JP2021500925A - 組織送達用材料の多重化解析 - Google Patents

組織送達用材料の多重化解析 Download PDF

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Abstract

本明細書において、標的組織への生物活性剤の機能的送達に好適な材料を特定するための組成物および方法が開示される。これらの組成物および方法は、細胞、組織、または臓器に生物活性剤を送達する能力について、材料のライブラリーを同時にスクリーニングするという利点を有する。これらの組成物および方法は、生物活性剤が機能するのに十分な形で生物活性剤が送達されたことを確認することにも使用できる。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１７年１０月３０日に出願された米国仮特許出願第６２／５７８，５９４号、および２０１８年６月２６日に出願された米国仮特許出願第６２／６９０，２４０号に基づく利益および優先権を主張するものであり、これらの両米国仮特許出願は許容される範囲でその全体が援用される。
配列表の参照
配列表は、提出日２０１８年１０月３０日、テキストファイル名「０６４４８９．０３６ＰＣＴ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」、作成日２０１８年１０月３０日、サイズ７．０８ＫＢであり、米国特許法施行規則１．５２（ｅ）（５）に従って参照により本明細書に援用される。
技術分野
本発明は、全体として、ナノ粒子送達用担体を包含するがこれに限定はされない送達用担体を特性評価するための方法および組成物を対象とする。
背景
ヒト疾患を治療および検出するための標的化された粒子の開発は、このクラスのバイオマテリアルの爆発的な市場拡大をもたらすと期待される。ｍＲＮＡを内包するナノ粒子は、外来性核酸の送達を妨げるように発達した、絶えず変化する障害に直面している。これらの課題を克服するため、ＬＮＰには２つの方法で化学的多様性が付与される。１つ目では、イオン化性、ｐＫａ、および疎水性を変化させた数千の化合物が合成され得る。２つ目では、各化合物が、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）、コレステロール、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、または他の成分の追加により、数百の化学的に異なるＬＮＰへと配合され得る。
数百〜数千のＬＮＰから構成されるナノ粒子ライブラリーが、インビトロでスクリーニングされ得る。このプロセスは、インビボ（生きている動物の中）での送達が予測されて初めて有効となる。インビボにおけるｍＲＮＡ送達は、血流の脈動、脈管構造の不均一性、並びに腎臓、脾臓、肝臓、リンパ管、および免疫系によるクリアランスの影響を受ける。バーコード付加技術によりＬＮＰ体内分布を定量化されたが、細胞質核酸送達には必要不十分な量である。より具体的には、標的細胞に到達する薬剤の３％未満しか細胞質内に逃げ込むことができず、ナノ粒子がエンドソーム内に逃げ込めるかどうかを変化させる遺伝子は各細胞型で異なるようである。故に、体内分布の測定では、細胞質内または核内への機能的な薬剤送達を予測することができない。
これらの障害を克服するため、所望の指向性を示し、且つ機能的積荷を特定の細胞または組織に送達する送達用担体を、特性評価およびスクリーニングするための方法が、必要とされている。
概要
機能的積荷を送達する送達用担体を特性評価するための組成物および方法が提供される。多くの送達用担体が積荷を細胞に送達することができるが、その積荷はエンドソームまたはリソソームにトラップされてしまう場合があり、事実上機能しなくなる。本開示の組成物および方法は、目的の細胞または組織に薬剤を送達するだけでなく、積荷をその機能的な形態で送達する送達用担体製剤を特定することもできる複数の送達用担体製剤を、シングルランでアッセイできるため、有利である。例えば、積荷が核酸である場合、その核酸の細胞内での発現は、細胞の細胞質または核への送達時にその核酸が機能的であることを示している。
１つの実施形態では、前記方法は、レポーターおよび化学組成識別子を含有する送達用担体を用いる。前記方法は、異なる化学組成を有する複数の送達用担体を配合する工程を含む。１つの実施形態では、１００種を超える、あるいは２５０種をも超える、異なる送達用担体製剤が、１回のランでアッセイされる。前記送達用担体は、細胞に取り込まれるように配合される。前記送達用担体は、非ヒト動物の細胞の細胞質内または核内に機能的に送達された場合に検出可能なシグナルを生成できるレポーターと、送達用担体の化学組成を特定する組成識別子と、を含有する。前記レポーターは、細胞で発現された場合に検出可能なシグナルを生成できるタンパク質をコードする、ｍＲＮＡなどの核酸とすることができる。例えば、前記タンパク質は、蛍光タンパク質、または細胞内で検出可能な物質を生成する酵素とすることができる。
前記方法はまた、ヒト以外の哺乳動物、例えばマウス、ラット、または非ヒト霊長類などの実験動物、に対して、複数の送達用担体をプールおよび投与する工程を含む。複数の送達用担体の投与後、検出可能なシグナルを生成する、前記ヒト以外の哺乳動物の複数の組織からの細胞が、検出可能なシグナルを生成しない細胞からソーティングされる。１つの実施形態では、前記細胞は、蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）を用いてソーティングされる。いくつかの実施形態では、検出可能なシグナルを生成する細胞は、組織型または細胞型を示す細胞表面タンパク質の有無に基づくソーティングも行われる。代表的な細胞表面タンパク質としては、ＣＤ（cluster of differentiation）タンパク質が挙げられるが、これらに限定はされない。細胞表面タンパク質に対するフルオロフォア結合型抗体を用いて、細胞上の細胞表面タンパク質が検出され、細胞がソーティングされる。
前記方法は、前記検出可能なシグナルを生成するソーティング後細胞中の化学組成識別子を同定することにより、前記ソーティング後細胞中の送達用担体の化学組成を決定し、ソーティング後細胞上の細胞表面マーカーに基づいて、前記送達用担体の化学組成と前記粒子を含有する組織型または細胞型とを関連付ける工程も含む。１つの実施形態では、前記化学組成識別子は核酸バーコードであり、その配列はディープシーケンス技術（別名、ハイスル―プットシーケンスまたは次世代シーケンス）などを用いて決定される。
送達用担体の特性評価後、積荷を、それを必要とする対象の細胞に送達するために、その送達用担体を用いることができる。前記積荷は生理活性物質とすることができ、例えば核酸およびタンパク質が挙げられるが、これらに限定はされない。例示的な薬剤として、ｍＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ヌクレアーゼ、リコンビナーゼ、およびこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定はされない。
いくつかの実施形態では、前記送達用担体は粒子であり、例えばナノ粒子である。ナノ粒子は通常、１μｍ未満の直径を有する。１つの実施形態では、前記ナノ粒子は２０〜２００ｎｍの直径を有する。１つの実施形態では、前記粒子は脂質ナノ粒子である。
いくつかの実施形態では、前記送達用担体は、以下の３つの成分を含有するコンジュゲートである：（１）レポーター；（２）化学組成識別子；および（３）ペプチド、脂質、ｓｓＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、ｓｓＤＮＡ、ｄｓＤＮＡ、またはポリマーからなる群のうちの１つ。前記３つの成分は前記コンジュゲート内でいかなる配置であってもよい。例示的なレポーターとしては、ｓｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ヌクレアーゼｍＲＮＡ、小分子、エピジェネティックモディファイヤー、および表現型モディファイヤーが挙げられるが、これらに限定はされない。エピジェネティックモディファイヤーは、当該分子が細胞に送達された際に、細胞内部のＤＮＡ構造に検出可能な変化を引き起こすことができる分子である。例示的なエピジェネティックモディファイヤーとしては、ＤＮＡ塩基配列決定法（例えば、ＡＴＡＣ−ｓｅｑ）を用いて解析できるように、細胞内部のＤＮＡのクロマチン構造を変化させるタンパク質が挙げられる。表現型モディファイヤーは、当該分子が細胞に送達された際に、細胞の構造または挙動に検出可能な変化を引き起こすことができる分子である。例示的な表現型モディファイヤーとしては、細胞、例えば細胞形態、に変化を誘導する分子が挙げられる。前記化学組成識別子は、上記のような核酸バーコードとすることができる。
別の実施形態では、送達用担体と、核酸バーコードと、細胞の細胞質または核に送達された際に生物学的に活性となるレポーターと、を含有する組成物が提供される。いくつかの実施形態では、前記送達用担体は脂質ナノ粒子である。他の実施形態では、前記送達用担体はコンジュゲートである。さらに別の実施形態では、次式の核酸バーコード組成物が提供され、
Ｒ１−Ｒ２−Ｒ３−Ｒ４−Ｒ５−Ｒ６−Ｒ７−Ｒ８−Ｒ１、
式中、
Ｒ１は、ホスホロチオエート結合を有する１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のヌクレオチドを表し、
Ｒ２は第一のユニバーサルプライマー結合部位を表し、
Ｒ３はスペーサーを表し、
Ｒ４はデジタルドロップレットＰＣＲプローブ結合部位を表し、
Ｒ５はランダムヌクレオチド配列を表し；
Ｒ６は核酸バーコード配列を表し、
Ｒ７はランダム核酸配列を表し；
Ｒ８は第二のユニバーサルプライマー結合部位を表す。
別の実施形態では、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８に対し８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を含む核酸バーコードが提供される。
別の実施形態では、本明細書で開示される核酸バーコードを含有する薬剤的に許容できる組成物が提供される。
１または複数の実施形態の詳細を添付の図面および下記の説明に記載する。本発明の他の特徴、目的、および利点は、説明および図面から、また特許請求の範囲から明らかとなる。
図１Ａ〜図１Ｈは、細胞質ｍＲＮＡ送達のハイスループット解析を示している。図１Ａおよび図１Ｂは、Ｃｒｅ ｍＲＮＡおよびＤＮＡバーコードを内包するように配合されたナノ粒子を示しており、これらが後にＣｒｅレポーター細胞株またはマウスに投与された。これらのレポーター細胞株において、Ｃｒｅ ｍＲＮＡが細胞質内に機能的に送達され、機能的タンパク質に翻訳された場合にのみ、細胞は蛍光性となる。これらのレポーターマウスにおいて、Ｃｒｅ ｍＲＮＡが細胞質内に機能的に送達され、機能的タンパク質に翻訳された場合にのみ、マウス内の細胞は蛍光性となる。Ｃｒｅに媒介される遺伝的変化を起こした細胞を、ＦＡＣＳを用いて単離し、ＤＮＡバーコードをシーケンスにかけて、前記ｍＲＮＡを送達したＬＮＰを特定した。図１Ｃは、ＬＮＰバーコードの、「正規化された送達率」によるランク付けを示しており；各サンプル（例えば、肺１ 対 心臓１）はデュアルインデックスを用いたシングルランで個々に解析した。図１Ｄ〜図１Ｅは、Ｃｒｅタンパク質への暴露後にＲＦＰを発現するＨＥＫ細胞における、ＧＦＰおよびＲＦＰの発現を示している。細胞は、Ｃｒｅ ｍＲＮＡ単独（図１Ｄ）またはＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）２０００（Ｌ２Ｋ）に内包されたＣｒｅ ｍＲＮＡ（図１Ｅ）で処理された。図１Ｆは、Ｃｒｅ ｍＲＮＡおよびＡｌｅｘａ−６４７標識ＤＮＡバーコードを内包するＬＮＰによる処理後の、Ａｌｅｘａ６４７およびＲＦＰの強度を示している。図１Ｇは、ＲＦＰ＋ＨＥＫ細胞が、Ｌ２Ｋに内包されたＣｒｅ ｍＲＮＡの投与量に応じていることを示している。図１Ｈは、１０ｎｇのトータルｍＲＮＡ、または１００ｎｇのトータルｍＲＮＡを投与後のＲＦＰ＋ＨＥＫ細胞からシーケンスされた、５４種のＬＮＰについての、正規化されたＤＮＡバーコード送達率を示している。図１Ｉは、細胞をエンドサイトーシス阻害剤で処理してから、５４種のＬＮＰ（１００ｎｇのトータルｍＲＮＡ）を投与した後の、ＲＦＰ＋ＨＥＫ細胞を示している。Ｎ＝３〜４ウェル／群。＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、両側ｔ検定。 同上。 同上。 同上。 図２Ａ〜図２Ｈは、インビボにおける細胞質ｍＲＮＡ送達のハイスループット解析を示している。図２Ａは、Ｃｒｅ ｍＲＮＡおよびＤＮＡバーコードを内包するように配合されたＬＮＰを示しており、これは後にＬｏｘＰ−Ｓｔｏｐ−ＬｏｘＰ−ｔｄＴｏｍａｔｏレポーターマウスに注射された。図２Ｂは、脂質−アミン化合物の構造を変化させて配合された１１２種のＬＮＰ、並びに前記化合物、ＰＥＧ、コレステロール、およびＤＯＰＥのモル比を示している。 図２Ｃは、１１２種のＬＮＰの動的光散乱解析を示しており、このライブラリーから、７１種が安定なＬＮＰを形成したため、含められた。図２Ｄは、ＬＮＰを静脈内注射した後の、腎臓および肺の内皮細胞（ＣＤ３１＋ＣＤ４５−）における、正規化されたＤＮＡ送達率、並びに筋肉内注射後に単離されたＣＤ４５＋細胞およびＣＤ４５−細胞を示している。 図２Ｅは、偏りのないユークリッドグループ化により作成された、インビボＬＮＰターゲティングのヒートマップを示している。 図２Ｆ〜図２Ｇは、段階的な第二のＬＮＰスクリーニングにおける、肺（図２Ｆ）および腎臓（図２Ｇ）の内皮細胞についての、濃縮解析を示している。図２Ｈは、３回全てのＬＮＰスクリーニングにおける、肺／腎臓内皮細胞送達の比を示している。 図３Ａ〜図３Ｉは、ＦＩＮＤによって発見されたリードナノ粒子の特性評価を示している。図３Ａは、３回のＦＩＮＤ後に発見された上位２つの粒子、ＡＴＬ１およびＡＴＬ２が、体内分布、ｓｉＲＮＡ、ｓｇＲＮＡ、ｍＲＮＡ、およびこれらの組み合わせの送達について、十分に特性評価されたことを示している。図３Ｂ〜図３Ｅは、ＡＴＬ１およびＡＴＬ２が、それぞれ、７Ｃ１化合物、コレステロール、Ｃ１４−ＰＥＧ２０００、および異なるヘルパー脂質、１８：１ Ｌｙｓｏ ＰＣおよびＤＯＰＥから構成されることを示している。図３Ｆは、ＡＴＬ１およびＡＴＬ２が、１ｍｇ／ｋｇのｓｉＩＣＡＭ２投与の後、各種臓器の内皮細胞において、ＩＣＡＭ２タンパク質のサイレンシングを誘導したことを示している。図３Ｇ〜図３Ｉは、ＡＴＬ１およびＡＴＬ２によって送達された１．５ｍｇ／ｋｇのｓｇＩＣＡＭ２ａおよびｓｇＩＣＡＭ２ｂの反復投与後に、複数の臓器から得られた内皮細胞において測定された、ＩＣＡＭ２タンパク質（図３Ｄ）およびインデル（図３Ｅ、図３Ｆ）を示している。図３Ｊは、ＡＴＬ１またはＡＴＬ２によって送達された１．５ｍｇ／ｋｇのＣｒｅ ｍＲＮＡ単回注射後の、ＬＳＬ−Ｔｏｍマウスの各種臓器におけるｔｄＴｏｍａｔｏ＋内皮細胞の割合を示している。 同上。 同上。 同上。 図３Ｋ〜図３Ｍは、１．５ｍｇ／ｋｇのＡＴＬ１−Ｃｒｅを注射後のＬＳＬ−Ｔｏｍ脾臓におけるｔｄＴｏｍａｔｏ＋細胞の代表的な画像を示している。図３Ｎは、１．５ｍｇ／ｋｇのＡＴＬ２−Ｃｒｅを３回注射後のＬＳＬ−Ｔｏｍ脾臓におけるｔｄＴｏｍａｔｏ＋細胞の代表的な画像を示している。 図３Ｏは、１．５ｍｇ／ｋｇのＡＴＬ２−Ｃｒｅを３回注射後のＬＳＬ−Ｔｏｍ肝臓におけるｔｄＴｏｍａｔｏ＋細胞の代表的な画像を示している。 図４Ａ〜図４Ｂは、ＬＮＰの選択規準を示している。図４Ｅは、ＤＮＡバーコードの設計を示しており（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）；ＤＮＡバーコードはエキソヌクレアーゼ活性およびＰＣＲバイアスを低減するように設計された。 同上。 図４Ｆ〜図４Ｇは、ＬｏｘＰ−ＧＦＰ−Ｓｔｏｐ−ＬｏｘＰ−ＲＦＰ ＨＥＫ細胞がＣｒｅ ｍＲＮＡ単独（−ｃｔｒｌ）（図４Ｆ）またはＬ２Ｋに内包されたＣｒｅ ｍＲＮＡ（図４Ｇ）でトランスフェクトされた７２時間後のＧＦＰおよびＲＦＰの発現を示している。 図４Ｈ〜図４Ｉは、細胞をＣｒｅ ｍＲＮＡ単独（−ｃｔｒｌ）（図４Ｉ）またはＬ２Ｋに内包されたＣｒｅ ｍＲＮＡ（図４Ｈ）でトランスフェクトした場合の、時間および用量に応じた、ＲＦＰ陽性細胞を示している。 図４Ｊ〜図４Ｌは、化合物７Ｃ１、化合物７８、および化合物９２に用いた合成を示している。エポキシドベース、アクリレートベース、およびメタクリレートベースの化学作用が選択された。 図４Ｐ〜図４Ｑは、インビトロスクリーニングにおけるＬＮＰのサイズ分布を示しており；２０〜２００ｎｍのＬＮＰを採用した。細胞を１０ｎｇ、１００ｎｇ、または１０００ｎｇのｍＲＮＡで処理した後の、ＲＦＰ＋細胞から得られた、正規化されたＤＮＡバーコード読み取りは、４％、２０％、および８０％のＲＦＰ＋細胞という結果となった。 図５Ａ〜図５Ｋは、化合物７Ｃ１、７８、および９２の組成を示している。様々なアルキル長とＰＥＩ６００、ＰＥＩ１２００、およびトリエチルテトラミンを反応させる、エポキシドベースおよびアクリレートベースの化学作用が選択された。 図５Ｌ〜図５Ｏは、濃縮の基準を示している。組織中の上位２０％のＬＮＰから得られた材料特性を、初期ライブラリー配合物によって示された材料特性で除算した。この濃縮基準は配合物の安定性およびインビボ成績の両方を包含する。 図５Ｐ〜図５Ｖは、第二のインビボ実験に使用されたＬＮＰライブラリー中の化合物の組成を示している。ＰＥＧアルキル長を変化させた。 図５Ｗ〜図５ＣＣは、第二のインビボ実験に使用されたＬＮＰライブラリー、第三のインビボ実験に使用されたＬＮＰライブラリー、中の化合物の組成を示している。ヘルパー脂質の種類を変化させた。 図５ＤＤ〜図５ＬＬは、スクリーニング１、２、および３における、選択された細胞型における、ＬＮＰ直径と正規化された数との間の相関を示している。 図６Ａおよび図６Ｂは、ｍＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、およびｓｇＲＮＡを内包しているＡＴＬ１（図６Ａ）およびＡＴＬ２（図６Ｂ）のＤＬＳスペクトルを示している。 図６Ｃおよび図６Ｄは、クロルプロマジン、ゲニステイン、およびＥＩＰＡの存在下における、ＡＴＬ１（図６Ｃ）およびＡＴＬ２（図６Ｄ）に内包された、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ−６４７バーコード取り込みの、エンドサイトーシスを示している。 図６Ｅおよび図６Ｆは、クロルプロマジン、ゲニステイン、およびＥＩＰＡの存在下における、ＡＴＬ１（図６Ｅ）およびＡＴＬ２（図６Ｆ）について、Ｃｒｅ ｍＲＮＡの送達を示している。 図６Ｇは、全組織エキソビボイメージングにより、肺、腎臓、脾臓、肝臓、および心臓において測定された、ＡＴＬ１およびＡＴＬ２の、バーコード−Ｃｙ５．５の体内分布を示している。図６Ｈは、組織質量に対して正規化されたＡＴＬ１およびＡＴＬ２の体内分布を示している。 図６Ｉは、ＡＴＬ１およびＡＴＬ２における、ＰＢＳまたは２ｍｇ／ｋｇのｓｉＧＦＰの投与の２４時間後および７２時間後のマウス体重の変化を示している。図６Ｊおよび図６Ｋは、ＰＢＳ、ＡＴＬ１（図６Ｊ）またはＡＴＬ２（図６Ｋ）の２ｍｇ／ｋｇ注射の７２時間後のマウスの臓器重量を％体重として示している。図６Ｌは、使用されたｓｉＩＣＡＭ２の配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）およびｓｉＧＦＰの配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）を示している。 同上。 図６Ｍは、使用されたｓｇＩＣＡＭ２ａの配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）およびｓｇＩＣＡＭ２ｂの配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）を示している。図６Ｎおよび図６Ｏは、ＡＴＬ１−ｓｇＩＣＡＭ２ａｂおよびＡＴＬ２−ｓｇＩＣＡＭ２ａｂまたはＰＢＳを複数回注射後の、経時的な体重を示している。 図６Ｐおよび図６Ｑは、１．５ｍｇ／ｋｇのＡＴＬ１−ｓｇＩＣＡＭ２ａｂまたはＡＴＬ２−ｓｇＩＣＡＭ２ａｂを３回注射後の、各ＩＣＡＭ２遺伝子座における、インデル形成を示している。 図６Ｒおよび図６Ｓは、１．５ｍｇ／ｋｇのＡＴＬ１− Ｃｒｅ ｍＲＮＡまたはＡＴＬ２−Ｃｒｅ ｍＲＮＡの１回注射後の、各種臓器における、ＣＤ３１＋細胞およびＣＤ４５＋細胞における、％ｔｄＴｏｍ＋細胞を示している。 図７は、コンジュゲートをベースとしたシステムを図示している。これらには、バーコードおよびレポーターを含有する、ペプチドベースのシステム（図７Ａ）、脂質ベースのシステム（図７Ｂ）、ｓｓＲＮＡベースのシステム（図７Ｃ）、ｄｓＲＮＡベースのシステム（図７Ｄ）、ｓｓＤＮＡベースのシステム（図７Ｅ）、ｄｓＤＮＡベースのシステム（図７Ｆ）、およびポリマーベースのシステム（図７Ｇ）が包含される。 図８Ａおよび図８Ｂは、ペプチドベースのシステムと脂質ベースのシステムの組み合わせを図示している。 図９は、前記レポーターが、前記コンジュゲートに接続されている（図９Ａ）、前記バーコードに接続されている（図９Ｂ）、前記コンジュゲートに埋め込まれている（図９Ｃ）、または前記バーコードに埋め込まれている（図９Ｄ）、システムを図示している。それぞれの場合で、前記レポーターは、共有結合性相互作用を介しても、または非共有結合性相互作用を介しても、接続または埋め込みが可能である。 図１０は、レポーターを前記コンジュゲートまたは前記バーコードに接続する例示来な相互作用を図示している。 図１１は、いかにしてレポーターシステムが細胞において解釈可能な変化を起こすことができるのかを図示している。 図１２Ａ〜図１２Ｅは、蛍光の増加（図１２Ａ）、蛍光の減少（図１２Ｂ）、細胞の物理的状態の変化（図１２Ｃ）、細胞の下流シグナル伝達の変化（図１２Ｄ）、または細胞のゲノム内へのバーコードの挿入（図１２Ｅ）を含む、いかにしてレポーターシステムが細胞において解釈可能な変化を起こすことができるのかを図示している。 同上。 図１３は、図１２Ａ〜図１２Ｆの全ての場合で、いかにして、異なる分子における変化によって、解釈可能な変化が引き起こされ得るかを図示している。図１３では、レポーター分子がＲＮＡ内のスプライシング変異を補正し、これが、図１２Ａ〜図１２Ｅで説明された変化に繋がる。 図１４Ａ〜図１４Ｈは、ナノ粒子送達の高感度読み取りを実現するように合理的に設計された、ＱＵＡＮＴバーコードを示している。図１４Ａは、ＱＵＡＮＴバーコードが、ユニバーサルプライマー部位と、８ヌクレオチドバーコード領域と、プローブ結合部位と、分断された半ランダム化領域とを含有することを示している。これらの設計により、ＤＮＡ二次構造が減少し、ＤＮＡポリメラーゼのアクセスが増加する。 図１４Ｂは、ハイスループットマイクロフルイディクスを用いて、バーコードを化学的に異なる脂質ナノ粒子中に配合できることを示している。 図１４Ｃは、多くの化学的に異なるバーコード付加された脂質ナノ粒子を、一緒にプールし、同時に投与できることを示している。ＤＮＡバーコードを抽出し、絶対送達（ｄｄＰＣＲ）および相対送達（ディープシーケンス）について定量化することができる。 図１４Ｄは、ＴＥ緩衝液で希釈された、ＱＵＡＮＴバーコードの検量線を示している。 図１４Ｅは、バーコードが、３００ｆＭの濃度で、バックグラウンドを上回って、特定可能であることを示している。＊＊ｐ＜０．０１、両側ｔ検定。 図１４Ｆは、インビトロ検量線を示しており；バーコードはＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００を用いて細胞に送達された２４時間後に定量化された。 図１４Ｇは、インビボナノ粒子送達後の細胞からＤＮＡを単離した直後の、そのサンプルを−２０℃で２０日間または３１日間保存した後の、ＱＵＡＮＴバーコードの読み取りを示している。各実験を異なるストック試薬を用いて実施することで、アッセイの再現性を示している。 図１５Ａ〜図１５Ｅは、蛍光に基づいたインビボ体内分布およびｄｄＰＣＲに基づいたインビボ体内分布の直接比較で明らかにされた、相違を示している。図１５Ａは、フルオロフォアを有する（または有さない）ＱＵＡＮＴバーコードをＬＮＰに含ませて配合し、静脈内注射した、模式的なワークフローを示している。５種類の組織を単離し、ＦＡＣＳで単離した１３種類の細胞型へのバーコード送達を、ＱＵＡＮＴまたは蛍光によって測定した。 図１５Ｂは、肝臓および肝臓以外の細胞型における、ＱＵＡＮＴまたは蛍光によって測定された累積的な体内分布を示している。＊＊ｐ＜０．０１、両側ｔ検定。 図１５Ｃ〜図１５Ｅは、ＱＵＡＮＴ（図１５Ｄ）および蛍光（図１５Ｅ）によって調べられた、５種類の組織内の累積的な体内分布を示している。肝臓送達の蛍光読み取りが過剰に多くなっている。図１５Ｆは、ＱＵＡＮＴおよび蛍光によって調べられた、１３種類の細胞型における、体内分布の比較を示している。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、両側ｔ検定。 図１６Ａ〜図１６Ｄは、ＱＵＡＮＴの体内分布がインビボ薬物動態研究においてより高感度であることを示している。図１６Ａは、フルオロフォアを有する（または有さない）ＱＵＡＮＴバーコードをＬＮＰに含ませて配合し、静脈内注射し、異なる時点で単離した、模式的なワークフローを示している。ナノ粒子分布をＱＵＡＮＴまたは蛍光を用いて測定した。図１６Ｂ〜図１６Ｆは、０．５ｍｇ／ｋｇの用量で、６４７−ＱＵＡＮＴバーコードまたはＱＵＡＮＴバーコードを内包するＬＮＰを投与後の、経時的な（時間）、各種細胞型における、相対的なナノ粒子の体内分布（任意の細胞型の最大シグナルに対して正規化）を示している。