KR20180086264A - 세포로부터 인디케이터 신호를 얻는 방법 - Google Patents

세포로부터 인디케이터 신호를 얻는 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 유전자적으로 편집된 세포의 분야 및 나아가 유전자적으로 편집된 세포의 인디케이터 신호를 측정하는 것에 관련된다. 발명은 세포로부터 인디케이터 신호를 얻는 방법, 더 구체적으로는 세포의 생물학적 상태를 측정하는 방법에 관련된다. 나아가, 본 발명은 재생 세포 및 모니터링 목적으로 재생 세포 또는 특이적 인디케이터 폴리뉴클레오타이드의 사용에 관련된다. 또한, 본 발명의 방법을 수행하기 위한 시스템이 포함된다.

Description

세포로부터 인디케이터 신호를 얻는 방법
본 발명은 유전자적으로 편집된 세포의 분야 및 나아가 유전자적으로 편집된 세포의 인디케이터 신호를 측정하는 것에 관한 것이다. 본 발명은 세포로부터 인디케이터 신호를 얻는 방법에 관한 것으로, 더 구체적으로는 세포의 생물학적 상태를 측정하는 방법에 관한 것이다. 나아가, 본 발명은 재생 세포 및 모니터링 목적으로 재생세포 또는 특이적 인디케이터 폴리뉴클레오타이드의 사용에 관한 것이다. 또한, 본 발명의 방법을 수행하기 위한 시스템이 포함된다.
표적화된 유전자 편집/엔지니어링은 예컨대 유전자를 결실 또는 첨가하기 위한, 엑손을 제거 또는 삽입하기 위한 또는 점 돌연변이를 도입하거나 교정하기 위한 매우 중요한 도구이다. 기술분야에는 여러 유형의 유전자 편집 기법이 있다. 예를 들면, Urnov 등은 ZFN을 사용함으로써 IL2Rγ 유전자의 돌연변이를 교정하였다(Urnov et al. 2005, Nature 435: 646-651). TALLEN 또는 Crisp/cas 기법은 예컨대 Hockemeyer 등과 Sander 및 Joung에 의해 사용되었다(Hockemeyer et al. 2012, Nat Biotechnol 29(8): 731-734; Hockemeyer et al. 2009, Nat Biotechnol 27(9): 851-857, Sander and Joung, 2014, Nature Biotechnology 32, 347-355). 나아가, 특이적인 표적화 유전자 변형을 가진 상이한 세포 유형에 대한 연구들이 최근 수년 동안 공개되었다. 예를 들어 Hockemeyer 등은 인간 배아 줄기 세포(hESC)의 게놈의 시험관내 변형을 위한 유전자 표적화를 기술하였고 만능 줄기 세포(iPSC)를 유도하였다(Hockemeyer et al. 2012, Nat Biotechnol 29(8): 731-734; Hockemeyer et al. 2009, Nat Biotechnol 27(9): 851-857).
세포의 유전자 편집은 상기 편집에 의해 유발된 분자 변화를 검출할 필요를 야기한다. 종래의 DNA/RNA/단백질 서열분석 및 블롯팅 방법이 특이적 단백질, RNA 또는 DNA 함량의 변화를 측정하기 위해 사용되어 왔고, 다양한 PCR 기법 및 면역조직화학이 또한 분자 변화를 관찰하는 데 매우 유용하였다. 바이오센서로서 내인성 분자를 유전자 편집을 통해 변환시키는 것은 세포의 생화학적 과정들을 모니터링하는 가능성을 확장시켜 주었고 자극에 대한 생물학적 시스템의 반응들을 측정하는 새로운 시대를 열어주었다.
그러나 여전히, 내부 및 외부 자극에 대해 세포 및 조직 단위의 생물학적 반응의 바이탈 척도의 맥락에서 세포의 분자적 변화를 측정하기 위한 보다 간단하고, 저렴하며, 고도로 민감한 최적의 방법에 대한 큰 필요성이 존재한다.
본 발명의 목적은 유전자적으로 편집된 세포를 예시한 후 특이적 인디케이터 신호 및/또는 그것의 상기 세포 외부에서의, 예컨대 대상체의 피부에서의 변화를 모니터링하기 위한 간단하고, 매우 민감하며 특이적인 방법을 제공하는 것이다. 달리 말하면, 변형된 재생 다능 세포(예컨대 피부 유래 재생 세포)에 의해 생성된 인디케이터 신호는 본 발명의 방법에 의해 대상체의 피부에서 모니터링될 수 있다. 발명의 목적은 독립적인 청구범위들에서 명시되는 것을 특징으로 하는 방법 및 배열에 의해 이루어진다. 발명의 바람직한 구체예들이 종속되는 청구범위에서 개시된다.
발명은 세포 과정 및 그것의 변화가 본 발명의 방법을 사용할 때 생체외에서 모니터링될 수 있다는 인식을 기반으로 한다. 본 발명은 생체편집된 유전자, 단백질 또는 세포의 대사물에 의해 생성된 인디케이터 신호의 비-침습성 모니터링을 주어진 생물학적 과정의 실시간 모니터링을 허용하는 방식으로 활용한다. 발명은, 신체 기능의 일차 측정 기준으로서 주로 물리적인, 인공적인 기술적 기계를 사용하는 대신, 주어진 생물학적으로 관련된 과정(예컨대 글루코오스 대사)에 대한 세포의 측정 능력을 사용한다. 본 발명은 규정된 생물학적 과정 및 그것의 변화를 가리키는 분자들에 의해 강조된 특이적인 생물학적 변화를 나타내기 위해 세포가 생체외에서 또는 시험관내에서 유전자적으로 편집되는, 방법 단계들의 조합을 활용한다. 바이오인디케이터가 묘사하는 과정의 모니터링도 역시 본 발명에 의해 세포 외부에서 수행된다.
발명은 인디케이터를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열이 세포의 DNA 안으로 삽입되고 인디케이터의 폴리뉴클레오타이드가 특이적 표적 폴리뉴클레오타이드와 함께 발현되는 연구를 기반으로 한다. 인디케이터 폴리뉴클레오타이드와 함께 삽입될 표적 폴리뉴클레오타이드는 관심의 분석물의 존재 또는 부재에 대한 반응으로 발현되는 능력을 기반으로 선택되었다. 달리 말하면 본 발명은 특이적 유전자의 발현이 특이적 분석물 또는 물리적 또는 격렬한 자극에 대해 반응하는 상황을 탐색한다. 그러므로, 세포에서 항상성에 영향을 주는 인자들에 대한 규정된 반응의 변화는 인디케이터에 의해 생성된 편집된 신호를 모니터링함으로써 연구될 수 있다. 나아가, 만약 여러 상이한 인디케이터 폴리뉴클레오타이드가 세포의 DNA 안으로 삽입되면, 하나 이상의 분석물 또는 자극이 동시에 모니터링될 수 있다.
본 발명은 특이적 유형의 세포(예컨대 피부 유래 재생 세포)의 모니터링을 위한 도구를 제공한다.
본 발명은 세포의 외부로부터의 실시간 모니터링에 의해 세포의 분자 변화를 연구하기 위한 특이적 방법의 결핍과 관련된 문제를 해결한다. 나아가, 본 발명은 세포의 분자 변화 또는 상태를 연구하기 위한 도구 및 조건을 제공한다.
본 발명은 세포 상태를 측정하기 위한 유동적이고, 간단하며, 저렴하고, 편리하며, 효율적이고, 특이적이며, 민감하고 믿을 수 있는 방법을 제공한다.
본 발명의 방법은 분자 생물학에서 추가의 개선을 가능하게 하고 환경에 대해 생명 시스템이 응답하는 방법을 측정하는 것을 가능하게 한다. 나아가, 본 발명은 특이적 세포들의 변화를 이해하고 세포의 및 세포 사이의 매우 특이적인 변화들을 측정하는 것을 돕는다.
본 발명은 또한 대상체의 세포 생물학적 사건을 측정하는 더 개인화된 방법을 제공하며 그것은 각 개인이 유전자 구성에서 독특하다는 사실을 기반으로 한다. 그러므로 혁신은 또한 개인화된 수준에서 생체 모니터링하기 위한 기술을 제공한다. 실시간 모니터링은, 모니터링이 비-수술적으로 발생하고 예컨대 환자의 피부 가장자리에서 일어날 수 있기 때문에, 모든 시간과 장소에서 계속될 수 있다. 실제로 건강한 또는 병든 환자는 축적된 바이오 인디케이터 결과를 획득하고 따르기 위하여 훈련된 전문가 없이 모니터링을 쉽게 관리할 수 있다.
사람들이 그들의 특이적인 생리적 상태를 계속해서 모니터링할 수 있다면, 더 심각한 장애의 발달이 감소될 수 있고 병원 또는 진료소를 방문할 필요성을 피할 수 있다. 가장 최상의 경우에 질환은 발명에 의해 제공된 생체 자기 제어로 인해 총체적으로 예방될 수 있다. 실제로, 본 발명은 또한 종래 진단에 대해 사용된 방법에 비교하여 예견력 및 조기 개입을 가능하게 한다.
본 발명은, 예컨대 치료법, 의학적 처치, 식습관, 라이프 스타일, 무드 또는 삶의 일상적인 방식 요소들의 계획에 사용될 수 있는, 결과를 얻기 위한 힘들고, 느리며 고비용의 방법의 한계점을 극복하는 방법을 제공한다.
한 측면으로, 본 발명은 세포로부터 인디케이터 신호를 얻기 위한 방법에 관련되며, 상기 방법은
대상체로부터 얻어진 재생 세포를 제공하는 단계,
인디케이터를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 재생 세포의 DNA 안으로 삽입함으로써 재생 세포를 변형시키는 단계로서, 인디케이터를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열은 상기 재생 세포에서 표적 폴리뉴클레오타이드와 함께 발현되는 단계,
변형된 재생 세포를 대상체에게 투여하는 단계,
인디케이터의 신호 또는 그것의 부재를 대상체의 피부에서 모니터링함으로써, 표적 폴리뉴클레오타이드의 발현과 관련된 인디케이터 신호를 얻는 단계를 포함한다.
한 측면으로, 본 발명은 세포의 생물학적 상태를 측정하는 방법에 관련되며, 상기 방법은
대상체로부터 얻어진 재생 세포를 제공하는 단계,
인디케이터를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 재생 세포의 DNA 안으로 삽입함으로써 재생 세포를 변형시키는 단계로서, 인디케이터를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열은 상기 재생 세포에서 표적 폴리뉴클레오타이드와 함께 발현되는 단계,
변형된 재생 세포를 대상체에게 투여하는 단계,
표적 폴리뉴클레오타이드의 발현과 관련된 인디케이터의 신호 또는 상기 인디케이터 신호의 부재를 대상체의 피부에서 모니터링하는 단계, 및
표적 폴리뉴클레오타이드의 발현에 의해 규정된 세포의 생물학적 상태를 측정하는 단계를 포함한다.
나아가, 한 측면으로, 본 발명은 표적 폴리뉴클레오타이드의 발현과 관련된 인디케이터 신호를 모니터링하기 위해 대상체로부터 얻어지고 표적 폴리뉴클레오타이드와 함께 발현될 인디케이터의 삽입된 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하도록 변형된 재생 세포의 사용에 관련되며, 여기서 모니터링은 대상체의 피부에서 수행된다.
나아가, 한 측면으로, 본 발명은 세포의 외부로부터 표적 폴리뉴클레오타이드의 발현과 관련된 인디케이터 신호를 모니터링하기 위해 대상체로부터 얻어지고 표적 폴리뉴클레오타이드와 함께 발현될 인디케이터의 삽입된 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하도록 변형된 피부 유래 재생 세포의 사용에 관련된다.
나아가, 한 측면으로, 본 발명은 대상체의 피부에서 표적 폴리뉴클레오타이드의 발현과 관련된 인디케이터 신호를 선택적으로 측정하기 위해 대상체로부터 얻어지고 표적 폴리뉴클레오타이드와 함께 발현될 인디케이터를 암호화하는 삽입된 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재생 세포에 관련된다.
또한 추가의 측면으로, 본 발명은 대상체의 피부에서 모니터링될 인디케이터 신호를 얻는 데 사용하기 위한 표적 폴리뉴클레오타이드와 함께 발현될 인디케이터를 암호화하는 삽입된 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 유전자적으로 변형된 재생 세포에 관련된다.
또한, 한 측면으로, 본 발명은 세포의 분석물을 측정하기 위한, 인디케이터를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드의 사용에 관련되는데, 그 폴리뉴클레오타이드는 재생 세포의 표적 폴리뉴클레오타이드로 삽입되고 폴리뉴클레오타이드는 표적 폴리뉴클레오타이드와 함께 발현되며, 여기서 분석물은 표적 폴리뉴클레오타이드의 발현을 제어할 수 있다.
또한, 추가의 측면으로, 본 발명은 필요로 하는 대상체의 생물학적 상태를 측정하는 방법에 관련되며, 상기 방법은
대상체로부터 재생 세포를 얻는 단계,
인디케이터를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 재생 세포의 DNA 안으로 삽입함으로써 재생 세포를 변형시키는 단계로서, 인디케이터를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열은 상기 재생 세포에서 표적 폴리뉴클레오타이드와 함께 발현될 단계,
변형된 재생 세포를 대상체에게 투여하는 단계,
표적 폴리뉴클레오타이드의 발현과 관련된 인디케이터의 신호 또는 상기 인디케이터 신호의 부재를 대상체의 피부에서 모니터링하는 단계, 및
표적 폴리뉴클레오타이드의 발현에 의해 규정된 대상체의 생물학적 상태를 측정하는 단계를 포함한다.
또한 추가의, 한 측면으로, 본 발명은 세포로부터 인디케이터 신호를 얻는 방법에 관련되며, 상기 방법은
대상체로부터 재생 세포를 얻는 단계,
인디케이터를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 재생 세포의 DNA 안으로 삽입함으로써 재생 세포를 변형시키는 단계로서, 인디케이터를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열은 상기 재생 세포에서 표적 폴리뉴클레오타이드와 함께 발현될 단계,
변형된 재생 세포를 대상체에게 투여하는 단계, 및
인디케이터의 신호 또는 그것의 부재를 대상체의 피부에서 모니터링함으로써, 표적 폴리뉴클레오타이드의 발현과 관련된 인디케이터 신호를 얻는 단계를 포함한다.
