JP2023134453A - Ｖｉ型ｃｒｉｓｐｒオルソログ及び系 - Google Patents

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Abstract

【課題】試料中の標的ＲＮＡを検出および／または定量するための組成物および方法を提供する。【解決手段】（ａ）Ｃａｓ１３ａ、（ｂ）Ｃａｓ１３ａと複合体を形成し、標的ＲＮＡ配列の標的配列への前記複合体の配列特異的結合を指向することができるガイド分子、及び（ｃ）非標的配列を含むＲＮＡベースのマスキング構築物、を含み、Ｃａｓ１３ａはコラテラルＲＮａｓｅ活性を示し、標的配列によって活性化されると、ＲＮＡベースのマスキング構築物の非標的配列を切断する、天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物を提供する。【選択図】なし

Description

関連出願及び参照による援用
本願は、２０１６年６月１７日に出願された米国仮特許出願第６２／３５１，６６２号明細書及び同第６２／３５１，８０３号明細書、２０１６年８月１７日に出願された米国仮特許出願第６２／３７６，３７７号明細書、２０１６年１０月１９日に出願された米国仮特許出願第６２／４１０，３６６号明細書、２０１６年１２月９日に出願された米国仮特許出願第６２／４３２，２４０号明細書、２０１７年３月１５日に出願された米国仮特許出願第６２／４７１，７９２号明細書、及び２０１７年４月１２日に出願された米国仮特許出願第６２／４８４，７８６号明細書に対する優先権を主張する。
２０１７年３月１５日に出願された米国仮特許出願第６２／４７１，７１０号明細書（発明の名称「Ｎｏｖｅｌ Ｃａｓ１３Ｂ Ｏｒｔｈｏｌｏｇｕｅｓ ＣＲＩＳＰＲ Ｅｎｚｙｍｅｓ ａｎｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ」、代理人整理番号：ＢＩ－１０１５７ ＶＰ ４７６２７．０４．２１４９）が参照される。更に、２０１６年１２月９日に出願された米国仮特許出願第６２／４３２，５５３号明細書、２０１７年２月８日に出願された米国仮特許出願第６２／４５６，６４５号明細書、及び２０１７年３月１５日に出願された米国仮特許出願第６２／４７１，９３０号明細書（発明の名称「ＣＲＩＳＰＲ Ｅｆｆｅｃｔｏｒ Ｓｙｓｔｅｍ Ｂａｓｅｄ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ」、代理人整理番号ＢＩ－１０１２１ ＢＲＯＤ ０８４２Ｐ）及び２０１７年４月１２日に出願された譲渡予定の米国仮特許出願（発明の名称「ＣＲＩＳＰＲ Ｅｆｆｅｃｔｏｒ Ｓｙｓｔｅｍ Ｂａｓｅｄ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ」、代理人整理番号ＢＩ－１０１２１ ＢＲＯＤ ０８４３Ｐ）が参照される。
本明細書に引用される文献中で引用又は参照される全ての文献は、本明細書で言及されるか又は本明細書に参照によって援用される任意の文献中にある任意の製品に関する任意の製造者の指示書、説明書、製品仕様書、及びプロダクトシートと共に、本明細書によって参照により本明細書に援用され、且つ本発明の実施に用いられ得る。より具体的には、参照される全ての文献は、各個別の文献について参照によって援用されることが具体的且つ個別に指示されたものとするのと同程度に参照によって援用される。
連邦政府支援研究に関する記載事項
本発明は、国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）から付与された助成金第ＭＨ１００７０６号及び第ＭＨ１１００４９号に基づく連邦政府の支援を受けて行われた。連邦政府は本発明に一定の権利を有する。
本発明は、概して、遺伝子転写物の摂動又は核酸編集など、クラスター化した規則的な間隔の短いパリンドローム反復（ＣＲＩＳＰＲ）及びその構成成分に関するベクター系を使用し得る配列ターゲティングを含む遺伝子発現の制御に用いられる系、方法及び組成物に関する。
ゲノムシーケンシング技法及び解析方法の最近の進歩により、様々な生物学的機能及び疾患に関連する遺伝因子をカタログ化し及びマッピングする能力は急速に向上している。個々の遺伝エレメントを選択的に摂動させることによる原因遺伝的変異の体系的なリバースエンジニアリングを可能にするとともに合成生物学、バイオテクノロジー的、及び医学的応用を進歩させるには、正確なゲノムターゲティング技術が必要である。標的化したゲノム摂動を生じさせるためにデザイナージンクフィンガー、転写アクチベーター様エフェクター（ＴＡＬＥ）、又はホーミングメガヌクレアーゼなどのゲノム編集技法が利用可能であるものの、新規戦略及び分子機構を利用した、且つ安価で、セットアップし易く、スケーリングが可能で、及び真核生物ゲノム及びトランスクリプトーム内の複数の位置を標的化するのに適した新規のゲノム及びトランスクリプトームエンジニアリング技術が依然として必要とされている。それは、ゲノムエンジニアリング及びバイオテクノロジーにおける新規適用の主要なリソースとなるであろう。
細菌及び古細菌適応免疫のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系は、タンパク質組成及びゲノム遺伝子座構成に関して極めて高度な多様性を示す。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系遺伝子座は５０を超える遺伝子ファミリーを有し、厳密な意味で普遍的な遺伝子はないことから、急速な進化及び遺伝子座構成の極めて高度な多様性が示唆される。これまでのところ、多方向からの手法をとることにより、９３個のＣａｓタンパク質について約３９５個のプロファイルのｃａｓ遺伝子が包括的に同定されている。分類に含まれるのは、シグネチャ遺伝子プロファイル＋遺伝子座構成のシグネチャである。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系の新規分類が提案されており、ここではこれらの系が大まかに２つのクラス、マルチサブユニットエフェクター複合体を有するクラス１と、Ｃａｓ９タンパク質に例示される単一サブユニットエフェクターモジュールを有するクラス２とに分けられる。クラス２ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系に関連する新規エフェクタータンパク質は、強力なゲノムエンジニアリングツールとして開発することができ、推定上の新規エフェクタータンパク質の予測並びにそれらのエンジニアリング及び最適化が重要である。
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ適応免疫系は微生物をＤＮＡ又はＲＮＡ－ＤＮＡ干渉によって外来遺伝要素から防御する。最近になって、クラス２ ＶＩ型単一成分ＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓエフェクターＣ２ｃ２（Ｓｈｍａｋｏｖ ｅｔ ａｌ．（２０１５）「多様なクラス２ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系の発見及び機能的特徴付け（Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｄｉｖｅｒｓｅ Ｃｌａｓｓ ２ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ Ｓｙｓｔｅｍｓ）」；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ ６０：１－１３；ｄｏｉ：ｈｔｔｐ：／／ｄｘ．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｍｏｌｃｅｌ．２０１５．１０．００８）がＲＮＡガイド下ＲＮアーゼとして特徴付けられた（Ａｂｕｄａｙｙｅｈ ｅｔ ａｌ．（２０１６），Ｓｃｉｅｎｃｅ，［Ｅｐｕｂ ａｈｅａｄ ｏｆ ｐｒｉｎｔ］，Ｊｕｎｅ ２；「Ｃ２ｃ２は単一成分プログラム可能ＲＮＡガイド下ＲＮＡターゲティングＣＲＩＳＰＲエフェクターである（Ｃ２ｃ２ ｉｓ ａ ｓｉｎｇｌｅ－ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ ＲＮＡ－ｇｕｉｄｅｄ ＲＮＡ－ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ＣＲＩＳＰＲ ｅｆｆｅｃｔｏｒ）」；ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．ａａｆ５５７３）。Ｃ２ｃ２（例えばレプトトリキア・シャーイイ（Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ ｓｈａｈｉｉ）由来）はＲＮＡファージ感染に対してロバストな干渉をもたらすことが実証された。インビトロ生化学分析及びインビボアッセイを通じて、３’Ｈ（非Ｇ）ＰＡＭが隣接するプロトスペーサーを有するｓｓＲＮＡ標的を切断するようにＣ２ｃ２をプログラムできることが示された。切断は、Ｃ２ｃ２の２つの保存されたＨＥＰＮドメインにある触媒残基によって媒介され、それらのドメインにおける突然変異は触媒不活性なＲＮＡ結合タンパク質を生じさせる。Ｃ２ｃ２は単一のガイドによって案内され、インビボで特定のｍＲＮＡを枯渇させるように再プログラムされることができる。ＬｓｈＣ２ｃ２は目的の特異的部位に標的化することができ、且つひとたびコグネイト標的ＲＮＡでプライミングされると非特異的ＲＮアーゼ活性を実行できることが示された。これらの結果はＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系に関する我々の理解を広げるとともに、Ｃ２ｃ２を生かして一連の広範なＲＮＡターゲティングツールを開発できる可能性を示している。
現在、Ｃ２ｃ２はＣａｓ１３ａとして知られる。本明細書における用語「Ｃ２ｃ２」が「Ｃａｓ１３ａ」と同義的に使用されることは理解されるであろう。
本願における任意の文書の引用又は特定は、かかる文書が本発明の先行技術として利用可能であることを承認するものではない。
多岐にわたる適用、詳細には真核生物系、より詳細には哺乳類系における適用を持つ、核酸又はポリヌクレオチド（例えばＤＮＡ又はＲＮＡ又はこれらの任意のハイブリッド若しくは誘導体）を標的化するための代替的且つロバストなシステム及び技法が喫緊に必要とされている。本発明はこの必要性に応え、関連する利点を提供する。本願の新規ＲＮＡターゲティング系がゲノム、トランスクリプトーム、及びエピゲノムターゲティング技術のレパートリーに加わることにより、詳細には真核生物系、より詳細には哺乳類系（細胞、器官、組織、又は生物を含む）及び植物系における、直接的な検出、分析及び操作を通じた特定の標的部位の研究及び摂動又は編集が変わり得る。本願のＲＮＡターゲティング系を有害作用なしにＲＮＡターゲティングに有効に利用するためには、これらのＲＮＡターゲティングツールのエンジニアリング及び最適化の側面を理解することが決定的に重要である。
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１３ファミリーは、ＣＲＩＳＰＲ系のシグネチャに関する細菌ゲノムのコンピュータマイニングによって発見されたもので（Ｓｈｍａｋｏｖ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．「多様なクラス２ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系の発見及び機能的特徴付け（Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｄｉｖｅｒｓｅ Ｃｌａｓｓ ２ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ Ｓｙｓｔｅｍｓ）」．Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ ６０，３８５－３９７，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｍｏｌｃｅｌ．２０１５．１０．００８（２０１５））、シングルエフェクターＲＮＡガイド下ＲＮアーゼＣａｓ１３ａ／Ｃ２ｃ２（Ａｂｕｄａｙｙｅｈ，Ｏ．Ｏ．ｅｔ ａｌ．「Ｃ２ｃ２は単一成分プログラム可能ＲＮＡガイド下ＲＮＡターゲティングＣＲＩＳＰＲエフェクターである（Ｃ２ｃ２ ｉｓ ａ ｓｉｎｇｌｅ－ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ ＲＮＡ－ｇｕｉｄｅｄ ＲＮＡ－ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ＣＲＩＳＰＲ ｅｆｆｅｃｔｏｒ）」．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３５３，ａａｆ５５７３，ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．ａａｆ５５７３（２０１６））及び後にシングルエフェクターＲＮＡガイド下ＲＮアーゼＣａｓ１３ｂ（Ｓｈｍａｋｏｖ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．「クラス２ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系の多様性と進化（Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ａｎｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｃｌａｓｓ ２ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ｓｙｓｔｅｍｓ）」．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ １５，１６９－１８２，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｒｍｉｃｒｏ．２０１６．１８４（２０１７）；Ｓｍａｒｇｏｎ，Ａ．Ａ．ｅｔ ａｌ．「Ｃａｓ１３ｂは、アクセサリータンパク質Ｃｓｘ２７及びＣｓｘ２８によって差次的に調節されるＶＩ－Ｂ型ＣＲＩＳＰＲ関連ＲＮＡガイド下ＲＮアーゼである（Ｃａｓ１３ｂ Ｉｓ ａ Ｔｙｐｅ ＶＩ－Ｂ ＣＲＩＳＰＲ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ＲＮＡ－Ｇｕｉｄｅｄ ＲＮａｓｅ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ Ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｂｙ Ａｃｃｅｓｓｏｒｙ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ Ｃｓｘ２７ ａｎｄ Ｃｓｘ２８）」．Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ ６５，６１８－６３０ ｅ６１７，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｍｏｌｃｅｌ．２０１６．１２．０２３（２０１７））が明らかとなった。Ｃａｓ１３ａとしても知られるクラス２ ＶＩ型エフェクタータンパク質Ｃ２ｃ２は、ｓｓＲＮＡを分解するように効率的にプログラムすることのできるＲＮＡガイド下ＲＮアーゼである。Ｃ２ｃ２（Ｃａｓ１３ａ）は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系に見られる他の公知のＲＮアーゼの触媒機構と対照的に、その２つのＨＥＰＮドメイン内にある保存された塩基性残基によってＲＮＡ切断を実現する。ＨＥＰＮドメインが４つの予測ＨＥＰＮドメイン触媒残基のいずれかで（例えばアラニン）置換など突然変異すると、Ｃ２ｃ２は不活性プログラム可能ＲＮＡ結合タンパク質（ｄＣａｓ９と似た、ｄＣ２ｃ２）に変換される。
ＲＮＡガイド下ＲＮアーゼＣａｓ１３は、そのプログラム可能性及び特異性により、トランスクリプトーム操作の理想的なプラットフォームとなり得る。本出願人らは、哺乳類転写物ノックダウン及び結合ツールとしての使用に向けたＣａｓ１３ａを開発する。レプトトリキア・シャーイイ（Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ ｓｈａｈｉｉ）由来のＣａｓ１３ａ（ＬｓｈＣａｓ１３ａ）は、プログラム可能ｃｒＲＮＡを使用して触媒不活性バージョンでロバストなＲＮＡ切断及び結合が可能であり、当該の切断はアイデンティティＨ（非グアニン）のプロトスペーサー隣接部位（ＰＦＳ）として知られる直接３’側に隣接するモチーフに依存した（Ａｂｕｄａｙｙｅｈ，Ｏ．Ｏ．ｅｔ ａｌ．「Ｃ２ｃ２は単一成分プログラム可能ＲＮＡガイド下ＲＮＡターゲティングＣＲＩＳＰＲエフェクターである（Ｃ２ｃ２ ｉｓ ａ ｓｉｎｇｌｅ－ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ ＲＮＡ－ｇｕｉｄｅｄ ＲＮＡ－ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ＣＲＩＳＰＲ ｅｆｆｅｃｔｏｒ）」．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３５３，ａａｆ５５７３，ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．ａａｆ５５７３（２０１６））。ＲＮＡが切断されると、活性化したＬｓｈＣａｓ１３ａは、構成的ＲＮアーゼ活性によって非標的ＲＮＡが切断される「コラテラル活性（ｃｏｌｌａｔｅｒａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ）」に関与する（Ａｂｕｄａｙｙｅｈ，Ｏ．Ｏ．ｅｔ ａｌ．「Ｃ２ｃ２は単一成分プログラム可能ＲＮＡガイド下ＲＮＡターゲティングＣＲＩＳＰＲエフェクターである（Ｃ２ｃ２ ｉｓ ａ ｓｉｎｇｌｅ－ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ ＲＮＡ－ｇｕｉｄｅｄ ＲＮＡ－ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ＣＲＩＳＰＲ ｅｆｆｅｃｔｏｒ）」．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３５３，ａａｆ５５７３，ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．ａａｆ５５７３（２０１６））。このｃｒＲＮＡによってプログラムされるコラテラル活性は、細菌によるインビボプログラム細胞死を可能にすることにより感染の伝播を防止し（Ａｂｕｄａｙｙｅｈ，Ｏ．Ｏ．ｅｔ ａｌ．「Ｃ２ｃ２は単一成分プログラム可能ＲＮＡガイド下ＲＮＡターゲティングＣＲＩＳＰＲエフェクターである（Ｃ２ｃ２ ｉｓ ａ ｓｉｎｇｌｅ－ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ ＲＮＡ－ｇｕｉｄｅｄ ＲＮＡ－ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ＣＲＩＳＰＲ ｅｆｆｅｃｔｏｒ）」．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３５３，ａａｆ５５７３，ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．ａａｆ５５７３（２０１６））、及びインビトロで核酸の特異的検出に適用されている（Ａｂｕｄａｙｙｅｈ，Ｏ．Ｏ．ｅｔ ａｌ．「Ｃ２ｃ２は単一成分プログラム可能ＲＮＡガイド下ＲＮＡターゲティングＣＲＩＳＰＲエフェクターである（Ｃ２ｃ２ ｉｓ ａ ｓｉｎｇｌｅ－ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ ＲＮＡ－ｇｕｉｄｅｄ ＲＮＡ－ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ＣＲＩＳＰＲ ｅｆｆｅｃｔｏｒ）」．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３５３，ａａｆ５５７３，ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．ａａｆ５５７３（２０１６）；Ｅａｓｔ－Ｓｅｌｅｔｓｋｙ，Ａ．ｅｔ ａｌ．「ＣＲＩＳＰＲ－Ｃ２ｃ２の２つの異なるＲＮアーゼ活性がガイド－ＲＮＡプロセシング及びＲＮＡ検出を可能にする（Ｔｗｏ ｄｉｓｔｉｎｃｔ ＲＮａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃ２ｃ２ ｅｎａｂｌｅ ｇｕｉｄｅ－ＲＮＡ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ａｎｄ ＲＮＡ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ）」．Ｎａｔｕｒｅ ５３８，２７０－２７３，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ１９８０２（２０１６））。コラテラル活性は、最近では、多くの臨床診断に有用なＳＨＥＲＬＯＣＫと称される高感度・高特異性核酸検出プラットフォームに利用された（Ｇｏｏｔｅｎｂｅｒｇ，Ｊ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．「ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１３ａ／Ｃ２ｃ２による核酸検出（Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１３ａ／Ｃ２ｃ２）」．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３５６，４３８－４４２（２０１７））。
細菌学的及び続く生化学的特徴付けにおけるＣａｓ１３ａオルソログのスクリーニングを経て、本出願人らはＲＮＡエンドヌクレアーゼ活性に最適なオルソログ、レプトトリキア・ウエイデイ（Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ ｗａｄｅｉｉ）のＣａｓ１３ａ（ＬｗａＣａｓ１３ａ）を選択する。ＬｗａＣａｓ１３ａは哺乳類細胞で安定に発現し、細胞においてレポーター及び内因性転写物の両方を有効にノックダウンするように再標的化することができ、観察可能なコラテラル活性なしにＲＮＡｉと比較して高度なターゲティング特異性のレベルを達成する。更に、本出願人らは、触媒不活性ＬｗａＣａｓ１３ａ（ｄＣａｓ１３ａ）がインビボでＲＮＡ転写物にプログラム可能に結合し、細胞内の転写物のイメージングに使用し得ることを示す。ｄＣａｓ１３ａをベースとしたネガティブフィードバックイメージングシステムをエンジニアリングすることにより、生細胞においてストレス顆粒の形成を追跡することができる。
ｄＣ２ｃ２（ｄＣａｓ１３ａ）が指定した配列に結合可能であれば、その能力を本発明に係る幾つかの態様に用いることにより、（ｉ）エフェクターモジュールを特異的転写物に持ち込んで機能又は翻訳を調節する（これは大規模スクリーニング、合成調節回路の構築及び他の目的に用い得る可能性がある）；（ｉｉ）特異的ＲＮＡに蛍光タグを付加してその輸送及び／又は局在を可視化する；（ｉｉｉ）特異的細胞内区画に親和性のあるドメインによってＲＮＡ局在を変化させる；及び（ｉｖ）特異的転写物を（ｄＣ２ｃ２を直接プルダウンするか、又はｄＣ２ｃ２を用いてビオチンリガーゼ活性を特異的転写物に局在させることにより）捕捉してＲＮＡ及びタンパク質を含めた近接分子パートナーをエンリッチすることができる。
活性Ｃ２ｃ２にもまた、多くの適用があるはずである。本発明のある態様は、ここでのＲＦＰと同様に、特異的転写物を破壊の標的にすることを含む。加えて、Ｃ２ｃ２は、ひとたびコグネイト標的によってプライミングされると、インビトロで他の（非相補的）ＲＮＡ分子を切断することができ、及びインビボで細胞成長を阻害することができる。生物学的には、この雑多なＲＮアーゼ活性は、ＶＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系のプログラム細胞死／休眠（ＰＣＤ／Ｄ）に基づく防御機構を反映し得る。従って、本発明のある態様では、Ｃ２ｃ２は、特異的細胞－例えば特定の転写物を発現する癌細胞、所与のクラスのニューロン、特異的病原体に感染した細胞、又は他の異常な細胞若しくはその存在が他に望ましくない細胞にＰＣＤ又は休眠を惹起するために使用し得る可能性がある。
本発明は、目的の標的遺伝子座、詳細には真核細胞、組織、器官、又は生物、より詳細には哺乳類細胞、組織、器官、又は生物の目的の標的遺伝子座に関連する又はそこにある核酸配列を改変する方法を提供し、この方法は、ＶＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ遺伝子座エフェクタータンパク質と１つ以上の核酸成分とを含む天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物を前記遺伝子座に送達することを含み、ここでエフェクタータンパク質は１つ以上の核酸成分と複合体を形成し、前記複合体が目的の遺伝子座に結合すると、エフェクタータンパク質は目的の標的遺伝子座に関連する又はそこにある配列の改変を誘導する。好ましい実施形態において、改変は鎖切断の導入である。好ましい実施形態において、目的の標的遺伝子座に関連する又はそこにある配列はＲＮＡを含み、及びエフェクタータンパク質はＶＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ遺伝子座によってコードされる。複合体はインビトロ又はエキソビボで形成されて細胞に導入されるか、又はＲＮＡと接触させてもよく；又はインビボで形成されてもよい。
用語のＣａｓ酵素、ＣＲＩＳＰＲ酵素、ＣＲＩＳＰＲタンパク質、Ｃａｓタンパク質及びＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓは概して同義的に用いられ、Ｃａｓ９に具体的に言及することによるなど、特に明らかでない限り、本明細書で言及する際は常に類推から本願に更に記載される新規ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質を指すことが理解されるであろう。本明細書に記載されるＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質は、好ましくはＣ２ｃ２エフェクタータンパク質である。
本発明は、目的の標的遺伝子座に関連する又はそこにある配列を標的化（改変など）する方法を提供し、この方法は、Ｃ２ｃ２遺伝子座エフェクタータンパク質（これは触媒活性であっても、或いは触媒不活性であってもよい）と１つ以上の核酸成分とを含む天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物を遺伝子座に関連する又はそこにある前記配列に送達することを含み、ここでＣ２ｃ２エフェクタータンパク質は１つ以上の核酸成分と複合体を形成し、前記複合体が目的の遺伝子座に結合すると、エフェクタータンパク質が目的の標的遺伝子座に関連する又はそこにある配列の改変を誘導する。好ましい実施形態において、改変は鎖切断の導入である。好ましい実施形態において、Ｃ２ｃ２エフェクタータンパク質は１つの核酸成分；有利にはエンジニアリングされた又は天然に存在しない核酸成分と複合体を形成する。複合体はインビトロ又はエキソビボで形成されて細胞に導入されるか、又はＲＮＡと接触させてもよく；又はインビボで形成されてもよい。目的の標的遺伝子座に関連する又はそこにある配列の改変の誘導は、Ｃ２ｃ２エフェクタータンパク質－核酸ガイド下であり得る。好ましい実施形態において、１つの核酸成分はＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）である。好ましい実施形態において、１つの核酸成分は成熟ｃｒＲＮＡ又はガイドＲＮＡであり、ここで成熟ｃｒＲＮＡ又はガイドＲＮＡはスペーサー配列（又はガイド配列）及びダイレクトリピート配列又はこれらの誘導体を含む。好ましい実施形態において、スペーサー配列又はその誘導体はシード配列を含み、ここでシード配列は、標的遺伝子座における配列の認識及び／又はそれとのハイブリダイゼーションに決定的に重要である。
本発明の態様は、１つ以上の天然に存在しない又はエンジニアリングされた又は改変された又は最適化された核酸成分を有するＣ２ｃ２エフェクタータンパク質複合体に関する。好ましい実施形態において、この複合体の核酸成分は、ダイレクトリピート配列に連結されたガイド配列を含むことができ、ここでダイレクトリピート配列は１つ以上のステムループ又は最適化された二次構造を含む。特定の実施形態において、ダイレクトリピートは１６ｎｔ、例えば少なくとも２８ｎｔの最小長さ及び単一のステムループを有する。更なる実施形態において、ダイレクトリピートは長さが１６ｎｔより長く、好ましくは１７ｎｔより長く、例えば少なくとも２８ｎｔであり、且つ２つ以上のステムループ又は最適化された二次構造を有する。詳細な実施形態において、ダイレクトリピートは、２５ｎｔ以上、例えば、２６ｎｔ、２７ｎｔ、２８ｎｔ以上、及び１つ以上のステムループ構造を有する。好ましい実施形態において、ダイレクトリピートは１つ以上のタンパク質結合ＲＮＡアプタマーを含むように改変されてもよい。好ましい実施形態において、ダイレクトリピートは１つ以上のタンパク質結合ＲＮＡアプタマーを含むように改変されてもよい。好ましい実施形態において、１つ以上のアプタマーは、最適化された二次構造の一部として含まれてもよい。かかるアプタマーはバクテリオファージコートタンパク質との結合能を有し得る。バクテリオファージコートタンパク質は、Ｑβ、Ｆ２、ＧＡ、ｆｒ、ＪＰ５０１、ＭＳ２、Ｍ１２、Ｒ１７、ＢＺ１３、ＪＰ３４、ＪＰ５００、ＫＵ１、Ｍ１１、ＭＸ１、ＴＷ１８、ＶＫ、ＳＰ、ＦＩ、ＩＤ２、ＮＬ９５、ＴＷ１９、ＡＰ２０５、φＣｂ５、φＣｂ８ｒ、φＣｂ１２ｒ、φＣｂ２３ｒ、７ｓ及びＰＲＲ１を含む群から選択され得る。好ましい実施形態において、バクテリオファージコートタンパク質はＭＳ２である。本発明はまた、３０以上、４０以上又は５０以上のヌクレオチド長である複合体の核酸成分も提供する。
本発明は、ＶＩ型エフェクタータンパク質及び／又はガイド及び／又はその標的核酸との複合体を含む細胞を提供する。特定の実施形態において、この細胞は、限定はされないが、酵母細胞、植物細胞、哺乳類細胞、動物細胞、又はヒト細胞を含めた真核細胞である。
本発明はまた、目的の標的遺伝子座、詳細には真核細胞、組織、器官、又は生物、より詳細には哺乳類細胞、組織、器官、又は生物の目的の標的遺伝子座を改変する方法も提供し、この方法は、Ｃ２ｃ２遺伝子座エフェクタータンパク質と１つ以上の核酸成分とを含む天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物を前記遺伝子座に送達することを含み、ここでＣ２ｃ２エフェクタータンパク質は１つ以上の核酸成分と複合体を形成し、前記複合体が目的の遺伝子座に結合すると、エフェクタータンパク質が目的の標的遺伝子座の改変を誘導する。好ましい実施形態において、改変は鎖切断の導入である。複合体はインビトロ又はエキソビボで形成されて細胞に導入されるか、又はＲＮＡと接触させてもよく；又はインビボで形成されてもよい。
かかる方法において目的の標的遺伝子座はＲＮＡ分子（ｍｏｌｅｄｕｌｅ）内に含まれてもよい。また、目的の標的遺伝子座はＤＮＡ分子内、及び特定の実施形態では転写されたＤＮＡ分子内に含まれてもよい。かかる方法において目的の標的遺伝子座はインビトロで核酸分子に含まれてもよい。
かかる方法において目的の標的遺伝子座は、細胞内、詳細には真核細胞、例えば哺乳類細胞又は植物細胞内の核酸分子に含まれてもよい。哺乳類細胞は、非ヒト霊長類、ウシ、ブタ、げっ歯類又はマウス細胞であってもよい。細胞は、家禽、魚類又はエビなどの非哺乳類真核細胞であってもよい。植物細胞は、キャッサバ、トウモロコシ、モロコシ、コムギ、又はコメなどの作物植物であってもよい。植物細胞はまた、藻類、樹木又は野菜であってもよい。本発明によって細胞に導入される改変は、抗体、デンプン、アルコール又は他の所望の細胞産出物などの生物学的産物の産生向上のため細胞及び細胞の子孫を変化させるようなものであり得る。本発明によって細胞に導入される改変は、産生される生物学的産物を変える変化が細胞及び細胞の子孫に含まれるようなものであり得る。
哺乳類細胞は、非ヒト哺乳動物、例えば、霊長類、ウシ、ヒツジ、ブタ、イヌ、げっ歯類、ウサギ科（Ｌｅｐｏｒｉｄａｅ）、例えば、サル、雌ウシ、ヒツジ、ブタ、イヌ、ウサギ、ラット又はマウス細胞であってもよい。細胞は、非哺乳類真核細胞、例えば、家禽類のトリ（例えば、ニワトリ）、脊椎動物魚類（例えば、サケ）又は甲殻類（例えば、カキ、ハマグリ（ｃｌａｉｍ）、ロブスター、エビ）細胞であってもよい。細胞はまた、植物細胞であってもよい。植物細胞は、単子葉植物又は双子葉植物のもの又は作物又は穀物植物のもの、例えば、キャッサバ、トウモロコシ、モロコシ、ダイズ、コムギ、オートムギ又はコメであってもよい。植物細胞はまた、藻類、樹木又は生産植物、果実又は野菜のもの（例えば、柑橘類の木、例えば、オレンジ、グレープフルーツ又はレモンの木などの木；モモ又はネクタリンの木；リンゴ又はセイヨウナシの木；アーモンド又はクルミ又はピスタチオの木などの堅果類の木；ナス科植物；アブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）の植物；アキノノゲシ属（Ｌａｃｔｕｃａ）の植物；ホウレンソウ属（Ｓｐｉｎａｃｉａ）の植物；トウガラシ属（Ｃａｐｓｉｃｕｍ）の植物；綿、タバコ、アスパラガス、ニンジン、キャベツ、ブロッコリー、カリフラワー、トマト、ナス、コショウ、レタス、ホウレンソウ、イチゴ、ブルーベリー、ラズベリー、ブラックベリー、ブドウ、コーヒー、ココア等）であってもよい。
本発明は、目的の標的遺伝子座を改変する方法を提供し、この方法は、ＶＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ遺伝子座エフェクタータンパク質と１つ以上の核酸成分とを含む天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物を前記遺伝子座に送達することを含み、ここでエフェクタータンパク質は１つ以上の核酸成分と複合体を形成し、前記複合体が目的の遺伝子座に結合すると、エフェクタータンパク質が目的の標的遺伝子座の改変を誘導する。好ましい実施形態において、改変は鎖切断の導入である。
本発明はまた、目的の標的遺伝子座を改変する方法も提供し、この方法は、Ｃ２ｃ２遺伝子座エフェクタータンパク質と１つ以上の核酸成分とを含む天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物を前記遺伝子座に送達することを含み、ここでＣ２ｃ２エフェクタータンパク質は１つ以上の核酸成分と複合体を形成し、前記複合体が目的の遺伝子座に結合すると、エフェクタータンパク質が目的の標的遺伝子座の改変を誘導する。好ましい実施形態において、改変は鎖切断の導入である。
かかる方法において目的の標的遺伝子座はインビトロで核酸分子に含まれてもよい。かかる方法において目的の標的遺伝子座は細胞内の核酸分子に含まれてもよい。好ましくは、かかる方法において目的の標的遺伝子座はインビトロでＲＮＡ分子に含まれてもよい。また好ましくは、かかる方法において目的の標的遺伝子座は細胞内のＲＮＡ分子に含まれてもよい。細胞は原核細胞又は真核細胞であってもよい。細胞は哺乳類細胞であってもよい。細胞はげっ歯類細胞であってもよい。細胞はマウス細胞であってもよい。
記載される方法の任意のものにおいて、目的の標的遺伝子座は目的のゲノム又はエピゲノム遺伝子座であってもよい。記載される方法の任意のものにおいて、複合体は、多重化した使用向けに複数のガイドと共に送達されてもよい。記載される方法の任意のものにおいて、２つ以上のタンパク質が用いられてもよい。
本発明の更なる態様において、核酸成分はＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）配列を含み得る。限定なしに、本出願人らは、かかる例において、ｐｒｅ－ｃｒＲＮＡが、成熟ｃｒＲＮＡを生じさせるプロセシング並びにエフェクタータンパク質へのｃｒＲＮＡのローディングに十分な二次構造を含み得ると仮定する。例として、及び限定ではなく、かかる二次構造は、ｐｒｅ－ｃｒＲＮＡ内、より詳細にはダイレクトリピート内にあるステムループを含んでもよく、それから本質的になってもよく、又はそれからなってもよい。
記載される方法の任意のものにおいて、エフェクタータンパク質及び核酸成分は、そのタンパク質及び／又は１つ又は複数の核酸成分をコードする１つ以上のポリヌクレオチド分子によって提供されてもよく、及びここで１つ以上のポリヌクレオチド分子は、タンパク質及び／又は１つ又は複数の核酸成分を発現するように作動可能に構成されている。１つ以上のポリヌクレオチド分子は、タンパク質及び／又は１つ又は複数の核酸成分を発現するように作動可能に構成された１つ以上の調節エレメントを含み得る。１つ以上のポリヌクレオチド分子は１つ以上のベクター内に含まれ得る。記載される方法のいずれにおいても、目的の標的遺伝子座は目的のゲノム又はエピゲノム遺伝子座であってもよい。記載される方法のいずれにおいても、複合体は多重化用途のため複数のガイドを伴い送達されてもよい。記載される方法のいずれにおいても、２つ以上のタンパク質が用いられてもよい。
調節エレメントは誘導性プロモーターを含み得る。ポリヌクレオチド及び／又はベクター系は誘導性系を含み得る。
記載される方法の任意のものにおいて、１つ以上のポリヌクレオチド分子は送達系に含まれてもよく、又は１つ以上のベクターが送達系に含まれてもよい。
記載される方法の任意のものにおいて、天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物は、リポソーム、ナノ粒子を含む粒子、エキソソーム、微小胞、遺伝子銃又は１つ以上のウイルスベクターによって送達されてもよい。
本発明はまた、本明細書で考察するとおりの特徴を有するか又は本明細書に記載される方法のいずれかに定義される組成物である天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物も提供する。
特定の実施形態において、従って本発明は、特に目的の標的遺伝子座を改変する能力を有する又は改変するように構成されている組成物など、天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物を提供し、前記組成物はＶＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ遺伝子座エフェクタータンパク質と１つ以上の核酸成分とを含み、ここでエフェクタータンパク質は１つ以上の核酸成分と複合体を形成し、前記複合体が目的の遺伝子座に結合すると、エフェクタータンパク質が目的の標的遺伝子座の改変を誘導する。特定の実施形態において、エフェクタータンパク質はＣ２ｃ２遺伝子座エフェクタータンパク質であってもよい。
本発明はまた、更なる態様において、特に目的の標的遺伝子座を改変する能力を有する又は改変するように構成されている組成物など、天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物も提供し、前記組成物は、（ａ）ガイドＲＮＡ分子（又は多重化のためなどの、ガイドＲＮＡ分子の組み合わせ、例えば、第１のガイドＲＮＡ分子及び第２のガイドＲＮＡ分子）又はガイドＲＮＡ分子をコードする核酸（又はガイドＲＮＡ分子の組み合わせをコードする１つ以上の核酸）；（ｂ）ＶＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ遺伝子座エフェクタータンパク質又はＶＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ遺伝子座エフェクタータンパク質をコードする核酸を含む。特定の実施形態において、エフェクタータンパク質はＣ２ｃ２遺伝子座エフェクタータンパク質であってもよい。
本発明はまた、更なる態様において、（ａ）ガイドＲＮＡ分子（又はガイドＲＮＡ分子の組み合わせ、例えば、第１のガイドＲＮＡ分子及び第２のガイドＲＮＡ分子）又はガイドＲＮＡ分子をコードする核酸（又はガイドＲＮＡ分子の組み合わせをコードする１つ以上の核酸）；（ｂ）Ｃ２ｃ２遺伝子座エフェクタータンパク質を含む、天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物も提供する。
本発明はまた、１つ以上のベクターを含むベクター系も提供し、この１つ以上のベクターは、本明細書に記載される方法に定義されるとおりの特徴を有する組成物である天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物の構成成分をコードする１つ以上のポリヌクレオチド分子を含む。
本発明はまた、１つ以上のベクター又は１つ以上のポリヌクレオチド分子を含む送達系も提供し、この１つ以上のベクター又はポリヌクレオチド分子は、本明細書で考察するとおりの特徴を有するか又は本明細書に記載される方法のいずれかに定義される組成物である天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物の構成成分をコードする１つ以上のポリヌクレオチド分子を含む。
本発明はまた、療法的治療方法に用いられる、天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物、又は前記組成物の構成成分をコードする１つ以上のポリヌクレオチド、又は前記組成物の構成成分をコードする１つ以上のポリヌクレオチドを含むベクター又は送達系も提供する。療法的治療方法には、遺伝子若しくはトランスクリプトーム編集、又は遺伝子療法が含まれ得る。
本発明はまた、エフェクタータンパク質の１つ以上のアミノ酸残基が改変されていてもよい方法及び組成物、例えば、エンジニアリングされた又は天然に存在しないエフェクタータンパク質又はＣ２ｃ２も提供する。ある実施形態において、改変は、エフェクタータンパク質の１つ以上のアミノ酸残基の突然変異を含み得る。１つ以上の突然変異は、エフェクタータンパク質の１つ以上の触媒活性ドメインにあってもよい。このエフェクタータンパク質は、前記１つ以上の突然変異を欠くエフェクタータンパク質と比較してヌクレアーゼ活性が低下し又は消失していてもよい。このエフェクタータンパク質は、目的の標的遺伝子座におけるＲＮＡ鎖の切断を誘導しないことがあり得る。好ましい実施形態において、１つ以上の突然変異は２つの突然変異を含み得る。好ましい実施形態において、Ｃ２ｃ２エフェクタータンパク質、例えば、エンジニアリングされた又は天然に存在しないエフェクタータンパク質又はＣ２ｃ２において１つ以上のアミノ酸残基が改変される。詳細な実施形態において、１つ以上の改変された又は突然変異したアミノ酸残基は、突然変異Ｒ５９７Ａ、Ｈ６０２Ａ、Ｒ１２７８Ａ及びＨ１２８３Ａなど、Ｒ５９７、Ｈ６０２、Ｒ１２７８及びＨ１２８３（Ｌｓｈ Ｃ２ｃ２アミノ酸を基準とする）に対応するＣ２ｃ２のアミノ酸残基のうちの１つ以上、又はＬｓｈ Ｃ２ｃ２オルソログの対応するアミノ酸残基である。
詳細な実施形態において、１つ以上の改変された又は突然変異したアミノ酸残基は、Ｃ２ｃ２コンセンサス付番に基づいてＫ２、Ｋ３９、Ｖ４０、Ｅ４７９、Ｌ５１４、Ｖ５１８、Ｎ５２４、Ｇ５３４、Ｋ５３５、Ｅ５８０、Ｌ５９７、Ｖ６０２、Ｄ６３０、Ｆ６７６、Ｌ７０９、Ｉ７１３、Ｒ７１７（ＨＥＰＮ）、Ｎ７１８、Ｈ７２２（ＨＥＰＮ）、Ｅ７７３、Ｐ８２３、Ｖ８２８、Ｉ８７９、Ｙ８８０、Ｆ８８４、Ｙ９９７、Ｌ１００１、Ｆ１００９、Ｌ１０１３、Ｙ１０９３、Ｌ１０９９、Ｌ１１１１、Ｙ１１１４、Ｌ１２０３、Ｄ１２２２、Ｙ１２４４、Ｌ１２５０、Ｌ１２５３、Ｋ１２６１、Ｉ１３３４、Ｌ１３５５、Ｌ１３５９、Ｒ１３６２、Ｙ１３６６、Ｅ１３７１、Ｒ１３７２、Ｄ１３７３、Ｒ１５０９（ＨＥＰＮ）、Ｈ１５１４（ＨＥＰＮ）、Ｙ１５４３、Ｄ１５４４、Ｋ１５４６、Ｋ１５４８、Ｖ１５５１、Ｉ１５５８に対応するＣ２ｃ２のアミノ酸残基のうちの１つ以上である。特定の実施形態において、１つ以上の改変された又は突然変異したアミノ酸残基は、Ｒ７１７及びＲ１５０９に対応するＣ２ｃ２のアミノ酸残基のうちの１つ以上である。特定の実施形態において、１つ以上の改変された又は突然変異したアミノ酸残基は、Ｋ２、Ｋ３９、Ｋ５３５、Ｋ１２６１、Ｒ１３６２、Ｒ１３７２、Ｋ１５４６及びＫ１５４８に対応するＣ２ｃ２のアミノ酸残基のうちの１つ以上である。特定の実施形態において、前記突然変異は、活性が変化した又は改変されたタンパク質を生じさせる。特定の実施形態において、前記突然変異は、特異性が増加するなど、活性が増加したタンパク質を生じさせる。特定の実施形態において、前記突然変異は、特異性が低下するなど、活性が低下したタンパク質を生じさせる。特定の実施形態において、前記突然変異は、触媒活性を有しないタンパク質（即ち「デッド」Ｃ２ｃ２）を生じさせる。ある実施形態において、前記アミノ酸残基は、Ｌｓｈ Ｃ２ｃ２アミノ酸残基、又は別の種のＣ２ｃ２タンパク質の対応するアミノ酸残基に対応する。
特定の実施形態において、１つ以上の改変された又は突然変異したアミノ酸残基は、図３に示されるとおりの、即ちレプトトリキア・ウエイデイ（Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ ｗａｄｅｉ）Ｆ０２７９（「Ｌｅｗ２」又は「Ｌｗ２」）とリステリア・ニューヨーケンシス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｎｅｗｙｏｒｋｅｎｓｉｓ）ＦＳＬ Ｍ６－０６３５（リステリア科（Ｌｉｓｔｅｒｉａｃｅａｅ）細菌ＦＳＬ Ｍ６－０６３５としても知られる（「Ｌｉｂ」又は「ＬｂＦＳＬ」））とのアラインメントに基づくコンセンサス配列を基準として、Ｍ３５、Ｋ３６、Ｔ３８、Ｋ３９、Ｉ５７、Ｅ６５、Ｇ６６、Ｌ６８、Ｎ８４、Ｔ８６、Ｅ８８、Ｉ１０３、Ｎ１０５、Ｅ１２３、Ｒ１２８、Ｒ１２９、Ｋ１３９、Ｌ１５２、Ｌ１９４、Ｎ１９６、Ｋ１９８、Ｎ２０１、Ｙ２２２、Ｄ２５３、Ｉ２６６、Ｆ２６７、Ｓ２８０、Ｉ３０３、Ｎ３０６、Ｒ３３１、Ｙ３３８、Ｋ３８９、Ｙ３９０、Ｋ３９１、Ｉ４３４、Ｋ４３５、Ｌ４５８、Ｄ４５９、Ｅ４６２、Ｌ４６３、Ｉ４７８、Ｅ４７９、Ｋ４９４、Ｒ４９５、Ｎ４９８、Ｓ５０１、Ｅ５１９、Ｎ５２４、Ｙ５２９、Ｖ５３０、Ｇ５３４、Ｋ５３５、Ｙ５３９、Ｔ５４９、Ｄ５５１、Ｒ５７７、Ｅ５８０、Ａ５８１、Ｆ５８２、Ｉ５８７、Ａ５９３、Ｌ５９７、Ｉ６０１、Ｌ６０２、Ｅ６１１、Ｅ６１３、Ｄ６３０、Ｉ６３１、Ｇ６３３、Ｋ６４１、Ｎ６４６、Ｖ６６９、Ｆ６７６、Ｓ６７８、Ｎ６９５、Ｅ７０３、Ａ７０７、Ｉ７０９、Ｉ７１３、Ｉ７１６、Ｒ７１７、Ｈ７２２、Ｆ７４０、Ｆ７４２、Ｋ７６８、Ｉ７７４、Ｋ７７８、Ｉ７８３、Ｌ７８７、Ｓ７８９、Ｖ７９２、Ｙ７９６、Ｄ７９９、Ｆ８１２、Ｎ８１８、Ｐ８２０、Ｆ８２１、Ｖ８２２、Ｐ８２３、Ｓ８２４、Ｆ８２５、Ｙ８２９、Ｋ８３１、Ｄ８３７、Ｌ８５２、Ｆ８５８、Ｅ８６７、Ａ８７１、Ｌ８７５、Ｋ８７７、Ｙ８８０、Ｙ８８１、Ｆ８８４、Ｆ８８８、Ｆ８９６、Ｎ９０１、Ｖ９０３、Ｎ９１５、Ｋ９１６、Ｒ９１８、Ｑ９２０、Ｅ９５１、Ｐ９５６、Ｙ９５９、Ｑ９６４、Ｉ９６９、Ｎ９９４、Ｆ１０００、Ｉ１０００１、Ｑ１００３、Ｆ１０００５、Ｋ１００７、Ｇ１００８、Ｆ１００９、Ｎ１０１９、Ｌ１０２０、Ｋ１０２１、Ｉ１０２３、Ｎ１０２８、Ｅ１０７０、Ｉ１０７５、Ｋ１０７６、Ｆ１０９２、Ｋ１０９７、Ｌ１０９９、Ｌ１１０４、Ｌ１１０７、Ｋ１１１３、Ｙ１１１４、Ｅ１１４９、Ｅ１１５１、Ｉ１１５３、Ｌ１１５５、Ｌ１１５８、Ｄ１１６６、Ｌ１２０３、Ｄ１２２２、Ｇ１２２４、Ｉ１２２８、Ｒ１２３６、Ｋ１２４３、Ｙ１２４４、Ｇ１２４５、Ｄ１２５５、Ｋ１２６１、Ｓ１２６３、Ｌ１２６７、Ｅ１２６９、Ｋ１２７４、Ｉ１２７７、Ｅ１２７８、Ｌ１２８９、Ｈ１２９０、Ａ１２９４、Ｎ１３２０、Ｋ１３２５、Ｅ１３２７、Ｙ１３２８、Ｉ１３３４、Ｙ１３３７、Ｋ１３４１、Ｎ１３４２、Ｋ１３４３、Ｎ１３５０、Ｌ１３５２、Ｌ１３５５、Ｌ１３５６、Ｉ１３５９、Ｌ１３６０、Ｒ１３６２、Ｖ１３６３、Ｇ１３６４、Ｙ１３６５、Ｉ１３６９、Ｒ１３７１、Ｄ１３７２、Ｆ１３８５、Ｅ１３９１、Ｄ１４５９、Ｋ１４６３、Ｋ１４６６、Ｒ１５０９、Ｎ１５１０、Ｉ１５１２、Ａ１５１３、Ｈ１５１４、Ｎ１５１６、Ｙ１５１７、Ｌ１５２９、Ｌ１５３０、Ｅ１５３４、Ｌ１５３６、Ｒ１５３７、Ｙ１５４３、Ｄ１５４４、Ｒ１５４５、Ｋ１５４６、Ｌ１５４７、Ｋ１５４８、Ｎ１５４９、Ａ１５５０、Ｋ１５５３、Ｓ１５５４、Ｄ１５５７、Ｉ１５５８、Ｌ１５５９、Ｇ１５６３、Ｆ１５６８、Ｉ１６１２、Ｌ１６５１、Ｅ１６５２、Ｋ１６５５、Ｈ１６５８、Ｌ１６５９、Ｋ１６６３、Ｔ１６７３、Ｓ１６７７、Ｅ１６７８、Ｅ１６７９、Ｃ１６８１、Ｖ１６８４、Ｋ１６８５、Ｅ１６８９に対応するＣ２ｃ２のアミノ酸残基のうちの１つ以上である。先に指摘したとおり、特定の実施形態では、上記のアミノ酸残基リストの中で、Ｒ５９７、Ｈ６０２、Ｒ１２７８及びＨ１２８３（Ｌｓｈ Ｃ２ｃ２アミノ酸を基準とする）に対応する残基は除外される。
特定の実施形態において、１つ以上の改変された又は突然変異したアミノ酸残基は、１つ以上の保存された荷電アミノ酸残基である。特定の実施形態において、前記アミノ酸残基はアラニンに突然変異していてもよい。
特定の実施形態において、１つ以上の改変された又は突然変異したアミノ酸残基は、図２に示されるとおりの、即ち図１に示されるとおりのＣ２ｃ２オルソログのアラインメントに基づくコンセンサス配列を基準として、Ｋ２８、Ｋ３１、Ｒ４４、Ｅ１６２、Ｅ１８４、Ｋ２６２、Ｅ２８８、Ｋ３５７、Ｅ３６０、Ｋ３３８、Ｒ４４１（ＨＥＰＮ）、Ｈ４４６（ＨＥＰＮ）、Ｅ４７１、Ｋ４８２、Ｋ５２５、Ｋ５５８、Ｄ７０７、Ｒ７９０、Ｋ８１１、Ｒ８３３、Ｅ８３９、Ｒ８８５、Ｅ８９４、Ｒ８９５、Ｄ８９６、Ｋ９４２、Ｒ９６０（ＨＥＰＮ）、Ｈ９６５（ＨＥＰＮ）、Ｄ９９０、Ｋ９９２、Ｋ９９４に対応するＣ２ｃ２のアミノ酸残基のうちの１つ以上である。先に指摘したとおり、特定の実施形態では、上記のアミノ酸残基リストの中で、Ｒ５９７、Ｈ６０２、Ｒ１２７８及びＨ１２８３（Ｌｓｈ Ｃ２ｃ２アミノ酸を基準とする）に対応する残基は除外される。
本発明はまた、エフェクタータンパク質の触媒活性ドメインにある１つ以上の突然変異又は２つ以上の突然変異も提供する。特定の実施形態において、１つ以上の突然変異又は２つ以上の突然変異は、ＨＥＰＮドメインを含むエフェクタータンパク質の触媒活性ドメイン、又はＨＥＰＮドメインと相同な触媒活性ドメインにあってもよい。エフェクタータンパク質は１つ以上の異種機能ドメインを含み得る。１つ以上の異種機能ドメインは１つ以上の核局在化シグナル（ＮＬＳ）ドメインを含み得る。１つ以上の異種機能ドメインは少なくとも２つ以上のＮＬＳドメインを含み得る。１つ以上のＮＬＳドメインはエフェクタータンパク質（例えばＣ２ｃ２）の末端に又はその近傍に又はそれに近接して位置してもよく、及び２つ以上のＮＬＳの場合、それらの２つの各々がエフェクタータンパク質（例えばＣ２ｃ２）の末端に又はその近傍に又はそれに近接して位置してもよい。１つ以上の異種機能ドメインは１つ以上の翻訳活性化ドメインを含み得る。他の実施形態において、機能ドメインは転写活性化ドメイン、例えばＶＰ６４を含み得る。１つ以上の異種機能ドメインは１つ以上の転写抑制ドメインを含み得る。特定の実施形態において、転写抑制ドメインはＫＲＡＢドメイン又はＳＩＤドメイン（例えばＳＩＤ４Ｘ）を含み得る。１つ以上の異種機能ドメインは１つ以上のヌクレアーゼドメインを含み得る。好ましい実施形態において、ヌクレアーゼドメインはＦｏｋ１を含む。
本発明はまた、１つ以上の異種機能ドメインが以下の活性：メチラーゼ活性、デメチラーゼ活性、翻訳活性化活性、翻訳抑制活性、転写活性化活性、転写抑制活性、転写終結因子活性、ヒストン修飾活性、ヌクレアーゼ活性、一本鎖ＲＮＡ切断活性、二本鎖ＲＮＡ切断活性、一本鎖ＤＮＡ切断活性、二本鎖ＤＮＡ切断活性及び核酸結合活性のうちの１つ以上を有することも提供する。本発明の特定の実施形態において、１つ以上の異種機能ドメインはエピトープタグ又はレポーターを含み得る。エピトープタグの非限定的な例としては、ヒスチジン（Ｈｉｓ）タグ、Ｖ５タグ、ＦＬＡＧタグ、インフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）タグ、Ｍｙｃタグ、ＶＳＶ－Ｇタグ、及びチオレドキシン（Ｔｒｘ）タグが挙げられる。レポーターの例としては、限定はされないが、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ） β－ガラクトシダーゼ、β－グルクロニダーゼ、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ＨｃＲｅｄ、ＤｓＲｅｄ、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、及び自己蛍光タンパク質、例えば青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）が挙げられる。
少なくとも１つ以上の異種機能ドメインはエフェクタータンパク質のアミノ末端にあるか又はその近傍にあってもよく、及び／又はここで少なくとも１つ以上の異種機能ドメインはエフェクタータンパク質のカルボキシ末端にあるか又はその近傍にある。１つ以上の異種機能ドメインはエフェクタータンパク質に融合されてもよい。１つ以上の異種機能ドメインはエフェクタータンパク質に繋留されてもよい。１つ以上の異種機能ドメインはリンカー部分を介してエフェクタータンパク質に連結されてもよい。
本発明はまた、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、カンピロバクター属（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、ニトラチフラクター属（Ｎｉｔｒａｔｉｆｒａｃｔｏｒ）、スタフィロコッカス属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、パルビバクラム属（Ｐａｒｖｉｂａｃｕｌｕｍ）、ロゼブリア属（Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ）、ナイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、グルコンアセトバクター属（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、アゾスピリラム属（Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）、スフェロヘータ属（Ｓｐｈａｅｒｏｃｈａｅｔａ）、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ユーバクテリウム属（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、コリネバクター属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒ）、カルノバクテリウム属（Ｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ロドバクター属（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ）、リステリア属（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）、パルディバクター属（Ｐａｌｕｄｉｂａｃｔｅｒ）、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、ラクノスピラ科（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ）、クロストリジアリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｒｉｄｉｕｍ）、レプトトリキア属（Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ）、フランシセラ属（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ）、レジオネラ属（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）、アリシクロバチルス属（Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、メタノメチオフィラス属（Ｍｅｔｈａｎｏｍｅｔｈｙｏｐｈｉｌｕｓ）、ポルフィロモナス属（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ）、プレボテラ属（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ）、バクテロイデス門（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ）、ヘルココッカス属（Ｈｅｌｃｏｃｏｃｃｕｓ）、レプトスピラ属（Ｌｅｔｏｓｐｉｒａ）、デスルホビブリオ属（Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ）、デスルホナトロヌム属（Ｄｅｓｕｌｆｏｎａｔｒｏｎｕｍ）、オピツツス科（Ｏｐｉｔｕｔａｃｅａｅ）、ツベリバチルス属（Ｔｕｂｅｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ブレビバチルス属（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｕｓ）、メチロバクテリウム属（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）又はアシダミノコッカス属（Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）を含む属の生物由来のエフェクタータンパク質を含むエフェクタータンパク質も提供する。エフェクタータンパク質は、第１のエフェクタータンパク質オルソログ由来の第１の断片と第２のエフェクタータンパク質オルソログ由来の第２の断片とを含むキメラエフェクタータンパク質を含むことができ、ここで第１及び第２のエフェクタータンパク質オルソログは異なる。第１及び第２のエフェクタータンパク質オルソログのうちの少なくとも一方は、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、カンピロバクター属（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、ニトラチフラクター属（Ｎｉｔｒａｔｉｆｒａｃｔｏｒ）、スタフィロコッカス属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、パルビバクラム属（Ｐａｒｖｉｂａｃｕｌｕｍ）、ロゼブリア属（Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ）、ナイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、グルコンアセトバクター属（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、アゾスピリラム属（Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）、スフェロヘータ属（Ｓｐｈａｅｒｏｃｈａｅｔａ）、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ユーバクテリウム属（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、コリネバクター属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒ）、カルノバクテリウム属（Ｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ロドバクター属（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ）、リステリア属（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）、パルディバクター属（Ｐａｌｕｄｉｂａｃｔｅｒ）、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、ラクノスピラ科（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ）、クロストリジアリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｒｉｄｉｕｍ）、レプトトリキア属（Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ）、フランシセラ属（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ）、レジオネラ属（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）、アリシクロバチルス属（Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、メタノメチオフィラス属（Ｍｅｔｈａｎｏｍｅｔｈｙｏｐｈｉｌｕｓ）、ポルフィロモナス属（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ）、プレボテラ属（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ）、バクテロイデス門（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ）、ヘルココッカス属（Ｈｅｌｃｏｃｏｃｃｕｓ）、レプトスピラ属（Ｌｅｔｏｓｐｉｒａ）、デスルホビブリオ属（Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ）、デスルホナトロヌム属（Ｄｅｓｕｌｆｏｎａｔｒｏｎｕｍ）、オピツツス科（Ｏｐｉｔｕｔａｃｅａｅ）、ツベリバチルス属（Ｔｕｂｅｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ブレビバチルス属（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｕｓ）、メチロバクテリウム属（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）又はアシダミノコッカス属（Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）を含む生物由来のエフェクタータンパク質を含むことができる。
特定の実施形態において、エフェクタータンパク質、特にＶＩ型遺伝子座エフェクタータンパク質、より詳細にはＣ２ｃ２ｐは、分類群アルファプロテオバクテリア門（ａｌｐｈａ－ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）、バチルス綱（Ｂａｃｉｌｌｉ）、クロストリジウム綱（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ）、フソバクテリウム門（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉａ）及びバクテロイデス門（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ）に属する細菌種から生じるものであってもよく、それから単離されてもよく、又はそれに由来してもよい。特定の実施形態において、エフェクタータンパク質、特にＶＩ型遺伝子座エフェクタータンパク質、より詳細にはＣ２ｃ２ｐは、ラクノスピラ科（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ）、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、カルノバクテリウム属（Ｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、パルディバクター属（Ｐａｌｕｄｉｂａｃｔｅｒ）、リステリア属（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）、レプトトリキア属（Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ）、及びロドバクター属（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ）からなる群から選択される属に属する細菌種から生じるものであってもよく、それから単離されてもよく、又はそれに由来してもよい。特定の実施形態において、エフェクタータンパク質、特にＶＩ型遺伝子座エフェクタータンパク質、より詳細にはＣ２ｃ２ｐは、ラクノスピラ科（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ）細菌ＭＡ２０２０、ラクノスピラ科（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ）細菌ＮＫ４Ａ１７９、クロストリジウム・アミノフィルム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｍｉｎｏｐｈｉｌｕｍ）（例えば、ＤＳＭ １０７１０）、ラクノスピラ科（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ）細菌ＮＫ４Ａ１４４、カルノバクテリウム・ガリナルム（Ｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）（例えば、ＤＳＭ ４８４７株ＭＴ４４）、パルディバクター・プロピオニシゲネス（Ｐａｌｕｄｉｂａｃｔｅｒ ｐｒｏｐｉｏｎｉｃｉｇｅｎｅｓ）（例えば、ＷＢ４）、リステリア・ゼーリゲリ（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｓｅｅｌｉｇｅｒｉ）（例えば、血清型１／２ｂ株ＳＬＣＣ３９５４）、リステリア・ウェイヘンステファネンシス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｗｅｉｈｅｎｓｔｅｐｈａｎｅｎｓｉｓ）（例えば、ＦＳＬ Ｒ９－０３１７ ｃ４）、リステリア・ニューヨーケンシス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｎｅｗｙｏｒｋｅｎｓｉｓ）（例えば、株ＦＳＬ Ｍ６－０６３５：また「ＬｂＦＳＬ」）、レプトトリキア・ウエイデイ（Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ ｗａｄｅｉ）（例えば、Ｆ０２７９：また「Ｌｗ」又は「Ｌｗ２」）、レプトトリキア・ブッカリス（Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ ｂｕｃｃａｌｉｓ）（例えば、ＤＳＭ １１３５）、レプトトリキア属種（Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ ｓｐ．）口腔細菌分類群２２５（例えば、株Ｆ０５８１）、レプトトリキア属種（Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ ｓｐ．）口腔細菌分類群８７９（例えば、株Ｆ０５５７）、レプトトリキア・シャーイイ（Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ ｓｈａｈｉｉ）（例えば、ＤＳＭ １９７５７）、ロドバクター・カプスラータス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ）（例えば、ＳＢ １００３、Ｒ１２１、又はＤＥ４４２）からなる群から選択される細菌種から生じるものであってもよく、それから単離されてもよく、又はそれに由来してもよい。特定の好ましい実施形態において、Ｃ２ｃ２エフェクタータンパク質は、リステリア科（Ｌｉｓｔｅｒｉａｃｅａｅ）細菌（例えばＦＳＬ Ｍ６－０６３５：また「ＬｂＦＳＬ」）、ラクノスピラ科（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ）細菌ＭＡ２０２０、ラクノスピラ科（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ）細菌ＮＫ４Ａ１７９、クロストリジウム・アミノフィルム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｍｉｎｏｐｈｉｌｕｍ）（例えば、ＤＳＭ １０７１０）、カルノバクテリウム・ガリナルム（Ｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）（例えば、ＤＳＭ ４８４７）、パルディバクター・プロピオニシゲネス（Ｐａｌｕｄｉｂａｃｔｅｒ ｐｒｏｐｉｏｎｉｃｉｇｅｎｅｓ）（例えば、ＷＢ４）、リステリア・ゼーリゲリ（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｓｅｅｌｉｇｅｒｉ）（例えば、血清型１／２ｂ株ＳＬＣＣ３９５４）、リステリア・ウェイヘンステファネンシス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｗｅｉｈｅｎｓｔｅｐｈａｎｅｎｓｉｓ）（例えば、ＦＳＬ Ｒ９－０３１７ ｃ４）、レプトトリキア・ウエイデイ（Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ ｗａｄｅｉ）（例えば、Ｆ０２７９：また「Ｌｗ」又は「Ｌｗ２」）、レプトトリキア・シャーイイ（Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ ｓｈａｈｉｉ）（例えば、ＤＳＭ １９７５７）、ロドバクター・カプスラータス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ）（例えば、ＳＢ １００３、Ｒ１２１、又はＤＥ４４２）；好ましくはリステリア科（Ｌｉｓｔｅｒｉａｃｅａｅ）細菌ＦＳＬ Ｍ６－０６３５（即ちリステリア・ニューヨーケンシス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｎｅｗｙｏｒｋｅｎｓｉｓ）ＦＳＬ Ｍ６－０６３５：図４～図７の「ＬｂＦＳＬ」）又はレプトトリキア・ウエイデイ（Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ ｗａｄｅｉ）Ｆ０２７９（また「Ｌｗ」又は「Ｌｗ２」）から生じるものである。
特定の実施形態において、本明細書で意図されるとおりのＶＩ型遺伝子座は、Ｃａｓ１、Ｃａｓ２、及びＣ２ｃ２ｐエフェクタータンパク質をコードし得る。
特定の実施形態において、エフェクタータンパク質、特にＶＩ型遺伝子座エフェクタータンパク質、より詳細には天然Ｃ２ｃ２ｐなどのＣ２ｃ２ｐは、約１０００～約１５００アミノ酸長、例えば約１１００～約１４００アミノ酸長、例えば、約１０００～約１１００、約１１００～約１２００アミノ酸長、又は約１２００～約１３００アミノ酸長、又は約１３００～約１４００アミノ酸長、又は約１４００～約１５００アミノ酸長、例えば、約１０００、約１１００、約１２００、約１３００、約１４００又は約１５００アミノ酸長であってもよい。
特定の実施形態において、エフェクタータンパク質、特にＶＩ型遺伝子座エフェクタータンパク質、より詳細にはＣ２ｃ２ｐは、少なくとも１つ及び好ましくは少なくとも２つ、例えばより好ましくは正確に２つの保存されたＲｘｘｘｘＨモチーフを含む。触媒ＲｘｘｘｘＨモチーフは、ＨＥＰＮ（Ｈｉｇｈｅｒ Ｅｕｋａｒｙｏｔｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｋａｒｙｏｔｅｓ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ－ｂｉｎｄｉｎｇ：高等真核生物及び原核生物ヌクレオチド結合）ドメインに特有である。従って、特定の実施形態において、エフェクタータンパク質、特にＶＩ型遺伝子座エフェクタータンパク質、より詳細にはＣ２ｃ２ｐは、少なくとも１つ及び好ましくは少なくとも２つ、例えばより好ましくは正確に２つのＨＥＰＮドメインを含む。特定の実施形態において、ＨＥＰＮドメインはＲＮアーゼ活性を有し得る。他の実施形態において、ＨＥＰＮドメインはＤＮアーゼ活性を有し得る。
特定の実施形態において、本明細書で意図されるとおりのＶＩ型遺伝子座は、３０～４０ｂｐ長、より典型的には３５～３９ｂｐ長、例えば、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、又は４０ｂｐ長のＣＲＩＳＰＲリピートを含み得る。詳細な実施形態において、ダイレクトリピートは少なくとも２５ｎｔ長である。
特定の実施形態では、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）又はＰＡＭ様モチーフが、本明細書に開示されるとおりのエフェクタータンパク質複合体による目的の標的遺伝子座への結合を導く。一部の実施形態において、ＰＡＭは５’ＰＡＭであってもよい（即ち、プロトスペーサーの５’末端の上流に位置する）。他の実施形態において、ＰＡＭは３’ＰＡＭであってもよい（即ち、プロトスペーサーの５’末端の下流に位置する）。用語「ＰＡＭ」は、用語「ＰＦＳ」又は「プロトスペーサー隣接部位」又は「プロトスペーサー隣接配列」と同義的に用いられ得る。
好ましい実施形態において、エフェクタータンパク質、特にＶＩ型遺伝子座エフェクタータンパク質、より詳細にはＣ２ｃ２ｐは、３’ＰＡＭを認識し得る。特定の実施形態において、エフェクタータンパク質、特にＶＩ型遺伝子座エフェクタータンパク質、より詳細にはＣ２ｃ２ｐは、５’Ｈ（式中、ＨはＡ、Ｃ又はＵである）である３’ＰＡＭを認識し得る。特定の実施形態において、エフェクタータンパク質は、レプトトリキア・シャーイイ（Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ ｓｈａｈｉｉ）Ｃ２ｃ２ｐ、より好ましくはレプトトリキア・シャーイイ（Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ ｓｈａｈｉｉ）ＤＳＭ １９７５７ Ｃ２ｃ２であってもよく、及び５’ＰＡＭは５’Ｈである。特定の実施形態において、エフェクタータンパク質はレプトトリキア・ウエイデイ（Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ ｗａｄｅｉ）Ｆ０２７９（Ｌｗ２）Ｃ２ｃ２であってもよく、及び５’ＰＡＭはＨ（式中、ＨはＣ、Ｕ又はＡである）である。
特定の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素はエンジニアリングされ、ヌクレアーゼ活性を低下又は消失させる１つ以上の突然変異を含むことができる。突然変異はまた、隣接残基、例えばヌクレアーゼ活性に関与する上記に示したものの近傍にあるアミノ酸に作られてもよい。一部の実施形態では１つのＨＥＰＮドメインのみが不活性化され、他の実施形態では第２のＨＥＰＮドメインが不活性化される。
本発明の特定の実施形態において、ガイドＲＮＡ又は成熟ｃｒＲＮＡは、ダイレクトリピート配列及びガイド配列又はスペーサー配列を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなる。特定の実施形態において、ガイドＲＮＡ又は成熟ｃｒＲＮＡは、ガイド配列又はスペーサー配列に連結されたダイレクトリピート配列を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなる。特定の実施形態において、ガイドＲＮＡ又は成熟ｃｒＲＮＡは、１９ｎｔの部分的ダイレクトリピートと、続く１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５ｎｔ、又はそれ以上のガイド配列、例えば１８～２５、１９～２５、２０～２５、２１～２５、２２～２５、又は２３～２５ｎｔのガイド配列又はスペーサー配列を含む。特定の実施形態において、エフェクタータンパク質はＣ２ｃ２エフェクタータンパク質であり、検出可能なＤＮＡ切断を達成するのに少なくとも１６ｎｔのガイド配列が必要で、及びインビトロで効率的なＤＮＡ切断を達成するのに最低でも１７ｎｔのガイド配列が必要である。詳細な実施形態において、エフェクタータンパク質はＣ２ｃ２タンパク質であり、検出可能なＲＮＡ切断を達成するのに少なくとも１９ｎｔのガイド配列が必要である。特定の実施形態において、ダイレクトリピート配列はガイド配列又はスペーサー配列の上流（即ち５’側）に位置する。好ましい実施形態において、Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡのシード配列（即ち、標的遺伝子座の配列の認識及び／又はそれとのハイブリダイゼーションに必須の重要な配列）は、ガイド配列又はスペーサー配列の５’末端上の最初の約５ｎｔ以内にある。
本発明の好ましい実施形態において、成熟ｃｒＲＮＡはステムループ又は最適化ステムループ構造又は最適化二次構造を含む。好ましい実施形態において、成熟ｃｒＲＮＡはダイレクトリピート配列中にステムループ又は最適化ステムループ構造を含み、ここでステムループ又は最適化ステムループ構造は切断活性に重要である。特定の実施形態において、成熟ｃｒＲＮＡは好ましくは単一のステムループを含む。特定の実施形態において、ダイレクトリピート配列は好ましくは単一のステムループを含む。特定の実施形態において、エフェクタータンパク質複合体の切断活性は、ステムループＲＮＡ二重鎖構造に影響を及ぼす突然変異を導入することによって改変される。好ましい実施形態において、ステムループのＲＮＡ二重鎖を維持する突然変異が導入されてもよく、それによってエフェクタータンパク質複合体の切断活性が維持される。他の好ましい実施形態において、ステムループのＲＮＡ二重鎖構造を破壊する突然変異が導入されてもよく、それによってエフェクタータンパク質複合体の切断活性が完全に無効にされる。
詳細な実施形態において、Ｃ２ｃ２タンパク質はＬｓｈ Ｃ２ｃ２エフェクタータンパク質であり、成熟ｃｒＲＮＡはステムループ又は最適化ステムループ構造を含む。詳細な実施形態において、ｃｒＲＮＡのダイレクトリピートは、ステムループを含む少なくとも２５ヌクレオチドを含む。詳細な実施形態において、ステムは個別の塩基スワップが可能であるが、活性はｃｒＲＮＡのほとんどの二次構造変化又はトランケーションによって破壊される。破壊性の突然変異の例としては、ステムヌクレオチドのうち３個以上のスワッピング、ステムにおける非対合ヌクレオチドの付加、ステムの短縮（対合ヌクレオチドの一方の除去による）又はステムの伸長（一組の対合ヌクレオチドの付加による）が挙げられる。しかしながら、ｃｒＲＮＡは、本明細書に記載される特定の適用に想定されるとおりの非機能性ＲＮＡ配列を含めるため５’及び／又は３’伸長が可能であってもよい。
本発明はまた、本明細書に記載される方法又は組成物のいずれかにおける真核生物又は真核細胞での発現にコドン最適化されたエフェクタータンパク質をコードするヌクレオチド配列も提供する。本発明のある実施形態において、コドン最適化されたエフェクタータンパク質をコードするヌクレオチド配列は、本明細書で考察されるいずれかのＣ２ｃ２をコードし、真核細胞又は生物、例えば、本明細書の他の部分で挙げるような細胞又は生物、例えば、限定なしに、酵母細胞、又は哺乳類細胞又は生物、例えば、マウス細胞、ラット細胞、及びヒト細胞又は非ヒト真核生物、例えば植物における作動性に関してコドン最適化される。
本発明の特定の実施形態において、Ｃ２ｃ２エフェクタータンパク質をコードする核酸配列に少なくとも１つの核局在化シグナル（ＮＬＳ）が付加される。好ましい実施形態において、少なくとも１つ以上のＣ末端又はＮ末端ＮＬＳが付加される（従ってＣ２ｃ２エフェクタータンパク質をコードする１つ又は複数の核酸分子が１つ又は複数のＮＬＳのコーディングを含むことができ、そのため発現した産物には１つ又は複数のＮＬＳが付加又は接続されていることになる）。本発明の特定の実施形態において、Ｃ２ｃ２エフェクタータンパク質をコードする核酸配列に少なくとも１つの核外移行シグナル（ＮＥＳ）が付加される。好ましい実施形態では、少なくとも１つ以上のＣ末端又はＮ末端ＮＥＳが付加される（ひいてはＣ２ｃ２エフェクタータンパク質をコードする核酸分子が１つ又は複数のＮＥＳのコーディングを含むことができ、発現産物が付加又は接続された１つ又は複数のＮＥＳを有することになる）。好ましい実施形態では、真核細胞、好ましくはヒト細胞における最適発現及び核ターゲティングのため、Ｃ末端及び／又はＮ末端ＮＬＳ又はＮＥＳが付加される。好ましい実施形態において、コドン最適化エフェクタータンパク質はＣ２ｃ２であり、ガイドＲＮＡのスペーサー長さは１５～３５ｎｔである。特定の実施形態において、ガイドＲＮＡのスペーサー長さは少なくとも１６ヌクレオチド、例えば少なくとも１７ヌクレオチド、好ましくは少なくとも１８ｎｔ、例えば好ましくは少なくとも１９ｎｔ、少なくとも２０ｎｔ、少なくとも２１ｎｔ、又は少なくとも２２ｎｔである。特定の実施形態において、スペーサー長さは１５～１７ｎｔ、１７～２０ｎｔ、２０～２４ｎｔ、例えば、２０、２１、２２、２３、又は２４ｎｔ、２３～２５ｎｔ、例えば、２３、２４、又は２５ｎｔ、２４～２７ｎｔ、２７～３０ｎｔ、３０～３５ｎｔ、又は３５ｎｔ又はそれ以上である。本発明の特定の実施形態において、コドン最適化エフェクタータンパク質はＣ２ｃ２であり、且つガイドＲＮＡのダイレクトリピート長さは少なくとも１６ヌクレオチドである。特定の実施形態において、コドン最適化エフェクタータンパク質はＣ２ｃ２であり、且つガイドＲＮＡのダイレクトリピート長さは１６～２０ｎｔ、例えば、１６、１７、１８、１９、又は２０ヌクレオチドである。特定の好ましい実施形態において、ガイドＲＮＡのダイレクトリピート長さは１９ヌクレオチドである。
本発明はまた、複数の核酸成分を送達する方法も包含し、ここで各核酸成分は異なる目的の標的遺伝子座に特異的であり、それにより複数の目的の標的遺伝子座を改変する。複合体の核酸成分は１つ以上のタンパク質結合ＲＮＡアプタマーを含み得る。１つ以上のアプタマーはバクテリオファージコートタンパク質との結合能を有し得る。バクテリオファージコートタンパク質は、Ｑβ、Ｆ２、ＧＡ、ｆｒ、ＪＰ５０１、ＭＳ２、Ｍ１２、Ｒ１７、ＢＺ１３、ＪＰ３４、ＪＰ５００、ＫＵ１、Ｍ１１、ＭＸ１、ＴＷ１８、ＶＫ、ＳＰ、ＦＩ、ＩＤ２、ＮＬ９５、ＴＷ１９、ＡＰ２０５、φＣｂ５、φＣｂ８ｒ、φＣｂ１２ｒ、φＣｂ２３ｒ、７ｓ及びＰＲＲ１を含む群から選択され得る。好ましい実施形態において、バクテリオファージコートタンパク質はＭＳ２である。本発明はまた、３０以上、４０以上又は５０以上のヌクレオチド長である複合体の核酸成分も提供する。
従って、本発明の目的は、本出願人らが権利を留保し、且つ任意の以前に公知の製品、プロセス、又は方法のディスクレーマー（ｄｉｓｃｌａｉｍｅｒ）を本明細書によって開示するような以前に公知のいかなる製品、製品の作製プロセス、又は製品の使用方法も本発明の範囲内に包含しないことである。更に、本発明は、本出願人らが権利を留保し、且つ任意の以前に記載された製品、製品の作製プロセス、又は製品の使用方法のディスクレーマー（ｄｉｓｃｌａｉｍｅｒ）を本明細書によって開示するような、米国特許商標庁（ＵＳＰＴＯ）（米国特許法第１１２条第一段落）又は欧州特許庁（ＥＰＯ）（ＥＰＣ第８３条）の明細書の記載及び実施可能要件を満たさないいかなる製品、製品の作製プロセス、又は製品の使用方法も本発明の範囲内に包含しないよう意図されることが注記される。本発明の実施においては、第５３条（ｃ）ＥＰＣ及び規則２８（ｂ）及び（ｃ）ＥＰＣに準拠することが有利であり得る。本明細書におけるいかなる事項も、見込み（ｐｒｏｍｉｓｅ）であると解釈されてはならない。
この開示及び特に特許請求の範囲及び／又は段落において、「～を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「～を含んだ（ｃｏｍｐｒｉｓｅｄ）」、「～を含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの用語は、米国特許法においてそれに帰される意味を有し得る；例えばこれらは、「～を含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「～を含んだ（ｉｎｃｌｕｄｅｄ）」、「～を含んでいる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」などを意味し得ること；及び「～から本質的になっている（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」及び「～から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｓ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」などの用語が米国特許法におけるそれらに帰される意味を有し、例えばこれらの用語は明示的に記載されていない要素を許容するが、先行技術に見られる要素又は本発明の基本的な若しくは新規の特徴に影響を及ぼす要素は除外することが注記される。
更なる態様において、本発明は、目的の標的遺伝子座の改変を確実にする本明細書に記載されるＣＲＩＳＰＲ系をコードするヌクレオチド配列を含む真核細胞を提供し、ここで目的の標的遺伝子座は、本明細書に記載される方法のいずれかにより改変される。更なる態様は、前記細胞の細胞株を提供する。別の態様は、１つ以上の前記細胞を含む多細胞生物を提供する。
特定の実施形態において、目的の標的遺伝子座の改変は、少なくとも１つの遺伝子産物の（タンパク質）発現の変化を含む真核細胞；少なくとも１つの遺伝子産物の（タンパク質）発現の変化を含む真核細胞であって、少なくとも１つの遺伝子産物の（タンパク質）発現が増加するもの；少なくとも１つの遺伝子産物の（タンパク質）発現の変化を含む真核細胞であって、少なくとも１つの遺伝子産物の（タンパク質）発現が減少するもの；又は編集されたトランスクリプトームを含む真核細胞をもたらし得る。
特定の実施形態において、真核細胞は哺乳類細胞又はヒト細胞であってもよい。
更なる実施形態において、本明細書に記載されるとおりの天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物、ベクター系、又は送達系は、発現（アイソフォーム特異的発現を含む）、安定性、局在、機能性（例えばリボソームＲＮＡ又はｍｉＲＮＡ）等のＲＮＡ配列特異的干渉、ＲＮＡ配列特異的改変；又はかかるプロセスの多重化に用いられ得る。
更なる実施形態において、本明細書に記載されるとおりの天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物、ベクター系、又は送達系は、生体試料などの試料のＲＮＡ検出及び／又は定量化に用いられ得る。特定の実施形態において、ＲＮＡ検出は細胞におけるものである。ある実施形態において、本発明は、試料中の標的ＲＮＡを検出する方法を提供し、この方法は、（ａ）試料を、ｉ）ＲＮＡを切断する能力を有するＶＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタータンパク質、ｉｉ）標的ＲＮＡにハイブリダイズする能力を有するガイドＲＮＡ、及びｉｉｉ）エフェクタータンパク質によって非特異的且つ検出可能に切断される能力を有するＲＮＡベースの切断誘導可能レポーターと共にインキュベートすること、（ｂ）前記ＲＮＡベースの切断誘導可能レポーターの切断によって生成されるシグナルに基づき前記標的ＲＮＡを検出することを含む。
ある実施形態において、ＶＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタータンパク質はＣ２ｃ２エフェクタータンパク質である。ある実施形態において、ＲＮＡベースの切断誘導可能レポーター構築物は蛍光色素及び消光剤を含む。特定の実施形態において、試料は無細胞生体試料を含む。他の実施形態において、試料は細胞試料、例えば、限定なしに植物細胞、又は動物細胞を含む。本発明のある実施形態において、標的ＲＮＡは、限定はされないが、ウイルス、細菌、真菌、又は寄生虫からの標的ＲＮＡを含め、病原体ＲＮＡを含む。ある実施形態において、ガイドＲＮＡは、一塩基変異多型を含む標的ＲＮＡ又はＲＮＡ転写物のスプライス変異体を検出するように設計される。ある実施形態において、ガイドＲＮＡは、標的ＲＮＡとの１つ以上のミスマッチヌクレオチドを含む。特定の実施形態において、ガイドＲＮＡは、限定はされないが、癌、又は免疫疾患など、疾患状態の診断指標となる標的分子にハイブリダイズする。
本発明は、ａ）ＲＮＡを切断する能力を有するＶＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタータンパク質、ｂ）標的ＲＮＡに結合する能力を有するガイドＲＮＡ、及びｃ）エフェクタータンパク質によって非特異的且つ検出可能に切断される能力を有するＲＮＡベースの切断誘導可能レポーターを含むリボ核酸（ＲＮＡ）検出系を提供する。更に、本発明は、ａ）ＲＮＡを切断する能力を有するＶＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタータンパク質、及びｂ）エフェクタータンパク質によって非特異的且つ検出可能に切断される能力を有するＲＮＡベースの切断誘導可能レポーターを含むＲＮＡ検出用キットを提供する。特定の実施形態において、ＲＮＡベースの切断誘導可能レポーター構築物は蛍光色素及び消光剤を含む。
更なる実施形態において、本明細書に記載されるとおりの天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物、ベクター系、又は送達系は、疾患モデル及び／又はスクリーニングシステムの作成に用いられ得る。
更なる実施形態において、本明細書に記載されるとおりの天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物、ベクター系、又は送達系は、部位特異的トランスクリプトーム編集又は摂動（ｐｕｒｔｕｒｂａｔｉｏｎ）；核酸配列特異的干渉；又は多重ゲノムエンジニアリングに用いられ得る。
また、本明細書に記載されるとおりの細胞、細胞株、又は生物からの遺伝子産物も提供される。特定の実施形態では、遺伝子産物の発現量が、変化した発現又は編集されたゲノムを有しない細胞からの遺伝子産物の量より多くても又は少なくてもよい。特定の実施形態では、遺伝子産物は、変化した発現又は編集されたゲノムを有しない細胞からの遺伝子産物と比較して変化してもよい。
上記及び他の実施形態が開示され、又は以下の詳細な説明から明らかで、それに包含される。
本発明の新規の特徴は、添付の特許請求の範囲に詳細に示される。本発明の原理が利用される例示的な実施形態を示す以下の詳細な説明、及びその添付の図面を参照することにより、本発明の特徴及び利点の更なる理解が得られるであろう。
図１Ａ～図１Ｄ．Ｃ２ｃ２オルソログの細胞局在。（Ａ）ＨＥＫ２９３細胞に、核局在化シグナル（ＮＬＳ）又は核外移行シグナル（ＮＥＳ）を有する又は有しないｍＣｈｅｒｒｙに融合した種々のＣ２ｃ２オルソログをトランスフェクトした。（Ｂ）レプトトリキア・ウエイデイ（Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｉａ ｗａｄｅｉ）Ｆ０２７９ Ｃ２ｃ２（Ｂ１）及びラクノスピラ科（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ）細菌ＮＫ４Ａ１７９ Ｃ２ｃ２（Ｂ２）のＮＥＳ融合物は細胞質に位置する。（Ｃ）レプトトリキア・ウエイデイ（Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｉａ ｗａｄｅｉ）Ｆ０２７９ Ｃ２ｃ２（Ｃ１）、ラクノスピラ科（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ）細菌ＮＫ４Ａ１７９ Ｃ２ｃ２（Ｃ２）、及びレプトトリキア・シャーイイ（Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ ｓｈａｈｉｉ）Ｃ２ｃ２（Ｃ３）のＮＬＳ融合物は核に位置し、及び不定に核小体に位置する。（Ｃ）ＮＬＳ又はＮＥＳに融合していないレプトトリキア・ウエイデイ（Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｉａ ｗａｄｅｉ）Ｆ０２７９ Ｃ２ｃ２（Ｄ１）、ラクノスピラ科（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ）細菌ＮＫ４Ａ１７９ Ｃ２ｃ２（Ｄ２）、及びレプトトリキア・シャーイイ（Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ ｓｈａｈｉｉ）Ｃ２ｃ２（Ｄ３）は不定に核及び細胞質に位置する。（Ｄ）評価した４つの哺乳類ＬｗａＣａｓ１３ａ構築物の概略図（左）及び設計の各々の局在及び発現を示すイメージング（右）。 図１Ａ～図１Ｄ．Ｃ２ｃ２オルソログの細胞局在。（Ａ）ＨＥＫ２９３細胞に、核局在化シグナル（ＮＬＳ）又は核外移行シグナル（ＮＥＳ）を有する又は有しないｍＣｈｅｒｒｙに融合した種々のＣ２ｃ２オルソログをトランスフェクトした。（Ｂ）レプトトリキア・ウエイデイ（Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｉａ ｗａｄｅｉ）Ｆ０２７９ Ｃ２ｃ２（Ｂ１）及びラクノスピラ科（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ）細菌ＮＫ４Ａ１７９ Ｃ２ｃ２（Ｂ２）のＮＥＳ融合物は細胞質に位置する。（Ｃ）レプトトリキア・ウエイデイ（Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｉａ ｗａｄｅｉ）Ｆ０２７９ Ｃ２ｃ２（Ｃ１）、ラクノスピラ科（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ）細菌ＮＫ４Ａ１７９ Ｃ２ｃ２（Ｃ２）、及びレプトトリキア・シャーイイ（Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ ｓｈａｈｉｉ）Ｃ２ｃ２（Ｃ３）のＮＬＳ融合物は核に位置し、及び不定に核小体に位置する。（Ｃ）ＮＬＳ又はＮＥＳに融合していないレプトトリキア・ウエイデイ（Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｉａ ｗａｄｅｉ）Ｆ０２７９ Ｃ２ｃ２（Ｄ１）、ラクノスピラ科（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ）細菌ＮＫ４Ａ１７９ Ｃ２ｃ２（Ｄ２）、及びレプトトリキア・シャーイイ（Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ ｓｈａｈｉｉ）Ｃ２ｃ２（Ｄ３）は不定に核及び細胞質に位置する。（Ｄ）評価した４つの哺乳類ＬｗａＣａｓ１３ａ構築物の概略図（左）及び設計の各々の局在及び発現を示すイメージング（右）。 図１Ａ～図１Ｄ．Ｃ２ｃ２オルソログの細胞局在。（Ａ）ＨＥＫ２９３細胞に、核局在化シグナル（ＮＬＳ）又は核外移行シグナル（ＮＥＳ）を有する又は有しないｍＣｈｅｒｒｙに融合した種々のＣ２ｃ２オルソログをトランスフェクトした。（Ｂ）レプトトリキア・ウエイデイ（Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｉａ ｗａｄｅｉ）Ｆ０２７９ Ｃ２ｃ２（Ｂ１）及びラクノスピラ科（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ）細菌ＮＫ４Ａ１７９ Ｃ２ｃ２（Ｂ２）のＮＥＳ融合物は細胞質に位置する。（Ｃ）レプトトリキア・ウエイデイ（Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｉａ ｗａｄｅｉ）Ｆ０２７９ Ｃ２ｃ２（Ｃ１）、ラクノスピラ科（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ）細菌ＮＫ４Ａ１７９ Ｃ２ｃ２（Ｃ２）、及びレプトトリキア・シャーイイ（Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ ｓｈａｈｉｉ）Ｃ２ｃ２（Ｃ３）のＮＬＳ融合物は核に位置し、及び不定に核小体に位置する。（Ｃ）ＮＬＳ又はＮＥＳに融合していないレプトトリキア・ウエイデイ（Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｉａ ｗａｄｅｉ）Ｆ０２７９ Ｃ２ｃ２（Ｄ１）、ラクノスピラ科（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ）細菌ＮＫ４Ａ１７９ Ｃ２ｃ２（Ｄ２）、及びレプトトリキア・シャーイイ（Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ ｓｈａｈｉｉ）Ｃ２ｃ２（Ｄ３）は不定に核及び細胞質に位置する。（Ｄ）評価した４つの哺乳類ＬｗａＣａｓ１３ａ構築物の概略図（左）及び設計の各々の局在及び発現を示すイメージング（右）。 図１Ａ～図１Ｄ．Ｃ２ｃ２オルソログの細胞局在。（Ａ）ＨＥＫ２９３細胞に、核局在化シグナル（ＮＬＳ）又は核外移行シグナル（ＮＥＳ）を有する又は有しないｍＣｈｅｒｒｙに融合した種々のＣ２ｃ２オルソログをトランスフェクトした。（Ｂ）レプトトリキア・ウエイデイ（Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｉａ ｗａｄｅｉ）Ｆ０２７９ Ｃ２ｃ２（Ｂ１）及びラクノスピラ科（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ）細菌ＮＫ４Ａ１７９ Ｃ２ｃ２（Ｂ２）のＮＥＳ融合物は細胞質に位置する。（Ｃ）レプトトリキア・ウエイデイ（Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｉａ ｗａｄｅｉ）Ｆ０２７９ Ｃ２ｃ２（Ｃ１）、ラクノスピラ科（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ）細菌ＮＫ４Ａ１７９ Ｃ２ｃ２（Ｃ２）、及びレプトトリキア・シャーイイ（Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ ｓｈａｈｉｉ）Ｃ２ｃ２（Ｃ３）のＮＬＳ融合物は核に位置し、及び不定に核小体に位置する。（Ｃ）ＮＬＳ又はＮＥＳに融合していないレプトトリキア・ウエイデイ（Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｉａ ｗａｄｅｉ）Ｆ０２７９ Ｃ２ｃ２（Ｄ１）、ラクノスピラ科（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ）細菌ＮＫ４Ａ１７９ Ｃ２ｃ２（Ｄ２）、及びレプトトリキア・シャーイイ（Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ ｓｈａｈｉｉ）Ｃ２ｃ２（Ｄ３）は不定に核及び細胞質に位置する。（Ｄ）評価した４つの哺乳類ＬｗａＣａｓ１３ａ構築物の概略図（左）及び設計の各々の局在及び発現を示すイメージング（右）。 図２Ａ～図２Ｃ．哺乳類細胞におけるＣ２ｃ２ノックダウン効率を評価するアッセイ。（Ａ）Ｃ２ｃ２のノックダウン効率の決定に用いる二重ルシフェラーゼレポータースキームの概略図。細胞に以下の種々のプラスミドをトランスフェクトした：ガウシアルシフェラーゼ（Ｇｌｕｃ）及びウミホタルルシフェラーゼ（Ｃｌｕｃ）をコードするプラスミド；Ｃ２ｃ２（ＮＬＳ又はＮＥＳを有する又は有しない）をコードするプラスミド；及びガウシアルシフェラーゼを標的とするｇＲＮＡをコードするプラスミド。Ｇｌｕｃのノックダウン効率はＧｌｕｃ及びＣｌｕｃの比に基づき決定される。（Ｂ）ガウシアルシフェラーゼｍＲＮＡを標的とする種々のｇＲＮＡの位置。（Ｃ）哺乳類細胞におけるＣ２ｃ２ノックダウン効率を評価するアッセイ。細胞に以下の種々のプラスミドをトランスフェクトした：ＥＧＦＰをコードするプラスミド；Ｃ２ｃ２（ＮＬＳ又はＮＥＳを有する又は有しない）をコードするプラスミド；及びＥＧＦＰを標的とするｇＲＮＡをコードするプラスミド。ＥＧＦＰのノックダウン効率はフローサイトメトリーによって決定される。 図２Ａ～図２Ｃ．哺乳類細胞におけるＣ２ｃ２ノックダウン効率を評価するアッセイ。（Ａ）Ｃ２ｃ２のノックダウン効率の決定に用いる二重ルシフェラーゼレポータースキームの概略図。細胞に以下の種々のプラスミドをトランスフェクトした：ガウシアルシフェラーゼ（Ｇｌｕｃ）及びウミホタルルシフェラーゼ（Ｃｌｕｃ）をコードするプラスミド；Ｃ２ｃ２（ＮＬＳ又はＮＥＳを有する又は有しない）をコードするプラスミド；及びガウシアルシフェラーゼを標的とするｇＲＮＡをコードするプラスミド。Ｇｌｕｃのノックダウン効率はＧｌｕｃ及びＣｌｕｃの比に基づき決定される。（Ｂ）ガウシアルシフェラーゼｍＲＮＡを標的とする種々のｇＲＮＡの位置。（Ｃ）哺乳類細胞におけるＣ２ｃ２ノックダウン効率を評価するアッセイ。細胞に以下の種々のプラスミドをトランスフェクトした：ＥＧＦＰをコードするプラスミド；Ｃ２ｃ２（ＮＬＳ又はＮＥＳを有する又は有しない）をコードするプラスミド；及びＥＧＦＰを標的とするｇＲＮＡをコードするプラスミド。ＥＧＦＰのノックダウン効率はフローサイトメトリーによって決定される。 図３Ａ～図３Ｑ．ＲＮＡ切断活性に関するＶＩ型ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ１３ａファミリーの特徴付け。（Ａ）Ｃａｓ１３ａオルソログに関するＰＦＳ特徴付けスクリーンの概略図。（Ｂ）Ｃａｓ１３ａタンパク質及びｃｒＲＮＡの発現用構築物の概略図。示される長さ及び残基番号はＬｗａＣａｓ１３ａのものである。（Ｃ）Ｃａｓ１３ａインビボ活性の定量化。（Ｄ）（Ｃ）からのインビボ活性の比。（Ｅ、Ｆ）生存大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）集団におけるエンリッチ後プラスミドの次世代シーケンシングによって決定したときの、ＬｓｈＣ２ｃ２及びＬｗａＣ２ｃ２のＰＦＳモチーフ決定。（Ｇ）ターゲティング及びノンターゲティング試料におけるＬｓｈＣａｓ１３ａ及びＬｗａＣａｓ１３ａのＰＦＳエンリッチメントの分布。（Ｈ）インビボＰＦＳスクリーニングは、ＬｗａＣａｓ１３ａが最小限のＰＦＳ優先性を有することを示す。（Ｉ）ＬｓｈＣ２ｃ２及びＬｗＣ２ｃ２のターゲティング及びノンターゲティングバイオレプリケート（ｎ＝２）についての正規化ＰＦＳカウントの分布を示す箱ひげ図。箱は第１～第３四分位数まで延び、ひげは四分位範囲の１．５倍を表す。平均値は赤色の水平のバーによって示される。（Ｊ）精製タンパク質を使用したＬｓｈＣ２ｃ２及びＬｗＣ２ｃ２ ＲＮＡ切断活性の比較。ＬｗａＣａｓ１３ａはＬｓｈＣａｓ１３ａよりも高活性のＲＮアーゼ活性を有する。５’標識ＲＮＡ標的をＣ２ｃ２及び対応するｃｒＲＶＡと３０分間インキュベートし、産物をゲル電気泳動によって分析した。（Ｋ）ＬｗａＣａｓ１３ａはＬ．ウエイデイ（Ｌ．ｗａｄｅｉｉ）ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座からのＣＲＩＳＰＲアレイ転写物をプロセシングすることができる。２スペーサーＬｗａアレイをＬｗＣ２ｃ２と３０分間インキュベートし、次に反応物をゲル電気泳動によって分離した。（Ｌ）評価した哺乳類ＬｗａＣａｓ１３ａ構築物の概略図並びに設計の各々の局在及び発現を示すイメージング。スケールバー、１０μｍ。（Ｍ）ルシフェラーゼタンパク質のリードアウトによるノックダウンの評価に使用した哺乳類レポーター系の概略図。（Ｎ）ＬｗａＣａｓ１３ａのエンジニアリングされた変異体を使用したガウシアルシフェラーゼ（Ｇｌｕｃ）のノックダウン。ガイド及びｓｈＲＮＡの配列を上に示す。（Ｏ）対応するＲＮＡｉ構築物と比較したＬｗａＣａｓ１３ａによる３つの異なる内因性転写物のノックダウン。（Ｐ）コメ（イネ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ））プロトプラストにおける転写物のＬｗａＣａｓ１３ａノックダウンの概略図。（Ｑ）各転写物につき３つのターゲティングガイド及びノンターゲティングガイドを使用したイネ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）プロトプラストにおける３つの転写物のＬｗａＣａｓ１３ａノックダウン。特に注記されない限り、値は全て、ｎ＝３での平均値±ＳＥＭである。 図３Ａ～図３Ｑ．ＲＮＡ切断活性に関するＶＩ型ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ１３ａファミリーの特徴付け。（Ａ）Ｃａｓ１３ａオルソログに関するＰＦＳ特徴付けスクリーンの概略図。（Ｂ）Ｃａｓ１３ａタンパク質及びｃｒＲＮＡの発現用構築物の概略図。示される長さ及び残基番号はＬｗａＣａｓ１３ａのものである。（Ｃ）Ｃａｓ１３ａインビボ活性の定量化。（Ｄ）（Ｃ）からのインビボ活性の比。（Ｅ、Ｆ）生存大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）集団におけるエンリッチ後プラスミドの次世代シーケンシングによって決定したときの、ＬｓｈＣ２ｃ２及びＬｗａＣ２ｃ２のＰＦＳモチーフ決定。（Ｇ）ターゲティング及びノンターゲティング試料におけるＬｓｈＣａｓ１３ａ及びＬｗａＣａｓ１３ａのＰＦＳエンリッチメントの分布。（Ｈ）インビボＰＦＳスクリーニングは、ＬｗａＣａｓ１３ａが最小限のＰＦＳ優先性を有することを示す。（Ｉ）ＬｓｈＣ２ｃ２及びＬｗＣ２ｃ２のターゲティング及びノンターゲティングバイオレプリケート（ｎ＝２）についての正規化ＰＦＳカウントの分布を示す箱ひげ図。箱は第１～第３四分位数まで延び、ひげは四分位範囲の１．５倍を表す。平均値は赤色の水平のバーによって示される。（Ｊ）精製タンパク質を使用したＬｓｈＣ２ｃ２及びＬｗＣ２ｃ２ ＲＮＡ切断活性の比較。ＬｗａＣａｓ１３ａはＬｓｈＣａｓ１３ａよりも高活性のＲＮアーゼ活性を有する。５’標識ＲＮＡ標的をＣ２ｃ２及び対応するｃｒＲＶＡと３０分間インキュベートし、産物をゲル電気泳動によって分析した。（Ｋ）ＬｗａＣａｓ１３ａはＬ．ウエイデイ（Ｌ．ｗａｄｅｉｉ）ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座からのＣＲＩＳＰＲアレイ転写物をプロセシングすることができる。２スペーサーＬｗａアレイをＬｗＣ２ｃ２と３０分間インキュベートし、次に反応物をゲル電気泳動によって分離した。（Ｌ）評価した哺乳類ＬｗａＣａｓ１３ａ構築物の概略図並びに設計の各々の局在及び発現を示すイメージング。スケールバー、１０μｍ。（Ｍ）ルシフェラーゼタンパク質のリードアウトによるノックダウンの評価に使用した哺乳類レポーター系の概略図。（Ｎ）ＬｗａＣａｓ１３ａのエンジニアリングされた変異体を使用したガウシアルシフェラーゼ（Ｇｌｕｃ）のノックダウン。ガイド及びｓｈＲＮＡの配列を上に示す。（Ｏ）対応するＲＮＡｉ構築物と比較したＬｗａＣａｓ１３ａによる３つの異なる内因性転写物のノックダウン。（Ｐ）コメ（イネ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ））プロトプラストにおける転写物のＬｗａＣａｓ１３ａノックダウンの概略図。（Ｑ）各転写物につき３つのターゲティングガイド及びノンターゲティングガイドを使用したイネ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）プロトプラストにおける３つの転写物のＬｗａＣａｓ１３ａノックダウン。特に注記されない限り、値は全て、ｎ＝３での平均値±ＳＥＭである。 図３Ａ～図３Ｑ．ＲＮＡ切断活性に関するＶＩ型ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ１３ａファミリーの特徴付け。（Ａ）Ｃａｓ１３ａオルソログに関するＰＦＳ特徴付けスクリーンの概略図。（Ｂ）Ｃａｓ１３ａタンパク質及びｃｒＲＮＡの発現用構築物の概略図。示される長さ及び残基番号はＬｗａＣａｓ１３ａのものである。（Ｃ）Ｃａｓ１３ａインビボ活性の定量化。（Ｄ）（Ｃ）からのインビボ活性の比。（Ｅ、Ｆ）生存大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）集団におけるエンリッチ後プラスミドの次世代シーケンシングによって決定したときの、ＬｓｈＣ２ｃ２及びＬｗａＣ２ｃ２のＰＦＳモチーフ決定。（Ｇ）ターゲティング及びノンターゲティング試料におけるＬｓｈＣａｓ１３ａ及びＬｗａＣａｓ１３ａのＰＦＳエンリッチメントの分布。（Ｈ）インビボＰＦＳスクリーニングは、ＬｗａＣａｓ１３ａが最小限のＰＦＳ優先性を有することを示す。（Ｉ）ＬｓｈＣ２ｃ２及びＬｗＣ２ｃ２のターゲティング及びノンターゲティングバイオレプリケート（ｎ＝２）についての正規化ＰＦＳカウントの分布を示す箱ひげ図。箱は第１～第３四分位数まで延び、ひげは四分位範囲の１．５倍を表す。平均値は赤色の水平のバーによって示される。（Ｊ）精製タンパク質を使用したＬｓｈＣ２ｃ２及びＬｗＣ２ｃ２ ＲＮＡ切断活性の比較。ＬｗａＣａｓ１３ａはＬｓｈＣａｓ１３ａよりも高活性のＲＮアーゼ活性を有する。５’標識ＲＮＡ標的をＣ２ｃ２及び対応するｃｒＲＶＡと３０分間インキュベートし、産物をゲル電気泳動によって分析した。（Ｋ）ＬｗａＣａｓ１３ａはＬ．ウエイデイ（Ｌ．ｗａｄｅｉｉ）ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座からのＣＲＩＳＰＲアレイ転写物をプロセシングすることができる。２スペーサーＬｗａアレイをＬｗＣ２ｃ２と３０分間インキュベートし、次に反応物をゲル電気泳動によって分離した。（Ｌ）評価した哺乳類ＬｗａＣａｓ１３ａ構築物の概略図並びに設計の各々の局在及び発現を示すイメージング。スケールバー、１０μｍ。（Ｍ）ルシフェラーゼタンパク質のリードアウトによるノックダウンの評価に使用した哺乳類レポーター系の概略図。（Ｎ）ＬｗａＣａｓ１３ａのエンジニアリングされた変異体を使用したガウシアルシフェラーゼ（Ｇｌｕｃ）のノックダウン。ガイド及びｓｈＲＮＡの配列を上に示す。（Ｏ）対応するＲＮＡｉ構築物と比較したＬｗａＣａｓ１３ａによる３つの異なる内因性転写物のノックダウン。（Ｐ）コメ（イネ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ））プロトプラストにおける転写物のＬｗａＣａｓ１３ａノックダウンの概略図。（Ｑ）各転写物につき３つのターゲティングガイド及びノンターゲティングガイドを使用したイネ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）プロトプラストにおける３つの転写物のＬｗａＣａｓ１３ａノックダウン。特に注記されない限り、値は全て、ｎ＝３での平均値±ＳＥＭである。 図３Ａ～図３Ｑ．ＲＮＡ切断活性に関するＶＩ型ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ１３ａファミリーの特徴付け。（Ａ）Ｃａｓ１３ａオルソログに関するＰＦＳ特徴付けスクリーンの概略図。（Ｂ）Ｃａｓ１３ａタンパク質及びｃｒＲＮＡの発現用構築物の概略図。示される長さ及び残基番号はＬｗａＣａｓ１３ａのものである。（Ｃ）Ｃａｓ１３ａインビボ活性の定量化。（Ｄ）（Ｃ）からのインビボ活性の比。（Ｅ、Ｆ）生存大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）集団におけるエンリッチ後プラスミドの次世代シーケンシングによって決定したときの、ＬｓｈＣ２ｃ２及びＬｗａＣ２ｃ２のＰＦＳモチーフ決定。（Ｇ）ターゲティング及びノンターゲティング試料におけるＬｓｈＣａｓ１３ａ及びＬｗａＣａｓ１３ａのＰＦＳエンリッチメントの分布。（Ｈ）インビボＰＦＳスクリーニングは、ＬｗａＣａｓ１３ａが最小限のＰＦＳ優先性を有することを示す。（Ｉ）ＬｓｈＣ２ｃ２及びＬｗＣ２ｃ２のターゲティング及びノンターゲティングバイオレプリケート（ｎ＝２）についての正規化ＰＦＳカウントの分布を示す箱ひげ図。箱は第１～第３四分位数まで延び、ひげは四分位範囲の１．５倍を表す。平均値は赤色の水平のバーによって示される。（Ｊ）精製タンパク質を使用したＬｓｈＣ２ｃ２及びＬｗＣ２ｃ２ ＲＮＡ切断活性の比較。ＬｗａＣａｓ１３ａはＬｓｈＣａｓ１３ａよりも高活性のＲＮアーゼ活性を有する。５’標識ＲＮＡ標的をＣ２ｃ２及び対応するｃｒＲＶＡと３０分間インキュベートし、産物をゲル電気泳動によって分析した。（Ｋ）ＬｗａＣａｓ１３ａはＬ．ウエイデイ（Ｌ．ｗａｄｅｉｉ）ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座からのＣＲＩＳＰＲアレイ転写物をプロセシングすることができる。２スペーサーＬｗａアレイをＬｗＣ２ｃ２と３０分間インキュベートし、次に反応物をゲル電気泳動によって分離した。（Ｌ）評価した哺乳類ＬｗａＣａｓ１３ａ構築物の概略図並びに設計の各々の局在及び発現を示すイメージング。スケールバー、１０μｍ。（Ｍ）ルシフェラーゼタンパク質のリードアウトによるノックダウンの評価に使用した哺乳類レポーター系の概略図。（Ｎ）ＬｗａＣａｓ１３ａのエンジニアリングされた変異体を使用したガウシアルシフェラーゼ（Ｇｌｕｃ）のノックダウン。ガイド及びｓｈＲＮＡの配列を上に示す。（Ｏ）対応するＲＮＡｉ構築物と比較したＬｗａＣａｓ１３ａによる３つの異なる内因性転写物のノックダウン。（Ｐ）コメ（イネ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ））プロトプラストにおける転写物のＬｗａＣａｓ１３ａノックダウンの概略図。（Ｑ）各転写物につき３つのターゲティングガイド及びノンターゲティングガイドを使用したイネ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）プロトプラストにおける３つの転写物のＬｗａＣａｓ１３ａノックダウン。特に注記されない限り、値は全て、ｎ＝３での平均値±ＳＥＭである。 図３Ａ～図３Ｑ．ＲＮＡ切断活性に関するＶＩ型ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ１３ａファミリーの特徴付け。（Ａ）Ｃａｓ１３ａオルソログに関するＰＦＳ特徴付けスクリーンの概略図。（Ｂ）Ｃａｓ１３ａタンパク質及びｃｒＲＮＡの発現用構築物の概略図。示される長さ及び残基番号はＬｗａＣａｓ１３ａのものである。（Ｃ）Ｃａｓ１３ａインビボ活性の定量化。（Ｄ）（Ｃ）からのインビボ活性の比。（Ｅ、Ｆ）生存大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）集団におけるエンリッチ後プラスミドの次世代シーケンシングによって決定したときの、ＬｓｈＣ２ｃ２及びＬｗａＣ２ｃ２のＰＦＳモチーフ決定。（Ｇ）ターゲティング及びノンターゲティング試料におけるＬｓｈＣａｓ１３ａ及びＬｗａＣａｓ１３ａのＰＦＳエンリッチメントの分布。（Ｈ）インビボＰＦＳスクリーニングは、ＬｗａＣａｓ１３ａが最小限のＰＦＳ優先性を有することを示す。（Ｉ）ＬｓｈＣ２ｃ２及びＬｗＣ２ｃ２のターゲティング及びノンターゲティングバイオレプリケート（ｎ＝２）についての正規化ＰＦＳカウントの分布を示す箱ひげ図。箱は第１～第３四分位数まで延び、ひげは四分位範囲の１．５倍を表す。平均値は赤色の水平のバーによって示される。（Ｊ）精製タンパク質を使用したＬｓｈＣ２ｃ２及びＬｗＣ２ｃ２ ＲＮＡ切断活性の比較。ＬｗａＣａｓ１３ａはＬｓｈＣａｓ１３ａよりも高活性のＲＮアーゼ活性を有する。５’標識ＲＮＡ標的をＣ２ｃ２及び対応するｃｒＲＶＡと３０分間インキュベートし、産物をゲル電気泳動によって分析した。（Ｋ）ＬｗａＣａｓ１３ａはＬ．ウエイデイ（Ｌ．ｗａｄｅｉｉ）ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座からのＣＲＩＳＰＲアレイ転写物をプロセシングすることができる。２スペーサーＬｗａアレイをＬｗＣ２ｃ２と３０分間インキュベートし、次に反応物をゲル電気泳動によって分離した。（Ｌ）評価した哺乳類ＬｗａＣａｓ１３ａ構築物の概略図並びに設計の各々の局在及び発現を示すイメージング。スケールバー、１０μｍ。（Ｍ）ルシフェラーゼタンパク質のリードアウトによるノックダウンの評価に使用した哺乳類レポーター系の概略図。（Ｎ）ＬｗａＣａｓ１３ａのエンジニアリングされた変異体を使用したガウシアルシフェラーゼ（Ｇｌｕｃ）のノックダウン。ガイド及びｓｈＲＮＡの配列を上に示す。（Ｏ）対応するＲＮＡｉ構築物と比較したＬｗａＣａｓ１３ａによる３つの異なる内因性転写物のノックダウン。（Ｐ）コメ（イネ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ））プロトプラストにおける転写物のＬｗａＣａｓ１３ａノックダウンの概略図。（Ｑ）各転写物につき３つのターゲティングガイド及びノンターゲティングガイドを使用したイネ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）プロトプラストにおける３つの転写物のＬｗａＣａｓ１３ａノックダウン。特に注記されない限り、値は全て、ｎ＝３での平均値±ＳＥＭである。 図３Ａ～図３Ｑ．ＲＮＡ切断活性に関するＶＩ型ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ１３ａファミリーの特徴付け。（Ａ）Ｃａｓ１３ａオルソログに関するＰＦＳ特徴付けスクリーンの概略図。（Ｂ）Ｃａｓ１３ａタンパク質及びｃｒＲＮＡの発現用構築物の概略図。示される長さ及び残基番号はＬｗａＣａｓ１３ａのものである。（Ｃ）Ｃａｓ１３ａインビボ活性の定量化。（Ｄ）（Ｃ）からのインビボ活性の比。（Ｅ、Ｆ）生存大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）集団におけるエンリッチ後プラスミドの次世代シーケンシングによって決定したときの、ＬｓｈＣ２ｃ２及びＬｗａＣ２ｃ２のＰＦＳモチーフ決定。（Ｇ）ターゲティング及びノンターゲティング試料におけるＬｓｈＣａｓ１３ａ及びＬｗａＣａｓ１３ａのＰＦＳエンリッチメントの分布。（Ｈ）インビボＰＦＳスクリーニングは、ＬｗａＣａｓ１３ａが最小限のＰＦＳ優先性を有することを示す。（Ｉ）ＬｓｈＣ２ｃ２及びＬｗＣ２ｃ２のターゲティング及びノンターゲティングバイオレプリケート（ｎ＝２）についての正規化ＰＦＳカウントの分布を示す箱ひげ図。箱は第１～第３四分位数まで延び、ひげは四分位範囲の１．５倍を表す。平均値は赤色の水平のバーによって示される。（Ｊ）精製タンパク質を使用したＬｓｈＣ２ｃ２及びＬｗＣ２ｃ２ ＲＮＡ切断活性の比較。ＬｗａＣａｓ１３ａはＬｓｈＣａｓ１３ａよりも高活性のＲＮアーゼ活性を有する。５’標識ＲＮＡ標的をＣ２ｃ２及び対応するｃｒＲＶＡと３０分間インキュベートし、産物をゲル電気泳動によって分析した。（Ｋ）ＬｗａＣａｓ１３ａはＬ．ウエイデイ（Ｌ．ｗａｄｅｉｉ）ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座からのＣＲＩＳＰＲアレイ転写物をプロセシングすることができる。２スペーサーＬｗａアレイをＬｗＣ２ｃ２と３０分間インキュベートし、次に反応物をゲル電気泳動によって分離した。（Ｌ）評価した哺乳類ＬｗａＣａｓ１３ａ構築物の概略図並びに設計の各々の局在及び発現を示すイメージング。スケールバー、１０μｍ。（Ｍ）ルシフェラーゼタンパク質のリードアウトによるノックダウンの評価に使用した哺乳類レポーター系の概略図。（Ｎ）ＬｗａＣａｓ１３ａのエンジニアリングされた変異体を使用したガウシアルシフェラーゼ（Ｇｌｕｃ）のノックダウン。ガイド及びｓｈＲＮＡの配列を上に示す。（Ｏ）対応するＲＮＡｉ構築物と比較したＬｗａＣａｓ１３ａによる３つの異なる内因性転写物のノックダウン。（Ｐ）コメ（イネ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ））プロトプラストにおける転写物のＬｗａＣａｓ１３ａノックダウンの概略図。（Ｑ）各転写物につき３つのターゲティングガイド及びノンターゲティングガイドを使用したイネ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）プロトプラストにおける３つの転写物のＬｗａＣａｓ１３ａノックダウン。特に注記されない限り、値は全て、ｎ＝３での平均値±ＳＥＭである。 図４Ａ～図４Ｂ．Ｇｌｕｃ．に対する種々のｇＲＮＡ別及びＮＬＳ、ＮＥＳと融合した、又はタグなしのＣ２ｃ２オルソログ（ｏｒｔｈｏｇｕｅ）別のルシフェラーゼの正規化タンパク質発現。（Ａ）Ｃ２ｃ２オルソログ（ｏｒｔｈｏｇｕｅ）はレプトトリキア・ウエイデイ（Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ ｗａｄｅｉ）Ｆ０２７９（Ｌｗ２）である。これらの実験に使用したスペーサー配列は、（ガイド１）ＡＴＣＡＧＧＧＣＡＡＡＣＡＧＡＡＣＴＴＴＧＡＣＴＣＣＣＡ；（ガイド２）ＡＧＡＴＣＣＧＴＧＧＴＣＧＣＧＡＡＧＴＴＧＣＴＧＧＣＣＡ；（ガイド３）ＴＣＧＣＣＴＴＣＧＴＡＧＧＴＧＴＧＧＣＡＧＣＧＴＣＣＴＧ；及び（ガイドＮＰ）ＴＡＧＡＴＴＧＣＴＧＴＴＣＴＡＣＣＡＡＧＴＡＡＴＣＣＡＴである。（Ｂ）Ｃ２ｃ２オルソログ（ｏｒｔｈｏｇｕｅ）はリステリア・ニューヨーケンシス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｎｅｗｙｏｒｋｅｎｓｉｓ）ＦＳＬ Ｍ６－０６３５（ＬｂＦＳＬ）である。これらの実験に使用したスペーサー配列は、（ガイド１）ＴＣＧＣＣＴＴＣＧＴＡＧＧＴＧＴＧＧＣＡＧＣＧＴＣＣＴＧ及び（ガイドＮＴ）ｔａｇａｔｔｇｃｔｇｔｔｃｔａｃｃａａｇｔａａｔｃｃａｔである。 図５Ａ～図５Ｂ．ＥＧＰＦに対する種々のｇＲＮＡ別及びＮＬＳ、ＮＥＳと融合した、又はタグなしのＣ２ｃ２オルソログ（ｏｒｔｈｏｇｕｅ）別のＧＦＰの正規化タンパク質発現。（Ａ）Ｃ２ｃ２オルソログ（ｏｒｔｈｏｇｕｅ）はレプトトリキア・ウエイデイ（Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ ｗａｄｅｉ）Ｆ０２７９（Ｌｗ２）である。これらの実験に使用したスペーサー配列は、（ガイド１）ｔｇａａｃａｇｃｔｃｃｔｃｇｃｃｃｔｔｇｃｔｃａｃｃａｔ；（ガイド２）ｔｃａｇｃｔｔｇｃｃｇｔａｇｇｔｇｇｃａｔｃｇｃｃｃｔｃ；（ガイド３）ｇｇｇｔａｇｃｇｇｃｔｇａａｇｃａｃｔｇｃａｃｇｃｃｇｔ；（ガイド４）ｇｇｔｃｔｔｇｔａｇｔｔｇｃｃｇｔｃｇｔｃｃｔｔｇａａｇ；（ガイド５）ｔａｃｔｃｃａｇｃｔｔｇｔｇｃｃｃｃａｇｇａｔｇｔｔｇｃ；（ガイド６）ｃａｃｇｃｔｇｃｃｇｔｃｃｔｃｇａｔｇｔｔｇｔｇｇｃｇｇ；（ガイド７）ｔｃｔｔｔｇｃｔｃａｇｇｇｃｇｇａｃｔｇｇｇｔｇｃｔｃａ；（ガイド８）ｇａｃｔｔｇｔａｃａｇｃｔｃｇｔｃｃａｔｇｃｃｇａｇａｇ；及び（ガイドＮＴ）ｔａｇａｔｔｇｃｔｇｔｔｃｔａｃｃａａｇｔａａｔｃｃａｔである。（Ｂ）Ｃ２ｃ２オルソログ（ｏｒｔｈｏｇｕｅ）はリステリア・ニューヨーケンシス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｎｅｗｙｏｒｋｅｎｓｉｓ）ＦＳＬ Ｍ６－０６３５（ＬｂＦＳＬ）である。これらの実験に使用したスペーサー配列は、（ガイド２）ｔｃａｇｃｔｔｇｃｃｇｔａｇｇｔｇｇｃａｔｃｇｃｃｃｔｃ；（ガイド３）ｇｇｇｔａｇｃｇｇｃｔｇａａｇｃａｃｔｇｃａｃｇｃｃｇｔ；（ガイド４）ｇｇｔｃｔｔｇｔａｇｔｔｇｃｃｇｔｃｇｔｃｃｔｔｇａａｇ；（ガイド５）ｔａｃｔｃｃａｇｃｔｔｇｔｇｃｃｃｃａｇｇａｔｇｔｔｇｃ；（ガイド６）ｃａｃｇｃｔｇｃｃｇｔｃｃｔｃｇａｔｇｔｔｇｔｇｇｃｇｇ；（ガイド７）ｔｃｔｔｔｇｃｔｃａｇｇｇｃｇｇａｃｔｇｇｇｔｇｃｔｃａ；（ガイド８）ｇａｃｔｔｇｔａｃａｇｃｔｃｇｔｃｃａｔｇｃｃｇａｇａｇ；及び（ガイドＮＴ）ｔａｇａｔｔｇｃｔｇｔｔｃｔａｃｃａａｇｔａａｔｃｃａｔである。 図６Ａ～図６Ｅ．哺乳類ノックダウンのためのＬｗａＣａｓ１３ａのエンジニアリング及び最適化。（Ａ）Ａ３７５細胞にトランスフェクトした様々なガイドを使用したＬｗＣａｓ１３ａによるＧｌｕｃ転写物のノックダウン：（Ｂ）ＬｗａＣａｓ１３ａのエンジニアリングした変異体を使用したガウシアルシフェラーゼ（Ｇｌｕｃ）のノックダウン。（Ｃ）ＬｗａＣａｓ１３ａ及び様々な長さのＧｌｕｃ ｃｒＲＮＡ １スペーサーによるガウシアルシフェラーゼ（Ｇｌｕｃ）のノックダウン。（Ｄ）様々なガイドを使用したＬｗａＣａｓ１３ａによるＫＲＡＳ転写物のノックダウン。（Ｅ）様々なガイドを使用したＬｗａＣａｓ１３ａによるＰＰＩＢ転写物のノックダウン。 図６Ａ～図６Ｅ．哺乳類ノックダウンのためのＬｗａＣａｓ１３ａのエンジニアリング及び最適化。（Ａ）Ａ３７５細胞にトランスフェクトした様々なガイドを使用したＬｗＣａｓ１３ａによるＧｌｕｃ転写物のノックダウン：（Ｂ）ＬｗａＣａｓ１３ａのエンジニアリングした変異体を使用したガウシアルシフェラーゼ（Ｇｌｕｃ）のノックダウン。（Ｃ）ＬｗａＣａｓ１３ａ及び様々な長さのＧｌｕｃ ｃｒＲＮＡ １スペーサーによるガウシアルシフェラーゼ（Ｇｌｕｃ）のノックダウン。（Ｄ）様々なガイドを使用したＬｗａＣａｓ１３ａによるＫＲＡＳ転写物のノックダウン。（Ｅ）様々なガイドを使用したＬｗａＣａｓ１３ａによるＰＰＩＢ転写物のノックダウン。 図６Ａ～図６Ｅ．哺乳類ノックダウンのためのＬｗａＣａｓ１３ａのエンジニアリング及び最適化。（Ａ）Ａ３７５細胞にトランスフェクトした様々なガイドを使用したＬｗＣａｓ１３ａによるＧｌｕｃ転写物のノックダウン：（Ｂ）ＬｗａＣａｓ１３ａのエンジニアリングした変異体を使用したガウシアルシフェラーゼ（Ｇｌｕｃ）のノックダウン。（Ｃ）ＬｗａＣａｓ１３ａ及び様々な長さのＧｌｕｃ ｃｒＲＮＡ １スペーサーによるガウシアルシフェラーゼ（Ｇｌｕｃ）のノックダウン。（Ｄ）様々なガイドを使用したＬｗａＣａｓ１３ａによるＫＲＡＳ転写物のノックダウン。（Ｅ）様々なガイドを使用したＬｗａＣａｓ１３ａによるＰＰＩＢ転写物のノックダウン。 図７．それぞれの標的遺伝子に対するｇＲＮＡ及びＮＥＳと融合したＣ２ｃ２レプトトリキア・ウエイデイ（Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ ｗａｄｅｉ）Ｆ０２７９による標的遺伝子の正規化タンパク質発現。それぞれの標的遺伝子に対するｇＲＮＡは、ｃｔｇｃｔｇｃｃａｃａｇａｃｃｇａｇａｇｇｃｔｔａａａａ（ＣＴＮＮＢ１）；ｔｃｃｔｔｇａｔｔａｃａｃｇａｔｇｇａａｔｔｔｇｃｔｇｔ（ＰＰＩＢ）；ｔｃａａｇｇｔｇｇｇｇｔｃａｃａｇｇａｇａａｇｃｃａａａ（ｍＡＰＫ１４）；ａｔｇａｔａａｔｇｃａａｔａｇｃａｇｇａｃａｇｇａｔｇａ（ＣＸＣＲ４）；ｇｃｇｔｇａｇｃｃａｃｃｇｃｇｃｃｔｇｇｃｃｇｇｃｔｇｔ（ＴＩＮＣＲ）；ｃｃａｇｃｔｇｃａｇａｔｇｃｔｇｃａｇｔｔｔｔｔｇｇｃｇ（ＰＣＡＴ１）；ｃｔｇｇａａａｔｇｇａａｇａｔｇｃｃｇｇｃａｔａｇｃｃａ（ＣＡＰＮ１）；ｇａｔｇａｃａｃｃｔｃａｃａｃｇｇａｃｃａｃｃｃｃｔａｇ（ＬＥＴＭＤ１）；ｔａａｔａｃｔｇｃｔｃｃａｇａｔａｔｇｇｇｔｇｇｇｃｃａ（ＭＡＰＫ１４）；ｃａｔｇａａｇａｃｃｇａｇｔｔａｔａｇａａｔａｃｔａｔａ（ＲＢ１）；ｇｇｔｇａａａｔａｔｔｃｔｃｃａｔｃｃａｇｔｇｇｔｔｔｃ（ＴＰ５３）；及びａａｔｔｔｃｔｃｇａａｃｔａａｔｇｔａｔａｇａａｇｇｃａ（ＫＲＡＳ）である。 図８．Ｇｌｕｃ．に対する種々のｇＲＮＡ別及びＮＬＳ、ＮＥＳと融合した、又はタグなしのＣ２ｃ２オルソログ（ｏｒｔｈｏｇｕｅ）別のルシフェラーゼの正規化タンパク質発現。Ｃ２ｃ２オルソログ（ｏｒｔｈｏｇｕｅ）は、レプトトリキア・シャーイイ（Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ ｓｈａｈｉｉ）（Ｌｓｈ）、レプトトリキア・ウエイデイ（Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ ｗａｄｅｉ）Ｆ０２７９（Ｌｗ２）、クロストリジウム・アミノフィルム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｍｉｎｏｐｈｉｌｕｍ）（Ｃａ）、リステリア・ニューヨーケンシス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｎｅｗｙｏｒｋｅｎｓｉｓ）ＦＳＬ Ｍ６－０６３５（ＬｂＦＳＬ）、ラクノスピラ科（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ）細菌ＮＫ４Ａ１７９（ＬｂＮｋ）、及びラクノスピラ科（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ）細菌ＭＡ２０２０（ＬｂＭ）である。 図９．Ｌｗ２は複数の細胞株で機能する。２９３ＦＴ細胞についての正規化したルシフェラーゼ活性を示す 図１０Ａ～図１０Ｂ．Ｇｌｕｃ．に対するｇＲＮＡ別及び触媒不活性Ｃ２ｃ２オルソログ（ｏｒｔｈｏｇｕｅ）別のルシフェラーゼの相対タンパク質発現。（Ａ）ｄＣ２ｃ２レプトトリキア・ウエイデイ（Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ ｗａｄｅｉ）（ＬｗＣ２ｃ２）をＥＩＦ４Ｅに融合し、ＥＩＦ４Ｅ及びＮＥＳに融合し、又はタグなしとした。（Ｂ）ｄＣ２ｃ２リステリア・ニューヨーケンシス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｎｅｗｙｏｒｋｅｎｓｉｓ）ＦＳＬ Ｍ６－０６３５（ＬｂＦＳＬ）をＮＬＳ及びＥＩＦ４Ｅに融合し、又はタグなしとした。 図１１Ａ～図１１Ｃ．細胞をＮａＡｓＯ２で処理すると、βアクチンを標的とするレプトトリキア・ウエイデイ（Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ ｗａｄｅｉ）Ｃ２ｃ２の細胞局在はストレス顆粒に局在する； 図１２．哺乳類細胞におけるＲＮＡノックダウン。Ｃ２ｃ２は２つの標的部位でｓｈＲＮＡより優れている。 図１３．ｃｒＲＮＡトランスフェクション量が増加するとノックダウンが増加する。 図１４．ＮＥＳを有するＬｗ２Ｃ２ｃ２（ＮＥＳ－Ｌｗ２Ｃ２ｃ２）はｔＲＮＡ及びＵ６ノックダウンのＲＮＡを有効に切断する。 図１５Ａ～図１５Ｂ．（Ａ）タンパク質トランスフェクション量がノックダウンを飽和させる。（Ｂ）Ｇｌｕｃ ｃｒＲＮＡ １及び様々な量のトランスフェクトＬｗａＣａｓ１３ａプラスミドによるＧｌｕｃ転写物のノックダウン。 図１６．Ｕ６ドライブＤＲ－スペーサー－ＤＲ－スペーサーターゲティング構築物 図１７．内因性遺伝子上の対応する標的に対してＣ２ｃ２が最適化ｓｈＲＮＡよりも優れている。 図１８．ｄＬｗ２Ｃ２ｃ２－ＥＩＦ４Ｅ融合物は３つの遺伝子の翻訳；ウエスタンブロットでのバンド強度によって計測したときのタンパク質レベルを上方制御することができる。 図１９．個別の転写物のノックダウン。Ｌｗ２は、より低い変動性及びより高い特異性を示す。 図２０．哺乳類細胞におけるＲＮＡノックダウン。 図２１．ＧＦＰのスーパーフォルダー誘導体（ｓｆＧＦＰ）によってイメージングが向上する。ＨＥＫ２９３ＦＴ細胞及びマウス胚性幹細胞（ｍＥＳＣ）でＣ２ｃ２－ｍＣｈｅｒｒｙ及びｓｆＧＦＰ－Ｃ２ｃ２融合タンパク質を比較する。 図２２Ａ．ｍｓｆＧＦＰ－Ｃ２ｃ２はノックダウンを向上させる。Ｃ２ｃ２とｍＣｈｅｒｒｙ又はｍｓｆＧＦＰとの様々な融合タンパク質であって、ＮＬＳ又はＮＥＳを更に含む融合タンパク質によるルシフェラーゼノックダウンを示す。 図２２Ｂ～図２２Ｄは、Ｃ２ｃ２によって転写を調節するタンパク質タグ付加系を例示し、改変Ｃ２ｃ２に含まれる短鎖ペプチド配列に結合する転写開始因子が連結されたｓｃＦｖのエレメントを示す（ＳｕｎＴａｇ）。図２２Ｃ～図２２Ｄは、この系の転写効果を示す。 図２２Ａ．ｍｓｆＧＦＰ－Ｃ２ｃ２はノックダウンを向上させる。Ｃ２ｃ２とｍＣｈｅｒｒｙ又はｍｓｆＧＦＰとの様々な融合タンパク質であって、ＮＬＳ又はＮＥＳを更に含む融合タンパク質によるルシフェラーゼノックダウンを示す。 図２２Ｂ～図２２Ｄは、Ｃ２ｃ２によって転写を調節するタンパク質タグ付加系を例示し、改変Ｃ２ｃ２に含まれる短鎖ペプチド配列に結合する転写開始因子が連結されたｓｃＦｖのエレメントを示す（ＳｕｎＴａｇ）。図２２Ｃ～図２２Ｄは、この系の転写効果を示す。 図２２Ａ．ｍｓｆＧＦＰ－Ｃ２ｃ２はノックダウンを向上させる。Ｃ２ｃ２とｍＣｈｅｒｒｙ又はｍｓｆＧＦＰとの様々な融合タンパク質であって、ＮＬＳ又はＮＥＳを更に含む融合タンパク質によるルシフェラーゼノックダウンを示す。 図２２Ｂ～図２２Ｄは、Ｃ２ｃ２によって転写を調節するタンパク質タグ付加系を例示し、改変Ｃ２ｃ２に含まれる短鎖ペプチド配列に結合する転写開始因子が連結されたｓｃＦｖのエレメントを示す（ＳｕｎＴａｇ）。図２２Ｃ～図２２Ｄは、この系の転写効果を示す。 図２３Ａ～図２３Ｂ．レポータータンパク質（ＧＦＰ、Ｖｅｎｕｓ、Ｃｒｅ等）のスプリッティング。各パートがＣ２ｃ２に融合される（スライド、例えばカスパーゼを含む概略図を参照）。転写物を標的とする２つのガイドを互いの近くに設計することにより、その転写物の存在下でスプリットタンパク質が再構成される。 図２４Ａ～図２４Ｃ．Ｃ２ｃ２コラテラルＲＮアーゼ活性による迅速ＲＮＡ検出。（Ａ）左側のパネル：Ｃ２ｃ２ ｃｒＲＮＡのガイド配列に相補的な標的ＲＮＡによるＣ２ｃ２コラテラル非特異的ＲＮアーゼ活性が活性化すると、レポーターが切断される。右側のパネル：標的ＲＮＡの非存在下では、コラテラル非特異的ＲＮアーゼ活性は誘導されず、従ってレポーターの切断はない。（Ｂ）ＬｗａＣａｓ１３ａによるコラテラル効果の活性を検出するアッセイの概略図。（Ｃ）標的ＲＮＡの存在下又は非存在下でＬｗａＣａｓ１３ａ－ｃｒＲＮＡ複合体とインキュベートした後のコラテラルＲＮＡ標的のゲル電気泳動。 図２４Ａ～図２４Ｃ．Ｃ２ｃ２コラテラルＲＮアーゼ活性による迅速ＲＮＡ検出。（Ａ）左側のパネル：Ｃ２ｃ２ ｃｒＲＮＡのガイド配列に相補的な標的ＲＮＡによるＣ２ｃ２コラテラル非特異的ＲＮアーゼ活性が活性化すると、レポーターが切断される。右側のパネル：標的ＲＮＡの非存在下では、コラテラル非特異的ＲＮアーゼ活性は誘導されず、従ってレポーターの切断はない。（Ｂ）ＬｗａＣａｓ１３ａによるコラテラル効果の活性を検出するアッセイの概略図。（Ｃ）標的ＲＮＡの存在下又は非存在下でＬｗａＣａｓ１３ａ－ｃｒＲＮＡ複合体とインキュベートした後のコラテラルＲＮＡ標的のゲル電気泳動。 図２５．様々な濃度のＣ２ｃ２を使用したコラテラル効果によるレンチウイルス検出。 図２６．コラテラル効果によるレンチウイルス検出の経時的変化。 図２７．Ｃ２ｃ２コラテラルＲＮアーゼ活性によるまれなＲＮＡ種の検出。標的濃度及び標的切断の増加に伴い非特異的オフターゲットＲＮアーゼ活性が増加する。 図２８Ａ～図２８Ｂ．Ｌｗ２Ｃ２ｃ２とＬｂｕＣ２ｃ２とのアラインメント。 図２８Ａ～図２８Ｂ．Ｌｗ２Ｃ２ｃ２とＬｂｕＣ２ｃ２とのアラインメント。 図２９Ａ～図２９Ｃ．（Ａ）スペーサー配列にシングル塩基対ミスマッチを有するルシフェラーゼｍＲＮＡノックダウンを標的とするβＬｗＣ２ｃ２。（Ｂ）スペーサー配列にシングル塩基対ミスマッチを有するＣＸＣＲ４ ｍＲＮＡノックダウンを標的とするＬｗＣ２ｃ２。（Ｃ）スペーサー配列にシングル及び連続ダブル塩基対ミスマッチを有するルシフェラーゼｍＲＮＡノックダウンを標的とするＬｗＣ２ｃ２。 図２９Ｄ－Ａ～図２９Ｄ－Ｃ．（Ａ）ルシフェラーゼレポーターｍＲＮＡのノックダウンの特異性。Ｃ２ｃ２はルシフェラーゼレポーターｍＲＮＡのノックダウンに関してＲＮＡｉよりも特異的が高い。左：ｓｈＲＮＡについてのルシフェラーゼノックダウン条件と比べたノンターゲティングトランスフェクト対照（全てのグラフのｘ軸）のＲＮＡ－ｓｅｑライブラリで検出された全ての遺伝子のｌｏｇ２（転写物百万分率（ＴＰＭ））値による発現レベル。右：Ｃ２ｃ２についてのルシフェラーゼノックダウン条件と比べたノンターゲティングトランスフェクト対照（全てのグラフのｘ軸）のＲＮＡ－ｓｅｑライブラリにおける検出された全ての遺伝子のｌｏｇ２（転写物百万分率（ＴＰＭ））値による発現レベル。ノックダウンの標的となる標的ルシフェラーゼ転写物は赤色の点で示す。ｎ＝３のバイオロジカルレプリケートからの平均を示す。（Ｂ）内因性ＫＲＡＳ ｍＲＮＡのノックダウンの特異性。Ｃ２ｃ２は内因性ＫＲＡＳのノックダウンに関してＲＮＡｉよりも特異的が高い。標的転写物は赤色の点で示す。（Ｃ）内因性ＰＰＩＢ ｍＲＮＡのノックダウンの特異性。Ｃ２ｃ２は内因性ＰＰＩＢのノックダウンに関してＲＮＡｉよりも特異的が高い。標的転写物は赤色の点で示す。 図２９Ｅ～図２９Ｇ．（Ｅ）３つの異なる遺伝子におけるＬｗａＣａｓ１３ａノックダウンをｓｈＲＮＡノックダウンと比較する６つのＲＮＡ－ｓｅｑライブラリの遺伝子発現差異解析（各々３回のバイオロジカルレプリケート）。遺伝子は、それがノンターゲティング対照と比べて平均変化倍数＞２又は＜０．７５を有し、且つ偽発見率（ＦＤＲ）＜０．１０を有する場合に有意に差次的に発現したと見なされる。（Ｆ）ＲＮＡ ｓｅｑライブラリからの標的遺伝子に関して定量化した平均ノックダウンレベル。（Ｇ）左：細胞成長の計測に先立つ抗生物質選択有り及び無しでＬｗａＣａｓ１３ａを７２時間トランスフェクトした細胞のルシフェラーゼノックダウン。中央：抗生物質選択有り及び無しでＬｗａＣａｓ１３ａを７２時間トランスフェクトした細胞の細胞生存度。右：抗生物質選択有り及び無しでＬｗａＣａｓ１３ａを７２時間トランスフェクトした細胞のＧＦＰ蛍光。値は全て、ｎ＝３での平均値±ＳＥＭである。 図２９Ａ～図２９Ｃ．（Ａ）スペーサー配列にシングル塩基対ミスマッチを有するルシフェラーゼｍＲＮＡノックダウンを標的とするβＬｗＣ２ｃ２。（Ｂ）スペーサー配列にシングル塩基対ミスマッチを有するＣＸＣＲ４ ｍＲＮＡノックダウンを標的とするＬｗＣ２ｃ２。（Ｃ）スペーサー配列にシングル及び連続ダブル塩基対ミスマッチを有するルシフェラーゼｍＲＮＡノックダウンを標的とするＬｗＣ２ｃ２。 図２９Ｄ－Ａ～図２９Ｄ－Ｃ．（Ａ）ルシフェラーゼレポーターｍＲＮＡのノックダウンの特異性。Ｃ２ｃ２はルシフェラーゼレポーターｍＲＮＡのノックダウンに関してＲＮＡｉよりも特異的が高い。左：ｓｈＲＮＡについてのルシフェラーゼノックダウン条件と比べたノンターゲティングトランスフェクト対照（全てのグラフのｘ軸）のＲＮＡ－ｓｅｑライブラリで検出された全ての遺伝子のｌｏｇ２（転写物百万分率（ＴＰＭ））値による発現レベル。右：Ｃ２ｃ２についてのルシフェラーゼノックダウン条件と比べたノンターゲティングトランスフェクト対照（全てのグラフのｘ軸）のＲＮＡ－ｓｅｑライブラリにおける検出された全ての遺伝子のｌｏｇ２（転写物百万分率（ＴＰＭ））値による発現レベル。ノックダウンの標的となる標的ルシフェラーゼ転写物は赤色の点で示す。ｎ＝３のバイオロジカルレプリケートからの平均を示す。（Ｂ）内因性ＫＲＡＳ ｍＲＮＡのノックダウンの特異性。Ｃ２ｃ２は内因性ＫＲＡＳのノックダウンに関してＲＮＡｉよりも特異的が高い。標的転写物は赤色の点で示す。（Ｃ）内因性ＰＰＩＢ ｍＲＮＡのノックダウンの特異性。Ｃ２ｃ２は内因性ＰＰＩＢのノックダウンに関してＲＮＡｉよりも特異的が高い。標的転写物は赤色の点で示す。 図２９Ｅ～図２９Ｇ．（Ｅ）３つの異なる遺伝子におけるＬｗａＣａｓ１３ａノックダウンをｓｈＲＮＡノックダウンと比較する６つのＲＮＡ－ｓｅｑライブラリの遺伝子発現差異解析（各々３回のバイオロジカルレプリケート）。遺伝子は、それがノンターゲティング対照と比べて平均変化倍数＞２又は＜０．７５を有し、且つ偽発見率（ＦＤＲ）＜０．１０を有する場合に有意に差次的に発現したと見なされる。（Ｆ）ＲＮＡ ｓｅｑライブラリからの標的遺伝子に関して定量化した平均ノックダウンレベル。（Ｇ）左：細胞成長の計測に先立つ抗生物質選択有り及び無しでＬｗａＣａｓ１３ａを７２時間トランスフェクトした細胞のルシフェラーゼノックダウン。中央：抗生物質選択有り及び無しでＬｗａＣａｓ１３ａを７２時間トランスフェクトした細胞の細胞生存度。右：抗生物質選択有り及び無しでＬｗａＣａｓ１３ａを７２時間トランスフェクトした細胞のＧＦＰ蛍光。値は全て、ｎ＝３での平均値±ＳＥＭである。 図２９Ａ～図２９Ｃ．（Ａ）スペーサー配列にシングル塩基対ミスマッチを有するルシフェラーゼｍＲＮＡノックダウンを標的とするβＬｗＣ２ｃ２。（Ｂ）スペーサー配列にシングル塩基対ミスマッチを有するＣＸＣＲ４ ｍＲＮＡノックダウンを標的とするＬｗＣ２ｃ２。（Ｃ）スペーサー配列にシングル及び連続ダブル塩基対ミスマッチを有するルシフェラーゼｍＲＮＡノックダウンを標的とするＬｗＣ２ｃ２。 図２９Ｄ－Ａ～図２９Ｄ－Ｃ．（Ａ）ルシフェラーゼレポーターｍＲＮＡのノックダウンの特異性。Ｃ２ｃ２はルシフェラーゼレポーターｍＲＮＡのノックダウンに関してＲＮＡｉよりも特異的が高い。左：ｓｈＲＮＡについてのルシフェラーゼノックダウン条件と比べたノンターゲティングトランスフェクト対照（全てのグラフのｘ軸）のＲＮＡ－ｓｅｑライブラリで検出された全ての遺伝子のｌｏｇ２（転写物百万分率（ＴＰＭ））値による発現レベル。右：Ｃ２ｃ２についてのルシフェラーゼノックダウン条件と比べたノンターゲティングトランスフェクト対照（全てのグラフのｘ軸）のＲＮＡ－ｓｅｑライブラリにおける検出された全ての遺伝子のｌｏｇ２（転写物百万分率（ＴＰＭ））値による発現レベル。ノックダウンの標的となる標的ルシフェラーゼ転写物は赤色の点で示す。ｎ＝３のバイオロジカルレプリケートからの平均を示す。（Ｂ）内因性ＫＲＡＳ ｍＲＮＡのノックダウンの特異性。Ｃ２ｃ２は内因性ＫＲＡＳのノックダウンに関してＲＮＡｉよりも特異的が高い。標的転写物は赤色の点で示す。（Ｃ）内因性ＰＰＩＢ ｍＲＮＡのノックダウンの特異性。Ｃ２ｃ２は内因性ＰＰＩＢのノックダウンに関してＲＮＡｉよりも特異的が高い。標的転写物は赤色の点で示す。 図２９Ｅ～図２９Ｇ．（Ｅ）３つの異なる遺伝子におけるＬｗａＣａｓ１３ａノックダウンをｓｈＲＮＡノックダウンと比較する６つのＲＮＡ－ｓｅｑライブラリの遺伝子発現差異解析（各々３回のバイオロジカルレプリケート）。遺伝子は、それがノンターゲティング対照と比べて平均変化倍数＞２又は＜０．７５を有し、且つ偽発見率（ＦＤＲ）＜０．１０を有する場合に有意に差次的に発現したと見なされる。（Ｆ）ＲＮＡ ｓｅｑライブラリからの標的遺伝子に関して定量化した平均ノックダウンレベル。（Ｇ）左：細胞成長の計測に先立つ抗生物質選択有り及び無しでＬｗａＣａｓ１３ａを７２時間トランスフェクトした細胞のルシフェラーゼノックダウン。中央：抗生物質選択有り及び無しでＬｗａＣａｓ１３ａを７２時間トランスフェクトした細胞の細胞生存度。右：抗生物質選択有り及び無しでＬｗａＣａｓ１３ａを７２時間トランスフェクトした細胞のＧＦＰ蛍光。値は全て、ｎ＝３での平均値±ＳＥＭである。 図３０Ａ～図３０Ｅ．ＲＮＡノックダウンのレベル及び特異性の比較。Ｃ２ｃ２はＲＮＡｉと同程度のノックダウンを維持しつつ特異性の増加を実証する。（Ａ）：解析した各ＲＮＡ－ｓｅｑライブラリにおいて有意に差次的に調節された遺伝子の数。３つの異なる遺伝子におけるＬｗａＣａｓ１３ａノックダウンをｓｈＲＮＡノックダウンと比較する６つのＲＮＡ－ｓｅｑライブラリの遺伝子発現差異解析（各々３回のバイオロジカルレプリケート）。遺伝子は、それがノンターゲティング対照と比べて平均変化倍数＞２又は＜０．７５を有し、且つ偽発見率（ＦＤＲ）＜０．１０を有する場合に有意に差次的に発現したと見なされる。（Ｂ）：ＲＮＡ ｓｅｑライブラリからの標的遺伝子に関して定量化した平均ノックダウンレベル。正規化発現は、ターゲティング条件における標的遺伝子のＴＰＭをノンターゲット条件における標的遺伝子のＴＰＭで除したものとして計算する。プロットは、図２８のＲＮＡ－ｓｅｑプロットの累積データを表す。オフターゲットは、有意に上方制御される（ｕｎｒｅｇｕｌａｔｅｄ）（＞２倍）又は下方制御される（＜０．７５倍）遺伝子として決定する。（Ｃ）非選択可能バージョン及びブラストサイジン（ｂｌａｓｔｃｉｄｉｎ）選択可能バージョンのＣ２ｃ２を含むＬｗａＣａｓ１３ａを７２時間トランスフェクトした細胞のルシフェラーゼノックダウン。（Ｄ）抗生物質選択有り及び無しでＬｗａＣａｓ１３ａを７２時間トランスフェクトした細胞の細胞生存度。（Ｅ）抗生物質選択有り及び無しでＬｗａＣａｓ１３ａを７２時間トランスフェクトした細胞のＧＦＰ蛍光。 図３０Ａ～図３０Ｅ．ＲＮＡノックダウンのレベル及び特異性の比較。Ｃ２ｃ２はＲＮＡｉと同程度のノックダウンを維持しつつ特異性の増加を実証する。（Ａ）：解析した各ＲＮＡ－ｓｅｑライブラリにおいて有意に差次的に調節された遺伝子の数。３つの異なる遺伝子におけるＬｗａＣａｓ１３ａノックダウンをｓｈＲＮＡノックダウンと比較する６つのＲＮＡ－ｓｅｑライブラリの遺伝子発現差異解析（各々３回のバイオロジカルレプリケート）。遺伝子は、それがノンターゲティング対照と比べて平均変化倍数＞２又は＜０．７５を有し、且つ偽発見率（ＦＤＲ）＜０．１０を有する場合に有意に差次的に発現したと見なされる。（Ｂ）：ＲＮＡ ｓｅｑライブラリからの標的遺伝子に関して定量化した平均ノックダウンレベル。正規化発現は、ターゲティング条件における標的遺伝子のＴＰＭをノンターゲット条件における標的遺伝子のＴＰＭで除したものとして計算する。プロットは、図２８のＲＮＡ－ｓｅｑプロットの累積データを表す。オフターゲットは、有意に上方制御される（ｕｎｒｅｇｕｌａｔｅｄ）（＞２倍）又は下方制御される（＜０．７５倍）遺伝子として決定する。（Ｃ）非選択可能バージョン及びブラストサイジン（ｂｌａｓｔｃｉｄｉｎ）選択可能バージョンのＣ２ｃ２を含むＬｗａＣａｓ１３ａを７２時間トランスフェクトした細胞のルシフェラーゼノックダウン。（Ｄ）抗生物質選択有り及び無しでＬｗａＣａｓ１３ａを７２時間トランスフェクトした細胞の細胞生存度。（Ｅ）抗生物質選択有り及び無しでＬｗａＣａｓ１３ａを７２時間トランスフェクトした細胞のＧＦＰ蛍光。 図３１ Ｃ２ｃ２は多重ノックダウン能を有する。ｃｒＲＮＡは、ＰＰＩＢ、ＣＸＣＲ４、ＫＲＡＳ、ＴＩＮＣＲ、及びＰＣＡＴを標的とするように設計した。上のパネルは、色分けされたｍＲＮＡの正規化発現レベルを、図示される多重化ｃｒＲＮＡ転写物と左から右に同じ順番で示す。下のパネルは、単一で投与したガイドを多重化したガイド及びプールしたガイドと比較する。 図３２Ａ～図３２Ｄ．ｇＬｕｃ又はｃＬｕｃの長さに沿ってガイドをタイリングすると、リターゲティング能力及び転写物上の脆弱性領域が示される。（Ａ）ＬｗａＣａｓ１３ａアレイ化スクリーニングの概略図。（Ｂ）１８６個のガイドを転写物の長さにわたって均等にタイリングしたＬｗＣ２ｃ２によるガウシアルシフェラーゼｍＲＮＡのノックダウン効率。（Ｃ）ガイドを転写物の長さにわたって均等にタイリングしたＬｗＣ２ｃ２によるウミホタルルシフェラーゼのアレイ化ノックダウンスクリーン。（Ｄ）アレイ化ノックダウンスクリーンからの上位３つのｃｒＲＮＡのｓｈＲＮＡ比較による検証。 図３３Ａ～図３３Ｂ．ＲＮＡ免疫沈降（ＲＩＰ）は標的結合のエンリッチメントを示す。ＨＡタグを含むｄＣ２ｃ２－ｍｓｆＧＦＰがタンパク質－ＲＮＡ複合体の沈殿をもたらした。結合したＲＮＡをｑＰＣＲによって定量化し、入力ＲＮＡ（免疫沈降なしの試料）及び陰性対照抗体による免疫沈降と比較してエンリッチメントを決定した。パネルＡは、β－アクチンＲＮＡ標的のエンリッチメントを示す。パネルＢは、ルシフェラーゼ標的のエンリッチメントを示す。 図３３Ａ～図３３Ｂ．ＲＮＡ免疫沈降（ＲＩＰ）は標的結合のエンリッチメントを示す。ＨＡタグを含むｄＣ２ｃ２－ｍｓｆＧＦＰがタンパク質－ＲＮＡ複合体の沈殿をもたらした。結合したＲＮＡをｑＰＣＲによって定量化し、入力ＲＮＡ（免疫沈降なしの試料）及び陰性対照抗体による免疫沈降と比較してエンリッチメントを決定した。パネルＡは、β－アクチンＲＮＡ標的のエンリッチメントを示す。パネルＢは、ルシフェラーゼ標的のエンリッチメントを示す。 図３４．３Ｔ３Ｌ１線維芽細胞におけるβ－アクチンのＣ２ｃ２イメージング。ターゲティング条件では（上のフレーム）、Ｃ２ｃ２複合体はアクチンｍＲＮＡに結合して核を離れ、細胞質β－アクチンｍＲＮＡを明らかにする。ノンターゲティング条件では、ＮＬＳタグ付加Ｃ２ｃ２が核に観察される。左右のカラムは異なる視野に相当する。 図３５．ＨＥＫ２９３ＦＴ細胞におけるβ－アクチンのＣ２ｃ２イメージング。ターゲティング条件では（上のフレーム）、Ｃ２ｃ２複合体はアクチンｍＲＮＡに結合して核を離れ、細胞質β－アクチンｍＲＮＡを明らかにする。ノンターゲティング条件では、ＮＬＳタグ付加Ｃ２ｃ２が核に観察される。左右のカラムは異なる視野に相当する。 図３６．Ｌｗ２Ｃａｓ１３ａのＲＮＡ切断動態のインビトロでの特徴付け。半対数段階で系列希釈したＬｗａＣａｓ１３ａ－ｃｒＲＮＡ複合体を使用した５’末端標識標的１の０．５時間のＲＮＡ切断後の変性ゲル。 図３７．Ｌｗ２Ｃａｓ１３ａのＲＮＡ切断動態のインビトロでの特徴付け。５’末端標識標的１を使用したＬｗ２Ｃａｓ１３ａ ｓｓＲＮＡ切断の時系列の変性ゲル（ｄｅｎｕｔａｒｉｎｇ ｇｅｌ）。 図３８．Ｌｗ２Ｃ２ｃ２及びｃｒＲＮＡはＲＮＡガイド下ｓｓＲＮＡ切断を媒介する。１時間のインキュベーション後におけるＬｗ２ Ｃ２ｃ２によるｃｒＲＮＡ媒介性ｓｓＲＮＡ切断を示す変性ゲル。ｓｓＲＮＡ標的はＩＲＤｙｅ ８００で５’標識する。切断にはｃｒＲＮＡの存在が必要であり、ＥＤＴＡを加えると切断はなくなる。 図３９Ａ～図３９Ｂ．Ｌｗ２Ｃ２ｃ２及びｃｒＲＮＡはＲＮＡガイド下ｓｓＲＮＡ切断を媒介する。（Ａ）ｃｒＲＮＡによって標的化されているｓｓＲＮＡ基質の概略図。プロトスペーサー領域を青色で強調表示し、ＰＦＳをマゼンタ色のバーで示す。（Ｂ）３時間のインキュベーション後におけるＰＦＳの必要性を示す変性ゲル。ＰＦＳ（概略図中、マゼンタ色のＸで示す）を除いて同一の４つのｓｓＲＮＡ基質をインビトロ切断反応に使用した。ｓｓＲＮＡ切断活性は標的部位の直ちに３’側にあるヌクレオチドに依存する。 図４０．ダイレクトリピート長さがＬｗ２Ｃ２ｃ２のＲＮＡガイド下ＲＮアーゼ活性に影響を及ぼす。３時間のインキュベーション後におけるダイレクトリピート長さに応じたｓｓＲＮＡ １のｃｒＲＮＡガイド下切断を示す変性ゲル。 図４１．スペーサー長さがＬｗ２Ｃ２ｃ２のＲＮＡガイド下ＲＮアーゼ活性に影響を及ぼす。３時間のインキュベーション後におけるスペーサー長さに応じたｓｓＲＮＡ １のｃｒＲＮＡガイド下切断を示す変性ゲル。 図４２Ａ～図４２Ｃ．Ｌｗ２Ｃ２ｃ２切断部位は標的ＲＮＡの二次構造及び配列によって決まる。（Ａ）ＬｗＣａｓ１３ａ及びｃｒＲＮＡ １とインキュベートした後のｓｓＲＮＡ ４及びｓｓＲＮＡ ５を示す変性ゲル。（Ｂ）ｓｓＲＮＡ ４（青色）及び（Ｃ）ｓｓＲＮＡ ５；（緑色）は同じプロトスペーサーを共有するが、異なる配列が隣接する。同一のプロトスペーサーにも関わらず、フランキング配列が異なるため、異なる切断パターンとなる。 図４３Ａ～図４３Ｃ．（Ａ）４つの可能なヌクレオチドの各々について強調表示したループ（赤色）においてホモポリマーストレッチで改変されたｓｓＲＮＡ ４の概略図。ｃｒＲＮＡスペーサー配列は青色で強調表示する。（Ｂ）．４つの可能なホモポリマー標的の各々について３時間のインキュベーション後におけるＬｗ２Ｃ２ｃ２－ｃｒＲＮＡ媒介性切断を示す変性ゲル。