アステリスクは、ＰＢＳ処置マウスと有意差があったシグナルを表しており；蛍光と異なり、ＱＵＡＮＴでは、全ての時点で、全ての細胞型に対して、統計的な送達が測定された。図１６Ｇは、ＱＵＡＮＴまたは蛍光によって測定された曲線下面積の比較を示している。蛍光では、肺への送達が、１／３倍よりも下回って、過剰に低い評価となった。図１６Ｈは、ＱＵＡＮＴおよび蛍光によって測定された、ピークＤＮＡ送達（肝ＥＣに対して正規化）を示している。肺マクロファージでは、蛍光シグナルは検出されなかった。＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、両側ｔ検定。 図１７は、ＱＵＡＮＴの読み取りが、インビボ実験全体で、再現性が高いことを示している。別々の日に実施された２つの実験にわたって、１時間の時点および１．２５時間の時点から得られた、ＱＵＡＮＴの絶対数の、Ｒ２解析。 図１８Ａ〜図１８Ｊは、ハイスループットＱＵＡＮＴ試験で明らかとなった、インビボでの、カベオリン１による細胞型特異的な送達への影響を示している。図１８Ａは、ＱＵＡＮＴ ｄｄＰＣＲ読み取りを、ＤＮＡシーケンスと組み合わせることで、１００種を超えるＬＮＰによる絶対送達を、インビボにおいて１回で測定できることを示している、模式的なワークフローである。 図１８Ｂは、１２８種の種々のＬＮＰを含んだスクリーニング１から得られた、ナノ粒子の配合比および直径を示している。図１８Ｃは、全てのＬＮＰおよびバーコード単独（陰性対照）について、全ての細胞型における正規化された送達の平均値を示している。図１８Ｄは、スクリーニング１における、野生型マウスおよびＣａｖ１−／−マウスの内皮細胞に対するＬＮＰターゲティングのヒートマップを示している。ユークリッドクラスタリングを細胞型に対して実施して、デンドログラムを作成した。図１８Ｅは、スクリーニング１における、野生型マウスおよびＣａｖ１−／−マウスのマクロファージに対する相対的なナノ粒子送達のヒートマップを示している。ユークリッドクラスタリングを細胞型に対して実施して、デンドログラムを作成した。図１８Ｆは、Ｃａｖ１−／−マウスまたは野生型マウスから得られた内皮細胞における、２回のスクリーニング（２２０種超のＬＮＰ）にわたっての、正規化されたナノ粒子の体内分布を示している。＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．００１、片側ｔ検定。図１８Ｇは、Ｃａｖ１−／−マウスまたは野生型マウスから得られたクッパー細胞における、２回のスクリーニング（２２０種超のＬＮＰ）にわたっての、正規化されたナノ粒子の体内分布を示している。肺マクロファージおよび腎臓マクロファージが、カベオリンの減少による影響が少なかった。＊＊ｐ＜０．０１、片側ｔ検定。 図１８Ｈは、スクリーニング１における、野生型マウスの複数の組織から単離された内皮細胞における、ナノ粒子体内分布を示している。図１８Ｉは、スクリーニング１における、野生型マウスの複数の組織から単離されたマクロファージにおける、ナノ粒子体内分布を示している。図１８Ｊは、肝臓の３種の細胞型における、２回のスクリーニング（２２０種超のＬＮＰ）にわたっての、正規化されたナノ粒子体内分布の比較を示している。＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、一元配置分散分析。 図１９Ａ〜図１９Ｉは、高感度となるように合理的に設計されたＱＵＡＮＴバーコードを示している。図１９Ａは、ＱＵＡＮＴバーコードの設計（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）を示している。 図１９Ｂは、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）による非特異的増幅を回避するために試験されたプライマーの組み合わせを示している。様々なプライマー対を、バーコード鋳型なしで、マウスｇＤＮＡおよびヒトｇＤＮＡに添加した。 図１９Ｃおよび図１９Ｄは、二段階ＰＣＲが、イルミナ社シーケンス用に、イルミナ社製ｎｅｘｔｅｒａケミストリー領域、インデックス、およびイルミナ社製アダプターを付加し（図１９Ｃ）、クリアな産物を生成する（図１９Ｄ）ことを示している。 同上。 図１９Ｅは、６０℃のアニーリング温度、およびｄｄＰＣＲ標準プロトコル濃度よりも２倍多いプローブ濃度を用いて、ｄｄＰＣＲが最適化されたことを示している。 図１９Ｆは、プローブに基づいたシグナルの特異性を検証するために試験された、スクランブルされたプローブ部位を示している。 図１９Ｇは、蛍光標識ＱＵＡＮＴバーコードをＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００と共にｉＭＡＥＣにインビトロ投与した２４時間後の、フローサイトメトリーで解析された、Ａｌｅｘａ−６４７蛍光を示している。 図２０は、２００ｎｇ／ウェルおよび５０ｎｇ／ウェルにおいてのＡｌｅｘａ−４８８結合型バーコードおよびＡｌｅｘａ−６４７結合型バーコードの平均蛍光強度（ＭＦＩ）の比較を示している。＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．００１、両側ｔ検定。 図２１Ａは、スクリーニング２から得られた各ＬＮＰの正規化された平均送達率を示している。陰性対照であるバーコード単独は、予想通り、ＬＮＰに内包されたバーコードと比較して送達効率が低かった。図２１Ｂおよび図２１Ｃは、スクリーニング２から得られた、野生型マウスおよびＣａｖ１−／−マウスにおける相対的なナノ粒子送達率のヒートマップを示している。ユークリッドクラスタリングを細胞型に対して実施して、デンドログラムを作成した。 同上。 図２１Ｄ〜図２１Ｋは、野生型マウスおよびＣａｖ１−／−マウスの複数の臓器および細胞型から得られた、スクリーニング１（図２１Ｄ〜図２１Ｇ）およびスクリーニング２（図２１Ｈ〜図２１Ｋ）にわたっての、ナノ粒子分布を示している。 同上。 同上。 図２１Ｌおよび図２１Ｍは、内皮細胞（図２１Ｌ）、マクロファージ、およびクッパー細胞（図２１Ｍ）における、野生型マウスおよびＣａｖ１−／−マウスから得られた、スクリーニング２のナノ粒子体内分布を示している。＊＊ｐ＜０．０１、片側ｔ検定。 図２２Ａは、ｄｄＰＣＲデータとディープシーケンスデータを組み合わせて、同一実験で１００種を超えるＬＮＰの絶対送達を算出する方法を説明している、模式的なワークフローである。図２２Ｂおよび図２２Ｃは、スクリーニング１（図２２Ｂ）およびスクリーニング２（図２２Ｃ）から得られた、野生型マウスおよびＣａｖ１−／−マウスの肺内皮細胞における、各ＬＮＰのシーケンスデータおよびｄｄＰＣＲ結果の組み合わせを示している。図２２Ｄおよび図２２Ｅは、スクリーニング１（図２２Ｄ）およびスクリーニング２（図２２Ｅ）から得られた、野生型マウスおよびＣａｖ１−／−マウスの肺マクロファージにおける、各ＬＮＰのシーケンスデータおよびｄｄＰＣＲ結果の組み合わせを示している。 図２３Ａは、肺組織の代表的なＦＡＣＳゲーティングを示している。内皮細胞（ＣＤ３１＋ＣＤ４５−）およびマクロファージ（ＣＤ３１−ＣＤ４５＋ＣＤ１１ｂ＋）を単離した。 図２３Ｂは、肝組織の代表的なＦＡＣＳゲーティングを示している。内皮細胞（ＣＤ３１＋ＣＤ４５−）、クッパー細胞（ＣＤ３１−ＣＤ４５＋ＣＤ６８＋）、および肝細胞（ＣＤ３１−ＣＤ４５−ＣＤ６８−）を単離した。 同上。 図２４Ａは、リン酸ジエステル結合およびホスホロチオエート結合（ＰＳ）、並びに２’Ｏ−メチルリボヌクレオチド（Ｏｍｅ）を図示している。 図２４Ｂは、ＤＮＡ、Ｏｍｅと、リン酸ジエステル結合およびホスホロチオエート結合との組み合わせを含む、種々のバーコードアプローチを図示している。 図２４Ｃは、５Ｏｍｅおよび５ＰＳのバーコード、３Ｏｍｅおよび３ＰＳのバーコード、５ＰＳバーコード、３ＰＳバーコード、５Ｏｍｅバーコード、３Ｏｍｅバーコード、または修飾無しバーコードの安定性を示す棒グラフである。
詳細な説明
本開示の実施形態を詳細に記載することに先立ち、特に記載がない限り、本開示が、特定の材料、試薬、反応物質、製造法などに限定されず、すなわち変更が可能であることを理解されたい。また、本明細書で使用される用語が、特定の実施形態を説明することのみを目的としており、限定を意図するものではないことを理解されたい。また、本開示では、論理的に可能である場合は、工程を異なる順序で実行することが可能である。
値の範囲が記載されている場合、その範囲の上限および下限の間にある、文脈によって特に明示されない限り下限の１０分の１までの、間にある各値、並びに、その記載された範囲内の任意の他の記載されたまたは間にある値も、本開示に包含されることを理解されたい。これらのより小さな範囲の上限および下限は、そのより小さな範囲に独立して含まれてもよく、また、記載範囲の中の任意の具体的に除外される境界値に従って、本開示に包含される。記載範囲が境界の一方または両方を含む場合、含まれた境界の一方または両方を除外した範囲も、本開示に包含される。
特に記載がない限り、本明細書で使用される全ての専門用語および科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者により一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載される方法および材料と類似または等価のいかなる方法および材料も、本開示の実施または試験で使用できるが、好適な方法および材料を以下に記載する。
本明細書で引用された全ての刊行物および特許は、個々の刊行物または特許が参照により援用されることが明確且つ個別に示されたかのように参照によって本明細書に援用され、引用された刊行物に関連した方法および／または材料を開示および説明するために、参照によって本明細書に援用される。いかなる出版物の引用も、その開示は出願日前のものであるが、本開示が事前開示により係る刊行物に先行する権利がないことの承認として解釈されるべきではない。さらに、記載された刊行物の日付は実際の刊行日付と異なっている可能性があり、個別の確認を要する場合がある。
本開示を読むことで当業者には明らかであるように、本明細書で説明および例示される個々の実施形態のそれぞれは、本開示の要旨を逸脱しない範囲において、他のいくつかの実施形態のいずれかの特徴から分離され得る、またはそれと組み合わされ得る、別個の成分および特徴を有する。記載されたいずれの方法も、記載された事象の順序で、または論理的に可能なあらゆる他の順序で、実行が可能である。
以下の例は、本願で開示および特許請求される方法の実施方法およびプローブの使用方法の完全な開示および説明を当業者に提供するために提示される。数値（例えば、量、温度など）に関して正確性を確保するための努力がなされているが、いくらかの誤差および偏差は考慮されるべきである。特に指示しない限り、部は重量部であり、温度は℃単位であり、圧力は大気圧かまたはそれに近い圧力である。標準的な温度および圧力は２０℃、１気圧と規定される。
なお、本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈によって特に明示されない限り、複数の指示対象を包含する。
Ｉ．定義
本明細書で使用される場合、「生物活性剤」とは、生物学的または化学的な事象を変化させる、それを抑制する、それを活性化する、またはそれに影響を与える、化合物または成分を指して用いられる。例えば、生物活性剤は、対象内の細胞に送達された際に、治療上または診断上の活性を有する、化学成分または生物由来物質であり得る。この化学成分または生物由来物質は、有機分子であっても無機分子であってもよい。いくつかの実施形態では、生物活性剤は修飾ポリヌクレオチドまたは無修飾ポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、生物活性剤はペプチドまたはペプチド模倣薬である。ある場合では、生物活性剤はタンパク質である。いくつかの実施形態では、生物活性剤はアンチセンス核酸、ＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、またはｓｈＲＮＡ）、受容体、リガンド、抗体、アプタマー、またはその断片、類似体、もしくはバリアントである。いくつかの実施形態では、生物活性剤は、治療用または診断用の遺伝子をコードする核酸を含むベクターである。生物活性剤としては、抗エイズ物質、抗がん物質、抗生剤、免疫抑制剤、抗ウイルス物質、プロテアーゼおよび逆転写酵素の阻害剤を含むがこれらに限定はされない酵素阻害剤、融合阻害剤、神経毒、オピオイド、催眠剤、抗ヒスタミン剤、滑沢剤、精神安定剤、抗痙攣剤、筋弛緩剤および抗パーキンソン物質、チャネル遮断剤、縮瞳剤および抗コリン薬を含む鎮痙剤および筋収縮剤（muscle contractant）、抗緑内障化合物、抗寄生虫性化合物および／または抗原生動物性化合物、細胞増殖阻害剤および抗接着分子を含む細胞−細胞外マトリックス相互作用の修飾薬、血管拡張剤、ＤＮＡ合成、ＲＮＡ合成またはタンパク質合成の阻害剤、降圧剤、鎮痛剤、解熱剤、ステロイド系抗炎症剤および非ステロイド系抗炎症剤、抗血管新生因子、抗分泌性因子、抗凝固剤および／または抗血栓剤、局所麻酔剤、眼科薬（ophthalmic）、プロスタグランジン、抗うつ薬、抗精神病物質、制吐薬、およびイメージング剤を挙げることができるが、これらに限定はされない。特定の実施形態では、生物活性剤は薬剤である。本発明での使用に好適な生物活性剤および特定薬剤のより完全な列挙は、“Pharmaceutical Substances: Syntheses, Patents, Applications”、Axel KleemannおよびJurgen Engel、Thieme Medical Publishing社、１９９９年；“Merck Index: An Encyclopedia of Chemicals, Drugs, and Biologicals”、Susan Budavariら（編）、CRC Press社、１９９６年、および米国薬局方２５版／国民医薬品集２０版、Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｐｈａｒｍｃｏｐｅｉａｌ Ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎ， Ｉｎｃ．社刊行、メリーランド州ロックヴィル、２００１年（これらのすべてが参照によって本明細書に援用される）で見つけることができる。
用語「生体分子」とは、本明細書で使用される場合、自然発生的か人工的に生成されたか（例えば、合成技術または組み換え技術によって）に関係なく、天然（例えば、生物、組織、細胞、またはウイルス）に通常存在する分子（例えば、タンパク質、アミノ酸、ペプチド、ポリヌクレオチド、ヌクレオチド、炭水化物、糖類、脂質、核タンパク質、糖タンパク質、リポ蛋白、ステロイド類など）を指す。特定クラスの生体分子として、酵素、受容体、神経伝達物質、ホルモン、サイトカイン、増殖因子および走化性因子などの細胞応答改変剤、抗体、ワクチン、ハプテン、毒素、インターフェロン、リボザイム、アンチセンス剤、プラスミド、ｓｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ＤＮＡ、およびＲＮＡが挙げられるが、これらに限定はされない。
本明細書で使用される場合、「生分解性」高分子は、生理条件下で分解する（すなわち、身体による排出または処理が可能な単量体種またはオリゴマーまで分解する）高分子である。いくつかの実施形態では、高分子および高分子生分解副生物は生体適合性である。生分解性高分子は、必ずしも加水分解可能である必要はなく、完全な分解に酵素作用を要してもよい。特定の実施形態では、生分解性高分子はエンドソームによって分解される。
本明細書で使用される場合、用語「機能的に発現された」とは、タンパク質が機能するように、コード配列が、転写され、翻訳され、翻訳後修飾され（適切な場合）、細胞内に配置されること、を指す。
用語「ポリヌクレオチド」、「核酸」、または「オリゴヌクレオチド」とは、ヌクレオチドの重合体を指す。用語「ポリヌクレオチド」、「核酸」、および「オリゴヌクレオチド」は、同義的に使用され得る。通常、ポリヌクレオチドは少なくとも２個のヌクレオチドを含む。ＤＮＡおよびＲＮＡはポリヌクレオチドである。この重合体は、天然ヌクレオシド（すなわち、アデノシン、チミジン、グアノシン、シチジン、ウリジン、デオキシアデノシン、デオキシチミジン、デオキシグアノシン、およびデオキシシチジン）、ヌクレオシド類似体（例えば、２−アミノアデノシン、２−チオチミジン、イノシン、ピロロ−ピリミジン、３−メチルアデノシン、Ｃ５−プロピニルシチジン、Ｃ５−プロピニルウリジン、Ｃ５−ブロモウリジン、Ｃ５−フルオロウリジン、Ｃ５−ヨードウリジン、Ｃ５−メチルシチジン、７−デアザアデノシン、７−デアザグアノシン、８−オキソアデノシン、８−オキソグアノシン、Ｏ（６）−メチルグアニン、および２−チオシチジン）、化学的に修飾された塩基、生物学的に修飾された塩基（例えば、メチル化塩基）、インターカレートされた塩基（intercalated base）、修飾された糖類（例えば、２′−フルオロリボース、２′−メトキシリボース、２′−アミノリボース、リボース、２′−デオキシリボース、アラビノース、およびヘキソース）、非天然塩基対（ＵＢＰ）、または修飾されたリン酸基（例えば、ホスホロチオエートおよび５′−Ｎホスホラミダイト結合）を含み得る。天然型または修飾型のヌクレオシドの鏡像異性体が用いられてもよい。核酸はまた、Wlotzka, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2002, 99(13):8898（その内容全体が参照によって本明細書に援用される）に記載される、核酸ベースの治療薬、例えば、核酸リガンド、ｓｉＲＮＡ、低分子ヘアピン型ＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、アプタマー、およびＳＰＩＥＧＥＬＭＥＲＳ（商標）、オリゴヌクレオチドリガンドも含む。核酸はまた、核酸アナログ（例えば、ＢｒｄＵ）、およびリン酸ジエステル以外のヌクレオシド間結合（例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）またはチオジエステル結合）を含むこともできる。特に、核酸としては、限定はされないが、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ｇＤＮＡ、ｓｓＤＮＡ、ｄｓＤＮＡ、またはこれらのあらゆる組み合わせを挙げることができる。
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」は、ペプチド結合で連結された少なくとも３個のアミノ酸の鎖を指して、同義的に使用され得る。ペプチドは、個々のペプチドを指す場合もあれば、ペプチドの集合を指す場合もある。ペプチドは、天然アミノ酸、非天然アミノ酸（すなわち、天然には生じないが、ポリペプチド鎖に組み込むことができる化合物）、および／またはアミノ酸類似体を含有し得る。また、ペプチド内の１または複数のアミノ酸が修飾されていてもよく、例えば、炭水化物基、リン酸基、ファルネシル基、イソファルネシル基、脂肪酸基、複合化、機能化、または他の修飾のためのリンカー、などの化学成分の付加によって修飾されていてもよい。修飾には、ペプチドの環化、Ｄ−アミノ酸の組み込みなども含まれ得る。
本明細書で使用される場合、「ペプチド模倣薬」とは、ペプチドの通常の化学的性質にいくらかの変化を含む、ペプチドの模倣薬を指す。ペプチド模倣薬は通常、安定性の増加、有効性の増加、送達の増強、半減期の延長など、元のペプチドのいくつかの特性を増強したものである。既知のポリペプチド配列に基づいてペプチド模倣薬を作製する方法は、例えば、米国特許第５，６３１，２８０号；同第５，６１２，８９５号；および同第５，５７９，２５０号に記載されている。ペプチド模倣薬の使用は、所与の位置における非アミド結合による非アミノ酸残基の組み込みを含み得る。本発明の１つの実施形態は、化合物の結合、ペプチド骨格、またはアミノ酸成分が好適な模倣体と置換された、ペプチド模倣薬である。好適なアミノ酸模倣体となり得る非天然アミノ酸のいくつかの非限定例として、β−アラニン、Ｌ−α−アミノ酪酸、Ｌ−γ−アミノ酪酸、Ｌ−α−アミノイソ酪酸、Ｌ−ε−アミノカプロン酸、７−アミノヘプタン酸、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン酸、Ｎ−ε−Ｂｏｃ−Ｎ−α−ＣＢＺ−Ｌ−リジン、Ｎ−ε−Ｂｏｃ−Ｎ−α−Ｆｍｏｃ−Ｌ−リジン、Ｌ−メチオニンスルホン、Ｌ−ノルロイシン、Ｌ−ノルバリン、Ｎ−α−Ｂｏｃ−Ｎ−δＣＢＺ−Ｌ−オルニチン、Ｎ−δ−Ｂｏｃ−Ｎ−α−ＣＢＺ−Ｌ−オルニチン、Ｂｏｃ−ｐ−ニトロ−Ｌ−フェニルアラニン、Ｂｏｃ−ヒドロキシプロリン、およびＢｏｃ−Ｌ−チオプロリンが挙げられる。
用語「多糖類」、「炭水化物」、または「オリゴ糖」とは、糖の重合体を指して同義的に使用され得る。通常、多糖類は少なくとも２個の糖を含む。この重合体は、天然糖類（例えば、グルコース、フルクトース、ガラクトース、マンノース、アラビノース、リボース、およびキシロース）および／または修飾糖類（例えば、２′−フルオロリボース、２′−デオキシリボース、およびヘキソース）を含み得る。
本明細書で使用される場合、用語「小分子」とは、自然発生的か人工的に生成されたか（例えば、化学合成により）に関係なく、比較的低い分子量を有する分子を指して用いられる。通常、小分子は有機化合物である（すなわち、小分子は炭素を含有する）。そのような小分子は、炭素−炭素結合、立体中心、および他の官能基（例えば、アミン、ヒドロキシル、カルボニル、複素環など）を複数含有してもよい。いくつかの実施形態では、小分子は単量体であり、およそ１５００ｇ／ｍｏｌ未満の分子量を有する。特定の実施形態では、小分子の分子量は、およそ１０００ｇ／ｍｏｌ未満またはおよそ５００ｇ／ｍｏｌ未満である。好ましい小分子は、動物、好ましくは哺乳類、より好ましくはヒトにおいて生物学的効果を生じるという点で、生物学的に活性なものである。小分子は、放射性核種およびイメージング剤を包含するが、これらに限定はされない。特定の実施形態では、小分子は薬剤である。必須ではないが、薬剤は、適切な政府当局または規制機関によりヒトまたは動物での使用が安全且つ効果的であると見なされているものであることが好ましい。例えば、ヒトでの使用が承認された薬剤は、ＦＤＡにより、２１ Ｃ．Ｆ．Ｒ． ｐａｒｔ３３０．５、３３１〜３６１、および４４０〜４６０（参照によって本明細書に援用される）に列挙されており；動物用の薬剤は、ＦＤＡにより、２１ Ｃ．Ｆ．Ｒ． ｐａｒｔ ５００〜５８９（参照によって本明細書に援用される）に列挙されている。列挙された全ての薬剤は、本発明における使用が許容されると見なされる。
用語「対象」とは、投与または治療の標的となるあらゆる個体を指す。対象は、脊椎動物、例えば哺乳動物、特にヒト、であり得る。すなわち、対象はヒト患者または患畜であり得る。用語「患者」とは、臨床医（例えば、医師）による治療を受けている対象を指す。
用語「治療有効（therapeutically effective）」とは、使用された組成物の量が、疾患または障害の１または複数の原因または症状を改善するのに十分な量であることを指す。そのような改善は低減または変化のみを必要とし、必ずしも除去を必要としない。
ＩＩ．粒子送達用担体を特性評価するための方法
所望の指向性を有し、特定の細胞の細胞質に機能的な積荷を送達する製剤を特定するための、担体型送達製剤（vehicle delivery formulation）を特性評価するための方法および組成物が提供される。本開示の方法および組成物は、細胞に送達された場合に検出可能な機能性を有するレポーターを利用する。細胞においてレポーターの機能が検出されることは、送達用担体の製剤が機能的積荷を細胞に送達することを示している。化学組成識別子が、各々異なる送達用担体製剤に含まれることで、各々異なる送達用担体製剤に特有の化学組成が追跡される。１つの実施形態では、前記化学組成識別子は核酸バーコードである。核酸バーコードの配列と、それを内包する送達用担体の配合に使用された化学成分とを対にすることで、核酸バーコードを配列決定した際に、バーコードを送達した送達用担体の化学組成が特定される。代表的なレポーターとして、ｓｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ヌクレアーゼタンパク質、ヌクレアーゼｍＲＮＡ、小分子、エピジェネティックモディファイヤー、および表現型モディファイヤーが挙げられるが、これらに限定はされない。
図１２Ａ〜図１２Ｅは、本発明の方法および組成物が、機能的積荷を細胞に送達する送達用担体組成物を特定する方法を図示している。図１２Ａにおいて、レポーターは、送達用担体によって細胞に送達された場合、その細胞において蛍光の増加を引き起こしている。レポーターは、発現され適切な波長の光に暴露された場合に蛍光を発することができる蛍光タンパク質をコードする核酸であり得る。図１２Ｂにおいて、レポーターは、細胞で発現または活性化された場合、蛍光の減少を引き起こしている。図１２Ｃにおいて、レポーターは、細胞に形態変化を引き起こしている。図１２Ｄにおいて、レポーターは、生体分子、例えば検出可能な標識（例えば蛍光ラベル）に結合する抗体、の発現を引き起こしている。図１２Ｅは、レポーターが細胞のゲノム内への化学組成識別子の挿入を引き起こすことを示している。図１３は、レポーターが核酸、例えばその発現を抑制する変異を有する核酸、の補正を引き起こすことを示している。この場合のレポーターは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓなどのヌクレアーゼまたはリコンビナーゼであり得る。