또한, 추가의 측면으로, 본 발명은
인디케이터를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 재생 세포의 DNA 안으로 삽입함으로써 재생 세포를 변형시키기 위한 수단, 여기서 인디케이터를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열은 상기 재생 세포에서 표적 폴리뉴클레오타이드와 함께 발현될 것이며,
대상체의 피부에 또는 대상체 안으로 변형된 세포를 적용시키기 위한 수단, 및
대상체의 피부에서 인디케이터의 신호 또는 그것의 부재를 모니터링하기 위한 수단을 포함하는 시스템에 관련된다.
다음에 발명은 첨부된 [수반되는] 도면을 참조로 바람직한 구체예들에 의해 더욱 상세하게 기술될 것이다.
도 1은 실리콘 챔버를 사용하는 피부 줄기 세포의 이종이식을 도시한다.
도 2는 WT 수령 마우스의 등에서 GFP 피부 이식편(전체 피부)을 도시한다.
도 3은 GFP 및 야생형(WT) 마우스의 피부 모두의 형광 스펙트럼을 도시한다.
도 4는 초분광 카메라(광원, 필터 및 다중색 이미지 센서) 및 OU Olympus 현미경으로 취한 녹색 형광 단백질(GFP) 마우스 피부의 이미지 및 스펙트럼을 도시한다. 도 4는 본 발명의 방법이 피부에서 인디케이터 신호를 얻기에 적합한 것을 드러낸다.
도 5는 본 발명의 방법에 의해 피부로부터 얻어진 인디케이터 신호의 이미지 및 스펙트럼을 도시한다. 염료가 있는 면적으로부터의 선명한 형광 신호가 형광 염료가 없는 면적과 비교되었다(A). 도 5는 본 발명의 방법이 대상체의 피부에서 인디케이터 신호를 얻기에 적합한 것을 드러낸다. 이미지는 GFP-유래 형광을 모니터링하기 위하여 OU Olympus 현미경 및 카메라를 사용하여 얻어졌다(B).
도 6은 본 발명에 대한 가능한 측정 셋업의 예를 도시한다.
도 7은 손목 기구에 장착된 측정의 예를 도시한다.
도 8은 본 발명에 적합한 셋업 A) 및 B)를 개략적으로 도시한다. A) 모니터링 수단은 광기계식 부품들, 렌즈 필터 및 다른 부품들로 구성되었다. 형광 표적을 비추기 위하여 적절한 필터를 가진 Led 또는 백색-광원이 사용되었다. 카메라는 검출을 위해 사용되었다. 형광(예컨대 글루코오스-유도된)은 이 셋업으로 측정되었고 필요한 검출 한계 및 강도 변화 규모가 테스트되었다. B) LED가 적절한 파장에 대해 선택되었고 조명 면적이 규정되었다. 작은 센서, CCD-카메라/열(row) 검출기 또는 단일 검출기가 선택되었고, 필요한 전자 회로 및 판독기용 기계 마운트가 얻어졌다. 신호 획득은 PC 데이터 획득 카드를 기반으로 하였고, 신호 처리는 임의의 적절한 프로그래밍 언어(예컨대 Labview)로 이루어졌다.
도 9는 (A) 칼크레인(kalkrein) 6, (B) Sprr1b 및 (C) Pyhin 1을 암호화하는 상이한 폴리펩타이드들에 대한 정량적 PCR(QPCR) 및 RNA 서열분석 결과를 도시한다.
도 10은 글루코오스 주입에 의해 유의미하게 변화된(최소 1.5배) 피부 조직 단백질을 도시한다.
본 발명에서 세포 과정들과 관련된 특이적인 인디케이터는 재생 세포로부터 실시간으로 모니터링될 수 있다. 아이디어는 표적 세포에서 인디케이터를 사용하고 주어진 생물학적 반응을 모니터링 및 제어 목적으로 신호를 예컨대 수치로 변환시키는 피부-부착된 디바이스로 그 인디케이터가 전송하도록 하는 것이다. 세포-수준 인디케이터는 주어진 생물학적 또는 환경적 자극의 반응으로서 활성화되고(즉, 특이적 분석물 또는 에너지가 표적 폴리뉴클레오타이드의 발현을 유발하고 동시에 또한 인디케이터 폴리뉴클레오타이드의 발현을 유발함), 자극이 종료될 때 하향조절되거나 완전하게 비활성화된다. 인디케이터는 민감한 바이탈 바이오센서로서 세포를 생성하기 위하여 재생 세포로 표적화된다. 재생 세포는 도너 또는 또 다른 대상체의 세포의 일부가 된다. 특정 구체예에서, 변형된 재생 세포는 피부를 재생시키는 기저 세포층의 일부가 되고, 그로써 대상체 또는 환자의 평생을 통해 인디케이터 및 센서로서 작용한다. 세포는 또한 작은 분자 유도된 메커니즘을 통해 근절될 수 있다. 유전자 편집된 재생 세포 내에서 생물학적 인디케이터 신호는 생체모니터링에서 실제-유형 및 바이탈 바이오센서로서 작용하는 측정 가능한 신호로 변환된다.
본 발명에 의해 감각 메커니즘이 하나 이상의 살아있는 세포 안으로 삽입되고 역동적인 양상으로 세포(들)의 생물학적 상태를 측정하는 것이 가능하다. 본원에서 사용되는 "생물학적 상태"는 세포의 임의의 상태를 나타내고, 항상성의 유지 또는 상실과 관련된 특정 분석물 또는 과정의 양, 존재, 부재 또는 활성에 의해 규정된다.
본원에서 사용되는 용어 "또는"은 "및"과 "또는"(즉 "및/또는") 둘 다의 의미를 가진다. 나아가, 단일형태의 명사의 의미는 복수의 명사의 의미를 포함하고 그러므로 단일 용어는, 다르게 명시되지 않는 한, 또한 그것의 복수의 형태의 의미를 가진다. 달리 말하면, 하나를 나타내는 용어는 하나 이상을 의미할 수 있다.
세포
본 발명에 따라 유전자적으로 편집될 세포는 체세포성 재생 세포와 같은 재생 세포이다. 본원에서 사용되는 "재생 세포"는 자체적으로 재생되고 분화할 수 있는 세포를 나타낸다. 발명의 한 구체예에서, 재생 세포는 체세포 줄기 세포(즉 그것들이 발견되는 조직을 유지하고 수복할 수 있는 세포), 예컨대 골수, 지방 조직, 혈액, 상피, 내피 및/또는 간엽조직(mesenchyme)의 세포들로 구성되는 군으로부터 선택된다. 발명의 재생 세포는 한정하는 것은 아니지만, 다능 줄기 세포(많은 세포 유형으로 분화할 수 있을뿐 아니라, 밀접하게 관련된 세포 과(family)의 세포들), 소능(oligopotent) 줄기 세포(림프구 또는 골수성 줄기 세포와 같은 단지 소수의 세포 유형으로 분화할 수 있음) 및/또는 단분화능 줄기 세포(오직 하나의 세포 유형, 그 자신을 생성할 수 있지만, 자체-재생하는 특성을 가짐, 비-줄기 세포와 구별됨)를 포함한다. 본 발명의 재생 세포는 또한 드물고 일반적으로 수가 적으며, 예컨대 골수에 존재하는 만능 성인 줄기 세포를 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "유전자적으로 편집된 세포" 및 "유전자적으로 변형된 세포"는 상호교환적이다.
발명의 한 구체예에서, 재생 세포는 피부 유래 재생 세포, 혈액 유래 재생 세포 및 iPS 세포로 구성되는 군으로부터 선택된다.
발명의 한 구체예에서, 재생 세포는 예컨대 그것들의 분화된 전구세포에서 유도된 만능 줄기 세포(iPSC)이다. 본원에서 사용되는 용어 "유도된 만능 줄기 세포"(iPSC)는 분화된 세포로부터, 전형적으로 섬유모세포와 같은 성인 체세포로부터 발달상의 리프로그래밍에 의해 생성된 만능 줄기 세포를 나타낸다. 그러한 세포는 예컨대 WO 2008/151058 및 US 2008/076176에 기술되어 있다.
발명의 한 구체예에서, 재생 세포는 배아 줄기 세포 또는 배아 줄기 세포 유래 세포이다. 배아 줄기 세포(ESC)는 광범위한 상이한 세포 유형, 예컨대 내피 세포로 분화하는 능력을 가진 만능 세포이다. 배아 줄기 세포를 얻는 방법은 기술분야에서 쉽게 이용할 수 있다. 또한, WO 2007/130664는 도너 배아를 손상시키지 않으면서 인간 배아 줄기 세포를 얻기 위한, 분할세포 생검으로 불리는 유망한 새로운 접근법을 개시한다.
발명의 다른 구체예에서, 재생세포는 피부 유래 재생 세포, 즉 피부로부터 얻어진 재생 세포이다. 본원에서 사용되는 "피부 유래 재생 세포"는 피부로부터 얻어지고 자체-재생되며 다중 계통으로 분화할 수 있는 세포를 말한다. 더 구체적인 구체예에서, 피부 유래 재생 세포는 피부의 기저층으로부터 또는 땀샘 또는 모낭으로부터 유래된다. 피부는 성인의 생애를 통해 끊임없이 자체 재생하고, 모낭은 성장과 퇴보의 끊임없는 사이클을 진행한다. 표피에 상주하는 줄기 세포 및 모낭은 성인 피부 항상성 및 모발 재생의 유지를 보장하지만, 또한 손상 후 표피의 수복에도 참여한다.
성인에서, 상이한 유형의 줄기 세포들은 정상적인 항상성 또는 상처 수복을 진행하는 것처럼 피부에서 다양한 세포 유형을 보충하는 기능을 한다. 일부 줄기 세포(예컨대 멜라닌모세포 및 표피 줄기 세포)는 피부 자체 내에 상주한다. 성숙한 표피는 그것의 최외각층이 피부 표면인 중층 편평 상피이다. 유일하게 최내각(기저)층만이 유사분열적으로 활성이다. 기저층은 세포외 기질을 생성하고, 분비하며, 조립하는데, 그것은 진피로부터 표피를 분리시키는 밑에 있는 기저막의 대부분을 구성한다. 세포가 기저층을 떠나 피부 표면을 향해 바깥쪽으로 이동함에 따라, 세포는 세포 사이클로부터 철수되고 말단 분화 프로그램을 실행하게 된다. 가시층 및 과립층을 생성하는 초기 단계에서, 프로그램은 전사적으로 활성이다. 그러나, 피부 표면으로부터 벗겨지는 각질층(비늘모양)의 죽은 평평해진 세포의 생성이 축적되고, 계속해서 바깥쪽으로 이동하는 내부 세포에 의해 대체된다(Blanpain C and Fuchs E, 2006, Annu Rev Cell Dev Biol 22: 339-373).
발명의 특정 구체예에서, 피부 유래 재생 세포는 표피 줄기 세포 또는 모낭의 줄기 세포이다. 이 줄기 세포들은 모든 줄기 세포에 공통적인 2개의 필수 특징을 가진다. 그것들은 연장된 기간 동안 자체-재생될 수 있고, 그것들의 조직 기원으로부터 유래된 다중 계통으로 분화할 수 있다(Weissman IL et al. 2001, Annu Rev Cell Dev Biol. 17:387-403, Blanpain C and Fuchs E, 2006, Annu Rev Cell Dev Biol 22: 339-373). 발명의 또 다른 특정 구체예에서, 피부 유래 재생 세포는 케라틴 생성세포이다. 케라틴 생성세포는 피부의 최외각층인 표피에서 우세한 세포 유형으로, 그곳에서 발견되는 세포의 90%를 구성한다. 피부의 기저층에서 발견된 이 케라틴 생성세포들은 때로 "기저 세포" 또는 "기저 케라틴 생성세포"로 언급된다.
발명의 한 구체예에서, 재생 세포는 혈액 유래 재생 세포, 즉 혈액으로부터 얻어진 재생 세포이다.
특정 구체예에서, 변형되고 모니터링될 세포는 일차 재생 세포(예컨대 일차 표피 줄기 세포)이다. 본원에서 사용된 "일차 세포"는 많은 집단 배가를 진행하지 않고 그로써 생체내에서 세포의 생리적 상태를 밀접하게 나타내며 생명 시스템을 나타내는 관련 데이터를 생성하는 세포를 나타낸다. 일차 세포는 살아있는 조직으로부터 직접 취해지며 시험관내에서의 배양을 위해 수립된다. 일차 세포는 예컨대 종양 또는 불멸화된 세포주가 아니다.
발명의 다른 구체예에서, 변형되고 모니터링될 세포는 일차 재생 세포가 아니다.
특정 구체예에서, 발명의 방법은 추가로 재생 세포를 배양하는 단계를 포함한다. 세포는 생체외 또는 시험관내 배양 조건에서 배양될 수 있다.
발명의 방법에 사용된 세포는 대상체로부터 얻어진다. 대상체는 인간 또는 동물 대상체로부터 선택될 수 있다. 특정 구체예에서, 유전자 변형을 위한 세포는 인간 또는 동물 세포이다. 바람직한 동물 세포는 한정하는 것은 아니지만 침팬지 및 다른 유인원 및 원숭이 종과 같은 비인간 영장류; 조류; 가금류, 소, 양, 돼지, 염소 및 말과 같은 가축; 사육조, 개 및 고양이와 같은 가정용 포유류; 마우스와 같은 설치류, 래트, 토끼, 기니아 피그 등을 포함한 실험실 동물의 세포를 포함한다. 매우 특정한 구체예에서, 대상체는 인간이다(예컨대 아동(0세부터 18세까지의 연령) 또는 성인(18세로부터 시작하는 연령)). 대상체는 인간 또는 동물 대상체로부터 선택될 수 있고, 단 만약 인간 배아 줄기(hES) 세포가 사용된다면, 방법은 인간 배아의 깨짐을 포함하지 않는다.
