CN107287238A

CN107287238A - 一种基因载体及其用于治疗雷柏氏先天性黑矇2型疾病的基因治疗药物

Info

Publication number: CN107287238A
Application number: CN201710230465.XA
Authority: CN
Inventors: 庞继景
Original assignee: Shenyang Fuming Biological Technology Co Ltd
Current assignee: Shenyang Weijing Biotechnology Co.,Ltd.
Priority date: 2016-04-11
Filing date: 2017-04-11
Publication date: 2017-10-24
Anticipated expiration: 2037-04-11
Also published as: CN107287238B

Abstract

本发明涉及一种基因治疗载体，该基因治疗载体用于治疗或预防由RPE65基因突变引起的2型Leber先天性黑蒙症(Leber’s congenital amaurosis,LCA2)。本发明的基因治疗载体包含人类视网膜色素上皮细胞主要蛋白65(hRPE65)、启动子及增加基因表达的血管紧张素II型受体内含子1。本发明还涉及包含上述基因治疗载体的药物及组合物。

Description

一种基因载体及其用于治疗雷柏氏先天性黑矇2型疾病的基因治疗药物

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，更具体地，本发明涉及一种用于LCA2的基因治疗载体及相关药物。

背景技术

Leber先天性黑蒙症(Leber’s congenital amaurosis,LCA)，是发生最早、最严重的遗传性视网膜病变,出生时或出生后一年内双眼锥杆细胞功能完全丧失，导致婴幼儿先天性盲。LCA占遗传性视网膜病变的5％以上，是导致儿童先天性盲的主要疾病(占10％-20％)。多呈常染色体隐性遗传，临床上以眼球震颤、固视障碍、畏光、指压眼球为特征。眼底检查早期多为正常，随着病变进行性进展，数年后可见眼底椒盐样色素沉着、骨细胞样色素、视网膜血管狭窄、广泛视网膜色素上皮和脉络膜萎缩。视网膜电图表现为a、b波平坦，甚至消失。可伴有圆锥角膜、远视、发育迟缓和神经系统异常等。

传统医疗手段对遗传性视网膜疾病没有作用，所以到目前为止这类疾病还处于无药可治的状态。近年来，随着基因检测技术的发展，我们逐渐了解这类隐性视网膜遗传病是由基因突变造成的相应功能性蛋白缺失导致的。

有研究发现18种与LCA相关的致病基因，主要包括视网膜色素上皮细胞蛋白65(retinal pigment epithelial(cells)65kDa protein，RPE65)，GUCY2D,CRX,RPGRIP1，CRBI和AIPL1等。其中以RPE65基因突变引起LCA2的研究最为深入和成熟。Leber先天性黑蒙中有约10％的患者为LCA2型，是由RPE65基因突变引起的。RPE65基因编码蛋白是一种相对分子质量为65KD的视网膜色素上皮的主要蛋白，帮助感光细胞制造视紫红质，而视紫红质是一种吸收光后能造成自身结构变化进而引起视讯号形成及传导的色素。RPE65能够催化全反式视黄醇异构化为11-顺-视黄醇，恢复视紫红质结构，维持视紫红质的再循环，维持视功能。Rpe65突变导致全反式视黄酯积累/不能再生视紫红质，造成视功能障碍。

随着生物技术的发展，基于腺相关病毒(Adeno-associated virus,AAV)载体的针对眼部特别是遗传性视网膜退行性病变的基因治疗方法受到了广泛的关注。但也有研究指出，应用重组病毒运送载体至眼内，同时在眼内表达治疗性的基因产物，还存在许多问题，如表达效率低，持续时间短，潜在的细胞毒性等。