Ａ．インビボ法
１つの実施形態において、薬剤をインビボ送達するための送達用担体製剤を特性評価するためのインビボ法であって、異なる化学組成を有する複数の送達用担体を配合する工程を含み、それぞれの送達用担体はヒト以外の哺乳動物の細胞の細胞質に送達された場合に検出可能なシグナルを生成できるレポーターと、媒体の化学組成を特定する組成識別子と、を含有する、前記方法が提供される。前記方法は、ヒト以外の哺乳動物に対し、前記複数の送達用担体をプールおよび投与する工程も含む。前記方法はまた、前記検出可能なシグナルを生成しない細胞から前記検出可能なシグナルを生成する細胞を、前記ヒト以外の哺乳動物の複数の組織からソーティングする工程であって、前記検出可能なシグナルを生成する細胞の組織型または細胞型を示す細胞表面タンパク質の有無に基づいたソーティングも行われる、前記工程を含む。前記細胞のソーティング後に、前記方法は、前記検出可能なシグナルを生成するソーティング後細胞中の化学組成識別子を同定することにより、前記ソーティング後細胞中の送達用担体の化学組成を決定し、前記送達用担体の化学組成と前記送達用担体を含有する組織型または細胞型とを関連付ける工程も含む。いくつかの実施形態では、前記送達用担体は粒子型送達用担体であり、他の実施形態では、前記送達用担体はコンジュゲートである。いくつかの実施形態では、前記方法は高処理スクリーニング系アッセイである。
複数の送達用担体製剤のプールは、通例は非経口的に、例えば静脈内注射または筋肉内注射によって、投与される。あるいは、前記組成物は、他の経路、例えば、動脈内経路、吸入経路、皮内経路、皮下経路、経口経路、経鼻経路、気管支経路、経眼経路、経皮経路（局所経路）、経粘膜経路、経腹膜経路、直腸の、および経腟経路で投与できる。いくつかの実施形態では、前記材料は、特定の組織部位に到達するように最適化されるだけでなく、特定の送達用経路用にも最適化される。
投与から所定の期間の後、組織または細胞が回収され、ソーティング用に処理される。場合によっては、レポーターまたは標識が陽性の標的細胞が単離される。材料が構成的なレポーター導入遺伝子の阻害剤を含有する場合などの、他の場合では、レポーターまたは標識が陰性の標的細胞が単離される。次に、そのような細胞内に存在する材料が同定のために単離され得る。いくつかの実施形態では、材料を処理し、結合したバーコードを放出させ、それを用いて、組織内に存在する材料が特定される。１細胞当たりに存在する総材料量も定量化され得る。あるいはまたはさらに、非標的の細胞または臓器からサンプルを採取し、同じ方法で材料を特定することができる。このように、非特異的な組織ターゲティングなどの望ましくない生物物理化学的性質を有する材料を特定し、それ以降の濃縮から排除することができる。
いくつかの実施形態では、標的細胞をアッセイにかけて、細胞内に存在する核酸バーコードを特定することにより、対応する材料が特定される。いくつかの場合で、これは、例えばＰＣＲ増幅の後、次世代シーケンス（ＮＧＳまたはディープシーケンス）を用いる、バーコードのシーケンスを含む。
レポーター陽性細胞の単離に用いたプロトコルは、使用されたレポーター系、および細胞源（例えばインビボ組織／血液およびインビトロ細胞培養物）によって異なる。組織および細胞は生きた動物または死後の動物を用いて単離され得る。組織および臓器の全体または部分が動物から摘出され得る。生検を細胞の供給源としてもよい。細胞は、心穿刺または眼窩後採血を含む様々な経路から得られた血液から単離され得る。単離は、酵素的手法（例えば、トリプシン、各種コラゲナーゼ、およびその組み合わせ）および／または機械的手法（例えば、遠心分離、乳鉢と乳棒、細切、および粉砕）により、行うことができる。得られた細胞懸濁液は、供給源に応じて、不均一細胞型または均一細胞型になり得る。次に、これらの懸濁液は、多数の基準（例えば、細胞型、細胞マーカー、細胞周期、レポーターの状態）に基づいて、同時または順次に分離され得る。これは、蛍光補助細胞選別、磁力補助細胞選別、遠心分離、および親和性に基づいた細胞単離（例えば、抗体−ＤＮＡコンジュゲート、抗体−ビオチン）によって実行され得る。細胞はシングルセルまたは集団に単離できる。その後、バーコードがその細胞から単離される。これは、ロマトグラフィーまたは溶液ベースの方法（solution-based method）により実施できる。バーコードをサイズの違いまたは他の特徴によりゲノムＤＮＡから最初に分離してもよいし、ゲノムＤＮＡを分解することもできるし；あるいは、ゲノムＤＮＡはそのままにしてもよい。抽出されたバーコードは、濃縮されたままにすることもできるし、さらなる解析用に希釈することもできる。このバーコード抽出物は、そのままシーケンスにかけることもできるし、より多くのコピーを作製するためにＰＣＲで増幅することもできる。バーコードは、サンガーシーケンス、次世代シーケンス（例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ、Ｒｏｃｈｅ ４５４、Ｉｏｎ ｔｏｒｒｅｎｔ）、またはナノポアに基づいたシーケンス法によって、シーケンスできる。
所望の組織の機能的なターゲティングを示す一方、所望により非標的臓器による低レベルの取り込みを示す製剤が濃縮され得る。このスクリーニングを数回繰り返すことで、例えば、アッセイの解像度が向上され得る。さらに、濃縮のための対応する材料を選択するため、特定の標識からの高レベルまたは低レベルのシグナルを要求することにより、スクリーニングの強さが変更され得る。
いくつかの実施形態では、前記方法は、機能的なターゲティングを行うことが示されたものに基づいて、送達用担体の新たなライブラリーを作製または製造することをさらに含む。本開示の方法をこのように用いることで、材料の生物物理学的特徴を最適化することができる。最適化のためのパラメーターとしては、サイズ、ポリマー組成、表面の親水性、表面の電荷、並びに材料表面上のターゲティング剤の有無、組成および密度を挙げることができるが、そのいずれにも限定はされない。この新たなライブラリーを上記のようにアッセイし、それを用いて、どの最適化が効果的であったかを決定することができる。
１つの実施形態では、前記送達用担体は、マイクロ流体デバイスを用いて配合されたナノ粒子である。化学組成１を有するナノ粒子１は、レポーターｍＲＮＡおよびバーコード１を内包するように配合される。化学組成２を有するナノ粒子２は、レポーターｍＲＮＡおよびバーコード２を内包するように配合される。化学組成Ｎを有するナノ粒子ＮがレポーターｍＲＮＡおよびバーコードＮを内包するように配合されるように、このプロセスがＮ回繰り返される。ナノ粒子１を構成する化学成分は１つのガラス製シリンジに添加される。バーコード１およびレポーターｍＲＮＡは別々のシリンジに添加される。ナノ粒子シリンジは２００μＬ／分の流速で、バーコードおよびレポーターｍＲＮＡのシリンジは６００μＬ／分の流速で、各シリンジの内容物が混合される。次に、ナノ粒子が、無菌１×ＰＢＳで０．００００１〜０．０１ｍｇ／ｍＬの濃度に希釈されることにより特性評価される。この時点で、ＤＬＳを用いて、ナノ粒子の流体力学的径およびその自己相関曲線が解析される。次に、ナノ粒子は、再生セルロース膜に対し透析された後、高分子量（１００ｋＤａ超）セルロース膜に対し透析される。次に、ナノ粒子は、０．２２μｍフィルターを通して濾過滅菌され、無菌プラスチックチューブに添加される。
次に、ナノ粒子はマウスに投与され、２時間後〜１６８時間後の時点で、マウスは屠殺される。
１つの実施形態では、前記レポーターｍＲＮＡはＧＦＰをコードしており；この場合、ＧＦＰ＋細胞が単離され、時点は２〜４８時間の範囲となる。
別の実施形態では、前記レポーターｍＲＮＡはｔｄＴｏｍａｔｏをコードしている。この場合、ｔｄＴｏｍａｔｏ＋細胞が単離され、時点は２〜１２０時間の範囲となる。別の実施形態では、前記レポーターはＲＦＰである。ＲＦＰ＋細胞が単離され、時点は２〜４８時間の範囲となる。
別の実施形態では、前記レポーターはＢＦＰである。この場合、ＢＦＰ＋細胞が単離され、時点は２〜４８時間の範囲となる。
別の実施形態では、前記レポーターは、細胞表面上に発現される遺伝子である、ＩＣＡＭ−２である。この場合、ＩＣＡＭ−２＋細胞がＩＣＡＭ−２抗体（バイオレジェンド社（BioLegend）クローン３Ｃ４）を用いて単離され、時点は２〜４８時間の範囲となる。
別の実施形態では、前記レポーターは、細胞表面上に発現され得る遺伝子である、ＭＨＣ１である。この場合、ＭＨＣ１＋細胞がＭＨＣ１抗体（クローンＥＲＭＰ４２）を用いてＭＨＣ２＋マウス系統（すなわち、００２０８７）から単離され、時点は２〜４８時間の範囲となる。
別の実施形態では、前記レポーターは、細胞表面上に発現され得る遺伝子である、ＭＨＣ２である。 この場合、ＭＨＣ２＋細胞がＭＨＣ２抗体（クローンＩＢＬ−５／２２）を用いてＭＨＣ１＋マウス系統（すなわち、００３５８４）から単離され、時点は２〜４８時間の範囲となる。
別の実施形態では、前記レポーターは、細胞質中に発現されるタンパク質である、ホタルルシフェラーゼである。この場合、ルシフェラーゼ＋細胞がルシフェラーゼ抗体（クローンＣ１２またはポリクローナル抗体）を用いて単離され、時点は２〜４８時間の範囲となる。
別の実施形態では、前記レポーターは、細胞質中に発現されるタンパク質である、ウミシイタケルシフェラーゼである。この場合、ルシフェラーゼ＋細胞がルシフェラーゼ抗体（クローンＥＰＲ１７７９２またはポリクローナル抗体）を用いて単離され、時点は２〜４８時間の範囲となる。
さらに別の実施形態では、前記レポーターはＣｒｅである。この場合、前記ナノ粒子がＣｒｅレポーターマウス（例えば、Ｌｏｘ−Ｓｔｏｐ−Ｌｏｘ−ｔｄＴｏｍａｔｏ Ａｉ１４マウス系統）に注射され、ｔｄＴｏｍａｔｏ＋細胞が単離され、時点は２〜１２０時間の範囲となる。
１つの実施形態では、前記レポーターｓｉＲＮＡはｓｉＧＦＰである。この場合、前記ナノ粒子がＧＦＰ陽性マウス（例えばＪＡＸ００３２９１）に投与される。ＧＦＰｌｏｗ細胞が単離され、時点は２〜９６時間の範囲となる。
別の実施形態では、前記レポーターはｓｉＲＦＰであり；この場合、前記ナノ粒子がＲＦＰ陽性マウス（例えばＪＡＸ００５８８４）に投与される。ＲＦＰｌｏｗ細胞が単離され、時点は２〜９６時間の範囲となる。
別の実施形態では、前記レポーターは、細胞表面上に発現される遺伝子である、ｓｉＩＣＡＭ−２である。この場合、ＩＣＡＭ−２ｌｏｗ細胞がＩＣＡＭ−２抗体（バイオレジェンド社、クローン３Ｃ４）を用いて単離され、時点は２〜９６時間の範囲となる。
別の実施形態では、前記レポーターは、細胞表面上に発現される遺伝子である、ｓｉＣＤ４５である。この場合、ＣＤ４５ｌｏｗ細胞がＣＤ４５抗体（バイオレジェンド社、クローン１０２）を用いて単離され、時点は２〜９６時間の範囲となる。
別の実施形態では、前記レポーターは、細胞表面上に発現される遺伝子である、ｓｉＣＤ４７である。 この場合、ＣＤ４７ｌｏｗ細胞がＣＤ４７抗体（バイオレジェンド社、クローンｍｉａｐ３０１）を用いて単離され、時点は２〜９６時間の範囲となる。
別の実施形態では、前記レポーターは、細胞表面上に発現される遺伝子である、ｓｉＴｉｅ２である。この場合、Ｔｉｅ２ｌｏｗ細胞がＴｉｅ２抗体（バイオレジェンド社、クローンＴＥＫ４）を用いて単離され、時点は２〜９６時間の範囲となる。他の実施形態では、前記レポーターｓｉＲＮＡはマイクロＲＮＡである。
１つの実施形態では、前記レポーターｓｇＲＮＡはｓｇＧＦＰである。この場合、前記ナノ粒子がＣａｓ９−ＧＦＰ発現マウス（例えばＪＡＸ０２６１７９）に投与される。ＧＦＰｌｏｗ細胞が単離され、時点は２〜１２０時間の範囲となる。
別の実施形態では、前記レポーターは細胞表面上に発現される遺伝子であるｓｇＩＣＡＭ−２であり、Ｃａｓ９発現マウスに注射される。この場合、ＩＣＡＭ−２ｌｏｗ細胞がＩＣＡＭ−２抗体（バイオレジェンド社、クローン３Ｃ４）を用いて単離され、時点は２〜１２０時間の範囲となる。
別の実施形態では、前記レポーターは細胞表面上に発現される遺伝子であるｓｇＣＤ４５であり、Ｃａｓ９発現マウスに注射される。この場合、ｉＣＤ４５ｌｏｗ細胞がＣＤ４５抗体（バイオレジェンド社、クローン１０２）を用いて単離され、時点は２〜１２０時間の範囲となる。
別の実施形態では、前記レポーターは細胞表面上に発現される遺伝子であるｓｇＣＤ４７であり、Ｃａｓ９発現マウスに注射される。この場合、ＣＤ４７ｌｏｗ細胞がＣＤ４７抗体（バイオレジェンド社、クローンｍｉａｐ３０１）を用いて単離され、時点は２〜９６時間の範囲となる。
別の実施形態では、前記レポーターは細胞表面上に発現される遺伝子であるｓｇＴｉｅ２であり、Ｃａｓ９発現マウスに注射される。この場合、Ｔｉｅ２ｌｏｗ細胞がＴｉｅ２抗体（バイオレジェンド社、クローンＴＥＫ４）を用いて単離され、時点は２〜１２０時間の範囲となる。
別の実施形態では、前記レポーターはｓｇＬｏｘＰであり、Ｃａｓ９−Ｌｏｘ−Ｓｔｏｐ−Ｌｏｘ−ｔｄＴｏｍａｔｏ発現マウスに注射される。ｔｄＴｏｍａｔｏ＋細胞が単離され、時点は２〜１２０時間の範囲となる。
適切な時点で、マウスから得られた組織は消化され、機能的なレポーター分子が陽性の細胞が単離される。いくつかの実施形態では、動物を屠殺し、組織を摘出し、コラゲナーゼＩ型、コラゲナーゼＩＶ型、コラゲナーゼＸＩ型、およびヒアルロニダーゼを含むがこれらに限定はされない、組織を消化するための酵素を添加することにより、細胞は単離される。次に、組織が３７℃の温度で１５〜６０分間振盪され、４０μｍ、７０μｍ、または１００μｍのストレーナーを通して濾過されることで、個々の細胞型が単離される。いくつかの実施形態では、細胞は、蛍光標示式細胞分取器を用いて、細胞型または組織型によってソーティングされる。
次に、前記細胞が溶解され、内側のバーコードが単離される。いくつかの実施形態では、細胞は、ＤＮＡ抽出プロトコル、例えばＱｕｉｃｋＥｘｔｒａｃｔ（登録商標）キット、にかけられる。本実施形態では、細胞は、サンプルを示すインデックスを付加するＰＣＲを用いてＤＮＡシーケンス用に調製され、磁気ビーズを用いて精製され、４ｎＭ濃度に希釈されたＰｈｉＸ制御配列に付加され（イルミナ社製装置を使用する場合）、ＭｉｎｉＳｅｑ（登録商標）、ＭｉＳｅｑ（登録商標）、ＮｅｘｔＳｅｑ（登録商標）、または他の次世代シーケンス装置を用いてシーケンスされる。
他の実施形態では、細胞は、ＲＮＡ抽出プロトコル、例えばＯｌｉｇｏＴｅｘ（登録商標）キット、にかけられる。本実施形態では、逆転写酵素が細胞に添加されて、任意のＲＮＡがｃＤＮＡに変換される。この時点で、このｃＤＮＡは、サンプルを示すインデックスを付加するＰＣＲを用いてシーケンス用に調製され、磁気ビーズを用いて精製され、４ｎＭ濃度に希釈されたＰｈｉＸ（登録商標）制御配列に付加され（イルミナ社製装置を使用する場合）、ＭｉｎｉＳｅｑ（登録商標）、ＭｉＳｅｑ（登録商標）、ＮｅｘｔＳｅｑ（登録商標）、または他の次世代シーケンス装置を用いてシーケンスされる。
Ｂ．インビトロ法
別の実施形態では、前記送達用担体製剤を特性評価するインビトロ法が提供される。本実施形態では、遺伝子（例えば蛍光タンパク質をコードする遺伝子）発現を妨げるように改変された遺伝子を含有する細胞または細胞株が使用され得る。前記送達用担体内のレポーターは、リコンビナーゼもしくはヌクレアーゼ、または前記リコンビナーゼもしくはヌクレアーゼをコードする核酸であり得る。送達用担体がレポーターを細胞に送達した際、蛍光タンパク質が発現されるように、リコンビナーゼまたはヌクレアーゼが改変遺伝子を修復する。前記細胞は、いくつかの異なる組織から得られた不均一な細胞プールであり得る。送達用担体の投与後、蛍光を発する細胞を特定するために、また、組織型または細胞型について、細胞がソーティングされ得る。核酸バーコードを、様々な種類の細胞から単離し、シーケンスすることで、当該核酸バーコードを送達した送達用担体の化学組成を特定することができる。
ＩＩＩ．送達用担体
Ａ．代表的な送達用担体
別の実施形態では、送達用担体と、化学組成識別子（例えば核酸バーコード）と、細胞の細胞質に送達された際に生物学的に活性となるレポーターと、を含有する組成物が提供される。前記組成物は所望によりターゲティング剤を含有する。いくつかの実施形態では、前記送達用担体は脂質ナノ粒子である。他の実施形態では、前記送達用担体はコンジュゲートである。前記レポーターは、ｓｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ヌクレアーゼ、リコンビナーゼ、小分子、エピジェネティックモディファイヤー、またはこれらの組み合わせであり得る。
１つの実施形態では、前記送達用担体は、ペグ化Ｃ６〜Ｃ１８アルキルと、コレステロールと、ＤＯＰＥと、化学組成識別子と、レポーターとを含有する。さらに他の実施形態では、前記送達用担体はコンジュゲートである。
１．ナノ粒子送達用担体
以下の例示的な送達用担体が、開示される組成物および方法に使用でき、この送達用担体はレポーターおよび化学組成識別子を含有する。いくつかの実施形態では、前記送達用担体は、Turnbull IC, et al. Methods Mol Biol. 2017 1521:153-166（この教示について参照によって援用される）に記載されているような、リピドイドナノ粒子（lipidoid nanoparticle）である。いくつかの実施形態では、前記送達用担体は、Kaczmarek JC, et al. Angew Chem Int Ed Engl. 2016 55(44):13808-13812（この教示について参照によって援用される）に記載されているような、ポリマー／脂質ナノ粒子である。いくつかの実施形態では、前記送達用担体は、Chahal JS, et al. Proc Natl Acad Sci U S A. 2016 113(29):E4133-42（この教示について参照によって援用される）に記載されているような、デンドリマー／ＲＮＡナノ粒子である。いくつかの実施形態では、前記送達用担体は、Dong Y, et al. Nano Lett. 2016 16(2):842-8（この教示について参照によって援用される）に記載されているような、ポリ（グリコアミドアミン）ブラシ（poly(glycoamidoamine) brush）である。いくつかの実施形態では、前記送達用担体は、Eltoukhy AA, et al. Biomaterials. 2014 35(24):6454-61（この教示について参照によって援用される）に記載されているような、脂質様ナノ粒子である。いくつかの実施形態では、前記送達用担体は、Dahlman JE, et al. Nat Nanotechnol. 2014 9(8):648-655（この教示について参照によって援用される）に記載されているような、低分子量ポリアミンおよび脂質ナノ粒子である。いくつかの実施形態では、前記送達用担体は、Dong Y, et al. Proc Natl Acad Sci U S A. 2014 111(11):3955-60（この教示について参照によって援用される）に記載されているような、リポペプチドナノ粒子である。いくつかの実施形態では、前記送達用担体は、Zhang Y, et al. Adv Mater. 2013 25(33):4641-5（この教示について参照によって援用される）に記載されているような、脂質修飾アミノグリコシド誘導体である。いくつかの実施形態では、前記送達用担体は、Yan Y, et al. Proc Natl Acad Sci U S A. 2016 113(39):E5702-10（この教示について参照によって援用される）に記載されているような、機能的ポリエステルである。いくつかの実施形態では、前記送達用担体は、Zhou K, et al. Proc Natl Acad Sci U S A. 2016 113(3):520-5（この教示について参照によって援用される）に記載されているような、分解可能デンドリマーである。いくつかの実施形態では、前記送達用担体は、Hao J, et al. J Am Chem Soc. 2015 137(29):9206-9（この教示について参照によって援用される）に記載されているような、リポカチオン性ポリエステルである。いくつかの実施形態では、前記送達用担体は、Siegwart DJ, et al. Proc Natl Acad Sci U S A. 2011 108(32):12996-3001（この教示について参照によって援用される）に記載されているような、陽イオン性のコアおよび可変性の殻を有するナノ粒子である。いくつかの実施形態では、前記送達用担体は、Zhang X, et al. ACS Appl Mater Interfaces. 2017 9(30):25481-25487（この教示について参照によって援用される）に記載されているような、アミノ−エステルナノマテリアルである。いくつかの実施形態では、前記送達用担体は、Zuckerman JE, et al. Nucleic Acid Ther. 2015 25(2):53-64（この教示について参照によって援用される）に記載されているような、ポリカチオン性シクロデキストリンナノ粒子である。いくつかの実施形態では、前記送達用担体は、Davis ME. Adv Drug Deliv Rev. 2009 61(13):1189-92、またはGaur S, et al. Nanomedicine. 2012 8(5):721-30（これらの教示について参照によって援用される）に記載されているような、カンプトテシンのシクロデキストリン含有ポリマーコンジュゲートである。いくつかの実施形態では、前記送達用担体は、Sorkin MR, et al. Bioconjug Chem. 2017 28(4):907-912（この教示について参照によって援用される）に記載されているような、オリゴチオエーテルアミドである。いくつかの実施形態では、前記送達用担体は、Porel M, et al. Nat Chem. 2016 Jun;8(6):590-6（この教示について参照によって援用される）に記載されているような、大環状分子である。いくつかの実施形態では、前記送達用担体は、Alabi CA, et al. Proc Natl Acad Sci U S A. 2013 110(32):12881-6（この教示について参照によって援用される）に記載されているような、脂質ナノ粒子である。いくつかの実施形態では、前記送達用担体は、Zamboni CG, et al. J Control Release. 2017 263:18-28（この教示について参照によって援用される）に記載されているような、ポリ（β−アミノエステル）（ＰＢＡＥ）ナノ粒子である。いくつかの実施形態では、前記送達用担体は、Green JJ, et al. Acc Chem Res. 2008 41(6):749-59（この教示について参照によって援用される）に記載されているような、ポリ（β−アミノエステル）（ＰＢＡＥ）である。いくつかの実施形態では、前記送達用担体は、Semple SC, et al. Nat Biotechnol. 2010 28(2):172-6（この教示について参照によって援用される）に記載されているような、安定核酸脂質粒子（ＳＮＡＬＰ）である。いくつかの実施形態では、前記材料はアミノ糖である。１つの実施形態では、前記材料は、Tanowitz M, et al. Nucleic Acids Res. 2017 Oct 23; Nair JK, et al. Nucleic Acids Res. 2017 Sep 15;およびZimmermann TS, et al. Mol Ther. 2017 Jan 4;25(1):71-78（これらの教示について参照によって援用される）に記載されているような、ＧａｌＮＡｃである。
２．コンジュゲート送達用担体
いくつかの実施形態では、前記送達用担体はコンジュゲートシステムである。図７Ａ〜図７Ｇ、図８Ａ〜図８Ｂ、および図９Ａ〜図９Ｄは、コア材料、化学組成識別子、およびレポーターを含有するいくつかの代表的なコンジュゲート型送達用担体を模式的に示している。前記コア材料は、ペプチド、脂質、ｓｓＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、ｓｓＤＮＡ、ｄｓＤＮＡ、ポリマー、ポリマー／脂質の組み合わせ、ペプチド／脂質の組み合わせ、またはこれらの組み合わせであり得る。図９Ａ〜図９Ｄに示すように、前記コンジュゲート型送達用担体の各成分はいかなる順であってもよい。図８Ｂに示すように、前記コンジュゲート型送達用担体の各成分は、糖、脂質、ペプチド、または他の修飾因子で修飾されていてもよい。
１つの実施形態では、前記レポーターは前記コンジュゲート型送達用担体にイオン結合している（図１０）。前記レポーターは、前記コンジュゲート型送達システムに、水素結合、ワトソン・クリック塩基対形成、または疎水性相互作用で結合していてもよい。
例示的なレポーターとしては、ｓｉＲＮＡ、ヌクレアーゼタンパク質、ｍＲＮＡ、ヌクレアーゼｍＲＮＡ、小分子、およびエピジェネティックモディファイヤーが挙げられるが、これらに限定はされない（図１１）。１つの実施形態では、前記レポーターは細胞において検出可能な表現型変化を引き起こす。例えば、前記レポーターは、細胞に、形態、代謝活性の変化や、遺伝子発現の増加または減少などを引き起こし得る。
Ｂ．送達用担体の配合
１つの実施形態では、本開示の方法で用いられる送達用担体は、粒子型送達用担体である。例えば、前記送達用担体は、脂質ナノ粒子を含むがこれに限定はされないナノ粒子であり得る。１つの実施形態では、前記粒子型送達用担体は、レポーターおよび化学組成識別子を内包する。他の実施形態では、レポーター、化学組成識別子、または両方が、前記送達用担体に結合している。
