 신경교세포 및 신경세포를 형질도입시킬 수 있는 것으로 입증되었다. AAV2 혈청형은 더 적은 벡터의 확산 및 자연 발생 신경세포 향성을 나타냈으며, 이는 AAV2 혈청형 캡시드 단백질을 가진 벡터가 더 작고 더 한정된 뇌 지역에 대해 적합한 전달일 수 있는 이유이다. 마찬가지로, AAVl 또는 AAV8 혈청형 캡시드 단백질을 가진 벡터는 대뇌 피질의 더 넓은 영역을 덮는 적합한 전달일 수 있다.

AAV 입자의 용량은 하나 또는 다중의 횟수로 제공되는 하나의 용량 또는 수개의 용량으로 구성될 수 있다. 단일 용량은 다중의 두개강내 주사를 피하는 이점이 있는 반면에, 다중 용량은 주사들 사이에 환자 용량 반응을 모니터링하면서 각각의 주사에 대해 더 낮은 용량의 사용을 가능하게 할 수 있다. 전형적으로, 용량은 0.01 내지 100 ㎍, 예컨대 0.1-50 ㎍ 또는 0.5-20 ㎍ 범위의 작용성 AAV 입자일 수 있다. 형질도입 효능은 또한, 벡터의 확산을 용이하게 하는, 주사 중 및 주사 후의 대상의 위치와 같은 다른 인자들에 의해 영향을 받을 수 있다.

일 실시 형태에서, 작용성 AAV의 유효 용량은 0.01 내지 100 ㎍, 예컨대 0.1-50 ㎍ 또는 0.5-20 ㎍ 범위의 작용성 AAV 입자이다. 추가의 일 실시 형태에서, AAV 입자는 단일 용량 또는 다중 용량, 예컨대 2, 3, 4, 또는 5회 용량으로서의 투여용으로 제형화된다.

일 실시 형태에서, 대상에서 신경학적 장애를 치료, 저해, 또는 개선하는 방법은, 신경학적 장애를 앓는 대상의 중추 신경계의 세포 내로 이러한 조성물의 약제학적 유효량을 투여하는 단계를 포함한다. 추가의 일 실시 형태에서, 대상은 포유류 대상, 예컨대 인간 대상이다. 추가로, 신경학적 장애는 뇌전증 또는 파킨슨병이다. 본 방법에서, 조성물은 부위-특이적 두개강내 주사를 통해 전달되며, 추가의 일 실시 형태에서, 신경학적 장애는 뇌전증이고 조성물은 뇌전증 병소 또는 병소들의 위치에 전달된다.

NPY 및 NPY2R의 전달은 또한, 대상으로부터의 내인성 세포와 같은 세포에 대한, 벡터를 함유하는 AAV 입자를 상기 세포에 전달하는 단계에 의한 것일 수 있을 것이다. 결국, 이러한 세포는, 예컨대 AAV 벡터에 의해 감염되거나 형질도입된 세포의 후속적인 이식을 동반하는 생체외 유전자 치료 접근법에서 관찰되는 바와 같이 뇌전증 또는 파킨슨병과 같은 포유류에서의 신경학적 장애의 예방, 저해, 개선, 또는 치료를 위해 대상의 부위 내로 주사하거나 이동시킴으로써 투여될 수 있을 것이다. 이러한 대상은 포유류, 예컨대 인간 대상일 수 있을 것이다.

일 실시 형태에서, NPY 및 Y2 유전체를 포유류 세포에 전달하는 방법은 상기 AAV 입자를 세포 내로 도입하는 단계를 포함한다. 추가의 일 실시 형태에서, 세포는 신경 세포, 폐 세포, 망막 세포, 상피 세포, 근육 세포, 췌장 세포, 간 세포, 심근 세포, 골 세포, 비장 세포, 케라티노사이트, 섬유모세포, 내피 세포, 전립선 세포, 생식 세포, 전구 세포, 및 줄기 세포로 구성된 그룹 중에서 선택된다. 일 실시 형태에서, NPY 및 Y2 유전체를 대상에게 투여하는 방법은 상기 세포(NPY 및 Y2 유전체를 포함함)를 대상에게 투여하는 단계를 포함한다. 일 실시 형태에서, 대상은 포유류 대상, 예컨대 인간 대상이다.

일 실시 형태에서, NPY 및 Y2 유전체를 대상에게 전달하는 방법은 대상 내의 포유류 세포에 상기 AAV 입자를 투여하는 단계를 포함하며, 여기에서 바이러스 입자는 대상의 해마에 투여된다.

일 실시 형태에서, NPY 및 Y2 유전체를 대상에게 전달하는 방법은 대상 내의 포유류 세포에 상기 AAV 입자를 투여하는 단계를 포함하며, 여기에서 바이러스 입자는 대상의 선조체, 중격의지핵, 흑질, 복측 피개 영역, 또는 내측 전뇌속에 투여된다.

NPY 및 NPY2R의 전달은 또한 NPY 및/또는 NPY2R 활성화가 치료 효과를 나타내거나 NPY-결핍에 의해 야기되는 질환을 감소시키기 위한 것일 수 있을 것이며, 여기에서 질환은 뇌전증 및 파킨슨병 중에서 선택된다. 따라서 일 실시 형태에서, NPY가 치료 효과를 나타내거나 NPY-결핍에 의해 야기되는 질환을 감소시키며, 여기에서 질환은 뇌전증 및 파킨슨 병 중에서 선택되는 방법은, 신경학적 장애를 앓는 대상의 중추 신경계의 세포 내로 상기 조성물의 약제학적 유효량을 투여하는 단계를 포함한다.

일 실시 형태에서, NPY를 이를 필요로 하는 대상에게 제공하는 방법은, NPY를 필요로 하는 대상, 예컨대 NPY 결핍을 나타내는 대상을 선택하는 단계, 및 상기 조성물의 약제학적 유효량을 상기 대상에게 제공하는 단계를 포함한다. 추가의 일 실시 형태에서, 상기 대상은, 예를 들어 뇌전증 또는 파킨슨병의 EEG 및/또는 임상 진단과 같은 임상 평가 또는 진단 시험에 의해 NPY 결핍을 나타내는 것으로 선택된다.

형질전환 유전자 발현의 평가

본 발명의 벡터를, NPY 및 NPY2R의 발현을 개시하는 그들의 능력에 대해 시험하였다. 도 2에서 알 수 있는 바와 같이, NPY 및 NPY2R에 대한 서열을 포함하는 AAV 발현 플라스미드에 의한 HEK293 세포의 일시적 형질감염은, 이중가닥 ddPCR 반응에서 NPY 및 Y2 표적 서열 양자 모두의 상승된 양에 의해 측정되는 바와 같이, 양자 모두의 형질전환 유전자를 암호화하는 mRNA 전사체의 증가된 수준을 유발하였다. 양자 모두의 플라스미드의 경우, IRES의 업스트림에 있는 형질전환 유전자에 대한 표적 서열의 발현 수준은 다운스트림 형질전환 유전자에 대한 표적 서열보다 더 풍부했다.

해마에서의 NPY 및 NPY2R 발현

NPY 및 NPY2R 서열을 포함하는 AAV 발현 플라스미드의 서열을 실험적으로 검증한 후, 상기 기재된 바와 같이 AAV 혈청형 1, 2, 또는 8 기원의 AAV 캡시드 입자 내에 플라스미드를 포장하여, 총 6개의 독특한 AAV 벡터 입자를 생성하였다. 이들 입자를 정제하고 랫트에서의 생체내 시험을 위해 진행시켰다. 성체 웅성 위스타 랫트의 배측 해마에 두개강내 주사 후 3 주에, 동물을 안락사시키고 그들의 뇌를 수집하여 급속-냉동시켰다. 이어서, 이들 뇌로부터의 뇌 슬라이스에 NPY를 표적화하는 면역조직화학 어세이와 더불어 NPY2R-결합 및 GPCR 작용성 결합을 가시화하는 자가방사기록법을 사용하여 NPY 및 NPY2R의 형질전환 유전자 발현의 평가를 적용하였다. AAV1-NPY/Y2, AAV1-Y2/NPY, AAV2-NPY/Y2, 또는 AAV8-NPY/Y2를 이용하는 치료는 모두 유의적으로 증가된 NPY 수준을 유발했다(도 3 및 도 4). NPY 발현을 유도하는 AAV 벡터의 계층적 순서는 하기와 같았다: AAV1-NPY/Y2 = AAV1-Y2/NPY = AAV8-NPY/Y2 > AAV-NPY/Y2 > AAV8-Y2/NPY = AAV2-Y2/NPY. 6개의 벡터 모두가 증가된 작용성 NPY2R 수준을 유발했으며(도 5a 및 도 5b) AAV1-NPY/Y2, AAV1-Y2/NPY, AAV2-Y2/NPY, 또는 AAV8-Y27NPY를 이용한 치료 후에는 유의적으로 증가된 NPY2R 결합 수준 또한 관찰되었다(도 6a 및 도 6b). NPY2R 발현을 유도하는 AAV 벡터의 계층적 순서는 하기와 같았다: AAV1-Y2/NPY > AAV8-Y2/NPY = AAV1-NPY/Y2 > AAV2-Y2/NPY > AAV8-NPY/Y2 = AAV2-NPY/Y2.