因此，亟需找到一种可靠、有效的给药载体，达到持续、高效、安全地治疗LCA2的目的。

发明内容

本发明的目的在于提供一种腺相关病毒载体及其用于治疗LCA2的相关药物。

在本发明的第一方面，提供一种腺相关病毒载体，所述载体含有增强子、特异性或非特异性启动子、血管紧张素II型受体内含子1和人类视网膜色素上皮细胞主要蛋白65(hRPE65)的基因序列，所述的RPE65蛋白选自与SEQ ID NO:1有至少95％同源性的核苷酸序列；所述的血管紧张素II型受体内含子1选自与SEQ ID NO:2有至少90％同源性的核苷酸序列。

优选地，所述的RPE65蛋白选自与SEQ ID NO:1有至少96％、97％、98％、99％、100％同源性的核苷酸序列；所述的血管紧张素II型受体内含子1选自与SEQ ID NO:2有至少90％、95％、96％、97％、98％、99％、100％同源性的核苷酸序列。

更优选地，所述的RPE65蛋白的核苷酸序列含有SEQ ID NO:1；所述的血管紧张素II型受体内含子1的核苷酸序列含有SEQ ID NO:2。最优选地，所述的RPE65蛋白的核苷酸序列选自SEQ ID NO:1；所述的血管紧张素II型受体内含子1的核苷酸序列选自SEQ ID NO:2。

在上述任一优选例中，所述的非特异性启动子为Chicken beta-actin(CBA)的启动子，选自与SEQ ID NO:3有至少95％同源性的核苷酸序列。更优选地，所述的CBA的启动子选自与SEQ ID NO:3有至少96％、97％、98％、99％、100％同源性的核苷酸序列。最优选地，所述的CBA启动子的核苷酸序列选自SEQ ID NO:3。

在另一优选例中，所述的特异性启动子为视网膜色素上皮特异的VMD2启动子，选自与SEQ ID NO:4有至少95％同源性的核苷酸序列。优选地，所述的VMD2启动子选自与SEQID NO:4有至少96％、97％、98％、99％、100％同源性的核苷酸序列。更优选地，所述的(CBA)的启动子选自与SEQ ID NO:4有至少96％、97％、98％、99％、100％同源性的核苷酸序列；最优选地，所述的CBA启动子的核苷酸序列选自SEQ ID NO:3。

在另一优选例中，所述腺相关病毒载体的序列含有

(a)SEQ ID NO:1；和

(b)SEQ ID NO:2；和

(c)SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4。

在上述任一优选例中，增强子为CMV，选自与SEQ ID NO:5有至少95％同源性的核苷酸序列。更优选地，所述的CMV选自与SEQ ID NO:5有至少96％、97％、98％、99％、100％同源性的核苷酸序列。最优选地，所述的CBA启动子的核苷酸序列选自SEQ ID NO:5。

在上述任一优选例中，腺相关病毒可以选自AAV1，AAV2，AAV3，AAV4，AAV5，AAV6，AAV7，AAV8，AAV9，AAV10，AAV2-AAV3，AAVrh.10，AAVhu.14，AAV3a/3b，AAVrh32.33，AAV-HSC15，AAV-HSC17，AAVhu.37，AAVrh.8，CHt-P6，AAV2.5，AAV6.2，AAV2i8，AAV-HSC15/17，AAVM41，AAV9.45，AAV6(Y445F/Y731F)，AAV2.5T，AAV-HAE1/2，AAV clone 32/83，AAVShH10，AAV2(Y->F)，AAV8(Y733F)，AAV2.15，AAV2.4，AAVM41，AAVr3.45AAV2或AAV5。更优选地，腺相关病毒选自AAV2和AAV5。最优选地，腺相关病毒选自AAV2。

在上述任一优选例中，腺相关病毒为自我互补AAV。

在上述任一优选例中，所述载体还含有一段缩短的嵌合内含子，所述的嵌合内含子序列选自与SEQ ID NO:14有至少90％同源性的核苷酸序列。

在另一优选例中，所述的腺相关病毒载体序列含有SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7。

在本发明的另一方面，提供一种用于治疗LCA2的药物组合物，所述的腺相关病毒载体和药学上可接受的载体。

在本发明的另一方面，提供所述的腺相关病毒载体在制备治疗LCA2的药物中的应用。

在本发明的另一方面，提供一种基因治疗LCA2的方法，将所述的腺相关病毒载体眼内注射，恢复正常hRPE65蛋白的表达。优选地，所述的眼内注射是指视网膜下腔注射或玻璃体腔注射。