１つの実施形態では、ナノ粒子の配合は、バイオマテリアルを、合成または市販の脂質と、１００％エタノールなどの有機溶剤を含むチューブの中で合わせ、それらを混合することにより、行われる。第二のチューブの中で、レポーターおよび化学組成識別子が、通例は緩衝液中で、合わされ、混合される。次に、これら２つのチューブの内容物が混合されて、ナノ粒子が生成される。チューブ１内のバイオマテリアルは、イオン化できる脂質、ポリマー、ペプチド、核酸、炭水化物などであり得る。Chen D, et al. (2012) Rapid discovery of potent siRNA-containing lipid nanoparticles enabled by controlled microfluidic formulation. J Am Chem Soc 134:6948−6951（その全体が参照によって援用される）で開示されたマイクロ流体デバイスを用いることで、種々様々な配合物を迅速に生成できる。
別の実施形態では、核酸（ｍＲＮＡ、ＤＮＡバーコード、ｓｉＲＮＡ、およびｓｇＲＮＡ）は緩衝液、例えば１０ｍＭ クエン酸緩衝液で希釈し、一方、脂質−アミン化合物、アルキル末端を有するＰＥＧ、コレステロール、およびヘルパー脂質はエタノールで希釈した。ナノ粒子のスクリーニングにおいては、レポーターおよび化学組成識別子（例えばＤＮＡバーコード）を１０：１の質量比で混合する。なお、この質量比はラン毎に最適化することができる。クエン酸相およびエタノール相を、それぞれ６００μＬ／分および２００μＬ／分の流速で、シリンジ（ハミルトン社）によって、マイクロ流体デバイス内で合わせた。ＰＥＧ、コレステロール、およびヘルパー脂質は全て、アバンティ・リピド社（Avanti Lipids）から購入した。
送達用担体の配合に用いられた材料の生物物理的特徴および化学的特徴。最適化のためのパラメーターとしては、サイズ、ポリマー組成、表面の親水性、表面の電荷、並びに材料表面上のターゲティング剤の有無、組成および密度を挙げることができるが、そのいずれにも限定はされない。コンビナトリアル技術を用いることで、これらまたは他のパラメーターを変化させた送達用担体のライブラリーを生成できる。また、コンビナトリアル技術を用いることで、それぞれの材料または材料集団にユニークな標識を与えることもできる。粒子中の脂質−アミン化合物、ＰＥＧのモル量、ＰＥＧの構造、およびコレステロールのモル量を変化させることにより、送達用担体の多数の異なる配合を達成できる。
１．代表的なポリマー
送達用担体は種々の材料から配合できる。いくつかの実施形態では、送達用担体はヘルパー脂質を含有する。ヘルパー脂質は送達用担体の安定性および送達効率に寄与する。ヘキサゴナルＩＩ相（hexagonal II phase）を形成する傾向がある円錐形のヘルパー脂質が使用され得る。一例として、積荷のエンドソーム放出を促進し得るジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）が挙げられる。円柱形の脂質であるホスファチジルコリンを用いることで、より大きな二重層安定性を生むことができ、これがＬＮＰのインビボ適用では重要となる。インビボにおける細胞内送達およびＬＮＰ安定性を向上させるヘルパーとして、コレステロールを含むことができる。ＰＥＧ化脂質の包含を利用することで、インビトロでのＬＮＰコロイド安定性およびインビボでの循環時間を増強できる。いくつかの実施形態では、前記ペグ化は、ＰＥＧ部分が血行中に徐々に放出されるという点で、可逆的である。脂肪酸およびヘミコハク酸コレステリル（ＣＨＥＭＳ）などの、ｐＨ感受性の陰イオン性ヘルパー脂質が、エンドソーム放出を促進し得る、低ｐＨ誘導性の、ＬＮＰ表面電荷の変化および不安定化を引き起こし得る。
本開示の送達用担体の生成に用いることができる代表的な材料として、以下が挙げられるが、これらに限定はされない：ポリ（エチレングリコール）、コレステロール、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、１−（１Ｚ−ヘキサデセニル）−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、１−Ｏ−１’−（Ｚ）−オクタデセニル−２−ヒドロキシ−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、１−（１Ｚ−オクタデセニル）−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、１−（１Ｚ−オクタデセニル）−２−アラキドノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、１−Ｏ−１’−（Ｚ）−オクタデセニル−２−ヒドロキシ−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、１−（１Ｚ−オクタデセニル）−２−ドコサヘキサエノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、１−（１Ｚ−オクタデセニル）−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、１−（１Ｚ−オクタデセニル）−２−アラキドノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、１−（１Ｚ−オクタデセニル）−２−ドコサヘキサエノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、１−パルミトイル−２−（５’−オキソ−バレロイル）−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、１−パルミトイル−２−（９’−オキソ−ノナノイル）−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、１−パルミトイル−２−グルタリル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、１−ヘキサデシル−２−アゼラオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、１−パルミトイル−２−アゼラオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、１−（１０−ピレンデカノイル）−２−グルタロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、１−（１０−ピレンデカノイル）−２−（５，５−ジメトキシバレロイル）−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、１−パルミトイル−２−グルタロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［４−（ジピロメテンボロンジフルオリド）ブタノイル］（アンモニウム塩）、１−パルミトイル−２−（５，５−ジメトキシバレロイル）−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［４−（ジピロメテンボロンジフルオリド）ブタノイル］（アンモニウム塩）、２−（（２，３−ビス（オレオイルオキシ）プロピル）ジメチルアンモニオ）エチルリン酸水素、２−（（２，３−ビス（オレオイルオキシ）プロピル）ジメチルアンモニオ）エチルリン酸エチル、１−オレオイル−２−コレステリルヘミスクシノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、１，２−ジコレステリルヘミスクシノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、１−パルミトイル−２−コレステリルカルボノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、１−パルミトイル−２−コレステリルヘミスクシノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、１−Ｏ−ヘキサデカニル−２−Ｏ−（９Ｚ−オクタデセニル）−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、１−Ｏ−ヘキサデカニル−２−Ｏ−（９Ｚ−オクタデセニル）−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−（１’−ｒａｃ−グリセロール）（アンモニウム塩）、１−Ｏ−ヘキサデカニル−２−Ｏ−（９Ｚ−オクタデセニル）−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、１−Ｏ−ヘキサデシル−ｓｎ−グリセロール（ＨＧ）、１，２−ジ−Ｏ−フィタニル−ｓｎ−グリセロール、１，２−ジ−Ｏ−フィタニル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、１，２−ジ−Ｏ−テトラデシル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−（１’−ｒａｃ−グリセロール）、１，２−ジ−Ｏ−ヘキシル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、１，２−ジ−０−ドデシル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、１，２−ジ−Ｏ−トリデシル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、１，２−ジ−Ｏ−ヘキサデシル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、１，２−ジ−Ｏ−オクタデシル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、１，２−ジ−Ｏ−（９Ｚ−オクタデセニル）−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、１，２−ジ−Ｏ−フィタニル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、１−Ｏ−オクタデシル−２−Ｏ−メチル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、１’，３’−ビス［１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ］−ｓｎ−グリセロール、１’，３’−ビス［１，２−ジミリストレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ］−ｓｎ−グリセロール、１’，３’−ビス［１，２−ジパルミトレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ］−ｓｎ−グリセロール、１’，３’−ビス［１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ］−ｓｎ−グリセロール、１’，３’−ビス［１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ］−ｓｎ−グリセロール、１’，３’−ビス［１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ］−ｓｎ−グリセロール、１’，３’−ビス［１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ］−ｓｎ−グリセロール、１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−（１’−ミオイノシトール−４’−ホスフェート）、１−ステアロイル−２−アラキドノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−（１’−ミオイノシトール−４’−ホスフェート）、１，２−ジオクタノイル−ｓｎ−グリセロ−３−（ホスホイノシトール−３−ホスフェート）、１，２−ジオクタノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−（１’−ミオイノシトール−３’，４’，５’−トリホスフェート）、１，２−ジオクタノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−（１’−ミオイノシトール−４’，５’−ビスホスフェート）、１，２−ジオクタノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−（１’−ミオイノシトール−３’，４’−ビスホスフェート）、１，２−ジオクタノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−（１’−ミオイノシトール−４’−ホスフェート）、１，２−ジオクタノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−（１’−ミオイノシトール）、１，２−ジヘキサノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−（１’−ミオイノシトール−３’，４’，５’−トリホスフェート）、１，２−ジヘキサノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−（１’−ミオイノシトール−３’，５’−ビスホスフェート）、１−ステアロイル−２−アラキドノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−（１’−ミオイノシトール−３’，４’，５’−トリホスフェート）、１−ステアロイル−２−アラキドノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−（１’−ミオイノシトール−４’，５’−ビスホスフェート）、１−ステアロイル−２−アラキドノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−（１’−ミオイノシトール−３’，５’−ビスホスフェート）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−（１’−ミオイノシトール−３’，４’，５’−トリホスフェート）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−（１’−ミオイノシトール−４’，５’−ビスホスフェート）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−（１’−ミオイノシトール−３’，５’−ビスホスフェート）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−（１’−ミオイノシトール−３’，４’−ビスホスフェート）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−（１’−ミオイノシトール−５’−ホスフェート）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−（１’−ミオイノシトール−４’−ホスフェート）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−（１’−ミオイノシトール−３’−ホスフェート）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−（１’−ミオイノシトール）、１−ステアロイル−２−アラキドノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホイノシトール、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホイノシトール、１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホイノシトール、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−（１’−ミオイノシトール）、１−オレオイル−２−（６−（（４，４−ジフルオロ−１，３−ジメチル−５−（４−メトキシフェニル）−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−２−プロピオニル）アミノ）ヘキサノイル）−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホイノシトール−４．５−ビスホスフェート、１−オレオイル−２−ヒドロキシ−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−（１’−ミオイノシトール）、１−トリデカノイル−２−ヒドロキシ−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−（１’−ミオイノシトール）、１−パルミトイル−２−ヒドロキシ−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホイノシトール、１−（１０Ｚ−ヘプタデセノイル）−２−ヒドロキシ−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−（１’−ミオイノシトール）、１−ステアロイル−２−ヒドロキシ−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホイノシトール、１−アラキドノイル−２−ヒドロキシ−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホイノシトール、Ｄ−ミオイノシトール−１，３，４−トリホスフェート、Ｄ−ミオイノシトール−１，３，５−トリホスフェート、Ｄ−ミオイノシトール−１，４，５−トリホスフェート、Ｄ−ミオイノシトール−１，３，４，５−テトラホスフェート、１−（１０Ｚ−ヘプタデセノイル）−２−ヒドロキシ−ｓｎ−グリセロ−３−［ホスホ−Ｌ−セリン］、またはこれらのあらゆる組み合わせ。
２．生体適合性ポリマー
特定の実施形態では、送達用担体は、生体適合性ポリマーから作製されるか、それを含有する。生分解性且つ／または生体適合性の種々のポリマーが当業者に周知である。本開示の組成物および方法での使用に好適な例示的な合成ポリマーとしては、以下が挙げられるが、これらに限定はされない：ポリ（ラクチド）、ポリ（グリコリド）、ポリ乳酸−グリコール酸共重合体、ポリ（アリレート）、ポリ（無水物）、ポリ（ヒドロキシ酸）、ポリエステル、ポリ（オルトエステル）、ポリカーボネート、ポリ（プロピレンフメラート）、ポリ（カプロラクトン）、ポリアミド、ポリホスファゼン、ポリアミノ酸、ポリエーテル、ポリアセタール、ポリ乳酸、ポリヒドロキシアルカン酸、ポリグリコール酸、ポリケタール、ポリエステルアミド、ポリ（ジオキサノン）、ポリヒドロキシブチレート、ポリヒドロキシバリレート、ポリカーボネート、ポリオルトカーボネート、ポリ（ビニルピロリドン）、生分解性ポリシアノアクリレート、ポリアルキレンオキサレート、ポリアルキレンスクシネート、ポリ（リンゴ酸）、ポリ（メチルビニルエーテル）、ポリ（エチレンイミン）、ポリ（アクリル酸）、ポリ（無水マレイン酸）、生分解性ポリウレタンおよび多糖類。特定の実施形態では、前記材料はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を包含する。特定の実施形態では、前記材料の作製に用いられるポリマーは、ＰＥＧ化（すなわち、ポリエチレングリコール部分に結合）されている。
いくつかの実施形態では、送達用担体は、ＦＤＡによって一般に安全と認められる（Generally Recognized as Safe）（ＧＲＡＳ）と認定された材料から形成される。
３．天然ポリマー
多糖類およびタンパク質などの天然ポリマーも、本開示の送達用担体の生成に使用できる。例示的な多糖類としては、アルギン酸、デンプン、デキストラン、セルロース、キチン、キトサン、ヒアルロン酸およびその誘導体が挙げられ；例示的なタンパク質としては、コラーゲン、アルブミン、およびゼラチンが挙げられる。デンプン、デキストラン、およびセルロースなどの多糖類は、未修飾でもよいし、または、水和状態での特徴、溶解性、またはインビボ半減期などの特性のうちの１または複数に影響を与えるように、物理的または化学的な修飾を受けていてもよい。特定の実施形態では、前記材料はタンパク質を含まない。
他の実施形態では、前記ポリマーは、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、これらのコポリマーであるポリ乳酸−グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）、およびこれらのあらゆる混合物などのポリヒドロキシ酸を包含する。特定の実施形態では、前記材料はポリ乳酸−グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）を包含する。特定の実施形態では、前記材料はポリ乳酸を包含する。他の特定の実施形態では、前記材料はポリグリコール酸を包含する。これらのポリマーは、手術用縫合材料として、および制御放出デバイスに含ませる、ヒト臨床用に承認された合成ポリマーの１つである。これらは、加水分解により、代謝および排出が可能な生成物へと分解される。さらに、ＰＬＡおよびＰＧＡの共重合は、グリコール酸と乳酸のコポリマー比を単に変化させるだけで、数日から数年まで、分解速度の幅が広いという利点があり、ＰＧＡよりも疎水性が高く、結晶性が低く、よりゆっくりとした速度で分解する。
非生分解性ポリマーも材料の生成に使用できる。非生分解性であるが、生体適合性のポリマーの例としては、ポリスチレン、ポリエステル、非生分解性ポリウレタン、ポリ尿素、ポリ（ビニルアルコール）、ポリアミド、ポリ（テトラフルオロエチレン）、ポリ（エチレン酢酸ビニル）、ポリプロピレン、ポリアクリレート、非生分解性ポリシアノアクリレート、非生分解性ポリウレタン、ポリメタクリレート、ポリ（メタクリル酸メチル）、ポリエチレン、ポリピロール、ポリアニリン、ポリチオフェン、およびポリ（エチレンオキシド）が挙げられる。
４．官能化ポリマー
上記のポリマーはいずれも、ポリ（アルキレングリコール）、例えば、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）またはポリ（プロピレングリコール）（ＰＰＧ）、またはあらゆる他の親水性ポリマー系により官能化することができる。あるいはまたはさらに、上記のポリマーはいずれも、ポリ（アルキレングリコール）または他の材料が結合できるように、特定の末端官能基、例えば末端カルボキシル基を有するように修飾されたポリ乳酸、を有してもよい。例示的なＰＥＧ官能化ポリマーとしては、ＰＥＧ官能化ポリ乳酸、ＰＥＧ官能化ポリ乳酸−グリコール酸共重合体、ＰＥＧ官能化ポリ（カプロラクトン）、ＰＥＧ官能化ポリ（オルトエステル）、ＰＥＧ官能化ポリリジン、およびＰＥＧ官能化ポリ（エチレンイミン）が含まれるが、これらに限定はされない。経口送達用の製剤に用いられる場合、ポリ（アルキレングリコール）は、多くの薬理学的に有用な化合物の生物学的利用能を増加させることが知られているが、これは、部分的には、誘導体化された化合物の胃腸管における安定性を増加させることによるものである。粒子送達系を含む、非経口投与される薬理学的に有用な化合物において、ポリ（アルキレングリコール）は、部分的にはこれらの化合物のオプソニン化（opsinization）を減少させて、免疫原性による除去を減少させることによって、および、部分的には外来性物質を身体から除去する機能を有する免疫細胞によるこれらの化合物の非特異的な除去を減少させることによって、安定性を増加させることが知られている。ポリ（アルキレングリコール）は、数百ダルトンと短い場合もあれば、数千以上の分子量を有する場合もある鎖である。
上記修飾ポリマーおよび無修飾ポリマーのいずれのコポリマー、混合物、および付加物も使用できる。例えば、疎水性領域と陰イオン性あるいは親水性の領域とを有する両親媒性のブロックコポリマーを使用できる。異なる種類の非共有結合性相互作用または共有結合性相互作用で結合する領域を有するブロックコポリマーも使用できる。あるいはまたはさらに、特定の官能基を有するように、ポリマーを化学修飾することができる。例えば、ヒドロキシル基、アミン基、カルボキシ基、マレイミド基、チオール基、Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミド（ＮＨＳ）エステル基、またはアジド基で、ポリマーを官能化することができる。これらの基を用いることで、ポリマーを親水性にしたり、あるいは、以下に記載されるような表面を修飾するために使用される材料との特定の相互作用を達成することができる。
分子量および架橋結合の程度を調整することで、ポリマーの分解速度を調節できることは、当業者には理解される。分子量および架橋結合を調節することで放出速度を調整する方法は、当業者に周知である。
５．非ポリマー材料
送達媒体は非ポリマー材料、例えば金属および半導体、から作製することもできる。例えば、造影剤またはイメージング剤を特定の組織に与えることが望まれる場合、特定の薬剤をポリマー担体と組み合わせる必要がない場合がある。