Ｌｗ２Ｃ２ｃ２はＣ及びＵを切断する。（Ｃ）ＬｗａＣａｓ１３ａはＬ．ウエイデイ（Ｌ．ｗａｄｅｉｉ）ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ遺伝子座からのｐｒｅ－ｃｒＲＮＡをプロセシングすることができる。 図４４Ａ～図４４Ｋ．触媒不活性ＬｗａＣａｓ１３ａ（ｄＣａｓ１３ａ）は哺乳類細胞において転写物への結合能を有する。（Ａ）ｄＣａｓ１３ａ結合のイメージング及び評価に使用されるｄＣａｓ１３ａ－ＧＦＰ構築物の概略図。（Ｂ）ｄＣａｓ１３ａ結合を定量化するためのＲＮＡ免疫沈降の概略図。（Ｃ）ｇＬｕｃ転写物を標的とするｄＣａｓ１３ａはノンターゲティング対照と比較して有意にエンリッチされる。対照抗体又は入力ライセートのいずれかに対して正規化したＲＩＰによるガウシア（ｇａｕｓｓｉａｎ）ルシフェラーゼｍＲＮＡについてのｄＣ２ｃ２－ｍｓｆＧＦＰ結合の定量化。値はノンターゲティングガイドに対して正規化する。（ｎ＝３、＊、ｐ＜０．０５；＊＊＊＊、ｐ＜０．０００１、ｔ検定による）。（Ｄ）ネガティブフィードバックイメージングに使用されるｄＣａｓ１３ａ－ＧＦＰ－ＫＲＡＢ構築物の概略図。標的及びガイドが存在しない場合、レポータータンパク質はそれ自身の転写を阻害する。（Ｅ）Ｇｌｕｃ、Ｃｌｕｃ、ＰＰＩＢ、及びＫＲＡＳノックダウンは、転写物の予測されるフォールディングによって計測したときの標的の接近可能性と部分的に相関する。（Ｆ）ｂ－アクチンのイメージングのためのｄＣａｓ１３－ＧＦＰ構築物とｄＣａｓ１３ａ－ＧＦＰ－ＫＲＡＢ構築物との局在間の比較。（Ｇ）ＨＥＫ２９３細胞におけるｂ－アクチンを標的とする複数のガイドによるｄＣａｓ１３ａ－ＧＦＰ－ＫＲＡＢイメージングの代表的な画像。（Ｈ）ＡＣＴＢを標的とする複数のガイドによるｄＣａｓ１３ａ－ＧＦＰ－ＫＲＡＢイメージングの代表的な画像。（Ｉ）核対全細胞シグナル比によって計測したときの、ｄＣａｓ１３ａ－ＧＦＰ－ＫＲＡＢの細胞質移行の定量化。（Ｊ）４００ｕＭ亜ヒ酸ナトリウムで処理した２９３ＦＴ細胞の代表的な固定免疫蛍光像。マーカーＧ３ＢＰ１を染色することによりストレス顆粒が示される。スケールバー、５μｍ。スケールバー、５μｍ。（Ｋ）ピアソン相関によって細胞当たりに定量化したＧ３ＢＰ１及びｄＣａｓ１３ａ－ＧＦＰ－ＫＲＡＢの共局在。値は全て、ｎ＝３での平均値±ＳＥＭである。＊＊＊＊ｐ＜０．０００１；＊＊＊ｐ＜０．００１；＊＊ｐ＜０．０１；＊ｐ＜０．０５。ｎｓ＝有意差なし。（ａ）の比較には片側スチューデントｔ検定を使用し、及び（Ｉ）及び（Ｋ）の比較には両側スチューデントｔ検定を使用した。 図４４Ａ～図４４Ｋ．触媒不活性ＬｗａＣａｓ１３ａ（ｄＣａｓ１３ａ）は哺乳類細胞において転写物への結合能を有する。（Ａ）ｄＣａｓ１３ａ結合のイメージング及び評価に使用されるｄＣａｓ１３ａ－ＧＦＰ構築物の概略図。（Ｂ）ｄＣａｓ１３ａ結合を定量化するためのＲＮＡ免疫沈降の概略図。（Ｃ）ｇＬｕｃ転写物を標的とするｄＣａｓ１３ａはノンターゲティング対照と比較して有意にエンリッチされる。対照抗体又は入力ライセートのいずれかに対して正規化したＲＩＰによるガウシア（ｇａｕｓｓｉａｎ）ルシフェラーゼｍＲＮＡについてのｄＣ２ｃ２－ｍｓｆＧＦＰ結合の定量化。値はノンターゲティングガイドに対して正規化する。（ｎ＝３、＊、ｐ＜０．０５；＊＊＊＊、ｐ＜０．０００１、ｔ検定による）。（Ｄ）ネガティブフィードバックイメージングに使用されるｄＣａｓ１３ａ－ＧＦＰ－ＫＲＡＢ構築物の概略図。標的及びガイドが存在しない場合、レポータータンパク質はそれ自身の転写を阻害する。（Ｅ）Ｇｌｕｃ、Ｃｌｕｃ、ＰＰＩＢ、及びＫＲＡＳノックダウンは、転写物の予測されるフォールディングによって計測したときの標的の接近可能性と部分的に相関する。（Ｆ）ｂ－アクチンのイメージングのためのｄＣａｓ１３－ＧＦＰ構築物とｄＣａｓ１３ａ－ＧＦＰ－ＫＲＡＢ構築物との局在間の比較。（Ｇ）ＨＥＫ２９３細胞におけるｂ－アクチンを標的とする複数のガイドによるｄＣａｓ１３ａ－ＧＦＰ－ＫＲＡＢイメージングの代表的な画像。（Ｈ）ＡＣＴＢを標的とする複数のガイドによるｄＣａｓ１３ａ－ＧＦＰ－ＫＲＡＢイメージングの代表的な画像。（Ｉ）核対全細胞シグナル比によって計測したときの、ｄＣａｓ１３ａ－ＧＦＰ－ＫＲＡＢの細胞質移行の定量化。（Ｊ）４００ｕＭ亜ヒ酸ナトリウムで処理した２９３ＦＴ細胞の代表的な固定免疫蛍光像。マーカーＧ３ＢＰ１を染色することによりストレス顆粒が示される。スケールバー、５μｍ。スケールバー、５μｍ。（Ｋ）ピアソン相関によって細胞当たりに定量化したＧ３ＢＰ１及びｄＣａｓ１３ａ－ＧＦＰ－ＫＲＡＢの共局在。値は全て、ｎ＝３での平均値±ＳＥＭである。＊＊＊＊ｐ＜０．０００１；＊＊＊ｐ＜０．００１；＊＊ｐ＜０．０１；＊ｐ＜０．０５。ｎｓ＝有意差なし。（ａ）の比較には片側スチューデントｔ検定を使用し、及び（Ｉ）及び（Ｋ）の比較には両側スチューデントｔ検定を使用した。 図４４Ａ～図４４Ｋ．触媒不活性ＬｗａＣａｓ１３ａ（ｄＣａｓ１３ａ）は哺乳類細胞において転写物への結合能を有する。（Ａ）ｄＣａｓ１３ａ結合のイメージング及び評価に使用されるｄＣａｓ１３ａ－ＧＦＰ構築物の概略図。（Ｂ）ｄＣａｓ１３ａ結合を定量化するためのＲＮＡ免疫沈降の概略図。（Ｃ）ｇＬｕｃ転写物を標的とするｄＣａｓ１３ａはノンターゲティング対照と比較して有意にエンリッチされる。対照抗体又は入力ライセートのいずれかに対して正規化したＲＩＰによるガウシア（ｇａｕｓｓｉａｎ）ルシフェラーゼｍＲＮＡについてのｄＣ２ｃ２－ｍｓｆＧＦＰ結合の定量化。値はノンターゲティングガイドに対して正規化する。（ｎ＝３、＊、ｐ＜０．０５；＊＊＊＊、ｐ＜０．０００１、ｔ検定による）。（Ｄ）ネガティブフィードバックイメージングに使用されるｄＣａｓ１３ａ－ＧＦＰ－ＫＲＡＢ構築物の概略図。標的及びガイドが存在しない場合、レポータータンパク質はそれ自身の転写を阻害する。（Ｅ）Ｇｌｕｃ、Ｃｌｕｃ、ＰＰＩＢ、及びＫＲＡＳノックダウンは、転写物の予測されるフォールディングによって計測したときの標的の接近可能性と部分的に相関する。（Ｆ）ｂ－アクチンのイメージングのためのｄＣａｓ１３－ＧＦＰ構築物とｄＣａｓ１３ａ－ＧＦＰ－ＫＲＡＢ構築物との局在間の比較。（Ｇ）ＨＥＫ２９３細胞におけるｂ－アクチンを標的とする複数のガイドによるｄＣａｓ１３ａ－ＧＦＰ－ＫＲＡＢイメージングの代表的な画像。（Ｈ）ＡＣＴＢを標的とする複数のガイドによるｄＣａｓ１３ａ－ＧＦＰ－ＫＲＡＢイメージングの代表的な画像。（Ｉ）核対全細胞シグナル比によって計測したときの、ｄＣａｓ１３ａ－ＧＦＰ－ＫＲＡＢの細胞質移行の定量化。（Ｊ）４００ｕＭ亜ヒ酸ナトリウムで処理した２９３ＦＴ細胞の代表的な固定免疫蛍光像。マーカーＧ３ＢＰ１を染色することによりストレス顆粒が示される。スケールバー、５μｍ。スケールバー、５μｍ。（Ｋ）ピアソン相関によって細胞当たりに定量化したＧ３ＢＰ１及びｄＣａｓ１３ａ－ＧＦＰ－ＫＲＡＢの共局在。値は全て、ｎ＝３での平均値±ＳＥＭである。＊＊＊＊ｐ＜０．０００１；＊＊＊ｐ＜０．００１；＊＊ｐ＜０．０１；＊ｐ＜０．０５。ｎｓ＝有意差なし。（ａ）の比較には片側スチューデントｔ検定を使用し、及び（Ｉ）及び（Ｋ）の比較には両側スチューデントｔ検定を使用した。 図４４Ａ～図４４Ｋ．触媒不活性ＬｗａＣａｓ１３ａ（ｄＣａｓ１３ａ）は哺乳類細胞において転写物への結合能を有する。（Ａ）ｄＣａｓ１３ａ結合のイメージング及び評価に使用されるｄＣａｓ１３ａ－ＧＦＰ構築物の概略図。（Ｂ）ｄＣａｓ１３ａ結合を定量化するためのＲＮＡ免疫沈降の概略図。（Ｃ）ｇＬｕｃ転写物を標的とするｄＣａｓ１３ａはノンターゲティング対照と比較して有意にエンリッチされる。対照抗体又は入力ライセートのいずれかに対して正規化したＲＩＰによるガウシア（ｇａｕｓｓｉａｎ）ルシフェラーゼｍＲＮＡについてのｄＣ２ｃ２－ｍｓｆＧＦＰ結合の定量化。値はノンターゲティングガイドに対して正規化する。（ｎ＝３、＊、ｐ＜０．０５；＊＊＊＊、ｐ＜０．０００１、ｔ検定による）。（Ｄ）ネガティブフィードバックイメージングに使用されるｄＣａｓ１３ａ－ＧＦＰ－ＫＲＡＢ構築物の概略図。標的及びガイドが存在しない場合、レポータータンパク質はそれ自身の転写を阻害する。（Ｅ）Ｇｌｕｃ、Ｃｌｕｃ、ＰＰＩＢ、及びＫＲＡＳノックダウンは、転写物の予測されるフォールディングによって計測したときの標的の接近可能性と部分的に相関する。（Ｆ）ｂ－アクチンのイメージングのためのｄＣａｓ１３－ＧＦＰ構築物とｄＣａｓ１３ａ－ＧＦＰ－ＫＲＡＢ構築物との局在間の比較。（Ｇ）ＨＥＫ２９３細胞におけるｂ－アクチンを標的とする複数のガイドによるｄＣａｓ１３ａ－ＧＦＰ－ＫＲＡＢイメージングの代表的な画像。（Ｈ）ＡＣＴＢを標的とする複数のガイドによるｄＣａｓ１３ａ－ＧＦＰ－ＫＲＡＢイメージングの代表的な画像。（Ｉ）核対全細胞シグナル比によって計測したときの、ｄＣａｓ１３ａ－ＧＦＰ－ＫＲＡＢの細胞質移行の定量化。（Ｊ）４００ｕＭ亜ヒ酸ナトリウムで処理した２９３ＦＴ細胞の代表的な固定免疫蛍光像。マーカーＧ３ＢＰ１を染色することによりストレス顆粒が示される。スケールバー、５μｍ。スケールバー、５μｍ。（Ｋ）ピアソン相関によって細胞当たりに定量化したＧ３ＢＰ１及びｄＣａｓ１３ａ－ＧＦＰ－ＫＲＡＢの共局在。値は全て、ｎ＝３での平均値±ＳＥＭである。＊＊＊＊ｐ＜０．０００１；＊＊＊ｐ＜０．００１；＊＊ｐ＜０．０１；＊ｐ＜０．０５。ｎｓ＝有意差なし。（ａ）の比較には片側スチューデントｔ検定を使用し、及び（Ｉ）及び（Ｋ）の比較には両側スチューデントｔ検定を使用した。 図４５．図４３に示されるとおりのＣ２ｃ２－ＧＦＰイメージングタンパク質を使用したβ－アクチンの検出。ｄＣ２ｃ２－ｅＧＦＰ－ＺＦ－ＫＲＡＢ－ＮＬＳをターゲティングガイド（左側のパネル）又はノンターゲティングガイド（右側のパネル）と共に使用してβ－アクチンをイメージングした。 図４６．ＧＦＰタグ付加Ｇ３ＢＰ１を使用したストレス顆粒の検出。 図４７．ストレス顆粒及びストレス顆粒部分構造（「コア」）におけるアクチン（ａｃｔｉｎｇ）の検出。ターゲティング構築物有り及び無しで、且つコア部分構造を安定化させるＮａＡｓＯ２処理有り又は無しで、Ｃ２ｃ２－ｅＧＦＰ－ＺＦ－ＫＲＡＢを使用してアクチンｍＲＮＡをイメージングした。ストレス顆粒は抗Ｇ３ＢＰ１を使用して標識した。 図４８Ａ～図４８Ｆ：ｄＣａｓ１３ａは生細胞のストレス顆粒形成をイメージングすることができる。（Ａ）ネガティブフィードバックｄＣａｓ１３ａ－ｍｓｆＧＦＰ－ＫＲＡＢ構築物を使用して亜ヒ酸ナトリウム処理時のβ－アクチンｍＲＮＡのストレス顆粒への局在化をイメージングすることに関する概略図。（Ｂ）４００ｕＭ亜ヒ酸ナトリウムで処理した２９３ＦＴ細胞の代表的な固定免疫蛍光像。β－アクチンｍＲＮＡターゲティングガイドと共にトランスフェクトされたｄＣａｓ１３ａ－ｍｓｆＧＦＰ－ＫＲＡＢはストレス顆粒に局在する。ストレス顆粒のＧ３ＢＰ１マーカーに対する抗体で免疫染色した固定ＨＥＫ２９３細胞の代表的な画像を示す。（Ｃ）条件当たり約２０細胞のピアソン相関分析によるストレス顆粒局在の定量化。（Ｄ）：条件当たり約２０細胞のマンダースの共局在解析によるストレス顆粒局在の定量化。（Ｅ）４００ｕＭ亜ヒ酸ナトリウム処理に応答したストレス顆粒形成の生細胞解析からの代表的な画像。（Ｆ）亜ヒ酸ナトリウム処理に応答したストレス顆粒形成の定量化。 図４８Ａ～図４８Ｆ：ｄＣａｓ１３ａは生細胞のストレス顆粒形成をイメージングすることができる。（Ａ）ネガティブフィードバックｄＣａｓ１３ａ－ｍｓｆＧＦＰ－ＫＲＡＢ構築物を使用して亜ヒ酸ナトリウム処理時のβ－アクチンｍＲＮＡのストレス顆粒への局在化をイメージングすることに関する概略図。（Ｂ）４００ｕＭ亜ヒ酸ナトリウムで処理した２９３ＦＴ細胞の代表的な固定免疫蛍光像。β－アクチンｍＲＮＡターゲティングガイドと共にトランスフェクトされたｄＣａｓ１３ａ－ｍｓｆＧＦＰ－ＫＲＡＢはストレス顆粒に局在する。ストレス顆粒のＧ３ＢＰ１マーカーに対する抗体で免疫染色した固定ＨＥＫ２９３細胞の代表的な画像を示す。（Ｃ）条件当たり約２０細胞のピアソン相関分析によるストレス顆粒局在の定量化。（Ｄ）：条件当たり約２０細胞のマンダースの共局在解析によるストレス顆粒局在の定量化。（Ｅ）４００ｕＭ亜ヒ酸ナトリウム処理に応答したストレス顆粒形成の生細胞解析からの代表的な画像。（Ｆ）亜ヒ酸ナトリウム処理に応答したストレス顆粒形成の定量化。 図４８Ａ～図４８Ｆ：ｄＣａｓ１３ａは生細胞のストレス顆粒形成をイメージングすることができる。（Ａ）ネガティブフィードバックｄＣａｓ１３ａ－ｍｓｆＧＦＰ－ＫＲＡＢ構築物を使用して亜ヒ酸ナトリウム処理時のβ－アクチンｍＲＮＡのストレス顆粒への局在化をイメージングすることに関する概略図。（Ｂ）４００ｕＭ亜ヒ酸ナトリウムで処理した２９３ＦＴ細胞の代表的な固定免疫蛍光像。β－アクチンｍＲＮＡターゲティングガイドと共にトランスフェクトされたｄＣａｓ１３ａ－ｍｓｆＧＦＰ－ＫＲＡＢはストレス顆粒に局在する。ストレス顆粒のＧ３ＢＰ１マーカーに対する抗体で免疫染色した固定ＨＥＫ２９３細胞の代表的な画像を示す。（Ｃ）条件当たり約２０細胞のピアソン相関分析によるストレス顆粒局在の定量化。（Ｄ）：条件当たり約２０細胞のマンダースの共局在解析によるストレス顆粒局在の定量化。（Ｅ）４００ｕＭ亜ヒ酸ナトリウム処理に応答したストレス顆粒形成の生細胞解析からの代表的な画像。（Ｆ）亜ヒ酸ナトリウム処理に応答したストレス顆粒形成の定量化。 図４９Ａ～図４９Ｏ ＬｗａＣａｓ１３ａは内因性哺乳類コード及び非コードＲＮＡ標的を標的とするように再プログラムすることができる。（Ａ）ＫＲＡＳ転写物にわたって均等にタイリングした９３個のガイドのアレイ化ノックダウンスクリーン。（Ｂ）ＰＰＩＢ転写物にわたって均等にタイリングした９３個のガイドのアレイ化ノックダウンスクリーン。（Ｃ）ＬｗａＣａｓ１３ａアレイ化スクリーニングの概略図。（Ｄ）Ｇｌｕｃ転写物にわたって均等にタイリングした１８６個のガイドのアレイ化ノックダウンスクリーン。（Ｅ）ウミホタル（Ｃｙｐｒｉｄｉｎｉａ）ルシフェラーゼ（Ｃｌｕｃ）転写物にわたって均等にタイリングした９３個のガイドのアレイ化ノックダウンスクリーン。（Ｆ）ＫＲＡＳ転写物にわたって均等にタイリングした９３個のガイドのアレイ化ノックダウンスクリーン。（Ｇ）ＰＰＩＢ転写物にわたって均等にタイリングした９３個のガイドのアレイ化ノックダウンスクリーン。（Ｈ）内因性アレイ化ノックダウンスクリーンからの上位３個のガイドのｓｈＲＮＡ比較による検証。値は全て、ｎ＝３での平均値±ＳＥＭである。＊＊＊ｐ＜０．００１；＊＊ｐ＜０．０１。比較には両側スチューデントｔ検定を使用した。（Ｉ）ＭＡＬＡＴ１転写物にわたって均等にタイリングした９３個のガイドのアレイ化ノックダウンスクリーン。（Ｊ）内因性アレイ化ＭＡＬＡＴ１ノックダウンスクリーンからの上位３個のガイドのｓｈＲＮＡ比較による検証。（Ｋ）単一プロモーターの発現下にある５つの異なる内因性遺伝子に対するＣＲＩＳＰＲアレイ内の５つのガイドの多重送達はロバストなノックダウンが可能である。（Ｌ）３つの異なる内因性遺伝子に対する３つのガイドの多重送達又はガイドの各々をノンターゲティング配列で置き換えた構築物では、標的の遺伝子の特異的ノックダウンが示される。値は全て、ｎ＝３での平均値±ＳＥＭである。（Ｍ）対応するＲＮＡｉ構築物と比較したＬｗａＣａｓ１３ａによる３つの異なる内因性転写物のノックダウン。（Ｎ）ＬｗａＣａｓ１３ａは核ｌｎｃＲＮＡ転写物ＭＡＬＡＴ１のノックダウン能を有する。（Ｏ）３つの異なる内因性遺伝子に対する３つのガイドの多重送達又はｃｒＲＮＡの各々をノンターゲティング配列で置き換えた構築物では、標的の遺伝子の特異的ノックダウンが示される。 図４９Ａ～図４９Ｏ ＬｗａＣａｓ１３ａは内因性哺乳類コード及び非コードＲＮＡ標的を標的とするように再プログラムすることができる。（Ａ）ＫＲＡＳ転写物にわたって均等にタイリングした９３個のガイドのアレイ化ノックダウンスクリーン。（Ｂ）ＰＰＩＢ転写物にわたって均等にタイリングした９３個のガイドのアレイ化ノックダウンスクリーン。（Ｃ）ＬｗａＣａｓ１３ａアレイ化スクリーニングの概略図。（Ｄ）Ｇｌｕｃ転写物にわたって均等にタイリングした１８６個のガイドのアレイ化ノックダウンスクリーン。（Ｅ）ウミホタル（Ｃｙｐｒｉｄｉｎｉａ）ルシフェラーゼ（Ｃｌｕｃ）転写物にわたって均等にタイリングした９３個のガイドのアレイ化ノックダウンスクリーン。（Ｆ）ＫＲＡＳ転写物にわたって均等にタイリングした９３個のガイドのアレイ化ノックダウンスクリーン。（Ｇ）ＰＰＩＢ転写物にわたって均等にタイリングした９３個のガイドのアレイ化ノックダウンスクリーン。（Ｈ）内因性アレイ化ノックダウンスクリーンからの上位３個のガイドのｓｈＲＮＡ比較による検証。値は全て、ｎ＝３での平均値±ＳＥＭである。＊＊＊ｐ＜０．００１；＊＊ｐ＜０．０１。比較には両側スチューデントｔ検定を使用した。（Ｉ）ＭＡＬＡＴ１転写物にわたって均等にタイリングした９３個のガイドのアレイ化ノックダウンスクリーン。（Ｊ）内因性アレイ化ＭＡＬＡＴ１ノックダウンスクリーンからの上位３個のガイドのｓｈＲＮＡ比較による検証。（Ｋ）単一プロモーターの発現下にある５つの異なる内因性遺伝子に対するＣＲＩＳＰＲアレイ内の５つのガイドの多重送達はロバストなノックダウンが可能である。（Ｌ）３つの異なる内因性遺伝子に対する３つのガイドの多重送達又はガイドの各々をノンターゲティング配列で置き換えた構築物では、標的の遺伝子の特異的ノックダウンが示される。値は全て、ｎ＝３での平均値±ＳＥＭである。（Ｍ）対応するＲＮＡｉ構築物と比較したＬｗａＣａｓ１３ａによる３つの異なる内因性転写物のノックダウン。（Ｎ）ＬｗａＣａｓ１３ａは核ｌｎｃＲＮＡ転写物ＭＡＬＡＴ１のノックダウン能を有する。（Ｏ）３つの異なる内因性遺伝子に対する３つのガイドの多重送達又はｃｒＲＮＡの各々をノンターゲティング配列で置き換えた構築物では、標的の遺伝子の特異的ノックダウンが示される。 図４９Ａ～図４９Ｏ ＬｗａＣａｓ１３ａは内因性哺乳類コード及び非コードＲＮＡ標的を標的とするように再プログラムすることができる。（Ａ）ＫＲＡＳ転写物にわたって均等にタイリングした９３個のガイドのアレイ化ノックダウンスクリーン。（Ｂ）ＰＰＩＢ転写物にわたって均等にタイリングした９３個のガイドのアレイ化ノックダウンスクリーン。（Ｃ）ＬｗａＣａｓ１３ａアレイ化スクリーニングの概略図。（Ｄ）Ｇｌｕｃ転写物にわたって均等にタイリングした１８６個のガイドのアレイ化ノックダウンスクリーン。（Ｅ）ウミホタル（Ｃｙｐｒｉｄｉｎｉａ）ルシフェラーゼ（Ｃｌｕｃ）転写物にわたって均等にタイリングした９３個のガイドのアレイ化ノックダウンスクリーン。（Ｆ）ＫＲＡＳ転写物にわたって均等にタイリングした９３個のガイドのアレイ化ノックダウンスクリーン。（Ｇ）ＰＰＩＢ転写物にわたって均等にタイリングした９３個のガイドのアレイ化ノックダウンスクリーン。（Ｈ）内因性アレイ化ノックダウンスクリーンからの上位３個のガイドのｓｈＲＮＡ比較による検証。値は全て、ｎ＝３での平均値±ＳＥＭである。＊＊＊ｐ＜０．００１；＊＊ｐ＜０．０１。比較には両側スチューデントｔ検定を使用した。（Ｉ）ＭＡＬＡＴ１転写物にわたって均等にタイリングした９３個のガイドのアレイ化ノックダウンスクリーン。（Ｊ）内因性アレイ化ＭＡＬＡＴ１ノックダウンスクリーンからの上位３個のガイドのｓｈＲＮＡ比較による検証。（Ｋ）単一プロモーターの発現下にある５つの異なる内因性遺伝子に対するＣＲＩＳＰＲアレイ内の５つのガイドの多重送達はロバストなノックダウンが可能である。（Ｌ）３つの異なる内因性遺伝子に対する３つのガイドの多重送達又はガイドの各々をノンターゲティング配列で置き換えた構築物では、標的の遺伝子の特異的ノックダウンが示される。値は全て、ｎ＝３での平均値±ＳＥＭである。（Ｍ）対応するＲＮＡｉ構築物と比較したＬｗａＣａｓ１３ａによる３つの異なる内因性転写物のノックダウン。（Ｎ）ＬｗａＣａｓ１３ａは核ｌｎｃＲＮＡ転写物ＭＡＬＡＴ１のノックダウン能を有する。（Ｏ）３つの異なる内因性遺伝子に対する３つのガイドの多重送達又はｃｒＲＮＡの各々をノンターゲティング配列で置き換えた構築物では、標的の遺伝子の特異的ノックダウンが示される。 図４９Ａ～図４９Ｏ ＬｗａＣａｓ１３ａは内因性哺乳類コード及び非コードＲＮＡ標的を標的とするように再プログラムすることができる。（Ａ）ＫＲＡＳ転写物にわたって均等にタイリングした９３個のガイドのアレイ化ノックダウンスクリーン。（Ｂ）ＰＰＩＢ転写物にわたって均等にタイリングした９３個のガイドのアレイ化ノックダウンスクリーン。（Ｃ）ＬｗａＣａｓ１３ａアレイ化スクリーニングの概略図。（Ｄ）Ｇｌｕｃ転写物にわたって均等にタイリングした１８６個のガイドのアレイ化ノックダウンスクリーン。（Ｅ）ウミホタル（Ｃｙｐｒｉｄｉｎｉａ）ルシフェラーゼ（Ｃｌｕｃ）転写物にわたって均等にタイリングした９３個のガイドのアレイ化ノックダウンスクリーン。（Ｆ）ＫＲＡＳ転写物にわたって均等にタイリングした９３個のガイドのアレイ化ノックダウンスクリーン。（Ｇ）ＰＰＩＢ転写物にわたって均等にタイリングした９３個のガイドのアレイ化ノックダウンスクリーン。（Ｈ）内因性アレイ化ノックダウンスクリーンからの上位３個のガイドのｓｈＲＮＡ比較による検証。値は全て、ｎ＝３での平均値±ＳＥＭである。＊＊＊ｐ＜０．００１；＊＊ｐ＜０．０１。比較には両側スチューデントｔ検定を使用した。（Ｉ）ＭＡＬＡＴ１転写物にわたって均等にタイリングした９３個のガイドのアレイ化ノックダウンスクリーン。（Ｊ）内因性アレイ化ＭＡＬＡＴ１ノックダウンスクリーンからの上位３個のガイドのｓｈＲＮＡ比較による検証。（Ｋ）単一プロモーターの発現下にある５つの異なる内因性遺伝子に対するＣＲＩＳＰＲアレイ内の５つのガイドの多重送達はロバストなノックダウンが可能である。（Ｌ）３つの異なる内因性遺伝子に対する３つのガイドの多重送達又はガイドの各々をノンターゲティング配列で置き換えた構築物では、標的の遺伝子の特異的ノックダウンが示される。値は全て、ｎ＝３での平均値±ＳＥＭである。（Ｍ）対応するＲＮＡｉ構築物と比較したＬｗａＣａｓ１３ａによる３つの異なる内因性転写物のノックダウン。（Ｎ）ＬｗａＣａｓ１３ａは核ｌｎｃＲＮＡ転写物ＭＡＬＡＴ１のノックダウン能を有する。（Ｏ）３つの異なる内因性遺伝子に対する３つのガイドの多重送達又はｃｒＲＮＡの各々をノンターゲティング配列で置き換えた構築物では、標的の遺伝子の特異的ノックダウンが示される。 図５０．２１個のＣ２ｃ２オルソログからのＨＥＰＮ配列モチーフ。 図５１．３３個のＣ２ｃ２オルソログからのＨＥＰＮ配列モチーフ。 図５２．エフェクタードメインの例示的連結位置。Ｃ末端又はＮ末端で異種機能ドメイン（示されるｍＣｈｅｒｒｙ及びｍｓｆＧＦＰ）に連結したＣ２ｃ２タンパク質は、ルシフェラーゼノックダウンによって示されるとおりの機能を保持している。 図５３Ａ～図５３Ｌ．（Ａ～Ｋ）Ｃ２ｃ２オルソログの配列アラインメント。（Ｌ）ＨＥＰＮドメインの配列アラインメント。 図５３Ａ～図５３Ｌ．（Ａ～Ｋ）Ｃ２ｃ２オルソログの配列アラインメント。（Ｌ）ＨＥＰＮドメインの配列アラインメント。 図５３Ａ～図５３Ｌ．（Ａ～Ｋ）Ｃ２ｃ２オルソログの配列アラインメント。（Ｌ）ＨＥＰＮドメインの配列アラインメント。 図５３Ａ～図５３Ｌ．（Ａ～Ｋ）Ｃ２ｃ２オルソログの配列アラインメント。（Ｌ）ＨＥＰＮドメインの配列アラインメント。 図５３Ａ～図５３Ｌ．（Ａ～Ｋ）Ｃ２ｃ２オルソログの配列アラインメント。（Ｌ）ＨＥＰＮドメインの配列アラインメント。 図５３Ａ～図５３Ｌ．（Ａ～Ｋ）Ｃ２ｃ２オルソログの配列アラインメント。（Ｌ）ＨＥＰＮドメインの配列アラインメント。 図５３Ａ～図５３Ｌ．（Ａ～Ｋ）Ｃ２ｃ２オルソログの配列アラインメント。（Ｌ）ＨＥＰＮドメインの配列アラインメント。 図５３Ａ～図５３Ｌ．（Ａ～Ｋ）Ｃ２ｃ２オルソログの配列アラインメント。（Ｌ）ＨＥＰＮドメインの配列アラインメント。 図５３Ａ～図５３Ｌ．（Ａ～Ｋ）Ｃ２ｃ２オルソログの配列アラインメント。（Ｌ）ＨＥＰＮドメインの配列アラインメント。 図５３Ａ～図５３Ｌ．（Ａ～Ｋ）Ｃ２ｃ２オルソログの配列アラインメント。（Ｌ）ＨＥＰＮドメインの配列アラインメント。 図５３Ａ～図５３Ｌ．（Ａ～Ｋ）Ｃ２ｃ２オルソログの配列アラインメント。（Ｌ）ＨＥＰＮドメインの配列アラインメント。 図５４．Ｃ２ｃ２オルソログのツリーアラインメント。 図５５Ａ～図５５Ｂ．Ｃ２ｃ２及びＣａｓ１３ｂオルソログのツリーアラインメント。 図５５Ａ～図５５Ｂ．Ｃ２ｃ２及びＣａｓ１３ｂオルソログのツリーアラインメント。 図５６Ａ～図５６Ｆ：哺乳類ノックダウンのためのＬｗａＣａｓ１３ａのエンジニアリング及び最適化。（Ａ）Ｇｌｕｃ ｃｒＲＮＡ １及び様々な量のトランスフェクトＬｗａＣａｓ１３ａプラスミドによるＧｌｕｃ転写物のノックダウン。（Ｂ）ＬｗａＣａｓ１３ａ及び様々な量のトランスフェクトＧｌｕｃ ｃｒＲＮＡ １及び２プラスミドによるＧｌｕｃ転写物のノックダウン。（Ｃ）Ｕ６プロモーター又はｔＲＮＡＶａｌプロモーターのいずれかから発現するｃｒＲＮＡを使用したＧｌｕｃ転写物のノックダウン。（Ｄ）Ｕ６プロモーター又はｔＲＮＡＶａｌプロモーターのいずれかから発現するｃｒＲＮＡを使用したＫＲＡＳ転写物のノックダウン。（Ｅ）Ｕ６プロモーター又はｔＲＮＡＶａｌプロモーターのいずれかから発現するガイドを使用したＫＲＡＳ転写物のノックダウン。（Ｆ）ＸＩＳＴ転写物にわたって均等にタイリングした９３個のガイドのアレイ化ノックダウンスクリーン。 図５６Ａ～図５６Ｆ：哺乳類ノックダウンのためのＬｗａＣａｓ１３ａのエンジニアリング及び最適化。（Ａ）Ｇｌｕｃ ｃｒＲＮＡ １及び様々な量のトランスフェクトＬｗａＣａｓ１３ａプラスミドによるＧｌｕｃ転写物のノックダウン。（Ｂ）ＬｗａＣａｓ１３ａ及び様々な量のトランスフェクトＧｌｕｃ ｃｒＲＮＡ １及び２プラスミドによるＧｌｕｃ転写物のノックダウン。（Ｃ）Ｕ６プロモーター又はｔＲＮＡＶａｌプロモーターのいずれかから発現するｃｒＲＮＡを使用したＧｌｕｃ転写物のノックダウン。（Ｄ）Ｕ６プロモーター又はｔＲＮＡＶａｌプロモーターのいずれかから発現するｃｒＲＮＡを使用したＫＲＡＳ転写物のノックダウン。（Ｅ）Ｕ６プロモーター又はｔＲＮＡＶａｌプロモーターのいずれかから発現するガイドを使用したＫＲＡＳ転写物のノックダウン。（Ｆ）ＸＩＳＴ転写物にわたって均等にタイリングした９３個のガイドのアレイ化ノックダウンスクリーン。 図５７Ａ～図５７Ｅ：ＬｗａＣａｓ１３ａ ＰＦＳ優先性の評価及びＬｓｈＣａｓ１３ａとの比較。（Ａ）本研究で評価した１５個のＣａｓ１３ａオルソログの配列比較ツリー。（Ｂ）様々な枯渇閾値について枯渇閾値を上回るＬｓｈＣａｓ１３ａ及びＬｗａＣａｓ１３ａ ＰＦＳ配列の数。（Ｃ）ターゲティング試料におけるＬｓｈＣａｓ１３ａ及びＬｗａＣａｓ１３ａのＰＦＳエンリッチメントの分布、ノンターゲティング試料に対して正規化した。（Ｄ）様々なエンリッチメントカットオフ閾値でのＬｓｈＣａｓ１３ａ切断後の残りのＰＦＳ配列の配列ロゴ及びカウント。（Ｅ）様々なエンリッチメントカットオフ閾値でのＬｗａＣａｓ１３ａ切断後の残りのＰＦＳ配列の配列ロゴ及びカウント。 図５７Ａ～図５７Ｅ：ＬｗａＣａｓ１３ａ ＰＦＳ優先性の評価及びＬｓｈＣａｓ１３ａとの比較。（Ａ）本研究で評価した１５個のＣａｓ１３ａオルソログの配列比較ツリー。（Ｂ）様々な枯渇閾値について枯渇閾値を上回るＬｓｈＣａｓ１３ａ及びＬｗａＣａｓ１３ａ ＰＦＳ配列の数。（Ｃ）ターゲティング試料におけるＬｓｈＣａｓ１３ａ及びＬｗａＣａｓ１３ａのＰＦＳエンリッチメントの分布、ノンターゲティング試料に対して正規化した。（Ｄ）様々なエンリッチメントカットオフ閾値でのＬｓｈＣａｓ１３ａ切断後の残りのＰＦＳ配列の配列ロゴ及びカウント。（Ｅ）様々なエンリッチメントカットオフ閾値でのＬｗａＣａｓ１３ａ切断後の残りのＰＦＳ配列の配列ロゴ及びカウント。 図５８Ａ～図５８Ｄ：ＬｗａＣａｓ１３ａターゲティング効率は転写物に沿った接近可能性の影響を受ける。（Ａ）第１列：上位ノックダウンガイドを標的転写物に沿った位置毎にプロットする。Ｇｌｕｃについては上位２０％のガイドを選択し、Ｃｌｕｃ、ＫＲＡＳ、及びＰＰＩＢについては上位３０％のガイドを選択する。第２列：ランダムな帰無分布（赤色）と比較した各転写物の隣接する上位ガイド間のペアワイズ距離（青色）のヒストグラム。挿入図は、これらのヒストグラムの累積度数曲線を示す。青色の曲線（実際の計測距離）から左の赤色の曲線（距離の帰無分布）へのシフトは、ガイドが偶然から予想されるよりも互いに近いことを示す。（Ｂ）Ｇｌｕｃ、Ｃｌｕｃ、ＰＰＩＢ、及びＫＲＡＳノックダウンは、転写物の予測されるフォールディングによって計測したときの標的の接近可能性と部分的に相関する。（Ｃ）標的の接近可能性（ある領域が塩基対合する確率）とＬｗａＣａｓ１３ａによるノックダウン後の標的発現との間の相関を示すカーネル密度推定プロット。（Ｄ）第１列：種々のウィンドウサイズ（Ｗ）で種々のｋ－ｍｅｒ長さについて計測した、標的発現と標的の接近可能性（ある領域が塩基対合する確率）との間の相関。第２列：種々のウィンドウサイズ（Ｗ）で種々のｋ－ｍｅｒ長さについて計測した標的発現と標的の接近可能性（ある領域が塩基対合する確率）との間の相関のｐ値。カラースケールは、ｐ値＞０．０５に赤色の陰影が付され、ｐ値＜０．０５に青色の陰影が付されるように設計される。 図５８Ａ～図５８Ｄ：ＬｗａＣａｓ１３ａターゲティング効率は転写物に沿った接近可能性の影響を受ける。（Ａ）第１列：上位ノックダウンガイドを標的転写物に沿った位置毎にプロットする。Ｇｌｕｃについては上位２０％のガイドを選択し、Ｃｌｕｃ、ＫＲＡＳ、及びＰＰＩＢについては上位３０％のガイドを選択する。第２列：ランダムな帰無分布（赤色）と比較した各転写物の隣接する上位ガイド間のペアワイズ距離（青色）のヒストグラム。挿入図は、これらのヒストグラムの累積度数曲線を示す。青色の曲線（実際の計測距離）から左の赤色の曲線（距離の帰無分布）へのシフトは、ガイドが偶然から予想されるよりも互いに近いことを示す。（Ｂ）Ｇｌｕｃ、Ｃｌｕｃ、ＰＰＩＢ、及びＫＲＡＳノックダウンは、転写物の予測されるフォールディングによって計測したときの標的の接近可能性と部分的に相関する。（Ｃ）標的の接近可能性（ある領域が塩基対合する確率）とＬｗａＣａｓ１３ａによるノックダウン後の標的発現との間の相関を示すカーネル密度推定プロット。（Ｄ）第１列：種々のウィンドウサイズ（Ｗ）で種々のｋ－ｍｅｒ長さについて計測した、標的発現と標的の接近可能性（ある領域が塩基対合する確率）との間の相関。第２列：種々のウィンドウサイズ（Ｗ）で種々のｋ－ｍｅｒ長さについて計測した標的発現と標的の接近可能性（ある領域が塩基対合する確率）との間の相関のｐ値。カラースケールは、ｐ値＞０．０５に赤色の陰影が付され、ｐ値＜０．０５に青色の陰影が付されるように設計される。 図５８Ａ～図５８Ｄ：ＬｗａＣａｓ１３ａターゲティング効率は転写物に沿った接近可能性の影響を受ける。（Ａ）第１列：上位ノックダウンガイドを標的転写物に沿った位置毎にプロットする。Ｇｌｕｃについては上位２０％のガイドを選択し、Ｃｌｕｃ、ＫＲＡＳ、及びＰＰＩＢについては上位３０％のガイドを選択する。第２列：ランダムな帰無分布（赤色）と比較した各転写物の隣接する上位ガイド間のペアワイズ距離（青色）のヒストグラム。挿入図は、これらのヒストグラムの累積度数曲線を示す。青色の曲線（実際の計測距離）から左の赤色の曲線（距離の帰無分布）へのシフトは、ガイドが偶然から予想されるよりも互いに近いことを示す。（Ｂ）Ｇｌｕｃ、Ｃｌｕｃ、ＰＰＩＢ、及びＫＲＡＳノックダウンは、転写物の予測されるフォールディングによって計測したときの標的の接近可能性と部分的に相関する。（Ｃ）標的の接近可能性（ある領域が塩基対合する確率）とＬｗａＣａｓ１３ａによるノックダウン後の標的発現との間の相関を示すカーネル密度推定プロット。（Ｄ）第１列：種々のウィンドウサイズ（Ｗ）で種々のｋ－ｍｅｒ長さについて計測した、標的発現と標的の接近可能性（ある領域が塩基対合する確率）との間の相関。第２列：種々のウィンドウサイズ（Ｗ）で種々のｋ－ｍｅｒ長さについて計測した標的発現と標的の接近可能性（ある領域が塩基対合する確率）との間の相関のｐ値。カラースケールは、ｐ値＞０．０５に赤色の陰影が付され、ｐ値＜０．０５に青色の陰影が付されるように設計される。 図５９Ａ～図５９Ｋ：様々なスペーサー長さのｃｒＲＮＡ：標的二重鎖におけるミスマッチに対するＬｗａＣａｓ１３ａ感受性の詳細な評価。（Ａ）スペーサー配列の様々な位置にシングルミスマッチを含むｃｒＲＮＡで評価したＫＲＡＳのノックダウン。（Ｂ）スペーサー配列の様々な位置にシングルミスマッチを含むｃｒＲＮＡで評価したＰＰＩＢのノックダウン。（Ｃ）スペーサー配列の様々な位置に非連続ダブルミスマッチを含むガイドで評価したＧｌｕｃのノックダウン。野生型配列を一番上に示し、ミスマッチのアイデンティティを下に示す。（Ｄ）様々なスペーサー長さについてのｓｓＲＮＡ １及び２に対するコラテラル切断活性。（ｎ＝４テクニカルレプリケート；バーは平均値±ｓ．ｅ．ｍ．を表す）。（Ｅ）（Ｄ）で試験したｃｒＲＮＡの特異性比。特異性比は、オフターゲットＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ ２）コラテラル切断に対するオンターゲットＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ １）コラテラル切断の比として計算する。（ｎ＝４テクニカルレプリケート；バーは平均値±ｓ．ｅ．ｍ．を表す）。（Ｆ）スペーサーに沿ってタイリングした合成ミスマッチを含む２８ｎｔスペーサーｃｒＲＮＡについてのｓｓＲＮＡ １及び２に対するコラテラル切断活性。（ｎ＝４テクニカルレプリケート；バーは平均値±ｓ．ｅ．ｍ．を表す）。（Ｇ）（Ｆ）で試験したｃｒＲＮＡの特異性比。特異性比は、オフターゲットＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ ２）コラテラル切断に対するオンターゲットＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ １）コラテラル切断の比として計算する。（ｎ＝４テクニカルレプリケート；バーは平均値±ｓ．ｅ．ｍ．を表す）。（Ｈ）スペーサーに沿ってタイリングした合成ミスマッチを含む２３ｎｔスペーサーｃｒＲＮＡについてのｓｓＲＮＡ １及び２に対するコラテラル切断活性。（ｎ＝４テクニカルレプリケート；バーは平均値±ｓ．ｅ．ｍ．を表す）。（Ｉ）（Ｈ）で試験したｃｒＲＮＡの特異性比。特異性比は、オフターゲットＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ ２）コラテラル切断に対するオンターゲットＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ １）コラテラル切断の比として計算する。（ｎ＝４テクニカルレプリケート；バーは平均値±ｓ．ｅ．ｍ．を表す）。（Ｊ）スペーサーに沿ってタイリングした合成ミスマッチを含む２０ｎｔスペーサーｃｒＲＮＡについてのｓｓＲＮＡ １及び２に対するコラテラル切断活性。（ｎ＝４テクニカルレプリケート；バーは平均値±ｓ．ｅ．ｍ．を表す）。（Ｋ）（Ｊ）で試験したｃｒＲＮＡの特異性比。特異性比は、オフターゲットＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ ２）コラテラル切断に対するオンターゲットＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ １）コラテラル切断の比として計算する。（ｎ＝４テクニカルレプリケート；バーは平均値±ｓ．ｅ．ｍ．を表す）。 図５９Ａ～図５９Ｋ：様々なスペーサー長さのｃｒＲＮＡ：標的二重鎖におけるミスマッチに対するＬｗａＣａｓ１３ａ感受性の詳細な評価。（Ａ）スペーサー配列の様々な位置にシングルミスマッチを含むｃｒＲＮＡで評価したＫＲＡＳのノックダウン。（Ｂ）スペーサー配列の様々な位置にシングルミスマッチを含むｃｒＲＮＡで評価したＰＰＩＢのノックダウン。（Ｃ）スペーサー配列の様々な位置に非連続ダブルミスマッチを含むガイドで評価したＧｌｕｃのノックダウン。野生型配列を一番上に示し、ミスマッチのアイデンティティを下に示す。（Ｄ）様々なスペーサー長さについてのｓｓＲＮＡ １及び２に対するコラテラル切断活性。（ｎ＝４テクニカルレプリケート；バーは平均値±ｓ．ｅ．ｍ．を表す）。（Ｅ）（Ｄ）で試験したｃｒＲＮＡの特異性比。特異性比は、オフターゲットＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ ２）コラテラル切断に対するオンターゲットＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ １）コラテラル切断の比として計算する。（ｎ＝４テクニカルレプリケート；バーは平均値±ｓ．ｅ．ｍ．を表す）。（Ｆ）スペーサーに沿ってタイリングした合成ミスマッチを含む２８ｎｔスペーサーｃｒＲＮＡについてのｓｓＲＮＡ １及び２に対するコラテラル切断活性。（ｎ＝４テクニカルレプリケート；バーは平均値±ｓ．ｅ．ｍ．を表す）。（Ｇ）（Ｆ）で試験したｃｒＲＮＡの特異性比。特異性比は、オフターゲットＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ ２）コラテラル切断に対するオンターゲットＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ １）コラテラル切断の比として計算する。（ｎ＝４テクニカルレプリケート；バーは平均値±ｓ．ｅ．ｍ．を表す）。（Ｈ）スペーサーに沿ってタイリングした合成ミスマッチを含む２３ｎｔスペーサーｃｒＲＮＡについてのｓｓＲＮＡ １及び２に対するコラテラル切断活性。（ｎ＝４テクニカルレプリケート；バーは平均値±ｓ．ｅ．ｍ．を表す）。（Ｉ）（Ｈ）で試験したｃｒＲＮＡの特異性比。特異性比は、オフターゲットＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ ２）コラテラル切断に対するオンターゲットＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ １）コラテラル切断の比として計算する。（ｎ＝４テクニカルレプリケート；バーは平均値±ｓ．ｅ．ｍ．を表す）。（Ｊ）スペーサーに沿ってタイリングした合成ミスマッチを含む２０ｎｔスペーサーｃｒＲＮＡについてのｓｓＲＮＡ １及び２に対するコラテラル切断活性。（ｎ＝４テクニカルレプリケート；バーは平均値±ｓ．ｅ．ｍ．を表す）。（Ｋ）（Ｊ）で試験したｃｒＲＮＡの特異性比。特異性比は、オフターゲットＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ ２）コラテラル切断に対するオンターゲットＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ １）コラテラル切断の比として計算する。（ｎ＝４テクニカルレプリケート；バーは平均値±ｓ．ｅ．ｍ．を表す）。 図５９Ａ～図５９Ｋ：様々なスペーサー長さのｃｒＲＮＡ：標的二重鎖におけるミスマッチに対するＬｗａＣａｓ１３ａ感受性の詳細な評価。（Ａ）スペーサー配列の様々な位置にシングルミスマッチを含むｃｒＲＮＡで評価したＫＲＡＳのノックダウン。（Ｂ）スペーサー配列の様々な位置にシングルミスマッチを含むｃｒＲＮＡで評価したＰＰＩＢのノックダウン。（Ｃ）スペーサー配列の様々な位置に非連続ダブルミスマッチを含むガイドで評価したＧｌｕｃのノックダウン。野生型配列を一番上に示し、ミスマッチのアイデンティティを下に示す。（Ｄ）様々なスペーサー長さについてのｓｓＲＮＡ １及び２に対するコラテラル切断活性。（ｎ＝４テクニカルレプリケート；バーは平均値±ｓ．ｅ．ｍ．を表す）。（Ｅ）（Ｄ）で試験したｃｒＲＮＡの特異性比。特異性比は、オフターゲットＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ ２）コラテラル切断に対するオンターゲットＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ １）コラテラル切断の比として計算する。（ｎ＝４テクニカルレプリケート；バーは平均値±ｓ．ｅ．ｍ．を表す）。（Ｆ）スペーサーに沿ってタイリングした合成ミスマッチを含む２８ｎｔスペーサーｃｒＲＮＡについてのｓｓＲＮＡ １及び２に対するコラテラル切断活性。（ｎ＝４テクニカルレプリケート；バーは平均値±ｓ．ｅ．ｍ．を表す）。（Ｇ）（Ｆ）で試験したｃｒＲＮＡの特異性比。特異性比は、オフターゲットＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ ２）コラテラル切断に対するオンターゲットＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ １）コラテラル切断の比として計算する。（ｎ＝４テクニカルレプリケート；バーは平均値±ｓ．ｅ．ｍ．を表す）。（Ｈ）スペーサーに沿ってタイリングした合成ミスマッチを含む２３ｎｔスペーサーｃｒＲＮＡについてのｓｓＲＮＡ １及び２に対するコラテラル切断活性。（ｎ＝４テクニカルレプリケート；バーは平均値±ｓ．ｅ．ｍ．を表す）。（Ｉ）（Ｈ）で試験したｃｒＲＮＡの特異性比。特異性比は、オフターゲットＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ ２）コラテラル切断に対するオンターゲットＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ １）コラテラル切断の比として計算する。（ｎ＝４テクニカルレプリケート；バーは平均値±ｓ．ｅ．ｍ．を表す）。（Ｊ）スペーサーに沿ってタイリングした合成ミスマッチを含む２０ｎｔスペーサーｃｒＲＮＡについてのｓｓＲＮＡ １及び２に対するコラテラル切断活性。（ｎ＝４テクニカルレプリケート；バーは平均値±ｓ．ｅ．ｍ．を表す）。（Ｋ）（Ｊ）で試験したｃｒＲＮＡの特異性比。特異性比は、オフターゲットＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ ２）コラテラル切断に対するオンターゲットＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ １）コラテラル切断の比として計算する。（ｎ＝４テクニカルレプリケート；バーは平均値±ｓ．ｅ．ｍ．を表す）。 図５９Ａ～図５９Ｋ：様々なスペーサー長さのｃｒＲＮＡ：標的二重鎖におけるミスマッチに対するＬｗａＣａｓ１３ａ感受性の詳細な評価。（Ａ）スペーサー配列の様々な位置にシングルミスマッチを含むｃｒＲＮＡで評価したＫＲＡＳのノックダウン。（Ｂ）スペーサー配列の様々な位置にシングルミスマッチを含むｃｒＲＮＡで評価したＰＰＩＢのノックダウン。（Ｃ）スペーサー配列の様々な位置に非連続ダブルミスマッチを含むガイドで評価したＧｌｕｃのノックダウン。野生型配列を一番上に示し、ミスマッチのアイデンティティを下に示す。（Ｄ）様々なスペーサー長さについてのｓｓＲＮＡ １及び２に対するコラテラル切断活性。（ｎ＝４テクニカルレプリケート；バーは平均値±ｓ．ｅ．ｍ．を表す）。（Ｅ）（Ｄ）で試験したｃｒＲＮＡの特異性比。特異性比は、オフターゲットＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ ２）コラテラル切断に対するオンターゲットＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ １）コラテラル切断の比として計算する。（ｎ＝４テクニカルレプリケート；バーは平均値±ｓ．ｅ．ｍ．を表す）。（Ｆ）スペーサーに沿ってタイリングした合成ミスマッチを含む２８ｎｔスペーサーｃｒＲＮＡについてのｓｓＲＮＡ １及び２に対するコラテラル切断活性。（ｎ＝４テクニカルレプリケート；バーは平均値±ｓ．ｅ．ｍ．を表す）。（Ｇ）（Ｆ）で試験したｃｒＲＮＡの特異性比。特異性比は、オフターゲットＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ ２）コラテラル切断に対するオンターゲットＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ １）コラテラル切断の比として計算する。（ｎ＝４テクニカルレプリケート；バーは平均値±ｓ．ｅ．ｍ．を表す）。（Ｈ）スペーサーに沿ってタイリングした合成ミスマッチを含む２３ｎｔスペーサーｃｒＲＮＡについてのｓｓＲＮＡ １及び２に対するコラテラル切断活性。（ｎ＝４テクニカルレプリケート；バーは平均値±ｓ．ｅ．ｍ．を表す）。（Ｉ）（Ｈ）で試験したｃｒＲＮＡの特異性比。特異性比は、オフターゲットＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ ２）コラテラル切断に対するオンターゲットＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ １）コラテラル切断の比として計算する。（ｎ＝４テクニカルレプリケート；バーは平均値±ｓ．ｅ．ｍ．を表す）。（Ｊ）スペーサーに沿ってタイリングした合成ミスマッチを含む２０ｎｔスペーサーｃｒＲＮＡについてのｓｓＲＮＡ １及び２に対するコラテラル切断活性。（ｎ＝４テクニカルレプリケート；バーは平均値±ｓ．ｅ．ｍ．を表す）。（Ｋ）（Ｊ）で試験したｃｒＲＮＡの特異性比。特異性比は、オフターゲットＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ ２）コラテラル切断に対するオンターゲットＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ １）コラテラル切断の比として計算する。（ｎ＝４テクニカルレプリケート；バーは平均値±ｓ．ｅ．ｍ．を表す）。 図６０Ａ～図６０Ｆ：ＬｗａＣａｓ１３ａは内因性標的に対してｓｈＲＮＡノックダウンよりも特異性が高く、生物学的ノイズに相当する変動がほとんどない。（Ａ）左：ＫＲＡＳターゲティングｓｈＲＮＡ（ｙ軸）と比べたノンターゲティングｓｈＲＮＡトランスフェクト対照（ｘ軸）のＲＮＡ－ｓｅｑライブラリで検出された全ての遺伝子のｌｏｇ２（転写物百万分率（ＴＰＭ））値による発現レベル。３回のバイオロジカルレプリケートの平均値が示される。ＫＲＡＳ転写物データ点には赤色を付ける。右：ＫＲＡＳターゲティングＬｗａＣａｓ１３ａ－ｃｒＲＮＡ（ｙ軸）と比べたノンターゲティングＬｗａＣａｓ１３ａ－ｃｒＲＮＡトランスフェクト対照（ｘ軸）のＲＮＡ－ｓｅｑライブラリで検出された全ての遺伝子のｌｏｇ２（転写物百万分率（ＴＰＭ））値による発現レベル。３回のバイオロジカルレプリケートの平均値が示される。ＫＲＡＳ転写物データ点には赤色を付ける。（Ｂ）左：ＰＰＩＢターゲティングｓｈＲＮＡ（ｙ軸）と比べたノンターゲティングｓｈＲＮＡトランスフェクト対照（ｘ軸）のＲＮＡ－ｓｅｑライブラリで検出された全ての遺伝子のｌｏｇ２（転写物百万分率（ＴＰＭ））値による発現レベル。３回のバイオロジカルレプリケートの平均値が示される。ＰＰＩＢ転写物データ点には赤色を付ける。右：ＰＰＩＢターゲティングＬｗａＣａｓ１３ａ－ｃｒＲＮＡ（ｙ軸）と比べたノンターゲティングＬｗａＣａｓ１３ａ－ｃｒＲＮＡトランスフェクト対照（ｘ軸）のＲＮＡ－ｓｅｑライブラリで検出された全ての遺伝子のｌｏｇ２（転写物百万分率（ＴＰＭ））値による発現レベル。３回のバイオロジカルレプリケートの平均値が示される。ＰＰＩＢ転写物データ点には赤色を付ける。（Ｃ）ノンターゲティングｓｈＲＮＡ条件（第１列）及びＧｌｕｃターゲティングｓｈＲＮＡ条件（第２列）の個別のレプリケートの比較。（Ｄ）ノンターゲティングｃｒＲＮＡ条件（第１列）及びＧｌｕｃ－ターゲティングｃｒＲＮＡ条件（第２列）の個別のレプリケートの比較。（Ｅ）ノンターゲティングｓｈＲＮＡ条件とＧｌｕｃターゲティングｓｈＲＮＡ条件の個別のレプリケートのペアワイズ比較。（Ｆ）ノンターゲティングｃｒＲＮＡ条件とＧｌｕｃターゲティングｃｒＲＮＡ条件の個別のレプリケートのペアワイズ比較。 図６０Ａ～図６０Ｆ：ＬｗａＣａｓ１３ａは内因性標的に対してｓｈＲＮＡノックダウンよりも特異性が高く、生物学的ノイズに相当する変動がほとんどない。（Ａ）左：ＫＲＡＳターゲティングｓｈＲＮＡ（ｙ軸）と比べたノンターゲティングｓｈＲＮＡトランスフェクト対照（ｘ軸）のＲＮＡ－ｓｅｑライブラリで検出された全ての遺伝子のｌｏｇ２（転写物百万分率（ＴＰＭ））値による発現レベル。３回のバイオロジカルレプリケートの平均値が示される。ＫＲＡＳ転写物データ点には赤色を付ける。右：ＫＲＡＳターゲティングＬｗａＣａｓ１３ａ－ｃｒＲＮＡ（ｙ軸）と比べたノンターゲティングＬｗａＣａｓ１３ａ－ｃｒＲＮＡトランスフェクト対照（ｘ軸）のＲＮＡ－ｓｅｑライブラリで検出された全ての遺伝子のｌｏｇ２（転写物百万分率（ＴＰＭ））値による発現レベル。３回のバイオロジカルレプリケートの平均値が示される。ＫＲＡＳ転写物データ点には赤色を付ける。（Ｂ）左：ＰＰＩＢターゲティングｓｈＲＮＡ（ｙ軸）と比べたノンターゲティングｓｈＲＮＡトランスフェクト対照（ｘ軸）のＲＮＡ－ｓｅｑライブラリで検出された全ての遺伝子のｌｏｇ２（転写物百万分率（ＴＰＭ））値による発現レベル。３回のバイオロジカルレプリケートの平均値が示される。ＰＰＩＢ転写物データ点には赤色を付ける。右：ＰＰＩＢターゲティングＬｗａＣａｓ１３ａ－ｃｒＲＮＡ（ｙ軸）と比べたノンターゲティングＬｗａＣａｓ１３ａ－ｃｒＲＮＡトランスフェクト対照（ｘ軸）のＲＮＡ－ｓｅｑライブラリで検出された全ての遺伝子のｌｏｇ２（転写物百万分率（ＴＰＭ））値による発現レベル。３回のバイオロジカルレプリケートの平均値が示される。ＰＰＩＢ転写物データ点には赤色を付ける。（Ｃ）ノンターゲティングｓｈＲＮＡ条件（第１列）及びＧｌｕｃターゲティングｓｈＲＮＡ条件（第２列）の個別のレプリケートの比較。（Ｄ）ノンターゲティングｃｒＲＮＡ条件（第１列）及びＧｌｕｃ－ターゲティングｃｒＲＮＡ条件（第２列）の個別のレプリケートの比較。（Ｅ）ノンターゲティングｓｈＲＮＡ条件とＧｌｕｃターゲティングｓｈＲＮＡ条件の個別のレプリケートのペアワイズ比較。（Ｆ）ノンターゲティングｃｒＲＮＡ条件とＧｌｕｃターゲティングｃｒＲＮＡ条件の個別のレプリケートのペアワイズ比較。 図６０Ａ～図６０Ｆ：ＬｗａＣａｓ１３ａは内因性標的に対してｓｈＲＮＡノックダウンよりも特異性が高く、生物学的ノイズに相当する変動がほとんどない。（Ａ）左：ＫＲＡＳターゲティングｓｈＲＮＡ（ｙ軸）と比べたノンターゲティングｓｈＲＮＡトランスフェクト対照（ｘ軸）のＲＮＡ－ｓｅｑライブラリで検出された全ての遺伝子のｌｏｇ２（転写物百万分率（ＴＰＭ））値による発現レベル。３回のバイオロジカルレプリケートの平均値が示される。ＫＲＡＳ転写物データ点には赤色を付ける。右：ＫＲＡＳターゲティングＬｗａＣａｓ１３ａ－ｃｒＲＮＡ（ｙ軸）と比べたノンターゲティングＬｗａＣａｓ１３ａ－ｃｒＲＮＡトランスフェクト対照（ｘ軸）のＲＮＡ－ｓｅｑライブラリで検出された全ての遺伝子のｌｏｇ２（転写物百万分率（ＴＰＭ））値による発現レベル。３回のバイオロジカルレプリケートの平均値が示される。ＫＲＡＳ転写物データ点には赤色を付ける。（Ｂ）左：ＰＰＩＢターゲティングｓｈＲＮＡ（ｙ軸）と比べたノンターゲティングｓｈＲＮＡトランスフェクト対照（ｘ軸）のＲＮＡ－ｓｅｑライブラリで検出された全ての遺伝子のｌｏｇ２（転写物百万分率（ＴＰＭ））値による発現レベル。３回のバイオロジカルレプリケートの平均値が示される。ＰＰＩＢ転写物データ点には赤色を付ける。右：ＰＰＩＢターゲティングＬｗａＣａｓ１３ａ－ｃｒＲＮＡ（ｙ軸）と比べたノンターゲティングＬｗａＣａｓ１３ａ－ｃｒＲＮＡトランスフェクト対照（ｘ軸）のＲＮＡ－ｓｅｑライブラリで検出された全ての遺伝子のｌｏｇ２（転写物百万分率（ＴＰＭ））値による発現レベル。３回のバイオロジカルレプリケートの平均値が示される。ＰＰＩＢ転写物データ点には赤色を付ける。（Ｃ）ノンターゲティングｓｈＲＮＡ条件（第１列）及びＧｌｕｃターゲティングｓｈＲＮＡ条件（第２列）の個別のレプリケートの比較。（Ｄ）ノンターゲティングｃｒＲＮＡ条件（第１列）及びＧｌｕｃ－ターゲティングｃｒＲＮＡ条件（第２列）の個別のレプリケートの比較。（Ｅ）ノンターゲティングｓｈＲＮＡ条件とＧｌｕｃターゲティングｓｈＲＮＡ条件の個別のレプリケートのペアワイズ比較。（Ｆ）ノンターゲティングｃｒＲＮＡ条件とＧｌｕｃターゲティングｃｒＲＮＡ条件の個別のレプリケートのペアワイズ比較。 図６０Ａ～図６０Ｆ：ＬｗａＣａｓ１３ａは内因性標的に対してｓｈＲＮＡノックダウンよりも特異性が高く、生物学的ノイズに相当する変動がほとんどない。（Ａ）左：ＫＲＡＳターゲティングｓｈＲＮＡ（ｙ軸）と比べたノンターゲティングｓｈＲＮＡトランスフェクト対照（ｘ軸）のＲＮＡ－ｓｅｑライブラリで検出された全ての遺伝子のｌｏｇ２（転写物百万分率（ＴＰＭ））値による発現レベル。３回のバイオロジカルレプリケートの平均値が示される。ＫＲＡＳ転写物データ点には赤色を付ける。右：ＫＲＡＳターゲティングＬｗａＣａｓ１３ａ－ｃｒＲＮＡ（ｙ軸）と比べたノンターゲティングＬｗａＣａｓ１３ａ－ｃｒＲＮＡトランスフェクト対照（ｘ軸）のＲＮＡ－ｓｅｑライブラリで検出された全ての遺伝子のｌｏｇ２（転写物百万分率（ＴＰＭ））値による発現レベル。３回のバイオロジカルレプリケートの平均値が示される。ＫＲＡＳ転写物データ点には赤色を付ける。（Ｂ）左：ＰＰＩＢターゲティングｓｈＲＮＡ（ｙ軸）と比べたノンターゲティングｓｈＲＮＡトランスフェクト対照（ｘ軸）のＲＮＡ－ｓｅｑライブラリで検出された全ての遺伝子のｌｏｇ２（転写物百万分率（ＴＰＭ））値による発現レベル。３回のバイオロジカルレプリケートの平均値が示される。ＰＰＩＢ転写物データ点には赤色を付ける。右：ＰＰＩＢターゲティングＬｗａＣａｓ１３ａ－ｃｒＲＮＡ（ｙ軸）と比べたノンターゲティングＬｗａＣａｓ１３ａ－ｃｒＲＮＡトランスフェクト対照（ｘ軸）のＲＮＡ－ｓｅｑライブラリで検出された全ての遺伝子のｌｏｇ２（転写物百万分率（ＴＰＭ））値による発現レベル。３回のバイオロジカルレプリケートの平均値が示される。ＰＰＩＢ転写物データ点には赤色を付ける。（Ｃ）ノンターゲティングｓｈＲＮＡ条件（第１列）及びＧｌｕｃターゲティングｓｈＲＮＡ条件（第２列）の個別のレプリケートの比較。（Ｄ）ノンターゲティングｃｒＲＮＡ条件（第１列）及びＧｌｕｃ－ターゲティングｃｒＲＮＡ条件（第２列）の個別のレプリケートの比較。（Ｅ）ノンターゲティングｓｈＲＮＡ条件とＧｌｕｃターゲティングｓｈＲＮＡ条件の個別のレプリケートのペアワイズ比較。（Ｆ）ノンターゲティングｃｒＲＮＡ条件とＧｌｕｃターゲティングｃｒＲＮＡ条件の個別のレプリケートのペアワイズ比較。 図６１Ａ～図６１Ｃ：全試料にわたるＬｗａＣａｓ１３ａ及びＲＮＡｉノックダウン変動性（標準偏差）の詳細な分析。（Ａ）ルシフェラーゼレポーター又は内因性遺伝子のいずれかを標的とするｓｈＲＮＡ又はｃｒＲＮＡのターゲティングレプリケートとノンターゲティングレプリケートとの間のＲＮＡ－ｓｅｑライブラリで検出された全ての遺伝子のｌｏｇ２（転写物百万分率（ＴＰＭ＋１））値についての相関（ケンドールのタウ）のヒートマップ。（Ｂ）全てのレプリケート及び摂動間のＲＮＡ－ｓｅｑライブラリで検出された全ての遺伝子のｌｏｇ２（転写物百万分率（ＴＰＭ＋１））値についての相関（ケンドールのタウ）のヒートマップ。（Ｃ）ｓｈＲＮＡ又はｃｒＲＮＡのいずれかについて標的化された各遺伝子のターゲティング及びノンターゲティングレプリケートの間でのＲＮＡ－ｓｅｑライブラリで検出された全ての遺伝子のｌｏｇ２（転写物百万分率（ＴＰＭ＋１））値の標準偏差分布。 図６１Ａ～図６１Ｃ：全試料にわたるＬｗａＣａｓ１３ａ及びＲＮＡｉノックダウン変動性（標準偏差）の詳細な分析。（Ａ）ルシフェラーゼレポーター又は内因性遺伝子のいずれかを標的とするｓｈＲＮＡ又はｃｒＲＮＡのターゲティングレプリケートとノンターゲティングレプリケートとの間のＲＮＡ－ｓｅｑライブラリで検出された全ての遺伝子のｌｏｇ２（転写物百万分率（ＴＰＭ＋１））値についての相関（ケンドールのタウ）のヒートマップ。（Ｂ）全てのレプリケート及び摂動間のＲＮＡ－ｓｅｑライブラリで検出された全ての遺伝子のｌｏｇ２（転写物百万分率（ＴＰＭ＋１））値についての相関（ケンドールのタウ）のヒートマップ。（Ｃ）ｓｈＲＮＡ又はｃｒＲＮＡのいずれかについて標的化された各遺伝子のターゲティング及びノンターゲティングレプリケートの間でのＲＮＡ－ｓｅｑライブラリで検出された全ての遺伝子のｌｏｇ２（転写物百万分率（ＴＰＭ＋１））値の標準偏差分布。 図６２Ａ～図６２Ｊ：ＬｗａＣａｓ１３ａノックダウンは標的転写物に特異的であり、計測されるオフターゲット転写物に対して活性を有しない。（Ａ）Ｇｌｕｃにタイリングする最初の９６スペーサーの絶対Ｇｌｕｃシグナルのヒートマップ。（Ｂ）Ｇｌｕｃにタイリングする最初の９６スペーサーの絶対Ｃｌｕｃシグナルのヒートマップ。（Ｃ）Ｇｌｕｃタイリングガイドの絶対Ｇｌｕｃシグナルと正規化ルシフェラーゼとの間の関係。（Ｄ）Ｇｌｕｃタイリングガイドの絶対Ｃｌｕｃシグナルと正規化ルシフェラーゼとの間の関係。（Ｅ）Ｃｌｕｃタイリングガイドの絶対Ｃｌｕｃシグナルと正規化ルシフェラーゼとの間の関係。（Ｆ）Ｃｌｕｃタイリングガイドの絶対Ｇｌｕｃシグナルと正規化ルシフェラーゼとの間の関係。（Ｇ）ＰＰＩＢタイリングガイドのＰＰＩＢ ２－ＣｔレベルとＰＰＩＢノックダウンとの間の関係。（Ｈ）ＰＰＩＢタイリングガイドのＧＡＰＤＨ ２－ＣｔレベルとＰＰＩＢノックダウンとの間の関係。（Ｉ）ＰＰＩＢ ＫＲＡＳガイドのＫＲＡＳ ２－ＣｔレベルとＫＲＡＳノックダウンとの間の関係。（Ｊ）ＰＰＩＢ ＫＲＡＳガイドのＧＡＰＤＨ ２－ＣｔレベルとＫＲＡＳノックダウンとの間の関係。 図６２Ａ～図６２Ｊ：ＬｗａＣａｓ１３ａノックダウンは標的転写物に特異的であり、計測されるオフターゲット転写物に対して活性を有しない。（Ａ）Ｇｌｕｃにタイリングする最初の９６スペーサーの絶対Ｇｌｕｃシグナルのヒートマップ。（Ｂ）Ｇｌｕｃにタイリングする最初の９６スペーサーの絶対Ｃｌｕｃシグナルのヒートマップ。（Ｃ）Ｇｌｕｃタイリングガイドの絶対Ｇｌｕｃシグナルと正規化ルシフェラーゼとの間の関係。（Ｄ）Ｇｌｕｃタイリングガイドの絶対Ｃｌｕｃシグナルと正規化ルシフェラーゼとの間の関係。（Ｅ）Ｃｌｕｃタイリングガイドの絶対Ｃｌｕｃシグナルと正規化ルシフェラーゼとの間の関係。（Ｆ）Ｃｌｕｃタイリングガイドの絶対Ｇｌｕｃシグナルと正規化ルシフェラーゼとの間の関係。（Ｇ）ＰＰＩＢタイリングガイドのＰＰＩＢ ２－ＣｔレベルとＰＰＩＢノックダウンとの間の関係。（Ｈ）ＰＰＩＢタイリングガイドのＧＡＰＤＨ ２－ＣｔレベルとＰＰＩＢノックダウンとの間の関係。（Ｉ）ＰＰＩＢ ＫＲＡＳガイドのＫＲＡＳ ２－ＣｔレベルとＫＲＡＳノックダウンとの間の関係。（Ｊ）ＰＰＩＢ ＫＲＡＳガイドのＧＡＰＤＨ ２－ＣｔレベルとＫＲＡＳノックダウンとの間の関係。 図６２Ａ～図６２Ｊ：ＬｗａＣａｓ１３ａノックダウンは標的転写物に特異的であり、計測されるオフターゲット転写物に対して活性を有しない。（Ａ）Ｇｌｕｃにタイリングする最初の９６スペーサーの絶対Ｇｌｕｃシグナルのヒートマップ。（Ｂ）Ｇｌｕｃにタイリングする最初の９６スペーサーの絶対Ｃｌｕｃシグナルのヒートマップ。（Ｃ）Ｇｌｕｃタイリングガイドの絶対Ｇｌｕｃシグナルと正規化ルシフェラーゼとの間の関係。（Ｄ）Ｇｌｕｃタイリングガイドの絶対Ｃｌｕｃシグナルと正規化ルシフェラーゼとの間の関係。（Ｅ）Ｃｌｕｃタイリングガイドの絶対Ｃｌｕｃシグナルと正規化ルシフェラーゼとの間の関係。（Ｆ）Ｃｌｕｃタイリングガイドの絶対Ｇｌｕｃシグナルと正規化ルシフェラーゼとの間の関係。（Ｇ）ＰＰＩＢタイリングガイドのＰＰＩＢ ２－ＣｔレベルとＰＰＩＢノックダウンとの間の関係。（Ｈ）ＰＰＩＢタイリングガイドのＧＡＰＤＨ ２－ＣｔレベルとＰＰＩＢノックダウンとの間の関係。（Ｉ）ＰＰＩＢ ＫＲＡＳガイドのＫＲＡＳ ２－ＣｔレベルとＫＲＡＳノックダウンとの間の関係。（Ｊ）ＰＰＩＢ ＫＲＡＳガイドのＧＡＰＤＨ ２－ＣｔレベルとＫＲＡＳノックダウンとの間の関係。 図６３Ａ～図６３Ｆ：ｄＣａｓ１３ａはレポーター遺伝子発現を抑制し、内因性遺伝子に結合する。（Ａ）ＣｌｕｃとＧｌｕｃとを分ける合成ＨＢＧ１イントロンにわたってタイリングしたｄＣａｓ１３ａは、翻訳開始部位から特定の距離におけるＧｌｕｃ翻訳を抑制する能力を有する。（Ｂ）ｄＣａｓ１３ａ並びに２つのターゲティングｃｒＲＮＡ及び１つのノンターゲティングｃｒＲＮＡによって標的化されるβ－アクチンｍＲＮＡのＲＮＡ免疫沈降エンリッチメント。（Ｃ）ＡＣＴＢをイメージングするためのｄＣａｓ１３－ＧＦＰ構築物とｄＣａｓ１３ａ－ＧＦＰ－ＫＲＡＢ構築物との局在間の比較。（Ｄ）ノンターゲティングガイドで送達したｄＣａｓ１３ａ－ＮＬＳ－ｍｓｆＧＦＰネガティブフィードバック構築物の更なる視野。（Ｅ）ＡＣＴＢガイドで送達したｄＣａｓ１３ａ－ＮＬＳ－ｍｓｆＧＦＰネガティブフィードバック構築物の更なる視野。（Ｆ）ＡＣＴＢガイドで送達したｄＣａｓ１３ａ－ＮＬＳ－ｍｓｆＧＦＰネガティブフィードバック構築物の更なる視野。 図６３Ａ～図６３Ｆ：ｄＣａｓ１３ａはレポーター遺伝子発現を抑制し、内因性遺伝子に結合する。（Ａ）ＣｌｕｃとＧｌｕｃとを分ける合成ＨＢＧ１イントロンにわたってタイリングしたｄＣａｓ１３ａは、翻訳開始部位から特定の距離におけるＧｌｕｃ翻訳を抑制する能力を有する。（Ｂ）ｄＣａｓ１３ａ並びに２つのターゲティングｃｒＲＮＡ及び１つのノンターゲティングｃｒＲＮＡによって標的化されるβ－アクチンｍＲＮＡのＲＮＡ免疫沈降エンリッチメント。（Ｃ）ＡＣＴＢをイメージングするためのｄＣａｓ１３－ＧＦＰ構築物とｄＣａｓ１３ａ－ＧＦＰ－ＫＲＡＢ構築物との局在間の比較。（Ｄ）ノンターゲティングガイドで送達したｄＣａｓ１３ａ－ＮＬＳ－ｍｓｆＧＦＰネガティブフィードバック構築物の更なる視野。（Ｅ）ＡＣＴＢガイドで送達したｄＣａｓ１３ａ－ＮＬＳ－ｍｓｆＧＦＰネガティブフィードバック構築物の更なる視野。（Ｆ）ＡＣＴＢガイドで送達したｄＣａｓ１３ａ－ＮＬＳ－ｍｓｆＧＦＰネガティブフィードバック構築物の更なる視野。 図６３Ａ～図６３Ｆ：ｄＣａｓ１３ａはレポーター遺伝子発現を抑制し、内因性遺伝子に結合する。（Ａ）ＣｌｕｃとＧｌｕｃとを分ける合成ＨＢＧ１イントロンにわたってタイリングしたｄＣａｓ１３ａは、翻訳開始部位から特定の距離におけるＧｌｕｃ翻訳を抑制する能力を有する。（Ｂ）ｄＣａｓ１３ａ並びに２つのターゲティングｃｒＲＮＡ及び１つのノンターゲティングｃｒＲＮＡによって標的化されるβ－アクチンｍＲＮＡのＲＮＡ免疫沈降エンリッチメント。（Ｃ）ＡＣＴＢをイメージングするためのｄＣａｓ１３－ＧＦＰ構築物とｄＣａｓ１３ａ－ＧＦＰ－ＫＲＡＢ構築物との局在間の比較。（Ｄ）ノンターゲティングガイドで送達したｄＣａｓ１３ａ－ＮＬＳ－ｍｓｆＧＦＰネガティブフィードバック構築物の更なる視野。（Ｅ）ＡＣＴＢガイドで送達したｄＣａｓ１３ａ－ＮＬＳ－ｍｓｆＧＦＰネガティブフィードバック構築物の更なる視野。（Ｆ）ＡＣＴＢガイドで送達したｄＣａｓ１３ａ－ＮＬＳ－ｍｓｆＧＦＰネガティブフィードバック構築物の更なる視野。 図６３Ａ～図６３Ｆ：ｄＣａｓ１３ａはレポーター遺伝子発現を抑制し、内因性遺伝子に結合する。（Ａ）ＣｌｕｃとＧｌｕｃとを分ける合成ＨＢＧ１イントロンにわたってタイリングしたｄＣａｓ１３ａは、翻訳開始部位から特定の距離におけるＧｌｕｃ翻訳を抑制する能力を有する。（Ｂ）ｄＣａｓ１３ａ並びに２つのターゲティングｃｒＲＮＡ及び１つのノンターゲティングｃｒＲＮＡによって標的化されるβ－アクチンｍＲＮＡのＲＮＡ免疫沈降エンリッチメント。（Ｃ）ＡＣＴＢをイメージングするためのｄＣａｓ１３－ＧＦＰ構築物とｄＣａｓ１３ａ－ＧＦＰ－ＫＲＡＢ構築物との局在間の比較。（Ｄ）ノンターゲティングガイドで送達したｄＣａｓ１３ａ－ＮＬＳ－ｍｓｆＧＦＰネガティブフィードバック構築物の更なる視野。（Ｅ）ＡＣＴＢガイドで送達したｄＣａｓ１３ａ－ＮＬＳ－ｍｓｆＧＦＰネガティブフィードバック構築物の更なる視野。（Ｆ）ＡＣＴＢガイドで送達したｄＣａｓ１３ａ－ＮＬＳ－ｍｓｆＧＦＰネガティブフィードバック構築物の更なる視野。 図６４Ａ～図６４Ｂ ｄＣａｓ１３ａ－ＮＦは生細胞のストレス顆粒形成をイメージングすることができる。（Ａ）対応するＡＣＴＢターゲティング及びノンターゲティングガイドによるｄＣａｓ１３ａ－ＮＦ－発現細胞におけるＡＣＴＢ転写物の代表的なＲＮＡ ＦＩＳＨ画像。細胞の輪郭を破線で示す。（Ｂ）マンダースのオーバーラップ係数（左）及びピアソン相関（右）によって定量化したＡＣＴＢ ＲＮＡ ＦＩＳＨシグナルとｄＣａｓ１３ａ－ＮＦとの間の全体的なシグナルオーバーラップ。相関及びシグナルオーバーラップは１細胞当たりで画素毎に計算する。値は全て、ｎ＝３での平均値±ＳＥＭである。＊＊＊＊ｐ＜０．０００１；＊＊＊ｐ＜０．００１；＊＊ｐ＜０．０１。比較には両側スチューデントｔ検定を使用した。 図６５Ａ～図６５Ｃ．直接の転写物及びコラテラル転写物発現ノックダウン（ｋｎｏｃｋｄｏｗｕ）。（Ａ）活性対デッドＣａｓ１３ａによるルシフェラーゼのノックダウン。（Ｂ）活性対デッドＣａｓ１３ａによる内因性遺伝子発現のノックダウン。デッドＣａｓ１３ａによるノックダウンは、結合に起因する翻訳の遮断又は転写物（ｔｒａｍｓｃｒｉｐｔ）の不安定化によるものであり得る。（Ｃ）哺乳類細胞におけるデッドＣａｓ１３ａによるコラテラル活性の欠如。（Ａ）のデッドＣａｓ１３ａ並びにルシフェラーゼに対するガイド１及び２を使用しても、ノンターゲティング対照と比較して転写物分布サイズの変化は観察されない。 図６６Ａ～図６６Ｏ．指示されるコンセンサス配列との図５３の種々のＣ２Ｃ２オルソログの配列アラインメント。 図６６Ａ～図６６Ｏ．指示されるコンセンサス配列との図５３の種々のＣ２Ｃ２オルソログの配列アラインメント。 図６６Ａ～図６６Ｏ．指示されるコンセンサス配列との図５３の種々のＣ２Ｃ２オルソログの配列アラインメント。 図６６Ａ～図６６Ｏ．指示されるコンセンサス配列との図５３の種々のＣ２Ｃ２オルソログの配列アラインメント。 図６６Ａ～図６６Ｏ．指示されるコンセンサス配列との図５３の種々のＣ２Ｃ２オルソログの配列アラインメント。 図６６Ａ～図６６Ｏ．指示されるコンセンサス配列との図５３の種々のＣ２Ｃ２オルソログの配列アラインメント。 図６６Ａ～図６６Ｏ．指示されるコンセンサス配列との図５３の種々のＣ２Ｃ２オルソログの配列アラインメント。 図６６Ａ～図６６Ｏ．指示されるコンセンサス配列との図５３の種々のＣ２Ｃ２オルソログの配列アラインメント。 図６６Ａ～図６６Ｏ．指示されるコンセンサス配列との図５３の種々のＣ２Ｃ２オルソログの配列アラインメント。 図６６Ａ～図６６Ｏ．指示されるコンセンサス配列との図５３の種々のＣ２Ｃ２オルソログの配列アラインメント。 図６６Ａ～図６６Ｏ．指示されるコンセンサス配列との図５３の種々のＣ２Ｃ２オルソログの配列アラインメント。 図６６Ａ～図６６Ｏ．指示されるコンセンサス配列との図５３の種々のＣ２Ｃ２オルソログの配列アラインメント。 図６６Ａ～図６６Ｏ．指示されるコンセンサス配列との図５３の種々のＣ２Ｃ２オルソログの配列アラインメント。 図６６Ａ～図６６Ｏ．指示されるコンセンサス配列との図５３の種々のＣ２Ｃ２オルソログの配列アラインメント。 図６６Ａ～図６６Ｏ．指示されるコンセンサス配列との図５３の種々のＣ２Ｃ２オルソログの配列アラインメント。 図６７Ａ～図６７Ｃ．レプトトリキア・ウエイデイ（Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ ｗａｄｅｉ）Ｆ０２７９ Ｃ２ｃ２（「Ｌｅｗ２Ｃ２ｃ２」）とリステリア・ニューヨーケンシス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｎｅｗｙｏｒｋｅｎｓｉｓ）ＦＳＬ Ｍ６－０６３５ Ｃ２ｃ２（「ＬｉｂＣ２ｃ２」）とのアラインメント。 図６７Ａ～図６７Ｃ．レプトトリキア・ウエイデイ（Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ ｗａｄｅｉ）Ｆ０２７９ Ｃ２ｃ２（「Ｌｅｗ２Ｃ２ｃ２」）とリステリア・ニューヨーケンシス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｎｅｗｙｏｒｋｅｎｓｉｓ）ＦＳＬ Ｍ６－０６３５ Ｃ２ｃ２（「ＬｉｂＣ２ｃ２」）とのアラインメント。 図６７Ａ～図６７Ｃ．レプトトリキア・ウエイデイ（Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ ｗａｄｅｉ）Ｆ０２７９ Ｃ２ｃ２（「Ｌｅｗ２Ｃ２ｃ２」）とリステリア・ニューヨーケンシス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｎｅｗｙｏｒｋｅｎｓｉｓ）ＦＳＬ Ｍ６－０６３５ Ｃ２ｃ２（「ＬｉｂＣ２ｃ２」）とのアラインメント。 図６８．ＲＮアーゼ活性を示すＣ２ｃ２ ＨＥＰＮドメインのアラインメント。上のアラインメントブロックは、これまでに記載されている選択のＨＥＰＮドメインを含み、下のブロックはＣ２ｃ２エフェクタータンパク質からの触媒モチーフを含む。各ドメイン構造の下には、それぞれのタンパク質ファミリーの選択された代表における保存モチーフのアラインメント。触媒残基は黒色の背景に白色の文字で示す；保存された疎水性残基は黄色で強調表示する；保存された小さい残基は緑色で強調表示する；ブリッジヘリックスアラインメントでは、正電荷残基は赤色である。アラインメントされた配列の下に二次構造予測を示す：Ｈはα－ヘリックスを表し、Ｅは伸長したコンホメーション（βストランド）を表す。アラインメントブロック間でほとんど保存されていないスペーサーは数字で示す。
本明細書の図は例示を目的としているに過ぎず、及び必ずしも一定の尺度で描かれているとは限らない。
発明の詳細な説明
一般に、国際公開第２０１４／０９３６２２号パンフレット（ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７４６６７号明細書）などの前述の文書で用いられているとおりのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ又はＣＲＩＳＰＲ系は、Ｃａｓ遺伝子をコードする配列、ｔｒａｃｒ（トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ）配列（例えばｔｒａｃｒＲＮＡ又は活性部分的ｔｒａｃｒＲＮＡ）、ｔｒａｃｒメイト配列（内因性ＣＲＩＳＰＲ系の文脈では「ダイレクトリピート」及びｔｒａｃｒＲＮＡによってプロセシングされる部分的ダイレクトリピートを包含する）、ガイド配列（内因性ＣＲＩＳＰＲ系の文脈では「スペーサー」とも称される）、又はこの用語が本明細書において使用されるとおりの「ＲＮＡ」（例えば、Ｃａｓ９などのＣａｓをガイドするＲＮＡ、例えばＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ及びトランス活性化（ｔｒａｃｒ）ＲＮＡ又はシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）（キメラＲＮＡ））又はＣＲＩＳＰＲ遺伝子座からの他の配列及び転写物を含めた、ＣＲＩＳＰＲ関連（「Ｃａｓ」）遺伝子の発現に関与し又はその活性を導く転写物及び他のエレメントをまとめて指す。一般に、ＣＲＩＳＰＲ系は、標的配列（内因性ＣＲＩＳＰＲ系の文脈ではプロトスペーサーとも称される）の部位においてＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進するエレメントによって特徴付けられる。ＣＲＩＳＰＲタンパク質がＣ２ｃ２タンパク質である場合、ｔｒａｃｒＲＮＡは不要である。
ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成の文脈では、「標的配列」とは、ガイド配列がそれに対して相補性を有するように設計される配列を指し、ここでは標的配列とガイド配列との間のハイブリダイゼーションがＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進する。標的配列はＲＮＡポリヌクレオチドを含み得る。一部の実施形態において、標的配列は細胞の核又は細胞質に位置する。一部の実施形態において、ダイレクトリピートは、以下の基準の一部又は全部を満たす繰り返しモチーフを検索することによりインシリコで同定されてもよい：１．ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座に隣接する２Ｋｂウィンドウのゲノム配列に存在する；２．２０～５０ｂｐにわたる；及び３．２０～５０ｂｐの間隔が空いている。一部の実施形態では、これらの基準のうち２つ、例えば１及び２、２及び３、又は１及び３が用いられてもよい。一部の実施形態では、３つの基準の全てが用いられてもよい。
一般に、ガイド配列は、標的配列とハイブリダイズして標的配列へのＣＲＩＳＰＲ複合体の配列特異的結合を導くのに十分な標的ポリヌクレオチド配列との相補性を有する任意のポリヌクレオチド配列である。用語「ターゲティング配列」は、標的配列と十分な相補性（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎａｒｉｔｙ）を有するガイド配列の一部分を意味する。一部の実施形態において、ガイド配列とその対応する標的配列との間の相補性の程度は、好適なアラインメントアルゴリズムを用いて最適にアラインメントしたとき、約５０％、６０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７．５％、９９％以上であるか、又はそれより高い。最適アラインメントは、配列のアラインメントに好適な任意のアルゴリズムを用いて決定することができ、その非限定的な例としては、スミス・ウォーターマンアルゴリズム、ニードルマン・ブンシュアルゴリズム、バローズ・ホイーラー変換に基づくアルゴリズム（例えば、バローズ・ホイーラーアライナー）、ＣｌｕｓｔａｌＷ、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｘ、ＢＬＡＴ、Ｎｏｖｏａｌｉｇｎ（Ｎｏｖｏｃｒａｆｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；ｗｗｗ．ｎｏｖｏｃｒａｆｔ．ｃｏｍにおいて利用可能）、ＥＬＡＮＤ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、ＳＯＡＰ（ｓｏａｐ．ｇｅｎｏｍｉｃｓ．ｏｒｇ．ｃｎにおいて利用可能）、及びＭａｑ（ｍａｑ．ｓｏｕｒｃｅｆｏｒｇｅ．ｎｅｔにおいて利用可能）が挙げられる。一部の実施形態において、ガイド配列は、約５、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、７５ヌクレオチド長以上であるか、又はそれより長い。一部の実施形態において、ガイド配列は、約７５、５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５、１２ヌクレオチド長未満か、又はそれより短い。好ましくはガイド配列は１０ ３０ヌクレオチド長である。ガイド配列が標的配列へのＣＲＩＳＰＲ複合体の配列特異的結合を導く能力は、任意の好適なアッセイによって評価し得る。例えば、ＣＲＩＳＰＲ複合体を形成するのに十分なＣＲＩＳＰＲ系の構成成分が、試験しようとするガイド配列を含め、ＣＲＩＳＰＲ配列の構成成分をコードするベクターのトランスフェクションなどにより対応する標的配列を有する宿主細胞に提供されてもよく、続いて本明細書に記載されるとおりのＳｕｒｖｅｙｏｒアッセイなどにより、標的配列内における優先的な切断を評価し得る。同様に、標的ポリヌクレオチド配列の切断は、標的配列、試験しようとするガイド配列を含めたＣＲＩＳＰＲ複合体の構成成分、及び供試ガイド配列と異なる対照ガイド配列を提供して、供試ガイド配列と対照ガイド配列との反応間の標的配列における結合又は切断速度を比較することにより試験管内で判定することができる。他のアッセイも可能であり、当業者には想起されるであろう。
古典的なＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系において、ガイド配列とその対応する標的配列との間の相補性の程度は、約５０％、６０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７．５％、９９％、又は１００％以上であってもよく；ガイド又はＲＮＡ又はｓｇＲＮＡは、約５、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、７５ヌクレオチド長以上であるか、又はそれより長くてもよく；又はガイド又はＲＮＡ又はｓｇＲＮＡは約７５、５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５、１２ヌクレオチド長未満であるか、又はそれより短くてもよい。しかしながら、本発明のある態様は、オフターゲット相互作用を低下させること、例えば、ガイドが相補性の低い標的配列と相互作用するのを低下させることである。実際、例において、８０％～約９５％超の相補性、例えば、８３％～８４％又は８８～８９％又は９４～９５％の相補性を有する標的配列とオフターゲット配列との間を区別する（例えば、１８ヌクレオチドを有する標的を、１、２又は３個のミスマッチを有する１８ヌクレオチドのオフターゲットと区別する）ことが可能なＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系をもたらす突然変異が本発明に関わることが示される。従って、本発明との関連において、ガイド配列とその対応する標的配列との間の相補性の程度は、９４．５％又は９５％又は９５．５％又は９６％又は９６．５％又は９７％又は９７．５％又は９８％又は９８．５％又は９９％又は９９．５％又は９９．９％超、又は１００％である。オフターゲットはその配列とガイドとの間で１００％又は９９．９％又は９９．５％又は９９％又は９９％又は９８．５％又は９８％又は９７．５％又は９７％又は９６．５％又は９６％又は９５．５％又は９５％又は９４．５％又は９４％又は９３％又は９２％又は９１％又は９０％又は８９％又は８８％又は８７％又は８６％又は８５％又は８４％又は８３％又は８２％又は８１％又は８０％未満の相補性であり、有利には、オフターゲットはその配列とガイドとの間で１００％又は９９．９％又は９９．５％又は９９％又は９９％又は９８．５％又は９８％又は９７．５％又は９７％又は９６．５％又は９６％又は９５．５％又は９５％又は９４．５％の相補性である。
特定の実施形態において、スペーサー配列と標的配列との間にミスマッチ、例えば１つ又は２つのミスマッチなど１つ以上のミスマッチを導入することにより、スペーサー／標的に沿ったミスマッチの位置を含め、切断効率の調節を利用することができる。例えばダブルミスマッチが中央寄りであるほど（即ち３’寄り又は５’寄りでない）、切断効率がより大きい影響を受ける。従って、スペーサーに沿ってミスマッチ位置を選択することにより、切断効率を調節することができる。例として、標的の１００％未満の切断が（例えばある細胞集団において）所望される場合、スペーサー配列にスペーサーと標的配列との間の１つ以上、例えば好ましくは２つのミスマッチが導入されてもよい。スペーサーに沿ってミスマッチ位置が中央寄りであるほど、切断割合が低くなる。
本明細書に記載されるとおりの本発明に係る方法は、本明細書に考察されるとおりのベクターを細胞に送達することを含む、本明細書に考察されるとおりの真核細胞において（インビトロで、即ち単離された真核細胞において）１つ以上のヌクレオチド改変を誘導することを包含する。この１つ又は複数の突然変異には、１つ又は複数のガイド１つ又は複数のＲＮＡ又は１つ又は複数のｓｇＲＮＡを介した１つ又は複数の細胞の各標的配列における１つ以上のヌクレオチドの導入、欠失、又は置換が含まれ得る。この突然変異には、１つ又は複数のガイド１つ又は複数のＲＮＡを介した１つ又は複数の前記細胞の各標的配列における１～７５ヌクレオチドの導入、欠失、又は置換が含まれ得る。この突然変異には、１つ又は複数のガイド１つ又は複数のＲＮＡを介した１つ又は複数の前記細胞の各標的配列における１、５、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、又は７５ヌクレオチドの導入、欠失、又は置換が含まれ得る。この突然変異には、１つ又は複数のガイド１つ又は複数のＲＮＡを介した１つ又は複数の前記細胞の各標的配列における５、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、又は７５ヌクレオチドの導入、欠失、又は置換が含まれ得る。この突然変異には、１つ又は複数のガイド１つ又は複数のＲＮＡを介した１つ又は複数の前記細胞の各標的配列における１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、又は７５ヌクレオチドの導入、欠失、又は置換が含まれ得る。この突然変異には、１つ又は複数のガイド１つ又は複数のＲＮＡを介した１つ又は複数の前記細胞の各標的配列における２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、又は７５ヌクレオチドの導入、欠失、又は置換が含まれ得る。この突然変異には、１つ又は複数のガイド１つ又は複数のＲＮＡを介した１つ又は複数の前記細胞の各標的配列における４０、４５、５０、７５、１００、２００、３００、４００又は５００ヌクレオチドの導入、欠失、又は置換が含まれ得る。
毒性及びオフターゲット効果を最小限に抑えるため、送達されるＣａｓ ｍＲＮＡ又はタンパク質及びガイドＲＮＡの濃度を制御することが重要となり得る。Ｃａｓ ｍＲＮＡ又はタンパク質及びガイドＲＮＡの最適濃度は、細胞モデル又は非ヒト真核生物動物モデルにおける種々の濃度の試験、及びディープシーケンシングを用いた潜在的なオフターゲットゲノム遺伝子座における改変の程度の分析によって決定することができる。
典型的には、内因性ＣＲＩＳＰＲ系の文脈では、ＣＲＩＳＰＲ複合体（標的配列にハイブリダイズし、且つ１つ以上のＣａｓタンパク質と複合体を形成したガイド配列を含む）が形成されると、標的配列又はその近傍（例えば標的配列から１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、５０塩基対、又はそれ以上の範囲内）に切断が生じるが、特にＲＮＡ標的の場合には、例えば二次構造に依存し得る。
Ｃａｓをコードする核酸分子は、有利にはコドン最適化されたＣａｓである。コドン最適化された配列の例は、この場合、真核生物、例えばヒトでの発現に最適化されるか（即ちヒトでの発現に最適化されている）、又は本明細書で考察されるとおりの別の真核生物、動物若しくは哺乳動物に最適化された配列である；例えば、国際公開第２０１４／０９３６２２号パンフレット（ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７４６６７号明細書）のＳａＣａｓ９ヒトコドン最適化配列を参照のこと。これが好ましいが、他の例が可能であることが理解され、ヒト以外の宿主種に対するコドン最適化、又は特定の器官に対するコドン最適化が公知である。一部の実施形態において、Ｃａｓをコードする酵素コード配列が、特定の細胞、例えば真核細胞での発現にコドン最適化される。真核細胞は、特定の生物、例えば、限定はされないがヒトを含めた哺乳動物、又は本明細書で考察されるとおりの非ヒト真核生物又は動物又は哺乳動物、例えば、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、家畜、又は非ヒト哺乳動物又は霊長類のものであるか、又はそれに由来し得る。一部の実施形態において、ヒト又は動物に対するいかなる実質的な医学的利益もなくそれらに苦痛を生じさせる可能性のあるヒトの生殖細胞系列遺伝子アイデンティティの改変方法及び／又は動物の遺伝子アイデンティティの改変方法、更にかかる方法から得られる動物は除外され得る。一般に、コドン最適化とは、天然配列の少なくとも１つのコドン（例えば、約１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、５０個以上、又はそれより多いコドン）を、天然のアミノ酸配列を維持しつつ、当該の宿主細胞の遺伝子においてより高頻度で又は最も高頻度で使用されるコドンに置き換えることにより、目的の宿主細胞における発現を増強するための核酸配列の改変方法を指す。様々な種が、特定のアミノ酸のある種のコドンについて特定のバイアスを呈する。コドンバイアス（生物間でのコドン使用の違い）は、多くの場合にメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の翻訳効率と相関し、次にはそれが、数ある中でも特に、翻訳されるコドンの特性及び特定のトランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）分子の利用可能性に依存すると考えられている。細胞において選択のｔＲＮＡが優勢であることは、概して、ペプチド合成で最も高頻度に使用されるコドンを反映するものである。従って、コドン最適化に基づき所与の生物における最適な遺伝子発現に合わせて遺伝子を調整することができる。コドン使用表が、例えば、ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒｊｐ／ｃｏｄｏｎ／で利用可能な「コドン使用データベース（Ｃｏｄｏｎ Ｕｓａｇｅ Ｄａｔａｂａｓｅ）」で容易に利用可能であり、これらの表を幾つもの方法で適合させることができる。Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｙ．，ｅｔ ａｌ．「国際的ＤＮＡ配列データベースから表にしたコドン使用：２０００年の状況（Ｃｏｄｏｎ ｕｓａｇｅ ｔａｂｕｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｄａｔａｂａｓｅｓ：ｓｔａｔｕｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｙｅａｒ ２０００）」Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２８：２９２（２０００）を参照のこと。特定の配列を特定の宿主細胞における発現にコドン最適化するためのコンピュータアルゴリズムもまた利用可能であり、Ｇｅｎｅ Ｆｏｒｇｅ（Ａｐｔａｇｅｎ；Ｊａｃｏｂｕｓ，ＰＡ）などもまた利用可能である。一部の実施形態において、Ｃａｓをコードする配列中の１つ以上のコドン（例えば、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、５０以上、又は全てのコドン）が、特定のアミノ酸について最も高頻度に使用されるコドンに対応する。
特定の実施形態において、本明細書に記載されるとおりの方法は、１つ以上の目的の遺伝子のプロモーターを含む調節エレメントと細胞内で作動可能に接続した１つ以上のガイドＲＮＡをコードする１つ以上の核酸が提供又は導入されるＣａｓトランスジェニック細胞を提供することを含み得る。本明細書で使用されるとき、用語「Ｃａｓトランスジェニック細胞」は、Ｃａｓ遺伝子がゲノム的に組み込まれている真核細胞などの細胞を指す。細胞の性質、タイプ、又は起源は、本発明によれば特に限定されない。また、Ｃａｓトランス遺伝子を細胞に導入する方法も様々であってよく、当該技術分野において公知のとおりの任意の方法であり得る。特定の実施形態において、Ｃａｓトランスジェニック細胞は、単離細胞にＣａｓトランス遺伝子を導入することによって得られる。特定の他の実施形態において、Ｃａｓトランスジェニック細胞は、Ｃａｓトランスジェニック生物から細胞を単離することによって得られる。例として、及び限定なしに、本明細書において言及されるとおりのＣａｓトランスジェニック細胞は、Ｃａｓノックイン真核生物など、Ｃａｓトランスジェニック真核生物に由来してもよい。国際公開第２０１４／０９３６２２号パンフレット（ＰＣＴ／ＵＳ１３／７４６６７号明細書）（参照により本明細書に援用される）が参照される。Ｒｏｓａ遺伝子座のターゲティングに関するＳａｎｇａｍｏ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．に譲渡された米国特許出願公開第２０１２００１７２９０号明細書及び同第２０１１０２６５１９８号明細書の方法を、本発明のＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ系を利用するように改変し得る。Ｒｏｓａ遺伝子座の標的化に関するＣｅｌｌｅｃｔｉｓに譲渡された米国特許出願公開第２０１３０２３６９４６号明細書の方法もまた、本発明のＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ系を利用するように改変し得る。更なる例として、Ｃａｓ９ノックインマウスについて記載しているＰｌａｔｔ ｅｔ．ａｌ．（Ｃｅｌｌ；１５９（２）：４４０－４５５（２０１４））（参照により本明細書に援用される）が参照される。Ｃａｓトランス遺伝子はＬｏｘ－Ｓｔｏｐ－ポリＡ－Ｌｏｘ（ＬＳＬ）カセットを更に含んでもよく、それによりＣａｓ発現をＣｒｅリコンビナーゼによって誘導可能なものにすることができる。或いは、Ｃａｓトランスジェニック細胞は、単離細胞にＣａｓトランス遺伝子を導入することによって得てもよい。トランス遺伝子の送達系は当該技術分野において周知である。例として、Ｃａｓトランス遺伝子は、同様に本明細書の他の部分に記載されるとおり、例えば真核細胞においてベクター（例えば、ＡＡＶ、アデノウイルス、レンチウイルス）及び／又は粒子及び／又はナノ粒子送達を用いて送達し得る。
当業者は、本明細書において参照されるとおりのＣａｓトランスジェニック細胞などの細胞が、例えば、及び限定なしに、Ｐｌａｔｔ ｅｔ ａｌ．（２０１４），Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，（２０１４）又はＫｕｍａｒ ｅｔ ａｌ．．（２００９）に記載されるとおり、組み込まれたＣａｓ遺伝子を有することに加えて更なるゲノム変化を含み、又はＣａｓを標的遺伝子座にガイドすることが可能なＲＮＡと複合体を形成したときＣａｓの配列特異的作用によって生じる突然変異、例えば１つ以上の発癌突然変異などを含み得ることを理解するであろう。
一部の実施形態において、Ｃａｓ配列は、１個以上の核局在化配列（ＮＬＳ）又は核外移行配列（ＮＥＳ）、例えば約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個以上、又はそれより多いＮＬＳ又はＮＥＳに融合される。一部の実施形態において、Ｃａｓは、アミノ末端又はその近傍に約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個以上、又はそれより多いＮＬＳ又はＮＥＳを含むか、カルボキシ末端又はその近傍に約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個以上、又はそれより多いＮＬＳ又はＮＥＳを含むか、又はこれらの組み合わせ（例えば、アミノ末端にゼロ個又は少なくとも１個以上のＮＬＳ又はＮＥＳ及びカルボキシ末端にゼロ個又は１個以上のＮＬＳ又はＮＥＳ）である。２個以上のＮＬＳ又はＮＥＳが存在する場合、各々を他と独立して選択してもよく、従って単一のＮＬＳ又はＮＥＳが２つ以上のコピーで存在してもよく、及び／又は１つ以上のコピーで存在する１つ以上の他のＮＬＳ又はＮＥＳとの組み合わせで存在してもよい。本発明の好ましい実施形態において、Ｃａｓは高々６個のＮＬＳを含む。一部の実施形態において、ＮＬＳ又はＮＥＳは、ＮＬＳ又はＮＥＳの最も近いアミノ酸がＮ末端又はＣ末端からポリペプチド鎖に沿って約１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、又はそれより多いアミノ酸の範囲内にあるとき、Ｎ末端又はＣ末端の近傍にあると見なされる。ＮＬＳの非限定的な例としては、アミノ酸配列ＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号Ｘ）を有するＳＶ４０ウイルスラージＴ抗原のＮＬＳ；ヌクレオプラスミンのＮＬＳ（例えば、配列ＫＲＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡＫＫＫＫ）（配列番号Ｘ）を有するヌクレオプラスミンビパルタイトＮＬＳ；アミノ酸配列ＰＡＡＫＲＶＫＬＤ（配列番号Ｘ）又はＲＱＲＲＮＥＬＫＲＳＰ（配列番号Ｘ）を有するｃ－ｍｙｃ ＮＬＳ；配列ＮＱＳＳＮＦＧＰＭＫＧＧＮＦＧＧＲＳＳＧＰＹＧＧＧＧＱＹＦＡＫＰＲＮＱＧＧＹ（配列番号Ｘ）を有するｈＲＮＰＡ１ Ｍ９ ＮＬＳ；インポーチン－αのＩＢＢドメインの配列ＲＭＲＩＺＦＫＮＫＧＫＤＴＡＥＬＲＲＲＲＶＥＶＳＶＥＬＲＫＡＫＫＤＥＱＩＬＫＲＲＮＶ（配列番号Ｘ）；筋腫Ｔタンパク質の配列ＶＳＲＫＲＰＲＰ（配列番号Ｘ）及びＰＰＫＫＡＲＥＤ（配列番号Ｘ）；ヒトｐ５３の配列ＰＯＰＫＫＫＰＬ（配列番号Ｘ）；マウスｃ－ａｂｌ ＩＶの配列ＳＡＬＩＫＫＫＫＫＭＡＰ（配列番号Ｘ）；インフルエンザウイルスＮＳ１の配列ＤＲＬＲＲ（配列番号Ｘ）及びＰＫＱＫＫＲＫ（配列番号Ｘ）；肝炎ウイルスデルタ抗原の配列ＲＫＬＫＫＫＩＫＫＬ（配列番号Ｘ）；マウスＭｘ１タンパク質の配列ＲＥＫＫＫＦＬＫＲＲ（配列番号Ｘ）；ヒトポリ（ＡＤＰ－リボース）ポリメラーゼの配列ＫＲＫＧＤＥＶＤＧＶＤＥＶＡＫＫＫＳＫＫ（配列番号Ｘ）；及びステロイドホルモン受容体（ヒト）グルココルチコイドの配列ＲＫＣＬＱＡＧＭＮＬＥＡＲＫＴＫＫ（配列番号Ｘ）に由来するＮＬＳ配列が挙げられる。ＮＥＳの非限定的な例としては、ＮＥＳ配列ＬＹＰＥＲＬＲＲＩＬＴ（ｃｔｇｔａｃｃｃｔｇａｇｃｇｇｃｔｇｃｇｇｃｇｇａｔｃｃｔｇａｃｃ）が挙げられる。一般に、１つ以上のＮＬＳ又はＮＥＳは、真核細胞のそれぞれ核又は細胞質における検出可能な量のＣａｓの蓄積をドライブするのに十分な強度である。一般に、核局在化／核外移行活性の強度は、Ｃａｓ内のＮＬＳ／ＮＥＳの数、用いられる詳細なＮＬＳ又はＮＥＳ、又はこれらの組み合わせ要因から導き出すことができる。核／細胞質内での蓄積の検出は任意の好適な技法によって実施し得る。例えば、検出可能なマーカーをＣａｓに融合してもよく、それにより、核（例えば、ＤＡＰＩなど、核に特異的な染色）又は細胞質の位置を検出する手段と組み合わせるなどして細胞内での位置を可視化してもよい。細胞核はまた、細胞から単離してもよく、次にその内容物を、免疫組織化学、ウエスタンブロット、又は酵素活性アッセイなど、任意の好適なタンパク質検出方法によって分析してもよい。核内における蓄積はまた、ＣＲＩＳＰＲ複合体形成の効果に関するアッセイ（例えば、標的配列におけるＤＮＡ切断又は突然変異に関するアッセイ、又はＣＲＩＳＰＲ複合体形成及び／又はＣａｓ酵素活性の影響を受けて変化した遺伝子発現活性に関するアッセイ）によるなどして、Ｃａｓ又は複合体に曝露されていない対照、又は１つ以上のＮＬＳ又はＮＥＳを欠くＣａｓに曝露された対照と比較して間接的に決定してもよい。特定の実施形態において、限定なしに、オルガネラ、例えば、ミトコンドリア、プラスチド、葉緑体、小胞、ゴルジ、（核又は細胞）膜、リボソーム、核小体、ＥＲ、細胞骨格、液胞、中心体、ヌクレオソーム、顆粒、中心小体などの細胞内の特定の部位にＣａｓを局在化させるためなど、他の局在化タグがＣａｓタンパク質に融合されてもよい。
特定の態様において、本発明は、例えばＣａｓ及び／又はＣａｓを標的遺伝子座に案内する能力を有するＲＮＡ（即ちガイドＲＮＡ）を細胞に送達又は導入するための、またこれらの成分を（例えば原核細胞において）増殖させるための、ベクターに関する。本明細書で使用されるとき、「ベクター」は、ある実体を一つの環境から別の環境に移すことを可能にする又は促進するツールである。これは、別のＤＮＡセグメントが挿入されて挿入セグメントの複製をもたらし得るレプリコン、例えば、プラスミド、ファージ、又はコスミドである。概して、ベクターは適切な制御エレメントと会合しているとき複製能を有する。一般に、用語「ベクター」は、それに連結されている別の核酸を輸送することが可能な核酸分子を指す。ベクターとしては、限定はされないが、一本鎖、二本鎖、又は部分的二本鎖の核酸分子；１つ以上の遊離末端を含む、遊離末端のない（例えば環状の）核酸分子；ＤＮＡ、ＲＮＡ、又は両方を含む核酸分子；及び当該技術分野において公知の他の各種ポリヌクレオチドが挙げられる。ある種のベクターは「プラスミド」であり、これは、標準的な分子クローニング技術によるなどして追加のＤＮＡセグメントを挿入することができる環状二本鎖ＤＮＡループを指す。別の種類のベクターはウイルスベクターであり、ここでベクターには、ウイルス（例えば、レトロウイルス、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス、複製欠損アデノウイルス、及びアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ））へのパッケージングのためのウイルス由来ＤＮＡ又はＲＮＡ配列が存在する。ウイルスベクターはまた、宿主細胞へのトランスフェクションのためのウイルスが担持するポリヌクレオチドも含む。特定のベクターは、それが導入される宿主細胞での自己複製能を有する（例えば、細菌性複製起点を有する細菌ベクター及びエピソーム哺乳類ベクター）。他のベクター（例えば非エピソーム哺乳類ベクター）は宿主細胞への導入時に宿主細胞のゲノムに組み込まれ、それにより宿主ゲノムと共に複製される。更に、特定のベクターは、それが作動可能に連結された遺伝子の発現を導くことが可能である。かかるベクターは、本明細書では「発現ベクター」と称される。組換えＤＮＡ技法において有用な一般的な発現ベクターは、プラスミドの形態であることが多い。
組換え発現ベクターは、宿主細胞における核酸の発現に好適な形態で本発明の核酸を含むことができ、これはつまり、組換え発現ベクターが、発現させる核酸配列に作動可能に連結された１つ以上の調節エレメント（これは、発現に用いられる宿主細胞に基づき選択されてもよい）を含むことを意味する。組換え発現ベクターの範囲内において、「作動可能に連結された」は、ヌクレオチド配列の（例えば、インビトロ転写／翻訳系における、又はベクターが宿主細胞に導入される場合に宿主細胞における）発現が可能となる形で目的のヌクレオチド配列が１つ又は複数の調節エレメントに連結されていることを意味するように意図される。組換え及びクローニング方法に関しては、２００４年９月２日に米国特許出願公開第２００４－０１７１１５６ Ａ１号明細書として公開された米国特許出願第１０／８１５，７３０号明細書（この内容は、本明細書において全体として参照により援用される）が挙げられる。
１つ又は複数のベクターが、１つ又は複数の調節エレメント、例えば１つ又は複数のプロモーターを含み得る。１つ又は複数のベクターはＣａｓコード配列、及び／又は単一の、しかし少なくとも３又は８又は１６又は３２又は４８又は５０個を含み得る可能性もあるガイドＲＮＡ（例えばｓｇＲＮＡ）コード配列、例えば、１～２、１～３、１～４ １～５、３～６、３～７、３～８、３～９、３～１０、３～８、３～１６、３～３０、３～３２、３～４８、３～５０個のＲＮＡ（例えばｓｇＲＮＡ）を含み得る。単一のベクターには、有利には約１６個以下のＲＮＡがある場合、各ＲＮＡ（例えばｓｇＲＮＡ）にプロモーターがあってもよく；及び、単一のベクターが１６個より多いＲＮＡを提供する場合、１つ以上のプロモーターがそれらのＲＮＡのうちの２個以上の発現をドライブしてもよく、例えば、３２個のＲＮＡがある場合、各プロモーターが２個のＲＮＡの発現をドライブしてもよく、及び４８個のＲＮＡがある場合、各プロモーターが３個のＲＮＡの発現をドライブしてもよい。単純な算術的な十分に確立されたクローニングプロトコル及び本開示の教示により、当業者は、例えばＡＡＶなどの好適な例示的ベクターに対するＲＮＡ、及びＵ６プロモーターなどの好適なプロモーターに関して本発明を容易に実施することができる。例えば、ＡＡＶのパッケージング限界は約４．７ｋｂである。単一のＵ６－ｇＲＮＡ（＋クローニング用の制限部位）の長さは３６１ｂｐである。従って、当業者は、単一のベクターに約１２～１６個、例えば１３個のＵ６－ｇＲＮＡカセットを容易に収めることができる。これは、ＴＡＬＥアセンブリに用いられるゴールデンゲート戦略（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｏｍｅ－ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．ｏｒｇ／ｔａｌｅｆｆｅｃｔｏｒｓ／）など、任意の好適な手段によってアセンブルすることができる。当業者はまた、Ｕ６－ｇＲＮＡの数を約１．５倍増加させるため、例えば、１２～１６、例えば１３から約１８～２４、例えば約１９個のＵ６－ｇＲＮＡに増加させるため、タンデムガイド戦略も用いることができる。従って、当業者は、単一のベクター、例えばＡＡＶベクター中に約１８～２４個、例えば約１９個のプロモーター－ＲＮＡ、例えばＵ６－ｇＲＮＡに容易に至ることができる。ベクター中のプロモーター及びＲＮＡの数を増加させる更なる手段は、単一のプロモーター（例えばＵ６）を使用して、切断可能な配列によって分離されたＲＮＡのアレイを発現させることである。及びベクター中のプロモーター－ＲＮＡの数を増加させる更に別の手段は、コード配列又は遺伝子のイントロンにおいて切断可能な配列によって分離されたプロモーター－ＲＮＡのアレイを発現させることである；及び、この場合、ポリメラーゼＩＩプロモーターを使用することが有利であり、それにより発現が増加し、組織特異的様式での長いＲＮＡの転写が可能となり得る（例えば、ｈｔｔｐ：／／ｎａｒ．ｏｘｆｏｒｄｊｏｕｒｎａｌｓ．ｏｒｇ／ｃｏｎｔｅｎｔ／３４／７／ｅ５３．ｓｈｏｒｔ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎａｔｕｒｅ．ｃｏｍ／ｍｔ／ｊｏｕｒｎａｌ／ｖ１６／ｎ９／ａｂｓ／ｍｔ２００８１４４ａ．ｈｔｍｌを参照）。有利な実施形態において、ＡＡＶは、最大約５０遺伝子を標的とするＵ６タンデムｇＲＮＡをパッケージングし得る。従って、当該技術分野における知識及び本開示の教示から、当業者は、１つ以上のプロモーターの制御下にあるか、又はそれに作動可能に若しくは機能的に連結された複数のＲＮＡ又はガイドを発現する１つ又は複数のベクター、例えばシングルベクターを（特に本明細書で考察されるＲＮＡ又はガイドの数に関して）いかなる過度の実験もなく容易に作製及び使用することができる。
１つ又は複数のガイドＲＮＡのコード配列及び／又はＣａｓコード配列は１つ又は複数の調節エレメントに機能的に又は作動可能に連結されてもよく、従って１つ又は複数の調節エレメントが発現をドライブする。１つ又は複数のプロモーターは構成的プロモーター及び／又は条件的プロモーター及び／又は誘導性プロモーター及び／又は組織特異的プロモーターであってもよい。プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼ、ｐｏｌ Ｉ、ｐｏｌ ＩＩ、ｐｏｌ ＩＩＩ、Ｔ７、Ｕ６、Ｈ１、レトロウイルスラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ジヒドロ葉酸レダクターゼプロモーター、β－アクチンプロモーター、ホスホグリセロールキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、及びＥＦ１αプロモーターからなる群から選択されてもよい。有利なプロモーターは、プロモーターはＵ６である。
本発明の態様は、クラス２ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系に関連する新規エフェクタータンパク質の同定及びエンジニアリングに関する。好ましい実施形態において、このエフェクタータンパク質はシングルサブユニットエフェクターモジュールを含む。更なる実施形態において、エフェクタータンパク質は、インビトロ、インビボ又はエキソビボ適用において原核細胞又は真核細胞で機能する。本発明のある態様は、新規クラス２ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系を予想し、且つその中の構成成分を同定するための計算方法及びアルゴリズムを包含する。
一実施形態において、新規クラス２ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ遺伝子座を同定する計算方法は、以下のステップ：Ｃａｓ１タンパク質をコードする全てのコンティグを検出するステップ；ｃａｓ１遺伝子の２０ｋＢの範囲内、より詳細にはｃａｓ１遺伝子の始端から領域２０ｋｂ及びｃａｓ１遺伝子の終端から２０ｋｂの範囲内にある全ての予測タンパク質コード遺伝子を同定するステップ；同定された遺伝子をＣａｓタンパク質特異的プロファイルと比較してＣＲＩＳＰＲアレイを予測するステップ；５００アミノ酸より大きい（＞５００ａａ）タンパク質を含有する部分的及び／又は未分類の候補ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ遺伝子座を選択するステップ；ＰＳＩ－ＢＬＡＳＴ及びＨＨＰｒｅｄを用いて選択候補を分析し、それにより新規クラス２ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ遺伝子座を単離及び同定するステップを含む。上述のステップに加えて、更なるホモログに関してメタゲノミクスデータベースを検索することによって候補の更なる分析が行われ得る。
一態様において、Ｃａｓ１タンパク質をコードする全てのコンティグを検出するステップは、「ＧｅｎｅＭａｒｋＳ：遺伝子予測のための自己訓練法が微生物ゲノムで始まる。調節領域における配列モチーフの発見への影響（ＧｅｎｅＭａｒｋＳ：ａ ｓｅｌｆ－ｔｒａｉｎｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｅ ｓｔａｒｔｓ ｉｎ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｇｅｎｏｍｅｓ．Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｆｉｎｄｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｍｏｔｉｆｓ ｉｎ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｒｅｇｉｏｎｓ）」Ｊｏｈｎ Ｂｅｓｅｍｅｒ，Ａｌｅｘａｎｄｒｅ Ｌｏｍｓａｄｚｅ ａｎｄ Ｍａｒｋ Ｂｏｒｏｄｏｖｓｋｙ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ （２００１）２９，ｐｐ ２６０７－２６１８（本明細書において参照により援用される）に更に記載されるとおりの遺伝子予測プログラムであるＧｅｎｅｍａｒｋＳによって実施される。
一態様において、全ての予測タンパク質コード遺伝子を同定するステップは、同定された遺伝子をＣａｓタンパク質特異的プロファイルと比較し、古いドメイン及び完全長タンパク質の十分にアノテートされた多重配列アラインメントモデルのコレクションからなるタンパク質アノテーションリソースであるＮＣＢＩ保存ドメインデータベース（ＣＤＤ）に従いそれらをアノテートすることによって行われる。これらは、ＲＰＳ－ＢＬＡＳＴによってタンパク質配列における保存されたドメインを迅速に同定するための位置特異的スコア行列（ＰＳＳＭ）として利用可能である。ＣＤＤの内容には、三次元構造情報を用いてドメイン境界を明示的に定義し、且つ配列／構造／機能の関係について洞察を提供するＮＣＢＩのキュレーションによるドメイン、並びに幾つもの外部ソースのデータベース（Ｐｆａｍ、ＳＭＡＲＴ、ＣＯＧ、ＰＲＫ、ＴＩＧＲＦＡＭ）からインポートされたドメインモデルが含まれる。更なる態様において、ＣＲＩＳＰＲアレイは、「ＰＩＬＥＲ－ＣＲ：ＣＲＩＳＰＲリピートの高速且つ正確な同定（ＰＩＬＥＲ－ＣＲ：ｆａｓｔ ａｎｄ ａｃｃｕｒａｔｅ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＣＲＩＳＰＲ ｒｅｐｅａｔｓ）」，Ｅｄｇａｒ，Ｒ．Ｃ．，ＢＭＣ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，Ｊａｎ ２０；８：１８（２００７）（本明細書において参照により援用される）に記載されるとおりの、ＣＲＩＳＰＲリピートを見つけ出すための公開されているドメインソフトウェアであるＰＩＬＥＲ－ＣＲプログラムを用いて予測した。
更なる態様では、ＰＳＩ－ＢＬＡＳＴ（位置特異的反復的基本局所アラインメント検索ツール）を用いてケース・バイ・ケース分析が実施される。ＰＳＩ－ＢＬＡＳＴは、タンパク質間ＢＬＡＳＴを用いて所与のスコア閾値を上回って検出された配列の多重配列アラインメントから位置特異的スコアリング行列（ＰＳＳＭ）又はプロファイルを導出する。このＰＳＳＭは新規マッチに関するデータベースの更なる検索に用いられ、続いてこれらの新規に検出された配列で反復するためアップデートされる。従って、ＰＳＩ－ＢＬＡＳＴは、タンパク質間の遠縁の関係性を検出する手段を提供する。
別の態様において、ＢＬＡＳＴ又はＰＳＩ－ＢＬＡＳＴと同じように使用し易いと同時に離れたホモログを見つけ出すのにはるかに感受性が高い配列データベース検索及び構造予測方法であるＨＨｐｒｅｄを用いてケース・バイ・ケース分析が実施される。実際に、ＨＨｐｒｅｄの感受性は、現在利用可能な最も強力な構造予測サーバーに匹敵する。ＨＨｐｒｅｄは、プロファイル隠れマルコフモデル（ＨＭＭ）のペアワイズ比較をベースとする最初のサーバーである。最も従来的な配列検索方法はＵｎｉＰｒｏｔ又はＮＲなどの配列データベースを検索するが、ＨＨｐｒｅｄは、Ｐｆａｍ又はＳＭＡＲＴなどのアラインメントデータベースを検索する。これによりヒットのリストが雑然とした単一配列の山でなく、何個かの配列ファミリーへと大幅に単純化される。主要な公的に利用可能なプロファイル及びアラインメントデータベースは全てＨＨｐｒｅｄで利用可能である。ＨＨｐｒｅｄは入力として単一のクエリ配列又は多重アラインメントを受け入れる。ＨＨｐｒｅｄは僅か数分以内にＰＳＩ－ＢＬＡＳＴと同様の読み易いフォーマットで検索結果を返す。検索オプションには、局所又は大域アラインメント及び二次構造類似性のスコアリングが含まれる。ＨＨｐｒｅｄは、ペアワイズのクエリ－鋳型配列アラインメント、合成クエリ－鋳型多重アラインメント（例えば推移的検索のため）、並びにＨＨｐｒｅｄアラインメントからＭＯＤＥＬＬＥＲソフトウェアによって計算される三次元構造モデルを生成することができる。
核酸がＤＮＡ又はＲＮＡであり、及び一部の態様においてＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッド（ｈｙｂｉｒｄ）又はその誘導体もまた指し得る用語「核酸ターゲティング系」は、まとめて、ＤＮＡ又はＲＮＡターゲティングＣＲＩＳＰＲ関連（「Ｃａｓ」）遺伝子の発現に関与するか又はその活性を誘導する転写物及び他のエレメントを指し、この遺伝子は、ＤＮＡ又はＲＮＡターゲティングＣａｓタンパク質をコードする配列及びＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）配列と（全ての系ではないが、一部において）トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）配列とを含むＤＮＡ又はＲＮＡターゲティングガイドＲＮＡ、又はＤＮＡ又はＲＮＡターゲティングＣＲＩＳＰＲ遺伝子座からの他の配列及び転写物を含み得る。一般に、ＲＮＡターゲティング系は、標的ＤＮＡ又はＲＮＡ配列の部位におけるＤＮＡ又はＲＮＡターゲティング複合体の形成を促進するエレメントによって特徴付けられる。ＤＮＡ又はＲＮＡターゲティング複合体の形成の文脈では、「標的配列」は、ＤＮＡ又はＲＮＡターゲティングガイドＲＮＡがそれと相補性を有するように設計されるＤＮＡ又はＲＮＡ配列を指し、ここで標的配列とＲＮＡターゲティングガイドＲＮＡとの間のハイブリダイゼーションが、ＲＮＡターゲティング複合体の形成を促進する。一部の実施形態において、標的配列は細胞の核又は細胞質に位置する。
本発明のある態様において、本願のＲＮＡ－又はＲＮＡターゲティングＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ又はＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系ＲＮＡターゲティング系とも称される新規ＲＮＡターゲティング系は同定されたＶＩ型Ｃａｓタンパク質をベースとし、これは特異的ＲＮＡ配列を標的化するのにカスタマイズしたタンパク質を作成する必要はなく、むしろ単一の酵素をＲＮＡ分子によって特異的ＲＮＡ標的を認識するようにプログラムすることができ、換言すれば前記ＲＮＡ分子を用いて酵素を特異的ＲＮＡ標的に動員することができる。
本発明のある態様において、本願のＤＮＡ－又はＤＮＡターゲティングＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ又はＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系ＲＮＡターゲティング系とも称される新規ＤＮＡターゲティング系は同定されたＶＩ型Ｃａｓタンパク質をベースとし、これは特異的ＲＮＡ配列を標的化するのにカスタマイズしたタンパク質を作成する必要はなく、むしろ単一の酵素をＲＮＡ分子によって特異的ＤＮＡ標的を認識するようにプログラムすることができ、換言すれば前記ＲＮＡ分子を用いて酵素を特異的ＤＮＡ標的に動員することができる。
本明細書に記載される核酸ターゲティング系、ベクター系、ベクター及び組成物は、様々な核酸ターゲティング適用、タンパク質などの遺伝子産物の合成の変化又は改変、核酸切断、核酸編集、核酸のスプライシング；標的核酸の輸送、標的核酸の追跡、標的核酸の単離、標的核酸の可視化等において用いられ得る。
本明細書で使用されるとき、Ｃａｓタンパク質又はＣＲＩＳＰＲ酵素は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系の新規分類に提示されるタンパク質のいずれかを指す。
Ｃ２ｃ２ヌクレアーゼ
クラス２ ＶＩ型エフェクタータンパク質Ｃ２ｃ２は、ｓｓＲＮＡを分解するよう効率的にプログラムすることのできるＲＮＡガイド下ＲＮアーゼである。本発明のＣ２ｃ２エフェクタータンパク質には、限定なしに、以下の２１のオルソログ（ｏｒｔｈｌｏｇ）種（複数のＣＲＩＳＰＲ遺伝子座を含む：レプトトリキア・シャーイイ（Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ ｓｈａｈｉｉ）；レプトトリキア・ウエイデイ（Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ ｗａｄｅｉ）（Ｌｗ２）；リステリア・ゼーリゲリ（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｓｅｅｌｉｇｅｒｉ）；ラクノスピラ科（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ）細菌ＭＡ２０２０；ラクノスピラ科（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ）細菌ＮＫ４Ａ１７９；［クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）］アミノフィルム（ａｍｉｎｏｐｈｉｌｕｍ）ＤＳＭ １０７１０；カルノバクテリウム・ガリナルム（Ｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）ＤＳＭ ４８４７；カルノバクテリウム・ガリナルム（Ｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）ＤＳＭ ４８４７（第２のＣＲＩＳＰＲ遺伝子座）；パルディバクター・プロピオニシゲネス（Ｐａｌｕｄｉｂａｃｔｅｒ ｐｒｏｐｉｏｎｉｃｉｇｅｎｅｓ）ＷＢ４；リステリア・ウェイヘンステファネンシス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｗｅｉｈｅｎｓｔｅｐｈａｎｅｎｓｉｓ）ＦＳＬ Ｒ９－０３１７；リステリア科（Ｌｉｓｔｅｒｉａｃｅａｅ）細菌ＦＳＬ Ｍ６－０６３５；レプトトリキア・ウエイデイ（Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ ｗａｄｅｉ）Ｆ０２７９；ロドバクター・カプスラータス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ）ＳＢ １００３；ロドバクター・カプスラータス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ）Ｒ１２１；ロドバクター・カプスラータス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ）ＤＥ４４２；レプトトリキア・ブッカリス（Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ ｂｕｃｃａｌｉｓ）Ｃ－１０１３－ｂ；ハービニクス・ヘミセルロシリティカ（Ｈｅｒｂｉｎｉｘ ｈｅｍｉｃｅｌｌｕｌｏｓｉｌｙｔｉｃａ）；［ユーバクテリウム（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ）］レクタレ（ｒｅｃｔａｌｅ）；ユーバクテリウム科（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）細菌ＣＨＫＣＩ００４；ブラウティア属種（Ｂｌａｕｔｉａ ｓｐ．）Ｍａｒｓｅｉｌｌｅ－Ｐ２３９８；及びレプトトリキア属種（Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ ｓｐ．）口腔細菌分類群８７９株Ｆ０５５７が含まれる。更なる１２の非限定的な例は、ラクノスピラ科（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ）細菌ＮＫ４Ａ１４４；クロロフレクサス・アグレガンス（Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ ａｇｇｒｅｇａｎｓ）；デメクイナ・アウランティアカ（Ｄｅｍｅｑｕｉｎａ ａｕｒａｎｔｉａｃａ）；タラソスピラ属種（Ｔｈａｌａｓｓｏｓｐｉｒａ ｓｐ．）ＴＳＬ５－１；シュードブチリビブリオ属種（Ｐｓｅｕｄｏｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ ｓｐ．）ＯＲ３７；ブチリビブリオ属種（Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ ｓｐ．）ＹＡＢ３００１；ブラウティア属種（Ｂｌａｕｔｉａ ｓｐ．）Ｍａｒｓｅｉｌｌｅ－Ｐ２３９８；レプトトリキア属種（Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ ｓｐ．）Ｍａｒｓｅｉｌｌｅ－Ｐ３００７；バクテロイデス・イフエ（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｉｈｕａｅ）；ポルフィロモナス科（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ）細菌ＫＨ３ＣＰ３ＲＡ；リステリア・リパリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｒｉｐａｒｉａ）；及びインソリティスピリルム・ペレダリヌム（Ｉｎｓｏｌｉｔｉｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｐｅｒｅｇｒｉｎｕｍ）である。
Ｃ２ｃ２は、その２つのＨＥＰＮドメイン内にある保存された塩基性残基によってＲＮＡ切断を実現する。予測されるＨＥＰＮドメイン触媒残基の（例えばアラニン）置換など、ＨＥＰＮドメインの突然変異を用いてＣ２ｃ２を不活性プログラム可能ＲＮＡ結合タンパク質（ｄＣａｓ９と似た、ｄＣ２ｃ２）に変換することができる。
本発明によれば、複数のＣ２ｃ２オルソログからコンセンサス配列を生成することができ、これは、限定はされないがＣ２ｃ２機能を媒介するＣ２ｃ２オルソログの触媒残基及びＨＥＰＮモチーフを含め、保存アミノ酸残基、及びモチーフの位置を突き止める助けとなり得る。Ｇｅｎｅｉｏｕｓアラインメントを用いて上述の３３個のオルソログから生成された一つのかかるコンセンサス配列は以下である：
Figure 2023134453000001
図４９及び図５０に、それぞれ最初の２１個のオルソログ及び全３３個のオルソログに基づく、上記のオルソログから同定されたＨＥＰＮ配列モチーフを提供する。上記のコンセンサスに基づき触媒的に効力のないＣ２ｃ２突然変異体が生成されるように突然変異させることのできるアミノ酸残基の非限定的な例としては、ＨＥＰＮ１又はその近傍において、Ｄ３７２、Ｒ３７７、Ｑ／Ｈ３８２、及びＦ３８３又はオルソログの対応するアミノ酸、及びＨＥＰＮ２又はその近傍において、Ｋ８９３、Ｎ８９４、Ｒ８９８、Ｎ８９９、Ｈ９０３、Ｆ９０４、Ｙ９０６、Ｙ９２７、Ｄ９２８、Ｋ９３０、Ｋ９３２又はオルソログの対応するアミノ酸が挙げられる。
別の非限定的な例では、コンセンサス配列の生成及び保存残基の同定を補助する配列アラインメントツールはＭＵＳＣＬＥアラインメントツール（ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｍｓａ／ｍｕｓｃｌｅ／）である。例えば、ＭＵＳＣＬＥを使用すると、Ｃ２ｃ２オルソログ間で保存されている以下のアミノ酸位置をレプトトリキア・ウエイデイ（Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ ｗａｄｅｉ）Ｃ２ｃ２において同定することができる：Ｋ２；Ｋ５；Ｖ６；Ｅ３０１；Ｌ３３１；Ｉ３３５；Ｎ３４１；Ｇ３５１；Ｋ３５２；Ｅ３７５；Ｌ３９２；Ｌ３９６；Ｄ４０３；Ｆ４４６；Ｉ４６６；Ｉ４７０；Ｒ４７４（ＨＥＰＮ）；Ｈ４７５；Ｈ４７９（ＨＥＰＮ）、Ｅ５０８；Ｐ５５６；Ｌ５６１；Ｉ５９５；Ｙ５９６；Ｆ６００；Ｙ６６９；Ｉ６７３；Ｆ６８１；Ｌ６８５；Ｙ７６１；Ｌ６７６；Ｌ７７９；Ｙ７８２；Ｌ８３６；Ｄ８４７；Ｙ８６３；Ｌ８６９；Ｉ８７２；Ｋ８７９；Ｉ９３３；Ｌ９５４；Ｉ９５８；Ｒ９６１；Ｙ９６５；Ｅ９７０；Ｒ９７１；Ｄ９７２；Ｒ１０４６（ＨＥＰＮ）、Ｈ１０５１（ＨＥＰＮ）、Ｙ１０７５；Ｄ１０７６；Ｋ１０７８；Ｋ１０８０；Ｉ１０８３；Ｉ１０９０。
図５２Ａ～図５２ＫはＣ２ｃ２オルソログのアラインメントを示す。図５２ＬはＨＥＰＮドメイン及び高度に保存された残基の例示的配列アラインメントを示す。
Ｃ２ｃ２ ＨＥＰＮはまた、ＤＮＡ、又は潜在的にはＤＮＡ及び／又はＲＮＡも標的とし得る。Ｃ２ｃ２のＨＥＰＮドメインが少なくともＲＮＡに結合し、及びその野生型の形態ではＲＮＡを切断する能力を有することに基づけば、Ｃ２ｃ２エフェクタータンパク質がＲＮアーゼ機能を有することが好ましい。更に、又はそれに代えて、ＤＮアーゼ機能を有してもよい。
従って、一部の実施形態において、エフェクタータンパク質はデッドＣａｓ型エフェクタータンパク質などのＲＮＡ結合タンパク質であってもよく、これは任意選択で本明細書に記載されるとおり、例えば転写アクチベーター又はリプレッサードメイン、ＮＬＳ又は他の機能ドメインで機能化されてもよい。一部の実施形態において、エフェクタータンパク質は、ＲＮＡの一本鎖を切断するＲＮＡ結合タンパク質であってもよい。結合するＲＮＡがｓｓＲＮＡである場合、そのｓｓＲＮＡは完全に切断される。一部の実施形態において、エフェクタータンパク質は、例えばそれが２つのＲＮアーゼドメインを含む場合、ＲＮＡの二本鎖を切断するＲＮＡ結合タンパク質であってもよい。結合するＲＮＡがｄｓＲＮＡである場合、そのｄｓＲＮＡは完全に切断される。
ＣＲＩＳＰＲ系におけるＲＮアーゼ機能は公知であり、例えばある種のＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系についてｍＲＮＡターゲティングが報告されており（Ｈａｌｅ ｅｔ ａｌ．，２０１４，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ，ｖｏｌ． ２８，２４３２－２４４３；Ｈａｌｅ ｅｔ ａｌ．，２００９，Ｃｅｌｌ，ｖｏｌ．１３９，９４５－９５６；Ｐｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１５，Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ ｒｅｓｅａｒｃｈ，ｖｏｌ．４３，４０６－４１７）、多大な利点をもたらす。表皮ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ）ＩＩＩ－Ａ型系では、標的にわたる転写が標的ＤＮＡ及びその転写物の切断（ｃｌｅａｖｇｅ）をもたらし、これはＣａｓ１０－Ｃｓｍリボ核タンパク質エフェクター複合体内の独立した活性部位によって媒介される（Ｓａｍａｉ ｅｔ ａｌ．，２０１５，Ｃｅｌｌ，ｖｏｌ．１５１，１１６４－１１７４を参照）。従って、本エフェクタータンパク質によってＲＮＡを標的とするＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系、組成物又は方法が提供される。
標的ＲＮＡ、即ち目的のＲＮＡは、標的ＲＮＡ上の目的の標的部位へのエフェクタータンパク質の動員及び結合につながる本発明によって標的とされるべきＲＮＡである。標的ＲＮＡは任意の好適な形態のＲＮＡであってよい。これには、一部の実施形態では、ｍＲＮＡが含まれ得る。他の実施形態において、標的ＲＮＡにはｔＲＮＡ又はｒＲＮＡが含まれ得る。他の実施形態において、標的ＲＮＡにはｍｉＲＮＡが含まれ得る。他の実施形態において、標的ＲＮＡにはｓｉＲＮＡが含まれ得る。
干渉性ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）及びマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）
他の実施形態において、標的ＲＮＡには、真核生物及び原核生物の両方の干渉性ＲＮＡ、即ちＲＮＡ干渉経路に関与するＲＮＡ、例えばｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡなどが含まれ得る。他の実施形態において、標的ＲＮＡにはマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）が含まれ得る。干渉性ＲＮＡ又はｍｉＲＮＡの制御は、インビボ又はインビトロで干渉性ＲＮＡ又はｍｉＲＮＡの寿命を短縮することによる手法で見られるオフターゲット効果（ＯＴＥ）を低減する助けとなり得る。
特定の実施形態において、標的はｍｉＲＮＡそれ自体でなく、ｍｉＲＮＡ標的のｍｉＲＮＡ結合部位である。
特定の実施形態において、ｍｉＲＮＡは（細胞内で再配置されることを含むなど）隔離されてもよい。特定の実施形態において、ｍｉＲＮＡは限定なしにヘアピンなどで切断されてもよい。
特定の実施形態において、ｍｉＲＮＡプロセシング（代謝回転を含むなど）は増加又は減少する。
エフェクタータンパク質及び好適なガイドが（例えば空間的又は時間的に好適なプロモーター、例えば組織特異的又は細胞周期特異的プロモーター及び／又はエンハンサーの制御下で）選択的に発現するならば、これを用いて細胞又は系を（インビボ又はインビトロで）その細胞におけるＲＮＡｉから「保護」することができるであろう。これは、ＲＮＡｉが必要ない隣接組織又は細胞において、又はエフェクタータンパク質及び好適なガイドが発現する及び発現しない（即ち、それぞれ、ＲＮＡｉが制御されない及びそれが制御される）細胞又は組織を比較する目的で有用であり得る。エフェクタータンパク質を使用して、リボザイム、リボソーム又はリボスイッチなど、ＲＮＡを含む又はそれからなる分子を制御し、又は結合し得る。本発明の実施形態では、ＲＮＡガイドがエフェクタータンパク質をそうした分子に動員することにより、エフェクタータンパク質はそれらに結合することが可能になる。
本発明のタンパク質系は、本願がこの系を情報に基づきエンジニアリングするための基礎を提供するため、本開示から、過度の実験を行うことなく、治療法、アッセイ及び他の適用を含め、ＲＮＡｉ技術の領域において適用することができる（例えば、Ｇｕｉｄｉ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｎｅｇｌ Ｔｒｏｐ Ｄｉｓ ９（５）：ｅ０００３８０１．ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｎｔｄ；Ｃｒｏｔｔｙ ｅｔ ａｌ．，「インビボＲＮＡｉスクリーン：概念と応用（Ｉｎ ｖｉｖｏ ＲＮＡｉ ｓｃｒｅｅｎｓ：ｃｏｎｃｅｐｔｓ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）」．Ｓｈａｎｅ Ｃｒｏｔｔｙ．．．２０１５ Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｌｔｄ．Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｂｙ Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｉｎｃ．，Ｐｅｓｔｉｃｉｄｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ（Ｉｍｐａｃｔ Ｆａｃｔｏｒ：２．０１）．０１／２０１５；１２０．ＤＯＩ：１０．１０１６／ｊ．ｐｅｓｔｂｐ．２０１５．０１．００２及びＭａｋｋｏｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｕｓｅｓ ２０１５，７（４），２０９９－２１２５；ｄｏｉ：１０．３３９０／ｖ７０４２０９９を参照のこと）。
リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）
例えば、アジスロマイシンなどのアザライド系抗生物質は周知である。これは５０Ｓリボソームサブユニットを標的としてそれを破壊する。本エフェクタータンパク質は、５０Ｓリボソームサブユニットを標的とする好適なガイドＲＮＡと共に、一部の実施形態において、５０Ｓリボソームサブユニットに動員されて、それに結合し得る。従って、リボソーム（特に５０ｓリボソームサブユニット）標的に向けられた好適なガイドと合わせた本エフェクタータンパク質が提供される。リボソーム（特に５０ｓリボソームサブユニット）標的に向けられた好適なガイドと合わせたこの使用エフェクタータンパク質の使用には、抗生物質としての使用が含まれ得る。詳細には、抗生物質としての使用は、アジスロマイシンなどのアザライド系抗生物質の働きと類似している。一部の実施形態では、原核生物リボソームサブユニット、例えば原核生物の７０Ｓサブユニット、上述の５０Ｓサブユニット、３０Ｓサブユニット、並びに１６Ｓ及び５Ｓサブユニットが標的とされてもよい。他の実施形態では、真核生物リボソームサブユニット、例えば真核生物の８０Ｓサブユニット、６０Ｓサブユニット、４０Ｓサブユニット、並びに２８Ｓ、１８Ｓ、５．８Ｓ及び５Ｓサブユニットが標的とされてもよい。
一部の実施形態において、エフェクタータンパク質は、本明細書に記載されるとおりの任意選択で機能化されたＲＮＡ結合タンパク質であってもよい。一部の実施形態において、エフェクタータンパク質は、ＲＮＡの一本鎖を切断するＲＮＡ結合タンパク質であってもよい。いずれの場合にも、しかし特にＲＮＡ結合タンパク質がＲＮＡの一本鎖を切断する場合、リボソーム機能が調節されてもよく、詳細にはそれが低減又は破壊されてもよい。これは任意のリボソームＲＮＡ及び任意のリボソームサブユニットに適用されてもよく、ｒＲＮＡの配列は周知である。
従って、リボソーム標的に対する好適なガイドと合わせた本エフェクタータンパク質の使用によるリボソーム活性の制御が想定される。これは、リボソームの切断、又はそれへの結合によってもよい。詳細には、リボソーム活性の低減が想定される。これはリボソーム機能のインビボ又はインビトロアッセイにおいて、また、リボソーム活性に基づく治療をインビボ又はインビトロで制御する手段としても有用であり得る。更に、インビボ系又はインビトロ系におけるタンパク質合成の制御（即ち低減）が想定され、かかる制御には抗生物質としての使用並びに研究及び診断上の使用が含まれる。
リボスイッチ
リボスイッチ（アプタザイム（ａｐｔｏｚｙｍｅ）としても知られる）は、小分子に結合するメッセンジャーＲＮＡ分子の調節性セグメントである。これは典型的には、ｍＲＮＡによってコードされるタンパク質の産生の変化をもたらす。従って、リボスイッチ標的に対する好適なガイドと合わせた本エフェクタータンパク質の使用によるリボスイッチ活性の制御が従って想定される。これは、リボスイッチの切断、又はそれへの結合によってもよい。詳細には、リボスイッチ活性の低減が想定される。これは、リボスイッチ機能のインビボ又はインビトロアッセイにおいて、また、リボスイッチ活性に基づく治療をインビボ又はインビトロで制御する手段としても有用であり得る。更に、インビボ系又はインビトロ系におけるタンパク質合成の制御（即ち低減）が想定される。この制御には、ｒＲＮＡに関する限りは、抗生物質としての使用並びに研究及び診断上の使用が含まれ得る。
リボザイム
リボザイムは、酵素（これは当然ながらタンパク質である）と類似した、触媒特性を有するＲＮＡ分子である。リボザイムは、天然に存在するものも、及びエンジニアリングされたものも、両方ともにＲＮＡを含む、又はそれからなるため、同様に本ＲＮＡ結合エフェクタータンパク質の標的となり得る。一部の実施形態において、エフェクタータンパク質は、リボザイムを切断して、それによりそれを無効にするＲＮＡ結合タンパク質であり得る。従ってリボザイム標的に対する好適なガイドと合わせた本エフェクタータンパク質の使用によるリボザイム活性の制御が想定される。これは、リボザイムの切断、又はそれへの結合によってもよい。詳細には、リボザイム活性の低減が想定される。これは、リボザイム機能のインビボ又はインビトロアッセイにおいて、また、リボザイム活性に基づく治療をインビボ又はインビトロで制御する手段としても有用であり得る。
ＲＮＡプロセシングを含めた遺伝子発現
エフェクタータンパク質はまた、好適なガイドと共に、ＲＮＡプロセシングの制御によることを含めた遺伝子発現のターゲティングに使用されてもよい。ＲＮＡプロセシングの制御には、ＲＮＡｐｏｌのターゲティングによる選択的スプライシングを含めたＲＮＡスプライシング；植物のウイロイド（ｖｉｒｉｏｉｄ）を含め、ウイルス複製（詳細には、サテライトウイルス、バクテリオファージ及びレトロウイルス、例えば、ＨＢＶ、ＨＢＣ及びＨＩＶ並びに本明細書に挙げられる他のウイルスのもの）；及びｔＲＮＡ生合成などのＲＮＡプロセシング反応が含まれ得る。エフェクタータンパク質及び好適なガイドはまた、ＲＮＡ活性化（ＲＮＡａ）の制御に使用されてもよい。ＲＮＡａは遺伝子発現の促進につながり、そのため遺伝子発現の制御はＲＮＡａの破壊又は低減、従って遺伝子発現の促進低下による形で実現し得る。これについては以下で更に詳細に考察する。
ＲＮＡｉスクリーン
ＲＮＡｉスクリーンにより、そのノックダウンが表現型の変化に関連する遺伝子産物を同定して、生物学的経路を調べ及び構成要素を同定することができる。エフェクタータンパク質及び好適なガイドを使用してスクリーンにおけるＲＮＡｉの活性を除去し又は低下させ、ひいては（それまで干渉を受けていた）遺伝子産物の活性を（干渉／抑制を除去し又は低下させることで）回復させることにより、こうしたスクリーンにも、又はスクリーンの間も制御を及ぼし得る。
サテライトＲＮＡ（ｓａｔＲＮＡ）及びサテライトウイルスもまた処理し得る。
ＲＮアーゼ活性に関連する本明細書の制御は、概して、低減、負の破壊又はノックダウン若しくはノックアウトを意味する。
インビボＲＮＡ適用
遺伝子発現の阻害
本明細書に提供される標的特異的ＲＮアーゼは、標的ＲＮＡの極めて特異的な切断が可能である。ＲＮＡレベルでの干渉は、空間的及び時間的の両方の、且つゲノムが改変されないため非侵襲的な方法での調節が可能である。
幾つもの疾患がｍＲＮＡターゲティングによって治療可能であることが実証されている。それらの研究のほとんどはｓｉＲＮＡの投与に関するが、本明細書に提供されるＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質を同じように適用し得ることは明らかである。
ｍＲＮＡ標的（及び対応する疾患治療）の例は、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ－Ｒ１及びＲＴＰ８０１（ＡＭＤ及び／又はＤＭＥの治療に）、カスパーゼ２（Ｎａｉｏｎの治療に）、ＡＤＲＢ２（眼圧の治療に）、ＴＲＰＶＩ（ドライアイ症候群の治療に、Ｓｙｋキナーゼ（喘息の治療に）、Ａｐｏ Ｂ（高コレステロール血症又は低βリポ蛋白血症の治療に）、ＰＬＫ１、ＫＳＰ及びＶＥＧＦ（固形腫瘍の治療に）、Ｂｅｒ－Ａｂｌ（ＣＭＬの治療に）である（Ｂｕｒｎｅｔｔ ａｎｄ Ｒｏｓｓｉ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ．２０１２，１９（１）：６０－７１））。同様に、ＲＮＡターゲティングは、ＨＩＶ（ＨＩＶ Ｔｅｔ及びＲｅｖのターゲティング）、ＲＳＶ（ＲＳＶヌクレオカプシドのターゲティング）及びＨＣＶ（ｍｉＲ－１２２のターゲティング）など、ＲＮＡウイルス媒介性疾患の治療に有効であることが実証されている（Ｂｕｒｎｅｔｔ ａｎｄ Ｒｏｓｓｉ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ．２０１２，１９（１）：６０－７１）。
更に、本発明のＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質を突然変異特異的又はアレル特異的ノックダウンに使用し得ることが想定される。突然変異を含む転写されたｍＲＮＡの配列又はアレル特異的配列を特異的に標的化するガイドＲＮＡを設計することができる。かかる特異的ノックダウンは、突然変異した又はアレル特異的な遺伝子産物に伴う障害に関する治療適用に特に好適である。例えば、家族性低βリポ蛋白血症（ＦＨＢＬ）のほとんどの症例はＡｐｏＢ遺伝子の突然変異によって引き起こされる。この遺伝子は２つのバージョンのアポリポタンパク質Ｂタンパク質：短いバージョン（ＡｐｏＢ－４８）及びより長いバージョン（ＡｐｏＢ－１００）をコードする。ＦＨＢＬにつながる幾つかのＡｐｏＢ遺伝子突然変異は、両方のバージョンのＡｐｏＢを異常に短くする。突然変異したＡｐｏＢ ｍＲＮＡ転写物を本発明のＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質で特異的にターゲティング及びノックダウンすることは、ＦＨＢＬの治療において有益であり得る。別の例として、ハンチントン病（ＨＤ）は、ハンチンチンタンパク質をコードする遺伝子のＣＡＧトリプレットリピートの伸長により異常なタンパク質が生じて引き起こされる。ハンチンチンタンパク質をコードする突然変異した又はアレル特異的なｍＲＮＡ転写物を本発明のＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質で特異的にターゲティング及びノックダウンすることは、ＨＤの治療において有益であり得る。
これに関連して、及びより一般的に本明細書に記載されるとおりの様々な適用について、スプリットバージョンのＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質の使用を想定し得ることが注記される。実際、これは特異性の増加を可能にし得るのみならず、送達にも有利であり得る。Ｃ２ｃ２は、Ｃ２ｃ２酵素の２つのパートが実質的に機能性Ｃ２ｃ２をなすという意味でスプリットである。理想的には、スプリットは常に１つ又は複数の触媒ドメインが影響を受けないようなものでなければならない。このＣ２ｃ２はヌクレアーゼとして機能してもよく、又はそれは、典型的にはその触媒ドメインの１つ又は複数の突然変異に起因して、本質的に触媒活性をほぼ又は全く持たないＲＮＡ結合タンパク質であるデッドＣ２ｃ２であってもよい。
スプリットＣ２ｃ２の各半分は二量化パートナーに融合されてもよい。例として、及び限定ではなく、ラパマイシン感受性二量化ドメインを用いると、Ｃ２ｃ２活性を時間的に制御するための化学的に誘導可能なスプリットＣ２ｃ２の作成が可能となる。従ってＣ２ｃ２は２つの断片に分割することにより化学的に誘導可能にすることができ、このラパマイシン感受性二量化ドメインを使用してＣ２ｃ２を制御された形で再アセンブルし得る。スプリットＣ２ｃ２の２つのパートは、スプリットＣ２ｃ２のＮ’末端パート及びＣ’末端パートと考えることができる。この融合は、典型的にはＣ２ｃ２のスプリット点である。換言すれば、スプリットＣ２ｃ２のＮ’末端パートのＣ’末端が二量体半体のうちの一方に融合し、一方でＣ’末端パートのＮ’末端が他方の二量体半体に融合する。
Ｃ２ｃ２は、切断点が新しく作り出されるという意味で分割される必要はない。スプリット点は典型的にはインシリコで設計され、構築物にクローニングされる。一緒になって、スプリットＣ２ｃ２の２つのパート、Ｎ’末端パート及びＣ’末端パートは、好ましくは野生型アミノ酸（又はそれをコードするヌクレオチド）の少なくとも７０％以上、好ましくは野生型アミノ酸（又はそれをコードするヌクレオチド）の少なくとも８０％以上、好ましくは少なくとも９０％以上、好ましくは少なくとも９５％以上、及び最も好ましくは少なくとも９９％以上を含む完全なＣ２ｃ２を形成する。何らかのトリミングがある可能性があってもよく、突然変異体が想定される。非機能性ドメインは完全に除去されてもよい。重要な点は、２つのパートが一体にされ得ること、及び所望のＣ２ｃ２機能が回復し又は元に戻ることである。二量体はホモ二量体又はヘテロ二量体であってもよい。
特定の実施形態において、本明細書に記載されるとおりのＣ２ｃ２エフェクターは、突然変異特異的、又はアレル特異的ノックダウンなど、突然変異特異的、又はアレル特異的ターゲティングに用いられ得る。
ＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質は、更に、相乗作用してＲＮアーゼ活性を増加させる、又はメッセージの更なる分解を確実にする、非特異的ＲＮアーゼ又はアルゴノート２などの別の機能性ＲＮア－ゼドメインに融合することができる。
ＲＮＡ機能の調節による遺伝子発現の調節
ｍＲＮＡの切断による遺伝子発現への直接的な効果は別として、ＲＮＡターゲティングはまた、細胞内でのＲＮＡプロセシングの特定の側面に影響を与えるためにも使用することができ、これにより遺伝子発現をより繊細に調節することが可能となり得る。概して調節は、例えばタンパク質の結合を遮断したり、又はＲＮＡ結合タンパク質を動員したりするなど、例えばＲＮＡへのタンパク質の結合に干渉することにより媒介され得る。実際、調節は、ｍＲＮＡのスプライシング、輸送、局在、翻訳及び代謝回転など、種々のレベルで確実とし得る。治療のコンテクストでも同様に、ＲＮＡ特異的ターゲティング分子を使用することにより、これらのレベルの各々において（病原性の）機能不全に対処することが想定され得る。これらの実施形態では、多くの場合に、ＲＮＡターゲティングタンパク質が、本明細書に記載される突然変異型のｃ２ｃ２など、ＲＮＡ標的を切断する能力を失った、しかしそれに結合するその能力は維持している「デッド」Ｃ２ｃ２であることが好ましい。
Ａ）選択的スプライシング
ヒト遺伝子は多くが選択的スプライシングの結果として複数のｍＲＮＡを発現する。種々の疾患が、発現した遺伝子の機能喪失又は機能獲得につながる異常なスプライシングに関係することが示されている。こうした疾患には、スプライシング欠損を引き起こす突然変異によって引き起こされるものもあるが、そうでないものも多数ある。一つの治療選択肢は、スプライシング機構を直接標的化することである。本明細書に記載されるＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質は、例えば、スライシング（ｓｌｉｃｉｎｇ）の遮断又は促進、エクソンのインクルージョン又はエクスクルージョン及び特異的アイソフォームの発現への影響付与、及び／又は代替的タンパク質産物の発現の刺激に使用することができる。かかる適用について、以下に更に詳細に記載する。
ＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質が標的ＲＮＡに結合すると、ＲＮＡ配列へのスプライシング因子の接近を立体的に遮断することができる。スプライス部位を標的とするＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質は、その部位でスプライシングを遮断し、任意選択でスプライシングを隣接する部位に向け直し得る。例えば５’スプライス部位に結合するＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質の結合は、スプライソソームのＵ１成分の動員を遮断することができ、当該エクソンのスキッピングに有利である。或いは、スプライシングエンハンサー又はサイレンサーを標的とするＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質は、標的部位におけるトランス作用性調節性スプライシング因子の結合を妨げ、スプライシングを有効に遮断又は促進することができる。更に、本明細書に記載されるとおりのＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質によってＩＬＦ２／３を前駆ｍＲＮＡのエクソン近傍に動員することにより、エクソンエクスクルージョンを実現することができる。更に別の例として、ｈｎＲＮＰ Ａ１の動員及びエクソンエクスクルージョンのため、グリシンリッチドメインを付加することができる（Ｄｅｌ Ｇａｔｔｏ－Ｋｏｎｃｚａｋ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１９９９ Ｊａｎ；１９（１）：２５１－６０）。
特定の実施形態において、ｇＲＮＡの適切な選択により、特定のスプライス変異体が標的化され得る一方で他のスプライス変異体は標的化されないことになる。
ある場合には、ＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質を使用して、スライシング（ｓｌｉｃｉｎｇ）を促進することができる（例えばスプライシングが欠損している場合）。例えば、更なるスプライシングのため、ＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質をスプライシング調節性ステム－ループの安定化能のあるエフェクターに会合させることができる。ＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質を特定のスプライシング因子のコンセンサス結合部位配列に連結すると、タンパク質を標的ＤＮＡに動員することができる。
異常なスプライシングと関連付けられている疾患の例としては、限定はされないが、シナプスで機能するタンパク質のスプライシングを調節するＮｏｖａタンパク質の喪失によって起こる傍腫瘍性眼球クローヌス・ミオクローヌス運動失調（又はＰＯＭＡ）、及び非機能性クロライドチャネルの産生をもたらす、嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子のスプライシング欠損によって引き起こされる嚢胞性線維症が挙げられる。他の疾患では、異常なＲＮＡスプライシングは機能獲得をもたらす。これには、例えば、スプライシング欠損を生じさせるｍＲＮＡの３’ＵＴＲにおけるＣＵＧトリプレットリピート伸長（５０～＞１５００リピート）によって引き起こされる筋強直性ジストロフィーが該当する。
ＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質を使用して、スプライシング因子（Ｕ１など）を５’スプライシング部位に動員して所望のエクソンの周りにあるイントロンの切出しを促進することにより、エクソンを除外することができる。かかる動員は、スプライシングアクチベーターとして機能するアルギニン／セリンリッチドメインとの融合によって媒介される可能性がある（Ｇｒａｖｅｌｙ ＢＲ ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ Ｔ，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ．１９９８（５）：７６５－７１）。
ＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質を使用して所望の遺伝子座におけるスプライシング機構を遮断し、それによりエクソン認識及び別のタンパク質産物の発現を妨げ得ることが想定される。治療し得る障害の例は、ジストロフィンタンパク質をコードする遺伝子の突然変異によって引き起こされるデュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）である。ほぼ全てのＤＭＤ突然変異がフレームシフトにつながり、ジストロフィン翻訳が障害されることになる。ＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質をスプライスジャンクション又はエクソンスプライシングエンハンサー（ＥＳＥ）と組み合わせて、それによってエクソン認識を妨げることにより、部分的に機能性のタンパク質の翻訳をもたらすことができる。これは致死性デュシェンヌ表現型を重篤度の低いベッカー表現型に変換する。
Ｂ）ＲＮＡ改変
ＲＮＡ編集は、ＲＮＡの小さい改変によって所与の配列の遺伝子産物の多様性が増加する自然の過程である。典型的には、この改変には、そのゲノムによってコードされるものと異なるＲＮＡ配列をもたらすアデノシン（Ａ）からイノシン（Ｉ）への変換が関わる。ＲＮＡ改変は、概してＡＤＡＲ酵素によって確実となり、これによればｐｒｅ－ＲＮＡ標的が、編集されるアデノシンを含むエクソンとイントロン非コードエレメントとの間の塩基対合によって不完全な二重鎖ＲＮＡを形成する。Ａ－Ｉ編集の古典的な例はグルタミン酸受容体ＧｌｕＲ－Ｂ ｍＲＮＡであり、これによればこの変化によってチャネルのコンダクタンス特性が改変されることになる（Ｈｉｇｕｃｈｉ Ｍ，ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ．１９９３；７５：１３６１－７０）。
本発明によれば、酵素的手法を用いて所与の転写物のＲＮＡ塩基における転移（Ａ⇔Ｇ又はＣ⇔Ｕの変化）又は転換（任意のプリン（ｐｕｒｉｎｇ）から任意のピリミジン、又はその逆）が誘導される。転移は、それぞれＡをＩに、又はＣをＵに変換する、アデニン（ａｄｅｎｉｎｇ）（ＡＤＡＲ１／２）、ＡＰＯＢＥＣ）又はシトシンデアミナーゼ（ＡＩＤ）を使用して直接誘導することができる。転換は、目的の塩基に活性酸素種の損傷を局在させて、それによりグアニンからオキソグアニンへの変換など、影響を受けた塩基に化学修飾が加わることにより間接的に誘導することができる。オキソグアニン（ｏｘｏ－ｇａｕｎｉｎｅ）はＴとして認識され、従ってアデニンと塩基対合して翻訳に影響を生じさせることになる。ＲＯＳ媒介性塩基損傷のために動員され得るタンパク質としては、ＡＰＥＸ及びｍｉｎｉ－ＳＯＧが挙げられる。両方の手法とも、これらのエフェクターを触媒不活性Ｃ２ｃ２に融合し、それらのタイプの突然変異が所望される転写物上の部位に動員することができる。
ヒトでは、ＡＤＡＲ１遺伝子におけるヘテロ接合機能的ヌル突然変異は皮膚疾患、ヒト色素性遺伝性皮膚症につながる（Ｍｉｙａｍｕｒａ Ｙ， ｅｔ ａｌ．Ａｍ Ｊ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ．２００３；７３：６９３－９）。本発明のＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質を使用して機能不全のＲＮＡ改変を修正し得ることが想定される。