따라서, 양자 모두의 AAV 발현 플라스미드(AAV-NPY/Y2 및 AAV-Y2/NPY)가 성공적으로 전사되었고 NPY 및 NPY2R 단백질의 발현을 유발했다. 추가로, 모든 경우에 형질전환 유전자 발현의 수준은 IRES 서열의 업스트림 또는 다운스트림에 위치하는 형질전환 유전자 서열에 의존했으며, IRES 서열의 업스트림에 위치하는 형질전환 유전자가 IRES 서열의 다운스트림에 위치하는 형질전환 유전자보다 비교적 더 높은 수준으로 발현되었다.

AAV 혈청형 1로부터의 캡시드 단백질로 위형화된 AAV 벡터는 랫트 해마 내로 두개강내 주사될 경우에 최고의 형질전환 유전자 발현 효능을 나타냈다(AAVl > AAV8 > AAV2). 따라서 일 실시 형태에서, AAV 입자의 AAV 캡시드 단백질은 AAVl, AAV2, 및 AAV8, 바람직하게 AAVl 및 AAV8로 구성된 그룹 중에서 선택된다.

의외로, 다운스트림 형질전환 유전자에 대해 비교적 더 낮은 발현을 나타낸 AAV 혈청형 2 및 8로부터의 캡시드 단백질로 위형화된 다른 AAV 벡터에 비교하여, AAV 혈청형 1로부터의 캡시드 단백질로 위형화된 AAV 벡터는 IRES 요소의 다운스트림에 위치하는 형질전환 유전자의 매우 높은 발현을 나타냈음이 확인되었다(도 4a 및 도 4b에서 알 수 있는 바와 같음). 따라서 AAV 혈청형 1로부터의 캡시드 단백질로 위형화된 AAV 벡터는 제1 및 제2 형질전환 유전자(즉, NPY 및 NPYR2)에 대해 높은 발현을 나타낸다.

임상적 AAV 유전자 요법에 대한 더 큰 장애물 중 하나는 높은 효능과 함께 안전한 발현을 보장하는 것이다. 따라서 균질하게 높은 발현은 매우 긍정적으로 여겨진다. 따라서 일 실시 형태에서, AAV 입자의 AAV 캡시드 단백질은 AAVl, AAV2, 및 AAV8로 구성된 그룹, 가장 바람직하게 AAVl 중에서 선택된다. 추가의 일 실시 형태에서, AAV 입자는 양자 모두의 형질전환 유전자(NPY 및 NPY2R)의 더 많은 동종 과발현(homolog overexpression)을 위해 AAVl 캡시드 단백질을 갖는다.

반면에, NPY 및 NPY2R 형질전환 유전자에 대한 이종 발현 효능을 목적하는 경우, 존재하는 AAV 혈청형 2 및 8로부터의 캡시드 단백질로 위형화된 AAV 벡터가 바람직할 수 있다.

일 실시 형태에 따라, 본 명세서에 사용되는 서열 동일성(%SI)은 임의의 편리한 방법에 의해 평가될 수 있다. 이러한 계산을 위해 컴퓨터 프로그램을 채용하는 것이 통례이며, 서열의 쌍을 비교하고 정렬하기 위한 표준 프로그램 세트는 ALIGN(문헌[Myers and Miller, CABIOS, 4: 11-17, 1988]), FASTA(문헌[Pearson, Methods in Enzymology, 183 :63-98, 1990]) 및 갭이 있는 BLAST(문헌[Altschul et al, Nucleic Acids Res., 25:3389-3402, 1997]), 또는 BLASTP(문헌[Devereux et al., Nucleic Acids Res., 12:387, 1984])를 포함한다. 이러한 자원이 수중에 없을 경우, 일 실시 형태에 따라, 서열 동일성(%SI)은 (%SI) = 100% * (쌍 정렬 내의 동일한 잔기의 수) / (최단 서열의 길이)로서 계산될 수 있다. 표 1 내지 표 3에 나타낸 바와 같이 점수화를 사용하여 발현 결과를 추가로 분석할 수 있다. 표 1에서는, 혈청형에 따라 형질전환 유전자 발현을 점수화하였다.

표 1: AAV1, AAV2, 또는 AAV8 벡터로부터의 형질전환 유전자 발현
AAV 벡터 혈청형	NPY 발현		NPY2R 발현
	NPY 단백질 수준(1-4)	순위(1-3)	NPY2R 단백질 수준(1-4)	순위(1-3)
AAV1	3.0±0.3	1	3.3±0.4	1
AAV2	1.9±0.3	3	2.0±0.2	3
AAV8	2.1±0.4	2	3.4±0.3	2

표 1은 NPY 및 Y2 과발현 AAV1, -2, 및 -8 벡터로 치료한 동물에서의 NPY 및 NPY2R 단백질 수준을 나타낸다. 관찰된 NPY 또는 NPY2R 단백질 신호에 상응하여 단백질 수준을 평가하였다: 1(내인성 수준에 상응하는 단백질 수준), 2(내인성 수준을 초과하는 낮은 단백질 발현), 3(내인성 수준을 초과하는 보통의 단백질 발현), 및 4(내인성 수준을 초과하는 높은 단백질 발현). 데이터는 평균값 ± s.e.m.으로서 제공되어 있다. 이어서, 상이한 AAV 벡터에는 1-3의 순위가 제공되며, 1은 최고 발현 수준에 해당하고 3은 최저에 해당한다.

따라서 랫트 해마 내로 두개강내 주사될 경우에 AAV 혈청형 1로부터의 캡시드 단백질로 위형화된 AAV 벡터가 최고 형질전환 유전자 발현 효능을 나타냈음이 분명하다(AAVl > AAV8 > AAV2).

추가로, 표 2에 나타낸 바와 같이, 형질전환 유전자 발현은 또한 2개의 벡터 배향(NPY/Y2 또는 Y2/NPY)에 관해 평가될 수 있다.

표 2: NPY/Y2 또는 Y2/NPY 벡터로부터의 형질전환 유전자 발현
형질전환 유전자 배향	NPY 발현		NPY2R 발현
	NPY 단백질 수준(1-4)	순위(1-2)	NPY2R 단백질 수준(1-4)	순위(1-2)
NPY/Y2	2.9±0.2	1	2.1±0.3	2
Y2/NPY	1.8±0.3	2	3.0±0.3	1

표 2는 NPY/Y2 또는 Y2/NPY AAV 벡터로 치료한 동물에서의 NPY 및 NPY2R 단백질 수준을 나타낸다. 관찰된 NPY 또는 NPY2R 단백질 신호에 상응하여 단백질 수준을 평가하였다: 1(내인성 수준에 상응하는 단백질 수준), 2(내인성 수준을 초과하는 낮은 단백질 발현), 3(내인성 수준을 초과하는 보통의 단백질 발현), 및 4(내인성 수준을 초과하는 높은 단백질 발현). 데이터는 평균값 ± s.e.m.으로서 제공되어 있다. 이어서, 상이한 AAV 벡터에는 1-2의 순위가 제공되며, 1은 최고 발현 수준에 해당하고 2는 최저에 해당한다.

따라서 형질전환 유전자 발현의 수준은 IRES 서열의 업스트림 또는 다운스트림에 위치하는 형질전환 유전자 서열에 의존했으며, IRES 서열의 업스트림에 위치하는 형질전환 유전자가 IRES 서열의 다운스트림에 위치하는 형질전환 유전자보다 비교적 더 높은 수준으로 발현됨이 분명하다.

KA-유도 발작에 대한 AAV 벡터-매개 효과

랫트에서의 카이네이트-유도 발작 모델을 사용하여 NPY 및 그의 수용체의 AAV 벡터-매개 발현의 발작-저해 효과를 평가하였다. 이 모델은 최초 운동 발작 및 뇌전증 지속상태까지의 잠복 시간과 더불어 발작의 빈도 및 지속기간 및 일반 개질 발작 중증도 점수(general modified seizure severity score)의 측정을 포함하는, 측두엽 뇌전증에서의 급성 발작 이벤트를 반영하는 것으로 생각된다. 이는 도 7에 예시되어 있으며, 이는 AAV-유도 형질전환 유전자 과발현의 수준과 관련하여 단일 카이네이트 주사(s.c.) 후 2 시간 기간의 관찰 중의 발작 발생의 그래픽 예시를 나타낸다. NPY 발현의 더 낮은 내인성 수준에 비교하여 높은 수준의 AAV 벡터-유도 NPY 발현 수준은 최초 운동 발작 및 뇌전증 지속상태 양자 모두까지의 잠복의 증가와 더불어 발작에 소요되는 시간의 감소를 유발했다(도 7a). NPY2R 발현의 더 낮은 내인성 수준에 비교하여 높은 수준의 AAV 벡터-유도 NPY2R 발현 수준은 발작에 소요되는 시간을 감소시키는 경향을 유발했으나, 유의적인 수준에는 도달하지 않았다(도 7b).

도 8a에서, AAV1-NPY/Y2를 이용한 치료는 뇌전증 지속상태(SE)의 발생까지의 잠복을 증가시키고 총 발작 시간을 감소시켰음을 추가로 알 수 있는 반면에, AAV1-Y2/NPY 치료 후에 관찰된 효과는 AAV1-엠프티(AAV1-empty) 치료에 비교하여 통계적 유의성을 나타내지 않았다(도 8a). AAV1-NPY/Y2 및 AAV1-Y2/NPY 양자 모두는 최초 운동 발작까지의 잠복 또는 발작의 총 횟수에 영향을 주지 않았다(도 8a).