送達用担体の界面化学特性は当業者に公知のあらゆる手法を用いて変化させることができる。表面の親水性および表面の電荷の両方を改変することができる。ポリマー材料の界面化学特性を改変するためのいくつかの方法を上記で論じている。シラン分子またはチオール分子を用いることで、特定の官能基をポリマー材料または非ポリマー材料の表面に繋ぎ止めることができる。例えば、親水性基（例えば、チオール基、ヒドロキシル基、またはアミン基）または疎水性基（例えば、ペルフルオロ基、アルキル基、シクロアルキル基、アリール基、シクロアリール基）を表面に繋ぎ止めることができる。酸性基または塩基性基を材料の表面に繋ぎ止めることで、表面の電荷を変化させることができる。例示的な酸性基としては、カルボン酸、窒素をベースとした酸、リンをベースとした酸、および硫黄をベースとした酸が挙げられる。例示的な塩基性基としては、アミンおよび他の窒素含有基が挙げられる。これらの基のｐＫａは、例えば、酸性基もしくは塩基性基に隣接させて電子供与基もしくは電子求引基を含めることにより、または、酸性基もしくは塩基性基を共役環または非共役環に含めることにより、酸性基または塩基性基の環境を調整することによって調節できる。あるいは、材料を、過酸化物、過マンガン酸、酸化性酸、プラズマエッチング、または他の酸化剤などを用いて酸化することで、表面におけるヒドロキシル基および他の酸素化基の密度を増加させることができる。あるいはまたはさらに、ホウ化水素、チオ硫酸塩、または他の還元剤を用いることで、表面の親水性を減少させることができる。
６．サイズ範囲
送達用担体は、細胞が当該粒子を取り込むことができる限り、いかなるサイズであってもよい。例えば、前記粒子は、約１ｎｍ〜約１０００μｍ、または約１ｎｍ〜約５０ｎｍ、または５０ｎｍ〜１００ｎｍ、または約１００ｎｍ〜約５００ｎｍ、または約５００ｎｍ〜約１０００ｎｍ、または約１μｍ〜約１０μｍの直径を有し得る。
いくつかの実施形態では、前記スクリーニング法は、機能的な生物活性剤を目的の細胞、組織、または臓器に送達するのに適した特徴について、微小粒子（１〜１０μｍの直径を有する）またはナノ粒子（１〜１０００ｎｍの直径を有する）をスクリーニングするために使用される。
前記アッセイのラン毎に特性評価される送達用担体の数は、前記アッセイに使用されるヒト以外の哺乳動物のサイズに応じて、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも１５０、少なくとも２００、少なくとも２５０、少なくとも３００、少なくとも３５０、少なくとも４００、少なくとも４５０、少なくとも５００、またはそれ以上であり得る。
７．ターゲティング剤
いくつかの実施形態では、送達用担体を目的の組織または細胞により正確に向かわせるために、ターゲティング剤が使用され得る。すなわち、本開示の送達用担体は、組織ターゲティング部分、細胞ターゲティング部分、受容体ターゲティング部分、またはこれらのあらゆる組み合わせを含有し得る。
目的の組織が、健常組織である必要性はなく、脈管構造における動脈硬化症領域または不安定なアテローム性（antheroma）プラーク領域などの、腫瘍または特定の形態の傷害組織もしくは罹患組織であり得ることは、当業者に理解される。ターゲティング剤は組織のあらゆる部分または成分を標的とし得る。例えば、ターゲティング剤は、腫瘍もしくは他の組織細胞上のエピトープもしくは抗原、インテグリンもしくは他の細胞接着因子、酵素受容体、細胞外マトリックス材、または特定組織のペプチド配列に対する親和性を示し得る。ターゲティング剤は、抗体および抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ′、またはＦ（ａｂ′）２フラグメント、または一本鎖抗体）、核酸リガンド（例えば、アプタマー）、オリゴヌクレオチド、オリゴペプチド、多糖類、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）、葉酸、トランスフェリン、アシアロ糖タンパク質（asialycoprotein）、炭水化物、多糖類、シアル酸、糖タンパク質、または脂質を包含し得るが、これらに限定はされない。ターゲティング剤は、細胞の表面に存在する細胞表面受容体、タンパク質または糖タンパク質に特異的に結合する、天然または合成の、あらゆる小分子、生物活性剤、または生体分子を包含し得る。いくつかの実施形態では、ターゲティング剤はオリゴヌクレオチド配列である。特定の実施形態では、ターゲティング剤はアプタマーである。いくつかの実施形態では、ターゲティング剤は、自然発生的な炭水化物分子、または炭水化物ライブラリーから選択される炭水化物分子である。標的ターゲティング剤として使用されるペプチドライブラリー、炭水化物ライブラリー、またはポリヌクレオチドライブラリーは、当業者に公知の技術を用いて合成され得る。また、様々な高分子ライブラリーが、インビトロジェン社およびケンブリッジ・ペプチド社（Cambridge Peptide）などの会社から購入され得る。
ターゲティング剤は、共有結合性相互作用によって材料に結合し得る。例えば、ポリマー性材料がカルボキシレート基で修飾された後、アミノ化ターゲティング剤、すなわち修飾によりアミノ化されたターゲティング剤が、ＥＤＣまたはＤＣＣなどのカップリング試薬により、当該ポリマーに結合し得る。あるいは、ポリマーが活性化ＮＨＳエステルを有するように修飾された後、ターゲティング剤上のアミン基と反応され得る。ターゲティング剤を材料に結合するために使用され得る他の反応性基としては、ヒドロキシル、アミン、カルボキシル、マレイミド、チオール、ＮＨＳエステル、アジド、およびアルキンが挙げられるが、これらに限定はされない。次いで、標準的なカップリング反応を用いて、修飾された材料を、相補基を有する第２の物質に結合させることができる（例えば、アミノ化ポリマーに結合したカルボキシル修飾ターゲティング剤）。無機材料から作製された材料は、表面に所望の官能基をつなぐための自己組織化単分子層形成材料を用いて、これらの基のいずれかを保有するように修飾することができる。
あるいは、ターゲティング剤は、非共有結合性相互作用を介し直接的または間接的に材料に結合し得る。非共有結合性相互作用としては、静電的相互作用、アフィニティー相互作用、金属配位、物理吸着、ホスト−ゲスト相互作用、および水素結合相互作用が挙げられるが、これらに限定はされない。
８．核酸バーコード
１つの実施形態において、核酸バーコードが提供される。図１９Ａは例示的な核酸バーコードを示している。核酸バーコードを合理的に設計することで、ＤＮＡポリメラーゼのアクセスを増加させることができ、また、完全ランダム化ヌクレオチド領域の分離によって、フォワードプライマー部位およびリバースプライマー部位上のＤＮＡ二次構造が最小化し、グアニン四重鎖形成が最小化する。
１つの実施形態において、下記式の核酸バーコードが提供され、
Ｒ１−Ｒ２−Ｒ３−Ｒ４−Ｒ５−Ｒ６−Ｒ７−Ｒ８−Ｒ１
式中、
Ｒ１は、ホスホロチオエート結合を有する１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のヌクレオチドを表し、
Ｒ２はフォワードユニバーサルプライマー結合部位を表し、
Ｒ３はスペーサーを表し、
Ｒ４はデジタルドロップレットＰＣＲプローブ結合部位を表し、
Ｒ５はランダムヌクレオチド配列を表し；
Ｒ６は核酸バーコード配列を表し；
Ｒ７はランダム核酸配列を表し；
Ｒ８はリバースユニバーサルプライマー結合部位を表している。
１つの実施形態では、前記核酸バーコードはホスホロチオエート結合を含まない。
別の実施形態では、Ｒ３は次の配列、ＮＨＮＷ、を有し、式中、ＮはＡ、Ｔ、Ｇ、またはＣであり；ＷはＡまたはＴであり；ＨはＡ、Ｔ、またはＣである。１つの実施形態では、Ｒ５は次の配列、ＮＷＮＨ、を有し、Ｒ７は次の配列、ＮＷＨ、を有し、式中、ＮはＡ、Ｔ、Ｇ、またはＣであり；ＷはＡまたはＴであり；ＨはＡ、Ｔ、またはＣである。
さらなる別の実施形態では、前記核酸プローブは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８に対し、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を有する。
本明細書で使用される場合、用語「核酸バーコード」とは、そのバーコードに特有の一連のヌクレオチド（「バーコード配列」）を含有し、所望により他のバーコードと共通の一連のヌクレオチドを含有する核酸配列を有するオリゴヌクレオチドを指す。共通のヌクレオチドは、例えば、バーコードを単離し配列決定するために利用することができる。すなわち、場合によって、バーコード配列は、上流および下流のプライマー部位、例えばユニバーサルプライマー部位など、で挟まれている。前記ポリヌクレオチドは、ＤＮＡヌクレオチド、ＲＮＡヌクレオチド、またはこれらの組み合わせを含み得る。それぞれの送達用担体製剤は、それ自体のユニークな核酸バーコードと対になっている。このユニークな核酸バーコードは送達用担体製剤の化学組成と対にされ、核酸バーコードを配列決定することにより、その特定の媒体型送達製剤を作製するために用いられた特定の化学組成を特定することができる。
バーコードは、５〜１００のヌクレオチド長、約５〜約９０のヌクレオチド長、約５〜約８０のヌクレオチド長、約５〜約７０のヌクレオチド長、約５〜約６０のヌクレオチド長、約５〜約５０のヌクレオチド長、約５〜約４５のヌクレオチド長、約５〜約４０のヌクレオチドを含み得る。核酸バーコードは、本開示の送達用担体に共有結合しても非共有結合してもよい。いくつかの実施形態では、核酸バーコードは、送達用担体に内包される。
別の実施形態では、本明細書に記載の核酸バーコードを含有する薬剤的に許容できる組成物が提供される。
本発明の多くの実施形態が説明された。しかし、本発明の趣旨の範囲内で、様々な変更を行うことができることを理解されたい。従って、他の実施形態も下記の特許請求の範囲に包含される。
実施例１：ナノ粒子媒介ｍＲＮＡ送達の多重インビボ解析
材料および方法
ナノ粒子配合
ナノ粒子を上述のマイクロ流体デバイスを用いて配合した。簡潔に説明すると、核酸（ｍＲＮＡ、ＤＮＡバーコード、ｓｉＲＮＡ、ｓｇＲＮＡ）は１０ｍＭクエン酸緩衝液（テクノバ社（Teknova））で希釈し、脂質−アミン化合物、アルキル末端を有するＰＥＧ、コレステロール、およびヘルパー脂質はエタノールで希釈した。ナノ粒子の選別については、Ｃｒｅ ｍＲＮＡおよびＤＮＡバーコードを１０：１の質量比で混合した。クエン酸相およびエタノール相を、それぞれ６００μＬ／分および２００μＬ／分の流速で、シリンジ（ハミルトン社）によって、マイクロ流体デバイス内で合わせた。ＰＥＧ、コレステロール、およびヘルパー脂質は全て、アバンティ・リピド社から購入した。
ＤＮＡのバーコード化
各ＬＮＰを、ＬＮＰのユニークな化学組成に対応する、ユニークなＤＮＡバーコード（図１）を内包するように配合した。例えば、ＬＮＰ１にはＤＮＡバーコード１が内包され、一方、化学的に異なるＬＮＰ２にはＤＮＡバーコード２が内包された。ＤＮＡバーコードを、以前の報告（Dahlman, Kauffman et al. 2017）の通りに、いくつかの特徴を考慮して合理的に設計した。５６ヌクレオチド長の一本鎖ＤＮＡ配列を、インテグレーテッド・ＤＮＡ・テクノロジーズ社（Integrated DNA Technologies）から購入した。この５６ヌクレオチドｓｓＤＮＡの５’末端および３’末端の２個のヌクレオチドに、ホスホロチオエート修飾を行うことで、エキソヌクレアーゼ分解を低減させ、ＤＮＡバーコードの安定性を向上させた。各配列が等しく増幅されるように、２つのユニバーサルフォワードプライマー領域およびユニバーサルリバースプライマー領域を全てのバーコード上に含ませた。ＰＣＲバイアスを監視するため、各バーコードを、７個のランダムヌクレオチドも含むように設計した。ユニークな８ｂｐ配列を用いて各バーコードを識別した。８ｂｐ配列は６５，５３６（４８）種類の異なるバーコードを生じ得る。イルミナ社製ＭｉｎｉＳｅｑ（商標）シーケンス装置での配列のブリーチング（bleaching）を防ぐように、２５０種類の異なる８ｂｐ配列を設計した。具体的には、８ヌクレオチド領域内で、全てのバーコード配列が８つの位置のうち３つ（以上）において他の全てのバーコードと異なるように、各バーコードを設計した。
ナノ粒子の特性評価
ＬＮＰの流体力学的径を、ハイスループット動的光散乱法（ＤＬＳ）（DynaPro plate reader II、ワイアット社（Wyatt））を用いて測定した。ＬＮＰは、無菌１×ＰＢＳで約０．０６μｇ／ｍＬの濃度に希釈して解析した。不安定なＬＮＰの使用を避けるため、また、０．２２μｍフィルターを用いた無菌精製を可能にするため、以下の３つの基準を満たすＬＮＰのみを含ませた：直径が２０ｎｍ超であること、直径が２００ｎｍ未満であること、且つ、相関関数が１つの変曲点を持つこと。実験を通して、配合されたＬＮＰの約６５％が３つ全ての基準を満たした。これらの基準を満たした粒子を、１×リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、インビトロジェン社）を用いた透析にかけ、０．２２μｍフィルターで濾過滅菌した。
細胞培養
１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ（ＶＷＲ社）および１％（ｖ／ｖ）ペニシリン−ストレプトマイシン（サーモフィッシャー・サイエンティフィック社）を添加したＤＭＥＭ／Ｆ−１２ ５０／５０培地（コーニング社）中で培養された、ＣＭＶ−ｌｏｘ−ＧＦＰ−ｓｔｏｐ−ｌｏｘ−ＲＦＰコンストラクトで安定トランスフェクションされたＨＥＫ２９３細胞（ジェンターゲット社（GenTarget））を用いて、インビトロ実験を実施した。細胞を６ウェルプレートに３×１０５細胞／ウェルの密度で播種した。２４時間後、総ｍＲＮＡ用量が１００ｎｇとなるようにＬＮＰを添加した。トランスフェクションの６時間後、培地を新しいものに交換した。５０μＬのＱｕｉｃｋＥｘｔｒａｃｔ（エピセンター社（EpiCentre））を用いて、ＤＮＡを単離した。
エンドサイトーシス阻害
図１に示される実験のため、細胞を、プールされたＬＮＰとのインキュベーションの１時間前に、クラスリン媒介エンドサイトーシスに対するエンドサイトーシス阻害剤（クロルプロマジン、１００μＭ、アルファ・エイサー社（Alfa Aesar））、カベオラ媒介エンドサイトーシスに対するエンドサイトーシス阻害剤（ゲニステイン、１００μＭ、ＴＣＩアメリカ社（TCI America））、およびマクロピノサイトーシスに対するエンドサイトーシス阻害剤（５−（Ｎ−エチル−Ｎ−イソプロピル）アミロライド、ＥＩＰＡ、５０μＭ、トロント・リサーチ・ケミカルズ社（Toronto Research Chemicals））と共にインキュベートした。
動物実験
全ての動物実験は、ジョージア工科大学の生理学研究所（Physiological Research Laboratory）（ＰＲＬ）の、動物のケアおよびサービスに関する規則（animal care and services policy）に従って実施した。ＬＳＬ−Ｔｏｍａｔｏマウス（＃００７９１４）、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（＃０００６６４）および構成的ＳｐＣａｓ９マウス（＃０２６１７９）をジャクソン研究所から購入し、５〜１２週齢で用いた。全ての実験で、Ｎ＝３〜５マウス／群を用いた。マウスには、側部尾静脈に静脈内注射を行うか、または、四頭筋、前脛骨筋、および腓腹筋に筋肉内注射を行った。ナノ粒子濃度はＮａｎｏＤｒｏｐ（サーモサイエンティフィック社）を用いて測定した。インビボナノ粒子選別においては、マウスへの投与は、血管内投与の場合は１．５ｍｇ／ｋｇ、筋内投与の場合は１ｍｇ／ｋｇで行った。
細胞の単離および染色
特に記載がない限り、ＬＮＰ注射の７２時間後に細胞を単離した。マウスを、右心房より２０ｍＬの１×ＰＢＳで灌流した。組織をきれいに切り取った後、コラゲナーゼＩ型（シグマ・アルドリッチ社）、コラゲナーゼＸＩ型（シグマ・アルドリッチ社）、およびヒアルロニダーゼ（シグマ・アルドリッチ社）を含む消化酵素液中に、３７℃、５５０ｒｐｍで、４５分間置いた。心臓および脾臓用の消化酵素にはコラゲナーゼＩＶ型を含ませた（Dahlman, Barnes et al. 2014, Sager, Dutta et al. 2016, Sager, Hulsmans et al. 3016）。細胞懸濁液を７０μｍメッシュに通して濾過し、赤血球を溶血させた。細胞を、特定の細胞集団を特定するために染色し、ジョージア工科大学の細胞解析コア施設（Cellular Analysis Core）のＢＤ ＦａｃｓＦｕｓｉｏｎセルソーターおよびＢＤ Ｆａｃｓ Ａｒｉａ ＩＩＩｕセルソーターを用いてソーティングした。インビトロ実験には、ＢＤ Ａｃｃｕｒｉ Ｃ６およびＢＤ ＦａｃｓＦｕｓｉｏｎを用いた。以下の抗体クローンを用いた：抗ＣＤ３１（３９０、バイオレジェンド社）、抗ＣＤ４５．２（１０４、バイオレジェンド社）、抗ＣＤ３（１７Ａ２、バイオレジェンド社）、抗ＣＤ１０２（３Ｃ４、バイオレジェンド社）。ＰＥ抗ＣＤ４７（ｍｉａｐ３０１、バイオレジェンド社）をｔｄＴｏｍａｔｏ補正に用いた。細胞集団は以下のように定義した：内皮細胞（ＣＤ３１＋ＣＤ４５−）、免疫細胞（ＣＤ３１−ＣＤ４５＋）、および他の細胞（ＣＤ３１−ＣＤ４５−）。ＰＢＳを注射されたＡｉ１４マウスを用いて静脈内投与用のｔｄＴｏｍａｔｏ集団をゲーティングし、反対側の肢を用いて筋肉内の実験用のゲーティングを行った。
体内分布
Ｃｙ５．５タグ化ＤＮＡバーコードを内包するＬＮＰを０．７５ｍｇ／ｋｇで投与した。３時間後、灌流を行わずに各組織を摘出し、個々に重量測定し、ライカ社製（Licor）Ｏｄｙｓｓｅｙ ＣＬｘイメージングシステムを用いてイメージングした。シグナル強度を組織重量に対して正規化した。
Ｃｒｅ ｍＲＮＡ投与
Ｃｒｅ ｍＲＮＡ（トリリンク・バイオテクノロジー社（TriLink Biotechnology）、Ｌ−７２１１）を、単独で、またはＡＴＬ１もしくはＡＴＬ２に内包させて投与し、投与は指定のＬＳＬ−Ｔｏｍマウスに１回または３回行った。最後の注射の７２時間後、フローサイトメトリーを用いてｔｄＴｏｍａｔｏ＋細胞のパーセントを定量した。
内皮ＲＮＡ干渉
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスに、ＡＴＬ１および７Ｃ４を、ＰＢＳ、２ｍｇ／ｋｇ ｓｉＣＴＲＬ（ｓｉＧＦＰ−６４７）、または１ｍｇ／ｋｇ ｓｉＩＣＡＭ２と共に注射した。全ての場合で、ｓｉＲＮＡには、安定性を増加させ、免疫刺激を無効化するために、２’位に化学修飾を加えた。ｓｉＧＦＰ配列およびｓｉＩＣＡＭ−２配列は共に、既に何度か報告されている（Dahlman, Barnes et al. 2014, Sager, Dutta et al. 2016, Sager, Hulsmans et al. 2016）。注射の７２時間後、各組織を摘出し、タンパク質発現をフローサイトメトリーで測定した。ＰＢＳ処置マウスにおけるＩＣＡＭ−２ ＭＦＩ発現を１００％に正規化し、全ての処置群をこの対照群のＭＦＩと比較した。
内皮の遺伝子編集
ＳｐＣａｓ９を構成的に発現しているマウスに、ＩＣＡＭ２を標的とする、１．５ｍｇ／ｋｇの２種類の化学修飾ｓｇＲＮＡ（トリリンク・バイオテクノロジーズ社）（ｓｇＩＣＡＭ２−コンボ）（１：１質量比）を保有するＡＴＬ１またはＡＴＬ２を、３回注射した。最後の注射の５日後、組織を摘出し、ＩＣＡＭ２タンパク質発現を測定し、それと同時に、約２０，０００個のＣＤ３１＋内皮細胞をソーティングしＱｕｉｃｋＥｘｔｒａｃｔに加えた。インデル形成をＴＩＤＥにより測定した。
ＰＣＲ増幅
全てのサンプルは、以前の報告（Dahlman, Kauffman et al. 2016）の通りの１工程ＰＣＲプロトコルを用いて、シーケンス用に増幅および調製した。より具体的には、１μＬのプライマー（ファイナルリバース／フォワードプライマーは５μＭ、ベースフォワードプライマーは０．５ｕＭ）を、５μＬのＫａｐａ ＨｉＦｉ ２Ｘマスターミックス、および４μＬの鋳型ＤＮＡ／水に加えた。反応を３０サイクル実行した。ＰＣＲ反応でクリアなバンドができなかった場合は、個々のサンプルに対しプライマー濃度、鋳型ＤＮＡインプット量、ＰＣＲ温度、およびサイクル数の最適化を行った。
ディープシーケンス
イルミナ社のディープシーケンスを、ジョージア工科大学の分子進化コア施設（Molecular Evolution core）で実施した。イルミナ社製Ｍｉｎｉｓｅｑ（商標）でランを実施した。Ｎｅｘｔｅｒａ ＸＴアダプター配列に基づいてプライマーを設計した。
データ正規化
組織毎に、各粒子の数を正規化した。マウスに注射されたバーコード付加ＬＮＰ混合物も、シーケンスにかけた。この「インプット」ＤＮＡが、ＤＮＡ数を与え、細胞および組織からのＤＮＡ数を正規化するために用いられた（表１）。
データ解析
カスタムＰｙｔｈｏｎをベースとしたツールを用いてシーケンス結果を処理し、各組織について未加工のバーコード数を抽出した。次に、これらの未加工の数をＲスクリプトにより正規化し、その後さらなる解析を行った。統計解析はＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ７を用いて行った。
結果
理想的なインビボ薬物送達スクリーニングとは、高感度であり、一般的な動物モデルを使用し、大量のＬＮＰを同時に試験可能であり、オンターゲット細胞型とオフターゲット細胞型のいかなる組み合わせへの細胞内送達も測定可能なものであろう。ＦＩＮＤはこれらの基準を満たすように設計された。本実施例において、ＦＩＮＤは、Ｃｒｅ ｍＲＮＡを送達するＬＮＰを特定するためにＣｒｅ−ｌｏｘレポーターシステムを利用している（図１Ａ）。マイクロフルイディクスを利用して、ＤＮＡバーコード１およびＣｒｅ ｍＲＮＡを保有するように、化学構造１を有するＬＮＰ−１を配合した。これをＮ回繰り返して、化学構造Ｎを有するＬＮＰ−Ｎ、ＤＮＡバーコードＮおよびＣｒｅ ｍＲＮＡ、を得た（図１Ｂ）。ｍＲＮＡと５６ｎｔ一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）バーコードの同時送達は、ヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１、またはＣａｓ１３）をコードするｍＲＮＡとシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）の送達に近いであろうと考えられた（Doudna and Charpentier 2014, Hsu, Lander et al. 2014, Zetsche, Gootenberg et al. 2015, Abudayyeh, Gootenberg et al. 2016, Abudayyeh, Gootenberg et al. 2017）。
一日で１５８個までのＬＮＰにバーコード付加した後、ハイスループット動的光散乱法（ＤＬＳ）を用いて、各ＬＮＰのサイズおよび安定性をキャラクタライズした。不安定または大型（２２０ｎｍ超）のＬＮＰは廃棄し（図４ａ〜図４ｂ）、安定なナノ粒子をプールし、その後、Ｃｒｅタンパク質が核移行された場合に蛍光を発するように操作された細胞またはマウスに投与した。蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）を用いてレポーター陽性細胞を単離し、レポーター陽性細胞において、イルミナ社のディープシーケンスを用いて、特定されたバーコードを濃縮した（図１Ｂ〜図１Ｃ、図４Ｃ〜図４Ｄ、表１）。
合理的に設計されたＤＮＡバーコードを用いた。これらのバーコードは、ユニバーサルプライマー部位、ＰＣＲバイアスを確認するための７個のランダムヌクレオチドを含み、エキソヌクレアーゼ分解を低減するために５’末端および３’末端においてホスホロチオエート結合により化学修飾されていた（Dahlman, Kauffman et al. 2017, Paunovska 2018）（図４ｅ）。５６ｍｅｒ ｓｓＤＮＡの中央の８個のヌクレオチドがバーコード配列を構成し；４８通りのＤＮＡバーコードの組み合わせのうち、イルミナ社製装置でのマルチプレックス法用に最適化された２４０個を選択した（表２）。個々のサンプルを、イルミナ社シーケンス用に最適化されたデュアルインデックスで標識した（表３）。これらのバーコードを事前にインビトロおよびインビボで特性評価したところ、ＤＮＡバーコードの読み取りが直線的であり、ＦＡＣＳで単離された細胞からシーケンス可能であり、１バーコード当たり０．０００１ｍｇ／ｋｇ ＤＮＡと低い用量で読み取り可能であり、送達に変化を与えない、ということが示された。加えて、ＬＮＰは、ハイブリッド粒子が溶液中で形成されるように作製することができる（Dahlman, Kauffman et al. 2017, Paunovska 2018）。
ＦＩＮＤを、一連のインビトロ実験およびインビボ実験を用いて特性評価した。ＬｏｘＰ−ＧＦＰ−Ｓｔｏｐ−ＬｏｘＰ−ＲＦＰ（ＬＧＳＬ−ＲＦＰ）を発現するＨＥＫ細胞を、ＣＭＶプロモーター下で培養した（図１Ａ）。予想通り、これらの細胞は、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｌ２Ｋ）に内包されたＣｒｅ ｍＲＮＡによる処理の７２時間後にＲＦＰ＋となったが、Ｃｒｅ ｍＲＮＡ単独処理ではＲＦＰ＋にならなかった（図１Ｄ〜図１Ｅ、図４Ｆ〜図４Ｇ）。Ｌ２Ｋ処理後のＲＦＰ＋細胞の数は、３日後まで、用量および時間とともに増加した（図４Ｈ〜図４Ｉ）。次に、Ｌ２ＫをＣｒｅ ｍＲＮＡおよびＡｌｅｘａ６４７標識ＤＮＡバーコードと共配合した。２４時間後、５３％、４５％、２％、および０％の細胞が、６４７＋ＲＦＰ−、６４７＋ＲＦＰ＋、６４７−ＲＦＰ−、および６４７−ＲＦＰ＋陽性となった。レポーター陽性且つバーコード陰性の細胞は存在せず、このことは、機能的なｍＲＮＡ送達には、体内分布が必要不十分であったことを示している（図１Ｆ）。