更に、ＲＮＡアデノシンメチラーゼ（Ｎ（６）－メチルアデノシン）を本発明のＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質に融合して目的の転写物に標的化し得ることが想定される。このメチラーゼは可逆的なメチル化を引き起こし、調節的役割を有し、及び複数のＲＮＡ関連細胞経路を調節することにより遺伝子発現及び細胞運命決定に影響を及ぼし得る（Ｆｕ ｅｔ ａｌ Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｇｅｎｅｔ．２０１４；１５（５）：２９３－３０６）。
Ｃ）ポリアデニル化
ｍＲＮＡのポリアデニル化はｍＲＮＡの核輸送、翻訳効率及び安定性に重要であり、これらの全てが、並びにポリアデニル化の過程もまた、特定のＲＢＰに依存する。多くの真核生物ｍＲＮＡは転写後に約２００ヌクレオチドの３’ポリ（Ａ）テールを受け取る。ポリアデニル化には、ポリ（Ａ）ポリメラーゼの活性を刺激する種々のＲＮＡ結合タンパク質複合体が関わる（Ｍｉｎｖｉｅｌｌｅ－Ｓｅｂａｓｔｉａ Ｌ ｅｔ ａｌ．Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１９９９；１１：３５２－７）。本明細書に提供されるＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質を使用してＲＮＡ結合タンパク質とＲＮＡとの間の相互作用に干渉し、又はそれを促進し得ることが想定される。
ポリアデニル化に関わる欠陥タンパク質と関係付けられている疾患の例は、眼咽頭型筋ジストロフィー（ＯＰＭＤ）である（Ｂｒａｉｓ Ｂ，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ．１９９８；１８：１６４－７）。
Ｄ）ＲＮＡ核外輸送
ｐｒｅ－ｍＲＮＡプロセシング後、ｍＲＮＡは核から細胞質に輸送される。これは、キャリア複合体の生成を含む細胞機構によって確実となり、キャリア複合体は次に核膜孔を通って移動し、細胞質でｍＲＮＡを放出し、続いてキャリアは再利用される。
ＲＮＡの核外輸送において役割を果たすタンパク質（ＴＡＰなど）の過剰発現は、アフリカツメガエルにおいて本来非効率的に（ｉｎｅｆｆｅｃｉｅｎｔｌｙ）核外輸送される転写物の核外輸送を増加させることが分かっている（Ｋａｔａｈｉｒａ Ｊ， ｅｔ ａｌ．ＥＭＢＯ Ｊ．１９９９；１８：２５９３－６０９）。
Ｅ）ｍＲＮＡ局在
ｍＲＮＡ局在は、空間的に調節されたタンパク質産生を確実にする。細胞の特定の領域への転写物の局在は、局在化エレメントによって確実となり得る。詳細な実施形態において、本明細書に記載されるエフェクタータンパク質を使用して局在化エレメントを目的のＲＮＡに標的化し得ることが想定される。エフェクタータンパク質は、標的転写物に結合して、それをそのペプチドシグナルタグによって決まる細胞内の位置にシャトル輸送するように設計することができる。例えばより詳細には、１つ以上の核局在化シグナル（ＮＬＳ）及び／又は１つ以上の核外移行シグナル（ＮＥＳ）に融合したＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質を使用してＲＮＡの局在性を変化させることができる。
局在化シグナルの更なる例としては、幾つかの非対称細胞型における細胞質へのβ－アクチンの局在を確実にするジップコード結合タンパク質（ＺＢＰ１）、ＫＤＥＬ保持配列（小胞体への局在化）、核外移行シグナル（細胞質への局在化）、ミトコンドリア標的シグナル（ミトコンドリアへの局在化）、ペルオキシソーム標的シグナル（ペルオキシソームへの局在化）及びｍ６Ａ標識／ＹＴＨＤＦ２（ｐボディへの局在化）が挙げられる。想定される他の手法は、ＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質と既知の局在（例えば、膜、シナプス）のタンパク質の融合である。
或いは、本発明に係るエフェクタータンパク質は、例えば局在依存性ノックダウンに使用してもよい。エフェクタータンパク質を適切な局在化シグナルと融合することにより、エフェクターが特定の細胞内区画に標的化される。この区画にある標的ＲＮＡのみが有効に標的化されることになり、一方、他の同一の、しかし別の細胞内区画にある標的は標的化されず、従って局在依存性ノックダウンを成立させることができる。
Ｆ）翻訳
本明細書に記載されるＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質を使用して翻訳を増進させる又は抑制することができる。翻訳の上方制御は細胞回路を制御する極めてロバストな方法であることが想定される。更に、機能研究には、転写物の上方制御がタンパク質産生の増加につながらないという欠点がある転写上方制御スクリーンと比べてタンパク質翻訳スクリーンが有利であり得る。
本明細書に記載されるＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質を使用してＥＩＦ４Ｇなどの翻訳開始因子を目的のメッセンジャーＲＮＡの５’非翻訳リピート（５’ＵＴＲ）の近傍に持っていき、翻訳をドライブし得ることが想定される（非再プログラム可能ＲＮＡ結合タンパク質についてＤｅ Ｇｒｅｇｏｒｉｏ ｅｔ ａｌ．ＥＭＢＯ Ｊ．１９９９；１８（１７）：４８６５－７４に記載されるとおり）。別の例として、細胞質ポリ（Ａ）ポリメラーゼのＧＬＤ２をＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質によって標的ｍＲＮＡに動員することができる。これによれば、標的ｍＲＮＡの指向性のポリアデニル化と、それによる翻訳の刺激が可能となり得る。
同様に、本明細書において想定されるＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質を使用して、ＺＢＰ１など、ｍＲＮＡの翻訳リプレッサーを遮断することができる（Ｈｕｔｔｅｌｍａｉｅｒ Ｓ，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ．２００５；４３８：５１２－５）。標的ＲＮＡの翻訳開始部位への結合により、翻訳が直接影響を受け得る。
加えて、ＲＮアーゼ阻害薬など、ｍＲＮＡを例えばその分解の防止によって安定化させるタンパク質にＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質を融合すると、目的の転写物からのタンパク質産生を増加させることが可能である。
本明細書に記載されるＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質を使用して、ＲＮＡ転写物の５ＵＴＲ領域に結合し、且つリボソームの形成及び翻訳開始を妨げることにより翻訳を抑制し得ることが想定される。
更に、ＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質を使用してＣＣＲ４－ＮＯＴデアデニラーゼ複合体の一成分であるＣａｆ１を標的ｍＲＮＡに動員することにより、標的転写物の脱アデニル化及びタンパク質翻訳の阻害をもたらすことができる。
例えば、本発明のＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質を使用して、治療的に関連性のあるタンパク質の翻訳を増加又は減少させることができる。ＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質を使用して翻訳を下方制御又は上方制御し得る治療適用の例は、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）及び心血管障害である。ＡＬＳ運動皮質及び脊髄ではグリアグルタミン酸トランスポーターＥＡＡＴ２レベルの低下が報告されているとともに、ＡＬＳ脳組織でも複数の異常なＥＡＡＴ２ ｍＲＮＡ転写物が報告されている。ＥＡＡＴ２タンパク質及び機能の喪失は、ＡＬＳにおける興奮毒性の主な原因であると考えられている。ＥＡＡＴ２タンパク質レベル及び機能の回復は治療利益をもたらし得る。従って、ＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質を例えば上記に記載したとおりの翻訳リプレッサーの遮断又はｍＲＮＡの安定化によるＥＡＡＴ２タンパク質の発現の上方制御に有益に使用することができる。アポリポタンパク質Ａ１は高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）の主要なタンパク質成分であり、ＡｐｏＡ１及びＨＤＬは概してアテローム形成抑制性であると考えられる。ＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質を例えば上記に記載したとおりの翻訳リプレッサーの遮断又はｍＲＮＡの安定化によるＡｐｏＡ１の発現の上方制御に有益に使用し得ることが想定される。
Ｇ）ｍＲＮＡ代謝回転
翻訳はｍＲＮＡ代謝回転及び調節性ｍＲＮＡ安定性と密接に結び付いている。転写物の安定性には特異的タンパク質が関わることが記載されている（ニューロンにおけるＥＬＡＶ／Ｈｕタンパク質、Ｋｅｅｎｅ ＪＤ，１９９９，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．９６：５－７）及びトリステトラプロリン（ＴＴＰ）など。これらのタンパク質は、細胞質におけるメッセージの分解を保護することにより標的ｍＲＮＡを安定化させる（Ｐｅｎｇ ＳＳ ｅｔ ａｌ．，１９８８，ＥＭＢＯ Ｊ．１７：３４６１－７０）。
本発明のＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質を使用して、ｍＲＮＡ代謝回転が影響を受けるように、ｍＲＮＡ転写物を安定化させる働きをするタンパク質の活性に干渉し得る、又はそれを促進し得ることが想定され得る。例えば、ＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質を使用してヒトＴＴＰを標的ＲＮＡに動員すれば、アデニル酸－ウリジル酸リッチエレメント（ＡＵリッチエレメント）媒介性翻訳抑制及び標的分解が可能となり得る。ＡＵリッチエレメントは、癌原遺伝子をコードする多くのｍＲＮＡの３’ＵＴＲ、核内転写因子、及びサイトカインに見られ、ＲＮＡ安定性を促進する。別の例として、ＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質を、別のｍＲＮＡ安定化タンパク質であるＨｕＲ（Ｈｉｎｍａｎ ＭＮ ａｎｄ Ｌｏｕ Ｈ，Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ ２００８；６５：３１６８－８１）に融合してそれを標的転写物に動員することにより、その寿命を延ばし、又は短命なｍＲＮＡを安定化させることができる。
更に、本明細書に記載されるＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質を使用して標的転写物の分解を促進し得ることが想定される。例えば、ｍ６Ａメチルトランスフェラーゼを標的転写物に動員して転写物をＰボディに局在させることにより、標的の分解をもたらすことができる。
更に別の例として、本明細書に記載されるとおりのＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質を非特異的エンドヌクレアーゼドメインＰｉｌＴ Ｎ末端（ＰＩＮ）に融合することにより、それを標的転写物に動員し、及びその分解を可能にすることができる。
傍腫瘍性神経障害（ＰＮＤ）関連脳脊髄炎及びニューロパチーの患者は、中枢神経系外の腫瘍におけるＨｕタンパク質に対する自己抗体を生成し（Ｓｚａｂｏ Ａ ｅｔ ａｌ．１９９１，Ｃｅｌｌ．；６７：３２５－３３、それが次には血液脳関門を通過する患者である。本発明のＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質を使用してｍＲＮＡ転写物への自己抗体の結合に干渉し得ることが想定され得る。
筋強直性ジストロフィープロテインキナーゼ（ＤＭＰＫ）遺伝子の３’ＵＴＲにおける（ＣＵＧ）ｎの伸長によって引き起こされるジストロフィー１型（ＤＭ１）の患者は、核内へのかかる転写物の蓄積によって特徴付けられる。（ＣＵＧ）ｎリピートを標的とするエンドヌクレアーゼと融合した本発明のＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質であれば、かかる異常な転写物の蓄積を阻害し得ることが想定される。
Ｈ）多機能タンパク質との相互作用
一部のＲＮＡ結合タンパク質は数多くのＲＮＡ上の複数の部位に結合して多様な過程で機能する。例えば、ｈｎＲＮＰ Ａ１タンパク質は、エクソンスプライシングサイレンサー配列に結合してスプライシング因子をアンタゴナイズし、テロメア末端に会合し（それによりテロメア活性を刺激する）、及びｍｉＲＮＡに結合してドローシャ媒介性プロセシングを促進し、それにより成熟に影響を及ぼすことが分かっている。本発明のＲＮＡ結合エフェクタータンパク質が１つ以上の位置でＲＮＡ結合タンパク質の結合に干渉し得ることが想定される。
Ｉ）ＲＮＡフォールディング
ＲＮＡは、その生物学的活性を発揮するため、定義付けられた構造をとる。代替的三次構造間でのコンホメーションの移行は多くのＲＮＡ媒介性プロセスに決定的に重要である。しかしながら、ＲＮＡフォールディングは幾つかの問題に関連し得る。例えば、ＲＮＡは不適切な代替的コンホメーションへと折り畳まれて、それに維持される傾向があることもあり、及び／又は正しい三次構造が代替的構造と比べて十分に熱力学的に好ましいとはいえないこともある。本発明のＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質、詳細には切断欠損又はデッドＲＮＡターゲティングタンパク質を使用して（ｍ）ＲＮＡのフォールディングを仕向け、及び／又はその正しい三次構造を確保し得る。
細胞状態の調節におけるＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質の使用
特定の実施形態において、ｃｒＲＮＡと複合体化したＣ２ｃ２は標的ＲＮＡへの結合時に活性化され、続いて任意の近接したｓｓＲＮＡ標的を切断する（即ち「コラテラル」又は「バイスタンダー」効果）。Ｃ２ｃ２は、ひとたびコグネイト標的によってプライミングされると、他の（非相補的な）ＲＮＡ分子を切断することができる。このような無差別的なＲＮＡ切断は潜在的に細胞毒性を引き起こし、又はその他、細胞生理若しくは細胞状態に影響を及ぼす可能性がある。
従って、特定の実施形態において、本明細書に記載されるとおりの天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物、ベクター系、又は送達系は、細胞の休眠の誘導に使用され、又はそれにおける使用のためのものである。特定の実施形態において、本明細書に記載されるとおりの天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物、ベクター系、又は送達系は、細胞周期停止の誘導に使用され、又はそれにおける使用のためのものである。特定の実施形態において、本明細書に記載されるとおりの天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物、ベクター系、又は送達系は、細胞成長及び／又は細胞増殖の低減に使用され、又はそれにおける使用のためのものである。特定の実施形態において、本明細書に記載されるとおりの天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物、ベクター系、又は送達系は、細胞アネルギーの誘導に使用され、又はそれにおける使用のためのものである。特定の実施形態において、本明細書に記載されるとおりの天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物、ベクター系、又は送達系は、細胞アポトーシスの誘導に使用され、又はそれにおける使用のためのものである。特定の実施形態において、本明細書に記載されるとおりの天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物、ベクター系、又は送達系は、細胞壊死の誘導に使用され、又はそれにおける使用のためのものである。特定の実施形態において、本明細書に記載されるとおりの天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物、ベクター系、又は送達系は、細胞死の誘導に使用され、又はそれにおける使用のためのものである。特定の実施形態において、本明細書に記載されるとおりの天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物、ベクター系、又は送達系は、プログラム細胞死の誘導に使用され、又はそれにおける使用のためのものである。
特定の実施形態において、本発明は、本明細書に記載されるとおりの天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物、ベクター系、又は送達系を導入又は誘導することを含む、細胞の休眠の誘導方法に関する。特定の実施形態において、本発明は、本明細書に記載されるとおりの天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物、ベクター系、又は送達系を導入又は誘導することを含む、細胞周期停止の誘導方法に関する。特定の実施形態において、本発明は、本明細書に記載されるとおりの天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物、ベクター系、又は送達系を導入又は誘導することを含む、細胞成長及び／又は細胞増殖の低減方法に関する。特定の実施形態において、本発明は、本明細書に記載されるとおりの天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物、ベクター系、又は送達系を導入又は誘導することを含む、細胞アネルギーの誘導方法に関する。特定の実施形態において、本発明は、本明細書に記載されるとおりの天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物、ベクター系、又は送達系を導入又は誘導することを含む、細胞アポトーシスの誘導方法に関する。特定の実施形態において、本発明は、本明細書に記載されるとおりの天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物、ベクター系、又は送達系を導入又は誘導することを含む、細胞壊死の誘導方法に関する。特定の実施形態において、本発明は、本明細書に記載されるとおりの天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物、ベクター系、又は送達系を導入又は誘導することを含む、細胞死の誘導方法に関する。特定の実施形態において、本発明は、本明細書に記載されるとおりの天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物、ベクター系、又は送達系を導入又は誘導することを含む、プログラム細胞死の誘導方法に関する。
本明細書に記載されるとおりの方法及び使用は治療的又は予防的であってもよく、特定の細胞、細胞（部分）集団、又は細胞型／組織型を標的とし得る。詳細には、本明細書に記載されるとおりの方法及び使用は治療的又は予防的であってもよく、１つ以上の標的配列、例えば１つ以上の特定の標的ＲＮＡ（例えばｓｓＲＮＡ）を発現する特定の細胞、細胞（部分）集団、又は細胞型／組織型を標的とし得る。限定なしに、標的細胞は、例えば、特定の転写物を発現する癌細胞、例えば所与のクラスのニューロン、例えば自己免疫を引き起こす（免疫）細胞、又は特異的な（例えばウイルス性の）病原体に感染した細胞等であってもよい。
従って、特定の実施形態において、本発明は、本明細書に記載されるとおりの天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物、ベクター系、又は送達系を導入又は誘導することを含む、望ましくない（ｕｎｄｅｒｓｉｒａｂｌｅ）細胞（宿主細胞）の存在によって特徴付けられる病的状態を治療する方法に関する。特定の実施形態において、本発明は、望ましくない（ｕｎｄｅｒｓｉｒａｂｌｅ）細胞（宿主細胞）の存在によって特徴付けられる病的状態を治療するための、本明細書に記載されるとおりの天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物、ベクター系、又は送達系の使用に関する。特定の実施形態において、本発明は、望ましくない（ｕｎｄｅｒｓｉｒａｂｌｅ）細胞（宿主細胞）の存在によって特徴付けられる病的状態の治療における使用のための、本明細書に記載されるとおりの天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物、ベクター系、又は送達系に関する。好ましくはＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系は、望ましくない細胞に特異的な標的を標的とすることが理解されるべきである。特定の実施形態において、本発明は、癌を治療、予防、又は軽減するための、本明細書に記載されるとおりの天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物、ベクター系、又は送達系の使用に関する。特定の実施形態において、本発明は、癌の治療、予防、又は軽減における使用のための、本明細書に記載されるとおりの天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物、ベクター系、又は送達系に関する。特定の実施形態において、本発明は、本明細書に記載されるとおりの天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物、ベクター系、又は送達系を導入又は誘導することを含む、癌を治療、予防、又は軽減する方法に関する。好ましくはＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系は、癌細胞に特異的な標的を標的とすることが理解されるべきである。特定の実施形態において、本発明は、病原体による細胞の感染を治療、予防、又は軽減するための、本明細書に記載されるとおりの天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物、ベクター系、又は送達系の使用に関する。特定の実施形態において、本発明は、病原体による細胞の感染の治療、予防、又は軽減における使用のための、本明細書に記載されるとおりの天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物、ベクター系、又は送達系に関する。特定の実施形態において、本発明は、本明細書に記載されるとおりの天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物、ベクター系、又は送達系を導入又は誘導することを含む、病原体による細胞の感染を治療、予防、又は軽減する方法に関する。好ましくはＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系は、病原体に感染した細胞に特異的な標的（例えば病原体由来の標的）を標的とすることが理解されるべきである。特定の実施形態において、本発明は、自己免疫障害を治療、予防、又は軽減するための、本明細書に記載されるとおりの天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物、ベクター系、又は送達系の使用に関する。特定の実施形態において、本発明は、自己免疫障害の治療、予防、又は軽減における使用のための、本明細書に記載されるとおりの天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物、ベクター系、又は送達系に関する。特定の実施形態において、本発明は、本明細書に記載されるとおりの天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物、ベクター系、又は送達系を導入又は誘導することを含む、自己免疫障害を治療、予防、又は軽減する方法に関する。好ましくはＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系は、自己免疫障害に関与する細胞に特異的な標的（例えば特異的免疫細胞）を標的とすることが理解されるべきである。
ＲＮＡ検出又はタンパク質検出におけるＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質の使用
更に、ＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質を生体試料中の核酸又はタンパク質の検出に使用し得ることが想定される。試料は細胞又は無細胞であってもよい。
ノーザンブロットアッセイにおいて。ノーザンブロッティングには、電気泳動を用いたＲＮＡ試料のサイズによる分離が関わる。ＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質を使用して標的ＲＮＡ配列を特異的に結合し、検出することができる。
ＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質はまた、蛍光タンパク質（ＧＦＰなど）に融合して、生細胞におけるＲＮＡ局在の追跡に使用することもできる。より詳細には、ＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質は、それがもはやＲＮＡを切断しない点で不活性化することができる。詳細な実施形態では、より精密な可視化を確保するため、スプリットＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質を使用し得ることが想定され、これによればシグナルが両方のサブタンパク質の結合に依存する。或いは、複数のＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質複合体が標的転写物に結合すると再構成されるスプリット蛍光タンパク質を使用することができる。更に、転写物がｍＲＮＡに沿った複数の結合部位で標的とされ、そのため蛍光シグナルが真のシグナルを増幅して限局的な識別を可能にし得ることが想定される。更に別の代替例として、蛍光タンパク質がスプリットインテインから再構成されてもよい。
ＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質は、例えば、ＲＮＡ又は特異的スプライス変異体の局在、ｍＲＮＡ転写物のレベル、転写物の上方又は下方制御及び疾患特異的診断の決定に好適に使用される。ＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質は、例えば蛍光顕微鏡法又はフローサイトメトリー、例えば、細胞のハイスループットスクリーニング及び細胞選別後の生細胞の回収を可能にする蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）などを用いた（生）細胞におけるＲＮＡの可視化に使用することができる。更に、種々の転写物の発現レベルをストレス下、例えば分子阻害薬又は細胞に対する低酸素条件を用いた癌成長の阻害下で同時に評価することができる。別の適用は、２つの光子顕微鏡を用いて神経刺激中のシナプス結合への転写物の局在を追跡することであり得る。
特定の実施形態において、本明細書に記載されるとおりの本発明に係る成分又は複合体は、例えば（蛍光）標識したＣ２ｃ２エフェクターによるなどの、多重化エラーロバスト蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＭＥＲＦＩＳＨ；Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ；２０１５；３４８（６２３３））において使用することができる。
インビトロＡＰＥＸ標識
細胞過程は、タンパク質、ＲＮＡ、及びＤＮＡ間の分子相互作用のネットワークに依存する。タンパク質－ＤＮＡ及びタンパク質－ＲＮＡ相互作用の正確な検出は、かかる過程の理解に重要である。インビトロ近接標識技術は、アフィニティータグを例えば光活性化可能なプローブと組み合わせて利用して、インビトロで目的のタンパク質又はＲＮＡの近くにあるポリペプチド及びＲＮＡを標識する。ＵＶ照射後、光活性化可能な基が、タグ付加分子にごく近接しているタンパク質及び他の分子と反応し、それによりそれらを標識する。標識された相互作用分子は、続いて回収して同定することができる。本発明のＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質を使用して、例えば、プローブを選択のＲＮＡ配列に標的化することができる。
これらの適用はまた、疾患に関連する適用又は培養が困難な細胞型のインビボイメージングのため動物モデルにおいても適用し得る可能性がある。
本発明は、リスクの検査及びＲＮＡ標的療法の手引きを含め、無細胞ＲＮＡの非侵襲的試料採取によって健康状態を診断及びモニタリングするための薬剤及び方法を提供し、治療の急速投与が治療成績に重要な状況で有用である。一実施形態において、本発明は、再発及び／又は一般的な薬剤耐性突然変異の発生をモニタリングすることを含め、循環腫瘍ＲＮＡに関する癌検出方法及び薬剤を提供する。別の実施形態において、本発明は、血液又は血清から直接細菌種を検出及び／又は同定して、それにより例えば疾患の進行及び敗血症をモニタするための検出方法及び薬剤を提供する。本発明のある実施形態では、Ｃ２ｃ２タンパク質及び誘導体を使用して、ライノウイルス感染症又は上気道感染症などの一般病が気管支炎などのより重篤な感染症と区別され、診断される。
本発明は、心筋梗塞又は脳卒中治療時の例えばＶＫＯＲＣ１、ＣＹＰ２Ｃ９、及びＣＹＰ２Ｃ１９遺伝子タイピングに基づく抗凝固薬の投与の手引きを含め、救急ファーマコゲノミクスに向けた迅速遺伝子タイピングのための方法及び薬剤を提供する。
本発明は、食品製造及び配送チェーンに沿ったあらゆるポイントでの食品の細菌汚染を監視するための薬剤及び方法を提供する。別の実施形態において、本発明は、例えば食品原料の特定及び純度の決定による、品質管理及び監視を提供する。一つの非限定的な例では、本発明を使用して、動物肉及び海産物の種など、食品原料を特定又は確認し得る。
別の実施形態において、本発明は法医学的決定において使用される。例えば、血液又は他の体液を含む犯罪現場試料。本発明のある実施形態では、本発明を使用して指紋から核酸試料が同定される。
ＲＮＡ折り紙／インビトロアセンブリラインにおけるＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質の使用－コンビナトリクス
ＲＮＡ折り紙とは、ＲＮＡを組み込まれた鋳型として使用して二次元又は三次元構造を作り出すためのナノスケールの折り畳み構造を指す。折り畳み構造はＲＮＡにコードされ、従って得られるＲＮＡの形状は合成されるＲＮＡ配列によって決まる（Ｇｅａｒｙ，ｅｔ ａｌ．２０１４．Ｓｃｉｅｎｃｅ，３４５（６１９８）．ｐｐ．７９９－８０４）。ＲＮＡ折り紙は、タンパク質などの他の成分を複合体となるように配列するための足場として働き得る。本発明のＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質を使用すると、例えば、好適なガイドＲＮＡを使用して目的のタンパク質をＲＮＡ折り紙に標的化することができる。
ＲＮＡ単離又は精製、エンリッチメント又は枯渇におけるＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質の使用
更に、ＲＮＡと複合体化したときのＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質を使用してＲＮＡを単離及び／又は精製し得ることが想定される。例えば、ＲＮＡ－ＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質複合体の単離及び／又は精製に使用し得るアフィニティータグにＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質を融合することができる。かかる適用は、例えば、細胞における遺伝子発現プロファイルの分析において有用である。詳細な実施形態において、ＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質を使用して特異的非コードＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）を標的化し、それによりその活性を遮断して、有用な機能性プローブを提供し得ることが想定され得る。特定の実施形態では、本明細書に記載されるとおりのエフェクタータンパク質（ｅｆｆｅｃｅｔｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ）を使用して特定のＲＮＡを特異的にエンリッチしてもよく（限定はされないが、安定性を増加させることなどを含む）、或いは特定のＲＮＡ（限定なしに、例えば特定のスプライス変異体、アイソフォームなど）を特異的に枯渇させてもよい。
ｌｉｎｃＲＮＡ機能及び他の核ＲＮＡの検査
ｓｉＲＮＡなどの現在のＲＮＡノックダウン戦略は、タンパク質機構が細胞質性であるため、ほとんどが細胞質転写物のターゲティングに限られるという不都合さがある。細胞機能に必須でない外因系である本発明のＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質の利点は、それを細胞のどの区画においても使用できることである。ＮＬＳシグナルをＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質に融合することにより、それを核に誘導することができ、核ＲＮＡのターゲティングが可能となる。例えば、ｌｉｎｃＲＮＡの機能をプローブすることが想定される。長鎖遺伝子間非コードＲＮＡ（ｌｉｎｃＲＮＡ）は、極めて広範に調査されている研究分野である。多くのｌｉｎｃＲＮＡが、今のところまだ解明されていない機能を有し、これは本発明のＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質を使用した研究となる可能性がある。
ＲＮＡ結合タンパク質の同定
特異的ＲＮＡに結合するタンパク質の同定は、多くのＲＮＡの役割を理解するのに有用であり得る。例えば、多くのｌｉｎｃＲＮＡは転写の制御に転写及び後成的調節因子が関連する。どのようなタンパク質が所与のｌｉｎｃＲＮＡに結合するかを理解することは、所与の調節経路の構成成分を解明する助けとなり得る。結合したタンパク質をビオチンで局所的に標識するため、ビオチンリガーゼを特異的転写物に動員するように本発明のＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質を設計することができる。次にタンパク質をプルダウンし、質量分析法により分析して、それを同定することができる。
ＲＮＡへの複合体のアセンブリ及び基質シャトリング
更に、本発明のＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質を使用して、ＲＮＡに複合体をアセンブルすることができる。これは、ＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質を複数の関連するタンパク質（例えば特定の合成経路の構成成分）で機能化することにより実現し得る。或いは、かかる種々の関連するタンパク質で複数のＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質を機能化して、同じ又は隣接する標的ＲＮＡに標的化してもよい。ＲＮＡへの複合体のアセンブリの有用な適用は、例えばタンパク質間の基質シャトリングの促進である。
合成生物学
生物学的システムの開発には、臨床応用を含め、広い有用性がある。本発明のプログラム可能なＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質を使用して、例えば癌関連ＲＮＡを標的転写物として使用した標的細胞死のため毒性ドメインのスプリットタンパク質に融合し得ることが想定される。更に、合成生物学的システムにおいて、例えばキナーゼ又は他の酵素などの適切なエフェクターとの融合複合体により、タンパク質間相互作用を含む経路に影響を与えることができる。
タンパク質スプライシング：インテイン
タンパク質スプライシングは、インテインと称される介在ポリペプチドが、エクステインと称される、それに隣接するポリペプチドからのそれ自身の切出し、並びに続くエクステインのライゲーションを触媒する翻訳後プロセスである。本明細書に記載されるとおりの２つ以上のＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質を標的転写物にアセンブルすることを用いてスプリットインテインの放出を仕向け（Ｔｏｐｉｌｉｎａ ａｎｄ Ｍｉｌｌｓ Ｍｏｂ ＤＮＡ．２０１４ Ｆｅｂ ４；５（１）：５）、それによりｍＲＮＡ転写物の存在に関する直接計算、及び続く代謝酵素又は転写因子などの（転写経路の下流作動のための）タンパク質産物の放出を可能にし得る。本願は合成生物学（上記参照）、又は大規模バイオ生産（一定の条件下でのみ産物を産生する）において多大な意義を有し得る。
誘導性システム、投与システム及び自己不活性化システム
一実施形態において、本発明のＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質及びエフェクター成分を含む融合複合体は、誘導性、例えば光誘導性又は化学誘導性となるように設計される。かかる誘導能により、エフェクター成分を所望の時点で活性化させることが可能となる。
光誘導能は、例えば、融合にＣＲＹ２ＰＨＲ／ＣＩＢＮ対形成が用いられる融合複合体を設計することにより実現される。このシステムは、生細胞におけるタンパク質相互作用の光誘導に特に有用である（Ｋｏｎｅｒｍａｎｎ Ｓ，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ．２０１３；５００：４７２－４７６）。
化学誘導能は、例えば、融合にＦＫＢＰ／ＦＲＢ（ＦＫ５０６結合タンパク質／ＦＫＢＰラパマイシン結合）対形成が用いられる融合複合体を設計することにより提供される。このシステムを使用すると、タンパク質の結合にラパマイシンが必要である（Ｚｅｔｓｃｈｅ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１５；３３（２）：１３９－４２が、Ｃａｓ９へのこのシステムの使用について記載している）。
更に、本発明のＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質は、細胞にＤＮＡとして導入すると、テトラサイクリン又はドキシサイクリン制御転写活性化（Ｔｅｔ－Ｏｎ及びＴｅｔ－Ｏｆｆ発現系）、例えばエクジソン誘導性遺伝子発現系などのホルモン誘導性遺伝子発現系、及びアラビノース誘導性遺伝子発現系など、誘導性プロモーターによって調節することができる。ＲＮＡとして送達すると、ＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質の発現をリボスイッチで調節することができ、これはテトラサイクリンのような小分子を検知することができるものである（Ｇｏｌｄｆｌｅｓｓ ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０１２；４０（９）：ｅ６４に記載されるとおり）。
一実施形態において、本発明のＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質の送達を調節して細胞内のタンパク質又はｃｒＲＮＡの量を変化させ、それにより所望の効果又は任意の望ましくないオフターゲット効果の大きさを変化させることができる。
一実施形態において、本明細書に記載されるＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質は自己不活性化するように設計することができる。これは、ｍＲＮＡ又は複製ＲＮＡ治療薬（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ＲＮＡ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ）（Ｗｒｏｂｌｅｓｋａ ｅｔ ａｌ Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１５ Ａｕｇ；３３（８）：８３９－８４１）のいずれかの、ＲＮＡとして細胞に送達すると、自己ＲＮＡを破壊して、それにより常在性及び潜在的に望ましくない効果を低減することにより、発現及び続く効果を自己不活性化し得る。
本明細書に記載されるとおりのＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質の更なるインビボ適用については、Ｍａｃｋａｙ ＪＰ ｅｔ ａｌ（Ｎａｔ Ｓｔｒｕｃｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２０１１ Ｍａｒ；１８（３）：２５６－６１）、Ｎｅｌｌｅｓ ｅｔ ａｌ（Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ．２０１５ Ｊｕｌ；３７（７）：７３２－９）及びＡｂｉｌ Ｚ ａｎｄ Ｚｈａｏ Ｈ（Ｍｏｌ Ｂｉｏｓｙｓｔ．２０１５ Ｏｃｔ；１１（１０）：２６５８－６５）が参照され、これらは参照により本明細書に援用される。詳細には、本発明の特定の実施形態において、好ましくは触媒不活性Ｃ２ｃ２を使用することによる特定の実施形態において以下の適用が想定される：翻訳の亢進（例えばＣ２ｃ２－翻訳促進因子融合物（例えばｅＩＦ４融合物））；翻訳の抑制（例えばリボソーム結合部位を標的とするｇＲＮＡ）；エクソンスキッピング（例えばスプライスドナー及び／又はアクセプター部位を標的とするｇＲＮＡ）；エクソンインクルージョン（例えば特定のエクソンスプライスドナー及び／又はアクセプター部位が含まれるように標的化するｇＲＮＡ又はスプライソソーム成分（例えばＵ１ ｓｎＲＮＡ）に融合した若しくはそれを動員するＣ２ｃ２）；ＲＮＡ局在への接近（例えばＣ２ｃ２－マーカー融合物（例えばＥＧＦＰ融合物））；ＲＮＡ局在の変化（例えばＣ２ｃ２－局在化シグナル融合物（例えばＮＬＳ又はＮＥＳ融合物））；ＲＮＡ分解（この場合、Ｃ２ｃ２の活性に頼るならば触媒不活性Ｃ２ｃ２は使用されないものとし、或いは、及び特異性の増加のため、スプリットＣ２ｃ２が使用されてもよい）；ｇＲＮＡの分解又は機能部位への結合によるなど（恐らくはＣ２ｃ２－シグナル配列融合物による再局在化によって特異的部位でタイトレートアウトする）、非コードＲＮＡ機能（例えばｍｉＲＮＡ）の阻害。
本明細書において上記に記載され、及び実施例で実証されるとおり、Ｃ２ｃ２機能はｃｒＲＮＡの５’又は３’伸長及びｃｒＲＮＡループの伸長に対してロバストである。従って、複合体形成及び標的転写物への結合に影響を及ぼすことなくｃｒＲＮＡにＭＳ２ループ及び他の動員ドメインを付加し得ることが想定される。様々なエフェクタードメインを動員するためのｃｒＲＮＡに対するかかる改変は、上記に記載したＲＮＡ標的化エフェクタータンパク質の使用において適用可能である。
実施例で実証されるとおり、Ｃ２ｃ２、詳細にはＬｓｈＣ２ｃ２は、ＲＮＡファージ耐性を媒介する能力を有する。従って、Ｃ２ｃ２を使用して、限定はされないが、レトロウイルス（例えばＨＩＶなどのレンチウイルス）、ＨＣＶ、エボラウイルス及びジカウイルスを含めたＲＮＡ単独病原体に対して例えば動物、ヒト及び植物を免疫し得ることが想定される。
本発明者らは、Ｃ２ｃ２がそれ自身のアレイをプロセシング（切断）できることを示している。これは、野生型Ｃ２ｃ２タンパク質と、Ｒ５９７Ａ、Ｈ６０２Ａ、Ｒ１２７８Ａ及びＨ１２８３Ａから選択される改変のうちの１つ以上など、１つ以上の突然変異アミノ酸残基Ｒ５９７、Ｈ６０２、Ｒ１２７８及びＨ１２８３を含む突然変異Ｃ２ｃ２タンパク質との両方に適用される。従って、種々の標的転写物及び／又は適用に向けて設計された複数のｃｒＲＮＡを単一のｐｒｅ－ｃｒＲＮＡとして、又は１つのプロモーターによってドライブされる単一の転写物として送達し得ることが想定される。かかる送達方法には、実質的によりコンパクトで、合成がより容易で、且つウイルス系での送達がより容易であるという利点がある。好ましくは、本明細書に記載されるとおりのアミノ酸付番はＬｓｈ Ｃ２ｃ２タンパク質を参照する。Ｌｓｈ Ｃ２ｃ２のオルソログについて正確なアミノ酸位置は異なることもあり、これは当該技術分野において公知のとおり、及び本明細書において他の部分に記載されるとおり、タンパク質アラインメントによって適切に決定し得ることは理解されるであろう。
本発明の態様はまた、原核細胞又は真核細胞におけるインビトロ、インビボ又はエキソビボでのゲノム又はトランスクリプトームエンジニアリングにおける、例えば１つ以上の遺伝子又は１つ以上の遺伝子産物の（タンパク質）発現を変化させる又は操作するための、本明細書に記載される組成物及び系の方法及び使用も包含する。
ある態様において、本発明は、細胞における標的ＲＮＡの（タンパク質）発現を調節する、例えば低下させるための方法及び組成物を提供する。本方法では、ＲＮＡの転写、安定性、及び／又は翻訳に干渉する本発明のＣ２ｃ２系が提供される。
特定の実施形態において、有効量のＣ２ｃ２系を使用してＲＮＡが切断され、又はその他、ＲＮＡ発現が阻害される。これに関連して、この系はｓｉＲＮＡ及びｓｈＲＮＡと同様の使用を有し、従ってまた、かかる方法に代えることもできる。この方法は、限定なしに、例えば、干渉リボ核酸（ｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡなど）又はその転写鋳型、例えばｓｈＲＮＡをコードするＤＮＡの代わりとしてのＣ２ｃ２系の使用を含む。Ｃ２ｃ２系は、例えば標的細胞を含む哺乳類への投与によって標的細胞に導入される。
有利には、本発明のＣ２ｃ２系は特異的である。例えば、干渉リボ核酸（ｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡなど）ポリヌクレオチド系は設計及び安定性の問題並びにオフターゲット結合に悩まされるが、本発明のＣ２ｃ２系は高い特異性で設計することができる。
不安定化Ｃ２ｃ２
特定の実施形態において、本明細書に記載されるとおりの本発明に係るエフェクタータンパク質（ｅｆｆｅｃｔｅｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ）（ＣＲＩＳＰＲ酵素；Ｃ２ｃ２）は、不安定化ドメイン（ＤＤ）に会合又は融合される。一部の実施形態において、ＤＤはＥＲ５０である。このＤＤの対応する安定化リガンドは、一部の実施形態において４ＨＴである。そのため、一部の実施形態では、少なくとも１つのＤＤのうちの１つがＥＲ５０であり、従って安定化リガンドが４ＨＴ又はＣＭＰ８である。一部の実施形態において、ＤＤはＤＨＦＲ５０である。このＤＤの対応する安定化リガンドは、一部の実施形態においてＴＭＰである。そのため、一部の実施形態では、少なくとも１つのＤＤのうち１つがＤＨＦＲ５０であり、従って安定化リガンドがＴＭＰである。一部の実施形態において、ＤＤはＥＲ５０である。このＤＤの対応する安定化リガンドは、一部の実施形態においてＣＭＰ８である。従ってＣＭＰ８は、ＥＲ５０系における４ＨＴの代替となる安定化リガンドであり得る。ＣＭＰ８及び４ＨＴを競合的に使用し得る／使用すべきである可能性があり得るが、一部の細胞型はこれらの２つのリガンドのうちのいずれか一方の影響を受け易いこともあり、本開示及び当該技術分野における知識から、当業者はＣＭＰ８及び／又は４ＨＴを使用することができる。
一部の実施形態において、１つ又は２つのＤＤがＣＲＩＳＰＲ酵素のＮ端側末端に融合され、１つ又は２つのＤＤがＣＲＩＳＰＲ酵素のＣ端側に融合されてもよい。一部の実施形態では、少なくとも２つのＤＤがＣＲＩＳＰＲ酵素と会合し、及びそれらのＤＤは同じＤＤであり、即ちＤＤは同種である。従って、ＤＤの両方（又は２つ以上）がＥＲ５０ ＤＤであり得る。一部の実施形態ではこれが好ましい。或いは、ＤＤの両方（又は２つ以上）がＤＨＦＲ５０ ＤＤであり得る。これもまた、一部の実施形態では好ましい。一部の実施形態において、少なくとも２つのＤＤがＣＲＩＳＰＲ酵素と会合し、及びそれらのＤＤは異なるＤＤであり、即ちＤＤは異種である。従って、ＤＤのうちの１つがＥＲ５０であり得る一方、ＤＤのうちの１つ以上又は任意の他のＤＤがＤＨＦＲ５０であり得る。異種である２つ以上のＤＤを有することは、より高い分解制御レベルをもたらし得るため有利であり得る。Ｎ端又はＣ端における２つ以上のＤＤのタンデム融合が分解を増強し得る；及びかかるタンデム融合は、例えばＥＲ５０－ＥＲ５０－Ｃ２ｃ２又はＤＨＦＲ－ＤＨＦＲ－Ｃ２ｃ２であり得る。いずれの安定化リガンドも存在しないならば高レベルの分解が起こり、一方の安定化リガンドが存在せず、他方の（又は別の）安定化リガンドが存在するならば中間レベルの分解が起こり得る一方、安定化リガンドの両方（又は２つ以上）が存在するならば低レベルの分解が起こり得ることが想定される。制御はまた、Ｎ端側ＥＲ５０ ＤＤ及びＣ端側ＤＨＦＲ５０ ＤＤを有することによってももたらされ得る。
一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素とＤＤの融合は、ＤＤとＣＲＩＳＰＲ酵素との間にリンカーを含む。一部の実施形態において、リンカーはＧｌｙＳｅｒリンカーである。一部の実施形態において、ＤＤ－ＣＲＩＳＰＲ酵素は少なくとも１つの核外移行シグナル（ＮＥＳ）を更に含む。一部の実施形態において、ＤＤ－ＣＲＩＳＰＲ酵素は２つ以上のＮＥＳを含む。一部の実施形態において、ＤＤ－ＣＲＩＳＰＲ酵素は少なくとも１つの核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含む。これは、ＮＥＳに加えて含むのであってもよい。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、ＣＲＩＳＰＲ酵素とＤＤとの間のリンカーとして、又はその一部として、局在化（核内移行又は核外移行）シグナルを含むか、又はそれから本質的になるか、又はそれからなる。ＨＡ又はＦｌａｇタグもまた、リンカーとしての本発明の範囲内にある。本出願人らはＮＬＳ及び／又はＮＥＳをリンカーとして使用し、また、ＧＳほどの短さのものから最大（ＧＧＧＧＳ）３に至るまでのグリシンセリンリンカーも使用する。
［００１９］不安定化ドメインには、広範囲のタンパク質に不安定性を付与する一般的な有用性がある；例えば、Ｍｉｙａｚａｋｉ，Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ．Ｍａｒ ７，２０１２；１３４（９）：３９４２－３９４５（参照により本明細書に援用される）を参照のこと。ＣＭＰ８又は４－ヒドロキシタモキシフェンは不安定化ドメインであり得る。より一般的には、Ｎ末端規則による不安定化残基である哺乳類ＤＨＦＲの温度感受性突然変異体（ＤＨＦＲｔｓ）が、許容温度で安定であるが、３７℃で不安定であることが分かった。ＤＨＦＲｔｓを発現する細胞に哺乳類ＤＨＦＲの高親和性リガンドであるメトトレキサートを加えると、タンパク質の分解が部分的に阻害された。これは、細胞において本来分解の標的となるタンパク質を小分子リガンドが安定化させ得るという重要な実証であった。ラパマイシン誘導体を使用すると、ｍＴＯＲのＦＲＢドメインの不安定突然変異体（ＦＲＢ＊）が安定化し、融合したキナーゼＧＳＫ－３βの機能が回復した６，７。この系は、リガンド依存的な安定性が、複雑な生物学的環境にある特異的タンパク質の機能を調節する魅力的な戦略に相当することを実証した。タンパク質活性の制御系には、ラパマイシンによって誘導されたＦＫ５０６結合タンパク質とＦＫＢＰ１２との二量体化によってユビキチン相補性が生じると機能性になるＤＤが関与し得る。ヒトＦＫＢＰ１２又はｅｃＤＨＦＲタンパク質の突然変異体は、その高親和性リガンド、それぞれＳｈｉｅｌｄ－１又はトリメトプリム（ＴＭＰ）が存在しない場合には代謝的に不安定であるようにエンジニアリングすることができる。これらの突然変異体は、本発明の実施において有用な可能な不安定化ドメイン（ＤＤ）の一部であり、及びＣＲＩＳＰＲ酵素との融合物としてのＤＤの不安定性が、プロテアソームによる融合タンパク質全体のＣＲＩＳＰＲタンパク質分解をもたらす。Ｓｈｉｅｌｄ－１及びＴＭＰは用量依存的にＤＤに結合してそれを安定化させる。エストロゲン受容体リガンド結合ドメイン（ＥＲＬＢＤ、ＥＲＳ１の残基３０５～５４９）もまた、不安定化ドメインとしてエンジニアリングすることができる。エストロゲン受容体シグナル伝達経路は乳癌などの種々の疾患に関与するため、この経路は広く研究されており、数多くのエストロゲン受容体作動薬及び拮抗薬が開発されている。従って、ＥＲＬＢＤと薬物との適合性のあるペアが公知である。突然変異形態のＥＲＬＢＤに結合するが、野生型形態のＥＲＬＢＤには結合しないリガンドがある。３つの突然変異（Ｌ３８４Ｍ、Ｍ４２１Ｇ、Ｇ５２１Ｒ）をコードするこれらの突然変異ドメインのうちの１つを使用することにより１２、内因性エストロゲン感受性ネットワークを乱すことのないリガンドを用いてＥＲＬＢＤ由来のＤＤの安定性を調節することが可能である。追加の突然変異（Ｙ５３７Ｓ）を導入してＥＲＬＢＤを更に不安定化させ、それを潜在的なＤＤ候補として構成することができる。この四重突然変異体は、有利なＤＤ展開である。この突然変異ＥＲＬＢＤをＣＲＩＳＰＲ酵素に融合させることができ、且つリガンドを用いてその安定性を調節し又は撹乱させることができ、これによりＣＲＩＳＰＲ酵素がＤＤを有する。別のＤＤは、Ｓｈｉｅｌｄ１リガンドによって安定化する、突然変異ＦＫＢＰタンパク質をベースとする１２ｋＤａ（１０７アミノ酸）タグであり得る；例えば、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ ５，（２００８）を参照のこと。例えばＤＤは、合成の生物学的に不活性な小分子、Ｓｈｉｅｌｄ－１に結合し、且つそれによって可逆的に安定化される、改変されたＦＫ５０６結合タンパク質１２（ＦＫＢＰ１２）であってもよく；例えば、Ｂａｎａｓｚｙｎｓｋｉ ＬＡ，Ｃｈｅｎ ＬＣ，Ｍａｙｎａｒｄ－Ｓｍｉｔｈ ＬＡ，Ｏｏｉ ＡＧ，Ｗａｎｄｌｅｓｓ ＴＪ．「合成小分子を使用して生細胞のタンパク質機能を調節するための迅速で可逆的且つ調整可能な方法（Ａ ｒａｐｉｄ，ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ，ａｎｄ ｔｕｎａｂｌｅ ｍｅｔｈｏｄ ｔｏ ｒｅｇｕｌａｔｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ ｌｉｖｉｎｇ ｃｅｌｌｓ ｕｓｉｎｇ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｓｍａｌｌ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）」．Ｃｅｌｌ．２００６；１２６：９９５－１００４；Ｂａｎａｓｚｙｎｓｋｉ ＬＡ，Ｓｅｌｌｍｙｅｒ ＭＡ，Ｃｏｎｔａｇ ＣＨ，Ｗａｎｄｌｅｓｓ ＴＪ，Ｔｈｏｒｎｅ ＳＨ．「生存マウスにおけるタンパク質安定性及び機能の化学的制御（Ｃｈｅｍｉｃａｌ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ ｌｉｖｉｎｇ ｍｉｃｅ）」．Ｎａｔ Ｍｅｄ．２００８；１４：１１２３－１１２７；Ｍａｙｎａｒｄ－Ｓｍｉｔｈ ＬＡ，Ｃｈｅｎ ＬＣ，Ｂａｎａｓｚｙｎｓｋｉ ＬＡ，Ｏｏｉ ＡＧ，Ｗａｎｄｌｅｓｓ ＴＪ．「生物学的にサイレントな小分子を用いて条件的タンパク質安定性をエンジニアリングする指向的手法（Ａ ｄｉｒｅｃｔｅｄ ａｐｐｒｏａｃｈ ｆｏｒ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｕｓｉｎｇ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ ｓｉｌｅｎｔ ｓｍａｌｌ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）」．Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．２００７；２８２：２４８６６－２４８７２；及びＲｏｄｒｉｇｕｅｚ，Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ．Ｍａｒ ２３，２０１２；１９（３）：３９１－３９８（これらは全て、参照により本明細書に援用される）を参照されたく、及び本発明の実施においてＣＲＩＳＰＲ酵素と会合させるＤＤの選択において本発明の実施で用いられ得る。理解し得るとおり、当該技術分野における知識には幾つものＤＤが含まれ、及びＤＤはＣＲＩＳＰＲ酵素と、有利にはリンカーを伴い会合させる、例えば融合することができ、それによってＤＤをリガンドの存在下で安定化させることができ、且つそれが存在しないときＤＤを不安定化させることができ、それによってＣＲＩＳＰＲ酵素が全体として不安定化し、又はＤＤはリガンドが存在しない場合に安定化させることができ、且つリガンドが存在するときにＤＤを不安定化させることができ；ＤＤによってＣＲＩＳＰＲ酵素、ひいてはＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ複合体又は系を調節又は制御する－いわばオン・オフを切り替えることが可能となり、それにより系を例えばインビボ又はインビトロ環境で調節又は制御する手段が提供される。例えば、目的のタンパク質をＤＤタグとの融合物として発現させると、それは細胞内で不安定化し、例えばプロテアソームによって急速に分解される。従って、安定化リガンドが存在しないと、Ｄが会合したＣａｓの分解につながる。新規ＤＤを目的のタンパク質に融合させると、その不安定性が目的のタンパク質に付与され、融合タンパク質全体の急速な分解が生じる。Ｃａｓのピーク活性は、時にオフターゲット効果の低減に有益である。従って、高い活性の短いバーストが好ましい。本発明はかかるピークを提供することが可能である。ある意味では、この系は誘導性である。別の意味では、この系は安定化リガンドの非存在下で抑制され、且つ安定化リガンドの存在下で抑制が解除される。
植物及び酵母へのＲＮＡターゲティングＲＮＡターゲティングＣＲＩＳＰＲ系の適用
定義：
一般に、用語「植物」は、細胞分裂によって特徴的に成長し、葉緑体を含有し、及びセルロースで構成された細胞壁を有する植物界（Ｐｌａｎｔａｅ）の任意の様々な光合成生物、真核生物、単細胞生物又は多細胞生物に関する。用語の植物には単子葉及び双子葉植物が包含される。具体的には、植物には、限定なしに、アカシア、アルファルファ、アマランス、リンゴ、アンズ、チョウセンアザミ、トネリコの木、アスパラガス、アボカド、バナナ、オオムギ、マメ類、テンサイ、カバノキ、ブナノキ、クロイチゴ、ブルーベリー、ブロッコリー、メキャベツ、キャベツ、キャノーラ、カンタループ、ニンジン、キャッサバ、カリフラワー、ヒマラヤスギ、穀物、セロリ、クリ、サクランボ、ハクサイ、柑橘類、クレメンタイン、クローバ、コーヒー、トウモロコシ、ワタ、ササゲ、キュウリ、イトスギ、ナス、ニレ、エンダイブ、ユーカリ、ウイキョウ、イチジク、モミ、ゼラニウム、ブドウ、グレープフルーツ、ラッカセイ類、ホオズキ、ガムヘムロック（ｇｕｍ ｈｅｍｌｏｃｋ）、ヒッコリー、ケール、キーウィフルーツ、コールラビ、カラマツ、レタス、ニラ、レモン、ライム、ニセアカシア、マツ、メイデンヘア、トウモロコシ、マンゴー、カエデ、メロン、キビ、キノコ、カラシ、堅果類、オーク、オートムギ、油ヤシ、オクラ、タマネギ、オレンジ、観賞植物又は装飾花又は観賞樹、パパイヤ、ヤシ、パセリ、パースニップ、エンドウマメ、モモ、ピーナッツ、セイヨウナシ、ピート、コショウ、カキ、キマメ、マツ、パイナップル、オオバコ、セイヨウスモモ、ザクロ、ジャガイモ、カボチャ、赤チコリ、ダイコン、ナタネ、キイチゴ、コメ、ライムギ、モロコシ、ベニバナ、サルヤナギ、ダイズ、ホウレンソウ、エゾマツ、カボチャ、イチゴ、サトウダイコン、サトウキビ、ヒマワリ、サツマイモ、スイートコーン、タンジェリン、茶、タバコ、トマト、樹木、ライ小麦、芝草、カブ、つる植物、クルミ、オランダガラシ、スイカ、コムギ、ヤムイモ、イチイ、及びズッキーニなどの被子植物及び裸子植物が含まれることが意図される。用語の植物にはまた、それらに根、葉及び高等植物を特徴付ける他の器官がないことによって主に統一された、大部分が光独立栄養生物である藻類も包含される。
本明細書に記載されるとおりのＲＮＡターゲティングＲＮＡターゲティング系を使用した遺伝子発現の調節方法を使用して、本質的にいかなる植物にも所望の形質を付与することができる。本明細書に記載される所望の生理学的及び農学的特性について、本開示の核酸構築物及び上述の様々な形質転換方法を用いて多種多様な植物及び植物細胞系をエンジニアリングし得る。好ましい実施形態において、エンジニアリングの標的となる植物及び植物細胞としては、限定はされないが、穀類作物（例えば、コムギ、トウモロコシ、コメ、キビ、オオムギ）、果実作物（例えば、トマト、リンゴ、セイヨウナシ、イチゴ、オレンジ）、飼料作物（例えば、アルファルファ）、根菜作物（例えば、ニンジン、ジャガイモ、サトウダイコン、ヤムイモ）、葉菜作物（例えば、レタス、ホウレンソウ）；顕花植物（例えば、ペチュニア、バラ、キク）、針葉樹及びマツの木（例えば、モミ、エゾマツ）；ファイトレメディエーションで用いられる植物（例えば、重金属蓄積植物）；油料作物（例えば、ヒマワリ、ナタネ）及び実験目的で用いられる植物（例えば、アラビドプシス属（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ））を含めた作物など、単子葉及び双子葉植物が挙げられる。従って、本方法及びＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系は広範囲の植物にわたり、例えば、モクレン目（Ｍａｇｎｉｏｌａｌｅｓ）、シキミ目（Ｉｌｌｉｃｉａｌｅｓ）、クスノキ目（Ｌａｕｒａｌｅｓ）、コショウ目（Ｐｉｐｅｒａｌｅｓ）、ウマノスズクサ目（Ａｒｉｓｔｏｃｈｉａｌｅｓ）、スイレン目（Ｎｙｍｐｈａｅａｌｅｓ）、キンポウゲ目（Ｒａｎｕｎｃｕｌａｌｅｓ）、ケシ目（Ｐａｐｅｖｅｒａｌｅｓ）、サラセニア科（Ｓａｒｒａｃｅｎｉａｃｅａｅ）、ヤマグルマ目（Ｔｒｏｃｈｏｄｅｎｄｒａｌｅｓ）、マンサク目（Ｈａｍａｍｅｌｉｄａｌｅｓ）、トチュウ目（Ｅｕｃｏｍｉａｌｅｓ）、レイトネリア目（Ｌｅｉｔｎｅｒｉａｌｅｓ）、ヤマモモ目（Ｍｙｒｉｃａｌｅｓ）、ブナ目（Ｆａｇａｌｅｓ）、モクマオウ目（Ｃａｓｕａｒｉｎａｌｅｓ）、ナデシコ目（Ｃａｒｙｏｐｈｙｌｌａｌｅｓ）、バティス目（Ｂａｔａｌｅｓ）、タデ目（Ｐｏｌｙｇｏｎａｌｅｓ）、イソマツ目（Ｐｌｕｍｂａｇｉｎａｌｅｓ）、ビワモドキ目（Ｄｉｌｌｅｎｉａｌｅｓ）、ツバキ目（Ｔｈｅａｌｅｓ）、アオイ目（Ｍａｌｖａｌｅｓ）、イラクサ目（Ｕｒｔｉｃａｌｅｓ）、サガリバナ目（Ｌｅｃｙｔｈｉｄａｌｅｓ）、スミレ目（Ｖｉｏｌａｌｅｓ）、ヤナギ目（Ｓａｌｉｃａｌｅｓ）、フウチョウソウ目（Ｃａｐｐａｒａｌｅｓ）、ツツジ目（Ｅｒｉｃａｌｅｓ）、イワウメ目（Ｄｉａｐｅｎｓａｌｅｓ）、カキノキ目（Ｅｂｅｎａｌｅｓ）、サクラソウ目（Ｐｒｉｍｕｌａｌｅｓ）、バラ目（Ｒｏｓａｌｅｓ）、マメ目（Ｆａｂａｌｅｓ）、カワゴケソウ目（Ｐｏｄｏｓｔｅｍａｌｅｓ）、アリノトウグサ目（Ｈａｌｏｒａｇａｌｅｓ）、フトモモ目（Ｍｙｒｔａｌｅｓ）、ミズキ目（Ｃｏｒｎａｌｅｓ）、ヤマモガシ目（Ｐｒｏｔｅａｌｅｓ）、ビャクダン目（Ｓａｎ ｔａｌｅｓ）、ラフレシア目（Ｒａｆｆｌｅｓｉａｌｅｓ）、ニシキギ目（Ｃｅｌａｓｔｒａｌｅｓ）、トウダイグサ目（Ｅｕｐｈｏｒｂｉａｌｅｓ）、クロウメモドキ目（Ｒｈａｍｎａｌｅｓ）、ムクロジ目（Ｓａｐｉｎｄａｌｅｓ）、クルミ目（Ｊｕｇｌａｎｄａｌｅｓ）、フウロソウ目（Ｇｅｒａｎｉａｌｅｓ）、ヒメハギ目（Ｐｏｌｙｇａｌａｌｅｓ）、セリ目（Ｕｍｂｅｌｌａｌｅｓ）、リンドウ目（Ｇｅｎｔｉａｎａｌｅｓ）、ハナシノブ目（Ｐｏｌｅｍｏｎｉａｌｅｓ）、シソ目（Ｌａｍｉａｌｅｓ）、オオバコ目（Ｐｌａｎｔａｇｉｎａｌｅｓ）、ゴマノハグサ目（Ｓｃｒｏｐｈｕｌａｒｉａｌｅｓ）、キキョウ目（Ｃａｍｐａｎｕｌａｌｅｓ）、アカネ目（Ｒｕｂｉａｌｅｓ）、マツムシソウ目（Ｄｉｐｓａｃａｌｅｓ）、及びキク目（Ａｓｔｅｒａｌｅｓ）に属する双子葉植物などで用いることができる；本方法及びＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系は、オモダカ目（Ａｌｉｓｍａｔａｌｅｓ）、トチカガミ目（Ｈｙｄｒｏｃｈａｒｉｔａｌｅｓ）、イバラモ目（Ｎａｊａｄａｌｅｓ）、ホンゴウソウ目（Ｔｒｉｕｒｉｄａｌｅｓ）、ツユクサ目（Ｃｏｍｍｅｌｉｎａｌｅｓ）、ホシクサ目（Ｅｒｉｏｃａｕｌａｌｅｓ）、サンアソウ目（Ｒｅｓｔｉｏｎａｌｅｓ）、イネ目（Ｐｏａｌｅｓ）、イグサ目（Ｊｕｎｃａｌｅｓ）、カヤツリグサ目（Ｃｙｐｅｒａｌｅｓ）、ガマ目（Ｔｙｐｈａｌｅｓ）、パイナップル目（Ｂｒｏｍｅｌｉａｌｅｓ）、ショウガ目（Ｚｉｎｇｉｂｅｒａｌｅｓ）、ヤシ目（Ａｒｅｃａｌｅｓ）、パナマソウ目（Ｃｙｃｌａｎｔｈａｌｅｓ）、タコノキ目（Ｐａｎｄａｎａｌｅｓ）、サトイモ目（Ａｒａｌｅｓ）、ユリ目（Ｌｉｌｌｉａｌｅｓ）、及びラン目（Ｏｒｃｈｉｄ ａｌｅｓ）に属するものなどの単子葉植物、又は裸子植物類（Ｇｙｍｎｏｓｐｅｒｍａｅ）に属する植物、例えば、マツ目（Ｐｉｎａｌｅｓ）、イチョウ目（Ｇｉｎｋｇｏａｌｅｓ）、ソテツ目（Ｃｙｃａｄａｌｅｓ）、ナンヨウスギ目（Ａｒａｕｃａｒｉａｌｅｓ）、ヒノキ目（Ｃｕｐｒｅｓｓａｌｅｓ）及びグネツム目（Ｇｎｅｔａｌｅｓ）に属するもので用いることができる。
本明細書に記載されるＲＮＡターゲティングＲＮＡターゲティングＣＲＩＳＰＲ系及び使用方法は、以下の双子葉類、単子葉類又は裸子植物の属の非限定的なリストに含まれる広範囲にわたる植物種に用いることができる：オオカミナスビ属（Ａｔｒｏｐａ）、アルセオダフネ属（Ａｌｓｅｏｄａｐｈｎｅ）、カシューナットノキ属（Ａｎａｃａｒｄｉｕｍ）、ラッカセイ属（Ａｒａｃｈｉｓ）、ベイルシュミエディア属（Ｂｅｉｌｓｃｈｍｉｅｄｉａ）、アブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）、ベニバナ属（Ｃａｒｔｈａｍｕｓ）、アオツヅラフジ属（Ｃｏｃｃｕｌｕｓ）、クロトン属（Ｃｒｏｔｏｎ）、ククミス属（Ｃｕｃｕｍｉｓ）、ミカン属（Ｃｉｔｒｕｓ）、スイカ属（Ｃｉｔｒｕｌｌｕｓ）、トウガラシ属（Ｃａｐｓｉｃｕｍ）、ニチニチソウ属（Ｃａｔｈａｒａｎｔｈｕｓ）、ココヤシ属（Ｃｏｃｏｓ）、コーヒーノキ属（Ｃｏｆｆｅａ）、ククルビタ属（Ｃｕｃｕｒｂｉｔａ）、ニンジン属（Ｄａｕｃｕｓ）、ドゥグエティア属（Ｄｕｇｕｅｔｉａ）、ハナビシソウ属（Ｅｓｃｈｓｃｈｏｌｚｉａ）、イチジク属（Ｆｉｃｕｓ）、オランダイチゴ属（Ｆｒａｇａｒｉａ）、ツノゲシ属（Ｇｌａｕｃｉｕｍ）、ダイズ属（Ｇｌｙｃｉｎｅ）、ワタ属（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ）、ヒマワリ属（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ）、パラゴムノキ属（Ｈｅｖｅａ）、ヒヨス属（Ｈｙｏｓｃｙａｍｕｓ）、アキノノゲシ属（Ｌａｃｔｕｃａ）、ランドルフィア属（Ｌａｎｄｏｌｐｈｉａ）、アマ属（Ｌｉｎｕｍ）、ハマビワ属（Ｌｉｔｓｅａ）、トマト属（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ）、ルピナス属（Ｌｕｐｉｎｕｓ）、キャッサバ属（Ｍａｎｉｈｏｔ）、マジョラナ属（Ｍａｊｏｒａｎａ）、リンゴ属（Ｍａｌｕｓ）、ウマゴヤシ属（Ｍｅｄｉｃａｇｏ）、タバコ属（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ）、オリーブ属（Ｏｌｅａ）、パルセニウム属（Ｐａｒｔｈｅｎｉｕｍ）、ケシ属（Ｐａｐａｖｅｒ）、ワニナシ属（Ｐｅｒｓｅａ）、インゲンマメ属（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ）、カイノキ属（Ｐｉｓｔａｃｉａ）、エンドウ属（Ｐｉｓｕｍ）、ナシ属（Ｐｙｒｕｓ）、サクラ属（Ｐｒｕｎｕｓ）、ダイコン属（Ｒａｐｈａｎｕｓ）、トウゴマ属（Ｒｉｃｉｎｕｓ）、キオン属（Ｓｅｎｅｃｉｏ）、ツヅラフジ属（Ｓｉｎｏｍｅｎｉｕｍ）、ハスノハカヅラ属（Ｓｔｅｐｈａｎｉａ）、シロガラシ属（Ｓｉｎａｐｉｓ）、ナス属（Ｓｏｌａｎｕｍ）、カカオ属（Ｔｈｅｏｂｒｏｍａ）、ジャジクソウ属（Ｔｒｉｆｏｌｉｕｍ）、フェヌグリーク属（Ｔｒｉｇｏｎｅｌｌａ）、ソラマメ属（Ｖｉｃｉａ）、ツルニチニチソウ属（Ｖｉｎｃａ）、ブドウ属（Ｖｉｌｉｓ）、及びササゲ属（Ｖｉｇｎａ）；及びネギ属（Ａｌｌｉｕｍ）、ウシクサ属（Ａｎｄｒｏｐｏｇｏｎ）、スズメガヤ属（Ａｒａｇｒｏｓｔｉｓ）、アスパラガス属（Ａｒａｇｒｏｓｔｉｓ）、カラスムギ属（Ａｖｅｎａ）、ギョウギシバ属（Ｃｙｎｏｄｏｎ）、アブラヤシ属（Ｅｌａｅｉｓ）、ウシノケグサ属（Ｆｅｓｔｕｃａ）、フェストロリウム属（Ｆｅｓｔｕｌｏｌｉｕｍ）、ワスレグサ属（Ｈｅｔｅｒｏｃａｌｌｉｓ）、オオムギ属（Ｈｏｒｄｅｕｍ）、アオウキクサ属（Ｌｅｍｎａ）、ドクムギ属（Ｌｏｌｉｕｍ）、バショウ属（Ｍｕｓａ）、イネ属（Ｏｒｙｚａ）、キビ属（Ｐａｎｉｃｕｍ）、チカラシバ属（Ｐａｎｎｅｓｅｔｕｍ）、アワガエリ属（Ｐｈｌｅｕｍ）、イチゴツナギ属（Ｐｏａ）、ライムギ属（Ｓｅｃａｌｅ）、モロコシ属（Ｓｏｒｇｈｕｍ）、コムギ属（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ）、トウモロコシ属（Ｚｅａ）、モミ属（Ａｂｉｅｓ）、コウヨウザン属（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍｉａ）、マオウ属（Ｅｐｈｅｄｒａ）、トウヒ属（Ｐｉｃｅａ）、マツ属（Ｐｉｎｕｓ）、及びトガサワラ属（Ｐｓｅｕｄｏｔｓｕｇａ）。
ＲＮＡターゲティングＣＲＩＳＰＲ系及び使用方法はまた、例えば、紅藻植物門（Ｒｈｏｄｏｐｈｙｔａ）（紅藻類）、緑藻植物門（Ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｔａ）（緑藻類）、褐藻植物門（Ｐｈａｅｏｐｈｙｔａ）（褐藻類）、珪藻植物門（Ｂａｃｉｌｌａｒｉｏｐｈｙｔａ）（珪藻類）、真正眼点藻植物門（Ｅｕｓｔｉｇｍａｔｏｐｈｙｔａ）及び渦鞭毛藻類を含む幾つかの真核生物の門、並びに原核生物の門、藍色植物門（Ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）（藍藻類）から選択される藻類（ａｌｇｅａ）を含め、広範囲にわたる「藻類」又は「藻類細胞」にも用いることができる。用語「藻類」には、例えば、アンフォラ属（Ａｍｐｈｏｒａ）、アナベナ属（Ａｎａｂａｅｎａ）、アンキストロデスムス属（Ａｎｉｋｓｔｒｏｄｅｓｍｉｓ）、ボトリオコッカス属（Ｂｏｔｒｙｏｃｏｃｃｕｓ）、キートケロス属（Ｃｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ）、クラミドモナス属（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ）、クロレラ属（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）、クロロコックム属（Ｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｍ）、キクロテラ属（Ｃｙｃｌｏｔｅｌｌａ）、シリンドロテカ属（Ｃｙｌｉｎｄｒｏｔｈｅｃａ）、ドナリエラ属（Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ）、エミリアニア属（Ｅｍｉｌｉａｎａ）、ユーグレナ属（Ｅｕｇｌｅｎａ）、ヘマトコッカス属（Ｈｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ）、イソクリシス属（Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ）、モノクリシス属（Ｍｏｎｏｃｈｒｙｓｉｓ）、モノラフィディウム属（Ｍｏｎｏｒａｐｈｉｄｉｕｍ）、ナンノクロリス属（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｉｓ）、ナンノクロロプシス属（Ｎａｎｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ）、フナガタケイソウ属（Ｎａｖｉｃｕｌａ）、ネフロクロリス属（Ｎｅｐｈｒｏｃｈｌｏｒｉｓ）、ネフロセルミス属（Ｎｅｐｈｒｏｓｅｌｍｉｓ）、ニッチア属（Ｎｉｔｚｓｃｈｉａ）、ノドゥラリア属（Ｎｏｄｕｌａｒｉａ）、ノストック属（Ｎｏｓｔｏｃ）、オクロモナス属（Ｏｏｃｈｒｏｍｏｎａｓ）、オオキスティス属（Ｏｏｃｙｓｔｉｓ）、オシラトリア属（Ｏｓｃｉｌｌａｒｔｏｒｉａ）、パブロバ属（Ｐａｖｌｏｖａ）、フェオダクチラム属（Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ）、プラチモナス属（Ｐｌａｙｔｍｏｎａｓ）、プレウロクリシス属（Ｐｌｅｕｒｏｃｈｒｙｓｉｓ）、アマノリ属（Ｐｏｒｈｙｒａ）、シュードアナベナ属（Ｐｓｅｕｄｏａｎａｂａｅｎａ）、ピラミモナス属（Ｐｙｒａｍｉｍｏｎａｓ）、スチココッカス属（Ｓｔｉｃｈｏｃｏｃｃｕｓ）、シネココッカス属（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ）、シネコシスティス属（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ）、テトラセルミス属（Ｔｅｔｒａｓｅｌｍｉｓ）、タラシオシラ属（Ｔｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ）、及びアイアカシオ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｓｍｉｕｍ）から選択される藻類が含まれる。
植物の一部、即ち「植物組織」を本発明の方法に従い処理して改良された植物を作り出し得る。植物組織は植物細胞も包含する。用語「植物細胞」は、本明細書で使用されるとき、インタクトな全植物であるか、或いはインビトロ組織培養下に培地又は寒天上で、成長培地又は緩衝液中の懸濁液中で、又は高度に組織化された単位、例えば、植物組織、植物器官、又は全植物などの一部として成長した単離された形態であるかのいずれかの、生きている植物の個々の単位を指す。
「プロトプラスト」は、その細胞壁を再形成し、増殖し及び再生して適切な成長条件下で全植物に成長することのできる生きている植物のインタクトな生化学的にコンピテントな単位をもたらす機械的又は酵素的手段を例えば用いてその保護細胞壁が完全に又は部分的に除去された植物細胞を指す。
用語「形質転換」は、広義には、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉａ）又は種々の化学的若しくは物理的方法の一つを用いたＤＮＡの導入によって植物宿主が遺伝子改変される方法を指す。本明細書で使用されるとき、用語「植物宿主」は、植物の任意の細胞、組織、器官、又は子孫を含め、植物を指す。多くの好適な植物組織又は植物細胞を形質転換することができ、限定はされないが、プロトプラスト、体細胞胚、花粉、葉、実生、茎、カルス、走根、微小管、及び苗条が挙げられる。植物組織はまた、有性生殖的に生成されたか、それとも無性生殖的に生成されたかに関わらず、かかる植物、種子、子孫、ムカゴの任意のクローン、及び挿し木又は種子など、これらのいずれかの子孫も指す。
用語「形質転換された」は、本明細書で使用されるとき、構築物などの外来性ＤＮＡ分子が導入されている細胞、組織、器官、又は生物を指す。導入されたＤＮＡ分子は、導入されたＤＮＡ分子が後続の子孫に伝わるようにレシピエント細胞、組織、器官、又は生物のゲノムＤＮＡに組み込まれてもよい。これらの実施形態において、「形質転換」又は「トランスジェニック」細胞又は植物にはまた、その細胞又は植物の子孫、及び交雑でかかる形質転換植物を親として用いる育種計画から作り出された、且つ導入されたＤＮＡ分子の存在によって生じる表現型の変化を呈する子孫も含まれ得る。好ましくは、トランスジェニック植物は稔性であり、導入されたＤＮＡを有性生殖を通じて子孫に伝えることが可能である。
トランスジェニック植物の子孫など、用語「子孫」は、植物又はトランスジェニック植物から生まれるか、それから作り出されたか、又はそれに由来するものである。導入ＤＮＡ分子はまた、レシピエント細胞に一過性に導入されてもよく、そのため導入ＤＮＡ分子は後続の子孫によって受け継がれないことになり、従って「トランスジェニック」とは見なされない。従って、本明細書で使用されるとき、「非トランスジェニック」植物又は植物細胞は、そのゲノムに安定に組み込まれた外来ＤＮＡを含有しない植物である。
用語「植物プロモーター」は、本明細書で使用されるとき、その起源が植物細胞であるか否かに関わらず、植物細胞において転写を開始させる能力を有するプロモーターである。例示的な適した植物プロモーターとしては、限定はされないが、植物、植物ウイルス、及び植物細胞で発現する遺伝子を含むアグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）又はリゾビウム属（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）などの細菌から得られるものが挙げられる。
本明細書で使用されるとき、「真菌細胞」は、真菌類の界内にある任意の種類の真核細胞を指す。真菌類の界内にある門としては、子嚢菌門（Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ）、担子菌門（Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｏｔａ）、コウマクノウキン門（Ｂｌａｓｔｏｃｌａｄｉｏｍｙｃｏｔａ）、ツボカビ門（Ｃｈｙｔｒｉｄｉｏｍｙｃｏｔａ）、グロムス門（Ｇｌｏｍｅｒｏｍｙｃｏｔａ）、微胞子虫門（Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｉｄｉａ）、及びネオカリマスティクス門（Ｎｅｏｃａｌｌｉｍａｓｔｉｇｏｍｙｃｏｔａ）が挙げられる。真菌細胞には、酵母、カビ、及び糸状菌類が含まれ得る。一部の実施形態において、真菌細胞は酵母細胞である。
本明細書で使用されるとき、用語「酵母細胞」は、子嚢菌門（Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ）及び担子菌門（Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｏｔａ）の範囲内にある任意の真菌細胞を指す。酵母細胞には、出芽酵母細胞、分裂酵母細胞、及びカビ細胞が含まれ得る。これらの生物に限定されないが、研究室及び工業環境で使用される多くの種類の酵母が、子嚢菌門（Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ）の一部である。一部の実施形態において、酵母細胞はＳ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｒｖｉｓｉａｅ）、クルイベロミセス・マルクシアヌス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｍａｒｘｉａｎｕｓ）、又はイサチェンキア・オリエンタリス（Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）細胞である。他の酵母細胞としては、限定なしに、カンジダ属種（Ｃａｎｄｉｄａ ｓｐｐ．）（例えば、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ））、ヤロウイア属種（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｓｐｐ．）（例えば、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ））、ピキア属種（Ｐｉｃｈｉａ ｓｐｐ．）（例えば、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ））、クルイベロミセス属種（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐｐ．）（例えば、クルイベロミセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）及びクルイベロミセス・マルクシアヌス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｍａｒｘｉａｎｕｓ））、アカパンカビ属種（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｓｐｐ．）（例えば、アカパンカビ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ））、フザリウム属種（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｐｐ．）（例えば、フザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ））、及びイサチェンキア属種（Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ ｓｐｐ．）（例えば、イサチェンキア・オリエンタリス（Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）、別名ピキア・クドリャフツェフィイ（Ｐｉｃｈｉａ ｋｕｄｒｉａｖｚｅｖｉｉ）及びカンジダ・アシドサーモフィルム（Ｃａｎｄｉｄａ ａｃｉｄｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ））を挙げることができる。一部の実施形態において、真菌細胞は糸状菌細胞である。本明細書で使用されるとき、用語「糸状菌細胞」は、フィラメント状に、即ち菌糸又は菌糸体として成長する任意の種類の真菌細胞を指す。糸状菌細胞の例としては、限定なしに、アスペルギルス属種（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｐｐ．）（例えば、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ））、トリコデルマ属種（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｓｐｐ．）（例えば、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ））、リゾプス属種（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｓｐｐ．）（例えば、リゾプス・オリゼ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｏｒｙｚａｅ））、及びモルティエレラ属種（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ｓｐｐ．）（例えば、モルティエレラ・イザベリナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ｉｓａｂｅｌｌｉｎａ））を挙げることができる。
一部の実施形態において、真菌細胞は工業用菌株である。本明細書で使用されるとき、「工業用菌株」は、工業的プロセス、例えば商業的又は工業的規模での製品の生産において使用されるか又はそれから単離される真菌細胞の任意の株を指す。工業用菌株は、典型的に工業的プロセスで使用される真菌種を指してもよく、又はそれは、非工業目的（例えば実験研究）にもまた使用され得る真菌種の分離株を指してもよい。工業的プロセスの例としては、発酵（例えば、食品又は飲料製品の生産における）、蒸留、バイオ燃料生産、化合物の生産、及びポリペプチドの生産を挙げることができる。工業用菌株の例としては、限定なしに、ＪＡＹ２７０及びＡＴＣＣ４１２４を挙げることができる。
一部の実施形態において、真菌細胞は倍数体細胞である。本明細書で使用されるとき、「倍数体」細胞は、ゲノムが２つ以上のコピーで存在する任意の細胞を指し得る。倍数体細胞は、天然で倍数体状態で見られる種類の細胞を指してもよく、又はそれは、倍数体状態で存在するように（例えば、減数分裂、細胞質分裂、又はＤＮＡ複製の特異的な調節、変化、不活性化、活性化、又は改変によって）誘導された細胞を指してもよい。倍数体細胞は、ゲノム全体が倍数体である細胞を指してもよく、又はそれは、特定の目的のゲノム遺伝子座において倍数体である細胞を指してもよい。理論に拘束されることを望むものではないが、一倍体細胞と比べて倍数体細胞のゲノムエンジニアリングではガイドＲＮＡの存在量が律速成分となることが多くなり得るため、本明細書に記載されるＣ２ｃ２ ＣＲＩＳＰＲＳ系を用いた方法は特定の真菌細胞タイプの使用を生かし得ると考えられる。
一部の実施形態において、真菌細胞は二倍体細胞である。本明細書で使用されるとき、「二倍体」細胞は、ゲノムが２つのコピーで存在する任意の細胞を指し得る。二倍体細胞は、天然で二倍体状態で見られる種類の細胞を指してもよく、又はそれは、二倍体状態で存在するように（例えば、減数分裂、細胞質分裂、又はＤＮＡ複製の特異的な調節、変化、不活性化、活性化、又は改変によって）誘導された細胞を指してもよい。例えば、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株Ｓ２２８Ｃは、一倍体又は二倍体状態で維持され得る。二倍体細胞は、ゲノム全体が二倍体である細胞を指してもよく、又はそれは、特定の目的のゲノム遺伝子座において二倍体である細胞を指してもよい。一部の実施形態において、真菌細胞は一倍体細胞である。本明細書で使用されるとき、「一倍体」細胞は、ゲノムが１つのコピーで存在する任意の細胞を指し得る。一倍体細胞は、天然で一倍体状態で見られる種類の細胞を指してもよく、又はそれは、一倍体状態で存在するように（例えば、減数分裂、細胞質分裂、又はＤＮＡ複製の特異的な調節、変化、不活性化、活性化、又は改変によって）誘導された細胞を指してもよい。例えば、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株Ｓ２２８Ｃは、一倍体又は二倍体状態で維持され得る。一倍体細胞は、ゲノム全体が一倍体である細胞を指してもよく、又はそれは、特定の目的のゲノム遺伝子座において一倍体である細胞を指してもよい。
本明細書で使用されるとき、「酵母発現ベクター」は、ＲＮＡ及び／又はポリペプチドをコードする１つ以上の配列を含有する核酸であって、且つその１つ又は複数の核酸の発現を制御する任意の所望のエレメント、並びに酵母細胞内部における発現ベクターの複製及び維持を可能にする任意のエレメントを更に含有し得る核酸を指す。多くの好適な酵母発現ベクター及びそれらの特徴が当該技術分野において公知である；例えば、様々なベクター及び技法が、Ｙｅａｓｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｘｉａｏ，Ｗ．，ｅｄ．（Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，２００７）及びＢｕｃｋｈｏｌｚ，Ｒ．Ｇ．ａｎｄ Ｇｌｅｅｓｏｎ，Ｍ．Ａ．（１９９１）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＮＹ）９（１１）：１０６７－７２に例示されている。酵母ベクターは、限定なしに、セントロメア（ＣＥＮ）配列、自己複製配列（ＡＲＳ）、目的の配列又は遺伝子に作動可能に連結されるＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターなどのプロモーター、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩターミネーターなどのターミネーター、複製起点、及びマーカー遺伝子（例えば、栄養要求体、抗生物質、又は他の選択可能マーカー）を含有し得る。酵母において用いられる発現ベクターの例としては、プラスミド、酵母人工染色体、２μプラスミド、酵母組込みプラスミド、酵母複製プラスミド、シャトルベクター、及びエピソームプラスミドを挙げることができる。
植物及び植物細胞のゲノムにおけるＲＮＡターゲティングＣＲＩＳＰ系構成成分の安定組込み
詳細な実施形態では、植物細胞のゲノムへの安定組込みのためＲＮＡターゲティングＣＲＩＳＰＲ系の構成成分をコードするポリヌクレオチドを導入することが想定される。これらの実施形態において、形質転換ベクター又は発現系の設計は、いつ、どこで、及びどのような条件下でガイドＲＮＡ及び／又は１つ又は複数のＲＮＡターゲティング遺伝子を発現させるかに応じて調整することができる。
詳細な実施形態では、ＲＮＡターゲティングＣＲＩＳＰＲ系の構成成分を植物細胞のゲノムＤＮＡに安定に導入することが想定される。それに加えて又は代えて、限定はされないがプラスチド、ミトコンドリア又は葉緑体などの植物細胞小器官のＤＮＡへの安定組込みのためＲＮＡターゲティングＣＲＩＳＰＲ系の構成成分を導入することが想定される。
植物細胞のゲノムに安定に組み込むための発現系は、以下のエレメントの１つ以上を含有し得る：植物細胞においてガイドＲＮＡ及び／又はＲＮＡターゲティング酵素を発現させるために使用し得るプロモーターエレメント；発現を増強する５’非翻訳領域；単子葉植物細胞など、特定の細胞における発現を更に増強するイントロンエレメント；１つ以上のガイドＲＮＡ及び／又はＲＮＡターゲティング遺伝子配列及び他の所望のエレメントを挿入するのに好都合な制限部位を提供する多クローニング部位；及び発現した転写物の効率的な終結をもたらす３’非翻訳領域。
発現系のエレメントは、プラスミド又は形質転換ベクターのように環状か、又は線状二本鎖ＤＮＡのように非環状かのいずれかである１つ以上の発現構築物上にあってもよい。
詳細な実施形態では、ＲＮＡターゲティングＣＲＩＳＰＲ発現系は、少なくとも：
（ａ）植物の標的配列とハイブリダイズするガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）であって、ガイド配列とダイレクトリピート配列とを含むガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列、及び
（ｂ）ＲＮＡターゲティングタンパク質をコードするヌクレオチド配列
を含み、
ここで構成成分（ａ）又は（ｂ）は同じ又は異なる構築物上に位置し、及びこれによって異なるヌクレオチド配列が、植物細胞において作動可能な同じ又は異なる調節エレメントの制御下にあることができる。
ＲＮＡターゲティングＣＲＩＳＰＲ系の構成成分、及び該当する場合には鋳型配列を含有する１つ又は複数のＤＮＡ構築物は、種々の従来技術によって植物、植物部位、又は植物細胞のゲノムに導入し得る。このプロセスには、概して、好適な宿主細胞又は宿主組織を選択するステップ、宿主細胞又は宿主組織に１つ又は複数の構築物を導入するステップ、及びそれから植物細胞又は植物を再生するステップが含まれる。
詳細な実施形態では、ＤＮＡ構築物は、限定はされないが、電気穿孔、マイクロインジェクション、植物細胞プロトプラストのエアロゾルビーム注入などの技法を用いて植物細胞に導入してもよく、又はＤＮＡ構築物は、ＤＮＡパーティクルボンバードメントなどの微粒子銃法を用いて植物組織に直接導入することもできる（Ｆｕ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｒｅｓ．２０００ Ｆｅｂ；９（１）：１１－９もまた参照）。パーティクルボンバードメントの基本は、１つ又は複数の目的の遺伝子で被覆された粒子を細胞に向けて加速させることにより粒子を原形質に侵入させて、典型的にはゲノムへの安定組込みを得るというものである（例えば、Ｋｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ（１９８７）、Ｋｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９２）、Ｃａｓａｓ ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９３）を参照）。
詳細な実施形態では、ＲＮＡターゲティングＣＲＩＳＰＲ系の構成成分を含有するＤＮＡ構築物は、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）媒介性形質転換によって植物に導入し得る。ＤＮＡ構築物を好適なＴ－ＤＮＡフランキング領域と組み合わせて、従来のアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）宿主ベクターに導入し得る。外来ＤＮＡは、植物を感染させることによるか、又は植物プロトプラストを、１つ以上のＴｉ（腫瘍誘発）プラスミドを含有するアグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）細菌と共にインキュベートすることにより、植物のゲノムに取り入れることができる（例えば、Ｆｒａｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，（１９８５），Ｒｏｇｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，（１９８７）及び米国特許第５，５６３，０５５号明細書を参照）。
植物プロモーター
植物細胞における適切な発現を確実にするため、本明細書に記載されるＣ２ｃ２ ＣＲＩＳＰＲ系の構成成分は、典型的には植物プロモーター、即ち植物細胞において作動可能なプロモーターの制御下に置かれる。様々な種類のプロモーターの使用が想定される。
構成的植物プロモーターは、それが制御するオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を植物の全て又はほぼ全ての発生段階において全て又はほぼ全ての植物組織で発現（「構成的発現」と称される）させることが可能なプロモーターである。構成的プロモーターの非限定的な一つの例はカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーターである。本発明は、ＲＮＡ配列の改変方法を想定し、そのため植物生体分子の発現を調節することもまた想定する。従って、本発明の詳細な実施形態では、ＲＮＡターゲティングＣＲＩＳＰＲ系の１つ以上のエレメントを調節型であり得るプロモーターの制御下に置くことが有利である。「調節型プロモーター」は、構成的でないものの時間的及び／又は空間的に調節された形で遺伝子発現を導くプロモーターを指し、組織特異的、組織優先的及び誘導性プロモーターが含まれる。異なるプロモーターは、異なる組織又は細胞型において、又は異なる発生段階で、又は異なる環境条件に応答して遺伝子の発現を導き得る。詳細な実施形態では、ＲＮＡターゲティングＣＲＩＳＰＲ構成成分の１つ以上がカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーターなどの構成的プロモーターの制御下で発現し、組織優先的（ｉｓｓｕｅ－ｐｒｅｆｅｒｒｅｄ）プロモーターを利用することにより、特定の植物組織内のある種の細胞型、例えば葉又は根の維管束細胞又は種子の特異的細胞における発現の増強を標的化することができる。ＲＮＡターゲティングＣＲＩＳＰＲ系において用いられる詳細なプロモーターの例については、Ｋａｗａｍａｔａ ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ ３８：７９２－８０３；Ｙａｍａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｐｌａｎｔ Ｊ １２：２５５－６５；Ｈｉｒｅ ｅｔ ａｌ，（１９９２）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２０：２０７－１８、Ｋｕｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ，（１９９５）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２９：７５９－７２、及びＣａｐａｎａ ｅｔ ａｌ．，（１９９４）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２５：６８１－９１が参照される。誘導性で、且つ遺伝子編集又は遺伝子発現の時空間的制御を可能にするプロモーターの例は、ある形態のエネルギーを使用し得る。エネルギーの形態としては、限定はされないが、音響エネルギー、電磁放射線、化学エネルギー及び／又は熱エネルギーを挙げることができる。誘導性系の例としては、テトラサイクリン誘導性プロモーター（Ｔｅｔ－Ｏｎ又はＴｅｔ－Ｏｆｆ）、小分子ツーハイブリッド転写活性化システム（ＦＫＢＰ、ＡＢＡ等）、又は光誘導性系（フィトクロム、ＬＯＶドメイン、又はクリプトクロム）、例えば転写活性の配列特異的変化を導く光誘導性転写エフェクター（ＬＩＴＥ）が挙げられる。光誘導性系の構成成分には、ＲＮＡターゲティングＣＲＩＳＰＲ酵素、光応答性シトクロムヘテロ二量体（例えばシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）由来）、及び転写活性化／抑制ドメインが含まれ得る。誘導性ＤＮＡ結合タンパク質及びその使用方法の更なる例が、米国仮特許出願第６１／７３６４６５号明細書及び米国仮特許出願第６１／７２１，２８３号明細書（本明細書によって全体として参照により援用される）に提供される。
詳細な実施形態では、例えば化学物質調節型プロモーターを使用して一過性又は誘導性発現を実現することができ、即ちこれによれば外因性化学物質を加えると遺伝子発現が誘導される。遺伝子発現の調節はまた、化学物質抑制性プロモーターによっても達成することができ、ここでは化学物質を加えると遺伝子発現が抑制される。化学物質誘導性プロモーターとしては、限定はされないが、ベンゼンスルホンアミド系除草剤解毒剤によって活性化するトウモロコシｌｎ２－２プロモーター（Ｄｅ Ｖｅｙｌｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ ３８：５６８－７７）、発芽前除草剤として使用される疎水性求電子化合物によって活性化するトウモロコシＧＳＴプロモーター（ＧＳＴ－ＩＩ－２７、国際公開第９３／０１２９４号パンフレット）、及びサリチル酸によって活性化するタバコＰＲ－１ａプロモーター（Ｏｎｏ ｅｔ ａｌ．，（２００４）Ｂｉｏｓｃｉ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ ６８：８０３－７）が挙げられる。テトラサイクリン誘導性及びテトラサイクリン抑制性プロモーターなど、抗生物質によって調節されるプロモーター（Ｇａｔｚ ｅｔ ａｌ．，（１９９１）Ｍｏｌ Ｇｅｎ Ｇｅｎｅｔ ２２７：２２９－３７；米国特許第５，８１４，６１８号明細書及び同第５，７８９，１５６号明細書）もまた、本明細書において使用することができる。
特定の植物細胞小器官における移行及び／又はそこでの発現
発現系は、特定の植物細胞小器官への移行及び／又はそこでの発現のためのエレメントを含み得る。
葉緑体ターゲティング
詳細な実施形態では、ＲＮＡターゲティングＣＲＩＳＰＲ系を使用して葉緑体遺伝子の発現及び／又は翻訳を特異的に改変し、又は葉緑体での発現を確実にすることが想定される。この目的で、葉緑体形質転換方法又はＲＮＡターゲティングＣＲＩＳＰＲ構成成分の葉緑体への区画化が用いられる。例えば、プラスチドゲノムに遺伝子改変を導入すると、花粉を通じた遺伝子流動などのバイオセーフティ問題を軽減することができる。
葉緑体形質転換方法は当該技術分野において公知であり、パーティクルボンバードメント、ＰＥＧ処理、及びマイクロインジェクションが挙げられる。加えて、国際公開第２０１００６１１８６号パンフレットに記載されるとおり、核ゲノムからプラスチドへの形質転換カセットの移行が関わる方法を用いることができる。
或いは、ＲＮＡターゲティングＣＲＩＳＰＲ構成成分の１つ以上を植物葉緑体に標的化することが想定される。これは、ＲＮＡターゲティングタンパク質をコードする配列の５’領域に作動可能に連結された、葉緑体輸送ペプチド（ＣＴＰ）又はプラスチド輸送ペプチドをコードする配列を発現構築物に取り込むことにより実現する。ＣＴＰは葉緑体への移行中にプロセシング段階で除去される。発現タンパク質の葉緑体ターゲティングは当業者に周知である（例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｔｒａｎｓｐｏｒｔ ｉｎｔｏ Ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔｓ，２０１０，Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．６１：１５７－１８０を参照）。かかる実施形態では、１つ以上のガイドＲＮＡを植物葉緑体に標的化することもまた望ましい。葉緑体局在化配列を用いてガイドＲＮＡを葉緑体に移行させるために用いることのできる方法及び構築物については、例えば、米国特許出願公開第２００４０１４２４７６号明細書（参照により本明細書に援用される）に記載されている。かかる各種構築物を本発明の発現系に取り込むことにより、１つ又は複数のＲＮＡターゲティングガイドＲＮＡを効率的に移行させることができる。
藻類細胞におけるＣＲＩＳＰＲ－ＲＮＡターゲティング系をコードするポリヌクレオチドの導入
トランスジェニック藻類（又はセイヨウアブラナなどの他の植物）は、植物油又はバイオ燃料、例えばアルコール類（特にメタノール及びエタノール）又は他の生産物の生産に特に有用であり得る。これらは、油又はバイオ燃料産業で使用される高レベルの油又はアルコールを発現又は過剰発現するようにエンジニアリングされ得る。
米国特許第８９４５８３９号明細書は、Ｃａｓ９を用いた微細藻類（コナミドリムシ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ）細胞）種）のエンジニアリング方法について記載している。同様のツールを使用して、本明細書に記載されるＲＮＡターゲティングＣＲＩＳＰＲ系の方法をクラミドモナス属（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ）種及び他の藻類に適用することができる。詳細な実施形態では、Ｈｓｐ７０Ａ－Ｒｂｃ Ｓ２又はβ２－チューブリンなどの構成的プロモーターの制御下でＲＮＡターゲティングタンパク質を発現するベクターを使用して藻類にＲＮＡターゲティングタンパク質及び１つ又は複数のガイドＲＮＡを導入し、発現させる。ガイドＲＮＡは、任意選択で、Ｔ７プロモーターを含有するベクターを使用して送達される。或いは、藻類細胞にＲＮＡターゲティングｍＲＮＡ及びインビトロ転写ガイドＲＮＡが送達されてもよい。当業者には、ＧｅｎｅＡｒｔクラミドモナスエンジニアリングキットからの標準的な推奨プロトコルなど、電気穿孔プロトコルが利用可能である。
酵母細胞におけるＲＮＡターゲティング構成成分をコードするポリヌクレオチドの導入
詳細な実施形態では、本発明は、酵母細胞におけるＲＮＡ編集のためのＲＮＡターゲティングＣＲＩＳＰＲ系の使用に関する。ＲＮＡターゲティングＣＲＩＳＰＲ系構成成分をコードするポリヌクレオチドの導入に用いることのできる酵母細胞の形質転換方法は当業者に周知であり、Ｋａｗａｉ ｅｔ ａｌ．，２０１０，Ｂｉｏｅｎｇ Ｂｕｇｓ．２０１０ Ｎｏｖ－Ｄｅｃ；１（６）：３９５－４０３）によってレビューされている。非限定的な例としては、酢酸リチウム処理による酵母細胞の形質転換（これはキャリアＤＮＡ及びＰＥＧ処理を更に含み得る）、ボンバードメント又は電気穿孔によるものが挙げられる。
植物及び植物細胞におけるＲＮＡターゲティングＣＲＩＳＰ系構成成分の一過性発現
詳細な実施形態では、ガイドＲＮＡ及び／又はＲＮＡターゲティング遺伝子を植物細胞において一過性に発現させることが想定される。これらの実施形態では、細胞内にガイドＲＮＡ及びＲＮＡターゲティングタンパク質の両方が存在するときに限りＲＮＡターゲティングＣＲＩＳＰＲ系がＲＮＡ標的分子を改変することが確実となり、従って遺伝子発現を更に制御することができる。ＲＮＡターゲティング酵素の発現は一過性であるため、かかる植物細胞から再生した植物は典型的には外来ＤＮＡを含有しない。詳細な実施形態では、ＲＮＡターゲティング酵素は植物細胞によって安定に発現し、ガイド配列が一過性に発現する。
特に好ましい実施形態において、ＲＮＡターゲティングＣＲＩＳＰＲ系構成成分は植物ウイルスベクターを使用して植物細胞に導入することができる（Ｓｃｈｏｌｔｈｏｆ ｅｔ ａｌ．１９９６，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌ．１９９６；３４：２９９－３２３）。更なる詳細な実施形態では、前記ウイルスベクターはＤＮＡウイルス由来のベクターである。例えば、ジェミニウイルス（例えば、キャベツ巻葉ウイルス、マメ萎黄ウイルス、コムギ萎縮ウイルス、トマト巻葉ウイルス、トウモロコシ条斑ウイルス、タバコ巻葉ウイルス、又はトマトゴールデンモザイクウイルス）又はナノウイルス（例えば、ソラマメ黄化えそウイルス）。他の詳細な実施形態では、前記ウイルスベクターはＲＮＡウイルス由来のベクターである。例えば、トブラウイルス（例えば、タバコ茎えそウイルス、タバコモザイクウイルス）、ポテックスウイルス（例えば、ジャガイモＸウイルス）、又はホルデイウイルス（例えば、ムギ斑葉モザイクウイルス）。植物ウイルスの複製ゲノムは非組込みベクターであり、これはＧＭＯ植物の作製の回避との関連で有利である。
詳細な実施形態では、ＲＮＡターゲティングＣＲＩＳＰＲ構築物の一過性発現に使用されるベクターは、例えばｐＥＡＱベクターであり、これはプロトプラストにおけるアグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）媒介性一過性発現に合わせて調整されているものである（Ｓａｉｎｓｂｕｒｙ Ｆ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｊ．２００９ Ｓｅｐ；７（７）：６８２－９３）。ＣＲＩＳＰＲ酵素を発現する安定トランスジェニック植物において改変キャベツ巻葉ウイルス（ＣａＬＣｕＶ）ベクターを使用してｇＲＮＡを発現させた、ゲノム位置の正確なターゲティングが実証された（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ ５，Ａｒｔｉｃｌｅ ｎｕｍｂｅｒ：１４９２６（２０１５），ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓｒｅｐ１４９２６）。
詳細な実施形態では、ガイドＲＮＡ及び／又はＲＮＡターゲティング遺伝子をコードする二本鎖ＤＮＡ断片を植物細胞に一過性に導入することができる。かかる実施形態において、導入される二本鎖ＤＮＡ断片は、細胞において１つ又は複数のＲＮＡ分子を改変するのに十分な、しかし企図された時間が経った後又は１回以上の細胞分裂後に残らない量で提供される。植物においてＤＮＡトランスファーを導く方法は当業者に公知である（例えば、Ｄａｖｅｙ ｅｔ ａｌ．Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．１９８９ Ｓｅｐ；１３（３）：２７３－８５を参照）
他の実施形態では、ＲＮＡターゲティングタンパク質をコードするＲＮＡポリヌクレオチドが、１つ又は複数のＲＮＡ分子細胞を（少なくとも１つのガイドＲＮＡの存在下で）改変するのに十分な、しかし企図された時間が経った後又は１回以上の細胞分裂後に残らない量で植物細胞に導入され、次にはこれが宿主細胞によって翻訳及びプロセシングされて、タンパク質が生成される。植物プロトプラストにｍＲＮＡを一過性発現のため導入する方法は当業者に公知である（例えば、Ｇａｌｌｉｅ，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ（１９９３），１３；１１９－１２２を参照）。上記に記載される異なる方法の組み合わせもまた想定される。
植物細胞へのＲＮＡターゲティングＣＲＩＳＰＲ構成成分の送達
詳細な実施形態では、ＲＮＡターゲティングＣＲＩＳＰＲ系の１つ以上の構成成分を植物細胞に直接送達することが有益である。これは特に、非トランスジェニック植物の作成に有益である（下記参照）。詳細な実施形態では、ＲＮＡターゲティング構成成分の１つ以上が植物又は植物細胞の外部で調製され、細胞に送達される。例えば詳細な実施形態では、ＲＮＡターゲティングタンパク質がインビトロで調製された後、植物細胞に導入される。ＲＮＡターゲティングタンパク質は当業者に公知の、組換え産生を含めた様々な方法によって調製することができる。発現後、ＲＮＡターゲティングタンパク質が単離され、必要に応じてリフォールディングされ、精製され、及び任意選択でＨｉｓタグなどの任意の精製タグを除去するため処理される。粗製の、部分的に精製された、又はより完全に精製されたＲＮＡターゲティングタンパク質が得られると、そのタンパク質が植物細胞に導入され得る。
詳細な実施形態では、ＲＮＡターゲティングタンパク質が、目的のＲＮＡを標的とするガイドＲＮＡと混合されて、予めアセンブルされたリボ核タンパク質が形成される。
個々の構成成分又は予めアセンブルされたリボ核タンパク質は、電気穿孔を用いるか、ＲＮＡターゲティング関連遺伝子産物で被覆した粒子のボンバードメントによるか、化学的トランスフェクションによるか、又は細胞膜を越えて輸送する他の何らかの手段によって植物細胞に導入することができる。例えば、予めアセンブルされたＣＲＩＳＰＲリボ核タンパク質による植物プロトプラストのトランスフェクションは、植物ゲノムの標的化した改変を確実にすることが実証されている（Ｗｏｏ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１５；ＤＯＩ：１０．１０３８／ｎｂｔ．３３８９による記載のとおり）。これらの方法を修正して、植物におけるＲＮＡ分子の標的化した改変を実現することができる。
詳細な実施形態では、ＲＮＡターゲティングＣＲＩＳＰＲ系構成成分はナノ粒子を用いて植物細胞に導入される。構成成分は、タンパク質又は核酸のいずれとしても、或いはそれらの組み合わせでも、ナノ粒子上にアップロードするか又はそれにパッケージングして植物に適用することができる（例えば国際公開第２００８０４２１５６号パンフレット及び米国特許出願公開第２０１３０１８５８２３号明細書の記載など）。詳細には、本発明の実施形態は、国際公開第２０１５０８９４１９号パンフレットに記載されるとおり、ＲＮＡターゲティングタンパク質をコードする１つ又は複数のＤＮＡ分子、ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡ分子及び／又は単離ガイドＲＮＡがアップロード又はパッケージングされたナノ粒子を含む。
ＲＮＡターゲティングＣＲＩＳＰＲ系の１つ以上の構成成分を植物細胞に導入する更なる手段は、細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）を用いることによるものである。従って、詳細には、本発明の実施形態は、ＲＮＡターゲティングタンパク質に連結された細胞透過性ペプチドを含む組成物を含む。本発明の詳細な実施形態において、ＲＮＡターゲティングタンパク質及び／又は１つ又は複数のガイドＲＮＡは、それらを植物プロトプラストの内部に有効に輸送するため１つ以上のＣＰＰにカップリングされる（ヒト細胞におけるＣａｓ９については、Ｒａｍａｋｒｉｓｈｎａ（２０１４ Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．２０１４ Ｊｕｎ；２４（６）：１０２０－７）。他の実施形態において、ＲＮＡターゲティング遺伝子及び／又は１つ又は複数のガイドＲＮＡは、植物プロトプラスト送達のため１つ以上のＣＰＰにカップリングされた１つ以上の環状又は非環状ＤＮＡ分子によってコードされる。次に植物プロトプラストは、植物細胞、及び更には植物に再生される。ＣＰＰは、概して、生体分子を受容体非依存的に細胞膜を越えて輸送する能力を有するタンパク質又はキメラ配列のいずれかに由来する３５アミノ酸未満の短鎖ペプチドとして記載される。ＣＰＰは、カチオン性ペプチド、疎水性配列を有するペプチド、両親媒性ペプチド、プロリンリッチな抗微生物性の配列を有するペプチド、及びキメラ又は二部ペプチドであってもよい（Ｐｏｏｇａ ａｎｄ Ｌａｎｇｅｌ ２００５）。ＣＰＰは生体膜を透過することが可能であり、そのため様々な生体分子の細胞膜を越えて細胞質に入る移動を引き起こし、及びそれらの細胞内輸送を改善することが可能であり、ひいては生体分子（ｂｉｏｌｏｍｏｌｅｃｕｌｅ）と標的の相互作用を促進する。ＣＰＰの例としては、中でも特に、ＨＩＶ １型によるウイルス複製に必要な核内転写活性化タンパク質であるＴａｔ、ペネトラチン、カポジ線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）シグナルペプチド配列、インテグリンβ３シグナルペプチド配列；ポリアルギニンペプチドＡｒｇ配列、グアニンリッチ分子輸送体、スイートアローペプチド等が挙げられる。
植物、藻類又は真菌適用が想定される標的ＲＮＡ
標的ＲＮＡ、即ち目的のＲＮＡは、本発明によって標的化されるＲＮＡであり、標的ＲＮＡ上の目的の標的部位へのＲＮＡターゲティングタンパク質の動員、及びそこにおける結合につながる。標的ＲＮＡは任意の好適な形態のＲＮＡであってよい。これには、一部の実施形態では、ｍＲＮＡが含まれ得る。他の実施形態では、標的ＲＮＡにはトランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）又はリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）が含まれ得る。他の実施形態では、標的ＲＮＡには、干渉性ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、マイクロスイッチ、マイクロザイム、サテライトＲＮＡ及びＲＮＡウイルスが含まれ得る。標的ＲＮＡは植物細胞の細胞質に、又は細胞核に、又はミトコンドリア、葉緑体若しくはプラスチドなどの植物細胞小器官に位置し得る。
詳細な実施形態において、ＲＮＡターゲティングＣＲＩＳＰＲ系を使用してＲＮＡが切断され、又はその他、ＲＮＡ発現が阻害される。
ＲＮＡ調節による植物遺伝子発現の調節のためのＲＮＡターゲティングＣＲＩＳＰＲ系の使用
ＲＮＡターゲティングタンパク質はまた、好適なガイドＲＮＡと共に、ＲＮＡプロセシングの制御による遺伝子発現のターゲティングに使用されてもよい。ＲＮＡプロセシングの制御には、選択的スプライシング又は特定のスプライス変異体若しくはアイソフォームの特異的ターゲティングを含めたＲＮＡスプライシング；ウイルス複製（詳細には、植物のウイロイド（ｖｉｒｉｏｉｄ）を含めた植物ウイルスのもの、及びｔＲＮＡ生合成などのＲＮＡプロセシング反応が含まれ得る。好適なガイドＲＮＡと組み合わせたＲＮＡターゲティングタンパク質はまた、ＲＮＡ活性化（ＲＮＡａ）の制御に使用されてもよい。ＲＮＡａは遺伝子発現の促進につながり、そのため遺伝子発現の制御はＲＮＡａの破壊又は低減、従って遺伝子発現の促進低下による形で実現し得る。
本発明のＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質は、更に、植物における、特にＲＮＡウイルスに対する抗ウイルス活性に使用することができる。エフェクタータンパク質は、選択のウイルスＲＮＡ配列に選択的な好適なガイドＲＮＡを使用してウイルスＲＮＡに標的化することができる。詳細には、エフェクタータンパク質は、一本鎖ＲＮＡなど、ＲＮＡを切断する活性ヌクレアーゼであってもよい。従って、抗ウイルス剤としての本発明のＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質の使用が提供される。このように拮抗し得るウイルスの例としては、限定はされないが、タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）、トマト黄化えそウイルス（ＴＳＷＶ）、キュウリモザイクウイルス（ＣＭＶ）、ジャガイモウイルスＹ（ＰＶＹ）、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）（ＲＴウイルス）、プラムポックスウイルス（ＰＰＶ）、ブロムモザイクウイルス（ＢＭＶ）及びジャガイモＸウイルス（ＰＶＸ）が挙げられる。
標的遺伝子改変の代替手段としての、植物、藻類又は真菌におけるＲＮＡ発現の調節の例は、本明細書に更に記載される。
特に、調節されたｍＲＮＡ切断による調節された遺伝子発現制御が興味深い。これは、ＲＮＡターゲティングのエレメントを本明細書に記載されるとおりの調節型プロモーターの制御下に置くことにより実現し得る。
ｔＲＮＡ分子の機能を回復させるためのＲＮＡターゲティングＣＲＩＳＰＲ系の使用
Ｐｒｉｎｇ ｅｔ ａｌが、ＤＮＡと異なるタンパク質をコードするようにｍＲＮＡ配列を変化させる植物ミトコンドリア及び葉緑体におけるＲＮＡ編集について記載している。（Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９９３）２１（６）：１１６３－１１７０．ｄｏｉ：１０．１００７／ＢＦ０００２３６１１）。本発明の詳細な実施形態において、ミトコンドリア及び葉緑体ｍＲＮＡを特異的に標的化するＲＮＡターゲティングＣＲＩＳＰＲ系のエレメントを植物又は植物細胞に導入することにより、かかる植物細胞小器官で異なるタンパク質を発現させて、インビボで起こる過程を模倣することができる。
ＲＮＡ発現を阻害するためのＲＮＡ干渉の代替手段としてのＲＮＡターゲティングＣＲＩＳＰＲ系の使用
ＲＮＡターゲティングＣＲＩＳＰＲ系は、ＲＮＡ阻害又はＲＮＡ干渉と同様の用途があり、従ってかかる方法に代えることもできる。詳細な実施形態において、本発明の方法は、例えば干渉リボ核酸（ｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡ又はｄｓＲＮＡなど）の代わりとしてのＲＮＡターゲティングＣＲＩＳＰＲの使用を含む。標的遺伝子改変の代替手段としての植物、藻類又は真菌におけるＲＮＡ発現の阻害の例は、本明細書に更に記載される。
ＲＮＡ干渉を制御するためのＲＮＡターゲティングＣＲＩＳＰＲ系の使用
干渉性ＲＮＡ又はｍｉＲＮＡの制御は、インビボ又はインビトロで干渉性ＲＮＡ又はｍｉＲＮＡの寿命を短縮することによる手法で見られるオフターゲット効果（ＯＴＥ）を低減する助けとなり得る。詳細な実施形態において、標的ＲＮＡには干渉性ＲＮＡ、即ちＲＮＡ干渉経路に関与するＲＮＡ、例えばｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡなどが含まれ得る。他の実施形態において、標的ＲＮＡにはマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）又は二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）が含まれ得る。
他の詳細な実施形態において、ＲＮＡターゲティングタンパク質及び１つ又は複数の好適なガイドＲＮＡが（例えば空間的又は時間的に調節型プロモーター、例えば組織特異的又は細胞周期特異的プロモーター及び／又はエンハンサーの制御下で）選択的に発現する場合、これを用いて細胞又は系を（インビボ又はインビトロで）その細胞におけるＲＮＡｉから「保護」することができる。これは、ＲＮＡｉが必要ない隣接組織又は細胞において、又はエフェクタータンパク質及び好適なガイドが発現する及び発現しない（即ち、それぞれ、ＲＮＡｉが制御されない及びそれが制御される）細胞又は組織を比較する目的で有用であり得る。ＲＮＡターゲティングタンパク質を使用して、リボザイム、リボソーム又はリボスイッチなど、ＲＮＡを含む又はそれからなる分子を制御し、又は結合し得る。本発明の実施形態では、ガイドＲＮＡがＲＮＡターゲティングタンパク質をそうした分子に動員することにより、ＲＮＡターゲティングタンパク質はそれらに結合することが可能になる。
本発明のＲＮＡターゲティングＣＲＩＳＰＲ系は、本願がこの系を情報に基づきエンジニアリングするための基礎を提供するため、本開示から、過度の実験を行うことなく、害虫管理、植物病害管理及び除草剤耐性管理を含めた、並びに植物アッセイにおける、及び他の適用に向けたインプランタＲＮＡｉ技術の領域において適用することができる（例えば、Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｐｅｓｔｉｃｉｄｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ（Ｉｍｐａｃｔ Ｆａｃｔｏｒ：２．０１）．０１／２０１５；１２０．ＤＯＩ：１０．１０１６／ｊ．ｐｅｓｔｂｐ．２０１５．０１．００２；Ｓｈａｒｍａ ｅｔ ａｌ．ｉｎ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｊｏｕｒｎａｌｓ（２０１５），Ｖｏｌ．１２（１８）ｐｐ２３０３－２３１２）；Ｇｒｅｅｎ Ｊ．Ｍ，ｉｎＰｅｓｔ Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ ７０（９），ｐｐ １３５１－１３５７を参照）。
植物、藻類及び真菌においてリボスイッチを改変し、及び代謝調節を制御するためのＲＮＡターゲティングＣＲＩＳＰＲ系の使用
リボスイッチ（アプタザイム（ａｐｔｏｚｙｍｅ）としても知られる）はメッセンジャーＲＮＡの調節性セグメントであり、小分子に結合して、ひいては遺伝子発現を調節する。この機構により、細胞はそれらの小分子の細胞内濃度を検知することが可能になる。特定のリボスイッチは、典型的にはその隣接遺伝子を、その遺伝子の転写、翻訳又はスプライシングを変化させることによって調節する。従って、本発明の詳細な実施形態では、リボスイッチを標的とする好適なガイドＲＮＡと組み合わせたＲＮＡターゲティングタンパク質を使用することによるリボスイッチ活性の制御が想定される。これは、リボスイッチの切断、又はそれへの結合によるものであってもよい。詳細な実施形態では、リボスイッチ活性の低減が想定される。最近になってチアミンピロリン酸（ＴＰＰ）に結合するリボスイッチが特徴付けられ、植物及び藻類におけるチアミン生合成を調節することが分かった。更に、このエレメントは植物における一次代謝の必須調節因子であるものと見られる（Ｂｏｃｏｂｚａ ａｎｄ Ａｈａｒｏｎｉ，Ｐｌａｎｔ Ｊ．２０１４ Ａｕｇ；７９（４）：６９３－７０３．ｄｏｉ：１０．１１１１／ｔｐｊ．１２５４０．Ｅｐｕｂ ２０１４ Ｊｕｎ １７）。ＴＰＰリボスイッチはまた、アカパンカビ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）など、ある種の真菌にも見られ、ここでそれは選択的スプライシングを制御して上流オープンリーディングフレーム（ｕＯＲＦ）を条件的に産生し、それにより下流遺伝子の発現に影響を及ぼす（Ｃｈｅａｈ ＭＴ ｅｔ ａｌ．，（２００７）Ｎａｔｕｒｅ ４４７（７１４３）：４９７－５００．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ０５７６９）。本明細書に記載されるＲＮＡターゲティングＣＲＩＳＰＲ系を使用して植物、藻類又は真菌の内因性リボスイッチ活性を操作し、そのようにしてそれにより制御される下流遺伝子の発現を変化させてもよい。詳細な実施形態において、ＲＮＡターゲティングＣＲＩＳＰ系は、インビボ又はインビトロでのリボスイッチ機能のアッセイ及び代謝ネットワークに対するその関連性の研究において使用し得る。詳細な実施形態において、ＲＮＡターゲティングＣＲＩＳＰＲ系は、潜在的には、植物及び遺伝子制御プラットフォームにおける代謝産物センサーとしてのリボスイッチのエンジニアリングに使用し得る。
植物、藻類又は真菌のＲＮＡｉスクリーンにおけるＲＮＡターゲティングＣＲＩＳＰＲ系の使用
ＲＮＡｉスクリーンにより、そのノックダウンが表現型の変化に関連する遺伝子産物を同定して、生物学的経路を調べ及び構成要素を同定することができる。本発明の詳細な実施形態では、本明細書に記載されるガイド２９又はガイド３０タンパク質及び好適なガイドＲＮＡを使用してスクリーンにおけるＲＮＡｉの活性を除去し又は低下させ、ひいては（それまで干渉を受けていた）遺伝子産物の活性を（干渉／抑制を除去し又は低下させることで）回復させることにより、こうしたスクリーンにも、又はスクリーンの間も制御を及ぼし得る。
インビボ及びインビトロでＲＮＡ分子を可視化するためのＲＮＡターゲティングタンパク質の使用
詳細な実施形態において、本発明は核酸結合系を提供する。ＲＮＡと相補的プローブとのインサイチュハイブリダイゼーションは、強力な技法である。典型的には、ハイブリダイゼーションによる核酸の検出には蛍光ＤＮＡオリゴヌクレオチドが使用される。ロックド核酸（ＬＮＡ）など、ある種の改変によって効率の増加が達成されているが、効率的且つ汎用的な代替手段が依然として必要とされている。このように、インサイチュハイブリダイゼーション用の効率的且つ適合可能な系の代替手段として、ＲＮＡターゲティング系の標識エレメントを使用することができる。
植物及び酵母におけるＲＮＡターゲティングＣＲＩＳＰＲ系の更なる適用
バイオ燃料生産におけるＲＮＡターゲティングＣＲＩＳＰＲ系の使用
用語「バイオ燃料」は、本明細書で使用されるとき、植物及び植物由来の資源から作られる代替燃料である。再生可能バイオ燃料は、炭素固定の過程を通じてエネルギーを得てきた有機物から抽出することができ、又はバイオマスの使用若しくは変換によって作られる。このバイオマスはバイオ燃料に直接使用してもよく、又は熱変換、化学変換、及び生化学変換によって好都合なエネルギー含有物質に変換されてもよい。このバイオマス変換により、固体、液体、又は気体形態の燃料が得られ得る。バイオ燃料には、バイオエタノールとバイオディーゼルとの２種類がある。バイオエタノールは、主として、大部分がトウモロコシ及びサトウキビに由来するセルロース（デンプン）の糖発酵プロセスによって生産される。他方でバイオディーゼルは、主として、ナタネ、ヤシ、及びダイズなどの油料作物から生産される。バイオ燃料は主として輸送機関に用いられる。
バイオ燃料生産のための植物特性の増強
詳細な実施形態において、発酵に際して糖類がより効率的に放出されるよう主要な加水分解剤を到達し易くするため、本明細書に記載されるとおりのＲＮＡターゲティングＣＲＩＳＰＲを使用する方法を用いて細胞壁の特性を変化させる。詳細な実施形態では、セルロース及び／又はリグニンの生合成が改変される。セルロースは細胞壁の主要な構成成分である。セルロース及びリグニンの生合成は共調節される。植物中のリグニンの割合を低下させることにより、セルロースの割合が増加し得る。詳細な実施形態では、本明細書に記載される方法を用いて植物におけるリグニン生合成が下方制御され、それにより発酵性糖質を増加させる。より詳細には、国際公開第２００８０６４２８９ Ａ２号パンフレットに開示されるとおり、本明細書に記載される方法を用いて、４－クマル酸３－ヒドロキシラーゼ（Ｃ３Ｈ）、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）、桂皮酸－４－ヒドロキシラーゼ（Ｃ４Ｈ）、ヒドロキシシンナモイルトランスフェラーゼ（ＨＣＴ）、コーヒー酸Ｏ－メチルトランスフェラーゼ（ＣＯＭＴ）、カフェオイルＣｏＡ３－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ（ＣＣｏＡＯＭＴ）、フェルラ酸５－ヒドロキシラーゼ（Ｆ５Ｈ）、シンナミルアルコールデヒドロゲナーゼ（ＣＡＤ）、シンナモイルＣｏＡ－レダクターゼ（ＣＣＲ）、４－クマル酸－ＣｏＡリガーゼ（４ＣＬ）、モノリグノール－リグニン特異的グリコシルトランスフェラーゼ、及びアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＡＬＤＨ）からなる群から選択される少なくとも第１のリグニン生合成遺伝子が下方制御される。
詳細な実施形態において、本明細書に記載される方法を用いて、発酵中に発生する酢酸レベルがより低い植物マスが作製される（国際公開第２０１００９６４８８号パンフレットもまた参照のこと）。
バイオ燃料生産のための酵母の改変
詳細な実施形態において、本明細書に提供されるＲＮＡターゲティング酵素は組換え微生物によるバイオエタノールの生産に使用される。例えば、ＲＮＡターゲティング酵素を使用して酵母などの微生物をエンジニアリングすることにより、発酵性糖類からバイオ燃料又はバイオポリマーを作成することができ、及び任意選択で発酵性糖類の供給源としての農業廃棄物から得られた植物由来のリグノセルロースを分解することが可能である。より詳細には、本発明は、ＲＮＡターゲティングＣＲＩＳＰＲ複合体を使用してバイオ燃料生産に必要な内因性遺伝子の発現を改変し、及び／又はバイオ燃料合成を妨げ得る内因性遺伝子を改変する方法を提供する。より詳細には、本方法は、ピルビン酸からエタノール又は別の目的産物への変換に関与する酵素をコードする１つ以上のヌクレオチド配列の酵母などの微生物における発現を刺激することを含む。詳細な実施形態では、本方法は、セルラーゼなど、微生物によるセルロースの分解を実現する１つ以上の酵素の発現の刺激を確実にする。更に別の実施形態では、ＲＮＡターゲティングＣＲＩＳＰＲ複合体を使用して、バイオ燃料生産経路と競合する内因性代謝経路が抑制される。
植物油又はバイオ燃料の生産のための藻類及び植物の改変
トランスジェニック藻類又はセイヨウアブラナなどの他の植物は、植物油又はバイオ燃料、例えばアルコール類（特にメタノール及びエタノール）の生産に特に有用であり得る。これらは、油又はバイオ燃料産業で使用される高レベルの油又はアルコールを発現又は過剰発現するようにエンジニアリングされ得る。
米国特許第８９４５８３９号明細書は、Ｃａｓ９を用いた微細藻類（コナミドリムシ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ）細胞）種）のエンジニアリング方法について記載している。同様のツールを使用して、本明細書に記載されるＲＮＡターゲティングＣＲＩＳＰＲ系の方法をクラミドモナス属（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ）種及び他の藻類に適用することができる。詳細な実施形態では、Ｈｓｐ７０Ａ－Ｒｂｃ Ｓ２又はβ２－チューブリンなどの構成的プロモーターの制御下でＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質を発現するベクターを使用して藻類にＲＮＡターゲティングエフェクター（ｅｆｆｅｔｏｒ）タンパク質及びガイドＲＮＡを導入し、発現させる。ガイドＲＮＡは、Ｔ７プロモーターを含有するベクターを使用して送達されることになる。或いは、インビトロ転写されたガイドＲＮＡが藻類細胞に送達されてもよい。電気穿孔プロトコルは、ＧｅｎｅＡｒｔクラミドモナスエンジニアリングキットの標準的な推奨プロトコルに従う。
植物におけるＲＮＡターゲティング酵素の詳細な適用
詳細な実施形態では、本発明は、ウイルスＲＮＡを切断することが可能であるため、植物系におけるウイルス除去用治療薬として使用することができる。ヒト系における先行研究は、一本鎖ＲＮＡウイルス、Ｃ型肝炎（Ａ．Ｐｒｉｃｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ，２０１５）のターゲティングにおけるＣＲＩＳＰＲの利用の成功を実証している。これらの方法はまた、植物におけるＲＮＡターゲティングＣＲＩＳＰＲ系の使用にも適合させ得る。
改良植物
本発明はまた、本明細書に提供される方法によって得ることのできる及びそれによって得られた植物及び酵母細胞も提供する。本明細書に記載される方法によって得られた改良植物は、例えば、植物害虫、除草剤、乾燥、低温又は高温、過剰な水等に対する耐性を確実にする遺伝子の発現の改変により、食品又は飼料製造において有用となり得る。
本明細書に記載される方法によって得られた改良植物、特に作物及び藻類は、例えば、通常野生型に見られるであろうよりも高いタンパク質、炭水化物、栄養素又はビタミンレベルの発現により、食品又は飼料製造において有用となり得る。この点で、改良植物、特に豆類及び塊茎が好ましい。
改良藻類又はセイヨウアブラナなどの他の植物は、植物油又はバイオ燃料、例えばアルコール類（特にメタノール及びエタノール）の生産に特に有用であり得る。これらは、油又はバイオ燃料産業で使用される高レベルの油又はアルコールを発現又は過剰発現するようにエンジニアリングされ得る。
本発明はまた、植物の改良された部位も提供する。植物部位としては、限定はされないが、葉、茎、根、塊茎、種子、胚乳、胚珠、及び花粉が挙げられる。本明細書において想定されるとおりの植物部位は、生育可能、生育不能、再生可能、及び／又は再生不能であってもよい。
また、本明細書には、本発明の方法によって作成された植物細胞及び植物を提供することも包含される。従来の育種方法によって作製された、遺伝子改変を含む植物の配偶子、種子、胚（接合胚であれ又は体細胞胚であれ）、子孫又は雑種もまた、本発明の範囲内に含まれる。かかる植物は、標的配列に挿入されるか又はそれの代わりに挿入された異種又は外来性ＤＮＡ配列を含有し得る。或いは、かかる植物は、１つ以上のヌクレオチドに、ある変化（突然変異、欠失、挿入、置換）のみを含有し得る。そのため、かかる植物はその先祖植物と特定の改変の存在だけが異なるに過ぎないことになる。
本発明のある実施形態では、Ｃ２ｃ２系を使用して、例えば細菌、真菌又はウイルスによって引き起こされる疾患に対する抵抗性を作り出すことにより、病原体抵抗性植物がエンジニアリングされる。特定の実施形態において、病原体抵抗性は、害虫が摂取して死亡につながるであろうＣ２ｃ２系が作り出されるように作物をエンジニアリングすることにより達成され得る。本発明のある実施形態では、Ｃ２ｃ２系を使用して非生物的ストレス耐性がエンジニアリングされる。別の実施形態では、Ｃ２ｃ２系を使用して干ばつストレス耐性又は塩ストレス耐性、又は低温若しくは熱ストレス耐性がエンジニアリングされる。Ｙｏｕｎｉｓ ｅｔ ａｌ．２０１４，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｓｃｉ．１０；１１５０は植物育種方法の潜在的標的をレビューしており、その全てが本明細書に記載されるＣ２ｃ２系を使用した修正又は改良に適している。一部の非限定的な標的作物としては、シロイヌナズナ属（Ａｒａｂｉｄｏｐｓ）トウモロコシ（Ｚｅａ ｍａｙｓ）はタリアナ（ｔｈａｌｉａｎａ）であり、イネ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ Ｌ）、セイヨウスモモ（Ｐｒｕｎｕｓ ｄｏｍｅｓｔｉｃａ Ｌ．）、ワタ（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ ｈｉｒｓｕｔｕｍ）、ニコチアナ・ルスティカ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｒｕｓｔｉｃａ）、トウモロコシ（Ｚｅａ ｍａｙｓ）、ムラサキウマゴヤシ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｓａｔｉｖａ）、ベンサミアナタバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）及びシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）が挙げられる。
本発明のある実施形態では、Ｃ２ｃ２系は作物害虫の管理に使用される。例えば、作物害虫において作動可能なＣ２ｃ２系を植物宿主から発現させるか、又は例えばウイルスベクターを使用して標的に直接トランスファーすることができる。
ある実施形態において、本発明は、ヘテロ接合非ヒト出発生物からホモ接合生物を効率的に作製する方法を提供する。ある実施形態において、本発明は植物育種に使用される。別の実施形態において、本発明は動物育種に使用される。かかる実施形態において、植物又は動物などのホモ接合生物は、二本鎖切断、染色体対合及び／又は鎖交換に関与する少なくとも１つの標的遺伝子への干渉によって組換えを防止又は抑制することにより作られる。
最適化された機能性ＲＮＡターゲティング系におけるＣ２Ｃ２タンパク質の適用
ある態様において本発明は、機能性構成成分をＲＮＡ環境に特異的に送達するための系を提供する。これは、ＲＮＡへの種々の構成成分の特異的ターゲティングを可能にする本発明のＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質を含むＣＲＩＳＰＲ系を使用して確実にすることができる。より詳細には、かかる構成成分には、ＲＮＡ翻訳、分解等のアクチベーター又はリプレッサーなど、アクチベーター又はリプレッサーが含まれる。この系の適用については本明細書の他の部分に記載される。
一態様によれば、本発明は、細胞の目的のゲノム遺伝子座内にある標的配列にハイブリダイズ可能なガイド配列を含むガイドＲＮＡを含む天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物を提供し、ここでガイドＲＮＡは、アダプタータンパク質に結合する１つ以上の個別のＲＮＡ配列の挿入によって改変される。詳細な実施形態において、ＲＮＡ配列は２つ以上のアダプタータンパク質（例えばアプタマー）に結合することができ、及び各アダプタータンパク質が１つ以上の機能ドメインと会合している。本明細書に記載されるｃ２ｃ２酵素のガイドＲＮＡは、ガイド配列の改変に適していることが示される。詳細な実施形態において、ガイドＲＮＡは、ダイレクトリピートの５’側、ダイレクトリピート内、又はガイド配列の３’側への１つ又は複数の個別のＲＮＡ配列の挿入によって改変される。２つ以上の機能ドメインがあるとき、それらの機能ドメインは同じであっても又は異なってもよく、例えば、同じ２つの又は２つの異なるアクチベーター又はリプレッサーであり得る。ある態様において本発明は、本明細書において考察される組成物を提供し、ここで１つ以上の機能ドメインがＲＮＡターゲティング酵素に付加されているため、機能ドメインは標的ＲＮＡに結合すると、機能ドメインがその帰属機能で機能することが可能な空間的配置となる；ある態様において本発明は、本明細書において考察される組成物を提供し、ここで組成物は、少なくとも３つの機能ドメインであって、そのうちの少なくとも１つがＲＮＡターゲティング酵素と会合し、且つそのうちの少なくとも２つがｇＲＮＡと会合している機能ドメインを有するＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ複合体を含む。
従って、ある態様において、本発明は、本明細書において考察するとおりのガイドＲＮＡとＲＮＡターゲティング酵素であるＣＲＩＳＰＲ酵素とを含む天然に存在しない又はエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ複合体組成物を提供し、ここで任意選択で、ＲＮＡターゲティング酵素は、ＲＮＡターゲティング酵素がその少なくとも１つの突然変異を有しない酵素の５％以下のヌクレアーゼ活性を有することになる少なくとも１つの突然変異、及び任意選択で少なくとも１つ以上の核局在化配列を含む１つ以上を含む。詳細な実施形態において、ガイドＲＮＡは、それに加えて又は代えて、ＲＮＡターゲティング酵素の結合はなおも確実にするが、ＲＮＡターゲティング酵素による切断は防ぐように（本明細書の他の部分で詳説するとおり）改変される。
詳細な実施形態において、ＲＮＡターゲティング酵素は、少なくとも１つの突然変異を有しないｃ２ｃ２酵素と比較したとき少なくとも９７％、又は１００％の低下したヌクレアーゼ活性を有するｃ２ｃ２酵素である。ある態様において本発明は、本明細書において考察される組成物を提供し、ここでＣ２ｃ２酵素は２つ以上の突然変異を含む。突然変異は、レプトトリキア・シャーイイ（Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ ｓｈａｈｉｉ）ｃ２ｃ２タンパク質に基づいて、例えば以下の突然変異：Ｒ５９７Ａ、Ｈ６０２Ａ、Ｒ１２７８Ａ、及びＨ１２８３Ａのうちの１つ以上など、以下のアミノ酸残基：Ｒ５９７、Ｈ６０２、Ｒ１２７８、及びＨ１２８３のうちの１つ以上又はオルソログにおける対応する位置の突然変異から選択されてもよい。
詳細な実施形態において、２つ以上の機能ドメインを含む本明細書において上記に記載されるとおりのＲＮＡターゲティング系が提供される。詳細な実施形態において、２つ以上の機能ドメインは異種機能ドメインである。詳細な実施形態において、この系は、機能ドメインを含む融合タンパク質であるアダプタータンパク質を含み、融合タンパク質は任意選択でアダプタータンパク質と機能ドメインとの間にリンカーを含む。詳細な実施形態において、リンカーはＧｌｙＳｅｒリンカーを含む。それに加えて又は代えて、１つ以上の機能ドメインがリンカー、任意選択でＧｌｙＳｅｒリンカーによってＲＮＡエフェクタータンパク質に付加される。詳細な実施形態において、１つ以上の機能ドメインはＨＥＰＮドメインの一方又は両方でＲＮＡターゲティング酵素に付加される。
ある態様において本発明は、本明細書において考察される組成物を提供し、ここでアダプタータンパク質又はＲＮＡターゲティング酵素（ｅｎｚｕｍｅ）と会合している１つ以上の機能ドメインは、ＲＮＡ翻訳を活性化又は抑制する能力を有するドメインである。ある態様において本発明は、本明細書において考察される組成物を提供し、ここでアダプタータンパク質に会合している１つ以上の機能ドメインのうちの少なくとも１つは、メチラーゼ活性、デメチラーゼ活性、転写活性化活性、転写抑制活性、転写終結因子活性、ヒストン修飾活性、ＤＮＡ組込み活性、ＲＮＡ切断活性、ＤＮＡ切断活性又は核酸結合活性、又は分子スイッチ活性又は化学誘導能若しくは光誘導能を含む１つ以上の活性を有する。
ある態様において本発明は、アプタマー配列を含む本明細書において考察される組成物を提供する。詳細な実施形態において、アプタマー配列は、同じアダプタータンパク質に特異的な２つ以上のアプタマー配列である。ある態様において、本発明は、本明細書において考察される組成物を提供し、ここでアプタマー配列は、異なるアダプタータンパク質に特異的な２つ以上のアプタマー配列である。ある態様において、本発明は、本明細書において考察される組成物を提供し、ここでアダプタータンパク質は、ＭＳ２、ＰＰ７、Ｑβ、Ｆ２、ＧＡ、ｆｒ、ＪＰ５０１、Ｍ１２、Ｒ１７、ＢＺ１３、ＪＰ３４、ＪＰ５００、ＫＵ１、Ｍ１１、ＭＸ１、ＴＷ１８、ＶＫ、ＳＰ、ＦＩ、ＩＤ２、ＮＬ９５、ＴＷ１９、ＡＰ２０５、φＣｂ５、φＣｂ８ｒ、φＣｂ１２ｒ、φＣｂ２３ｒ、７ｓ、ＰＲＲ１を含む。従って、詳細な実施形態では、アプタマーは、上記に列挙するアダプタータンパク質のいずれか一つを特異的に結合する結合タンパク質から選択される。ある態様において、本発明は、本明細書において考察される組成物を提供し、ここで細胞は真核細胞である。ある態様において、本発明は、本明細書において考察される組成物を提供し、ここで真核細胞は哺乳類細胞、植物細胞又は酵母細胞であり、それによって哺乳類細胞は任意選択でマウス細胞である。ある態様において、本発明は、本明細書において考察される組成物を提供し、ここで哺乳類細胞はヒト細胞である。
ある態様において、本発明は、本明細書において上記で考察した組成物を提供し、ここで２つ以上のｇＲＮＡがあり、及びこれらのｇＲＮＡは異なる配列を標的化し、それによって本組成物が用いられるとき、多重化がある。ある態様において、本発明は、１つ以上のアダプタータンパク質に結合する１つ又は複数の個別のＲＮＡ配列の挿入によって改変された２つ以上のｇＲＮＡがある組成物を提供する。
ある態様において、本発明は、本明細書において考察される組成物を提供し、ここで１つ以上の機能ドメインと会合した１つ以上のアダプタータンパク質が存在して、１つ又は複数のガイドＲＮＡに挿入された１つ又は複数の個別のＲＮＡ配列に結合する。
ある態様において、本発明は、本明細書において考察される組成物を提供し、ここでガイドＲＮＡは少なくとも１つの非コード機能性ループを有するように改変され；例えば、少なくとも１つの非コード機能性ループは抑制性であり；例えば、少なくとも１つの非コード機能性ループはＡｌｕを含む。
ある態様において本発明は、本明細書において考察するとおりの組成物のうちの１つ以上の宿主への投与又は宿主におけるインビボ発現を含む遺伝子発現の改変方法を提供する。
ある態様において、本発明は、組成物又はそれをコードする１つ又は複数の核酸分子の送達を含む、本明細書において考察される方法を提供し、ここで前記１つ又は複数の核酸分子は１つ又は複数の調節配列に作動可能に連結され、且つインビボで発現する。ある態様において、本発明は、本明細書において考察される方法を提供し、ここでインビボでの発現はレンチウイルス、アデノウイルス、又はＡＡＶを介する。
ある態様において、本発明は、本明細書において考察するとおりの細胞の哺乳類細胞株を提供し、ここで細胞株は、任意選択で、ヒト細胞株又はマウス細胞株である。ある態様において、本発明は、トランスジェニック哺乳類モデル、任意選択でマウスを提供し、ここでこのモデルは、本明細書において考察される組成物で形質転換されているか、又は前記形質転換体の子孫である。
ある態様において、本発明は、本明細書において考察するとおりのガイドＲＮＡ又はＲＮＡターゲティングＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ複合体又は組成物をコードする１つ又は複数の核酸分子を提供する。ある態様において、本発明は、細胞の目的のゲノム遺伝子座にある標的配列にハイブリダイズ可能なガイド配列を含むガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする核酸分子を含むベクターを提供し、ここでｇＲＮＡのダイレクトリピートは、２つ以上のアダプタータンパク質に結合する１つ又は複数の個別のＲＮＡ配列の挿入によって改変され、及び各アダプタータンパク質は１つ以上の機能ドメインと会合しているか；又はｇＲＮＡは、少なくとも１つの非コード機能性ループを有するように改変される。ある態様において、本発明は、本明細書において考察されるｇＲＮＡと、ＲＮＡターゲティング酵素［任意選択でＲＮＡターゲティング酵素は少なくとも１つの突然変異を含み、そのためＲＮＡターゲティング酵素は少なくとも１つの突然変異を有しないＲＮＡターゲティング酵素の５％以下のヌクレアーゼ活性を有し、及び任意選択で、少なくとも１つ以上の核局在化配列を含む１つ以上を含む］とを含む天然に存在しない又はエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ複合体組成物をコードする１つ又は複数の核酸分子を含む１つ又は複数のベクターを提供する。ある態様において、ベクターは、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする核酸分子、及び／又はＲＮＡターゲティング酵素をコードする核酸分子及び／又は任意選択の１つ又は複数の核局在化配列に作動可能に連結された真核細胞において作動可能な１つ又は複数の調節エレメントを更に含み得る。
一態様において、本発明は、上記に記載した構成成分の１つ以上を含むキットを提供する。一部の実施形態において、本キットは、上記に記載したとおりのベクター系とキットの使用説明書とを含む。
ある態様において、本発明は、機能獲得（ＧＯＦ）又は機能喪失（ＬＯＦ）に関してスクリーニングする方法又は非コードＲＮＡ又は潜在的な調節領域（例えばエンハンサー、リプレッサー）のスクリーニング方法を提供し、この方法は、ＲＮＡターゲティング酵素を含有し又はそれを発現する本明細書において考察するとおりの細胞株又は本明細書において考察されるモデルの細胞、及び本明細書において考察するとおりの組成物を細胞株又はモデルの細胞に導入し、それによってｇＲＮＡがアクチベーター又はリプレッサーのいずれかを含むこと、及びそれらの細胞に関して導入されたｇＲＮＡがアクチベーターを含むのはどれかに関して、又はそれらの細胞に関して導入されたｇＲＮＡがリプレッサーを含むのはどれかに関して、それぞれＧＯＦ又はＬＯＦをモニタすることを含む。
ある態様において本発明は、細胞の目的の標的ＲＮＡ配列にハイブリダイズ可能なガイド配列を含むＲＮＡターゲティングＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、ＲＮＡターゲティング酵素を各々が含む天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物のライブラリを提供し、ここでＲＮＡターゲティング酵素は少なくとも１つの突然変異を含み、そのためＲＮＡターゲティング酵素は少なくとも１つの突然変異を有しないＲＮＡターゲティング酵素の５％以下のヌクレアーゼ活性を有し、ｇＲＮＡは、１つ以上のアダプタータンパク質に結合する１つ又は複数の個別のＲＮＡ配列の挿入によって改変され、及びアダプタータンパク質は１つ以上の機能ドメインと会合し、この組成物は１つ以上又は２つ以上のアダプタータンパク質を含み、各タンパク質は１つ以上の機能ドメインと会合し、及びｇＲＮＡは、複数のＲＮＡターゲティングガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含むゲノムワイドライブラリを含む。ある態様において、本発明は、本明細書において考察するとおりのライブラリを提供し、ここでＲＮＡターゲティングＲＮＡターゲティング酵素は、少なくとも１つの突然変異を有しないＲＮＡターゲティング酵素と比較したとき少なくとも９７％、又は１００％の低下したヌクレアーゼ活性を有する。ある態様において、本発明は、本明細書において考察するとおりのライブラリを提供し、ここでアダプタータンパク質は、機能ドメインを含む融合タンパク質である。ある態様において、本発明は、本明細書に考察されるとおりのライブラリを提供し、ここでｇＲＮＡは、１つ又は２つ以上のアダプタータンパク質に結合する１つ又は複数の個別のＲＮＡ配列の挿入によって改変されない。ある態様において、本発明は、本明細書において考察するとおりのライブラリを提供し、ここで１つ又２つ以上の機能ドメインはＲＮＡターゲティング酵素と会合している。ある態様において、本発明は、本明細書に考察されるとおりのライブラリを提供し、ここで細胞の細胞集団は真核細胞の集団である。ある態様において、本発明は、本明細書に考察されるとおりのライブラリを提供し、ここで真核細胞は哺乳類細胞、植物細胞又は酵母細胞である。ある態様において、本発明は、本明細書に考察されるとおりのライブラリを提供し、ここで哺乳類細胞はヒト細胞である。ある態様において、本発明は、本明細書に考察されるとおりのライブラリを提供し、ここで細胞の集団は、胚性幹（ＥＳ）細胞の集団である。
ある態様において本発明は、本明細書で考察するとおりのライブラリを提供し、ここでターゲティングは約１００以上のＲＮＡ配列である。ある態様において本発明は、本明細書で考察するとおりのライブラリを提供し、ここでターゲティングは約１０００以上のＲＮＡ配列である。ある態様において本発明は、本明細書で考察するとおりのライブラリを提供し、ここでターゲティングは約２０，０００以上の配列である。ある態様において本発明は、本明細書で考察するとおりのライブラリを提供し、ここでターゲティングはトランスクリプトーム全体である。ある態様において本発明は、本明細書で考察するとおりのライブラリを提供し、ここでターゲティングは、関連性のある又は望ましい経路に焦点を置いた標的配列のパネルである。ある態様において本発明は、本明細書で考察するとおりのライブラリを提供し、ここで経路は免疫経路である。ある態様において本発明は、本明細書で考察するとおりのライブラリを提供し、ここで経路は細胞分裂経路である。