도 8b에서 알 수 있는 바와 같이, AAV2-NPY/Y2 또는 AAV2-Y2/NPY를 이용한 치료는 AAV2-엠프티에 비교하여 발작 발생 또는 중증도에 임의의 유의적인 변화를 유발하지 않았다(도 8b).

도 8c에서 알 수 있는 바와 같이, AAV8-엠프티에 비교하여 AAV8-NPY/Y2를 이용한 치료는 뇌전증 지속상태(SE)의 발생까지의 잠복의 증가 및 총 발작 시간의 감소를 나타낸 반면에 AAV8-Y2/NPY의 경우에는 유의적인 효과가 관찰되지 않았다(도 8c). 그러나, 총 발작 시간의 AAV8-NPY/Y2-유도 감소의 유의적이지는 않지만 강력한 경향이 관찰되었다(도 8c).

모든 벡터 입자 중에서, 관찰된 발작 지속기간의 감소 및 SE의 발생까지의 잠복 시간의 증가에 의해 입증되는 바와 같이 AAV1-NPY/Y2를 이용한 치료는 항-발작 효과를 유발했음이 확인되었다. AAV1-Y2/NPY, AAV2-NPY/Y2, AAV2-Y2/NPY, AAV8-NPY/Y2, 또는 AAV8-Y2/NPY를 이용한 치료는 발작 발생 또는 중증도의 통계적으로 유의적인 저해를 유발하지 않았다. AAV 벡터 입자의 확산 및 NPY 형질전환 유전자 발현 효능은 혈청형 의존성인 것으로 확인되었다(AAV1 > AAV8 > AAV2). NPY 및 Y2의 형질전환 유전자 발현은 NPY 면역염색 및 작용성 Y2 수용체 결합 어세이에 의해 각각 확인되었다. 두개강내 주사 및 AAV 벡터 치료 후에 동물에서 비정상적 거동 또는 분명한 건강 문제가 관찰되지 않았다.

요약하면, 관찰된 발작 지속기간의 감소 및 SE의 발생까지의 잠복 시간의 증가에 의해 입증되는 바와 같이, 도 8은 AAV1-NPY/Y2, AAV1-Y2/NPY, AAV8- NPY/Y2가 항-발작 효과의 분명한 경향을 나타냄을 예시하며, AAV1-NPY/Y2의 경우에는 분명한 통계적 유의성이 있다. AAV2 작제물의 경우에 결과는 덜 분명하며, AAV8-Y2/NPY도 항-발작 효과의 분명한 경향을 나타내지 않았다. 생체내 시스템의 경우에, 발현이 효능과 동일하지는 않지만, 발현은 여전히 벡터 작용에 필수적임이 분명하다.

단일 작제물로부터 발현되는 NPY 및 NPY2R에 대한 형질전환 유전자를 가짐으로써, 본 발명의 벡터는, 의학적 효과에 대한 상관관계가 있는 NPY/NPY2R 단백질에 대한 양자 모두의 발현 수준을 관찰하기 위한, 동물 모델에서 이전에 전혀 볼 수 없었던 기회를 제공한다. 형질도입된 모든 세포는 동일한 수의 NPY 및 NPY2R 유전자를 가진 작제물로 감염되었고, 여기에서 이전된 모든 유전자는 동일한 위치에 국소화되며, 여기에서 NPY/NPY2R의 비율은 고정되고 벡터 의존성이다(그 비가 또한 형질변환된 모든 세포에 대해 일관적일 이유임). NPY 및 NPY2R 유전자의 확산 및 분포 또한 상이하지 않을 것이나, 그들은 정확하게 동일한 세포 내에 국소화될 것이다. NPY 및 NPY2R 유전자를 각각 함유하는 2개의 벡터를 사용해서는 이들 효과를 달성할 수 없다. 이에 대한 긍정적 효과는 매우 일관적인 치료 결과를 포함한다. 통계적으로, 이는 또한 각각의 개별적인 벡터를 그의 효과에 대해 점수화하는 것을 더 용이하게 한다. 표 3에 나타낸 바와 같이, 벡터의 상이한 특성을 점수화함으로써(카이네이트-유도 발작을 억제하는 효능 및 발현), 어느 벡터가 치료에 가장 유리한지를 강조하는 것이 더 용이해진다.

표 3: AAV 벡터의 전체 순위
AAV 벡터	발현 순위(1-6)	효능 순위(1-6)	전체 평균 순위(1-6)
AAV1-NPY/Y2	2	2	1
AAV1-Y2/NPY	1	3	1
AAV2-NPY/Y2	6	5	6
AAV2-Y2/NPY	5	4	4
AAV8-NPY/Y2	3	1	1
AAV8-Y2/NPY	4	6	4

표 3은 급성 카이네이트 유도 발작 모델에서의 항-발작 치료로서의 효능 및 형질전환 유전자 발현 양자 모두를 기반으로 하는 6개의 AAV 벡터의 전체 순위를 나타낸다. 순위는 1-6으로 제공되며, 1은 최고 순위에 해당하고 6은 최저에 해당한다. 전체 순위는 발현 및 효능 순위의 평균 순위를 나타낸다. 전체 순위는 AAV1-NPY/Y2 = AAV1-Y2/NPY = AAV8-NPY/Y2 > AAV8-Y2/NPY = AAV2-NPY/Y2 > AAV2-Y2/NPY를 나타내고 있다.

따라서 일 실시 형태에서, AAV 입자는 AAV1-NPY/Y2, AAV1-Y2/NPY, 또는 AAV8-NPY/Y2이다. 일 실시 형태에서, AAV 입자는 AAV1-NPY/Y2이다.

AAV1-NPY/Y2, AAV1-Y2/NPY, AAV2-NPY/Y2, 또는 AAV8-NPY/Y2를 이용한 치료는 모두 유의적으로 증가된 NPY 수준을 유발했다(도 3 및 도 4). 6개의 벡터 모두를 이용한 치료는 증가된 작용성 NPY2R 수준을 유발했으나(도 5a 및 도 5b), 최고 발현은 AAV1-Y2/NPY의 경우였다. NPY2R 결합 수준은 6개의 벡터 모두의 경우에 증가되었으며, AAV1-NPY/Y2, AAV1-Y2/NPY, AAV2-Y2/NPY, 또는 AAV8-Y2/NPY를 이용한 치료 후에 유의적으로 증가되었다(도 6a 및 도 6b).

NPY 발현을 유도하는 AAV 벡터의 계층적 순서는 하기와 같았다: AAV1-NPY/Y2 = AAV1-Y2/NPY = AAV8-NPY/Y2 > AAV-NPY/Y2 > AAV8-Y2/NPY = AAV2-Y2/NPY. NPY2R 발현을 유도하는 AAV 벡터의 계층적 순서는 하기와 같았다: AAV1-Y2/NPY > AAV8-Y2/NPY = AAV1-NPY/Y2 > AAV2-Y2/NPY > AAV8-NPY/Y2 = AAV2-NPY/Y2. 이는 동시-국소화된 NPY2R 발현을 동반하는 높은 NPY 발현이 생체내 효능을 위해 바람직한 것으로 보임을 시사한다.

할로페리돌 -유도 경직 격자 시험

마우스에서의 할로페리돌-유도 경직 모델을 사용하여 경직 상태에 대한 NPY 및 그의 수용체의 AAV 벡터-매개 발현의 효과를 평가하였다. 이 모델은 도파민 D2 수용체에 길항작용을 하고 선조체 도파민 함량을 감소시키는 것으로 공지된 할로페리돌의 투여를 채용한다. 이는 결과적으로 도파민성 신경전달의 차단 및 기저핵 회로 내부의 비정상적 다운스트림 발화를 유발하며, 이는 파킨슨병에서 관찰되는 운동 증상을 모방하는 강직 및 경직의 증상으로서 나타난다.

도 9a에서 알 수 있는 바와 같이, 마우스에서 AAV1-NPY/Y2 벡터 주사는 AAV1-엠프티에 비교하여 경직 상태에 소요되는 시간의 유의적인 감소를 유도했다. 추가로, 도 9b는 AAV1-NPY/Y2 벡터를 이용한 치료 또한 AAV1-엠프티에 비교하여 15-분 간격으로 관찰된 경직 상태에 소요되는 평균 시간의 유의적인 감소를 유도했음을 예시한다.

본 발명은 특이적 실시 형태(들)와 관련하여 상기 기재되었지만, 본 명세서에 기술된 특이적 형태로 제한하고자 의도하는 것은 아니다. 그보다는, 본 발명은 첨부된 청구범위에 의해서만 제한되며, 이들 첨부된 청구범위의 범위 이내의 상기 특이적 실시 형태 이외의 실시 형태, 예를 들어 상기 기재된 것들과 상이한 것들이 동일하게 가능하다.