발명의 한 구체예에서, 대상체로부터 얻어진 재생 세포는 표적 폴리뉴클레오타이드와 함께 발현될 인디케이터를 암호화하는 삽입된 폴리뉴클레오타이드와 나아가 인디케이터 신호를 포함한다. 특정 구체예에서, 세포는 세포 외부로부터 또는 대상체의 피부에서 표적 폴리뉴클레오타이의 발현과 관련된 신호를 측정함으로써 인디케이터 신호를 모니터링하기 위한 것이다.
일부 구체예에서, 변형되고 모니터링될 재생 세포는 세포가 투여될 수령 대상체와 이종성인 대상체로부터 얻어질 수 있다. 그러나, 바람직한 구체예에서, 변형되고 모니터링될 재생 세포는 세포가 투여될 수령 대상체에 대해 동종성인(즉 동종이계의), 더 바람직하게는 자생적인 대상체로부터 얻어진다. 따라서, 변형된 재생 세포가 투여될 적합한 대상체는 변형되고 모니터링될 적합한 동물 세포와 연계하여 상기 개시된 대상체들을 포함한다.
폴리뉴클레오타이드 표적화
폴리뉴클레오타이드 표적화(즉 유전자 표적화)는 특정 내인성 폴리펩타이드에 대해 원하는 변화를 표적으로 하기 위해 상동성 재조합을 사용한다. 폴리뉴클레오타이드 표적화의 성공은 징크 핑거 뉴클레아제, 엔지니어링된 호우밍 엔도뉴클레아제, 전사 활성화제-유사 이펙터 뉴클레아제 또는 CRISPR과 같은 엔지니어링된 뉴클레아제의 사용으로 향상될 수 있다. 엔지니어링된 뉴클레아제는 또한 유전자 녹아웃을 생성하는 내인성 유전자에서의 돌연변이를 도입할 수 있다.
본 발명에서 폴리뉴클레오타이드 표적화는 인디케이터 폴리뉴클레오타이드를 표적 폴리뉴클레오타이드에 삽입하기 위해 사용된다. 폴리뉴클레오타이드 표적화는 영구적이거나 또는 조건부일 수 있다. 발명의 특정 구체예에서, 폴리뉴클레오타이드 표적화는 영구적이다. 폴리뉴클레오타이드 표적화는 관심의 각 표적 폴리뉴클레오타이드에 대한 특이적 벡터의 생성을 필요로 한다. 그러나, 벡터는 전사 활성 또는 크기와 관계없이, 임의의 인디케이터 폴리뉴클레오타이드에 대해 사용될 수 있다. 용어 "벡터"는 세포를 형질도입시키고, 그로써 세포가 세포에 대해 천연인 것들 이외의, 또는 세포에 대해 천연이 아닌 방식으로 폴리뉴클레오타이드 및/또는 폴리펩타이드를 발현하도록 유도하는 핵산 화합물 및/또는 조성물을 나타낸다. 일반적으로, DNA로 만들어진 표적화 구성물은 박테리아에서 생성된다. 구성물은 전형적으로 표적화될 폴리뉴클레오타이드의 일부 및 인디케이터 폴리뉴클레오타이드, 또한 선택적으로 선택 가능한 마커를 함유한다. 생체외 또는 시험관내 세포의 DNA에 대해 특이적 폴리뉴클레오타이드를 표적으로 하기 위해 폴리뉴클레오타이드 표적화 구성물은 배양중의 세포에 삽입된다. 정확히 삽입된 세포가 마커를 기반으로 선택될 수 있다.
폴리뉴클레오타이드 표적화는 기술분야에 잘 알려져 있는 임의의 방법 또는 기법에 의해 수행될 수 있다. 유전자 표적화 방법은 실험실 분자 기법을 기술하는 다양한 실제 매뉴얼에서 기술된다. 기술분야의 숙련자는 이 방법들을 언제 어떻게 사용하는지 안다.
발명의 폴리뉴클레오타이드 표적화는 인공적으로 엔지니어링된 뉴클레아제를 사용함으로써 수행될 수 있다. 뉴클레아제는 게놈의 원하는 위치에서 특이적인 이중-가닥 깨짐을 생성하고, 상동성 재조합 및 비상동성 단부-결합의 천연 과정에 의해 유도된 깨짐을 수복하기 위해 세포의 내인성 메커니즘을 이용한다. 본 발명에 적합한 뉴클레아제는 한정하는 것은 아니지만, 징크 핑거 뉴클레아제, 전사 활성화제-유사 이펙터 뉴클레아제(TALEN), CRISPR/Cas 시스템, 및 엔지니어링된 메가뉴클레아제 재-엔지니어링된 호우밍 엔도뉴클레아제를 포함한다. 발명의 특정 구체예에서, 인디케이터를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열의 삽입은 부위-특이적 뉴클레아제를 사용함으로써 수행된다. 본원에서 사용되는 "부위-특이적 뉴클레아제"는 원하는 위치에서 이중-가닥 깨짐을 생성하는 뉴클레아제를 나타낸다. 발명의 다른 특정 구체예에서, 인디케이터를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열의 삽입은 징크 핑거 뉴클레아제(ZFN), 전사 활성화-유사 이펙터 뉴클레아제(TALEN) 매개된 게놈 편집 또는 CRISPR/Cas 시스템에 의해 수행된다. ZFN은 징크 핑거 DNA-결합 도메인을 DNA-절단 도메인에 융합시킴으로써 생성된 인공 제한 효소이다. TALEN은 TAL 이펙터 DNA 결합 도메인을 DNA 절단 도메인에 융합시킴으로써 생성된 인공 제한 효소이다. ZFN 및 TALEN은 그것들의 DNA 결합 도메인이 원하는 DNA 서열을 표적으로 하기 위해 디자인될 수 있고 이것이 뉴클레아제가 복합한 게놈 내일지라도 독특한 서열을 표적으로 하는 것을 가능하게 하기 때문에 실제적으로 임의의 원하는 DNA 서열에 결합하기 위해 빠르게 엔지니어링될 수 있다. ZFN 및 TALEN을 사용하는 방법들의 특이성은 DNA 결합 도메인으로 인한 것이고, 그것이 이웃하는 서열에 대한 DNA 절단을 지시한다. ZFN 및 TALEN 기법은 실험실 분자 기법을 기술하는 다양한 실제 매뉴얼에서, 예를 들면 Hockemeyer 등의 기사(Hockemeyer et al. 2012, Nat Biotechnol 29(8): 731-734; Hockemeyer et al. 2009, Nat Biotechnol 27(9): 851-857)에서 기술된다. CRISPR/Cas 시스템은 예컨대 Sander 및 Joung의 기사(2014, Nature Biotechnology 32, 347-355)에서 기술되었다. 기술분야의 숙련된 사람은 이 방법들을 언제 어떻게 사용하는지를 안다.
선택적으로, 폴리뉴클레오타이드 표적의 스크리닝은 원하는 유전자 삽입이 일어났는지를 확인하기 위해 또는 인디케이터 폴리뉴클레오타이드의 통합지점을 확인하기 위해 서열분석, PCR 또는 서던 분석에 의해 수행될 수 있다.
표적 폴리뉴클레오타이드
본 발명에서 인디케이터를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열은 특이적으로 세포의 DNA 대신 삽입되고 인디케이터의 폴리뉴클레오타이드는 관심의 표적 인디케이터 유전자와 함께 발현된다. 실제로, 인디케이터 폴리뉴클레오타이드는 DNA의 규정되고 디자인된 영역(들)에 삽입된다. 폴리뉴클레오타이드가 삽입되는 DNA의 부위는 발현될 표적 폴리뉴클레오타이드 서열 내에 또는 표적 폴리뉴클레오타이드 서열의 외부에, 예컨대 표적 폴리뉴클레오타이드와 동일한 클러스터(유전자 클러스터)에 있을 수 있다. 유전자 클러스터는 폴리펩타이드를 암호화하는 적어도 2개의 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 그 폴리뉴클레오타이드 서열은 보통 함께 무리지어 있고 함께 발현된다. 그러므로 기술분야의 숙련자는 본 발명에 따라 인디케이터 폴리뉴클레오타이드가 표적 폴리뉴클레오타이드와 함께 또는 동시에 발현되는 것을 인지한다. 이것은 표적 폴리뉴클레오타이드의 발현의 추적을 가능하게 한다.
인디케이터 폴리뉴클레오타이드의 DNA로의 삽입은 세포 기능에 네거티브 효과를 나타내지 않는다. 예를 들어, 인디케이터 폴리뉴클레오타이드가 발현될 표적 폴리뉴클레오타이드에 삽입되어 융합 폴리펩타이드가 형성된다면, 융합 폴리펩타이드이 기능은 변형되지 않은 폴리펩타이드의 기능과 비슷하다. 그러므로 숙주 DNA 서열을 제거할 필요가 없고 편집은 게놈에 대해 매우 최소한이며 확고부동하다.
발명의 특정 구체예에서, 인디케이터를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열은 표적 폴리뉴클레오타이드에 삽입된다. 발명의 매우 특정한 구체예에서, 인디케이터를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열은 표적 폴리뉴클레오타이드의 3' 단부에 삽입된다. 표적화되기 위한 표적 폴리뉴클레오타이드의 부위는 암호화 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 임의의 비암호화 또는 조절 서열 내의 임의의 부위로부터 선택될 수 있다. 기술분야의 숙련자에게는 삽입에 적합한 부위가 문제의 특이적 표적 폴리뉴클레오타이드에 좌우된다는 것이 잘 알려져 있다.
바이오인디케이터/리포터로서 편집될 표적 폴리뉴클레오타이드는 그것의 발현이 분석물에 의해 영향을 받을 수 있는 임의의 폴리뉴클레오타이드일 수 있다. 발명의 특정 구체예에서, 표적 폴리뉴클레오타이드는 글루코오스 반응성 폴리펩타이드, 성장 인자, 미토콘드리아 효소, 호르몬 반응성 폴리펩타이드, 스트레스 반응성 폴리펩타이드, 중추 또는 말초 신경계 기능의 폴리펩타이드, 알코올 또는 약물 반응성 폴리펩타이드, 질환 발달의 면역학적 모니터링에 사용된 폴리펩타이드, 압력 또는 연신과 같은 물리력의 변화를 나타내는 폴리펩타이드, 및 운동 중 또는 병원체 감염에서 물리적 부하에 의해 발현된 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드로 구성되는 군으로부터 선택된다. 상기 언급된 표적 폴리뉴클레오타이드의 발현과 관련된 어떠한 과정이든지 정상적인 생리적 상태에서 또는 질환 중으로부터의 항상성 및 일탈의 이런 특이적 생물학적 과정들을 묘사하는 확인된 바이오마커를 기반으로 본 발명에 의해 모니터링될 수 있다. 확인된 분자 회로에 적합한 표적 폴리뉴클레오타이드의 예는, 한정하는 것은 아니지만 분석물에 의해 조절되는 유전자, 에탄올과 같은 유독물질에 의해 표적화된 유전자, 세포외 기질 및 운동 부하로부터 근육 회복에 관여된 효소 및 수복 인자를 암호화하는 유전자, 및 세포에서 체액성 반응의 선천적 면역을 촉발하는 면역학적 인자들을 암호화하는 유전자들을 암호화하는 특이적 효소를 포함한다. 본 발명에 적합한 글루코오스 반응성 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는, 한정하는 것은 아니지만, 실시예 1의 표 1, 표2 또는 표 3에, 도 9에 또는 도 10에 제시된 목록, 또는 그것들의 임의의 조합으로부터 선택될 수 있다. 예로서, 표적 폴리뉴클레오타이드가 글루코오스 반응성 폴리펩타이드라면, 본 발명은 세포가 글루코오스에 어떻게 반응하는지를 검정하기 위한 정확하고, 믿을 수 있으며 안전한 방법을 위한 특정 방법 및 도구를 허용한다. 예로서, 예컨대 실시예 1의 표 1, 2 또는 3, 도 9 또는 도 10에서 언급된 유전자들은 모델 유기체에서 생체내에서 글루코오스에 의해 유도되었고 발현은 글루코오스의 부재시에 감소된다. 본 발명은 생리적 기능을 모니터링하고 측정하는 새로운 방법을 제공하기 때문에, 또한 세포 및 재생 세포에 의해 만들어진 조직에서 신규한 분석물 및반응 메커니즘을 확인하기 위한 플랫폼을 대표한다.
본원에서 사용된 "폴리뉴클레오타이드"는 문제의 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열 또는 그것의 보존성 서열 변종을 포함하는 임의의 폴리뉴클레오타이드, 예컨대 단일 또는 이중-가닥 DNA(게놈 DNA 또는 cDNA)를 나타낸다. 폴리뉴클레오타이드와 관련하여, 용어 "보존성 서열 변종"은 암호화된 폴리펩타이드의 생물학적 특성을 유의미하게 변화시키지 않는 뉴클레오타이드 서열 변형을 나타낸다. 보존성 뉴클레오타이드 서열 변종은 유전자 코드의 축퇴성으로부터 및 사일런트 돌연변이로부터 발생하는 변종들을 포함한다. 뉴클레오타이드 치환, 결실 및 첨가가 또한 고려된다. 본원에서 사용되는 용어 "변종"은 주어진 서열에 비교하여 아미노산 또는 핵산 서열에 마이너 변화를 가진 서열을 나타낸다. 그러한 변종은 자연적으로, 예컨대 대립유전자 변종으로서 발생하거나, 또는 돌연변이생성 또는 다른 유전자 변형에 의해 생성될 수 있다.