一態様において、本発明は、発現が改変された遺伝子を含むモデル真核細胞を作成する方法を提供する。一部の実施形態において、疾患遺伝子は、疾患の罹患又は発症リスクの増加に関連する任意の遺伝子である。一部の実施形態において、本方法は、（ａ）本明細書において上記に記載される系の構成成分をコードする１つ以上のベクターを真核細胞に導入すること、及び（ｂ）ＣＲＩＳＰＲ複合体を標的ポリヌクレオチドに結合させて遺伝子の発現を改変し、それにより遺伝子発現の改変を含むモデル真核細胞を作成することを含む。
本明細書に提供される構造情報により、標的ＲＮＡ及びＲＮＡターゲティング酵素とのガイドＲＮＡ相互作用を調べることが可能であり、ＲＮＡターゲティングＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系全体の機能性が最適化されるようにガイドＲＮＡ構造をエンジニアリングし又は変化させることが可能になる。例えば、ＲＮＡに結合することのできるアダプタータンパク質の挿入によりＲＮＡターゲティングタンパク質との衝突なしにガイドＲＮＡを伸長させることができる。これらのアダプタータンパク質は更に、１つ以上の機能ドメインを含むエフェクタータンパク質又は融合物を動員することができる。
本発明のある態様は、上記のエレメントが単一の組成物に含まれるか、又は個々の組成物に含まれるものである。これらの組成物は、有利には、ゲノムレベルで機能的効果を誘発するため宿主に適用され得る。
当業者は、ガイドＲＮＡに対する改変で、アダプター＋機能ドメインの結合を可能にするが、アダプター＋機能ドメインを適切に位置させることは（例えばＣＲＩＳＰＲ複合体の三次元構造（ｔｈｒｅｅ ｄｉｍｅｎｓｉａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）内の立体障害に起因して）できないものは、意図されない改変であることを理解するであろう。１つ以上の改変ガイドＲＮＡは、ダイレクトリピートの５’側、ダイレクトリピート内、又はガイド配列の３’側への１つ又は複数の個別のＲＮＡ配列の導入によって改変されてもよい。
改変ガイドＲＮＡ、不活性化ＲＮＡターゲティング酵素（機能ドメインを有する又は有しない）、及び１つ以上の機能ドメインを有する結合タンパク質は、各々が個別に組成物中に含まれ、宿主に個別に又はまとめて投与され得る。或いは、これらの構成成分は、宿主への投与用の単一の組成物中に提供されてもよい。宿主への投与は、宿主への送達に関して当業者に公知の又は本明細書に記載されるウイルスベクター（例えば、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ＡＡＶベクター）を用いて実施し得る。本明細書に説明されるとおり、異なる選択マーカー（例えばレンチウイルスｇＲＮＡ選択用のもの）及びｇＲＮＡの濃度（例えば複数のｇＲＮＡが用いられるかどうかに依存する）を使用することが、向上した効果を生じさせるのに有利であり得る。
当業者は、提供される組成物を用いて、同じ又は異なる機能ドメインで単一又は複数の遺伝子座を有利に且つ特異的に標的化して、１つ以上のゲノムイベントを誘発することができる。本組成物は、細胞のライブラリにおけるスクリーニング及びインビボでの機能モデリング（例えばｌｉｎｃＲＮＡの遺伝子活性化及び機能の同定（ｉｎｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ）；機能獲得モデリング；機能喪失モデリング；最適化及びスクリーニング目的の細胞株及びトランスジェニック動物を樹立するための本発明の組成物の使用）のための多種多様な方法に適用され得る。
本発明は、条件的又は誘導性ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡターゲティングイベントを樹立し及び利用するための本発明の組成物の使用を包含する。（例えば、Ｐｌａｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ（２０１４），ｈｔｔｐ：／／ｄｘ．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｌ．２０１４．０９．０１４、又は本明細書に引用されるＰＣＴ特許公報、例えば国際公開第２０１４／０９３６２２号パンフレット（ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７４６６７号明細書）（これらは本発明若しくは本願に先行するとは考えられない）を参照のこと）。例えば、標的細胞がＲＮＡターゲティングＣＲＩＳＲＰ酵素を条件的に又は誘導性に（例えばＣｒｅ依存性構築物の形態で）含み、及び／又はアダプタータンパク質を条件的に又は誘導性に含み、及び標的細胞に導入されたベクターの発現時、ベクターは、標的細胞におけるＲＮＡターゲティング酵素発現及び／又はアダプター発現を誘導し、又はその条件を生じるように発現する。ＣＲＩＳＰＲ複合体を作成する公知の方法と共に本発明の教示及び組成物を適用することにより、機能ドメインによって影響を受ける誘導性遺伝子発現もまた、本発明の態様である。或いは、条件的又は誘導性ＲＮＡターゲティング酵素と共にアダプタータンパク質が条件的又は誘導性エレメントとして提供されることにより、スクリーニング目的に有効なモデルが提供されてもよく、これは有利には、多種多様な適用に対して、特異的なｇＲＮＡの最小限の設計及び投与しか必要としないものである。
デッドガイド配列を含む本発明に係るガイドＲＮＡ
一態様において、本発明は、ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成及び標的への結合の成功を可能にすると同時にヌクレアーゼ活性の成功を許容しない（即ちヌクレアーゼ活性がない／インデル活性がない）ように改変されるガイド配列を提供する。説明上の問題で、かかる改変ガイド配列は「デッドガイド」又は「デッドガイド配列」と称される。これらのデッドガイド又はデッドガイド配列は、ヌクレアーゼ活性の点で触媒的に不活性である又は立体構造的に不活性であると考えることができる。実際、デッドガイド配列は、触媒活性を促進する能力又はオンターゲットとオフターゲットとの結合活性を区別する能力の点で生産的な塩基対合に十分に関与しないものであり得る。簡潔に言えば、このアッセイには、ＣＲＩＳＰＲ標的ＲＮＡ及び標的ＲＮＡとのミスマッチを含むガイドＲＮＡを合成すること、それらをＲＮＡターゲティング酵素と組み合わせて、切断産物によって生成されるバンドの存在に基づいたゲルに基づき切断を分析すること、及び相対バンド強度に基づき切断を定量化することが関わる。
従って、関連する態様において、本発明は、本明細書に記載されるとおりの機能性ＲＮＡターゲティング、及びガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物ＲＮＡターゲティングＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系を提供し、ここでｇＲＮＡはデッドガイド配列を含み、それによってｇＲＮＡは、この系の非突然変異ＲＮＡターゲティング酵素の検出可能なＲＮＡ切断活性なしにＲＮＡターゲティングＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系が細胞内の目的のゲノム遺伝子座へと導かれるような標的配列へのハイブリダイゼーション能力を有するものとなる。本明細書の他の部分に記載されるとおりの本発明に係るｇＲＮＡのいずれも、本明細書において以下に記載するとおりのデッドｇＲＮＡ／デッドガイド配列を含むｇＲＮＡとして使用し得ることが理解されるべきである。本明細書の他の部分に記載されるとおりの方法、生成物、組成物及び使用のいずれも、以下に更に詳述するとおりのデッドｇＲＮＡ／デッドガイド配列を含むｇＲＮＡで等しく適用可能である。更なる指針として、以下の詳細な態様及び実施形態を提供する。
ＲＮＡ標的配列へのＣＲＩＳＰＲ複合体の配列特異的結合を導くデッドガイド配列の能力は、任意の好適なアッセイによって評価し得る。例えば、ＣＲＩＳＰＲ複合体を形成するのに十分なＣＲＩＳＰＲ系の構成成分が、試験しようとするデッドガイド配列を含め、対応する標的配列を有する宿主細胞へと、ＣＲＩＳＰＲ配列の構成成分をコードするベクターのトランスフェクションによるなどして提供されてもよく、続いて標的配列内における優先的な切断が評価され得る。例えば、標的ＲＮＡポリヌクレオチド配列の切断は、標的配列、試験しようとするデッドガイド配列を含めたＣＲＩＳＰＲ複合体の構成成分、及び供試デッドガイド配列と異なる対照ガイド配列を提供して、それらの供試ガイド配列と対照ガイド配列との反応間で標的配列における結合又は切断速度を比較することにより、試験管内で判定することができる。他のアッセイも可能であり、当業者には想起されるであろう。デッドガイド配列は、任意の標的配列を標的化するように選択し得る。一部の実施形態において、標的配列は細胞のゲノム内の配列である。
本明細書に更に説明されるとおり、幾つかの構造パラメータによって適切なフレームワークをかかるデッドガイドに至らせることが可能である。デッドガイド配列は、典型的には、活性ＲＮＡ切断をもたらすそれぞれのガイド配列よりも短い。詳細な実施形態において、デッドガイドは、同じものに対するそれぞれのガイドよりも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％短い。
以下に説明し、及び当該技術分野において公知のとおり、ｇＲＮＡの一態様－ＲＮＡターゲティング特異性はダイレクトリピート配列であり、これはかかるガイドに適切に連結されるべきである。詳細には、これは、ダイレクトリピート配列がＲＮＡターゲティング酵素の起源に応じて設計されることを含意する。従って、Ｃ２ｃ２特異的等価物の設計には、検証されたデッドガイド配列に利用可能な構造データが用いられ得る。例えば、２つ以上のＣ２ｃ２エフェクタータンパク質のオルソロガスなヌクレアーゼドメインＨＥＰＮの間の構造的類似性を用いることにより、等価な設計のデッドガイドをトランスファーし得る。従って、本明細書におけるデッドガイドは、かかるＣ２ｃ２特異的等価物を反映するように長さ及び配列が適切に改変されてもよく、それによりＣＲＩＳＰＲ複合体の形成及び標的ＲＮＡへの結合の成功が実現すると同時に、ヌクレアーゼ活性の成功が許容されなくなる。
本明細書並びに当該分野の技術水準の文脈におけるデッドガイドの使用は、インビトロ、エキソビボ、及びインビボ適用の両方でのネットワーク生物学及び／又はシステム生物学の意外且つ予想外のプラットフォームをもたらして、多重遺伝子ターゲティング、詳細には両方向性多重遺伝子ターゲティングを可能にする。デッドガイドを使用する以前は、複数の標的に対処することは難題であり、場合によっては不可能であった。デッドガイドを使用すると、例えば、同じ細胞、同じ動物、又は同じ患者における複数の標的、従って複数の活性に対処し得る。かかる多重化は同時に起こってもよく、又は所望の時間フレームで時差的に起こってもよい。
例えば、デッドガイドは、ヌクレアーゼ活性を伴うことのない、遺伝子ターゲティングの手段としてのｇＲＮＡの使用を可能にすると同時に、誘導的な活性化又は抑制手段を提供する。デッドガイドを含むガイドＲＮＡは、遺伝子活性の活性化又は抑制を可能にする形でエレメント、詳細には遺伝子エフェクター（例えば遺伝子活性のアクチベーター又はリプレッサー）を機能的に置くことを可能にする本明細書の他の部分に記載されるとおりのタンパク質アダプター（例えばアプタマー）を更に含むように改変し得る。一例は、本明細書及び当該分野の技術水準で説明されるとおりの、アプタマーの取込みである。デッドガイドを含むｇＲＮＡがタンパク質相互作用性アプタマーを取り込むようにエンジニアリングすることにより（Ｋｏｎｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，「エンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９複合体によるゲノム規模の転写活性化（Ｇｅｎｏｍｅ－ｓｃａｌｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｂｙ ａｎ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ ｃｏｍｐｌｅｘ）」，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ１４１３６、参照により本明細書に援用される）、複数の個別のエフェクタードメインをアセンブルし得る。これは、天然の過程の後にモデル化し得る。
従って、一態様は、デッドガイドを含む本発明のｇＲＮＡであり、ここでｇＲＮＡは、本明細書に記載されるとおり、遺伝子活性化又は抑制をもたらす改変を更に含む。デッドｇＲＮＡは１つ以上のアプタマーを含み得る。アプタマーは、遺伝子エフェクター、遺伝子アクチベーター又は遺伝子リプレッサーに特異的であってもよい。或いは、アプタマーはタンパク質に特異的であってもよく、次にはこのタンパク質が特定の遺伝子エフェクター、遺伝子アクチベーター又は遺伝子リプレッサーに特異的であって、それを動員／結合する。アクチベーター又はリプレッサーのリクルート部位が複数ある場合、それらの部位がアクチベーター又はリプレッサーのいずれかに特異的であることが好ましい。アクチベーター又はリプレッサーの結合部位が複数ある場合、それらの部位は同じアクチベーター又は同じリプレッサーに特異的であってもよい。それらの部位はまた、異なるアクチベーター又は異なるリプレッサーに特異的であってもよい。エフェクター、アクチベーター、リプレッサーは融合タンパク質の形態で存在し得る。
ある態様において、本発明は、機能化ＣＲＩＳＰＲ系を生物の遺伝子座に導くためのデッドガイドＲＮＡターゲティング配列を選択する方法を提供し、この方法は、ａ）遺伝子座における１つ以上のＣＲＩＳＰＲモチーフの位置を特定すること；ｂ）生物のゲノムにおいて各ＣＲＩＳＰＲモチーフの下流２０ｎｔ配列を、ｉ）配列のＧＣ含量の決定；及びｉｉ）配列の最初の１５ｎｔのオフターゲットマッチがあるかどうかの決定により分析すること；ｃ）配列のＧＣ含量が７０％以下であり、且つオフターゲットマッチが同定されない場合に、その配列をガイドＲＮＡにおける使用に選択することを含む。ある実施形態において、ＧＣ含量が５０％以下の場合に、その配列が選択される。ある実施形態において、ＧＣ含量が４０％以下の場合に、その配列が選択される。ある実施形態において、ＧＣ含量が３０％以下の場合に、その配列が選択される。ある実施形態において、２つ以上の配列が分析され、最も低いＧＣ含量を有する配列が選択される。ある実施形態において、オフターゲットマッチは生物の調節配列で決定される。ある実施形態において、遺伝子座は調節領域である。ある態様は、前述の方法により選択されたターゲティング配列を含むデッドガイドＲＮＡを提供する。
ある態様において、本発明は、機能化ＣＲＩＳＰＲ系を生物の遺伝子座に標的化するためのデッドガイドＲＮＡを提供する。本発明のある実施形態において、このデッドガイドＲＮＡは、標的配列のＣＧ含量が７０％以下であるターゲティング配列を含み、このターゲティング配列の最初の１５ｎｔは、生物の別の遺伝子座の調節配列におけるＣＲＩＳＰＲモチーフから下流のオフターゲット配列にマッチしない。特定の実施形態において、ターゲティング配列のＧＣ含量は６０％以下、５５％以下、５０％以下、４５％以下、４０％以下、３５％以下又は３０％以下である。特定の実施形態において、ターゲティング配列のＧＣ含量は７０％～６０％又は６０％～５０％又は５０％～４０％又は４０％～３０％である。ある実施形態において、ターゲティング配列は、その遺伝子座の潜在的なターゲティング配列の中で最も低いＣＧ含量を有する。
本発明のある実施形態において、デッドガイドの最初の１５ｎｔが標的配列にマッチする。別の実施形態において、デッドガイドの最初の１４ｎｔが標的配列にマッチする。別の実施形態において、デッドガイドの最初の１３ｎｔが標的配列にマッチする。別の実施形態において、デッドガイドの最初の１２ｎｔが標的配列にマッチする。別の実施形態において、デッドガイドの最初の１１ｎｔが標的配列にマッチする。別の実施形態において、デッドガイドの最初の１０ｎｔが標的配列にマッチする。本発明のある実施形態において、デッドガイドの最初の１５ｎｔは、別の遺伝子座の調節領域におけるＣＲＩＳＰＲモチーフから下流のオフターゲット配列にマッチしない。他の実施形態において、デッドガイドの最初の１４ｎｔ、又は最初の１３ｎｔ、又はガイドの最初の１２ｎｔ、又はデッドガイドの最初の１１ｎｔ、又はデッドガイドの最初の１０ｎｔは、別の遺伝子座の調節領域におけるＣＲＩＳＰＲモチーフから下流のオフターゲット配列にマッチしない。他の実施形態において、デッドガイドの最初の１５ｎｔ、又は１４ｎｔ、又は１３ｎｔ、又は１２ｎｔ、又は１１ｎｔは、ゲノムにおけるＣＲＩＳＰＲモチーフから下流のオフターゲット配列にマッチしない。
特定の実施形態において、デッドガイドＲＮＡは、標的配列にマッチしない追加のヌクレオチドを３’末端に含む。従って、ＣＲＩＳＰＲモチーフの下流の最初の２０～２８ｎｔを含むデッドガイドＲＮＡは、３’末端で長さが延長していてもよい。
提供概要
ある態様において、本発明は核酸結合系を提供する。ＲＮＡと相補的プローブとのインサイチュハイブリダイゼーションは、強力な技法である。典型的には、ハイブリダイゼーションによる核酸の検出には蛍光ＤＮＡオリゴヌクレオチドが使用される。ロックド核酸（ＬＮＡ）など、ある種の改変によって効率の増加が達成されているが、効率的且つ汎用的な代替手段が依然として必要とされている。本発明は、インサイチュハイブリダイゼーションのための効率的且つ適合可能な系を提供する。
本発明の実施形態において、用語のガイド配列及びガイドＲＮＡは、国際公開第２０１４／０９３６２２号パンフレット（ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７４６６７号明細書）などの前述の引用文献にあるとおり同義的に使用される。一般に、ガイド配列は、標的配列とハイブリダイズして標的配列に対するＣＲＩＳＰＲ複合体の配列特異的結合を導くのに十分な標的ポリヌクレオチド配列との相補性を有する任意のポリヌクレオチド配列である。一部の実施形態において、ガイド配列とその対応する標的配列との間の相補性の程度は、好適なアラインメントアルゴリズムを用いて最適にアラインメントしたとき、約５０％、６０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７．５％、９９％以上であるか、又はそれより高い。最適アラインメントは、配列のアラインメントに好適な任意のアルゴリズムを用いて決定することができ、その非限定的な例としては、スミス－ウォーターマンアルゴリズム、ニードルマン－ブンシュアルゴリズム、バローズ・ホイーラー変換に基づくアルゴリズム（例えば、バローズ・ホイーラーアライナー）、ＣｌｕｓｔａｌＷ、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｘ、ＢＬＡＴ、Ｎｏｖｏａｌｉｇｎ（Ｎｏｖｏｃｒａｆｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；ｗｗｗ．ｎｏｖｏｃｒａｆｔ．ｃｏｍにおいて利用可能）、ＥＬＡＮＤ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、ＳＯＡＰ（ｓｏａｐ．ｇｅｎｏｍｉｃｓ．ｏｒｇ．ｃｎにおいて利用可能）、及びＭａｑ（ｍａｑ．ｓｏｕｒｃｅｆｏｒｇｅ．ｎｅｔにおいて利用可能）が挙げられる。一部の実施形態において、ガイド配列は、約５、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、７５ヌクレオチド長以上であるか、又はそれより長い。一部の実施形態において、ガイド配列は、約７５、５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５、１２ヌクレオチド長未満か、又はそれより短い。好ましくはガイド配列は１０～３０ヌクレオチド長である。ガイド配列が標的配列へのＣＲＩＳＰＲ複合体の配列特異的結合を導く能力は、任意の好適なアッセイによって評価し得る。例えば、ＣＲＩＳＰＲ複合体を形成するのに十分なＣＲＩＳＰＲ系の構成成分が、試験しようとするガイド配列を含め、ＣＲＩＳＰＲ配列の構成成分をコードするベクターのトランスフェクションによるなどして対応する標的配列を有する宿主細胞に提供されてもよく、続いて本明細書に記載されるとおりのＳｕｒｖｅｙｏｒアッセイなどにより、標的配列内における優先的な切断を評価し得る。同様に、標的ポリヌクレオチド配列の切断は、標的配列、試験しようとするガイド配列を含めたＣＲＩＳＰＲ複合体の構成成分、及び供試ガイド配列と異なる対照ガイド配列を提供して、それらの供試ガイド配列と対照ガイド配列との反応間の標的配列における結合又は切断速度を比較することにより、試験管内で判定することができる。他のアッセイも可能であり、当業者には想起されるであろう。ガイド配列は、任意の標的配列を標的化するように選択することができる。一部の実施形態において、標的配列は細胞のゲノム内の配列である。例示的標的配列には、標的ゲノムにおいてユニークなものが含まれる。
一般に、及び本明細書全体を通じて、用語「ベクター」は、それに連結されている別の核酸を輸送することが可能な核酸分子を指す。ベクターとしては、限定はされないが、一本鎖、二本鎖、又は部分的二本鎖の核酸分子；１つ以上の遊離末端を含む、遊離末端のない（例えば環状の）核酸分子；ＤＮＡ、ＲＮＡ、又は両方を含む核酸分子；及び当該技術分野において公知の他の種類のポリヌクレオチドが挙げられる。ある種のベクターは「プラスミド」であり、これは、標準的な分子クローニング技術によるなどして追加のＤＮＡセグメントを挿入することのできる環状二本鎖ＤＮＡループを指す。別の種類のベクターはウイルスベクターであり、ここでベクターには、ウイルス（例えば、レトロウイルス、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス、複製欠損アデノウイルス、及びアデノ随伴ウイルス）へのパッケージングのためのウイルス由来ＤＮＡ又はＲＮＡ配列が存在する。ウイルスベクターはまた、宿主細胞へのトランスフェクションのためのウイルスによって担持されるポリヌクレオチドも含む。特定のベクターは、それが導入される宿主細胞での自己複製能を有する（例えば、細菌性複製起点を有する細菌ベクター及びエピソーム哺乳類ベクター）。他のベクター（例えば非エピソーム哺乳類ベクター）は宿主細胞への導入時に宿主細胞のゲノムに組み込まれ、それにより宿主ゲノムと共に複製される。更に、特定のベクターは、それが作動可能に連結された遺伝子の発現を導くことが可能である。かかるベクターは、本明細書では「発現ベクター」と称される。真核細胞における発現用の、及びそこでの発現をもたらすベクターは、本明細書では、「真核細胞発現ベクター」と称することができる。組換えＤＮＡ技法において有用な一般的な発現ベクターは、プラスミドの形態であることが多い。
組換え発現ベクターは、宿主細胞における核酸の発現に好適な形態の本発明の核酸を含むことができ、これはつまり、組換え発現ベクターが、発現させる核酸配列に作動可能に連結された１つ以上の調節エレメント（これは、発現に用いられる宿主細胞に基づき選択されてもよい）を含むことを意味する。組換え発現ベクターの範囲内において、「作動可能に連結された」は、ヌクレオチド配列の（例えば、インビトロ転写／翻訳系における、又はベクターが宿主細胞に導入される場合に宿主細胞における）発現が可能となる形で目的のヌクレオチド配列が１つ又は複数の調節エレメントに連結されていることを意味するように意図される。
用語「調節エレメント」には、プロモーター、エンハンサー、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）、及び他の発現制御エレメント（例えば、ポリアデニル化シグナル及びポリＵ配列などの転写終結シグナル）が含まれることが意図される。かかる調節エレメントについては、例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ，ＧＥＮＥ ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ：ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９０）に記載されている。調節エレメントには、多くの種類の宿主細胞においてヌクレオチド配列の構成的発現を導くもの及び特定の宿主細胞においてのみヌクレオチド配列の発現を導くもの（例えば、組織特異的調節配列）が含まれる。組織特異的プロモーターは、主として、所望の目的組織、例えば、筋肉、ニューロン、骨、皮膚、血液、特定の臓器（例えば、肝臓、膵臓）、又は特定の細胞型（例えば、リンパ球）において発現を導き得る。調節エレメントはまた、細胞周期依存的又は発生段階依存的様式など、時間依存的様式で発現を導いてもよく、この発現もまた組織又は細胞型特異的であることも又はそうでないこともある。一部の実施形態において、ベクターは、１つ以上のｐｏｌ ＩＩＩプロモーター（例えば、１、２、３、４、５個、又はそれより多いｐｏｌ ＩＩＩプロモーター）、１つ以上のｐｏｌ ＩＩプロモーター（例えば、１、２、３、４、５個、又はそれより多いｐｏｌ ＩＩプロモーター）、１つ以上のｐｏｌ Ｉプロモーター（例えば、１、２、３、４、５個、又はそれより多いｐｏｌ Ｉプロモーター）、又はこれらの組み合わせを含む。ｐｏｌ ＩＩＩプロモーターの例としては、限定はされないが、Ｕ６及びＨ１プロモーターが挙げられる。ｐｏｌ ＩＩプロモーターの例としては、限定はされないが、レトロウイルスラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーター（任意選択でＲＳＶエンハンサーと共に）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター（任意選択でＣＭＶエンハンサーと共に）［例えば、Ｂｏｓｈａｒｔ ｅｔ ａｌ，Ｃｅｌｌ，４１：５２１－５３０（１９８５）を参照］、ＳＶ４０プロモーター、ジヒドロ葉酸レダクターゼプロモーター、β－アクチンプロモーター、ホスホグリセロールキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、及びＥＦ１αプロモーターが挙げられる。また、用語「調節エレメント」には、ＷＰＲＥなどのエンハンサーエレメント；ＣＭＶエンハンサー；ＨＴＬＶ－ＩのＬＴＲにおけるＲ－Ｕ５’セグメント（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，Ｖｏｌ．８（１），ｐ．４６６－４７２，１９８８）；ＳＶ４０エンハンサー；及びウサギβ－グロビンのエクソン２と３との間のイントロン配列（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，Ｖｏｌ．７８（３），ｐ．１５２７－３１，１９８１）も包含される。当業者によれば、発現ベクターの設計が、形質転換する宿主細胞の選択、所望の発現レベルなどの要因に依存し得ることが理解されるであろう。ベクターは宿主細胞に導入することができ、それにより、本明細書に記載されるとおりの核酸によってコードされる転写物、タンパク質、又はペプチドが、融合タンパク質又はペプチド（例えば、クラスター化した規則的な間隔の短いパリンドローム反復（ＣＲＩＳＰＲ）転写物、タンパク質、酵素、それらの突然変異型、それらの融合タンパク質等）を含め、産生され得る。
有利なベクターとしては、レンチウイルス及びアデノ随伴ウイルスが挙げられ、かかるベクターのタイプもまた、特定のタイプの細胞を標的化するように選択することができる。
本明細書で使用されるとき、Ｖ型又はＶＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ遺伝子座エフェクタータンパク質の「ｃｒＲＮＡ」又は「ガイドＲＮＡ」又は「シングルガイドＲＮＡ」又は「ｓｇＲＮＡ」又は「１つ以上の核酸成分」という用語には、標的核酸配列とハイブリダイズして標的核酸配列への核酸ターゲティング複合体の配列特異的結合を導くのに十分な標的核酸配列との相補性を有する任意のポリヌクレオチド配列が含まれる。
特定の実施形態において、本明細書に提供されるとおりのＣＲＩＳＰＲ系は、ｃｒＲＮＡ又はガイド配列を含む同様のポリヌクレオチドを利用することができ、ここでポリヌクレオチドは、ＲＮＡ、ＤＮＡ又はＲＮＡとＤＮＡとの混合物であり、及び／又はポリヌクレオチドは１つ以上のヌクレオチド類似体を含む。この配列は、限定はされないが、バルジ、ヘアピン又はステムループ構造など、天然ｃｒＲＮＡの構造を含め、任意の構造を含み得る。特定の実施形態において、ガイド配列を含むポリヌクレオチドは、ＲＮＡ又はＤＮＡ配列であってよい第２のポリヌクレオチド配列と二重鎖を形成する。
特定の実施形態において、本発明のガイドは、天然に存在しない核酸及び／又は天然に存在しないヌクレオチド及び／又はヌクレオチド類似体、及び／又は化学的改変を含む。天然に存在しない核酸には、例えば、天然に存在するヌクレオチドと天然に存在しないヌクレオチドとの混合物が含まれ得る。天然に存在しないヌクレオチド及び／又はヌクレオチド類似体は、リボース、リン酸、及び／又は塩基部分が改変されていてもよい。本発明のある実施形態において、ガイド核酸はリボヌクレオチド及び非リボヌクレオチドを含む。一つのかかる実施形態において、ガイドは１つ以上のリボヌクレオチド及び１つ以上のデオキシリボヌクレオチドを含む。本発明のある実施形態において、ガイドは、ホスホロチオエート結合、ボラノホスフェート結合を有するヌクレオチド、リボース環の２’及び４’炭素間にメチレン架橋を含むロックド核酸（ＬＮＡ）ヌクレオチド、又は架橋核酸（ＢＮＡ）など、１つ以上の天然に存在しないヌクレオチド又はヌクレオチド類似体を含む。改変ヌクレオチドの他の例には、２’－Ｏ－メチル類似体、２’－デオキシ類似体、２－チオウリジン類似体、Ｎ６－メチルアデノシン類似体、又は２’－フルオロ類似体が含まれる。改変塩基の更なる例としては、限定はされないが、２－アミノプリン、５－ブロモ－ウリジン、プソイドウリジン（Ψ）、Ｎ１－メチルプソイドウリジン（ｍｅ１Ψ）、５－メトキシウリジン（５ｍｏＵ）、イノシン、７－メチルグアノシンが挙げられる。
特定の実施形態において、化学的に改変されたガイドＲＮＡが利用される。ガイドＲＮＡの化学的改変の例としては、限定なしに、１つ以上の末端ヌクレオチドにおける２’－Ｏ－メチル（Ｍ）、２’－Ｏ－メチル３’ホスホロチオエート（ＭＳ）、Ｓ－拘束エチル（ｃＥｔ）、又は２’－Ｏ－メチル３’チオＰＡＣＥ（ＭＳＰ）の取込みが挙げられる。かかる化学的に改変されたガイドＲＮＡは、改変されていないガイドＲＮＡと比較したとき高い安定性及び高い活性を含むことができ、しかしながらオンターゲット対オフターゲット特異性は予測不可能である（Ｈｅｎｄｅｌ，２０１５，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３３（９）：９８５－９，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．３２９０，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎｌｉｎｅ ２９ Ｊｕｎｅ ２０１５；Ａｌｌｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２００５，４８：９０１－９０４；Ｂｒａｍｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｆｒｏｎｔ．Ｇｅｎｅｔ．，２０１２，３：１５４；Ｄｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ，２０１５，１１２：１１８７０－１１８７５；Ｓｈａｒｍａ ｅｔ ａｌ．，ＭｅｄＣｈｅｍＣｏｍｍ．，２０１４，５：１４５４－１４７１；Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，２０１７，１，００６６ ＤＯＩ：１０．１０３８／ｓ４１５５１－０１７－００６６を参照）。化学的に改変されたガイドＲＮＡには、限定なしに、ホスホロチオエート結合を有するＲＮＡ及びリボース環の２’及び４’炭素間にメチレン架橋を含むロックド核酸（ＬＮＡ）ヌクレオチドが更に含まれる。
一部の実施形態において、相補性の程度は、好適なアラインメントアルゴリズムを用いて最適にアラインメントしたとき、約５０％、６０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７．５％、９９％以上であるか、又はそれより高い。最適アラインメントは、配列のアラインメントに好適な任意のアルゴリズムを用いて決定することができ、その非限定的な例としては、スミス－ウォーターマンアルゴリズム、ニードルマン－ブンシュアルゴリズム、バローズ－ホイーラー変換に基づくアルゴリズム（例えば、バローズ・ホイーラーアライナー）、ＣｌｕｓｔａｌＷ、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｘ、ＢＬＡＴ、Ｎｏｖｏａｌｉｇｎ（Ｎｏｖｏｃｒａｆｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；ｗｗｗ．ｎｏｖｏｃｒａｆｔ．ｃｏｍにおいて利用可能）、ＥＬＡＮＤ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、ＳＯＡＰ（ｓｏａｐ．ｇｅｎｏｍｉｃｓ．ｏｒｇ．ｃｎにおいて利用可能）、及びＭａｑ（ｍａｑ．ｓｏｕｒｃｅｆｏｒｇｅ．ｎｅｔにおいて利用可能）が挙げられる。ガイド配列（核酸ターゲティングガイドＲＮＡ内にある）が標的核酸配列への核酸ターゲティング複合体の配列特異的結合を導く能力は、任意の好適なアッセイによって評価し得る。例えば、核酸ターゲティング複合体を形成するのに十分な核酸ターゲティングＣＲＩＳＰＲ系の構成成分が、試験しようとするガイド配列を含め、対応する標的核酸配列を有する宿主細胞へと、核酸ターゲティング複合体の構成成分をコードするベクターのトランスフェクションによるなどして提供されてもよく、続いて本明細書に記載されるとおりのＳｕｒｖｅｙｏｒアッセイなどにより、標的核酸配列内における優先的なターゲティング（例えば切断）を評価し得る。同様に、標的核酸配列の切断は、標的核酸配列、試験しようとするガイド配列を含めた核酸ターゲティング複合体の構成成分、及び供試ガイド配列と異なる対照ガイド配列を提供して、それらの供試ガイド配列と対照ガイド配列との反応間で標的配列における結合又は切断速度を比較することにより、試験管内で判定することができる。他のアッセイも可能であり、当業者には想起されるであろう。ガイド配列、ひいては核酸ターゲティングガイドＲＮＡは、任意の標的核酸配列を標的化するように選択し得る。標的配列はＤＮＡであってもよい。標的配列は任意のＲＮＡ配列であってもよい。一部の実施形態において、標的配列は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、プレｍＲＮＡ、リボソームＲＮＡ（ｒｉｂｏｓｏｍａａｌ ＲＮＡ）（ｒＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、核内低分子ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）、核小体低分子ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、非コードＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）、長い非コードＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）、及び小さい細胞質ＲＮＡ（ｓｃＲＮＡ）からなる群から選択されるＲＮＡ分子内の配列であってもよい。一部の好ましい実施形態において、標的配列は、ｍＲＮＡ、プレｍＲＮＡ、及びｒＲＮＡからなる群から選択されるＲＮＡ分子内の配列であってもよい。一部の好ましい実施形態において、標的配列は、ｎｃＲＮＡ、及びｌｎｃＲＮＡからなる群から選択されるＲＮＡ分子内の配列であってもよい。一部のより好ましい実施形態において、標的配列はｍＲＮＡ分子又はプレｍＲＮＡ分子内の配列であってもよい。
一部の実施形態において、核酸ターゲティングガイドＲＮＡは、ＲＮＡターゲティングガイドＲＮＡ内の二次構造度が低下するように選択される。一部の実施形態において、核酸ターゲティングガイドＲＮＡのヌクレオチドのうち最適に折り畳まれたとき自己相補性塩基対合に関与するのは約７５％、５０％、４０％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、１％以下であるか、又はそれより少ない。最適な折り畳みは、任意の好適なポリヌクレオチド折り畳みアルゴリズムによって決定し得る。一部のプログラムは最小ギブズ自由エネルギーの計算に基づく。かかる一つのアルゴリズムの例は、Ｚｕｋｅｒ ａｎｄ Ｓｔｉｅｇｌｅｒ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．９（１９８１），１３３－１４８）により記載されるとおりのｍＦｏｌｄである。別の例示的な折り畳みアルゴリズムは、ウィーン大学（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｖｉｅｎｎａ）のＩｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙにおいて開発された、セントロイド構造予測アルゴリズムを用いるオンラインウェブサーバーＲＮＡｆｏｌｄである（例えば、Ａ．Ｒ．Ｇｒｕｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００８，Ｃｅｌｌ １０６（１）：２３－２４；及びＰＡ Ｃａｒｒ ａｎｄ ＧＭ Ｃｈｕｒｃｈ，２００９，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２７（１２）：１１５１－６２を参照）。
特定の実施形態において、ガイドＲＮＡ又はｃｒＲＮＡは、ダイレクトリピート（ＤＲ）配列とガイド配列又はスペーサー配列とを含んでもよく、それから本質的になってもよく、又はそれからなってもよい。特定の実施形態において、ガイドＲＮＡ又はｃｒＲＮＡは、ガイド配列又はスペーサー配列に融合又は連結したダイレクトリピート配列を含んでもよく、それから本質的になってもよく、又はそれからなってもよい。特定の実施形態において、ダイレクトリピート配列はガイド配列又はスペーサー配列の上流（即ち５’側）に位置し得る。他の実施形態において、ダイレクトリピート配列はガイド配列又はスペーサー配列の下流（即ち３’側）に位置し得る。
特定の実施形態において、ｃｒＲＮＡはステムループ、好ましくは単一のステムループを含む。特定の実施形態において、ダイレクトリピート配列はステムループ、好ましくは単一のステムループを形成する。
特定の実施形態において、ガイドＲＮＡのスペーサー長さは１５～３５ｎｔである。特定の実施形態において、ガイドＲＮＡのスペーサー長さは少なくとも１５ヌクレオチド、好ましくは少なくとも１８ｎｔ、例えば少なくとも１９、２０、２１、２２ｎｔ、又はそれ以上である。特定の実施形態において、スペーサー長さは、１５～１７ｎｔ、例えば、１５、１６、又は１７ｎｔ、１７～２０ｎｔ、例えば、１７、１８、１９、又は２０ｎｔ、２０～２４ｎｔ、例えば、２０、２１、２２、２３、又は２４ｎｔ、２３～２５ｎｔ、例えば、２３、２４、又は２５ｎｔ、２４～２７ｎｔ、例えば、２４、２５、２６、又は２７ｎｔ、２７～３０ｎｔ、例えば、２７、２８、２９、又は３０ｎｔ、３０～３５ｎｔ、例えば、３０、３１、３２、３３、３４、又は３５ｎｔ、又は３５ｎｔ以上である。
本出願人らはまた、Ｃ２ｃ２のＲＮＡターゲティング及び切断能力を検証するチャレンジ実験も実施する。この実験は、ＳｔＣａｓ９の異種発現に関する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における同様の研究（Ｓａｐｒａｎａｕｓｋａｓ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３９，９２７５－９２８２（２０１１））と極めて類似している。本出願人らは、ＰＡＭ及び抵抗性遺伝子の両方を含有するプラスミドを異種大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に導入し、次に対応する抗生物質上にプレーティングする。プラスミド転写抵抗性遺伝子のＲＮＡ切断がある場合、本出願人らは生存コロニーを観察しない。
更なる詳細において、ＤＮＡ標的に関してアッセイは以下のとおりであるが、ＲＮＡ標的に関してはそれに応じて適合させることができる。このアッセイでは、２つの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株を使用する。一方は、細菌株由来の内因性エフェクタータンパク質遺伝子座をコードするプラスミドを有する。他方の株は空のプラスミドを有する（例えばｐＡＣＹＣ１８４、対照株）。可能な全ての７又は８ｂｐ ＰＡＭ配列を抗生物質耐性プラスミド（アンピシリン耐性遺伝子を有するｐＵＣ１９）に提供する。ＰＡＭは、プロトスペーサー１（内因性エフェクタータンパク質遺伝子座における第１のスペーサーに対するＤＮＡ標的）の配列の隣りに位置する。２つのＰＡＭライブラリをクローニングした。一方は、プロトスペーサーの５’側に８ランダムｂｐ（例えば合計６５５３６個の異なるＰＡＭ配列＝複雑性）を有する。他方のライブラリは、プロトスペーサーの３’側に７ランダムｂｐを有する（例えば複雑性の合計は１６３８４個の異なるＰＡＭである）。両方のライブラリをクローニングすると、可能性のあるＰＡＭ当たり平均５００個のプラスミドを有することになった。試験株及び対照株に別個の形質転換で５’ＰＡＭ及び３’ＰＡＭライブラリを形質転換し、形質転換細胞を別々にアンピシリンプレートに播いた。プラスミドによる認識及び続く切断／干渉によって細胞はアンピシリンに対して脆弱になり、成長が妨げられる。形質転換の約１２時間後、試験株及び対照株によって形成された全てのコロニーを回収し、プラスミドＤＮＡを単離した。プラスミドＤＮＡを鋳型として使用してＰＣＲ増幅し、続いてディープシーケンシングを行った。非形質転換ライブラリ中の全てのＰＡＭの表現が、形質転換細胞におけるＰＡＭの予想される表現を示した。対照株に見られる全てのＰＡＭの表現が、実際の表現を示した。試験株における全てのＰＡＭの表現が、どのＰＡＭが酵素によって認識されないかを示したとともに、対照株との比較により、枯渇したＰＡＭの配列を抽出することが可能である。
毒性及びオフターゲット効果を最小限に抑えるため、送達される核酸ターゲティングガイドＲＮＡの濃度を制御することが重要となり得る。核酸ターゲティングガイドＲＮＡの最適濃度は、細胞モデル又は非ヒト真核生物動物モデルにおける種々の濃度の試験、及びディープシーケンシングを用いた潜在的なオフターゲットゲノム遺伝子座における改変の程度の分析によって決定することができる。最も高いレベルのオンターゲット改変をもたらす一方でオフターゲット改変レベルを最小限に抑える濃度が、インビボ送達に選択されるべきである。核酸ターゲティング系は、有利にはＶＩ型ＣＲＩＳＰＲ系に由来する。一部の実施形態において、核酸ターゲティング系の１つ以上のエレメントが、内因性ＲＮＡターゲティング系を含む特定の生物に由来する。詳細な実施形態では、ＶＩ型ＲＮＡターゲティングＣａｓ酵素はＣ２ｃ２である。Ｃａｓタンパク質の非限定的な例としては、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９（Ｃｓｎ１及びＣｓｘ１２としても知られる）、Ｃａｓ１０、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、これらのホモログ、又はこれらの改変バージョンが挙げられる。実施形態において、本明細書において言及されるとおりのＣ２ｃ２などのＶＩ型タンパク質は、Ｃ２ｃ２などのＶＩ型タンパク質のホモログ又はオルソログもまた包含する。用語「オルソログ（ｏｒｔｈｏｌｏｇｕｅ）」（本明細書では「オルソログ（ｏｒｔｈｏｌｏｇ）」とも称される）及び「ホモログ（ｈｏｍｏｌｏｇｕｅ）」（本明細書では「ホモログ（ｈｏｍｏｌｏｇ）」とも称される）は、当該技術分野において周知である。更なる指針として、本明細書で使用されるとおりのタンパク質の「ホモログ」は、それがそのホモログであるところのタンパク質と同じ又は同様の機能を果たす同じ種のタンパク質である。しかしホモログタンパク質は構造上関係がなくてもよく、又は構造上部分的にのみ関係している。本明細書で使用されるとおりのタンパク質の「オルソログ」は、それがそのオルソログであるところのタンパク質と同じ又は同様の機能を果たす異なる種のタンパク質である。しかしオルソログタンパク質は構造上関係がなくてもよく、又は構造上部分的にのみ関係している。詳細な実施形態において、本明細書で言及されるとおりのＣ２ｃ２などのＶＩ型タンパク質のホモログ又はオルソログは、Ｃ２ｃ２などのＶＩ型タンパク質と少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、更により好ましくは少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％などの配列相同性又は同一性を有する。更なる実施形態において、本明細書で言及されるとおりのＣ２ｃ２などのＶＩ型タンパク質のホモログ又はオルソログは、Ｃ２ｃ２などの野生型ＶＩ型タンパク質と少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、更により好ましくは少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％などの配列同一性を有する。
ある実施形態において、ＶＩ型ＲＮＡターゲティングＣａｓタンパク質は、限定はされないが、レプトトリキア属（Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ）、リステリア属（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）、コリネバクター属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒ）、ステレラ属（Ｓｕｔｔｅｒｅｌｌａ）、レジオネラ属（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）、トレポネーマ属（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ）、フィリファクター属（Ｆｉｌｉｆａｃｔｏｒ）、ユーバクテリウム属（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、マイコプラズマ属（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）、バクテロイデス属（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）、フラビイボラ属（Ｆｌａｖｉｉｖｏｌａ）、フラボバクテリウム属（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、スフェロヘータ属（Ｓｐｈａｅｒｏｃｈａｅｔａ）、アゾスピリラム属（Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）、グルコンアセトバクター属（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、ナイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、ロゼブリア属（Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ）、パルビバクラム属（Ｐａｒｖｉｂａｃｕｌｕｍ）、スタフィロコッカス属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、ニトラチフラクター属（Ｎｉｔｒａｔｉｆｒａｃｔｏｒ）、マイコプラズマ属（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）及びカンピロバクター属（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）を含む属の生物のＣ２ｃ２オルソログであってもよい。かかる属の生物の種は、他に本明細書で考察するとおりであり得る。
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系酵素のオルソログを同定する幾つかの方法は、目的のゲノムのｔｒａｃｒ配列を同定するステップを含み得る。ｔｒａｃｒ配列の同定は、以下のステップに関し得る：データベースでダイレクトリピート又はｔｒａｃｒメイト配列を検索して、ＣＲＩＳＰＲ酵素を含むＣＲＩＳＰＲ領域を同定するステップ。センス方向及びアンチセンス方向の両方にＣＲＩＳＰＲ酵素に隣接するＣＲＩＳＰＲ領域中の相同配列を検索するステップ。転写ターミネーター及び二次構造を調べるステップ。ダイレクトリピート又はｔｒａｃｒメイト配列ではないが、ダイレクトリピート又はｔｒａｃｒメイト配列と５０％より高い同一性を有する任意の配列を潜在的ｔｒａｃｒ配列として同定するステップ。その潜在的ｔｒａｃｒ配列を取り、それと会合している転写終結配列に関して分析するステップ。
本明細書に記載される機能のいずれも、複数のオルソログ由来の断片を含むキメラ酵素を含め、他のオルソログ由来のＣＲＩＳＰＲ酵素にエンジニアリングし得ることが理解されるであろう。かかるオルソログの例は、本明細書の他の部分に記載される。従って、キメラ酵素は、限定はされないが、レプトトリキア属（Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ）、リステリア属（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）、コリネバクター属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒ）、ステレラ属（Ｓｕｔｔｅｒｅｌｌａ）、レジオネラ属（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）、トレポネーマ属（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ）、フィリファクター属（Ｆｉｌｉｆａｃｔｏｒ）、ユーバクテリウム属（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、マイコプラズマ属（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）、バクテロイデス属（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）、フラビイボラ属（Ｆｌａｖｉｉｖｏｌａ）、フラボバクテリウム属（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、スフェロヘータ属（Ｓｐｈａｅｒｏｃｈａｅｔａ）、アゾスピリラム属（Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）、グルコンアセトバクター属（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、ナイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、ロゼブリア属（Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ）、パルビバクラム属（Ｐａｒｖｉｂａｃｕｌｕｍ）、スタフィロコッカス属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、ニトラチフラクター属（Ｎｉｔｒａｔｉｆｒａｃｔｏｒ）、マイコプラズマ属（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）及びカンピロバクター属（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）を含む生物のＣＲＩＳＰＲ酵素オルソログの断片を含み得る。キメラ酵素は第１の断片と第２の断片とを含むことができ、これらの断片（ｆｒａｇｒｍｅｎｔ）は、本明細書に挙げられる属又は本明細書に挙げられる種の生物のＣＲＩＳＰＲ酵素オルソログのものであり得る；有利には断片は、異なる種のＣＲＩＳＰＲ酵素オルソログ由来である。
実施形態において、本明細書において言及されるとおりのＶＩ型ＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質、詳細にはＣ２ｃ２タンパク質にはまた、Ｃ２ｃ２又はそのホモログ若しくはオルソログの機能変異体も包含される。タンパク質の「機能変異体」は、本明細書で使用されるとき、当該のタンパク質の活性を少なくとも部分的に保持しているかかるタンパク質の変異体を指す。機能変異体には、多型等を含め、突然変異体（これは挿入、欠失、又は置換突然変異体であり得る）が含まれ得る。また、機能変異体の範囲内には、かかるタンパク質と、別の、通常は無関係の核酸、タンパク質、ポリペプチド又はペプチドとの融合産物も含まれる。機能変異体は天然に存在するものであってもよく、又は人工のものであってもよい。有利な実施形態は、エンジニアリングされた又は天然に存在しないＶＩ型ＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質を含み得る。
本発明のある実施形態において、レプトトリキア・シャーイイ（Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ ｓｈａｈｉｉ）Ｃ２ｃ２、ラクノスピラ科（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ）細菌ＭＡ２０２０ Ｃ２ｃ２、ラクノスピラ科（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ）細菌ＮＫ４Ａ１７９ Ｃ２ｃ２、クロストリジウム・アミノフィルム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｍｉｎｏｐｈｉｌｕｍ）（ＤＳＭ １０７１０）Ｃ２ｃ２、カルノバクテリウム・ガリナルム（Ｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）（ＤＳＭ ４８４７）Ｃ２ｃ２、パルディバクター・プロピオニシゲネス（Ｐａｌｕｄｉｂａｃｔｅｒ ｐｒｏｐｉｏｎｉｃｉｇｅｎｅｓ）（ＷＢ４）Ｃ２ｃ２、リステリア・ウェイヘンステファネンシス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｗｅｉｈｅｎｓｔｅｐｈａｎｅｎｓｉｓ）（ＦＳＬ Ｒ９－０３１７）Ｃ２ｃ２、リステリア科（Ｌｉｓｔｅｒｉａｃｅａｅ）細菌（ＦＳＬ Ｍ６－０６３５）Ｃ２ｃ２、リステリア・ニューヨーケンシス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｎｅｗｙｏｒｋｅｎｓｉｓ）（ＦＳＬ Ｍ６－０６３５）Ｃ２ｃ２、レプトトリキア・ウエイデイ（Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ ｗａｄｅｉ）（Ｆ０２７９）Ｃ２ｃ２、ロドバクター・カプスラータス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ）（ＳＢ １００３）Ｃ２ｃ２、ロドバクター・カプスラータス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ）（Ｒ１２１）Ｃ２ｃ２、ロドバクター・カプスラータス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ）（ＤＥ４４２）Ｃ２ｃ２、レプトトリキア・ウエイデイ（Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ ｗａｄｅｉ）（Ｌｗ２）Ｃ２ｃ２、又はリステリア・ゼーリゲリ（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｓｅｅｌｉｇｅｒｉ）Ｃ２ｃ２のいずれかの野生型配列と少なくとも８０％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含むエフェクタータンパク質が提供される。
本発明のある実施形態において、エフェクタータンパク質は、限定はされないが本明細書に記載されるコンセンサス配列を含め、ＶＩ型エフェクタータンパク質コンセンサス配列と少なくとも８０％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含む。
本発明のある実施形態において、エフェクタータンパク質（ｐｏｔｅｉｎ）は、限定はされないが、本明細書に記載されるＨＥＰＮドメイン、当該技術分野において公知のＨＥＰＮドメイン、並びにコンセンサス配列及びモチーフとの比較によってＨＥＰＮドメインと認識されるドメインを含め、少なくとも１つのＨＥＰＮドメインを含む。幾つかのかかるドメインが本明細書に提供される。一つの非限定的な例において、コンセンサス配列は、本明細書に提供されるＣ２ｃ２オルソログの配列に由来することができる。
本発明のある実施形態において、エフェクタータンパク質は、ＲｘｘｘｘＨモチーフ配列を含む１つ以上のＨＥＰＮドメインを含む。ＲｘｘｘｘＨモチーフ配列は、限定なしに、本明細書に記載されるＨＥＰＮドメイン又は当該技術分野において公知のＨＥＰＮドメインからのものであってよい。ＲｘｘｘｘＨモチーフ配列には、２つ以上のＨＥＰＮドメインの一部を組み合わせることにより作り出されるモチーフ配列が更に含まれる。指摘したとおり、コンセンサス配列は、米国特許出願第６２／４３２，２４０号明細書（ＢＩ－１００３５）に開示される１５個のオルソログの配列に由来することができる。例えば、上記の配列アラインメントから、第１のＨＥＰＮドメインがＲ｛Ｎ／Ｈ｝ｘｘｘＨモチーフを含み、一方、第２のＨＥＰＮドメインがＲ｛Ｎ／Ｋ｝ｘｘｘＨモチーフを含む。
本発明のある実施形態において、ＨＥＰＮドメインは、Ｒ｛Ｎ／Ｈ／Ｋ｝Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｈの配列を含む少なくとも１つのＲｘｘｘｘＨモチーフを含む。本発明のある実施形態において、ＨＥＰＮドメインは、Ｒ｛Ｎ／Ｈ｝Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｈの配列を含むＲｘｘｘｘＨモチーフを含む。本発明のある実施形態において、ＨＥＰＮドメインはＲ｛Ｎ／Ｋ｝Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｈの配列を含む。特定の実施形態において、Ｘ１はＲ、Ｓ、Ｄ、Ｅ、Ｑ、Ｎ、Ｇ、Ｙ、又はＨである。特定の実施形態において、Ｘ２はＩ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、又はＬである。特定の実施形態において、Ｘ３はＬ、Ｆ、Ｎ、Ｙ、Ｖ、Ｉ、Ｓ、Ｄ、Ｅ、又はＡである。
本発明に係る使用のための更なるエフェクターは、ｃａｓ１遺伝子へのその近接性、例えば、限定はされないが、ｃａｓ１遺伝子の始端から領域２０ｋｂ及びｃａｓ１遺伝子の終端から２０ｋｂ以内によって同定することができる。特定の実施形態（ｅｍｂｏｄｉｍｅｎｓｔ）において、エフェクタータンパク質は少なくとも１つのＨＥＰＮドメイン及び少なくとも５００アミノ酸を含み、ここでＣ２ｃ２エフェクタータンパク質は原核生物ゲノムにおいてＣａｓ１遺伝子又はＣＲＩＳＰＲアレイの上流又は下流２０ｋｂ以内に天然に存在する。
ある実施形態において、ＶＩ型ＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質、詳細にはＣ２ｃ２又はそのオルソログ若しくはホモログをコードする１つ又は複数の核酸分子は、真核細胞での発現にコドン最適化され得る。真核生物は、本明細書に考察されるとおりのものであってもよい。１つ又は複数の核酸分子は、エンジニアリングされたもの又は天然に存在しないものであってもよい。
ある実施形態において、ＶＩ型ＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質、詳細にはＣ２ｃ２又はそのオルソログ若しくはホモログは１つ以上の突然変異を含み得る（ひいてはそれをコードする１つ又は複数の核酸分子が１つ又は複数の突然変異を有し得る）。突然変異は人工的に導入された突然変異であってもよく、限定はされないが、触媒ドメインにおける１つ以上の突然変異が含まれ得る。Ｃａｓ９酵素に関連する触媒ドメインの例としては、限定はされないが、ＲｕｖＣ Ｉ、ＲｕｖＣ ＩＩ、ＲｕｖＣ ＩＩＩ及びＨＮＨドメインを挙げることができる。
ある実施形態において、Ｃ２ｃ２などのＶＩ型タンパク質又はそのオルソログ若しくはホモログは１つ以上の突然変異を含み得る。突然変異は人工的に導入された突然変異であってもよく、限定はされないが、触媒ドメインにおける１つ以上の突然変異を挙げることができる。Ｃａｓ酵素に関連する触媒ドメインの例としては、限定はされないがＨＥＰＮドメインを挙げることができる。
ある実施形態において、Ｃ２ｃ２又はそのオルソログ若しくはホモログなどのＶＩ型タンパク質は、機能ドメインと融合した又はそれに作動可能に連結された汎用核酸結合タンパク質として用いられ得る。例示的機能ドメインとしては、限定はされないが、翻訳開始因子、翻訳活性化因子、翻訳抑制因子、ヌクレアーゼ、詳細にはリボヌクレアーゼ、スプライソソーム、ビーズ、光誘導性／制御性ドメイン又は化学物質誘導性／制御性ドメインを挙げることができる。
一部の実施形態において、非改変核酸ターゲティングエフェクタータンパク質は切断活性を有し得る。一部の実施形態において、ＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質は、標的配列内及び／又は標的配列の相補体内又は標的配列と会合した配列においてなど、標的配列の位置又はその近傍における一方又は両方の核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ）鎖の切断を導き得る。一部の実施形態において、核酸ターゲティングＣａｓタンパク質は、標的配列の最初又は最後のヌクレオチドから約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、５０、１００、２００、５００、又はそれを超える塩基対以内にあるＲＮＡ鎖の切断を導き得る。一部の実施形態において、ベクターは、対応する野生型酵素と比べて突然変異していてもよい核酸ターゲティングＣａｓタンパク質をコードし、そのため突然変異型核酸ターゲティングＣａｓタンパク質は、標的配列を含有する標的ポリヌクレオチドの一方又は両方のＤＮＡ鎖又はＲＮＡ鎖を切断する能力を欠くことになる。更なる例として、Ｃａｓの２つ以上の触媒ドメイン（例えばＨＥＰＮドメイン）を突然変異させることにより、実質的に全てのＲＮＡ切断活性を欠く突然変異型Ｃａｓが作製されてもよい。一部の実施形態において、核酸ターゲティングエフェクタータンパク質は、突然変異酵素のＲＮＡ切断活性が非突然変異型の酵素の核酸切断活性の約２５％、１０％、５％、１％、０．１％、０．０１％以下、又はそれ未満であるとき、実質的に全てのＲＮＡ切断活性を欠いていると見なされ得る；一例は、突然変異型の核酸切断活性が非突然変異型と比較したときゼロ又は無視できる程度のときであり得る。エフェクタータンパク質は、ＶＩ型ＣＲＩＳＰＲ系からの複数のヌクレアーゼドメインを有する最も大型のヌクレアーゼと相同性を共有する一般的な酵素クラスを参照して同定し得る。最も好ましくは、エフェクタータンパク質は、Ｃ２ｃ２などのＶＩ型タンパク質である。由来するとは、本出願人らは、由来酵素が野生型酵素と高度な配列相同性を有するという意味で概して野生型酵素をベースとするが、しかしそれは当該技術分野において公知のとおりの又は本明細書に記載されるとおりの何らかの方法で突然変異している（改変されている）ことを意味する。
この場合もまた、用語のＣａｓ及びＣＲＩＳＰＲ酵素及びＣＲＩＳＰＲタンパク質及びＣａｓタンパク質は、概して同義的に用いられ、Ｃａｓ９に具体的に言及することによるなど、特に明らかでない限り、本明細書で言及する際は常に類推から、本願に更に記載される新規ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質を指すことが理解されるであろう。上述のとおり、本明細書において用いられる残基付番の多くは、ＶＩ型ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座からのエフェクタータンパク質を参照する。しかしながら、本発明には、他の微生物種由来の更に多くのエフェクタータンパク質が含まれることが理解されるであろう。特定の実施形態において、Ｃａｓは構成的に存在しても、又は誘導可能に存在しても、又は条件的に存在しても、又は投与されても、又は送達されてもよい。Ｃａｓ最適化を用いて機能を増強し、又は新規機能を開発してもよく、キメラＣａｓタンパク質を作成することができる。及びＣａｓを汎用核酸結合タンパク質として用いられてもよい。
典型的には、内因性核酸ターゲティング系のコンテクストでは、核酸ターゲティング複合体の形成（標的配列にハイブリダイズし、且つ１つ以上の核酸ターゲティングエフェクタータンパク質と複合体を形成したガイドＲＮＡを含む）は、標的配列内に又はその近傍に（例えば、それから１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、５０、１００、２００、５００塩基対、又はそれ以上の範囲内に）一方又は両方のＤＮＡ鎖又はＲＮＡ鎖の切断をもたらす。本明細書で使用されるとき、用語「目的の標的遺伝子座と会合した１つ又は複数の配列」は、標的配列付近の近傍（例えば標的配列から１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、５０、１００、２００、５００塩基対、又はそれ以上の範囲内、ここで標的配列は目的の標的遺伝子座内に含まれる）にある配列を指す。
コドン最適化された配列の例は、この場合、真核生物、例えばヒトでの発現に最適化されるか（即ちヒトでの発現に最適化されている）、又は別の本明細書で考察されるとおりの真核生物、動物又は哺乳動物に最適化された配列である；例えば、コドン最適化配列の例として国際公開第２０１４／０９３６２２号パンフレット（ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７４６６７号明細書）のＳａＣａｓ９ヒトコドン最適化配列を参照のこと（当該技術分野及び本開示における知識から、特にエフェクタータンパク質（例えばＣ２ｃ２）に関して、１つ又は複数のコード核酸分子のコドン最適化は当業者の範囲内にある）。これが好ましいが、他の例が可能であることが理解され、ヒト以外の宿主種に対するコドン最適化、又は特定の器官に対するコドン最適化が公知である。一部の実施形態において、ＤＮＡ／ＲＮＡターゲティングＣａｓタンパク質をコードする酵素コード配列が、特定の細胞、例えば真核細胞での発現にコドン最適化される。真核細胞は、特定の生物、例えば限定はされないがヒトを含めた哺乳動物、又は本明細書で考察されるとおりの非ヒト真核生物又は動物又は哺乳動物、例えば、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、家畜、又は非ヒト哺乳動物又は霊長類のものであるか、又はそれに由来し得る。一部の実施形態において、ヒト又は動物に対するいかなる実質的な医学的利益もなくそれらに苦痛を生じさせる可能性のあるヒトの生殖細胞系列遺伝子アイデンティティの改変方法及び／又は動物の遺伝子アイデンティティの改変方法、更にかかる方法から得られる動物は除外され得る。一般に、コドン最適化とは、天然配列の少なくとも１つのコドン（例えば、約１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、５０個以上、又はそれより多いコドン）を、天然のアミノ酸配列を維持しつつ、当該の宿主細胞の遺伝子においてより高頻度で又は最も高頻度で使用されるコドンに置き換えることにより、目的の宿主細胞における発現を増強するための核酸配列の改変方法を指す。様々な種が、特定のアミノ酸のあるコドンについて特定のバイアスを呈する。コドンバイアス（生物間でのコドン使用の違い）は、多くの場合にメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の翻訳効率と相関し、次にはそれが、数ある中でも特に、翻訳されるコドンの特性及び特定のトランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）分子の利用可能性に依存すると考えられている。細胞において選択のｔＲＮＡが優勢であることは、概して、ペプチド合成で最も高頻度に使用されるコドンを反映するものである。従って、コドン最適化に基づき所与の生物における最適な遺伝子発現に合わせて遺伝子を調整することができる。コドン使用表が、例えば、ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒｊｐ／ｃｏｄｏｎ／で利用可能な「コドン使用データベース（Ｃｏｄｏｎ Ｕｓａｇｅ Ｄａｔａｂａｓｅ）」で容易に利用可能であり、これらの表を幾つもの方法で適合させることができる。Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｙ．，ｅｔ ａｌ．「国際的ＤＮＡ配列データベースから表にしたコドン使用：２０００年の状況（Ｃｏｄｏｎ ｕｓａｇｅ ｔａｂｕｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｄａｔａｂａｓｅｓ：ｓｔａｔｕｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｙｅａｒ ２０００）」Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２８：２９２（２０００）を参照のこと。特定の配列を特定の宿主細胞における発現にコドン最適化するためのコンピュータアルゴリズムもまた利用可能であり、Ｇｅｎｅ Ｆｏｒｇｅ（Ａｐｔａｇｅｎ；Ｊａｃｏｂｕｓ，ＰＡ）などもまた利用可能である。一部の実施形態において、ＤＮＡ／ＲＮＡターゲティングＣａｓタンパク質をコードする配列中の１つ以上のコドン（例えば、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、５０以上、又は全てのコドン）が、特定のアミノ酸について最も高頻度に使用されるコドンに対応する。
一部の実施形態において、ベクターは、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個以上、又はそれより多いＮＬＳ又はＮＥＳなど、１個以上の核局在化配列（ＮＬＳ）又は核外移行配列（ＮＥＳ）を含む核酸ターゲティングエフェクタータンパク質、例えばＣ２ｃ２又はそのオルソログ若しくはホモログをコードする。一部の実施形態において、ＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質は、アミノ末端又はその近傍に約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個以上、又はそれより多いＮＬＳ又はＮＥＳを含むか、カルボキシ末端又はその近傍に約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個以上、又はそれより多いＮＬＳ又はＮＥＳを含むか、又はこれらの組み合わせ（例えば、アミノ末端にゼロ個又は少なくとも１個以上のＮＬＳ又はＮＥＳ及びカルボキシ末端にゼロ個又は１個以上のＮＬＳ又はＮＥＳ）である。２個以上のＮＬＳ又はＮＥＳが存在する場合、各々を他と独立して選択してもよく、従って単一のＮＬＳ又はＮＥＳが２つ以上のコピーで存在してもよく、及び／又は１つ以上のコピーで存在する１つ以上の他のＮＬＳ又はＮＥＳとの組み合わせで存在してもよい。一部の実施形態において、ＮＬＳ又はＮＥＳは、ＮＬＳ又はＮＥＳの最も近いアミノ酸がＮ末端又はＣ末端からポリペプチド鎖に沿って約１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、又はそれより多いアミノ酸の範囲内にあるとき、Ｎ末端又はＣ末端の近傍にあると見なされる。ＮＬＳの非限定的な例としては、アミノ酸配列ＰＫＫＫＲＫＶを有するＳＶ４０ウイルスラージＴ抗原のＮＬＳ；ヌクレオプラスミンのＮＬＳ（例えば、配列ＫＲＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡＫＫＫＫを有するヌクレオプラスミンビパルタイトＮＬＳ）；アミノ酸配列ＰＡＡＫＲＶＫＬＤ又はＲＱＲＲＮＥＬＫＲＳＰを有するｃ－ｍｙｃ ＮＬＳ；配列ＮＱＳＳＮＦＧＰＭＫＧＧＮＦＧＧＲＳＳＧＰＹＧＧＧＧＱＹＦＡＫＰＲＮＱＧＧＹを有するｈＲＮＰＡ１ Ｍ９ ＮＬＳ；インポーチン－αのＩＢＢドメインの配列ＲＭＲＩＺＦＫＮＫＧＫＤＴＡＥＬＲＲＲＲＶＥＶＳＶＥＬＲＫＡＫＫＤＥＱＩＬＫＲＲＮＶ；筋腫Ｔタンパク質の配列ＶＳＲＫＲＰＲＰ及びＰＰＫＫＡＲＥＤ；ヒトｐ５３の配列ＰＱＰＫＫＫＰＬ；マウスｃ－ａｂｌ ＩＶの配列ＳＡＬＩＫＫＫＫＫＭＡＰ；インフルエンザウイルスＮＳ１の配列ＤＲＬＲＲ及びＰＫＱＫＫＲＫ；肝炎ウイルスデルタ抗原の配列ＲＫＬＫＫＫＩＫＫＬ；マウスＭｘ１タンパク質の配列ＲＥＫＫＫＦＬＫＲＲ；ヒトポリ（ＡＤＰ－リボース）ポリメラーゼの配列ＫＲＫＧＤＥＶＤＧＶＤＥＶＡＫＫＫＳＫＫ；及びステロイドホルモン受容体（ヒト）グルココルチコイドの配列ＲＫＣＬＱＡＧＭＮＬＥＡＲＫＴＫＫに由来するＮＬＳ配列が挙げられる。一般に、１つ以上のＮＬＳ又はＮＥＳは、真核細胞の核又は細胞質における検出可能な量のＤＮＡ／ＲＮＡターゲティングＣａｓタンパク質の蓄積をドライブするのに十分な強度である。一般に、核局在化活性の強度は、核酸ターゲティングエフェクタータンパク質内のＮＬＳ又はＮＥＳの数、用いられる詳細なＮＬＳ又はＮＥＳ、又はこれらの組み合わせ要因から導き出すことができる。核／細胞質内での蓄積の検出は任意の好適な技法によって実施し得る。例えば、検出可能なマーカーを核酸ターゲティングタンパク質に融合してもよく、それにより、核又は細胞質の位置を検出する手段（例えば、ＤＡＰＩなど、核に特異的な染色）と組み合わせるなどして細胞内での位置を可視化してもよい。細胞核はまた、細胞から単離してもよく、次にその内容物を、免疫組織化学、ウエスタンブロット、又は酵素活性アッセイなど、任意の好適なタンパク質検出方法によって分析してもよい。核／細胞質内における蓄積はまた、核酸ターゲティング複合体形成の効果に関するアッセイ（例えば、標的配列におけるＲＮＡ切断又は突然変異に関するアッセイ、又はＲＮＡターゲティング複合体形成及び／又はＲＮＡターゲティングＣａｓタンパク質活性の影響を受けて変化した遺伝子発現活性に関するアッセイ）によるなどして、核酸ターゲティングＣａｓタンパク質又は核酸ターゲティング複合体に曝露されていない対照、又は１つ以上のＮＬＳ又はＮＥＳを欠く核酸ターゲティングＣａｓタンパク質に曝露された対照と比較して間接的に決定してもよい。本明細書に記載されるＣ２ｃ２エフェクタータンパク質複合体及び系の好ましい実施形態において、コドン最適化Ｃ２ｃ２エフェクタータンパク質は、タンパク質のＣ末端に付加されたＮＬＳ又はＮＥＳを含む。
一部の実施形態において、核酸ターゲティング系の１つ以上のエレメントの発現をドライブする１つ以上のベクターが宿主細胞に導入され、核酸ターゲティング系のエレメントが発現すると、１つ以上の標的部位において核酸ターゲティング複合体の形成が導かれる。例えば、核酸ターゲティングエフェクター酵素及び核酸ターゲティングガイドＲＮＡが、各々別個のベクター上で別個の調節エレメントに作動可能に連結されてもよい。核酸ターゲティング系の１つ又は複数のＲＮＡは、トランスジェニック核酸ターゲティングエフェクタータンパク質動物又は哺乳動物、例えば、核酸ターゲティングエフェクタータンパク質を構成的に又は誘導性に又は条件的に発現する動物又は哺乳動物；又は本来核酸ターゲティングエフェクタータンパク質を発現しているか又は核酸ターゲティングエフェクタータンパク質を含有する細胞を有する動物又は哺乳動物へと、核酸ターゲティングエフェクタータンパク質をインビボでコードし及び発現する１つ又は複数のベクターをそれに事前投与するなどして送達することができる。或いは、同じ又は異なる調節エレメントから発現するエレメントのうちの２つ以上が単一のベクターに組み合わされてもよく、１つ以上の追加のベクターが、第１のベクターに含まれない核酸ターゲティング系の任意の構成成分を提供する。単一のベクターに組み合わされる核酸ターゲティング系エレメントは、あるエレメントが第２のエレメントに対して５’側（その「上流」）に位置し、又はそれに対して３’側（その「下流」）に位置するなど、任意の好適な向きで配置されてもよい。あるエレメントのコード配列は第２のエレメントのコード配列と同じ鎖上又は逆鎖上に位置してもよく、同じ又は逆の方向に向いていてもよい。一部の実施形態において、単一のプロモーターが、１つ以上のイントロン配列内に組み込まれた（例えば、各々が異なるイントロンにあるか、２つ以上が少なくとも１つのイントロンにあるか、又は全てが単一のイントロンにある）、核酸ターゲティングエフェクタータンパク質及び核酸ターゲティングガイドＲＮＡをコードする転写物の発現をドライブする。一部の実施形態において、核酸ターゲティングエフェクタータンパク質と核酸ターゲティングガイドＲＮＡとは同じプロモーターに作動可能に連結されていて、そこから発現してもよい。核酸ターゲティング系の１つ以上のエレメントを発現させるための送達媒体、ベクター、粒子、ナノ粒子、製剤及びその構成成分については、国際公開第２０１４／０９３６２２号パンフレット（ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７４６６７号明細書）など、前述の文献で使用されているとおりである。一部の実施形態において、ベクターは制限エンドヌクレアーゼ認識配列などの１つ以上の挿入部位（「クローニング部位」とも称される）を含む。一部の実施形態において、１つ以上の挿入部位（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個以上、又はそれより多い挿入部位）は、１つ以上のベクターの１つ以上の配列エレメントの上流及び／又は下流に位置する。一部の実施形態において、ベクターは２つ以上の挿入部位を含み、従って各部位へのガイド配列の挿入が可能である。かかる構成において、２つ以上のガイド配列は、単一のガイド配列の２つ以上のコピー、２つ以上の異なるガイド配列、又はこれらの組み合わせを含み得る。複数の異なるガイド配列を使用すると、単一の発現構築物を用いて細胞内の複数の異なる対応する標的配列へと核酸ターゲティング活性を標的化させることができる。例えば、単一のベクターが、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０個以上、又はそれより多いガイド配列を含み得る。一部の実施形態において、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個以上、又はそれより多いかかるガイド配列含有ベクターが提供され、及び任意選択で細胞に送達されてもよい。一部の実施形態において、ベクターは、核酸ターゲティングエフェクタータンパク質をコードする酵素コード配列に作動可能に連結された調節エレメントを含む。核酸ターゲティングエフェクタータンパク質又は１つ又は複数の核酸ターゲティングガイドＲＮＡは別個に送達してもよく；及び有利には、これらのうちの少なくとも１つが粒子又はナノ粒子複合体によって送達される。核酸ターゲティングエフェクタータンパク質に発現する時間を与えるため、核酸ターゲティングエフェクタータンパク質ｍＲＮＡを核酸ターゲティングガイドＲＮＡより先に送達してもよい。核酸ターゲティングエフェクタータンパク質ｍＲＮＡは核酸ターゲティングガイドＲＮＡの投与の１～１２時間前（好ましくは約２～６時間前）に投与されてもよい。或いは、核酸ターゲティングエフェクタータンパク質ｍＲＮＡ及び核酸ターゲティングガイドＲＮＡは一緒に投与されてもよい。有利には、核酸ターゲティングエフェクタータンパク質ｍＲＮＡ＋ガイドＲＮＡの初回投与から１～１２時間後（好ましくは約２～６時間後）にガイドＲＮＡの第２のブースター用量が投与されてもよい。核酸ターゲティングエフェクタータンパク質ｍＲＮＡ及び／又はガイドＲＮＡの追加の投与は、最も効率的なゲノム及び／又はトランスクリプトーム改変レベルを達成するのに有用であり得る。
一態様において、本発明は、核酸ターゲティング系の１つ以上のエレメントの使用方法を提供する。本発明の核酸ターゲティング複合体は、標的ＲＮＡを改変する有効な手段を提供する。本発明の核酸ターゲティング複合体は、非常に多数の細胞型における標的ＲＮＡの改変（例えば、欠失、挿入、転位、不活性化、活性化）を含め、多岐にわたる有用性を有する。このように本発明の核酸ターゲティング複合体は、例えば、遺伝子療法、薬物スクリーニング、疾患診断、及び予後判定において、広範な適用性を有する。例示的核酸ターゲティング複合体は、目的の標的遺伝子座内の標的配列にハイブリダイズするガイドＲＮＡと複合体を形成したＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質を含む。
一実施形態において、本発明は、標的ＲＮＡを切断する方法を提供する。本方法は、標的ＲＮＡに結合して前記標的ＤＮＡの切断を生じさせる核酸ターゲティング複合体を用いて標的ＲＮＡを改変するステップを含み得る。ある実施形態において、本発明の核酸ターゲティング複合体は、細胞に導入されると、ＲＮＡ配列に切断（例えば一本鎖又は二本鎖切断）を作り出し得る。例えば、本方法を用いて細胞内の疾患ＲＮＡを切断することができる。例えば、組み込もうとする配列に上流配列及び下流配列が隣接した外因性ＲＮＡ鋳型が細胞に導入されてもよい。これらの上流及び下流配列は、ＲＮＡにおける組込み部位の両側と配列類似性を共有している。必要に応じて、ドナーＲＮＡはｍＲＮＡであってもよい。外因性ＲＮＡ鋳型は、組み込もうとする配列（例えば、突然変異型ＲＮＡ）を含む。組込み配列は、細胞にとって内因性又は外因性の配列であってもよい。組み込もうとする配列の例としては、タンパク質をコードするＲＮＡ又は非コードＲＮＡ（例えば、マイクロＲＮＡ）が挙げられる。従って、組込み配列は、１つ又は複数の適切な制御配列に作動可能に連結され得る。或いは、組込み配列が調節機能を提供し得る。外因性ＲＮＡ鋳型中の上流及び下流配列は、目的のＲＮＡ配列とドナーＲＮＡとの間の組換えを促進するように選択される。上流配列は、標的組込み部位の上流のＲＮＡ配列と配列類似性を共有するＲＮＡ配列である。同様に、下流配列は、標的組込み部位の下流のＲＮＡ配列と配列類似性を共有するＲＮＡ配列である。外因性ＲＮＡ鋳型中の上流及び下流配列は、標的ＲＮＡ配列と７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は１００％の配列同一性を有し得る。好ましくは、外因性ＲＮＡ鋳型中の上流及び下流配列は、標的ＲＮＡ配列と約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する。一部の方法において、外因性ＲＮＡ鋳型中の上流及び下流配列は、標的ＲＮＡ配列と約９９％又は１００％の配列同一性を有する。上流又は下流配列は、約２０ｂｐ～約２５００ｂｐ、例えば、約５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、２０００、２１００、２２００、２３００、２４００、又は２５００ｂｐを含み得る。一部の方法において、例示的上流又は下流配列は、約２００ｂｐ～約２０００ｂｐ、約６００ｂｐ～約１０００ｂｐ、又はより詳細には約７００ｂｐ～約１０００ｂｐを有する。一部の方法において、外因性ＲＮＡ鋳型はマーカーを更に含み得る。かかるマーカーは標的組込みのスクリーニングを容易にし得る。好適なマーカーの例としては、制限部位、蛍光タンパク質、又は選択可能マーカーが挙げられる。本発明の外因性ＲＮＡ鋳型は組換え技術を用いて構築することができる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，２００１及びＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９９６を参照）。外因性ＲＮＡ鋳型を組み込むことによる標的ＲＮＡの改変方法では、核酸ターゲティング複合体によってＤＮＡ又はＲＮＡ配列に切断（例えば、二本鎖又は一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡにおける二本鎖又は一本鎖切断）が導入され、外因性ＲＮＡ鋳型との相同組換えによってこの切断が修復されると、鋳型がＲＮＡ標的に組み込まれる。二本鎖切断の存在が鋳型の組込みを促進する。他の実施形態において、本発明は、真核細胞におけるＲＮＡの発現を改変する方法を提供する。本方法は、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ又はプレｍＲＮＡ）に結合する核酸ターゲティング複合体を用いて標的ポリヌクレオチドの発現を増加又は減少させるステップを含む。一部の方法では、標的ＲＮＡを不活性化させて細胞の発現の改変を生じさせることができる。例えば、ＲＮＡターゲティング複合体が細胞内の標的配列に結合すると、標的ＲＮＡが不活性化され、そのためその配列は翻訳されないか、コードされたタンパク質が産生されないか、又は配列が野生型配列のようには機能しなくなる。例えば、タンパク質又はマイクロＲＮＡをコードする配列を不活性化して、タンパク質又はマイクロＲＮＡ又はプレマイクロＲＮＡ転写物が産生されないようにし得る。ＲＮＡターゲティング複合体の標的ＲＮＡは、真核細胞にとって内因性又は外因性の任意のＲＮＡであってもよい。例えば、標的ＲＮＡは、真核細胞の核に存在するＲＮＡであってもよい。標的ＲＮＡは、遺伝子産物（例えばタンパク質）をコードする配列（例えば、ｍＲＮＡ又はプレｍＲＮＡ）又は非コード配列（例えば、ｎｃＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｔＲＮＡ、又はｒＲＮＡ）であってもよい。標的ＲＮＡの例としては、生化学的シグナル伝達経路に関連する配列、例えば、生化学的シグナル伝達経路関連ＲＮＡが挙げられる。標的ＲＮＡの例としては、疾患関連ＲＮＡが挙げられる。「疾患関連」ＲＮＡは、非疾患対照の組織又は細胞と比較して罹患組織に由来する細胞において翻訳産物を異常なレベルで、又は異常な形態で産生している任意のＲＮＡを指す。それは異常に高いレベルで発現するようになる遺伝子から転写されるＲＮＡであってもよく；それは異常に低いレベルで発現するようになる遺伝子から転写されるＲＮＡであってもよく、ここで発現の変化は疾患の発生率及び／又は進行と相関する。疾患関連ＲＮＡはまた、疾患の病因に直接関与するか、又はそれに関与する１つ又は複数の遺伝子との連鎖不平衡がある１つ又は複数の突然変異又は遺伝的変異を有する遺伝子から転写されるＲＮＡも指す。翻訳産物は既知であっても又は未知であってもよく、及び正常レベルであっても又は異常レベルであってもよい。ＲＮＡターゲティング複合体の標的ＲＮＡは、真核細胞にとって内因性又は外因性の任意のＲＮＡであってもよい。例えば、標的ＲＮＡは、真核細胞の核に存在するＲＮＡであってもよい。標的ＲＮＡは、遺伝子産物（例えばタンパク質）をコードする配列（例えば、ｍＲＮＡ又はプレｍＲＮＡ）又は非コード配列（例えば、ｎｃＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｔＲＮＡ、又はｒＲＮＡ）であってもよい。
一部の実施形態において、本方法は、核酸ターゲティング複合体を標的ＲＮＡに結合させて前記標的ＲＮＡ又はＲＮＡの切断を生じさせ、それにより標的ＲＮＡを改変するステップを含むことができ、ここで核酸ターゲティング複合体は、前記標的ＲＮＡ内の標的配列にハイブリダイズするガイドＲＮＡと複合体を形成した核酸ターゲティングエフェクタータンパク質を含む。一態様において、本発明は、真核細胞におけるＲＮＡの発現を改変する方法を提供する。一部の実施形態において、本方法は、核酸ターゲティング複合体をＲＮＡに結合させて、前記結合により前記ＲＮＡの発現の増加又は減少を生じさせるステップを含み；ここで核酸ターゲティング複合体は、ガイドＲＮＡと複合体を形成した核酸ターゲティングエフェクタータンパク質を含む。同様の考察及び条件が、標的ＲＮＡを改変する方法にも上記のとおり適用される。実際上、これらの試料採取、培養及び再導入の選択肢は本発明の全態様に適用される。一態様において、本発明は、真核細胞の標的ＲＮＡを改変する方法を提供し、これはインビボ、エキソビボ又はインビトロであってもよい。一部の実施形態において、本方法は、ヒト又は非ヒト動物から細胞又は細胞集団を試料採取するステップ、及び１つ又は複数の細胞を改変するステップを含む。培養は任意の段階でエキソビボで行われ得る。この１つ又は複数の細胞が、更には非ヒト動物又は植物に再導入されてもよい。再導入される細胞について、細胞は幹細胞であることが特に好ましい。
実際、本発明の任意の態様において、核酸ターゲティング複合体は、標的配列にハイブリダイズするガイドＲＮＡと複合体を形成した核酸ターゲティングエフェクタータンパク質を含み得る。
本発明は、核酸ターゲティング系及びその構成成分に関係した、ＲＮＡ配列ターゲティングが関わる遺伝子発現の制御に用いられる系、方法及び組成物のエンジニアリング及び最適化に関する。有利な実施形態において、エフェクタータンパク質酵素は、Ｃ２ｃ２などのＶＩ型タンパク質である。本方法の利点は、ＣＲＩＳＰＲ系がオフターゲット結合及びその結果として生じる副作用を最小限に抑え、又はそれを回避することである。これは、標的ＲＮＡに対して高度な配列特異性を有するように構成された系を用いて達成される。
核酸ターゲティング複合体又は系に関して、好ましくは、ｔｒａｃｒ配列は１つ以上のヘアピンを有し、３０ヌクレオチド長以上、４０ヌクレオチド長以上、又は５０ヌクレオチド長以上であり；ｃｒＲＮＡ配列は１０～３０ヌクレオチド長であり、核酸ターゲティングエフェクタータンパク質はＶＩ型エフェクタータンパク質である。
特定の実施形態において、エフェクタータンパク質はリステリア属種（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｓｐ．）Ｃ２ｃ２ｐ、好ましくはリステリア・ゼーリゲリ（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｓｅｅｌｉｇｅｒｉａ）Ｃ２ｃ２ｐ、より好ましくはリステリア・ゼーリゲリ（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｓｅｅｌｉｇｅｒｉａ）血清型１／２ｂ株ＳＬＣＣ３９５４ Ｃ２ｃ２ｐであってもよく、及びｃｒＲＮＡ配列は４４～４７ヌクレオチド長で、５’２９ｎｔダイレクトリピート（ＤＲ）及び１５ｎｔ～１８ｎｔスペーサーを有してもよい。
特定の実施形態において、エフェクタータンパク質はレプトトリキア属種（Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ ｓｐ．）Ｃ２ｃ２ｐ、好ましくはレプトトリキア・シャーイイ（Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ ｓｈａｈｉｉ）Ｃ２ｃ２ｐ、より好ましくはレプトトリキア・シャーイイ（Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ ｓｈａｈｉｉ）ＤＳＭ １９７５７ Ｃ２ｃ２ｐであってもよく、及びｃｒＲＮＡ配列は４２～５８ヌクレオチド長で、少なくとも２４ｎｔの５’ダイレクトリピート、例えば５’２４～２８ｎｔダイレクトリピート（ＤＲ）及び少なくとも１４ｎｔのスペーサー、例えば１４ｎｔ～２８ｎｔスペーサー、又は少なくとも１８ｎｔ、例えば１９、２０、２１、２２ｎｔ、又はそれ以上、例えば１８～２８、１９～２８、２０～２８、２１～２８、又は２２～２８ｎｔのスペーサーを有してもよい。
より好ましくは、エフェクタータンパク質はレプトトリキア属種（Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ ｓｐ．）、好ましくはレプトトリキア・ウエイデイ（Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ ｗａｄｅｉ）Ｆ０２７９、又はリステリア属種（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｓｐ．）、好ましくはリステリア・ニューヨーケンシス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｎｅｗｙｏｒｋｅｎｓｉｓ）ＦＳＬ Ｍ６－０６３５であってもよい。
特定の実施形態において、エフェクタータンパク質はＶＩ型遺伝子座エフェクタータンパク質、より詳細にはＣ２ｃ２ｐであってもよく、及びｃｒＲＮＡ配列は３６～６３ヌクレオチド長、好ましくは３７ｎｔ～６２ｎｔ長、又は３８ｎｔ～６１ｎｔ長、又は３９ｎｔ～６０ｎｔ長、より好ましくは４０ｎｔ～５９ｎｔ長、又は４１ｎｔ～５８ｎｔ長、最も好ましくは４２ｎｔ～５７ｎｔ長であってもよい。例えば、ｃｒＲＮＡは、２６ｎｔ～３１ｎｔ長、好ましくは２７ｎｔ～３０ｎｔ長、更により好ましくは２８ｎｔ若しくは２９ｎｔ長又は少なくとも２８若しくは２９ｎｔ長のダイレクトリピート（ＤＲ）、好ましくは５’ＤＲ、及び１０ｎｔ～３２ｎｔ長、好ましくは１１ｎｔ～３１ｎｔ長、より好ましくは１２ｎｔ～３０ｎｔ長、更により好ましくは１３ｎｔ～２９ｎｔ長、及び最も好ましくは１４ｎｔ～２８ｎｔ長、例えば１８～２８ｎｔ、１９～２８ｎｔ、２０～２８ｎｔ、２１～２８ｎｔ、又は２２～２８ｎｔのスペーサーを含んでもよく、それから本質的になってもよく、又はそれからなってもよい。
特定の実施形態において、エフェクタータンパク質はＶＩ型遺伝子座エフェクタータンパク質、より詳細にはＣ２ｃ２ｐであってもよく、及びｔｒａｃｒＲＮＡ配列（存在する場合）は、少なくとも６０ｎｔ長、例えば少なくとも６５ｎｔ長、又は少なくとも７０ｎｔ長、例えば６０ｎｔ～７０ｎｔ長、又は６０ｎｔ～７０ｎｔ長、又は７０ｎｔ～８０ｎｔ長、又は８０ｎｔ～９０ｎｔ長、又は９０ｎｔ～１００ｎｔ長、又は１００ｎｔ～１１０ｎｔ長、又は１１０ｎｔ～１２０ｎｔ長、又は１２０ｎｔ～１３０ｎｔ長、又は１３０ｎｔ～１４０ｎｔ長、又は１４０ｎｔ～１５０ｎｔ長、又は１５０ｎｔ長超であってもよい。
特定の実施形態において、エフェクタータンパク質はＶＩ型遺伝子座エフェクタータンパク質、より詳細にはＣ２ｃ２ｐであってもよく、及びｔｒａｃｒＲＮＡは切断に不要であってもよい。
２つの異なるアプタマー（各々が個別の核酸ターゲティングガイドＲＮＡと会合している）を用いると、アクチベーター－アダプタータンパク質融合物及びリプレッサー－アダプタータンパク質融合物を異なる核酸ターゲティングガイドＲＮＡと共に使用して、１つのＤＮＡ又はＲＮＡの発現を活性化する一方で別のＤＮＡ又はＲＮＡの発現を抑制することが可能になる。これらは、その異なるガイドＲＮＡと共に、多重化手法で一緒に、又は実質的に一緒に投与することができる。比較的少数のエフェクタータンパク質分子を多数の改変ガイドと共に使用することができるため、例えば１０又は２０又は３０個など、多数のかかる改変された核酸ターゲティングガイドＲＮＡを全て同時に使用し得る一方で１つのみの（又は少なくとも最小数の）エフェクタータンパク質分子を送達するだけで十分である。アダプタータンパク質は１つ以上のアクチベーター又は１つ以上のリプレッサーと会合（好ましくは連結又は融合）していてもよい。例えば、アダプタータンパク質は第１のアクチベーター及び第２のアクチベーターと会合していてもよい。第１及び第２のアクチベーターは同じであってもよいが、これらは好ましくは異なるアクチベーターである。３つ以上又は更には４つ以上のアクチベーター（又はリプレッサー）を使用してもよく、しかしパッケージサイズにより、個数が５を超える異なる機能ドメインとなることは制限され得る。アダプタータンパク質との直接的な融合と比べて、好ましくはリンカーが用いられ、ここでは２つ以上の機能ドメインがアダプタータンパク質と会合する。好適なリンカーとしてはＧｌｙＳｅｒリンカーを挙げることができる。
核酸ターゲティングエフェクタータンパク質－ガイドＲＮＡ 複合体が全体として２つ以上の機能ドメインと会合し得ることもまた想定される。例えば、核酸ターゲティングエフェクタータンパク質と会合した２つ以上の機能ドメインがあってもよく、又はガイドＲＮＡと（１つ以上のアダプタータンパク質を介して）会合した２つ以上の機能ドメインがあってもよく、又は核酸ターゲティングエフェクタータンパク質と会合した１つ以上の機能ドメイン及びガイドＲＮＡと（１つ以上のアダプタータンパク質を介して）会合した１つ以上の機能ドメインがあってもよい。
アダプタータンパク質とアクチベーター又はリプレッサーとの間の融合は、リンカーを含み得る。例えば、ＧｌｙＳｅｒリンカーＧＧＧＳを使用することができる。これらを３個（（ＧＧＧＧＳ）３）又は６個、９個又は更には１２個又はそれ以上の反復で使用することにより、必要に応じて好適な長さを提供することができる。リンカーは、ガイドＲＮＡと機能ドメイン（アクチベーター又はリプレッサー）との間、又は核酸ターゲティングエフェクタータンパク質と機能ドメイン（アクチベーター又はリプレッサー）との間に使用することができる。リンカー、使用者は適切な量の「機械的柔軟性」を操作する。
本発明は、核酸ターゲティングエフェクタータンパク質とガイドＲＮＡとを含む核酸ターゲティング複合体を包含し、ここで核酸ターゲティングＣａｓタンパク質は少なくとも１つの突然変異［そのため核酸ターゲティングＣａｓタンパク質は、その少なくとも１つの突然変異を有しない核酸ターゲティングエフェクタータンパク質の５％以下の活性を有する］、及び任意選択で少なくとも１つ以上の核局在化配列を含み；ガイドＲＮＡは、細胞内の目的のＲＮＡにおける標的配列にハイブリダイズ可能なガイド配列を含み；及びここで：核酸ターゲティングＣａｓタンパク質は２つ以上の機能ドメインと会合し；又はガイドＲＮＡの少なくとも１つのループが、１つ以上のアダプタータンパク質に結合する１つ又は複数の個別的なＲＮＡ配列の挿入によって改変され、及びここでアダプタータンパク質は２つ以上の機能ドメインと会合し；又は核酸ターゲティングＣａｓタンパク質は１つ以上の機能ドメインと会合し、及びガイドＲＮＡの少なくとも１つのループが、１つ以上のアダプタータンパク質に結合する１つ又は複数の個別のＲＮＡ配列の挿入によって改変され、及びここでアダプタータンパク質は１つ以上の機能ドメインと会合する。
送達概要
Ｃ２ｃ２エフェクタータンパク質複合体は機能エフェクターを送達することができる
遺伝子をＤＮＡレベルで突然変異させることにより発現を永久的に消失させるＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ媒介性遺伝子ノックアウトと異なり、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓノックダウンは人工転写又は翻訳因子を用いて遺伝子発現を一時的に低下させることが可能である。Ｃ２ｃ２タンパク質の両方のＤＮＡ又はＲＮＡ切断ドメインにある鍵となる残基を突然変異させると、触媒的に不活性なＣ２ｃ２が生成される。触媒的に不活性なＣ２ｃ２はガイドＲＮＡと複合体を形成し、当該のガイドＲＮＡのターゲティングドメインによって特定されるＲＮＡ配列に局在化するが、しかしながら、これは標的ＤＮＡを切断しない。不活性Ｃ２ｃ２タンパク質をエフェクタードメイン、例えば転写抑制ドメインと融合させると、ガイドＲＮＡによって特定される任意のＲＮＡ部位へとそのエフェクターをリクルートすることが可能になる。特定の実施形態において、Ｃ２ｃ２を転写又は翻訳抑制ドメインに融合させて遺伝子のプロモーター領域にリクルートしてもよい。特に遺伝子抑制について、本明細書では、内因性転写因子の結合部位を遮断すれば、遺伝子発現を下方制御する助けとなり得ることが企図される。別の実施形態において、不活性Ｃ２ｃ２をクロマチン修飾タンパク質と融合させてもよい。クロマチン状態が変化すると、標的遺伝子の発現の低下が起こり得る。更なる実施形態において、Ｃ２ｃ２は翻訳抑制ドメインに融合されてもよい。
ある実施形態において、ガイドＲＮＡ分子は、既知の転写応答エレメント（例えば、プロモーター、エンハンサー等）、既知の上流活性化配列、及び／又は標的ＲＮＡの（タンパク質）発現を制御可能であると疑われる未知又は既知の機能の配列を標的とすることができる。
一部の方法において、標的ポリヌクレオチドを不活性化させることにより細胞に発現の改変を生じさせ得る。例えば、ＣＲＩＳＰＲ複合体が細胞内の標的配列に結合すると、標的ポリヌクレオチドが不活性化され、そのためその配列が転写されないか、コードされたタンパク質が産生されないか、又は配列が野生型配列のようには機能しなくなる。例えば、タンパク質又はマイクロＲＮＡコード配列を不活性化してタンパク質が産生されないようにし得る。一部の方法では、標的ポリヌクレオチドを不活性化させることにより細胞における発現の改変を生じさせ得る。例えば、ＣＲＩＳＰＲ複合体が細胞内のＲＮＡ標的配列に結合すると、標的ポリヌクレオチドが不活性化され、そのためその配列が翻訳されず、細胞内におけるタンパク質の発現レベルに影響が及ぶ。
詳細な実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、Ｒ５９７Ａ、Ｈ６０２Ａ、Ｒ１２７８Ａ及びＨ１２８３Ａからなる群から選択される１つ以上の突然変異を含み、及び／又は１つ以上の突然変異はＣＲＩＳＰＲ酵素のＨＥＰＮドメインにあるか、又は他に本明細書で考察するとおりの突然変異である。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素は触媒ドメインに１つ以上の突然変異を有し、ここで転写されると、ダイレクトリピート配列が単一のステムループを形成し、及びガイド配列が標的配列へのＣＲＩＳＰＲ複合体の配列特異的結合を導き、及びここで酵素は機能ドメインを更に含む。一部の実施形態において、機能ドメインは。一部の実施形態において、機能ドメインは転写抑制ドメイン、好ましくはＫＲＡＢである。一部の実施形態において、転写抑制ドメインはＳＩＤ、又はＳＩＤのコンカテマー（例えばＳＩＤ４Ｘ）である。一部の実施形態において、機能ドメインは後成的に改変されるドメインであり、後成的に改変される酵素が提供される。一部の実施形態において、機能ドメインは活性化ドメインであり、これはＰ６５活性化ドメインであってもよい。
Ｃ２ｃ２エフェクタータンパク質複合体又はその構成成分の送達
本開示及び当該技術分野における知識から、ＴＡＬＥ、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系、又はその構成成分又はその核酸分子又はその構成成分をコードし又は提供する核酸分子は、本明細書に概略的にも詳細にも記載される送達系によって送達し得る。
ベクター送達、例えば、プラスミド、ウイルス送達：ＣＲＩＳＰＲ酵素、例えばＣ２ｃ２などのＶ型タンパク質、及び／又は任意の本ＲＮＡ、例えば、ガイドＲＮＡは、任意の適切なベクター、例えば、プラスミド又はウイルスベクター、例えば、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レンチウイルス、アデノウイルス、又は他の種類のウイルスベクター、又はこれらの組み合わせを用いて送達することができる。エフェクタータンパク質及び１つ以上のガイドＲＮＡを１つ以上のベクター、例えばプラスミド又はウイルスベクターにパッケージングすることができる。一部の実施形態において、ベクター、例えばプラスミド又はウイルスベクターは、例えば筋肉注射によって目的の組織に送達されるが、一方で送達は、静脈内、経皮、鼻腔内、口腔、粘膜、又は他の送達方法によることもある。かかる送達は単回投与によっても、又は複数回投与によってもよい。当業者は、本明細書で送達される実際の投薬量が、ベクターの選択、標的細胞、生物、又は組織、治療する対象の全身状態、求められる形質転換／改変の程度、投与経路、投与様式、求められる形質転換／改変の種類など、種々の要因に応じて大きく異なり得ることを理解する。
かかる用量は、例えば、担体（水、生理食塩水、エタノール、グリセロール、ラクトース、スクロース、リン酸カルシウム、ゼラチン、デキストラン、寒天、ペクチン、ピーナッツ油、ゴマ油など）、希釈剤、薬学的に許容可能な担体（例えば、リン酸緩衝生理食塩水）、薬学的に許容可能な賦形剤、及び／又は当該技術分野で公知の他の化合物を更に含み得る。投薬量は、１つ以上の薬学的に許容可能な塩、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩などの鉱酸塩；及び酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、安息香酸塩などの有機酸塩を更に含み得る。加えて、湿潤剤又は乳化剤、ｐＨ緩衝物質、ゲル又はゲル化物質、香料、着色剤、ミクロスフェア、ポリマー、懸濁剤などの補助物質もまたこの中に存在し得る。加えて、１つ以上の他の従来の医薬成分、例えば、防腐剤、湿潤剤、懸濁剤、界面活性剤、酸化防止剤、固化防止剤、充填剤、キレート化剤、コーティング剤、化学安定剤などもまた、特に投薬形態が再構成可能な形態である場合に存在し得る。好適な例示的成分として、微結晶性セルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリソルベート８０、フェニルエチルアルコール、クロロブタノール、ソルビン酸カリウム、ソルビン酸、二酸化硫黄、没食子酸プロピル、パラベン類、エチルバニリン、グリセリン、フェノール、パラクロロフェノール、ゼラチン、アルブミン、及びこれらの組み合わせが挙げられる。薬学的に許容可能な賦形剤の徹底的な考察は、ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥＳ（Ｍａｃｋ Ｐｕｂ．Ｃｏ．，Ｎ．Ｊ．１９９１）（参照により本明細書に援用される）において利用可能である。
本明細書のある実施形態において、送達はアデノウイルスを介し、これは、少なくとも１×１０５粒子（粒子単位、ｐｕとも称される）のアデノウイルスベクターを含有する単回ブースター用量であり得る。本明細書のある実施形態において、用量は好ましくは、少なくとも約１×１０６粒子（例えば、約１×１０６～１×１０１２粒子）、より好ましくは少なくとも約１×１０７粒子、より好ましくは少なくとも約１×１０８粒子（例えば、約１×１０８～１×１０１１粒子又は約１×１０８～１×１０１２粒子）、及び最も好ましくは少なくとも約１×１００粒子（例えば、約１×１０９～１×１０１０粒子又は約１×１０９～１×１０１２粒子）、又は更には少なくとも約１×１０１０粒子（例えば、約１×１０１０～１×１０１２粒子）のアデノウイルスベクターである。或いは、用量は、約１×１０１４粒子以下、好ましくは約１×１０１３粒子以下、更により好ましくは約１×１０１２粒子以下、更により好ましくは約１×１０１１粒子以下、及び最も好ましくは約１×１０１０粒子以下（例えば、約１×１０９粒子（ａｒｔｉｃｌｅｓ）以下）を含む。従って、用量は、例えば、約１×１０６粒子単位（ｐｕ）、約２×１０６ｐｕ、約４×１０６ｐｕ、約１×１０７ｐｕ、約２×１０７ｐｕ、約４×１０７ｐｕ、約１×１０８ｐｕ、約２×１０８ｐｕ、約４×１０８ｐｕ、約１×１０９ｐｕ、約２×１０９ｐｕ、約４×１０９ｐｕ、約１×１０１０ｐｕ、約２×１０１０ｐｕ、約４×１０１０ｐｕ、約１×１０１１ｐｕ、約２×１０１１ｐｕ、約４×１０１１ｐｕ、約１×１０１２ｐｕ、約２×１０１２ｐｕ、又は約４×１０１２ｐｕのアデノウイルスベクターを含む単回用量のアデノウイルスベクターを含有し得る。例えば、２０１３年６月４日に付与されたＮａｂｅｌ，ｅｔ．ａｌ．に対する米国特許第８，４５４，９７２ Ｂ２号明細書（参照によって本明細書に援用される）のアデノウイルスベクター、及びその第２９欄第３６～５８行にある投薬量を参照のこと。本明細書のある実施形態において、アデノウイルスは複数回用量で送達される。
本明細書のある実施形態において、送達はＡＡＶを介する。ヒトに対するＡＡＶのインビボ送達についての治療上有効な投薬量は、約１×１０１０～約１×１０１０の機能性ＡＡＶ／ｍｌ溶液を含有する約２０～約５０ｍｌの生理食塩水の範囲であると考えられる。投薬量は、治療利益と任意の副作用との均衡がとれるように調整され得る。本明細書のある実施形態において、ＡＡＶ用量は、概して、約１×１０５～１×１０５０ゲノムＡＡＶ、約１×１０８～１×１０２０ゲノムＡＡＶ、約１×１０１０～約１×１０１６ゲノム、又は約１×１０１１～約１×１０１６ゲノムＡＡＶの濃度範囲である。ヒト投薬量は約１×１０１３ゲノムＡＡＶであってもよい。かかる濃度は、約０．００１ｍｌ～約１００ｍｌ、約０．０５～約５０ｍｌ、又は約１０～約２５ｍｌの担体溶液で送達され得る。他の効果的な投薬量が、当業者により、用量反応曲線を作成するルーチンの試験を用いて容易に確立され得る。例えば、２０１３年３月２６日に付与されたＨａｊｊａｒ，ｅｔ ａｌ．に対する米国特許第８，４０４，６５８ Ｂ２号明細書、第２７欄、第４５～６０行を参照のこと。
本明細書のある実施形態において、送達はプラスミドを介する。かかるプラスミド組成物では、投薬量は、反応を誘発するのに十分な量のプラスミドでなければならない。例えば、プラスミド組成物中のプラスミドＤＮＡの好適な分量は、個体７０ｋｇ当たり約０．１～約２ｍｇ、又は約１μｇ～約１０μｇであり得る。本発明のプラスミドは、概して、（ｉ）プロモーター；（ｉｉ）前記プロモーターに作動可能に連結された、核酸ターゲティングＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする配列；（ｉｉｉ）選択可能マーカー；（ｉｖ）複製起点；及び（ｖ）（ｉｉ）の下流で（ｉｉ）に作動可能に連結された転写ターミネーターを含み得る。プラスミドはＣＲＩＳＰＲ複合体のＲＮＡ構成成分もコードし得るが、これらのうちの１つ以上は、代わりに異なるベクター上にコードされてもよい。
本明細書の用量は平均７０ｋｇの個体に基づく。投与頻度は医学又は獣医学の実務者（例えば、医師、獣医師）、又は当該技術分野の科学者の裁量の範囲内にある。また、実験に使用されるマウスは典型的には約２０ｇであり、マウス実験から７０ｋｇの個体にスケールアップし得ることも注記される。
一部の実施形態では本発明のＲＮＡ分子はリポソーム製剤又はリポフェクチン製剤などで送達され、当業者に周知の方法により調製することができる。かかる方法は、例えば、米国特許第５，５９３，９７２号明細書、同第５，５８９，４６６号明細書及び同第５，５８０，８５９号明細書（これらは参照により本明細書に援用される）に記載されている。特に哺乳類細胞へのｓｉＲＮＡ送達の増強及び改良を目的とした送達系が開発されており（例えば、Ｓｈｅｎ ｅｔ ａｌ ＦＥＢＳ Ｌｅｔ．２００３，５３９：１１１－１１４；Ｘｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２００２，２０：１００６－１０１０；Ｒｅｉｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｖｉｓｉｏｎ．２００３，９：２１０－２１６；Ｓｏｒｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２００３，３２７：７６１－７６６；Ｌｅｗｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｇｅｎ．２００２，３２：１０７－１０８及びＳｉｍｅｏｎｉ ｅｔ ａｌ．，ＮＡＲ ２００３，３１，１１：２７１７－２７２４を参照）、本発明に適用し得る。ｓｉＲＮＡは近年、霊長類における遺伝子発現の抑制への使用が成功しており（例えば、Ｔｏｌｅｎｔｉｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｔｉｎａ ２４（４）：６６０を参照）、これは本発明にも適用し得る。
実際、ＲＮＡ送達はインビボ送達の有用な方法である。リポソーム又は粒子を用いて核酸ターゲティングＣａｓタンパク質Ｃａｓ９及びガイドＲＮＡｇＲＮＡ（及び、例えばＨＲ修復鋳型）を細胞内に送達することが可能である。従って、ＣａｓＣａｓ９などの核酸ターゲティングＣａｓタンパク質／ＣＲＩＳＰＲ酵素の送達、及び／又は本発明のガイドＲＮＡの送達は、ＲＮＡ形態で、微小胞、リポソーム又は粒子を介することができる。例えば、Ｃａｓ ｍＲＮＡ及びガイドＲＮＡをインビボ送達用にリポソーム粒子にパッケージングすることができる。リポソームトランスフェクション試薬、例えば、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのリポフェクタミン及び市販の他の試薬は、ＲＮＡ分子を肝臓に効果的に送達することができる。
同様に好ましいＲＮＡの送達手段としてはまた、ＲＮＡのナノ粒子による送達（Ｃｈｏ，Ｓ．，Ｇｏｌｄｂｅｒｇ，Ｍ．，Ｓｏｎ，Ｓ．，Ｘｕ，Ｑ．，Ｙａｎｇ，Ｆ．，Ｍｅｉ，Ｙ．，Ｂｏｇａｔｙｒｅｖ，Ｓ．，Ｌａｎｇｅｒ，Ｒ．ａｎｄ Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｄ．，「内皮細胞への低分子干渉ＲＮＡ送達用の脂質様ナノ粒子（Ｌｉｐｉｄ－ｌｉｋｅ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｆｏｒ ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｔｏ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ）」，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ，１９：３１１２－３１１８，２０１０）又はエキソソームによる送達（Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ，Ａ．，Ｌｅｖｉｎｓ，Ｃ．，Ｃｏｒｔｅｚ，Ｃ．，Ｌａｎｇｅｒ，Ｒ．，ａｎｄ Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｄ．，「ｓｉＲＮＡ送達用の脂質ベースのナノ療法（Ｌｉｐｉｄ－ｂａｓｅｄ ｎａｎｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ｆｏｒ ｓｉＲＮＡ ｄｅｌｉｖｅｒｙ）」，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２６７：９－２１，２０１０，ＰＭＩＤ：２００５９６４１）も挙げられる。実際、エキソソームは、ＲＮＡターゲティング系とある程度の類似性を有する系であるｓｉＲＮＡの送達に特に有用であることが示されている。例えば、Ｅｌ－Ａｎｄａｌｏｕｓｓｉ Ｓ，ｅｔ ａｌ．（「インビトロ及びインビボでのｓｉＲＮＡのエキソソーム媒介送達（Ｅｘｏｓｏｍｅ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｓｉＲＮＡ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ）」Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ．２０１２ Ｄｅｃ；７（１２）：２１１２－２６．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｐｒｏｔ．２０１２．１３１．Ｅｐｕｂ ２０１２ Ｎｏｖ １５）は、エキソソームがいかに種々の生物学的障壁を越えた薬物送達に有望なツールであるか、及びｓｉＲＮＡのインビトロ及びインビボ送達に利用できるかを記載している。彼らの手法は、発現ベクターのトランスフェクションにより、ペプチドリガンドに融合したエキソソームタンパク質を含む標的エキソソームを作成するものである。次にトランスフェクト細胞上清からエキソソームが精製され、特徴付けられた後、ＲＮＡがエキソソームにロードされる。本発明に係る送達又は投与はエキソソームを用いて、詳細には、限定はされないが脳に対して行うことができる。ビタミンＥ（α－トコフェロール）を核酸ターゲティングＣａｓタンパク質にコンジュゲートさせて、例えばＵｎｏ ｅｔ ａｌ．（ＨＵＭＡＮ ＧＥＮＥ ＴＨＥＲＡＰＹ ２２：７１１－７１９（Ｊｕｎｅ ２０１１））によって行われた脳への低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）の送達と同じように、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）と共に脳に送達することができる。リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）又はフリーＴｏｃｓｉＢＡＣＥ又はＴｏｃ－ｓｉＢＡＣＥ／ＨＤＬが充填され且つＢｒａｉｎ Ｉｎｆｕｓｉｏｎ Ｋｉｔ ３（Ａｌｚｅｔ）に接続された浸透圧ミニポンプ（モデル１００７Ｄ；Ａｌｚｅｔ，Ｃｕｐｅｒｔｉｎｏ，ＣＡ）でマウスが注入された。背側第三脳室内への注入のため、正中線上でブレグマから約０．５ｍｍ後方に脳注入カニューレが留置された。Ｕｎｏ ｅｔ ａｌ．は、ＨＤＬを含む僅か３ｎｍｏｌのＴｏｃ－ｓｉＲＮＡが、同じＩＣＶ注入法による同程度の標的の減少を誘導可能であったことを見出した。脳を標的としてＨＤＬと共投与される、α－トコフェロールにコンジュゲートされた同様の投薬量の核酸ターゲティングエフェクタータンパク質を本発明においてヒトで企図することができ、例えば、脳を標的とする約３ｎｍｏｌ～約３μｍｏｌの核酸ターゲティングエフェクタータンパク質を企図し得る。Ｚｏｕ ｅｔ ａｌ．（（ＨＵＭＡＮ ＧＥＮＥ ＴＨＥＲＡＰＹ ２２：４６５－４７５（Ａｐｒｉｌ ２０１１））は、ラットの脊髄におけるインビボでの遺伝子サイレンシングのためのＰＫＣγを標的とする短鎖ヘアピンＲＮＡのレンチウイルス媒介送達方法を記載している。Ｚｏｕ ｅｔ ａｌ．は、１×１０９形質導入単位（ＴＵ）／ｍｌの力価を有する約１０μｌの組換えレンチウイルスをくも膜下カテーテルによって投与した。脳を標的とするレンチウイルスベクターにおいて発現する同様の投薬量の核酸ターゲティングエフェクタータンパク質を本発明においてヒトに企図することができ、例えば、１×１０９形質導入単位（ＴＵ）／ｍｌの力価を有するレンチウイルスにおける脳を標的とする約１０～５０ｍｌの核酸ターゲティングエフェクタータンパク質を企図し得る。
脳への局所送達に関して、これは様々な方法で達成することができる。例えば、物質を線条体内に例えば注入によって送達することができる。注入は、開頭により定位的に行うことができる。
パッケージング及びプロモーター概要
インビボでゲノム改変を媒介するため核酸ターゲティングエフェクターコード核酸分子、例えばＤＮＡをベクター、例えばウイルスベクターにパッケージングする方法は、以下を含む：
ＮＨＥＪ媒介遺伝子ノックアウトを達成するため：
シングルウイルスベクター：
２つ以上の発現カセットを含むベクター：
プロモーター－核酸ターゲティングエフェクタータンパク質コード核酸分子－ターミネーター
プロモーター－ガイドＲＮＡ１－ターミネーター
プロモーター－ガイドＲＮＡ（Ｎ）－ターミネーター（ベクターサイズの限界まで）
ダブルウイルスベクター：
核酸ターゲティングエフェクタータンパク質の発現をドライブするための１つの発現カセットを含むベクター１
プロモーター－核酸ターゲティングエフェクタータンパク質コード核酸分子－ターミネーター
１つ以上のガイドＲＮＡの発現をドライブするためのもう１つの発現カセットを含むベクター２
プロモーター－ガイドＲＮＡ１－ターミネーター
プロモーター－ガイドＲＮＡ１（Ｎ）－ターミネーター（ベクターサイズの限界まで）
相同依存性修復を媒介するため
上記に記載されるシングル及びダブルウイルスベクター手法に加えて、相同依存性修復鋳型を送達するため追加のベクターが使用される。
核酸ターゲティングエフェクタータンパク質コード核酸分子発現のドライブに用いられるプロモーターには、以下が含まれ得る：
ＡＡＶ ＩＴＲはプロモーターとして役立ち得る：これは、追加のプロモーターエレメント（ベクター内で場所をとり得る）の必要性がなくなるため有利である。空いた追加のスペースを用いて、追加のエレメント（ｇＲＮＡなど）の発現をドライブすることができる。また、ＩＴＲ活性は比較的弱いため、核酸ターゲティングエフェクタータンパク質の過剰発現による潜在的な毒性を低減するために用いることができる。
－偏在発現には、ＣＭＶ、ＣＡＧ、ＣＢｈ、ＰＧＫ、ＳＶ４０、フェリチン重鎖又は軽鎖等のプロモーターを使用し得る。
脳又は他のＣＮＳでの発現には、プロモーター：全てのニューロン用のシナプシンＩ、興奮性ニューロン用のＣａＭＫＩＩα、ＧＡＢＡ作動性ニューロン用のＧＡＤ６７又はＧＡＤ６５又はＶＧＡＴ等を使用することができる。
肝臓での発現には、アルブミンプロモーターを使用することができる。
肺での発現には、ＳＰ－Ｂを使用することができる。
内皮細胞には、ＩＣＡＭを使用することができる。
造血細胞には、ＩＦＮβ又はＣＤ４５を使用することができる。
骨芽細胞には、ＯＧ－２を使用することができる。
ガイドＲＮＡのドライブに用いられるプロモーターには、以下が含まれ得る：
－Ｕ６又はＨ１などのＰｏｌ ＩＩＩプロモーター
－ガイドＲＮＡを発現させるためのＰｏｌ ＩＩプロモーター及びイントロンカセットの使用。
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）
核酸ターゲティングエフェクタータンパク質及び１つ以上のガイドＲＮＡは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レンチウイルス、アデノウイルス又は他のプラスミド又はウイルスベクタータイプを使用して、詳細には、例えば、米国特許第８，４５４，９７２号明細書（アデノウイルス用の製剤、用量）、同第８，４０４，６５８号明細書（ＡＡＶ用の製剤、用量）及び同第５，８４６，９４６号明細書（ＤＮＡプラスミド用の製剤、用量）並びにレンチウイルス、ＡＡＶ及びアデノウイルスが関わる臨床試験及びそのような臨床試験に関する刊行物からの製剤及び用量を用いて送達することができる。例えば、ＡＡＶについて、投与経路、製剤及び用量は、米国特許第８，４５４，９７２号明細書及びＡＡＶが関わる臨床試験にあるとおりであってもよい。アデノウイルスについては、投与経路、製剤及び用量は、米国特許第８，４０４，６５８号明細書及びアデノウイルスが関わる臨床試験にあるとおりであってもよい。プラスミド送達については、投与経路、製剤及び用量は、米国特許第５，８４６，９４６号明細書及びプラスミドが関わる臨床試験にあるとおりであってもよい。用量は、平均７０ｋｇの個体（例えば男性成人ヒト）に基づくか、又はそれに当てはめてもよく、異なる体重及び種の患者、対象、哺乳動物用に調整することができる。投与頻度は、患者又は対象の年齢、性別、全般的な健康、他の条件並びに対処される特定の状態又は症状を含めた通常の要因に応じて、医学又は獣医学実務者（例えば、医師、獣医師）の範囲内である。ウイルスベクターは、目的の組織に注射することができる。細胞型特異的ゲノム／トランスクリプトーム改変について、核酸ターゲティングエフェクタータンパク質の発現は細胞型特異的プロモーターによってドライブすることができる。例えば、肝臓特異的発現にはアルブミンプロモーターが用いられてもよく、及びニューロン特異的発現には（例えばＣＮＳ障害を標的化するため）シナプシンＩプロモーターが用いられてもよい。
インビボ送達に関しては、他のウイルスベクターと比べて幾つかの理由でＡＡＶが有利である：
低毒性（これは、免疫応答を活性化させ得る細胞粒子の超遠心が不要な精製方法に起因し得る）及び
宿主ゲノムに組み込まれないため、挿入突然変異誘発を引き起こす確率の低さ。
ＡＡＶのパッケージング限界は４．５又は４．７５Ｋｂである。これは、核酸ターゲティングエフェクタータンパク質（Ｃ２ｃ２などのＶ型タンパク質など）並びにプロモーター及び転写ターミネーターを全て同じウイルスベクターに収める必要があることを意味する。従って本発明の実施形態は、より短い核酸ターゲティングエフェクタータンパク質のホモログを利用することを含む。
ＡＡＶに関して、ＡＡＶは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５又はこれらの任意の組み合わせであり得る。標的化しようとする細胞に関連するＡＡＶのＡＡＶを選択することができる；例えば、脳又は神経細胞の標的化にはＡＡＶ血清型１、２、５又はハイブリッドカプシドＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５又はこれらの任意の組み合わせを選択することができ；及び心臓組織の標的化にはＡＡＶ４を選択することができる。ＡＡＶ８は肝臓への送達に有用である。本明細書におけるプロモーター及びベクターが個々に好ましい。これらの細胞に関する特定のＡＡＶ血清型の一覧は以下のとおりである（Ｇｒｉｍｍ，Ｄ．ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８２：５８８７－５９１１（２００８）を参照）。
Figure 2023134453000002
レンチウイルス
レンチウイルスは、有糸分裂細胞及び分裂終了細胞の両方でその遺伝子の感染能及び発現能を有する複合的レトロウイルスである。最も一般的には、公知のレンチウイルスはヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）であり、これは他のウイルスのエンベロープ糖タンパク質を用いて広範囲の細胞型を標的化する。
レンチウイルスは以下のとおり調製し得る。ｐＣａｓＥＳ１０（これはレンチウイルストランスファープラスミド骨格を含有する）のクローニング後、低継代（ｐ＝５）のＨＥＫ２９３ＦＴをＴ－７５フラスコに５０％コンフルエンスとなるように播種し、その翌日、１０％ウシ胎仔血清含有及び抗生物質不含のＤＭＥＭ中でトランスフェクトした。２０時間後、培地をＯｐｔｉＭＥＭ（無血清）培地に交換し、４時間後にトランスフェクションを行った。細胞に１０μｇのレンチウイルストランスファープラスミド（ｐＣａｓＥＳ１０）及び以下のパッケージングプラスミド：５μｇのｐＭＤ２．Ｇ（ＶＳＶ－ｇシュードタイプ）、及び７．５ｕｇのｐｓＰＡＸ２（ｇａｇ／ｐｏｌ／ｒｅｖ／ｔａｔ）をトランスフェクトした。トランスフェクションは、カチオン性脂質デリバリー剤（５０ｕＬ Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００及び１００ｕｌ Ｐｌｕｓ試薬）を含む４ｍＬ ＯｐｔｉＭＥＭ中で行った。６時間後、培地を１０％ウシ胎仔血清を含む抗生物質不含ＤＭＥＭに交換した。これらの方法では細胞培養中に血清を使用するが、無血清方法が好ましい。
レンチウイルスは以下のとおり精製し得る。４８時間後にウイルス上清を回収した。初めに上清から残屑を除去し、０．４５ｕｍ低タンパク質結合（ＰＶＤＦ）フィルタでろ過した。次にそれを超遠心機において２４，０００ｒｐｍで２時間スピンした。ウイルスペレットを５０ｕｌのＤＭＥＭ中に４℃で一晩再懸濁した。次にそれをアリコートに分け、直ちに－８０℃で凍結した。
別の実施形態において、ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）をベースとする最小限の非霊長類レンチウイルスベクターもまた、特に眼遺伝子療法に企図される（例えば、Ｂａｌａｇａａｎ，Ｊ Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ ２００６；８：２７５－２８５を参照）。別の実施形態において、滲出型（ｗｅｂ ｆｏｒｍ）の加齢黄斑変性症の治療のため網膜下注射によって送達される血管新生抑制タンパク質エンドスタチン及びアンジオスタチンを発現するウマ伝染性貧血ウイルスベースのレンチウイルス遺伝子療法ベクターであるＲｅｔｉｎｏＳｔａｔ（登録商標）もまた企図され（例えば、Ｂｉｎｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，ＨＵＭＡＮ ＧＥＮＥ ＴＨＥＲＡＰＹ ２３：９８０－９９１（Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ ２０１２）を参照のこと）、このベクターは本発明の核酸ターゲティング系向けに改変し得る。
別の実施形態において、ＨＩＶ ｔａｔ／ｒｅｖによって共有される共通のエクソンを標的化するｓｉＲＮＡと、核小体局在ＴＡＲデコイと、抗ＣＣＲ５特異的ハンマーヘッド型リボザイムとを含む自己不活性化レンチウイルスベクター（例えば、ＤｉＧｉｕｓｔｏ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ ２：３６ｒａ４３を参照のこと）を本発明の核酸ターゲティング系に使用し及び／又は適合させてもよい。患者の体重１キログラム当たり最低２．５×１０６個のＣＤ３４＋ 細胞を収集し、２μｍｏｌ／Ｌ－グルタミン、幹細胞因子（１００ｎｇ／ｍｌ）、Ｆｌｔ－３リガンド（Ｆｌｔ－３Ｌ）（１００ｎｇ／ｍｌ）、及びトロンボポエチン（１０ｎｇ／ｍｌ）（ＣｅｌｌＧｅｎｉｘ）を含有するＸ－ＶＩＶＯ １５培地（Ｌｏｎｚａ）中２×１０６細胞／ｍｌの密度でで１６～２０時間予備刺激し得る。フィブロネクチン（２５ｍｇ／ｃｍ２）（ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ、Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ Ｉｎｃ．）で被覆した７５ｃｍ２組織培養フラスコにおいて、予備刺激した細胞をレンチウイルスによって感染多重度５で１６～２４時間にわたって形質導入し得る。
レンチウイルスベクターについては、パーキンソン病の治療にあるとおり開示されており、例えば、米国特許出願公開第２０１２０２９５９６０号明細書及び米国特許第７３０３９１０号明細書及び同第７３５１５８５号明細書を参照のこと。レンチウイルスベクターはまた、眼疾患の治療についても開示されており、例えば、米国特許出願公開第２００６０２８１１８０号明細書、２００９０００７２８４号明細書、米国特許出願公開第２０１１０１１７１８９号明細書；米国特許出願公開第２００９００１７５４３号明細書；米国特許出願公開第２００７００５４９６１号明細書、米国特許出願公開第２０１００３１７１０９号明細書を参照のこと。レンチウイルスベクターはまた、脳への送達についても開示されており、例えば、米国特許出願公開第２０１１０２９３５７１号明細書；米国特許出願公開第２０１１０２９３５７１号明細書、米国特許出願公開第２００４００１３６４８号明細書、米国特許出願公開第２００７００２５９７０号明細書、米国特許出願公開第２００９０１１１１０６号明細書及び米国特許第７２５９０１５号明細書を参照のこと。
ＲＮＡ送達
ＲＮＡ送達：核酸ターゲティングＣａｓタンパク質、例えばＣ２ｃ２などのＶ型タンパク質、及び／又はガイドＲＮＡはまた、ＲＮＡの形態で送達することもできる。核酸ターゲティングＣａｓタンパク質（Ｃ２ｃ２などのＶＩ型タンパク質などの）ｍＲＮＡはインビトロ転写を用いて作成することができる。例えば、核酸ターゲティングエフェクタータンパク質（Ｃ２ｃ２などのＶ型タンパク質などの）ｍＲＮＡは、以下のエレメントを含むＰＣＲカセットを用いて合成することができる：βグロビン－ポリＡテール（１２０以上の一連のアデニン）由来のＴ７＿プロモーター－コザック配列（ＧＣＣＡＣＣ）－エフェクタータンパク質－３’ＵＴＲを含有するＰＣＲカセットを用いて合成することができる。このカセットは、Ｔ７ポリメラーゼによる転写に使用することができる。ガイドＲＮＡはまた、Ｔ７＿プロモーター－ＧＧ－ガイドＲＮＡ配列を含有するカセットからのインビトロ転写を用いて転写することもできる。
発現を増強し、及び可能性のある毒性を低下させるため、核酸ターゲティングエフェクタータンパク質コード配列及び／又はガイドＲＮＡを、例えば擬似Ｕ又は５－メチル－Ｃを使用して１つ以上の改変ヌクレオシドを含むように改変することができる。
ｍＲＮＡ送達方法は、現在、肝臓送達に特に有望である。
ＲＮＡ送達に関する多くの臨床研究はＲＮＡｉ又はアンチセンスに焦点が置かれているが、これらの系は、本発明を実施するためのＲＮＡの送達に適合させることができる。以下のＲＮＡｉ等の参考文献は、それに従い読まれるべきである。
粒子送達系及び／又は製剤：
幾つかのタイプの粒子送達系及び／又は製剤が、多様な生物医学的適用において有用であることが知られている。一般に、粒子は、その輸送及び特性の点で一単位として挙動する小さい物体として定義される。粒子は、更に直径に基づき分類される。粗粒子は２，５００～１０，０００ナノメートルの範囲を包含する。微粒子は１００～２，５００ナノメートルのサイズを有する。超微粒子、又はナノ粒子は、概して１～１００ナノメートルのサイズである。１００ｎｍ限度の基準は、粒子をバルク材料と区別する新規特性が典型的には１００ｎｍ未満の臨界長さスケールで生じるという事実である。
本明細書で使用されるとき、粒子送達系／製剤は、本発明における粒子を含む任意の生物学的送達系／製剤として定義される。本発明における粒子は、１００ミクロン（μｍ）未満の最大径（例えば直径）を有する任意の実体である。一部の実施形態において、本発明の粒子は１０μｍ未満の最大径を有する。一部の実施形態において、本発明の粒子は２０００ナノメートル（ｎｍ）未満の最大径を有する。一部の実施形態において、本発明の粒子は１０００ナノメートル（ｎｍ）未満の最大径を有する。一部の実施形態において、本発明の粒子は９００ｎｍ、８００ｎｍ、７００ｎｍ、６００ｎｍ、５００ｎｍ、４００ｎｍ、３００ｎｍ、２００ｎｍ、又は１００ｎｍ未満の最大径を有する。典型的には、本発明の粒子は５００ｎｍ以下の最大径（例えば直径）を有する。一部の実施形態において、本発明の粒子は２５０ｎｍ以下の最大径（例えば直径）を有する。一部の実施形態において、本発明の粒子は２００ｎｍ以下の最大径（例えば直径）を有する。一部の実施形態において、本発明の粒子は１５０ｎｍ以下の最大径（例えば直径）を有する。一部の実施形態において、本発明の粒子は１００ｎｍ以下の最大径（例えば直径）を有する。より小さい粒子、例えば５０ｎｍ以下の最大径を有する粒子が、本発明の一部の実施形態で使用される。一部の実施形態において、本発明の粒子は２５ｎｍ～２００ｎｍの範囲の最大径を有する。
粒子の特徴付け（例えば、形態、寸法等を特徴付けることを含む）は種々の異なる技法を用いて行われる。一般的な技法は、電子顕微鏡法（ＴＥＭ、ＳＥＭ）、原子間力顕微鏡法（ＡＦＭ）、動的光散乱（ＤＬＳ）、Ｘ線光電子分光法（ＸＰＳ）、粉末Ｘ線回折（ＸＲＤ）、フーリエ変換赤外分光法（ＦＴＩＲ）、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析法（ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ）、紫外・可視分光法、二重偏光干渉法及び核磁気共鳴（ＮＭＲ）である。特徴付け（寸法計測）は、天然粒子（即ち負荷前）に関して行われても、又はカーゴの負荷後に行われてもよく（本明細書においてカーゴとは、例えば、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系の１つ以上の構成成分、例えばＣＲＩＳＰＲ酵素又はｍＲＮＡ又はガイドＲＮＡ、又はこれらの任意の組み合わせを指し、及び更なる担体及び／又は賦形剤を含み得る）、それにより本発明の任意のインビトロ、エキソビボ及び／又はインビボ適用のための送達に最適なサイズの粒子が提供される。特定の好ましい実施形態において、粒子寸法（例えば直径）の特徴付けは、動的レーザー散乱法（ＤＬＳ）を用いた計測に基づく。粒子、その作製及び使用方法並びにその計測に関して、米国特許第８，７０９，８４３号明細書；米国特許第６，００７，８４５号明細書；米国特許第５，８５５，９１３号明細書；米国特許第５，９８５，３０９号明細書；米国特許第５，５４３，１５８号明細書；及びＪａｍｅｓ Ｅ．Ｄａｈｌｍａｎ ａｎｄ Ｃａｒｍｅｎ Ｂａｒｎｅｓ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２０１４）ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎｌｉｎｅ １１ Ｍａｙ ２０１４，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｎａｎｏ．２０１４．８４による発表が挙げられる。
本発明の範囲内の粒子送達系は、限定はされないが、固体、半固体、エマルション、又はコロイド粒子を含め、任意の形態で提供され得る。従って、限定はされないが、例えば、脂質ベースのシステム、リポソーム、ミセル、微小胞、エキソソーム、又は遺伝子銃を含め、本明細書に記載される送達系の任意のものが、本発明の範囲内の粒子送達系として提供され得る。
粒子
ＣＲＩＳＰＲ酵素ｍＲＮＡ及びガイドＲＮＡは、粒子又は脂質エンベロープを使用して同時に送達し得る；例えば、本発明のＣＲＩＳＰＲ酵素及びＲＮＡ（例えば複合体としての）は、７Ｃ１など、Ｄａｈｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．，国際公開第２０１５０８９４１９ Ａ２号パンフレット及びその引用文献にあるとおりの粒子によって送達することができ（例えば、Ｊａｍｅｓ Ｅ．Ｄａｈｌｍａｎ ａｎｄ Ｃａｒｍｅｎ Ｂａｒｎｅｓ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２０１４）ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎｌｉｎｅ １１ Ｍａｙ ２０１４，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｎａｎｏ．２０１４．８４を参照）、例えば、送達粒子は脂質又はリピドイド及び親水性ポリマー、例えばカチオン性脂質及び親水性ポリマーを含み、例えばカチオン性脂質には、１，２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウム－プロパン（ＤＯＴＡＰ）又は１，２－ジテトラデカノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＭＰＣ）が含まれ、及び／又は親水性ポリマーには、エチレングリコール又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が含まれ；及び／又は粒子は、コレステロール（例えば、製剤１＝ＤＯＴＡＰ １００、ＤＭＰＣ ０、ＰＥＧ ０、コレステロール ０；製剤番号２＝ＤＯＴＡＰ ９０、ＤＭＰＣ ０、ＰＥＧ １０、コレステロール ０；製剤番号３＝ＤＯＴＡＰ ９０、ＤＭＰＣ ０、ＰＥＧ ５、コレステロール ５からの粒子）を更に含み、粒子は効率的な多段階プロセスを用いて形成され、ここでは初めに、エフェクタータンパク質及びＲＮＡを、例えば１：１モル比で、例えば室温で、例えば３０分間、例えば無菌ヌクレアーゼフリー１×ＰＢＳ中において共に混合し；及びそれとは別に、製剤に適用し得るとおりＤＯＴＡＰ、ＤＭＰＣ、ＰＥＧ、及びコレステロールをアルコール、例えば１００％エタノール中に溶解し；及び、これらの２つの溶液を共に混合して、複合体を含有する粒子を形成する）。
核酸ターゲティングエフェクタータンパク質（Ｃ２ｃ２などのＶＩ型タンパク質など）ｍＲＮＡ及びガイドＲＮＡは、粒子又は脂質エンベロープを使用して同時に送達し得る。
例えば、Ｓｕ Ｘ，Ｆｒｉｃｋｅ Ｊ，Ｋａｖａｎａｇｈ ＤＧ，Ｉｒｖｉｎｅ ＤＪ （「脂質被包ｐＨ応答性ポリマーナノ粒子を使用したインビトロ及びインビボｍＲＮＡ送達（Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ ｍＲＮＡ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｕｓｉｎｇ ｌｉｐｉｄ－ｅｎｖｅｌｏｐｅｄ ｐＨ－ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ｐｏｌｙｍｅｒ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ）」Ｍｏｌ Ｐｈａｒｍ．２０１１ Ｊｕｎ ６；８（３）：７７４－８７．ｄｏｉ：１０．１０２１／ｍｐ１００３９０ｗ．Ｅｐｕｂ ２０１１ Ａｐｒ １）は、ポリ（β－アミノエステル）（ＰＢＡＥ）コアがリン脂質二重層シェルによって被包された生分解性コア－シェル構造化粒子について記載している。これらはインビボｍＲＮＡ送達のために開発された。ｐＨ応答性ＰＢＡＥ成分はエンドソーム破壊を促進するように選ばれ、一方、脂質表面層はポリカチオンコアの毒性を最小限に抑えるように選択された。従って、これは本発明のＲＮＡの送達に好ましい。
一実施形態において、自己集合生体付着性ポリマーをベースとする粒子が企図され、これは、ペプチドの経口送達、ペプチドの静脈内送達及びペプチドの経鼻送達、脳への全てに適用し得る。疎水性薬物の経口吸収及び眼内送達など、他の実施形態もまた企図される。分子エンベロープ技術は、保護され且つ疾患部位に送達されるエンジニアリングされたポリマーエンベロープを含む（例えば、Ｍａｚｚａ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．ＡＣＳＮａｎｏ，２０１３．７（２）：１０１６－１０２６；Ｓｉｅｗ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｐｈａｒｍ，２０１２．９（１）：１４－２８；Ｌａｌａｔｓａ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｃｏｎｔｒ Ｒｅｌ，２０１２．１６１（２）：５２３－３６；Ｌａｌａｔｓａ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｐｈａｒｍ，２０１２．９（６）：１６６５－８０；Ｌａｌａｔｓａ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｐｈａｒｍ，２０１２．９（６）：１７６４－７４；Ｇａｒｒｅｔｔ，Ｎ．Ｌ．，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｂｉｏｐｈｏｔｏｎｉｃｓ，２０１２．５（５－６）：４５８－６８；Ｇａｒｒｅｔｔ，Ｎ．Ｌ．，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｒａｍａｎ Ｓｐｅｃｔ，２０１２．４３（５）：６８１－６８８；Ａｈｍａｄ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｒｏｙａｌ Ｓｏｃ Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ ２０１０．７：Ｓ４２３－３３；Ｕｃｈｅｇｂｕ，Ｉ．Ｆ．Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ，２００６．３（５）：６２９－４０；Ｑｕ，Ｘ．，ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，２００６．７（１２）：３４５２－９及びＵｃｈｅｇｂｕ，Ｉ．Ｆ．，ｅｔ ａｌ．Ｉｎｔ Ｊ Ｐｈａｒｍ，２００１．２２４：１８５－１９９を参照）。標的組織に応じて単回又は複数回用量での約５ｍｇ／ｋｇの用量が企図される。
一実施形態において、ＭＩＴのＤａｎ Ａｎｄｅｒｓｏｎ研究室によって開発された、腫瘍成長を止めるためＲＮＡを癌細胞に送達することのできる粒子を、本発明の核酸ターゲティング系に使用し及び／又は適合させることができる。詳細には、Ａｎｄｅｒｓｏｎ研究室は、新規生体材料及びナノ製剤の合成、精製、特徴付け、及び製剤化のための完全に自動化されたコンビナトリアルシステムを開発した。例えば、Ａｌａｂｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．２０１３ Ａｕｇ ６；１１０（３２）：１２８８１－６；Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ａｄｖ Ｍａｔｅｒ．２０１３ Ｓｅｐ ６；２５（３３）：４６４１－５；Ｊｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｎｏ Ｌｅｔｔ．２０１３ Ｍａｒ １３；１３（３）：１０５９－６４；Ｋａｒａｇｉａｎｎｉｓ ｅｔ ａｌ．，ＡＣＳ Ｎａｎｏ．２０１２ Ｏｃｔ ２３；６（１０）：８４８４－７；Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ ｅｔ ａｌ．，ＡＣＳ Ｎａｎｏ．２０１２ Ａｕｇ ２８；６（８）：６９２２－９及びＬｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１２ Ｊｕｎ ３；７（６）：３８９－９３を参照のこと。
米国特許出願公開第２０１１０２９３７０３号明細書はリピドイド化合物に関し、同様にポリヌクレオチドの投与に特に有用であり、これは、本発明の核酸ターゲティング系の送達に適用し得る。一態様において、アミノアルコールリピドイド化合物が、細胞又は対象に送達される薬剤と組み合わされて、マイクロパーティクル、ナノ粒子、リポソーム、又はミセルを形成する。粒子、リポソーム、又はミセルによって送達される薬剤は、気体、液体、又は固体の形態であってもよく、及び薬剤はポリヌクレオチド、タンパク質、ペプチド、又は小分子であってもよい。アミノアルコール（ｍｉｎｏａｌｃｏｈｏｌ）リピドイド化合物は、他のアミノアルコールリピドイド化合物、ポリマー（合成又は天然）、界面活性剤、コレステロール、炭水化物、タンパク質、脂質等と組み合わされて粒子を形成し得る。次にはこれらの粒子が任意選択で医薬賦形剤と組み合わされて医薬組成物を形成し得る。
米国特許出願公開第２０１１０２９３７０３号明細書はまた、アミノアルコールリピドイド化合物を調製する方法も提供する。アミンの１つ以上の等価物をエポキシド末端化合物の１つ以上の等価物と好適な条件下で反応させると、本発明のアミノアルコールリピドイド化合物が形成される。特定の実施形態において、アミンの全てのアミノ基がエポキシド末端化合物と完全に反応して第三級アミンを形成する。他の実施形態において、アミンの全てのアミノ基がエポキシド末端化合物と完全には反応せずに第三級アミンを形成し、それによりアミノアルコールリピドイド化合物に第一級又は第二級アミンが生じる。これらの第一級又は第二級アミンはそのままにされるか、又は異なるエポキシド末端化合物などの別の求電子剤と反応させてもよい。当業者によって理解されるであろうとおり、アミンが過剰未満のエポキシド末端化合物と反応すると、様々な数の末端部を有する複数の異なるアミノアルコールリピドイド化合物が生じることになる。ある種のアミン類は２つのエポキシド由来化合物末端部で完全に官能化されてもよく、一方、他の分子はエポキシド末端化合物末端部で完全には官能化されない。例えば、ジアミン又はポリアミンは、分子の様々なアミノ部分の１、２、３、又は４つのエポキシド由来化合物末端部を含んで第一級、第二級、及び第三級アミンを生じ得る。特定の実施形態において、全てのアミノ基が完全には官能化されない。特定の実施形態において、同じタイプのエポキシド末端化合物のうちの２つが使用される。他の実施形態において、２つ以上の異なるエポキシド末端化合物が使用される。アミノアルコールリピドイド化合物の合成は溶媒有り又は無しで実施され、及び合成は３０～１００℃、好ましくは約５０～９０℃の範囲の高温で実施され得る。調製されたアミノアルコールリピドイド化合物は任意選択で精製されてもよい。例えば、アミノアルコールリピドイド化合物の混合物を精製して、特定の数のエポキシド由来化合物末端部を有するアミノアルコールリピドイド化合物を得てもよい。又は混合物を精製して、特定の立体又は位置異性体を得てもよい。アミノアルコールリピドイド化合物はまた、ハロゲン化アルキル（例えばヨウ化メチル）又は他のアルキル化剤を用いてアルキル化されてもよく、及び／又はそれらはアシル化されてもよい。
米国特許出願公開第２０１１０２９３７０３号明細書はまた、この発明の方法によって調製されたアミノアルコールリピドイド化合物のライブラリも提供する。これらのアミノアルコールリピドイド化合物は、液体ハンドラー、ロボット、マイクロタイタープレート、コンピュータ等が関わるハイスループット技法を用いて調製され及び／又はスクリーニングされ得る。特定の実施形態において、アミノアルコールリピドイド化合物は、ポリヌクレオチド又は他の薬剤（例えば、タンパク質、ペプチド、小分子）を細胞にトランスフェクトする能力に関してスクリーニングされる。
米国特許出願公開第２０１３０３０２４０１号明細書は、コンビナトリアル重合を用いて調製されたポリ（β－アミノアルコール）（ＰＢＡＡ）類の一クラスに関する。この発明のＰＢＡＡは、コーティング（医療器具又はインプラントのフィルム又は多層フィルムコーティングなど）、添加剤、材料、賦形剤、生物付着防止剤、マイクロパターニング剤、及び細胞封入剤など、バイオテクノロジー及び生物医学的適用において用いられ得る。表面コーティングとして使用される場合、これらのＰＢＡＡは、インビトロ及びインビボの両方で、その化学構造に応じて様々なレベルの炎症を誘発した。この材料クラスの化学的多様性は大きいため、インビトロでマクロファージ活性化を阻害するポリマーコーティングを同定することが可能であった。更に、これらのコーティングは、カルボキシル化ポリスチレンマイクロパーティクルの皮下移植後の炎症細胞の動員を低減し、及び線維症を低減する。これらのポリマーを使用して、細胞封入用の高分子電解質複合体カプセルを形成し得る。本発明もまた、抗菌性コーティング、ＤＮＡ又はｓｉＲＮＡ送達、及び幹細胞組織工学など、他の多くの生物学的適用を有し得る。米国特許出願公開第２０１３０３０２４０１号明細書の教示は、本発明の核酸ターゲティング系に適用し得る。
別の実施形態において、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）が企図される。抗トランスサイレチン低分子干渉ＲＮＡが脂質ナノ粒子に封入され、ヒトに送達されており（例えば、Ｃｏｅｌｈｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ２０１３；３６９：８１９－２９を参照）、及びかかるシステムを本発明の核酸ターゲティング系に適合させて応用し得る。静脈内投与される約０．０１～約１ｍｇ／ｋｇ体重の用量が企図される。注入関連反応のリスクを低下させる薬物投与が企図され、デキサメタゾン、アセトアミノフェン（ａｃｅｔａｍｐｉｎｏｐｈｅｎ）、ジフェンヒドラミン又はセチリジン、及びラニチジンなどが企図される。４週間毎の５用量にわたる約０．３ｍｇ／キログラムの複数回用量もまた企図される。