ＦＩＮＤが多くのナノ粒子によって媒介される送達を同時に測定できるかどうかを確認するために、５４種類の化学的に異なるＬＮＰを配合し（表５、図４Ｊ〜図４Ｏ）；それぞれにはＣｒｅ ｍＲＮＡおよびユニークなＤＮＡバーコードを含ませた。これらのＬＮＰを、１０、１００、または１０００ｎｇ／ウェルのｍＲＮＡ用量、および１０：１のｍＲＮＡ：ＤＮＡバーコード質量比を用いて、６ウェルプレート内のＨＥＫ細胞に投与した。用量依存的なＲＦＰ＋細胞の増加が確認され、トランスフェクションの７２時間後、１０００ｎｇでは、８０％超の細胞がＲＦＰ＋であった（図１Ｇ）。バーコードが３つ全ての用量においてディープシーケンスにかけられたが、最も低い用量でバーコードを送達したＬＮＰ（４％ＲＦＰ＋細胞）は、中間の用量においてもＬＮＰを送達するであろう（２０％ＲＦＰ＋細胞）と考えられた。これら２つの用量における正規化された送達率の間には強い相関関係があった（図１Ｈ）。また、１０００ｎｇ ｍＲＮＡで処理された細胞をシーケンスにかけた。予想通り、１０００ｎｇと１０ｎｇまたは１００ｎｇとの間では相関は弱くなったが、これは、この用量では、ほぼ全ての細胞（８０％超）がＲＦＰ＋であるために、システムの飽和が起こるからである（図４Ｐ〜図４Ｑ）。最後に、クラスリン媒介エンドサイトーシス、カベオリン媒介エンドサイトーシス、およびマクロピノサイトーシス媒介エンドサイトーシスをそれぞれ阻害するクロルプロマジン、ゲニステイン、またはエチルイソプロピルアミロライド（ＥＩＰＡ）で細胞を前処理した場合に、ＲＦＰ＋細胞の数が減少するかどうかを評価した。阻害剤で処理されなかった細胞と比較して、ＲＦＰ＋細胞の数は４０〜６０％減少し、以前のＬＮＰの結果の再現となった（Sahay, Querbes et al. 2013, Dahlman, Barnes et al. 2014, Wittrup, Ai et al. 2015）（図１Ｉ）。
ＦＩＮＤがインビボのＬＮＰ送達を定量化できるかを確認するため、ＣＡＧレポーターの制御下のＬｏｘＰ−Ｓｔｏｐ−ＬｏｘＰ−ｔｄＴｏｍａｔｏ（ＬＳＬ−ｔｄＴｏｍ）を発現するマウスを使用した（Madisen, Zwingman et al. 2010）（図２Ａ）。ＬＮＰ送達に影響することが知られている以下の４つの因子を変化させて、１１２種のＬＮＰを配合した：脂質−アミン化合物の構造、ＰＥＧのモル量、ＰＥＧの構造、およびコレステロールのモル量（図２Ｂ、図５Ａ〜図５Ｋ、および表６Ｂ）。７１種の製剤が安定であると確認されたため、それらをまとめてプールした（図２Ｃ）。ＤＮＡバーコード単独は陰性対照として用いた。１．５ｍｇ／ｋｇの全ＲＮＡを静脈内注射し、７２時間後に肺および腎臓の内皮細胞を単離した（ｔｄＴｏｍａｔｏ＋ＣＤ４５−ＣＤ３１＋）（Dahlman, Barnes et al. 2014, Platt, Chen et al. 2014, Sager, Dutta et al. 2016, Sager, Hulsmans et al. 2016）。それとは別に、１．０ｍｇ／ｋｇの全ＲＮＡを筋肉内注射し、免疫細胞（ｔｄＴｏｍａｔｏ＋ＣＤ４５＋）および非免疫細胞（ｔｄＴｏｍａｔｏ＋ＣＤ４５−）を単離した。また、１００ｎｇのｍＲＮＡをＬＧＳＬ−ＲＦＰ発現ＨＥＫ細胞に投与した。様々なＬＮＰが、静脈内条件、筋肉内条件、およびインビトロ条件でｍＲＮＡを送達するであろうと考えられた。偽陽性を最小限にするため、静脈内注射マウスについてはＰＢＳ注射ＬＳＬ−ｔｄＴｏｍマウスに、筋内投与については対側肢に、ゲートを配置した。いくつかの証拠から、これらのデータがロバストであることが示された。第一に、バーコード単独はどのＬＮＰよりも送達効率が低かった（図２Ｄ）。第二に、インビボＲＮＡ送達用に以前に最適化された７Ｃ１ベースのＬＮＰが、上位２０％のＬＮＰにおいて２．３〜４．７倍に濃縮された（図２ｄ、図５ｌ〜５ｏ）（Dahlman, Barnes et al. 2014）。最後に、不偏性のユークリッドクラスタリング（unbiased Euclidean clustering）により、静脈内送達、筋肉内送達、およびインビトロ送達が３つの異なるクラスターに分けられた（図２Ｅ）。他の不偏性のアルゴリズムではクラスタリングに変化が生じなかった（Ronan, Qi et al. 2016）。
ＰＥＧ、コレステロール、およびヘルパー脂質（例えば、ＤＯＰＥ）がインビボにおける細胞への送達にどのように影響するか、という重要な問題に着目して、第二の段階的ＬＮＰライブラリーを配合した。７Ｃ１ベースのＬＮＰが第１スクリーニングで濃縮されたため、この化合物を用いて作製されたＬＮＰに着目した。７Ｃ１のモル％、ＰＥＧのモル％、およびＰＥＧ上のアルキル長を変化させた（図５Ｐ〜５Ｖ、および表７）。１０８種中７８種のＬＮＰが安定となり、それを１．５ｍｇ／ｋｇの総ｍＲＮＡ用量でマウスに静脈内投与した。７２時間後、ｔｄＴｏｍａｔｏ＋肺内皮細胞およびｔｄＴｏｍａｔｏ＋腎内皮細胞を単離し、バーコードをシーケンスした。各ＬＮＰは、肺および腎臓の内皮細胞に対してわずかに異なる親和性を示した。Ｃ１８ＰＥＧと比較して、Ｃ１４アルキルＰＥＧが肺ＬＮＰで濃縮された（図２Ｆ〜図２Ｇ）。腎臓送達に対して肺送達を改善するために設計された第３ＬＮＰライブラリーは、Ｃ１４アルキルテールＰＥＧのみを用いて配合した（図５ｗ〜５ｃｃ、および表８）。腎内皮細胞よりも３．７５倍多い肺内皮細胞がｔｄＴｏｍａｔｏ＋となった（図２Ｈ）。これらのデータは、ＰＥＧアルキルテール長が体内分布に影響を与えることを示唆する以前の研究を裏付けている（Mui, Tam et al. 2013, Dahlman, Kauffman et al. 2017）。ＬＮＰ送達とＬＮＰ直径との間には強い相関は認められなかった（図５ｄｄ〜図５ｌｌ）。
全てのハイスループットスクリーニング物と同様、ＦＩＮＤで特定されたＬＮＰも検証の必要がある。ＡＴＬ１およびＡＴＬ２（図３Ａ、３Ｂ〜３Ｅ）を選択した。ＡＴＬ１およびＡＴＬ２は小型の安定なＬＮＰを形成した（図６Ａ〜６Ｂ）。インビトロにおいて、ＬＧＳＬ−ＲＦＰ細胞における両方のＬＮＰのエンドサイトーシスおよび機能的Ｃｒｅ ｍＲＮＡ送達が、クロルプロマジンおよびゲニステインによって阻害され、一方で、ＥＩＰＡのみがＬＮＰ取り込みに影響を与えた（図６Ｃ〜６Ｆ）。
体内分布、忍容性、並びに内皮細胞にｓｉＲＮＡ、ｓｇＲＮＡ、およびｍＲＮＡを送達する能力をインビボで測定した。まず、ＡＴＬ１およびＡＴＬ２をＣｙ５．５複合型ＤＮＡバーコードと配合し、０．７５ｍｇ／ｋｇのＤＮＡをマウスに静脈内注射した。Ｃｙ５．５のエキソビボ蛍光は脾臓、腎臓、および肝臓において最も高く、このことは、大部分のＬＮＰと同様、ＡＴＬ１およびＡＴＬ２もこれらの組織に分布し、且つ／またはこれらの組織によって部分的に除去されることを示唆している（図６Ｇ〜６Ｈ）。
次に、ＡＴＬ１およびＡＴＬ２を、内皮に特異的な遺伝子ＩＣＡＭ−２を標的とするｓｉＲＮＡと配合した。マウスにＰＢＳ、２．０ｍｇ／ｋｇのｓｉＧＦＰ（忍容性を試験するための高用量）、または１．０ｍｇ／ｋｇのｓｉＩＣＡＭ−２を静脈内注射した３日後、以前の報告（Dahlman, Barnes et al. 2014, Sager, Dutta et al. 2016, Sager, Hulsmans et al. 2016）の通りに、ＦＡＣＳを用いて、肺、腎臓、および脾臓の内皮細胞について、ＩＣＡＭ−２タンパク質の蛍光強度中央値（ＭＦＩ）を定量化した。ＩＣＡＭ−２ ＭＦＩは、ＰＢＳ処置マウスおよびｓｉＧＦＰ処置マウスにおいては一定であったが、ｓｉＩＣＡＭ−２を注射されたマウスから単離された内皮細胞では最大６０％の減少を示した。肺内皮細胞において、ＡＴＬ１を介したｓｉＲＮＡ送達はＡＴＬ２を介したｓｉＲＮＡ送達よりもロバストであり、興味深いことに、ＡＴＬ２は肺内皮細胞よりも脾臓内皮細胞により多くのｓｉＲＮＡを送達した（図３Ｆ）。２．０ｍｇ／ｋｇ ｓｉＧＦＰ注射マウスは、ＰＢＳ注射マウスとの比較で、体重を減少させなかった（図６Ｉ〜図６Ｋ）。共に以前に検証された（Dahlman, Barnes et al. 2014, Sager, Dutta et al. 2016, Sager, Hulsmans et al. 2016）ｓｉＲＮＡを、化学修飾ＲＮＡを用いて合成した（図６Ｌ）。
ＡＴＬ１およびＡＴＬ２がｓｇＲＮＡを内皮細胞に送達するかどうかを確認するため、ＩＣＡＭ−２を標的とする、２種の化学修飾（Hendel, Bak et al. 2015）ｓｇＲＮＡをそれぞれ０．７５ｍｇ／ｋｇの用量でＳｐＣａｓ９を構成的に発現するマウス注射した（Platt, Chen et al. 2014）（図６Ｍ）。ＰＢＳ注射マウスとの比較において、体重増加に変化は認められなかった（図６Ｎ〜図６Ｏ）。３回の注射後、ＩＣＡＭ−２ ＭＦＩは、肺、脾臓、および腎臓の内皮細胞において、最大９０％、７５％、および５９％減少した（図３Ｇ）。タンパク質のサイレンシングが遺伝子編集によってもたらされたことの確認のため、ＦＡＣＳで単離された肺、脾臓、および腎臓の内皮細胞においてＩＣＡＭ−２の挿入および欠失を測定したところ、ｓｇＲＮＡ当たり３０〜７０％の編集が見つかり、それぞれ、細胞当たり１．３５、０．９５、および１．２３個のＩＣＡＭ−２の挿入および欠失がもたらされた（図３Ｈ〜３Ｉ、図６Ｐ〜６Ｑ）。これらのｓｉＲＮＡおよびｓｇＲＮＡのデータは、インビボでＡＴＬ１およびＡＴＬ２が小型ＲＮＡを内皮細胞に送達することを示しており、製剤が血管床ＬＮＰ標的を変化させ得ることを示唆している。
インビボでＡＴＬ１およびＡＴＬ２がｍＲＮＡを内皮細胞に送達するかどうかを確認するため、１．５ｍｇ／ｋｇのＣｒｅ ｍＲＮＡをＬＳＬ−Ｔｏｍレポーターマウスに静脈内注射した。ＡＴＬ１またはＡＴＬ２の１回注射後、それぞれ１２．６％および４０％の脾臓内皮細胞がｔｄＴｏｍａｔｏ＋となった（図３Ｊ）。これは２つの理由から興味深いものであった。第一に、ＡＴＬ１およびＡＴＬ２は共に、他の血管床よりも脾臓内皮細胞に優先的にｍＲＮＡを送達した。第二に、脾臓において、ＡＴＬ２はＡＴＬ１よりも成績が良かった。全ての場合で、内皮細胞は他の細胞型よりも優先的に標的とされ（図６Ｒ〜図６Ｓ）、この結果は蛍光性の血管が脾臓全体に存在したことにより確認された（図３Ｋ〜図３Ｎ）。
考察
インビボにおいて所与のナノ粒子がそのＲＮＡ搭載物を細胞質に送達するかの予測は未だ困難である。ＪＯＲＤＡＮは、他のナノ粒子バーコード付加プラットフォームと同様、インビボにおけるＬＮＰの試験に使用できる。ＦＩＮＤは、細胞質ｍＲＮＡ送達を測定することにより、これらのアッセイを補完するものである。
ＦＩＮＤにはいくつかの利点がある。第一に、ＦＩＮＤは細胞型に依存せず；あらゆる細胞の組み合わせが単離可能である。第二に、ＦＩＮＤは、ＬＮＰ構造がインビボにおける細胞質送達にどのように影響するかの、系統的な試験を可能にする。インビボにおける２５５種のＬＮＰのスクリーニングにより、ＰＥＧアルキルテールの長さはインビボ送達に影響を与える可能性があり、これは以前の研究を再現している。第三に、ＦＩＮＤは多くの動物モデルで使用することができ、疾患が送達にどのように影響するかの評価を可能にする。第四に、多重化試験は、従来の１つずつのスクリーニングよりも実施がより簡単であった。ＬＮＰをインビトロで１つずつスクリーニングする場合、全く同じ細胞密度を維持することが困難であり、その間中、キットおよび試薬が何か月間も完全に不変であることをあてにすることになる。多くのナノ粒子を一度に解析することは、実験結果の解釈をより容易にし得る。関連して、ＦＩＮＤは、大規模増殖に適していない、継代が困難な細胞に使用できる。
ＦＩＮＤにより、インビボにおいて遺伝子サイレンシングおよび遺伝子編集を媒介した、ＡＴＬ１およびＡＴＬ２を特定することができた。ｓｇＲＮＡの構造、またはＣａｓ９ ｍＲＮＡの安定性を最適化するさらなる試験により、編集効率は改善され得る。内皮細胞においてのデータ、および肝細胞においてのデータは、ＬＮＰが静脈内投与後に遺伝子編集を媒介できることを示している。
（表１）正規化された送達率の計算例
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（表２）バーコード配列
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（表３）多重化したイルミナ社シーケンス用のデュアルインデックス設計
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（表４）プライマー
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（表５）インビトロアッセイに用いたLNPライブラリー
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（表６）インビボスクリーニング1に用いられたLNPライブラリー
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（表７）インビボスクリーニング3に用いられたLNPライブラリー
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（表８）インビボスクリーニング4に用いられたLNPライブラリー
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（表９）ATL1 siRNA実験
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（表１０）臓器重量
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（表１１）臓器/体重
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実施例２：共通に発現されるエンドサイトーシス受容体の改変はインビボにおいてナノ粒子を再標的化する
材料および方法
ナノ粒子製剤
ナノ粒子を、以前の報告（Chen D, et al., J Am Chem Soc 134:6948―6951 (2012)）の通りに、マイクロ流体デバイスを用いて製剤化した。簡潔に説明すると、核酸（ＤＮＡバーコード）を１０ｍＭクエン酸緩衝液（テクノバ社）で希釈し、脂質−アミン化合物、アルキル末端を有するＰＥＧ、コレステロール、およびヘルパー脂質をエタノールで希釈した。ＰＥＧ、コレステロール、およびヘルパー脂質は全て、アバンティ・リピド社から購入した。クエン酸相およびエタノール相を、それぞれ６００μＬ／分および２００μＬ／分の流速で、シリンジ（ハミルトン社）によって、マイクロ流体デバイス内で合わせた。
ＤＮＡのバーコード化
それぞれの化学的に異なるＬＮＰを、ユニークなＤＮＡバーコードを内包するように製剤化した（図１４Ａ〜図１４Ｂ）。例えば、ＬＮＰ１にはＤＮＡバーコード１を内包させ、一方、化学的に異なるＬＮＰ２にはＤＮＡバーコード２を内包させた。９１ヌクレオチド長の一本鎖ＤＮＡ配列を、ウルトラマー（ultramer）として、インテグレーテッド・ＤＮＡ・テクノロジーズ（ＩＤＴ）社から購入した。５’末端および３’末端の３個のヌクレオチドに、ホスホロチオエート修飾を行うことで、エキソヌクレアーゼ分解を低減させ、ＤＮＡバーコードの安定性を向上させた。各配列が等しく増幅されるように、ユニバーサルフォワードプライマー領域およびユニバーサルリバースプライマー領域を全てのバーコード上に含ませた。ユニークな８ｎｔ配列を用いて各バーコードを識別した。８ｎｔ配列は４８（６５，５３６）種類の異なるバーコードを生じ得る。イルミナ社製ＭｉｎｉＳｅｑ（商標）シーケンス装置での配列のブリーチング（bleaching）を防ぐように設計された、１５６種類の異なる８ｎｔ配列を用いた。フルオロフォアとして５’ＦＡＭを有する２６ｎｔのプローブをＩＤＴ社から購入し、一方、内部のＺｅｎおよび３’のＩｏｗａ Ｂｌａｃｋ ＦＱはクエンチャーとして用いた。ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７またはＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８が５’末端に結合した蛍光性バーコードをＩＤＴ社から購入した。
ナノ粒子の特性評価
ＬＮＰの流体力学的径を、ハイスループット動的光散乱法（ＤＬＳ）（DynaPro Plate Reader II、ワイアット社）を用いて測定した。ＬＮＰは、無菌１×ＰＢＳで約０．０６μｇ／ｍＬの濃度に希釈して解析した。不安定なＬＮＰの使用を避けるため、また、０．２２μｍフィルターを用いた無菌精製を可能にするため、直径２０〜２００ｎｍの単分散集団という基準を満たすＬＮＰのみを用いた。これらの基準を満たした粒子を、１×リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、インビトロジェン社）を用いた透析にかけ、０．２２μｍフィルターで濾過滅菌した。
動物実験
全ての動物実験はジョージア工科大学のＩＡＣＵＣに従って実施した。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（＃０００６６４）、ＳｐＣａｓ９マウス（＃＃０２６１７９）およびカベオリン１−／−マウス（＃００７０８３）をジャクソン研究所から購入し、５〜８週齢で用いた。全てのインビトロ実験およびインビボ実験で、Ｎ＝３〜５群を用いた。マウスには側部尾静脈に静脈内注射した。ナノ粒子濃度はＮａｎｏＤｒｏｐ（サーモサイエンティフィック社）を用いて測定した。インビボでのナノ粒子スクリーニングにおいては、マウスには０．５ｍｇ／ｋｇの用量で投与を実施した。
細胞の単離および染色
特に記載がない限り、細胞の単離は、ＬＮＰ注射の２４時間後（スクリーニングの場合）または９６時間後（インビボ遺伝子編集の場合）に行った。マウスを、右心房より２０ｍＬの１×ＰＢＳで灌流した。組織をきれいに切り取った後、コラゲナーゼＩ型（シグマ・アルドリッチ社）、コラゲナーゼＸＩ型（シグマ・アルドリッチ社）、およびヒアルロニダーゼ（シグマ・アルドリッチ社）を含む消化酵素液中に、３７℃、５５０ｒｐｍで、４５分間置いた。心臓および脾臓用の消化酵素にはコラゲナーゼＩＶ型を用いた（Dahlman JE, et al. (2014) Nat Nano 9(8):648-655; Sager HB, et al. (2016) Sci Transl Med. 8(342):342ra380-342ra380; Sager HB, et al. (2016) Circ Res 119(7):853-864）。細胞懸濁液を７０μｍメッシュに通して濾過し、赤血球を溶血させた。細胞を、特定の細胞集団を特定するために染色し、ジョージア工科大学の細胞解析コア施設のＢＤ ＦａｃｓＦｕｓｉｏｎセルソーターおよびＢＤ Ｆａｃｓ Ａｒｉａ ＩＩＩｕセルソーターを用いてソーティングした。インビトロのフローサイトメトリー実験には、ジョージア工科大学細胞解析コア施設のＢＤ Ａｃｃｕｒｉ Ｃ６を使用した。以下の抗体クローンを用いた：抗ＣＤ３１（３９０、バイオレジェンド社）、抗ＣＤ４５．２（１０４、バイオレジェンド社）、抗ＣＤ６８（ＦＡ−１１、バイオレジェンド社）、および抗ＣＤ１１ｂ（Ｍ１／７０、バイオレジェンド社）。代表的なフローゲート（flow gate）を補足の図４に示す。
ｄｄＰＣＲ
ＱＸ２００（商標）Ｄｒｏｐｌｅｔ Ｄｉｇｉｔａｌ（商標）ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（バイオラド社）を用いて、全てのｄｄＰＣＲ結果を用意し解析した。全てのＰＣＲサンプルは、１０μＬのｄｄＰＣＲ ｗｉｔｈ ｄｄＰＣＲ（商標）Ｓｕｐｅｒｍｉｘ ｆｏｒ Ｐｒｏｂｅｓ（バイオラド社）、１μＬのプライマーおよびプローブのミックス（１０μＭのターゲットプローブおよび２０μＭのリバース／フォワードプライマーの溶液）、１μＬの鋳型／ＴＥ緩衝液、および８μＬの水を用いて調製した。２０μＬの各反応液および７０μＬのＤｒｏｐｌｅｔ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ｏｉｌ ｆｏｒ Ｐｒｏｂｅｓ（バイオラド社）を、ＤＧ８（商標）カートリッジに添加し、ＤＧ８（商標）ガスケットで覆った。カートリッジをＱＸ２００（商標）Ｄｒｏｐｌｅｔ Ｇｅｎｅｒａｔｏｒに入れ、油中水滴型エマルジョンを作製した。ＰＣＲのサイクル条件以下の通りであった：９５℃、１０分間を１サイクル、９４℃、３０秒間、６０℃、１分間を４０サイクル、および９５℃、１０分間を１サイクル。ＱＸ２００（商標）Ｄｒｏｐｌｅｔ Ｄｉｇｉｔａｌ（商標）ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍでランが実施されるまで、プレートは４℃で保存した。それぞれのバイオロジカルレプリケートにおいて、３回の技術的反復（technical repetition）を達成した。全ての場合で、テクニカルレプリケートは平均を取った。テクニカルレプリケートは、検出を飽和させたか、一致性のない陽性事象振幅を示した場合にのみ、除外を行った。
イルミナ社シーケンス用のＰＣＲ増幅
全てのサンプルは、２工程ネステッドＰＣＲプロトコルを用いて、シーケンス用に増幅および調製した（図１９Ｄ）。より具体的には、２μＬのプライマー（ベースリバース／フォワードプライマーは１０μＭ）を、５μＬのＫａｐａ ＨｉＦｉ ２Ｘマスターミックス、および３μＬの鋳型ＤＮＡ／水に加えた。この第一のＰＣＲ反応を２０〜３０サイクル実行した。Ｎｅｘｔｅｒａ ＸＴケミストリー、インデックス、およびｉ５／ｉ７アダプター領域を付加するための第二のＰＣＲを、５〜１０サイクル実行し、鋳型には「ＰＣＲ１」の産物を用いた。デュアルインデックス付加サンプルを２％アガロースゲル上で泳動することにより、ＰＣＲ反応が起こったことを確認し、その後プールし、ＢｌｕｅＰｉｐｐｉｎ（セージ・サイエンス社（Sage Science））を用いて精製した。
ディープシーケンス
イルミナ社のシーケンスを、ジョージア工科大学の分子進化コア施設で実施した。イルミナ社製Ｍｉｎｉｓｅｑでランを実施した。Ｎｅｘｔｅｒａ ＸＴアダプター配列に基づいてプライマーを設計した。
バーコードシーケンスの正規化
細胞型毎の、それぞれの粒子数を、細胞にアプライされた、またはマウスに注射されたバーコード付加ＬＮＰ混合物に対して正規化した。
データの解析および統計
カスタムＲスクリプトを用いてシーケンス結果を処理し、各組織について未加工のバーコード数を抽出した。次に、これらの未加工の数をＲスクリプトにより正規化し、その後さらなる解析を行った。統計解析はＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ７を用いて実施し；より具体的には、片側ｔ検定、対応のある両側ｔ検定、または一元配置分散分析を適宜用いた。特に記載がない限り、データは平均値±平均値の標準誤差としてプロットされている。
結果
ｄｄＰＣＲには効率的なＤＮＡ増幅が必要であるため、ＤＮＡポリメラーゼのアクセスを増加させるようにＱＵＡＮＴ ＤＮＡバーコードの合理的設計を行った。完全ランダム化７ヌクレオチド領域（Dahlman JE, et al. (2017) Proc Natl Acad Sci U S A. 114(8):2060-2065; Paunovska K, et al. (2018) Nano Lett 18(3):2148-2157）をＮＷＮＨ部位およびＮＷＨ部位に分離することにより、フォワードプライマー部位およびリバースプライマー部位上のＤＮＡの二次構造が最小限となり、グアニン四重鎖形成が最小限となった。また、プライマー部位を３つのホスホロチオエート修飾ヌクレオチドと隣接させることで、エキソヌクレアーゼ分解が低減された。最後に、マウスゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）もヒトｇＤＮＡも増幅しないユニバーサルプライマー結合部位を特定した。具体的には、同様の融解温度（１℃以内）を有するプライマーのライブラリーを設計し、バーコード鋳型なしでヒトｇＤＮＡおよびマウスｇＤＮＡに添加した後；４０サイクルのＰＣＲ（図１９Ａ〜図１９Ｂ）を実行した。４０サイクル後にｇＤＮＡを増幅しなかったが（表Ｘ）、２０サイクルと少ないサイクルでバーコード鋳型を増幅した、プライマーを特定した。これらの「バックグラウンド無し」のユニバーサルプライマー部位をバーコードに付加した後、ｄｄＰＣＲプロトコル（図１９Ｃ〜図１９Ｅ）が最適化された。アニーリング温度、プライマー濃度、およびプローブ濃度を変化させ、現在のゴールドスタンダードのプロトコルと比較して信号対雑音比を１４倍に増加させた（Hindson CM, et al. (2013) Nat Methods 10(10):1003-1005）。ｄｄＰＣＲ読み取りが特異的であることを確認するため、ｄｄＰＣＲプローブ部位をスクランブルしたところ；この対照条件ではシグナルは生成されず、これは、シグナルには特異的なバーコード−プローブ相互作用が必要であることを示している（図１９Ｆ）。