인디케이터를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열의 세포의 DNA로의 삽입에 의한 유전자 변형에 더불어, 본 발명의 세포는 또한 다른 유전자 변형을 포함할 수 있다. 이런 유전자 변형으로는 임의의 유전자 변형, 예컨대 하나 이상의 유전자 또는 그것의 단편(들)의 삽입, 결실 또는 파괴 또는 하나 이상의 뉴클레오타이드의 삽입, 결실 또는 파괴, 또는 플라스미드의 첨가를 포함한다. 본원에서 사용된 "파괴"는 하나 또는 여러 뉴클레오타이드의 유전자 안으로의 삽입으로 상응하는 단백질의 결핍 또는 비-기능성 단백질 또는 저하된 활성을 가지는 단백질의 존재를 초래하는 것을 나타낸다. 다른 유전자 변형은 폴리뉴클레오타이드의 하향 조절 및/또는 과잉 발현을 유발하는 또는 폴리뉴클레오타이드의 발현에 영향을 미치지 않는 하나 또는 여러 변형으로부터 선택될 수 있다. 본원에서 사용되는 "과잉 발현"은 미변형 세포보다 더 많은 생성물(예컨대 폴리펩타이드)을 생성함으로써 폴리뉴클레오타이드의 과도한 발현을 나타낸다. 예를 들어 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드의 하나 이상의 복사물은 과잉발현을 위해 세포로 형질전환될 수 있다. 용어는 또한 폴리펩타이드의 과잉 발현을 허용하기 위해 프로모터 또는 프로모터 영역이 변형되어 있거나 또는 세포에서 자연적으로 존재하지 않는 프로모터가 삽입되어 있는 구체예들을 포함한다. 또한, DNA 메틸화 및 히스톤 변형과 같은 후생적 변형이 "유전자 변형"에 포함된다.
발명의 특정 구체예에서, 인디케이터를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열의 삽입이 모니터링될 세포에서 수행되는 것 이외의 다른 유전자 변형은 없다.
일부 구체예에서, 예컨대 실시예 1의 표 1, 2 또는 3에 또는 도 9 또는 10에 나타낸 폴리펩타이드를 암호화하는 표적 폴리뉴클레오타이드 서열은 공공의 뉴클레오타이드 서열 데이터베이스로부터 유래할 수 있는 폴리뉴클레오타이드 서열, 또는 그것과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 핵산 서열 동일성을 가지는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다.
본 개시의 서열과 비교된 임의의 서열 또는 그것의 단편의 동일성은 본 발명의 전체 서열과 비교된 임의의 서열의 동일성을 나타낸다. 본원에서 사용된, 두 서열 사이의 % 동일성은 두 서열의 최적의 배열을 위해 도입될 필요가 있는 갭의 수, 각 갭의 길이를 고려한, 서열들에 의해 공유된 동일한 위치의 수의 함수이다(즉 % 동일성 = 동일한 위치의 수/위치의 총 수 x 100). 서열들의 비교 및 두 서열 사이의 동일성 백분율의 측정은 기술분야에서 활용할 수 있는 수학적 알고리즘을 사용하여 이루어질 수 있다. 이것은 아미노산 및 핵산 서열에도 적용된다.
서열 동일성은 예를 들면 BLAST(Basic Local Alignment Search Tools) 또는 FASTA(FAST-All)를 사용함으로써 측정될 수 있다. 연구조사에서, 세팅 파라미터 "갭 페널티" 및 "기질"은 전형적으로 디폴트로서 선택된다.
발명의 한 특정 구체예에서, 인디케이터 폴리뉴클레오타이드는 GFP이고 표적 폴리뉴클레오타이드는 글루코오스 반응성 폴리펩타이드, 성장 인자, 미토콘드리아 효소, 호르몬 반응성 폴리펩타이드, 스트레스 반응성 폴리펩타이드, 중추 또는 말초 신경계 기능의 폴리펩타이드, 알코올 또는 약물 반응성 폴리펩타이드, 질환 발달의 면역학적 모니터링에 사용된 폴리펩타이드, 압력 또는 연신과 같은 물리력의 변화를 나타내는 폴리펩타이드, 및 운동 중 또는 병원체 감염에서 물리적 부하에 의해 발현된 폴리펩타이드 또는 표 1, 표 2, 표 3, 도 9 또는 도 10의 목록에 제시된 어느 하나 또는 그것들의 임의의 조합을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드이다.
발명의 특정 구체예에서, 표적 폴리뉴클레오타이드의 발현은 분석물에 의해 영향을 받는다. 본원에서 사용된 "발현은 분석물에 의해 영향을 받는다"는 분석물이 예컨대 폴리뉴클레오티드의 발현의 시작, 증가, 감소 또는 중단에 의해, 즉 분석물에 반응하는 표적 폴리뉴클레오타이드의 발현에 의해 제어될 수 있는 임의의 상황을 나타낸다.
본원에서 사용된 "분석물"은 분석적 과정에서 관심의 대상인 분자, 물질 또는 화학적 구성요소이고 표적 폴리뉴클레오타이드의 발현에 영향(직접 또는 간접)을 나타낸다. "직접 영향"은 분석물 자체가 예컨대 발현을 제어하는 폴리뉴클레오타이드의 위치에의 결합에 의해 발현에 영향을 주는 상황을 나타내는 반면, "간접 영향"은 분석물이 예컨대 문제의 표적 폴리펩타이드가 아닌 임의의 다른 폴리펩타이드의 발현의 다른 분석물에 영향을 주고, 상기 다른 분석물 또는 발현에 의해 표적 폴리뉴클레오타이드의 발현에 영향을 주는 상황을 나타낸다. 특정 구체예에서, 분석물은 분비된 나노- 및 마이크로소포(또한 포괄적으로 엑소솜, 지질 캡슐화 나노 및 마이크로규모 세포 분비된 소포로도 불림), 박테리아 및 바이러스 유래 독소, 콜레스테롤 유래 친유성 및 비-친유성 호르몬 및 그것들의 유도체, 폴리뉴클레오타이드(예컨대 DNA, cDNA, mRNA, siRNA, 비코딩 RNA, 인핸서 RNA, 유리(free) RNA), 폴리펩타이드(예컨대 성장 인자 결합 폴리뉴클레오타이드), 당(예컨대 글루코오스, 갈락토오스, 락테이트), 지방산, 지질, 당단백질, 대사 생성물, 전해질(예컨대 Cl, K, Na, CO2) 및 물리적 자극의 스펙트럼 주파수로 구성되는 군으로부터 선택될 수 있다. 본 발명의 방법에 의해 검출될 수 있는 분석물의 일부 예로는, 한정하는 것은 아니지만 글루코오스, 인슐린, 내분비, 측분비 또는 자가분비 호르몬, 바이오마커 및/또는 제약학적 제제를 포함한다. 특정 구체예에서, 분석물은 질환-관련 바이오마커이다. 그러므로, 발명은 질환(예컨대 당뇨병, 심장 질환, 암, 알츠하이머병, 약물/알코올/중독, 병원체 감염, 회복의 면역학적 모니터링 및 숙주 이식 부합성 모니터링, 등)과 관련된 바이오마커를 모니터링하는 것을 포함할 수 있다.
특정 구체예에서, 분석물은 글루코오스이고 표적 폴리뉴클레오타이드는 글루코오스 반응 요소를 포함하는 폴리뉴클레오타이드(예컨대 인슐린 또는 글루카곤 수용체 또는 실시예 1의 표 1, 2 또는 3, 도 9 또는 도 10에 열거된 폴리펩타이드 중 어느 것을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드)이다. 글루코오스 검출은 현재 혈액 샘플로부터 시행된다. 그러나, 본 발명의 특정 구체예는 글루코오스 수준 또는 대상체의 피부로부터의 임의의 다른 분석물을 간접적으로, 그러나 동시에 효율적으로 및 특이적으로 추적하는 방법을 제공한다.
인디케이터
인디케이터를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열이 DNA에 삽입된 후에, 그것은 표적 폴리뉴클레오타이드와 함께 세포에서 발현된다. 인디케이터 폴리뉴클레오타이드 서열은 폴리펩타이드 또는 그것의 임의의 단편을 암호화한다. 인디케이터 폴리뉴클레오타이드는 천연이거나(예컨대 분리됨) 또는 또한 인공적인, 인간이 합성한 또는 화학적으로 변형된 비-천연 뉴클레오타이드, 또는 엔지니어링된 운반 RNA의 사용을 택함으로써 생성될 수 있다. 인디케이터 폴리펩타이드, 예컨대 녹색 형광 단백질(GFP) 및 GFP 변형물, 가시 범위에서 자연적으로 광자를 생성하는 루시페라제 리포터, FRET 화합물의 앱타머와 상호작용할 수 있는 단백질의 도메인, 가시광 주파수에 반응하는 광유전자적으로 활성인 폴리펩타이드, 무선주파수와 같은 전자기 스펙트럼 주파수에 반응하는 폴리펩타이드, myc, 플래그(flag) 또는 할로태그가 붙은 펩타이드, 가시범위 주파수(예를 들면 멜라닌 생성 효소에 의해 생성된 갈색, 청색, 적색, 녹색)에서 피부 표면에 위치한 판독기에 의해 진단될 수 있는 폴리펩타이드, 숙주의 눈 또는 부신 발색단의 생물학적 피그먼트를 암호화하는 유전자와 같은 유기체로부터 유래된 유전자는 UV 노출에 대한 반응으로서 빛을 방출할 수 있다. 발명의 한 구체예에서, 인디케이터는 형광 단백질, 녹색 형광 단백질(GFP), GFP 유도체, 광단백질(예컨대 반딧불이 루시페린 단백질), mCherry, 황색 형광 단백질, 토마토 적색 단백질, 루시페라제 리포터, FRET 도너 및/또는 수용체 단백질, 앱타머 폴리뉴클레오타이드 및/또는 앱타머 폴리펩타이드, myc 태그, 플래그 태그, 할로 태그, 비오틴/아비딘 태그 및 그것들의 변형물, 비천연 염기 및 운반 RNA 및 아미노산 기반 태그 부착, 전기 인디케이터로서 작용하는 폴리펩타이드 및 신체의 피그먼트, 예컨대 멜라닌 및 눈의 색 피그먼트를 암호화하는 유전자들로 구성되는 군으로부터 선택된다.
GFP는 283개의 아미노산 잔기로 구성되고 청색 내지 자외선 범위의 빛에 노출될 때 밝은 녹색 형광을 나타내는 폴리펩타이드이다. GFP는 또한 임의의 GFP 동족체를 나타낸다. 본원에서 사용되는 "GFP 유도체"는 GFP와 비교하여 아미노산 치환, 결실 또는 삽입을 포함하지만, 여전히 GFP와 실질적으로 동일한 방식의 기능을 포함하는, 특히 청색 내지 자외선 범위의 빛에 노출될 때 밝은 녹색 형광을 나타내는 능력을 보유한 폴리펩타이드를 나타낸다. 예컨대 융합 단백질은 "GFP 유도체"의 범주 내에 있다. 세포 및 분자 생물학에서, GFP 유전자는 발현의 리포터로서 빈번하게 사용된다. GFP를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열은 세포안에 도입되고 게놈에서 유지된다. 예를 들면, GFP는 Hockemeyer 등의 기사(Hockemeyer et al. 2009, Nat Biotechnol 27(9): 851-857)의 방법에서 활용된다. 야생형 GFP 폴리뉴클레오타이드 및 아미노산 서열은 공공의 서열 데이터베이스로부터 얻을 수 있고 GFP 또한 상업적으로 입수 가능하다.
임의의 광 방출 폴리펩타이드가 본 발명에 활용될 수 있다. 광단백질은 산화되었을 때 빛을 생성하고 통상적으로 생체발광에 사용된다.
형광 공명 에너지 전이(Fluorescence Resonance Energy Transfer(FRET))는 여기된 형광단(도너)로부터 다른 형광단(수용체)으로의 에너지의 비-방사성 전이이다. 도너를 여기시킨 후 상대적인 도너 및 수용체 방출을, 순차적으로 또는 동시에 모니터링하는 것은 FRET가 발생했을 때 측정하는 것을 가능하게 만든다. FRET의 검출은 둘 이상의 생체분자가 상호작용하는 때와 장소를 정량하기 위해 사용될 수 있다. FRET 방법은 기술분야에 잘 기술되어 있다.
앱타머는 특이적 표적 분자에 결합하는 올리고뉴클레오타이드 또는 펩타이드 분자이다. 앱타머는 보통 큰 무작위 서열 풀로부터 앱타머를 선택함으로써 생성된다. 앱타머는 그것들의 표적 분자의 존재하에 자체-절단하는 리보자임과 조합될 수 있다. DNA, RNA 또는 핵산 유사체 앱타머는 폴리뉴클레오타이드의 짧은 가닥들로 구성된다. 펩타이드 앱타머는 단백질 스캐폴드에 대해 양 단부에 부착된 짧은 가변성 폴리펩타이드 도메인으로 구성된다. 본원에서 사용되는 "단백질 스캐폴드"는 신호전달 경로의 다른 다중 폴리펩타이드와 상호작용하는 및/또는 결합하여 그것들을 복합체로 묶는 폴리펩타이드를 나타낸다. 앱타머 방법은 기술분야에 잘 기술되어 있고 기술분야의 숙련자에게 잘 알려져 있다.
GFP, 광단백질, FRET 및 앱타머 기법 또한 실험실 분자 기법을 기술하는 다양한 실제 매뉴얼에 기술되어 있다. 기술분야의 숙련자는 이 방법들을 언제 어떻게 사용하는지 안다.
선택적으로 및 사용된 인디케이터 폴리뉴클레오타이드에 따라, 인디케이터 폴리뉴클레오타이드는 (추가로) 기술분야의 숙련자에게 잘 알려져 있는 임의의 표지로 또는 표지화 기법으로 마킹되거나 표지화될 수 있다. 이 표지들은 인디케이터의 신호를 제공할 수 있다. 표지화 방법은 실험실 분자 기법을 기술하는 다양한 실제 매뉴얼에 기술되어 있다. 기술분야의 숙련자는 이 방법들을 언제 어떻게 사용하는지 안다. 인디케이터의 적합한 표지는, 한정하는 것은 아니지만 아비딘 및 비오틴 시스템 또는 태그들의 클릭 화학 기반 결합을 포함한다. 발명의 특정 구체예에서, 인디케이터는 측정 가능한 신호를 가지며 추가의 표지는 필요하지 않다. 다른 특정 구체예에서, 인디케이터 폴리뉴클레오타이드는 암호화된 폴리펩타이드가 임의의 적합한 수단에 의해 검출될 수 있는 임의의 제제 또는 분자에 결합할 수 있는 방식으로 편집될 수 있다.