ＬＮＰは、ｓｉＲＮＡの肝臓への送達に極めて有効であることが示されており（例えば、Ｔａｂｅｒｎｅｒｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，Ａｐｒｉｌ ２０１３，Ｖｏｌ．３，Ｎｏ．４，ｐａｇｅｓ ３６３－４７０を参照のこと）、従って核酸ターゲティングエフェクタータンパク質をコードするＲＮＡの肝臓への送達に企図される。２週間毎に６ｍｇ／ｋｇのＬＮＰの約４用量の投薬量が企図され得る。Ｔａｂｅｒｎｅｒｏ ｅｔ ａｌ．は、０．７ｍｇ／ｋｇで投与するＬＮＰの最初の２サイクル後に腫瘍退縮が観察され、及び６サイクルの終わりまでに患者がリンパ節転移の完全退縮及び肝腫瘍の実質的な縮小を伴う部分奏効を達成したことを実証した。この患者においては４０用量後に完全奏効が得られ、２６ヵ月間にわたって投与を受けた後も患者は寛解を保ったまま治療を完了した。ＶＥＧＦ経路阻害薬による先行治療後に進行していた、腎臓、肺、及びリンパ節を含めた肝外疾患部位を有する２人のＲＣＣ患者は、約８～１２ヵ月間全ての部位で疾患の安定が得られ、及びＰＮＥＴ及び肝転移患者は１８ヵ月間（３６用量）にわたって延長試験を継続し、疾患は安定していた。
しかしながら、ＬＮＰの電荷が考慮されなければならない。カチオン性脂質を負電荷脂質と組み合わせると、細胞内送達を促進する非二重層構造が誘導されるためである。荷電ＬＮＰは静脈内注射後に循環から急速に除去されるため、ｐＫａ値が７未満のイオン化可能なカチオン性脂質が開発された（例えば、Ｒｏｓｉｎ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，ｖｏｌ．１９，ｎｏ．１２，ｐａｇｅｓ １２８６－２２００，Ｄｅｃ．２０１１を参照）。ＲＮＡなどの負電荷ポリマーは低ｐＨ値（例えばｐＨ４）でＬＮＰに負荷することができ、ここでイオン化可能な脂質は正電荷を呈する。しかしながら、生理的ｐＨ値では、ＬＮＰは、より長い循環時間と適合する低い表面電荷を呈する。４種のイオン化可能なカチオン性脂質、即ち、１，２－ジリネオイル（ｄｉｌｉｎｅｏｙｌ）－３－ジメチルアンモニウム－プロパン（ＤＬｉｎＤＡＰ）、１，２－ジリノレイルオキシ－３－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、１，２－ジリノレイルオキシ－ケト－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－アミノプロパン（ＤＬｉｎＫＤＭＡ）、及び１，２－ジリノレイル－４－（２－ジメチルアミノエチル）－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎＫＣ２－ＤＭＡ）が着目されている。これらの脂質を含有するＬＮＰ ｓｉＲＮＡシステムは、インビボで肝細胞において著しく異なる遺伝子サイレンシング特性を呈し、効力は、第ＶＩＩ因子遺伝子サイレンシングモデルを用いて系列ＤＬｉｎＫＣ２－ＤＭＡ＞ＤＬｉｎＫＤＭＡ＞ＤＬｉｎＤＭＡ＞＞ＤＬｉｎＤＡＰに従い様々であることが示されている（例えば、Ｒｏｓｉｎ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，ｖｏｌ．１９，ｎｏ．１２，ｐａｇｅｓ １２８６－２２００，Ｄｅｃ．２０１１を参照）。ＬＮＰ又はＬＮＰ中の又はそれに関連するＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ＲＮＡの１μｇ／ｍｌの投薬量が、特にＤＬｉｎＫＣ２－ＤＭＡを含有する製剤について企図され得る。
ＬＮＰ及びＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ封入の調製は、Ｒｏｓｉｎ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，ｖｏｌ．１９，ｎｏ．１２，ｐａｇｅｓ １２８６－２２００，Ｄｅｃ．２０１１）を使用し及び／又は適合させ得る。カチオン性脂質１，２－ジリネオイル（ｄｉｌｉｎｅｏｙｌ）－３－ジメチルアンモニウム－プロパン（ＤＬｉｎＤＡＰ）、１，２－ジリノレイルオキシ－３－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、１，２－ジリノレイルオキシケト－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－アミノプロパン（ＤＬｉｎＫ－ＤＭＡ）、１，２－ジリノレイル－４－（２－ジメチルアミノエチル）－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎＫＣ２－ＤＭＡ）、（３－ｏ－［２”－（メトキシポリエチレングリコール２０００）サクシノイル］－１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリコール（ＰＥＧ－Ｓ－ＤＭＧ）、及びＲ－３－［（ω－メトキシ－ポリ（エチレングリコール）２０００）カルバモイル］－１，２－ジミリスチルオクスルプロピル（ｄｉｍｙｒｉｓｔｙｌｏｘｌｐｒｏｐｙｌ）－３－アミン（ＰＥＧ－Ｃ－ＤＯＭＧ）がＴｅｋｍｉｒａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ（Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，Ｃａｎａｄａ）によって供給され、又は合成されてもよい。コレステロールはＳｉｇｍａ（Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から購入し得る。特定の核酸ターゲティング複合体（ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ）ＲＮＡは、ＤＬｉｎＤＡＰ、ＤＬｉｎＤＭＡ、ＤＬｉｎＫ－ＤＭＡ、及びＤＬｉｎＫＣ２－ＤＭＡを含有するＬＮＰに封入してもよい（４０：１０：４０：１０モル比のカチオン性脂質：ＤＳＰＣ：ＣＨＯＬ：ＰＥＧＳ－ＤＭＧ又はＰＥＧ－Ｃ－ＤＯＭＧ）。必要な場合、０．２％ＳＰ－ＤｉＯＣ１８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，Ｃａｎａｄａ）を取り入れて細胞取込み、細胞内送達、及び体内分布を評価する。封入は、カチオン性脂質：ＤＳＰＣ：コレステロール：ＰＥＧ－ｃ－ＤＯＭＧ（４０：１０：４０：１０モル比）で構成される脂質混合物をエタノール中に１０ｍｍｏｌ／ｌの最終脂質濃度となるように溶解することにより実施し得る。このエタノール脂質溶液を５０ｍｍｏｌ／ｌクエン酸塩、ｐＨ４．０に滴下して加えると、多層小胞が形成され、３０％エタノールｖｏｌ／ｖｏｌの最終濃度が生じ得る。エクストルーダ（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｌｉｐｉｄｓ，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，Ｃａｎａｄａ）を使用して２つの積み重ねた８０ｎｍ Ｎｕｃｌｅｐｏｒｅポリカーボネートフィルタで多層小胞を押し出した後、大きい単層小胞が形成され得る。封入は、３０％エタノールｖｏｌ／ｖｏｌを含有する５０ｍｍｏｌ／ｌクエン酸塩、ｐＨ４．０中に２ｍｇ／ｍｌのＲＮＡを、押し出されて予め形成された大きい単層小胞に滴下して加え、０．０６／１ｗｔ／ｗｔの最終ＲＮＡ／脂質重量比となるように常に混合しながら３１℃で３０分間インキュベートすることにより達成し得る。Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ ２再生セルロース透析膜を使用したリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、ｐＨ７．４での１６時間の透析によってエタノールの除去及び製剤化緩衝液の中和を実施した。粒径分布はＮＩＣＯＭＰ ３７０粒径測定機、小胞／強度モード、及びガウスフィッティング（Ｎｉｃｏｍｐ Ｐａｒｔｉｃｌｅ Ｓｉｚｉｎｇ，Ｓａｎｔａ Ｂａｒｂａｒａ，ＣＡ）を使用した動的光散乱によって決定し得る。３つ全てのＬＮＰ系の粒径が直径約７０ｎｍであり得る。ＲＮＡ封入効率は、透析前及び透析後に収集した試料からＶｉｖａＰｕｒｅＤ ＭｉｎｉＨカラム（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ Ｓｔｅｄｉｍ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を使用して遊離ＲＮＡを除去することにより決定し得る。溶出した粒子から封入されたＲＮＡを抽出し、２６０ｎｍで定量化し得る。Ｗａｋｏ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ ＵＳＡ（Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＶＡ）からのコレステロールＥ酵素アッセイを用いて小胞中のコレステロール含有量を計測することにより、ＲＮＡ対脂質比を決定した。本明細書におけるＬＮＰ及びＰＥＧ脂質の考察と併せて、ＰＥＧ化リポソーム又はＬＮＰも同様に核酸ターゲティング系又はその構成成分の送達に好適である。
大きいＬＮＰの調製は、Ｒｏｓｉｎ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，ｖｏｌ．１９，ｎｏ．１２，ｐａｇｅｓ １２８６－２２００，Ｄｅｃ．２０１１を使用し及び／又は応用し得る。エタノール中にＤＬｉｎＫＣ２－ＤＭＡ、ＤＳＰＣ、及びコレステロールを５０：１０：３８．５モル比で含有する脂質プレミックス溶液（２０．４ｍｇ／ｍｌ総脂質濃度）を調製し得る。酢酸ナトリウムを０．７５：１（酢酸ナトリウム：ＤＬｉｎＫＣ２－ＤＭＡ）のモル比でこの脂質プレミックスに加え得る。続いて混合物を１．８５容積のクエン酸塩緩衝液（１０ｍｍｏｌ／ｌ、ｐＨ３．０）と激しく撹拌しながら合わせることにより脂質を水和させると、３５％エタノールを含有する水性緩衝液中でリポソームの自然形成が起こり得る。このリポソーム溶液を３７℃でインキュベートして、粒径を時間依存的に増加させ得る。インキュベーション中様々な時点でアリコートを取り出して、動的光散乱（Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ，Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒｓｈｉｒｅ，ＵＫ）によってリポソームサイズの変化を調べ得る。所望の粒径に達したところで、総脂質の３．５％の最終ＰＥＧモル濃度が得られるようにリポソーム混合物にＰＥＧ脂質水溶液（ストック＝３５％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）エタノール中１０ｍｇ／ｍｌ ＰＥＧ－ＤＭＧ）を加え得る。ＰＥＧ－脂質を加えると、リポソームはそのサイズで、更なる成長が事実上クエンチされるはずである。次に空のリポソームに約１：１０（ｗｔ：ｗｔ）のＲＮＡ対総脂質でＲＮＡを加え、続いて３７℃で３０分間インキュベートすると、負荷されたＬＮＰが形成され得る。続いてこの混合物をＰＢＳで一晩透析し、０．４５μｍシリンジフィルタでろ過し得る。
球状核酸（ＳＮＡ（商標））構築物及び他の粒子（特に金粒子）もまた、核酸ターゲティング系を意図した標的に送達する手段として企図される。多量のデータが、核酸機能化金粒子をベースとするＡｕｒａＳｅｎｓｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓの球状核酸（ＳＮＡ（商標））構築物が有用であることを示している。
本明細書の教示と併せて用い得る文献としては、Ｃｕｔｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０１１ １３３：９２５４－９２５７、Ｈａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｓｍａｌｌ．２０１１ ７：３１５８－３１６２、Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，ＡＣＳ Ｎａｎｏ．２０１１ ５：６９６２－６９７０、Ｃｕｔｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０１２ １３４：１３７６－１３９１、Ｙｏｕｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｎｏ Ｌｅｔｔ．２０１２ １２：３８６７－７１、Ｚｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．２０１２ １０９：１１９７５－８０、Ｍｉｒｋｉｎ，Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ ２０１２ ７：６３５－６３８ Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０１２ １３４：１６４８８－１６９１、Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ，Ｎａｔｕｒｅ ２０１３ ４９５：Ｓ１４－Ｓ１６、Ｃｈｏｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．２０１３ １１０（１９）：７６２５－７６３０、Ｊｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．５，２０９ｒａ１５２（２０１３）及びＭｉｒｋｉｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｍａｌｌ，１０：１８６－１９２が挙げられる。
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の遠位端に結合したＡｒｇ－Ｇｌｙ－Ａｓｐ（ＲＧＤ）ペプチドリガンドによってポリエチレンイミン（ＰＥＩ）をＰＥＧ化して、ＲＮＡを含む自己集合性粒子を構築し得る。この系は、例えば、インテグリンを発現する腫瘍新生血管系を標的化し、且つ血管内皮成長因子受容体－２（ＶＥＧＦ Ｒ２）の発現を阻害して、それにより腫瘍血管新生を達成するｓｉＲＮＡを送達する手段として用いられている（例えば、Ｓｃｈｉｆｆｅｌｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００４，Ｖｏｌ．３２，Ｎｏ．１９を参照）。ナノプレックスは、等容積のカチオン性ポリマーと核酸との水溶液を混合して２～６の範囲にわたって正味モル過剰のイオン化可能窒素（ポリマー）対リン酸（核酸）を得ることにより調製し得る。カチオン性ポリマーと核酸との間の静電相互作用によって平均粒径分布が約１００ｎｍのポリプレックスが形成され、従ってここではナノプレックスと称された。Ｓｃｈｉｆｆｅｌｅｒｓ ｅｔ ａｌ．の自己集合性粒子での送達には、約１００～２００ｍｇの投薬量の核酸ターゲティング複合体ＲＮＡが想定される。
Ｂａｒｔｌｅｔｔ ｅｔ ａｌ．（ＰＮＡＳ，Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ ２５，２００７，ｖｏｌ．１０４，ｎｏ．３９）のナノプレックスもまた、本発明に適用され得る。Ｂａｒｔｌｅｔｔ ｅｔ ａｌ．のナノプレックスは、等容積のカチオン性ポリマーと核酸との水溶液を混合して２～６の範囲にわたって正味モル過剰のイオン化可能な窒素（ポリマー）対リン酸（核酸）を得ることにより調製される。カチオン性ポリマーと核酸との間の静電相互作用によって平均粒径分布が約１００ｎｍのポリプレックスが形成され、従ってここではナノプレックスと称された。Ｂａｒｔｌｅｔｔ ｅｔ ａｌ．のＤＯＴＡ－ｓｉＲＮＡは、以下のとおり合成された：１，４，７，１０－テトラアザシクロドデカン－１，４，７，１０－四酢酸モノ（Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル）（ＤＯＴＡ－ＮＨＳエステル）をＭａｃｒｏｃｙｃｌｉｃｓ（Ｄａｌｌａｓ，ＴＸ）から注文した。カーボネート緩衝液（ｐＨ９）中１００倍モル過剰のＤＯＴＡ－ＮＨＳ－エステルを有するアミン改変ＲＮＡセンス鎖を微量遠心管に加えた。室温で４時間撹拌することにより内容物を反応させた。ＤＯＴＡ－ＲＮＡセンスコンジュゲートをエタノール沈殿させて、水中に再懸濁し、及び非改変アンチセンス鎖とアニーリングさせることにより、ＤＯＴＡ－ｓｉＲＮＡを得た。液体は全てＣｈｅｌｅｘ－１００（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）で前処理して微量金属の汚染が除去された。シクロデキストリン含有ポリカチオンを使用することにより、Ｔｆ標的及び非標的ｓｉＲＮＡ粒子を形成し得る。典型的には、３（±）の電荷比及び０．５ｇ／リットルのｓｉＲＮＡ濃度で水中に粒子が形成された。標的粒子の表面上にある１パーセントのアダマンタン－ＰＥＧ分子をＴｆ（アダマンタン－ＰＥＧ－Ｔｆ）で改変した。注射用に５％（ｗｔ／ｖｏｌ）グルコース担体溶液中に粒子を懸濁した。
Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ ４６４，１５ Ａｐｒｉｌ ２０１０）は、標的粒子送達系を使用するＲＮＡ臨床試験を行う（臨床試験登録番号ＮＣＴ００６８９０６５）。標準ケア療法に抵抗性の固形癌患者に対し２１日間サイクルの１、３、８及び１０日目に用量の標的粒子を３０分間静脈内注入によって投与する。粒子は、（１）線状シクロデキストリン系ポリマー（ＣＤＰ）、（２）癌細胞の表面上のＴＦ受容体（ＴＦＲ）に会合するようにナノ粒子の外側に提示されたヒトトランスフェリンタンパク質（ＴＦ）標的リガンド、（３）親水性ポリマー（生体液中でのナノ粒子の安定性を促進するために用いられるポリエチレングリコール（ＰＥＧ））、及び（４）ＲＲＭ２の発現を低下させるように設計されたｓｉＲＮＡ（臨床で使用された配列は、以前はｓｉＲ２Ｂ＋５と称された）を含有する合成送達系を含むか、それらから本質的になるか、又はそれらからなる。ＴＦＲは悪性細胞で上方制御されることが長く知られており、及びＲＲＭ２は確立された抗癌標的である。これらの粒子（臨床版はＣＡＬＡＡ－０１と称される）は、非ヒト霊長類における複数回投与試験で良好に忍容されることが示されている。１人の慢性骨髄性白血病患者にｓｉＲＮＡがリポソーム送達によって投与されているが、Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．の臨床試験は、ｓｉＲＮＡを標的送達系で全身送達して固形癌患者を治療する初期ヒト試験である。標的送達系がヒト腫瘍への機能性ｓｉＲＮＡの有効な送達を提供し得るかどうかを確かめるため、Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．は、３つの異なる投与コホートからの３人の患者の生検を調べた；患者Ａ、Ｂ及びＣ、全員が転移性黒色腫を有し、それぞれ１８、２４及び３０ｍｇ・ｍ－２ ｓｉＲＮＡのＣＡＬＡＡ－０１の投与を受けた。同程度の用量が本発明の核酸ターゲティング系にも企図され得る。本発明の送達は、線状シクロデキストリン系ポリマー（ＣＤＰ）、癌細胞の表面上のＴＦ受容体（ＴＦＲ）に会合するように粒子の外側に提示されたヒトトランスフェリンタンパク質（ＴＦ）標的リガンド、及び／又は親水性ポリマー（例えば、生体液中での粒子の安定性を促進するために用いられるポリエチレングリコール（ＰＥＧ））を含有する粒子で達成され得る。
本発明に関しては、核酸ターゲティング複合体の１つ以上の構成成分、例えば核酸ターゲティングエフェクタータンパク質又はｍＲＮＡ又はガイドＲＮＡを粒子又は脂質エンベロープを用いて送達することが好ましい。他の送達系又はベクターを本発明の粒子の態様と併せて用いてもよい。
一般に、「ナノ粒子」は、直径が１０００ｎｍ未満の任意の粒子を指す。特定の好ましい実施形態において、本発明のナノ粒子は最大径（例えば直径）が５００ｎｍ以下である。他の好ましい実施形態において、本発明のナノ粒子は最大径が２５ｎｍ～２００ｎｍの範囲である。他の好ましい実施形態において、本発明の粒子は最大径が１００ｎｍ以下である。他の好ましい実施形態において、本発明のナノ粒子は最大径が３５ｎｍ～６０ｎｍの範囲である。
本発明に包含される粒子は、例えば、固体粒子（例えば、銀、金、鉄、チタンなどの金属）、非金属、脂質ベースの固体、ポリマー）、粒子の懸濁液、又はこれらの組み合わせとして、種々の形態で提供され得る。金属、誘電体、及び半導体粒子、並びにハイブリッド構造（例えば、コアシェル粒子）を調製してもよい。半導体材料でできている粒子はまた、電子エネルギーレベルの量子化が起こるのに十分に小さい（典型的には１０ｎｍ未満）ならば、標識量子ドットであってもよい。かかるナノスケール粒子は、生物医学的適用において薬物担体又は造影剤として用いられ、本発明における同様の目的に応用し得る。
半固体及び軟質粒子が製造されており、本発明の範囲内にある。半固体の性質のプロトタイプ粒子がリポソームである。各種のリポソーム粒子が現在、抗癌薬及びワクチンの送達系として臨床で用いられている。一方の親水性の半体と他方の疎水性の半体とを有する粒子はヤヌス粒子と呼ばれ、特にエマルションを安定化させるのに有効である。ヤヌス粒子は水／油界面で自己集合して、固体界面活性剤として働くことができる。
米国特許第８，７０９，８４３号明細書（参照により本明細書に援用される）は、治療剤含有粒子を組織、細胞、及び細胞内区画に標的化して送達するための薬物送達システムを提供する。本発明は、界面活性剤、親水性ポリマー又は脂質にコンジュゲートしたポリマーを含む標的粒子を提供する。
米国特許第６，００７，８４５号明細書（参照により本明細書に援用される）は、多官能化合物を１つ以上の疎水性ポリマー及び１つ以上の親水性ポリマーと共有結合的に連結することにより形成されたマルチブロック共重合体のコアを有し、且つ生物学的に活性な材料を含有する粒子を提供する。
米国特許第５，８５５，９１３号明細書（参照により本明細書に援用される）は、肺系統への薬物送達のためその表面上に界面活性剤を取り込んだ、タップ密度が０．４ｇ／ｃｍ３未満で平均直径が５μｍ～３０μｍの空気力学的に軽い粒子を有する粒子状組成物を提供する。
米国特許第５，９８５，３０９号明細書（参照により本明細書に援用される）は、界面活性剤及び／又は正電荷又は負電荷治療薬又は診断薬と肺系統への送達用の逆の電荷の荷電分子との親水性又は疎水性複合体を取り込んだ粒子を提供する。
米国特許第５，５４３，１５８号明細書（参照により本明細書に援用される）は、生物学的に活性な材料を含有する生分解性固体コア及び表面上のポリ（アルキレングリコール）部分を有する生分解性注射用粒子を提供する。
国際公開第２０１２１３５０２５号パンフレット（米国特許出願公開第２０１２０２５１５６０号明細書としても公開されている）（参照により本明細書に援用される）は、コンジュゲート型ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）ポリマー及びコンジュゲート型アザ大環状分子（まとめて「コンジュゲート型リポマー（ｌｉｐｏｍｅｒ）」又は「リポマー」と称される）について記載している。特定の実施形態において、本明細書に記載のかかる方法及び材料、例えばコンジュゲート型リポマーを、インビトロ、エキソビボ及びインビボゲノム摂動を達成してタンパク質発現の改変を含めた遺伝子発現の改変を行うため核酸ターゲティング系のコンテクストで使用し得ることを想定し得る。
一実施形態において、粒子はエポキシド改変脂質ポリマー、有利には７Ｃ１であってもよい（例えば、Ｊａｍｅｓ Ｅ．Ｄａｈｌｍａｎ ａｎｄ Ｃａｒｍｅｎ Ｂａｒｎｅｓ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２０１４）ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎｌｉｎｅ １１ Ｍａｙ ２０１４，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｎａｎｏ．２０１４．８４を参照）。Ｃ７１は、Ｃ１５エポキシド末端脂質をＰＥＩ６００と１４：１のモル比で混合することにより合成され、Ｃ１４ＰＥＧ２０００と配合されて、ＰＢＳ溶液中で少なくとも４０日間安定な粒子が作製された（直径３５～６０ｎｍ）。
エポキシド改変脂質ポリマーを利用して本発明の核酸ターゲティング系を肺細胞、心血管細胞又は腎細胞に送達し得るが、しかしながら、当業者はこの系を応用して他の標的器官に送達し得る。約０．０５～約０．６ｍｇ／ｋｇの範囲の投薬量が想定される。数日間又は数週間にわたる、合計投薬量を約２ｍｇ／ｋｇとする投薬もまた想定される。
エキソソーム
エキソソームは、ＲＮＡ及びタンパク質を輸送する内因性のナノ小胞であり、これはＲＮＡを脳及び他の標的器官に送達することができる。免疫原性を低下させるため、Ａｌｖａｒｅｚ－Ｅｒｖｉｔｉ ｅｔ ａｌ．（２０１１，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２９：３４１）はエキソソーム産生に自己由来の樹状細胞を使用した。ニューロン特異的ＲＶＧペプチドに融合したエキソソーム膜タンパク質Ｌａｍｐ２ｂを発現するように樹状細胞をエンジニアリングすることにより、脳への標的化が達成された。精製エキソソームに電気穿孔によって外因性ＲＮＡが負荷された。静脈内注射されるＲＶＧ標的化エキソソームが、ＧＡＰＤＨ ｓｉＲＮＡを脳内のニューロン、ミクログリア、オリゴデンドロサイトに特異的に送達し、特異的遺伝子ノックダウンが得られた。ＲＶＧエキソソームに予め曝露してもノックダウンは減弱しなかったとともに、他の組織における非特異的取込みは観察されなかった。アルツハイマー病の治療標的であるＢＡＣＥ１の強力なｍＲＮＡ（６０％）及びタンパク質（６２％）ノックダウンによって、エキソソーム媒介ｓｉＲＮＡ送達の治療可能性が実証された。
免疫学的に不活性なエキソソームのプールを得るため、Ａｌｖａｒｅｚ－Ｅｒｖｉｔｉ ｅｔ ａｌ．は、同種主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）ハプロタイプの近交系Ｃ５７ＢＬ／６マウスから骨髄を採取した。未熟樹状細胞は、ＭＨＣ－ＩＩ及びＣＤ８６など、Ｔ細胞アクチベーターを欠くエキソソームを多量に産生するため、Ａｌｖａｒｅｚ－Ｅｒｖｉｔｉ ｅｔ ａｌ．は、顆粒球／マクロファージ－コロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）を有する樹状細胞を７日間選択した。翌日、十分に確立された超遠心法プロトコルを用いて培養上清からエキソソームを精製した。産生されたエキソソームは物理的に均一であり、粒子トラッキング解析（ＮＴＡ）及び電子顕微鏡法によって決定したとき分布サイズのピークが直径８０ｎｍであった。Ａｌｖａｒｅｚ－Ｅｒｖｉｔｉ ｅｔ ａｌ．は、１０６細胞当たり（タンパク質濃度に基づき計測して）６～１２μｇのエキソソームを得た。
次に、Ａｌｖａｒｅｚ－Ｅｒｖｉｔｉ ｅｔ ａｌ．は、ナノスケール適用に適合させた電気穿孔プロトコルを用いて改変エキソソームに外因性カーゴを負荷する可能性を調べた。ナノメートルスケールでの膜粒子に対する電気穿孔は十分に特徴付けられていないため、非特異的Ｃｙ５標識ＲＮＡを使用して電気穿孔プロトコルを経験的に最適化した。超遠心法及びエキソソームの溶解後に、封入されるＲＮＡの量をアッセイした。４００Ｖ及び１２５μＦでの電気穿孔が最大のＲＮＡ保持をもたらし、以降の全ての実験でこれを使用した。
Ａｌｖａｒｅｚ－Ｅｒｖｉｔｉ ｅｔ ａｌ．は、１５０μｇのＲＶＧエキソソームに封入された１５０μｇの各ＢＡＣＥ１ ｓｉＲＮＡを正常Ｃ５７ＢＬ／６マウスに投与し、４つの対照とノックダウン効率を比較した：未治療マウス、ＲＶＧエキソソームのみを注入したマウス、インビボカチオン性リポソーム試薬と複合体化したＢＡＣＥ１ ｓｉＲＮＡを注入したマウス、及びＲＶＧ－９Ｒ（ｓｉＲＮＡに静電的に結合する９つのＤ－アルギニンとコンジュゲートしたＲＶＧペプチド）と複合体化したＢＡＣＥ１ ｓｉＲＮＡを注入したマウス。投与３日後に皮質組織試料を分析し、ｓｉＲＮＡ－ＲＶＧ－９Ｒ治療マウス及びｓｉＲＮＡＲＶＧエキソソーム治療マウスの両方で有意なタンパク質ノックダウン（４５％、Ｐ＜０．０５、対６２％、Ｐ＜０．０１）が観察され、ＢＡＣＥ１ ｍＲＮＡレベルの有意な低下がもたらされた（それぞれ６６％±１５％、Ｐ＜０．００１及び６１％±１３％、Ｐ＜０．０１）。更に、この出願人らは、ＲＶＧ－エキソソーム治療動物においてアルツハイマー病におけるアミロイド斑の主要な構成成分である総β－アミロイド１－４２レベルの有意な低下（５５％、Ｐ＜０．０５）を実証した。観察された低下は、正常マウスでＢＡＣＥ１阻害薬の脳室内注射後に実証されたβ－アミロイド１－４０の低下よりも大きかった。Ａｌｖａｒｅｚ－Ｅｒｖｉｔｉ ｅｔ ａｌ．はＢＡＣＥ１切断産物でｃＤＮＡ末端の５’迅速増幅（ＲＡＣＥ）を実施し、これは、ｓｉＲＮＡによるＲＮＡｉ媒介性ノックダウンのエビデンスを提供した。
最後に、Ａｌｖａｒｅｚ－Ｅｒｖｉｔｉ ｅｔ ａｌ．は、ＩＬ－６、ＩＰ－１０、ＴＮＦα及びＩＦＮ－α血清濃度を評価することにより、ＲＮＡ－ＲＶＧエキソソームがインビボで免疫応答を誘導したかどうかを調べた。エキソソーム治療後、ｓｉＲＮＡ－ＲＶＧ－９Ｒと対照的にｓｉＲＮＡ－トランスフェクション試薬治療と同様に全てのサイトカインにおける有意でない変化を記録し、これはＩＬ－６分泌を強力に刺激したことから、エキソソーム治療の免疫学的に不活性なプロファイルが確認された。エキソソームがｓｉＲＮＡの２０％しか封入しないことを所与とすれば、対応するレベルの免疫刺激なしに５分の１のｓｉＲＮＡで同等のｍＲＮＡノックダウン及びより大きいタンパク質ノックダウンが達成されたため、ＲＶＧ－エキソソームによる送達はＲＶＧ－９Ｒ送達よりも効率的であるように見える。この実験は、ＲＶＧ－エキソソーム技術の治療可能性を実証したものであり、これは潜在的に神経変性疾患に関連する遺伝子の長期サイレンシングに適している。Ａｌｖａｒｅｚ－Ｅｒｖｉｔｉ ｅｔ ａｌ．のエキソソーム送達系は、治療標的、特に神経変性疾患への本発明の核酸ターゲティング系の送達に適用し得る。約１００～１０００ｍｇのＲＶＧエキソソームに封入された約１００～１０００ｍｇの核酸ターゲティング系の投薬量が本発明に企図され得る。
Ｅｌ－Ａｎｄａｌｏｕｓｓｉ ｅｔ ａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ７，２１１２－２１２６（２０１２））は、培養細胞に由来するエキソソームをどのようにインビトロ及びインビボでのＲＮＡの送達に利用することができるかを開示している。このプロトコルは、初めに、ペプチドリガンドと融合したエキソソームタンパク質を含む、発現ベクターのトランスフェクションによる標的エキソソームの作成を記載している。次に、Ｅｌ－Ａｎｄａｌｏｕｓｓｉ ｅｔ ａｌ．は、トランスフェクト細胞上清からエキソソームをどのように精製し及び特徴付けるかを説明する。次に、Ｅｌ－Ａｎｄａｌｏｕｓｓｉ ｅｔ ａｌ．は、ＲＮＡをエキソソームに負荷するために重要なステップを詳説する。最後に、Ｅｌ－Ａｎｄａｌｏｕｓｓｉ ｅｔ ａｌ．は、どのようにエキソソームを使用してインビトロで及びマウス脳においてインビボでＲＮＡを効率的に送達するかを概説する。エキソソーム媒介性ＲＮＡ送達の見込まれた結果の例が機能アッセイによって評価され、イメージングもまた提供される。プロトコル全体は約３週間かかる。本発明に係る送達又は投与は、自己由来樹状細胞から産生されたエキソソームを使用して実施されてもよい。本明細書における教示から、これを本発明の実施において用いることができる。
別の実施形態において、Ｗａｈｌｇｒｅｎ ｅｔ ａｌ．（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０１２，Ｖｏｌ．４０，Ｎｏ．１７ ｅ１３０）の血漿エキソソームが企図される。エキソソームは、樹状細胞（ＤＣ）、Ｂ細胞、Ｔ細胞、肥満細胞、上皮細胞及び腫瘍細胞を含めた多くの細胞型によって産生されるナノサイズの小胞（３０～９０ｎｍサイズ）である。これらの小胞は後期エンドソームの内向きの出芽によって形成され、次に細胞膜との融合時に細胞外環境へと放出される。エキソソームは天然で細胞間にＲＮＡを有するため、この特性は遺伝子療法に有用であり得るとともに、この開示から、本発明の実施に用いることができる。
血漿からのエキソソームは、バフィーコートを９００ｇで２０分間遠心して血漿を単離し、続いて細胞上清を回収し、３００ｇで１０分間遠心して細胞を除去し、１６ ５００ｇで３０分間遠心し、続いて０．２２ｍｍフィルタでろ過することにより調製することができる。１２０ ０００ｇで７０分間の超遠心によってエキソソームをペレット化する。エキソソームへのｓｉＲＮＡの化学的トランスフェクションをＲＮＡｉヒト／マウススターターキット（Ｑｕｉａｇｅｎ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で製造者の指示に従い実施する。ｓｉＲＮＡを１００ｍｌ ＰＢＳに２ｍｍｏｌ／ｍｌの最終濃度で加える。ＨｉＰｅｒＦｅｃｔトランスフェクション試薬を加えた後、混合物を室温で１０分間インキュベートする。過剰なミセルを除去するため、アルデヒド／硫酸塩ラテックスビーズを使用してエキソソームを再単離する。エキソソームへの核酸ターゲティング系の化学的トランスフェクションをｓｉＲＮＡと同様に行い得る。エキソソームを健常ドナーの末梢血から単離した単球及びリンパ球と共培養し得る。従って、核酸ターゲティング系を含有するエキソソームをヒトの単球及びリンパ球に導入し、且つヒトに自己再導入し得ることが企図され得る。従って、本発明に係る送達又は投与を血漿エキソソームを用いて実施し得る。
リポソーム
本発明に係る送達又は投与は、リポソームで実施することができる。リポソームは、内部の水性区画を取り囲む単層又は多重膜脂質二重層及び比較的不透過性の外側の親油性リン脂質二重層からなる球形の小胞構造である。リポソームは、生体適合性であり、非毒性であり、親水性及び親油性の両方の薬物分子を送達することができ、そのカーゴを血漿酵素による分解から保護し、且つ生体膜及び血液脳関門（ＢＢＢ）を越えてそのロードを輸送するため、薬物送達担体として大いに注目を集めてきた（例えば、レビューについては、Ｓｐｕｃｈ ａｎｄ Ｎａｖａｒｒｏ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，ｖｏｌ．２０１１，Ａｒｔｉｃｌｅ ＩＤ ４６９６７９，１２ ｐａｇｅｓ，２０１１．ｄｏｉ：１０．１１５５／２０１１／４６９６７９を参照のこと）。
リポソームは幾つかの異なるタイプの脂質から作製することができる；しかしながら、薬物担体としてのリポソームの作成には、リン脂質が最も一般的に用いられている。脂質薄膜が水溶液と混合されたときにリポソーム形成は自然に起こるが、また、ホモジナイザー、ソニケーター、又は押出し装置を使用して振盪の形態の力を加えることによっても促進し得る（例えば、レビューについては、Ｓｐｕｃｈ ａｎｄ Ｎａｖａｒｒｏ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，ｖｏｌ．２０１１，Ａｒｔｉｃｌｅ ＩＤ ４６９６７９，１２ ｐａｇｅｓ，２０１１．ｄｏｉ：１０．１１５５／２０１１／４６９６７９を参照のこと）。
その構造及び特性を改変するため、リポソームに幾つかの他の添加剤を加えてもよい。例えば、リポソーム構造の安定化を助けるため、及びリポソームの内部カーゴの漏出を防ぐため、リポソーム混合物にコレステロール又はスフィンゴミエリンのいずれかを加えてもよい。更に、リポソームは、水素化卵ホスファチジルコリン又は卵ホスファチジルコリン、コレステロール、及びジセチルリン酸から調製され、その平均小胞サイズは約５０及び１００ｎｍに調整された（例えば、レビューについては、Ｓｐｕｃｈ ａｎｄ Ｎａｖａｒｒｏ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，ｖｏｌ．２０１１，Ａｒｔｉｃｌｅ ＩＤ ４６９６７９，１２ ｐａｇｅｓ，２０１１．ｄｏｉ：１０．１１５５／２０１１／４６９６７９を参照のこと）。
リポソーム製剤は主に、１，２－ジステアロイル（ｄｉｓｔｅａｒｏｒｙｌ）－ｓｎ－グリセロ－３－ホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、スフィンゴミエリン、卵ホスファチジルコリン及びモノシアロガングリオシドなどの天然リン脂質及び脂質で構成され得る。この製剤はリン脂質のみでできているため、リポソーム製剤は多くの難題に直面しており、その１つが血漿中での不安定性である。これらの難題を解消しようとする幾つかの試みが、特に脂質膜の操作においてなされている。これらの試みの１つは、コレステロールの操作に着目するものであった。従来の製剤にコレステロールを加えると、封入された生物学的活性化合物が血漿又は１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）中に急速に放出されることが抑えられ、安定性が増す（例えば、レビューについては、Ｓｐｕｃｈ ａｎｄ Ｎａｖａｒｒｏ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，ｖｏｌ．２０１１，Ａｒｔｉｃｌｅ ＩＤ ４６９６７９，１２ ｐａｇｅｓ，２０１１．ｄｏｉ：１０．１１５５／２０１１／４６９６７９を参照のこと）。
特に有利な実施形態において、トロイの木馬リポソーム（分子トロイの木馬としても知られる）が望ましく、ｈｔｔｐ：／／ｃｓｈｐｒｏｔｏｃｏｌｓ．ｃｓｈｌｐ．ｏｒｇ／ｃｏｎｔｅｎｔ／２０１０／４／ｐｄｂ．ｐｒｏｔ５４０７．ｌｏｎｇにおいてプロトコルを参照し得る。これらの粒子は、トランス遺伝子を血管内注射後に脳全体に送達することが可能である。制約により拘束されるものではないが、特異抗体が表面にコンジュゲートした中性脂質粒子はエンドサイトーシスによって血液脳関門を通過することが可能であると考えられる。本出願人は、トロイの木馬リポソームを利用してヌクレアーゼのＣＲＩＳＰＲファミリーを血管内注射によって脳に送達することを仮定し、これにより、胚を操作する必要なしに全脳トランスジェニック動物が実現し得る。リポソームでの生体内投与には、約１～５ｇのＤＮＡ又はＲＮＡが企図され得る。
別の実施形態において、核酸ターゲティング系又はその構成成分は安定核酸脂質粒子（ＳＮＡＬＰ）などのリポソームで投与され得る（例えば、Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２３，Ｎｏ．８，Ａｕｇｕｓｔ ２００５を参照）。ＳＮＡＬＰで標的化される特定の核酸ターゲティング系の毎日の約１、３又は５ｍｇ／ｋｇ／日の静脈内注射が企図される。毎日の治療は約３日間にわたり、次に毎週、約５週間にわたり得る。別の実施形態において、特定の核酸ターゲティング系が封入されたＳＮＡＬＰの約１又は２．５ｍｇ／ｋｇの用量の静脈内注射による投与もまた企図される（例えば、Ｚｉｍｍｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｌｅｔｔｅｒｓ，Ｖｏｌ．４４１，４ Ｍａｙ ２００６を参照）。ＳＮＡＬＰ製剤は、脂質３－Ｎ－［（ｗメトキシポリ（エチレングリコール）２０００）カルバモイル］－１，２－ジミリスチルオキシ－プロピルアミン（ＰＥＧ－Ｃ－ＤＭＡ）、１，２－ジリノレイルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－アミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）及びコレステロールを２：４０：１０：４８モルパーセント比で含有し得る（例えば、Ｚｉｍｍｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｌｅｔｔｅｒｓ，Ｖｏｌ．４４１，４ Ｍａｙ ２００６を参照）。
別の実施形態において、安定核酸脂質粒子（ＳＮＡＬＰ）は、高度に血管新生したＨｅｐＧ２由来肝腫瘍への分子の送達に有効であるが、血管新生が不十分なＨＣＴ－１１６由来肝腫瘍においては有効でないことが分かっている（例えば、Ｌｉ，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（２０１２）１９，７７５－７８０を参照）。ＳＮＡＬＰリポソームは、Ｄ－Ｌｉｎ－ＤＭＡ及びＰＥＧ－Ｃ－ＤＭＡをジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、コレステロール及びｓｉＲＮＡと共に２５：１脂質／ｓｉＲＮＡ比及び４８／４０／１０／２モル比のコレステロール／Ｄ－Ｌｉｎ－ＤＭＡ／ＤＳＰＣ／ＰＥＧ－Ｃ－ＤＭＡを用いて製剤化することにより調製し得る。得られたＳＮＡＬＰリポソームは約８０～１００ｎｍサイズである。
更に別の実施形態において、ＳＮＡＬＰは、合成コレステロール（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ，Ａｌａｂａｓｔｅｒ，ＡＬ，ＵＳＡ）、３－Ｎ－［（ｗ－メトキシポリ（エチレングリコール）２０００）カルバモイル］－１，２－ジミレスチルオキシプロピルアミン（ｄｉｍｙｒｅｓｔｙｌｏｘｙｐｒｏｐｙｌａｍｉｎｅ）、及びカチオン性１，２－ジリノレイルオキシ－３－Ｎ，Ｎジメチルアミノアミノプロパンを含み得る（例えば、Ｇｅｉｓｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ ２０１０；３７５：１８９６－９０５を参照）。例えばボーラス静脈内注入として投与される１用量当たり合計約２ｍｇ／ｋｇの核酸ターゲティング系の投薬量が企図され得る。
更に別の実施形態において、ＳＮＡＬＰは、合成コレステロール（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ；Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ Ｉｎｃ．）、ＰＥＧ－ｃＤＭＡ、及び１，２－ジリノレイルオキシ－３－（Ｎ；Ｎ－ジメチル）アミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）を含み得る（例えば、Ｊｕｄｇｅ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１１９：６６１－６７３（２００９）を参照）。インビボ研究に用いられる製剤は、約９：１の最終脂質／ＲＮＡ質量比を含み得る。
ＲＮＡｉナノメディシンの安全性プロファイルが、Ａｌｎｙｌａｍ ＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓのＢａｒｒｏｓ ａｎｄ Ｇｏｌｌｏｂによってレビューされている（例えば、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ ６４（２０１２）１７３０－１７３７を参照）。安定核酸脂質粒子（ＳＮＡＬＰ）は、４つの異なる脂質－低ｐＨでカチオン性のイオン化可能な脂質（ＤＬｉｎＤＭＡ）、中性ヘルパー脂質、コレステロール、及び拡散性ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）－脂質で構成される。この粒子は直径約８０ｎｍであり、生理的ｐＨで電荷的に中性である。製剤化時、イオン化可能な脂質が粒子形成の間に脂質をアニオン性ＲＮＡと凝縮させる働きをする。漸進的に酸性になるエンドソーム条件下で正電荷のとき、イオン化可能な脂質はまた、ＳＮＡＬＰとエンドソーム膜との融合も媒介し、細胞質中へのＲＮＡの放出を可能にする。ＰＥＧ－脂質は粒子を安定化させ、製剤化時の凝集を低減し、続いて薬物動態特性を改善する中性の親水性外部を提供する。
現在までに、ＲＮＡを有するＳＮＡＬＰ製剤を使用して２つの臨床プログラムが開始されている。Ｔｅｋｍｉｒａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓは、最近、高ＬＤＬコレステロールの成人ボランティアにおけるＳＮＡＬＰ－ＡｐｏＢの第Ｉ相単回投与試験を完了した。ＡｐｏＢは主に肝臓及び空腸に発現し、ＶＬＤＬ及びＬＤＬのアセンブリ及び分泌に必須である。１７人の対象に単一用量のＳＮＡＬＰ－ＡｐｏＢが投与された（７用量レベルにわたる用量漸増）。肝毒性（前臨床試験に基づき潜在的用量制限毒性として予想された）のエビデンスはなかった。（２人中）１人の対象が最も高い用量で免疫系刺激と一致してインフルエンザ様症状を起こし、試験終了が決定された。
Ａｌｎｙｌａｍ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓも同様にＡＬＮ－ＴＴＲ０１を進めており、これは上記に記載されるＳＮＡＬＰ技術を用い、ＴＴＲアミロイドーシス（ＡＴＴＲ）の治療のため突然変異体及び野生型の両方のＴＴＲの肝細胞産生を標的化する。３つのＡＴＴＲ症候群が記載されている：家族性アミロイドポリニューロパチー（ＦＡＰ）及び家族性アミロイド心筋症（ＦＡＣ）－両方ともにＴＴＲの常染色体優性突然変異によって引き起こされる；及び野生型ＴＴＲによって引き起こされる老人性全身性アミロイドーシス（ＳＳＡ）。ＡＬＮ－ＴＴＲ０１のプラセボ対照単回用量漸増第Ｉ相試験が最近、ＡＴＴＲ患者で完了した。ＡＬＮ－ＴＴＲ０１が１５分間の静脈内注入として３１人の患者に（２３人は試験薬物及び８人はプラセボ）０．０１～１．０ｍｇ／ｋｇの用量範囲内で（ｓｉＲＮＡに基づく）投与された。治療は良好に忍容され、肝機能検査値の重大な増加はなかった。≧０．４ｍｇ／ｋｇで２３人中３人の患者に注入関連反応が認められた；全員が注入速度の減速に応答し、全員が試験を続行した。２人の患者に１ｍｇ／ｋｇの最も高い用量で血清サイトカインＩＬ－６、ＩＰ－１０及びＩＬ－１ｒａの最小限且つ一過性の上昇が認められた（前臨床及びＮＨＰ試験から予想されたとおり）。ＡＬＮ－ＴＴＲ０１の期待された薬力学的効果である血清ＴＴＲの低下が１ｍｇ／ｋｇで観察された。
更に別の実施形態において、ＳＮＡＬＰは、例えばカチオン性脂質、ＤＳＰＣ、コレステロール及びＰＥＧ－脂質をエタノール中に、例えばそれぞれ４０：１０：４０：１０のモル比で可溶化させることにより作製し得る（Ｓｅｍｐｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｎｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ ２８ Ｎｕｍｂｅｒ ２ Ｆｅｂｒｕａｒｙ ２０１０，ｐｐ．１７２－１７７を参照）。水性緩衝液（５０ｍＭクエン酸塩、ｐＨ４）にそれぞれ３０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）及び６．１ｍｇ／ｍｌの最終エタノール及び脂質濃度となるように混合しながら脂質混合物を加え、２２℃で２分間平衡化させた後、押し出した。水和した脂質を、２つの積み重ねた８０ｎｍ細孔径フィルタ（Ｎｕｃｌｅｐｏｒｅ）で２２℃においてＬｉｐｅｘ Ｅｘｔｒｕｄｅｒ（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｌｉｐｉｄｓ）を使用して、動的光散乱分析によって決定したとき７０～９０ｎｍの小胞直径が観察されるまで押し出した。これには、概して１～３回のパスが必要であった。ｓｉＲＮＡ（３０％エタノールを含有する５０ｍＭクエン酸塩、ｐＨ４水溶液中に可溶化した）を、予め平衡化した（３５℃）小胞に約５ｍｌ／分の速度で混合しながら加えた。０．０６（ｗｔ／ｗｔ）の最終目標ｓｉＲＮＡ／脂質比に達した後、混合物を３５℃で更に３０分間インキュベートして小胞再構築及びｓｉＲＮＡの封入を可能にした。次にエタノールを除去し、外部緩衝液を透析又はタンジェンシャルフローダイアフィルトレーションのいずれかによってＰＢＳ（１５５ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、１ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．５）と交換した。制御された段階的希釈方法プロセスを用いてｓｉＲＮＡをＳＮＡＬＰに封入した。ＫＣ２－ＳＮＡＬＰの脂質構成要素は、５７．１：７．１：３４．３：１．４のモル比で用いられたＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ（カチオン性脂質）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ；Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ）、合成コレステロール（Ｓｉｇｍａ）及びＰＥＧ－Ｃ－ＤＭＡであった。負荷粒子が形成されたところで、ＳＮＡＬＰをＰＢＳで透析し、使用前に０．２μｍフィルタで滅菌ろ過した。平均粒径は７５～８５ｎｍであり、ｓｉＲＮＡの９０～９５％が脂質粒子内に封入された。インビボ試験に使用した製剤中の最終的なｓｉＲＮＡ／脂質比は約０．１５（ｗｔ／ｗｔ）であった。使用直前に、第ＶＩＩ因子ｓｉＲＮＡを含有するＬＮＰ－ｓｉＲＮＡ系を滅菌ＰＢＳ中に適切な濃度に希釈し、製剤を１０ｍｌ／ｋｇの合計容積で外側尾静脈から静脈内投与した。この方法及びこれらの送達系は、本発明の核酸ターゲティング系に当てはめることができる。
他の脂質
アミノ脂質２，２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノエチル－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ）などの他のカチオン性脂質を利用して、例えばＳｉＲＮＡと同様に、核酸ターゲティング系又はその構成成分又はそれをコードする１つ又は複数の核酸分子を封入してもよく（例えば、Ｊａｙａｒａｍａｎ，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．２０１２，５１，８５２９－８５３３を参照）、従って本発明の実施に用い得る。以下の脂質組成を有する予め形成された小胞が企図され得る：アミノ脂質、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、コレステロール及び（Ｒ）－２，３－ビス（オクタデシルオキシ）プロピル－１－（メトキシポリ（エチレングリコール）２０００）プロピルカルバメート（ＰＥＧ－脂質）、それぞれモル比４０／１０／４０／１０、及び約０．０５（ｗ／ｗ）のＦＶＩＩ ｓｉＲＮＡ／総脂質比。７０～９０ｎｍの範囲の狭い粒径分布及び０．１１±０．０４の低い多分散性指数（ｎ＝５６）が確実となるように、粒子を最大３回まで８０ｎｍ膜で押し出し、その後ガイドＲＮＡに加えた。極めて強力なアミノ脂質１６を含有する粒子を使用してもよく、ここで４つの脂質構成成分１６、ＤＳＰＣ、コレステロール及びＰＥＧ－脂質のモル比（５０／１０／３８．５／１．５）はインビボ活性を増強させるため更に最適化され得る。
Ｍｉｃｈａｅｌ Ｓ Ｄ Ｋｏｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．（「マウスにおける化学的に改変されたｍＲＮＡの送達後の治療用タンパク質の発現（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｆｔｅｒ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｍＲＮＡ ｉｎ ｍｉｃｅ）：Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ：２９，Ｐａｇｅｓ：１５４－１５７（２０１１））は、脂質エンベロープを用いたＲＮＡの送達について記載している。脂質エンベロープの使用は本発明においても好ましい。
別の実施形態では、脂質を本発明の核酸ターゲティング系又はその１つ又は複数の構成成分又はそれをコードする１つ又は複数の核酸分子と共に製剤化して、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）を形成してもよい。脂質としては、限定はされないが、ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ４、Ｃ１２－２００及びコリピド（ｃｏｌｉｐｉｄ）ジステロイルホスファチジルコリン（ｄｉｓｔｅｒｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌ ｃｈｏｌｉｎｅ）、コレステロールが挙げられ、及びＰＥＧ－ＤＭＧを小胞自然形成手順を用いてｓｉＲＮＡの代わりにＲＮＡターゲティング系と共に製剤化してもよい（例えば、Ｎｏｖｏｂｒａｎｔｓｅｖａ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ－Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ（２０１２）１，ｅ４；ｄｏｉ：１０．１０３８／ｍｔｎａ．２０１１．３を参照）。構成成分のモル比は約５０／１０／３８．５／１．５（ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ又はＣ１２－２００／ジステロイルホスファチジルコリン（ｄｉｓｔｅｒｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌ ｃｈｏｌｉｎｅ）／コレステロール／ＰＥＧ－ＤＭＧ）であってもよい。最終的な脂質：ｓｉＲＮＡ重量比は、ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ及びＣ１２－２００脂質粒子（ＬＮＰ）の場合、それぞれ約１２：１及び９：１であり得る。製剤は、＞９０％の捕捉効率で約８０ｎｍの平均粒子直径を有し得る。３ｍｇ／ｋｇ用量が企図され得る。
Ｔｅｋｍｉｒａは、米国及び米国外に、ＬＮＰ及びＬＮＰ製剤の様々な態様に関する約９５のパテントファミリーのポートフォリオを有し（例えば、米国特許第７，９８２，０２７号明細書；同第７，７９９，５６５号明細書；同第８，０５８，０６９号明細書；同第８，２８３，３３３号明細書；同第７，９０１，７０８号明細書；同第７，７４５，６５１号明細書；同第７，８０３，３９７号明細書；同第８，１０１，７４１号明細書；同第８，１８８，２６３号明細書；同第７，９１５，３９９号明細書；同第８，２３６，９４３号明細書及び同第７，８３８，６５８号明細書及び欧州特許第１７６６０３５号明細書；同第１５１９７１４号明細書；同第１７８１５９３号明細書及び同第１６６４３１６号明細書を参照）、これらは全て、本発明に使用及び／又は応用することができる。
核酸ターゲティング系又はその構成成分又はそれをコードする１つ又は複数の核酸分子は、タンパク質、タンパク質前駆体、又は部分的又は完全にプロセシングされた形態のタンパク質又はタンパク質前駆体をコードし得る改変核酸分子を含む組成物の製剤の態様に関する米国特許出願公開第２０１３０２５２２８１号明細書及び同第２０１３０２４５１０７号明細書及び同第２０１３０２４４２７９号明細書（Ｍｏｄｅｒｎａ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓに譲渡された）に更に記載されるものなど、ＰＬＧＡミクロスフェアに封入して送達し得る。製剤は、モル比５０：１０：３８．５：１．５～３．０（カチオン性脂質：膜融合性脂質：コレステロール：ＰＥＧ脂質）を有し得る。ＰＥＧ脂質は、限定はされないが、ＰＥＧ－ｃ－ＤＯＭＧ、ＰＥＧ－ＤＭＧから選択され得る。膜融合性脂質はＤＳＰＣであり得る。また、Ｓｃｈｒｕｍ ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ａｎｄ Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ、米国特許出願公開第２０１２０２５１６１８号明細書も参照のこと。
Ｎａｎｏｍｅｒｉｃｓの技術は、低分子量疎水性薬物、ペプチド、及び核酸ベースの治療薬（プラスミド、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ）を含めた広範囲の治療薬に関するバイオアベイラビリティの難題に対処している。この技術が明らかな利点を実証している特定の投与経路には、経口経路、血液脳関門を越える輸送、固形腫瘍への送達、並びに眼への送達が含まれる。例えば、Ｍａｚｚａ ｅｔ ａｌ．，２０１３，ＡＣＳ Ｎａｎｏ．２０１３ Ｆｅｂ ２６；７（２）：１０１６－２６；Ｕｃｈｅｇｂｕ ａｎｄ Ｓｉｅｗ，２０１３，Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ．１０２（２）：３０５－１０及びＬａｌａｔｓａ ｅｔ ａｌ．，２０１２，Ｊ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ．２０１２ Ｊｕｌ ２０；１６１（２）：５２３－３６を参照のこと。
米国特許出願公開第２００５００１９９２３号明細書は、ポリヌクレオチド分子、ペプチド及びポリペプチド及び／又は医薬品などの生理活性分子を哺乳類の体に送達するためのカチオン性デンドリマーについて記載している。デンドリマーは、生理活性分子の送達を、例えば、肝臓、脾臓、肺、腎臓又は心臓に（又は更には脳までも）標的化するのに好適である。デンドリマーは、単純な分岐単量体単位から段階的に調製される合成三次元巨大分子であり、その性質及び機能は容易に制御し、変化させることができる。デンドリマーは、構成要素を多機能コアに（ダイバージェント合成手法）、又は多機能コアに向かって（コンバージェント合成手法）反復的に加えることによって合成され、構成要素の三次元シェルを加える毎に、より高世代のデンドリマーの形成につながる。ポリプロピレンイミンデンドリマーはジアミノブタンコアから開始され、それに第一級アミンへのアクリロニトリルの二重マイケル付加によって２倍の数のアミノ基が加えられ、続いてニトリルが水素化される。この結果、アミノ基の倍増がもたらされる。ポリプロピレンイミンデンドリマーは１００％プロトン化可能な窒素及び最大６４個の末端アミノ基（第５世代、ＤＡＢ ６４）を含有する。プロトン化可能な基は、通常、中性ｐＨでプロトンを受け取ることが可能なアミン基である。デンドリマーの遺伝子デリバリー剤としての使用は、大部分が、コンジュゲート単位としてそれぞれアミン／アミド又はＮ－－Ｐ（Ｏ２）Ｓの混合物を有するポリアミドアミン及び亜リン酸含有化合物の使用に着目したものであり、それより低い世代のポリプロピレンイミンデンドリマーの遺伝子送達への使用に関しては報告がない。ポリプロピレンイミンデンドリマーもまた、周囲アミノ酸性基によって化学的に改変されたとき薬物送達及びゲスト分子のそれらの封入のためのｐＨ感受性制御放出系として研究されている。ＤＮＡを有するポリプロピレンイミンデンドリマーの細胞傷害性及び相互作用並びにＤＡＢ ６４のトランスフェクション有効性もまた研究されている。
米国特許出願公開第２００５００１９９２３号明細書は、先行の報告に反して、ポリプロピレンイミンデンドリマーなどのカチオン性デンドリマーが、特異的標的化及び低毒性など、遺伝物質など、生理活性分子の標的化した送達において用いるのに好適な特性を示すという観察に基づく。加えて、カチオン性デンドリマーの誘導体もまた、生理活性分子の標的化された送達に好適な特性を示す。また、「カチオン性ポリアミンポリマー及びデンドリマーポリマーを含めた様々なポリマーは抗増殖活性を有することが示され、従って、新生物及び腫瘍、炎症性障害（自己免疫障害を含む）、乾癬及びアテローム性動脈硬化症など、望ましくない細胞増殖によって特徴付けられる障害の治療に有用であり得る。ポリマーは単独で活性薬剤として用いられてもよく、又は遺伝子療法用の薬物分子又は核酸など、他の治療剤の送達ビヒクルとして用いられてもよい。そのような場合、ポリマーそれ自体の固有の抗腫瘍活性が、送達される薬剤の活性を補完し得る」ことを開示するＢｉｏａｃｔｉｖｅ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，米国特許出願公開第２００８０２６７９０３号明細書も参照のこと。これらの特許公報の開示は、１つ又は複数の核酸ターゲティング系又はその１つ又は複数の構成成分又はそれをコードする１つ又は複数の核酸分子の送達に関する本明細書における教示と併せて用いられ得る。
超荷電タンパク質
超荷電タンパク質は、異常に高い理論上の正味正電荷又は負電荷を有するエンジニアリングされた又は天然に存在するタンパク質の一クラスであり、１つ又は複数の核酸ターゲティング系又はその１つ又は複数の構成成分又はそれをコードする１つ又は複数の核酸分子の送達に用いられ得る。超負電荷及び超正電荷の両方のタンパク質とも、熱的又は化学的に誘導される凝集に耐える著しい能力を呈する。超正電荷タンパク質はまた、哺乳類細胞に侵入することも可能である。プラスミドＤＮＡ、ＲＮＡ、又は他のタンパク質など、これらのタンパク質と関連付けるカーゴが、インビトロ及びインビボの両方でこれらの巨大分子を哺乳類細胞に機能的に送達することを可能にし得る。Ｄａｖｉｄ Ｌｉｕの研究室は、２００７年に超荷電タンパク質の作成及び特徴付けを報告した（Ｌａｗｒｅｎｃｅ ｅｔ ａｌ．，２００７，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ １２９，１０１１０－１０１１２）。
哺乳類細胞へのＲＮＡ及びプラスミドＤＮＡの非ウイルス性送達は、研究及び治療適用の両方に価値がある（Ａｋｉｎｃ ｅｔ ａｌ．，２０１０，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２６，５６１－５６９）。精製＋３６ ＧＦＰタンパク質（又は他の超正電荷タンパク質）を適切な無血清培地中でＲＮＡと混合して複合体化させた後、細胞に加える。この段階で血清を含めると、超荷電タンパク質－ＲＮＡ複合体の形成が阻害され、治療の有効性が低下する。以下のプロトコルが種々の細胞株に有効であることが分かっている（ＭｃＮａｕｇｈｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，２００９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０６，６１１１－６１１６。しかしながら、具体的な細胞株に対して手順を最適化するには、タンパク質及びＲＮＡの用量を変化させるパイロット実験を行わなければならない）。
（１）処理前日、４８ウェルプレートにウェル当たり１×１０５細胞をプレーティングする。
（２）処理当日、最終濃度２００ｎＭとなるように精製＋３６ ＧＦＰタンパク質を無血清培地中に希釈する。５０ｎＭの最終濃度となるようにＲＮＡを加える。ボルテックスして混合し、室温で１０分間インキュベートする。
（３）インキュベーション中、細胞から培地を吸引し、ＰＢＳで１回洗浄する。
（４）＋３６ ＧＦＰ及びＲＮＡのインキュベーション後、細胞にタンパク質－ＲＮＡ複合体を加える。
（５）細胞を複合体と共に３７℃で４時間インキュベートする。
（６）インキュベーション後、培地を吸引し、２０Ｕ／ｍＬヘパリンＰＢＳで３回洗浄する。細胞を血清含有培地と共に、活性に関するアッセイに応じて更に４８時間又はそれ以上インキュベートする。
（７）免疫ブロット、ｑＰＣＲ、表現型アッセイ、又は他の適切な方法によって細胞を分析する。
Ｄａｖｉｄ Ｌｉｕの研究室は、＋３６ ＧＦＰが様々な細胞で有効なプラスミド送達試薬であることを更に見出した。プラスミドＤＮＡはｓｉＲＮＡよりも大きいカーゴであるため、プラスミドを有効に複合体化するためには、比例して更なる＋３６ ＧＦＰタンパク質が必要になる。有効なプラスミド送達のため、本出願人らは、インフルエンザウイルスヘマグルチニンタンパク質に由来する公知のエンドソーム破壊ペプチドであるＣ末端ＨＡ２ペプチドタグを担持する＋３６ ＧＦＰの変異体を開発している。以下のプロトコルが種々の細胞において有効となっているが、上記のとおり、プラスミドＤＮＡ及び超荷電タンパク質の用量を特定の細胞株及び送達の適用に最適化することが助言される。
（１）処理前日、４８ウェルプレートにウェル当たり１×１０５をプレーティングする。
（２）処理当日、無血清培地中の精製ｐ３６ ＧＦＰタンパク質を最終濃度２ｍＭとなるように希釈する。１ｍｇのプラスミドＤＮＡを加える。ボルテックスして混合し、室温で１０分間インキュベートする。
（３）インキュベーション中、細胞から培地を吸引し、ＰＢＳで１回洗浄する。
（４）ｐ３６ ＧＦＰ及びプラスミドＤＮＡのインキュベーション後、タンパク質－ＤＮＡ複合体を細胞に穏やかに加える。
（５）細胞を複合体と共に３７℃で４時間インキュベートする。
（６）インキュベーション後、培地を吸引し、ＰＢＳで洗浄する。血清含有培地中で細胞をインキュベートし、更に２４～４８時間インキュベートする。
（７）適宜、プラスミド送達を分析する（例えば、プラスミドによってドライブされる遺伝子発現による）。
また、例えば、ＭｃＮａｕｇｈｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０６，６１１１－６１１６（２００９）；Ｃｒｏｎｉｃａｎ ｅｔ ａｌ．，ＡＣＳ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ５，７４７－７５２（２０１０）；Ｃｒｏｎｉｃａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ＆ Ｂｉｏｌｏｇｙ １８，８３３－８３８（２０１１）；Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ５０３，２９３－３１９（２０１２）；Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｄ．Ｂ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ＆ Ｂｉｏｌｏｇｙ １９（７），８３１－８４３（２０１２）も参照のこと。超荷電タンパク質の方法は、本発明の核酸ターゲティング系の送達に使用及び／又は応用することができる。Ｄｒ．Ｌｕｉ及び本明細書における文献のこれらの系を本明細書における教示と併せて１つ又は複数の核酸ターゲティング系又はその１つ又は複数の構成成分又はそれをコードする１つ又は複数の核酸分子の送達に用いることができる。
細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）
更に別の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ系の送達に細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）が企図される。ＣＰＰは、（ナノサイズ粒子から化学的小分子及び大型ＤＮＡ断片に至るまでの）様々な分子カーゴの細胞取込みを促進する短鎖ペプチドである。用語「カーゴ」は、本明細書で使用されるとき、限定はされないが、治療剤、診断プローブ、ペプチド、核酸、アンチセンスオリゴヌクレオチド、プラスミド、タンパク質、ナノ粒子を含めた粒子、リポソーム、発色団、小分子及び放射性物質からなる群を含む。本発明の態様では、カーゴにはまた、ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ系の任意の構成成分又は機能性ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ系全体も含まれ得る。本発明の態様は、所望のカーゴを対象に送達する方法を更に提供し、この方法は、（ａ）本発明の細胞透過性ペプチドと所望のカーゴとを含む複合体を調製するステップ、及び（ｂ）複合体を対象に経口的に、関節内に、腹腔内に、くも膜下腔内に、動脈内に（ｉｎｔｒａｒｔｅｒｉａｌｌｙ）、鼻腔内に、実質内に、皮下に、筋肉内に、静脈内に、経皮的に、直腸内に、又は局所的に投与するステップを含む。カーゴは、共有結合を介した化学的連結によるか、又は非共有結合性の相互作用によるかのいずれかでペプチドと会合している。
ＣＰＰの機能は、カーゴを細胞内に送達することであり、これは一般的にはエンドサイトーシスを通じて起こるプロセスであって、カーゴは哺乳類生細胞のエンドソームに送達される。細胞透過性ペプチドのサイズ、アミノ酸配列、及び電荷は様々であるが、全てのＣＰＰが、細胞膜を移行し且つ細胞質又は細胞小器官への様々な分子カーゴの送達を促進する能力である１つの個別的な特徴を有する。ＣＰＰの移行は３つの主な侵入機構に分類し得る：膜における直接の透過、エンドサイトーシスを介する侵入、及び一過性構造の形成を通じた移行。ＣＰＰは、癌及びウイルス阻害薬、並びに細胞標識用の造影剤を含め、種々の疾患の治療におけるドラッグデリバリー剤として医薬において数多くの適用が見出されている。後者の例としては、ＧＦＰ、ＭＲＩ造影剤、又は量子ドットの担体としての働きが挙げられる。ＣＰＰには、研究及び医薬に用いられるインビトロ及びインビボ送達ベクターとして大きな可能性がある。ＣＰＰのアミノ酸組成は、典型的には、リジン又はアルギニンなど正電荷アミノ酸の高い相対存在量を含むか、又は極性／荷電アミノ酸と非極性疎水性アミノ酸との交互のパターンを含む配列を有するかのいずれかである。これらの２つの構造タイプは、それぞれポリカチオン性又は両親媒性と称される。第３のＣＰＰクラスは、非極性残基のみを含む疎水性ペプチドであり、これは正味電荷が低いか又は細胞取込みに重要な疎水性アミノ酸基を有する。発見当初のＣＰＰの一つはヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ－１）由来のトランス活性化転写アクチベーター（Ｔａｔ）であり、これは多数の培養下細胞型によって周囲の培地から効率的に取り込まれることが見出された。それ以降、既知のＣＰＰの数は大幅に増え続け、より有効なタンパク質形質導入特性を有する小分子合成類似体が作成されている。ＣＰＰとしては、限定はされないが、ペネトラチン、Ｔａｔ（４８－６０）、トランスポータン、及び（Ｒ－ＡｈＸ－Ｒ４）（Ａｈｘ＝アミノヘキサノイル）が挙げられる。
米国特許第８，３７２，９５１号明細書は、高い細胞透過性効率及び低毒性を呈する好酸球カチオン性タンパク質（ＥＣＰ）から送達されるＣＰＰを提供する。ＣＰＰをそのカーゴで脊椎動物対象に送達する態様もまた提供されている。ＣＰＰ及びそれらの送達の更なる態様は、米国特許第８，５７５，３０５号明細書；８；同第６１４，１９４号明細書及び同第８，０４４，０１９号明細書に記載されている。ＣＰＰはＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系又はその構成成分の送達に使用することができる。ＣＰＰを用いてＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系又はその構成成分を送達できることはまた、論稿「Ｃａｓ９タンパク質及びガイドＲＮＡの細胞透過性ペプチド媒介送達による遺伝子破壊（Ｇｅｎｅ ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ ｂｙ ｃｅｌｌ－ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ Ｃａｓ９ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ）」，Ｓｕｒｅｓｈ Ｒａｍａｋｒｉｓｈｎａ，Ａｂｕ－Ｂｏｎｓｒａｈ Ｋｗａｋｕ Ｄａｄ，Ｊａｇａｄｉｓｈ Ｂｅｌｏｏｒ，ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．２０１４ Ａｐｒ ２．［Ｅｐｕｂ ａｈｅａｄ ｏｆ ｐｒｉｎｔ］（全体として参照により援用される）にも提供されており、ここでは、ＣＰＰコンジュゲート組換えＣａｓ９タンパク質及びＣＰＰ複合体化ガイドＲＮＡによる処理が、ヒト細胞株における内因性遺伝子破壊につながることが実証されている。この論文では、Ｃａｓ９タンパク質はチオエーテル結合によってＣＰＰにコンジュゲートされた一方、ガイドＲＮＡはＣＰＰと複合体化され、縮合した正電荷粒子を形成した。胚性幹細胞、皮膚線維芽細胞、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、ＨｅＬａ細胞、及び胚性癌腫細胞を含めたヒト細胞を改変Ｃａｓ９及びガイドＲＮＡで同時に及び逐次的に処理すると、プラスミドトランスフェクションと比べてオフターゲット突然変異が低下した効率的な遺伝子破壊につながったことが示された。
植込み型デバイス
別の実施形態において、植込み型デバイスもまた、核酸ターゲティング系又はその１つ又は複数の構成成分又はそれをコードする１つ又は複数の核酸分子の送達に企図される。例えば、米国特許出願公開第２０１１０１９５１２３号明細書は、薬物を局所的に長時間溶出する植込み型医療器具を、幾つかのタイプのかかるデバイス、治療の実施態様及び植え込み方法を含めて開示しており、それが提供される。デバイスは、例えばデバイス本体として用いられるマトリックスなどのポリマー基質、及び薬物、及び場合によっては金属又は更なるポリマーなどの追加的な足場材料、及び可視性及びイメージングを増強する材料を含む。植込み型送達デバイスは局所的な長期間にわたる放出を提供するのに有利であってよく、ここで薬物は、腫瘍、炎症、変性などの罹患範囲の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）に直接又は症候性の対象のため、又は損傷した平滑筋細胞に、又は予防のため放出される。薬物の一種は上記に開示されるとおりＲＮＡであり、このシステムは本発明の核酸ターゲティング系に使用及び／又は応用することができる。一部の実施形態において植え込み方法は、小線源照射療法及び針生検を含め、現在他の治療向けに開発及び使用されている既存の植え込み手技である。そのような場合、この発明に記載される新規インプラントの寸法は、元のインプラントと同様である。典型的には、同じ治療手技中に数個のデバイスが植え込まれる。
米国特許出願公開第２０１１０１９５１２３号明細書は、例えば任意選択でマトリックスであってもよい生体安定性及び／又は分解性及び／又は生体吸収性ポリマー基質を含む、腹腔などの体腔及び／又は薬物送達システムが繋留されたり又は付着したりしない任意の他のタイプの投与に適用可能なシステムを含め、薬物送達植込み型又は挿入型システムを提供する。用語「挿入」にはまた、植込みも含まれることに留意しなければならない。薬物送達システムは、好ましくは米国特許出願公開第２０１１０１９５１２３号明細書に記載されるとおりの「Ｌｏｄｅｒ」として植え込まれる。
ポリマー又は複数のポリマーが生体適合性であり、薬剤及び／又は複数の薬剤を取り入れ、及び制御された速度での薬剤の放出を可能にし、ここでマトリックスなどのポリマー基質の総容積は、例えば、一部の実施形態では、任意選択で及び好ましくは、治療レベルの薬剤の放出を可能にする最大容積以下である。非限定的な例として、かかる容積は、薬剤負荷容積による必要に応じて好ましくは０．１ ｍ３～１０００ｍｍ３の範囲内である。Ｌｏｄｅｒは、任意選択で、例えば及び限定なしに膝関節、子宮内又は子宮頸部リングなど、そのサイズが機能によって決まるデバイスで例えば取り込まれるとき、より大きくてもよい。
薬物送達システム（組成物を送達するための）は、一部の実施形態において、好ましくは分解性ポリマーを用いるように設計され、ここで主な放出機構はバルク侵食である；又は一部の実施形態において、非分解性の、又は徐々に分解されるポリマーが使用され、ここで主な放出機構はバルク侵食よりむしろ拡散であり、従って外側部分が膜として機能し、及びその内側部分が、実質的に長期間にわたって（例えば約１週間～約数ヵ月）周囲からの影響を受けない薬物リザーバとして機能する。異なる放出機構を有する異なるポリマーの組み合わせもまた、任意選択で用いられ得る。表面の濃度勾配は、好ましくは相当な期間の全薬物放出期間にわたって事実上一定に維持され、従って拡散速度は事実上一定である（「ゼロモード」拡散と呼ばれる）。用語「一定」とは、好ましくは治療有効性の下限閾値より高く維持されるが、しかしなおも任意選択で初期バーストを特徴とし得るか、及び／又は変動し得る、例えば一定限度増加及び減少し得る拡散速度が意味される。拡散速度は、好ましくは長期間そのように維持され、及び治療上有効な期間、例えば有効なサイレンシング期間を最適化するのに特定のレベルで一定であると見なすことができる。
薬物送達システムは、本質的に化学的であるか、それとも酵素及び対象の体内にある他の因子からの攻撃に起因するかに関わらず、任意選択で及び好ましくは分解からヌクレオチドベースの治療剤を遮蔽するように設計される。
米国特許出願公開第２０１１０１９５１２３号明細書の薬物送達システムは、例えば任意選択で、限定はされないが、熱的加熱及び冷却、レーザービーム、及び集束超音波を含めた超音波及び／又はＲＦ（高周波）による方法又はデバイスを含め、非侵襲性及び／又は最小侵襲性の起動及び／又は加速／速度方法によって任意選択でデバイスの植込み時及び／又は植込み後に動作させる検知及び／又は起動器具と関連付けられる。
米国特許出願公開第２０１１０１９５１２３号明細書の一部の実施形態によれば、局所送達部位には、任意選択で、腫瘍、自己免疫疾患状態を含めた活性化及び／又は慢性的炎症及び感染、筋肉及び神経組織を含めた変性組織、慢性痛、変性部位、及び骨折箇所及び組織の再生強化のための他の創傷箇所、及び傷害された心筋、平滑筋及び横紋筋を含め、細胞の高度な異常増殖、及び抑制されたアポトーシスによって特徴付けられる標的部位が含まれ得る。
組成物の植込み部位、又は標的部位は、好ましくは標的局所送達に十分に小さい半径、面積及び／又は容積を特徴とする。例えば、標的部位は任意選択で約０．１ｍｍ～約５ｃｍの範囲の直径を有する。
標的部位の位置は、好ましくは治療有効性を最大化するように選択される。例えば、薬物送達システム（任意選択で上記に記載したとおりの植込み用デバイスを伴う）の組成物は、任意選択で及び好ましくは、腫瘍環境、又はそれに関連する血液供給の範囲内又はその近くに植え込まれる。
例えば組成物（任意選択でデバイスを伴う）は、任意選択で、脈管系の範囲内などでニップルを用いて膵臓、前立腺、乳房、肝臓の範囲内又はその近くに植え込まれる。
標的の位置は、任意選択で、（任意選択で体内の任意の部位がＬｏｄｅｒの植込みに好適であり得るように、あくまでも非限定的な例として）：１．基底核、白質及び灰白質におけるパーキンソン病又はアルツハイマー病のような変性部位の脳；２．筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）の場合のような脊椎；３．ＨＰＶ感染症予防のための子宮頸部；４．活性化及び慢性的炎症関節；５．乾癬の場合のような真皮；６．鎮痛効果のための交感神経及び感覚神経部位；７．骨内植え込み；８．急性及び慢性感染部位；９．腟内；１０．内耳－聴覚系、内耳の迷路、前庭系；１１．気管内；１２．心内；冠動脈、心外膜；１３．膀胱；１４．胆管系；１５．限定されないが、腎臓、肝臓、脾臓を含む実質組織；１６．リンパ節；１７．唾液腺；１８．歯肉；１９．関節内（関節の中）；２０．眼内；２１．脳組織；２２．脳室；２３．腹腔を含む腔（例えば、限定されないが、卵巣癌について）；２４．食道内及び２５．直腸内を含むか、それらから本質的になるか、又はそれらからなる群から選択される。
任意選択でシステム（例えば組成物を含有するデバイス）の挿入は、標的部位及び当該部位の近傍におけるＥＣＭへの材料の注射によって、標的部位及びかかる部位の近傍の局所ｐＨ及び／又は温度及び／又はＥＣＭにおける薬物の拡散及び／又は薬物動態に影響を及ぼす他の生物学的因子に影響を及ぼすことを伴う。
任意選択で、一部の実施形態によれば、前記薬剤の放出は、挿入前及び／又は挿入時及び／又は挿入後に、非侵襲性及び／又は最小侵襲性及び／又は他の起動及び／又は加速／減速方法、例えば、レーザービーム、放射線照射、熱的加熱及び冷却、及び集束超音波を含めた超音波及び／又はＲＦ（高周波）方法又はデバイス、及び化学的アクチベーターによって動作させるアプライアンスを検知及び／又は起動することを伴い得る。
米国特許出願公開第２０１１０１９５１２３号明細書の他の実施形態によれば、薬物は好ましくは、例えば以下に記載するとおり乳房、膵臓、脳、腎臓、膀胱、肺、及び前立腺における限局性の癌の場合に、ＲＮＡを含む。ＲＮＡｉで例示されるが、多くの薬物がＬｏｄｅｒへの封入に適用可能であり、かかる薬物を、例えばマトリックスなど、Ｌｏｄｅｒ基質で封入することができる限り、この発明に関連して使用することができ、このシステムは本発明の核酸ターゲティング系の送達に使用及び／又は応用することができる。
特定の適用の別の例として、異常な遺伝子発現に起因して神経及び筋肉変性疾患が発生する。ＲＮＡの局所送達は、かかる異常な遺伝子発現に干渉する治療特性を有し得る。小薬物及び巨大分子を含めた抗アポトーシス、抗炎症性及び抗変性薬物の局所送達もまた、場合により治療効果があり得る。そのような場合、Ｌｏｄｅｒは、一定の速度での及び／又は別途植え込まれる専用のデバイスを介した長期放出に適用される。これは全て、本発明の核酸ターゲティング系に使用及び／又は応用することができる。
特定の適用の更に別の例として、精神障害及び認知障害が遺伝子修飾薬で治療される。遺伝子ノックダウンは治療の選択肢である。薬剤を中枢神経系部位に局所的に送達するＬｏｄｅｒは、限定はされないが、精神病、双極性疾患、神経症性障害及び行動疾患を含めた精神障害及び認知障害に対する治療選択肢である。Ｌｏｄｅｒはまた、特定の脳部位における植込み時に小薬物及び巨大分子を含めた薬物を局所的に送達することもできる。これは全て、本発明の核酸ターゲティング系に使用及び／又は応用することができる。
特定の適用の別の例として、局所部位における自然及び／又は適応免疫メディエーターのサイレンシングにより、移植臓器拒絶反応の予防が可能となる。移植臓器及び／又は移植部位に植え込まれたＬｏｄｅｒによるＲＮＡ及び免疫調節試薬の局所送達が、移植臓器に対して活性化したＣＤ８などの免疫細胞を撃退することにより局所免疫抑制を与える。これは全て、本発明の核酸ターゲティング系に使用及び／又は応用することができる。
特定の適用の別の例として、ＶＥＧＦ及びアンジオゲニンなどを含む血管成長因子は、血管新生に不可欠である。因子、ペプチド、ペプチド模倣体の局所送達、又はそれらのリプレッサーの抑制は、重要な治療モダリティである；Ｌｏｄｅｒによるリプレッサーのサイレンシング並びに血管新生を刺激する因子、ペプチド、巨大分子及び小薬物の局所送達は、末梢、全身及び心血管疾患に治療効果がある。
植込みなどの挿入方法は、任意選択で、かかる方法において任意選択で改変なしに、或いは任意選択で重要でない改変のみを伴い、他のタイプの組織移植及び／又は挿入及び／又は組織試料採取に既に用いられているものであってもよい。かかる方法としては、任意選択で、限定はされないが、小線源照射療法、生検、ＥＲＣＰなどの、超音波を伴う及び／又は伴わない内視鏡検査、脳組織への定位的方法、関節、腹部器官、膀胱壁及び体腔への腹腔鏡の植え込みを含む腹腔鏡検査が挙げられる。
本明細書において考察される植込み型デバイス技術は、本明細書における教示と共に用いることができ、従ってこの開示及び当該技術分野における知識により、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系又はその構成成分又は構成成分をコードするか又はそれを提供するその核酸分子を植込み型デバイスによって送達し得る。
患者特異的スクリーニング方法
ＲＮＡ、例えばトリヌクレオチドリピートを標的とする核酸ターゲティング系を使用して、かかるリピートの存在に関して患者又は患者の試料をスクリーニングすることができる。このリピートは核酸ターゲティング系のＲＮＡの標的であることができ、その核酸ターゲティング系によるこのリピートへの結合がある場合、当該の結合を検出して、それによりかかるリピートの存在を示すことができる。従って、核酸ターゲティング系を使用して、リピートの存在に関して患者又は患者試料をスクリーニングすることができる。次に、患者に好適な１つ又は複数の化合物を投与して状態に対応し得る；又は、核酸ターゲティング系を投与して結合させ、挿入、欠失、又は突然変異を生じさせて、状態を緩和し得る。
本発明は核酸を使用して標的ＲＮＡ配列を結合する。
ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質ｍＲＮＡ及びガイドＲＮＡ
ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質ｍＲＮＡ及びガイドＲＮＡはまた、別々に送達されてもよい。ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質に発現する時間を与えるため、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質ｍＲＮＡをガイドＲＮＡより先に送達してもよい。ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質ｍＲＮＡはガイドＲＮＡ投与の１～１２時間前（好ましくは約２～６時間前）に投与されてもよい。
或いは、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質ｍＲＮＡ及びガイドＲＮＡは一緒に投与されてもよい。有利には、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質ｍＲＮＡ＋ガイドＲＮＡの初回投与から１～１２時間後（好ましくは約２～６時間後）にガイドＲＮＡの第２のブースター用量が投与されてもよい。
本発明のＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質、即ちＣ２ｃ２エフェクタータンパク質は、時に本明細書においてＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と称される。エフェクタータンパク質は酵素をベースとし又はそれに由来し、従って一部の実施形態において用語「エフェクタータンパク質」は必ず「酵素」を含むことが理解されるであろう。しかしながら、また、エフェクタータンパク質は一部の実施形態において必要に応じてＤＮＡ又はＲＮＡ結合を有し得るが、デッドＣａｓエフェクタータンパク質機能を含め、必ずしも切断又はニッキング活性を有するとは限らないことも理解されるであろう。
ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質ｍＲＮＡ及び／又はガイドＲＮＡの追加の投与は、最も効率的なゲノム改変レベルを達成するのに有用であり得る。一部の実施形態において、特に治療方法の中で遺伝性疾患が標的化されるとき、好ましくは表現型の変化がゲノム改変の結果であり、好ましくはここで表現型を修正し又は変化させるため修復鋳型が提供される。
一部の実施形態において、標的となり得る疾患としては、疾患を引き起こすスプライス欠損に関係しているものが挙げられる。
一部の実施形態において、細胞標的としては、造血幹／前駆細胞（ＣＤ３４＋）；ヒトＴ細胞；及び眼（網膜細胞）－例えば光受容前駆細胞が挙げられる。
一部の実施形態において、遺伝子標的としては、ヒトβグロビン－ＨＢＢ（鎌状赤血球貧血の治療用、遺伝子変換の（内因性鋳型として近縁のＨＢＤ遺伝子を使用した）刺激によることを含む）；ＣＤ３（Ｔ細胞）；及びＣＥＰ９２０－網膜（眼）が挙げられる。
一部の実施形態において、疾患標的としてはまた、癌；鎌状赤血球貧血（点突然変異に基づく）；ＨＩＶ；β－サラセミア；及び眼科的疾患又は眼疾患－例えばレーベル先天黒内障（ＬＣＡ）を引き起こすスプライス欠損も挙げられる。
一部の実施形態において、送達方法には、酵素－ガイド複合体（リボ核タンパク質）のカチオン性脂質媒介性「直接」送達及びプラスミドＤＮＡの電気穿孔が含まれる。
本発明の方法は、ｄｓＯＤＮ又はｓｓＯＤＮ（以下参照）であってもよい修復鋳型などの鋳型の送達を更に含むことができる。鋳型の送達は、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質又はガイドの一部又は全部の送達と同時であっても又は別個であってもよく、且つ同じ又は異なる送達機構によってもよい。一部の実施形態において、鋳型はガイドと共に、好ましくはＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質もまた共に送達されることが好ましい；一例はＡＡＶベクターであってもよい。
本発明の方法は、（ａ）前記二本鎖切断によって生じたオーバーハングに相補的なオーバーハングを含む二本鎖オリゴデオキシヌクレオチド（ｄｓＯＤＮ）を細胞に送達するステップであって、前記ｄｓＯＤＮが目的の遺伝子座に組み込まれるステップ；又は－（ｂ）一本鎖オリゴデオキシヌクレオチド（ｓｓＯＤＮ）を細胞に送達するステップであって、前記ｓｓＯＤＮが前記二本鎖切断の相同依存性修復の鋳型として働くステップを更に含むことができる。本発明の方法は個体の疾患の予防又は治療方法であってもよく、任意選択で前記疾患は前記目的の遺伝子座の欠陥によって引き起こされる。本発明の方法は個体においてインビボで行うか又は個体から採取した細胞上でエキソビボで行うことができ、任意選択で前記細胞は個体に戻される。
毒性及びオフターゲット効果を最小限に抑えるため、送達されるＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質ｍＲＮＡ及びガイドＲＮＡの濃度を制御することが重要となり得る。ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質ｍＲＮＡ及びガイドＲＮＡの最適濃度は、細胞モデル又は動物モデルにおける種々の濃度の試験、及びディープシーケンシングを用いた潜在的なオフターゲットゲノム遺伝子座における改変の程度の分析によって決定することができる。例えば、ヒトゲノムのＥＭＸ１遺伝子の５’－ＧＡＧＴＣＣＧＡＧＣＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡ－３’を標的化するガイド配列について、ディープシーケンシングを用いて以下の２つのオフターゲット遺伝子座における改変レベルを評価することができる、１：５’－ＧＡＧＴＣＣＴＡＧＣＡＧＧＡＧＡＡＧＡＡ－３’及び２：５’－ＧＡＧＴＣＴＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡ－３’。最も高いレベルのオンターゲット改変をもたらす一方でオフターゲット改変レベルを最小限に抑える濃度が、インビボ送達に選択されるべきである。
誘導性系
一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質は誘導性系の一成分を形成し得る。この系の誘導可能な性質により、エネルギーの形態を用いた遺伝子編集又は遺伝子発現の時空間的制御が可能となり得る。エネルギーの形態としては、限定はされないが、電磁放射線、音響エネルギー、化学エネルギー及び熱エネルギーを挙げることができる。誘導性系の例には、テトラサイクリン誘導性プロモーター（Ｔｅｔ－Ｏｎ又はＴｅｔ－Ｏｆｆ）、小分子２ハイブリッド転写活性化システム（ＦＫＢＰ、ＡＢＡ等）、又は光誘導性系（フィトクロム、ＬＯＶドメイン、又はクリプトクロム）が含まれる。一実施形態において、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質は、配列特異的に転写活性の変化を導く光誘導性転写エフェクター（ＬＩＴＥ）の一部であり得る。光の構成成分には、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質、光応答性シトクロムヘテロ二量体（例えばシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）由来）、及び転写活性化／抑制ドメインが含まれ得る。誘導性ＤＮＡ結合タンパク質及びその使用方法の更なる例は、米国仮特許出願第６１／７３６４６５号明細書及び米国仮特許出願第６１／７２１，２８３号明細書、及び国際公開第２０１４０１８４２３ Ａ２号パンフレット（本明細書によって全体として参照により援用される）に提供される。
ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ系の例示的使用方法
本発明は、標的細胞をインビボ、エキソビボ又はインビトロで改変するのに用いられる、天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物、又は前記組成物の構成成分をコードする１つ以上のポリヌクレオチド、又は前記組成物の構成成分をコードする１つ以上のポリヌクレオチドを含むベクター又は送達系を提供し、及び、改変後はＣＲＩＳＰＲにより改変された細胞の子孫又は細胞株が変化した表現型を保持するように細胞を変化させる方法で行われ得る。改変された細胞及び子孫は、ＣＲＩＳＰＲ系が所望の細胞型にエキソビボ又はインビボ適用された植物又は動物などの多細胞生物の一部であり得る。本ＣＲＩＳＰＲ発明は、療法的治療方法であり得る。療法的治療方法には、遺伝子又はゲノム編集、又は遺伝子療法が含まれ得る。
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系又は複合体による標的の改変（例えば、Ｃ２ｃ２－ＲＮＡ複合体）
一態様において、本発明は、真核細胞内の標的ポリヌクレオチドを改変する方法を提供し、これはインビボ、エキソビボ又はインビトロであってもよい。一部の実施形態において、本方法は、ヒト又は非ヒト動物から細胞又は細胞集団を試料採取するステップ、及び１つ又は複数の細胞を改変するステップを含む。培養は任意の段階でエキソビボで行われ得る。この１つ又は複数の細胞が、更には非ヒト動物又は植物に再導入されてもよい。再導入される細胞について、細胞は幹細胞であることが特に好ましい。
一部の実施形態において、本方法は、ＣＲＩＳＰＲ複合体を標的ポリヌクレオチドに結合させて前記標的ポリヌクレオチドの切断を生じさせ、それにより標的ポリヌクレオチドを改変するステップを含み、ここでＣＲＩＳＰＲ複合体は、前記標的ポリヌクレオチド内の標的配列にハイブリダイズする又はそれにハイブリダイズ可能なガイド配列と複合体を形成したＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質を含む。
一態様において、本発明は、真核細胞内のポリヌクレオチドの発現を改変する方法を提供する。一部の実施形態において、本方法は、ＣＲＩＳＰＲ複合体をポリヌクレオチドに結合させて、前記結合により前記ポリヌクレオチドの発現の増加又は減少を生じさせるステップを含み；ここでＣＲＩＳＰＲ複合体は、前記ポリヌクレオチド内の標的配列にハイブリダイズする又はそれにハイブリダイズ可能なガイド配列と複合体を形成したＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質を含む。同様の考察及び条件が、標的ポリヌクレオチドを改変する方法にも上記のとおり適用される。実際上、これらの試料採取、培養及び再導入の選択肢は本発明の全態様に適用される。
実際、本発明の任意の態様において、ＣＲＩＳＰＲ複合体は、標的配列にハイブリダイズする又はそれにハイブリダイズ可能なガイド配列と複合体を形成したＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質を含むことができる。同様の考察及び条件が、標的ポリヌクレオチドを改変する方法にも上記のとおり適用される。
従って本明細書に記載される天然に存在しないＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質の任意のものにおいて少なくとも１つの改変を含み、それによってエフェクタータンパク質は、ある種の向上した能力を有する。詳細には、これらのエフェクタータンパク質のいずれも、ガイドＲＮＡとＣＲＩＳＰＲ複合体を形成可能である。かかる複合体の形成時、ガイドＲＮＡは標的ポリヌクレオチド配列に結合可能であり、エフェクタータンパク質は標的遺伝子座を改変可能である。加えて、ＣＲＩＳＰＲ複合体中のエフェクタータンパク質は、非改変酵素／エフェクタータンパク質と比較したとき１つ以上のオフターゲット遺伝子座を改変する能力が低下している。
加えて、本明細書に記載される改変ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質には、ＣＲＩＳＰＲ複合体において非改変酵素／エフェクタータンパク質と比較したとき１つ以上の標的遺伝子座を改変する能力が増加したエフェクタータンパク質が包含される。かかる機能は、１つ以上のオフターゲット遺伝子座を改変する能力の低下の上述の機能と別個に提供されてもよく、又はそれと組み合わせて提供されてもよい。任意のかかるエフェクタータンパク質が、１つ以上の会合した異種機能ドメインによって提供される任意の活性との組み合わせ、ヌクレアーゼ活性を低下させる任意の更なる突然変異など、本明細書に記載されるとおりのＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質に対する更なる改変のいずれかと共に提供されてもよい。
本発明の有利な実施形態において、非改変酵素／エフェクタータンパク質と比較したとき１つ以上のオフターゲット遺伝子座を改変する能力の低下及び非改変酵素／エフェクタータンパク質と比較したとき１つ以上の標的遺伝子座を改変する能力の増加を伴う改変ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質が提供される。エフェクタータンパク質に対する更なる改変との組み合わせで、特異性の大幅な増強が実現し得る。例えば、かかる有利な実施形態と１つ以上の追加の突然変異の組み合わせが提供され、ここで１つ以上の追加の突然変異は１つ以上の触媒活性ドメインにある。かかるエフェクタータンパク質では、エフェクタータンパク質活性の点で特異性が改善されるため、特異性の増強が実現し得る。
本明細書に記載されるとおりの改変ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質にエンジニアリングし得る更なる機能としては、以下が挙げられる。１．タンパク質三次又は二次構造に影響を及ぼすことなくＲＮＡ：タンパク質相互作用を破壊する改変ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質。これには、ＲＮＡ：ＲＮＡ二重鎖の任意の部分と接触する残基が含まれる。２．Ｃ２ｃ２をＲＮＡ結合（オン又はオフターゲット）に応答したヌクレアーゼ切断に必須のコンホメーションに保持するタンパク質間相互作用を弱める改変ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質。例えば：ＨＮＨドメイン（切れ易いリン酸に位置する）のヌクレアーゼコンホメーションを軽度に阻害するものの、なおも許容する改変。３．Ｃ２ｃ２をＲＮＡ結合（オン又はオフターゲット）に応答してヌクレアーゼ活性を阻害するコンホメーションに保持するタンパク質間相互作用を強める改変ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質。例えば：ＨＮＨドメインを切れ易いリン酸から遠ざけるコンホメーションで安定化させる改変。任意のかかる追加的な機能増強が、本明細書の他の部分で詳細に記載されるとおりのＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質に対する任意の他の改変と組み合わせて提供されてもよい。
本明細書に記載される向上した機能のいずれも、Ｃ２ｃ２エフェクタータンパク質など、任意のＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質に加えることができる。しかしながら、本明細書に記載される機能のいずれも、複数のオルソログからの断片を含むキメラエフェクタータンパク質を含め、他のオルソログからのＣ２ｃ２エフェクタータンパク質にエンジニアリングし得ることが理解されるであろう。
本発明は核酸を使用して標的ＤＮＡ配列を結合する。核酸はタンパク質と比べて作製するのがはるかに容易で安価であり、且つ相同性が求められるストレッチの長さに応じて特異性を変化させることができるため、これは有利である。例えば、複数のフィンガーを複雑に三次元配置させる必要はない。用語「ポリヌクレオチド」、「ヌクレオチド」、「ヌクレオチド配列」、「核酸」、及び「オリゴヌクレオチド」は同義的に使用される。これらの用語は、デオキシリボヌクレオチドであれ又はリボヌクレオチドであれ、任意の長さのポリマー形態のヌクレオチド、又はその類似体を指す。ポリヌクレオチドは任意の三次元構造を有することができ、既知又は未知の任意の機能を果たし得る。以下は、ポリヌクレオチドの非限定的な例である：遺伝子又は遺伝子断片のコード領域又は非コード領域、連鎖解析によって定義される複数の遺伝子座（１つの遺伝子座）、エクソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分枝状ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離ＤＮＡ、任意の配列の単離ＲＮＡ、核酸プローブ、及びプライマー。この用語はまた、合成骨格を有する核酸様構造も包含し、例えば、Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，１９９１；Ｂａｓｅｒｇａ ｅｔ ａｌ．，１９９２；Ｍｉｌｌｉｇａｎ，１９９３；国際公開第９７／０３２１１号パンフレット；国際公開第９６／３９１５４号パンフレット；Ｍａｔａ，１９９７；Ｓｔｒａｕｓｓ－Ｓｏｕｋｕｐ，１９９７；及びＳａｍｓｔａｇ，１９９６を参照のこと。ポリヌクレオチドは、１つ以上の改変ヌクレオチド、例えばメチル化ヌクレオチド及びヌクレオチド類似体を含み得る。存在する場合、ヌクレオチド構造の改変はポリマーをアセンブルする前又はその後に付与することができる。ヌクレオチドの配列は非ヌクレオチド構成成分で中断されていてもよい。ポリヌクレオチドは、重合後に、標識構成成分とのコンジュゲーションによるなどして更に改変されてもよい。本明細書で使用されるとき、用語「野生型」は、当業者によって理解される当該技術分野の用語であり、突然変異体又は変異体形態とは区別されるものとして天然に存在するとおりの、典型的な形態の生物、菌株、遺伝子、又は特徴を意味する。「野生型」はベースラインであり得る。本明細書で使用されるとき、用語「変異体」は、天然に存在するものから逸脱したパターンを有する質の呈示を意味するものと解釈されなければならない。用語「天然に存在しない」又は「エンジニアリングされた」は同義的に使用され、人間の手が加えられていることを示す。この用語は、核酸分子又はポリペプチドに言及するとき、核酸分子又はポリペプチドが、自然中ではそれと天然に結び付いている、且つ自然中に見られるとおりの少なくとも１つの他の構成成分を少なくとも実質的に含まないことを意味する「相補性」は、従来のワトソン・クリック塩基対合又は他の非従来型の対合のいずれかによって核酸が別の核酸配列と１つ又は複数の水素結合を形成する能力を指す。「相補性」は、従来のワトソン・クリック塩基対合又は他の非従来型のいずれかによって核酸が別の核酸配列と１つ又は複数の水素結合を形成する能力を指す。パーセント相補性は、核酸分子中で第２の核酸配列と水素結合を形成（例えばワトソン・クリック塩基対合）することのできる残基のパーセンテージを示す（例えば、１０個のうち５、６、７、８、９、１０個は、それぞれ、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％の相補性である）。「完全に相補的」とは、核酸配列の全ての連続する残基が第２の核酸配列中の同じ数の連続する残基と水素結合することを意味する。「実質的に相補的」は、本明細書で使用されるとき、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０ヌクレオチド、又はそれ以上の領域にわたって少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、又は１００％である相補性の程度を指し、又はストリンジェントな条件下でハイブリダイズする２つの核酸を指す。本明細書で使用されるとき、ハイブリダイゼーションの「ストリンジェントな条件」とは、標的配列と相補性を有する核酸が標的配列に優先的にハイブリダイズし、且つ非標的配列とは実質的にハイブリダイズしない条件を指す。ストリンジェントな条件は概して配列依存性であり、幾つもの要因に応じて異なる。一般に、配列が長いほど、配列がその標的配列に特異的にハイブリダイズする温度が高くなる。ストリンジェントな条件の非限定的な例が、Ｔｉｊｓｓｅｎ（１９９３），Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ Ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ－Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｂｅｓ Ｐａｒｔ Ｉ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｃｈａｐｔｅｒ “Ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｐｒｏｂｅ ａｓｓａｙ”，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．に詳述されている。ポリヌクレオチド配列に言及する場合、相補配列又は部分的相補配列も想定される。これらは、好ましくは、高度にストリンジェントな条件下で参照配列とハイブリダイズ可能なものである。概して、ハイブリダイゼーション速度を最大にするには、比較的低いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件（熱融点（Ｔｍ）より約２０～２５℃低い）が選択される。Ｔｍは、特定の標的配列の５０％が規定のイオン強度及びｐＨの溶液中で完全に相補的なプローブにハイブリダイズする温度である。概して、ハイブリダイズした配列の少なくとも約８５％のヌクレオチド相補性を要求する場合、Ｔｍより約５～１５℃低くなるよう高度にストリンジェントな洗浄条件が選択される。ハイブリダイズした配列の少なくとも約７０％のヌクレオチド相補性を要求する場合、Ｔｍより約１５～３０℃低くなるよう中程度にストリンジェントな洗浄条件が選択される。高度に許容的な（極めて低いストリンジェンシーの）洗浄条件はＴｍより５０℃も低いものであってよく、ハイブリダイズした配列間に高レベルのミスマッチが許容される。当業者は、ハイブリダイゼーション段階及び洗浄段階における他の物理的及び化学的パラメーターもまた、標的配列とプローブ配列との間の特定の相同性レベルからの検出可能なハイブリダイゼーションシグナルの結果に影響を与えるよう変更し得ることを認識するであろう。好ましい高度にストリンジェントな条件は、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、及び１％ ＳＤＳ中４２℃でのインキュベーション、又は５×ＳＳＣ及び１％ ＳＤＳ中６５℃でのインキュベーションと、０．２×ＳＳＣ及び０．１％ ＳＤＳ中６５℃での洗浄を含む。「ハイブリダイゼーション」とは、１つ以上のポリヌクレオチドが反応することによりヌクレオチド残基の塩基間の水素結合によって安定した複合体を形成する反応を指す。水素結合は、ワトソン・クリック塩基対合、フーグステイン（Ｈｏｏｇｓｔｅｉｎ）結合によるか、又は任意の他の配列特異的様式で起こり得る。複合体には、二重鎖構造を形成する２本の鎖、多重鎖複合体を形成する３本以上の鎖、単一の自己ハイブリダイズ鎖、又はこれらの任意の組み合わせが含まれ得る。ハイブリダイゼーション反応は、ＰＣＲの開始、又は酵素によるポリヌクレオチドの切断など、より大規模なプロセスで一ステップを構成し得る。所与の配列とハイブリダイズ可能な配列は、その所与の配列の「相補体」と称される。本明細書で使用されるとき、用語「ゲノム遺伝子座（ｇｅｎｏｍｉｃ ｌｏｃｕｓ）」又は「遺伝子座（ｌｏｃｕｓ）」（複数形ｌｏｃｉ）は、染色体上の遺伝子又はＤＮＡ配列の特定の位置である。「遺伝子」は、ポリペプチドをコードする一続きのＤＮＡ若しくはＲＮＡ、又は生物において機能的役割を果たし、従って生体における分子的遺伝単位であるＲＮＡ鎖を指す。本発明の目的上、遺伝子は、遺伝子産物の産生を調節する領域を含むと（かかる調節配列がコード配列及び／又は転写配列に隣接しているか否かに関わらず）見なし得る。従って、遺伝子には、必ずしも限定されないが、プロモーター配列、ターミネーター、リボソーム結合部位及び配列内リボソーム進入部位などの翻訳調節配列、エンハンサー、サイレンサー、インスレーター、境界エレメント、複製起点、マトリックス付着部位及び遺伝子座制御領域が含まれる。本明細書で使用されるとき、「ゲノム遺伝子座の発現」又は「遺伝子発現」は、機能的遺伝子産物の合成に遺伝子からの情報が用いられる過程である。遺伝子発現の産物は、多くの場合にタンパク質であるが、ｒＲＮＡ遺伝子又はｔＲＮＡ遺伝子などの非タンパク質コード遺伝子では、産物は機能性ＲＮＡである。遺伝子発現の過程は、あらゆる既知の生命－真核生物（多細胞生物を含む）、原核生物（細菌及び古細菌）、及びウイルスによって生存のための機能性産物の産生に用いられている。本明細書で使用されるとき、遺伝子又は核酸の「発現」には、細胞遺伝子発現のみならず、クローニング系及び任意の他のコンテクストにおける１つ又は複数の核酸の転写及び翻訳もまた包含される。本明細書で使用されるとき、「発現」はまた、ポリヌクレオチドがＤＮＡ鋳型から（ｍＲＮＡ又は他のＲＮＡ転写物などに）転写される過程及び／又は転写されたｍＲＮＡが続いてペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質に翻訳される過程も指す。転写物及びコードされたポリペプチドは、まとめて「遺伝子産物」と称される。ポリヌクレオチドがゲノムＤＮＡに由来する場合、発現には真核細胞におけるｍＲＮＡのスプライシングが含まれ得る。用語「ポリペプチド」、「ペプチド」及び「タンパク質」は、本明細書では、任意の長さのアミノ酸のポリマーを指して同義的に使用される。ポリマーは線状又は分枝状であってよく、それは修飾アミノ酸を含んでもよく、及びそれは非アミノ酸が割り込んでいてもよい。これらの用語はまた、改変されているアミノ酸ポリマー（例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、又はその他任意の、標識成分とのコンジュゲーションなどの操作）も包含する。本明細書で使用されるとき、用語「アミノ酸」には、グリシン及びＤ又はＬの両方の光学異性体、及びアミノ酸類似体及びペプチド模倣体を含め、天然及び／又は非天然又は合成のアミノ酸が含まれる。本明細書で使用されるとき、用語「ドメイン」又は「タンパク質ドメイン」は、タンパク質配列のうち残りのタンパク質鎖と独立に存在し及び機能し得る一部分を指す。本発明の態様に記載されるとおり、配列同一性は配列相同性と関係する。相同性比較は目測で行われてもよく、又はより通例では、容易に利用可能な配列比較プログラムの助けを借りて行われてもよい。これらの市販のコンピュータプログラムは、２つ以上の配列間のパーセント（％）相同性を計算することができ、また２つ以上のアミノ酸配列又は核酸配列が共有する配列同一性も計算することができる。
本発明の態様において、用語「ガイドＲＮＡ」は、推定上の又は同定されたｔｒａｃｒ配列及び推定上の又は同定されたｃｒＲＮＡ配列又はガイド配列のうちの１つ以上を含むポリヌクレオチド配列を指す。詳細な実施形態では、「ガイドＲＮＡ」は、推定上の又は同定されたｃｒＲＮＡ配列又はガイド配列を含む。更なる実施形態において、ガイドＲＮＡは推定上の又は同定されたｔｒａｃｒ配列を含まない。
本明細書で使用されるとき、用語「野生型」は、当業者によって理解される当該技術分野の用語であり、突然変異体又は変異体の形態とは区別されるものとして天然に存在するとおりの、典型的な形態の生物、菌株、遺伝子、又は特徴を意味する。「野生型」はベースラインであり得る。
本明細書で使用されるとき、用語「変異体」は、天然に存在するものから逸脱したパターンを有する質の呈示を意味するものと解釈されなければならない。
用語「天然に存在しない」又は「エンジニアリングされた」は同義的に使用され、人間の手が加えられていることを示す。この用語は、核酸分子又はポリペプチドに言及しているとき、核酸分子又はポリペプチドが、自然中ではそれと天然に結び付いている、且つ自然中に見られるとおりの少なくとも１つの他の構成成分を少なくとも実質的に含まないことを意味する。これらの用語を含むか否かに関わらず、あらゆる態様及び実施形態において、好ましくはｔｈｅは任意選択であってよく、従って好ましくは含まれ、又は含まれないことは好ましくないことは理解されるであろう。更に、用語「天然に存在しない」及び「エンジニアリングされた」は同義的に用いられてもよく、そのため、従って単独で又は組み合わせで用いることができ、いずれか一方を両方とも併せた記述に置き換えてもよい。詳細には、「天然に存在しない」又は「天然に存在しない及び／又はエンジニアリングされた」の代わりに「エンジニアリングされた」が好ましい。
配列相同性は、当該技術分野において公知の幾つものコンピュータプログラムのいずれか、例えばＢＬＡＳＴ又はＦＡＳＴＡなどによって求めることができる。かかるアラインメントの実施に好適なコンピュータプログラムは、ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｂｅｓｔｆｉｔパッケージ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，Ｕ．Ｓ．Ａ；Ｄｅｖｅｒｅｕｘ ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １２：３８７）である。配列の比較を行うことができる他のソフトウェアの例としては、限定はされないが、ＢＬＡＳＴパッケージ（Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９９９ 前掲－Ｃｈａｐｔｅｒ １８を参照）、ＦＡＳＴＡ（Ａｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４０３－４１０）、及び比較ツールのＧＥＮＥＷＯＲＫＳスイートが挙げられる。ＢＬＡＳＴ及びＦＡＳＴＡは、いずれもオフライン及びオンライン検索が利用可能である（Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９９９ 前掲，７－５８～７－６０頁を参照）。しかしながら、ＧＣＧ Ｂｅｓｔｆｉｔプログラムを使用することが好ましい。パーセンテージ（％）配列相同性は連続配列に関して計算されてもよく、即ち、一方の配列を他方の配列とアラインメントして、一方の配列の各アミノ酸又はヌクレオチドが他方の配列の対応するアミノ酸又はヌクレオチドと１残基ずつ直接比較される。これは「ギャップなし」アラインメントと呼ばれる。かかるギャップなしアラインメントは比較的少数の残基にのみ行われる。これは極めて単純で一貫した方法であるが、例えば、本来は同一の配列ペアにおいて、一つの挿入又は欠失があるために以降のアミノ酸残基がアラインメントから外れる点を考慮に入れることができず、従って大域的アラインメントを行うと潜在的に％相同性が大きく低下し得る。結果的に、ほとんどの配列比較法は、全体的な相同性又は同一性スコアに過度のペナルティーを与えることなく、可能性のある挿入又は欠失を考慮に入れる最適アラインメントを生成するように設計される。これは、局所的な相同性又は同一性を最大化しようと配列アラインメントに「ギャップ」を挿入することによって達成される。しかしながら、これらの複雑性の高い方法は、アラインメント内に出現する各ギャップに「ギャップペナルティー」を割り当てるため、同数の同一アミノ酸について、ギャップが可能な限り少ない配列アラインメント（２つの比較される配列間の高い関連性を反映する）の方が、ギャップの多い配列よりも高いスコアを達成し得る。典型的には、あるギャップの存在に比較的高いコストを課し、且つそのギャップにおけるそれぞれの後続残基のペナルティーを小さくする「アフィニティギャップコスト（Ａｆｆｉｎｉｔｙ ｇａｐ ｃｏｓｔｓ）」が用いられる。これが、最も一般的に用いられているギャップスコアリングシステムである。高いギャップペナルティーは、当然ながらギャップがより少ない最適化されたアラインメントを生成し得る。多くのアラインメントプログラムで、ギャップペナルティーを変更することが可能である。しかしながら、配列比較にかかるソフトウェアを使用する場合、デフォルト値を使用することが好ましい。例えば、ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｂｅｓｔｆｉｔパッケージを使用する場合、アミノ酸配列のデフォルトのギャップペナルティーは、ギャップが－１２で各伸長が－４である。従って、最大％相同性の計算には、初めにギャップペナルティーを考慮して最適アラインメントを生成する必要がある。かかるアラインメントの実行に好適なコンピュータプログラムは、ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｂｅｓｔｆｉｔパッケージ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ ｅｔ ａｌ．，１９８４ Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １２ ｐ３８７）である。配列の比較を行うことができる他のソフトウェアの例としては、限定はされないが、ＢＬＡＳＴパッケージ（Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９９９ Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，４ｔｈ Ｅｄ．－Ｃｈａｐｔｅｒ １８を参照）、ＦＡＳＴＡ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，１９９０ Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４０３－４１０）、及び比較ツールのＧＥＮＥＷＯＲＫＳスイートが挙げられる。ＢＬＡＳＴ及びＦＡＳＴＡは、いずれもオフライン及びオンライン検索が利用可能である（Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，７－５８～７－６０頁を参照）。しかしながら、一部の適用には、ＧＣＧ Ｂｅｓｔｆｉｔプログラムを使用することが好ましい。ＢＬＡＳＴ ２ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓと呼ばれる新規ツールもまた、タンパク質及びヌクレオチド配列の比較に利用可能である（ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔ．１９９９ １７４（２）：２４７－５０；ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔ．１９９９ １７７（１）：１８７－８及び米国国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｆｏｒ Ｈｅａｌｔｈ）のウェブサイトにある国立バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）のウェブサイトを参照）。最終的な％相同性は同一性の点で計測され得るが、アラインメント過程それ自体は、典型的にはオール・オア・ナッシングのペア比較に基づくわけではない。代わりに、化学的類似性又は進化距離に基づき各ペアワイズ比較にスコアを割り当てるスケーリング型類似性スコア行列が概して用いられる。一般的に用いられるかかる行列の例は、ＢＬＯＳＵＭ６２行列－ＢＬＡＳＴプログラムスイートのデフォルト行列－である。ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎプログラムは、概して公式のデフォルト値か、又は供給がある場合にはカスタムの記号比較テーブルかのいずれかを使用する（更なる詳細についてはユーザマニュアルを参照）。適用によっては、ＧＣＧパッケージについて公式のデフォルト値を使用し、又は他のソフトウェアの場合、ＢＬＯＳＵＭ６２などのデフォルト行列を使用することが好ましい。或いは、パーセンテージ相同性は、ＣＬＵＳＴＡＬ（Ｈｉｇｇｉｎｓ ＤＧ ＆ Ｓｈａｒｐ ＰＭ（１９８８），Ｇｅｎｅ ７３（１），２３７－２４４）と同様のアルゴリズムに基づくＤＮＡＳＩＳ（商標）（Ｈｉｔａｃｈｉ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）の多重アラインメント機能を用いて計算してもよい。ソフトウェアが最適アラインメントを生成すると、％相同性、好ましくは％配列同一性を計算することが可能になる。ソフトウェアは、典型的には配列比較の一部としてこれを行い、数値的な結果を出す。配列はまた、サイレントな変化を生じて機能的に等価な物質をもたらすようなアミノ酸残基の欠失、挿入又は置換も有し得る。アミノ酸特性（残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性、及び／又は両親媒性の性質など）の類似性に基づき計画的なアミノ酸置換が作製されてもよく、従ってアミノ酸を機能的なグループにまとめることが有用である。アミノ酸は、その側鎖の特性のみに基づきまとめてもよい。しかしながら、突然変異データも同様に含めることが更に有用である。このように得られた一組のアミノ酸は、構造上の理由から保存されているものと思われる。これらの組はベン図の形式で記述することができる（Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ Ｃ．Ｄ．ａｎｄ Ｂａｒｔｏｎ Ｇ．Ｊ．（１９９３）「タンパク質配列アラインメント：残基保存の階層分析戦略（Ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ：ａ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｆｏｒ ｔｈｅ ｈｉｅｒａｒｃｈｉｃａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｒｅｓｉｄｕｅ ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎ）」Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．９：７４５－７５６）（Ｔａｙｌｏｒ Ｗ．Ｒ．（１９８６）「アミノ酸保存の分類（Ｔｈｅ ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎ）」Ｊ．Ｔｈｅｏｒ．Ｂｉｏｌ．１１９；２０５－２１８）。保存的置換は、例えば、一般に認められているベン図によるアミノ酸分類を記載する下記の表に従い作製し得る。
Figure 2023134453000003
用語「対象」、「個体」、及び「患者」は、本明細書では、脊椎動物、好ましくは哺乳類、より好ましくはヒトを指して同義的に使用される。哺乳類としては、限定はされないが、ネズミ科動物、サル類、ヒト、農業動物、競技動物、及びペットが挙げられる。インビボで得られたか又はインビトロで培養された生物学的実体の組織、細胞及びそれらの子孫もまた包含される。
用語「療法薬剤」、「療法的能力のある薬剤」又は「治療薬剤」は同義的に使用され、対象への投与時に何らかの有益な効果を付与する分子又は化合物を指す。有益な効果には、診断上の判断の実施可能性；疾患、症状、障害、又は病的状態の改善；疾患、症状、障害又は病態の発症の低減又は予防；及び疾患、症状、障害又は病的状態への一般的な対抗が含まれる。
本明細書で使用されるとき、「治療」又は「治療する」、又は「緩和する」又は「改善する」は同義的に使用される。これらの用語は、限定はされないが治療利益及び／又は予防利益を含めた有益な又は所望の結果を達成するための手法を指す。治療利益とは、治療下の１つ以上の疾患、病態、又は症状における任意の治療的に関連性のある向上又はそれに対する効果を意味する。予防的利益については、組成物は、特定の疾患、病態、又は症状を発症するリスクのある対象、又は疾患、病態、又は症状がまだ現れていないことがあり得るにしろ、疾患の生理学的症状の１つ以上を訴えている対象に投与され得る。
用語「有効量」又は「治療有効量」は、有益な又は所望の結果を生じさせるのに十分な薬剤の量を指す。治療有効量は、治療下の対象及び疾患状態、対象の体重及び年齢、疾患状態の重症度、投与方法などのうちの１つ以上に応じて異なり得るが、当業者はこれを容易に判断することができる。この用語はまた、本明細書に記載されるイメージング方法のいずれか１つによる検出用の画像を提供し得る用量にも適用される。具体的な用量は、詳細な選択の薬剤、従うべき投与レジメン、他の化合物と併用して投与されるかどうか、投与タイミング、イメージングする組織、及びそれが担持される物理的送達系のうちの１つ以上に応じて異なり得る。
本発明の実施では、特に指示されない限り、当該分野の技術の範囲内にある免疫学、生化学、化学、分子生物学、微生物学、細胞生物学、ゲノミクス及び組換えＤＮＡの従来技術を利用する。Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ，２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９）；ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．，（１９８７））；ｔｈｅ ｓｅｒｉｅｓ ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）：ＰＣＲ ２：Ａ ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ ＡＰＰＲＯＡＣＨ（Ｍ．Ｊ．ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ，Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ ａｎｄ Ｇ．Ｒ．Ｔａｙｌｏｒ ｅｄｓ．（１９９５））、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，ｅｄｓ．（１９８８）ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ，Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ，ａｎｄ ＡＮＩＭＡＬ ＣＥＬＬ ＣＵＬＴＵＲＥ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．（１９８７））を参照のこと。
本発明の幾つかの態様は、１つ以上のベクターを含むベクター系、又はベクターそれ自体に関する。ベクターは、原核細胞又は真核細胞でのＣＲＩＳＰＲ転写物（例えば、核酸転写物、タンパク質、又は酵素）の発現用に設計することができる。例えば、ＣＲＩＳＰＲ転写物は、細菌細胞、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、昆虫細胞（バキュロウイルス発現ベクターを使用）、酵母細胞、又は哺乳類細胞で発現させることができる。好適な宿主細胞については、Ｇｏｅｄｄｅｌ，ＧＥＮＥ ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ：ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９０）に詳述されている。或いは、組換え発現ベクターは、例えば、Ｔ７プロモーター調節配列及びＴ７ポリメラーゼを用いてインビトロで転写及び翻訳されてもよい。
本発明の実施形態は、起こり得る相同置換（置換（ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）及び置換（ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）は両方ともに、本明細書では既存のアミノ酸残基又はヌクレオチドと代替の残基又はヌクレオチドとの相互交換を意味して用いられる）、即ち、アミノ酸の場合に塩基性同士、酸性同士、極性同士等、同種のもの同士の置換を含み得る配列（ポリヌクレオチド又はポリペプチドの両方）を含む。非相同置換、即ち、あるクラスから別のクラスの残基への置換、或いは、オルニチン（以下、Ｚと称する）、ジアミノ酪酸オルニチン（以下、Ｂと称する）、ノルロイシンオルニチン（以下、Ｏと称する）、ピリイルアラニン、チエニルアラニン、ナフチルアラニン及びフェニルグリシンなどの非天然アミノ酸の取り込みが関わる置換もまた起こり得る。変異体アミノ酸配列は、グリシン又はβ－アラニン残基などのアミノ酸スペーサーに加え、メチル基、エチル基又はプロピル基などのアルキル基を含む配列の任意の２つのアミノ酸残基の間に挿入され得る好適なスペーサー基を含み得る。更に別の形態（これにはペプトイド形態の１つ以上のアミノ酸残基の存在が関わる）については、当業者は十分に理解し得る。誤解を避けるため、「ペプトイド形態」は、α－炭素置換基がα－炭素上ではなく、むしろ残基の窒素原子上にある変異体アミノ酸残基を指して使用される。ペプトイド形態のペプチドの調製方法は当該技術分野において公知である（例えばＳｉｍｏｎ ＲＪ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ（１９９２）８９（２０），９３６７－９３７１及びＨｏｒｗｅｌｌ ＤＣ，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（１９９５）１３（４），１３２－１３４）。
相同性モデリング：他のＣ２ｃ２オルソログにおける対応する残基は、Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１２（Ｎａｔｕｒｅ；４９０（７４２１）：５５６－６０）及びＣｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１５（ＰＬｏＳ Ｃｏｍｐｕｔ Ｂｉｏｌ；１１（５）：ｅ１００４２４８）の方法－ドメイン－モチーフ界面によって媒介される相互作用を予測する計算的タンパク質間相互作用（ＰＰＩ）方法によって同定することができる。構造に基づくＰＰＩ予測方法であるＰｒｅＰＰＩ（予測ＰＰＩ）は、ベイズ統計学の枠組みを用いて構造的エビデンスを非構造的エビデンスと組み合わせる。この方法は、クエリタンパク質のペアをとり、構造アラインメントを用いることにより、それらの実験的に決定された構造又は相同性モデルのいずれかに対応する構造表現を同定することを含む。構造アラインメントは、更に、大域的及び局所的幾何学関係を考慮することによって近く及び遠くの両方の隣接構造を同定するのに用いられる。構造表現の２つの隣接構造がタンパク質データバンクに報告されている複合体を形成する場合は常に、これが、これらの２つのクエリタンパク質間の相互作用をモデル化するための鋳型を定義付ける。複合体のモデルは、鋳型内の対応する隣接構造上の代表的な構造を重ね合わせることにより作成される。この手法は、Ｄｅｙ ｅｔ ａｌ．，２０１３（Ｐｒｏｔ Ｓｃｉ；２２：３５９－６６）に更に記載される。
本発明の目的上、増幅は、妥当なフィデリティで標的配列を複製する能力を有するプライマー及びポリメラーゼを用いる任意の方法を意味する。増幅は、天然又は組換えＤＮＡポリメラーゼ、例えば、ＴａｑＧｏｌｄ（商標）、Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＮＡポリメラーゼのクレノウ断片、及び逆転写酵素によって行われ得る。好ましい増幅方法はＰＣＲである。
特定の態様において、本発明はベクターに関する。本明細書で使用されるとき、「ベクター」は、ある実体を一つの環境から別の環境に移すことを可能にする又は促進するツールである。これは、別のＤＮＡセグメントが挿入されて挿入セグメントの複製をもたらし得るレプリコン、例えば、プラスミド、ファージ、又はコスミドである。概して、ベクターは適切な制御エレメントと会合しているとき複製能を有する。一般に、用語「ベクター」は、それに連結されている別の核酸を輸送することが可能な核酸分子を指す。ベクターとしては、限定はされないが、一本鎖、二本鎖、又は部分的二本鎖の核酸分子；１つ以上の遊離末端を含む、遊離末端のない（例えば環状の）核酸分子；ＤＮＡ、ＲＮＡ、又は両方を含む核酸分子；及び当該技術分野において公知の他の種類のポリヌクレオチドが挙げられる。ある種のベクターは「プラスミド」であり、これは、標準的な分子クローニング技術によるなどして追加のＤＮＡセグメントを挿入することのできる環状二本鎖ＤＮＡループを指す。別の種類のベクターはウイルスベクターであり、ここでベクターには、ウイルス（例えば、レトロウイルス、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス、複製欠損アデノウイルス、及びアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ））へのパッケージングのためのウイルス由来ＤＮＡ又はＲＮＡ配列が存在する。ウイルスベクターはまた、宿主細胞へのトランスフェクションのためのウイルスによって担持されるポリヌクレオチドも含む。特定のベクターは、それが導入される宿主細胞での自己複製能を有する（例えば、細菌性複製起点を有する細菌ベクター及びエピソーム哺乳類ベクター）。他のベクター（例えば非エピソーム哺乳類ベクター）は宿主細胞への導入時に宿主細胞のゲノムに組み込まれ、それにより宿主ゲノムと共に複製される。更に、特定のベクターは、それが作動可能に連結された遺伝子の発現を導くことが可能である。かかるベクターは、本明細書では「発現ベクター」と称される。組換えＤＮＡ技法において有用な一般的な発現ベクターは、プラスミドの形態であることが多い。
組換え発現ベクターは、宿主細胞における核酸の発現に好適な形態の本発明の核酸を含むことができ、これはつまり、組換え発現ベクターが、発現させる核酸配列に作動可能に連結された１つ以上の調節エレメント（これは、発現に用いられる宿主細胞に基づき選択されてもよい）を含むことを意味する。組換え発現ベクターの範囲内において、「作動可能に連結された」は、ヌクレオチド配列の（例えば、インビトロ転写／翻訳系における、又はベクターが宿主細胞に導入される場合に宿主細胞における）発現が可能となる形で目的のヌクレオチド配列が１つ又は複数の調節エレメントに連結されていることを意味するように意図される。組換え及びクローニング方法に関しては、２００４年９月２日に米国特許出願公開第２００４－０１７１１５６ Ａ１号明細書として公開された米国特許出願第１０／８１５，７３０号明細書（この内容は、本明細書において全体として参照により援用される）が挙げられる。
本発明の態様は、ガイドＲＮＡ及び野生型、改変若しくは突然変異ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質／酵素（例えばＣ２ｃ２）用のバイシストロニックベクターに関する。ガイドＲＮＡ及び野生型、改変若しくは突然変異ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質／酵素（例えばＣ２ｃ２）用のバイシストロニック発現ベクターが好ましい。概して、及び特に、この実施形態において野生型、改変又は突然変異ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質／酵素（例えばＣ２ｃ２）は好ましくはＣＢｈプロモーターによってドライブされる。ＲＮＡは、好ましくはＵ６プロモーターなどのＰｏｌ ＩＩＩプロモーターによってドライブされ得る。理想的にはこの２つが組み合わされる。
一部の実施形態において、ガイドＲＮＡ中のループが提供される。これは、ステムループ又はテトラループであり得る。ループは好ましくはＧＡＡＡであるが、この配列に限定されるものではなく、又は実際には、４ｂｐ長であることのみに限定されるものではない。実際には、ヘアピン構造における使用に好ましいループ形成配列は４ヌクレオチド長であり、最も好ましくは配列ＧＡＡＡを有する。しかしながら、代替的な配列であってよいとおり、より長い又は短いループ配列が使用され得る。配列は好ましくはヌクレオチドトリプレット（例えばＡＡＡ）、及び更なるヌクレオチド（例えばＣ又はＧ）を含む。ループ形成配列の例にはＣＡＡＡ及びＡＡＡＧが含まれる。
本明細書に開示される任意の方法の実施においては、限定なしに、マイクロインジェクション、電気穿孔、ソノポレーション、微粒子銃、リン酸カルシウム媒介性トランスフェクション、カチオン性トランスフェクション、リポソームトランスフェクション、デンドリマートランスフェクション、熱ショックトランスフェクション、ヌクレオフェクショントランスフェクション、マグネトフェクション、リポフェクション、インペイルフェクション（ｉｍｐａｌｅｆｅｃｔｉｏｎ）、光学的トランスフェクション、専売薬剤により増強される核酸取り込み、及びリポソーム、免疫リポソーム、ビロソーム、又は人工ビリオンを介した送達を含めた当該技術分野で公知の１つ以上の方法によって細胞又は胚に好適なベクターを導入することができる。一部の方法において、ベクターはマイクロインジェクションによって胚に導入される。１つ又は複数のベクターが胚の核又は細胞質に微量注入され得る。一部の方法において、１つ又は複数のベクターはヌクレオフェクションによって細胞に導入され得る。
用語「調節エレメント」には、プロモーター、エンハンサー、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）、及び他の発現制御エレメント（例えば、ポリアデニル化シグナル及びポリＵ配列などの転写終結シグナル）が含まれることが意図される。かかる調節エレメントについては、例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ，ＧＥＮＥ ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ：ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９０）に記載される。調節エレメントには、多くの種類の宿主細胞においてヌクレオチド配列の構成的発現を導くもの及び特定の宿主細胞においてのみヌクレオチド配列の発現を導くもの（例えば、組織特異的調節配列）が含まれる。組織特異的プロモーターは、主として、所望の目的組織、例えば、筋肉、ニューロン、骨、皮膚、血液、特定の臓器（例えば、肝臓、膵臓）、又は特定の細胞型（例えば、リンパ球）において発現を導き得る。調節エレメントはまた、細胞周期依存的又は発生段階依存的様式など、時間依存的様式で発現を導いてもよく、この発現もまた組織又は細胞型特異的であることも又はそうでないこともある。一部の実施形態において、ベクターは、１つ以上のｐｏｌ ＩＩＩプロモーター（例えば、１、２、３、４、５個、又はそれより多いｐｏｌ ＩＩＩプロモーター）、１つ以上のｐｏｌ ＩＩプロモーター（例えば、１、２、３、４、５個、又はそれより多いｐｏｌ ＩＩプロモーター）、１つ以上のｐｏｌ Ｉプロモーター（例えば、１、２、３、４、５個、又はそれより多いｐｏｌ Ｉプロモーター）、又はこれらの組み合わせを含む。ｐｏｌ ＩＩＩプロモーターの例としては、限定はされないが、Ｕ６及びＨ１プロモーターが挙げられる。ｐｏｌ ＩＩプロモーターの例としては、限定はされないが、レトロウイルスラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーター（任意選択でＲＳＶエンハンサーと共に）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター（任意選択でＣＭＶエンハンサーと共に）［例えば、Ｂｏｓｈａｒｔ ｅｔ ａｌ，Ｃｅｌｌ，４１：５２１－５３０（１９８５）を参照］、ＳＶ４０プロモーター、ジヒドロ葉酸レダクターゼプロモーター、β－アクチンプロモーター、ホスホグリセロールキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、及びＥＦ１αプロモーターが挙げられる。また、用語「調節エレメント」には、ＷＰＲＥなどのエンハンサーエレメント；ＣＭＶエンハンサー；ＨＴＬＶ－ＩのＬＴＲにおけるＲ－Ｕ５’セグメント（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，Ｖｏｌ．８（１），ｐ．４６６－４７２，１９８８）；ＳＶ４０エンハンサー；及びウサギβ－グロビンのエクソン２と３との間のイントロン配列（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，Ｖｏｌ．７８（３），ｐ．１５２７－３１，１９８１）も包含される。当業者によれば、発現ベクターの設計が、形質転換する宿主細胞の選択、所望の発現レベルなどの要因に依存し得ることが理解されるであろう。ベクターは宿主細胞に導入することができ、それにより、本明細書に記載されるとおりの核酸によってコードされる転写物、タンパク質、又はペプチドが、融合タンパク質又はペプチド（例えば、クラスター化した規則的な間隔の短いパリンドローム反復（ＣＲＩＳＰＲ）転写物、タンパク質、酵素、それらの突然変異型、それらの融合タンパク質等）を含め、産生され得る。調節配列に関しては、米国特許出願第１０／４９１，０２６号明細書（その内容は全体として参照により本明細書に援用される）が挙げられる。プロモーターに関しては、国際公開第２０１１／０２８９２９号パンフレット及び米国特許出願第１２／５１１，９４０号明細書（その内容は全体として参照により本明細書に援用される）が挙げられる。
ベクターは、原核細胞又は真核細胞でのＣＲＩＳＰＲ転写物（例えば、核酸転写物、タンパク質、又は酵素）の発現用に設計することができる。例えば、ＣＲＩＳＰＲ転写物は、細菌細胞、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、昆虫細胞（バキュロウイルス発現ベクターを使用）、酵母細胞、又は哺乳類細胞で発現させることができる。好適な宿主細胞については、Ｇｏｅｄｄｅｌ，ＧＥＮＥ ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ：ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９０）に詳しく考察されている。或いは、組換え発現ベクターは、例えば、Ｔ７プロモーター調節配列及びＴ７ポリメラーゼを用いてインビトロで転写及び翻訳されてもよい。
ベクターは、原核生物又は原核細胞に導入して増殖させてもよい。一部の実施形態において、真核細胞に導入するベクターのコピーを増幅させるため、又は真核細胞に導入するベクターの産生における中間ベクターとして（例えば、ウイルスベクターパッケージング系の一部としてプラスミドを増幅する）、原核生物が使用される。一部の実施形態において、原核生物を用いてベクターのコピーを増幅し、１つ以上の核酸を発現させて、それにより例えば宿主細胞又は宿主生物に送達するための１つ以上のタンパク質の供給源を提供する。原核生物でのタンパク質の発現は、多くの場合に、融合タンパク質又は非融合タンパク質のいずれかの発現を導く構成的プロモーター又は誘導プロモーターを含むベクターを用いて大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）で行われる。融合ベクターが、そこでコードされるタンパク質、例えば組換えタンパク質のアミノ末端に幾つものアミノ酸を付加する。かかる融合ベクターは、（ｉ）組換えタンパク質の発現の増加；（ｉｉ）組換えタンパク質の溶解度の増加；及び（ｉｉｉ）アフィニティー精製でリガンドとして作用することによる組換えタンパク質の精製の促進など、１つ以上の目的を果たし得る。多くの場合に、融合発現ベクターでは、融合タンパク質の精製後に組換えタンパク質を融合部分と分離することができるように、融合部分と組換えタンパク質との接合部にタンパク質分解切断部位が導入される。かかる酵素及びそのコグネイト認識配列には、第Ｘａ因子、トロンビン、及びエンテロキナーゼが含まれる。融合発現ベクターの例としては、ｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｃ；Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｊｏｈｎｓｏｎ，１９８８．Ｇｅｎｅ ６７：３１－４０）、ｐＭＡＬ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍａｓｓ．）、及びｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．）が挙げられ、これらはそれぞれ、グルタチオンＳ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトースＥ結合タンパク質、又はプロテインＡを標的組換えタンパク質に融合させる。
好適な誘導性非融合大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）発現ベクターの例としては、ｐＴｒｃ（Ａｍｒａｎｎ ｅｔ ａｌ．，（１９８８）Ｇｅｎｅ ６９：３０１－３１５）及びｐＥＴ １１ｄ（Ｓｔｕｄｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＧＥＮＥ ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ：ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９０）６０－８９）が挙げられる。
一部の実施形態において、ベクターは酵母発現ベクターである。酵母サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｉｖｉｓａｅ）における発現用のベクターの例としては、ｐＹｅｐＳｅｃ１（Ｂａｌｄａｒｉ，ｅｔ ａｌ．，１９８７．ＥＭＢＯ Ｊ．６：２２９－２３４）、ｐＭＦａ（Ｋｕｉｊａｎ ａｎｄ Ｈｅｒｓｋｏｗｉｔｚ，１９８２．Ｃｅｌｌ ３０：９３３－９４３）、ｐＪＲＹ８８（Ｓｃｈｕｌｔｚ ｅｔ ａｌ．，１９８７．Ｇｅｎｅ ５４：１１３－１２３）、ｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）、及びｐｉｃＺ（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）が挙げられる。
一部の実施形態において、ベクターは、バキュロウイルス発現ベクターを用いて昆虫細胞でのタンパク質発現をドライブする。培養昆虫細胞（例えば、ＳＦ９細胞）でのタンパク質の発現に利用可能なバキュロウイルスベクターとしては、ｐＡｃシリーズ（Ｓｍｉｔｈ，ｅｔ ａｌ．，１９８３．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３：２１５６－２１６５）及びｐＶＬシリーズ（Ｌｕｃｋｌｏｗ ａｎｄ Ｓｕｍｍｅｒｓ，１９８９．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １７０：３１－３９）が挙げられる。
一部の実施形態において、ベクターは、哺乳類発現ベクターを用いて哺乳類細胞での１つ以上の配列の発現をドライブする能力を有する。哺乳類発現ベクターの例としては、ｐＣＤＭ８（Ｓｅｅｄ，１９８７．Ｎａｔｕｒｅ ３２９：８４０）及びｐＭＴ２ＰＣ（Ｋａｕｆｍａｎ，ｅｔ ａｌ．，１９８７．ＥＭＢＯ Ｊ．６：１８７－１９５）が挙げられる。哺乳類細胞で使用される場合、発現ベクターの制御機能は、典型的には１つ以上の調節エレメントによって提供される。例えば、一般的に用いられるプロモーターは、ポリオーマ、アデノウイルス２、サイトメガロウイルス、シミアンウイルス４０、及び本明細書に開示される及び当該技術分野において公知の他のウイルスに由来する。原核細胞及び真核細胞の両方に好適な他の発現系については、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ．２ｎｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９のＣｈａｐｔｅｒｓ １６及び１７を参照のこと。
一部の実施形態において、組換え哺乳類発現ベクターは、特定の細胞型で優先的に核酸の発現を導くことが可能である（例えば、組織特異的調節エレメントが核酸の発現に使用される）。組織特異的調節エレメントは当該技術分野において公知である。好適な組織特異的プロモーターの非限定的な例としては、アルブミンプロモーター（肝臓特異的；Ｐｉｎｋｅｒｔ，ｅｔ ａｌ．，１９８７．Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１：２６８－２７７）、リンパ系特異的プロモーター（Ｃａｌａｍｅ ａｎｄ Ｅａｔｏｎ，１９８８．Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４３：２３５－２７５）、詳細にはＴ細胞受容体（Ｗｉｎｏｔｏ ａｎｄ Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，１９８９．ＥＭＢＯ Ｊ．８：７２９－７３３）及び免疫グロブリン（Ｂａｎｅｉｊｉ，ｅｔ ａｌ．，１９８３．Ｃｅｌｌ ３３：７２９－７４０；Ｑｕｅｅｎ ａｎｄ Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，１９８３．Ｃｅｌｌ ３３：７４１－７４８）のプロモーター、ニューロン特異的プロモーター（例えば、ニューロフィラメントプロモーター；Ｂｙｒｎｅ ａｎｄ Ｒｕｄｄｌｅ，１９８９．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：５４７３－５４７７）、膵臓特異的プロモーター（Ｅｄｌｕｎｄ，ｅｔ ａｌ．，１９８５．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３０：９１２－９１６）、及び乳腺特異的プロモーター（例えば、乳清プロモーター；米国特許第４，８７３，３１６号明細書、及び欧州特許出願公開第２６４，１６６号明細書）が挙げられる。発生的に調節されるプロモーター、例えば、マウスｈｏｘプロモーター（Ｋｅｓｓｅｌ ａｎｄ Ｇｒｕｓｓ，１９９０．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：３７４－３７９）及びαフェトプロテインプロモーター（Ｃａｍｐｅｓ ａｎｄ Ｔｉｌｇｈｍａｎ，１９８９．Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．３：５３７－５４６）もまた包含される。これらの原核生物及び真核生物ベクターに関しては、米国特許第６，７５０，０５９号明細書（その内容は全体として参照により本明細書に援用される）が挙げられる。本発明の他の実施形態はウイルスベクターの使用に関してもよく、それについては米国特許出願第１３／０９２，０８５号明細書（その内容は全体として参照により本明細書に援用される）が挙げられる。組織特異的調節エレメントは当該技術分野において公知であり、この点で、米国特許第７，７７６，３２１号明細書（その内容は全体として参照により本明細書に援用される）が挙げられる。