청구범위에서, 용어 "포함하다/포함하는"은 다른 요소 또는 단계의 존재를 배제하지 않는다. 추가로, 개별적으로 열거되었더라도, 예를 들어 단일 단위 또는 프로세서에 의해 복수의 수단, 요소, 또는 방법 단계가 실행될 수 있다. 부가적으로, 개별적인 특징이 상이한 청구범위에 포함될 수 있지만, 이들은 아마도 유리하게 조합될 수 있으며, 상이한 청구범위 내의 포함은 특징의 조합이 실현가능하고/하거나 유리하지 않음을 의미하지 않는다. 부가적으로, 단수의 지칭은 복수를 배제하지 않는다. 용어 "일", "하나의", "제1", "제2" 등은 복수를 금지하지 않는다. 청구범위 내의 참조 부호는 단지 명확하게 하는 예로서 제공되며, 어떠한 방식으로도 청구범위의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.

실시형태의 설명

실험 방법

하기 실시예는 단지 예일 뿐이며 결코 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다. 그보다는, 본 발명은 첨부된 청구범위에 의해서만 제한된다.

벡터

인간 NPY(NM_000905.3) 및 NPY2R(NM_000910.2) 개방 해독틀(ORF: open reading frame)과 더불어 내부 리보솜 진입 부위(IRES 서열, A7 버전)을 0.9 kb 혼성 사이토메갈로바이러스 인핸서/닭 β-액틴(CAG) 프로모터의 제어 하에 AAV2 반전 말단 반복이 인접한 소 성장 호르몬 폴리아데닐화(bGH) 신호 및 우드척 간염 전사-후 조절 요소(WPRE)를 함유하는 AAV 발현 플라스미드 내로 클로닝하였다. 생성되는 벡터는 도 1a 및 도 1b에 도식적으로 요약되어 있다.

AAV 벡터 유전체의 AAV 입자 내로의 포장

보완(complementing) AAV 유전체(예컨대 pAV2(ATCC)) 또는 재조합 AAV-플라스미드의 존재 하에 벡터 DNA를 증식허용 진핵세포(예컨대 인간 293 세포) 내로 형질감염시킨다. 세포를 2 내지 4 일 동안(LB + 암피실린 중에 37 ℃에서) 배양한 후, 다중 냉동/해동 사이클을 통해 바이러스 입자를 방출시키고, 그 후에 60 ℃로의 가열을 통해 아데노바이러스 헬퍼 바이러스를 불활성화한다. 생성되는 세포 용해물은 AAV 입자 내에 포장된 AAV 벡터를 가진 AAV 입자를 함유한다. 상기 기재된 2개의 벡터, 및 AAV1, 2, 8 헬퍼 바이러스를 사용하여, 6개의 상이한 AAV 입자를 얻을 수 있다. 생성된 모든 벡터는 소위 위형화된 AAV 입자 내에 포장된, AAV 혈청형 2로부터의 ITR을 가진 상기 언급된 AAV 플라스미드 작제물로 구성되며, 이는 그들이 AAV 혈청형 1, 2, 및 8로부터의 캡시드 단백질로 코팅됨을 의미한다.

랫트 해마 내로의 AAV 벡터 주사

성체 웅성 위스타 랫트를 마취시키고 AAV 벡터를 배측 해마 내로(좌표 설정 1 : 경막으로부터 전방-후방 -3.3 mm, 내측-외측 1.8 mm, 배측-복측 -2.6 mm 또는 좌표 설정 2: 두개골 표면으로부터 전방-후방 -4.0 mm, 내측-외측 -2.1 mm, 배측-복측 -4.3 mm) 편측 주사하거나 배복측 해마 내로(전방-후방 -3.3 mm, 내측-외측 +/-1.8 mm, 배측-복측 -2.6 mm, AP -4.8 mm, ML ± 5.2 mm, DV -6.4 및 -3.8 mm) 양측 주사하였다. 기준점은 전방-후방 축의 경우에 브레그마였고 내측-외측 축의 경우에 정중선이었다. 반구당 1 또는 3 ㎕ 부피의 바이러스 벡터 현탁액(1.1 x 10¹² 유전체 입자/ml)을 주입하였다.

랫트에서의 카이네이트-유도 발작

AAV 벡터 주사 후 3 주에 랫트에 카이네이트(KA; 10 mg/kg; 0.9% 등장성 식염수에 희석; pH 7.4)를 피하 주사하고, 개별적인 Plexiglas 상자(30x19x29 cm)에 넣고, 2 h 동안 녹화하였다. 이어서, 치료 조건을 알지 못하는 관찰자가 최초 운동 발작 및 뇌전증 지속상태까지의 잠복, 운동 발작에 소요되는 시간과 더불어, 발작의 횟수를 평가하였다. 운동 발작은 적어도 15 s 지속기간 동안의 전지 및/또는 후지의 만성 운동으로서 정의되었다.

안락사 및 랫트로부터의 조직 수집

KA 주사 후 3 시간에 동물을 깊이 마취시키고 참수하였다. 신속하게 뇌를 수집하고 드라이 아이스 상에서 급속 냉동시킨 후, 추가의 처리까지 -80 ℃에 저장하였다.

랫트에서의 AAV 벡터-매개 형질전환 유전자 발현의 평가

AAV 벡터 치료 후의 발현 수준을 상응하는 치료 무경험 대조군 랫트에서의 발현 수준에 비교하였다. 치료한 동물로부터의 세포 또는 해마 뇌 슬라이스에 대한 ddPCR, 면역조직화학 어세이, 및 자가방사기록법 어세이를 사용하여, 2개의 형질전환 유전자 NPY 및 NPY2R의 발현 수준 및 분포 패턴을 평가하였다.

미세방울 디지털 PCR(ddPCR) 어세이: AAV-NPY/Y2 또는 AAV-Y2/NPY 벡터로 형질감염시킨 인간 배아 신장 293 세포로부터 RNA를 단리하였다. RT-qPCR용 iScript Advanced cDNA Synthesis kit(바이오-라드(Bio-Rad))를 사용하여 cDNA를 합성하였다. 인테그레이티드 DNA 테크놀로지스(Integrated DNA Technologies) RealTime qPCR Assay design tool을 사용하여 ddPCR용 프라이머 및 탐침 어세이(인테그레이티드 DNA 테크놀로지스)를 설계하였다: NPY(정방향: CTCATCACCAGGCAGAGATATG(서열 번호 11); 역방향: ACCACATTGCAGGGTCTTC(서열 번호 12)), NPY2R(정방향: CTGGACCTGAAGGAGTACAAAC(서열 번호 13); 역방향: GTTCATCCAGCCATAGAGAAGG(서열 번호 14)). 바이오-라드 QX200 플랫폼을 사용하여 FAM-표지 NPY 표적 서열 및 HEX-표지 NPY2R 표적 서열을 측정하는 이중가닥 ddPCR 어세이를 실행하였다. lx 탐침용 ddPCR Supermix(dUTP 없음)(바이오-라드), NPY 프라이머/FAM 탐침(900 nM/250 nM), NPY2R 프라이머/HEX 탐침(900 nM/250 nM), 및 2 ㎕의 1:5000으로 희석된 cDNA로 이루어진 20 ㎕의 반응 혼합물을 미세방울 생성 및 PCR에 사용하였다. 60 ℃의 어닐링/연장 온도를 가진 미세방울 디지털 PCR(바이오-라드 C1000 Touch thermal cycler)을 위한 표준 사이클링 조건을 사용하였다. QX200 droplet reader(바이오-라드) 상에서 QuantaSoft™ 소프트웨어(바이오-라드)를 사용하여 샘플을 분석하였다.

NPY 면역조직화학 어세이: 해마 슬라이스에서의 NPY 발현의 가시화를 위해 토끼 항-NPY 항체(1:500 / 1:10,000; 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich))를 이용한 인큐베이션에 이어서 Cy3-접합 당나귀 항-토끼 항체(1:200, 미국 소재의 잭슨 이뮤노리서치(Jackson Immunoresearch)) 또는 바이오티닐화 당나귀 항-토끼 2차 항체를 이용한 인큐베이션 및 3,3-디아미노벤지딘(DAB)을 사용하였다. Olympus BX61 현미경 및 CellSens 소프트웨어를 사용하여 디지털화 영상을 얻었다. 정성적 평가 후에 배측 해마 CA1(피라미드층 및 지향층(strata oriens) 및 방사층(strata radiatum))에서 NPY 수준을 평가하고 NPY-양성 신호에 상응하는 값을 제공하였다: 1(내인성 수준에 상응하는 NPY 수준), 2(내인성 수준을 초과하는 낮은 NPY 발현), 3(내인성 수준을 초과하는 보통의 NPY 발현), 및 4(내인성 수준을 초과하는 높은 NPY 발현). 데이터는 평균값 ± s.e.m으로 제공되며 맨-휘트니 U 검정을 사용하여 분석한다. 치료하지 않은 무경험 대조군 동물에 비교하여 * P<0.05.