인디케이터 또는 그것의 신호를 모니터링하는 것은 표적 폴리뉴클레오타이드의 발현의 변화를 추적하는 것을 가능하게 한다. 발현된 인디케이터 폴리뉴클레오타이드의 인디케이터 신호는 표적 폴리뉴클레오타이드의 발현과 관련된다. 본원에서 사용된 "표적 폴리뉴클레오타이드의 발현과 관련되는"은 인디케이터 신호 및 표적 폴리뉴클레오타이드의 발현의 존재, 부재, 상대적인 풍부함 또는 강도 사이의 임의의 상관관계를 나타낸다. 나아가, 세포 또는 세포들의 특이적 분석물의 존재, 부재 또는 상대적인 풍부함은 표적 폴리뉴클레오타이드의 발현과 및 또한 인디케이터를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열의 발현과 관련된다. 그러므로, 예를 들어 분석물의 농도는 인디케이터 신호의 모니터링에 의해 세포(들)의 외부로부터 측정될 수 있다.
발명의 특정 구체예에서, 인디케이터는 표적 폴리펩타이드와 함께 융합 폴리펩타이드를 형성한다. 이 경우 인디케이터 폴리펩타이드는 융합 폴리펩타이드의 표적 폴리펩타이드와 함께 동일한 단백질 분해 사이클에서 분해된다.
일부 구체예에서, 인디케이터 폴리뉴클레오타이드 서열은 공공 뉴클레오타이드 서열 데이터 베이스(예컨대 NIH, EMBL)로부터 유래될 수 있는 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 그것과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 핵산 서열 동일성을 가지는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다.
발명의 특정 구체예에서, 표적 폴리뉴클레오타이드는 실시예 1의 표 1, 2 또는 3, 도 9 또는 도 10에 열거된 것들 중 임의의 하나이고, 인디케이터 폴리뉴클레오타이드는 GFP이며 분석물은 글루코오스이다.
발명의 한 구체예에서, 본 발명에 사용된 세포의 유전자 변형은 미변형 세포와 비교할 때 인디케이터 폴리뉴클레오타이드의 전사뿐만 아니라 인디케이터 신호의 생성을 제외하고 세포 기능에 임의의 다른 효과를 나타내지 않는다. 인디케이터는 생리적으로 기능성이 아닌 성분이고, 항상성 제어에 비활성이다. 이것을 기반으로 여러 바이오인디케이터가 생체 모니터링에 사용될 세포에 대한 편집에 의해 동시에 삽입될 수 있다. 다른 구체예에서, 추가의 유전자 변형은 본 발명의 방법에 또는 상기 방법을 활용함으로써 얻어진 생성물에 포함될 수 있다.
인디케이터 신호의 모니터링
본 발명에 따르는 유전자적으로 변형된 세포는 유전자적으로 변형된 세포와 미변형 세포 둘 다를 포함하는 세포의 군으로부터 선택될 수 있다. 본 발명에 따르면 유전자적으로 변형된 세포는 대상체에 투여된다. 임의의 투여 방법이 본 발명에 활용될 수 있고 한 구체예에서, 적합한 투여 경로는, 한정하는 것은 아니지만, 기술분야의 숙련자에게 알려져 있는 것과 같이, 비경구 전달(예컨대 정맥내 주입), 장 전달(예컨대 경구로), 국소 투여, 국부 투여(예컨대 피부로 또는 경피로)를 포함한다. 매우 특정한 구체예에서, 유전자적으로 변형된 세포는 피부를 재생시킬 수 있는 피부의 기저 세포층 또는 표피에 투여된다.
발명의 한 구체예에서, 유전자적으로 변형된 재생 세포 또는 상기 변형된 세포를 포함하는 임의의 조성물이 대상체의 피부에 적용된다. 이런 특정 구체예에서, 변형된 세포는 피부의 재생 부분에 들어가고 그로써 피부의 재생 세포의 일부가 되며 따라서 또한 피부의 항상성의 일부가 된다. 특이적으로 분자 생물학 기술에 의해 확인된 유전자 편집된 인디케이터 세포를 함유하는 세포는 그런 다음 피부를 재생시키는 것을 담당하는 특이적 세포층에 도입된다. 이것에 대한 대안은 인디케이터 세포가 에피솜에 머무르는 것이다. 이것은 세포가 사람에게 통합되지는 않지만 세포가 예컨대 나노 바늘을 사용하여 땀샘 구멍에 삽입된 것을 의미한다. 그러므로 이 방법에 의하여 세포는 혈액 유래된 구성성분 및 그 안의 분석물을 포함하여 체액에 노출된다. 더욱이 숙주 유래된 바이오/유전자 편집된 인디케이터 세포를 피부에 도입시키는 세 번째 방법은 그것을 숙주의 피부의 일부로서 도입시킴으로써 피부 재구성을 생성하기 위해 그것을 사용하는 것이다. 바이오인디케이터는 또한 그러한 세포가 휴대형 디바이스의 미세유체역학 챔버에 놓여지는 상태에서 리포터로서 작용할 수 있는 수단을 제공하여서 분석물이 분석물 투과성 막을 통해 인디케이터 세포에 노출된다. 여기서 바이오인디케이터 재생 세포가 그 분야에서 일상적인 장기 배양 및 장기유사체 배양 기술에 의해 피부 구조를 조립하기 위한 생체외 세팅에 사용된다. 네 번째로 피부는 작은 전류의 사용을 통해 개방될 수 있다. 그러한 과정은 피부의 기공을 개방하는 것으로 최근 VTT에 의해 나타났고, 그러므로 인디케이터 세포가 땀샘 구멍을 들어가기 위한 더 나은 통로를 형성한다. 나아가 전류는 피부 세포를 더 수용적으로 만들기 위해 자극하는 것으로 나타났다. 인디케이터 세포는, 예를 들어 통상적인 피부 크림과 혼합되어 인디케이터 세포가 피부 안으로 삽입되는 실제적인 방식이 가능해질 수 있을 것이다. 다섯 번째로, 인디케이터 세포는 타투 제작 기법을 사용함으로써 피부로 삽입될 수 있을 것이다. 여섯 번째로, 인디케이터 세포는 피부의 재생 피부 세포층과 최외각 세포층 사이의 거리 정도의 바늘 높이를 가지는, 인디케이터 세포로 침지된 미세바늘 플라스터를 사용함으로써 피부로 삽입될 수 있을 것이다.
발명의 한 구체예에서, 변형된 세포를 투여하기 위해 사용된 기법들은, 한정하는 것은 아니지만, 타투 제작 유사 방법(즉 세포는 피부의 진피로 투여됨), 피어싱, 광학적 방사, 피부의 미세-마모, 모낭 구멍 또는 모낭에 영향을 미치는 끈적거리는 플라스터, 및 피부에의 세포의 적용을 포함한다. 대상체의 피부에 유전자적으로 변형된 세포의 적용은 상기 세포가 신체와 접촉하여 재생 세포로서 기능하는 것을 허용한다. 대상체로부터 얻어지고 나아가 유전자적으로 변형된 세포는 상기 대상체의 피부에 또는 또 다른 대상체의 피부에 적용될 수 있다. 한 특정 구체예에서, 모발은 유전자적으로 변형된 세포가 피부에 적용되기 전에 모낭으로부터 제거된다.
발명의 일부 구체예에서, 유전자적으로 변형된 재생 인디케이터 세포는 세포를 투과성 피부 영역에 세포를 적용함으로써 비-침습적 방식으로 대상체에 투여된다. 상기 피부 영역은 예컨대 절단 또는 마모를 통해, 또는 피어싱에 의해, 천공에 의해, 문지르기(scrubbing)에 의해, 박피에 의해, 하나 이상의 가는 모발을 모낭으로부터 제거함으로써(예컨대 풀링(pulling)에 의해) 모낭을 개방함에 의해, 모낭 구멍, 모낭 및/또는 땀샘 구멍을 전류에 의해 또는 임의의 다른 적합한 수단에 의해 개방함에 의해, 또는 유전자적으로 변형된 세포를 피부의 재생 세포층에 투여하고 통합시키기 위한 경로를 개방하는 임의의 다른 목적으로 만들어진 미미한 피부 손상 등을 통해 세포에 대해 투과성으로 만들어질 수 있다. 피부의 투과성은 또한 플라스틱 필름 또는 임의의 다른 상응하는 시트-형 구조물을 피부에 놓음으로써 피부 세포의 세포질의 액체 함량을 증가시킴으로써 향상될 수 있다. 또한 피부 영역을 본 세포에 대해 투과성으로 만들기 위한 화학적 수단이 예상된다. 따라서, 유전자적으로 변형된 재생 인디케이터 세포는 투과성 피부 영역을 가지는 대상체에 상기 피부 영역을 통해 투여될 수 있다. 중요하게도, 이 구체예들에서, 주어진 피부 영역을 본 세포에 대해 투과성으로 만드는 처치는 본 방법의 일부가 아니다. 대신, 세포로부터 인디케이터 신호를 얻는 방법 또는 세포의 생물학적 상태를 측정하는 방법은 이미 투과성 피부 영역을 가지고 있는 대상체에서 실행된다.
일부 다른 구체예에서, 유전자적으로 변형된 재생 인디케이터 세포는 대상체에게 무상 피부 영역을 통해 투여될 수 있다. 이것은 유전자적으로 변형된 세포를 무상 피부에 국소적으로 적용함으로써 실행될 수 있다. 바람직하게 세포는 재생 피부층으로 세포의 통합을 향상시키기 위하여 적합한 화학적 조성물에, 예컨대 피부에 쉽게 흡수되는 크림 또는 다른 담체 물질의 형태로 포함된다. 달리 말하면, 세포가 적용될 피부 영역은 임의의 예비처리에 의해 투과성으로 만들어지지는 않지만, 세포에 대한 투과성은 세포를 투여하기 위해 사용된 조성물 또는 담체를 통해 이루어진다. 따라서, 용어 "투과성 피부 영역"은 또한 무상 피부도 포함한다.
본 발명에 따르는 유전자적으로 변형된 세포의 적용을 위한 양 및 처방은 유전자적으로 변형된 재생 세포의 기술분야에서 숙련된 사람들에 의해 쉽게 측정될 수 있다. 일반적으로, 유전자적으로 변형된 세포의 투여량은 투여 빈도(여러번의 투여가 이용되는 경우), 재생 세포 및 투여를 위한 표적 조직의 유형; 및 개별 의사에 의해 조정될 다른 변수들과 같은 고려사항에 따라 달라진다. 예를 들어, 재생 세포는 전형적으로 약 1000개의 세포로 구성된 세포 클러스터의 양으로, 특히 재생 및 자체-재생에 대한 용량을 제공하는 적어도 한 세포의 양으로 투여된다. 원하는 투여량은 표적 조직의 재생 세포의 원하는 양을 얻기 위해 적합한 간격으로 하나 이상의 용량으로 투여될 수 있다.
유전자적으로 변형된 세포는 단지 1회 또는 다르게는 여러 번 대상체에게 투여될 수 있다. 예를 들어, 사용된 특정 구체예에 따라, 주마다, 월마다, 6개월마다, 또는 해마다 변형된 세포를 적용하는 것이 바람직할 수 있다.
유전자적으로 변형된 세포는 임의의 형태로, 예컨대 고체, 반고체 또는 액체 형태로 투여될 수 있다. 제형은 한정하는 것은 아니지만, 용액, 에멀션, 현탁액, 크림, 로션, 정제 및 캡슐로 구성되는 군으로부터 선택될 수 있다. 그러나, 유전자적으로 변형된 세포 또는 상기 유전자적으로 변형된 세포를 포함하는 조성물은 특정 제형에 한정되지 않지만 임의의 공지된 허용되는 제형으로 제형화될 수 있다. 조성물은 기술분야에 공지된 임의의 종래 과정에 의해, 예컨대 세포와 임의의 다른 제제(들)을 혼합함으로써 제조될 수 있다.
발명의 한 구체예에서, 인간 또는 동물 대상체를 본 발명의 방법에 따르는 유전자적으로 변형된 재생 세포를 투여하기 위한 적합한 표적으로서 분류하기 전에, 예를 들어 병력 또는 예컨대 특정 질환에 대한 위험이 평가될 수 있다. 본 발명의 방법을 수행하고 정상으로부터 벗어나는 결과를 받아들인 후에, 임상의는 예컨대 환자에 대한 추가의 진단 방법 및/또는 치료를 제안할 수 있다.
본 발명의 감지(sensing)는 인디케이터 분자의 신호를 검출하는 것에 의존한다. 인디케이터의 신호는 예컨대 대상체의 피부에서, 피부를 벗어나서 또는 피부 위에서 세포로부터 바깥쪽에서 모니터링된다. 본 발명의 방법은 세포벽을 관통하거나 세포벽을 파괴하지 않으면서 세포의 분석물의 존재, 부재 또는 양과 관련된 인디케이터 신호의 존재, 부재 또는 양을 검출한다. 실제로, 본 발명에서 사용된 모니터링은 비-수술적 모니터링 방법이거나 또는 최소한의 세포/조직 삽입 조작이 필요한 수술적 모니터링으로 전환될 수 있다. 이것은 예를 들어 사람이 심하게 화상을 입었을 때 케라틴 생성세포가 유출에 대해 피부를 보호하기 위해 사용되고 그러한 세포는 다음에 피부를 회복시키기 때문에 그 분야에서는 일상적이다. 그러므로 피부 회복을 위한 일상적인 기술이 존재하고 상업화되었다.
발명의 한 가지 장점은 인디케이터 신호가 실시간으로 모니터링될 수 있다는 것이다. 이것은 사용자 친숙한 적용을 가능하게 한다. 발명의 특정 구체예에서, 모니터링은 연속으로 수행된다. 본원에서 사용되는 "연속적으로"는 비-중단 방식으로 인디케이터 신호의 변화를 따르는 것을 나타낸다. 표현 "연속적으로"는 때때로 모니터링하는 것과 반대이다.