一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ系の１つ以上のエレメントの発現をドライブするため、ＣＲＩＳＰＲ系の１つ以上のエレメントに調節エレメントが作動可能に連結される。一般に、ＳＰＩＤＲ（ＳＰａｃｅｒ Ｉｎｔｅｒｓｐｅｒｓｅｄ Ｄｉｒｅｃｔ Ｒｅｐｅａｔ、スペーサー散在型ダイレクトリピート）としても知られるＣＲＩＳＰＲ（クラスター化した規則的な間隔の短いパリンドローム反復）は、通常特定の細菌種に特異的なＤＮＡ遺伝子座のファミリーを構成する。ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（Ｉｓｈｉｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１６９：５４２９－５４３３［１９８７］；及びＮａｋａｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７１：３５５３－３５５６ ［１９８９］）に認められた特徴的なクラスの散在型短鎖配列リピート（ＳＳＲ）、及び関連遺伝子を含む。同様の散在型ＳＳＲが、ハロフェラックス・メディテラネイ（Ｈａｌｏｆｅｒａｘ ｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｅｉ）、化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、アナベナ属（Ａｎａｂａｅｎａ）、及び結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）において同定されている（Ｇｒｏｅｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１０：１０５７－１０６５［１９９３］；Ｈｏｅ ｅｔ ａｌ．，Ｅｍｅｒｇ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．，５：２５４－２６３［１９９９］；Ｍａｓｅｐｏｈｌ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １３０７：２６－３０［１９９６］；及びＭｏｊｉｃａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１７：８５－９３［１９９５］を参照）。ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座は、典型的にはリピートの構造が他のＳＳＲと異なり、短い規則的な間隔のリピート（ＳＲＳＲ）と呼ばれている（Ｊａｎｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，ＯＭＩＣＳ Ｊ．Ｉｎｔｅｇ．Ｂｉｏｌ．，６：２３－３３［２００２］；及びＭｏｊｉｃａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，３６：２４４－２４６［２０００］）。一般に、このリピートは、実質的に一定長さのユニークな介在配列によって規則的な間隔が置かれたクラスター内に存在する短いエレメントである（Ｍｏｊｉｃａ ｅｔ ａｌ．，［２０００］、前掲）。リピート配列は株間で高度に保存されているが、散在するリピートの数及びスペーサー領域の配列は、典型的には株毎に異なる（ｖａｎ Ｅｍｂｄｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１８２：２３９３－２４０１［２０００］）。ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座は、限定はされないが、アエロピルム属（Ａｅｒｏｐｙｒｕｍ）、ピロバキュラム属（Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ）、スルホロブス属（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ）、アーケオグロブス属（Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ）、ハロアーキュラ属（Ｈａｌｏｃａｒｃｕｌａ）、メタノバクテリウム属（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、メタノコッカス属（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ）、メタノサルシナ属（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ）、メタノピュルス属（Ｍｅｔｈａｎｏナシ属（Ｐｙｒｕｓ））、パイロコッカス属（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）、ピクロフィルス属（Ｐｉｃｒｏｐｈｉｌｕｓ）、サーモプラズマ属（Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ）、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、マイコバクテリウム属（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、アクウィフェクス属（Ａｑｕｉｆｅｘ）、ポルフィロモナス属（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ）、クロロビウム属（Ｃｈｌｏｒｏｂｉｕｍ）、サーマス属（Ｔｈｅｒｍｕｓ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、リステリア属（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）、スタフィロコッカス属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、サーモアナエロバクター属（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、マイコプラズマ属（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）、フゾバクテリウム属（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、アゾアルカス属（Ａｚａｒｃｕｓ）、クロモバクテリウム属（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ナイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、ニトロソモナス属（Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ）、デスルホビブリオ属（Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ）、ジオバクター属（Ｇｅｏｂａｃｔｅｒ）、ミキソコッカス属（Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓ）、カンピロバクター属（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、ウォリネラ属（Ｗｏｌｉｎｅｌｌａ）、アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、エルウィニア属（Ｅｒｗｉｎｉａ）、大腸菌属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、レジオネラ属（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）、メチロコッカス属（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、パスツレラ属（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ）、フォトバクテリウム属（Ｐｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、ザントモナス属（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）、エルシニア属（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）、トレポネーマ属（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ）、及びサーモトガ属（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ）を含め、４０を超える原核生物において同定されている（例えば、Ｊａｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，４３：１５６５－１５７５ ［２００２］；及びＭｏｊｉｃａ ｅｔ ａｌ．，［２００５］を参照）。
一般に、「核酸ターゲティング系」は、本願で使用されるとき、まとめて、核酸ターゲティングＣａｓ（エフェクター）タンパク質及びガイドＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ配列及び転写活性化ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）配列を含む）をコードする配列又は他の配列及び核酸ターゲティングＣＲＩＳＰＲ遺伝子座からの転写物を含めた、核酸ターゲティングＣＲＩＳＰＲ関連（「Ｃａｓ」）遺伝子（本明細書ではエフェクタータンパク質とも称される）の発現又はその活性の誘導に関わる転写物及び他のエレメントを指す。一部の実施形態において、核酸ターゲティング系の１つ以上のエレメントがＶ型／ＶＩ型核酸ターゲティングＣＲＩＳＰＲ系に由来する。一部の実施形態において、核酸ターゲティング系の１つ以上のエレメントは、内因性核酸ターゲティングＣＲＩＳＰＲ系を含む特定の生物に由来する。一般に、核酸ターゲティング系は、標的配列の部位における核酸ターゲティング複合体の形成を促進するエレメントによって特徴付けられる。核酸ターゲティング複合体の形成の文脈では、「標的配列」は、ガイド配列がそれと相補性を有するように設計される配列を指し、ここで標的配列とガイドＲＮＡとの間のハイブリダイゼーションが、ＤＮＡ又はＲＮＡターゲティング複合体の形成を促進する。ハイブリダイゼーションを生じさせ且つ核酸ターゲティング複合体の形成を促進するのに十分な相補性があるならば、完全な相補性は必ずしも必要でない。標的配列はＲＮＡポリヌクレオチドを含み得る。一部の実施形態において、標的配列は細胞の核又は細胞質に位置する。一部の実施形態において、標的配列は真核細胞の細胞小器官内、例えばミトコンドリア又は葉緑体内にあってもよい。標的配列を含む標的遺伝子座への組換えに用いられ得る配列又は鋳型は、「編集用鋳型」又は「編集用ＲＮＡ」又は「編集用配列」と称される。本発明の態様では、外因性鋳型ＲＮＡが編集用鋳型と称され得る。本発明のある態様では、組換えは相同組換えである。
典型的には、内因性核酸ターゲティング系のコンテクストでは、核酸ターゲティング複合体（標的配列にハイブリダイズし、且つ１つ以上の核酸ターゲティングエフェクタータンパク質と複合体を形成したガイドＲＮＡを含む）が形成されると、標的配列にあるか又はその近傍（例えば、標的配列から１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、５０塩基対、又はそれ以上の範囲内）にある一方又は両方のＲＮＡ鎖の切断が生じる。一部の実施形態において、核酸ターゲティング系の１つ以上のエレメントの発現をドライブする１つ以上のベクターが宿主細胞に導入され、核酸ターゲティング系のエレメントが発現すると、１つ以上の標的部位において核酸ターゲティング複合体の形成が導かれる。例えば、核酸ターゲティングエフェクタータンパク質及びガイドＲＮＡが、各々別個のベクター上で別個の調節エレメントに作動可能に連結されてもよい。或いは、同じ又は異なる調節エレメントから発現するエレメントのうちの２つ以上が単一のベクターに組み合わされてもよく、１つ以上の追加のベクターが、第１のベクターに含まれない核酸ターゲティング系の任意の構成成分を提供する。単一のベクターに組み合わされる核酸ターゲティング系エレメントは、あるエレメントが第２のエレメントに対して５’側（その「上流」）に位置し、又はそれに対して３’側（その「下流」）に位置するなど、任意の好適な向きで配置されてもよい。あるエレメントのコード配列は第２のエレメントのコード配列と同じ鎖上又は逆鎖上に位置してもよく、同じ又は逆の方向に向いていてもよい。一部の実施形態において、単一のプロモーターが、１つ以上のイントロン配列内に組み込まれた（例えば、各々が異なるイントロンにあるか、２つ以上が少なくとも１つのイントロンにあるか、又は全てが単一のイントロンにある）核酸ターゲティングエフェクタータンパク質及びガイドＲＮＡをコードする転写物の発現をドライブする。一部の実施形態において、核酸ターゲティングエフェクタータンパク質とガイドＲＮＡとは同じプロモーターに作動可能に連結され、それから発現する。
一般に、ガイド配列は、標的配列とハイブリダイズして標的配列への核酸ターゲティング複合体の配列特異的結合を導くのに十分な標的ポリヌクレオチド配列との相補性を有する任意のポリヌクレオチド配列である。一部の実施形態において、ガイド配列とその対応する標的配列との間の相補性の程度は、好適なアラインメントアルゴリズムを用いて最適にアラインメントしたとき、約５０％、６０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７．５％、９９％以上であるか、又はそれより高い。最適アラインメントは、配列のアラインメントに好適な任意のアルゴリズムを用いて決定することができ、その非限定的な例としては、スミス－ウォーターマンアルゴリズム、ニードルマン－ブンシュアルゴリズム、バローズ・ホイーラー変換に基づくアルゴリズム（例えばバローズ－ホイーラーアライナー）、ＣｌｕｓｔａｌＷ、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｘ、ＢＬＡＴ、Ｎｏｖｏａｌｉｇｎ（Ｎｏｖｏｃｒａｆｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＥＬＡＮＤ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、ＳＯＡＰ（ｓｏａｐ．ｇｅｎｏｍｉｃｓ．ｏｒｇ．ｃｎにおいて利用可能）、及びＭａｑ（ｍａｑ．ｓｏｕｒｃｅｆｏｒｇｅ．ｎｅｔにおいて利用可能）が挙げられる。一部の実施形態において、ガイド配列は、約５、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、７５ヌクレオチド長以上であるか、又はそれより長い。一部の実施形態において、ガイド配列は、約７５、５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５、１２ヌクレオチド長未満か、又はそれより短い。ガイド配列が標的配列への核酸ターゲティング複合体の配列特異的結合を導く能力は、任意の好適なアッセイによって評価し得る。例えば、核酸ターゲティング複合体を形成するのに十分な核酸ターゲティング系の構成成分が、試験しようとするガイド配列を含め、対応する標的配列を有する宿主細胞へと、核酸ターゲティングＣＲＩＳＰＲ配列の構成成分をコードするベクターのトランスフェクションによるなどして提供されてもよく、続いて本明細書に記載されるとおりのＳｕｒｖｅｙｏｒアッセイなどにより、標的配列内又はその近傍における優先的な切断を評価し得る。同様に、標的ポリヌクレオチド配列（又はその近傍にある配列）の切断は、標的配列、試験しようとするガイド配列を含めた核酸ターゲティング複合体の構成成分、及び供試ガイド配列と異なる対照ガイド配列を提供して、それらの供試ガイド配列と対照ガイド配列との反応間で標的配列又はその近傍における結合又は切断速度を比較することにより、試験管内で判定することができる。他のアッセイも可能であり、当業者には想起されるであろう。
ガイド配列は、任意の標的配列を標的化するように選択することができる。一部の実施形態において、標的配列は、遺伝子転写物又はｍＲＮＡ内の配列である。
一部の実施形態において、標的配列は細胞のゲノム内の配列である。
一部の実施形態において、ガイド配列は、ガイド配列内の二次構造度が低下するように選択される。二次構造は、任意の好適なポリヌクレオチド折り畳みアルゴリズムによって決定することができる。一部のプログラムは最小ギブズ自由エネルギーの計算に基づく。かかる一つのアルゴリズムの例は、Ｚｕｋｅｒ ａｎｄ Ｓｔｉｅｇｌｅｒ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．９（１９８１），１３３－１４８）により記載されるとおりのｍＦｏｌｄである。別の例示的な折り畳みアルゴリズムは、ウィーン大学（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｖｉｅｎｎａ）のＩｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙにおいて開発された、セントロイド構造予測アルゴリズムを用いるオンラインウェブサーバーＲＮＡｆｏｌｄである（例えば、Ａ．Ｒ．Ｇｒｕｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００８，Ｃｅｌｌ １０６（１）：２３－２４；及びＰＡ Ｃａｒｒ ａｎｄ ＧＭ Ｃｈｕｒｃｈ，２００９，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２７（１２）：１１５１－６２を参照）。更なるアルゴリズムについて、米国出願第ＴＢＡ号（代理人整理番号４４７９０．１１．２０２２；Ｂｒｏａｄ参照番号ＢＩ－２０１３／００４Ａ）（参照により本明細書に援用される）を参照することができる。
一部の実施形態において、核酸ターゲティングエフェクタータンパク質は、１つ以上の異種タンパク質ドメイン（例えば核酸ターゲティングエフェクタータンパク質に加えて約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個以上、又はそれより多いドメイン）を含む融合タンパク質の一部である。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質／酵素は、１つ以上の異種タンパク質ドメイン（例えばＣＲＩＳＰＲ酵素に加えて約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個以上、又はそれより多いドメイン）を含む融合タンパク質の一部である。ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質／酵素融合タンパク質は、任意の追加的なタンパク質配列、及び任意選択で任意の２つのドメイン間のリンカー配列を含み得る。エフェクタータンパク質に融合させ得るタンパク質ドメインの例としては、限定なしに、エピトープタグ、レポーター遺伝子配列、及び以下の活性：メチラーゼ活性、デメチラーゼ活性、転写活性化活性、転写抑制活性、転写終結因子活性、ヒストン修飾活性、ＲＮＡ切断活性及び核酸結合活性のうちの１つ以上を有するタンパク質ドメインが挙げられる。エピトープタグの非限定的な例としては、ヒスチジン（Ｈｉｓ）タグ、Ｖ５タグ、ＦＬＡＧタグ、インフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）タグ、Ｍｙｃタグ、ＶＳＶ－Ｇタグ、及びチオレドキシン（Ｔｒｘ）タグが挙げられる。レポーター遺伝子の例としては、限定はされないが、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ） β－ガラクトシダーゼ、β－グルクロニダーゼ、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ＨｃＲｅｄ、ＤｓＲｅｄ、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、及び自己蛍光タンパク質、例えば青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）が挙げられる。核酸ターゲティングエフェクタータンパク質は、ＤＮＡ分子に結合するか、又は限定はされないが、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、Ｓタグ、Ｌｅｘ Ａ ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）融合物、ＧＡＬ４ ＤＮＡ結合ドメイン融合物、及び単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ＢＰ１６タンパク質融合物を含めた他の細胞分子に結合するタンパク質又はタンパク質の断片をコードする遺伝子配列と融合してもよい。核酸ターゲティングエフェクタータンパク質を含む融合タンパク質の一部を形成し得る追加的なドメインは、米国特許出願公開第２０１１００５９５０２号明細書（参照により本明細書に援用される）に記載されている。一部の実施形態では、タグ付加核酸ターゲティングエフェクタータンパク質を使用して標的配列の位置が同定される。
一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ酵素は誘導性系の一成分を形成し得る。この系の誘導可能な性質により、エネルギーの形態を用いた遺伝子編集又は遺伝子発現の時空間的制御が可能となり得る。エネルギーの形態としては、限定はされないが、電磁放射線、音響エネルギー、化学エネルギー及び熱エネルギーを挙げることができる。誘導性系の例には、テトラサイクリン誘導性プロモーター（Ｔｅｔ－Ｏｎ又はＴｅｔ－Ｏｆｆ）、小分子２ハイブリッド転写活性化システム（ＦＫＢＰ、ＡＢＡ等）、又は光誘導性系（フィトクロム、ＬＯＶドメイン、又はクリプトクロム）が含まれる。一実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、配列特異的に転写活性の変化を導く光誘導性転写エフェクター（ＬＩＴＥ）の一部であり得る。光の構成成分には、ＣＲＩＳＰＲ酵素、光応答性シトクロムヘテロ二量体（例えばシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）由来）、及び転写活性化／抑制ドメインが含まれ得る。誘導性ＤＮＡ結合タンパク質及びその使用方法の更なる例は、米国仮特許出願第６１／７３６４６５号明細書及び米国仮特許出願第６１／７２１，２８３号明細書及び国際公開第２０１４／０１８４２３号パンフレット及び米国特許第８８８９４１８号明細書、米国特許第８８９５３０８号明細書、米国特許出願公開第２０１４０１８６９１９号明細書、米国特許出願公開第２０１４０２４２７００号明細書、米国特許出願公開第２０１４０２７３２３４号明細書、米国特許出願公開第２０１４０３３５６２０号明細書、国際公開第２０１４０９３６３５号パンフレット（本明細書によって全体として参照により援用される）に提供される。
送達
一部の態様において、本発明は、１つ以上のポリヌクレオチド、例えば、又は本明細書に記載されるとおりの１つ以上のベクター、その１つ以上の転写物、及び／又はそれから転写されるもの又はタンパク質を、宿主細胞に送達するステップを含む方法を提供する。一部の態様において、本発明は、かかる方法によって作製される細胞、及びかかる細胞を含むか、又はそれから作製される生物（動物、植物、又は真菌類など）を更に提供する。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡと組み合わせた（及び任意選択でそれと複合体を形成した）核酸ターゲティングエフェクタータンパク質が細胞に送達される。哺乳類細胞又は標的組織における核酸の導入には、従来のウイルスベース及び非ウイルスベースの遺伝子導入方法を用いることができる。かかる方法を用いて、核酸ターゲティング系の構成成分をコードする核酸を培養下の細胞に、又は宿主生物中の細胞に投与することができる。非ウイルスベクター送達系には、ＤＮＡプラスミド、ＲＮＡ（例えば本明細書に記載されるベクターの転写物）、ネイキッド核酸、及び送達ビヒクルと複合体を形成した核酸、例えばリポソームが含まれる。ウイルスベクター送達系にはＤＮＡ及びＲＮＡウイルスが含まれ、これは細胞への送達後にエピソームゲノム又は組込みゲノムのいずれかを有する。遺伝子療法手順のレビューに関しては、Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６：８０８－８１３（１９９２）；Ｎａｂｅｌ ＆ Ｆｅｌｇｎｅｒ，ＴＩＢＴＥＣＨ １１：２１１－２１７（１９９３）；Ｍｉｔａｎｉ ＆ Ｃａｓｋｅｙ，ＴＩＢＴＥＣＨ １１：１６２－１６６（１９９３）；Ｄｉｌｌｏｎ，ＴＩＢＴＥＣＨ １１：１６７－１７５（１９９３）；Ｍｉｌｌｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ ３５７：４５５－４６０（１９９２）；Ｖａｎ Ｂｒｕｎｔ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６（１０）：１１４９－１１５４（１９８８）；Ｖｉｇｎｅ，Ｒｅｓｔｏｒａｔｉｖｅ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ８：３５－３６（１９９５）；Ｋｒｅｍｅｒ ＆ Ｐｅｒｒｉｃａｕｄｅｔ，Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ ５１（１）：３１－４４（１９９５）；Ｈａｄｄａｄａ ｅｔ ａｌ．，ｉｎ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｄｏｅｒｆｌｅｒ ａｎｄ Ｂｏｅｈｍ（ｅｄｓ）（１９９５）；及びＹｕ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １：１３－２６（１９９４）を参照のこと。
核酸の非ウイルス送達方法には、リポフェクション、ヌクレオフェクション、マイクロインジェクション、微粒子銃、ビロソーム、リポソーム、免疫リポソーム、ポリカチオン又は脂質：核酸コンジュゲート、ネイキッドＤＮＡ、人工ビリオン、及び薬剤で促進するＤＮＡ取込みが含まれる。リポフェクションは、例えば、米国特許第５，０４９，３８６号明細書、同第４，９４６，７８７号明細書；及び同第４，８９７，３５５号明細書に記載され）、及びリポフェクション試薬は市販されている（例えば、Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ（商標）及びＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（商標））。ポリヌクレオチドの効率的な受容体認識リポフェクションに好適なカチオン性及び中性脂質には、Ｆｅｌｇｎｅｒ、国際公開第９１／１７４２４号パンフレット；国際公開第９１／１６０２４号パンフレットのものが含まれる。送達は、細胞に対してであってもよく（例えばインビトロ又はエキソビボ投与）、又は標的組織に対してであってもよい（例えば生体内投与）。
脂質：核酸複合体の調製は、免疫脂質複合体などの標的リポソームを含め、当業者に周知されている（例えば、Ｃｒｙｓｔａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０：４０４－４１０（１９９５）；Ｂｌａｅｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２：２９１－２９７（１９９５）；Ｂｅｈｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．５：３８２－３８９（１９９４）；Ｒｅｍｙ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．５：６４７－６５４（１９９４）；Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２：７１０－７２２（１９９５）；Ａｈｍａｄ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５２：４８１７－４８２０（１９９２）；米国特許第４，１８６，１８３号明細書、同第４，２１７，３４４号明細書、同第４，２３５，８７１号明細書、同第４，２６１，９７５号明細書、同第４，４８５，０５４号明細書、同第４，５０１，７２８号明細書、同第４，７７４，０８５号明細書、同第４，８３７，０２８号明細書、及び同第４，９４６，７８７号明細書を参照）。
ＲＮＡ又はＤＮＡウイルスベースの系を使用した核酸の送達では、ウイルスを体内の特定の細胞に標的化してウイルスペイロードを核に輸送する高度に進化したプロセスが利用される。ウイルスベクターは患者に直接投与してもよく（インビボ）、又はインビトロでの細胞の処理に使用してもよく、任意選択でその改変細胞が患者に投与され得る（エキソビボ）。従来のウイルスベースの系は、遺伝子導入用にレトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴及び単純ヘルペスウイルスベクターを含み得る。レトロウイルス、レンチウイルス、及びアデノ随伴ウイルス遺伝子導入方法では宿主ゲノムにおける組込みが可能であり、多くの場合に挿入されたトランス遺伝子の長期発現がもたらされる。加えて、多くの異なる細胞型及び標的組織で高い形質導入効率が観察されている。
レトロウイルスの向性は外来性エンベロープタンパク質の取込みによって変えることができ、標的細胞の潜在的標的集団が拡大し得る。レンチウイルスベクターは、非分裂細胞を形質導入し、又は感染させることが可能な、且つ典型的には高いウイルス価を生じるレトロウイルスベクターである。従ってレトロウイルス遺伝子導入系の選択は、標的組織に依存し得る。レトロウイルスベクターは、６～１０ｋｂまでの外来配列のパッケージング能力を有するシス作用性長末端反復配列で構成される。ベクターの複製及びパッケージングには、最小のシス作用性ＬＴＲが十分であり、次にはこれを用いて治療遺伝子を標的細胞に組み込むと、永続的なトランス遺伝子発現がもたらされる。広く使用されているレトロウイルスベクターには、マウス白血病ウイルス（ＭｕＬＶ）、テナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、及びそれらの組み合わせをベースとするものが含まれる（例えば、Ｂｕｃｈｓｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６：２７３１－２７３９（１９９２）；Ｊｏｈａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６：１６３５－１６４０（１９９２）；Ｓｏｍｍｎｅｒｆｅｌｔ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌ．１７６：５８－５９（１９９０）；Ｗｉｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：２３７４－２３７８（１９８９）；Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６５：２２２０－２２２４（１９９１）；ＰＣＴ／ＵＳ９４／０５７００号明細書を参照）。一過的発現が好ましい適用には、アデノウイルスベースの系を使用することができる。アデノウイルスベースのベクターは、多くの細胞型で極めて高い形質導入効率を示すことができ、細胞分裂が不要である。このようなベクターで、高い力価及び発現レベルが得られている。このベクターは、比較的単純な系で大量に産生することができる。アデノ随伴ウイルス（「ＡＡＶ」）ベクターもまた、例えば、核酸及びペプチドのインビトロ産生において、並びにインビボ及びエキソビボ遺伝子療法手順のため、標的核酸による細胞の形質導入に使用することができる（例えば、Ｗｅｓｔ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １６０：３８－４７（１９８７）；米国特許第４，７９７，３６８号明細書；国際公開第９３／２４６４１号パンフレット；Ｋｏｔｉｎ，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ５：７９３－８０１（１９９４）；Ｍｕｚｙｃｚｋａ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９４：１３５１（１９９４）を参照のこと。組換えＡＡＶベクターの構築は、多数の刊行物、例として、米国特許第５，１７３，４１４号明細書；Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：３２５１－３２６０（１９８５）；Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４：２０７２－２０８１（１９８４）；Ｈｅｒｍｏｎａｔ ＆ Ｍｕｚｙｃｚｋａ，ＰＮＡＳ ８１：６４６６－６４７０（１９８４）；及びＳａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：０３８２２－３８２８（１９８９）に記載されている。
遺伝的及び後成的状態のモデル
本発明の方法を用いることにより、目的の突然変異のモデル又は疾患モデルによるなどの、目的の遺伝的又は後成的条件のモデル化及び／又は研究に使用し得る植物、動物又は細胞を作り出すことができる。本明細書で使用されるとき、「疾患」は、対象における疾患、障害、又は徴候を指す。例えば、本発明の方法を用いて、疾患に関連する１つ以上の核酸配列に改変を含む動物若しくは細胞、又は疾患に関連する１つ以上の核酸配列の発現が変化している植物、動物若しくは細胞を作り出すことができる。かかる核酸配列は疾患関連タンパク質配列をコードしてもよく、又は疾患関連制御配列であってもよい。従って、本発明の実施形態において植物、対象、患者、生物又は細胞は、非ヒトの対象、患者、生物又は細胞であり得ることが理解される。従って、本発明は、本方法により作製された植物、動物若しくは細胞、又はその子孫を提供する。子孫は、作製された植物又は動物のクローンであってもよく、又は更に望ましい形質をその子孫に遺伝子移入させるため同じ種の他の個体と交配させることによる有性生殖から生じてもよい。細胞は、多細胞生物、特に動物又は植物の場合にインビボ又はエキソビボであってよい。細胞が培養下にある例では、適切な培養条件が満たされる場合、且つ好ましくは細胞がこの目的に好適に適合する場合（例えば幹細胞）、細胞系が樹立され得る。本発明によって作製される細菌細胞系もまた想定される。ひいては細胞系もまた想定される。
一部の方法において、疾患モデルを使用することにより、疾患の研究で一般的に用いられる手段を用いて突然変異が動物又は細胞及び疾患の発症及び／又は進行に及ぼす効果を研究することができる。或いは、かかる疾患モデルは、薬学的に活性な化合物が疾患に及ぼす効果の研究に有用である。
一部の方法において、疾患モデルを使用して、見込みのある遺伝子治療戦略の有効性を評価することができる。即ち、疾患の発症及び／又は進行が阻害又は軽減されるように疾患関連遺伝子又はポリヌクレオチドを改変することができる。詳細には、本方法は、変化したタンパク質が産生され、結果として動物又は細胞が変化した反応を有するように疾患関連遺伝子又はポリヌクレオチドを改変することを含む。従って、一部の方法において、遺伝子治療イベントの効果を評価し得るように、遺伝子改変を受けた動物が、疾患を発症する素因のある動物と比較され得る。
別の実施形態において、本発明は、疾患遺伝子に関連する細胞シグナル伝達イベントを調節する生物学的に活性な薬剤を開発する方法を提供する。本方法は、ＣＲＩＳＰＲ酵素、及びダイレクトリピート配列に結合したガイド配列の１つ以上の発現をドライブする１つ以上のベクターを含む細胞に試験化合物を接触させるステップ；及び例えば細胞に含まれる疾患遺伝子の突然変異に関連する細胞シグナル伝達イベントの減少又は増加を示す読み取り値の変化を検出するステップを含む。
細胞機能の変化をスクリーニングするため本発明の方法と組み合わせて細胞モデル又は動物モデルを構築することができる。かかるモデルを使用して、本発明のＣＲＩＳＰＲ複合体により改変されたゲノム配列が目的の細胞機能に及ぼす効果を研究し得る。例えば、細胞機能モデルを使用して、改変ゲノム配列が細胞内シグナル伝達又は細胞外シグナル伝達に及ぼす効果を研究することができる。或いは、細胞機能モデルを使用して、改変ゲノム配列が感覚認知に及ぼす効果を研究することができる。一部のかかるモデルにおいては、モデルにおける生化学的シグナル伝達経路に関連する１つ以上のゲノム配列が改変される。
いくつかの疾患モデルが特に研究されている。それらには、デノボ自閉症リスク遺伝子ＣＨＤ８、ＫＡＴＮＡＬ２、及びＳＣＮ２Ａ；並びに症候性自閉症（アンジェルマン症候群）遺伝子ＵＢＥ３Ａが含まれる。これらの遺伝子及び得られる自閉症モデルは当然ながら好ましいが、遺伝子及び対応するモデル全体にわたる本発明の広範な適用性を明らかにすることに役立つ。
生化学的シグナル伝達経路に関連する１つ以上のゲノム配列の発現の変化は、候補薬剤に接触させたときの試験モデル細胞と対照細胞との間における対応する遺伝子のｍＲＮＡレベルの差をアッセイすることにより決定され得る。或いは、生化学的シグナル伝達経路に関連する配列の発現の差は、コードされたポリペプチド又は遺伝子産物のレベルの差を検出することにより決定される。
ｍＲＮＡ転写物又は対応するポリヌクレオチドのレベルの薬剤により引き起こされた変化をアッセイするため、初めに試料中に含まれる核酸が当該技術分野の標準方法に従い抽出される。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（１９８９）に示される手順に従い種々の溶菌酵素又は化学溶液を使用してｍＲＮＡを単離することができ、又は製造者により提供される付属の説明書に従い核酸結合樹脂で抽出することができる。抽出した核酸試料に含まれるｍＲＮＡは、次に当該技術分野において広く知られている方法に従うか又は本明細書に例示する方法に基づき、増幅手順又は従来のハイブリダイゼーションアッセイ（例えばノーザンブロット解析）により検出される。
本発明の目的上、増幅は、妥当なフィデリティで標的配列を複製する能力を有するプライマー及びポリメラーゼを用いる任意の方法を意味する。増幅は、天然又は組換えＤＮＡポリメラーゼ、例えば、ＴａｑＧｏｌｄ（商標）、Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＮＡポリメラーゼのクレノウ断片、及び逆転写酵素によって行われ得る。好ましい増幅方法はＰＣＲである。詳細には、単離されたＲＮＡが、生化学的シグナル伝達経路に関連する配列の発現レベルを定量化するため定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）と組み合わされた逆転写アッセイに供され得る。
遺伝子発現レベルの検出は、増幅アッセイ中にリアルタイムで行うことができる。一態様では、増幅産物が、蛍光ＤＮＡ結合剤、例えば限定はされないがＤＮＡインターカレート剤及びＤＮＡ溝結合剤で直接可視化され得る。二本鎖ＤＮＡ分子に組み込まれるインターカレート剤の量は、典型的には増幅されたＤＮＡ産物の量に比例するため、好都合には、当該技術分野における従来の光学的システムを使用してインターカレート色素の蛍光を定量化することにより、増幅産物の量を決定することができる。この適用に好適なＤＮＡ結合色素としては、ＳＹＢＲグリーン、ＳＹＢＲブルー、ＤＡＰＩ、プロピジウムヨウ素、Ｈｏｅｓｔｅ、ＳＹＢＲゴールド、臭化エチジウム、アクリジン、プロフラビン、アクリジンオレンジ、アクリフラビン、蛍光クマリン（ｆｌｕｏｒｃｏｕｍａｎｉｎ）、エリプチシン、ダウノマイシン、クロロキン、ジスタマイシンＤ、クロモマイシン、ホミジウム、ミトラマイシン、ルテニウムポリピリジル、アントラマイシンなどが挙げられる。
別の態様では、配列特異的プローブなどの他の蛍光標識を増幅反応に用いて増幅産物の検出及び定量化を促進し得る。プローブベースの定量的増幅は、所望の増幅産物の配列特異的検出に頼る。この増幅は、特異性及び感度の増加をもたらす蛍光性の標的特異的プローブ（例えば、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ）を利用する。プローブベースの定量的増幅を実施する方法は当該技術分野で十分に確立されており、米国特許第５，２１０，０１５号明細書に教示される。
更に別の態様では、生化学的シグナル伝達経路に関連する配列と配列相同性を共有するハイブリダイゼーションプローブを使用して従来のハイブリダイゼーションアッセイを実施し得る。典型的には、プローブは、被験対象から得られた生体試料内に含まれる生化学的シグナル伝達経路に関連する配列と安定した複合体をハイブリダイゼーション反応で形成することが可能である。アンチセンスがプローブ核酸として使用される場合、試料中に提供される標的ポリヌクレオチドがアンチセンス核酸の配列と相補的であるように選択されることは、当業者に理解されるであろう。逆に、ヌクレオチドプローブがセンス核酸である場合、標的ポリヌクレオチドはセンス核酸の配列と相補的であるように選択される。
ハイブリダイゼーションは、種々のストリンジェンシーの条件下で実施することができる。本発明の実施に好適なハイブリダイゼーション条件は、プローブと生化学的シグナル伝達経路に関連する配列との間の認識相互作用が十分に特異的であるとともに十分に安定しているものである。ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーが増加する条件は当該技術分野で広く知られており、発表されている。例えば、（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．，（１９８９）；Ｎｏｎｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ Ｉｎ Ｓｉｔｕ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｍａｎｕａｌ，Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ，ｓｅｃｏｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ）を参照のこと。ハイブリダイゼーションアッセイは、限定はされないが、ニトロセルロース、ガラス、ケイ素、及び種々の遺伝子アレイを含めた任意の固体支持体上に固定化されたプローブを使用して形成され得る。好ましいハイブリダイゼーションアッセイは、米国特許第５，４４５，９３４号明細書に記載されるとおりの高密度遺伝子チップで実施される。
ハイブリダイゼーションアッセイ中に形成されるプローブ－標的複合体を好都合に検出するため、ヌクレオチドプローブが検出可能標識にコンジュゲートされる。本発明における使用に好適な検出可能標識には、光化学的、生化学的、分光学的、免疫化学的、電気的、光学的又は化学的手段で検出可能な任意の組成物が含まれる。幅広い種類の適切な検出可能標識が当該技術分野において公知であり、それには、蛍光又は化学発光標識、放射性同位元素標識、酵素又は他のリガンドが含まれる。好ましい実施形態では、ジゴキシゲニン、β－ガラクトシダーゼ、ウレアーゼ、アルカリホスファターゼ又はペルオキシダーゼ、アビジン／ビオチン複合体など、蛍光標識又は酵素タグを用いることが所望されるものと思われる。
ハイブリダイゼーション強度の検出又は定量化に用いられる検出方法は、典型的には上記で選択される標識に依存することになる。例えば、放射標識は、写真フィルム又はホスフォイメージャー（ｐｈｏｓｐｈｏｉｍａｇｅｒ）を使用して検出し得る。蛍光マーカーは、放出される光を検出するため光検出器を使用して検出及び定量化し得る。酵素標識は、典型的には酵素に基質を提供し、基質に対する酵素の作用によって産生された反応産物を計測することにより検出される；及び最後に、比色標識は、単純に、着色した標識を可視化することにより検出される。
薬剤により引き起こされる、生化学的シグナル伝達経路に関連する配列の発現の変化はまた、対応する遺伝子産物を調べることによっても決定し得る。タンパク質レベルの決定には、典型的には、ａ）生体試料中に含まれるタンパク質を、生化学的シグナル伝達経路に関連するタンパク質に特異的に結合する薬剤と接触させるステップ；及び（ｂ）そのようにして形成された任意の薬剤：タンパク質複合体を同定するステップが関わる。この実施形態の一態様において、生化学的シグナル伝達経路に関連するタンパク質に特異的に結合する薬剤は、抗体、好ましくはモノクローナル抗体である。
反応は、薬剤と生化学的シグナル伝達経路に関連するタンパク質との間で複合体が形成されることを可能にする条件下で、被験試料から得られた生化学的シグナル伝達経路に関連するタンパク質の試料に薬剤を接触させることにより実施される。複合体の形成は、当該技術分野の標準的手順に従い直接的又は間接的に検出することができる。直接的な検出方法では、薬剤に検出可能標識が提供され、複合体から未反応薬剤が除去され得る；従って残る標識の量が、形成された複合体の量を示す。かかる方法には、ストリンジェントな洗浄条件の中にあっても薬剤に結合したまま留まる標識を選択することが好ましい。標識は結合反応を妨げないことが好ましい。代替として、間接的な検出手順では、化学的に、或いは酵素的に導入された標識を含む薬剤を使用し得る。望ましい標識は、概して得られる薬剤：ポリペプチド複合体の結合又は安定性を妨げない。しかしながら、標識は典型的には、有効な結合、ひいては検出可能なシグナルの生成のため抗体に接触可能であるように設計される。
タンパク質レベルの検出に好適な幅広い種類の標識が当該技術分野において公知である。非限定的な例としては、放射性同位元素、酵素、コロイド金属、蛍光化合物、生物発光化合物、及び化学発光化合物が挙げられる。
結合反応中に形成された薬剤：ポリペプチド複合体の量は、標準的な定量アッセイにより定量化することができる。上記に説明したとおり、薬剤：ポリペプチド複合体の形成は、結合部位に残る標識の量によって直接計測することができる。代替例では、生化学的シグナル伝達経路に関連するタンパク質が、特定の薬剤上の結合部位に関して標識類似体と競合するその能力に関して試験される。この競合アッセイでは、捕捉される標識の量は、被験試料中に存在する生化学的シグナル伝達経路に関連するタンパク質配列の量に反比例する。
上記に概説した一般的原理に基づく多くのタンパク質分析技術は、当該技術分野において利用可能である。これには、限定はされないが、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素結合イムノラジオメトリックアッセイ）、「サンドイッチ」イムノアッセイ、イムノラジオメトリックアッセイ、インサイチュイムノアッセイ（例えば、コロイド金、酵素又は放射性同位元素標識を使用する）、ウエスタンブロット分析、免疫沈降アッセイ、免疫蛍光アッセイ、及びＳＤＳ－ＰＡＧＥが含まれる。
前述のタンパク質分析の実施には、生化学的シグナル伝達経路に関連するタンパク質を特異的に認識し又は結合する抗体が好ましい。望ましい場合、特定のタイプの翻訳後改変（例えば、生化学的シグナル伝達経路誘導性改変）を認識する抗体を使用することができる。翻訳後改変としては、限定はされないが、グリコシル化、脂質化、アセチル化、及びリン酸化が挙げられる。これらの抗体は、商業的な供給業者から購入してもよい。例えば、チロシンリン酸化タンパク質を特異的に認識する抗ホスホチロシン抗体が、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ及びＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒを含む多くの供給業者から入手可能である。抗ホスホチロシン抗体は、ＥＲストレスに応答してそのチロシン残基で別様にリン酸化されるタンパク質の検出において特に有用である。かかるタンパク質としては、限定はされないが、真核生物翻訳開始因子２α（ｅＩＦ－２α）が挙げられる。或いは、これらの抗体は、従来のポリクローナル又はモノクローナル抗体技術を用いて、所望の翻訳後改変を呈する標的タンパク質で宿主動物又は抗体産生細胞を免疫することにより作成し得る。
主題の方法を実施するにおいて、異なる体組織、異なる細胞型、及び／又は異なる細胞内構造における生化学的シグナル伝達経路に関連するタンパク質の発現パターンを識別することが望ましいこともある。こうした試験は、特定の組織、細胞型、又は細胞内構造で優先的に発現するタンパク質マーカーと結合する能力を有する組織特異的、細胞特異的又は細胞内構造特異抗体を使用して実施することができる。
生化学的シグナル伝達経路に関連する遺伝子の発現の変化はまた、対照細胞と比べた遺伝子産物の活性の変化を調べることにより決定し得る。薬剤により引き起こされる、生化学的シグナル伝達経路に関連するタンパク質の活性の変化に関するアッセイは、調べている生物学的活性及び／又はシグナル伝達経路に依存し得る。例えば、タンパク質がキナーゼである場合、下流の１つ又は複数の基質をリン酸化するその能力の変化を当該技術分野において公知の種々のアッセイにより決定することができる。代表的なアッセイとしては、限定はされないが、リン酸化タンパク質を認識する抗ホスホチロシン抗体などの抗体による免疫ブロット及び免疫沈降が挙げられる。加えて、キナーゼ活性は、ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ（商標）（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒから入手可能）及びｅＴａｇ（商標）アッセイ（Ｃｈａｎ－Ｈｕｉ，ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １１１：１６２－１７４）などのハイスループット化学発光アッセイにより検出することができる。
生化学的シグナル伝達経路に関連するタンパク質が細胞内ｐＨ条件の変動をもたらすシグナル伝達カスケードの一部である場合、蛍光ｐＨ色素などのｐＨ感受性分子をレポーター分子として使用することができる。生化学的シグナル伝達経路に関連するタンパク質がイオンチャネルである別の例では、膜電位及び／又は細胞内イオン濃度の変動をモニタすることができる。多くの市販キット及びハイスループット装置が、イオンチャネルの調節因子に関する迅速且つロバストなスクリーニングに特に適している。代表的な機器としては、ＦＬＩＰＲ（商標）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｉｎｃ．）及びＶＩＰＲ（Ａｕｒｏｒａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）が挙げられる。これらの機器は、マイクロプレートの１０００個を超えるサンプルウェルで同時に反応を検出し、且つ１秒又は更には１ミリ秒（ｍｉｎｉｓｅｃｏｎｄ）以内にリアルタイムの計測値及び機能データを提供する能力を有する。
本明細書に開示される任意の方法の実施においては、限定なしに、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、ソノポレーション、微粒子銃、リン酸カルシウム媒介性形質移入、カチオン性形質移入、リポソーム形質移入、デンドリマー形質移入、熱ショック形質移入、ヌクレオフェクション形質移入、マグネトフェクション、リポフェクション、インペイルフェクション（ｉｍｐａｌｅｆｅｃｔｉｏｎ）、光学的トランスフェクション、専売薬剤により増強される核酸取り込み、及びリポソーム、免疫リポソーム、ビロソーム、又は人工ビリオンを介した送達を含めた当該技術分野で公知の１つ以上の方法によって細胞又は胚に好適なベクターを導入することができる。一部の方法において、ベクターはマイクロインジェクションにより胚に導入される。１つ又は複数のベクターが胚の核又は細胞質に微量注入され得る。一部の方法において、１つ又は複数のベクターはヌクレオフェクションにより細胞に導入され得る。
ＣＲＩＳＰＲ複合体の標的ポリヌクレオチドは、真核細胞にとって内因性又は外因性の任意のポリヌクレオチドであってもよい。例えば、標的ポリヌクレオチドは、真核細胞の核内に存在するポリヌクレオチドであってもよい。標的ポリヌクレオチドは、遺伝子産物（例えばタンパク質）をコードする配列、又は非コード配列（例えば調節ポリヌクレオチド又はジャンクＤＮＡ）であってもよい。
標的ポリヌクレオチドの例としては、生化学的シグナル伝達経路に関連する配列、例えば、生化学的シグナル伝達経路関連遺伝子又はポリヌクレオチドが挙げられる。標的ポリヌクレオチドの例としては、疾患関連遺伝子又はポリヌクレオチドが挙げられる。「疾患関連」遺伝子又はポリヌクレオチドとは、非疾患対照の組織又は細胞と比較して罹患組織に由来する細胞において異常なレベルで又は異常な形態で転写又は翻訳産物を産生している任意の遺伝子又はポリヌクレオチドを指す。それは異常に高いレベルで発現するようになる遺伝子であってもよく；異常に低いレベルで発現するようになる遺伝子であってもよく、ここで発現の変化は疾患の発生及び／又は進行と相関する。疾患関連遺伝子はまた、疾患の原因に直接関与するか又はそれに関与する１つ又は複数の遺伝子との連鎖不平衡がある１つ又は複数の突然変異又は遺伝的変異を有する遺伝子も指す。転写又は翻訳された産物は既知であっても又は未知であってもよく、及び正常レベルであっても又は異常レベルであってもよい。
ＣＲＩＳＰＲ複合体の標的ポリヌクレオチドは、真核細胞にとって内因性又は外因性の任意のポリヌクレオチドであってもよい。例えば、標的ポリヌクレオチドは、真核細胞の核内に存在するポリヌクレオチドであってもよい。標的ポリヌクレオチドは、遺伝子産物（例えばタンパク質）をコードする配列、又は非コード配列（例えば調節ポリヌクレオチド又はジャンクＤＮＡ）であってもよい。理論によって拘束されることを望むものではないが、標的配列はＰＡＭ（プロトスペーサー隣接モチーフ）、即ちＣＲＩＳＰＲ複合体によって認識される短い配列を伴わなければならないと考えられる。ＰＡＭの正確な配列及び長さ要件は、用いられるＣＲＩＳＰＲ酵素に応じて異なるが、ＰＡＭは、典型的にはプロトスペーサー（即ち標的配列）に隣接する２～５塩基対の配列である。ＰＡＭ配列の例は以下の実施例の節に示され、当業者は、所与のＣＲＩＳＰＲ酵素と共に使用される更なるＰＡＭ配列を同定することができるであろう。
ＣＲＩＳＰＲ複合体の標的ポリヌクレオチドとしては、両方ともにＳＹＳＴＥＭＳ ＭＥＴＨＯＤＳ ＡＮＤ ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ ＦＯＲ ＳＥＱＵＥＮＣＥ ＭＡＮＩＰＵＬＡＴＩＯＮと題される、それぞれ２０１２年１２月１２日及び２０１３年１月２日に出願された、米国仮特許出願第６１／７３６，５２７号明細書及び同第６１／７４８，４２７号明細書、及び２０１３年１２月１２日に出願されたＤＥＬＩＶＥＲＹ，ＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ ＡＮＤ ＯＰＴＩＭＩＺＡＴＩＯＮ ＯＦ ＳＹＳＴＥＭＳ，ＭＥＴＨＯＤＳ ＡＮＤ ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ ＦＯＲ ＳＥＱＵＥＮＣＥ ＭＡＮＩＰＵＬＡＴＩＯＮ ＡＮＤ ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣ ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳと題されるＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７４６６７号明細書（これらの内容は全て、本明細書において全体として参照により援用される）に挙げられるとおりの幾つもの疾患関連遺伝子及びポリヌクレオチド並びに生化学的シグナル伝達経路関連遺伝子及びポリヌクレオチドが含まれ得る。
標的ポリヌクレオチドの例としては、生化学的シグナル伝達経路に関連する配列、例えば、生化学的シグナル伝達経路関連遺伝子又はポリヌクレオチドが挙げられる。標的ポリヌクレオチドの例としては、疾患関連遺伝子又はポリヌクレオチドが挙げられる。「疾患関連」遺伝子又はポリヌクレオチドとは、非疾患対照の組織又は細胞と比較して罹患組織に由来する細胞において異常なレベルで又は異常な形態で転写又は翻訳産物を産生している任意の遺伝子又はポリヌクレオチドを指す。それは異常に高いレベルで発現するようになる遺伝子であってもよく；異常に低いレベルで発現するようになる遺伝子であってもよく、ここで発現の変化は疾患の発生及び／又は進行と相関する。疾患関連遺伝子はまた、疾患の原因に直接関与するか又はそれに関与する１つ又は複数の遺伝子との連鎖不平衡がある１つ又は複数の突然変異又は遺伝的変異を有する遺伝子も指す。転写又は翻訳された産物は既知であっても又は未知であってもよく、及び正常レベルであっても又は異常レベルであってもよい。
トランスクリプトームノックダウンスクリーニング
本明細書に記載されるＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質複合体は、効率的で対費用効果の高い機能性トランスクリプトニックスクリーニングの実施に用いることができる。かかるスクリーニングは、トランスクリプトームワイドライブラリベースのＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質を用いることができる。かかるスクリーニング及びライブラリにより、遺伝子の機能、遺伝子が関与する細胞経路、及び遺伝子発現の任意の変化が如何に特定の生物学的過程をもたらし得るかを決定することが可能となり得る。本発明の利点は、ＣＲＩＳＰＲ系がオフターゲット結合及びその結果として生じる副作用を回避することである。これは、標的ＤＮＡに対して高度な配列特異性を有するように構成された系を用いて達成される。本発明の好ましい実施形態において、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質複合体はＣ２ｃ２エフェクタータンパク質複合体である。
本発明の実施形態において、トランスクリプトームワイドライブラリは、本明細書に記載されるとおりの、真核細胞集団内の複数の遺伝子座における複数の標的配列を標的化可能なガイド配列を含む複数のＣ２ｃ２系ガイドＲＮＡを含み得る。細胞集団は胚性幹（ＥＳ）細胞集団であってもよい。遺伝子座にある標的配列は非コード配列であってもよい。非コード配列は、イントロン、調節配列、スプライス部位、３’ＵＴＲ、５’ＵＴＲ、又はポリアデニル化シグナルであり得る。前記標的化により、１つ以上の遺伝子産物の遺伝子機能が変化し得る。標的化は遺伝子機能のノックアウトをもたらし得る。遺伝子産物の標的化は２つ以上のガイドＲＮＡを含み得る。遺伝子産物は、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個のガイドＲＮＡ、好ましくは遺伝子当たり３～４個によって標的化され得る。オフターゲット改変は、Ｃ２ｃ２エフェクタータンパク質複合体によって作成される付着末端型の二本鎖切断を利用することによるか、又はＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９系で用いられるものと類似の方法を利用することにより、最小限に抑えることができる（例えば、参照により本明細書に援用される「ＲＮＡガイド下Ｃａｓ９ヌクレアーゼのＤＮＡターゲティング特異性（Ｏｆｆ－ｔａｒｇｅｔ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ｍａｙ ｂｅ ｍｉｎｉｍｉｚｅｄ（Ｓｅｅ，ｅ．ｇ．，ＤＮＡ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ ＲＮＡ－ｇｕｉｄｅｄ Ｃａｓ９ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ）」．Ｈｓｕ，Ｐ．，Ｓｃｏｔｔ，Ｄ．，Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ，Ｊ．，Ｒａｎ，ＦＡ．，Ｋｏｎｅｒｍａｎｎ，Ｓ．，Ａｇａｒｗａｌａ，Ｖ．，Ｌｉ，Ｙ．，Ｆｉｎｅ，Ｅ．，Ｗｕ，Ｘ．，Ｓｈａｌｅｍ，Ｏ．，Ｃｒａｄｉｃｋ，ＴＪ．，Ｍａｒｒａｆｆｉｎｉ，ＬＡ．，Ｂａｏ，Ｇ．，＆ Ｚｈａｎｇ，Ｆ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．２６４７（２０１３）を参照）。約１００個以上の配列の標的化であってもよい。約１０００個以上の配列の標的化であってもよい。約２０，０００個以上の配列の標的化であってもよい。ゲノム全体の標的化であってもよい。関連性のある又は望ましい経路に焦点を置いた標的配列のパネルの標的化であってもよい。経路は免疫経路であってもよい。経路は細胞分裂経路であってもよい。
本発明の一態様は、複数の遺伝子座の複数の標的配列を標的化可能なガイド配列を含み得る複数のＣ２ｃ２ガイドＲＮＡを含み得るトランスクリプトームワイドライブラリを包含し、ここで前記標的化により遺伝子機能のノックダウンが生じる。このライブラリは、生物のゲノム内の一つ一つの遺伝子を標的化するガイドＲＮＡを潜在的に含み得る。
本発明の一部の実施形態において、生物又は対象は真核生物（ヒトを含めた哺乳動物を含む）又は非ヒト真核生物又は非ヒト動物又は非ヒト哺乳動物である。一部の実施形態において、生物又は対象は非ヒト動物であり、節足動物、例えば昆虫であってもよく、又は線虫であってもよい。本発明の一部の方法において、生物又は対象は植物である。本発明の一部の方法において、生物又は対象は哺乳動物又は非ヒト哺乳動物である。非ヒト哺乳動物は、例えばげっ歯類（好ましくはマウス又はラット）、有蹄類、又は霊長類であってもよい。本発明の一部の方法において、生物又は対象は微細藻類を含む藻類であり、又は真菌類である。
遺伝子機能のノックダウンには、Ｉ．Ｃ２ｃ２エフェクタータンパク質、及びＩＩ．１つ以上のガイドＲＮＡを含むエンジニアリングされた天然に存在しないＣ２ｃ２エフェクタータンパク質系を含む１つ以上のベクターのベクター系を細胞集団における各細胞に導入するステップ［構成成分Ｉ及びＩＩは系の同じ又は異なるベクター上にあってもよい］、構成成分Ｉ及びＩＩを各細胞に組み込むステップ［ガイド配列は各細胞内のユニークな遺伝子を標的化し、Ｃ２ｃ２エフェクタータンパク質は調節エレメントに作動可能に連結されており、ガイド配列を含むガイドＲＮＡは、転写されると、ユニークな遺伝子のゲノム遺伝子座における標的配列へのＣ２ｃ２エフェクタータンパク質系の配列特異的結合を導く］、Ｃ２ｃ２エフェクタータンパク質によるゲノム遺伝子座の切断を誘導するステップ、及び細胞集団の各細胞内の複数のユニークな遺伝子における異なるノックダウンイベントを確認するステップが含まれてもよく、それにより遺伝子ノックダウン細胞ライブラリが生成される。本発明は、細胞集団が真核細胞集団であり、及び好ましい実施形態において、細胞集団が胚性幹（ＥＳ）細胞の集団であることを包含する。
１つ以上のベクターはプラスミドベクターであってもよい。ベクターは、Ｃ２ｃ２エフェクタータンパク質、ｇＲＮＡ、及び任意選択で選択マーカーを含む標的細胞への単一のベクターであってもよい。理論によって拘束されないが、単一のベクターでＣ２ｃ２エフェクタータンパク質及びｇＲＮＡを同時に送達可能であることにより、Ｃ２ｃ２エフェクタータンパク質を発現する細胞株を初めに作成する必要なしに、いかなる目的の細胞型にも適用することができる。調節エレメントは誘導性プロモーターであってもよい。誘導性プロモーターはドキシサイクリン誘導性プロモーターであってもよい。本発明の一部の方法において、ガイド配列の発現はＴ７プロモーターの制御下にあり、Ｔ７ポリメラーゼの発現によってドライブされる。種々のノックダウンイベントの確認は全トランスクリプトームシーケンシングによることができる。ノックダウンイベントは１００個以上のユニークな遺伝子において実現し得る。ノックダウンイベントは１０００個以上のユニークな遺伝子において実現し得る。ノックダウンイベントは２０，０００個以上のユニークな遺伝子において実現し得る。ノックダウンイベントはトランスクリプトーム全体で実現し得る。遺伝子機能のノックダウンは、特定の生理学的経路又は条件において機能する複数のユニークな遺伝子に実現してもよい。経路又は条件は免疫経路又は条件であってもよい。経路又は条件は細胞分裂経路又は条件であってもよい。
本発明はまた、本明細書に記載するトランスクリプトームワイドライブラリを含むキットも提供する。本キットは、本発明のライブラリを含むベクター又はプラスミドを含む単一の容器を含み得る。本キットはまた、本発明のライブラリからのガイド配列を含むユニークなＣ２ｃ２エフェクタータンパク質系ガイドＲＮＡの選択された一部を含むパネルも含むことができ、ここで選択された一部は、特定の生理的条件を示すものである。本発明は、標的化が約１００配列以上、約１０００配列以上又は約２０，０００配列以上又はトランスクリプトーム全体であることを包含する。更に、標的配列のパネルは、免疫経路又は細胞分裂など、関連性のある又は望ましい経路に焦点が置かれ得る。
本発明の更なる態様において、Ｃ２ｃ２エフェクタータンパク質酵素は１つ以上の突然変異を含んでもよく、機能ドメインへの融合を伴う又は伴わない一般的なＲＮＡ結合タンパク質として用いられ得る。突然変異は人工的に導入された突然変異か又は機能獲得型若しくは機能喪失型突然変異であってもよい。本明細書に記載のとおり突然変異が特徴付けられている。本発明の一態様において、機能ドメインは転写活性化ドメインであってもよく、これはＶＰ６４であり得る。本発明の他の態様において、機能ドメインは転写リプレッサードメインであってもよく、これはＫＲＡＢ又はＳＩＤ４Ｘであり得る。本発明の他の態様は、限定はされないが、転写アクチベーター、リプレッサー、リコンビナーゼ、トランスポザーゼ、ヒストンリモデラー、デメチラーゼ、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ、クリプトクロム、光誘導性／制御性ドメイン又は化学物質誘導性／制御性ドメインを含むドメインに融合した変異Ｃ２ｃ２エフェクタータンパク質酵素に関する。本発明の一部の方法は、標的遺伝子の発現を誘導するステップを含み得る。一実施形態において、真核細胞集団内の複数のゲノム遺伝子座における複数の標的配列を標的化することによる発現の誘導は、機能ドメインの使用による。
Ｃ２ｃ２ ３エフェクタータンパク質複合体を利用する本発明の実施では、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９系で用いられる方法が有用であり、以下が参照される。
「ヒト細胞におけるゲノム規模のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ノックアウトスクリーニング（Ｇｅｎｏｍｅ－Ｓｃａｌｅ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ Ｋｎｏｃｋｏｕｔ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｃｅｌｌｓ）」．Ｓｈａｌｅｍ，Ｏ．，Ｓａｎｊａｎａ，ＮＥ．，Ｈａｒｔｅｎｉａｎ，Ｅ．，Ｓｈｉ，Ｘ．，Ｓｃｏｔｔ，ＤＡ．，Ｍｉｋｋｅｌｓｏｎ，Ｔ．，Ｈｅｃｋｌ，Ｄ．，Ｅｂｅｒｔ，ＢＬ．，Ｒｏｏｔ，ＤＥ．，Ｄｏｅｎｃｈ，ＪＧ．，Ｚｈａｎｇ，Ｆ．Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｅｃ １２．（２０１３）．［Ｅｐｕｂ ａｈｅａｄ ｏｆ ｐｒｉｎｔ］；最終的な改訂版が以下として発表された：Ｓｃｉｅｎｃｅ．２０１４ Ｊａｎ ３；３４３（６１６６）：８４－８７。
Ｓｈａｌｅｍ ｅｔ ａｌ．は、ゲノムワイド規模で遺伝子機能を探索する新規方法に関する。彼らの研究は、６４，７５１個のユニークなガイド配列で１８，０８０個の遺伝子を標的化するゲノム規模のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ノックアウト（ＧｅＣＫＯ）ライブラリを送達することにより、ヒト細胞におけるネガティブ選択及びポジティブ選択の両方のスクリーニングが可能になったことを示した。第一に、この著者らは、ＧｅＣＫＯライブラリを用いて癌及び多能性幹細胞における細胞生存能力に必須の遺伝子を同定することを示した。次に、この著者らはメラノーマモデルにおいて、その欠損がベムラフェニブ（突然変異プロテインキナーゼＢＲＡＦを阻害する治療薬）に対する耐性に関わる遺伝子をスクリーニングした。彼らの研究は、最も上位に位置付けられる候補には、既に検証されている遺伝子ＮＦ１及びＭＥＤ１２並びに新規ヒットＮＦ２、ＣＵＬ３、ＴＡＤＡ２Ｂ、及びＴＡＤＡ１が含まれたことを明らかにした。この著者らは、同じ遺伝子を標的化する独立したガイドＲＮＡ間における高度な一貫性及び高いヒット確認率を観察し、従ってＣａｓ９によるゲノム規模のスクリーニングの有望さを実証した。
また、米国特許出願公開第２０１４０３５７５３０号明細書；及び国際公開第２０１４０９３７０１号パンフレット（本明細書によって参照により本明細書に援用される）も参照される。
機能的変化及びスクリーニング
別の態様において、本発明は、遺伝子の機能的評価及びスクリーニング方法を提供する。機能ドメインを正確に送達するため、遺伝子を活性化若しくは抑制するため又は目的の特定の遺伝子座上のメチル化部位を正確に変化させることによりエピジェネティック状態を変化させるための本発明のＣＲＩＳＰＲ系の使用は、単細胞又は細胞集団に適用される１つ以上のガイドＲＮＡを伴うか、又は複数のガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を含むライブラリの投与又は発現を含む、エキソビボ又はインビボで細胞のプール内のゲノムに適用されるライブラリを伴うことができ、及びここでスクリーニングはＣ２ｃ２エフェクタータンパク質の使用を更に含み、ここでＣ２ｃ２エフェクタータンパク質を含むＣＲＩＳＰＲ複合体は、異種機能ドメインを含むように改変される。ある態様において、本発明は、ライブラリの宿主への投与又は宿主におけるインビボ発現を含む、ゲノム／トランスクリプトームのスクリーニング方法を提供する。ある態様において、本発明は、宿主に投与される又は宿主で発現するアクチベーターを更に含む、本明細書に考察されるとおりの方法を提供する。ある態様において、本発明は、本明細書に考察されるとおりの方法を提供し、ここでアクチベーターはＣ２ｃ２エフェクタータンパク質に付加される。ある態様において、本発明は、本明細書に考察されるとおりの方法を提供し、ここでアクチベーターはＣ２ｃ２エフェクタータンパク質のＮ末端又はＣ末端に付加される。ある態様において、本発明は、本明細書に考察されるとおりの方法を提供し、ここでアクチベーターはｓｇＲＮＡループに付加される。ある態様において、本発明は、宿主に投与される又は宿主で発現するリプレッサーを更に含む、本明細書に考察されるとおりの方法を提供する。ある態様において、本発明は、本明細書に考察されるとおりの方法を提供し、ここでスクリーニングは、遺伝子活性化、遺伝子阻害、又は遺伝子座における切断に影響を及ぼし、及びそれを検出することを含む。
ある態様において、本発明は、効率的なオンターゲット活性を提供し、且つオフターゲット活性を最小限に抑える。ある態様において、本発明は、Ｃ２ｃ２エフェクタータンパク質による効率的なオンターゲット切断を提供し、且つＣ２ｃ２エフェクタータンパク質によるオフターゲット切断を最小限に抑える。ある態様において、本発明は、ＤＮＡ切断のない、遺伝子座におけるＣ２ｃ２エフェクタータンパク質のガイド特異的結合を提供する。従って、ある態様において、本発明は、標的特異的遺伝子調節を提供する。ある態様において、本発明は、ＤＮＡ切断のない、遺伝子座におけるＣ２ｃ２エフェクタータンパク質のガイド特異的結合を提供する。従って、ある態様において、本発明は、単一のＣ２ｃ２エフェクタータンパク質を使用したある遺伝子座における切断及び別の遺伝子座における遺伝子調節を提供する。ある態様において、本発明は、１つ以上のＣ２ｃ２エフェクタータンパク質及び／又は酵素を使用した複数の標的の直交性の活性化及び／又は阻害及び／又は切断を提供する。
ある態様において、本発明は、本明細書に考察されるとおりの方法を提供し、ここで宿主は真核細胞である。ある態様において、本発明は、本明細書に考察されるとおりの方法を提供し、ここで宿主は哺乳類細胞である。ある態様において、本発明は、本明細書に考察されるとおりの方法を提供し、ここで宿主は非ヒト真核生物である。ある態様において、本発明は、本明細書に考察されるとおりの方法を提供し、ここで非ヒト真核生物は非ヒト哺乳類である。ある態様において、本発明は、本明細書に考察されるとおりの方法を提供し、ここで非ヒト哺乳類はマウスである。ある態様において、本発明は、本明細書に考察されるとおりの方法を提供し、この方法は、Ｃ２ｃ２エフェクタータンパク質複合体又はその１つ又は複数の構成成分又はそれをコードする１つ又は複数の核酸分子の送達を含み、ここで前記１つ又は複数の核酸分子は１つ又は複数の調節配列に作動可能に連結され、且つインビボで発現する。ある態様において、本発明は、本明細書に考察されるとおりの方法を提供し、ここでインビボ発現は、レンチウイルス、アデノウイルス、又はＡＡＶを介する。ある態様において、本発明は、本明細書に考察されるとおりの方法を提供し、ここで送達は、粒子、ナノ粒子、脂質又は細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）を介する。
ある態様において、本発明は、細胞の目的のゲノム遺伝子座にある標的配列にハイブリダイズ可能なガイド配列を含むガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を各々が含む、Ｃ２ｃ２エフェクタータンパク質を含むＣＲＩＳＰＲ複合体の対を提供し、ここで各ｓｇＲＮＡの少なくとも１つのループは、１つ以上のアダプタータンパク質に結合する１つ又は複数の個別のＲＮＡ配列の挿入によって改変され、及びここでアダプタータンパク質は１つ以上の機能ドメインと会合し、ここで各Ｃ２ｃ２エフェクタータンパク質複合体の各ｓｇＲＮＡは、ＤＮＡ切断活性を有する機能ドメインを含む。
ある態様において、本発明は、目的のゲノム遺伝子座にある標的配列の切断方法を提供し、この方法は、Ｃ２ｃ２エフェクタータンパク質複合体又はその１つ又は複数の構成成分又はそれをコードする１つ又は複数の核酸分子を細胞に送達することを含み、ここで前記１つ又は複数の核酸分子は１つ又は複数の調節配列に作動可能に連結され、且つインビボで発現する。ある態様において、本発明は、本明細書において考察するとおりの方法を提供し、ここで送達は、レンチウイルス、アデノウイルス、又はＡＡＶを介する。
ある態様において、本発明は、本明細書において考察するとおりのライブラリ、方法又は複合体を提供し、ここでｓｇＲＮＡは、少なくとも１つの非コード機能性ループを有するように改変され、例えば少なくとも１つの非コード機能性ループが抑制性であり；例えば少なくとも１つの非コード機能性ループがＡｌｕを含む。
一態様において、本発明は、遺伝子産物の発現を変化させ又は改変する方法を提供する。前記方法は、遺伝子産物をコードするＤＮＡ分子を含有し及び発現する細胞に、Ｃ２ｃ２エフェクタータンパク質とＲＮＡ分子を標的化するガイドＲＮＡとを含むエンジニアリングされた天然に存在しないＣＲＩＳＰＲ系を導入するステップを含むことができ、それによってガイドＲＮＡが、遺伝子産物をコードするＲＮＡ標的分子を標的化し、及びＣ２ｃ２エフェクタータンパク質が、遺伝子産物をコードするＲＮＡ分子を切断し、それによって遺伝子産物の発現が変化し；及び、ここでＣ２ｃ２エフェクタータンパク質とガイドＲＮＡとは天然では一緒に存在しない。本発明は、ダイレクトリピート配列に連結されたガイド配列を含むガイドＲＮＡを包含する。本発明は更に、真核細胞での発現にコドン最適化されたＣ２ｃ２エフェクタータンパク質を包含する。好ましい実施形態において真核細胞は哺乳類細胞であり、より好ましい実施形態において哺乳類細胞はヒト細胞である。本発明の更なる実施形態において、遺伝子産物の発現は減少する。
一部の実施形態において、１つ以上の機能ドメインがＣ２ｃ２エフェクタータンパク質に会合する。一部の実施形態において、１つ以上の機能ドメインが、例えばＫｏｎｎｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ ５１７，５８３－５８８，２９ Ｊａｎｕａｒｙ ２０１５）の改変ガイドと共に使用されるとおり、アダプタータンパク質に会合する。一部の実施形態において、１つ以上の機能ドメインがデッドｇＲＮＡ（ｄＲＮＡ）に会合する。一部の実施形態において、例えばＤａｈｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．，「触媒活性Ｃａｓ９ヌクレアーゼによる直交性遺伝子制御（Ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｇｅｎｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｗｉｔｈ ａ ｃａｔａｌｙｔｉｃａｌｌｙ ａｃｔｉｖｅ Ｃａｓ９ ｎｕｃｌｅａｓｅ）」（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３３，ｐ．１１５９－６１（２０１５年１１月））によるＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９系に類似的に記載のとおり、活性Ｃ２ｃ２エフェクタータンパク質を含むｄＲＮＡ複合体が、ある遺伝子座上で機能ドメインによる遺伝子調節を導く一方、ｓｇＲＮＡが別の遺伝子座で活性Ｃ２ｃ２エフェクタータンパク質によるＤＮＡ切断を導く。一部の実施形態において、ｄＲＮＡは、オフターゲット調節と比較して目的の遺伝子座に関する調節の選択性が最大となるように選択される。一部の実施形態において、ｄＲＮＡは、標的遺伝子調節が最大となり、且つ標的切断が最小限に抑えられるように選択される。
以下の考察の目的上、機能ドメインへの言及は、Ｃ２ｃ２エフェクタータンパク質と会合した機能ドメイン又はアダプタータンパク質と会合した機能ドメインのことであり得る。
一部の実施形態において、１つ以上の機能ドメインはＮＬＳ（核局在化配列）又はＮＥＳ（核外移行シグナル）である。一部の実施形態において、１つ以上の機能ドメインは転写活性化ドメインであり、ＶＰ６４、ｐ６５、ＭｙｏＤ１、ＨＳＦ１、ＲＴＡ、ＳＥＴ７／９及びヒストンアセチルトランスフェラーゼを含む。ＣＲＩＳＰＲ酵素と会合したものに関する活性化（又はアクチベーター）ドメインへの本明細書中の他の言及には、任意の公知の転写活性化ドメイン及び具体的には、ＶＰ６４、ｐ６５、ＭｙｏＤ１、ＨＳＦ１、ＲＴＡ、ＳＥＴ７／９又はヒストンアセチルトランスフェラーゼが含まれる。
一部の実施形態において、１つ以上の機能ドメインは転写リプレッサードメインである。一部の実施形態において、転写リプレッサードメインはＫＲＡＢドメインである。一部の実施形態において、転写リプレッサードメインは、ＮｕＥドメイン、ＮｃｏＲドメイン、ＳＩＤドメイン又はＳＩＤ４Ｘドメインである。
一部の実施形態において、１つ以上の機能ドメインは、翻訳活性化活性、翻訳抑制活性、メチラーゼ活性、デメチラーゼ活性、転写活性化活性、転写抑制活性、転写解除因子活性、ヒストン修飾活性、ＲＮＡ切断活性、ＤＮＡ切断活性、ＤＮＡ組込み活性又は核酸結合活性を含む１つ以上の活性を有する。
ヒストン修飾ドメインもまた、一部の実施形態において好ましい。例示的ヒストン修飾ドメインは以下で考察する。トランスポザーゼドメイン、ＨＲ（相同組換え）機構ドメイン、リコンビナーゼドメイン、及び／又はインテグラーゼドメインもまた、本機能ドメインとして好ましい。一部の実施形態において、ＤＮＡ組込み活性は、ＨＲ機構ドメイン、インテグラーゼドメイン、リコンビナーゼドメイン及び／又はトランスポザーゼドメインを含む。ヒストンアセチルトランスフェラーゼが一部の実施形態において好ましい。
一部の実施形態において、ＤＮＡ切断活性はヌクレアーゼに起因する。一部の実施形態において、ヌクレアーゼはＦｏｋ１ヌクレアーゼを含む。「高度に特異的なゲノム編集のための二量体ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡガイド下ＦｏｋＩヌクレアーゼ（Ｄｉｍｅｒｉｃ ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ－ｇｕｉｄｅｄ ＦｏｋＩ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ ｆｏｒ ｈｉｇｈｌｙ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ）」，Ｓｈｅｎｇｄａｒ Ｑ．Ｔｓａｉ，Ｎｉｃｏｌａｓ Ｗｙｖｅｋｅｎｓ，Ｃｙｄ Ｋｈａｙｔｅｒ，Ｊｅｎｎｉｆｅｒ Ａ．Ｆｏｄｅｎ，Ｖｉｓｈａｌ Ｔｈａｐａｒ，Ｄｅｅｐａｋ Ｒｅｙｏｎ，Ｍａｔｈｅｗ Ｊ．Ｇｏｏｄｗｉｎ，Ｍａｒｔｉｎ Ｊ．Ａｒｙｅｅ，Ｊ．Ｋｅｉｔｈ Ｊｏｕｎｇ Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３２（６）：５６９－７７（２０１４）を参照されたく、これは、伸長配列を認識し、且つヒト細胞において内因性遺伝子を高効率で編集することのできる二量体ＲＮＡガイド下ＦｏｋＩヌクレアーゼに関する。
一部の実施形態において、１つ以上の機能ドメインは、ｓｇＲＮＡ及び標的への結合時に機能ドメインがその帰属機能で機能することが可能な空間的配置に機能ドメインが置かれるようにＣ２ｃ２エフェクタータンパク質に付加される。
一部の実施形態において、１つ以上の機能ドメインは、Ｃ２ｃ２エフェクタータンパク質がｓｇＲＮＡ及び標的に結合すると、機能ドメインがその帰属機能で機能することが可能な空間的配置に機能ドメインが置かれるようにアダプタータンパク質に付加される。
ある態様において、本発明は、本明細書に考察されるとおりの組成物を提供し、ここで１つ以上の機能ドメインは、本明細書で考察するとおりのリンカー、任意選択でＧｌｙＳｅｒリンカーを介してＣ２ｃ２エフェクタータンパク質又はアダプタータンパク質に付加される。
また、翻訳、安定性等に関わるものなど、内因性（調節性）制御エレメントを標的化することも好ましい。公知の制御エレメントのターゲティングを用いて目的の遺伝子を活性化又は抑制し得る。他方で推定制御エレメントのターゲティングは、かかるエレメントの確認手段（目的の遺伝子の翻訳を計測することによる）又は新規制御エレメントの検出手段として用いることができる（。加えて、推定制御エレメントのターゲティングは、疾患の遺伝的原因を解明する文脈において有用であり得る。疾患表現型に関連する多くの突然変異及び共通ＳＮＰ変異体が、コード領域外に位置する。他方で推定制御エレメントの標的化は、かかるエレメントの確認手段（目的の遺伝子の翻訳を計測することによる）又は新規制御エレメントの検出手段として用いることができる。加えて、推定制御エレメントの標的化は、疾患の遺伝的原因を解明する文脈において有用であり得る。疾患表現型に関連する多くの突然変異及び共通ＳＮＰ変異体が、コード領域外に位置する。本明細書に記載される活性化系又は抑制系のいずれかによるかかる領域の標的化は、その後に、ａ）一組の推定標的（例えば制御エレメントにごく近接して位置する一組の遺伝子）又はｂ）例えばＲＮＡｓｅｑ又はマイクロアレイによる全トランスクリプトーム読取りのいずれかの転写の読取りが続き得る。これにより、疾患表現型に関わると見込まれる候補遺伝子の同定が可能となり得る。かかる候補遺伝子は、新規薬物標的として有用であり得る。
ヒストンアセチルトランスフェラーゼ（ＨＡＴ）阻害因子が本明細書において言及される。しかしながら、一部の実施形態における代替例は、１つ以上の機能ドメインがアセチルトランスフェラーゼ、好ましくはヒストンアセチルトランスフェラーゼを含むものである。これらはエピゲノミクスの分野において、例えばエピゲノムの探索方法で有用である。エピゲノムの探索方法には、例えばエピゲノム配列の標的化が含まれ得る。エピゲノム配列の標的化には、ガイドがエピゲノム標的配列に向けられることが含まれ得る。エピゲノム標的配列には、一部の実施形態において、プロモーター、サイレンサー又はエンハンサー配列が含まれ得る。
本明細書に記載されるとおりのＣ２ｃ２エフェクタータンパク質、好ましくはデッドＣ２ｃ２エフェクタータンパク質、より好ましくはデッドＦｎＣ２ｃ２エフェクタータンパク質に連結した機能ドメインを用いることによるエピゲノム配列の標的化は、プロモーター、サイレンサー又はエンハンサーを活性化し又は抑制するために用いることができる。
アセチルトランスフェラーゼの例は公知であり、しかし一部の実施形態ではヒストンアセチルトランスフェラーゼを含み得る。一部の実施形態において、ヒストンアセチルトランスフェラーゼはヒトアセチルトランスフェラーゼｐ３００の触媒コアを含み得る（Ｇｅｒｂａｓｃｈ ＆ Ｒｅｄｄｙ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ ６ｔｈ Ａｐｒｉｌ ２０１５）。
一部の好ましい実施形態では、機能ドメインがデッドＣ２ｃ２エフェクタータンパク質に連結され、プロモーター又はエンハンサーなどのエピゲノム配列を標的化及び活性化する。かかるプロモーター又はエンハンサーに向けられる１つ以上のガイドもまた提供されて、かかるプロモーター又はエンハンサーへのＣＲＩＳＰＲ酵素の結合を導き得る。
特定の実施形態において、本発明のＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質を使用して、ＤＮＡ／クロマチン構造の同時転写改変、ＲＮＡ依存性ＤＮＡメチル化、又はＤＮＡ／クロマチンのＲＮＡ依存性サイレンシング／活性化に干渉することができる。ＲＮＡ依存性ＤＮＡメチル化（ＲｄＤＭ）は、当初植物で発見されたエピジェネティック過程である。ＲｄＤＭの間、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）が２１～２４ヌクレオチドの低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）にプロセシングされ、相同ＤＮＡ遺伝子座のメチル化を誘導する。ＲＮＡ分子に加えて、アルゴノート、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ、クロマチンリモデリング複合体及び植物特異的ＰｏｌＩＶ及びＰｏｌＶなど、多量のタンパク質がＲｄＤＭの確立に関わる。これら全てが協調して働き、シトシンの５’位にメチル基を付加する。低分子ＲＮＡはアルゴノート含有複合体を相補的な新生（非コード）ＲＮＡ転写物（ｔｒａｎｃｒｉｐｔ）にガイドすることによりクロマチン構造を改変し、転写をサイレンシングし得る。続いてヒストン及びＤＮＡメチルトランスフェラーゼを含むクロマチン修飾複合体の動員が媒介される。本発明のＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質を使用してかかる低分子ＲＮＡを標的化し、それらの低分子ＲＮＡと新生非コード転写物との間の相互作用に干渉し得る。
用語「～と会合している」は、ここでは機能ドメインとＣ２ｃ２エフェクタータンパク質又はアダプタータンパク質の会合に関して用いられる。これは、例えばアダプタータンパク質と機能ドメインとの間、又はＣ２ｃ２エフェクタータンパク質と機能ドメインとの間で、一つの分子がどのように別の分子と「会合」しているかに関して用いられる。かかるタンパク質間相互作用の場合、この会合は、抗体がエピトープを認識する方法における認識の観点で考えられてもよい。或いは、一つのタンパク質が別のタンパク質と、それら２つの融合物を介して会合していてもよく、例えば一つのサブユニットが別のサブユニットに融合していてもよい。融合は典型的には、例えば、各タンパク質又はサブユニットをコードするヌクレオチド配列を併せてスプライシングすることにより、一方のアミノ酸配列を他方のアミノ酸配列に加えることによって起こる。或いは、これは、本質的に、融合タンパク質など、２つの分子間の結合又は直接的な連結と考えられてもよい。いずれにしろ、融合タンパク質は２つの目的のサブユニット間（即ち酵素と機能ドメインとの間又はアダプタータンパク質と機能ドメインとの間）にリンカーを含んでもよい。従って、一部の実施形態において、Ｃ２ｃ２エフェクタータンパク質又はアダプタータンパク質は機能ドメインへの結合によってそれと会合している。他の実施形態において、Ｃ２ｃ２エフェクタータンパク質又はアダプタータンパク質は機能ドメインと、それらの２つが任意選択で中間リンカーを介して一体に融合されているため、会合している。リンカーの例としては、本明細書で考察されるＧｌｙＳｅｒリンカーが挙げられる。
飽和突然変異誘発
本明細書に記載される１つ又は複数のＣ２ｃ２エフェクタータンパク質系は、例えば、遺伝子発現、薬剤耐性、及び疾患の好転に必要な機能性エレメントの重要な最小限の特徴及び個別的な脆弱性を決定するための、細胞表現型と併せたゲノム遺伝子座における飽和又はディープスキャニング突然変異誘発の実施に用いることができる。飽和又はディープスキャニング突然変異誘発とは、ゲノム遺伝子座内であらゆる又は本質的にあらゆるＲＮＡ塩基が切断されることを意味する。Ｃ２ｃ２エフェクタータンパク質ガイドＲＮＡのライブラリが細胞集団に導入される。このライブラリは、各細胞がシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を受け取るように導入され得る。本明細書に記載されるとおり、ライブラリがウイルスベクターの形質導入によって導入される場合、低い感染多重度（ＭＯＩ）が用いられる。ライブラリは、ゲノム遺伝子座において（プロトスペーサー隣接モチーフ）（ＰＡＭ）配列の上流にある全ての配列を標的化するｓｇＲＮＡを含み得る。ライブラリは、ゲノム遺伝子座内の１０００塩基対毎にＰＡＭ配列の上流に少なくとも１００個の非重複ゲノム配列を含み得る。ライブラリは、少なくとも１つの異なるＰＡＭ配列の上流の配列を標的化するｓｇＲＮＡを含み得る。１つ又は複数のＣ２ｃ２エフェクタータンパク質系は２つ以上のＣ２ｃ２タンパク質を含み得る。異なるＰＡＭ配列を認識するオルソログ又はエンジニアリングされたＣ２ｃ２エフェクタータンパク質を含め、本明細書に記載されるとおりの任意のＣ２ｃ２エフェクタータンパク質を用いることができる。ｓｇＲＮＡに関するオフターゲット部位の頻度は５００未満であり得る。オフターゲットスコアを作成して、最も低いオフターゲット部位のｓｇＲＮＡを選択し得る。単一の実験で同じ部位を標的化するｓｇＲＮＡを用いることにより、ｓｇＲＮＡ標的部位における切断に関連すると決定された任意の表現型を確認し得る。標的部位の検証はまた、本明細書に記載されるとおりの改変Ｃ２ｃ２エフェクタータンパク質、及び目的のゲノム部位を標的化する２つのｓｇＲＮＡを用いることにより行ってもよい。理論によって拘束されないが、標的部位は、検証実験で表現型の変化が観察された場合に真のヒットである。
飽和又はディープスキャニング突然変異誘発のために１つ又は複数のＣ２ｃ２エフェクタータンパク質系を細胞集団で使用することができる。１つ又は複数のＣ２ｃ２エフェクタータンパク質系は、限定はされないが哺乳類細胞及び植物細胞を含め、真核細胞で使用することができる。細胞集団は原核細胞であってもよい。真核細胞集団は胚性幹（ＥＳ）細胞、神経細胞、上皮細胞、免疫細胞、内分泌細胞、筋細胞、赤血球、リンパ球、植物細胞、又は酵母細胞の集団であってもよい。
一態様において、本発明は、表現型の変化に関連する機能性エレメントのスクリーニング方法を提供する。Ｃ２ｃ２エフェクタータンパク質を含むように適合された細胞集団にライブラリを導入し得る。細胞を表現型に基づき少なくとも２つの群に分類し得る。表現型は、遺伝子の発現、細胞成長、又は細胞生存度であってもよい。各群に存在するガイドＲＮＡの相対的表現を決定し、それによって表現型の変化に関連するゲノム部位を、各群に存在するガイドＲＮＡの表現によって決定する。表現型の変化は、目的の遺伝子の発現の変化であってもよい。目的の遺伝子は上方制御され、下方制御され、又はノックアウトされ得る。細胞は高発現群と低発現群とに分類され得る。細胞集団は、表現型の決定に用いられるレポーター構築物を含み得る。レポーター構築物は検出可能なマーカーを含み得る。細胞は、検出可能なマーカーを用いることによって分類し得る。
別の態様において、本発明は、化学的化合物耐性に関連するゲノム部位のスクリーニング方法を提供する。化学的化合物は薬物又は農薬であり得る。Ｃ２ｃ２エフェクタータンパク質を含むように適合された細胞集団にライブラリを導入することができ、ここで集団の各細胞は１つ以下のガイドＲＮＡを含有する；細胞集団を化学的化合物で処理する；及び化学的化合物による処理後、早い時点と比較した遅い時点におけるガイドＲＮＡの表現を決定し、それによって化学的化合物耐性に関連するゲノム部位をガイドＲＮＡのエンリッチメントによって決定する。ｓｇＲＮＡの表現はディープシーケンシング方法によって決定してもよい。
Ｃ２ｃ２エフェクタータンパク質複合体を利用する本発明の実施では、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９系で用いられる方法が有用であり、「Ｃａｓ９媒介インサイチュー飽和突然変異誘発によるＢＣＬ１１Ａエンハンサー分析（ＢＣＬ１１Ａ ｅｎｈａｎｃｅｒ ｄｉｓｓｅｃｔｉｏｎ ｂｙ Ｃａｓ９－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｎ ｓｉｔｕ ｓａｔｕｒａｔｉｎｇ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）」と題される論文が参照される。Ｃａｎｖｅｒ，Ｍ．Ｃ．，Ｓｍｉｔｈ，Ｅ．Ｃ．，Ｓｈｅｒ，Ｆ．，Ｐｉｎｅｌｌｏ，Ｌ．，Ｓａｎｊａｎａ，Ｎ．Ｅ．，Ｓｈａｌｅｍ，Ｏ．，Ｃｈｅｎ，Ｄ．Ｄ．，Ｓｃｈｕｐｐ，Ｐ．Ｇ．，Ｖｉｎｊａｍｕｒ，Ｄ．Ｓ．，Ｇａｒｃｉａ，Ｓ．Ｐ．，Ｌｕｃ，Ｓ．，Ｋｕｒｉｔａ，Ｒ．，Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｙ．，Ｆｕｊｉｗａｒａ，Ｙ．，Ｍａｅｄａ，Ｔ．，Ｙｕａｎ，Ｇ．，Ｚｈａｎｇ，Ｆ．，Ｏｒｋｉｎ，Ｓ．Ｈ．，＆ Ｂａｕｅｒ，Ｄ．Ｅ．ＤＯＩ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ１５５２１，オンライン発行 Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ １６，２０１５が参照され、この論文は本明細書において参照により援用され、及び以下に簡単に考察する。
・Ｃａｎｖｅｒ ｅｔ ａｌ．は、胎児ヘモグロビン（ＨｂＦ）レベルに関連する且つそのマウスオルソログが赤血球ＢＣＬ１１Ａ発現に必要であるエンハンサーとして既に同定されたヒト及びマウスＢＣＬ１１Ａ赤血球エンハンサーのインサイチュ飽和突然変異誘発を実施するための新規プールＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ガイドＲＮＡライブラリについて包含している。この手法から、これらのエンハンサーの重要な最小限の特徴及び個別的な脆弱性が明らかになった。この著者らは、初代ヒト前駆細胞の編集及びマウストランスジェネシスを用いて、ＨｂＦ再誘導の標的としてのＢＣＬ１１Ａ赤血球エンハンサーを実証した。この著者らは、治療的ゲノム編集についての情報を与える詳細なエンハンサーマップを作成した。
Ｃ２ｃ２系を用いて細胞又は生物を改変する方法
一部の実施形態における本発明は、細胞又は生物を改変する方法を包含する。細胞は原核細胞又は真核細胞であってもよい。細胞は哺乳類細胞であってもよい。哺乳類細胞は、非ヒト霊長類、ウシ、ブタ、げっ歯類又はマウス細胞であってもよい。細胞は、家禽、魚類又はエビなどの非哺乳類真核細胞であってもよい。細胞はまた、植物細胞であってもよい。植物細胞は、キャッサバ、トウモロコシ、モロコシ、コムギ、又はコメなどの作物植物であってもよい。植物細胞はまた、藻類、樹木又は野菜であってもよい。本発明によって細胞に導入される改変は、抗体、デンプン、アルコール又は他の所望の細胞産出物などの生物学的産物の産生向上のため細胞及び細胞の子孫を変化させるようなものであり得る。本発明によって細胞に導入される改変は、産生される生物学的産物を変える変化が細胞及び細胞の子孫に含まれるようなものであり得る。
本系は１つ以上の異なるベクターを含み得る。本発明のある態様において、エフェクタータンパク質は、所望の細胞型、優先的に真核細胞、好ましくは哺乳類細胞又はヒト細胞での発現にコドンが最適化されている。
パッケージング細胞は、典型的には、宿主細胞への感染能を有するウイルス粒子の形成に使用される。かかる細胞としては、アデノウイルスをパッケージングする２９３細胞、及びレトロウイルスをパッケージングするψ２細胞又はＰＡ３１７細胞が挙げられる。遺伝子療法に使用されるウイルスベクターは、通常、核酸ベクターをウイルス粒子中にパッケージングする細胞株を作製することにより作成される。ベクターは、典型的には、パッケージング及び続く宿主中への組込みに必要な最小限のウイルス配列を含有し、他のウイルス配列は、発現させるポリヌクレオチド用の発現カセットに置き換えられる。欠損ウイルス機能は、典型的には、パッケージング細胞株によってトランスで供給される。例えば、遺伝子療法に使用されるＡＡＶベクターは、典型的には、パッケージング及び宿主ゲノム中への組込みに必要なＡＡＶゲノム由来のＩＴＲ配列のみを有する。ウイルスＤＮＡは、他のＡＡＶ遺伝子、即ちｒｅｐ及びｃａｐをコードするもののＩＴＲ配列を欠くヘルパープラスミドを含有する細胞株中にパッケージングされる。この細胞株もまた、ヘルパーとしてアデノウイルスに感染させ得る。ヘルパーウイルスはＡＡＶベクターの複製及びヘルパープラスミドからのＡＡＶ遺伝子の発現を促進する。ヘルパープラスミドはＩＴＲ配列がないため、大きい量でパッケージングされることはない。アデノウイルスによる汚染は、例えば、アデノウイルスがＡＡＶよりも高い感受性を有する熱処理によって低減することができる。核酸を細胞に送達する更なる方法は、当業者に公知である。例えば、参照により本明細書に組み入れられる米国特許出願公開第２００３００８７８１７号明細書を参照のこと。
一部の実施形態において、宿主細胞が本明細書に記載の１つ以上のベクターによって一過性に又は非一過性にトランスフェクトされる。一部の実施形態では、細胞は、それが対象において天然に存在するとおりにトランスフェクトされる。一部の実施形態において、トランスフェクトされる細胞は対象から採取される。一部の実施形態において、細胞は、細胞株など、対象から採取された細胞に由来する。組織培養向けの広範な細胞株が、当技術分野において公知である。細胞株の例としては、限定はされないが、Ｃ８１６１、ＣＣＲＦ－ＣＥＭ、ＭＯＬＴ、ｍＩＭＣＤ－３、ＮＨＤＦ、ＨｅＬａ－Ｓ３、Ｈｕｈ１、Ｈｕｈ４、Ｈｕｈ７、ＨＵＶＥＣ、ＨＡＳＭＣ、ＨＥＫｎ、ＨＥＫａ、ＭｉａＰａＣｅｌｌ、Ｐａｎｃ１、ＰＣ－３、ＴＦ１、ＣＴＬＬ－２、Ｃ１Ｒ、Ｒａｔ６、ＣＶ１、ＲＰＴＥ、Ａ１０、Ｔ２４、Ｊ８２、Ａ３７５、ＡＲＨ－７７、Ｃａｌｕ１、ＳＷ４８０、ＳＷ６２０、ＳＫＯＶ３、ＳＫ－ＵＴ、ＣａＣｏ２、Ｐ３８８Ｄ１、ＳＥＭ－Ｋ２、ＷＥＨＩ－２３１、ＨＢ５６、ＴＩＢ５５、ジャーカット、Ｊ４５．０１、ＬＲＭＢ、Ｂｃｌ－１、ＢＣ－３、ＩＣ２１、ＤＬＤ２、Ｒａｗ２６４．７、ＮＲＫ、ＮＲＫ－５２Ｅ、ＭＲＣ５、ＭＥＦ、Ｈｅｐ Ｇ２、ＨｅＬａ Ｂ、ＨｅＬａ Ｔ４、ＣＯＳ、ＣＯＳ－１、ＣＯＳ－６、ＣＯＳ－Ｍ６Ａ、ＢＳ－Ｃ－１サル腎臓上皮、ＢＡＬＢ／３Ｔ３マウス胚線維芽細胞、３Ｔ３スイス、３Ｔ３－Ｌ１、１３２－ｄ５ヒト胎児線維芽細胞；１０．１マウス線維芽細胞、２９３－Ｔ、３Ｔ３、７２１、９Ｌ、Ａ２７８０、Ａ２７８０ＡＤＲ、Ａ２７８０ｃｉｓ、Ａ１７２、Ａ２０、Ａ２５３、Ａ４３１、Ａ－５４９、ＡＬＣ、Ｂ１６、Ｂ３５、ＢＣＰ－１細胞、ＢＥＡＳ－２Ｂ、ｂＥｎｄ．３、ＢＨＫ－２１、ＢＲ２９３、ＢｘＰＣ３、Ｃ３Ｈ－１０Ｔ１／２、Ｃ６／３６、Ｃａｌ－２７、ＣＨＯ、ＣＨＯ－７、ＣＨＯ－ＩＲ、ＣＨＯ－Ｋ１、ＣＨＯ－Ｋ２、ＣＨＯ－Ｔ、ＣＨＯ Ｄｈｆｒ－／－、ＣＯＲ－Ｌ２３、ＣＯＲ－Ｌ２３／ＣＰＲ、ＣＯＲ－Ｌ２３／５０１０、ＣＯＲ－Ｌ２３／Ｒ２３、ＣＯＳ－７、ＣＯＶ－４３４、ＣＭＬ Ｔ１、ＣＭＴ、ＣＴ２６、Ｄ１７、ＤＨ８２、ＤＵ１４５、ＤｕＣａＰ、ＥＬ４、ＥＭ２、ＥＭ３、ＥＭＴ６／ＡＲ１、ＥＭＴ６／ＡＲ１０．０、ＦＭ３、Ｈ１２９９、Ｈ６９、ＨＢ５４、ＨＢ５５、ＨＣＡ２、ＨＥＫ－２９３、ＨｅＬａ、Ｈｅｐａ１ｃ１ｃ７、ＨＬ－６０、ＨＭＥＣ、ＨＴ－２９、ジャーカット、ＪＹ細胞、Ｋ５６２細胞、Ｋｕ８１２、ＫＣＬ２２、ＫＧ１、ＫＹＯ１、ＬＮＣａｐ、Ｍａ－Ｍｅｌ１－４８、ＭＣ－３８、ＭＣＦ－７、ＭＣＦ－１０Ａ、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１、ＭＤＡ－ＭＢ－４６８、ＭＤＡ－ＭＢ－４３５、ＭＤＣＫ ＩＩ、ＭＤＣＫ ＩＩ、ＭＯＲ／０．２Ｒ、ＭＯＮＯ－ＭＡＣ６、ＭＴＤ－１Ａ、ＭｙＥｎｄ、ＮＣＩ－Ｈ６９／ＣＰＲ、ＮＣＩ－Ｈ６９／ＬＸ１０、ＮＣＩ－Ｈ６９／ＬＸ２０、ＮＣＩ－Ｈ６９／ＬＸ４、ＮＩＨ－３Ｔ３、ＮＡＬＭ－１、ＮＷ－１４５、ＯＰＣＮ／ＯＰＣＴ細胞株、Ｐｅｅｒ、ＰＮＴ－１Ａ／ＰＮＴ２、ＲｅｎＣａ、ＲＩＮ－５Ｆ、ＲＭＡ／ＲＭＡＳ、Ｓａｏｓ－２細胞、Ｓｆ－９、ＳｋＢｒ３、Ｔ２、Ｔ－４７Ｄ、Ｔ８４、ＴＨＰ１細胞株、Ｕ３７３、Ｕ８７、Ｕ９３７、ＶＣａＰ、ベロ細胞、ＷＭ３９、ＷＴ－４９、Ｘ６３、ＹＡＣ－１、ＹＡＲ、及びそれらのトランスジェニック変種が挙げられる。細胞株は、当業者に公知の種々の供給元から入手可能である（例えば、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ：ＡＴＣＣ）（Ｍａｎａｓｓｕｓ，Ｖａ．）を参照）。一部の実施形態において、本明細書に記載される１つ以上のベクターによってトランスフェクトされた細胞を使用して、１つ以上のベクター由来配列を含む新規の細胞株が樹立される。一部の実施形態において、本明細書に記載される核酸ターゲティング系の構成成分によって一過性にトランスフェクトされ（例えば、１つ以上のベクターの一過性のトランスフェクション、又はＲＮＡによるトランスフェクションによる）、且つ核酸ターゲティング複合体の活性を通して改変された細胞を使用して、改変は含むものの他のあらゆる外因性配列を欠く細胞を含む新規の細胞株が樹立される。一部の実施形態において、本明細書に記載される１つ以上のベクターによって一過性に又は非一過性にトランスフェクトされた細胞、又はかかる細胞から誘導される細胞株が、１つ以上の試験化合物の評価において使用される。
一部の実施形態では、本明細書に記載される１つ以上のベクターを用いて非ヒトトランスジェニック動物又はトランスジェニック植物が作製される。一部の実施形態において、トランスジェニック動物は、マウス、ラット、又はウサギなどの哺乳動物である。特定の実施形態において、生物又は対象は植物である。特定の実施形態において、生物又は対象又は植物は藻類である。トランスジェニック植物及び動物の作製方法は当該技術分野において公知であり、一般には、本明細書に記載されるものなど、細胞トランスフェクション方法から始まる。
一態様において、本発明は、真核細胞内の標的ポリヌクレオチドの改変方法を提供する。一部の実施形態において、本方法は、核酸ターゲティング複合体を標的ポリヌクレオチドに結合させて前記標的ポリヌクレオチドの切断を生じさせ、それにより標的ポリヌクレオチドを改変することを含み、ここで核酸ターゲティング複合体は、前記標的ポリヌクレオチド内の標的配列にハイブリダイズするガイドＲＮＡと複合体を形成した核酸ターゲティングエフェクタータンパク質を含む。
一態様において、本発明は、真核細胞内のポリヌクレオチドの発現を改変する方法を提供する。一部の実施形態において、本方法は、核酸ターゲティング複合体をポリヌクレオチドに結合させて、前記結合により前記ポリヌクレオチドの発現の増加又は減少を生じさせることを含み；ここで核酸ターゲティング複合体は、前記ポリヌクレオチド内の標的配列にハイブリダイズするガイドＲＮＡと複合体を形成した核酸ターゲティングエフェクタータンパク質を含む。
Ｃ２ｃ２エフェクタータンパク質複合体は植物で使用することができる
Ｃ２ｃ２エフェクタータンパク質系（例えば単一の又は多重化した）は、作物ゲノミクスにおける近年の進歩と併せて用いることができる。本明細書に記載される系を使用して、効率的で且つ対費用効果の高い植物遺伝子又はゲノムの探索又は編集又は操作を－例えば、植物遺伝子又はゲノムの迅速な調査及び／又は選択及び／又は探索及び／又は比較及び／又は操作及び／又は形質転換のため、実施することができ；例えば、１つ又は複数の形質又は１つ又は複数の特徴を作出し、同定し、開発し、最適化し、又は１つ又は複数の植物に付与し、又は植物ゲノムを形質転換することができる。従って、植物の生産の向上、新規組み合わせの形質又は特徴を有する新規植物、又は形質が増強された新規植物があり得る。Ｃ２ｃ２エフェクタータンパク質系は、植物に関して、部位特異的組込み（ＳＤＩ）又は遺伝子編集（ＧＥ）又は任意の準逆育種（ＮＲＢ）又は逆育種（ＲＢ）技術において使用することができる。本明細書に記載されるＣ２ｃ２エフェクタータンパク質系を利用する態様は、植物におけるＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ（例えばＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９）系の使用と同様であってもよく、アリゾナ大学（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ａｒｉｚｏｎａ）ウェブサイト「ＣＲＩＳＰＲ－ＰＬＡＮＴ」（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｏｍｅ．ａｒｉｚｏｎａ．ｅｄｕ／ｃｒｉｓｐｒ／）（後援Ｐｅｎｎ Ｓｔａｔｅ及びＡＧＩ）が挙げられる。本発明の実施形態（ｅｍｏｄｉｍｅｎｔｓ）は、植物におけるゲノム編集で、又はＲＮＡｉ若しくは同様のゲノム編集技法が既に用いられているところで用いることができる；例えば、Ｎｅｋｒａｓｏｖ，「容易になった植物ゲノム編集：ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を使用したモデル及び作物植物における標的突然変異誘発（Ｐｌａｎｔ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｍａｄｅ ｅａｓｙ：ｔａｒｇｅｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎ ｍｏｄｅｌ ａｎｄ ｃｒｏｐ ｐｌａｎｔｓ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ ｓｙｓｔｅｍ）」，Ｐｌａｎｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０１３，９：３９（ｄｏｉ：１０．１１８６／１７４６－４８１１－９－３９）；Ｂｒｏｏｋｓ，「ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系を使用した第一世代のトマトにおける効率的遺伝子編集（Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｇｅｎｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｉｎ ｔｏｍａｔｏ ｉｎ ｔｈｅ ｆｉｒｓｔ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ｓｙｓｔｅｍ）」，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ ２０１４ ｐｐ １１４．２４７５７７；Ｓｈａｎ，「ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系を使用した作物植物の標的ゲノム改変（Ｔａｒｇｅｔｅｄ ｇｅｎｏｍｅ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｒｏｐ ｐｌａｎｔｓ ｕｓｉｎｇ ａ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ｓｙｓｔｅｍ）」，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３１，６８６－６８８（２０１３）；Ｆｅｎｇ，「ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を使用した植物における効率的なゲノム編集（Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｉｎ ｐｌａｎｔｓ ｕｓｉｎｇ ａ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ ｓｙｓｔｅｍ）」，Ｃｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２０１３）２３：１２２９－１２３２．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｃｒ．２０１３．１１４；オンライン発行 ２０ Ａｕｇｕｓｔ ２０１３；Ｘｉｅ，「ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系を使用した植物におけるＲＮＡガイド下ゲノム編集（ＲＮＡ－ｇｕｉｄｅｄ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｉｎ ｐｌａｎｔｓ ｕｓｉｎｇ ａ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ｓｙｓｔｅｍ）」，Ｍｏｌ Ｐｌａｎｔ．２０１３ Ｎｏｖ；６（６）：１９７５－８３．ｄｏｉ：１０．１０９３／ｍｐ／ｓｓｔ１１９．Ｅｐｕｂ ２０１３ Ａｕｇ １７；Ｘｕ，「コメにおけるアグロバクテリウム・ツメファシエンス媒介ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系を使用した遺伝子ターゲティング（Ｇｅｎｅ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ｓｙｓｔｅｍ ｉｎ ｒｉｃｅ）」，Ｒｉｃｅ ２０１４，７：５（２０１４）、Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，「木本多年生植物ポプラ属（Ｐｏｐｕｌｕｓ）の外交配における両アレルＣＲＩＳＰＲ突然変異へのＳＮＰの利用により、４－クマル酸：ＣｏＡリガーゼ特異性及び冗長性が明らかになる（Ｅｘｐｌｏｉｔｉｎｇ ＳＮＰｓ ｆｏｒ ｂｉａｌｌｅｌｉｃ ＣＲＩＳＰＲ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｔｈｅ ｏｕｔｃｒｏｓｓｉｎｇ ｗｏｏｄｙ ｐｅｒｅｎｎｉａｌ Ｐｏｐｕｌｕｓ ｒｅｖｅａｌｓ ４－ｃｏｕｍａｒａｔｅ：ＣｏＡ ｌｉｇａｓｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ａｎｄ Ｒｅｄｕｎｄａｎｃｙ）」，Ｎｅｗ Ｐｈｙｔｏｌｏｇｉｓｔ（２０１５）（Ｆｏｒｕｍ）１－４（ｗｗｗ．ｎｅｗｐｈｙｔｏｌｏｇｉｓｔ．ｃｏｍにおいてオンラインでのみ入手可能）；Ｃａｌｉａｎｄｏ ｅｔ ａｌ，「宿主ゲノムを安定に担持するＣＲＩＳＰＲデバイスを使用した標的ＤＮＡ分解（Ｔａｒｇｅｔｅｄ ＤＮＡ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ａ ＣＲＩＳＰＲ ｄｅｖｉｃｅ ｓｔａｂｌｙ ｃａｒｒｉｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｈｏｓｔ ｇｅｎｏｍｅ）」，ＮＡＴＵＲＥ ＣＯＭＭＵＮＩＣＡＴＩＯＮＳ ６：６９８９，ＤＯＩ：１０．１０３８／ｎｃｏｍｍｓ７９８９，ｗｗｗ．ｎａｔｕｒｅ．ｃｏｍ／ｎａｔｕｒｅｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ＤＯＩ：１０．１０３８／ｎｃｏｍｍｓ７９８９；米国特許第６，６０３，０６１号明細書－アグロバクテリウム属媒介性植物形質転換方法（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ－Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｐｌａｎｔ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄ）；米国特許第７，８６８，１４９号明細書－植物ゲノム配列及びその使用（Ｐｌａｎｔ Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ａｎｄ Ｕｓｅｓ Ｔｈｅｒｅｏｆ）及び米国特許出願公開第２００９／０１００５３６号明細書－農業形質が増強されたトランスジェニック植物（Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｐｌａｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ａｇｒｏｎｏｍｉｃ Ｔｒａｉｔｓ）（これらの各々の内容及び開示は全て、本明細書において全体として参照により援用される）を参照のこと。本発明の実施では、Ｍｏｒｒｅｌｌ ｅｔ ａｌ「作物ゲノミクス：進展と応用（Ｃｒｏｐ ｇｅｎｏｍｉｃｓ：ａｄｖａｎｃｅｓ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）」，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｇｅｎｅｔ．２０１１ Ｄｅｃ ２９；１３（２）：８５－９６の内容及び開示；その各々が、本明細書における実施形態が植物に関してどのように用いられ得るかに関してを含め、参照により本明細書に援用される。従って、本明細書において動物細胞への言及はまた、特に明らかでない限り、適宜修正して植物細胞にも適用し得る；及び、オフターゲット効果が低下した本明細書における酵素及びかかる酵素を利用する系は、本明細書に記載するものを含め、植物適用（ａｐｐｌｃｉａｔｉｏｎｓ）に用いることができる。
Ｓｕｇａｎｏ ｅｔ ａｌ．（Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．２０１４ Ｍａｒ；５５（３）：４７５－８１．ｄｏｉ：１０．１０９３／ｐｃｐ／ｐｃｕ０１４．Ｅｐｕｂ ２０１４ Ｊａｎ １８）は、陸上植物進化の研究向けのモデル種として浮上しているゼニゴケのマルカンティア・ポリモルファ・Ｌ．（Ｍａｒｃｈａｎｔｉａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ Ｌ．）における標的突然変異誘発へのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９の適用を報告している。Ｍ．ポリモルファ（Ｍ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）のＵ６プロモーターが同定及びクローニングされ、ｇＲＮＡが発現された。ｇＲＮＡの標的配列は、Ｍ．ポリモルファ（Ｍ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）のオーキシン応答因子１（ＡＲＦ１）をコードする遺伝子を破壊するように設計された。Ｓｕｇａｎｏ ｅｔ ａｌ．は、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）媒介性形質転換を用いてＭ．ポリモルファ（Ｍ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）の配偶体世代における安定突然変異体を単離した。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ベースのインビボ部位特異的突然変異誘発が、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓ又はＭ．ポリモルファ（Ｍ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）ＥＦ１αのいずれかのプロモーターを用いてＣａｓ９を発現させることにより達成された。オーキシン耐性表現型を示す単離された突然変異個体はキメラではなかった。更に、Ｔ１植物の無性生殖によって安定突然変異体が産生された。ＣＲＩＰＳＲ－Ｃａｓ９ベースの標的突然変異誘発を用いて複数のａｒｆ１対立遺伝子が容易に構築された。本発明のＣ２ｃ２系を使用して同じ並びに他の遺伝子を調節することができ、ＲＮＡｉ及びｓｉＲＮＡなどの発現制御系（ｓｙｓｔｅｓｍ）と同様に、本発明の方法は誘導可能且つ可逆である。
Ｋａｂａｄｉ ｅｔ ａｌ．（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０１４ Ｏｃｔ ２９；４２（１９）：ｅ１４７．ｄｏｉ：１０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋｕ７４９．Ｅｐｕｂ ２０１４ Ａｕｇ １３）は、好都合なゴールデンゲートクローニング方法によってベクターに取り込まれた独立したＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターからＣａｓ９変異体、レポーター遺伝子及び最大４つのｓｇＲＮＡを発現する単一レンチウイルス系を開発した。各ｓｇＲＮＡが効率的に発現しており、不死化及び初代ヒト細胞において多重遺伝子編集及び持続的な転写活性化を媒介することができる。本発明を使用してＫａｂａｄｉの植物遺伝子を調節することができる。
Ｘｉｎｇ ｅｔ ａｌ．（ＢＭＣ Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２０１４，１４：３２７）は、ｐＧｒｅｅｎ又はｐＣＡＭＢＩＡ骨格、並びにｇＲＮＡをベースとしてＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９バイナリーベクターセットを開発した。このツールキットは、ＢｓａＩの他には制限酵素を必要とすることなしに、トウモロコシコドン最適化Ｃａｓ９及び１つ以上のｇＲＮＡを持つ最終構築物を僅か１回のクローニングステップで効率良く生成する。このツールキットはトウモロコシプロトプラスト、トランスジェニックトウモロコシ株、及びトランスジェニックアラビドプシス属（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）株を用いて実証され、高い効率及び特異性を呈することが示された。更に重要なことには、このツールキットを使用して、Ｔ１世代のトランスジェニック実生で３つのアラビドプシス属（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）遺伝子の標的突然変異が検出された。更に、複数の遺伝子突然変異を次世代に受け継ぐことができた。植物における多重ゲノム編集用のツールキットとして、（ガイドＲＮＡ）モジュールベクターセット。本発明のＣ２ｃ２系及びタンパク質を使用して、Ｘｉｎｇが標的とする遺伝子を標的化し得る。
本発明のＣ２ｃ２ ＣＲＩＳＰＲ系は植物ウイルスの検出に使用し得る。Ｇａｍｂｉｎｏ ｅｔ ａｌ．（Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ．２００６ Ｎｏｖ；９６（１１）：１２２３－９．ｄｏｉ：１０．１０９４／ＰＨＹＴＯ－９６－１２２３）は増幅及びマルチプレックスＰＣＲに頼って９つのブドウウイルスを同時検出する。本発明のＣ２ｃ２系及びタンパク質を同様に使用して、宿主における複数の標的を検出し得る。更に、本発明の系を使用して高価値な栽培品種におけるウイルス遺伝子発現を同時にノックダウンし、及び発現したウイルスＲＮＡ（ｖｉａｌ ＲＮＡ）のターゲティングにより活性化又は更なる感染を防ぐことができる。
Ｍｕｒｒａｙ ｅｔ ａｌ． （Ｐｒｏｃ Ｂｉｏｌ Ｓｃｉ． ２０１３ Ｊｕｎ ２６；２８０（１７６５）：２０１３０９６５． ｄｏｉ： １０．１０９８／ｒｓｐｂ．２０１３．０９６５；２０１３年８月２２日発表）は１２の植物ＲＮＡウイルスを分析して進化速度（ｅｖｏｌｕａｔｉｏｎａｒｙ ｒａｔｅ）を調べ、恐らくは異なる宿主遺伝子型（ｇｅｎｏｔｙｏｐｅ）間又は種間でのシフトに起因する一時的選択のエビデンスを見出した。本発明のＣ２ｃ２系及びタンパク質を使用して宿主におけるかかるウイルスを標的化し、又はそれに対して免疫を付与し得る。例えば、本発明の系を使用して、ウイルスＲＮＡ発現、ひいては複製を遮断することができる。また、本発明を使用して切断のため核酸（ｎｕｃｌｉｃ ａｃｉｄｓ）を標的化し、並びに発現又は活性化を標的化することもできる。更に、本発明の系は多重化することができ、そのため同じウイルスの複数の標的又は複数の分離株に当てることができる。
Ｍａ ｅｔ ａｌ．（Ｍｏｌ Ｐｌａｎｔ．２０１５ Ａｕｇ ３；８（８）：１２７４－８４．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｍｏｌｐ．２０１５．０４．００７）は、単子葉及び双子葉植物における簡便で高効率な多重ゲノム編集のための、植物コドン最適化Ｃａｓ９遺伝子を利用したロバストなＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ベクター系を報告している。Ｍａ ｅｔ ａｌ．は、複数のｓｇＲＮＡ発現カセットを迅速に作成するためのＰＣＲベースの手順を設計しており、これはゴールデンゲートライゲーション又はギブソンアセンブリにより１ラウンドのクローニングでバイナリーＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ベクターにアセンブルすることができる。この系で、Ｍａ ｅｔ ａｌ．はコメの４６ヵ所の標的部位を編集し、平均８５．４％の突然変異率で、ほとんどが二アレル及びホモ接合状態であった。Ｍａ ｅｔ ａｌ．は、遺伝子ファミリーの複数の（最大８個の）メンバー、生合成経路の複数の遺伝子、又は単一遺伝子内の複数の部位を同時に標的化することにより、Ｔ０コメ及びＴ１アラビドプシス属（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）植物の機能喪失型遺伝子突然変異の例を提供している。同様に、本発明のＣ２ｃ２系は複数の遺伝子の発現を同時に差次的に（ｄｆｆｉｅｉｃｎｅｌｔｙ）標的化することができる。
Ｌｏｗｄｅｒ ｅｔ ａｌ．（Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．２０１５ Ａｕｇ ２１．ｐｉｉ：ｐｐ．００６３６．２０１５）もまた、植物における発現した、サイレンシングされた又は非コードの遺伝子の多重ゲノム編集及び転写調節を可能にするＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ツールボックスを開発した。このツールボックスは、ゴールデンゲート及びゲートウェイクローニング方法を用いて単子葉類及び双子葉類のための機能性ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ Ｔ－ＤＮＡ構築物を迅速且つ効率的にアセンブルするためのプロトコル及び試薬を研究者に提供する。これは、植物内因性遺伝子の多重遺伝子編集及び転写活性化又は抑制を含め、完全な一揃いの能力を備えている。Ｔ－ＤＮＡベースの形質転換技術は、現代の植物バイオテクノロジー、遺伝学、分子生物学及び生理学の基礎である。そのため、本発明者らは、Ｃａｓ９（ＷＴ、ニッカーゼ又はｄＣａｓ９）及び１つ又は複数のｇＲＮＡを目的のデスティネーションＴ－ＤＮＡベクターにアセンブルする方法を開発した。このアセンブル方法は、ゴールデンゲートアセンブリ及びマルチサイトゲートウェイ組換えの両方に基づく。アセンブリには３つのモジュールが必要である。第１のモジュールはＣａｓ９エントリーベクターであり、これは、ａｔｔＬ１及びａｔｔＲ５部位が隣接したプロモーターレスＣａｓ９又はその誘導遺伝子を含有する。第２のモジュールはｇＲＮＡエントリーベクターであり、これは、ａｔｔＬ５及びａｔｔＬ２部位が隣接したエントリーｇＲＮＡ発現カセットを含有する。第３のモジュールは、Ｃａｓ９発現用に選択されたプロモーターを提供するａｔｔＲ１－ａｔｔＲ２含有デスティネーションＴ－ＤＮＡベクターを含む。Ｌｏｗｄｅｒ ｅｔ ａｌ．のツールボックスは、本発明のＣ２ｃ２エフェクタータンパク質系に適用し得る。
酵母及び微細藻類などの生物は、合成生物学に広く用いられている。Ｓｔｏｖｉｃｅｋ ｅｔ ａｌ．（Ｍｅｔａｂ．Ｅｎｇ．Ｃｏｍｍ．，２０１５；２：１３は、工業生産用のロバストな株を効率的に作製するための工業用酵母、例えばサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓａｅ）のゲノム編集について記載している。Ｓｔｏｖｉｃｅｋは、酵母にコドン最適化されたＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９系を使用して内因性遺伝子の両方のアレルを同時に破壊し、異種遺伝子をノックインした。ゲノム又はエピソーム２μ系ベクター位置からＣａｓ９及びｇＲＮＡを発現させた。この著者らはまた、Ｃａｓ９及びｇＲＮＡ発現レベルを最適化することにより遺伝子破壊効率を改善できたことも示した。Ｈｌａｖｏｖａ ｅｔ ａｌ．（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｄｖ．２０１５）は、挿入突然変異誘発及びスクリーニングのため核及び葉緑体遺伝子を標的化するＣＲＩＳＰＲなどの技法を用いた微細藻類の種又は株の開発を考察している。本発明のＣ２ｃ２系に同じプラスミド及びベクターを適用することができる。
Ｐｅｔｅｒｓｅｎ（「正確にグリコールエンジニアリングされた植物に向けて（Ｔｏｗａｒｄｓ ｐｒｅｃｉｓｅｌｙ ｇｌｙｃｏｌ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｐｌａｎｔｓ）」，Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｄｅｎｍａｒｋ Ａｎｎｕａｌ ｍｅｅｔｉｎｇ ２０１５，Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ，Ｄｅｎｍａｒｋ）は、所望の翻訳後修飾を有するタンパク質及び産物の産生のため、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を用いてアラビドプシス属（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）におけるゲノム変化をエンジニアリングする方法、例えばアラビドプシス属（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）を糖鎖エンジニアリングする方法を開発した。Ｈｅｂｅｌｓｔｒｕｐ ｅｔ ａｌ．（Ｆｒｏｎｔ Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉ．２０１５ Ａｐｒ ２３；６：２４７）は、デンプン修飾酵素を発現し、且つ通常はデンプンを工業的に化学処理及び／又は物理処理することによって作られる生産物を直接産生する作物を提供するインプランタでのデンプンバイオエンジニアリングを概説している。Ｐｅｔｅｒｓｅｎ及びＨｅｂｅｌｓｔｒｕｐの方法は、本発明のＣ２ｃ２エフェクタータンパク質系に適用し得る。
Ｋｕｒｔｈｅ ｔ ａｌ，Ｊ Ｖｉｒｏｌ．２０１２ Ｊｕｎ；８６（１１）：６００２－９．ｄｏｉ：１０．１１２８／ＪＶＩ．００４３６－１２．Ｅｐｕｂ ２０１２ Ｍａｒ ２１）は、ゲノムの遺伝的改変なしにブドウに所望の形質を導入するためのＲＮＡウイルスベースのベクターを開発した。このベクターは、ウイルス誘導性遺伝子サイレンシングによって内因性遺伝子の発現を調節する能力をもたらした。本発明のＣ２ｃ２系及びタンパク質を使用して、ゲノムの遺伝的改変なしに遺伝子及びタンパク質をサイレンシングすることができる。
ある実施形態において、植物はマメ科植物であってもよい。本発明は、本明細書に開示されるＣＲＩＳＰ－Ｃａｓ系を利用して、例えば、限定なしに、ダイズ、エンドウマメ、及びピーナッツを調査及び改変し得る。Ｃｕｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．がマメ科植物機能ゲノミクス用のツールボックスを提供している（Ｃｕｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，「マメ科植物機能ゲノミクスのためのゲノムエンジニアリングツールボックス（Ａ ｇｅｎｏｍｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｔｏｏｌｂｏｘ ｆｏｒ ｌｅｇｕｍｅ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｇｅｎｏｍｉｃｓ）」，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｐｌａｎｔ ａｎｄ Ａｎｉｍａｌ Ｇｅｎｏｍｅ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ ＸＸＩＩ ２０１４を参照）。ＣｕｒｔｉｎはＣＲＩＳＰＲの遺伝子形質転換を用いて単一コピーをノックアウト／ノックダウンし、毛状根及び全植物系の両方でマメ科植物遺伝子を複製した。標的遺伝子のうちのあるものは、ノックアウト／ノックダウン系（例えばフィトエンデサチュラーゼ）の特徴を調査し及び最適化するために選択され、一方、別のものは、アラビドプシス属（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）ダイサー様遺伝子とのダイズ相同性によるか、又はウマゴヤシ属（Ｍｅｄｉｃａｇｏ）における根粒形成のゲノムワイド関連分析によって同定された。本発明のＣ２ｃ２系及びタンパク質をノックアウト／ノックダウン系に使用することができる。
ピーナッツアレルギー及び一般にマメ科植物に対するアレルギーは、実在する重大な健康問題である。本発明のＣ２ｃ２エフェクタータンパク質系を使用して、かかるマメ科植物のアレルゲンタンパク質をコードする遺伝子を同定し、次にそれを編集し又はサイレンシングすることができる。かかる遺伝子及びタンパク質に関して限定なしに、Ｎｉｃｏｌａｏｕ ｅｔ ａｌ．が、ピーナッツ、ダイズ、レンズマメ、エンドウマメ、ルピナス、サヤマメ、及びヤエナリのアレルゲンタンパク質を同定している。Ｎｉｃｏｌａｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ａｌｌｅｒｇｙ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２０１１；１１（３）：２２２）を参照のこと。
有利な実施形態において、植物は樹木であってもよい。本発明はまた、本明細書に開示されるＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ系を草本系にも利用し得る（例えば、Ｂｅｌｈａｊ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ ９：３９及びＨａｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ ＆ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ２８：１８５９－１８７２を参照）。特に有利な実施形態において、本発明のＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ系は樹木における一塩基変異多型（ＳＮＰ）を標的化し得る（例えば、Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｗ Ｐｈｙｔｏｌｏｇｉｓｔ，Ｖｏｌｕｍｅ ２０８，Ｉｓｓｕｅ ２，ｐａｇｅｓ ２９８－３０１，Ｏｃｔｏｂｅｒ ２０１５を参照）。Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．の研究では、著者らは事例研究として４－クマル酸：ＣｏＡリガーゼ（４ＣＬ）遺伝子ファミリーを用いて木本多年生ポプルス属（Ｐｏｐｕｌｕｓ）でＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ系を適用し、標的化した２つの４ＣＬ遺伝子について１００％の突然変異効率を達成しており、ここで調べた形質転換体は全て、二対立遺伝子改変を有していた。Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．の研究では、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９系は一塩基変異多型（ＳＮＰ）に対する感受性が極めて高く、標的配列中のＳＮＰに起因して３番目の４ＣＬ遺伝子の切断が無効になった。これらの方法は、本発明のＣ２ｃ２エフェクタータンパク質系に適用し得る。
Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．（Ｎｅｗ Ｐｈｙｔｏｌｏｇｉｓｔ，Ｖｏｌｕｍｅ ２０８，Ｉｓｓｕｅ ２，ｐａｇｅｓ ２９８－３０１，Ｏｃｔｏｂｅｒ ２０１５）の方法は、以下のとおり本発明に適用し得る。それぞれリグニン及びフラボノイド生合成に関連する２つの４ＣＬ遺伝子、４ＣＬ１及び４ＣＬ２が、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９編集の標的とされる。ルーチンで形質転換に用いられるポプルス・トレムラ×アルバクローン（Ｐｏｐｕｌｕｓ ｔｒｅｍｕｌａ ｘ ａｌｂａ ｃｌｏｎｅ）７１７－１Ｂ４は、ゲノムシーケンシングされたポプルス・トリコカルパ（Ｐｏｐｕｌｕｓ ｔｒｉｃｈｏｃａｒｐａ）からの分岐である。従って、参照ゲノムから設計された４ＣＬ１及び４ＣＬ２ ｇＲＮＡをインハウスの７１７ ＲＮＡ－Ｓｅｑデータで調べることにより、Ｃａｓ効率を制限し得るＳＮＰがないことを確認する。４ＣＬ５用に設計された、４Ｌ１のゲノムデュプリケートである第３のｇＲＮＡもまた含める。対応する７１７配列は各対立遺伝子のＰＡＭの近傍／その内部に１つのＳＮＰを持ち、これらは両方ともに、４ＣＬ５－ｇＲＮＡによるターゲティングを無効にするものと思われる。３つ全てのｇＲＮＡ標的部位が第１のエクソン内に位置する。７１７形質転換については、ウマゴヤシ属（Ｍｅｄｉｃａｇｏ）Ｕ６．６プロモーターからｇＲＮＡが、バイナリーベクター中でＣａＭＶ ３５Ｓプロモーターの制御下にあるコドン最適化ヒトＣａｓと共に発現する。Ｃａｓのみのベクターによる形質転換が対照として働き得る。無作為に選択した４ＣＬ１及び４ＣＬ２株をアンプリコンシーケンシングに供する。次にデータを処理し、全ての場合において二対立遺伝子突然変異を確認する。これらの方法は、本発明のＣ２ｃ２エフェクタータンパク質系に適用し得る。
植物では、病原体は多くの場合に宿主特異的である。例えば、フザリウム・オキシスポラム・ｆ・エスピー・リコペルシシ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ ｆ．ｓｐ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｉ）はトマト萎凋病を引き起こすが、攻撃するのはトマトのみであり、Ｆ．オキシスポラム・ｆ・ジアンチ（Ｆ．ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ ｆ．ｄｉａｎｔｈｉｉ）、プクシニア・グラミニス・ｆ・エスピー・トリチシ（Ｐｕｃｃｉｎｉａ ｇｒａｍｉｎｉｓ ｆ．ｓｐ．ｔｒｉｔｉｃｉ）はコムギのみを攻撃する。植物は既存の誘導防御を有して多くの病原体に抵抗する。特に病原体が植物より高い頻度で複製することに伴い、植物世代間での突然変異及び組換えイベントが、感受性を生じさせる遺伝的変異性をもたらす。植物には非宿主抵抗性が存在することもあり、例えばその宿主と病原体とが適合しない。また、水平抵抗性、例えば、典型的には多くの遺伝子によって制御される、あらゆる病原体系統に対する部分抵抗性、及び垂直抵抗性、例えば、典型的には数個の遺伝子によって制御される、他の系統に対しては存在しない、一部の病原体系統に対する完全抵抗性も存在し得る。遺伝子対遺伝子レベルでは、植物と病原体とは共に進化し、一方の遺伝的変化が他方の変化と均衡する。従って、育種家は自然変異性を用いて、収穫量、品質、均一性、耐寒性、抵抗性に関して最も有用な遺伝子をかけ合わせる。抵抗性遺伝子の供給源には、天然又は外来品種、在来品種、野生植物の近縁種、及び誘発突然変異（例えば突然変異誘発物質による植物材料の処理）が含まれる。本発明を用いることで、突然変異を誘発する新規の手段が植物育種家に提供される。従って、当業者は抵抗性遺伝子の供給源のゲノムを分析し、且つ所望の特性又は形質を有する品種において本発明を用いることにより、これまでの突然変異誘発物質より高い精度で抵抗性遺伝子の産生を誘発し、ひいては植物育種プログラムを加速させ、及び改善することができる。
本明細書及び上記で他に考察される植物に加えて、提供されるとおりの、エフェクタータンパク質及び好適なガイドによって改変されたエンジニアリング植物、及びその子孫。これには、コムギ、オオムギ、コメ、ダイズ又はトウモロコシなど、病害又は干ばつ耐性作物；自家授粉能力を取り除き又は低下させるように改変された（しかし代わりに、任意選択で、代わりに雑種形成する）植物；及びエフェクタータンパク質及び好適なガイドによるターゲティングによって免疫原性タンパク質が無効になった、破壊された、又は断たれたピーナッツ及び堅果などのアレルギー誘発性食品が含まれる。
治療処置
本発明の系は、本願がこの系を情報に基づきエンジニアリングするための基礎を提供するため、本開示から、過度の実験を行うことなく、治療、アッセイ及び他の適用を含めた旧ＲＮＡ切断技術の領域において適用することができる。本発明は、ＲＮＡの過剰発現、毒性ＲＮＡ及び／又は突然変異したＲＮＡ（例えば、スプライシング欠損又はトランケーションなど）によって引き起こされる疾患の治療処置を提供する。毒性ＲＮＡの発現は、核封入体の形成及び脳、心臓又は骨格筋における遅発性変性変化に関連し得る。最もよく研究された例、筋強直性ジストロフィーでは、毒性ＲＮＡの主要な病原性効果は、結合タンパク質を隔離し、及び選択的スプライシングの調節を損なうことと見られる（Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．（２００６）１５（ｓｕｐｐｌ ２）：Ｒ１６２－Ｒ１６９）。筋強直性ジストロフィー［筋緊張性異栄養症（ＤＭ）］は、極めて幅広い臨床的特徴を生じるため、遺伝学者にとって特に興味深い。一部を挙げれば、筋肉の消耗、白内障、インスリン抵抗性、精巣萎縮、心伝導の減速、皮膚腫瘍及び認知への効果であろう。現在ＤＭ１型（ＤＭ１）と呼ばれている古典的形態のＤＭは、細胞質タンパク質キナーゼをコードする遺伝子ＤＭＰＫの３’非翻訳領域（ＵＴＲ）におけるＣＴＧリピートの伸長によって引き起こされる。
以下の表は、ＤＭ１骨格筋、心臓又は脳に選択的スプライシングの誤調節があることが示されているエクソンのリストを提示する。
Figure 2023134453000004
Figure 2023134453000005
Figure 2023134453000006
Figure 2023134453000007
本発明の酵素は、過剰発現ＲＮＡ又は毒性ＲＮＡ、例えば、ＤＭＰＫ遺伝子など、又は例えば上記の表にある、ＤＭ１骨格筋、心臓又は脳における誤調節された選択的スプライシングのいずれかを標的化し得る。
本発明の酵素はまた、以下の表に示されるとおりの疾患を引き起こすＲＮＡ依存的機能に影響を及ぼすトランス作用性突然変異も標的化し得る（Ｃｅｌｌ．２００９ Ｆｅｂ ２０；１３６（４）：７７７－７９３に要約されている）。
Figure 2023134453000008
Figure 2023134453000009
Figure 2023134453000010
本発明の酵素はまた、原発性年齢関連タウオパチー（ＰＡＲＴ）／神経原線維変化優位型老年性認知症（ＡＤと同様のＮＦＴを伴うがプラークがない）、ボクサー痴呆（慢性外傷性脳症）、進行性核上性麻痺、皮質基底核変性症、１７番染色体に連鎖する前頭側頭型認知症及びパーキンソニズム、リティコ－ボディグ病（グアム島パーキンソン認知症複合）、神経節膠腫及び神経節細胞腫、髄膜血管腫症、脳炎後パーキンソニズム、亜急性硬化性全脳炎、並びに鉛脳症、結節性硬化症、ハレルフォルデン・スパッツ病、及びリポフスチン沈着症、アルツハイマー病など、原発性及び二次性タウオパチーを含め、様々なタウオパチーの治療においても使用し得る。本発明の酵素はまた、スプライシング欠損及び疾患を引き起こす、シス作用スプライシングコードを破壊する突然変異も標的とし得る（Ｃｅｌｌ．２００９ Ｆｅｂ ２０；１３６（４）：７７７－７９３に要約されている）。運動ニューロン変性疾患ＳＭＡはＳＭＮ１遺伝子の欠失によって起こる。残るＳＭＮ２遺伝子はエクソン７にＣ→Ｔ置換を有し、これがエクソンスプライシングエンハンサー（ＥＳＥ）を不活性化してエクソンスプライシングサイレンサー（ＥＳＳ）を作り出し、エクソン７のスキッピング及びトランケート型タンパク質（ＳＭＮΔ７）につながる。同時にジストロフィン遺伝子のエクソン３１におけるＴ→Ａ置換が未熟終止コドン（ＳＴＯＰ）及びＥＳＳを作り出し、エクソン３１のスキッピングにつながる。エクソン３１が欠損したｍＲＮＡは部分的に機能性のタンパク質を産生するため、この突然変異は軽症型のＤＭＤを引き起こす。タウタンパク質をコードするＭＡＰＴ遺伝子のエクソン１０の範囲内及び下流における突然変異はスプライシング調節エレメントに影響を及ぼし、エクソン１０をインクルージョン又はエクスクルージョンするｍＲＮＡの正常な１：１比を破綻させる。この結果、４つ又は３つのいずれかの微小管結合ドメインを含有するタウタンパク質（それぞれ４Ｒタウ及び３Ｒタウ）の間の均衡が乱れ、神経病理学的障害ＦＴＤＰ－１７が引き起こされる。示される例はＮ２７９Ｋ突然変異であり、これはＥＳＥ機能を亢進させて、エクソン１０のインクルージョン及び４Ｒタウが増加する方への均衡のシフトを促進する。ＣＦＴＲ遺伝子エクソン９の３’スプライス部位内における多型（ＵＧ）ｍ（Ｕ）ｎトラクトはエクソン９インクルージョンの程度及び完全長機能タンパク質のレベルに影響を与え、ＣＦＴＲ遺伝子の他の部分の突然変異によって引き起こされる嚢胞性線維症（ＣＦ）の重症度を改変する。
自然免疫系は主に感染細胞内部のウイルス核酸を認識することによりウイルス感染を検出し、これはＤＮＡ又はＲＮＡセンシングと称される。インビトロＲＮＡセンシングアッセイを用いると、特異的ＲＮＡ基質を検出することができる。例えば、生細胞におけるＲＮＡベースのセンシングにＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質を使用することができる。適用の例は、例えば疾患特異的ＲＮＡのセンシングによる診断法である。
本発明のＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質は更に、抗ウイルス活性、詳細にはＲＮＡウイルスに対する抗ウイルス活性に使用することができる。選択のウイルスＲＮＡ配列に選択的な好適なガイドＲＮＡを使用してエフェクタータンパク質をウイルスＲＮＡに標的化することができる。詳細には、エフェクタータンパク質は、一本鎖ＲＮＡなどのＲＮＡを切断する活性ヌクレアーゼであってもよい。従って、抗ウイルス剤としての本発明のＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質の使用が提供される。
ＲＮＡ、上記で言及したＲＮＡを標的化するための本発明の酵素系の治療投薬量は約０．１～約２ｍｇ／ｋｇであることが企図され、これらの投薬量は、応答をモニタしながら、必要であれば繰り返しの投薬量で、患者１人当たり約７～１０用量まで逐次的に投与されてもよい。有利には、治療レジメン中に各患者から試料が採取され、治療の有効性が確認される。例えば、ＲＮＡ試料は分離及び定量化され、発現が低下しているか、又は改善しているかどうかが判断されてもよい。かかる診断法は当業者の範囲内にある。
転写物検出方法
本発明のエフェクタータンパク質及び系は、細胞又は他の試料中のＲＮＡの特異的検出に有用である。目的のＲＮＡ標的の存在下では、ガイド依存性Ｃ２ｃ２ヌクレアーゼ活性に、コラテラル標的に対する非特異的ＲＮアーゼ活性が付随し得る。このＲＮアーゼ活性を利用するには、検出可能に切断されることのできるレポーター基質があれば十分である。例えば、レポーター分子は、一端に蛍光レポーター分子（ｆｌｕｏｒ）及び他端に消光剤のタグを付加したＲＮＡを含み得る。Ｃ２ｃ２ ＲＮアーゼ活性が存在しない場合、消光剤が物理的に近接しているため、ｆｌｕｏｒからの蛍光は低レベルに抑えられる。目的のＲＮＡ標的及び好適なガイドＲＮＡの存在によってＣ２ｃ２の標的特異的切断が活性化されると、ＲＮＡ含有レポーター分子は非特異的に切断され、ｆｌｕｏｒと消光剤とが空間的に分離される。これにより、適切な波長の光で励起したときｆｌｕｏｒが検出可能シグナルを発する。
ある態様において、本発明は、ＲＮＡターゲティングエフェクター；対応するＲＮＡ標的に結合するように設計された１つ以上のガイドＲＮＡ；及びＲＮＡベースの切断誘導可能レポーター構築物を含む（標的）ＲＮＡ検出系に関する。別の態様において、本発明は、試料中の（標的）ＲＮＡの検出方法に関し、この方法は、ＲＮＡターゲティングエフェクター、前記（標的）ＲＮＡに結合するように設計された１つ以上のガイドＲＮＡ、及びＲＮＡベースの切断誘導可能レポーター構築物を前記試料に加えることを含む。更なる態様において、本発明は、本明細書に定義するとおりの（標的）ＲＮＡ検出系を含むキット又は装置、又は少なくともＲＮＡターゲティングエフェクターとＲＮＡベースの切断誘導可能レポーター構築物とを含むキット又は装置に関する。更なる態様において、本発明は、（標的）ＲＮＡ検出のための本明細書に定義するとおりのＲＮＡターゲティング系又はキット又は装置の使用に関する。ＲＮＡターゲティングエフェクターは、特定の実施形態では、ＲＮＡガイド下ＲＮアーゼである。特定の実施形態において、ＲＮＡターゲティングエフェクターはＣＲＩＳＰＲエフェクターである。特定の実施形態において、ＲＮＡターゲティングエフェクターはクラス２ ＣＲＩＳＰＲエフェクターである。特定の実施形態において、ＲＮＡターゲティングエフェクターはクラス２ ＶＩ型ＣＲＩＳＰＲエフェクターである。好ましい実施形態において、ＲＮＡターゲティングエフェクターはＣ２ｃ２である。特定の実施形態において、ＲＮＡターゲティングエフェクター、好ましくはＣ２ｃ２は、本明細書において他の部分に記載されるとおりの種に由来する。本明細書に記載されるとおりの前記（標的）ＲＮＡに結合するように設計されたガイドＲＮＡはＲＮＡターゲティングエフェクターと複合体を形成可能であり、及び前記複合体中のガイドＲＮＡは標的ＲＮＡ分子に結合可能であり、同様に本明細書の他の部分に記載されるとおり、それにより標的ＲＮＡが切断されることは理解されるであろう。ガイドＲＮＡは典型的には、本明細書において他の部分に記載されるとおり、ガイド配列及びダイレクトリピートを含むことは理解されるであろう。特定の実施形態において、１つ以上のガイドＲＮＡは、疾患状態の診断指標となる１つ以上の標的分子に結合するように設計される。特定の実施形態において、疾患状態は、ウイルス、細菌、真菌、又は寄生虫感染症など、感染症である。特定の実施形態において、疾患状態は異常な（標的）ＲＮＡ発現によって特徴付けられる。特定の実施形態において、疾患状態は癌である。特定の実施形態において、疾患状態は自己免疫疾患である。ＲＮＡベースの切断誘導可能レポーター構築物はＲＮＡを含み、ＲＮＡが切断されると検出可能なリードアウトが生じ、即ちＲＮＡの切断時に検出可能シグナルが生成される。特定の実施形態において、ＲＮＡベースの切断誘導可能レポーター構築物は蛍光色素及び消光剤を含む。当業者は、種々のタイプの蛍光色素及び対応する消光剤が使用されてもよいことを理解するであろう。当業者は、本ＲＮＡ切断レポーター構築物での使用に適し得る他のタイプの誘導可能レポーター系を容易に想定するであろう。
一つの例示的アッセイ方法では、Ｃ２ｃ２エフェクター、目的の標的に特異的なガイドＲＮＡ、及びレポーター分子が細胞試料に加えられる。蛍光の増加が目的のＲＮＡ標的の存在を示す。別の例示的な方法では、検出アレイが提供される。アレイ上の各位置にＣ２ｃ２エフェクター、レポーター分子、及び目的の標的に特異的なガイドＲＮＡが提供される。実施するアッセイに応じて、アレイの各位置における目的の標的に特異的なガイドＲＮＡは同じであっても、異なっても、又はこれらの組み合わせであってもよい。例えば単一の供給源試料中にある１つ以上の標的を試験することが所望される場合、目的の標的に特異的なガイドＲＮＡは異なるものが提供されてもよい。例えば同じ標的に関して複数の試料を試験することが所望される場合、目的の標的に特異的なガイドＲＮＡは各位置に同じものが提供されてもよい。
本明細書で使用されるとき、「マスキング構築物」は、本明細書に記載される活性化ＣＲＩＳＰＲ系エフェクタータンパク質によって切断されるか、又は他の方法で不活性化されることのできる分子を指す。特定の例示的実施形態において、マスキング構築物はＲＮＡベースのマスキング構築物である。マスキング構築物は正の検出可能シグナルの生成又は検出を防ぐ。正の検出可能シグナルは、当該技術分野において公知の光学、蛍光、化学発光、電気化学又は他の検出方法を用いて検出し得る任意のシグナルであってもよい。マスキング構築物は、マスキング構築物が除去されるか、又は他の方法でサイレンシングされるまで、検出可能な正のシグナルの生成を防ぎ、又はその存在をマスキングし得る。用語「正の検出可能シグナル」は、マスキング構築物の存在下で検出可能であり得る他の検出可能シグナルと区別するために使用される。例えば、特定の実施形態において、マスキング剤が存在するとき第１のシグナルが検出されてもよく（即ち負の検出可能シグナル）、これが次には活性化ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質による標的分子の検出並びにマスキング剤の切断又は不活性化に伴い第２のシグナル（例えば正の検出可能シグナル）に変換される。
特定の例示的実施形態において、マスキング構築物は遺伝子産物の生成を抑制し得る。遺伝子産物は、試料に加えられるレポーター構築物によってコードされ得る。マスキング構築物は、ｓｈＲＨＮ又はｓｉＲＮＡなど、ＲＮＡ干渉経路に関わる干渉性ＲＮＡであってもよい。マスキング構築物はまたマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）も含み得る。存在する間は、マスキング構築物は遺伝子産物の発現を抑制する。遺伝子産物は、マスキング構築物の存在がなければ本来標識プローブ又は抗体によって検出可能であろう蛍光タンパク質又は他のＲＮＡ転写物若しくはタンパク質であってもよい。エフェクタータンパク質の活性化に伴いマスキング構築物が切断されるか、又は他の方法でサイレンシングされて、正の検出可能シグナルとしての遺伝子産物の発現及び検出が可能となる。
特定の例示的実施形態において、マスキング構築物は、検出可能な正のシグナルを生成するのに必要な１つ以上の試薬を隔離してもよく、従ってマスキング構築物から１つ以上の試薬が放出されると、検出可能な正のシグナルが生成されることになる。１つ以上の試薬を組み合わせて比色シグナル、化学発光シグナル、蛍光シグナル、又は任意の他の検出可能シグナルを生じさせてもよく、かかる目的に好適であることが公知の任意の試薬を含み得る。特定の例示的実施形態において、１つ以上の試薬は、１つ以上の試薬に結合するＲＮＡアプタマーによって隔離される。１つ以上の試薬は、標的分子の検出に伴いエフェクタータンパク質が活性化されると放出される。特定の例示的実施形態において、１つ以上の試薬は、１つ以上のＲＮＡアプタマーをタンパク質に結合させることによってタンパク質が検出可能シグナルを生成できないように阻害又は隔離される検出可能シグナル、例えば比色、化学発光、又は蛍光シグナルなどの生成を促進可能な酵素などのタンパク質である。本明細書に開示されるエフェクタータンパク質が活性化すると、ＲＮＡアプタマーは、タンパク質が検出可能シグナルを生成する能力をもはや阻害しない程度まで切断又は分解される。