次に、検量線対照実験を実施して、ＱＵＡＮＴ感度を測定した。バーコードをＴｒｉｓ−ＥＤＴＡ緩衝液で７５０ａＭ〜１２ｆＭの濃度に希釈した場合、ＱＵＡＮＴ ｄｄＰＣＲシグナルは直線的であり（Ｒ２＝１．００）、３００ａＭ（図１４Ｄ〜図１４Ｅ）で検出された。対照として、濃度を３０ａＭに減少させると、未処理のベースラインを上回る読み取りは生じなかった。次に、ＱＵＡＮＴの感度をインビトロで解析した。ＱＵＡＮＴバーコードを蛍光標識し、１ｐｇ／ウェル〜４００ｎｇ／ウェルの用量で、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｌ２Ｋ）と共に、９６ウェルプレート内の不死化大動脈内皮細胞（ｉＭＡＥＣ）（Ni CW, et al. (2014) Vascular cell 6(1):7）に投与した。２４時間後、フローサイトメトリーを用いて体内分布を解析したところ、１０ｐｇ／ウェルを超える用量で、測定可能な、しかし非直線的な、平均蛍光強度の増加が示された（図１９Ｇ）。それとは別に、ＱＵＡＮＴバーコードを、フルオロフォア無しで、６０〜１０，０００ｚｇ／ウェルの用量で投与した。ｄｄＰＣＲ読み取りは、蛍光よりも１／１０９倍低い用量の１５〜１０００ｚｇ／ウェルで直線的（Ｒ２＝０．９１）であった（図１４Ｆ）。最後に、ＱＵＡＮＴバーコードを検証済みのＬＮＰ（Dahlman JE, et al. (2014) Nat Nano 9(8):648-655）に含ませて配合したところ；バーコードを内包するＬＮＰは平均流体力学的径が５３ｎｍであるナノ粒子を形成した。これらを、臨床的に意義のある（Coelho T, et al. (2013) N Engl J Med 369(9):819-829）バーコード用量の０．５ｍｇ／ｋｇで静脈内投与し、２４時間後に蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）を用いて肺内皮（ＣＤ３１＋ＣＤ４５−）細胞を単離し（Dahlman JE, et al. (2014) Nat Nano 9(8):648-655; Paunovska K, et al. (2018) Nano Letters）、ｄｄＰＣＲを用いてバーコード送達を定量化した。ＱＵＡＮＴのロバストネスを評価するため、この実験を完了した直後にサンプルを比較し、サンプルを−２０℃で２０日間または３１日間保存した後に測定を繰り返した。異なる個人が異なる試薬ストックを用いて実施した場合も、読み取りは一貫性があった（図１４Ｇ）。
核酸はホスホジエステル結合を切断するヌクレアーゼで分解されるが（Yang W (2011) Quarterly reviews of biophysics 44(1):1-93）；フルオロフォアは分解されない。フルオロフォアと核酸は異なる機構で分解するとし、ＤＮＡに結合した蛍光タグに基づいたインビボにおける体内分布の読み取りは、核酸を直接的に測定するＱＵＡＮＴとは異なる結果を生じ得るという仮説を立てた。この仮説を調べるため、検証済みのＬＮＰ（Dahlman JE, et al. (2014) Nat Nano 9(8):648-655）を、Ａｌｅｘａ−６４７で蛍光標識した、またはされていない、ＱＵＡＮＴバーコードと配合した。Ａｌｅｘａ−６４７は、Ａｌｅｘａ−４８８と比較して、細胞の自己蛍光が最も少ないことが判明した後で選択された（図２０）。臨床的に意義のある用量（Coelho T, et al. (2013) N Engl J Med 369(9):819-829）の０．５ｍｇ／ｋｇを静脈内投与した１時間後に、ＦＡＣＳを用いて５種の組織から１３種の細胞型を単離し、Ａｌｅｘａ−６４７の平均蛍光強度（ＭＦＩ）またはｄｄＰＣＲ（図１５Ａ）を用いてＬＮＰ送達を定量化した。共通して確認された結果を要約すると、ほぼ全ての蛍光シグナル（８７％）が肝細胞で見出された（図１５Ｂ〜図１５Ｅ）。残りの１０種の細胞型は総蛍光シグナルの１３％しか生じていなかった。対照的に、ＱＵＡＮＴの体内分布はより均等に分布しており；ｄｄＰＣＲシグナルの５６％が肝細胞由来であり、シグナルの４４％が他の細胞型由来であった。これらの結果に基づいて、１３種全ての細胞型において送達を比較したところ（両方の場合で、ナノ粒子を直ちに除去することが知られている常在性の肝臓マクロファージであるクッパー細胞に対して正規化）、それらのうち７種で統計的に有意な差異が示された（図１５Ｆ）。全ての場合で、これらのデータは、蛍光により肝臓体内分布の過剰に高い評価を示した。
これらの結果が特定の時点によるものである可能性を排除するため、インビボにおけるナノ粒子の挙動を特性評価するために用いられる重要なパラメーターである、ナノ粒子の薬物動態を解析した。同じ検証済みＬＮＰ（Dahlman JE, et al. (2014) Nat Nano 9(8):648-655）に内包させた、０．５ｍｇ／ｋｇのＱＵＡＮＴバーコードまたは蛍光標識ＱＵＡＮＴバーコードをマウスに静脈内注射した０．４時間後、０．７５時間後、１．２５時間後、１２時間後、２４時間後、および３６時間後（図１６Ａ）の、５種の細胞型、肝臓の内皮細胞、クッパー細胞、肝細胞、肺の内皮細胞、および肺のマクロファージにおいて、体内分布を定量化した。繰り返しになるが、初期の時点では、蛍光の体内分布は肝細胞に局在していた（図１６Ｂ）。それ以降の時点では、蛍光の体内分布は、ＰＢＳ処置マウスを超える有意差はなかった（図１６Ｂ）。対照的に、ｄｄＰＣＲに基づいた体内分布は、５種全ての細胞型で、６つ全ての時点で確認された（図１６Ｃ〜図１６Ｆ）。曲線下面積および最大ＤＮＡ送達を含む、実施された全ての解析により、蛍光による肝臓への送達の過剰に高い評価が示唆された（図１６Ｇ〜図１６Ｈ）。
最後に、各実験にわたってのＱＵＡＮＴ読み取りのロバストネスを調べた。まず、ＱＵＡＮＴマウス間の決定係数相関を各時点で算出した。類似の時点（それぞれ、１時間および１．２５時間）において、最初の体内分布実験（図１５）および薬物動態実験（図１６）における、５種全ての細胞型からの、絶対ｄｄＰＣＲ値を算出した。これらの絶対値をプロットしたところ、実験間に高度な直線関係（Ｒ２＝０．９８）が示され、ＱＵＡＮＴ実験の繰返し性が示された（図１７）。図２〜図４のデータは、フルオロフォアの体内分布が核酸それ自体の体内分布を正確に表さない可能性を示唆している。他の研究室に反復される場合、これは、多くの前臨床ナノ粒子試験において重大な意味を持つことになる。さらに総じて言えば、図１〜図４のデータは、ＱＵＡＮＴが高感度で、ロバストで、再現性のある、ナノ粒子体内分布定量化法であることを示している。
感度の増加に加えて、ＱＵＡＮＴバーコードは多重化することができる。これは、１００種を超えるナノ粒子を介した絶対送達の同時測定を可能とする、最初のＤＮＡナノ粒子バーコード付加法である。この新たな可能性を、インビボのナノ粒子送達に影響を与える生体因子の試験に用いた。線維性（Gvaramia D, et al. (2013) Matrix Biol. 32(6):307-315）神経性（Gaudreault SB, et al. (2004) Neurobiol Aging.25(6):753-759）疾患、およびがん（Yang G, et al. (1999) Cancer Res 59(22):5719-5723; Witkiewicz AK, et al. (2009) Am J Pathol 174(6):2023-2034）に関与するエンドサイトーシス遺伝子であるカベオリン−１（Ｃａｖ１）に着目した。Ｃａｖ１はまた、インビトロにおけるナノ粒子の取り込みに影響を与えるカノニカルなエンドサイトーシス遺伝子でもある（Sahay G, et al. (2010) J Control Release 145(3):182-195）。しかし、Ｃａｖ１がインビボでナノ粒子に影響を与えるかどうか、そしてＣａｖ１の影響がどの程度まで細胞型依存性であるかは、不明である。さらに広く言えば、少数の研究がインビボにおけるナノ粒子ターゲティングで遺伝子が果たす役割を調べてはいたが（Akinc A, et al. (2010) Mol Ther 18(7):1357-1364; Bertrand N, et al. (2017) Nat Commun. 8(1):777）、複数の細胞型で発現される遺伝子（a given）が細胞型特異的にナノ粒子送達に影響を与え得るかどうかは不明であった。Ｃａｖ１は、その発現が組織微小環境によって制御され得ることから（Sotgia F, et al. (2011) Breast Cancer Res. 13(4):213）、細胞型特異的な挙動を示すだろうと考えられた。
Ｃａｖ１ノックアウトが細胞型特異的にＬＮＰ送達に影響を与えるという仮説を調べるため、２つのハイスループットインビボＬＮＰスクリーニングを実施した。化学構造１を有するＬＮＰ−１にはＱＵＡＮＴバーコード１を内包させ；化学構造Ｎを有するＬＮＰ−ＮにはＱＵＡＮＴバーコードＮを内包させた（図１８Ａ）。ＱＵＡＮＴバーコード上の８ヌクレオチドバーコード領域は６５，５３６種のユニークなバーコードを生成し得るが；イルミナ社製シーケンス装置上で互いに適合性の１５６種を選択した（Paunovska K, et al. (2018) Nano Lett 18(3):2148-2157）。各ＬＮＰの流体力学的径を動的光散乱法で個々に解析し、小型ＬＮＰ（２００ｎｍ未満の直径）を１×ＰＢＳ中にプールした。第一のＬＮＰライブラリーでは、１２８種のＬＮＰが配合され；１１１種が安定であるとして、プールされた。総ＤＮＡ投与量０．５ｍｇ／ｋｇ（平均して粒子当たりおよそ０．００４ｍｇ／ｋｇ）を、野生型マウスおよびＣａｖ１−／−マウスに静脈内投与した。別のマウスにおいて、第二のライブラリーである１２０種のＬＮＰ（そのうち１１５種が安定）を配合し、プールし、注射した（図１８Ｂ、表１３および表１４）。両方の実験で、肝臓、肺、心臓および腎臓に由来する細胞を、投与の２４時間後にＦＡＣＳを用いて単離した。次に、ディープシーケンスを用いて相対送達を測定し、ｄｄＰＣＲを用いて絶対送達を測定した。正規化された送達率は、特定のバーコードが、他のバーコードと比較して、どの程度よく送達されたかを測定する（Dahlman JE, et al. (2017) Proc Natl Acad Sci U S A. 114(8):2060-2065; Paunovska K, et al. (2018) Nano Lett 18(3):2148-2157）。
予想通り、ＤＮＡバーコード単独（陰性対照）の正規化された送達率は、ＬＮＰに内包されたバーコードの正規化された送達率よりもかなり低かった（図１８Ｃ、図２１Ａ）。各細胞型からバーコードをディープシーケンスし、多数のサンプルの類似性／相違性を比較する一般的なバイオインフォマティクス体系であるユークリッドクラスタリングを用いて、送達の解析を行った（Ronan T, et al. (2016) Sci Signal. 9(432):re6）。複数の証拠によって、Ｃａｖ１発現が、マクロファージへの送達よりもずっと多く、内皮細胞への送達に影響を与えたことが示唆された。第一に、内皮細胞のユークリッドクラスタリングは、マクロファージのクラスタリングよりも多く、マウスが野生型であるかＣａｖ１−／−であるかの影響を受けた（図１８Ｄ〜図１８Ｅ、図２１Ｂ〜図２１Ｃ）。第二に、野生型マウスと比較して、Ｃａｖ１−／−マウスでは、肝臓、肺および心臓の内皮細胞へのナノ粒子送達がかなり減少した。興味深いことに、腎内皮細胞への送達への影響は少なかった（図１８Ｆ、図２１Ｄ〜図２１Ｋ）。マクロファージでは変化はあまり認められなかった。肺マクロファージへの送達は変化しなかったが、腎臓マクロファージへの送達はわずかに変化した。興味深いことに、クッパー細胞への送達はＣａｖ１−／−マウスで顕著に減少した（図１８Ｈ）。これらの結果は、全身投与後にクッパー細胞がナノ粒子を隔離すると考えると重要であり；Ｃａｖ１発現の阻害がクッパー細胞によるナノ粒子の除去を防ぎ得ることを示唆している。
これらのデータをさらに検証するため、シーケンスデータ（多くのＬＮＰによる相対送達）とｄｄＰＣＲ（絶対送達）を組み合わせることで、全ての細胞型において、全部で２００種を超えるＬＮＰがカベオリン１によってどのような影響を受けたかを算出した（図２２Ａ）。この場合も、内皮細胞への送達（図２２Ｂ〜２２Ｃ）はマクロファージへの送達（図２２Ｄ〜２２Ｅ）よりも多くの影響を受けた。ＱＵＡＮＴは容易に多重化できるため、２つのインビボ実験にわたって生じた２，０００を超えるデータ点の解析（これは、従来の方法を用いる場合、１０，０００匹近くのマウスを必要とするだろう）が可能となった。
まとめると、ＱＵＡＮＴは、従来の実験ではなし得なかったであろう、インビボ薬物送達のバイオロジーに関する、３つの新たな科学的観察を可能にした。第一に、カベオリン１発現はインビボにおいて、マクロファージよりも多く、内皮細胞への送達に影響を与える。第二に、主要なクリアランス細胞型であるクッパー細胞への送達は、カベオリン１を操作することにより低減し得る。第三に、異なる組織由来の内皮細胞は、ＬＮＰによるターゲティングに差異があり；これはマクロファージについても同様である。これらの一連の証拠を合わせると、単一の遺伝子変化によって、ナノ粒子送達における細胞型特異的な変化を引き起こすことが可能であると示唆される。
考察
核酸療法においては普遍的な課題であるが、体内分布の特異性と非特異性はインビボでの試験が困難である。本明細書で開示されるように、稀なゲノムイベントを定量化する手法であるｄｄＰＣＲを、合理的に設計されたＤＮＡバーコードと合わせて用いることで、ナノ粒子送達を測定することができる。本研究とは別であるが、ｄｄＰＣＲは、環境毒性学の研究においてもナノ粒子を高感度に計数した（Paunescu D, et al. (2015) ACS nano 9(10):9564-9572）。
ＱＵＡＮＴの高い感度を利用して、薬物送達における新たな問題を提起した。ＱＵＡＮＴによって、何千ものナノ粒子が稀な、または単離が困難な細胞型をどのように標的とするかを評価できると期待される。一例として、インビボで幹細胞および希少な腫瘍細胞を標的とするナノ粒子を予測し設計することは困難であったが；ＱＵＡＮＴは、ナノ粒子の構造がこれらの細胞型へのターゲティングをどのように促すかを特定するのに役立ち得る。関連して、２つの実験および複数の時点にわたって、蛍光体内分布では、他の細胞型と比較して、肝臓への送達が過剰に高く評価される傾向があることが分かった。このことは、肝細胞以外の細胞型を標的とするナノ粒子が既に報告されていたかもしれず、予備的な体内分布アッセイの中で単に「肝臓特異的」と誤ったレッテルを張られているかもしれないという、刺激的な可能性を提起する。肝臓を標的としたＲＮＡ療法が臨床的に成功していることと、現在、他の臓器に核酸薬剤を送達できないことを考えると、このことは重要である。これらのデータはまた、特異的な送達および非特異的な送達が、ＦＡＣＳで独立に単離された多くの細胞型で測定されるべきであることを示している。
ＱＵＡＮＴは多重化することができるため；ＱＵＡＮＴを活用して、野生型マウスおよびＣａｖ１−／−マウスにおいて２００種を超えるＬＮＰを介した送達が解析された。このアプローチによって、Ｃａｖ１が細胞型特異的にＬＮＰ送達に影響を与えることが明らかとなった。インビボにおいて、共通に発現される遺伝子が細胞型特異的にナノ粒子送達に影響を与え得るという証明はこれが初めてである。これらのデータはまた、全体的なＣａｖ１発現阻害は、特定の細胞型への送達を止めることに利用できることを示唆している。さらに広く言えば、ＱＵＡＮＴは「インビボ薬物送達のバイオロジー」の研究に使用できる。
Figure 2021500925
（表１２）バーコード配列
Figure 2021500925
特に記載がない限り、本明細書で使用される全ての専門用語および科学用語は、本開示の発明が属する技術分野の当業者により一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書において、材料、およびそれに関連して引用された刊行物は、参照により明示的に援用される。
当業者であれば、本明細書に記載された本発明の特定の実施形態の多くの等価物を、認識するか、通例の実験のみを用いて確認することができる。そのような等価物は以下の特許請求の範囲に包含されることが意図される。
[本発明1001]
インビボ薬剤送達のための送達用担体のインビボ特性評価法であって、
（ａ）異なる化学組成を有する複数の送達用担体を配合する工程であって、各々異なる送達用担体は、対象の細胞の細胞質に送達された際に生物活性を発揮することにより検出可能なシグナルを生成できる分子と、前記送達用担体の化学組成を特定する化学組成識別子と、を含む、前記工程；
（ｂ）前記複数の送達用担体をヒト以外の哺乳動物に投与する工程；
（ｃ）前記検出可能なシグナルを生成しない細胞から前記検出可能なシグナルを生成する細胞を、前記ヒト以外の哺乳動物の複数の組織からソーティングする工程であって、前記検出可能なシグナルを生成する細胞は、組織型または細胞型を示す細胞表面タンパク質の有無に基づいたソーティングも行われる、前記工程；並びに
（ｄ）前記検出可能なシグナルを生成するソーティング後細胞中の前記組成識別子を同定することにより、前記ソーティング後細胞中の送達用担体の化学組成を決定して、前記粒子の化学組成と前記粒子を含有する組織型または細胞型とを関連付ける工程、
を含む、前記方法。
[本発明1002]
前記送達用担体が、所望により、送達される前記薬剤を搭載している、本発明1001の方法。
[本発明1003]
前記送達用担体が脂質ナノ粒子を含む、本発明1001または本発明1002の方法。
[本発明1004]
前記薬剤が核酸である、本発明1001〜1003のいずれかの方法。
[本発明1005]
前記核酸がＲＮＡ、ＤＮＡ、またはその両方を含む、本発明1004の方法。
[本発明1006]
前記検出可能なシグナルを生成できる分子が、細胞の細胞質中で検出可能なシグナルを生成できるタンパク質をコードする核酸である、本発明1001〜1005のいずれかの方法。
[本発明1007]
前記検出可能なシグナルが蛍光である、本発明1001〜1006のいずれかの方法。
[本発明1008]
前記検出可能なシグナルが、前記細胞において通例発現される遺伝子のダウンレギュレーションである、本発明1001〜1006のいずれかの方法。
[本発明1009]
前記化学組成識別子が核酸バーコードである、本発明1001〜1008のいずれかの方法。
[本発明1010]
前記核酸バーコードをシーケンスすることで、前記送達用担体の化学組成が特定される、本発明1009の方法。
[本発明1011]
前記ヒト以外の哺乳動物が、蛍光タンパク質をコードする遺伝子内に終止コドンを有するように操作されたトランスジェニックマウスであり、前記検出可能なシグナルを生成できる分子が、前記遺伝子内の終止コドンを除去するヌクレアーゼまたはリコンビナーゼをコードする核酸である、本発明1001〜1010のいずれかの方法。
[本発明1012]
ハイスループットな方法である、本発明1001〜1011のいずれかの方法。
[本発明1013]
前記送達用担体中の脂質−アミン化合物、ＰＥＧのモル量、ＰＥＧの構造、およびコレステロールのモル量が、送達用担体によって異なる、本発明1001〜1012のいずれかの方法。
[本発明1014]
検出可能なシグナルの細胞内での生成を引き起こす送達用担体の指向性を特定する工程をさらに含む、本発明1001〜1013のいずれかの方法。
[本発明1015]
100種を超える異なる送達用担体製剤がアッセイされる、本発明1001〜1014のいずれかの方法。
[本発明1016]
250種を超える異なる送達用担体製剤がアッセイされる、本発明1001〜1014のいずれかの方法。
[本発明1017]
前記送達用担体がコンジュゲートである、本発明1001〜1016のいずれかの方法。
[本発明1018]
細胞質に送達された際に検出可能なシグナルを生成できる前記分子が、ｓｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｓｇＲＮＡ、ヌクレアーゼ、リコンビナーゼ、小分子、エピジェネティックモディファイヤー、またはこれらの組み合わせからなる群から選択される、本発明1001〜1017のいずれかの方法。
[本発明1016]
送達用担体と、核酸バーコードと、細胞の細胞質に送達された際に生物学的に活性となるレポーターと、を含む、組成物。
[本発明1017]
前記送達用担体が脂質ナノ粒子である、本発明1016の組成物。
[本発明1018]
前記レポーターが、ｓｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｓｇＲＮＡ、ヌクレアーゼ、リコンビナーゼ、小分子、エピジェネティックモディファイヤー、またはこれらの組み合わせからなる群から選択される、本発明1016または本発明1017の組成物。
[本発明1019]
前記送達用担体が脂質ナノ粒子を含む、本発明1016〜1018のいずれかの組成物。
[本発明1020]
前記送達用担体がコンジュゲートを含む、本発明1016〜1018のいずれかの組成物。
[本発明1021]
次式の核酸バーコード組成物であって、
Ｒ1−Ｒ2−Ｒ3−Ｒ4−Ｒ5−Ｒ6−Ｒ7−Ｒ8−Ｒ1、
式中、
Ｒ1は、ホスホロチオエート結合を有する1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10個のヌクレオチドを表し、
Ｒ2は第一のユニバーサルプライマー結合部位を表し、
Ｒ3はスペーサーを表し、
Ｒ4はプローブ結合部位を表し、
Ｒ5はランダムヌクレオチド配列を表し；
Ｒ6は核酸バーコード配列を表し、
Ｒ7はランダム核酸配列を表し；
Ｒ8は第二のユニバーサルプライマー結合部位を表す、
前記核酸バーコード組成物。
[本発明1022]
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：8に対し80％、85％、90％、95％、99％、または100％の配列同一性を含む、核酸バーコード。
[本発明1023]
本発明1021または本発明1022の核酸バーコードを含む、薬剤的に許容できる組成物。
１または複数の実施形態の詳細を添付の図面および下記の説明に記載する。本発明の他の特徴、目的、および利点は、説明および図面から、また特許請求の範囲から明らかとなる。
図１Ａ〜図１Ｈは、細胞質ｍＲＮＡ送達のハイスループット解析を示している。図１Ａおよび図１Ｂは、Ｃｒｅ ｍＲＮＡおよびＤＮＡバーコードを内包するように配合されたナノ粒子を示しており、これらが後にＣｒｅレポーター細胞株またはマウスに投与された。これらのレポーター細胞株において、Ｃｒｅ ｍＲＮＡが細胞質内に機能的に送達され、機能的タンパク質に翻訳された場合にのみ、細胞は蛍光性となる。これらのレポーターマウスにおいて、Ｃｒｅ ｍＲＮＡが細胞質内に機能的に送達され、機能的タンパク質に翻訳された場合にのみ、マウス内の細胞は蛍光性となる。Ｃｒｅに媒介される遺伝的変化を起こした細胞を、ＦＡＣＳを用いて単離し、ＤＮＡバーコードをシーケンスにかけて、前記ｍＲＮＡを送達したＬＮＰを特定した。図１Ｃは、ＬＮＰバーコードの、「正規化された送達率」によるランク付けを示しており；各サンプル（例えば、肺１ 対 心臓１）はデュアルインデックスを用いたシングルランで個々に解析した。図１Ｄ〜図１Ｅは、Ｃｒｅタンパク質への暴露後にＲＦＰを発現するＨＥＫ細胞における、ＧＦＰおよびＲＦＰの発現を示している。細胞は、Ｃｒｅ ｍＲＮＡ単独（図１Ｄ）またはＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）２０００（Ｌ２Ｋ）に内包されたＣｒｅ ｍＲＮＡ（図１Ｅ）で処理された。図１Ｆは、Ｃｒｅ ｍＲＮＡおよびＡｌｅｘａ−６４７標識ＤＮＡバーコードを内包するＬＮＰによる処理後の、Ａｌｅｘａ６４７およびＲＦＰの強度を示している。図１Ｇは、ＲＦＰ＋ＨＥＫ細胞が、Ｌ２Ｋに内包されたＣｒｅ ｍＲＮＡの投与量に応じていることを示している。図１Ｈは、１０ｎｇのトータルｍＲＮＡ、または１００ｎｇのトータルｍＲＮＡを投与後のＲＦＰ＋ＨＥＫ細胞からシーケンスされた、５４種のＬＮＰについての、正規化されたＤＮＡバーコード送達率を示している。図１Ｉは、細胞をエンドサイトーシス阻害剤で処理してから、５４種のＬＮＰ（１００ｎｇのトータルｍＲＮＡ）を投与した後の、ＲＦＰ＋ＨＥＫ細胞を示している。Ｎ＝３〜４ウェル／群。＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、両側ｔ検定。 同上。 同上。 同上。 図２Ａ〜図２Ｈは、インビボにおける細胞質ｍＲＮＡ送達のハイスループット解析を示している。図２Ａは、Ｃｒｅ ｍＲＮＡおよびＤＮＡバーコードを内包するように配合されたＬＮＰを示しており、これは後にＬｏｘＰ−Ｓｔｏｐ−ＬｏｘＰ−ｔｄＴｏｍａｔｏレポーターマウスに注射された。図２Ｂは、脂質−アミン化合物の構造を変化させて配合された１１２種のＬＮＰ、並びに前記化合物、ＰＥＧ、コレステロール、およびＤＯＰＥのモル比を示している。 図２Ｃは、１１２種のＬＮＰの動的光散乱解析を示しており、このライブラリーから、７１種が安定なＬＮＰを形成したため、含められた。図２Ｄは、ＬＮＰを静脈内注射した後の、腎臓および肺の内皮細胞（ＣＤ３１＋ＣＤ４５−）における、正規化されたＤＮＡ送達率、並びに筋肉内注射後に単離されたＣＤ４５＋細胞およびＣＤ４５−細胞を示している。 図２Ｅは、偏りのないユークリッドグループ化により作成された、インビボＬＮＰターゲティングのヒートマップを示している。 図２Ｆ〜図２Ｇは、段階的な第二のＬＮＰスクリーニングにおける、肺（図２Ｆ）および腎臓（図２Ｇ）の内皮細胞についての、濃縮解析を示している。図２Ｈは、３回全てのＬＮＰスクリーニングにおける、肺／腎臓内皮細胞送達の比を示している。 図３Ａ〜図３Ｉは、ＦＩＮＤによって発見されたリードナノ粒子の特性評価を示している。図３Ａは、３回のＦＩＮＤ後に発見された上位２つの粒子、ＡＴＬ１およびＡＴＬ２が、体内分布、ｓｉＲＮＡ、ｓｇＲＮＡ、ｍＲＮＡ、およびこれらの組み合わせの送達について、十分に特性評価されたことを示している。図３Ｂ〜図３Ｅは、ＡＴＬ１およびＡＴＬ２が、それぞれ、７Ｃ１化合物、コレステロール、Ｃ１４−ＰＥＧ２０００、および異なるヘルパー脂質、１８：１ Ｌｙｓｏ ＰＣおよびＤＯＰＥから構成されることを示している。図３Ｆは、ＡＴＬ１およびＡＴＬ２が、１ｍｇ／ｋｇのｓｉＩＣＡＭ２投与の後、各種臓器の内皮細胞において、ＩＣＡＭ２タンパク質のサイレンシングを誘導したことを示している。図３Ｇ〜図３Ｉは、ＡＴＬ１およびＡＴＬ２によって送達された１．５ｍｇ／ｋｇのｓｇＩＣＡＭ２ａおよびｓｇＩＣＡＭ２ｂの反復投与後に、複数の臓器から得られた内皮細胞において測定された、ＩＣＡＭ２タンパク質（図３Ｄ）およびインデル（図３Ｅ、図３Ｆ）を示している。図３Ｊは、ＡＴＬ１またはＡＴＬ２によって送達された１．５ｍｇ／ｋｇのＣｒｅ ｍＲＮＡ単回注射後の、ＬＳＬ−Ｔｏｍマウスの各種臓器におけるｔｄＴｏｍａｔｏ＋内皮細胞の割合を示している。 同上。 同上。 同上。 図３Ｋ〜図３Ｍは、１．