발명의 한 구체예에서, 모니터링은 광학적, 전도성, 자기장, 방사선, 임피던스, 전기화학적, 음향적 및 생물학적 측정으로 구성되는 군으로부터 선택된 측정을 활용함으로써 수행된다. 그러므로, 인디케이터 신호는 임의의 광학적(예컨대 광 및 그것의 반사율, 굴절, 흡수 또는 색; 또한 라만 산란 특성의 변화 또는 초분광 지문(hyperspectral fingerprint)의 변화), 전기적(예컨대 피부 표면 전기 전도성 또는 표면 전위의 변화), 자기장(예컨대 자기 분극, 강자성 공명, 전자 스핀 공명, 전자 상자성 공명 또는 핵 자기 공명의 변화), 방사선(예컨대 형광 공명 에너지 전이, 발광 또는 인광(phosphorescence)의 변화), 임피던스(예컨대 유전율의 변화 또는 그것의 주파수 스펙트럼), 전기화학적(예컨대 이온 전도성 또는 산화환원 반응의 변화), 음향적(예컨대 음향 또는 광음향 특성의 변화) 및/또는 생물학적(예컨대 조직 또는 모발의 검출 가능한 생물학적 변화) 신호일 수 있다. 인디케이터 분자로부터의 신호는 기술분야에 공지된 다양한 방법에 의해 검출되거나 모니터링될 수 있다. 이 방법들은 기술분야의 숙련자들에게 잘 알려져 있고 기술분야의 숙련자는 이 방법들을 언제 어떻게 사용하는지 안다. 이 방법들은, 한정하는 것은 아니지만 자외선, 적외선, 생체발광 측정 또는 영상화와 같은 광학적 측정, 형광 측정 또는 영상화, 방사성 표지 또는 트레이서의 측정, 자기장의 사용 및/또는 X-선 또는 감마 방사선의 사용을 포함한다. 본 발명의 방법은 세포 바깥쪽, 예컨대 피부의 외부 디바이스로 하나 이상의 분석물의 존재 및/또는 양에 상응하는 신호를 전송하는 단계를 포함할 수 있다. 대상체의 세포(들) 또는 피부는 세포(들)로부터의 신호를 검출하기 위해 적응된 디바이스 가까이에 커플링되거나 있을 수 있다.
예컨대 전기 신호로 추가로 전환될 수 있는, 인디케이터의 어떠한 신호든지 본 발명에 적합하다. 발명의 한 구체예에서, 인디케이터 신호는 전기 신호로 전환된다.
예를 들어 발명의 한 구체예에서, 외부 광원 및 형광측정기가 예컨대 GFP 또는 FRET 쌍으로부터의 형광을 사용하여 예컨대 글루코오스와 관련된 인디케이터 신호의 측정을 위해 변형된 세포 가까이에 놓일 수 있다. 다른 실례에서 도 6의 셋업 및/또는 도 7의 셋업을 포함하는 측정 셋업 또는 디바이스가 본 발명에 사용될 수 있다. 발명의 한 구체예에서, 측정은 손목 디바이스 아래에 있는 피부를 조명하기 위해 저비용의 LED를 사용한 후 인디케이터 신호를 저비용의 광검출기를 사용하여 판독함으로써 수행된다. LED 및 광검출기는 둘 다 주변의 빛이 실제 측정을 방해하지 않게 하는 방식으로 손목 디바이스의 바닥 표면에 놓일 수 있다.
본 발명의 모니터링 단계는 비-수술적 또는 비-침습성 수단에 의해 세포의 분석물의 존재, 부재 또는 양을 검출한다. "비-수술적" 또는 "비-침습성"이란 피부에 손상이 생성되지 않고 모니터링이 대상체 또는 세포 내부에서 수행되지 않는 것을 의미한다.
발명의 한 구체예에서, 방법은 추가로 인디케이터 신호를 값, 정량적 또는 정성적 값, 수치, 결과를 드러내는 동향 또는 온/오프 결과로 전환시키는 단계를 포함한다. 발명의 특정 구체예에서, 세포로부터의 신호를 검출하기 위해 조정된 디바이스는 판독기 디바이스이거나 또는 사용자에게 친숙한 방법으로 결과를 나타내는 데 필요한 전자디바이스 및/또는 신호 프로세서를 가진 판독기 디바이스를 포함한다. 본 발명에 적합한 모니터링 셋업 또는 디바이스는 한정하는 것은 아니지만 예컨대 도 5B 내지 8에 기술되거나 도시된 것들을 포함한다.
발명은 또한 인디케이터를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 재생 세포의 DNA에 삽입시킴으로써 재생 세포를 변형시키는 수단, 여기서 인디케이터를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열은 상기 재생 세포에 표적 폴리뉴클레오타이드와 함께 발현될 것이고; 및 대상체의 피부에서 인디케이터의 신호 또는 그것의 부재를 모니터링하기 위한 수단을 포함하는 시스템에 관련된다. 한 구체예에서, 시스템은 추가로 변형된 세포를 대상체의 피부에 또는 대상체 안으로 투여하기 위한 수단을 포함한다. 발명의 한 구체예에서, 시스템은 또한 변형될 재생 세포를 포함한다.
발명의 특정 구체예에서, 시스템은 본 발명의 방법을 수행하기 위한 것이다.
본원에서 사용되는 "재생 세포를 변형시키기 위한 수단"은 재생 세포를 변형시키기 위한 임의의 디바이스 및/또는 제제를 나타내고 예를 들면 재생 세포를 변형시키기 위한 키트, 변형을 수행하기 위해 필요한 시약(예컨대 완충제), 적합한 프라이머 또는 프로브, 인디케이터(들)을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드(들) 및 세포를 변형시키기에 적합한 피펫 또는 바이알과 같은 디바이스로 구성되는 군으로부터 선택될 수 있다. 재생 세포를 변형시키기 위한 방법은 앞서 개시에서 기술되었고 기술분야의 숙련자의 일반적인 지식에 속한다.
본원에서 사용되는 "대상체의 피부에서 인디케이터의 신호 또는 그것의 부재를 모니터링하기 위한 수단"은 대상체의 피부에서 인디케이터 신호를 모니터링하기 위한 임의의 디바이스, 장치 또는 셋업을 나타낸다. 적합한 디바이스, 장치 또는 셋업의 예는 개시에서 앞서 기술되었고 기술분야의 숙련자의 일반적인 지식 내에 있다.
본원에서 사용된 "변형된 세포를 대상체의 피부에 또는 대상체 안으로 투여하기 위한 수단"은 세포를 적용하기 위해 사용된 임의의 디바이스 및/또는 제제를 나타내고, 예컨대 바늘, 주사기, 피펫, 바이알, 로션, 크림, 액체 및 임의의 다른 제제, 예컨대 허용되는 담체, 완충제, 부형제, 보조제, 첨가제, 방부제, 충전제, 안정화제 및/또는 증점제, 및/또는 상응하는 제품에서 일반적으로 발견되는 임의의 성분들로 구성되는 군으로부터 선택될 수 있다. 적합한 성분 및 적절한 수단의 선택은 기술분야의 숙련된 사람의 지식 수준에 속한다.
기술분야의 숙련자에게는, 기술이 진보함에 다라, 발명의 개념이 다양한 방법으로 실행될 수 있는 것이 분명할 것이다. 발명 및 그것의 구체예들은 상기 기술된 실례들에 한정되지 않지만 청구범위의 범주 내에서 달라질 수 있다.
실시예
실시예 1. 마커로서 사용될 유전자들의 확인
발명의 한 실시예에서 글루코오스 반응성 유전자를 마우스 피부로부터 스크리닝하였다:
피부에서 생체내 글루코오스 반응을 마우스를 사용하여 측정하였다. 동물들을 12시간 동안 금식시킨 후, 체중을 측정하고 라타네스트(ratanest)를 사용하여 마취시키고 2 그룹으로 나누었다. 실험 동물들을 용액 중의 2g/kg D-글루코오스로 복강내 주사하고 완충액 중의 본 발명자들의 D-글루코오스로 대조동물을 주사하였다. 혈당을 모든 동물에서 스트립을 포함한 Bayer ContourR 혈당계를 사용하여 측정하였다. 45분 후에, 혈당은 최대치에 도달하였고 동물들을 경부 탈구로 죽인 후, 등 피부의 털을 깍고, 70% EtOH로 소독한 후 피부 샘플을 절단하고 액체 N2 중에 즉시 냉동시켰다. RNA를 TrizolTM(Thermofisher, Vantaa, Finland)로 추출하고, 냉동된 피부를 TissulyzerTM(Qiagen, Helsinki, Finland)에서 두 개의 7 mm 금속 비드 사이에 5분 동안 분리시킨 후, 비드를 제거하고, 피부 용해물을 10분 동안 10000 g에서 4℃에서 원심분리한 다음 상층액을 0.2 부피의 CHCl3과 혼합하여 15초 동안 혼합하고, 실온에서 인큐베이션하고 18분 동안 12000 g에서 원심분리하였다. 그런 다음 과정을 제조자에 의해 권고된 대로 계속하였다. 농도를 측정하고 Qiaxel(Qiagen, Helsinki, Finland)에서 RNA 강도의 캐널라이징(canalizing) 후에, 12 μg의 총 RNA를 1/10 부피의 Na-아세테이트 pH 5.3 및 2.5 부피의 100% EtOH로 침전을 형성시키고 H2O에 재현탁한 후, 폴리A RNA를 폴리(A)PuristTM(Ambion, Austin, USA)를 사용하여 제조자의 설명을 따라 선택하였다. 6개의 샘플(3개는 기준선으로부터, 및 3개는 글루코오스-주사된 동물로부터)로부터의 폴리A-RNA로부터 라이브러리를 만들어서 서열을 분석하였다. 대조군과 글루코오스 주사된 동물 사이의 판독을 비교하였다. 적어도 2배의 변화(+ 또는 -) 및 p 값 < 0.1을 가진 유전자들을 글루코오스에 대해 민감한 것으로 간주하였다. 이것을 증명하기 위해 QPCR을 RAN-서열에 대해 사용한 것과 다른 동물로부터의 샘플에 대해 수행하였다.
RNA를 수득하는 시간을 자극에 대한 반응을 보이는 혈액 테스트에 의해 측정하였고(실험 자극에 따라: 혈액 또는 체액으로부터 검출될 수 있는 암-관련 분자, 프리온 단백질, 아밀로이드 단백질, 임의의 병리학 관련 분자에 대한 반응일 수 있음) 동시에 건강한/자극받지 않은 대조군과 비교하였다.
2와 같거나 2보다 큰 배수의 변화로 계산된 유전자를 후보로 간주하였다.
이 방법에 의해 확인한 많은 유전자의 동시의 유의미한 변화를 자극의 특징으로 간주하였다.
후보들을 2가지 기준으로 선택하였다:
1: 어린 동물 및 늙은 동물 둘 다에서 자극에 대해 반응함(5마리 대조군 및 5마리 처리됨), 상향 또는 하향-조절된 일시적 반응으로 간주함
2a: 어린 동물 및 늙은 동물 둘 다에서 상향-조절에 의해 자극에 대해 반응함(장기간 반응은 글루코오스가 혈액으로부터 제거되자마자 저하되지 않음)
2b: 상향-조절에 의해 자극에 대해 반응하고 고혈당증으로 상향-조절된 상태를 유지함(제거하기 위한 인슐린이 충분하지 않음)
일시적으로 변화된 유전자들을 표 1에 나타낸다.
Figure pct00001
장기간 변화된 유전자를 표 2에 열거한다.
Figure pct00002
예를 들어 표 1, 2 또는 3, 또는 도 9 또는 10의 글루코오스 반응성 유전자 또는 그것들의 임의의 조합 중 어느 것이든지 본 발명에 활용될 수 있다.
상기 언급된 검정은 예를 들어 인슐린을 생성하는 데 있어서 췌장의 기능성을 테스트할 때 인간에서 또한 일상적이다.
글루코오스 주사 후에 상향-조절되는 단백질을 확인하는 것을 목표로 하는 실험의 또 다른 세트에서, 건강한 및 제 1 형 당뇨병 마우스를 사용하였다. 이 목적을 위해, 제 1 형 당뇨병을 마우스 하위세트에서 4 내지 8주 되었을 때 시트레이트 완충액(pH 4.5) 중의 150 mg/kg의 스트렙토조토신(STZ)을 단일 정맥내 주사(마취 하에)함으로써 유도하였다. 혈당을 48시간마다 모니터링하였고, 주사 후 1주 후에 모든 STZ-처리된 마우스는 당뇨병에 걸렸다. 그런 다음 마우스를 다음과 같이 4개의 연구 그룹(n=11)으로 나누었다:
G1: 물을 주사한 건강한 마우스(대조군, Ctrl)
G2: 글루코오스를 주사한 건강한 마우스(대조군, Ctrl)
G3: 물을 주사한 제 1 형 당뇨병 마우스
G4: 글루코오스를 주사한 제 1 형 당뇨병 마우스
단백질을 각 연구 그룹으로부터의 6개의 피부 샘플로부터 추출하여 단백질체학 분석을 수행하였다. 이 목적을 위해, 피부 조각을 절단하고 2개의 5 mm 금속 비드를 함유한 사전-냉각된 튜브에 넣었다. 피부를 TissueLyser(Qiagen)에서 아래에서 개시될 1 ml의 용해 완충액을 사용하여 5분 동안 50 Hz에서 용해시켰다. 남겨진 두꺼운, 파괴되지 않고 불용성인 막 조각을 제거하였다. 그런 다음 샘플을 15분 동안 13000 rpm에서 4℃에서 회전시키고 상층액을 새로운 튜브에 넣고 -70℃에서 보관하였다. 단백질 농도를 Pierce BCA 키트(Thermo Fisher)를 사용하여 제조자의 설명을 따라 측정하였다. 대조군 마우스로부터의 동일한 양의 총 단백질(50μg)을 Cy3(최소 DIGE)으로 표지하고 IEF(pH4 내지 7) 및 SDS-PAGE에 의해 분리하였다. 단백질 반점 위치의 변화를 검출한 후, 각 단백질의 발현 프로파일을 정량하고 통계학적으로 분석하였다. 단백질 발현을 p 값이 <0.05였을 때 유의미하게 감소 또는 증가된 것으로 간주하였다.