NPY Y2 수용체 결합 자가방사기록법 어세이: 10 nM Leu31, Pro34-뉴로펩티드 Y(Y1/Y4/Y5 선호되는 작용제; #H-3306, 스위스 소재의 바켐 AG(Bachem AG))를 포함하는 0.1 nM [¹²⁵I][Tyr36]모노요오도-PYY(4000 Ci/mmol; #IM259; 아머샴 바이오사이언시즈(Amersham Biosciences))와 함께 해마 슬라이스를 인큐베이션하여 Y2 결합을 가시화하였다. 1 μM 비-표지 NPY(인간/랫트 합성, 덴마크 소재의 사퍼-N(Schafer-N))를 첨가하여 비-특이적 결합을 가시화하였다. 이어서, 슬라이스를 1251-감응성 Kodak Biomax MS 필름(아머샴 바이오사이언시즈)에 노출시키고 현상하였다. 정성적 평가 후에 배측 해마 CA1(피라미드층 및 지향층 및 방사층)에서 Y2 수용체 결합을 평가하고 Y2 수용체 신호에 상응하는 값을 제공하였다: 1(내인성 수준에 상응하는 Y2 수용체 발현), 2(내인성 수준을 초과하는 낮은 Y2 수용체 발현), 3(내인성 수준을 초과하는 보통의 Y2 수용체 발현), 및 4(내인성 수준을 초과하는 높은 Y2 수용체 발현). 데이터는 평균값 ± s.e.m으로 제공되며 맨-휘트니 U 검정을 사용하여 분석한다. 치료하지 않은 무경험 대조군 동물에 비교하여 *P<0.05.

NPY Y2 작용성 수용체 결합 자가방사기록법 어세이: Y2 수용체 작용성 결합의 가시화를 위해 40 pM [³⁵S]-GTPγS(1250 Ci/mmol; NEG030H250UC; 덴마크 소재의 퍼킨엘머(PerkinElmer)), 1 μM NPY(덴마크 코펜하겐 소재의 사퍼-N), 1 μM Yl 수용체 길항제 BIBP3226(#E3620, 스위스 소재의 바켐 AG), 및 10 μM Y5 수용체 길항제 L-152,804(#1382, 영국 소재의 토크리스 쿡선(Tocris Cookson))와 함께 해마 슬라이스를 인큐베이션하였다. Y2 수용체 결합을 확인하기 위해, 1 μM Y2 수용체 길항제 BIIE0246(#1700, 영국 소재의 토크리스 쿡선)을 BIBP3226 및 L-152,804와 함께 NPY에 첨가하였다. 40 pM [³⁵S]-GTPγS 및 10 μM 비-표지 GTPγS(#89378; 시그마-알드리치)와 함께 완충제 B 중에 인큐베이션함으로써 비-특이적 결합을 결정한다. 이어서, 슬라이스를 Kodak BioMax MR 필름에 노출시키고 현상하였다. ImageJ 소프트웨어(미국 국립 보건원)를 사용하여 배측 해마 CAl(피라미드층 및 지향층 및 방사층)에서 Y2 수용체 작용성 결합을 평가하였다. 데이터는 평균값 ± s.e.m으로 제공되며 양측 스튜던트 t-검정을 사용하여 분석한다. 치료하지 않은 무경험 대조군 동물에 비교하여 * P<0.05, ***P<0.001.

마우스 선조체 내로의 AAV 벡터 주사

마우스를 마취시키고 브레그마에 대해 하기 좌표를 가진 3개 부위에 바이러스 벡터(1.1 x 10¹² 유전체 입자/ml)를 주사하였다: 두개골 외부(cranium externum)를 기준점으로 사용하여 전방- 후방: +0.85 mm; 내측-외측: ±1.85 mm; 배측-복측: -3.00 mm(1 ㎕), -3.4 mm(0.5 ㎕), -3.85 mm(1 ㎕).

마우스에서의 할로페리돌-유도 경직 격자 시험

이 통상적으로 사용되는 파킨슨병에서의 증상의 약리학적 모델은 도파민 D2 수용체에 길항작용을 하고 선조체 도파민 함량을 감소시키는 것으로 공지된 할로페리돌의 투여를 채용한다(문헌[Duty and Jenner, 2011]). 이는 결과적으로 도파민성 신경전달의 차단 및 기저핵 회로 내부의 비정상적 다운스트림 발화를 유발하며, 이는 파킨슨병에서 관찰되는 운동 증상을 모방하는 강직 및 경직의 증상으로서 나타난다.

마우스에 할로페리돌(1.0 mg/kg, i.p.)을 주사하고 마우스를 60 초의 기간 동안 금속 격자 상에 놓음으로써 시험하고 부동 시간(immobilization time)을 기록하였다. 이는 치료 조건을 알지 못하는 관찰자에 의해 할로페리돌 주사 후 2-시간 관찰 기간 중에 매 30 min마다 60 초 관찰 기간 동안 실행되었다.