５ｍｇ／ｋｇのＡＴＬ１−Ｃｒｅを注射後のＬＳＬ−Ｔｏｍ脾臓におけるｔｄＴｏｍａｔｏ＋細胞の代表的な画像を示している。図３Ｎは、１．５ｍｇ／ｋｇのＡＴＬ２−Ｃｒｅを３回注射後のＬＳＬ−Ｔｏｍ脾臓におけるｔｄＴｏｍａｔｏ＋細胞の代表的な画像を示している。 図３Ｏは、１．５ｍｇ／ｋｇのＡＴＬ２−Ｃｒｅを３回注射後のＬＳＬ−Ｔｏｍ肝臓におけるｔｄＴｏｍａｔｏ＋細胞の代表的な画像を示している。 図４Ａ〜図４Ｂは、ＬＮＰの選択規準を示している。図４Ｅは、ＤＮＡバーコードの設計を示しており（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）；ＤＮＡバーコードはエキソヌクレアーゼ活性およびＰＣＲバイアスを低減するように設計された。 同上。 図４Ｆ〜図４Ｇは、ＬｏｘＰ−ＧＦＰ−Ｓｔｏｐ−ＬｏｘＰ−ＲＦＰ ＨＥＫ細胞がＣｒｅ ｍＲＮＡ単独（−ｃｔｒｌ）（図４Ｆ）またはＬ２Ｋに内包されたＣｒｅ ｍＲＮＡ（図４Ｇ）でトランスフェクトされた７２時間後のＧＦＰおよびＲＦＰの発現を示している。 図４Ｈ〜図４Ｉは、細胞をＣｒｅ ｍＲＮＡ単独（−ｃｔｒｌ）（図４Ｉ）またはＬ２Ｋに内包されたＣｒｅ ｍＲＮＡ（図４Ｈ）でトランスフェクトした場合の、時間および用量に応じた、ＲＦＰ陽性細胞を示している。 図４Ｊ〜図４Ｌは、化合物７Ｃ１、化合物７８、および化合物９２に用いた合成を示している。エポキシドベース、アクリレートベース、およびメタクリレートベースの化学作用が選択された。 図４Ｐ〜図４Ｑは、インビトロスクリーニングにおけるＬＮＰのサイズ分布を示しており；２０〜２００ｎｍのＬＮＰを採用した。細胞を１０ｎｇ、１００ｎｇ、または１０００ｎｇのｍＲＮＡで処理した後の、ＲＦＰ＋細胞から得られた、正規化されたＤＮＡバーコード読み取りは、４％、２０％、および８０％のＲＦＰ＋細胞という結果となった。 図５Ａ〜図５Ｋは、化合物７Ｃ１、７８、および９２の組成を示している。様々なアルキル長とＰＥＩ６００、ＰＥＩ１２００、およびトリエチルテトラミンを反応させる、エポキシドベースおよびアクリレートベースの化学作用が選択された。 図５Ｌ〜図５Ｏは、濃縮の基準を示している。組織中の上位２０％のＬＮＰから得られた材料特性を、初期ライブラリー配合物によって示された材料特性で除算した。この濃縮基準は配合物の安定性およびインビボ成績の両方を包含する。 図５Ｐ〜図５Ｖは、第二のインビボ実験に使用されたＬＮＰライブラリー中の化合物の組成を示している。ＰＥＧアルキル長を変化させた。 図５Ｗ〜図５ＣＣは、第二のインビボ実験に使用されたＬＮＰライブラリー、第三のインビボ実験に使用されたＬＮＰライブラリー、中の化合物の組成を示している。ヘルパー脂質の種類を変化させた。 図５ＤＤ〜図５ＬＬは、スクリーニング１、２、および３における、選択された細胞型における、ＬＮＰ直径と正規化された数との間の相関を示している。 図６Ａおよび図６Ｂは、ｍＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、およびｓｇＲＮＡを内包しているＡＴＬ１（図６Ａ）およびＡＴＬ２（図６Ｂ）のＤＬＳスペクトルを示している。 図６Ｃおよび図６Ｄは、クロルプロマジン、ゲニステイン、およびＥＩＰＡの存在下における、ＡＴＬ１（図６Ｃ）およびＡＴＬ２（図６Ｄ）に内包された、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ−６４７バーコード取り込みの、エンドサイトーシスを示している。 図６Ｅおよび図６Ｆは、クロルプロマジン、ゲニステイン、およびＥＩＰＡの存在下における、ＡＴＬ１（図６Ｅ）およびＡＴＬ２（図６Ｆ）について、Ｃｒｅ ｍＲＮＡの送達を示している。 図６Ｇは、全組織エキソビボイメージングにより、肺、腎臓、脾臓、肝臓、および心臓において測定された、ＡＴＬ１およびＡＴＬ２の、バーコード−Ｃｙ５．５の体内分布を示している。図６Ｈは、組織質量に対して正規化されたＡＴＬ１およびＡＴＬ２の体内分布を示している。 図６Ｉは、ＡＴＬ１およびＡＴＬ２における、ＰＢＳまたは２ｍｇ／ｋｇのｓｉＧＦＰの投与の２４時間後および７２時間後のマウス体重の変化を示している。図６Ｊおよび図６Ｋは、ＰＢＳ、ＡＴＬ１（図６Ｊ）またはＡＴＬ２（図６Ｋ）の２ｍｇ／ｋｇ注射の７２時間後のマウスの臓器重量を％体重として示している。図６Ｌは、使用されたｓｉＩＣＡＭ２の配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）およびｓｉＧＦＰの配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）を示している。 同上。 図６Ｍは、使用されたｓｇＩＣＡＭ２ａの配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）およびｓｇＩＣＡＭ２ｂの配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）を示している。図６Ｎおよび図６Ｏは、ＡＴＬ１−ｓｇＩＣＡＭ２ａｂおよびＡＴＬ２−ｓｇＩＣＡＭ２ａｂまたはＰＢＳを複数回注射後の、経時的な体重を示している。 図６Ｐおよび図６Ｑは、１．５ｍｇ／ｋｇのＡＴＬ１−ｓｇＩＣＡＭ２ａｂまたはＡＴＬ２−ｓｇＩＣＡＭ２ａｂを３回注射後の、各ＩＣＡＭ２遺伝子座における、インデル形成を示している。 図６Ｒおよび図６Ｓは、１．５ｍｇ／ｋｇのＡＴＬ１− Ｃｒｅ ｍＲＮＡまたはＡＴＬ２−Ｃｒｅ ｍＲＮＡの１回注射後の、各種臓器における、ＣＤ３１＋細胞およびＣＤ４５＋細胞における、％ｔｄＴｏｍ＋細胞を示している。 図７は、コンジュゲートをベースとしたシステムを図示している。これらには、バーコードおよびレポーターを含有する、ペプチドベースのシステム（図７Ａ）、脂質ベースのシステム（図７Ｂ）、ｓｓＲＮＡベースのシステム（図７Ｃ）、ｄｓＲＮＡベースのシステム（図７Ｄ）、ｓｓＤＮＡベースのシステム（図７Ｅ）、ｄｓＤＮＡベースのシステム（図７Ｆ）、およびポリマーベースのシステム（図７Ｇ）が包含される。 図８Ａおよび図８Ｂは、ペプチドベースのシステムと脂質ベースのシステムの組み合わせを図示している。 図９は、前記レポーターが、前記コンジュゲートに接続されている（図９Ａ）、前記バーコードに接続されている（図９Ｂ）、前記コンジュゲートに埋め込まれている（図９Ｃ）、または前記バーコードに埋め込まれている（図９Ｄ）、システムを図示している。それぞれの場合で、前記レポーターは、共有結合性相互作用を介しても、または非共有結合性相互作用を介しても、接続または埋め込みが可能である。 図１０は、レポーターを前記コンジュゲートまたは前記バーコードに接続する例示来な相互作用を図示している。 図１１は、いかにしてレポーターシステムが細胞において解釈可能な変化を起こすことができるのかを図示している。 図１２Ａ〜図１２Ｅは、蛍光の増加（図１２Ａ）、蛍光の減少（図１２Ｂ）、細胞の物理的状態の変化（図１２Ｃ）、細胞の下流シグナル伝達の変化（図１２Ｄ）、または細胞のゲノム内へのバーコードの挿入（図１２Ｅ）を含む、いかにしてレポーターシステムが細胞において解釈可能な変化を起こすことができるのかを図示している。 同上。 図１３は、図１２Ａ〜図１２Ｆの全ての場合で、いかにして、異なる分子における変化によって、解釈可能な変化が引き起こされ得るかを図示している。図１３では、レポーター分子がＲＮＡ内のスプライシング変異を補正し、これが、図１２Ａ〜図１２Ｅで説明された変化に繋がる。 図１４Ａ〜図１４Ｈは、ナノ粒子送達の高感度読み取りを実現するように合理的に設計された、ＱＵＡＮＴバーコードを示している。図１４Ａは、ＱＵＡＮＴバーコードが、ユニバーサルプライマー部位と、８ヌクレオチドバーコード領域と、プローブ結合部位と、分断された半ランダム化領域とを含有することを示している。これらの設計により、ＤＮＡ二次構造が減少し、ＤＮＡポリメラーゼのアクセスが増加する。 図１４Ｂは、ハイスループットマイクロフルイディクスを用いて、バーコードを化学的に異なる脂質ナノ粒子中に配合できることを示している。 図１４Ｃは、多くの化学的に異なるバーコード付加された脂質ナノ粒子を、一緒にプールし、同時に投与できることを示している。ＤＮＡバーコードを抽出し、絶対送達（ｄｄＰＣＲ）および相対送達（ディープシーケンス）について定量化することができる。 図１４Ｄは、ＴＥ緩衝液で希釈された、ＱＵＡＮＴバーコードの検量線を示している。 図１４Ｅは、バーコードが、３００ｆＭの濃度で、バックグラウンドを上回って、特定可能であることを示している。＊＊ｐ＜０．０１、両側ｔ検定。 図１４Ｆは、インビトロ検量線を示しており；バーコードはＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００を用いて細胞に送達された２４時間後に定量化された。 図１４Ｇは、インビボナノ粒子送達後の細胞からＤＮＡを単離した直後の、そのサンプルを−２０℃で２０日間または３１日間保存した後の、ＱＵＡＮＴバーコードの読み取りを示している。各実験を異なるストック試薬を用いて実施することで、アッセイの再現性を示している。 図１５Ａ〜図１５Ｅは、蛍光に基づいたインビボ体内分布およびｄｄＰＣＲに基づいたインビボ体内分布の直接比較で明らかにされた、相違を示している。図１５Ａは、フルオロフォアを有する（または有さない）ＱＵＡＮＴバーコードをＬＮＰに含ませて配合し、静脈内注射した、模式的なワークフローを示している。５種類の組織を単離し、ＦＡＣＳで単離した１３種類の細胞型へのバーコード送達を、ＱＵＡＮＴまたは蛍光によって測定した。 図１５Ｂは、肝臓および肝臓以外の細胞型における、ＱＵＡＮＴまたは蛍光によって測定された累積的な体内分布を示している。＊＊ｐ＜０．０１、両側ｔ検定。 図１５Ｃ〜図１５Ｅは、ＱＵＡＮＴ（図１５Ｄ）および蛍光（図１５Ｅ）によって調べられた、５種類の組織内の累積的な体内分布を示している。肝臓送達の蛍光読み取りが過剰に多くなっている。図１５Ｆは、ＱＵＡＮＴおよび蛍光によって調べられた、１３種類の細胞型における、体内分布の比較を示している。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、両側ｔ検定。 図１６Ａ〜図１６Ｄは、ＱＵＡＮＴの体内分布がインビボ薬物動態研究においてより高感度であることを示している。図１６Ａは、フルオロフォアを有する（または有さない）ＱＵＡＮＴバーコードをＬＮＰに含ませて配合し、静脈内注射し、異なる時点で単離した、模式的なワークフローを示している。ナノ粒子分布をＱＵＡＮＴまたは蛍光を用いて測定した。図１６Ｂ〜図１６Ｆは、０．５ｍｇ／ｋｇの用量で、６４７−ＱＵＡＮＴバーコードまたはＱＵＡＮＴバーコードを内包するＬＮＰを投与後の、経時的な（時間）、各種細胞型における、相対的なナノ粒子の体内分布（任意の細胞型の最大シグナルに対して正規化）を示している。アステリスクは、ＰＢＳ処置マウスと有意差があったシグナルを表しており；蛍光と異なり、ＱＵＡＮＴでは、全ての時点で、全ての細胞型に対して、統計的な送達が測定された。図１６Ｇは、ＱＵＡＮＴまたは蛍光によって測定された曲線下面積の比較を示している。蛍光では、肺への送達が、１／３倍よりも下回って、過剰に低い評価となった。図１６Ｈは、ＱＵＡＮＴおよび蛍光によって測定された、ピークＤＮＡ送達（肝ＥＣに対して正規化）を示している。肺マクロファージでは、蛍光シグナルは検出されなかった。＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、両側ｔ検定。 図１７は、ＱＵＡＮＴの読み取りが、インビボ実験全体で、再現性が高いことを示している。別々の日に実施された２つの実験にわたって、１時間の時点および１．２５時間の時点から得られた、ＱＵＡＮＴの絶対数の、Ｒ２解析。 図１８Ａ〜図１８Ｊは、ハイスループットＱＵＡＮＴ試験で明らかとなった、インビボでの、カベオリン１による細胞型特異的な送達への影響を示している。図１８Ａは、ＱＵＡＮＴ ｄｄＰＣＲ読み取りを、ＤＮＡシーケンスと組み合わせることで、１００種を超えるＬＮＰによる絶対送達を、インビボにおいて１回で測定できることを示している、模式的なワークフローである。 図１８Ｂは、１２８種の種々のＬＮＰを含んだスクリーニング１から得られた、ナノ粒子の配合比および直径を示している。図１８Ｃは、全てのＬＮＰおよびバーコード単独（陰性対照）について、全ての細胞型における正規化された送達の平均値を示している。図１８Ｄは、スクリーニング１における、野生型マウスおよびＣａｖ１−／−マウスの内皮細胞に対するＬＮＰターゲティングのヒートマップを示している。ユークリッドクラスタリングを細胞型に対して実施して、デンドログラムを作成した。図１８Ｅは、スクリーニング１における、野生型マウスおよびＣａｖ１−／−マウスのマクロファージに対する相対的なナノ粒子送達のヒートマップを示している。ユークリッドクラスタリングを細胞型に対して実施して、デンドログラムを作成した。図１８Ｆは、Ｃａｖ１−／−マウスまたは野生型マウスから得られた内皮細胞における、２回のスクリーニング（２２０種超のＬＮＰ）にわたっての、正規化されたナノ粒子の体内分布を示している。＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．００１、片側ｔ検定。図１８Ｇは、Ｃａｖ１−／−マウスまたは野生型マウスから得られたクッパー細胞における、２回のスクリーニング（２２０種超のＬＮＰ）にわたっての、正規化されたナノ粒子の体内分布を示している。肺マクロファージおよび腎臓マクロファージが、カベオリンの減少による影響が少なかった。＊＊ｐ＜０．０１、片側ｔ検定。 図１８Ｈは、スクリーニング１における、野生型マウスの複数の組織から単離された内皮細胞における、ナノ粒子体内分布を示している。図１８Ｉは、スクリーニング１における、野生型マウスの複数の組織から単離されたマクロファージにおける、ナノ粒子体内分布を示している。図１８Ｊは、肝臓の３種の細胞型における、２回のスクリーニング（２２０種超のＬＮＰ）にわたっての、正規化されたナノ粒子体内分布の比較を示している。＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、一元配置分散分析。 図１９Ａ〜図１９Ｉは、高感度となるように合理的に設計されたＱＵＡＮＴバーコードを示している。図１９Ａは、ＱＵＡＮＴバーコードの設計（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）を示している。 図１９Ｂは、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）による非特異的増幅を回避するために試験されたプライマーの組み合わせを示している。様々なプライマー対を、バーコード鋳型なしで、マウスｇＤＮＡおよびヒトｇＤＮＡに添加した。 図１９Ｃおよび図１９Ｄは、二段階ＰＣＲが、イルミナ社シーケンス用に、イルミナ社製ｎｅｘｔｅｒａケミストリー領域、インデックス、およびイルミナ社製アダプターを付加し（図１９Ｃ）、クリアな産物を生成する（図１９Ｄ）ことを示している。 同上。 図１９Ｅは、６０℃のアニーリング温度、およびｄｄＰＣＲ標準プロトコル濃度よりも２倍多いプローブ濃度を用いて、ｄｄＰＣＲが最適化されたことを示している。 図１９Ｆは、プローブに基づいたシグナルの特異性を検証するために試験された、スクランブルされたプローブ部位を示している。スクランブルされたプローブ部位のヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２に表されており、正しいプローブ部位のヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３に表されている。 図１９Ｇは、蛍光標識ＱＵＡＮＴバーコードをＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００と共にｉＭＡＥＣにインビトロ投与した２４時間後の、フローサイトメトリーで解析された、Ａｌｅｘａ−６４７蛍光を示している。 図２０は、２００ｎｇ／ウェルおよび５０ｎｇ／ウェルにおいてのＡｌｅｘａ−４８８結合型バーコードおよびＡｌｅｘａ−６４７結合型バーコードの平均蛍光強度（ＭＦＩ）の比較を示している。＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．００１、両側ｔ検定。 図２１Ａは、スクリーニング２から得られた各ＬＮＰの正規化された平均送達率を示している。陰性対照であるバーコード単独は、予想通り、ＬＮＰに内包されたバーコードと比較して送達効率が低かった。図２１Ｂおよび図２１Ｃは、スクリーニング２から得られた、野生型マウスおよびＣａｖ１−／−マウスにおける相対的なナノ粒子送達率のヒートマップを示している。ユークリッドクラスタリングを細胞型に対して実施して、デンドログラムを作成した。 同上。 図２１Ｄ〜図２１Ｋは、野生型マウスおよびＣａｖ１−／−マウスの複数の臓器および細胞型から得られた、スクリーニング１（図２１Ｄ〜図２１Ｇ）およびスクリーニング２（図２１Ｈ〜図２１Ｋ）にわたっての、ナノ粒子分布を示している。 同上。 同上。 図２１Ｌおよび図２１Ｍは、内皮細胞（図２１Ｌ）、マクロファージ、およびクッパー細胞（図２１Ｍ）における、野生型マウスおよびＣａｖ１−／−マウスから得られた、スクリーニング２のナノ粒子体内分布を示している。＊＊ｐ＜０．０１、片側ｔ検定。 図２２Ａは、ｄｄＰＣＲデータとディープシーケンスデータを組み合わせて、同一実験で１００種を超えるＬＮＰの絶対送達を算出する方法を説明している、模式的なワークフローである。図２２Ｂおよび図２２Ｃは、スクリーニング１（図２２Ｂ）およびスクリーニング２（図２２Ｃ）から得られた、野生型マウスおよびＣａｖ１−／−マウスの肺内皮細胞における、各ＬＮＰのシーケンスデータおよびｄｄＰＣＲ結果の組み合わせを示している。図２２Ｄおよび図２２Ｅは、スクリーニング１（図２２Ｄ）およびスクリーニング２（図２２Ｅ）から得られた、野生型マウスおよびＣａｖ１−／−マウスの肺マクロファージにおける、各ＬＮＰのシーケンスデータおよびｄｄＰＣＲ結果の組み合わせを示している。 図２３Ａは、肺組織の代表的なＦＡＣＳゲーティングを示している。内皮細胞（ＣＤ３１＋ＣＤ４５−）およびマクロファージ（ＣＤ３１−ＣＤ４５＋ＣＤ１１ｂ＋）を単離した。 図２３Ｂは、肝組織の代表的なＦＡＣＳゲーティングを示している。内皮細胞（ＣＤ３１＋ＣＤ４５−）、クッパー細胞（ＣＤ３１−ＣＤ４５＋ＣＤ６８＋）、および肝細胞（ＣＤ３１−ＣＤ４５−ＣＤ６８−）を単離した。 同上。 図２４Ａは、リン酸ジエステル結合およびホスホロチオエート結合（ＰＳ）、並びに２’Ｏ−メチルリボヌクレオチド（Ｏｍｅ）を図示している。 図２４Ｂは、ＤＮＡ、Ｏｍｅと、リン酸ジエステル結合およびホスホロチオエート結合との組み合わせを含む、種々のバーコードアプローチを図示している。 図２４Ｃは、５Ｏｍｅおよび５ＰＳのバーコード、３Ｏｍｅおよび３ＰＳのバーコード、５ＰＳバーコード、３ＰＳバーコード、５Ｏｍｅバーコード、３Ｏｍｅバーコード、または修飾無しバーコードの安定性を示す棒グラフである。

Claims (26)

  1. インビボ薬剤送達のための送達用担体のインビボ特性評価法であって、
    （ａ）異なる化学組成を有する複数の送達用担体を配合する工程であって、各々異なる送達用担体は、対象の細胞の細胞質に送達された際に生物活性を発揮することにより検出可能なシグナルを生成できる分子と、前記送達用担体の化学組成を特定する化学組成識別子と、を含む、前記工程；
    （ｂ）前記複数の送達用担体をヒト以外の哺乳動物に投与する工程；
    （ｃ）前記検出可能なシグナルを生成しない細胞から前記検出可能なシグナルを生成する細胞を、前記ヒト以外の哺乳動物の複数の組織からソーティングする工程であって、前記検出可能なシグナルを生成する細胞は、組織型または細胞型を示す細胞表面タンパク質の有無に基づいたソーティングも行われる、前記工程；並びに
    （ｄ）前記検出可能なシグナルを生成するソーティング後細胞中の前記組成識別子を同定することにより、前記ソーティング後細胞中の送達用担体の化学組成を決定して、前記粒子の化学組成と前記粒子を含有する組織型または細胞型とを関連付ける工程、
    を含む、前記方法。
  2. 前記送達用担体が、所望により、送達される前記薬剤を搭載している、請求項１に記載の方法。
  3. 前記送達用担体が脂質ナノ粒子を含む、請求項１または請求項２に記載の方法。
  4. 前記薬剤が核酸である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
  5. 前記核酸がＲＮＡ、ＤＮＡ、またはその両方を含む、請求項４に記載の方法。
  6. 前記検出可能なシグナルを生成できる分子が、細胞の細胞質中で検出可能なシグナルを生成できるタンパク質をコードする核酸である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
  7. 前記検出可能なシグナルが蛍光である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
  8. 前記検出可能なシグナルが、前記細胞において通例発現される遺伝子のダウンレギュレーションである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
  9. 前記化学組成識別子が核酸バーコードである、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
  10. 前記核酸バーコードをシーケンスすることで、前記送達用担体の化学組成が特定される、請求項９に記載の方法。
  11. 前記ヒト以外の哺乳動物が、蛍光タンパク質をコードする遺伝子内に終止コドンを有するように操作されたトランスジェニックマウスであり、前記検出可能なシグナルを生成できる分子が、前記遺伝子内の終止コドンを除去するヌクレアーゼまたはリコンビナーゼをコードする核酸である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
  12. ハイスループットな方法である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
  13. 前記送達用担体中の脂質−アミン化合物、ＰＥＧのモル量、ＰＥＧの構造、およびコレステロールのモル量が、送達用担体によって異なる、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
  14. 検出可能なシグナルの細胞内での生成を引き起こす送達用担体の指向性を特定する工程をさらに含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
  15. １００種を超える異なる送達用担体製剤がアッセイされる、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
  16. ２５０種を超える異なる送達用担体製剤がアッセイされる、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
  17. 前記送達用担体がコンジュゲートである、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
  18. 細胞質に送達された際に検出可能なシグナルを生成できる前記分子が、ｓｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｓｇＲＮＡ、ヌクレアーゼ、リコンビナーゼ、小分子、エピジェネティックモディファイヤー、またはこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
  19. 送達用担体と、核酸バーコードと、細胞の細胞質に送達された際に生物学的に活性となるレポーターと、を含む、組成物。
  20. 前記送達用担体が脂質ナノ粒子である、請求項１６に記載の組成物。
  21. 前記レポーターが、ｓｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｓｇＲＮＡ、ヌクレアーゼ、リコンビナーゼ、小分子、エピジェネティックモディファイヤー、またはこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１６または請求項１７に記載の組成物。
  22. 前記送達用担体が脂質ナノ粒子を含む、請求項１６〜１８のいずれか一項に記載の組成物。
  23. 前記送達用担体がコンジュゲートを含む、請求項１６〜１８のいずれか一項に記載の組成物。
  24. 次式の核酸バーコード組成物であって、
    Ｒ１−Ｒ２−Ｒ３−Ｒ４−Ｒ５−Ｒ６−Ｒ７−Ｒ８−Ｒ１、
    式中、
    Ｒ１は、ホスホロチオエート結合を有する１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のヌクレオチドを表し、
    Ｒ２は第一のユニバーサルプライマー結合部位を表し、
    Ｒ３はスペーサーを表し、
    Ｒ４はプローブ結合部位を表し、
    Ｒ５はランダムヌクレオチド配列を表し；
    Ｒ６は核酸バーコード配列を表し、
    Ｒ７はランダム核酸配列を表し；
    Ｒ８は第二のユニバーサルプライマー結合部位を表す、
    前記核酸バーコード組成物。
  25. ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８に対し８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を含む、核酸バーコード。
  26. 請求項２１または請求項２２に記載の核酸バーコードを含む、薬剤的に許容できる組成物。
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