용해 완충액
25 mM HEPES
0.3 M NaCl,
1.5 mM MgCl2,
0.2 mM EDTA
0.1% Triton X-100,
0.5 mM 다이티오트레이톨,
100 μl 최종 부피에 대해 1 정의 프로테아제 억제제(Sigma).
100 μl 최종 부피에 대해 2 정의 포스파타제 억제제(Sigma, Mirja 스톡).
결과는 3개의 단백질이 건강한 마우스 및 제 1 형 당뇨병 마우스 둘 다에서 글루코오스 주사 후에 유의미하게 증가된 것(p<0.05)을 나타냈다. 이 단백질들 및 상이한 연구 그룹 사이에서 그것들의 관련된 발현 비율을 하기 표 3에 나타낸다:
단백질 비율 T-테스트
G2/G1 G3/G1 G4/G1 G4/G2 G4/G3 G2/G1 G3/G1 G4/G1 G4/G2 G4/G3
알파-2-HS-당단백질 0.80
 1.51 1.17 1.46 0.78 0.03 0.00 0.18 0.02 0.05
단백질 LYRIC 1.32 1.45 2.19 1.66 1.51 0.01 0.09 0.00 0.00 0.02
확인된 글루코오스-반응성 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 인디케이터를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드와 함께 발현될 적합한 표적 폴리뉴클레오타이드의 비-제한적인 예이다.
발명의 추가의 실례에서, 글루코오스 반응성 유전자를 피부 전구세포로부터 스크리닝하였다:
피부 전구세포(SKP)를 앞서 기술된 것과 같이 성형 수술을 진행한 환자의 정상적인 인간 피부로부터 분리하였다(Rezvani HR et al. J Clin Invest. 2011 Jan;121(1):195-211). 간단히 설명하면, 새로운 피부 단편을 5X5 mm 조각으로 즉시 절단하고, 트립신으로 3시간 동안 37℃에서 또는 밤새 4℃에서 처리하여 표피를 진피로부터 분리하였다. SKP를 하이드로코르티손(0.5 mg/ml), 상피 성장 인자(10 ng/ml), 인슐린(5 mg/ml)이 첨가된 케라틴생성세포-SFM(1X) 배지에 105 세포/cm2의 농도로 시딩하였다. 배지를 주 3회 교체하였다. 배양이 70 내지 80%의 집밀도에 도달했을 때, 세포를 10% 트립신으로 탈착시킨 후 케라틴생성세포-SFM(1X) 배지에 재현탁하여 변환 실험(예컨대 실시예 3에서 기술하는 것과 같음)을 위해 사용하거나 또는 글루코오스 처리(예컨대 실시예 1 또는 2에서 기술하는 것과 같음)를 위해 사용하거나, 및/또는 이식 실험(예컨대 실시예 4에서 기술하는 것과 같음)에 사용하였다.
글루코오스 반응성 유전자를 발견하기 위하여, SKP를 2가지 농도의 글루코오스(6 및 26 mM)로 처리하였다. RNA 샘플을 상이한 종점(5- 45- 90분 및 6시간, 24시간)에서 수집하였다. RNA 추출 및 RNA-Seq를 마우스 피부와 관련하여 글루코오스 반응성 유전자에 관해상기 기술한 것과 같이 수행하였다.
결과에 따라 예를 들어 표 1, 2 또는 3, 또는 도 9 또는 10의 글루코오스 반응성 유전자 또는 그것들의 임의의 조합 중 어느 것이든지 본 발명에 활용될 수 있다.
실시예 2. 마우스 피부로부터의 피부 줄기 세포의 분리
피부 줄기 세포를 6 내지 8주령 마우스의 피부로부터 분리하였다. 마우스들을 희생(경부 탈구에 의해)시킨 후 털을 깎았다. 피부를 10% 베타딘이 들어있는 비이커에 2분 동안, 70% 에탄올이 들어있는 비이커에 1분 동안 침지한 후 멸균 PBS에 1분 동안 침지함으로써 멸균시켰다. 피부 샘플을 트립신으로 밤새 4℃에서 처리하였다. 표피를 진피로부터 분리하고, 갈은 후 트립신을 함유한 멸균 50 ml 팔콘 튜브에 옮겼다. 표피 분획을 40 mm 필터를 통해 여과하고 세포 펠릿을 0.5% BSA가 들어있는 PBS에 현탁시킨 후 CD34 및 CD49f(α6-인티그린) 항체로 얼음에서 1시간 동안 염색하였다. 염색 분석을 유동 세포분석(FACS)을 사용하여 수행하였다. CD34 및 CD49f 양성 세포를 선택하고 FAD-DMEM 배지에 플레이팅하였다.
세포를 공급자(섬유모세포 세포주인 3T3 세포)와 공동-배양하였다. 이 마지막 세포는 피부 줄기 세포에 줄기 세포의 성장에 필요한 모든 부착 분자를 제공하였다. 그러나, 일부 처방 후에 본 발명자들은 줄기 세포와 3T3 세포의 공동-배양이 피부 줄기 세포의 정상적인 증식에 영향을 미쳤음을 알게 되었다. 본 발명자들은 어떠한 공급자 없이 피부 줄기 세포를 배양하기로 결정하였고 상이한 마우스 개체로부터 상이한 피부 줄기 세포를 준비할 수 있었다. 또한, 본 발명자들은 계대 2가 될 때까지 줄기 피부 세포를 유지할 수 있었다. 이 기술은 생검을 통해 피부 세포를 분리하고, 온건한 효소 처리에 의해 세포를 분리하고 항체 마커 세트를 사용하여 세포 및 다른 피부 구성 세포들의 줄기 세포 푸울을 정제하기 위하여 FACS를 사용하는 것에 대해 유사하게 적용하였다. 그러한 세포를 세포 배양에 넣고 유전자 편집을 그 안에서 시행하였다. 기술을 활용할 수 있게 되었을 때 표적화된 유전자 편집은 또한 피부 줄기 세포 표적화 엑소좀을 사용함으로써 생체내에서 이루어지는 것이 목표가 된다.
상이한 유형의 세포를 두 가지 농도의 글루코오스(6 및 26 mM)로 일상적인 글루코오스 도전, 내성 프로토콜에 따라 처리하였다. RNA 샘플을 이 세포들로부터 상이한 종점에서(5-, 45- 및 90분 및 6시간, 24시간) 상업적 키트에 따라 수집하였고 RNA 추출, RNA 서열분석 및 QPCR을 글루코오스 반응성 유전자를 발견하기 위하여 실시예 1에서 기술한 대로 수행하였다(표 1, 2 및 3, 도 9 및 10 참조).
실시예 3. 세포 DNA로의 인디케이터 폴리뉴클레오타이드 서열의 삽입
임의의 공지된 인디케이터 또는 인디케이터들이 본 발명에 사용될 수 있다. 적합한 인디케이터는 기술분야의 숙련자에게 잘 알려져 있고 기술분야의 숙련자는 이 인디케이터들을 언제 어떻게 사용하는지 안다. 적합한 인디케이터의 예는 한정하는 것은 아니지만 형광 단백질, 녹색 형광 단백질(GFP), GFP 유도체, 광단백질(예컨대 반딧불이 루시페린 단백질), mCherry, 황색 형광 단백질, 토마토 적색 단백질, 루시페라제 리포터, FRET 도너 및/또는 수용체 단백질, 앱타머 폴리뉴클레오타이드 및/또는 앱타머 폴리펩타이드, myc 태그, 플래그 태그, 할로 태그, 비오틴/아비딘 태그 및 그것들의 변형, 비천연 염기 및 운반 RNA 및 아미노산 기반 태그 부착, 전기 인디케이터로서 작용하는 폴리펩타이드 및 멜라닌 및 눈 색 피그먼트와 같은 피그먼트를 암호화하는 유전자를 포함한다. 한 구체예에서, 인디케이터는 GFP이다.
인디케이터 폴리뉴클레오타이드를 표적 DNA에 삽입하기 위하여 임의의 공지된 방법 및 수단이 본 발명에 사용될 수 있다. 적합한 방법 및 수단은 기술분야의 숙련자에게 잘 알려져 있고 기술분야의 숙련자는 이 방법 및 수단을 언제 어떻게 사용하는지 안다. 적합한 방법의 예로는, 한정하는 것은 아니지만 징크 핑거 뉴클레아제, 전사 활성화제-유사 이펙터 뉴클레아제(TALEN), CRISPR/Cas 시스템 또는 엔지니어링된 메가뉴클레아제 재-엔지니어링된 호우밍 엔도뉴클레아제를 포함한다.
한 구체예에서, 인디케이터(예컨대 GFP) 폴리뉴클레오타이드는 피부에서 글루코오스 반응성으로서 확인되고 예컨대 표 1, 2 또는 3, 또는 도 9 또는 10에서 언급된 유전자에, 또는 상기 유전자와 함께 발현되기 위해 상기 유전자에 가까이 삽입되었다. 도 9에 따르면, 칼크레인 6, Sprr1 및 Pyhin1 유전자 발현은 글루코오스의 유효성을 변형시켰을 때 극적으로 변화하였다. 이 유전자 서열을 공공 데이터뱅크(NIH, EMBL)로부터 유도하였다. crisp/cas 기술 기반 구성물, 그로써 이 유전자 각각에 대한 가이드 RNA를 디자인하고 상업적 공급원으로부터 얻었다. 기존의 일상적이고 상업적으로 활용 가능한 기술을 사용함으로써 가이드 RNA 및 cas를 인간 또는 동물의 피부 재생 세포, 예컨대 실시예 2의 세포에 도입한다. GFP의 뉴클레오타이드 서열의 표적 유전자 칼크레인 6, Sprr1b 및 Pyhin 1에의(또는 그것들 가까이에의) 삽입은 Sander와 Joung (2014, Nature Biotechnology 32, 347-355)의 기사에서 기술된 방법에 따라 수행한다. 지정된 가이드 RNA에 의해 생성된 유전자 편집은 서열 분석, PCR 및 서던 블롯팅에 의해 확인된다. 표적을 벗어난 것 또한 유전자 편집된 세포로부터의 게놈으로부터 광범위한 서열 데이터에 의해 분석한다. 일단 이것이 완료되면 유전자 편집된 세포에 인디케이터의 기능성의 테스트를 수행한다. 예를 들어 GFP는 실제로 예상과 같이 거동한다. 재생 세포를 글루코오스 및 인슐린에 노출시키고 인디케이터의 변화를 GFP로부터 방출된 에너지를 기반으로 한 공초점 현미경에 의해 판독한다. 일단 이것이 확인되면 인디케이터를 함유한 리포터 세포를 규정하고, 본 발명의 기술에서 묘사된 디자인된 유전자 유전자좌를 본 발명의 개시에서 기술된 기술들에 의해 누드 마우스에 생체내 이식한다. 그런 다음 재생 리포터를 가진 세포의 기능성을 생체내에서 글루코오스 내성 테스트에 노출시킨다. 과정의 이 부분은 생체내에서 인디케이터의 적절한 기능성을 확인하는 작용을 한다. 바이오리포터 생성 과정에서 이 단계 후에 세포를 본 개시에서 개관한 것과 같이 피부 재생을 진행하는 피부층에 이소성(ectopic) 대상체 피부 기공 제공 세포로서 또는 구성요소로서 전달된다.
발명의 한 구체예에서, 인디케이터 폴리뉴클레오타이드 서열을 하기 실시예 3에서 기술하는 것과 같이 세포 DNA 안에 삽입하였다.
CRISPR 렌티바이러스 입자 및 피부 전구세포 형질도입
실시예 1 또는 2의 RNA-Seq 데이터는 칼리크레인(kallikrein) 하위패밀리 구성원들 중 한 유전자인 KLK6(칼리크레인 관련 펩티다제 6)이 생체내에서(마우스에서) 및 시험관내에서(전구세포) 글루코오스 주사 후에 유의미하게 상향 조절되었음을 보여주었다. SKP에서 KKL6의 발현을 녹아웃하기 위하여, CRISPR 렌티바이러스 입자를 3개의 gRNA 서열: AAGCATAACCTTCGGCAAAGGG(SEQ ID NO: 1), GAGCAGAGTTCTGTTGTCCGGG(SEQ ID NO: 2), 및 CCCTGACTATGATGCCGCCAGC(SEQ ID NO: 3)(Sigma-Aldrich, Finland)을 기반으로 구성하였다. 렌티바이러스 입자는 2개의 선택 마커(GFP 및 Puro)를 함유하였고, 세포 집단을 모니터링하기 위한 다중 옵션을 제공한다.
형질도입을 위해, 실시예 1의 인간 피부 전구세포(T25 플라스크당 5 Х 105 세포)를 24시간 동안 완전 배지에서 인큐베이션하였다. 감염 전에, 배지를 제거하고, 세포를 바이러스 상층액과 함께 24시간 동안 37℃에서 8 μg/ml의 프로타민 설페이트의 존재하에 인큐베이션하였다. 5일 후에, 형질도입 효율을 GFP-양성 세포의 백분율을 기준으로 유동 세포분석(FACS)에 의해 측정하였다.
유전자 편집을 확인하기 위한 웨스턴 블롯팅 과정
KLK6 녹아웃의 효율을 증명하기 위하여, 웨스턴 블롯팅을 앞서 기술한 것과 같이 수행하였다((Rezvani HR et al. J Clin Invest. 2011 Jan;121(1):195-211). 간단히 설명하면, 동일한 양의 총 단백질을 SDS-PAGE에 의해 분해하고 PVDF 막에 전기영동에 의해 전달하였다. 그런 다음 막을 밤새 4℃에서 1:200 희석의 항-KLK6(클론 4A10, Sigma-Aldrich, Finland), 및 1:1000 희석의 항-β-악틴 항체(ab8227, abcam)와 함께 인큐베이션하였다. 1:10,000 희석의 항-면역글로빈 양고추냉이-과산화효소-결합 항체(Vector Laboratories)와 함께 1시간 동안 추가로 인큐베이션한 후에, 블롯을 화학발광 ECL 시약(Amersham Biosciences, Finland)을 사용하여 전개시켰다.