참고문헌 목록

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SEQUENCE LISTING <110> COMBIGENE AB <120> VECTOR <130> IPA180745-SE <150> SE1650192-6 <151> 2016-02-12 <160> 16 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 294 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 atgctaggta acaagcgact ggggctgtcc ggactgaccc tcgccctgtc cctgctcgtg 60 tgcctgggtg cgctggccga ggcgtacccc tccaagccgg acaacccggg cgaggacgca 120 ccagcggagg acatggccag atactactcg gcgctgcgac actacatcaa cctcatcacc 180 aggcagagat atggaaaacg atccagccca gagacactga tttcagacct cttgatgaga 240 gaaagcacag aaaatgttcc cagaactcgg cttgaagacc ctgcaatgtg gtga 294 <210> 2 <211> 1146 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 atgggtccaa taggtgcaga ggctgatgag aaccagacag tggaagaaat gaaggtggaa 60 caatacgggc cacaaacaac tcctagaggt gaactggtcc ctgaccctga gccagagctt 120 atagatagta ccaagctgat tgaggtacaa gttgttctca tattggccta ctgctccatc 180 atcttgcttg gggtaattgg caactccttg gtgatccatg tggtgatcaa attcaagagc 240 atgcgcacag taaccaactt tttcattgcc aatctggctg tggcagatct tttggtgaac 300 actctgtgtc taccgttcac tcttacctat accttaatgg gggagtggaa 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attgacgtca ataatgacgt atgttcccat agtaacgcca atagggactt 240 tccattgacg tcaatgggtg gagtatttac ggtaaactgc ccacttggca gtacatcaag 300 tgtatcatat gccaagtacg ccccctattg acgtcaatga cggtaaatgg cccgcctggc 360 attatgccca gtacatgacc ttatgggact ttcctacttg gcagtacatc tacgtattag 420 tcatcgctat taccatggtc gaggtgagcc ccacgttctg cttcactctc cccatctccc 480 ccccctcccc acccccaatt ttgtatttat ttatttttta attattttgt gcagcgatgg 540 gggcgggggg gggggggggg cgcgcgccag gcggggcggg gcggggcgag gggcggggcg 600 gggcgaggcg gagaggtgcg gcggcagcca atcagagcgg cgcgctccga aagtttcctt 660 ttatggcgag gcggcggcgg cggcggccct ataaaaagcg aagcgcgcgg cgggcgggag 720 tcgctgcgcg ctgccttcgc cccgtgcccc gctccgccgc cgcctcgcgc cgcccgcccc 780 ggctctgact gaccgcgtta ctcccacagg tgagcgggcg ggacggccct tctcctccgg 840 gctgtaatta gcgcttggtt taatgacggc ttgtttcttt tctgtggctg cgtgaaagcc 900 ttgaggggct ccgggagggc cctttgtgcg gggggagcgg ctcggggctg tccgcggggg 960 gacggctgcc ttcggggggg acggggcagg gcggggttcg gcttctggcg tgtgaccggc 1020 ggctctagag cctctgctaa ccatgttcat gccttcttct ttttcctaca gctcctgggc 1080 aacgtgctgg ttattgtgct gtctcatcat tttggcaaag aattggatcc actcgagatg 1140 ctaggtaaca agcgactggg gctgtccgga ctgaccctcg ccctgtccct gctcgtgtgc 1200 ctgggtgcgc tggccgaggc gtacccctcc aagccggaca acccgggcga ggacgcacca 1260 gcggaggaca tggccagata ctactcggcg ctgcgacact acatcaacct catcaccagg 1320 cagagatatg gaaaacgatc cagcccagag acactgattt cagacctctt gatgagagaa 1380 agcacagaaa atgttcccag aactcggctt gaagaccctg caatgtggtg acaattgcgc 1440 ccctctccct cccccccccc taacgttact ggccgaagcc gcttggaata aggccggtgt 1500 gcgtttgtct atatgttatt ttccaccata ttgccgtctt ttggcaatgt gagggcccgg 1560 aaacctggcc ctgtcttctt gacgagcatt cctaggggtc tttcccctct cgccaaagga 1620 atgcaaggtc tgttgaatgt cgtgaaggaa gcagttcctc tggaagcttc ttgaagacaa 1680 acaacgtctg tagcgaccct ttgcaggcag cggaaccccc cacctggcga caggtgcctc 1740 tgcggccaaa agccacgtgt ataagataca cctgcaaagg cggcacaacc ccagtgccac 1800 gttgtgagtt ggatagttgt ggaaagagtc aaatggctct cctcaagcgt attcaacaag 1860 gggctgaagg atgcccagaa ggtaccccat tgtatgggat ctgatctggg gcctcggtgc 1920 acatgcttta catgtgttta gtcgaggtta aaaaaacgtc taggcccccc gaaccacggg 1980 gacgtggttt tcctttgaaa aacacgatga taagtcgaca ctagcatggg tccaataggt 2040 gcagaggctg atgagaacca gacagtggaa gaaatgaagg tggaacaata cgggccacaa 2100 acaactccta gaggtgaact ggtccctgac cctgagccag agcttataga tagtaccaag 2160 ctgattgagg tacaagttgt tctcatattg gcctactgct ccatcatctt gcttggggta 2220 attggcaact ccttggtgat ccatgtggtg atcaaattca agagcatgcg cacagtaacc 2280 aactttttca ttgccaatct ggctgtggca gatcttttgg tgaacactct gtgtctaccg 2340 ttcactctta cctatacctt aatgggggag tggaaaatgg gtcctgtcct gtgccacctg 2400 gtgccctatg cccagggcct ggcagtacaa gtatccacaa tcaccttgac agtaattgcc 2460 ctggaccggc acaggtgcat cgtctaccac ctagagagca agatctccaa gcgaatcagc 2520 ttcctgatta ttggcttggc ctggggcatc agtgccctgc tggcaagtcc cctggccatc 2580 ttccgggagt attcgctgat tgagatcatt ccggactttg agattgtggc ctgtactgaa 2640 aagtggcctg gcgaggagaa gagcatctat ggcactgtct atagtctttc ttccttgttg 2700 atcttgtatg ttttgcctct gggcattata tcattttcct acactcgcat ttggagtaaa 2760 ttgaagaacc atgtcagtcc tggagctgca aatgaccact accatcagcg aaggcaaaaa 2820 accaccaaaa tgctggtgtg tgtggtggtg gtgtttgcgg tcagctggct gcctctccat 2880 gccttccagc ttgccgttga cattgacagc caggtcctgg acctgaagga gtacaaactc 2940 atcttcacag tgttccacat tatcgccatg tgctccactt ttgccaatcc ccttctctat 3000 ggctggatga acagcaacta cagaaaggct ttcctctcgg ccttccgctg tgagcagcgg 3060 ttggatgcca ttcactctga ggtgtccgtg acattcaagg ctaaaaagaa cctggaggtc 3120 agaaagaaca gtggccccaa tgactctttc acagaggcta ccaatgtcta aggatccact 3180 agtccagtgt ggtggaattc gatatcaagc ttatcgataa tcaacctctg gattacaaaa 3240 tttgtgaaag attgactggt attcttaact atgttgctcc ttttacgcta tgtggatacg 3300 ctgctttaat gcctttgtat catgctattg cttcccgtat ggctttcatt ttctcctcct 3360 tgtataaatc ctggttgctg tctctttatg aggagttgtg gcccgttgtc aggcaacgtg 3420 gcgtggtgtg cactgtgttt gctgacgcaa cccccactgg ttggggcatt gccaccacct 3480 gtcagctcct ttccgggact ttcgctttcc ccctccctat tgccacggcg gaactcatcg 3540 ccgcctgcct tgcccgctgc tggacagggg ctcggctgtt gggcactgac aattccgtgg 3600 tgttgtcggg gaaatcatcg tcctttcctt ggctgctcgc ctgtgttgcc acctggattc 3660 tgcgcgggac gtccttctgc tacgtccctt cggccctcaa tccagcggac cttccttccc 3720 gcggcctgct gccggctctg cggcctcttc cgcgtcttcg ccttcgccct cagacgagtc 3780 ggatctccct ttgggccgcc tccccgcatc gataccgtcg atcgactcgc tgatcagcct 3840 cgactgtgcc ttctagttgc cagccatctg ttgtttgccc ctcccccgtg ccttccttga 3900 ccctggaagg tgccactccc actgtccttt cctaataaaa tgaggaaatt gcatcgcatt 3960 gtctgagtag gtgtcattct attctggggg gtggggtggg gcaggacagc aagggggagg 4020 attgggaaga caatagcagg catgctgggg atgcggtggg ctctatggct tctgaggcgg 4080 aaagaaccag ctggggctcg actagagcat ggctacgtag ataagtagca tggcgggtta 4140 atcattaact acaaggaacc cctagtgatg gagttggcca ctccctctct gcgcgctcgc 4200 tcgctcactg aggccgggcg accaaaggtc gcccgacgcc cgggctttgc ccgggcggcc 4260 tcagtgagcg agcgagcgcg cagagctt 4288 <210> 10 <211> 4288 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ITR-CAG-NPY2R-IRES-NPY-WPRE-BGHpA-ITR <400> 10 tagctgcgcg ctcgctcgct cactgaggcc gcccgggcaa agcccgggcg tcgggcgacc 60 tttggtcgcc cggcctcagt gagcgagcga gcgcgcagag agggagtggc caactccatc 120 actaggggtt ccttgtagtt aatgattaac ccgccatgct acttatctac gtagccatgc 180 tctaggtacc attgacgtca ataatgacgt atgttcccat agtaacgcca atagggactt 240 tccattgacg tcaatgggtg gagtatttac ggtaaactgc ccacttggca gtacatcaag 300 tgtatcatat gccaagtacg ccccctattg acgtcaatga cggtaaatgg cccgcctggc 360 attatgccca gtacatgacc ttatgggact ttcctacttg gcagtacatc tacgtattag 420 tcatcgctat taccatggtc gaggtgagcc ccacgttctg cttcactctc cccatctccc 480 ccccctcccc acccccaatt ttgtatttat ttatttttta attattttgt gcagcgatgg 540 gggcgggggg gggggggggg cgcgcgccag gcggggcggg gcggggcgag gggcggggcg 600 gggcgaggcg gagaggtgcg gcggcagcca atcagagcgg cgcgctccga aagtttcctt 660 ttatggcgag gcggcggcgg cggcggccct ataaaaagcg aagcgcgcgg cgggcgggag 720 tcgctgcgcg ctgccttcgc cccgtgcccc gctccgccgc cgcctcgcgc cgcccgcccc 780 