一実施形態において、シグナル増幅酵素としてトロンビンが、例えば以下の配列：ＧＧＧＡＡＣＡＡＡＧＣＵＧＡＡＧＵＡＣＵＵＡＣＣＣを有する阻害性アプタマーと共に使用される。このアプタマーが切断されるとトロンビンが活性になり、ペプチド比色基質（例えば、ｗｗｗ．ｓｉｇｍａａｌｄｒｉｃｈ．ｃｏｍ／ｃａｔａｌｏｇ／ｐｒｏｄｕｃｔ／ｓｉｇｍａ／ｔ３０６８？ｌａｎｇ＝ｅｎ＆ｒｅｇｉｏｎ＝ＵＳを参照）又は蛍光基質（例えば、ｗｗｗ．ｓｉｇｍａａｌｄｒｉｃｈ．ｃｏｍ／ｃａｔａｌｏｇ／ｐｒｏｄｕｃｔ／ｓｉｇｍａ／ｂ９３８５？ｌａｎｇ＝ｅｎ＆ｒｅｇｉｏｎ＝ＵＳを参照）を切断することになる。比色基質のパラニトロアニリド（ｐＮＡ）が、トロンビンのペプチド基質に共有結合的に連結される。トロンビンによって切断されると、ｐＮＡが放出されて色が黄色に変わり、肉眼で容易に見ることができる。蛍光基質も同様の原理によって働き、トロンビンによって切断されると、蛍光検出器を使用して検出することのできる青色フルオロフォア、７－アミノ－４－メチルクマリンを放出する。トロンビンの代替としては、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、β－ガラクトシダーゼ、及び仔ウシアルカリホスファターゼ（ＣＡＰ）が挙げられ、これらも同様に比色又は蛍光シグナルの生成に使用し、阻害性アプタマーによって阻害することができる。
特定の例示的実施形態では、マスキング構築物が個々の個別的な容量（以下に更に定義する）で固体基質上に固定化されて、単一の試薬を隔離してもよい。例えば、試薬は、色素を含むビーズであってもよい。固定化された試薬によって隔離されると、個々のビーズが過剰に拡散しているため検出可能シグナルは生成されないが、マスキング構築物から放出されると、例えば凝集によるか、又は単純に溶液濃度の増加により、検出可能シグナルの生成が可能となる。特定の例示的実施形態において、固定化されるマスキング剤は、標的分子の検出に伴い活性化エフェクタータンパク質によって切断されることができるＲＮＡベースのアプタマーである。
特定の他の例示的実施形態において、マスキング構築物は溶液中の固定化試薬に結合し、それにより溶液中に遊離している別個の標識結合パートナーに結合する試薬の能力を遮断する。従って、試料に洗浄ステップを適用すると、標的分子が存在しない場合、標識結合パートナーを試料から洗い流すことができる。しかしながら、エフェクタータンパク質が活性化された場合、マスキング構築物は、マスキング構築物が試薬に結合する能力に干渉するのに十分な程度に切断され、それにより標識結合パートナーによる固定化試薬への結合が可能となる。従って、標識結合パートナーは洗浄ステップの後も残り、試料中の標的分子の存在を指示する。特定の態様において、固定化試薬に結合するマスキング構築物はＲＮＡアプタマーである。固定化試薬はタンパク質であってもよく、標識結合パートナー（ｍｉｎｄｉｎｇ ｐａｒｔｎｅｒ）は標識抗体であってもよい。或いは、固定化試薬はストレプトアビジンであってもよく、標識結合パートナーは標識ビオチンであってもよい。上記の実施形態において使用される結合パートナーの標識は、当該技術分野において公知の任意の検出可能標識であってよい。加えて、本明細書に記載される全体的な設計に従い他の公知の結合パートナーが使用されてもよい。
特定の例示的実施形態において、マスキング構築物はリボザイムを含んでもよい。リボザイムは、触媒特性を有するＲＮＡ分子である。リボザイムは、天然のものもエンジニアリングされたものも、両方ともにＲＮＡを含む、又はそれからなるため、これは本明細書に開示されるエフェクタータンパク質の標的となり得る。リボザイムは、負の検出可能シグナルを生成するか、又は正の対照シグナルの生成を妨げるかのいずれかの反応を触媒するように選択又はエンジニアリングされてもよい。活性化エフェクタータンパク質分子によりリボザイムが失活すると、負の対照シグナルを生成するか、又は正の検出可能シグナルの生成を妨げる反応が取り除かれ、それにより正の検出可能シグナルを検出することが可能となる。一例示的実施形態において、リボザイムは比色反応を触媒して、溶液を第１の色として見えさせる。リボザイムが失活すると、次に溶液が第２の色に変わり、この第２の色が検出可能な正のシグナルである。どのようにリボザイムを比色反応の触媒に使用し得るかの例が、Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ．「リボザイムｇｌｍＳに基づくグルコサミン－６－リン酸のシグナル増幅（Ｓｉｇｎａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ－６－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｒｉｂｏｚｙｍｅ ｇｌｍＳ）」，Ｂｉｏｓｅｎｓ Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎ．２０１４；１６：３３７－４２に記載され、どのようにかかるシステムを本明細書に開示される実施形態のコンテクストで機能するように改変し得るかの例を提供する。或いは、リボザイムは、存在する場合、例えばＲＮＡ転写物の切断産物を生成することができる。従って、正の検出可能シグナルの検出は、リボザイムの非存在下に限り生成される非切断ＲＮＡ転写物の検出を含み得る。
一例示的実施形態において、マスキング構築物は、検出剤が溶液中で凝集しているか、それとも分散しているかに応じて色を変える検出剤を含む。例えば、コロイド金などの特定のナノ粒子は、凝集体から分散粒子へと移るに従い、目に見える紫色から赤色への色シフトを起こす。従って、特定の例示的実施形態では、かかる検出剤が１つ以上の架橋分子によって凝集体として保持され得る。架橋分子の少なくとも一部分はＲＮＡを含む。本明細書に開示されるエフェクタータンパク質が活性化されると、架橋分子のＲＮＡ部分が切断されて検出剤が分散することが可能となり、対応する色の変化が起こる。特定の例示的実施形態において、架橋分子はＲＮＡ分子である。特定の例示的実施形態において、検出剤はコロイド金属である。コロイド金属材料としては、液体、ヒドロゾル、又は金属ゾルに分散した水不溶性金属粒子又は金属化合物を挙げることができる。コロイド金属は、周期表のＩＡ、ＩＢ、ＩＩＢ及びＩＩＩＢ族の金属、並びに遷移金属、特にＶＩＩＩ族のものから選択され得る。好ましい金属には、金、銀、アルミニウム、ルテニウム、亜鉛、鉄、ニッケル及びカルシウムが含まれる。他の好適な金属にはまた、そのあらゆる様々な酸化状態の以下：リチウム、ナトリウム、マグネシウム、カリウム、スカンジウム、チタン、バナジウム、クロム、マンガン、コバルト、銅、ガリウム、ストロンチウム、ニオブ、モリブデン、パラジウム、インジウム、スズ、タングステン、レニウム、白金、及びガドリニウムも含まれる。金属は、好ましくは適切な金属化合物に由来するイオン形態、例えばＡ１３＋、Ｒｕ３＋、Ｚｎ２＋、Ｆｅ３＋、Ｎｉ２＋及びＣａ２＋イオンで提供される。
特定の他の例示的実施形態において、マスキング構築物は、検出可能標識及び当該の検出可能標識のマスキング剤が付加されたＲＮＡオリゴヌクレオチドを含み得る。かかる検出可能標識／マスキング剤の組み合わせの例は、フルオロフォア及びフルオロフォアの消光剤である。フルオロフォアの消光は、フルオロフォアと別のフルオロフォア又は非蛍光性分子との間で非蛍光性複合体が形成される結果として起こり得る。この機構は、基底状態複合体形成、静的消光、又は接触消光として知られる。従って、ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、接触消光が起こるのにフルオロフォアと消光剤とが十分に近接しているように設計され得る。フルオロフォア及びそのコグネイト消光剤は当該技術分野において公知であり、この目的で当業者が選択することができる。本発明の文脈において詳細なフルオロフォア／消光剤の組み合わせは重要でなく、フルオロフォア／消光剤の組み合わせの選択がフルオロフォアのマスキングを確実にすることだけである。本明細書に開示されるエフェクタータンパク質が活性化すると、ＲＮＡオリゴヌクレオチドが切断されて、それにより接触消光効果を維持するのに必要なフルオロフォアと消光剤との間の近接性が断たれる。従って、フルオロフォアの検出を用いて試料中の標的分子の存在を決定し得る。
一例示的実施形態において、マスキング構築物は量子ドットを含んでもよい。量子ドットは、表面に付加された複数のリンカー分子を有し得る。リンカー分子の少なくとも一部分はＲＮＡを含む。リンカー分子は一端で量子ドットに付加され、及びその長さに沿って、又はリンカーの終端で１つ以上の消光剤に付加され、そのため消光剤は量子ドットの消光が起こるのに十分に近接して維持される。リンカーは分枝状であってもよい。上記のとおり、量子ドット／消光剤の組み合わせは重要でなく、量子ドット／消光剤の組み合わせの選択がフルオロフォアのマスキングを確実にすることだけである。量子ドット及びそのコグネイト消光剤は当該技術分野において公知であり、この目的で当業者が選択することができる。本明細書に開示されるエフェクタータンパク質が活性化すると、リンカー分子のＲＮＡ部分が切断されて、それにより消光効果を維持するのに必要な量子ドットと１つ以上の消光剤との間の近接性がなくなる。一実施形態において、量子ドットは、Ｑｄｏｔ（登録商標）６２５ストレプトアビジンコンジュゲート（ｗｗｗ．ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ．ｃｏｍ／ｏｒｄｅｒ／ｃａｔａｌｏｇ／ｐｒｏｄｕｃｔ／Ａ１０１９６）など、コンジュゲートされたストレプトアビジンである。ＲＮＡはビオチンリンカーを介して付加され、消光分子を動員し、配列／５Ｂｉｏｓｇ／ＵＣＵＣＧＵＡＣＧＵＵＣ／３ＩＡｂＲＱＳｐ／又は／５Ｂｉｏｓｇ／ＵＣＵＣＧＵＡＣＧＵＵＣＵＣＵＣＧＵＡＣＧＵＵＣ／３ＩＡｂＲＱＳｐ／［式中、／５Ｂｉｏｓｇ／はビオチンタグであり、／３ＩＡｂＲＱＳｐ／はアイオワブラック消光剤である］である。切断に伴い消光剤が放出されることになり、量子ドットが目に見える蛍光を発することになる。
同様に、蛍光エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を用いて検出可能な正のシグナルを生成し得る。ＦＲＥＴは、エネルギー的に励起されたフルオロフォア（即ち「ドナーフルオロフォア」）からの光子によって別の分子（即ち「アクセプター」）の電子のエネルギー状態が上がり、より高い励起した一重項状態の振動準位になる無放射過程である。ドナーフルオロフォアは基底状態に戻り、当該のフルオロフォアに特有の蛍光を発しなくなる。アクセプターは別のフルオロフォア又は非蛍光性分子であり得る。アクセプターがフルオロフォアである場合、移動したエネルギーは当該のフルオロフォアに特有の蛍光として放たれる。アクセプターが非蛍光性分子である場合、吸収されたエネルギーが熱として失われる。従って、本明細書に開示される実施形態のコンテクストでは、フルオロフォア／消光剤の組み合わせは、オリゴヌクレオチド分子に付加されたドナーフルオロフォア／アクセプターの組み合わせに置き換えられる。インタクトな場合、マスキング構築物は、アクセプターが発する蛍光又は熱によって検出されるとおりの第１のシグナル（負の検出可能シグナル）を生成する。本明細書に開示されるエフェクタータンパク質が活性化すると、ＲＮＡオリゴヌクレオチドが切断されてＦＲＥＴが破綻するため、ここでドナーフルオロフォアの蛍光が検出される（正の検出可能シグナル）。
ＲＮアーゼを検出するための一つの比色リードアウトモードはインターカレート色素に基づき、これは長いＲＮＡから短いヌクレオチドへの切断に応答してその吸光度を変化させる。このような特性を備える既存の色素が幾つか存在する。Ｗａｇｎｅｒ（１９８３）によれば、ピロニンＹはＲＮＡとの複合体であり、５７２ｎｍの吸光度を有する複合体を形成することになる；ＲＮＡの切断により吸光度が失われ、色が変化する。Ｇｒｅｉｎｅｒ－Ｓｔｏｅｆｆｅｌｅ（１９９６）は同様にメチレンブルーを使用しており、ＲＮアーゼ活性化に伴い６８８ｎｍの吸光度の変化があった。
別の比色リードアウトモードには、切断に伴い色が変化する核酸基質が関わる。Ｗｉｔｍｅｒ（１９９１）は、切断後にレポーター基を放出する合成リボヌクレオチド基質、Ｕ－３’－ＢＣＩＰを利用しており、６５０ｎｍの吸光度の生成がもたらされた。
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系、その構成成分、及びかかる構成成分の送達に関する一般的な情報に関しては、量及び製剤に関することを含めた、全て本発明の実施において有用な、方法、材料、送達ビヒクル、ベクター、粒子、ＡＡＶ、並びにその作製及び使用を含め、米国特許第８，９９９，６４１号明細書、同第８，９９３，２３３号明細書、同第８，９４５，８３９号明細書、同第８，９３２，８１４号明細書、同第８，９０６，６１６号明細書、同第８，８９５，３０８号明細書、同第８，８８９，４１８号明細書、同第８，８８９，３５６号明細書、同第８，８７１，４４５号明細書、同第８，８６５，４０６号明細書、同第８，７９５，９６５号明細書、同第８，７７１，９４５号明細書及び同第８，６９７，３５９号明細書；米国特許出願公開第２０１４－０３１０８３０号明細書（米国特許出願第１４／１０５，０３１号明細書）、同第２０１４－０２８７９３８ Ａ１号明細書（米国特許出願第１４／２１３，９９１号明細書）、同第２０１４－０２７３２３４ Ａ１号明細書（米国特許出願第１４／２９３，６７４号明細書）、同第２０１４－０２７３２３２ Ａ１号明細書（米国特許出願第１４／２９０，５７５号明細書）、同第２０１４－０２７３２３１号明細書（米国特許出願第１４／２５９，４２０号明細書）、同第２０１４－０２５６０４６ Ａ１号明細書（米国特許出願第１４／２２６，２７４号明細書）、同第２０１４－０２４８７０２ Ａ１号明細書（米国特許出願第１４／２５８，４５８号明細書）、同第２０１４－０２４２７００ Ａ１号明細書（米国特許出願第１４／２２２，９３０号明細書）、同第２０１４－０２４２６９９ Ａ１号明細書（米国特許出願第１４／１８３，５１２号明細書）、同第２０１４－０２４２６６４ Ａ１号明細書（米国特許出願第１４／１０４，９９０号明細書）、同第２０１４－０２３４９７２ Ａ１号明細書（米国特許出願第１４／１８３，４７１号明細書）、同第２０１４－０２２７７８７ Ａ１号明細書（米国特許出願第１４／２５６，９１２号明細書）、同第２０１４－０１８９８９６ Ａ１号明細書（米国特許出願第１４／１０５，０３５号明細書）、同第２０１４－０１８６９５８号明細書（米国特許出願第１４／１０５，０１７号明細書）、同第２０１４－０１８６９１９ Ａ１号明細書（米国特許出願第１４／１０４，９７７号明細書）、同第２０１４－０１８６８４３ Ａ１号明細書（米国特許出願第１４／１０４，９００号明細書）、同第２０１４－０１７９７７０ Ａ１号明細書（米国特許出願第１４／１０４，８３７号明細書）及び同第２０１４－０１７９００６ Ａ１号明細書（米国特許出願第１４／１８３，４８６号明細書）、同第２０１４－０１７０７５３号明細書（米国特許出願第１４／１８３，４２９号明細書）；欧州特許第２ ７８４ １６２ Ｂ１号明細書及び同第２ ７７１ ４６８ Ｂ１号明細書；欧州特許出願公開第２ ７７１ ４６８号明細書（ＥＰ１３８１８５７０．７号明細書）、同第２ ７６４ １０３号明細書（ＥＰ１３８２４２３２．６号明細書）、及び同第２ ７８４ １６２号明細書（ＥＰ１４１７０３８３．５号明細書）；及びＰＣＴ特許公報、国際公開第２０１４／０９３６６１号パンフレット（ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７４７４３号明細書）、同第２０１４／０９３６９４号パンフレット（ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７４７９０号明細書）、同第２０１４／０９３５９５号パンフレット（ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７４６１１号明細書）、同第２０１４／０９３７１８号パンフレット（ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７４８２５号明細書）、同第２０１４／０９３７０９号パンフレット（ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７４８１２号明細書）、同第２０１４／０９３６２２号パンフレット（ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７４６６７号明細書）、同第２０１４／０９３６３５号パンフレット（ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７４６９１号明細書）、同第２０１４／０９３６５５号パンフレット（ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７４７３６号明細書）、同第２０１４／０９３７１２号パンフレット（ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７４８１９号明細書）、同第２０１４／０９３７０１号パンフレット（ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７４８００号明細書）、同第２０１４／０１８４２３号パンフレット（ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０５１４１８号明細書）、同第２０１４／２０４７２３号パンフレット（ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０４１７９０号明細書）、同第２０１４／２０４７２４号パンフレット（ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０４１８００号明細書）、同第２０１４／２０４７２５号パンフレット（ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０４１８０３号明細書）、同第２０１４／２０４７２６号パンフレット（ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０４１８０４号明細書）、同第２０１４／２０４７２７号パンフレット（ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０４１８０６号明細書）、同第２０１４／２０４７２８号パンフレット（ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０４１８０８号明細書）、同第２０１４／２０４７２９号パンフレット（ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０４１８０９号明細書）が参照される。また、それぞれ２０１３年１月３０日；２０１３年３月１５日；２０１３年３月２８日；２０１３年４月２０日；２０１３年５月６日及び２０１３年５月２８日に出願された米国仮特許出願第６１／７５８，４６８号明細書；同第６１／８０２，１７４号明細書；同第６１／８０６，３７５号明細書；同第６１／８１４，２６３号明細書；同第６１／８１９，８０３号明細書及び同第６１／８２８，１３０号明細書も参照される。また、２０１３年６月１７日に出願された米国仮特許出願第６１／８３６，１２３号明細書も参照される。加えて、各々２０１３年６月１７日に出願された米国仮特許出願第６１／８３５，９３１号明細書、同第６１／８３５，９３６号明細書、同第６１／８３６，１２７号明細書、同第６１／８３６，１０１号明細書、同第６１／８３６，０８０号明細書及び同第６１／８３５，９７３号明細書が参照される。更に、２０１３年８月５日に出願された米国仮特許出願第６１／８６２，４６８号明細書及び同第６１／８６２，３５５号明細書；２０１３年８月２８日に出願された同第６１／８７１，３０１号明細書；２０１３年９月２５日に出願された同第６１／９６０，７７７号明細書及び２０１３年１０月２８日に出願された同第６１／９６１，９８０号明細書が参照される。なおも更に、各々２０１４年６月１０日、６／１０／１４に出願されたＰＣＴ特許出願：ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０４１８０３号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０４１８００号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０４１８０９号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０４１８０４号明細書及びＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０４１８０６号明細書；２０１４年６月１１日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０４１８０８号明細書；及び２０１４年１０月２８日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ２０１４／６２５５８号明細書、及び各々２０１３年１２月１２日に出願された米国仮特許出願第６１／９１５，１５０号明細書、同第６１／９１５，３０１号明細書、同第６１／９１５，２６７号明細書及び同第６１／９１５，２６０号明細書；２０１３年１月２９日及び２０１３年２月２５日に出願された同第６１／７５７，９７２号明細書及び同第６１／７６８，９５９号明細書；２０１３年６月１７日に出願された同第６１／８３５，９３６号明細書、同第６１／８３６，１２７号明細書、同第６１／８３６，１０１号明細書、同第６１／８３６，０８０号明細書、同第６１／８３５，９７３号明細書、及び同第６１／８３５，９３１号明細書；両方ともに２０１４年６月１１日に出願された同第６２／０１０，８８８号明細書及び同第６２／０１０，８７９号明細書；各々２０１４年６月１０日に出願された同第６２／０１０，３２９号明細書及び同第６２／０１０，４４１号明細書；各々２０１４年２月１２日に出願された同第６１／９３９，２２８号明細書及び同第６１／９３９，２４２号明細書；２０１４年４月１５日に出願された同第６１／９８０，０１２号明細書；２０１４年８月１７日に出願された同第６２／０３８，３５８号明細書；各々２０１４年９月２５日に出願された同第６２／０５４，４９０号明細書、同第６２／０５５，４８４号明細書、同第６２／０５５，４６０号明細書及び同第６２／０５５，４８７号明細書；及び２０１４年１０月２７日に出願された同第６２／０６９，２４３号明細書が参照される。また、２０１４年９月２５日に出願された米国仮特許出願第６２／０５５，４８４号明細書、同第６２／０５５，４６０号明細書、及び同第６２／０５５，４８７号明細書；２０１４年４月１５日に出願された米国仮特許出願第６１／９８０，０１２号明細書；及び２０１４年２月１２日に出願された米国仮特許出願第６１／９３９，２４２号明細書も参照される。特に米国を指定するＰＣＴ出願、２０１４年６月１０日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ１４／４１８０６号明細書が参照される。２０１４年１月２２日に出願された米国仮特許出願第６１／９３０，２１４号明細書が参照される。各々２０１３年１２月１２日に出願された米国仮特許出願第６１／９１５，２５１号明細書；同第６１／９１５，２６０号明細書及び同第６１／９１５，２６７号明細書が参照される。２０１４年４月１５日に出願された米国特許出願第６１／９８０，０１２号明細書が参照される。特に米国を指定するＰＣＴ出願、２０１４年６月１０日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ１４／４１８０６号明細書が参照される。２０１４年１月２２日に出願された米国仮特許出願第６１／９３０，２１４号明細書が参照される。各々２０１３年１２月１２日に出願された米国仮特許出願第６１／９１５，２５１号明細書；同第６１／９１５，２６０号明細書及び同第６１／９１５，２６７号明細書が参照される。
また、１４年１２月１２日に出願された米国仮特許出願第６２／０９１，４５５号明細書、「保護型ガイドＲＮＡ（ＰＧＲＮＡ）（ＰＲＯＴＥＣＴＥＤ ＧＵＩＤＥ ＲＮＡＳ（ＰＧＲＮＡＳ））」；米国仮特許出願第６２／０９６，７０８号明細書、１４年１２月２４日、「保護型ガイドＲＮＡ（ＰＧＲＮＡ）（ＰＲＯＴＥＣＴＥＤ ＧＵＩＤＥ ＲＮＡＳ（ＰＧＲＮＡＳ））」；米国仮特許出願第６２／０９１，４６２号明細書、１４年１２月１２日、「ＣＲＩＳＰＲ転写因子用のデッドガイド（ＤＥＡＤ ＧＵＩＤＥＳ ＦＯＲ ＣＲＩＳＰＲ ＴＲＡＮＳＣＲＩＰＴＩＯＮ ＦＡＣＴＯＲＳ）」；米国仮特許出願第６２／０９６，３２４号明細書、１４年１２月２３日、「ＣＲＩＳＰＲ転写因子用のデッドガイド（ＤＥＡＤ ＧＵＩＤＥＳ ＦＯＲ ＣＲＩＳＰＲ ＴＲＡＮＳＣＲＩＰＴＩＯＮ ＦＡＣＴＯＲＳ）」；米国仮特許出願第６２／０９１，４５６号明細書、１４年１２月１２日、「ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系のエスコート付きの且つ機能化されたガイド（ＥＳＣＯＲＴＥＤ ＡＮＤ ＦＵＮＣＴＩＯＮＡＬＩＺＥＤ ＧＵＩＤＥＳ ＦＯＲ ＣＲＩＳＰＲ－ＣＡＳ ＳＹＳＴＥＭＳ）」；米国仮特許出願第６２／０９１，４６１号明細書、１４年１２月１２日、「造血幹細胞（ＨＳＣ）に関するゲノム編集のためのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系及び組成物の送達、使用及び治療適用（ＤＥＬＩＶＥＲＹ，ＵＳＥ ＡＮＤ ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣ ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ ＯＦ ＴＨＥ ＣＲＩＳＰＲ－ＣＡＳ ＳＹＳＴＥＭＳ ＡＮＤ ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ ＦＯＲ ＧＥＮＯＭＥ ＥＤＩＴＩＮＧ ＡＳ ＴＯ ＨＥＭＡＴＯＰＯＥＴＩＣ ＳＴＥＭ ＣＥＬＬＳ（ＨＳＣｓ））」；米国仮特許出願第６２／０９４，９０３号明細書、１４年１２月１９日、「ゲノムワイズインサートキャプチャシーケンシングによる二本鎖切断及びゲノム再編成の偏りのない同定（ＵＮＢＩＡＳＥＤ ＩＤＥＮＴＩＦＩＣＡＴＩＯＮ ＯＦ ＤＯＵＢＬＥ－ＳＴＲＡＮＤ ＢＲＥＡＫＳ ＡＮＤ ＧＥＮＯＭＩＣ ＲＥＡＲＲＡＮＧＥＭＥＮＴ ＢＹ ＧＥＮＯＭＥ－ＷＩＳＥ ＩＮＳＥＲＴ ＣＡＰＴＵＲＥ ＳＥＱＵＥＮＣＩＮＧ）」；米国仮特許出願第６２／０９６，７６１号明細書、１４年１２月２４日、「配列操作のための系、方法並びに最適化酵素及びガイドスキャフォールドのエンジニアリング（ＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ ＯＦ ＳＹＳＴＥＭＳ，ＭＥＴＨＯＤＳ ＡＮＤ ＯＰＴＩＭＩＺＥＤ ＥＮＺＹＭＥ ＡＮＤ ＧＵＩＤＥ ＳＣＡＦＦＯＬＤＳ ＦＯＲ ＳＥＱＵＥＮＣＥ ＭＡＮＩＰＵＬＡＴＩＯＮ）」；米国仮特許出願第６２／０９８，０５９号明細書、１４年１２月３０日、「ＲＮＡターゲティング系（ＲＮＡ－ＴＡＲＧＥＴＩＮＧ ＳＹＳＴＥＭ）」；米国仮特許出願第６２／０９６，６５６号明細書、１４年１２月２４日、「不安定化ドメインを有する又はそれと会合したＣＲＩＳＰＲ（ＣＲＩＳＰＲ ＨＡＶＩＮＧ ＯＲ ＡＳＳＯＣＩＡＴＥＤ ＷＩＴＨ ＤＥＳＴＡＢＩＬＩＺＡＴＩＯＮ ＤＯＭＡＩＮＳ）」；米国仮特許出願第６２／０９６，６９７号明細書、１４年１２月２４日、「ＡＡＶを有する又はそれと会合したＣＲＩＳＰＲ（ＣＲＩＳＰＲ ＨＡＶＩＮＧ ＯＲ ＡＳＳＯＣＩＡＴＥＤ ＷＩＴＨ ＡＡＶ）」；米国仮特許出願第６２／０９８，１５８号明細書、１４年１２月３０日、「エンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ複合体挿入ターゲティング系（ＥＮＧＩＮＥＥＲＥＤ ＣＲＩＳＰＲ ＣＯＭＰＬＥＸ ＩＮＳＥＲＴＩＯＮＡＬ ＴＡＲＧＥＴＩＮＧ ＳＹＳＴＥＭＳ）」；米国仮特許出願第６２／１５１，０５２号明細書、１５年４月２２日、「細胞外エキソソームレポートのための細胞性ターゲティング（ＣＥＬＬＵＬＡＲ ＴＡＲＧＥＴＩＮＧ ＦＯＲ ＥＸＴＲＡＣＥＬＬＵＬＡＲ ＥＸＯＳＯＭＡＬ ＲＥＰＯＲＴＩＮＧ）」；米国仮特許出願第６２／０５４，４９０号明細書、１４年９月２４日、「粒子送達成分を用いた障害及び疾患を標的化するためのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系及び組成物の送達、使用及び治療適用（ＤＥＬＩＶＥＲＹ，ＵＳＥ ＡＮＤ ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣ ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ ＯＦ ＴＨＥ ＣＲＩＳＰＲ－ＣＡＳ ＳＹＳＴＥＭＳ ＡＮＤ ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ ＦＯＲ ＴＡＲＧＥＴＩＮＧ ＤＩＳＯＲＤＥＲＳ ＡＮＤ ＤＩＳＥＡＳＥＳ ＵＳＩＮＧ ＰＡＲＴＩＣＬＥ ＤＥＬＩＶＥＲＹ ＣＯＭＰＯＮＥＮＴＳ）」；米国仮特許出願第６２／０５５，４８４号明細書、１４年９月２５日、「最適化された機能性ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系による配列操作のための系、方法及び組成物（ＳＹＳＴＥＭＳ，ＭＥＴＨＯＤＳ ＡＮＤ ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ ＦＯＲ ＳＥＱＵＥＮＣＥ ＭＡＮＩＰＵＬＡＴＩＯＮ ＷＩＴＨ ＯＰＴＩＭＩＺＥＤ ＦＵＮＣＴＩＯＮＡＬ ＣＲＩＳＰＲ－ＣＡＳ ＳＹＳＴＥＭＳ）」；米国仮特許出願第６２／０８７，５３７号明細書、１４年１２月４日、「最適化された機能性ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系による配列操作のための系、方法及び組成物（ＳＹＳＴＥＭＳ，ＭＥＴＨＯＤＳ ＡＮＤ ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ ＦＯＲ ＳＥＱＵＥＮＣＥ ＭＡＮＩＰＵＬＡＴＩＯＮ ＷＩＴＨ ＯＰＴＩＭＩＺＥＤ ＦＵＮＣＴＩＯＮＡＬ ＣＲＩＳＰＲ－ＣＡＳ ＳＹＳＴＥＭＳ）」；米国仮特許出願第６２／０５４，６５１号明細書、１４年９月２４日、「インビボでの複数の癌突然変異の競合をモデル化するためのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系及び組成物の送達、使用及び治療適用（ＤＥＬＩＶＥＲＹ，ＵＳＥ ＡＮＤ ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣ ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ ＯＦ ＴＨＥ ＣＲＩＳＰＲ－ＣＡＳ ＳＹＳＴＥＭＳ ＡＮＤ ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ ＦＯＲ ＭＯＤＥＬＩＮＧ ＣＯＭＰＥＴＩＴＩＯＮ ＯＦ ＭＵＬＴＩＰＬＥ ＣＡＮＣＥＲ ＭＵＴＡＴＩＯＮＳ ＩＮ ＶＩＶＯ）」；米国仮特許出願第６２／０６７，８８６号明細書、１４年１０月２３日、「インビボでの複数の癌突然変異の競合をモデル化するためのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系及び組成物の送達、使用及び治療適用（ＤＥＬＩＶＥＲＹ，ＵＳＥ ＡＮＤ ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣ ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ ＯＦ ＴＨＥ ＣＲＩＳＰＲ－ＣＡＳ ＳＹＳＴＥＭＳ ＡＮＤ ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ ＦＯＲ ＭＯＤＥＬＩＮＧ ＣＯＭＰＥＴＩＴＩＯＮ ＯＦ ＭＵＬＴＩＰＬＥ ＣＡＮＣＥＲ ＭＵＴＡＴＩＯＮＳ ＩＮ ＶＩＶＯ）」；米国仮特許出願第６２／０５４，６７５号明細書、１４年９月２４日、「神経細胞／組織におけるＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系及び組成物の送達、使用及び治療適用（ＤＥＬＩＶＥＲＹ，ＵＳＥ ＡＮＤ ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣ ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ ＯＦ ＴＨＥ ＣＲＩＳＰＲ－ＣＡＳ ＳＹＳＴＥＭＳ ＡＮＤ ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ ＩＮ ＮＥＵＲＯＮＡＬ ＣＥＬＬＳ／ＴＩＳＳＵＥＳ）」；米国仮特許出願第６２／０５４，５２８号明細書、１４年９月２４日、「免疫疾患又は障害におけるＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系及び組成物の送達、使用及び治療適用（ＤＥＬＩＶＥＲＹ，ＵＳＥ ＡＮＤ ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣ ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ ＯＦ ＴＨＥ ＣＲＩＳＰＲ－ＣＡＳ ＳＹＳＴＥＭＳ ＡＮＤ ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ ＩＮ ＩＭＭＵＮＥ ＤＩＳＥＡＳＥＳ ＯＲ ＤＩＳＯＲＤＥＲＳ）」；米国仮特許出願第６２／０５５，４５４号明細書、１４年９月２５日、「細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）を用いて障害及び疾患を標的化するためのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系及び組成物の送達、使用及び治療適用（ＤＥＬＩＶＥＲＹ，ＵＳＥ ＡＮＤ ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣ ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ ＯＦ ＴＨＥ ＣＲＩＳＰＲ－ＣＡＳ ＳＹＳＴＥＭＳ ＡＮＤ ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ ＦＯＲ ＴＡＲＧＥＴＩＮＧ ＤＩＳＯＲＤＥＲＳ ＡＮＤ ＤＩＳＥＡＳＥＳ ＵＳＩＮＧ ＣＥＬＬ ＰＥＮＥＴＲＡＴＩＯＮ ＰＥＰＴＩＤＥＳ（ＣＰＰ））」；米国仮特許出願第６２／０５５，４６０号明細書、１４年９月２５日、「多機能性ＣＲＩＳＰＲ複合体及び／又は最適化酵素が連結された機能性ＣＲＩＳＰＲ複合体（ＭＵＬＴＩＦＵＮＣＴＩＯＮＡＬ－ＣＲＩＳＰＲ ＣＯＭＰＬＥＸＥＳ ＡＮＤ／ＯＲ ＯＰＴＩＭＩＺＥＤ ＥＮＺＹＭＥ ＬＩＮＫＥＤ ＦＵＮＣＴＩＯＮＡＬ－ＣＲＩＳＰＲ ＣＯＭＰＬＥＸＥＳ）」；米国仮特許出願第６２／０８７，４７５号明細書、１４年１２月４日、「最適化された機能性のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系による機能スクリーニング（ＦＵＮＣＴＩＯＮＡＬ ＳＣＲＥＥＮＩＮＧ ＷＩＴＨ ＯＰＴＩＭＩＺＥＤ ＦＵＮＣＴＩＯＮＡＬ ＣＲＩＳＰＲ－ＣＡＳ ＳＹＳＴＥＭＳ）」；米国仮特許出願第６２／０５５，４８７号明細書、１４年９月２５日、「最適化された機能性のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系による機能スクリーニング（ＦＵＮＣＴＩＯＮＡＬ ＳＣＲＥＥＮＩＮＧ ＷＩＴＨ ＯＰＴＩＭＩＺＥＤ ＦＵＮＣＴＩＯＮＡＬ ＣＲＩＳＰＲ－ＣＡＳ ＳＹＳＴＥＭＳ）」；米国仮特許出願第６２／０８７，５４６号明細書、１４年１２月４日、「多機能性ＣＲＩＳＰＲ複合体及び／又は最適化酵素が連結された機能性ＣＲＩＳＰＲ複合体（（ＭＵＬＴＩＦＵＮＣＴＩＯＮＡＬ ＣＲＩＳＰＲ ＣＯＭＰＬＥＸＥＳ ＡＮＤ／ＯＲ ＯＰＴＩＭＩＺＥＤ ＥＮＺＹＭＥ ＬＩＮＫＥＤ ＦＵＮＣＴＩＯＮＡＬ－ＣＲＩＳＰＲ ＣＯＭＰＬＥＸＥＳ））」；及び米国仮特許出願第６２／０９８，２８５号明細書、１４年１２月３０日、「腫瘍成長及び転移のＣＲＩＳＰＲ媒介性インビボモデリング及び遺伝子スクリーニング（ＣＲＩＳＰＲ ＭＥＤＩＡＴＥＤ ＩＮ ＶＩＶＯ ＭＯＤＥＬＩＮＧ ＡＮＤ ＧＥＮＥＴＩＣ ＳＣＲＥＥＮＩＮＧ ＯＦ ＴＵＭＯＲ ＧＲＯＷＴＨ ＡＮＤ ＭＥＴＡＳＴＡＳＩＳ）」も挙げられる。
これらの特許、特許公報、及び出願の各々、並びにそれらの中に又はそれらの審査中に引用される全ての文献（「出願引用文献」）及び出願引用文献において引用又は参照される全ての文献は、それらの中で言及される又はそれらの中にある任意の文献において言及される及び参照によって本明細書に援用される任意の製品に関する任意の指示書、説明書、製品仕様書、及びプロダクトシートと共に、本明細書によって参照により本明細書に援用され、且つ本発明の実施に用いられ得る。全ての文献（例えば、これらの特許、特許公報及び出願並びに出願引用文献）は、各個別の文献が参照によって援用されることが具体的且つ個別的に示されたものとみなすのと同程度に参照により本明細書に援用される。
また、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系に関する一般情報に関しては、以下を挙げることができる（同様に参照により本明細書に援用される）：
・「ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を用いた多重ゲノムエンジニアリング（Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ｇｅｎｏｍｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｕｓｉｎｇ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ ｓｙｓｔｅｍｓ）」．Ｃｏｎｇ，Ｌ．，Ｒａｎ，Ｆ．Ａ．，Ｃｏｘ，Ｄ．，Ｌｉｎ，Ｓ．，Ｂａｒｒｅｔｔｏ，Ｒ．，Ｈａｂｉｂ，Ｎ．，Ｈｓｕ，Ｐ．Ｄ．，Ｗｕ，Ｘ．，Ｊｉａｎｇ，Ｗ．，Ｍａｒｒａｆｆｉｎｉ，Ｌ．Ａ．，＆ Ｚｈａｎｇ，Ｆ．Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｆｅｂ １５；３３９（６１２１）：８１９－２３（２０１３）；
・「ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系を用いた細菌ゲノムのＲＮＡガイド下編集（ＲＮＡ－ｇｕｉｄｅｄ ｅｄｉｔｉｎｇ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｇｅｎｏｍｅｓ ｕｓｉｎｇ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ｓｙｓｔｅｍｓ）」．Ｊｉａｎｇ Ｗ．，Ｂｉｋａｒｄ Ｄ．，Ｃｏｘ Ｄ．，Ｚｈａｎｇ Ｆ，Ｍａｒｒａｆｆｉｎｉ ＬＡ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｍａｒ；３１（３）：２３３－９（２０１３）；
・「複数の遺伝子に突然変異を有するマウスのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ媒介性ゲノムエンジニアリングによるワンステップ生成（Ｏｎｅ－Ｓｔｅｐ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｅ Ｃａｒｒｙｉｎｇ Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｇｅｎｅｓ ｂｙ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ－Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）」．Ｗａｎｇ Ｈ．，Ｙａｎｇ Ｈ．，Ｓｈｉｖａｌｉｌａ ＣＳ．，Ｄａｗｌａｔｙ ＭＭ．，Ｃｈｅｎｇ ＡＷ．，Ｚｈａｎｇ Ｆ．，Ｊａｅｎｉｓｃｈ Ｒ．Ｃｅｌｌ Ｍａｙ ９；１５３（４）：９１０－８（２０１３）；
・「哺乳類内因性転写及び後成状態の光学制御（Ｏｐｔｉｃａｌ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃ ｓｔａｔｅｓ）」．Ｋｏｎｅｒｍａｎｎ Ｓ，Ｂｒｉｇｈａｍ ＭＤ，Ｔｒｅｖｉｎｏ ＡＥ，Ｈｓｕ ＰＤ，Ｈｅｉｄｅｎｒｅｉｃｈ Ｍ，Ｃｏｎｇ Ｌ，Ｐｌａｔｔ ＲＪ，Ｓｃｏｔｔ ＤＡ，Ｃｈｕｒｃｈ ＧＭ，Ｚｈａｎｇ Ｆ．Ｎａｔｕｒｅ．Ａｕｇ ２２；５００（７４６３）：４７２－６．ｄｏｉ：１０．１０３８／Ｎａｔｕｒｅ１２４６６．Ｅｐｕｂ ２０１３ Ａｕｇ ２３（２０１３）；
・「ゲノム編集特異性を増強するためのＲＮＡガイド下ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ９による二重ニッキング（Ｄｏｕｂｌｅ Ｎｉｃｋｉｎｇ ｂｙ ＲＮＡ－Ｇｕｉｄｅｄ ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ９ ｆｏｒ Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｅｄｉｔｉｎｇ Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ）」．Ｒａｎ，ＦＡ．，Ｈｓｕ，ＰＤ．，Ｌｉｎ，ＣＹ．，Ｇｏｏｔｅｎｂｅｒｇ，ＪＳ．，Ｋｏｎｅｒｍａｎｎ，Ｓ．，Ｔｒｅｖｉｎｏ，ＡＥ．，Ｓｃｏｔｔ，ＤＡ．，Ｉｎｏｕｅ，Ａ．，Ｍａｔｏｂａ，Ｓ．，Ｚｈａｎｇ，Ｙ．，＆ Ｚｈａｎｇ，Ｆ．Ｃｅｌｌ Ａｕｇ ２８．ｐｉｉ：Ｓ００９２－８６７４（１３）０１０１５－５（２０１３－Ａ）；
・「ＲＮＡガイド下Ｃａｓ９ヌクレアーゼのＤＮＡターゲティング特異性（ＤＮＡ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ ＲＮＡ－ｇｕｉｄｅｄ Ｃａｓ９ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ）」．Ｈｓｕ，Ｐ．，Ｓｃｏｔｔ，Ｄ．，Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ，Ｊ．，Ｒａｎ，ＦＡ．，Ｋｏｎｅｒｍａｎｎ，Ｓ．，Ａｇａｒｗａｌａ，Ｖ．，Ｌｉ，Ｙ．，Ｆｉｎｅ，Ｅ．，Ｗｕ，Ｘ．，Ｓｈａｌｅｍ，Ｏ．，Ｃｒａｄｉｃｋ，ＴＪ．，Ｍａｒｒａｆｆｉｎｉ，ＬＡ．，Ｂａｏ，Ｇ．，＆ Ｚｈａｎｇ，Ｆ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．２６４７（２０１３）；
・「ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９系を用いたゲノムエンジニアリング（Ｇｅｎｏｍｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ ｓｙｓｔｅｍ）」．Ｒａｎ，ＦＡ．，Ｈｓｕ，ＰＤ．，Ｗｒｉｇｈｔ，Ｊ．，Ａｇａｒｗａｌａ，Ｖ．，Ｓｃｏｔｔ，ＤＡ．，Ｚｈａｎｇ，Ｆ．Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｎｏｖ；８（１１）：２２８１－３０８（２０１３－Ｂ）；
・「ヒト細胞におけるゲノム規模のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ノックアウトスクリーニング（Ｇｅｎｏｍｅ－Ｓｃａｌｅ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ Ｋｎｏｃｋｏｕｔ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｃｅｌｌｓ）」．Ｓｈａｌｅｍ，Ｏ．，Ｓａｎｊａｎａ，ＮＥ．，Ｈａｒｔｅｎｉａｎ，Ｅ．，Ｓｈｉ，Ｘ．，Ｓｃｏｔｔ，ＤＡ．，Ｍｉｋｋｅｌｓｏｎ，Ｔ．，Ｈｅｃｋｌ，Ｄ．，Ｅｂｅｒｔ，ＢＬ．，Ｒｏｏｔ，ＤＥ．，Ｄｏｅｎｃｈ，ＪＧ．，Ｚｈａｎｇ，Ｆ．Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｅｃ １２．（２０１３）．［Ｅｐｕｂ ａｈｅａｄ ｏｆ ｐｒｉｎｔ］；
・「ガイドＲＮＡと標的ＤＮＡとを有する複合体におけるｃａｓ９の結晶構造（Ｃｒｙｓｔａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｃａｓ９ ｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘ ｗｉｔｈ ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ ａｎｄ ｔａｒｇｅｔ ＤＮＡ）」．Ｎｉｓｈｉｍａｓｕ，Ｈ．，Ｒａｎ，ＦＡ．，Ｈｓｕ，ＰＤ．，Ｋｏｎｅｒｍａｎｎ，Ｓ．，Ｓｈｅｈａｔａ，ＳＩ．，Ｄｏｈｍａｅ，Ｎ．，Ｉｓｈｉｔａｎｉ，Ｒ．，Ｚｈａｎｇ，Ｆ．，Ｎｕｒｅｋｉ，Ｏ．Ｃｅｌｌ Ｆｅｂ ２７，１５６（５）：９３５－４９（２０１４）；
・「哺乳類細胞におけるＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼＣａｓ９のゲノムワイドな結合（Ｇｅｎｏｍｅ－ｗｉｄｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ＣＲＩＳＰＲ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ Ｃａｓ９ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ）」．Ｗｕ Ｘ．，Ｓｃｏｔｔ ＤＡ．，Ｋｒｉｚ ＡＪ．，Ｃｈｉｕ ＡＣ．，Ｈｓｕ ＰＤ．，Ｄａｄｏｎ ＤＢ．，Ｃｈｅｎｇ ＡＷ．，Ｔｒｅｖｉｎｏ ＡＥ．，Ｋｏｎｅｒｍａｎｎ Ｓ．，Ｃｈｅｎ Ｓ．，Ｊａｅｎｉｓｃｈ Ｒ．，Ｚｈａｎｇ Ｆ．，Ｓｈａｒｐ ＰＡ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｐｒ ２０．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．２８８９（２０１４）；
・「ゲノム編集及び癌モデリングのためのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ノックインマウス（ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ Ｋｎｏｃｋｉｎ Ｍｉｃｅ ｆｏｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ｅｄｉｔｉｎｇ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｍｏｄｅｌｉｎｇ）」．Ｐｌａｔｔ ＲＪ，Ｃｈｅｎ Ｓ，Ｚｈｏｕ Ｙ，Ｙｉｍ ＭＪ，Ｓｗｉｅｃｈ Ｌ，Ｋｅｍｐｔｏｎ ＨＲ，Ｄａｈｌｍａｎ ＪＥ，Ｐａｒｎａｓ Ｏ，Ｅｉｓｅｎｈａｕｒｅ ＴＭ，Ｊｏｖａｎｏｖｉｃ Ｍ，Ｇｒａｈａｍ ＤＢ，Ｊｈｕｎｊｈｕｎｗａｌａ Ｓ，Ｈｅｉｄｅｎｒｅｉｃｈ Ｍ，Ｘａｖｉｅｒ ＲＪ，Ｌａｎｇｅｒ Ｒ，Ａｎｄｅｒｓｏｎ ＤＧ，Ｈａｃｏｈｅｎ Ｎ，Ｒｅｇｅｖ Ａ，Ｆｅｎｇ Ｇ，Ｓｈａｒｐ ＰＡ，Ｚｈａｎｇ Ｆ．Ｃｅｌｌ １５９（２）：４４０－４５５ ＤＯＩ：１０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｌ．２０１４．０９．０１４（２０１４）；
・「ゲノムエンジニアリングに向けたＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９の開発及び適用（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ ｆｏｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）」，Ｈｓｕ ＰＤ，Ｌａｎｄｅｒ ＥＳ，Ｚｈａｎｇ Ｆ．，Ｃｅｌｌ．Ｊｕｎ ５；１５７（６）：１２６２－７８（２０１４）
・「ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系を用いたヒト細胞における遺伝子スクリーニング（Ｇｅｎｅｔｉｃ ｓｃｒｅｅｎｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｃｅｌｌｓ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ｓｙｓｔｅｍ）」，Ｗａｎｇ Ｔ，Ｗｅｉ ＪＪ，Ｓａｂａｔｉｎｉ ＤＭ，Ｌａｎｄｅｒ ＥＳ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ．Ｊａｎｕａｒｙ ３；３４３（６１６６）：８０－８４．ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．１２４６９８１（２０１４）；
・「ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９媒介性遺伝子不活性化のための高活性ｓｇＲＮＡの合理的設計（Ｒａｔｉｏｎａｌ ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ ｈｉｇｈｌｙ ａｃｔｉｖｅ ｓｇＲＮＡｓ ｆｏｒ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｇｅｎｅ ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）」，Ｄｏｅｎｃｈ ＪＧ，Ｈａｒｔｅｎｉａｎ Ｅ，Ｇｒａｈａｍ ＤＢ，Ｔｏｔｈｏｖａ Ｚ，Ｈｅｇｄｅ Ｍ，Ｓｍｉｔｈ Ｉ，Ｓｕｌｌｅｎｄｅｒ Ｍ，Ｅｂｅｒｔ ＢＬ，Ｘａｖｉｅｒ ＲＪ，Ｒｏｏｔ ＤＥ．，（オンライン発行 ３ Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ ２０１４）Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｄｅｃ；３２（１２）：１２６２－７（２０１４）；
・「ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９を用いた哺乳類脳における遺伝子機能のインビボ探索（Ｉｎ ｖｉｖｏ ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｂｒａｉｎ ｕｓｉｎｇ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９）」，Ｓｗｉｅｃｈ Ｌ，Ｈｅｉｄｅｎｒｅｉｃｈ Ｍ，Ｂａｎｅｒｊｅｅ Ａ，Ｈａｂｉｂ Ｎ，Ｌｉ Ｙ，Ｔｒｏｍｂｅｔｔａ Ｊ，Ｓｕｒ Ｍ，Ｚｈａｎｇ Ｆ．，（オンライン発行 １９ Ｏｃｔｏｂｅｒ ２０１４）Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｊａｎ；３３（１）：１０２－６（２０１５）；
・「エンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９複合体によるゲノム規模の転写活性化（Ｇｅｎｏｍｅ－ｓｃａｌｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｂｙ ａｎ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ ｃｏｍｐｌｅｘ）」，Ｋｏｎｅｒｍａｎｎ Ｓ，Ｂｒｉｇｈａｍ ＭＤ，Ｔｒｅｖｉｎｏ ＡＥ，Ｊｏｕｎｇ Ｊ，Ａｂｕｄａｙｙｅｈ ＯＯ，Ｂａｒｃｅｎａ Ｃ，Ｈｓｕ ＰＤ，Ｈａｂｉｂ Ｎ，Ｇｏｏｔｅｎｂｅｒｇ ＪＳ，Ｎｉｓｈｉｍａｓｕ Ｈ，Ｎｕｒｅｋｉ Ｏ，Ｚｈａｎｇ Ｆ．，Ｎａｔｕｒｅ．Ｊａｎ ２９；５１７（７５３６）：５８３－８（２０１５）
・「誘導性ゲノム編集及び転写調節のためのスプリットＣａｓ９アーキテクチャ（Ａ ｓｐｌｉｔ－Ｃａｓ９ ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ ｆｏｒ ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ａｎｄ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ）」，Ｚｅｔｓｃｈｅ Ｂ，Ｖｏｌｚ ＳＥ，Ｚｈａｎｇ Ｆ．，（ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎｌｉｎｅ ０２ Ｆｅｂｒｕａｒｙ ２０１５）Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｆｅｂ；３３（２）：１３９－４２（２０１５）；
・「腫瘍成長及び転移マウスモデルにおけるゲノムワイドＣＲＩＳＰＲスクリーニング（Ｇｅｎｏｍｅ－ｗｉｄｅ ＣＲＩＳＰＲ Ｓｃｒｅｅｎ ｉｎ ａ Ｍｏｕｓｅ Ｍｏｄｅｌ ｏｆ Ｔｕｍｏｒ Ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ）」，Ｃｈｅｎ Ｓ，Ｓａｎｊａｎａ ＮＥ，Ｚｈｅｎｇ Ｋ，Ｓｈａｌｅｍ Ｏ，Ｌｅｅ Ｋ，Ｓｈｉ Ｘ，Ｓｃｏｔｔ ＤＡ，Ｓｏｎｇ Ｊ，Ｐａｎ ＪＱ，Ｗｅｉｓｓｌｅｄｅｒ Ｒ，Ｌｅｅ Ｈ，Ｚｈａｎｇ Ｆ，Ｓｈａｒｐ ＰＡ．Ｃｅｌｌ １６０，１２４６－１２６０，Ｍａｒｃｈ １２，２０１５（マウスにおける多重スクリーニング）、及び
・「黄色ブドウ球菌Ｃａｓ９を用いたインビボゲノム編集（Ｉｎ ｖｉｖｏ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｕｓｉｎｇ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ Ｃａｓ９）」，Ｒａｎ ＦＡ，Ｃｏｎｇ Ｌ，Ｙａｎ ＷＸ，Ｓｃｏｔｔ ＤＡ，Ｇｏｏｔｅｎｂｅｒｇ ＪＳ，Ｋｒｉｚ ＡＪ，Ｚｅｔｓｃｈｅ Ｂ，Ｓｈａｌｅｍ Ｏ，Ｗｕ Ｘ，Ｍａｋａｒｏｖａ ＫＳ，Ｋｏｏｎｉｎ ＥＶ，Ｓｈａｒｐ ＰＡ，Ｚｈａｎｇ Ｆ．，（ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎｌｉｎｅ ０１ Ａｐｒｉｌ ２０１５），Ｎａｔｕｒｅ．Ａｐｒ ９；５２０（７５４６）：１８６－９１（２０１５）
・Ｓｈａｌｅｍ ｅｔ ａｌ．，「ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９を用いたハイスループット機能ゲノミクス（Ｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｇｅｎｏｍｉｃｓ ｕｓｉｎｇ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９）」，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １６，２９９－３１１（Ｍａｙ ２０１５）
・Ｘｕ ｅｔ ａｌ．，「改良ＣＲＩＳＰＲ ｓｇＲＮＡ設計の配列決定因子（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ ｏｆ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ＣＲＩＳＰＲ ｓｇＲＮＡ ｄｅｓｉｇｎ）」，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２５，１１４７－１１５７（Ａｕｇｕｓｔ ２０１５）
・Ｐａｒｎａｓ ｅｔ ａｌ．，「初代免疫細胞におけるゲノムワイドＣＲＩＳＰＲスクリーニングによる調節ネットワークの分析（Ａ Ｇｅｎｏｍｅ－ｗｉｄｅ ＣＲＩＳＰＲ Ｓｃｒｅｅｎ ｉｎ Ｐｒｉｍａｒｙ Ｉｍｍｕｎｅ Ｃｅｌｌｓ ｔｏ Ｄｉｓｓｅｃｔ Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｎｅｔｗｏｒｋｓ）」，Ｃｅｌｌ １６２，６７５－６８６（Ｊｕｌｙ ３０，２０１５）
・Ｒａｍａｎａｎ ｅｔ ａｌ．，「ウイルスＤＮＡのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９切断はＢ型肝炎ウイルスを効率的に抑制する（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ｃｌｅａｖａｇｅ ｏｆ ｖｉｒａｌ ＤＮＡ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔｌｙ ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｖｉｒｕｓ）」，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ ５：１０８３３．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓｒｅｐ１０８３３（Ｊｕｎｅ ２，２０１５）
・Ｎｉｓｈｉｍａｓｕ ｅｔ ａｌ．，「黄色ブドウ球菌Ｃａｓ９の結晶構造（Ｃｒｙｓｔａｌ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ Ｃａｓ９）」，Ｃｅｌｌ １６２，１１１３－１１２６（Ａｕｇ．２７，２０１５）
・Ｚｅｔｓｃｈｅ ｅｔ ａｌ．（２０１５），「Ｃｐｆ１はクラス２ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系のシングルＲＮＡガイド下エンドヌクレアーゼである（Ｃｐｆ１ ｉｓ ａ ｓｉｎｇｌｅ ＲＮＡ－ｇｕｉｄｅｄ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ ｏｆ ａ ｃｌａｓｓ ２ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ｓｙｓｔｅｍ）」，Ｃｅｌｌ １６３，７５９－７７１（Ｏｃｔ．２２，２０１５）ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｌ．２０１５．０９．０３８．Ｅｐｕｂ Ｓｅｐ．２５，２０１５
・Ｓｈｍａｋｏｖ ｅｔ ａｌ．（２０１５），「多様なクラス２ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系の発見及び機能的特徴付け（Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｄｉｖｅｒｓｅ Ｃｌａｓｓ ２ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ Ｓｙｓｔｅｍｓ）」，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ ６０，３８５－３９７（Ｎｏｖ．５，２０１５）ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｍｏｌｃｅｌ．２０１５．１０．００８．Ｅｐｕｂ Ｏｃｔ ２２，２０１５
・Ｄａｈｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．，「触媒活性Ｃａｓ９ヌクレアーゼによる直交性遺伝子制御（Ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｇｅｎｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｗｉｔｈ ａ ｃａｔａｌｙｔｉｃａｌｌｙ ａｃｔｉｖｅ Ｃａｓ９ ｎｕｃｌｅａｓｅ）」，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３３，１１５９－１１６１（Ｎｏｖｅｍｂｅｒ，２０１５）
・Ｇａｏ ｅｔ ａｌ，「変化したＰＡＭ特異性を有するエンジニアリングＣｐｆ１酵素（Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｃｐｆ１ Ｅｎｚｙｍｅｓ ｗｉｔｈ Ａｌｔｅｒｅｄ ＰＡＭ Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｉｅｓ）」，ｂｉｏＲｘｉｖ ０９１６１１；ｄｏｉ：ｈｔｔｐ：／／ｄｘ．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１０１／０９１６１１ Ｅｐｕｂ Ｄｅｃ．４，２０１６
・Ｓｍａｒｇｏｎ ｅｔ ａｌ．（２０１７），「Ｃａｓ１３ｂは、アクセサリータンパク質Ｃｓｘ２７及びＣｓｘ２８によって差次的に調節されるＶＩ－Ｂ型ＣＲＩＳＰＲ関連ＲＮＡガイド下ＲＮアーゼである（Ｃａｓ１３ｂ Ｉｓ ａ Ｔｙｐｅ ＶＩ－Ｂ ＣＲＩＳＰＲ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ＲＮＡ－Ｇｕｉｄｅｄ ＲＮａｓｅ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ Ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｂｙ Ａｃｃｅｓｓｏｒｙ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ Ｃｓｘ２７ ａｎｄ Ｃｓｘ２８）」，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ ６５，６１８－６３０（Ｆｅｂ．１６，２０１７）ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｍｏｌｃｅｌ．２０１６．１２．０２３．Ｅｐｕｂ Ｊａｎ ５，２０１７
この各々が参照により本明細書に援用され、本発明の実施において考慮されてもよく、及び以下に簡単に考察する：
・Ｃｏｎｇ ｅｔ ａｌ．は、サーモフィラス菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）Ｃａｓ９及びまた化膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９の両方に基づき、真核細胞で使用されるＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系をエンジニアリングし、Ｃａｓ９ヌクレアーゼが低分子ＲＮＡの指図を受けてヒト及びマウス細胞で正確なＤＮＡ切断を誘導し得ることを実証した。この著者らの研究は更に、ニッキング酵素に変換されるＣａｓ９を使用して、最小限の変異原活性を有する真核細胞での相同性組換え修復を促進し得ることを示した。加えて、この著者らの研究は、複数のガイド配列を単一のＣＲＩＳＰＲ配列にコードすることによって哺乳類ゲノム内の内在性ゲノム遺伝子座部位でいくつかを同時に編集することが可能となり得ることを実証し、ＲＮＡガイドヌクレアーゼ技術の容易なプログラム可能性及び広範な適用性を実証した。このようにＲＮＡを使用して細胞における配列特異的ＤＮＡ切断をプログラムすることが可能となり、ゲノムエンジニアリングツールの新しいクラスが定義された。これらの研究は更に、他のＣＲＩＳＰＲ遺伝子座が哺乳類細胞に移植可能である可能性があり、哺乳類ゲノム切断も媒介し得ることを示した。重要なことに、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系のいくつかの側面を更に改良してその効率及び多用途性を高め得ることが想定され得る。
・Ｊｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．は、デュアルＲＮＡと複合体を形成したクラスター化等間隔短鎖回分リピート（ＣＲＩＳＰＲ）関連Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼを使用して、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）及び大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）のゲノムに正確な突然変異を導入した。この手法は、標的ゲノム部位におけるデュアルＲＮＡ：Ｃａｓ９誘導切断によって非突然変異細胞を死滅させることに頼ったもので、選択可能マーカー又は対抗選択系の必要性が回避される。この研究は、単一及び複数のヌクレオチド変化が生じるように短鎖ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）の配列を変えることによってデュアルＲＮＡ：Ｃａｓ９特異性を再プログラム化すると、鋳型の編集が行われることを報告した。この研究は、２つのｃｒＲＮＡを同時に使用すると突然変異誘発の多重化が可能であることを示した。更に、この手法を組換えと組み合わせて用いたとき、肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）では、記載される手法を用いて回収された細胞のほぼ１００％が所望の突然変異を含み、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）では回収された細胞の６５％が突然変異を含んだ。
・Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１３）はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を用いることにより、胚性幹細胞における逐次的組換え及び／又は及び／又は時間のかかる単一突然変異を有するマウスの交雑による複数の段階で従来作成された複数の遺伝子に突然変異を保有するマウスを一段階で作成した。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系は機能的に重複する遺伝子及び上位遺伝子相互作用のインビボ研究を大幅に加速させ得る。
・Ｋｏｎｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．（２０１３）は、ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ９酵素及びまた転写活性化因子様エフェクターに基づくＤＮＡ結合ドメインの光学的及び化学的調節を可能にする多用途の且つロバストな技術が当該技術分野で必要とされていることに対処した。
・Ｒａｎ ｅｔ ａｌ．（２０１３－Ａ）は、Ｃａｓ９ニッカーゼ突然変異体を対のガイドＲＮＡと組み合わせて標的二本鎖切断を導入するという手法を記載した。これは、微生物ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系のＣａｓ９ヌクレアーゼがガイド配列によって特異的なゲノム遺伝子座に標的化されるが、ガイド配列はＤＮＡ標的との幾らかのミスマッチに耐えることができるため、従って望ましくないオフターゲット突然変異誘発を促進し得るという問題に対処する。ゲノム中の個々のニックは高いフィデリティーで修復されるため、二本鎖切断には適切にオフセットしたガイドＲＮＡによる同時のニッキングが必要であり、標的切断のために特異的に認識される塩基の数が大きくなる。この著者らは、対のニッキングを使用して細胞系におけるオフターゲット活性を５０～１，５００分の１に減らし、オンターゲット切断効率を犠牲にすることなしにマウス接合体における遺伝子ノックアウトを促進し得ることを実証した。この多用途戦略により、高い特異性が要求される多種多様なゲノム編集適用が可能となる。
・Ｈｓｕ ｅｔ ａｌ．（２０１３）は、標的部位の選択を知らせ、且つオフターゲット効果を回避するためのヒト細胞におけるＳｐＣａｓ９ターゲティングの特異性を特徴付けた。この研究は、７００個を超えるガイドＲＮＡ変異体並びに２９３Ｔ及び２９３ＦＴ細胞の１００個を超える予測ゲノムオフターゲット遺伝子座におけるＳｐＣａｓ９誘導インデル突然変異レベルを評価した。この著者ら、ＳｐＣａｓ９が、ミスマッチの数、位置及び分布に感受性を示して配列依存的に種々の位置におけるガイドＲＮＡと標的ＤＮＡとの間のミスマッチに耐えること。この著者らは更に、ＳｐＣａｓ９媒介性切断がＤＮＡメチル化の影響を受けないこと、ＳｐＣａｓ９及びｓｇＲＮＡの投与量を滴定してオフターゲット改変を最小限に抑え得ることを示した。加えて、哺乳類ゲノムエンジニアリング適用を促進するため、この著者らは、標的配列の選択及び検証並びにオフターゲット解析をガイドするウェブベースのソフトウェアツールの提供を報告した。
・Ｒａｎ ｅｔ ａｌ．（２０１３－Ｂ）は、哺乳類細胞における非相同末端結合（ＮＨＥＪ）又は相同性組換え修復（ＨＤＲ）を用いたＣａｓ９媒介性ゲノム編集用並びに下流機能研究のための改変細胞系作成用の一組のツールを記載した。オフターゲット切断を最小限に抑えるため、この著者らは更に、対のガイドＲＮＡを含むＣａｓ９ニッカーゼ突然変異体を使用した二重ニッキング戦略を記載した。この著者らによって提供されるプロトコルから、標的部位の選択、切断効率の評価及びオフターゲット活性の分析に関する指針が実験的に導かれた。この研究は、標的設計から始めて、僅か１～２週間以内に遺伝子改変を達成し得るとともに、２～３週間以内に改変クローン細胞系を誘導し得ることを示した。
・Ｓｈａｌｅｍ ｅｔ ａｌ．は、ゲノムワイドな規模で遺伝子機能を調べる新しい方法を記載した。この著者らの研究は、６４，７５１個のユニークなガイド配列で１８，０８０個の遺伝子を標的化するゲノム規模のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ノックアウト（ＧｅＣＫＯ）ライブラリの送達が、ヒト細胞におけるネガティブ選択及びポジティブ選択の両方のスクリーニングを可能にしたことを示した。第一に、この著者らは、ＧｅＣＫＯライブラリを使用した、癌及び多能性幹細胞における細胞生存にとって不可欠な遺伝子の同定を示した。次に、この著者らは黒色腫モデルにおいて、その欠損が突然変異体プロテインキナーゼＢＲＡＦを阻害する治療薬ベムラフェニブに対する耐性に関わる遺伝子をスクリーニングした。この著者らの研究は、最も上位にランク付けされた候補に、以前検証された遺伝子ＮＦ１及びＭＥＤ１２並びに新規ヒットＮＦ２、ＣＵＬ３、ＴＡＤＡ２Ｂ、及びＴＡＤＡ１が含まれたことを示した。この著者らは、同じ遺伝子を標的化する独立したガイドＲＮＡ間における高度な一致及び高率のヒット確認を観察し、従ってＣａｓ９によるゲノム規模スクリーニングの有望さを実証した。
・Ｎｉｓｈｉｍａｓｕ ｅｔ ａｌ．は、２．５Åの分解能でｓｇＲＮＡ及びその標的ＤＮＡと複合体形成する化膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９の結晶構造を報告した。この構造から、標的認識ローブとヌクレアーゼローブとで構成された、それらの界面にある正電荷の溝にｓｇＲＮＡ：ＤＮＡヘテロ二本鎖を受け入れる２ローブ構成が明らかになった。認識ローブはｓｇＲＮＡ及びＤＮＡの結合に決定的に重要であるのに対し、ヌクレアーゼローブはＨＮＨ及びＲｕｖＣヌクレアーゼドメインを含み、これらのドメインは標的ＤＮＡのそれぞれ相補鎖及び非相補鎖の切断に適切な位置にある。ヌクレアーゼローブはまた、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）との相互作用に関与するカルボキシル末端ドメインも含む。この高分解能構造解析及び付随する機能解析により、Ｃａｓ９によるＲＮＡガイド下ＤＮＡターゲティングの分子機構が明らかになることで、ひいては新規の多用途ゲノム編集技術の合理的な設計への道が開かれつつある。
・Ｗｕ ｅｔ ａｌ．は、マウス胚性幹細胞（ｍＥＳＣ）においてシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を負荷した化膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来の触媒不活性Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）のゲノムワイドな結合部位をマッピングした。この著者らは、試験した４つのｓｇＲＮＡの各々が、多くの場合にｓｇＲＮＡにおける５ヌクレオチドシード領域及びＮＧＧプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）によって特徴付けられる数十個ないし数千個のゲノム部位にｄＣａｓ９を標的化することを示した。クロマチンが接触不可能であることにより、一致するシード配列を含む他の部位に対するｄＣａｓ９結合が減少し；従ってオフターゲット部位の７０％が遺伝子と会合する。この著者らは、触媒活性Ｃａｓ９を形質移入したｍＥＳＣにおける２９５個のｄＣａｓ９結合部位の標的シーケンシングから、バックグラウンドレベルを上回って突然変異した部位は１つのみ同定されたことを示した。この著者らは、Ｃａｓ９結合及び切断の２状態モデルを提案しており、このモデルではシードの一致が結合を引き起こすが、切断には標的ＤＮＡとの広範な対合が必要である。
・Ｐｌａｔｔ ｅｔ ａｌ．はＣｒｅ依存性Ｃａｓ９ノックインマウスを樹立した。この著者らは、ニューロン、免疫細胞、及び内皮細胞においてガイドＲＮＡのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）媒介性、レンチウイルス媒介性、又は粒子媒介性送達を用いたインビボ並びにエキソビボゲノム編集を実証した。
・Ｈｓｕ ｅｔ ａｌ．（２０１４）は、細胞の遺伝子スクリーニングを含めたヨーグルトからゲノム編集に至るまでのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９の歴史を広く考察するレビュー論文である。
・Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１４）は、ゲノム規模のレンチウイルスシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）ライブラリを使用するポジティブ選択及びネガティブ選択の両方に好適なプールされた機能喪失型遺伝子スクリーニング手法に関する。
・Ｄｏｅｎｃｈ ｅｔ ａｌ．は、６個の内因性マウス遺伝子及び３個の内因性ヒト遺伝子のパネルの可能な全ての標的部位にわたってタイリングするｓｇＲＮＡのプールを作成し、その標的遺伝子のヌル対立遺伝子を産生するそれらの能力を抗体対比染色及びフローサイトメトリーによって定量的に評価した。この著者らは、ＰＡＭの最適化により活性が向上することを示し、また、ｓｇＲＮＡを設計するためのオンラインツールも提供した。
・Ｓｗｉｅｃｈ ｅｔ ａｌ．は、ＡＡＶ媒介性ＳｐＣａｓ９ゲノム編集により脳における遺伝子機能の逆遺伝学研究が可能となり得ることを実証している。
・Ｋｏｎｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．（２０１５）は、複数のエフェクタードメイン、例えば、転写アクチベーター、機能及びエピゲノム調節因子をステム又はテトラループなどのガイド上の適切な位置にリンカーを伴い及び伴わず付加する能力を考察している。
・Ｚｅｔｓｃｈｅ ｅｔ ａｌ．は、Ｃａｓ９酵素が２つにスプリットされることができ、ひいては活性化のためのＣａｓ９のアセンブリを制御し得ることを実証している。
・Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．は、マウスにおけるゲノムワイドなインビボＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９スクリーニングによって肺転移の調節遺伝子が明らかになることを実証することによる多重スクリーニングに関する。
・Ｒａｎ ｅｔ ａｌ．（２０１５）はＳａＣａｓ９及びそのゲノム編集能力に関し、生化学アッセイからは推定できないことを実証している。Ｓｈａｌｅｍ ｅｔ ａｌ．（２０１５）は、触媒不活性Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）融合物を使用して発現を合成的に抑制（ＣＲＩＳＰＲｉ）又は活性化（ＣＲＩＳＰＲａ）する方法を記載し、アレイ化且つプール化されたスクリーンを含め、ゲノムスケールのスクリーン用のＣａｓ９を使用した進歩、ゲノム遺伝子座を不活性化するノックアウト手法及び転写活性を調節する戦略を示している。
・Ｓｈａｌｅｍ ｅｔ ａｌ．（２０１５）は、触媒的に不活性なＣａｓ９（ｄＣａｓ９）の融合物を用いて発現を合成的に抑制（ＣＲＩＳＰＲｉ）又は活性化（ＣＲＩＳＰＲａ）する方法について記載し、アレイ化及びプール化されたスクリーニングを含めたゲノム規模のスクリーニング、ゲノム遺伝子座を不活性化させるノックアウト手法及び転写活性を調節するストラテジーにＣａｓ９を用いる進歩を示している。
・Ｘｕ ｅｔ ａｌ．（２０１５）は、ＣＲＩＳＰＲベースのスクリーニングにおけるシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）の効率に寄与するＤＮＡ配列特徴を評価した。この著者らは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ノックアウトの効率及び切断部位におけるヌクレオチド優先度を調査した。この著者らはまた、ＣＲＩＳＰＲｉ／ａの配列優先度がＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ノックアウトのものと実質的に異なることも見出した。
・Ｐａｒｎａｓ ｅｔ ａｌ．（２０１５）は、ゲノムワイドなプールＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ライブラリを樹状細胞（ＤＣ）に導入することにより、細菌リポ多糖（ＬＰＳ）による腫瘍壊死因子（Ｔｎｆ）の誘導を制御する遺伝子を同定した。Ｔｌｒ４シグナル伝達の既知の調節因子及びこれまで知られていない候補が同定され、ＬＰＳに対するカノニカルな応答への個別的な効果を有する３つの機能モジュールに分類された。
・Ｒａｍａｎａｎ ｅｔ ａｌ（２０１５）は、感染細胞におけるウイルスエピソームＤＮＡ（ｃｃｃＤＮＡ）の切断を実証した。ＨＢＶゲノムは感染ヘパトサイトの核に、共有結合閉環状ＤＮＡ（ｃｃｃＤＮＡ）と呼ばれる３．２ｋｂの二本鎖エピソームＤＮＡ種として存在し、ｃｃｃＤＮＡは、現在の治療法によってはその複製が阻害されないＨＢＶライフサイクルの主要な構成成分である。この著者らは、ＨＢＶの高度に保存された領域を特異的に標的化するｓｇＲＮＡがウイルス複製をロバストに抑制し、ｃｃｃＤＮＡを枯渇させることを示した。
・Ｎｉｓｈｉｍａｓｕ ｅｔ ａｌ．（２０１５）は、５’－ＴＴＧＡＡＴ－３’ＰＡＭ及び５’－ＴＴＧＧＧＴ－３’ＰＡＭを含有する、シングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）及びその二本鎖ＤＮＡ標的との複合体中のＳａＣａｓ９の結晶構造を報告した。ＳａＣａｓ９とＳｐＣａｓ９の構造比較により、構造的保存及び多様性の両方が明らかとなり、それらの特徴的なＰＡＭ特異性及びオルソロガスｓｇＲＮＡ認識が説明された。
・Ｚｅｔｓｃｈｅ ｅｔ ａｌ．（２０１５）は、推定クラス２ ＣＲＩＳＰＲエフェクターであるＣｐｆ１の特徴付けを報告した。Ｃｐｆ１はＣａｓ９と異なる特徴をもってロバストなＤＮＡ干渉を媒介することが実証された。この干渉機構の同定により、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系に関する我々の理解が深まり、そのゲノム編集適用が進歩する。
・Ｓｈｍａｋｏｖ ｅｔ ａｌ．（２０１５）は、３つの異なるクラス２ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系の特徴付けを報告した。同定された系のうちの２つのエフェクター、Ｃ２ｃ１及びＣ２ｃ３は、Ｃｐｆ１と遠縁のＲｕｖＣ様エンドヌクレアーゼドメインを含む。第３の系、Ｃ２ｃ２は、２つの予測ＨＥＰＮ ＲＮアーゼドメインを有するエフェクターを含む。
・Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．（２０１６）は、構造誘導型飽和突然変異誘発スクリーンを用いてＣｐｆ１のターゲティング範囲を増加させることを報告した。ＡｓＣｐｆ１変異体が、それぞれＴＹＣＶ／ＣＣＣＣ及びＴＡＴＶ ＰＡＭを有する標的部位を切断することのできる突然変異Ｓ５４２Ｒ／Ｋ６０７Ｒ及びＳ５４２Ｒ／Ｋ５４８Ｖ／Ｎ５５２Ｒによってエンジニアリングされ、インビトロ及びヒト細胞における活性が増進した。
また、「高度に特異的なゲノム編集のための二量体ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡガイド下ＦｏｋＩヌクレアーゼ（Ｄｉｍｅｒｉｃ ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ－ｇｕｉｄｅｄ ＦｏｋＩ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ ｆｏｒ ｈｉｇｈｌｙ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ）」，Ｓｈｅｎｇｄａｒ Ｑ．Ｔｓａｉ，Ｎｉｃｏｌａｓ Ｗｙｖｅｋｅｎｓ，Ｃｙｄ Ｋｈａｙｔｅｒ，Ｊｅｎｎｉｆｅｒ Ａ．Ｆｏｄｅｎ，Ｖｉｓｈａｌ Ｔｈａｐａｒ，Ｄｅｅｐａｋ Ｒｅｙｏｎ，Ｍａｔｈｅｗ Ｊ．Ｇｏｏｄｗｉｎ，Ｍａｒｔｉｎ Ｊ．Ａｒｙｅｅ，Ｊ．Ｋｅｉｔｈ Ｊｏｕｎｇ Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３２（６）：５６９－７７（２０１４）は、伸長した配列を認識し、且つヒト細胞において内因性遺伝子を高効率で編集することのできる二量体ＲＮＡガイド下ＦｏｋＩヌクレアーゼに関する。
加えて、ｓｇＲＮＡ・Ｃａｓ９タンパク質含有粒子を調製する方法であって、ｓｇＲＮＡ及びＣａｓ９タンパク質（及び任意選択でＨＤＲ鋳型）を含む混合物を界面活性剤、リン脂質、生分解性ポリマー、リポタンパク質及びアルコールを含むか又はそれらから本質的になるか又はそれらからなる混合物と混合することを含む方法；及びかかる方法からの粒子に関して、「粒子送達成分を用いた障害及び疾患を標的化するためのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系及び組成物の送達、使用及び治療適用（ＤＥＬＩＶＥＲＹ，ＵＳＥ ＡＮＤ ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣ ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ ＯＦ ＴＨＥ ＣＲＩＳＰＲ－ＣＡＳ ＳＹＳＴＥＭＳ ＡＮＤ ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ ＦＯＲ ＴＡＲＧＥＴＩＮＧ ＤＩＳＯＲＤＥＲＳ ＡＮＤ ＤＩＳＥＡＳＥＳ ＵＳＩＮＧ ＰＡＲＴＩＣＬＥ ＤＥＬＩＶＥＲＹ ＣＯＭＰＯＮＥＮＴＳ）」と題されるＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ１４／７００５７号明細書、代理人整理番号４７６２７．９９．２０６０及びＢＩ－２０１３／１０７（２０１４年９月２４日に出願された米国仮特許出願第６２／０５４，４９０号明細書；２０１４年６月１０日に出願された同第６２／０１０，４４１号明細書；及び各々２０１３年１２月１２日に出願された同第６１／９１５，１１８号明細書、同第６１／９１５，２１５号明細書及び同第６１／９１５，１４８号明細書の１つ以上又は全てからの優先権を主張する）（「粒子送達ＰＣＴ」）（参照により本明細書に援用される）が挙げられる。例えば、Ｃａｓ９タンパク質とｓｇＲＮＡとが、有利には滅菌ヌクレアーゼフリー緩衝液、例えば１×ＰＢＳ中に、好適な、例えば３：１～１：３又は２：１～１：２又は１：１のモル比で、好適な温度、例えば１５～３０℃、例えば２０～２５℃、例えば室温で、好適な時間、例えば１５～４５、例えば３０分間にわたり共に混合された。それとは別に、界面活性剤、例えば、カチオン性脂質、例えば、１，２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）；リン脂質、例えば、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）；生分解性ポリマー、例えばエチレングリコールポリマー又はＰＥＧ、及びリポタンパク質、例えば低密度リポタンパク質、例えばコレステロールなどの、又はそれらを含む粒子構成成分が、アルコール、有利にはＣ１～６アルキルアルコール、例えば、メタノール、エタノール、イソプロパノール、例えば１００％エタノール中に溶解された。これらの２つの溶液が共に混合され、Ｃａｓ９－ｓｇＲＮＡ複合体を含有する粒子が形成された。従って、複合体全体を粒子に製剤化する前に、ｓｇＲＮＡをＣａｓ９タンパク質と予め複合体化してもよい。製剤は、細胞への核酸の送達を促進することが知られる種々のモル比の種々の構成成分（例えば１，２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）、１，２－ジテトラデカノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＭＰＣ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、及びコレステロール）で作製されてもよい。例えばＤＯＴＡＰ：ＤＭＰＣ：ＰＥＧ：コレステロールのモル比はＤＯＴＡＰ１００、ＤＭＰＣ０、ＰＥＧ０、コレステロール０；又はＤＯＴＡＰ９０、ＤＭＰＣ０、ＰＥＧ１０、コレステロール０；又はＤＯＴＡＰ９０、ＤＭＰＣ０、ＰＥＧ５、コレステロール５、ＤＯＴＡＰ１００、ＤＭＰＣ０、ＰＥＧ０、コレステロール０であってもよい。従って本出願は、ｓｇＲＮＡ、Ｃａｓ９タンパク質及び粒子を形成する構成成分を混合すること；並びにかかる混合からの粒子を包含する。本発明の態様は、粒子；例えば、本発明にあるようなｓｇＲＮＡ及び／又はＣａｓ９を含む混合物と、例えば粒子送達ＰＣＴにあるような、粒子を形成する構成成分とを混合して粒子を形成することにより、例えば、粒子送達ＰＣＴと同様の方法を使用する粒子、及びかかる混合からの粒子（又は、当然ながら、本発明にあるようなｓｇＲＮＡ及び／又はＣａｓ９を含む他の粒子）を含み得る。
実施例１：Ｃａｓ１３ａファミリーの特徴付け
本出願人らは、１５個のＣａｓ１３ａオルソログをＰＦＳ優先性及び活性に関して（図５７Ａ）アンピシリン耐性細菌アッセイ（図３Ａ）を用いて包括的に評価した。簡潔に言えば、ランダム化したＰＦＳヌクレオチドが隣接するβ－ラクタマーゼ転写物の配列の５’ストレッチを標的とするようにＣａｓ１３ａをプログラムする。Ｃａｓ１３ａ切断活性により、アンピシリン選択下では細菌が死滅し、続いて次世代シーケンシングによってＰＦＳ枯渇を分析する。オルソログ間での定量的比較を可能にするため、本出願人らはｐＪ２３１１９小型ＲＮＡプロモーターの発現下の隣接するシングルスペーサーＣＲＩＳＰＲアレイと共にｐＬａｃプロモーター下の各Ｃａｓ１３ａオルソログをクローニングした。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）においてＰＦＳプラスミドライブラリをＣａｓ１３ａオルソログプラスミドの各々と同時形質転換した後、本出願人らは形質転換体をカウントすることにより細菌の生存を計測し、レプトトリキア・ウエイデイ（Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ ｗａｄｅｉｉ）（ＬｗａＣａｓ１３ａ）からのＣａｓ１３ａオルソログが最も高活性で、続いてレプトトリキア・シャーイイ（Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ ｓｈａｈｉｉ）Ｃａｓ１３ａ（ＬｓｈＣａｓ１３ａ）であることを見出した（図３Ｃ、図３Ｄ）。ＬｗａＣａｓ１３ａ及びＬｓｈＣａｓ１３ａスクリーンからのＰＦＳ分布の次世代シーケンシング解析により、ほとんどのＬｗＣａｓ１３ａ ＰＦＳ配列が枯渇したことが明らかになり（図３Ｇ及び図５７Ｂ、図５７Ｃ）、ロバストなＬｗＣａｓ１３ａ ＲＮＡ切断活性が示唆された。実際、様々な閾値での枯渇ＰＦＳ配列のモチーフ分析により、ＬｓｈＣａｓ１３ａの予想される３’Ｈモチーフが明らかになったが、ＬｗＣａｓ１３ａについては有意なＰＦＳモチーフはなかった（図３Ｈ、図５６Ｄ、図５６Ｅ）。核酸検出のためのＬｗＣａｓ１３ａの最近の開発において、本出願人らはＬｗＣａｓ１３ａがＬｓｈＣａｓ１３ａよりも高活性であることを見出したとともに、生化学的特徴付けによって弱い３’Ｈ ＰＦＳを見出した。ＬｗＣａｓ１３ａは試験した１５個のＣａｓ１３ａオルソログのなかで最も高活性であり、及び細菌においてはＰＦＳを有しないことが見出された。
実施例２：真核細胞におけるＣ２ｃ２の発現
以下のＣ２ｃ２オルソログを哺乳類細胞における発現にコドン最適化した。
Figure 2023134453000011
以下の表に、上記の種のタンパク質配列を挙げる。
Figure 2023134453000012
Figure 2023134453000013
Figure 2023134453000014
Figure 2023134453000015
Figure 2023134453000016
Figure 2023134453000017
Figure 2023134453000018
Figure 2023134453000019
Figure 2023134453000020
Ｃ２ｃ２オルソログの各々をｍＣｈｅｒｒｙ及び任意選択でＮＬＳ又はＮＥＳと合わせた融合構築物を作製し、哺乳類発現ベクターにクローニングした（図１Ａ）。様々なＣ２ｃ２オルソログをＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクトし、ｍＣｈｅｒｒｙ発現に基づき細胞局在を評価した。Ｃ末端及びＮ末端ＮＥＳに融合したとき、Ｃ末端及びＮ末端ＮＬＳに融合したとき、又はＮＥＳ又はＮＬＳ融合がないときの種々のＣ２ｃ２オルソログの代表的な局在をそれぞれ図１Ｂ、図１Ｃ、及び図１Ｄに示す。ＮＥＳ融合物は効率的にＣ２ｃ２タンパク質の細胞質局在をもたらした。ＮＬＳ融合物は効率的にＣ２ｃ２タンパク質の核局在をもたらした。不定に、ＮＬＳ融合物では核小体局在もまた観察することができる。Ｃ２ｃ２がＮＬＳ又はＮＥＳに融合されなかったとき、不定の細胞質／核局在が観察された。
実施例３：真核細胞におけるＣ２ｃ２（Ｃａｓ１３ａ）の活性
Ｇｌｕｃに対する種々のｇＲＮＡで図２に示すとおりルシフェラーゼターゲティングアッセイを実施した。Ｃ２ｃ２オルソログ、レプトトリキア・ウエイデイ（Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ ｗａｄｅｉ）Ｆ０２７９（Ｌｗ２）及びリステリア・ニューヨーケンシス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｎｅｗｙｏｒｋｅｎｓｉｓ）ＦＳＬ Ｍ６－０６３５（ＬｂＦＳＬ）をＮＬＳ又はＮＥＳに融合し、或いは局在化シグナルに融合しなかった。ルシフェラーゼの正規化タンパク質発現を決定し、ノンターゲティング（ＮＴ）ｇＲＮＡと比較した。結果は図４に示す。効率的なノックダウンが見られた。図４Ａ及び図４Ｂに示すとおりの実験で使用したスペーサー配列は以下のとおりである：
図４Ａ
ガイド１ ＡＴＣＡＧＧＧＣＡＡＡＣＡＧＡＡＣＴＴＴＧＡＣＴＣＣｃａ
ガイド２ ＡＧＡＴＣＣＧＴＧＧＴＣＧＣＧＡＡＧＴＴＧＣＴＧＧＣＣＡ
ガイド３ ＴＣＧＣＣＴＴＣＧＴＡＧＧＴＧＴＧＧＣＡＧＣＧＴＣＣＴＧ
ガイドＮＴ ｔａｇａｔｔｇｃｔｇｔｔｃｔａｃｃａａｇｔａａｔｃｃａｔ
図４Ｂ
ガイド１ ＴＣＧＣＣＴＴＣＧＴＡＧＧＴＧＴＧＧＣＡＧＣＧＴＣＣＴＧ
ガイドＮＴ ｔａｇａｔｔｇｃｔｇｔｔｃｔａｃｃａａｇｔａａｔｃｃａｔ
ＥＧＦＰに対する種々のｇＲＮＡで図２Ｃに示すとおりＧＦＰ発現に基づくターゲティングアッセイを実施した。Ｃ２ｃ２オルソログ、レプトトリキア・ウエイデイ（Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ ｗａｄｅｉ）Ｆ０２７９（Ｌｗ２）及びリステリア・ニューヨーケンシス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｎｅｗｙｏｒｋｅｎｓｉｓ）ＦＳＬ Ｍ６－０６３５（ＬｂＦＳＬ）をＮＬＳ又はＮＥＳに融合し、或いは局在化シグナルに融合しなかった。ＧＦＰの正規化発現を決定し、ノンターゲティング（ＮＴ）ｇＲＮＡと比較した。結果は図５に示す。効率的なノックダウンが見られた。図５Ａ及び図５Ｂに示すとおりの実験で使用したスペーサー配列は以下のとおりである：
図５Ａ
ガイド１ ｔｇａａｃａｇｃｔｃｃｔｃｇｃｃｃｔｔｇｃｔｃａｃｃａｔ
ガイド２ ｔｃａｇｃｔｔｇｃｃｇｔａｇｇｔｇｇｃａｔｃｇｃｃｃｔｃ
ガイド３ ｇｇｇｔａｇｃｇｇｃｔｇａａｇｃａｃｔｇｃａｃｇｃｃｇｔ
ガイド４ ｇｇｔｃｔｔｇｔａｇｔｔｇｃｃｇｔｃｇｔｃｃｔｔｇａａｇ
ガイド５ ｔａｃｔｃｃａｇｃｔｔｇｔｇｃｃｃｃａｇｇａｔｇｔｔｇｃ
ガイド６ ｃａｃｇｃｔｇｃｃｇｔｃｃｔｃｇａｔｇｔｔｇｔｇｇｃｇｇ
ガイド７ ｔｃｔｔｔｇｃｔｃａｇｇｇｃｇｇａｃｔｇｇｇｔｇｃｔｃａ
ガイド８ ｇａｃｔｔｇｔａｃａｇｃｔｃｇｔｃｃａｔｇｃｃｇａｇａｇ
ガイドＮＴ ｔａｇａｔｔｇｃｔｇｔｔｃｔａｃｃａａｇｔａａｔｃｃａｔ
図５Ｂ
ガイド２ ｔｃａｇｃｔｔｇｃｃｇｔａｇｇｔｇｇｃａｔｃｇｃｃｃｔｃ
ガイド３ ｇｇｇｔａｇｃｇｇｃｔｇａａｇｃａｃｔｇｃａｃｇｃｃｇｔ
ガイド４ ｇｇｔｃｔｔｇｔａｇｔｔｇｃｃｇｔｃｇｔｃｃｔｔｇａａｇ
ガイド５ ｔａｃｔｃｃａｇｃｔｔｇｔｇｃｃｃｃａｇｇａｔｇｔｔｇｃ
ガイド６ ｃａｃｇｃｔｇｃｃｇｔｃｃｔｃｇａｔｇｔｔｇｔｇｇｃｇｇ
ガイド７ ｔｃｔｔｔｇｃｔｃａｇｇｇｃｇｇａｃｔｇｇｇｔｇｃｔｃａ
ガイド８ ｇａｃｔｔｇｔａｃａｇｃｔｃｇｔｃｃａｔｇｃｃｇａｇａｇ
ガイドＮＴ ｔａｇａｔｔｇｃｔｇｔｔｃｔａｃｃａａｇｔａａｔｃｃａｔ
ＨＥＫ２９３細胞の種々の内因性標的遺伝子に関して内因性標的遺伝子に対するｇＲＮＡでターゲティングアッセイを実施した。Ｃ２ｃ２レプトトリキア・ウエイデイ（Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ ｗａｄｅｉ）Ｆ０２７９（Ｌｗ２）をＮＥＳに融合した。それぞれの標的遺伝子の正規化タンパク質発現を決定した（ノンターゲティング（ＮＴ）ｇＲＮＡと比較した）。結果は図７に示す。効率的なノックダウンが見られた。図７に示すとおりの実験で使用したスペーサー配列は以下のとおりである：
図７
ＣＴＮＮＢ１ ｃｔｇｃｔｇｃｃａｃａｇａｃｃｇａｇａｇｇｃｔｔａａａａ
ＰＰＩＢ ｔｃｃｔｔｇａｔｔａｃａｃｇａｔｇｇａａｔｔｔｇｃｔｇｔ
ｍＡＰＫ１４ ｔｃａａｇｇｔｇｇｇｇｔｃａｃａｇｇａｇａａｇｃｃａａａ
ＣＸＣＲ４ ａｔｇａｔａａｔｇｃａａｔａｇｃａｇｇａｃａｇｇａｔｇａ
ＴＩＮＣＲ ｇｃｇｔｇａｇｃｃａｃｃｇｃｇｃｃｔｇｇｃｃｇｇｃｔｇｔ
ＰＣＡＴ１ ｃｃａｇｃｔｇｃａｇａｔｇｃｔｇｃａｇｔｔｔｔｔｇｇｃｇ
ＣＡＰＮ１ ｃｔｇｇａａａｔｇｇａａｇａｔｇｃｃｇｇｃａｔａｇｃｃａ
ＬＥＴＭＤ１ ｇａｔｇａｃａｃｃｔｃａｃａｃｇｇａｃｃａｃｃｃｃｔａｇ
ＭＡＰＫ１４ ｔａａｔａｃｔｇｃｔｃｃａｇａｔａｔｇｇｇｔｇｇｇｃｃａ
ＲＢ１ ｃａｔｇａａｇａｃｃｇａｇｔｔａｔａｇａａｔａｃｔａｔａ
ＴＰ５３ ｇｇｔｇａａａｔａｔｔｃｔｃｃａｔｃｃａｇｔｇｇｔｔｔｃ
ＫＲＡＳ ａａｔｔｔｃｔｃｇａａｃｔａａｔｇｔａｔａｇａａｇｇｃａ
実施例４：真核細胞における翻訳アクチベーター／プロモーターに融合した触媒不活性Ｃ２ｃ２による翻訳上方制御
触媒不活性Ｃ２ｃ２オルソログ、レプトトリキア・ウエイデイ（Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ ｗａｄｅｉ）Ｆ０２７９（Ｌｗ）及びリステリア・ニューヨーケンシス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｎｅｗｙｏｒｋｅｎｓｉｓ）ＦＳＬ Ｍ６－０６３５（ＬｂＦＳＬ）を作成した。
Ｌｗ Ｃ２ｃ２はＮＥＳに融合するか又は局在化シグナルなしで、及び任意選択でＥＩＦ４Ｅに融合した。
ＬｂＦＳＬはＮＬＳ及び任意選択でＥＩＦ４Ｅに融合した。
Ｇｌｕｃを標的とした（図２を参照）。
ＥＩＦ４Ｅ有り及び無しのＣ２ｃ２によるターゲティング間の比較に基づき相対タンパク質発現を評価した。
結果は図１０に示す。
効率的な翻訳上方制御が見られた。図１０に示されるとおりの実験で使用したスペーサー配列はｔａｇａｔｔｇｃｔｇｔｔｃｔａｃｃａａｇｔａａｔｃｃａｔであり、標的はこのスペーサーに対する結合部位を３回有する。
実施例５：ＮａＡＳＯ２処理時のＣ２ｃ２及びその標的β－アクチンの共局在
亜ヒ酸ナトリウム（ＮａＡｓＯ２）の影響下におけるβ－アクチンを標的とするＣ２ｃ２の局在について調べた。レプトトリキア・ウエイデイ（Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ ｗａｄｅｉ）Ｃ２ｃ２とｍＣｈｅｒｒｙ及びＮＥＳの融合構築物を作製し、β－アクチンを標的とするガイド又はノンターゲティングガイドと共に哺乳類発現ベクターにクローニングした。ｍＣｈｅｒｒｙ発現に基づきＣ２ｃ２の細胞局在を評価し、ストレス顆粒をＧ３ＢＰ１－ＧＦＰで標識した。βアクチンを標的とするＬｗ Ｃ２ｃ２はＮａＡｓＯ２処理時にストレス顆粒に局在することが見出された（図１１Ａ）。この局在はβ－アクチン（ｂｅｔａ－ａｃｔｉｎｇ）ターゲティングでのみ見られ、ノンターゲティングガイドでは見られなかったため、ガイド依存的であった（図１１Ｂ、図１１Ｃ）。
実施例６：別のｃｒＲＮＡプロモーターを使用してノックダウン活性をブーストする
干渉効果を更に増加させるため、ｃｒＲＮＡをＵ６プロモーターの制御下に置いた。
Ｃ２ｃ２による干渉効率の向上を目的として、ｔＲＮＡ－ｃｒＲＮＡ及びＵ６によりドライブされるｃｒＲＮＡ及びｓｈＲＮＡを用いて標的化した遺伝子の発現を比較した。ｓｈＲＮＡと同等の効率で確実な標的遺伝子ノックダウンが観察された（図１２、図１４）。更なる実験を実施して、ｃｒＲＮＡトランスフェクション量の増加効果（図１３）、タンパク質トランスフェクション量の増加効果（図１５）及びＤＲ－スペーサー－ＤＲ－スペーサー構築物の効果（図１６）を決定した。Ｃ２ｃ２は内因性遺伝子上の対応する標的に対して最適化ｓｈＲＮＡより優れていることが分かった。
実施例７：Ｃ２ｃ２との融合構築物
図１８に実証されるとおり、ｄＬｗ２Ｃ２ｃ２－ＥＩＦ４Ｅ融合物は３つの遺伝子の翻訳；ウエスタンブロットでのバンド強度によって計測したときのタンパク質レベルを上方制御することができる。
実施例８：標的誘導性非特異的ＲＮアーゼ活性
Ｃ２ｃ２標的誘導性非特異的ＲＮアーゼ活性は、試料中のＲＮＡ種の検出に有用である。目的のＲＮＡ標的の存在下では、ガイド依存的Ｃ２ｃ２ヌクレアーゼ活性に、コラテラル標的に対する非特異的ＲＮアーゼ活性が付随する。例えば、蛍光部分及び蛍光消光剤を含むレポーターＲＮＡは活性化Ｃ２ｃ２によって非特異的に切断される。ＲＮＡ基質の一端に蛍光レポーター分子（ｆｌｕｏｒ）及び他端に消光剤のタグを付加する。Ｃ２ｃ２ＲＮアーゼ活性が存在しない場合、消光剤が物理的に近接しているため、ｆｌｕｏｒからの蛍光は低レベルに抑えられる。Ｃ２ｃ２標的特異的切断（ｃｌｅａｖｇｅ）が活性化されると、ＲＮＡ基質が非特異的に切断され、ｆｌｕｏｒ及び消光剤が空間的に分離される。これにより、適切な波長（ｗａｖｅｗｌｅｎｇｔｈ）の光によって励起したときｆｌｕｏｒがシグナルを発する。かかるアッセイの概略図を図２４Ａに示す。
実施例９：Ｌｗ２Ｃ２ｃ２（ＬｗａＣａｓ１３ａ）の生化学的特徴付け
方法は基本的にＡｂｕｄａｙｙｅｈ ｅｔ ａｌ．（２０１６）「Ｃ２ｃ２は単一成分プログラム可能ＲＮＡガイド下ＲＮＡターゲティングＣＲＩＳＰＲエフェクターである（Ｃ２ｃ２ ｉｓ ａ ｓｉｎｇｌｅ－ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ ＲＮＡ－ｇｕｉｄｅｄ ＲＮＡ－ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ＣＲＩＳＰＲ ｅｆｆｅｃｔｏｒ）」；Ｓｃｉｅｎｃｅ ３５３（６２９９），ＤＯＩ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．ａａｆ５５７３に記載されるとおりであり；及び参照により本明細書に援用される。
細菌細胞におけるＬｗａＣａｓ１３ａの望ましい切断活性から、本出願人らは哺乳類細胞で試験する前にその切断をより良く理解しようと更なる生化学的特徴付けを探究した。ＬｓｈＣａｓ１３ａ及びＬｗａＣａｓ１３ａの両方によるインビトロ切断反応から、２８ｎｔスペーサーをコードするガイドによるプログラム可能な標的切断及びＭｇ２＋の必要性が実証され（図３Ｉ）、並びにＬｓｈＣａｓ１３ａと比べたＬｗａＣａｓ１３ａのインビボでの効率増加が確認された。一本鎖ＲＮＡ標的（ｓｓＲＮＡ １）をＬｗａＣａｓ１３ａ及びガイドとインキュベートすると、２分以内に検出可能な切断が示され、３０分のインキュベーション後にはほぼ完全な切断となった一方、ガイドのないＬｗａＣａｓ１３ａでは観察可能な切断はなく（図３７）、切断はＬｗａＣ２ｃ２－ガイド複合体レベルに伴い用量依存的であった（図３６）。型通りの切断産物が見られることを考え、本出願人らは、ＬｗａＣａｓ１３ａ切断パターンがＬｓｈＣａｓ１３ａと同様に標的依存性であったと仮定した（Ａｂｕｄａｙｙｅｈ，Ｏ．Ｏ．ｅｔ ａｌ．「Ｃ２ｃ２は単一成分プログラム可能ＲＮＡガイド下ＲＮＡターゲティングＣＲＩＳＰＲエフェクターである（Ｃ２ｃ２ ｉｓ ａ ｓｉｎｇｌｅ－ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ ＲＮＡ－ｇｕｉｄｅｄ ＲＮＡ－ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ＣＲＩＳＰＲ ｅｆｆｅｃｔｏｒ）」．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３５３，ａａｆ５５７３，ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．ａａｆ５５７３（２０１６））。様々なインシリコ予測二次構造を持つ複数のＲＮＡ標的（図４２）とインキュベートすると、実質的に異なる切断パターンが明らかになった（図４２）。ＬｗａＣａｓ１３ａ切断が標的上の露出した一本鎖領域の塩基同一性に依存するかどうかを決定するため、本出願人らは、ループにホモポリマー置換を有する標的（改変ｓｓＲＮＡ標的４）上でＬｗａＣａｓ１３ａをインキュベートした（図４３）。本出願人らは、Ｃ又はＵ置換を有する標的に対する切断がより強いことを見出し（図４３）、ＬｗａＣａｓ１３ａは、Ｕ残基で優先的に切断するＬｓｈＣａｓ１３ａよりも基質柔軟性が高いことを示した（Ａｂｕｄａｙｙｅｈ，Ｏ．Ｏ．ｅｔ ａｌ．「Ｃ２ｃ２は単一成分プログラム可能ＲＮＡガイド下ＲＮＡターゲティングＣＲＩＳＰＲエフェクターである（Ｃ２ｃ２ ｉｓ ａ ｓｉｎｇｌｅ－ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ ＲＮＡ－ｇｕｉｄｅｄ ＲＮＡ－ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ＣＲＩＳＰＲ ｅｆｆｅｃｔｏｒ）」．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３５３，ａａｆ５５７３，ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．ａａｆ５５７３（２０１６））。標的ＲＮアーゼ活性に加えて、Ｃａｓ１３ファミリーはＬ．ウエイデイ（Ｌ．ｗａｄｉｅ）からのそれ自身の対応するｐｒｅ－ｃｒＲＮＡ転写物をプロセシングすることが報告されている（図４３Ｃ）（Ｅａｓｔ－Ｓｅｌｅｔｓｋｙ，Ａ．ｅｔ ａｌ．「ＣＲＩＳＰＲ－Ｃ２ｃ２の２つの異なるＲＮアーゼ活性がガイドＲＮＡプロセシング及びＲＮＡ検出を可能にする（Ｔｗｏ ｄｉｓｔｒｉｃｔ ＲＮａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃ２ｃ２ ｅｎａｂｌｅ ｇｕｉｄｅ－ＲＮＡ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ａｎｄ ＲＮＡ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ）」，Ｎａｔｕｒｅ ５３８，２７０－２７３（２０１６））。本出願人らはまた、スペーサー配列又はダイレクトリピート（ＤＲ）配列のいずれかをトランケートすることによりＬｗａＣａｓ１３ａ切断に対するガイド制約についても調べた。本出願人らは、２０ｎｔほどの短いスペーサー長さでもＬｗａＣａｓ１３ａがインビトロ切断活性を保持し（図４１）、２７ｎｔほどの短いＤＲトランケーションでも切断できた（図４０）（但し１つのＤＲ長トランケーション（３２ｎｔ）では恐らく二次構造の摂動に起因して活性がなくなるように見えた）ことを見出した。２０ｎｔ未満のガイド長さはもはや触媒活性を示さないが、ＬｗａＣａｓ１３－ガイド複合体はなおも結合活性を保持できたことから、単一の触媒酵素による直交性の適用が可能となる（Ｄａｈｌｍａｎ，Ｊ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．「触媒活性Ｃａｓ９ヌクレアーゼによる直交性遺伝子ノックアウト及び活性化（Ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｇｅｎｅ ｋｎｏｃｋｏｕｔ ａｎｄ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ａ ｃａｔａｌｙｔｉｃａｌｌｙ ａｃｔｉｖｅ Ｃａｓ９ ｎｕｃｌｅａｓｅ）」．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３３，１１５９－１１６１，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．３３９０（２０１５））。
Ｃａｓ１３ファミリーは、Ｃｐｆ１と同じように（Ｆｏｎｆａｒａ，Ｉ．，Ｒｉｃｈｔｅｒ，Ｈ．，Ｂｒａｔｏｖｉｃ，Ｍ．，Ｌｅ Ｒｈｕｎ，Ａ．＆ Ｃｈａｒｐｅｎｔｉｅｒ，Ｅ．「ＣＲＩＳＰＲ関連ＤＮＡ切断酵素Ｃｐｆ１は前駆体ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡもプロセシングする（Ｔｈｅ ＣＲＩＳＰＲ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ＤＮＡ－ｃｌｅａｖｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ Ｃｐｆ１ ａｌｓｏ ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ）」．Ｎａｔｕｒｅ ５３２，５１７－５２１，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ１７９４５（２０１６）；Ｚｅｔｓｃｈｅ，Ｂ．ｅｔ ａｌ．「単一のガイドアレイを使用したＣＲＩＳＰＲ－Ｃｐｆ１による多重遺伝子編集（Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ｇｅｎｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｂｙ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃｐｆ１ ｕｓｉｎｇ ａ ｓｉｎｇｌｅ ｇｕｉｄｅ ａｒｒａｙ）」．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３５，３１－３４，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．３７３７（２０１７））、完全長ＣＲＩＳＰＲ転写物のプロセシングに関して二重ＲＮアーゼ活性を有することが分かっている（Ｅａｓｔ－Ｓｅｌｅｔｓｋｙ，Ａ．ｅｔ ａｌ．「ＣＲＩＳＰＲ－Ｃ２ｃ２の２つの異なるＲＮアーゼ活性がガイドプロセシング及びＲＮＡ検出を可能にする（Ｔｗｏ ｄｉｓｔｉｎｃｔ ＲＮａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃ２ｃ２ ｅｎａｂｌｅ ｇｕｉｄｅ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ａｎｄ ＲＮＡ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ）」．Ｎａｔｕｒｅ ５３８，２７０－２７３，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ１９８０２（２０１６））。本出願人らは、ＬｗａＣａｓ１３ａがＬ．ウエイデイ（Ｌ．ｗａｄｅｉｉ）からの対応するＣＲＩＳＰＲスペーサー転写物を切断することができ（図３Ｊ）、及びこの切断が濃度依存的であった（図１５Ｂ）ことを見出した。更に、ＬｗａＣａｓ１３ａはゲル電気泳動（図２４Ｃ）によって分離されたＲＮＡ産物に対するコラテラル活性（図２４Ｂ）を示したことから、消光されたフルオロフォアの切断によるコラテラル活性に関する以前の特徴付けが確認された（Ｇｏｏｔｅｎｂｅｒｇ，Ｊ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．「ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１３ａ／Ｃ２ｃ２による核酸検出（Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１３ａ／Ｃ２ｃ２）」．Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｉｎ ｐｒｅｓｓ（２０１７））。
インビトロアッセイでレプトトリキア・ウエイデイ（Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ ｗａｄｅｉ）Ｆ０２７９（Ｌｗａ２）Ｃ２ｃ２を使用して、切断動態（図３６～図３７）、カチオンの存在への切断活性の依存性（図３８）、ＰＦＳ優先性（図３９）、ダイレクトリピート長さの効果（図４０）、スペーサー長さの効果（図４１）、標的ＲＮＡ配列及び二次構造の効果（図４２）及びヌクレオチド切断優先性（図４３）を評価した。
実施例１０：ＬｗａＣａｓ１３ａはレポーターｍＲＮＡをノックダウンするように再プログラムされることができる
ＬｗａＣａｓ１３ａのロバストなＲＮＡ切断活性及び柔軟な配列優先性を所与として、本出願人らは、哺乳類細胞において転写物を切断するその能力を評価することにした。本出願人らは初めに、哺乳類コドン最適化ＬｗａＣａｓ１３ａをＣ末端又はＮ末端上のｍｓｆＧＦＰ融合物及びデュアルフランキング核外移行配列（ＮＥＳ）又は核局在化配列（ＮＬＳ）のいずれかと共に哺乳類発現ベクターにクローニングし、発現及び局在を評価した（図１Ｄ）。本出願人らは、ｍｓｆＧＦＰ融合ＬｗａＣａｓ１３ａ構築物が良好に発現し、局在化配列に従い細胞質又は核に有効に局在したことを見出した。ＬｗａＣａｓ１３ａのインビボ切断活性を評価するため、本出願人らは、同じベクター上で異なるプロモーター下にあるガウシアルシフェラーゼ（Ｇｌｕｃ）及びウミホタル（Ｃｙｐｒｉｄｉｎｉａ）ルシフェラーゼ（Ｃｌｕｃ）の両方を発現するデュアルルシフェラーゼレポーター系を開発し、一方の転写物がＣａｓ１３ａ標的として働き、他方が投与対照として働くことを可能にした（図２Ａ）。本出願人らは次に、Ｇｌｕｃに対するガイドを設計し、それをｔＲＮＡＶａｌプロモーター発現ガイドベクターにクローニングした。本出願人らはＬｗａＣａｓ１３ａ発現ベクター、ガイドベクター、及びデュアルルシフェラーゼ構築物をＨＥＫ２９３ＦＴにトランスフェクトし、トランスフェクション後４８時間でルシフェラーゼ活性を計測した。本出願人らは、核局在したＬｗａＣａｓ１３ａ－ｍｓｆＧＦＰが最も高いノックダウンレベルをもたらし（ガイド１について７５．７％、ガイド２について７２．９％）、標的領域の接近可能性及び配列を対照する位置対応ｓｈＲＮＡ対照（ガイド１について７８．３％、ガイド２について（ｆｐｒ ｇｅｏｄｅ ２）５１．１％）と同等であったことを見出した（図６Ｂ）。ＬｗａＣａｓ１３ａ－ｍｓｆＧＦＰ－ＮＬＳ構築物の切断が優れていたため、本出願人らは以降の全てのノックダウン実験にこの設計を使用した。核局在したＬｗａＣａｓ１３ａ－ｍｓｆＧＦＰはまた、ｍＣｈｅｒｒｙ融合バージョンと比べても健闘し、これはｍｓｆＧＦＰによってもたらされる安定性の高まりに起因するものと思われた。エンジニアリング融合物によってＬｗａＣａｓ１３ａ活性を操作可能であることは、Ｃａｓ１３ａツールの柔軟性に光を当てる。ＬｗａＣａｓ１３ａはまた、Ａ３７５メラノーマ細胞株においてもノックダウン能を有し（図６Ａ、図９）、Ｃａｓ１３の汎用性を実証する。本出願人らはまた、ＬｗａＣａｓ１３ａが２８ｎｔのスペーサー長さで最良のＧｌｕｃノックダウン（７３．８％）を生じ（図６Ｃ）、このノックダウンがタンパク質及びガイド又はｃｒＲＮＡトランスフェクトベクター量の両方に対して用量反応性である（図５６Ａ、図５６Ｂ）ことも見出した。ガイド発現はプロモーターの選択に感受性を示さず、ｔＲＮＡＶａｌ又はＵ６プロモーターから発現するガイド又はｃｒＲＮＡは同様のレベルのＧｌｕｃノックダウンをもたらす（ｔＲＮＡｖａｌについて６６．３％、Ｕ６について７４．５％）（図５６Ｃ）。
本出願人らは次に、３つの内因性遺伝子：ＫＲＡＳ、ＣＸＣＲ４、及びＰＰＩＢに対するノックダウンを試験して、ノックダウンレベルが様々で、及び３つの遺伝子のうち２つについて、ＬｗａＣａｓ１３ａノックダウン（ＰＰＩＢについて４０．４％、ＣＸＣＲ４について８３．９％、ＫＲＡＳについて５７．５％）が位置対応ｓｈＲＮＡによるＲＮＡｉ（ＰＰＩＢについて６３．０％、ＣＸＣＲ４について７３．９％、ＫＲＡＳについて４４．３％）と同様であったことを見出した（図３Ｏ）。本出願人らはまた、内因性遺伝子ノックダウンがガイドプロモーターの選択に柔軟であり、ｔＲＮＡＶａｌ又はＵ６プロモーターから発現したガイドについて同様のレベルのノックダウンであった（ｔＲＮＡＶａｌについて８６．７％、Ｕ６について７７．６％）ことも見出した（図５６Ｄ）。本出願人らはまた、ＬｗａＣａｓ１３ａがＡ３７５メラノーマ細胞株においてノックダウン能を有することも見出した（図５６Ｅ）。ＬｗａＣａｓ１３ａノックダウンの汎用性を広げるため、本出願人らは、コメ（イネ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ））遺伝子ＥＰＳＰＳ、ＨＣＴ、及びＰＤＳの転写物に対するガイドを設計し、ＬｗａＣａｓ１３ａ及びガイドベクターをイネ（Ｏ．ｓａｔｉｖａ）プロトプラストにコトランスフェクトした（図３Ｐ）。トランスフェクション後、本出願人らは試験した３つの遺伝子全て及び９つのガイドのうち７つについて＞５０％のノックダウンを観察し、最高のノックダウンは７８．０％であった（図３Ｑ）。総合すると、これらの結果は、ＬｗａＣａｓ１３ａがＲＮＡｉと同様のレベルのＲＮＡノックダウンを媒介可能であることを示唆している。Ｃａｓ１３ファミリーの別のメンバーを更に調べることにより、更に強力なノックダウン効果を実現可能なタンパク質が明らかとなり得る。
実施例１１：レポーター及び内因性転写物のＬｗａＣａｓ１３ａノックダウンスクリーニング
ＬｗａＣａｓ１３ａノックダウン効率に対するＲＮＡコンテクストの依存性を包括的に特徴付けるため、本出願人らはＬｗａＣａｓ１３ａのプログラム可能性を利用して、Ｇｌｕｃ、ＫＲＡＳ、ＰＰＩＢ又はＣｌｕｃ転写物の長さに沿ってガイドをタイリングした（図３２Ａ）。Ｇｌｕｃ及びＣｌｕｃスクリーンにより、ノックダウンが６０％を上回るガイド（図３２）が明らかになり、及びＧｌｕｃターゲティングガイドの大多数が５０％を超えるノックダウンを有し、最も高いノックダウンは８３％に至ることが明らかになった。ＬｗａＣａｓ１３ａノックダウンをＲＮＡｉと比較するため、本出願人らはＧｌｕｃ及びＣｌｕｃに対するガイドで上位３つのパフォーマンスのものを選択し、それらを位置対応ｓｈＲＮＡと比較した。本出願人らは、上位６つのパフォーマンスのガイドのうち５つが、それらの対応ｓｈＲＮＡと比べて有意に高いレベルのノックダウン（ｐ＜０．０５）を実現したことを見出した（図３２Ｄ）。
レポーター遺伝子に対するロバストなノックダウンが実証されたことから、本出願人らは次に、２つの遺伝子、ＫＲＡＳ及びＰＰＩＢのタイリングによって内因性転写物を標的化するようにＣａｓ１３ａをエンジニアリングし得るかどうかを調べた。本出願人らは、ノックダウン効率が転写物依存的でありながら、いずれの標的に対しても５０％のノックダウンを実現可能なガイドを本出願人らがなおも見出すことができ、最大のノックダウンはＫＲＡＳ及びＰＰＩＢについてそれぞれ８５％及び７５％であったことを見出した（図４９Ａ、図４９Ｂ）。本出願人らはまた、内因性遺伝子のノックダウンがガイド発現設計に対して柔軟であり、ｔＲＮＡＶａｌ又はＵ６プロモーターから発現したｃｒＲＮＡについて同様のレベルのノックダウンであったことも見出した（図５６Ｄ）。
ＲＮＡｉと比べたＬｗａＣａｓ１３ノックダウンの効率を更に理解するため、本出願人らは様々なガイドを同じ標的領域に位置対応するｓｈＲＮＡ構築物と比較した。本出願人らは、内因性タイリングスクリーンの各々（ＫＲＡＳ及びＰＰＩＢ）から上位３つのガイドを選択し、ｓｈＲＮＡノックダウンによって達成されたレベル（６１．８％～９５．２％）と同等のロバストなノックダウンをＣａｓ１３ａで観察し（５３．７％～８８．８％）、６つのガイドのうち２つについてはｓｈＲＮＡの方が良好で（ｐ＜０．０１）、６つのガイドのうち２つについてはＣａｓ１３ａの方が良好であった（ｐ＜０．０１）（図４９Ｈ）。
実施例１２：ＬｗａＣａｓ１３ａノックダウンは標的転写物の接近可能部位で最適である
本出願人らは大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）においてＬｓｈＣａｓ１３ａ活性が標的の接近可能性に左右されることを見出したため（Ａｂｕｄａｙｙｅｈ，Ｏ．Ｏ．ｅｔ ａｌ．「Ｃ２ｃ２は単一成分プログラム可能ＲＮＡガイド下ＲＮＡターゲティングＣＲＩＳＰＲエフェクターである（Ｃ２ｃ２ ｉｓ ａ ｓｉｎｇｌｅ－ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ ＲＮＡ－ｇｕｉｄｅｄ ＲＮＡ－ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ＣＲＩＳＰＲ ｅｆｆｅｃｔｏｒ）」．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３５３，ａａｆ５５７３，ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．ａａｆ５５７３（２０１６））、本出願人らは、本発明者らのガイドタイリングスクリーンで標的となる４つの転写物に沿って接近可能性領域に位置するガイドについてＬｗａＣａｓ１３ａ活性が増加するかどうかを調べることにした。本出願人らは初めに、最も有効なガイドが定義付けられた領域にクラスターを形成するように見えることを見出し（図５８Ａ）、有効なガイド間のペアワイズ距離を帰無分布と比較することにより、本出願人らは、４つの転写物全てに関してガイドが偶然から予想され得るよりも有意に互いの近くにあることを観察した（図５８Ａ）。これらの初期クラスタリング結果は、より良好なＬｗａＣａｓ１３ａ切断活性のため接近可能性領域をエンリッチし得ることを示唆している。
転写物の接近可能性がＬｗａＣａｓ１３ａ活性に影響を与えたことを確認するため、本出願人らは、転写物の各々にわたって全ての標的領域の接近可能性を計算的に予測し、これらの計算的予測がノックダウン効率と部分的に相関することを見出した（図５８Ｂ～図５８Ｄ）。４つの標的転写物で、予測される標的の接近可能性がターゲティング有効性の変動の一部（ノックダウンで４．４％～１６％の変動）を説明できたことから、接近可能性はノックダウン効率の決定要因であるが、塩基同一性、配列特性及びＲＮＡへのタンパク質結合などの他の要因もまたターゲティング有効性において重要な役割を果たし得ることが指摘される。将来のより広範なスクリーニングによってこれらの機構のより明確な解明が可能になるものと思われる。
実施例１３：内因性転写物に対するＬｗａＣａｓ１３ａノックダウン及びＲＮＡｉの比較
ＲＮＡｉと比べたＬｗＣａｓ１３ノックダウンの効率を更に理解するため、本出願人らは、様々なガイドを同じ標的領域に対応するｓｈＲＮＡ構築物と比較した。本出願人らは初めに、内因性タイリングスクリーンの各々（ＫＲＡＳ及びＰＰＩＢ）から上位３つのガイドを選択し、ほぼ全てのガイドについてｓｈＲＮＡと同等のノックダウンの、ロバストなノックダウンをＣａｓ１３ａで観察した（図４９Ｃ）。ｓｈＲＮＡと更に比較するため、本出願人らはまた、ＫＲＡＳ、ＰＰＩＢ、及びＣＸＣＲ４についてＲＮＡｘｓアルゴリズムによって予測される接近可能性領域におけるＣａｓ１３ａ ｃｒＲＮＡも設計し、ｓｈＲＮＡと同等のノックダウンレベルを見出した（図４８Ｄ）。
実施例１４：ＭＡＬＡＴ１ ＩｎｃＲＮＡのＬｗａＣａｓ１３ａノックダウンスクリーニング
ＬｗａＣａｓ１３ａは細胞局在に関してエンジニアリングすることができるため、細胞のどの区画をＲＮＡノックダウンの標的にし得るかについて汎用性がある。本出願人らは、ｌｎｃＲＮＡ ＭＡＬＡＴ１転写物（これは核局在する）の全体にわたって均等にタイリングした９３個のガイドを設計し、それらのガイドを核局在ＬｗａＣａｓ１３ａと共にトランスフェクトした。本出願人らは様々なレベルのノックダウンを見出し、１つの実験ではノックダウンは約４０％～５０％にまで上った（図４９Ｅ）。検出可能なノックダウンを示さない位置対応ｓｈＲＮＡと比較して（ｐ＞０．０５）、Ｃａｓ１３ａは有意に高いレベルのノックダウン（３９．０～６６．５％、ｐ＜０．０５）を実現した（図４９Ｊ）。本出願人らはまた、ｌｎｃＲＮＡ ＸＩＳＴ転写物もタイリングし、全てのガイドで平均２２．０％及び最高８３．９％のノックダウンを見出した（図５６Ｆ）。
実施例１５：内因性転写物の多重ノックダウン
Ｃｐｆ１など、ＣＲＩＳＰＲアレイプロセシング活性を有する他のＣＲＩＳＰＲエフェクターは、１つのプロモーター下で多数のガイドを発現させることにより多重遺伝子編集に利用されている（Ｚｅｔｓｃｈｅ，Ｂ．ｅｔ ａｌ．「単一のガイドアレイを使用したＣＲＩＳＰＲ－Ｃｐｆ１による多重遺伝子編集（Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ｇｅｎｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｂｙ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃｐｆ１ ｕｓｉｎｇ ａ ｓｉｎｇｌｅ ｇｕｉｄｅ ａｒｒａｙ）」．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３５，３１－３４，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．３７３７（２０１７））。ＬｗａＣａｓ１３ａはそれ自身のアレイをプロセシングすることができるため、本出願人らは、単一のプロモーター下で発現するＣＲＩＳＰＲアレイとしてのＬｗａＣａｓ１３ａガイドの多重送達を試験することにした。本出願人らは、内因性ＰＰＩＢ、ＣＸＣＲ４、ＫＲＡＳ、ＴＩＮＣＲ、及びＰＣＡＴ転写物に対する５つの異なるガイドを設計し、Ｕ６プロモーターの発現下に、プロセシングされていないＤＲ及びトランケート型スペーサーに相当する、２８ｎｔガイドとそれに隣接する３６ｎｔダイレクトリピート（ＤＲ）を有するＣＲＩＳＰＲアレイとしてターゲティングシステムを送達した。この手法で、本出願人らは、各遺伝子のノックダウンレベルが単一の又はプール化したガイド対照と同等であったことを見出した（図４９Ｆ）。
オフターゲットＬｗａＣａｓ１３ａ活性が、ＣＲＩＳＰＲアレイによって標的化される５つの転写物の非特異的ノックダウンを引き起こしているのではないかという懸念があったため、本出願人らは、ＰＰＩＢ、ＣＸＣＲ４、及びＫＲＡＳに対する３つのガイド並びに３つのガイドのうちの各１つをノンターゲティングガイドに置き換えた３つの変異体の多重送達を含む実験を設計した。本出願人らは、アレイにガイドが存在しない場合のいずれにおいても、欠損したガイドによって標的化される転写物の有意なノックダウンはなく、標的化された転写物のみがＬｗａＣａｓ１３ａによってノックダウンされたことを見出し、ノックダウンが転写物の非特異的分解に起因するのでなく、実際にはＬｗａＣａｓ１３ａによる特異的多重ノックダウンに起因することが実証された（図４９Ｇ）。
実施例１６：ＬｗａＣａｓ１３ａノックダウンはミスマッチに感受性がある
特異性は核酸ターゲティングツールの主要な関心事であり、ＲＮＡｉ及びＣａｓ９ ＤＮＡターゲティング系の両方の特異性（Ｍａｌｉ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．「標的特異性スクリーニングのためのＣＡＳ９転写アクチベーター及び協同的ゲノムエンジニアリングのためのペアニッカーゼ（ＣＡＳ９ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ａｃｔｉｖａｔｏｒｓ ｆｏｒ ｔａｒｇｅｔ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ａｎｄ ｐａｉｒｅｄ ｎｉｃｋａｓｅｓ ｆｏｒ ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ ｇｅｎｏｍｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）」．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３１，８３３－８３８，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．２６７５（２０１３）；Ｆｕ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．「ヒト細胞におけるＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓヌクレアーゼの誘導による高頻度オフターゲット突然変異誘発（Ｈｉｇｈ－ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ ｏｆｆ－ｔａｒｇｅｔ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｃｅｌｌｓ）」．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３１，８２２－８２６，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．２６２３（２０１３）；Ｐａｔｔａｎａｙａｋ，Ｖ．ｅｔ ａｌ．「オフターゲットＤＮＡ切断のハイスループットプロファイリングは、ＲＮＡによってプログラムされるＣａｓ９ヌクレアーゼ特異性を明らかにする（Ｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｏｆ ｏｆｆ－ｔａｒｇｅｔ ＤＮＡ ｃｌｅａｖａｇｅ ｒｅｖｅａｌｓ ＲＮＡ－ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ Ｃａｓ９ ｎｕｃｌｅａｓｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ）」．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３１，８３９－８４３，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．２６７３（２０１３）；Ｈｓｕ，Ｐ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．「ＲＮＡガイド下Ｃａｓ９ヌクレアーゼのＤＮＡターゲティング特異性（ＤＮＡ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ ＲＮＡ－ｇｕｉｄｅｄ Ｃａｓ９ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ）」．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３１，８２７－８３２，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．２６４７（２０１３）；Ｄｏｅｎｃｈ，Ｊ．Ｇ．ｅｔ ａｌ．「ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９の活性を最大化し、且つオフターゲット効果を最小限に抑えるための最適化ｓｇＲＮＡ設計（Ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ｓｇＲＮＡ ｄｅｓｉｇｎ ｔｏ ｍａｘｉｍｉｚｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｍｉｎｉｍｉｚｅ ｏｆｆ－ｔａｒｇｅｔ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９）」．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３４，１８４－１９１，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．３４３７（２０１６））が広範に特徴付けられている。ＬｓｈＣａｓ１３ａの当初の特徴付けにより、それはインビトロで２つほどの少ないミスマッチに対しても感受性があり得ることが示されており（Ａｂｕｄａｙｙｅｈ，Ｏ．Ｏ．ｅｔ ａｌ．「Ｃ２ｃ２は単一成分プログラム可能ＲＮＡガイド下ＲＮＡターゲティングＣＲＩＳＰＲエフェクターである（Ｃ２ｃ２ ｉｓ ａ ｓｉｎｇｌｅ－ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ ＲＮＡ－ｇｕｉｄｅｄ ＲＮＡ－ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ＣＲＩＳＰＲ ｅｆｆｅｃｔｏｒ）」．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３５３，ａａｆ５５７３，ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．ａａｆ５５７３（２０１６））、及びコラテラル効果によるＬｗａＣａｓ１３ａの特異性プロファイリング（Ｇｏｏｔｅｎｂｅｒｇ，Ｊ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．「ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１３ａ／Ｃ２ｃ２による核酸検出（Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１３ａ／Ｃ２ｃ２）」．Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｉｎ ｐｒｅｓｓ（２０１７））から、ガイド：標的二重鎖のシード領域においてはシングルヌクレオチド分解能で、ダブルヌクレオチド分解能での識別を実現できたことを明らかにした。インビボでＣａｓ１３ａの特異性を調べるため、本出願人らは、Ｇｌｕｃ（図２９Ａ）又は内因性遺伝子ＣＸＣＲ４、ＫＲＡＳ、及びＰＰＩＢのいずれかを標的とするガイドにミスマッチを導入した（図２９Ｂ、図５９Ａ～図５９Ｂ）。本出願人らは、全ての転写物について、ガイド：標的二重鎖の中心領域がシングルミスマッチに対して最も感受性が高かったことを見出し、前出のインビトロでのＣａｓ１３ａ特異性の特徴付けと一致した（Ａｂｕｄａｙｙｅｈ，Ｏ．Ｏ．ｅｔ ａｌ．「Ｃ２ｃ２は単一成分プログラム可能ＲＮＡガイド下ＲＮＡターゲティングＣＲＩＳＰＲエフェクターである（Ｃ２ｃ２ ｉｓ ａ ｓｉｎｇｌｅ－ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ ＲＮＡ－ｇｕｉｄｅｄ ＲＮＡ－ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ＣＲＩＳＰＲ ｅｆｆｅｃｔｏｒ）」．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３５３，ａａｆ５５７３，ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．ａａｆ５５７３（２０１６））。シード領域でのノックダウンは低下したが、本出願人らは、Ｇｌｕｃなどの一部の標的に関してはシングルミスマッチが実質的なレベルの特異性には不十分であったことを見出した。Ｇｌｕｃに対するスペーサーについての連続したダブルミスマッチのタイリング（図２９Ａ）により、ダブルミスマッチが最大８倍の活性の低下をもたらしたことが明らかとなり、特異的インビボターゲティングツールとしてのＣａｓ１３ａの有望さが示された。本出願人らはまた、非連続ダブルミスマッチの効果についても調べ、ほとんどのダブルミスマッチが、ガイド配列の５’遠位端又は３’遠位端のいずれかに位置するダブルミスマッチを除き、ノックダウンを８０．４％から６０％未満に低下させたことを見出した（図５９Ｃ）。
インビトロで複数の特異性パラメータにわたってＣａｓ１３ａを更に特徴付けるため、本出願人らは直接的なＣａｓ１３ａ活性の代わりとしてコラテラル活性の検出を用いた（Ｇｏｏｔｅｎｂｅｒｇ，Ｊ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．「ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１３ａ／Ｃ２ｃ２による核酸検出（Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１３ａ／Ｃ２ｃ２）」．Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｉｎ ｐｒｅｓｓ（２０１７））。より短いスペーサー長さによって特異性が増加し得たことを示すＣａｓ９実験の結果を所与として（Ｆｕ，Ｙ．，Ｓａｎｄｅｒ，Ｊ．Ｄ．，Ｒｅｙｏｎ，Ｄ．，Ｃａｓｃｉｏ，Ｖ．Ｍ．＆ Ｊｏｕｎｇ，Ｊ．Ｋ．「トランケート型ガイドＲＮＡを用いたＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓヌクレアーゼ特異性の向上（Ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ｎｕｃｌｅａｓｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｕｓｉｎｇ ｔｒｕｎｃａｔｅｄ ｇｕｉｄｅ ＲＮＡｓ）」．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３２，２７９－２８４，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．２８０８（２０１４））、本出願人らは、シングルミスマッチだけ異なる２つの標的に対するＣａｓ１３ａ特異性にスペーサー長さが効果を及ぼすかという疑問を持った。本出願人らは、我々のインビボＬｗａＣａｓ１３ａ結果から予想されるとおり、より短いスペーサーでは活性が低下したが（図５９Ｄ）、より短いスペーサーはまた、一塩基ミスマッチの区別を改善したことを見出した（図５９Ｄ、図５９Ｅ）。本出願人らは次に、スペーサー配列に更なる合成ミスマッチを設計することにより特異性を向上させることができるかどうかを、この手法がＬｗａＣａｓ１３ａでインビトロでのシングルミスマッチの区別に用いられて成功していることに伴い調査した（Ｇｏｏｔｅｎｂｅｒｇ，Ｊ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．「ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１３ａ／Ｃ２ｃ２による核酸検出（Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１３ａ／Ｃ２ｃ２）」．Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｉｎ ｐｒｅｓｓ（２０１７））。本出願人らは、完全長スペーサー（図５９Ｆ、図５９Ｇ）と比較して、２３ｎｔ（図５９Ｈ、図５９Ｉ）又は２０ｎｔ（図５９Ｊ、図５９Ｋ）のいずれかにトランケートされたスペーサーは全体的な活性が低く、しかし特異性は実質的に増加したことを見出した。まとめると、ＬｗａＣａｓ１３ａのインビトロ及びインビボエンジニアリングは、特異的ノックダウンツールとしてのその使用に有望さを示す。一塩基特異性を付与するようにガイドをエンジニアリング可能であれば、ＬｗａＣａｓ１３ａによるアレル特異的転写物ノックダウンが促進されるはずである。
実施例１７：ＬｗａＣａｓ１３ａによる転写物ノックダウンは高度に特異的である
ＬｗａＣａｓ１３ａノックダウンのオフターゲット効果があるかどうかを包括的に理解するため、本出願人らはトランスクリプトームワイドｍＲＮＡシーケンシングを実施した。本出願人らはＬｗａＣａｓ１３ａ又は位置対応ｓｈＲＮＡ構築物でＧｌｕｃ転写物を標的化し、標的転写物の有意なノックダウンを見出した（図２９Ｂ－Ａ）。２つの内因性遺伝子ＫＲＡＳ及びＰＰＩＢに関する同じ比較について、同様の結果が見出された（図２９Ｂ－Ｂ、図２９Ｂ－Ｃ）。ｓｈＲＮＡ条件はＬｗａＣａｓ１３ａ条件と比べてトランスクリプトームワイドな変動が大きく、且つターゲティングとノンターゲティング対照との間の相関が弱かったことから、ｓｈＲＮＡターゲティング実験でオフターゲットがより多いことが示唆された。本出願人らは発現差異解析によって有意なオフターゲットの数を更に特徴付け、ｓｈＲＮＡ条件の各々ではオフターゲットが何百もあったが、ＬｗａＣａｓ１３ａ条件ではオフターゲットがゼロであったことを見出し（図３０Ａ）、これは標的転写物のノックダウンレベルが同等であったにも関わらずである（Ｇｌｕｃ、ＫＲＡＳ、及びＰＰＩＢについてそれぞれ、ｓｈＲＮＡで３０．５％、４３．５％、及び６４．７％、Ｃａｓ１３ａで６２．６％、２７．１％、及び２９．２％）（図３０Ｂ）。本出願人らはＧｌｕｃターゲティングＲＮＡ－ｓｅｑ比較の更なる分析を実施し、ｓｈＲＮＡ条件における主要な変動源が、個々のレプリケートにおけるターゲティング条件とノンターゲティング条件との違い（ケンドールのタウ平均値＝０．９１７）に起因したことを見出した（図６０Ｃ～図６０Ｅ）。同じ条件の個々のレプリケートを比較したとき、相関がはるかに高く、且つ変動が低かったことから（ケンドールのタウ平均値＝０．９４１）、観察される変動が所与のｓｈＲＮＡ構築物の一貫したオフターゲット効果によることが指摘される。３つの遺伝子について分析した全ＲＮＡ－ｓｅｑライブラリにこの分析を適用したとき、転写物の分布の広がりが狭いことに起因してガイド配列が異なるにも関わらず全てのＬｗａＣａｓ１３ａ条件が互いに高い相関を有する。対照的に、ｓｈＲＮＡ条件の各々について３回のレプリケートのセットは、各々の異なるｓｈＲＮＡ配列のオフターゲット変動の大きさに起因してｓｈＲＮＡ条件よりも高いセット内相関を有する（図６１Ａ、図６１Ｂ）。更に、３つの転写物にわたって各ガイド条件の標準偏差の分布を各ｓｈＲＮＡ条件と比較したとき、ｓｈＲＮＡ条件で有意に高い変動が観察される（ｐ＜１０－１９２、両側Ｋ－Ｓ検定）（図６１Ｃ）。
実施例１８：ＬｗａＣａｓ１３ａは哺乳類細胞において観察可能なコラテラル活性を示さない
Ｃａｓ１３ａのコラテラル活性はインビトロで生化学的に直接観察されており、及び細菌の成長抑制を通じて間接的に観察されている。多重一個抜き及びＲＮＡ－ｓｅｑ解析により、哺乳類細胞における非特異的ＲＮＡ分解、従ってコラテラル活性の欠如が示唆されたため、本出願人らは、ノックダウン実験においてコラテラル活性に起因した大域的オフターゲット発現の低下が起こるかどうかを確かめようと考えた。本出願人らはルシフェラーゼ及び内因性ノックダウン実験で遺伝子制御を解析することにより、標的転写物ノックダウンの結果として制御に変動があるかどうかを確かめた。当初のＧｌｕｃタイリング実験から、多くのガイドがＧｌｕｃの有意なノックダウンを示したが、Ｃｌｕｃレベルの変動はほとんどなかったことが明らかであった（図６２Ａ、図６２Ｂ）。本出願人らは次に、オンターゲットノックダウンとオンターゲット発現又はオンターゲットノックダウンとオフターゲット発現（ルシフェラーゼ対照又は内因性ターゲティングの場合にはＧＡＰＤＨ）の間の相関を分析することにした。本出願人らは、これらの４つの標的の各々について、オンターゲットノックダウンとオンターゲット発現との間に有意な正の相関があった一方（Ｇｌｕｃ：Ｒ＝０．８９、ｐ＜０．０００１；ＰＰＩＢ：Ｒ＝０．８１、ｐ＜０．０００１；ＫＲＡＳ：Ｒ＝０．５２、ｐ＜０．０００１）、オンターゲットノックダウンと対照遺伝子発現との間の相関ははるかに弱かった、又は全くなかった（Ｇｌｕｃ：Ｒ＝－０．０７８、ｐ＞０．０５；ＰＰＩＢ：Ｒ＝－０．０５８、ｐ＞０．０５；ＫＲＡＳ：Ｒ＝－０．５１、ｐ＜０．０００１）（図６１Ｃ～図６１Ｊ）ことを見出し、検出可能なオフターゲットノックダウンはなかったことが指摘される。
制御発現とノックダウンとの間にいかなる有意な相関もないため、哺乳類細胞においてＬｗａＣａｓ１３ａのコラテラル活性はほとんど又は全くないことが示唆される。本出願人らは、細菌でこれまでに観察されているとおり転写物ノックダウン時に細胞の成長制限が見られるかどうかを見ることによりこれを更に調べようと考えた（Ａｂｕｄａｙｙｅｈ，Ｏ．Ｏ．ｅｔ ａｌ．「Ｃ２ｃ２は単一成分プログラム可能ＲＮＡガイド下ＲＮＡターゲティングＣＲＩＳＰＲエフェクターである（Ｃ２ｃ２ ｉｓ ａ ｓｉｎｇｌｅ－ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ ＲＮＡ－ｇｕｉｄｅｄ ＲＮＡ－ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ＣＲＩＳＰＲ ｅｆｆｅｃｔｏｒ）」．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３５３，ａａｆ５５７３，ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．ａａｆ５５７３（２０１６））。本出願人らはＬｗａＣａｓ１３ａをＧｌｕｃに対する複数のガイドと共に選択有り及び無しで７２時間トランスフェクトし、次にノックダウンを計測した後、直ちにＧＦＰ蛍光によって細胞生存度及びＬｗａＣａｓ１３ａ発現を計測した。本出願人らは、５つ全てのＧｌｕｃターゲティングガイドについて有意なノックダウンレベルを観察したが（図３０Ｃ）、細胞成長又はＧＦＰ蛍光についてターゲティングガイドとノンターゲティングガイド対照との間に有意差はなかった（図３０Ｄ、図３０Ｅ）。
Ｃａｓ１３ａのコラテラル活性はインビトロで生化学的に直接観察されており、及び細菌の成長抑制を通じて間接的に観察されているが、哺乳類細胞におけるこの活性の程度は不明である。本出願人らは我々のＲＮＡシーケンシング実験において配列特異的オフターゲットＬｗａＣａｓ１３ａ活性を認めなかったとともに、標的転写物のＬｗａＣａｓ１３ａ媒介性ノックダウンは、同様のレベルのＬｗａＣａｓ１３ａを発現する哺乳類細胞の成長に影響を及ぼさなかった（図２９Ｇ）。加えて、検出可能な遺伝子発現の変化はなかったことから、ＬｗａＣａｓ１３ａターゲティングの存在がトランスクリプトームレベルでの観察可能な細胞ストレス応答につながらないことが指摘される（図２９Ａ、図６０Ａ、図６０Ｂ）（Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｎ，Ａ．ｅｔ ａｌ．「遺伝子セットエンリッチメント解析：ゲノムワイド発現プロファイルの解釈のための知識ベース手法（Ｇｅｎｅ ｓｅｔ ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ ａｎａｌｙｓｉｓ：ａ ｋｎｏｗｌｅｄｇｅ－ｂａｓｅｄ ａｐｐｒｏａｃｈ ｆｏｒ ｉｎｔｅｒｐｒｅｔｉｎｇ ｇｅｎｏｍｅ－ｗｉｄｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐｒｏｆｉｌｅｓ）」，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ １０２，１５５４５－１５５５０（２００５）。要約すれば、本出願人らは低レベルの均一なコラテラル活性切断が起こり得る可能性を排除することはできないが、本出願人らは以下の４つの観察で検出可能なコラテラル活性を認めない：１）我々のタイリング実験の全てにおいて、本出願人らは標的転写物ノックダウンとインライン対照遺伝子ノックダウンとの間に有意な相関を観察しなかった（図６２）、２）本出願人らは我々のＲＮＡ配列解析においてトランスクリプトームへの妨害が最小限であり、有意なオフターゲットがないことを認める（図２９Ａ）、３）一個抜き多重実験において、本出願人らは除外された遺伝子のノックダウンを認めない（図４９Ｌ）、及び４）本出願人らはＬｗａＣａｓ１３ａターゲティングに起因した細胞の成長又はストレスに対する表現型効果を認めない（図２９Ｇ）。
実施例１９：ｄＣａｓ１３ａは哺乳類細胞内の転写物にプログラム可能に結合する
プログラム可能なＲＮＡ結合タンパク質は広範囲にわたる適用の基礎となり得たため、本出願人らは、ＬｗａＣａｓ１３ａを触媒不活性変異体（ｄＣａｓ１３ａ）としてエンジニアリングし得るかどうかを調べた。先行研究では、触媒残基の突然変異によってＬｓｈＣａｓ１３ａを不活性化するとＲＮアーゼ活性が消失し、しかしＲＮＡ結合性は維持されることが実証されている（Ａｂｕｄａｙｙｅｈ，Ｏ．Ｏ．ｅｔ ａｌ．「Ｃ２ｃ２は単一成分プログラム可能ＲＮＡガイド下ＲＮＡターゲティングＣＲＩＳＰＲエフェクターである（Ｃ２ｃ２ ｉｓ ａ ｓｉｎｇｌｅ－ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ ＲＮＡ－ｇｕｉｄｅｄ ＲＮＡ－ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ＣＲＩＳＰＲ ｅｆｆｅｃｔｏｒ）」．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３５３，ａａｆ５５７３，ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．ａａｆ５５７３（２０１６））。本出願人らはＬｗａＣａｓ１３ａの触媒アルギニン残基を突然変異させてｄＣａｓ１３ａを作成し（図４４Ａ）、ｄＣａｓ１３ａをレポーターコード配列の上流の５’ＵＴＲにターゲティングすると、翻訳及びレポーター遺伝子発現が低下することを見出した（図６３Ａ）。ｄＣａｓ１３ａによってＲＮＡ結合を定量化するため、本出願人らは、３６ｎｔ ＤＲ及び２８ｎｔスペーサーを含むガイドを使用してＲＮＡ免疫沈降（ＲＩＰ）を実施し（図５８Ｂ）、ルシフェラーゼ転写物（図４４Ａ）又はＡＣＴＢ ｍＲＮＡ（図６３Ｂ）のいずれかを標的とするｄＣａｓ１３ａのプルダウンにより、ノンターゲティング対照と比べて対応する標的の有意なエンリッチメントがもたらされた（ルシフェラーゼについて７．８～１１．２倍のエンリッチメント及びＡＣＴＢについて２．１～３倍のエンリッチメント；ｐ＜０．０５）ことを見出し、再プログラム可能なＲＮＡ結合タンパク質としてのｄＣａｓ１３ａが検証された。
実施例２０：ｄＣａｓ１３ａによる転写物のネガティブフィードバックイメージング
インビボイメージング用にｄＣａｓ１３ａをエンジニアリングし、未結合のタンパク質によるバックグラウンドノイズを低減するため、本出願人らはジンクフィンガー自己ターゲティング及びＫＲＡＢドメイン抑制に基づくネガティブフィードバックシステムを取り入れた（Ｇｒｏｓｓ，Ｇ．Ｇ．ｅｔ ａｌ．「生きているニューロンの内因性シナプスタンパク質を可視化するための組換えプローブ（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｒｏｂｅｓ ｆｏｒ ｖｉｓｕａｌｉｚｉｎｇ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｓｙｎａｐｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ ｌｉｖｉｎｇ ｎｅｕｒｏｎｓ）」．Ｎｅｕｒｏｎ ７８，９７１－９８５，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｎｅｕｒｏｎ．２０１３．０４．０１７（２０１３））（図４４Ｂ）。ジンクフィンガー、ＫＲＡＢドメイン、及びＮＬＳをｄＣａｓ１３ａに融合すると、ネガティブフィードバック構築物（ｄＣａｓ１３ａ－ＮＦ）が得られた。ｄＣａｓ１３ａ－ＮＦは、その標的転写物に結合していないとき、核に局在して自らの発現を抑制する。転写物に結合すると、ｄＣａｓ１３ａ－ＮＦは細胞質に運ばれ、それにより発現が増加し、しかしながらまた、新たに翻訳されたｄＣａｓ１３ａ－ＮＦが細胞質に常在したまま留まる可能性もある。転写物結合の結果として中程度の細胞質移行（又は保持）を示したｄＣａｓ１３ａと比較して、ｄＣａｓ１３ａ－ＮＦはＡＣＴＢ ｍＲＮＡを標的としたとき有効に移行され又は再局在化した（図６３Ｅ）。ｄＣａｓ１３ａ－ＮＦの移行の程度を更に特徴付けるため、本出願人らはＡＣＴＢ転写物を２つのガイドで標的化し、ノンターゲティングガイドと比較して両方のガイドで移行が増加したことを見出した（３．１～３．７倍の細胞／核シグナル比；ｐ＜０．０００１）（図４４Ｃ、図１１Ｃ～図１１Ｅ）。移行の定量化から、ターゲティングガイドがノンターゲティングガイドと比べて細胞質に有意に多い蛍光画分をもたらしたことが示され、転写物イメージングツールとしてのｄＣａｓ１３ａ－ＮＦの有用性が示された。ｄＣａｓ１３ａ－ＮＦイメージングを更に検証するため、本出願人らは、ｄＣａｓ１３ａ－ＮＦシグナルとＡＣＴＢ ｍＲＮＡ蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）シグナルとの相関を分析し（図６４Ａ）、ノンターゲティングガイド条件に対するターゲティングガイドに有意な相関及びシグナルオーバーラップがあった（ガイド１及び２についてそれぞれＲ＝０．２７及び０．３０、及びノンターゲティングガイド条件についてＲ＝０．００；ｐ＜０．０００１ことを見出した（図６４Ｂ）。
実施例２１：生細胞におけるストレス顆粒のｄＣａｓ１３ａイメージング