CRISPR/Cas9를 가진 피부 전구세포에서 KLK6 유전자의 고갈에 대해 사용된 방법을 GFP 센서와의 KLK6 융합을 과잉발현시키기 위해 활용한다. 그런 다음 GFP 센서와의 KLK6 융합을 과잉발현하는 변형된 세포를 마우스 또는 인간 대상체에 주사하거나 그것들의 피부에 놓는다.
실시예 4. 피부 세포를 수령체에 통합하기 위한 기술의 개발
이식 실험을 GFP+ 세포(GFP 마우스로부터의)의 WT 수령체 마우스로의 통합을 테스트하기 위하여 수행하였다. 2개의 상이한 방법(A 및/또는 B)을 사용하였다. 예를 들어 A 또는 B 또는 A와 B 둘 다를 본 발명의 방법에 활용할 수 있다. 또한, 변형된 세포가 모낭 또는 땀샘에 들어갈 때 유전자적으로 변형된 세포 또는 상기 세포를 포함하는 조성물을 대상체(예컨대 마우스 또는 인간 대상체)의 피부 상부에 적용함으로써 유사한 결과를 얻는다.
A. 실리콘 챔버를 사용하는 피부 줄기 세포의 이종이식(도 1).
GFP 양성 세포를 상기 기술한 것과 같이 제조하고, 2x106 세포를 실리콘 챔버에 주입하였다. 그 결과는 도너 세포가 수령체 스킨 마우스에 잘 통합(증식 및 이동)될 수 있었고 적어도 2개월 동안 그대로 있는 것을 나타냈다. 이 결과들을 GFP 항체 면역염색에 의해 확인하였다.
B. WT 수령체 마우스의 등에서 GFP 피부 이식(전체 피부)(도 2).
이 프로토콜에서 본 발명자들은 GFP 마우스의 전체 피부를 작은 조각(잘게 자른 피부)으로 절단하였다. 이 조각들을 WT 마우스의 스몰 포켓(small pocket)에 주입하였다. GFP 피부의 통합을 형광 현미경에 의해 거의 2개월 동안 검출한 후 GFP 항체 면역염색에 의해 확인하였다.
도 3 내지 4는 이식 실험의 결과를 나타낸다. 도 5A는 본 발명의 방법이 작동되고 인디케이터 신호가 본 발명의 방법을 사용함으로써 피부로부터 얻어질 수 있는 것을 나타낸다.
변형된 재생 세포가 피부 병변을 함유한 피부 영역에의 국부 투여에 의해 비-침습성 방식으로 성공적으로 이식될 수 있는 것을 증명하기 위해 추가의 이식 실험을 수행하였다. 이 실험에 대해, 형광 GFP 단백질이 모든 기관, 특히 피부에서 구성적으로 발현되는 GFP-양성 마우스를 도너로서 사용하였다. 어떠한 형광 단백질 발현 없이 검은색인 C57BL/6 마우스를 수령체로서 사용하였다. C57BL/6 마우스를 CO2로 안락사시키고 등으로부터 털을 겸자를 사용하여 벗겨냈다. 일단 털이 제거되면, 등으로부터의 전체 피부를 수집하고 상이한 조각들로 절단하였다. 실리콘 챔버를 각 조각의 상부에 설치하였다. GFP-양성 줄기 세포를 상기에서 기술한 것과 같이 GFP 마우스로부터 새롭게 분리하고, 실리콘 챔버 안에 적용하였다. GFP 신호를 24 내지 72시간 후에 추적하였고, 이 세포들이 모낭에 통합되는 능력을 보여주기 위하여 사진을 취하였다.
이 실험의 결과는 피부 털의 제거가 유전자적으로 변형된 인디케이터 세포를 어떠한 주사 없이 피부 아래에서 단지 예컨대 크림으로서 피부 상부에 세포를 적용시킴으로써 피부에 통합시키기 위한 경로로서 사용될 수 있다는 것을 가리킨다.
발명의 한 구체예에서, 인간 피부 전구세포를 생체내에서 마우스에 이식한다. SKP 배양을 상기 실시예 1에서 기술한 것과 같이 수행한다. 이 세포들에 KLK6 GFP 융합을 과잉발현시키기 위해 렌티바이러스 입자 CRISPR로 형질도입시킨다. GFP-양성 세포의 백분율을 기반으로 한 FACS를 활용하여 형질도입 효율을 측정한다.
작은 실리콘 챔버를 스킨 마우스에 삽입하고 GFP 양성 세포를 주입한다. 주입 후 24시간 후에, 작은 홀(hall)을 적용한 후 주입후 1주일 후에 실리콘 챔버를 제거한다. GFP 양성 세포의 통합성을 형광 현미경을 사용하여 체크한다(1주, 2주, 1개월 및 2개월).
GFP 양성 세포의 수령체 마우스 및 대조군 마우스를 상이한 농도의 글루코오스로 처리한다. 그런 다음 KLK6의 발현을 GFP 신호 후에 추적하였고 이 유전자가 특이적인 글루코오스 바이오센서인 것을 보여준다.
이식 실험을 또한 인간에서 수행한다. 편집된 세포를 사람의 피부에 적용하거나 피부를 재생시킬 수 있는 피부의 기저 세포층 또는 표피에 투여한다. 다르게는, 타투 제작 유사 방법, 피어싱, 광학적 방사, 피부의 미세-마모, 모낭 구멍 또는 모낭에 영향을 미치는 끈적거리는 플라스터가 활용된다.
실시예 5. 세포의 생화학적 변화의 모니터링
임의의 공지된 모니터링 방법 및 수단을 특이적 유전자의 발현과 관련된 세포의 인디케이터 신호를 모니터링하기 위해 본 발명에 사용할 수 있다. 이 방법들은 기술분야의 숙련자에게 잘 알려져 있고 기술분야의 숙련자는 이 방법들을 언제 어떻게 사용하는지를 안다. 적합한 모니터링 방법의 실례는, 한정하는 것은 아니지만 자외선, 적외선, 생체발광 측정 또는 영상화와 같은 광학적 측정, 형광 측정 또는 영상화, 방사성 표지 또는 트레이서의 측정, 자기장의 사용 및/또는 X-선 또는 감마 방사선의 사용을 포함한다.
한 구체예에서, 모니터링을 광전자 방법 또는 수단(예컨대 초분광 방법 및/또는 카메라)을 활용함으로써 수행하였다. 본 발명에 적합한 모니터링 셋업 또는 디바이스는, 한정하는 것은 아니지만 예컨대 도 5B 내지 8에 기술되거나 도시된 것들을 포함한다.
<110> Teknologian Tutkimuskeskus VTT Oy <120> A method for obtaining indicator signals from a cell <130> 23987 <150> PCT/FI <151> 2016-12-22 <160> 3 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gRNA <400> 1 aagcataacc ttcggcaaag gg 22 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gRNA <400> 2 gagcagagtt ctgttgtccg gg 22 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gRNA <400> 3 ccctgactat gatgccgcca gc 22

Claims (23)

  1. 세포로부터 인디케이터 신호를 얻는 방법으로서, 상기 방법은
    대상체로부터 얻어진 재생 세포를 제공하는 단계,
    인디케이터를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 상기 재생 세포의 DNA 안으로 삽입함으로써 재생 세포를 변형시키는 단계로서, 인디케이터를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열은 상기 재생 세포에서 표적 폴리뉴클레오타이드와 함께 발현되는 단계,
    상기 변형된 재생 세포를 대상체에게 투여하는 단계,
    인디케이터의 신호 또는 그것의 부재를 대상체의 피부에서 모니터링함으로써, 상기 표적 폴리뉴클레오타이드의 발현과 관련된 인디케이터 신호를 얻는 단계를 포함하는 방법.
  2. 세포의 생물학적 상태를 측정하는 방법으로서, 상기 방법은
    대상체로부터 얻어진 재생 세포를 제공하는 단계,
    인디케이터를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 상기 재생 세포의 DNA 안으로 삽입함으로써 재생 세포를 변형시키는 단계로서, 인디케이터를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열은 상기 재생 세포에서 표적 폴리뉴클레오타이드와 함께 발현되는 단계,
    상기 변형된 재생 세포를 대상체에게 투여하는 단계,
    표적 폴리뉴클레오타이드의 발현과 관련된 인디케이터의 신호 또는 상기 인디케이터 신호의 부재를 대상체의 피부에서 모니터링하는 단계, 및
    상기 표적 폴리뉴클레오타이드의 발현에 의해 규정된 세포의 생물학적 상태를 측정하는 단계를 포함하는 방법.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 대상체는 투과성 피부 영역을 가지며 상기 변형된 재생 세포는 비-침습성 방식으로 상기 투과성 피부 영역에 국부 적용에 의해 투여되는 것인 방법.
  4. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 변형된 재생 세포는 타투 제작 유사 방법, 피어싱, 광학적 방사, 피부의 미세-마모 또는 대상체의 피부에 세포의 적용으로 구성되는 군으로부터 선택된 방법에 의해 상기 대상체에게 투여되는 것인 방법.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인디케이터 신호는 전기 신호로 전환되는 것인 방법.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 모니터링은 연속적으로 수행되는 것인 방법.
  7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 모니터링은 광학적, 전도성, 자기장, 방사선, 임피던스, 전기화학적, 음향적 및 생물학적 측정으로 구성되는 군으로부터 선택된 측정을 활용함으로써 수행되는 것인 방법.
  8. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서, 방법은 인디케이터 신호를 값, 정량적 또는 정성적 값, 수치, 결과를 드러내는 동향 또는 온/오프 결과로 전환시키는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
  9. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 방법은 재생 세포를 배양하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
  10. 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인디케이터는 형광 단백질, 녹색 형광 단백질(GFP), GFP 유도체, 광단백질(예컨대 반딧불이 루시페린 단백질), mCherry, 황색 형광 단백질, 토마토 적색 단백질, 루시페라제 리포터, FRET 도너 및/또는 수용체 단백질, 앱타머 폴리뉴클레오타이드 및/또는 앱타머 폴리펩타이드, myc 태그, 플래그 태그, 할로 태그, 비오틴/아비딘 태그 및 그것들의 변형물, 비천연 염기 및 운반 RNA 및 아미노산 기반 태그 부착, 전기 인디케이터로서 작용하는 폴리펩타이드 및 멜라닌 및 눈의 색 피그먼트와 같은 신체의 피그먼트를 암호화하는 유전자들로 구성되는 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  11. 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인디케이터를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열의 삽입은 부위-특이적 뉴클레아제를 사용함으로써 수행되는 것인 방법.
  12. 제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인디케이터를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열의 삽입은 징크 핑거 뉴클레아제(ZFN), 전사 활성화-유사 이펙터 뉴클레아제(TALEN) 매개된 게놈 편집 또는 CRISPR/Cas 시스템에 의해 수행되는 것인 방법.
  13. 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적 폴리뉴클레오타이드의 발현은 분석물에 의해 영향을 받는 것인 방법.
  14. 제 1 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적 폴리뉴클레오타이드는 글루코오스 반응성 폴리펩타이드, 성장 인자, 미토콘드리아 효소, 호르몬 반응성 폴리펩타이드, 스트레스 반응성 폴리펩타이드, 중추 또는 말초 신경계 기능의 폴리펩타이드, 알코올 또는 약물 반응성 폴리펩타이드, 질환 발달의 면역학적 모니터링에 사용된 폴리펩타이드, 압력 또는 연신과 같은 물리력의 변화를 나타내는 폴리펩타이드, 운동 중 또는 병원체 감염에서 물리적 부하에 의해 발현된 폴리펩타이드, 표 1, 표 2, 표 3, 도 9 또는 도 10의 목록에 제시된 임의의 폴리펩타이드, 및 그것들의 임의의 조합을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드들로 구성되는 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  15. 표적 폴리뉴클레오타이드의 발현과 관련된 인디케이터 신호를 모니터링하기 위한, 대상체로부터 얻어지고 표적 폴리뉴클레오타이드와 함께 발현될 인디케이터의 삽입된 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하도록 변형된 재생 세포의 사용으로서, 여기서 상기 모니터링은 상기 대상체의 피부에서 수행되는 사용.
  16. 대상체로부터 얻어지고 표적 폴리뉴클레오타이드와 함께 발현될 인디케이터를 암호화하는 삽입된 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재생 세포.
  17. 제 16 항에 있어서, 인디케이터 신호를 더 포함하는 것인 세포.
  18. 제 16 항 또는 제 17 항에 있어서, 상기 인디케이터 폴리뉴클레오타이드는 GFP이고 상기 표적 유전자는 표 1, 표 2, 표 3, 도 9 또는 도 10에 열거된 유전자들로부터 선택되는 것인 세포.
  19. 제 16 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항에 있어서, 세포는 대상체의 피부에서 표적 폴리뉴클레오타이드의 발현과 관련된 인디케이터 신호를 측정하기 위한 것인 세포.
  20. 세포의 분석물을 측정하기 위한, 인디케이터를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드의 사용으로서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 재생 세포에서 표적 폴리뉴클레오타이드에 삽입되고 표적 폴리뉴클레오타이드와 함께 발현될 것이며, 분석물은 표적 폴리뉴클레오타이드의 발현을 제어할 수 있는 것인 사용.
  21. 제 1 항 내지 제 20 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재생 세포는 피부 유래 재생 세포, 혈액 유래 재생 세포 및 iPS 세포로 구성되는 군으로부터 선택되는 것인 방법, 사용 또는 재생 세포.
  22. 인디케이터를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 재생 세포의 DNA 안으로 삽입함으로써 재생 세포를 변형시키기 위한 수단, 여기서 인디케이터를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열은 상기 재생 세포에서 표적 폴리뉴클레오타이드와 함께 발현될 것이며,
    대상체의 피부에 또는 대상체 안으로 상기 변형된 세포를 적용시키기 위한 수단, 및
    대상체의 피부에서 인디케이터의 신호 또는 그것의 부재를 모니터링하기 위한 수단을 포함하는 시스템.
  23. 제 22 항에 있어서, 제 1 항 내지 제 14 항 또는 제 21 항 중 어느 한 항의 방법을 수행하기 위한 것인 시스템.
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