ggctctgact gaccgcgtta ctcccacagg tgagcgggcg ggacggccct tctcctccgg 840 gctgtaatta gcgcttggtt taatgacggc ttgtttcttt tctgtggctg cgtgaaagcc 900 ttgaggggct ccgggagggc cctttgtgcg gggggagcgg ctcggggctg tccgcggggg 960 gacggctgcc ttcggggggg acggggcagg gcggggttcg gcttctggcg tgtgaccggc 1020 ggctctagag cctctgctaa ccatgttcat gccttcttct ttttcctaca gctcctgggc 1080 aacgtgctgg ttattgtgct gtctcatcat tttggcaaag aattggatcc actcgacact 1140 agcatgggtc caataggtgc agaggctgat gagaaccaga cagtggaaga aatgaaggtg 1200 gaacaatacg ggccacaaac aactcctaga ggtgaactgg tccctgaccc tgagccagag 1260 cttatagata gtaccaagct gattgaggta caagttgttc tcatattggc ctactgctcc 1320 atcatcttgc ttggggtaat tggcaactcc ttggtgatcc atgtggtgat caaattcaag 1380 agcatgcgca cagtaaccaa ctttttcatt gccaatctgg ctgtggcaga tcttttggtg 1440 aacactctgt gtctaccgtt cactcttacc tataccttaa tgggggagtg gaaaatgggt 1500 cctgtcctgt gccacctggt gccctatgcc cagggcctgg cagtacaagt atccacaatc 1560 accttgacag taattgccct ggaccggcac aggtgcatcg tctaccacct agagagcaag 1620 atctccaagc gaatcagctt cctgattatt ggcttggcct ggggcatcag tgccctgctg 1680 gcaagtcccc tggccatctt ccgggagtat tcgctgattg agatcattcc ggactttgag 1740 attgtggcct gtactgaaaa gtggcctggc gaggagaaga gcatctatgg cactgtctat 1800 agtctttctt ccttgttgat cttgtatgtt ttgcctctgg gcattatatc attttcctac 1860 actcgcattt ggagtaaatt gaagaaccat gtcagtcctg gagctgcaaa tgaccactac 1920 catcagcgaa ggcaaaaaac caccaaaatg ctggtgtgtg tggtggtggt gtttgcggtc 1980 agctggctgc ctctccatgc cttccagctt gccgttgaca ttgacagcca ggtcctggac 2040 ctgaaggagt acaaactcat cttcacagtg ttccacatta tcgccatgtg ctccactttt 2100 gccaatcccc ttctctatgg ctggatgaac agcaactaca gaaaggcttt cctctcggcc 2160 ttccgctgtg agcagcggtt ggatgccatt cactctgagg tgtccgtgac attcaaggct 2220 aaaaagaacc tggaggtcag aaagaacagt ggccccaatg actctttcac agaggctacc 2280 aatgtctaag gatccactag tccagtgtgg tggaattgcg cccctctccc tccccccccc 2340 ctaacgttac tggccgaagc cgcttggaat aaggccggtg tgcgtttgtc tatatgttat 2400 tttccaccat attgccgtct tttggcaatg tgagggcccg gaaacctggc cctgtcttct 2460 tgacgagcat tcctaggggt ctttcccctc tcgccaaagg aatgcaaggt ctgttgaatg 2520 tcgtgaagga agcagttcct ctggaagctt cttgaagaca aacaacgtct gtagcgaccc 2580 tttgcaggca gcggaacccc ccacctggcg acaggtgcct ctgcggccaa aagccacgtg 2640 tataagatac acctgcaaag gcggcacaac cccagtgcca cgttgtgagt tggatagttg 2700 tggaaagagt caaatggctc tcctcaagcg tattcaacaa ggggctgaag gatgcccaga 2760 aggtacccca ttgtatggga tctgatctgg ggcctcggtg cacatgcttt acatgtgttt 2820 agtcgaggtt aaaaaaacgt ctaggccccc cgaaccacgg ggacgtggtt ttcctttgaa 2880 aaacacgatg ataagtcgag atgctaggta acaagcgact ggggctgtcc ggactgaccc 2940 tcgccctgtc cctgctcgtg tgcctgggtg cgctggccga ggcgtacccc tccaagccgg 3000 acaacccggg cgaggacgca ccagcggagg acatggccag atactactcg gcgctgcgac 3060 actacatcaa cctcatcacc aggcagagat atggaaaacg atccagccca gagacactga 3120 tttcagacct cttgatgaga gaaagcacag aaaatgttcc cagaactcgg cttgaagacc 3180 ctgcaatgtg gtgacaattc gatatcaagc ttatcgataa tcaacctctg gattacaaaa 3240 tttgtgaaag attgactggt attcttaact atgttgctcc ttttacgcta tgtggatacg 3300 ctgctttaat gcctttgtat catgctattg cttcccgtat ggctttcatt ttctcctcct 3360 tgtataaatc ctggttgctg tctctttatg aggagttgtg gcccgttgtc aggcaacgtg 3420 gcgtggtgtg cactgtgttt gctgacgcaa cccccactgg ttggggcatt gccaccacct 3480 gtcagctcct ttccgggact ttcgctttcc ccctccctat tgccacggcg gaactcatcg 3540 ccgcctgcct tgcccgctgc tggacagggg ctcggctgtt gggcactgac aattccgtgg 3600 tgttgtcggg gaaatcatcg tcctttcctt ggctgctcgc ctgtgttgcc acctggattc 3660 tgcgcgggac gtccttctgc tacgtccctt cggccctcaa tccagcggac cttccttccc 3720 gcggcctgct gccggctctg cggcctcttc cgcgtcttcg ccttcgccct cagacgagtc 3780 ggatctccct ttgggccgcc tccccgcatc gataccgtcg atcgactcgc tgatcagcct 3840 cgactgtgcc ttctagttgc cagccatctg ttgtttgccc ctcccccgtg ccttccttga 3900 ccctggaagg tgccactccc actgtccttt cctaataaaa tgaggaaatt gcatcgcatt 3960 gtctgagtag gtgtcattct attctggggg gtggggtggg gcaggacagc aagggggagg 4020 attgggaaga caatagcagg catgctgggg atgcggtggg ctctatggct tctgaggcgg 4080 aaagaaccag ctggggctcg actagagcat ggctacgtag ataagtagca tggcgggtta 4140 atcattaact acaaggaacc cctagtgatg gagttggcca ctccctctct gcgcgctcgc 4200 tcgctcactg aggccgggcg accaaaggtc gcccgacgcc cgggctttgc ccgggcggcc 4260 tcagtgagcg agcgagcgcg cagagctt 4288 <210> 11 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NPY forward primer <400> 11 ctcatcacca ggcagagata tg 22 <210> 12 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NPY reverse primer <400> 12 accacattgc agggtcttc 19 <210> 13 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NPY2R forward primer <400> 13 ctggacctga aggagtacaa ac 22 <210> 14 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NPY2R reverse primer <400> 14 gttcatccag ccatagagaa gg 22 <210> 15 <211> 97 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 15 Met Leu Gly Asn Lys Arg Leu Gly Leu Ser Gly Leu Thr Leu Ala Leu 1 5 10 15 Ser Leu Leu Val Cys Leu Gly Ala Leu Ala Glu Ala Tyr Pro Ser Lys 20 25 30 Pro Asp Asn Pro Gly Glu Asp Ala Pro Ala Glu Asp Met Ala Arg Tyr 35 40 45 Tyr Ser Ala Leu Arg His Tyr Ile Asn Leu Ile Thr Arg Gln Arg Tyr 50 55 60 Gly Lys Arg Ser Ser Pro Glu Thr Leu Ile Ser Asp Leu Leu Met Arg 65 70 75 80 Glu Ser Thr Glu Asn Val Pro Arg Thr Arg Leu Glu Asp Pro Ala Met 85 90 95 Trp <210> 16 <211> 381 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 16 Met Gly Pro Ile Gly Ala Glu Ala Asp Glu Asn Gln Thr Val Glu Glu 1 5 10 15 Met Lys Val Glu Gln Tyr Gly Pro Gln Thr Thr Pro Arg Gly Glu Leu 20 25 30 Val Pro Asp Pro Glu Pro Glu Leu Ile Asp Ser Thr Lys Leu Ile Glu 35 40 45 Val Gln Val Val Leu Ile Leu Ala Tyr Cys Ser Ile Ile Leu Leu Gly 50 55 60 Val Ile Gly Asn Ser Leu Val Ile His Val Val Ile Lys Phe Lys Ser 65 70 75 80 Met Arg Thr Val Thr Asn Phe Phe Ile Ala Asn Leu Ala Val Ala Asp 85 90 95 Leu Leu Val Asn Thr Leu Cys Leu Pro Phe Thr Leu Thr Tyr Thr Leu 100 105 110 Met Gly Glu Trp Lys Met Gly Pro Val Leu Cys His Leu Val Pro Tyr 115 120 125 Ala Gln Gly Leu Ala Val Gln Val Ser Thr Ile Thr Leu Thr Val Ile 130 135 140 Ala Leu Asp Arg His Arg Cys Ile Val Tyr His Leu Glu Ser Lys Ile 145 150 155 160 Ser Lys Arg Ile Ser Phe Leu Ile Ile Gly Leu Ala Trp Gly Ile Ser 165 170 175 Ala Leu Leu Ala Ser Pro Leu Ala Ile Phe Arg Glu Tyr Ser Leu Ile 180 185 190 Glu Ile Ile Pro Asp Phe Glu Ile Val Ala Cys Thr Glu Lys Trp Pro 195 200 205 Gly Glu Glu Lys Ser Ile Tyr Gly Thr Val Tyr Ser Leu Ser Ser Leu 210 215 220 Leu Ile Leu Tyr Val Leu Pro Leu Gly Ile Ile Ser Phe Ser Tyr Thr 225 230 235 240 Arg Ile Trp Ser Lys Leu Lys Asn His Val Ser Pro Gly Ala Ala Asn 245 250 255 Asp His Tyr His Gln Arg Arg Gln Lys Thr Thr Lys Met Leu Val Cys 260 265 270 Val Val Val Val Phe Ala Val Ser Trp Leu Pro Leu His Ala Phe Gln 275 280 285 Leu Ala Val Asp Ile Asp Ser Gln Val Leu Asp Leu Lys Glu Tyr Lys 290 295 300 Leu Ile Phe Thr Val Phe His Ile Ile Ala Met Cys Ser Thr Phe Ala 305 310 315 320 Asn Pro Leu Leu Tyr Gly Trp Met Asn Ser Asn Tyr Arg Lys Ala Phe 325 330 335 Leu Ser Ala Phe Arg Cys Glu Gln Arg Leu Asp Ala Ile His Ser Glu 340 345 350 Val Ser Val Thr Phe Lys Ala Lys Lys Asn Leu Glu Val Arg Lys Asn 355 360 365 Ser Gly Pro Asn Asp Ser Phe Thr Glu Ala Thr Asn Val 370 375 380