酸化的ストレスは細胞質内のストレス顆粒へのポリアデニル化転写物及びタンパク質の凝集を生じさせ（Ｎｅｌｌｅｓ，Ｄ．Ａ．ｅｔ ａｌ．「ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９による生細胞でのプログラム可能ＲＮＡトラッキング（Ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ ＲＮＡ Ｔｒａｃｋｉｎｇ ｉｎ Ｌｉｖｅ Ｃｅｌｌｓ ｗｉｔｈ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９）」．Ｃｅｌｌ １６５，４８８－４９６，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｌ．２０１６．０２．０５４（２０１６）；Ｕｎｓｗｏｒｔｈ，Ｈ．，Ｒａｇｕｚ，Ｓ．，Ｅｄｗａｒｄｓ，Ｈ．Ｊ．，Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｃ．Ｆ．＆ Ｙａｇｕｅ，Ｅ．「ストレス顆粒への隔離からのｍＲＮＡエスケープは小胞体への局在によって左右される（ｍＲＮＡ ｅｓｃａｐｅ ｆｒｏｍ ｓｔｒｅｓｓ ｇｒａｎｕｌｅ ｓｅｑｕｅｓｔｒａｔｉｏｎ ｉｓ ｄｉｃｔａｔｅｄ ｂｙ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｔｏ ｔｈｅ ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ）」．ＦＡＳＥＢ Ｊ ２４，３３７０－３３８０，ｄｏｉ：１０．１０９６／ｆｊ．０９－１５１１４２（２０１０））、ストレス顆粒の発生は、癌、神経変性疾患、及びミオパチーを含めた多くの病変と関連付けられている（Ｗｙｓｓ－Ｃｏｒａｙ，Ｔ．「加齢、神経変性及び脳の若返り（Ａｇｅｉｎｇ，ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｂｒａｉｎ ｒｅｊｕｖｅｎａｔｉｏｎ）」．Ｎａｔｕｒｅ ５３９，１８０－１８６，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ２０４１１（２０１６）；Ｐｒｏｔｔｅｒ，Ｄ．Ｓ．＆ Ｐａｒｋｅｒ，Ｒ．「ストレス顆粒の原理及び特性（Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ Ｓｔｒｅｓｓ Ｇｒａｎｕｌｅｓ）」．Ｔｒｅｎｄｓ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ２６，６６８－６７９，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｔｃｂ．２０１６．０５．００４（２０１６））。本出願人らは、転写物のｄＣａｓ１３ａ－ＮＦイメージングを周知のストレス顆粒マーカー、Ｇ３ＢＰ１の可視化と組み合わせることによりストレス顆粒へのｍＲＮＡの蓄積を調べた（Ｔｏｕｒｒｉｅｒｅ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．「ＲａｓＧＡＰ関連エンドリボヌクレアーゼＧ３ＢＰはストレス顆粒をアセンブルする（Ｔｈｅ ＲａｓＧＡＰ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｅｎｄｏｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ Ｇ３ＢＰ ａｓｓｅｍｂｌｅｓ ｓｔｒｅｓｓ ｇｒａｎｕｌｅｓ）」．Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １６０，８２３－８３１，ｄｏｉ：１０．１０８３／ｊｃｂ．２００２１２１２８（２００３））（図４８Ａ）。固定試料においてｍＲＮＡトラッキングを確認するため、本出願人らは２つのＡＣＴＢターゲティングｃｒＲＮＡ又はガイドのいずれかをｄＣａｓ１３ａ－ＮＦとコトランスフェクトし、亜ヒ酸ナトリウムでストレス顆粒形成を誘導して、Ｇ３ＢＰ１を免疫蛍光法によって可視化した（図４８Ｂ）。予想どおりこのターゲティング条件についてｄＣａｓ１３ａ－ＮＦは細胞質へと移行し、又は細胞質に再局在化し、本出願人らは、ｄＣａｓ１３ａ－ＮＦシグナルとＧ３ＢＰ１蛍光との間にノンターゲティング対照と比較して有意な相関（ガイド１及びガイド２について、それぞれＲ＝０．４９及び０．５０、及びノンターゲティングガイドについて０．０８；ｐ＜０．００１）を見出したことから（図４８Ｃ、図４８Ｄ）、ｄＣａｓ１３ａ－ＮＦがストレス顆粒形成をトラッキング可能であることが示唆される。固定試料における共局在を所与として、本出願人らは次に生細胞でストレス顆粒トラッキングを実施した。本出願人らはＡＣＴＢターゲティングガイド及びノンターゲティングガイドをｄＣａｓ１３ａ－ＮＦとトランスフェクトし、トランスフェクション後２４時間で亜ヒ酸ナトリウムでストレス顆粒形成を誘導し、生細胞を経時的にイメージングした（図４８Ｅ）。ストレス顆粒マーカーとしてＧ３ＢＰ１－ＲＦＰ融合物を使用して、本出願人らは、ＡＣＴＢに標的化されたｄＣａｓ１３ａ－ＮＦが対応するノンターゲティング対照と比べて時間の経過に伴い細胞当たり有意により多くのストレス顆粒に局在した（ｐ＜０．０５）ことを見出した（図４８Ｆ）。
実施例２２：考察
クラス２ ＶＩ型ＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓエフェクターＣａｓ１３ａは哺乳類細胞の転写物をノックダウン又は結合するようにｃｒＲＮＡ又はガイドによって有効に再プログラムされることができる。本出願人らは、細菌におけるＲＮＡ切断に関して１５個のＣａｓ１３ａオルソログのうちＬｗａＣａｓ１３ａが最も高活性であると同定し、それを利用してＲＮＡｉと同等のレベルで哺乳類ＲＮＡをノックダウンした。本出願人らは、細菌スクリーニングを通じて検出可能なＰＦＳはなかったこと、及びガイド活性がＰＦＳの影響を受けなかったことを見出した。ＬｗａＣａｓ１３ａはインビボでスペーサー：標的二重鎖のミスマッチに感受性があり、この感受性がＲＮＡｉと比較して高いノックダウン特異性につながる。本出願人らはまた、タンパク質を更にエンジニアリング及び最適化可能であること、ガイドの多重送達、及び核ｌｎｃＲＮＡのノックダウンを含め、ＲＮＡノックダウンツールとしてのＬｗａＣａｓ１３ａのユニークな特質も示す。重要なことに、本出願人らによれば、インビトロで極めて活性が高い、且つ診断などの多くの適用に有用な特徴であるＬｗａＣａｓ１３ａのコラテラル活性は観察されない（Ｇｏｏｔｅｎｂｅｒｇ，Ｊ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．「ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１３ａ／Ｃ２ｃ２による核酸検出（Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１３ａ／Ｃ２ｃ２）」．Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｉｎ ｐｒｅｓｓ（２０１７））。更に、本出願人らは、ＬｗａＣａｓ１３ａを触媒不活性にすることができ、従ってそれをプログラム可能ＲＮＡ結合プラットフォームとして使用し得ることを示し、及び本出願人らは、生細胞のストレス顆粒における転写物蓄積のトラッキングへのその有用性を実証する。
重要なことに、本出願人らによれば、本出願人らがインビトロで観察した、且つ診断適用に利用される特徴である哺乳類細胞におけるＬｗａＣａｓ１３ａのコラテラル活性は観察されない（Ｇｏｏｔｅｎｂｅｒｇ，Ｊ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．「ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１３ａ／Ｃ２ｃ２による核酸検出（Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１３ａ／Ｃ２ｃ２）」，Ｓｃｉｅｎｃｅ，ｉｎ ｐｒｅｓｓ（２０１７）。コラテラル活性は、集団から感染細胞を取り除き、又は感染細胞に適応する時間を与えて感染に打ち勝ち、それによりＣａｓ１３ａのオンターゲットウイルス転写物切断活性を補助し得るものである天然細菌細胞のプログラム細胞死／休眠経路の一部であると仮定されている。哺乳類細胞におけるコラテラル活性の欠如は、天然の細胞のコンテクストにおけるその存在の可能性を除外するものではない。
Ｃａｓ１３ファミリーメンバーをベースとするＲＮＡターゲティングツールを精緻化及び多様化する機会は数多くある。Ｃａｓ１３ｂ（Ｓｍａｒｇｏｎ，Ａ．Ａ．ｅｔ ａｌ．「Ｃａｓ１３ｂは、アクセサリータンパク質Ｃｓｘ２７及びＣｓｘ２８によって差次的に調節されるＶＩ－Ｂ型ＣＲＩＳＰＲ関連ＲＮＡガイド下ＲＮアーゼである（Ｃａｓ１３ｂ Ｉｓ ａ Ｔｙｐｅ ＶＩ－Ｂ ＣＲＩＳＰＲ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ＲＮＡ－Ｇｕｉｄｅｄ ＲＮａｓｅ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ Ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｂｙ Ａｃｃｅｓｓｏｒｙ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ Ｃｓｘ２７ ａｎｄ Ｃｓｘ２８）」．Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ ６５，６１８－６３０ ｅ６１７，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｍｏｌｃｅｌ．２０１６．１２．０２３（２０１７）又はＣａｓ１３ｃ（Ｓｈｍａｋｏｖ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．「クラス２ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系の多様性及び進化（Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ａｎｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｃｌａｓｓ ２ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ｓｙｓｔｅｍｓ）」．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ １５，１６９－１８２，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｒｍｉｃｒｏ．２０１６．１８４（２０１７））などの更なるＣａｓ１３タンパク質をインビボで特徴付けることにより、切断能又は結合能の更なる向上がもたらされ、多色イメージングを含め、直交性のＲＮＡ結合タンパク質を必要とする適用が実現する。加えて、より小型のオルソログであれば、アデノ随伴ウイルスベクターなど、サイズが制限された送達の選択肢が可能となり得る（Ｒａｎ，Ｆ．Ａ．ｅｔ ａｌ．「黄色ブドウ球菌Ｃａｓ９を使用したインビボゲノム編集（Ｉｎ ｖｉｖｏ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｕｓｉｎｇ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ Ｃａｓ９）」．Ｎａｔｕｒｅ ５２０，１８６－１９１，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ１４２９９，ｎａｔｕｒｅ１４２９９ ［ｐｉｉ］（２０１５））。最後に、構造データの増加と併せたＣａｓ１３メンバーの多様性の探究により（Ｌｉｕ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．「２つの遠い触媒部位がＣ２ｃ２ＲＮアーゼ活性に関与する（Ｔｗｏ Ｄｉｓｔａｎｔ Ｃａｔａｌｙｔｉｃ Ｓｉｔｅｓ Ａｒｅ Ｒｅｓｐｏｎｓｉｂｌｅ ｆｏｒ Ｃ２ｃ２ ＲＮａｓｅ Ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ）」．Ｃｅｌｌ １６８，１２１－１３４ ｅ１１２，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｌ．２０１６．１２．０３１（２０１７））、バイオインフォマティクス（Ｚｉｎｎ，Ｅ．ｅｔ ａｌ．「ウイルス進化系統のインシリコ再構築は強力な遺伝子療法ベクターをもたらす（Ｉｎ Ｓｉｌｉｃｏ Ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｖｉｒａｌ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ Ｌｉｎｅａｇｅ Ｙｉｅｌｄｓ ａ Ｐｏｔｅｎｔ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｖｅｃｔｏｒ）」．Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ １２，１０５６－１０６８，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｒｅｐ．２０１５．０７．０１９（２０１５））又は構造（Ｋｌｅｉｎｓｔｉｖｅｒ，Ｂ．Ｐ．ｅｔ ａｌ．「検出可能なゲノムワイドオフターゲット効果のないハイフィデリティＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ヌクレアーゼ（Ｈｉｇｈ－ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ ｗｉｔｈ ｎｏ ｄｅｔｅｃｔａｂｌｅ ｇｅｎｏｍｅ－ｗｉｄｅ ｏｆｆ－ｔａｒｇｅｔ ｅｆｆｅｃｔｓ）」．Ｎａｔｕｒｅ ５２９，４９０－４９５，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ１６５２６（２０１６）；Ｓｌａｙｍａｋｅｒ，Ｉ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．「特異性が向上した合理的にエンジニアリングされたＣａｓ９ヌクレアーゼ（Ｒａｔｉｏｎａｌｌｙ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｃａｓ９ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ ｗｉｔｈ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ）」．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３５１，８４－８８，ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．ａａｄ５２２７（２０１６））のいずれかを指針とする合理的設計が可能となり得る。ＲＮＡ結合ツールの向上により、スプリットフルオロフォアの再構成によるイメージング（Ｏｚａｗａ，Ｔ．，Ｎａｔｏｒｉ，Ｙ．，Ｓａｔｏ，Ｍ．＆ Ｕｍｅｚａｗａ，Ｙ．「単一の生細胞における内因性ミトコンドリアＲＮＡのイメージングダイナミクス（Ｉｍａｇｉｎｇ ｄｙｎａｍｉｃｓ ｏｆ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ＲＮＡ ｉｎ ｓｉｎｇｌｅ ｌｉｖｉｎｇ ｃｅｌｌｓ）」．Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ ４，４１３－４１９，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｍｅｔｈ１０３０（２００７））、翻訳調節（Ｄｅ Ｇｒｅｇｏｒｉｏ，Ｅ．，Ｐｒｅｉｓｓ，Ｔ．＆ Ｈｅｎｔｚｅ，Ｍ．Ｗ．「インビボでｅＩＦ４Ｇコアドメインによってドライブされる翻訳（Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ｄｒｉｖｅｎ ｂｙ ａｎ ｅＩＦ４Ｇ ｃｏｒｅ ｄｏｍａｉｎ ｉｎ ｖｉｖｏ）」．ＥＭＢＯ Ｊ １８，４８６５－４８７４，ｄｏｉ：１０．１０９３／ｅｍｂｏｊ／１８．１７．４８６５（１９９９）；Ａｄａｍａｌａ，Ｋ．Ｐ．，Ｍａｒｔｉｎ－Ａｌａｒｃｏｎ，Ｄ．Ａ．＆ Ｂｏｙｄｅｎ，Ｅ．Ｓ．「単一モジュラー単位のリピートで構成されるプログラム可能ＲＮＡ結合タンパク質（Ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ ＲＮＡ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｍｐｏｓｅｄ ｏｆ ｒｅｐｅａｔｓ ｏｆ ａ ｓｉｎｇｌｅ ｍｏｄｕｌａｒ ｕｎｉｔ）」．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １１３，Ｅ２５７９－２５８８，ｄｏｉ：１０．１０７３／ｐｎａｓ．１５１９３６８１１３（２０１６）；Ｃａｍｐｂｅｌｌ，Ｚ．Ｔ．，Ｖａｌｌｅｙ，Ｃ．Ｔ．＆ Ｗｉｃｋｅｎｓ，Ｍ．「タンパク質－ＲＮＡ特異性コードが内因性ヒト転写物の標的活性化を可能にする（Ａ ｐｒｏｔｅｉｎ－ＲＮＡ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｃｏｄｅ ｅｎａｂｌｅｓ ｔａｒｇｅｔｅｄ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｈｕｍａｎ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ）」．Ｎａｔ Ｓｔｒｕｃｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２１，７３２－７３８，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｓｍｂ．２８４７（２０１４）；Ｃａｏ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．「哺乳類細胞における標的ｍＲＮＡ翻訳の光誘導性活性化（Ｌｉｇｈｔ－ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｔａｒｇｅｔ ｍＲＮＡ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ）」．Ｃｈｅｍ Ｃｏｍｍｕｎ（Ｃａｍｂ）４９，８３３８－８３４０，ｄｏｉ：１０．１０３９／ｃ３ｃｃ４４８６６ｅ（２０１３）；Ｃｏｏｋｅ，Ａ．，Ｐｒｉｇｇｅ，Ａ．，Ｏｐｐｅｒｍａｎ，Ｌ．＆ Ｗｉｃｋｅｎｓ，Ｍ．「ＰＵＦタンパク質ファミリー足場を使用したターゲット翻訳調節（Ｔａｒｇｅｔｅｄ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ＰＵＦ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆａｍｉｌｙ ｓｃａｆｆｏｌｄ）」．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １０８，１５８７０－１５８７５，ｄｏｉ：１０．１０７３／ｐｎａｓ．１１０５１５１１０８（２０１１））、ＲＮＡベースの編集（Ｎｉｓｈｉｋｕｒａ，Ｋ．「ＡＤＡＲによるコード及び非コードＲＮＡのＡ－ｔｏ－Ｉ編集（Ａ－ｔｏ－Ｉ ｅｄｉｔｉｎｇ ｏｆ ｃｏｄｉｎｇ ａｎｄ ｎｏｎ－ｃｏｄｉｎｇ ＲＮＡｓ ｂｙ ＡＤＡＲｓ）」．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １７，８３－９６，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｒｍ．２０１５．４（２０１６）；Ｗｅｄｅｋｉｎｄ，Ｊ．Ｅ．，Ｄａｎｃｅ，Ｇ．Ｓ．，Ｓｏｗｄｅｎ，Ｍ．Ｐ．＆ Ｓｍｉｔｈ，Ｈ．Ｃ．「哺乳類におけるメッセンジャーＲＮＡ編集：ファミリービジネスにおける役割を探すＡＰＯＢＥＣファミリーの新規メンバー（Ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ ＲＮＡ ｅｄｉｔｉｎｇ ｉｎ ｍａｍｍａｌｓ：ｎｅｗ ｍｅｍｂｅｒｓ ｏｆ ｔｈｅ ＡＰＯＢＥＣ ｆａｍｉｌｙ ｓｅｅｋｉｎｇ ｒｏｌｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｆａｍｉｌｙ ｂｕｓｉｎｅｓｓ）」．Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ １９，２０７－２１６，ｄｏｉ：１０．１０１６／Ｓ０１６８－９５２５（０３）０００５４－４（２００３））、エピトランスクリプトーム的摂動（Ｈａｒｃｏｕｒｔ，Ｅ．Ｍ．，Ｋｉｅｔｒｙｓ，Ａ．Ｍ．＆ Ｋｏｏｌ，Ｅ．Ｔ．「メッセンジャーＲＮＡにおける塩基修飾の化学的及び構造的効果（Ｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｂａｓｅ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ ＲＮＡ）」．Ｎａｔｕｒｅ ５４１，３３９－３４６，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ２１３５１（２０１７））、ＲＮＡ発現レベルに基づく標的化したアポトーシス誘導（Ｒｉｄｅｒ，Ｔ．Ｈ．ｅｔ ａｌ．「広域抗ウイルス療法薬（Ｂｒｏａｄ－ｓｐｅｃｔｒｕｍ ａｎｔｉｖｉｒａｌ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）」．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ６，ｅ２２５７２，ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００２２５７２（２０１１））、又はスプライシング調節（Ｗａｎｇ，Ｙ．，Ｃｈｅｏｎｇ，Ｃ．Ｇ．，Ｈａｌｌ，Ｔ．Ｍ．＆ Ｗａｎｇ，Ｚ．「設計された特異性を有するスプライシング因子のエンジニアリング（Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｓｐｌｉｃｉｎｇ ｆａｃｔｏｒｓ ｗｉｔｈ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｉｅｓ）」．Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ ６，８２５－８３０，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｍｅｔｈ．１３７９（２００９））を含め、更なる機能化が可能になることになる。
Ｃａｓ１３ａによるＲＮＡノックダウンは、ゲノムワイドプール化ノックダウンスクリーニング、ｌｎｃＲＮＡ及び新生転写物機能の研究、アレル特異的ノックダウン、及びＲＮＡウイルス療法薬を含め、複数の生物学的コンテクストにおいてＲＮＡの摂動に適用することができる。加えて、ｄＣａｓ１３ａ及び誘導体は、特異的細胞集団の研究又は癌性細胞の死滅に有用となるであろう、ＲＮＡ－タンパク質相互作用を調べるためのＲＮＡプルダウン、生細胞における転写物のトラッキング、及びＲＮＡレベルに基づく細胞の標的破壊を可能にする。本出願人らは、Ｃａｓ１３が哺乳類細胞及び植物細胞におけるＲＮＡのプログラム可能なノックダウン及び結合の両方のロバストなプラットフォームであることを示しており、このプラットフォームは他の真核生物に拡張し得る。創造的エンジニアリング手法と組み合わせたＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１３は核酸ベースの診断法及び治療法の強力なプラットフォームとなるであろうとともに、トランスクリプトームの研究に革命を導き得る。
実施例２３：アポトーシスのスプリット設計
多くの場合に、特定の細胞型の役割を研究する基礎生物学適用についても、又は癌若しくは老化細胞クリアランスなどの治療適用についても、転写シグネチャ又は特異的遺伝子発現に基づいて細胞を枯渇又は死滅させることが望ましい（Ｂａｋｅｒ，Ｄ．Ｊ．，Ｃｈｉｌｄｓ，Ｂ．Ｇ．，Ｄｕｒｉｋ，Ｍ．，Ｗｉｊｅｒｓ，Ｍ．Ｅ．，Ｓｉｅｂｅｎ，Ｃ．Ｊ．，Ｚｈｏｎｇ，Ｊ．，Ｓａｌｔｎｅｓｓ，Ｒ．Ａ．，Ｊｅｇａｎａｔｈａｎ，Ｋ．Ｂ．，Ｖｅｒｚｏｓａ，Ｇ．Ｃ．，Ｐｅｚｅｓｈｋｉ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．（２０１６）．「天然に存在するｐ１６（Ｉｎｋ４ａ）陽性細胞は健康寿命を短縮する（Ｎａｔｕｒａｌｌｙ ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ ｐ１６（Ｉｎｋ４ａ）－ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｅｌｌｓ ｓｈｏｒｔｅｎ ｈｅａｌｔｈｙ ｌｉｆｅｓｐａｎ）」．Ｎａｔｕｒｅ ５３０，１８４－１８９．）。この標的化した細胞死滅は、スプリットアポトーシスドメインをＣａｓ１３タンパク質に融合して実現することができ、これが転写物への結合時に再構成されて、標的遺伝子又は遺伝子のセットを特異的に発現する細胞の死滅につながる。特定の実施形態において、アポトーシスドメインはスプリットカスパーゼ３であってもよい（Ｃｈｅｌｕｒ，Ｄ．Ｓ．，ａｎｄ Ｃｈａｌｆｉｅ，Ｍ．（２００７）．「再構成されたカスパーゼによる標的化した細胞死（Ｔａｒｇｅｔｅｄ ｃｅｌｌ ｋｉｌｌｉｎｇ ｂｙ ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｅｄ ｃａｓｐａｓｅｓ）」．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０４，２２８３－２２８８．）。他の可能性は、２つのカスパーゼ８（Ｐａｊｖａｎｉ，Ｕ．Ｂ．，Ｔｒｕｊｉｌｌｏ，Ｍ．Ｅ．，Ｃｏｍｂｓ，Ｔ．Ｐ．，Ｉｙｅｎｇａｒ，Ｐ．，Ｊｅｌｉｃｋｓ，Ｌ．，Ｒｏｔｈ，Ｋ．Ａ．，Ｋｉｔｓｉｓ，Ｒ．Ｎ．，ａｎｄ Ｓｃｈｅｒｅｒ，Ｐ．Ｅ．（２００５）．「カスパーゼ８の標的活性化による脂肪アポトーシス：誘導性且つ可逆的脂肪組織萎縮症の新規マウスモデル（Ｆａｔ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｔｈｒｏｕｇｈ ｔａｒｇｅｔｅｄ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｃａｓｐａｓｅ ８：ａ ｎｅｗ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ａｎｄ ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ ｌｉｐｏａｔｒｏｐｈｙ）」．Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１１，７９７－８０３）又はカスパーゼ９（Ｓｔｒａａｔｈｏｆ，Ｋ．Ｃ．，Ｐｕｌｅ，Ｍ．Ａ．，Ｙｏｔｎｄａ，Ｐ．，Ｄｏｔｔｉ，Ｇ．，Ｖａｎｉｎ，Ｅ．Ｆ．，Ｂｒｅｎｎｅｒ，Ｍ．Ｋ．，Ｈｅｓｌｏｐ，Ｈ．Ｅ．，Ｓｐｅｎｃｅｒ，Ｄ．Ｍ．，ａｎｄ Ｒｏｏｎｅｙ，Ｃ．Ｍ．（２００５）．「Ｔ細胞療法のための誘導性カスパーゼ９安全スイッチ（Ａｎ ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｃａｓｐａｓｅ ９ ｓａｆｅｔｙ ｓｗｉｔｃｈ ｆｏｒ Ｔ－ｃｅｌｌ ｔｈｅｒａｐｙ）」．Ｂｌｏｏｄ １０５，４２４７－４２５４．）エフェクターをＣａｓ１３結合によって近接させるなど、カスパーゼのアセンブリである。また、スプリットＴＥＶ（Ｇｒａｙ，Ｄ．Ｃ．，Ｍａｈｒｕｓ，Ｓ．，ａｎｄ Ｗｅｌｌｓ，Ｊ．Ａ．（２０１０）．「エンジニアリングされた小分子活性化プロテアーゼによる特異的アポトーシスカスパーゼの活性化（Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｐｏｐｔｏｔｉｃ ｃａｓｐａｓｅｓ ｗｉｔｈ ａｎ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｓｍａｌｌ－ｍｏｌｅｃｕｌｅ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅａｓｅ）」．Ｃｅｌｌ １４２，６３７－６４６．）をＣａｓ１３結合によって転写物に再構成することも可能である。このスプリットＴＥＶは、発光及び蛍光リードアウトを含め、様々なリードアウトに使用することができる（Ｗｅｈｒ，Ｍ．Ｃ．，Ｌａａｇｅ，Ｒ．，Ｂｏｌｚ，Ｕ．，Ｆｉｓｃｈｅｒ，Ｔ．Ｍ．，Ｇｒｕｅｎｅｗａｌｄ，Ｓ．，Ｓｃｈｅｅｋ，Ｓ．，Ｂａｃｈ，Ａ．，Ｎａｖｅ，Ｋ．－Ａ．，ａｎｄ Ｒｏｓｓｎｅｒ，Ｍ．Ｊ．（２００６）．「スプリットＴＥＶを使用した調節性タンパク質間相互作用のモニタリング（Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ－ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｕｓｉｎｇ ｓｐｌｉｔ ＴＥＶ）」．Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ３，９８５－９９３）。一実施形態には、このスプリットＴＥＶの再構成による改変プロカスパーゼ３又はプロカスパーゼ７の切断（Ｇｒａｙ，Ｄ．Ｃ．，Ｍａｈｒｕｓ，Ｓ．，ａｎｄ Ｗｅｌｌｓ，Ｊ．Ａ．（２０１０）．「エンジニアリングされた小分子活性化プロテアーゼによる特異的アポトーシスカスパーゼの活性化（Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｐｏｐｔｏｔｉｃ ｃａｓｐａｓｅｓ ｗｉｔｈ ａｎ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｓｍａｌｌ－ｍｏｌｅｃｕｌｅ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅａｓｅ）」．Ｃｅｌｌ １４２，６３７－６４６．）により細胞死がもたらされることが関わる。
実施例２４：イメージングのためのスプリット設計
本願で言及されるが、２つのＣａｓ１３タンパク質が転写物に結合するとスプリットフルオロフォアが再構成されることによりバックグラウンドが低下したイメージングとなるように、更なるスプリットフルオロフォア構築物を設計した。これらのスプリットタンパク質には、ｉＳｐｌｉｔ（Ｆｉｌｏｎｏｖ，Ｇ．Ｓ．，ａｎｄ Ｖｅｒｋｈｕｓｈａ，Ｖ．Ｖ．（２０１３）．「タンパク質間相互作用のインビボイメージング用の近赤外ＢｉＦＣレポーター（Ａ ｎｅａｒ－ｉｎｆｒａｒｅｄ ＢｉＦＣ ｒｅｐｏｒｔｅｒ ｆｏｒ ｉｎ ｖｉｖｏ ｉｍａｇｉｎｇ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ－ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ）」．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２０，１０７８－１０８６．）、Ｓｐｌｉｔ Ｖｅｎｕｓ（Ｗｕ，Ｂ．，Ｃｈｅｎ，Ｊ．，ａｎｄ Ｓｉｎｇｅｒ，Ｒ．Ｈ．（２０１４）．「スプリット蛍光タンパク質を使用した生細胞におけるシングルｍＲＮＡのバックグラウンドフリーイメージング（Ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ ｆｒｅｅ ｉｍａｇｉｎｇ ｏｆ ｓｉｎｇｌｅ ｍＲＮＡｓ ｉｎ ｌｉｖｅ ｃｅｌｌｓ ｕｓｉｎｇ ｓｐｌｉｔ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎｓ）」．Ｓｃｉ．Ｒｅｐ．４，３６１５．）、及びスプリットスーパーポジティブＧＦＰ（Ｂｌａｋｅｌｅｙ，Ｂ．Ｄ．，Ｃｈａｐｍａｎ，Ａ．Ｍ．，ａｎｄ ＭｃＮａｕｇｈｔｏｎ，Ｂ．Ｒ．（２０１２）．「スプリットスーパーポジティブＧＦＰのリアセンブリは、インビボでタンパク質間相互作用を検出する高速で効率的且つロバストな方法である（Ｓｐｌｉｔ－ｓｕｐｅｒｐｏｓｉｔｉｖｅ ＧＦＰ ｒｅａｓｓｅｍｂｌｙ ｉｓ ａ ｆａｓｔ，ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ，ａｎｄ ｒｏｂｕｓｔ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ－ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｉｎ ｖｉｖｏ）」．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｓｙｓｔ．８，２０３６－２０４０．）が含まれる。
実施例２５：更なる転写活性のためのスプリット設計、ルシフェラーゼ
Ｃａｓ１３タンパク質によって構成され得る更なる可能なスプリット融合物としては、発光イメージング用のルシフェラーゼ（Ｋｉｍ，Ｓ．Ｂ．，Ｏｚａｗａ，Ｔ．，Ｗａｔａｎａｂｅ，Ｓ．，ａｎｄ Ｕｍｅｚａｗａ，Ｙ．（２００４）．「スプリットウミシイタケルシフェラーゼの再構成を用いることによるタンパク質核輸送のハイスループットセンシング及び非侵襲性イメージング（Ｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｓｅｎｓｉｎｇ ａｎｄ ｎｏｎｉｎｖａｓｉｖｅ ｉｍａｇｉｎｇ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｎｕｃｌｅａｒ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ ｂｙ ｕｓｉｎｇ ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ ｏｆ ｓｐｌｉｔ Ｒｅｎｉｌｌａ ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）」．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０１，１１５４２－１１５４７．）又はＲＮＡセンシングに基づく方法で遺伝回路の遺伝子の発現をドライブするためのスプリット転写因子を挙げることができるであろう。可能なスプリット転写因子としては、スプリットユビキチン－ＬｅｘＡシステム（Ｐｅｔｓｃｈｎｉｇｇ，Ｊ．，Ｇｒｏｉｓｍａｎ，Ｂ．，Ｋｏｔｌｙａｒ，Ｍ．，Ｔａｉｐａｌｅ，Ｍ．，Ｚｈｅｎｇ，Ｙ．，Ｋｕｒａｔ，Ｃ．Ｆ．，Ｓａｙａｄ，Ａ．，Ｓｉｅｒｒａ，Ｊ．Ｒ．，Ｍａｔｔｉａｚｚｉ Ｕｓａｊ，Ｍ．，Ｓｎｉｄｅｒ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．（２０１４）．「ヒト細胞における膜－タンパク質相互作用をプローブするための哺乳類膜ツーハイブリッドアッセイ（ＭａＭＴＨ）（Ｔｈｅ ｍａｍｍａｌｉａｎ－ｍｅｍｂｒａｎｅ ｔｗｏ－ｈｙｂｒｉｄ ａｓｓａｙ（ＭａＭＴＨ）ｆｏｒ ｐｒｏｂｉｎｇ ｍｅｍｂｒａｎｅ－ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｃｅｌｌｓ）」．Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １１，５８５－５９２．）など、スプリットユビキチン（ｕｂｑｕｉｔｉｎ）ベースのシステムが挙げられる。
実施例２６：Ｃ２ｃ２オルソログの同定
以下のＣ２ｃ２オルソログは哺乳類細胞での発現にコドン最適化し得る。
Figure 2023134453000021
以下の表に、上記の種のタンパク質配列を挙げる。
Figure 2023134453000022
Figure 2023134453000023
Figure 2023134453000024
Figure 2023134453000025
Figure 2023134453000026
Figure 2023134453000027
Figure 2023134453000028
Figure 2023134453000029
Figure 2023134453000030
実施例２７：Ｃ２ｃ２オルソログの同定
特定のＣａｓ１３ｂオルソログは、意外にもＣ２ｃ２と同様である。図５４はＣ２ｃ２及びＣａｓ１３ｂタンパク質のツリーアラインメントを提供する。以下のＣａｓ１３ｂタンパク質は哺乳類細胞での発現にコドン最適化し得る。
Figure 2023134453000031
Figure 2023134453000032
Figure 2023134453000033
Figure 2023134453000034
Figure 2023134453000035
Figure 2023134453000036
Figure 2023134453000037
Figure 2023134453000038
Figure 2023134453000039
Figure 2023134453000040
Figure 2023134453000041
Figure 2023134453000042
Figure 2023134453000043
Figure 2023134453000044
Figure 2023134453000045
Figure 2023134453000046
Figure 2023134453000047
Figure 2023134453000048
Figure 2023134453000049
Figure 2023134453000050
Figure 2023134453000051
Figure 2023134453000052
Figure 2023134453000053
Figure 2023134453000054
Figure 2023134453000055
Figure 2023134453000056
Figure 2023134453000057
Figure 2023134453000058
Figure 2023134453000059
Figure 2023134453000060
Figure 2023134453000061
Figure 2023134453000062
Figure 2023134453000063
Figure 2023134453000064
Figure 2023134453000065
Figure 2023134453000066
Figure 2023134453000067
Figure 2023134453000068
Figure 2023134453000069
Figure 2023134453000070
Figure 2023134453000071
Figure 2023134453000072
実施例２８：Ｃ２ｃ２オルソログの同定
Ｃ２ｃ２酵素の特性を向上させ、又はその他変化させるため、アミノ酸の改変を実施する。保存された荷電残基のサブセットとして、変更可能な残基を同定する。これらの残基は図５３のアラインメントで＞８０％の保存を有する。これらは非荷電残基（典型的にはアラニン）に変更することができる。指示される残基の１つ以上を突然変異させる。アミノ酸残基付番は図６６（一番上の列）に示すとおりのコンセンサス付番に対応し、以下に再掲する：
Figure 2023134453000073
ＭＵＳＣＬＥアラインメント（ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｍｓａ／ｍｕｓｃｌｅ／）を用いたコンセンサス配列に基づく突然変異残基。Ｌｓｈにおける対応する位置を示す。
Figure 2023134453000074
単独で、又は組み合わせで突然変異させた上記のアミノ酸残基のうちの任意の１つ以上を有するＣ２ｃ２タンパク質は、特異性及び／又は活性の変化及び／又は別のＰＡＭ認識を示す。
実施例２９：
Ｌｗ２及びＦＳＬのアラインメント（図６７）に基づき、以下の保存残基を同定した：
Figure 2023134453000075
Figure 2023134453000076
指示される残基のうちの１つ以上を突然変異させる。アミノ酸残基付番は図６７に示されるとおりの付番に対応する（２つのオルソロガスアラインメント配列間にある中央の列、同一の残基を示す）。
Ｃ２ｃ２タンパク質の活性、特異性、又は機能を改変するため、Ｌｅｗ２ Ｃ２ｃ２とＬｉｂ Ｃ２ｃ２との間で同一の、図６７に示す残基のうちの任意の１つ以上を突然変異させる。単独で、又は組み合わせで突然変異させた上記のアミノ酸残基のうちの任意の１つ以上を有するＣ２ｃ２タンパク質は、特異性及び／又は活性の変化及び／又は別のＰＡＭ認識を示す。
実施例３０：方法
活性スクリーン及び組換え発現のためのオルソログのクローニング
本発明者らはヒトコドン最適化バージョンの１５個のＣａｓ１３ａオルソログを合成し（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ、Ｊｉａｎｇｓｕ、中国）（補表９）、ｐＬａｃプロモーターによる発現下でそれらをｐＡＣＹＣ１８４にクローニングした。本発明者らは、Ｃａｓ１３ａ発現カセットの隣に、オルソログの対応するダイレクトリピートと、それに隣接するβ－ラクタマーゼターゲティングスペーサー又はノンターゲティングスペーサーのいずれかをクローニングした。スペーサーアレイ発現はＪ２３１１９プロモーターによってドライブした。
ＬｗａＣａｓ１３ａを精製するため、本発明者らは哺乳類コドン最適化ＬｗａＣａｓ１３ａ配列をタンパク質精製用の細菌性（ｂａｔｅｒｉａｌ）発現ベクター（６×Ｈｉｓ／Ｔｗｉｎ Ｓｔｒｅｐ ＳＵＭＯ、テキサス大学オースティン校のＩｌｙａ Ｆｉｎｋｅｌｓｔｅｉｎから供与いただいたｐＥＴベースの発現ベクター）にクローニングした。
この試験に使用した全てのプラスミドを補表１に挙げる。
Ｃａｓ１３ａ活性及びＰＦＳ同一性に関する細菌インビボ試験
スクリーンは以下のとおり機能する。簡潔に言えば、ランダム化したＰＦＳヌクレオチドが隣接するβ－ラクタマーゼ転写物の配列の５’ストレッチを標的とするようにＣａｓ１３ａをプログラムする。Ｃａｓ１３ａ切断活性により、アンピシリン選択下では細菌が死滅し、続いて次世代シーケンシングによってＰＦＳ枯渇を分析する。オルソログ間での定量的比較を可能にするため、本発明者らはｐＪ２３１１９小型ＲＮＡプロモーターの発現下の隣接するシングルスペーサーＣＲＩＳＰＲアレイと共にｐＬａｃプロモーター下の各Ｃａｓ１３ａオルソログをクローニングした。
Ｃａｓ１３ａオルソログの活性を試験するため、９０ｎｇのオルソログ発現プラスミドをターゲティングガイド又はノンターゲティングガイドのいずれかと共に２５ｎｇの以前に記載されたβ－ラクタマーゼ標的プラスミド５８とＮｏｖａＢｌｕｅ Ｓｉｎｇｌｅｓコンピテント細胞（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）にコトランスフェクトした。形質転換後、細胞を希釈し、１００μｇ／ｕＬアンピシリン及び２５μｇ／ｕＬクロラムフェニコールを補足したＬＢ寒天にプレーティングし、３７℃で一晩インキュベートした。翌日、形質転換体をカウントした。
ＬｓｈＣａｓ１３ａ及びＬｗａＣａｓ１３ａ ＰＦＳの同一性を決定するため、４０ｎｇのオルソログ発現プラスミドをターゲティングスペーサー又はノンターゲティングスペーサーのいずれかと共に２５ｎｇのβ－ラクタマーゼ標的プラスミドとバイオロジカルレプリケート当たり２アリコートのＮｏｖａＢｌｕｅ ＧｉｇａＳｉｎｇｌｅｓ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）にコトランスフェクトした。２回のバイオロジカルレプリケートを実施した。形質転換後、細胞をバイオロジカルレプリケート当たり５００ｕＬのＳＯＣ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中３７℃で１時間回復させて、１００μｇ／ｕＬアンピシリン及び２５μｇ／ｕＬクロラムフェニコールを補足したＬＢ寒天（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）が入ったバイオアッセイプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）にプレーティングし、３７℃で１６時間インキュベートした。次にコロニーを掻き取ることにより回収し、続くシーケンシングのためＮｕｃｅｌｏＢｏｎｄ Ｘｔｒａ ＥＦ（Ｍａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ）でプラスミドＤＮＡを精製した。
回収したプラスミド試料は、ＮＥＢＮｅｘｔ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ２Ｘ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用したバーコード付加プライマー及びＩｌｌｕｍｉｎａフローセルハンドルによるＰＣＲによって次世代シーケンシング用に調製した。ＰＣＲ産物はプールし、Ｚｙｍｏｃｌｅａｎゲル抽出キット（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用してゲル抽出し、ＭｉＳｅｑ次世代シーケンシング機（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を使用してシーケンシングした。
ＰＦＳのコンピュータ解析
ＬｓｈＣａｓ１３ａ及びＬｗａＣａｓ１３ａ ＰＦＳスクリーニングライブラリの次世代シーケンシングから、本発明者らはランダム化ＰＦＳ領域に隣接する配列をアラインメントし、ＰＦＳ同一性を抽出した。本発明者らはＰＦＳ同一性を４ヌクレオチドに縮小してシーケンスカバレッジを改善し、ユニークな各ＰＦＳの頻度をカウントし、ｐｓｅｕｄｏｃｏｕｎｔを１として各ライブラリの総リードカウントに対して正規化した。図１Ｅに示すとおりの各分布のエンリッチメントをｐＡＣＹＣ１８４対照（タンパク質／ガイド遺伝子座なし）に対して－ｌｏｇ２（ｆｃｏｎｄｉｔｉｏｎ／ｆｐＡＣＹＣ１８４）［式中、ｆｃｏｎｄｉｔｉｏｎは実験条件におけるＰＦＳ同一性の頻度であり、ｆｐＡＣＹＣ１８４はｐＡＣＹＣ１８４対照におけるＰＦＳ同一性の頻度である］として計算した。保存されたＰＦＳモチーフを分析するため、各条件のノンターゲティング対照を使用して上位の枯渇ＰＦＳ同一性を以下のとおり計算した：－ｌｏｇ２（ｆｉ，ｔａｒｇｅｔｉｎｇ／ｆｉ，ｎｏｎ－ｔａｒｇｅｔｉｎｇ）［式中、ｆｉ，ｔａｒｇｅｔｉｎｇはターゲティングスペーサーでの条件ｉにおけるＰＦＳ同一性の頻度であり、ｆｉ，ｎｏｎ－ｔａｒｇｅｔｉｎｇはノンターゲティングスペーサーでの条件ｉにおけるＰＦＳ同一性の頻度である］。ＰＦＳモチーフは拡張データ図１Ｄ、図１Ｅに示すとおりの閾値範囲に関して分析した。
ＬｗａＣａｓ１３ａの精製
ＬｗａＣａｓ１３ａの精製を以前記載のとおり実施した６０。簡潔に言えば、ＬｗａＣａｓ１３ａ細菌発現ベクターをＲｏｓｅｔｔａ ２（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ ｓｉｎｇｌｅｓコンピテント細胞（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に形質転換し、４ＬのＴｅｒｒｉｆｉｃ Ｂｒｏｔｈ ４成長培地（ＴＢ）にスターター培養物を播種した。ＩＰＴＧで細胞タンパク質発現を誘導し、一晩成長させた後、細胞ペレットを回収し、－８０℃で保存した。細胞溶解後、ＳｔｒｅｐＴａｃｔｉｎセファロース樹脂（ＧＥ）を使用してタンパク質を結合させて、ＳＵＭＯプロテアーゼ消化（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）によってタンパク質を溶出させた。ＨｉＴｒａｐ ＳＰ ＨＰ陽イオン交換カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用した陽イオン交換、続いてＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００ Ｉｎｃｒｅａｓｅ １０／３００ ＧＬカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用したゲルろ過により、両方のステップともＦＰＬＣ（ＡＫＴＡ ＰＵＲＥ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）でタンパク質を更に精製した。ＬｗａＣａｓ１３ａタンパク質を含有する最終的な画分をプールし、保存緩衝液（６００ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭトリス－ＨＣｌ ｐＨ７．５、５％グリセロール、２ｍＭ ＤＴＴ）中に濃縮し、長期保存のためアリコートを－８０℃で凍結した。
哺乳類発現構築物のクローニング
ヒトコドン最適化Ｃａｓ１３ａ遺伝子を合成し（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ）、ＥＦ１－αプロモーターによる発現下で核外移行配列（ＮＥＳ）又は核局在化配列（ＮＬＳ）と共に哺乳類発現ベクターにクローニングした。モノマースーパーフォルダーＧＦＰ（ｍｓｆＧＦＰ）によって付与される安定性の理由から、本発明者らはｍｓｆＧＦＰをＬｗａＣａｓ１３ａのＣ末端に融合した。ＬｗａＣａｓ１３ａの完全長ダイレクトリピートを使用してＵ６プロモーター下の発現でガイド骨格プラスミドにクローニングした。２つのＨＥＰＮドメインにＲ４７４Ａ及びＲ１０４６Ａ突然変異を導入することにより触媒不活性ＬｗａＣａｓ１３ａ－ｍｓｆＧＦＰ構築物（デッドＣａｓ１３ａ又はｄＣａｓ１３ａ）を作成した。２Ａペプチド配列を介してＣ末端に連結したブラストサイジン選択マーカーを有する骨格にタンパク質をクローニングすることにより、薬物選択可能なバージョンのＬｗａＣａｓ１３ａ－ｍｓｆＧＦＰを作成した。ｄＣａｓ１３ａ－ｍｓｆＧＦＰのプロモーターの上流にジンクフィンガー結合部位をクローニングして、ジンクフィンガー及びＫＲＡＢドメインをＣ末端に融合することにより、ネガティブフィードバックバージョンのｄＣａｓ１３ａ－ｍｓｆＧＦＰ構築物を作成した。
ＣＭＶによる発現下にウミホタル（Ｃｙｐｒｉｄｉｎｉａ）ルシフェラーゼ（Ｃｌｕｃ）及びＥＦ１－αによる発現下にガウシアルシフェラーゼ（Ｇｌｕｃ）を両方ともに単一のベクター上にクローニングすることによりレポータールシフェラーゼ構築物を作成した。単一のベクター上の両方のルシフェラーゼが発現することにより、一方のルシフェラーゼが他方のルシフェラーゼのノックダウンを正規化するための投与対照として働き、トランスフェクション条件に起因するばらつきを制御することが可能になる。
図１Ｇの内因性ノックダウン実験のため、ＲＮＡｘｓ ｓｉＲＮＡ設計アルゴリズムを用いてガイド及びｓｈＲＮＡを設計した８７。この予測ツールを用いてｓｈＲＮＡを設計し、且つガイドを同じ位置に設計して、ｓｈＲＮＡとＣａｓ１３ａとのノックダウン間の比較を可能にした。
コメアクチンプロモーター（ｐＯｓＡｃｔｉｎ）をｐＡＮＩＣ６ＡからＰＣＲ増幅し８８、各Ｃａｓ１３ａを既に存在するＣａｓ１３ａ構築物からＰＣＲ増幅した。これらの断片を既に存在する植物発現プラスミドにライゲートして、各Ｃａｓ１３ａがコメアクチンプロモーターによってドライブされ、及び転写がＨＳＰターミネーターによって終結するようにした。Ｃａｓ１３ａ ｇＲＮＡをコメＵ６プロモーター（ｐＯｓＵ６）から発現させた。各遺伝子についてｇＲＮＡ標的配列を同定し、一方、足場配列はＣａｓ１３ａ特異的であった。これらの実験において、本発明者らは、グリホサート系除草剤の標的であるコメ５－エノールピルビルシキミ酸－３－リン酸シンターゼ（ＯｓＥＰＳＰＳ）遺伝子、及び正常な植物成長に必要なコメヒドロキシシンナモイル－ＣｏＡシキミ酸／キナ酸ヒドロキシシンナモイルトランスフェラーゼ（ＯｓＨＣＴ）遺伝子を標的とした。
本研究に使用したガイド及びｓｈＲＮＡは補表２及び補表３に挙げる。
プロトプラスト調製
緑米プロトプラスト（イネ亜種ジャポニカ変種ニッポンバレ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ Ｌ．ｓｓｐ．ｊａｐｏｎｉｃａ ｖａｒ．Ｎｉｐｐｏｎｂａｒｅ）を以前に記載のとおり調製し８９、但し少し修正を加えた。実生は１４日間成長させて、０．１Ｍ ＣａＣｌ２を含有するＭＭＧ緩衝液にプロトプラストを再懸濁した。この変法ＭＭＧ緩衝液を使用して新鮮な４０％ＰＥＧ緩衝液を並びにＷＩ緩衝液に代えて調製した。最後に、プロトプラストは形質転換後４８時間にわたって暗黒下に置いた。他の全ての条件は以前に記載のとおりとした。
インビトロ反応用の核酸標的及びｃｒＲＮＡ調製並びにコラテラル活性
核酸標的を作成するため、ＫＡＰＡ Ｈｉｆｉ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ（Ｋａｐａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）でオリゴヌクレオチドをＰＣＲ増幅した。ＭｉｎＥｌｕｔｅゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してｄｓＤＮＡアンプリコンをゲル抽出して精製した。得られた精製ｄｓＤＮＡをＨｉＳｃｒｉｂｅ Ｔ７ Ｑｕｉｃｋ高収率ＲＮＡ合成キット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）と３０℃で一晩インキュベートすることにより転写した。転写されたＲＮＡをＭＥＧＡｃｌｅａｒ転写クリーンアップキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を使用して精製した。この研究に使用した全てのＲＮＡ標的を補表４及び補表６に挙げる。
ｃｒＲＮＡを作成するため、オリゴヌクレオチドをＤＮＡとして（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、追加的な５’Ｔ７プロモーター配列と共に注文した。ｃｒＲＮＡ鋳型ＤＮＡにＴ７プライマーをアニールし（最終濃度１０ｕＭ）、ＨｉＳｃｒｉｂｅ Ｔ７ Ｑｕｉｃｋ高収率ＲＮＡ合成キット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）と３７℃で一晩インキュベートすることにより転写した。得られた転写ｃｒＲＮＡはＲＮＡＸＰクリーンビーズ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）で、追加的な１．８倍比のイソプロパノール（Ｓｉｇｍａ）を補足した、反応容積に対して２倍比のビーズを使用して精製した。インビトロ実験研究に使用したｃｒＲＮＡ構築物は補表５に挙げ、コラテラル検出に使用したｃｒＲＮＡ構築物は補表６に挙げる。
ＬｗａＣａｓ１３ａ切断及びコラテラル活性検出
ＬｗａＣａｓ１３ａの生化学的特徴付けのため、以前に記載のとおりアッセイを実施した５８。簡潔に言えば、特に指示されない限り、１６０ｎＭの末端標識ｓｓＲＮＡ標的、２００ｎＭ精製ＬｗａＣａｓ１３ａ、及び１００ｎＭ ｃｒＲＮＡでヌクレアーゼアッセイを実施した。アッセイは全て、ヌクレアーゼアッセイ緩衝液（４０ｍＭトリス－ＨＣｌ、６０ｍＭ ＮａＣｌ、６ｍＭ ＭｇＣｌ２、ｐＨ７．３）中で実施した。アレイのプロセシングのため、１回のヌクレアーゼ（ｎｕｃｅｌｅａｓｅ）アッセイ当たり１００ｎｇのインビトロ転写アレイを使用した。反応を３７℃で１時間（特に指示されない限り）進め、次にプロテイナーゼ緩衝液（プロテイナーゼＫ、６０ｍＭ ＥＤＴＡ、及び４Ｍ尿素）によって３７℃で１５分間クエンチした。次に反応物を４．５Ｍ尿素変性緩衝液によって９５℃で５分間変性させた。４５℃で実施した１０％ＰＡＧＥ ＴＢＥ－尿素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の変性ゲル電気泳動によって試料を分析した。Ｏｄｙｓｓｅｙスキャナ（ＬＩ－ＣＯＲ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用してゲルをイメージングした。
コラテラル活性検出アッセイを以前に記載のとおり実施した９０。簡潔に言えば、反応物は、ヌクレアーゼアッセイ緩衝液（４０ｍＭトリス－ＨＣｌ、６０ｍＭ ＮａＣｌ、６ｍＭ ＭｇＣｌ２、ｐＨ７．３）中、特に指示されない限り、４５ｎＭ精製ＬｗＣａｓ１３ａ、２２．５ｎＭ ｃｒＲＮＡ、１２５ｎＭクエンチ蛍光ＲＮＡレポーター（ＲＮＡｓｅ Ａｌｅｒｔ ｖ２、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、２μＬマウスＲＮアーゼ阻害薬（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、１００ｎｇのバックグラウンド全ヒトＲＮＡ（ＨＥＫ２９３ＦＴ培養物から精製した）、及び様々な量の入力核酸標的からなった。蛍光プレートリーダー（ＢｉｏＴｅｋ）上で反応を３７℃で１～３時間（特に指示されない限り）、５分毎に蛍光動態を計測しながら進めた。
ＲＮＡ抽出及びｑＲＴ－ＰＣＲ
Ｔｒｉｚｏｌ及び付属のプロトコルを用いて４８時間のインキュベーション後に全ＲＮＡを単離した。付属のプロトコルを用いたＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩＩ Ｐｌａｎｔｉｎｕｍ ＳＹＢＲグリーンＯｎｅ－Ｓｔｅｐ ｑＲＴ－ＰＣＲキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に１ナノグラムの全ＲＮＡを使用した。試料は全て、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ ４８０インスツルメント（Ｒｏｃｈｅ）の３８４ウェルフォーマットにおいて３回のバイオロジカルレプリケートのテクニカルトリプリケートで実行した。ＰＣＲプライマーは全て、融解曲線分析に基づき特異的であるとバリデートされており、以下のとおりである：ＯｓＥＰＳＰＳ（Ｏｓ０６ｇ０４２８０）、５’－ＴＴＧ ＣＣＡ ＴＧＡ ＣＣＣ ＴＴＧ ＣＣＧ ＴＴＧ ＴＴＧ－３’及び５’－ＴＧＡ ＴＧＡ ＴＧＣ ＡＧＴ ＡＧＴ ＣＡＧ ＧＡＣ ＣＴＴ－３’；ＯｓＨＣＴ（Ｏｓ１１ｇ０７９６０）、５’－ＣＡＡ ＧＴＴ ＴＧＴ ＧＴＡ ＣＣＣ ＧＡＧ ＧＡＴ ＴＴＧ－３’及び５’－ＡＧＣ ＴＡＧ ＴＣＣ ＣＡＡ ＴＡＡ ＡＴＡ ＴＧＣ ＧＣＴ－３’；ＯｓＥＦ１ａ（Ｏｓ０３ｇ０８０２０）、５’－ＣＴＧ ＴＡＧ ＴＣＧ ＴＴＧ ＧＣＴ ＧＴＧ ＧＴ－３’及び５’－ＣＡＧ ＣＧＴ ＴＣＣ ＣＣＡ ＡＧＡ ＡＧＡ ＧＴ－３’。ＯｓＥＦ１ａのプライマーは以前に記載された９１。データは全て、ＥＦ１ａの発現と比べた各試料で平均値±標準誤差として提示する。
タイリングガイドスクリーンのクローニング
タイリングガイドスクリーンのため、転写物の全長を完全に網羅するため均等な間隔でｍＲＮＡ転写物を標的化するようにスペーサーを設計した。スペーサーはＩＤＴに注文し、アニールして、Ｇｌｕｃ及びＣｌｕｃスクリーン用のｔＲＮＡｖａｌプロモーター、又は全ての内因性スクリーン用のＵ６プロモーターのいずれかと共にＬｗａＣａｓ１３ａガイド発現構築物にゴールデンゲートクローニングした。
ＬｗａＣａｓ１３ａによるノックダウンのための哺乳類細胞培養及びトランスフェクション
哺乳類細胞実験は全て、特に注記されない限り、ＨＥＫ２９３ＦＴ株（ＡＴＣＣ）で実施した。ＨＥＫ２９３ＦＴ細胞は、１０％ウシ胎仔血清（ＶＷＲ Ｓｅｒａｄｉｇｍ）及び１×ペニシリン－ストレプトマイシン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を補足した、高グルコース、ピルビン酸ナトリウム、及びＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）含有のダルベッコ変法イーグル培地で培養した。細胞を継代して７０％未満のコンフルエンシーを維持した。Ａ３７５（ＡＴＣＣ）が関わる実験については、細胞は、９％ウシ胎仔血清（ＶＷＲ Ｓｅｒａｄｉｇｍ）及び１×ペニシリン－ストレプトマイシン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を補足したＲＰＭＩ培地１６４０（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で培養した。
内因性遺伝子のノックダウンを試験するため、特に注記されない限り、ウェル当たり１５０ｎｇのＬｗａＣａｓ１３ａプラスミド及び２５０ｎｇのガイドプラスミドでＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）トランスフェクションを実施した。レポータープラスミドのノックダウンを試験する実験は、ウェル当たり１２．５ｎｇレポーター構築物を補足した。トランスフェクションの１６時間前、細胞を９６ウェルプレートに約２０，０００細胞／ウェルでプレーティングし、９０％コンフルエンシーになるまで一晩成長させた。各ウェルにつき、プラスミドを合計２５ｕＬとなるようにＯｐｔｉ－ＭＥＭ（登録商標）Ｉ低血清培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）と合わせ、別途０．５ｕＬのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００を２４．５ｕＬのＯｐｔｉ－ＭＥＭと合わせた。次にプラスミド及びリポフェクタミン溶液を合わせ、５分間インキュベートして、破壊しないよう細胞上にゆっくりとピペッティングした。
緑米プロトプラストの形質転換
緑米実験については、各Ｃａｓ１３ａを発現するプラスミド及び対応するｇＲＮＡを等モル比で混合することにより、合計３０ｍｇのＤＮＡを使用して１回の形質転換当たり合計２００，０００のプロトプラストを形質転換した。
ルシフェラーゼ活性の計測
本発明者らは、特に注記されない限り、トランスフェクション後４８時間で分泌ルシフェラーゼを含有する培地を回収した。培地をＰＢＳで１：５希釈し、次にＢｉｏｔｅｋ Ｓｙｎｅｒｇｙ ４プレートリーダーにおいて注入プロトコルでＮＥＢウミホタル（Ｃｙｐｒｉｄｉｎｉａ）及びガウシアルシフェラーゼ測定キットを使用してルシフェラーゼ活性を計測した。レプリケートは全て、バイオロジカルレプリケートとして実施した。
全ＲＮＡの回収及び定量的ＰＣＲ
トランスフェクション後４８時間で、以前に記載された市販のＣｅｌｌｓ－ｔｏ－Ｃｔキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の変法９２を用いて細胞の回収及び逆転写によるｃＤＮＡ作成を実施した。次にＦａｓｔ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）及びＴａｑＭａｎ ｑＰＣＲプローブ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、補表７及び補表８）をＧＡＰＤＨ対照プローブ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）と共に使用したｑＰＣＲで転写物発現を定量化した。ｑＰＣＲ反応は全て、３８４ウェルフォーマットにおいて４回のテクニカルレプリケートによって５ｕＬ反応物で実施し、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ ４８０インスツルメントＩＩ（Ｒｏｃｈｅ）を用いて読み取った。多重ターゲティング反応については、異なる標的の読取りは別個のウェルで実施した。
発現レベルは、総入力に対して正規化するため標的Ｃｔ値からハウスキーピング対照（ＧＡＰＤＨ）Ｃｔ値を差し引いてΔＣｔレベルを求めることにより計算した。相対転写物存在量は２＾（－ΔＣｔ）として算出した。レプリケートは全て、バイオロジカルレプリケートとして実施した。
標的の接近可能性のコンピュータ解析
初めに標的の接近可能性を分析するため、本発明者らはタイリングスクリーンからの上位ガイドを分析し、接近可能性領域があったならば、当該領域における複数のガイドは極めて高活性であると予想し得るという仮定の下に、それらが予想よりも互いに近くにグループ化されるかどうかを決定した。本発明者らは上位ガイドをＧｌｕｃタイリングスクリーンについては上位２０％のパフォーマンスのガイド、Ｃｌｕｃ、ＫＲＡＳ、及びＰＰＩＢタイリングスクリーンについては上位３０％のパフォーマンスのガイドと定義した。本発明者らはランダムにシミュレートした１０，０００のガイド位置によってガイド間のペアワイズ距離の帰無確率分布を作成し、次に実験的に決定した上位ガイドのペアワイズ距離を比較した。
Ｖｉｅｎｎａ ＲＮＡソフトウェアスイートのＲＮＡｐｌｆｏｌｄアルゴリズムを用いて接近可能性を予測した９３。デフォルトのウィンドウサイズ７０ｎｔを使用し、対合しない標的領域の確率を、標的領域にわたる２８の単一ヌクレオチド対合なし確率の平均として計算した。これらの接近可能性曲線をスムージングし、４つの転写物の各々でスムージングしたノックダウン曲線と比較し、ピアソンの相関係数を用いて２つの因子間の相関を算出した。これらの２つの因子の確率空間もまた、２変数で２Ｄカーネル密度推定を実施することにより視覚化した。
ＲＮＡシーケンシング及び解析
ＬｗａＣａｓ１３ａノックダウンの特異性を決定するため、本発明者らは、ＬｗａＣａｓ１３ａ及びｓｈＲＮＡの両方の構築物が関わるノックダウン実験からのｍＲＮＡに関してＲＮＡシーケンシングを実施した。Ｑｉａｇｅｎ ＲＮｅａｓｙ Ｐｌｕｓ Ｍｉｎｉキット（ｍｉｔ）を使用して、４８時間後にトランスフェクション実験から全ＲＮＡを調製した。次にＮＥＢＮｅｘｔ（登録商標）ポリ（Ａ）ｍＲＮＡ磁気分離モジュールを使用してｍＲＮＡを抽出し、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）のためＮＥＢＮｅｘｔ（登録商標）Ｕｌｔｒａ（商標）Ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ ＲＮＡライブラリ調製キットを使用してＲＮＡ－ｓｅｑライブラリを調製した。ＲＮＡシーケンシングライブラリをＩｌｌｕｍｉｎａ ＮｅｘｔＳｅｑインスツルメントでライブラリ当たり少なくとも１０Ｍリードとしてシーケンシングした。
ＲｅｆＳｅｑ ＧＲＣｈ３８アセンブリを使用してインデックスを作成し、デフォルトパラメータを用いたＢｏｗｔｉｅ及びＲＳＥＭ ｖ１．２．３１を使用してリードをアラインメントし、定量化した９４。転写物百万分率（ＴＰＭ）値を使用して発現をカウントし、ｌｏｇ２（ＴＰＭ＋１）をとることにより対数空間に変換した。
差次的に発現する遺伝子を見付けるため、本発明者らは、３回のノンターゲティングレプリケートに対する３回のターゲティングレプリケートに関してスチューデントｔ検定を実施した。統計的分析は、６回のレプリケートのうち少なくとも２回において２．５より大きいｌｏｇ２（ＴＰＭ＋１）値を有する遺伝子に関してのみ実施した。２より大きいか、又は０．７５より小さい発現差異及び偽発見率＜０．１０を有した遺伝子のみを有意に差次的に発現したと報告した。
ケンドールのタウ係数を用いてレプリケートとレプリケート平均との間の相互相関を実施した。６回のレプリケート（３回のターゲティング及び３回のノンターゲティングレプリケート）にわたる遺伝子発現の標準偏差分布を考慮することによりｓｈＲＮＡ対Ｃａｓ１３ａライブラリの変動を分析し、バイオリンプロットとしてプロットした。
哺乳類細胞におけるコラテラル活性に関するＬｗａＣａｓ１３ａの評価
潜在的な成長制限効果があるかを試験することにより、ＬｗａＣａｓ１３ａをコラテラル活性に関して更に評価した。哺乳類細胞にルシフェラーゼレポーター標的、ガイドプラスミド、及びＬｗａＣａｓ１３ａ又は薬物選択可能なＬｗａＣａｓ１３ａのいずれかをトランスフェクトした。トランスフェクション後２４時間で細胞を新鮮培地中に１：５分割し、薬物選択可能なＬｗａＣａｓ１３ａ試料に１０ｕｇ／ｍＬブラストサイジンＳ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を補足した。更に４８時間成長させた後、ルシフェラーゼノックダウン、多モードプレートリーダー（Ｂｉｏｔｅｋ Ｎｅｏ２）でのＧＦＰ蛍光計測によるＬｗａＣａｓ１３ａ発現の維持、及びＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）発光細胞生存アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）による細胞成長に関して細胞をアッセイした。
ＲＩＰによるｄＣａｓ１３ａ結合の定量化
ＲＮＡ免疫沈降実験のため、ＨＥＫ２９３ＦＴ細胞を６ウェルプレートにプレーティングし、１．３ｕｇのｄＣａｓ１３ａ発現プラスミド及び１．７ｕｇのガイドプラスミドを、レポーターターゲティングが関わる条件については更なる１５０ｎｇのレポータープラスミドと共にトランスフェクトした。トランスフェクション後４８時間で細胞を氷冷ＰＢＳ（Ｓｉｇｍａ）で２回洗浄し、０．２％パラホルムアルデヒド（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）でＰＢＳ中に室温で１５分間固定した。固定後、パラホルムアルデヒドを取り除き、ＰＢＳ中１２５ｍＭグリシンを加えて架橋結合をクエンチし、細胞を１０分間インキュベートした。細胞を再び氷冷ＰＢＳで２回洗浄し、掻き取って回収し、細胞懸濁液を８００ｇで４分間遠心して細胞をペレット化した。上清を取り除き、ペレットをＰＢＳで洗浄した後、溶解させた。細胞は、ｃＯｍｐｌｅｔｅ（商標）ＵＬＴＲＡ錠、ＥＤＴＡフリー（Ｓｉｇｍａ）及びリボヌクレアーゼ阻害薬（Ｓｉｇｍａ Ｒ１１５８）を補足した２００ｕＬの１×ＲＩＰＡ緩衝液（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）で溶解させた。細胞を氷上で１０分間溶解させて、次にＢｉｏｒｕｐｔｏｒソニケーター（Ｄｉａｇｅｎｏｄｅ）において低強度で３０秒オン／３０秒オフのサイクルによって２分間超音波処理した。４℃、１６，０００ｇで１０分間の遠心によってペレット化された不溶性材料、及び清澄化ライセートを含有する上清を磁気ビーズによるプルダウンに使用した。
抗体を磁気ビーズにコンジュゲートするため、１００μＬ／試料のＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）免疫沈降用プロテインＡ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を磁石の適用によってペレット化し、上清を取り除いた。ビーズを２００μＬの洗浄緩衝液（０．０２％Ｔｗｅｅｎ－２０（Ｓｉｇｍａ）を補足したＰＢＳ）に再懸濁し、５μｇのウサギ抗マウスＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ Ｍ７０２３）を加えた。試料をローテータ上において室温で１０分間インキュベートして、抗体をビーズにコンジュゲートさせた。インキュベーション後、ビーズを磁石によってペレット化し、上清を取り除き、ビーズを洗浄緩衝液で２回洗浄した。ペレットを１００μＬ洗浄緩衝液中に再懸濁し、抗ＨＡ抗体（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ２６１８３）又はＩｇＧ抗体対照（Ｓｉｇｍａ Ｉ５３８１）のコンジュゲーション用に２つの５０μＬ容量に分割した。各抗体について２．５μｇの抗体を２００μＬ洗浄緩衝液と加え合わせ、ローテータ上において室温で１０分間インキュベートした。インキュベーション後、ビーズを磁石によってペレット化し、洗浄緩衝液で２回洗浄し、リボヌクレアーゼ阻害薬（Ｓｉｇｍａ Ｒ１１５８）及びプロテアーゼ阻害薬カクテル（Ｓｉｇｍａ Ｐ８３４０）を含む２００μＬ １×ＲＩＰＡ中に再懸濁した。１００μＬの試料ライセートをビーズに加え、４℃で一晩回転させた。
試料ライセートとのインキュベーション後、ビーズをペレット化し、１×ＲＩＰＡ、０．０２％Ｔｗｅｅｎ－２０で３回洗浄し、次にＤＮアーゼ緩衝液（３５０ｍＭトリス－ＨＣｌ［ｐＨ６．５］；５０ｍＭ ＭｇＣｌ２；５ｍＭ ＤＴＴ）で洗浄した。ビーズをＤＮアーゼ緩衝液に再懸濁し、ＴＵＲＢＯ ＤＮアーゼ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を０．０８単位／μｌの最終濃度となるように加えた。ＤＮアーゼをローテータ上において３７℃で３０分間インキュベートした。次にプロテイナーゼＫ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を０．１単位／μｌの最終濃度となるように加えることによりタンパク質を消化し、回転させながら３７℃で更に３０分間インキュベートした。変性及び精製のため、尿素（Ｓｉｇｍａ）を２．５Ｍの最終濃度となるように加え、試料を３０分間インキュベートし、Ｄｉｒｅｃｔ－Ｚｏｌ ＲＮＡミニプレップ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用してＲＮＡを精製した。ｑＳｃｒｉｐｔ Ｆｌｅｘ ｃＤＮＡ（Ｑｕａｎｔａｂｉｏ）を使用して精製ＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写し、Ｆａｓｔ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ及びＴａｑＭａｎ ｑＰＣＲプローブを使用したｑＰＣＲでプルダウンを定量化した（補表７及び補表８）。ｑＰＣＲ反応は全て、３８４ウェルフォーマットにおいて４回のテクニカルレプリケートによって５μＬ反応物で実施し、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ ４８０インスツルメントＩＩを使用して読み取った。試料について、その対応するＩｇＧ抗体と比較してエンリッチメントを定量化した。
ＬｗａＣａｓ１３ａ及びＬｗａＣａｓ１３ａ－ＮＦの移行の計測
２４ウェル組織培養プレート内のポリ－Ｄ－リジンカバーガラス（Ｃｏｒｎｉｎｇ）上にＨＥＫ２９３ＦＴ細胞をプレーティングし、１５０ｎｇ ｄＣａｓ１３ａ－ＮＦベクター及び３００ｎｇ ＡＣＴＢイメージング用ガイドをトランスフェクトした。移行実験のため、細胞を４％ＰＦＡで固定し、４８時間後に０．２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００で透過処理し、ＤＡＰＩ含有退色防止封入剤（Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ）を使用してマウントした。Ｎｉｋｏｎ Ｅｃｌｉｐｓｅ Ｔｉ１をＡｎｄｏｒ Ｙｏｋａｇａｗａ Ｓｐｉｎｎｉｎｇ ｄｉｓｋ Ｒｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ＷＤシステムと共に使用して共焦点顕微鏡法を実施した。
平均細胞質及び核ｍｓｆＧＦＰ蛍光を計測して、ターゲティング条件とノンターゲティング条件との間の多くの細胞にわたる比を比較することにより、ＡＣＴＢ ｍＲＮＡを標的とするガイドによるｄＣａｓ１３ａ－ＮＦ－ｍｓｆＧＦＰの核外移行を分析した。
ＡＣＴＢ転写物の蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）
２４ウェル組織培養プレート内のポリ－Ｄ－リジンカバーガラス（Ｃｏｒｎｉｎｇ）上にＨＥＫ２９３ＦＴ細胞をプレーティングし、７５ｎｇ ｄＣａｓ１３ａ－ＮＦベクター及び２５０ｎｇ ＡＣＴＢイメージング用ガイドをトランスフェクトした。４８時間後、細胞を４％ＰＦＡで４５分間固定した。ＱｕａｎｔｉＧｅｎｅ ｖｉｅｗＲＮＡ ＩＳＨ細胞アッセイキット（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）を使用して細胞試料にＦＩＳＨを実施し、プロトコルは製造者が記載するとおり従った。ＦＩＳＨ手順の終了後、退色防止封入剤（Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ）を使用してカバーガラスをマウントした。Ｎｉｋｏｎ Ｅｃｌｉｐｓｅ Ｔｉ１をＡｎｄｏｒ Ｙｏｋａｇａｗａ Ｓｐｉｎｎｉｎｇ ｄｉｓｋ Ｒｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ＷＤシステムと共に使用して共焦点顕微鏡法を実施した。
ストレス顆粒へのＬｗａＣａｓ１３ａのトラッキング
２４ウェル組織培養プレート内のポリ－Ｄ－リジンカバーガラス（Ｃｏｒｎｉｎｇ）上にＨＥＫ２９３ＦＴ細胞をプレーティングし、７５ｎｇ ｄＣａｓ１３ａ－ＮＦベクター及び２５０ｎｇ ＡＣＴＢイメージング用ガイドをトランスフェクトした。ストレス顆粒実験のため、２００μＭ亜ヒ酸ナトリウムを１時間適用した後、細胞を固定し、透過処理した。Ｇ３ＢＰ１の免疫蛍光法のため、細胞を２０％ヤギ血清でブロックし、抗Ｇ３ＢＰ１一次抗体（Ａｂｎｏｖａ Ｈ０００１０１４６－Ｂ０１Ｐ）と室温で一晩インキュベートした。次に、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５９４で標識した二次抗体と細胞をインキュベートし、ＤＡＰＩ含有褪色防止封入剤（Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ）を使用してマウントした。Ｎｉｋｏｎ Ｅｃｌｉｐｓｅ Ｔｉ１をＡｎｄｏｒ Ｙｏｋａｇａｗａ Ｓｐｉｎｎｉｎｇ ｄｉｓｋ Ｒｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ＷＤシステムと共に使用して共焦点顕微鏡法を実施した。
ピアソンの相関係数を使用した細胞当たりの平均ｍｓｆＧＦＰ及びＧ３ＢＰ１シグナルを用いてｄＣａｓ１３ａ－ＮＦ－ｍｓｆＧＦＰとのストレス顆粒共局在を計算した。画像解析ソフトウェアＦＩＪＩ９５でＣｏｌｏｃ ２プラグインを使用して共局在分析を実施した。
ライブイメージング実験のため、ＨＥＫ２９３ＦＴ細胞を９６ウェル組織培養プレートにプレーティングし、１５０ｎｇ ｄＣａｓ１３ａ－ＮＦベクター、３００ｎｇ ＡＣＴＢイメージング用ガイド、及び５ｎｇのＧ３ＢＰ１－ＲＦＰレポーターをトランスフェクトした。４８時間後、細胞を０μＭ又は４００μＭ亜ヒ酸ナトリウムに供し、Ｏｐｅｒａ Ｐｈｅｎｉｘ（商標）ハイコンテンツスクリーニングシステム（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）で２０倍水浸対物レンズによるスピンディスク共焦点セッティングを用いて１５分毎に２時間毎にイメージングした。細胞は５０％ＣＯ２の加湿チャンバ内で３７℃に維持した。Ｏｐｅｒａ Ｐｈｅｎｉｘ Ｈａｒｍｏｎｙソフトウェア（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を使用してストレス顆粒におけるＧ３ＢＰ１－ＲＦＰとの生細胞ｄＣａｓ１３ａ－ＮＦ－ｍｓｆＧＦＰ共局在を測定した。
標的の接近可能性とノックダウンとの相関
本発明者らは、偶然から予想され得るよりも互いにより近くにグループ化する極めて有効なガイドによってＬｓｈＣａｓ１３ａがＭＳ２ ｓｓＲＮＡゲノムを定義された位置で標的化したことを示した１。本発明者らは、有効なガイドのクラスターが標的結合の立体及び利用可能性に起因してＬｓｈＣａｓ１３ａによってより良好に標的化される接近可能性領域から生じ得ると仮定した。本発明者らは、これらの結果をＬｗＣａｓ１３ａによる哺乳類ｍＲＮＡのターゲティングに拡張し得るかどうかを分析しようとし、そのため、本発明者らがガイドをタイリングした４つの遺伝子：Ｇｌｕｃ、Ｃｌｕｃ、ＫＲＡＳ、及びＰＰＩＢに対して同様の分析を実施した。本発明者らは初めに、有効なガイドを、ノックダウン効率によって計測したときＧｌｕｃについて上位２０％のガイド及び他の３つの遺伝子について上位３０％のガイドとして定義した（Ｃｌｕｃ、ＫＲＡＳ、及びＰＰＩＢはＧｌｕｃよりも５０％少ないガイドをタイリングしたため、本発明者らはこれらに対する閾値についてより寛容であることに留意されたい）。これらの閾値を使用して定義したときの最も有効なガイドのみを分析するにおいて、本発明者らは、それらが実に偶然から予想されるよりも互いにより近くにクラスター化することを見出した。
本発明者らは次に、Ｖｉｅｎｎａ ＲＮＡソフトウェアスイートのＲＮＡｐｌｆｏｌｄアルゴリズムを用いて標的転写物の接近可能性をモデル化しようとした。本発明者らはサイズ７０のウィンドウ（デフォルト）にわたる接近可能性、及び転写物上の所与のヌクレオチド位置が対合しないであろう確率を計算した。所与のガイドについて、本発明者らは次に２８ｎｔにわたってこの確率を平均して、所与のガイド標的が対合しない、ひいては接近可能である平均確率を求めることができる。本発明者らは、この計算値を標的の接近可能性の尺度として取り、各ガイドの標的発現と比較する。ガイドによって起こる変動のため、特に遺伝子は高密度にタイリングされないため、本発明者らは、標的の接近可能性及び標的発現の両方の曲線をスムージングすることにした。これらの曲線をプロットして相関を分析することにより、本発明者らは、標的の接近可能性が標的発現と有意に相関すること、及びこれが標的発現の４．４％～１６％の変動を説明し得ることを見出した。スムージングのスプリアス効果を相殺するため、本発明者らはまた、カーネル密度推定を用いることにより確率空間におけるノックダウンデータに対する確率も分析した。この分析により、塩基対合する標的領域の確率と標的発現との間の同様の正の関係が明らかになった。最後に、塩基対合確率についてスプリアス相関を生じるＲＮＡｐｌｆｏｌｄの任意のパラメータ特異的側面を相殺するため、本発明者らは、グリッド状のパラメータ：ウィンドウサイズ及びｋ－ｍｅｒサイズに関して対合しない確率を計算した。本発明者らは、最初は、１のｋ－ｍｅｒに関する確率、即ち所与の位置が対合しない確率のみを計算し、２８ｎｔ標的領域にわたって平均した。ｋ＝２で、本発明者らはヌクレオチドペアが対合しない確率を計算してそれらを２８ｎｔ領域にわたって平均し、以下同様にｋが２８に至るまで行った。この分析により、単なる相関を与える特定のパラメータセットでないより高い信頼をもたらす、正の相関を生じる各転写物のパラメータ領域が明らかになった。当然のことだが、はるかに小さいウィンドウサイズに関して正の相関を有したＰＰＩＢなどの小型の転写物と比べて、ＫＲＡＳなどの大型の転写物ほどより大きいウィンドウサイズに関して正の相関を有する。
ｓｈＲＮＡとＣａｓ１３ａとの間の標的ノックダウン特異性の比較
ｓｈＲＮＡとＣａｓ１３ａとの間の転写物ノックダウン特異性の厳密な比較のため、本発明者らは、ターゲティングとノンターゲティング対照とを比較したトランスクリプトームワイドな摂動効果を評価しようと考えた。オフターゲットは同一性ラインからの偏差として現れることになり、レポーター構築物のターゲティング時にＣａｓ１３ａよりもｓｈＲＮＡについてより多くのオフターゲットが起こることは明らかである。内因性遺伝子についても同様の偏差の増加が起こる。内因性転写物のノックダウンは生物学的機能の変化から更なる遺伝子発現変化をもたらし得ることを予想し得るが、本発明者らは、恐らくは実質的な下流効果にノックダウンレベルが不十分であることに起因して、Ｃａｓ１３ａによるＰＰＩＢ及びＫＲＡＳノックダウンが発現の変化をもたらさないことを見出す。
次に、本発明者らは差次的遺伝子発現によるオフターゲット数を定量化した：オフターゲット転写物は、少なくとも１００％の上方制御又は２５％の下方制御を有する遺伝子として定義した。次にターゲティング条件とノンターゲティング条件との間で有意なオフターゲットを、０．１のＦＤＲでベンジャミニ・ホックバーグ（Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ－Ｈｏｃｈｂｅｒｇ）法によって補正した多重比較でスチューデントｔ検定によって比較した。本発明者らは、試験した３つ全ての転写物について、ｓｈＲＮＡターゲティングの結果として何百もの有意なオフターゲット転写物があったが、Ｃａｓ１３ａターゲティングの結果として有意なオフターゲットはなかったことを見出した。
ターゲティング条件とノンターゲティング条件との間におけるｓｈＲＮＡ摂動の大きい変動は、バイオロジカルレプリケート間に同様の偏差をもたらすものと思われる全体的な遺伝子発現変動の増加、又は同じ条件についてのレプリケート間の相関の増加として現れるものと思われる再現可能な一貫したオフターゲットのいずれかに起因する可能性がある。Ｇｌｕｃ摂動に関してノンターゲティング及びターゲティングレプリケートを互いに比較して、本発明者らはレプリケート間にほとんど変動がないことを見出した。しかしながら、ｓｈＲＮＡ又はＣａｓ１３ａのいずれについても、ターゲティング条件の個々のレプリケートを全てのノンターゲティング条件と比較したとき、本発明者らは、レプリケート間の比較が、平均測定値について見られるオフターゲットを再現したことを見出した。レプリケート間の相関を定量化するため、本発明者らは、レポーター及び内因性遺伝子にわたってターゲティング及びノンターゲティング条件の全てのレプリケートを比較した。ｓｈＲＮＡ試料はレプリケート内でノンターゲティング条件とターゲティング条件との間よりも相関が高く、一方、Ｃａｓ１３ａ試料間の相関はターゲティング摂動とノンターゲティング摂動との間の変動が小さかった。本発明者らは次に、全ての試料を互いに比較し、ｓｈＲＮＡ試料は試料間及びＣａｓ１３ａとの間でＣａｓ１３ａ内よりも相関が低いことを見出し、Ｃａｓ１３ａは一貫性が高かったことが示された。最後に、本発明者らは、ターゲティング及びノンターゲティングの両方のレプリケートにわたって遺伝子当たりの標準偏差を計算し、トランスクリプトームにわたるＣａｓ１３ａ摂動についてｓｈＲＮＡ摂動よりも標準偏差分布が低かったことを見出した。総じて、このエビデンスは、Ｃａｓ１３ａターゲティングがトランスクリプトームワイドな変動を生じにくいことを示している。
哺乳類細胞におけるコラテラル活性欠如のエビデンス
ＬｓｈＣａｓ１３ａ及びＬｗＣａｓ１３ａはインビトロでロバストなコラテラル活性を示すように見える。コラテラル効果に起因して細胞の健康及びＬｗＣａｓ１３ａノックダウンの特異性が懸念されるため、本発明者らは、このコラテラル効果が哺乳類細胞に実際に存在するかどうかを研究しようと試みている。我々の論稿全体を通じて、本発明者らはＬｗＣａｓ１３ａについてのコラテラル活性の欠如を示唆するデータを集め、ここで本発明者らは、エビデンスのあらゆる断片を一つにまとめ、それらを詳細に考察する。
１．ＲＮＡシーケンシング：本発明者らはＲＮＡシーケンシングを実施してＬｗＣａｓ１３ａノックダウンの特異性を決定し、ＬｗＣａｓ１３ａがＲＮＡｉよりもはるかに高い特異性を示すことを見出した。本発明者らの発現差異解析では、分析したいずれのＬｗＣａｓ１３ａ条件についても、標的転写物の有意なノックダウンにも関わらず、有意に差次的に発現したオフターゲットはなかった。ヒトトランスクリプトームにおける全ての転写物の均一なノックダウンはなかったと仮定して、本発明者らは、ＬｗＣａｓ１３ａによるノックダウンが特異的で、哺乳類細胞においてコラテラル効果がないという実質的なエビデンスがこれにより提供されると考える。
２．タイリングスクリーン：本発明者らが実施した４つの遺伝子タイリングスクリーンにおいて、本発明者らは、正規化に使用した対照遺伝子のノックダウンを認めなかった。これはＲＮＡシーケンシングと同様の分析であり、但しトランスクリプトームというよりむしろ、ただ１つの他の遺伝子だけに焦点が置かれる。しかしながら、本発明者らが試験した何百ものガイドにわたってコラテラル活性を認めないことから、この結果は重要であり、ＬｗＣａｓ１３ａがインビボでコラテラル活性をロバストに示さないという確信を与える。
３．一個抜き多重化：我々の多重化実験において遺伝子ノックダウンの特異性を確かめるため、本発明者らは、３つの異なる遺伝子に対するガイドを含むガイド発現アレイにおいて各遺伝子ターゲティングガイドがノンターゲティングガイドに置き換えられる実験を設計した。本発明者らは、欠損したガイドが標的とする遺伝子に関して有意な遺伝子発現の変化はなかったことを見出した。本発明者らは、そのガイドが存在するか、それとも欠損しているかに関わらず、３つ全ての遺伝子が常にノックダウンを示すことを予想し得るため、これがまた、哺乳類細胞にコラテラル活性の欠如があることの良い実証でもあると考える。
４．成長実験：以前に、本発明者らは、ＬｓｈＣａｓ１３ａが細菌において遺伝子ノックダウン中に成長制限を引き起こすことを示した１。本発明者らは、哺乳類細胞においてノックダウンの成長効果があるかどうかを計測する単純な実験を設計した。本発明者らは、Ｇｌｕｃを標的とするＬｗＣａｓ１３ａを有する細胞を７２時間成長させ、次に細胞生存度を計測して、ターゲティングガイド条件とノンターゲティングガイド条件との間に成長の差がなかったことを見出した。本発明者らは更に、Ｃ末端ｍｓｆＧＦＰ融合物の蛍光を調べることによりＬｗＣａｓ１３ａ発現を対照し、全ての条件で発現が同じであり、潜在的に有害な表現型に起因して選び出されることがなかったことを示した。以前の細菌成長抑制の観察にも関わらず、哺乳類細胞における成長阻害の欠如に関しては、ＲＮＡ細胞質密度、サイトゾル組成、及び切断された転写物のプロセシング機構の違いを含め、数多くの理由が考えられる。
第１～３点目は、まとめて、標的化した遺伝子ノックダウンが標的遺伝子以外の他の遺伝子に影響を及ぼさないことを示しており、及び第４点目は、遺伝子ノックダウンに観察可能な副作用がないことを明らかにしている。本発明者らは、これらのデータが、全て一緒になって、哺乳類細胞におけるＬｗＣａｓ１３ａコラテラル活性の欠如の実質的なエビデンスであり、及びＣａｓ１３ノックダウンが非常に特異的であると考える。
ｄＣａｓ１３ａイメージングに対するネガティブフィードバック構築物の重要性
生細胞イメージングには、高い信号対雑音比を維持し、且つバックグラウンドを低減することが重要である。未結合のｄＣａｓ１３ａは細胞から取り除くことができない、又は結合したタンパク質と区別することができないため、バックグラウンドに関する懸念はｄＣａｓ１３ａなどのフルオロフォア標識構築物について特に重要である。バックグラウンドを低減する一つの手法は、核局在化シグナル（ＮＬＳ）タグによる核内へのタンパク質の隔離である；新生転写物の結合に伴い、タンパク質は一過性に細胞質に輸送される。この技法はＭＳ２系に利用されているが、本発明者らは、オフターゲット核外漏出及びオンターゲット核外エスケープに起因してそれが不完全であることを見出した。ＮＬＳタグ付加単独の信号対雑音を改善するため、本発明者らはネガティブフィードバックシステムを取り入れ、ここでは核内常在タンパク質がｄＣａｓ１３ａの更なる発現を阻害することになる。本発明者らは、ネガティブフィードバック調節が細胞質へのスプリアス移行を低減し、ターゲティング条件と比較したノンターゲティング条件におけるｄＣａｓ１３ａ－ＮＦレベルの全体的なレベルの低下につながり、それによりイメージングツールとしてのｄＣａｓ１３ａの有用性が増加することを見出す。
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本発明の好ましい実施形態を本明細書に示し、説明したが、当業者には、かかる実施形態が単に例として提供されるに過ぎないことは明らかであろう。ここで、当業者には、本発明から逸脱することなく多数の変形、変更、及び置換が想起されるであろう。本発明の実施においては本明細書に記載される発明の実施形態の様々な代替例を用い得ることが理解されなければならない。以下の特許請求の範囲が本発明の範囲を定義すること、並びにこの特許請求の範囲内にある方法及び構造並びにその均等物が本発明に包含されることが意図される。

Claims (161)

  1. 目的の哺乳類標的遺伝子座を改変する方法であって、１つ以上の局在化シグナルに融合したＣ２ｃ２エフェクタータンパク質と１つ以上の核酸成分とを含む天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物を前記遺伝子座に送達することを含み、ここで少なくとも前記１つ以上の核酸成分はエンジニアリングされ、前記１つ以上の核酸成分が複合体を前記目的の標的に導き、及び前記エフェクタータンパク質が前記１つ以上の核酸成分と複合体を形成し、及び前記複合体が前記目的の標的遺伝子座に結合する、方法。
  2. １つ以上の局在化シグナルに融合したＣ２ｃ２エフェクタータンパク質と１つ以上の核酸成分とを含む天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物であって、ここで少なくとも前記１つ以上の核酸成分は目的の哺乳類標的遺伝子座の改変における使用のためにエンジニアリングされ、前記１つ以上の核酸成分が複合体を前記目的の標的に導き、及び前記エフェクタータンパク質が前記１つ以上の核酸成分と複合体を形成し、及び前記複合体が前記目的の標的遺伝子座に結合する、組成物。
  3. １つ以上の局在化シグナルに融合したＣ２ｃ２エフェクタータンパク質と１つ以上の核酸成分とを含む天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物の使用であって、ここで少なくとも前記１つ以上の核酸成分は目的の哺乳類標的遺伝子座を改変するためにエンジニアリングされ、前記１つ以上の核酸成分が複合体を前記目的の標的に導き、及び前記エフェクタータンパク質が前記１つ以上の核酸成分と複合体を形成し、及び前記複合体が前記目的の標的遺伝子座に結合する、使用。
  4. 前記目的の標的遺伝子座がＲＮＡを含む、請求項１～３又は５８～５９のいずれか一項に記載の方法、組成物、又は使用。
  5. 前記局在化シグナルが核局在化シグナル（ＮＬＳ）又は核外移行シグナル（ＮＥＳ）、好ましくはＮＥＳである、請求項１～４又は５８～５９のいずれか一項に記載の方法、組成物、又は使用。
  6. 前記目的の標的遺伝子座の前記改変が鎖切断を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
  7. 前記Ｃ２ｃ２エフェクタータンパク質が哺乳類細胞での発現にコドン最適化される、請求項１～６又は５８～５９のいずれか一項に記載の方法、組成物、又は使用。
  8. 前記Ｃ２ｃ２エフェクタータンパク質が１つ以上の機能ドメインに会合し；及び任意選択で前記エフェクタータンパク質が、Ｒ５９７Ａ、Ｈ６０２Ａ、Ｒ１２７８Ａ、及び／又はＨ１２８３Ａなど、１つ以上の突然変異を任意選択でＨＥＰＮドメイン内に含み、それにより前記複合体はエピジェネティックモディファイヤー又は転写若しくは翻訳活性化若しくは抑制シグナルを送達することができる、請求項１～７又は５８～５９のいずれか一項に記載の方法、組成物、又は使用。
  9. 前記機能ドメインが前記標的遺伝子座の転写又は翻訳を改変する、請求項８に記載の方法、組成物、又は使用。
  10. 前記目的の標的遺伝子座が細胞内の核酸分子に含まれる、請求項１～９又は５８～５９のいずれか一項に記載の方法、組成物、又は使用。
  11. 前記改変がインビボ又はエキソビボである、請求項１～１０又は５８～５９のいずれか一項に記載の方法、組成物、又は使用。
  12. 前記エフェクタータンパク質と複合体化したとき、１つ又は複数の前記核酸成分が、前記目的の標的遺伝子座の標的配列に対する前記複合体の配列特異的結合を生じさせる能力を有する、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法、組成物、又は使用。
  13. １つ又は複数の前記核酸成分がデュアルダイレクトリピート配列を含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法、組成物、又は使用。
  14. 前記エフェクタータンパク質及び１つ又は複数の前記核酸成分が、前記ポリペプチド及び／又は１つ又は複数の前記核酸成分をコードする１つ以上のポリヌクレオチド分子によって提供され、及び前記１つ以上のポリヌクレオチド分子が前記ポリペプチド及び／又は１つ又は複数の前記核酸成分を発現するように作動可能に構成される、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法、組成物、又は使用。
  15. 前記１つ以上のポリヌクレオチド分子が、前記ポリペプチド及び／又は１つ又は複数の前記核酸成分を発現するように作動可能に構成された１つ以上の調節エレメントを含み、任意選択で前記１つ以上の調節エレメントが１つ又は複数のプロモーター又は１つ又は複数の誘導性プロモーターを含む、請求項１４に記載の方法、組成物、又は使用。
  16. 前記１つ以上のポリヌクレオチド分子が１つ以上のベクター内に含まれる、請求項１４又は１５に記載の方法、組成物、又は使用。
  17. 前記１つ以上のポリヌクレオチド分子が１つのベクター内に含まれる、請求項１４又は１５に記載の方法、組成物、又は使用。
  18. 前記１つ以上のベクターがウイルスベクターを含む、請求項１６又は１７に記載の方法、組成物、又は使用。
  19. 前記１つ以上のウイルスベクターが、１つ以上のレトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴又は単純ヘルペスウイルスベクターを含む、請求項１８に記載の方法、組成物、又は使用。
  20. 前記１つ以上のポリヌクレオチド分子が送達系に含まれる、請求項１４又は１５に記載の方法、組成物、又は使用、又は前記１つ以上のベクターが送達系に含まれる、請求項１６又は１７に記載の方法、組成物、又は使用、又は前記アセンブルされた複合体が送達系に含まれる、請求項１～１３又は５８～５９のいずれか一項に記載の方法、組成物、又は使用。
  21. 前記天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物が、１つ又は複数のリポソーム、１つ又は複数の粒子、１つ又は複数のエキソソーム、１つ又は複数の微小胞、遺伝子銃又は１つ以上のウイルスベクターを含む送達媒体によって送達される、請求項１～２０のいずれか一項に記載の方法、組成物、又は使用。
  22. 請求項１～２１のいずれか一項に定義されるとおりの特徴を有する組成物である、天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物。
  23. １つ以上のＮＬＳ又はＮＥＳに融合したＣ２ｃ２エフェクタータンパク質と１つ以上の核酸成分とを含む天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物であって、ここで少なくとも前記１つ以上の核酸成分はエンジニアリングされ、前記１つ以上の核酸成分が複合体を目的の哺乳類標的に導き、及び前記エフェクタータンパク質が前記１つ以上の核酸成分と複合体を形成し、及び前記複合体が前記目的の標的遺伝子座に結合する、組成物。
  24. 前記目的の標的遺伝子座がＲＮＡを含む、請求項２３に記載の組成物。
  25. 前記目的の標的遺伝子座の前記改変が鎖切断を含む、請求項２３又は２４に記載の組成物。
  26. 前記Ｃ２ｃ２エフェクタータンパク質が哺乳類細胞での発現にコドン最適化される、請求項２３又は２４に記載の組成物。
  27. 前記Ｃ２ｃ２エフェクタータンパク質が１つ以上の機能ドメインに会合し；及び任意選択で前記エフェクタータンパク質が、Ｒ５９７Ａ、Ｈ６０２Ａ、Ｒ１２７８Ａ、及び／又はＨ１２８３Ａなど、１つ以上の突然変異を任意選択でＨＥＰＮドメイン内に含み、それにより前記複合体はエピジェネティックモディファイヤー又は転写若しくは翻訳活性化若しくは抑制シグナルを送達することができる、請求項２３又は２４に記載の組成物。
  28. 前記機能ドメインが前記標的遺伝子座の転写又は翻訳を改変する、請求項２７に記載の組成物。
  29. 前記目的の標的遺伝子座が細胞内の核酸分子に含まれる、請求項２７又は２８に記載の組成物。
  30. 前記エフェクタータンパク質と複合体化したとき、１つ又は複数の前記核酸成分が、前記目的の標的遺伝子座の標的配列に対する前記複合体の配列特異的結合を生じさせる能力を有する、請求項２７～２９のいずれか一項に記載の組成物。
  31. １つ又は複数の前記核酸成分がデュアルダイレクトリピート配列を含む、請求項２７～３０のいずれか一項に記載の組成物。
  32. 前記エフェクタータンパク質及び１つ又は複数の前記核酸成分が、前記ポリペプチド及び／又は１つ又は複数の前記核酸成分をコードする１つ以上のポリヌクレオチド分子によって提供され、及び前記１つ以上のポリヌクレオチド分子が前記ポリペプチド及び／又は１つ又は複数の前記核酸成分を発現するように作動可能に構成される、請求項２７～３１のいずれか一項に記載の組成物。
  33. 前記１つ以上のポリヌクレオチド分子が、前記ポリペプチド及び／又は１つ又は複数の前記核酸成分を発現するように作動可能に構成された１つ以上の調節エレメントを含み、任意選択で前記１つ以上の調節エレメントが１つ又は複数のプロモーター又は１つ又は複数の誘導性プロモーターを含む、請求項３２に記載の組成物。
  34. 前記１つ以上のポリヌクレオチド分子が１つ以上のベクター内に含まれる、請求項３２又は３３に記載の組成物。
  35. 前記１つ以上のポリヌクレオチド分子が１つのベクター内に含まれる、請求項３２又は３３に記載の組成物。
  36. 前記１つ以上のベクターがウイルスベクターを含む、請求項３４又は３５に記載の組成物。
  37. 前記１つ以上のウイルスベクターが、１つ以上のレトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴又は単純ヘルペスウイルスベクターを含む、請求項３６に記載の組成物。
  38. 前記１つ以上のポリヌクレオチド分子が送達系に含まれる、請求項３２又は３３に記載の組成物、又は前記１つ以上のベクターが送達系に含まれる、請求項３４又は３５に記載の組成物、又は前記アセンブルされた複合体が送達系に含まれる、請求項２３～３１のいずれか一項に記載の組成物。
  39. 前記天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物が、１つ又は複数のリポソーム、１つ又は複数の粒子、１つ又は複数のエキソソーム、１つ又は複数の微小胞、遺伝子銃又は１つ以上のウイルスベクターを含む送達媒体によって送達される、請求項１～３８のいずれか一項に記載の組成物。
  40. １つ以上のベクターを含むベクター系であって、前記１つ以上のベクターが、請求項１～３９のいずれか一項に定義されるとおりの特徴を有する組成物である天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物の構成成分をコードする１つ以上のポリヌクレオチド分子を含む、ベクター系。
  41. 請求項１～４０のいずれか一項に定義されるとおりの特徴を有する組成物である、天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物のＣ２ｃ２エフェクタータンパク質及び１つ以上の核酸成分を送達するように構成された送達系。
  42. １つ以上のベクター又は１つ以上のポリヌクレオチド分子を含み、前記１つ以上のベクター又はポリヌクレオチド分子が、請求項１～４１のいずれか一項に定義されるとおりの特徴を有する前記天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物の前記Ｃ２ｃ２エフェクタータンパク質及び１つ以上の核酸成分をコードする１つ以上のポリヌクレオチド分子を含む、請求項４１に記載の送達系。
  43. 治療的処置方法における使用のための先行する又は後続の請求項のいずれか一項に記載の天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物、ベクター系、又は送達系。
  44. 先行する又は後続の請求項のいずれか一項に記載の方法により改変された、又は組成物又はその構成成分を任意選択で誘導可能に又は構成的に含む又は発現するようにエンジニアリングされた哺乳類細胞。
  45. 前記改変が、
    －少なくとも１つのＲＮＡ産物の転写又は翻訳の変化を含む前記細胞；
    －少なくとも１つのＲＮＡ産物の転写又は翻訳の変化を含む前記細胞であって、前記少なくとも１つの産物の発現が増加するもの；又は
    －少なくとも１つのＲＮＡ産物の転写又は翻訳の変化を含む前記細胞であって、前記少なくとも１つ産物の発現が低下するもの
    をもたらす、請求項４４に記載の哺乳類細胞。
  46. 哺乳類細胞におけるインビボ又はエキソビボでの使用：
    －ＲＮＡ配列特異的干渉、
    －ＲＮＡ配列特異的遺伝子調節、
    －ＲＮＡ又はＲＮＡ産物又はｌｉｎｃＲＮＡ又は非コードＲＮＡ、又は核ＲＮＡ、又はｍＲＮＡのスクリーニング、
    －突然変異誘発、
    －蛍光インサイチュハイブリダイゼーション、
    －育種、
    －インビトロ又はインビボでの細胞の休眠の誘導、
    －インビトロ又はインビボでの細胞周期停止の誘導、
    －インビトロ又はインビボでの細胞成長及び／又は細胞増殖の低減、
    －インビトロ又はインビボでの細胞アネルギーの誘導、
    －インビトロ又はインビボでの細胞アポトーシスの誘導、
    －インビトロ又はインビボでの細胞壊死の誘導、
    －インビトロ又はインビボでの細胞死の誘導、又は
    －インビトロ又はインビボでのプログラム細胞死の誘導
    のための、請求項１～４５のいずれか一項に記載の天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物、ベクター系、又は送達系。
  47. 請求項４４又は４５に記載の細胞、又はその子孫の、又はそれを含む細胞株。
  48. 請求項４４又は４５に記載の１つ以上の細胞を含む哺乳類。
  49. 請求項４４又は４５に記載の１つ以上の細胞を含む哺乳類モデルであって；１つ又は複数の前記細胞が、請求項１～４８のいずれか一項に記載の組成物又はその構成成分を任意選択で誘導可能に又は構成的に発現する、哺乳類モデル。
  50. 請求項４４又は４５に記載の細胞、又は請求項４７又は４８に記載の細胞株又は生物又は請求項４９に記載の哺乳類モデルからの産物であって；前記細胞又は前記細胞株若しくは哺乳類若しくは哺乳類モデルの１つ又は複数の細胞が、請求項１～４９のいずれか一項に記載の組成物又はその構成成分を任意選択で誘導可能に又は構成的に発現する、産物。
  51. 産物量が、請求項１～５０のいずれか一項に記載の方法又は組成物による変化又は改変を有していない細胞からの産物量より多い又は少ない、請求項５０に記載の産物。
  52. 前記産物が、請求項１～５１のいずれか一項に記載の方法又は組成物による変化又は改変を有していない前記細胞からの産物と比較して変化する、請求項５０に記載の産物。
  53. 先行する又は後続の請求項のいずれか一項に記載の系又は方法又は細胞を含むアッセイ、スクリーニング方法又は突然変異誘発方法。
  54. ＲＮＡベースのアッセイ、スクリーニング方法又は突然変異誘発方法における、向上が含み、ＲＮＡを使用する代わりに、前記方法が、請求項１～５３のいずれか一項に記載の組成物を使用することを含む、方法
  55. 前記ＲＮＡベースのアッセイ、スクリーニング方法又は突然変異誘発方法がＲＮＡｉ又は蛍光インサイチュハイブリダイゼーション方法である、請求項５３に記載の方法。
  56. 好ましくはインビボ又はエキソビボでの、哺乳類細胞における
    －ＲＮＡ配列特異的干渉、
    －ＲＮＡ配列特異的遺伝子調節、
    －ＲＮＡ又はＲＮＡ産物又はｌｉｎｃＲＮＡ又は非コードＲＮＡ、又は核ＲＮＡ、又はｍＲＮＡのスクリーニング、
    －突然変異誘発、
    －蛍光インサイチュハイブリダイゼーション、
    －育種、
    －インビトロ又はインビボでの細胞の休眠の誘導、
    －インビトロ又はインビボでの細胞周期停止の誘導、
    －インビトロ又はインビボでの細胞成長及び／又は細胞増殖の低減、
    －インビトロ又はインビボでの細胞アネルギーの誘導、
    －インビトロ又はインビボでの細胞アポトーシスの誘導、
    －インビトロ又はインビボでの細胞壊死の誘導、
    －インビトロ又はインビボでの細胞死の誘導、又は
    －インビトロ又はインビボでのプログラム細胞死の誘導；
    のための、請求項１～５５のいずれか一項に記載の天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物、ベクター系、又は送達系の使用。
  57. 前記方法が、
    －ＲＮＡ配列特異的干渉、
    －ＲＮＡ配列特異的遺伝子調節、
    －ＲＮＡ又はＲＮＡ産物又はｌｉｎｃＲＮＡ又は非コードＲＮＡ、又は核ＲＮＡ、又はｍＲＮＡのスクリーニング、
    －突然変異誘発、
    －蛍光インサイチュハイブリダイゼーション、
    －育種、
    －インビトロ又はインビボでの細胞の休眠の誘導、
    －インビトロ又はインビボでの細胞周期停止の誘導、
    －インビトロ又はインビボでの細胞成長及び／又は細胞増殖の低減、
    －インビトロ又はインビボでの細胞アネルギーの誘導、
    －インビトロ又はインビボでの細胞アポトーシスの誘導、
    －インビトロ又はインビボでの細胞壊死の誘導、
    －インビトロ又はインビボでの細胞死の誘導、又は
    －インビトロ又はインビボでのプログラム細胞死の誘導
    をもたらす、請求項１～２１のいずれか一項に記載の方法又は使用。
  58. 哺乳類細胞における
    －ＲＮＡ配列特異的干渉、
    －ＲＮＡ配列特異的遺伝子調節、
    －ＲＮＡ又はＲＮＡ産物又はｌｉｎｃＲＮＡ又は非コードＲＮＡ、又は核ＲＮＡ、又はｍＲＮＡのスクリーニング、
    －突然変異誘発、
    －蛍光インサイチュハイブリダイゼーション、
    －育種、
    －インビトロ又はインビボでの細胞の休眠の誘導、
    －インビトロ又はインビボでの細胞周期停止の誘導、
    －インビトロ又はインビボでの細胞成長及び／又は細胞増殖の低減、
    －インビトロ又はインビボでの細胞アネルギーの誘導、
    －インビトロ又はインビボでの細胞アポトーシスの誘導、
    －インビトロ又はインビボでの細胞壊死の誘導、
    －インビトロ又はインビボでの細胞死の誘導、又は
    －インビトロ又はインビボでのプログラム細胞死の誘導
    のための方法であって、
    請求項１～５７のいずれか一項に記載の天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物、ベクター系、又は送達系をインビトロ、エキソビボ、又はインビボで標的細胞に導入又は誘導することを含む、方法。
  59. 目的の哺乳類標的遺伝子座の翻訳を調節する方法であって、１つ以上の局在化シグナル並びに翻訳アクチベーター又は翻訳リプレッサーなどの（異種）翻訳調節因子に融合したＣ２ｃ２エフェクタータンパク質と；１つ以上の核酸成分とを含む天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物を前記遺伝子座に送達することを含み、ここで少なくとも前記１つ以上の核酸成分はエンジニアリングされ、前記１つ以上の核酸成分が複合体を前記目的の標的に導き、及び前記エフェクタータンパク質が前記１つ以上の核酸成分と複合体を形成し、及び前記複合体が前記目的の標的遺伝子座に結合し、好ましくは前記異種ドメインがＥＩＦ４ＥなどのＥＩＦ４である、方法。
  60. 前記Ｃ２ｃ２エフェクタータンパク質が触媒不活性である、請求項５９に記載の方法。
  61. 前記Ｃ２ｃ２が、レプトトリキア・シャーイイ（Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ ｓｈａｈｉｉ）Ｃ２ｃ２、レプトトリキア・ウエイデイ（Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ ｗａｄｅｉ）Ｆ０２７９（Ｌｗ２）Ｃ２ｃ２、リステリア・ゼーリゲリ（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｓｅｅｌｉｇｅｒｉ）Ｃ２ｃ２、ラクノスピラ科（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ）細菌ＭＡ２０２０ Ｃ２ｃ２、ラクノスピラ科（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ）細菌ＮＫ４Ａ１７９ Ｃ２ｃ２、クロストリジウム・アミノフィルム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｍｉｎｏｐｈｉｌｕｍ）ＤＳＭ １０７１０ Ｃ２ｃ２、カルノバクテリウム・ガリナルム（Ｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）ＤＳＭ ４８４７ Ｃ２ｃ２、カルノバクテリウム・ガリナルム（Ｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）ＤＳＭ ４８４７ Ｃ２ｃ２、パルディバクター・プロピオニシゲネス（Ｐａｌｕｄｉｂａｃｔｅｒ ｐｒｏｐｉｏｎｉｃｉｇｅｎｅｓ）ＷＢ４ Ｃ２ｃ２、リステリア・ウェイヘンステファネンシス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｗｅｉｈｅｎｓｔｅｐｈａｎｅｎｓｉｓ）ＦＳＬ Ｒ９－０３１７、Ｃ２ｃ２、リステリア科（Ｌｉｓｔｅｒｉａｃｅａｅ）細菌ＦＳＬ Ｍ６－０６３５ Ｃ２ｃ２、レプトトリキア・ウエイデイ（Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ ｗａｄｅｉ）Ｆ０２７９ Ｃ２ｃ２、ロドバクター・カプスラータス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ）ＳＢ １００３ Ｃ２ｃ２、ロドバクター・カプスラータス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ）Ｒ１２１ Ｃ２ｃ２、ロドバクター・カプスラータス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ）ＤＥ４４２ Ｃ２ｃ２を含む群から選択される、請求項１～６０のいずれか一項に記載の方法、組成物、使用、ベクター系、送達系、細胞、哺乳類、哺乳類モデル、産物、又はアッセイ。
  62. 前記Ｃ２ｃ２が、レプトトリキア・ウエイデイ（Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ ｗａｄｅｉ）Ｆ０２７９（Ｌｗ又はＬｗ２）Ｃ２ｃ２又はリステリア・ニューヨーケンシス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｎｅｗｙｏｒｋｅｎｓｉｓ）ＦＳＬ Ｍ６－０６３５（ＬｂＦＳＬ）Ｃ２ｃ２である、請求項１～５９のいずれか一項に記載の方法、組成物、使用、ベクター系、送達系、細胞、哺乳類、哺乳類モデル、産物、又はアッセイ。
  63. 試料中の標的ＲＮＡを検出する方法であって、
    （ａ）前記試料を
    ｉ）ＲＮＡを切断する能力を有するＶＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタータンパク質、
    ｉｉ）前記標的ＲＮＡにハイブリダイズする能力を有するガイドＲＮＡ、及び
    ｉｉｉ）前記エフェクタータンパク質によって非特異的且つ検出可能に切断される能力を有するＲＮＡベースの切断誘導可能レポーター
    とインキュベートすること、
    （ｂ）前記ＲＮＡベースの切断誘導可能レポーターの切断によって生成されるシグナルに基づき前記標的ＲＮＡを検出すること
    を含む方法。
  64. 前記ＶＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタータンパク質がＣ２ｃ２エフェクタータンパク質である、請求項６３に記載の方法。
  65. 前記ＲＮＡベースの切断誘導可能レポーター構築物が蛍光色素及び消光剤を含む、請求項６３に記載の方法。
  66. 前記試料が無細胞生体試料を含む、請求項６３に記載の方法。
  67. 前記試料が細胞試料を含む、請求項６３に記載の方法。
  68. 前記細胞試料が植物細胞を含む、請求項６７に記載の方法。
  69. 前記細胞試料が動物細胞を含む、請求項６７に記載の方法。
  70. 前記細胞試料が癌細胞を含む、請求項６７に記載の方法。
  71. 前記標的ＲＮＡが病原体ＲＮＡを含む、請求項６３に記載の方法。
  72. 前記病原体が、ウイルス、細菌、真菌、又は寄生虫を含む、請求項７１に記載の方法。
  73. 標的ＲＮＡの一塩基変異多型又はＲＮＡ転写物のスプライス変異体を検出するように設計されたガイドＲＮＡを含む、請求項６３に記載の方法。
  74. 前記ガイドＲＮＡが標的ＲＮＡとのミスマッチヌクレオチドを１つ以上含む、請求項６３に記載の方法。
  75. 前記ガイドＲＮＡが、疾患状態の診断指標となる標的分子に結合する、請求項６３に記載の方法。
  76. 前記疾患状態が癌を含む、請求項７５に記載の方法。
  77. 前記疾患状態が自己免疫疾患を含む、請求項７５に記載の方法。
  78. 前記Ｃ２ｃ２エフェクタータンパク質が、レプトトリキア属（Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ）、リステリア属（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）、コリネバクター属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒ）、ステレラ属（Ｓｕｔｔｅｒｅｌｌａ）、レジオネラ属（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）、トレポネーマ属（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ）、フィリファクター属（Ｆｉｌｉｆａｃｔｏｒ）、ユーバクテリウム属（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、マイコプラズマ属（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）、バクテロイデス属（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）、フラビイボラ属（Ｆｌａｖｉｉｖｏｌａ）、フラボバクテリウム属（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、スフェロヘータ属（Ｓｐｈａｅｒｏｃｈａｅｔａ）、アゾスピリラム属（Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）、グルコンアセトバクター属（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、ナイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、ロゼブリア属（Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ）、パルビバクラム属（Ｐａｒｖｉｂａｃｕｌｕｍ）、スタフィロコッカス属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、ニトラチフラクター属（Ｎｉｔｒａｔｉｆｒａｃｔｏｒ）、マイコプラズマ属（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）及びカンピロバクター属（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）からなる群から選択される生物由来である、請求項６３に記載の方法。
  79. リボ核酸（ＲＮＡ）検出系であって、
    ａ）ＲＮＡを切断する能力を有するＶＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタータンパク質、
    ｂ）標的ＲＮＡに結合する能力を有するガイドＲＮＡ、及び
    ｃ）前記エフェクタータンパク質によって非特異的且つ検出可能に切断される能力を有するＲＮＡベースの切断誘導可能レポーター
    を含む、ＲＮＡ検出系。
  80. 前記ＶＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタータンパク質がＣ２ｃ２エフェクタータンパク質である、請求項７９に記載のＲＮＡ検出系。
  81. 前記ＲＮＡベースの切断誘導可能レポーター構築物が蛍光色素及び消光剤を含む、請求項７９に記載のＲＮＡ検出系。
  82. 前記ＶＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタータンパク質が、レプトトリキア・シャーイイ（Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ ｓｈａｈｉｉ）Ｃ２ｃ２、ラクノスピラ科（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ）細菌ＭＡ２０２０ Ｃ２ｃ２、ラクノスピラ科（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ）細菌ＮＫ４Ａ１７９ Ｃ２ｃ２、クロストリジウム・アミノフィルム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｍｉｎｏｐｈｉｌｕｍ）（ＤＳＭ １０７１０）Ｃ２ｃ２、カルノバクテリウム・ガリナルム（Ｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）（ＤＳＭ ４８４７）Ｃ２ｃ２、パルディバクター・プロピオニシゲネス（Ｐａｌｕｄｉｂａｃｔｅｒ ｐｒｏｐｉｏｎｉｃｉｇｅｎｅｓ）（ＷＢ４）Ｃ２ｃ２、リステリア・ウェイヘンステファネンシス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｗｅｉｈｅｎｓｔｅｐｈａｎｅｎｓｉｓ）（ＦＳＬ Ｒ９－０３１７）Ｃ２ｃ２、リステリア科（Ｌｉｓｔｅｒｉａｃｅａｅ）細菌（ＦＳＬ Ｍ６－０６３５）Ｃ２ｃ２、リステリア・ニューヨーケンシス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｎｅｗｙｏｒｋｅｎｓｉｓ）（ＦＳＬ Ｍ６－０６３５）Ｃ２ｃ２、レプトトリキア・ウエイデイ（Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ ｗａｄｅｉ）（Ｆ０２７９）Ｃ２ｃ２、ロドバクター・カプスラータス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ）（ＳＢ １００３）Ｃ２ｃ２、ロドバクター・カプスラータス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ）（Ｒ１２１）Ｃ２ｃ２、ロドバクター・カプスラータス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ）（ＤＥ４４２）Ｃ２ｃ２、レプトトリキア・ウエイデイ（Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ ｗａｄｅｉ）（Ｌｗ２）Ｃ２ｃ２、又はリステリア・ゼーリゲリ（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｓｅｅｌｉｇｅｒｉ）Ｃ２ｃ２のうちのいずれかの野生型配列と少なくとも８０％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含む、請求項６３に記載の方法又は請求項７９に記載のＲＮＡ検出系。
  83. 前記ＶＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタータンパク質が少なくとも１つのＨＥＰＮドメインを含む、請求項６３に記載の方法又は請求項７９に記載のＲＮＡ検出系。
  84. 前記ＶＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタータンパク質が２つのＨＥＰＮドメインを含む、請求項６３に記載の方法又は請求項７９に記載のＲＮＡ検出系。
  85. 前記ＶＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタータンパク質が、ＲｘｘｘｘＨモチーフを含む少なくとも１つの触媒活性ＨＥＰＮドメインを含む、請求項６３に記載の方法又は請求項７９に記載のＲＮＡ検出系。
  86. 前記ＶＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタータンパク質が、ＲｘｘｘｘＨモチーフを各々含む２つの触媒活性ＨＥＰＮドメインを含む、請求項６３に記載の方法又は請求項７９に記載のＲＮＡ検出系。
  87. 前記ＶＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタータンパク質が、野生型ＲｘｘｘｘＨモチーフのＲ又はＨのうちの少なくとも一方の突然変異から得られる少なくとも１つの触媒不活性ＨＥＰＮドメインを含む、請求項６３に記載の方法又は請求項７９に記載のＲＮＡ検出系。
  88. 前記ＶＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタータンパク質が、野生型ＲｘｘｘｘＨモチーフのＲ又はＨのうちの少なくとも一方の突然変異から各々得られる２つの触媒不活性ＨＥＰＮドメインを含む、請求項６３に記載の方法又は請求項７９に記載のＲＮＡ検出系。
  89. ａ）ＲＮＡを切断する能力を有するＶＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタータンパク質、及び
    ｂ）前記エフェクタータンパク質によって非特異的且つ検出可能に切断される能力を有するＲＮＡベースの切断誘導可能レポーター
    を含む、キット。
  90. ２つの異なる触媒不活性Ｃ２ｃ２エフェクタータンパク質を含む組成物。
  91. 前記異なるＣ２ｃ２エフェクタータンパク質の各々が異なるレポーター分子に連結される、請求項９０に記載の組成物。
  92. 前記レポーター分子が、異なるエピトープタグ及び／又は蛍光（ｆｌｏｕｒｅｓｃｅｎｔ）分子から個別に選択される、請求項９０又は９１に記載の組成物。研究及び診断用途並びに好ましくは多色イメージングのための、請求項９０～９２のいずれか一項に記載の組成物の使用。
  93. １つ以上の改変された又は突然変異したアミノ酸残基を有するＣ２ｃ２エフェクタータンパク質であって、前記１つ以上の改変された又は突然変異したアミノ酸残基が、Ｃ２ｃ２コンセンサス付番に基づいて、Ｋ２、Ｋ３９、Ｖ４０、Ｅ４７９、Ｌ５１４、Ｖ５１８、Ｎ５２４、Ｇ５３４、Ｋ５３５、Ｅ５８０、Ｌ５９７、Ｖ６０２、Ｄ６３０、Ｆ６７６、Ｌ７０９、Ｉ７１３、Ｒ７１７（ＨＥＰＮ）、Ｎ７１８、Ｈ７２２（ＨＥＰＮ）、Ｅ７７３、Ｐ８２３、Ｖ８２８、Ｉ８７９、Ｙ８８０、Ｆ８８４、Ｙ９９７、Ｌ１００１、Ｆ１００９、Ｌ１０１３、Ｙ１０９３、Ｌ１０９９、Ｌ１１１１、Ｙ１１１４、Ｌ１２０３、Ｄ１２２２、Ｙ１２４４、Ｌ１２５０、Ｌ１２５３、Ｋ１２６１、Ｉ１３３４、Ｌ１３５５、Ｌ１３５９、Ｒ１３６２、Ｙ１３６６、Ｅ１３７１、Ｒ１３７２、Ｄ１３７３、Ｒ１５０９（ＨＥＰＮ）、Ｈ１５１４（ＨＥＰＮ）、Ｙ１５４３、Ｄ１５４４、Ｋ１５４６、Ｋ１５４８、Ｖ１５５１、Ｉ１５５８に対応するＣ２ｃ２のアミノ酸残基のうちの１つ以上であり、好ましくは、Ｃ２ｃ２コンセンサス付番に基づいて、Ｋ２、Ｋ３９、Ｖ４０、Ｅ４７９、Ｌ５１４、Ｖ５１８、Ｎ５２４、Ｇ５３４、Ｋ５３５、Ｅ５８０、Ｄ６３０、Ｆ６７６、Ｌ７０９、Ｉ７１３、Ｒ７１７（ＨＥＰＮ）、Ｎ７１８、Ｈ７２２（ＨＥＰＮ）、Ｅ７７３、Ｐ８２３、Ｖ８２８、Ｉ８７９、Ｙ８８０、Ｆ８８４、Ｙ９９７、Ｌ１００１、Ｆ１００９、Ｌ１０１３、Ｙ１０９３、Ｌ１０９９、Ｌ１１１１、Ｙ１１１４、Ｌ１２０３、Ｄ１２２２、Ｙ１２４４、Ｌ１２５０、Ｌ１２５３、Ｋ１２６１、Ｉ１３３４、Ｌ１３５５、Ｌ１３５９、Ｒ１３６２、Ｙ１３６６、Ｅ１３７１、Ｒ１３７２、Ｄ１３７３、Ｒ１５０９（ＨＥＰＮ）、Ｈ１５１４（ＨＥＰＮ）、Ｙ１５４３、Ｄ１５４４、Ｋ１５４６、Ｋ１５４８、Ｖ１５５１、Ｉ１５５８に対応するＣ２ｃ２のアミノ酸残基のうちの１つ以上から選択されるか；
    前記１つ以上の改変された又は突然変異したアミノ酸残基が、図６７に示されるとおりのコンセンサス配列に基づいて、Ｍ３５、Ｋ３６、Ｔ３８、Ｋ３９、Ｉ５７、Ｅ６５、Ｇ６６、Ｌ６８、Ｎ８４、Ｔ８６、Ｅ８８、Ｉ１０３、Ｎ１０５、Ｅ１２３、Ｒ１２８、Ｒ１２９、Ｋ１３９、Ｌ１５２、Ｌ１９４、Ｎ１９６、Ｋ１９８、Ｎ２０１、Ｙ２２２、Ｄ２５３、Ｉ２６６、Ｆ２６７、Ｓ２８０、Ｉ３０３、Ｎ３０６、Ｒ３３１、Ｙ３３８、Ｋ３８９、Ｙ３９０、Ｋ３９１、Ｉ４３４、Ｋ４３５、Ｌ４５８、Ｄ４５９、Ｅ４６２、Ｌ４６３、Ｉ４７８、Ｅ４７９、Ｋ４９４、Ｒ４９５、Ｎ４９８、Ｓ５０１、Ｅ５１９、Ｎ５２４、Ｙ５２９、Ｖ５３０、Ｇ５３４、Ｋ５３５、Ｙ５３９、Ｔ５４９、Ｄ５５１、Ｒ５７７、Ｅ５８０、Ａ５８１、Ｆ５８２、Ｉ５８７、Ａ５９３、Ｌ５９７、Ｉ６０１、Ｌ６０２、Ｅ６１１、Ｅ６１３、Ｄ６３０、Ｉ６３１、Ｇ６３３、Ｋ６４１、Ｎ６４６、Ｖ６６９、Ｆ６７６、Ｓ６７８、Ｎ６９５、Ｅ７０３、Ａ７０７、Ｉ７０９、Ｉ７１３、Ｉ７１６、Ｒ７１７、Ｈ７２２、Ｆ７４０、Ｆ７４２、Ｋ７６８、Ｉ７７４、Ｋ７７８、Ｉ７８３、Ｌ７８７、Ｓ７８９、Ｖ７９２、Ｙ７９６、Ｄ７９９、Ｆ８１２、Ｎ８１８、Ｐ８２０、Ｆ８２１、Ｖ８２２、Ｐ８２３、Ｓ８２４、Ｆ８２５、Ｙ８２９、Ｋ８３１、Ｄ８３７、Ｌ８５２、Ｆ８５８、Ｅ８６７、Ａ８７１、Ｌ８７５、Ｋ８７７、Ｙ８８０、Ｙ８８１、Ｆ８８４、Ｆ８８８、Ｆ８９６、Ｎ９０１、Ｖ９０３、Ｎ９１５、Ｋ９１６、Ｒ９１８、Ｑ９２０、Ｅ９５１、Ｐ９５６、Ｙ９５９、Ｑ９６４、Ｉ９６９、Ｎ９９４、Ｆ１０００、Ｉ１０００１、Ｑ１００３、Ｆ１０００５、Ｋ１００７、Ｇ１００８、Ｆ１００９、Ｎ１０１９、Ｌ１０２０、Ｋ１０２１、Ｉ１０２３、Ｎ１０２８、Ｅ１０７０、Ｉ１０７５、Ｋ１０７６、Ｆ１０９２、Ｋ１０９７、Ｌ１０９９、Ｌ１１０４、Ｌ１１０７、Ｋ１１１３、Ｙ１１１４、Ｅ１１４９、Ｅ１１５１、Ｉ１１５３、Ｌ１１５５、Ｌ１１５８、Ｄ１１６６、Ｌ１２０３、Ｄ１２２２、Ｇ１２２４、Ｉ１２２８、Ｒ１２３６、Ｋ１２４３、Ｙ１２４４、Ｇ１２４５、Ｄ１２５５、Ｋ１２６１、Ｓ１２６３、Ｌ１２６７、Ｅ１２６９、Ｋ１２７４、Ｉ１２７７、Ｅ１２７８、Ｌ１２８９、Ｈ１２９０、Ａ１２９４、Ｎ１３２０、Ｋ１３２５、Ｅ１３２７、Ｙ１３２８、Ｉ１３３４、Ｙ１３３７、Ｋ１３４１、Ｎ１３４２、Ｋ１３４３、Ｎ１３５０、Ｌ１３５２、Ｌ１３５５、Ｌ１３５６、Ｉ１３５９、Ｌ１３６０、Ｒ１３６２、Ｖ１３６３、Ｇ１３６４、Ｙ１３６５、Ｉ１３６９、Ｒ１３７１、Ｄ１３７２、Ｆ１３８５、Ｅ１３９１、Ｄ１４５９、Ｋ１４６３、Ｋ１４６６、Ｒ１５０９、Ｎ１５１０、Ｉ１５１２、Ａ１５１３、Ｈ１５１４、Ｎ１５１６、Ｙ１５１７、Ｌ１５２９、Ｌ１５３０、Ｅ１５３４、Ｌ１５３６、Ｒ１５３７、Ｙ１５４３、Ｄ１５４４、Ｒ１５４５、Ｋ１５４６、Ｌ１５４７、Ｋ１５４８、Ｎ１５４９、Ａ１５５０、Ｋ１５５３、Ｓ１５５４、Ｄ１５５７、Ｉ１５５８、Ｌ１５５９、Ｇ１５６３、Ｆ１５６８、Ｉ１６１２、Ｌ１６５１、Ｅ１６５２、Ｋ１６５５、Ｈ１６５８、Ｌ１６５９、Ｋ１６６３、Ｔ１６７３、Ｓ１６７７、Ｅ１６７８、Ｅ１６７９、Ｃ１６８１、Ｖ１６８４、Ｋ１６８５、Ｅ１６８９に対応するＣ２ｃ２のアミノ酸残基のうちの１つ以上であるか；又は
    前記１つ以上の改変された又は突然変異したアミノ酸残基が、図６６に示されるとおりのコンセンサス配列に基づいて、Ｋ２８、Ｋ３１、Ｒ４４、Ｅ１６２、Ｅ１８４、Ｋ２６２、Ｅ２８８、Ｋ３５７、Ｅ３６０、Ｋ３３８、Ｒ４４１（ＨＥＰＮ）、Ｈ４４６（ＨＥＰＮ）、Ｅ４７１、Ｋ４８２、Ｋ５２５、Ｋ５５８、Ｄ７０７、Ｒ７９０、Ｋ８１１、Ｒ８３３、Ｅ８３９、Ｒ８８５、Ｅ８９４、Ｒ８９５、Ｄ８９６、Ｋ９４２、Ｒ９６０（ＨＥＰＮ）、Ｈ９６５（ＨＥＰＮ）、Ｄ９９０、Ｋ９９２、Ｋ９９４に対応するＣ２ｃ２のアミノ酸残基のうちの１つ以上である、Ｃ２ｃ２エフェクタータンパク質。
  94. 目的の標的遺伝子座を改変する方法であって、請求項９３に記載のＣ２ｃ２エフェクタータンパク質と１つ以上の核酸成分とを含む天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物を前記遺伝子座に送達することを含み、ここで少なくとも前記１つ以上の核酸成分はエンジニアリングされ、前記１つ以上の核酸成分が複合体を前記目的の標的に導き、及び前記エフェクタータンパク質が前記１つ以上の核酸成分と複合体を形成し、及び前記複合体が前記目的の標的遺伝子座に結合する、方法。
  95. 請求項１に記載のＣ２ｃ２エフェクタータンパク質と１つ以上の核酸成分とを含む天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物であって、ここで少なくとも前記１つ以上の核酸成分は目的の標的遺伝子座の改変における使用のためにエンジニアリングされ、前記１つ以上の核酸成分が複合体を前記目的の標的に導き、及び前記エフェクタータンパク質が前記１つ以上の核酸成分と複合体を形成し、及び前記複合体が前記目的の標的遺伝子座に結合する、組成物。
  96. 請求項９３に記載のＣ２ｃ２エフェクタータンパク質と１つ以上の核酸成分とを含む天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物の使用であって、ここで少なくとも前記１つ以上の核酸成分は目的の標的遺伝子座を改変するためにエンジニアリングされ、前記１つ以上の核酸成分が複合体を前記目的の標的に導き、及び前記エフェクタータンパク質が前記１つ以上の核酸成分と複合体を形成し、及び前記複合体が前記目的の標的遺伝子座に結合する、使用。
  97. 前記目的の標的遺伝子座がＲＮＡを含む、請求項９３～９６のいずれか一項に記載の方法、組成物、又は使用。
  98. 前記目的の標的遺伝子座の前記改変が鎖切断を含む、請求項９３～９７のいずれか一項に記載の方法。
  99. 前記Ｃ２ｃ２エフェクタータンパク質が真核細胞での発現にコドン最適化される、請求項９３～９８のいずれか一項に記載の方法、組成物、又は使用。
  100. 前記Ｃ２ｃ２エフェクタータンパク質が１つ以上の機能ドメインに会合し；及び任意選択で前記エフェクタータンパク質が、Ｒ５９７Ａ、Ｈ６０２Ａ、Ｒ１２７８Ａ、及び／又はＨ１２８３Ａなど、１つ以上の突然変異を任意選択でＨＥＰＮドメイン内に含み、それにより前記複合体はエピジェネティックモディファイヤー又は転写若しくは翻訳活性化若しくは抑制シグナルを送達することができる、請求項９３～９９のいずれか一項に記載の方法、組成物、又は使用。
  101. 前記機能ドメインが前記標的遺伝子座の転写又は翻訳を改変する、請求項１００に記載の方法、組成物、又は使用。
  102. 前記Ｃ２ｃ２エフェクタータンパク質が少なくとも１つ以上の核局在化シグナル又は核外移行シグナルを含む、請求項９３～１０１のいずれか一項に記載の方法、組成物、又は使用。
  103. 前記目的の標的遺伝子座がインビトロで核酸分子に含まれる、請求項９３～１０２のいずれか一項に記載の方法、組成物、又は使用。
  104. 前記目的の標的遺伝子座が細胞内の核酸分子に含まれる、請求項９３～１０のいずれか一項に記載の方法、組成物、又は使用。
  105. 前記細胞が原核細胞を含む、請求項１０４に記載の方法、組成物、又は使用。
  106. 前記細胞が真核細胞を含む、請求項１２に記載の方法。
  107. 前記改変がインビトロ、インビボ又はエキソビボである、請求項９３～１０６のいずれか一項に記載の方法、組成物、又は使用。
  108. 前記エフェクタータンパク質と複合体化したとき、１つ又は複数の前記核酸成分が、前記目的の標的遺伝子座の標的配列に対する前記複合体の配列特異的結合を生じさせる能力を有する、請求項９３～１０７のいずれか一項に記載の方法、組成物、又は使用。
  109. １つ又は複数の前記核酸成分がデュアルダイレクトリピート配列を含む、請求項９３～１０８のいずれか一項に記載の方法、組成物、又は使用。
  110. 前記エフェクタータンパク質及び１つ又は複数の前記核酸成分が、前記ポリペプチド及び／又は１つ又は複数の前記核酸成分をコードする１つ以上のポリヌクレオチド分子によって提供され、及び前記１つ以上のポリヌクレオチド分子が前記ポリペプチド及び／又は１つ又は複数の前記核酸成分を発現するように作動可能に構成される、請求項９３～１０９のいずれか一項に記載の方法、組成物、又は使用。
  111. 前記１つ以上のポリヌクレオチド分子が、前記ポリペプチド及び／又は１つ又は複数の前記核酸成分を発現するように作動可能に構成された１つ以上の調節エレメントを含み、任意選択で前記１つ以上の調節エレメントが１つ又は複数のプロモーター又は１つ又は複数の誘導性プロモーターを含む、請求項１１０に記載の方法、組成物、又は使用。
  112. 前記１つ以上のポリヌクレオチド分子が１つ以上のベクター内に含まれる、請求項１１０又は１１１に記載の方法、組成物、又は使用。
  113. 前記１つ以上のポリヌクレオチド分子が１つのベクター内に含まれる、請求項１１０又は１１１に記載の方法、組成物、又は使用。
  114. 前記１つ以上のベクターがウイルスベクターを含む、請求項１１２又は１１３に記載の方法、組成物、又は使用。
  115. 前記１つ以上のウイルスベクターが、１つ以上のレトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴又は単純ヘルペスウイルスベクターを含む、請求項１１４に記載の方法、組成物、又は使用。
  116. 前記１つ以上のポリヌクレオチド分子が送達系に含まれる、請求項１１０又は１１１に記載の方法、組成物、又は使用、又は前記１つ以上のベクターが送達系に含まれる、請求項１１２又は１１３に記載の方法、組成物、又は使用、又は前記アセンブルされた複合体が送達系に含まれる、請求項９３～１０９のいずれか一項に記載の方法、組成物、又は使用。
  117. 前記天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物が、１つ又は複数のリポソーム、１つ又は複数の粒子、１つ又は複数のエキソソーム、１つ又は複数の微小胞、遺伝子銃又は１つ以上のウイルスベクターを含む送達媒体によって送達される、請求項９３～１１６のいずれか一項に記載の方法、組成物、又は使用。
  118. 請求項９３～１１７のいずれか一項に定義されるとおりの特徴を有する組成物である、天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物。
  119. Ｃ２ｃ２エフェクタータンパク質と１つ以上の核酸成分とを含む天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物であって、ここで少なくとも前記１つ以上の核酸成分はエンジニアリングされ、前記１つ以上の核酸成分が複合体を前記目的の標的に導き、及び前記エフェクタータンパク質が前記１つ以上の核酸成分と複合体を形成し、及び前記複合体が前記目的の標的遺伝子座に結合する、組成物。
  120. 前記目的の標的遺伝子座がＲＮＡを含む、請求項１１９に記載の組成物。
  121. 前記目的の標的遺伝子座の前記改変が鎖切断を含む、請求項１１９又は１２０に記載の組成物。
  122. 前記Ｃ２ｃ２エフェクタータンパク質が真核細胞での発現にコドン最適化される、請求項１１９又は１２０に記載の組成物。
  123. 前記Ｃ２ｃ２エフェクタータンパク質が１つ以上の機能ドメインに会合し；及び任意選択で前記エフェクタータンパク質が、Ｒ５９７Ａ、Ｈ６０２Ａ、Ｒ１２７８Ａ、及び／又はＨ１２８３Ａなど、１つ以上の突然変異を任意選択でＨＥＰＮドメイン内に含み、それにより前記複合体はエピジェネティックモディファイヤー又は転写若しくは翻訳活性化若しくは抑制シグナルを送達することができる、請求項１１９又は１２０に記載の組成物。
  124. 前記機能ドメインが前記標的遺伝子座の転写又は翻訳を改変する、請求項１２３に記載の組成物。
  125. 前記Ｃ２ｃ２エフェクタータンパク質が少なくとも１つ以上の核局在化シグナルを含む、請求項１１９～１２４のいずれか一項に記載の組成物。
  126. 前記目的の標的遺伝子座がインビトロで核酸分子に含まれる、請求項１１９に記載の組成物。
  127. 前記目的の標的遺伝子座が細胞内の核酸分子に含まれる、請求項１１９に記載の組成物。
  128. 前記細胞が原核細胞を含む、請求項１２７に記載の組成物。
  129. 前記細胞が真核細胞を含む、請求項１２７に記載の組成物。
  130. 前記エフェクタータンパク質と複合体化したとき、１つ又は複数の前記核酸成分が、前記目的の標的遺伝子座の標的配列に対する前記複合体の配列特異的結合を生じさせる能力を有する、請求項１１９～１２９のいずれか一項に記載の組成物。
  131. １つ又は複数の前記核酸成分がデュアルダイレクトリピート配列を含む、請求項１１９～１３０のいずれか一項に記載の組成物。
  132. 前記エフェクタータンパク質及び１つ又は複数の前記核酸成分が、前記ポリペプチド及び／又は１つ又は複数の前記核酸成分をコードする１つ以上のポリヌクレオチド分子によって提供され、及び前記１つ以上のポリヌクレオチド分子が前記ポリペプチド及び／又は１つ又は複数の前記核酸成分を発現するように作動可能に構成される、請求項１１９～１２７のいずれか一項に記載の組成物。
  133. 前記１つ以上のポリヌクレオチド分子が、前記ポリペプチド及び／又は１つ又は複数の前記核酸成分を発現するように作動可能に構成された１つ以上の調節エレメントを含み、任意選択で前記１つ以上の調節エレメントが１つ又は複数のプロモーター又は１つ又は複数の誘導性プロモーターを含む、請求項１２８に記載の組成物。
  134. 前記１つ以上のポリヌクレオチド分子が１つ以上のベクター内に含まれる、請求項１３２又は１３３に記載の組成物。
  135. 前記１つ以上のポリヌクレオチド分子が１つのベクター内に含まれる、請求項１３２又は１３３に記載の組成物。
  136. 前記１つ以上のベクターがウイルスベクターを含む、請求項１３４又は１３５に記載の組成物。
  137. 前記１つ以上のウイルスベクターが、１つ以上のレトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴又は単純ヘルペスウイルスベクターを含む、請求項１３６に記載の組成物。
  138. 前記１つ以上のポリヌクレオチド分子が送達系に含まれる、請求項１３２又は１３３に記載の組成物、又は前記１つ以上のベクターが送達系に含まれる、請求項１３４又は１３５に記載の組成物、又は前記アセンブルされた複合体が送達系に含まれる、請求項１１９～１２７のいずれか一項に記載の組成物。
  139. 前記天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物が、１つ又は複数のリポソーム、１つ又は複数の粒子、１つ又は複数のエキソソーム、１つ又は複数の微小胞、遺伝子銃又は１つ以上のウイルスベクターを含む送達媒体によって送達される、請求項１～１３８のいずれか一項に記載の組成物。
  140. １つ以上のベクターを含むベクター系であって、前記１つ以上のベクターが、請求項１～１３９のいずれか一項に定義されるとおりの特徴を有する組成物である天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物の構成要素をコードする１つ以上のポリヌクレオチド分子を含む、ベクター系。
  141. 請求項１～１４０のいずれか一項に定義されるとおりの特徴を有する組成物である、天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物のＣ２ｃ２エフェクタータンパク質及び１つ以上の核酸成分を送達するように構成された送達系。
  142. 請求項１４１に記載の送達系であって、１つ以上のベクター又は１つ以上のポリヌクレオチド分子を含み、前記１つ以上のベクター又はポリヌクレオチド分子が、請求項１～１４１のいずれか一項に定義されるとおりの特徴を有する天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物の前記Ｃ２ｃ２エフェクタータンパク質及び１つ以上の核酸成分をコードする１つ以上のポリヌクレオチド分子を含む、送達系。
  143. 治療的処置方法における使用のための先行する又は後続の請求項のいずれか一項に記載の天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物、ベクター系、又は送達系。
  144. 先行する又は後続の請求項のいずれか一項に記載の方法により改変された、又は組成物若しくはその構成成分を任意選択で誘導可能に又は構成的に含む若しくは発現するようにエンジニアリングされた細胞。
  145. 前記改変が、
    －少なくとも１つのＲＮＡ産物の転写又は翻訳の変化を含む前記細胞；
    －少なくとも１つのＲＮＡ産物の転写又は翻訳の変化を含む前記細胞であって、前記少なくとも１つの産物の発現が増加するもの；又は
    －少なくとも１つのＲＮＡ産物の転写又は翻訳の変化を含む前記細胞であって、前記少なくとも１つ産物の発現が低下するもの
    をもたらす、請求項１４４に記載の細胞。
  146. 真核細胞を含む、請求項１４５に記載の細胞。
  147. 哺乳類細胞を含む、請求項１４４又は１４５に記載の細胞。
  148. 原核細胞を含む、請求項１４４に記載の細胞。
  149. －ＲＮＡ配列特異的干渉、
    －ＲＮＡ配列特異的遺伝子調節、
    －ＲＮＡ又はＲＮＡ産物又はｌｉｎｃＲＮＡ又は非コードＲＮＡ、又は核ＲＮＡ、又はｍＲＮＡのスクリーニング、
    －突然変異誘発、
    －蛍光インサイチュハイブリダイゼーション、
    －育種、
    －インビトロ又はインビボでの細胞の休眠の誘導、
    －インビトロ又はインビボでの細胞周期停止の誘導、
    －インビトロ又はインビボでの細胞成長及び／又は細胞増殖の低減、
    －インビトロ又はインビボでの細胞アネルギーの誘導、
    －インビトロ又はインビボでの細胞アポトーシスの誘導、
    －インビトロ又はインビボでの細胞壊死の誘導、
    －インビトロ又はインビボでの細胞死の誘導、又は
    －インビトロ又はインビボでのプログラム細胞死の誘導
    における使用のための、請求項１～１４８のいずれか一項に記載の天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物、ベクター系、又は送達系。
  150. 請求項１４４～１４８のいずれか一項に記載の細胞、又はその子孫の、又はそれを含む細胞株。
  151. 請求項１４６又は１４７に記載の１つ以上の細胞を含む多細胞生物。
  152. 請求項１４４～１４７のいずれか一項に記載の１つ以上の細胞を含む植物又は動物モデルであって；１つ又は複数の前記細胞が、請求項１～１５１のいずれか一項に記載の組成物又はその構成成分を任意選択で誘導可能に又は構成的に発現する、植物又は動物モデル。
  153. 請求項１４４～１４８、１５０～１５２のいずれか一項に記載の細胞、又は細胞株又は生物、又は植物若しくは動物モデルからの産物であって；前記細胞又は細胞株又は生物又は植物若しくは動物モデルの１つ又は複数の細胞が、請求項１～１５２のいずれか一項に記載の前記組成物又はその構成成分を任意選択で誘導可能に又は構成的に発現する、産物。
  154. 産物量が、請求項１～１５３のいずれか一項に記載の方法又は組成物による変化又は改変を有していない細胞からの産物量より多い又は少ない、請求項１５３に記載の産物。
  155. 前記産物が、請求項１～１５４のいずれか一項に記載の方法又は組成物による変化又は改変を有していない前記細胞からの産物と比較して変化する、請求項１５３に記載の産物。
  156. 先行する又は後続の請求項のいずれか一項に記載のシステム又は方法又は細胞を含むアッセイ、スクリーニング方法又は突然変異誘発方法。
  157. ＲＮＡベースのアッセイ、スクリーニング方法又は突然変異誘発方法における、向上が含み、ＲＮＡを使用する代わりに、前記方法が、請求項１～１５６のいずれか一項に記載の組成物を使用することを含む、方法。
  158. 前記ＲＮＡベースのアッセイ、スクリーニング方法又は突然変異誘発方法がＲＮＡｉ又は蛍光インサイチュハイブリダイゼーション方法である、請求項１５７に記載の方法。
  159. －ＲＮＡ配列特異的干渉、
    －ＲＮＡ配列特異的遺伝子調節、
    －ＲＮＡ又はＲＮＡ産物又はｌｉｎｃＲＮＡ又は非コードＲＮＡ、又は核ＲＮＡ、又はｍＲＮＡのスクリーニング、
    －突然変異誘発、
    －蛍光インサイチュハイブリダイゼーション、
    －育種、
    －インビトロ又はインビボでの細胞の休眠の誘導、
    －インビトロ又はインビボでの細胞周期停止の誘導、
    －インビトロ又はインビボでの細胞成長及び／又は細胞増殖の低減、
    －インビトロ又はインビボでの細胞アネルギーの誘導、
    －インビトロ又はインビボでの細胞アポトーシスの誘導、
    －インビトロ又はインビボでの細胞壊死の誘導、
    －インビトロ又はインビボでの細胞死の誘導、又は
    －インビトロ又はインビボでのプログラム細胞死の誘導
    のための、請求項１～１５８のいずれか一項に記載の天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物、ベクター系、又は送達系の使用。
  160. 前記方法が、
    －ＲＮＡ配列特異的干渉、
    －ＲＮＡ配列特異的遺伝子調節、
    －ＲＮＡ又はＲＮＡ産物又はｌｉｎｃＲＮＡ又は非コードＲＮＡ、又は核ＲＮＡ、又はｍＲＮＡのスクリーニング、
    －突然変異誘発、
    －蛍光インサイチュハイブリダイゼーション、
    －育種、
    －インビトロ又はインビボでの細胞の休眠の誘導、
    －インビトロ又はインビボでの細胞周期停止の誘導、
    －インビトロ又はインビボでの細胞成長及び／又は細胞増殖の低減、
    －インビトロ又はインビボでの細胞アネルギーの誘導、
    －インビトロ又はインビボでの細胞アポトーシスの誘導、
    －インビトロ又はインビボでの細胞壊死の誘導、
    －インビトロ又はインビボでの細胞死の誘導、又は
    －インビトロ又はインビボでのプログラム細胞死の誘導
    をもたらす、請求項９３～１１７のいずれか一項に記載の方法又は使用。
  161. －ＲＮＡ配列特異的干渉、
    －ＲＮＡ配列特異的遺伝子調節、
    －ＲＮＡ又はＲＮＡ産物又はｌｉｎｃＲＮＡ又は非コードＲＮＡ、又は核ＲＮＡ、又はｍＲＮＡのスクリーニング、
    －突然変異誘発、
    －蛍光インサイチュハイブリダイゼーション、
    －育種、
    －インビトロ又はインビボでの細胞の休眠の誘導、
    －インビトロ又はインビボでの細胞周期停止の誘導、
    －インビトロ又はインビボでの細胞成長及び／又は細胞増殖の低減、
    －インビトロ又はインビボでの細胞アネルギーの誘導、
    －インビトロ又はインビボでの細胞アポトーシスの誘導、
    －インビトロ又はインビボでの細胞壊死の誘導、
    －インビトロ又はインビボでの細胞死の誘導、又は
    －インビトロ又はインビボでのプログラム細胞死の誘導
    のための方法であって、請求項１～１６０のいずれか一項に記載の天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物、ベクター系、又は送達系をインビトロ、エキソビボ、又はインビボで標的細胞に導入又は誘導することを含む、方法。
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