Claims (47)

1. 뉴로펩티드 Y(NPY) 코딩 서열 및 뉴로펩티드 Y2 수용체(NPY2R) 코딩 서열을 포함하는 재조합 아데노-관련 바이러스(rAAV) 벡터.
2. 제1항에 있어서,
   상기 뉴로펩티드 Y(NPY) 코딩 서열이 서열 번호 l에 상응하는 서열 또는 상기 서열에 대해 적어도 90% 서열 동일성, 예컨대 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성(%SI)을 나타내는 서열을 갖는 벡터.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
   상기 뉴로펩티드 Y2 수용체(NPY2R) 코딩 서열이 서열 번호 2에 상응하는 서열 또는 상기 서열에 대해 적어도 90% 서열 동일성, 예컨대 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성(%SI)을 나타내는 서열을 갖는 벡터.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
   AAV2 반전 말단 반복 서열(ITR), 혼성 사이토메갈로바이러스 인핸서/닭 베타-액틴 CAG 프로모터(CAG), 내부 리보솜 진입 부위(IRES), 우드척 간염 번역-후 조절 요소(WPRE), 및 소 성장 호르몬 폴리아데닐화(bGH-폴리A) 신호 서열의 작용성 요소 중 적어도 하나, 바람직하게 전부를 추가로 포함하는 벡터.
5. 제4항에 있어서,
   혼성 사이토메갈로바이러스 인핸서/닭 베타-액틴 CAG 프로모터(CAG)를 포함하며, CAG 프로모터 서열이 NPY 및 NPY2R에 대한 코딩 서열의 업스트림(upstream)에 위치하는 벡터.
6. 제4항 또는 제5항에 있어서,
   내부 리보솜 진입 부위(IRES)를 포함하며, IRES 서열이 NPY 및 NPY2R에 대한 코딩 서열들 사이에 위치하는 벡터.
7. 제4항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
   우드척(woodchuck) 간염 번역-후 조절 요소(WPRE)를 포함하며, WPRE 서열이 NPY 및 NPY2R에 대한 코딩 서열의 다운스트림에 위치하는 벡터.
8. 제4항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
   소 성장 호르몬 폴리아데닐화(BGHpA) 신호 서열을 포함하며, (BGHpA) 신호 서열이 NPY 및 NPY2R에 대한 코딩 서열의 다운스트림에 위치하는 벡터.
9. 제4항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
   2개의 ITR 서열을 포함하며, 제1 ITR 서열은 벡터의 5'-단부, NPY 및 NPY2R에 대한 코딩 서열의 업스트림에 위치하고, 제2 ITR 서열은 벡터의 3'-단부, NPY 및 NPY2R에 대한 코딩 서열의 다운스트림에 위치하는 벡터.
10. 제4항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 서열이
    5'-ITR, CAG, NPY, IRES, NPY2R, WPRE, BGHpA, 및 ITR-3', 또는
    5'-ITR, CAG, NPY2R, IRES, NPY, WPRE, BGHpA, 및 ITR-3'의 순서로 작동적으로 연결되는 벡터.
11. 제4항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 5'-단부 ITR은 서열 번호 7에 상응하는 서열 또는 서열 번호 7 내에 존재하는 상응하는 길이의 올리고뉴클레오티드 단편에 대해 적어도 90% 서열 동일성, 예컨대 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성(%SI)을 나타내는 서열을 갖고, 상기 3'-단부 ITR은 서열 번호 8에 상응하는 서열 또는 서열 번호 8 내에 존재하는 상응하는 길이의 올리고뉴클레오티드 단편에 대해 적어도 90%, 예컨대 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성(%SI)을 나타내는 서열을 갖는 벡터.
12. 제4항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 CAG가 서열 번호 4에 상응하는 서열 또는 서열 번호 4 내에 존재하는 상응하는 길이의 올리고뉴클레오티드 단편에 대해 적어도 90% 서열 동일성, 예컨대 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성(%SI)을 나타내는 서열을 갖는 벡터.
13. 제4항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 IRES가 서열 번호 3에 상응하는 서열 또는 서열 번호 3 내에 존재하는 상응하는 길이의 올리고뉴클레오티드 단편에 대해 적어도 90% 서열 동일성, 예컨대 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성(%SI)을 나타내는 서열을 갖는 벡터.
14. 제4항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 WPRE가 서열 번호 5에 상응하는 서열 또는 서열 번호 5 내에 존재하는 상응하는 길이의 올리고뉴클레오티드 단편에 대해 적어도 90% 서열 동일성, 예컨대 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성(%SI)을 나타내는 서열을 갖는 벡터.
15. 제4항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 BGHpA가 서열 번호 6에 상응하는 서열 또는 서열 번호 6 내에 존재하는 상응하는 길이의 올리고뉴클레오티드 단편에 대해 적어도 90% 서열 동일성, 예컨대 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성(%SI)을 나타내는 서열을 갖는 벡터.
16. 제4항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서,
    서열 번호 9에 상응하는 서열 또는 서열 번호 9 내에 존재하는 상응하는 길이의 올리고뉴클레오티드 단편에 대해 적어도 90% 서열 동일성, 예컨대 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성(%SI)을 나타내는 서열을 갖거나, 서열 번호 10에 상응하는 서열 또는 서열 번호 10 내에 존재하는 상응하는 길이의 올리고뉴클레오티드 단편에 대해 적어도 90% 서열 동일성, 예컨대 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성(%SI)을 나타내는 서열을 갖는 벡터.
17. 제4항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서,
    서열이 인간에서의 발현을 위해 코돈 최적화된 벡터.
18. 제4항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서,
    NPY2R 코딩 서열이 NPY 코딩 서열의 다운스트림에 있는 벡터.
19. 제4항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서,
    CAG 프로모터 서열의 다운스트림 및 IRES 서열의 업스트림에 있는 NPY 또는 NPY2R에 대한 코딩 서열과 상기 CAG 프로모터 서열 사이의 거리가 60 내지 0개 염기, 바람직하게 40 내지 5개 염기, 가장 바람직하게 20 내지 10개 염기의 범위인 벡터.
20. 제4항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서,
    NPY 또는 NPY2R에 대한 다운스트림 코딩 서열과 상기 IRES 서열 사이의 거리가 60 내지 0개 염기, 바람직하게 40 내지 2개 염기, 가장 바람직하게 10 내지 4개 염기의 범위인 벡터.
21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 따른 벡터를 포함하며, 여기에서 벡터가 아데노-관련 바이러스(AAV) 캡시드 단백질에 의해 캡슐화된 AAV 입자.
22. 제21항에 있어서,
    AAV 캡시드 단백질이 AAV1, AAV2, 및 AAV8로 구성된 그룹, 바람직하게 AAV1 또는 AAV8, 가장 바람직하게 AAV1 중에서 선택되는 AAV 입자.
23. 제21항 또는 제22항에 있어서,
    AAV1-NPY/Y2, AAV1-Y2/NPY, 또는 AAV8-NPY/Y2인 AAV 입자.
24. 제21항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서,
    AAV1-NPY/Y2인 AAV 입자.
25. 포유류에서 신경학적 장애의 예방, 저해, 개선, 또는 치료에 사용하기 위한, 제21항 내지 제24항 중 어느 한 항에 따른 AAV 입자를 포함하는 약제학적 조성물.
26. 제25항에 있어서,
    상기 신경학적 장애가 뇌전증 또는 파킨슨병인 약제학적 조성물.
27. 제25항에 있어서,
    상기 뇌전증이 약물내성 뇌전증인 약제학적 조성물.
28. 제25항에 있어서,
    상기 신경학적 장애가 파킨슨병인 약제학적 조성물.
29. 제25항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서,
    부위-특이적 두개강내 주사를 통해 투여되는 약제학적 조성물.
30. 제25항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서,
    AAV 입자가 단일 용량 또는 다중 용량, 예컨대 2, 3, 4, 5회 용량으로서의 투여용으로 제형화되는 약제학적 조성물.
31. 제25항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서,
    작용성 AAV의 유효 용량이 0.01 내지 100 ㎍, 예컨대 0.1-50 ㎍ 또는 0.5-20 ㎍의 작용성 AAV 입자의 범위인 약제학적 조성물.
32. 신경학적 장애를 앓는 대상의 중추 신경계의 세포 내로 제25항 내지 제31항 중 어느 한 항에 따른 조성물의 약제학적 유효량을 투여하는 단계를 포함하는, 대상에서 신경학적 장애를 치료, 저해, 또는 개선하는 방법.
33. 제32항에 있어서,
    대상이 포유류 대상인 방법.
34. 제32항에 있어서,
    대상이 인간, 개, 고양이, 또는 말 대상인 방법.
35. 제32항에 있어서,
    대상이 인간 대상인 방법.
36. 제32항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서,
    신경학적 장애가 뇌전증 또는 파킨슨병인 방법.
37. 제32항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서,
    조성물이 부위-특이적 두개강내 주사를 통해 전달되는 방법.
38. 제32항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서,
    신경학적 장애가 뇌전증이고, 조성물이 뇌전증 병소 또는 병소들의 위치에 전달되는 방법.
39. 제21항 또는 제24항에 따른 AAV 입자를 세포 내로 도입하는 단계를 포함하는, NPY 및 Y2 유전체를 포유류 세포에 전달하는 방법.
40. 제39항에 있어서,
    세포가 신경 세포, 폐 세포, 망막 세포, 상피 세포, 근육 세포, 췌장 세포, 간 세포, 심근 세포, 골 세포, 비장 세포, 케라티노사이트, 섬유모세포, 내피 세포, 전립선 세포, 생식 세포, 전구 세포, 및 줄기 세포로 구성된 그룹 중에서 선택되는 전달 방법.
41. 제39항 또는 제40항의 세포를 대상에게 투여하는 단계를 포함하는, NPY 및 Y2 유전체를 대상에게 투여하는 방법.
42. 제41항에 있어서,
    대상이 포유류 대상인, 핵산을 대상에게 투여하는 방법.
43. 제41항에 있어서,
    대상이 인간 대상인, 핵산을 대상에게 투여하는 방법.
44. 제21항 내지 제24항 중 어느 한 항에 따른 AAV 입자를 대상 내의 포유류 세포에 투여하는 단계를 포함하며, 여기에서 바이러스 입자는 대상의 해마에 투여되는, NPY 및 Y2 유전체를 대상에게 전달하는 방법.
45. 신경학적 장애를 앓는 대상의 중추 신경계의 세포 내로 제19항 내지 제24항 중 어느 한 항에 따른 조성물의 약제학적 유효량을 투여하는 단계를 포함하는, NPY가 치료 효과를 나타내거나 NPY-결핍에 의해 야기되는 질환을 감소시키며, 여기에서 질환은 뇌전증 또는 파킨슨병 중에서 선택되는 방법.
46. NPY를 필요로 하는 대상, 예컨대 NPY 결핍을 나타내는 대상을 선택하는 단계; 및
    제19항 내지 제24항 중 어느 한 항에 따른 조성물의 약제학적 유효량을 상기 대상에게 제공하는 단계를 포함하는, NPY를 이를 필요로 하는 대상에게 제공하는 방법.
47. 제46항에 있어서,
    상기 대상이, 예를 들어 뇌전증 또는 파킨슨병의 EEG 및/또는 임상 진단과 같은 임상 평가 또는 진단 시험에 의해 NPY 결핍을 나타내는 것으로 선택되는 방법.

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