本发明的有益效果在于，采用血管紧张素II型受体内含子1增加hRPE65蛋白在视网膜的表达使之得以高效、持续和稳定的表达，并提高其对LCA2的治疗效果。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1.AAV2载体的质粒模式图。质粒包含CBA启动子驱动的hRPE65cDNA，CMV和angiotensin II type 2receptor(AT2R)Intron 1，SV40聚腺苷酸化信号，表达盒两侧是反向末端重复序列(TR)。

图2.pTR-CBA-hRPE65质粒的特征图。

图3.rd12小鼠在生后14天视网膜下腔注射AAV2-CBA-AT2R intron1-hRPE65后18个月时暗适应下视网膜电图(视杆细胞ERG)。左：rd12小鼠18个月后治疗眼ERG；右：同一只rd12小鼠另一只未治疗眼ERG。

图4.rd12小鼠在生后14天视网膜下腔注射AAV2-CBA-AT2R intron 1-hRPE65后18个月时的明适应下视网膜电图(视锥细胞ERG)。左：rd12小鼠注射18个月后治疗眼ERG；右：同一只rd12小鼠另一只未治疗眼ERG。

图5.小鼠眼底像。左：18个月龄rd12小鼠未治疗眼；中：同一只rd12小鼠另一只眼在生后14天治疗，治疗18个月后眼底；右：18个月龄正常C57小鼠眼底。

图6.小鼠视网膜光镜图片：A：18个月龄正常C57小鼠未注射眼；B：同一只正常C57小鼠另一只眼在生后14天注射治疗载体，18个月后；C：rd12小鼠在生后14天注射治疗载体，18个月后；D：同一只rd12小鼠另一只未治疗眼。标尺＝20微米。

图7.小鼠视网膜电镜图片：A：18个月龄正常C57小鼠未注射眼；B：同一只正常C57小鼠另一只眼在生后14天时注射治疗载体，18个月后；C：rd12小鼠在生后14天注射治疗载体，注射18个月后；D：同一只rd12小鼠另一只未治疗眼。标尺＝4微米。

图8.AAV2-CBA-AT2R Intron 1-hRPE65载体和AAV2-CBA-hRPE65载体暗适应下双眼视网膜电图对比。应用带有Rat AT2R Intron 1的AAV2-CBA-hRPE65和没有Rat AT2RIntron 1的AAV2-CBA-hRPE65载体注射同一只生后21天的rd12小鼠的右眼和左眼，1个月后暗适应下双眼视网膜电图(杆细胞ERG)。带有Rat AT2R Intron 1的AAV2-CBA-hRPE65载体和传统AAV2-CBA-hRPE65载体相比，注射眼的ERG b波波幅高20％。箭头所示为b波。波谷到波峰之间是b波波幅。

图9.含sCBA的AAV2载体的质粒模式图。

具体实施方式

本发明人经过研究，提供一种腺相关病毒载体及其用于治疗LCA2的相关药物、药物组合物等。

药物组合物及药盒

为了便于临床应用，本发明的药物组合物可以包含在注射用给药器(如注射用针)中，所述的注射用给药器中，可以包含一次给药量的所述的药物组合物。所述的注射用给药器可以被包含在药盒中，以方便储存、使用。运输时需要将装有药物悬浊液的微小容器放置于干冰中。平时应保存于-80C冰箱中。

本发明所述的药盒或试剂盒中，还可包括使用说明书，以利于本领域技术人员按照正确的方式使用。

如本文所用，“药学上可接受的”的成分是适用于人和/或哺乳动物而无过度不良副反应(如毒性)的，即具有合理的效益/风险比的物质。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。该术语指这样一些药剂载体：它们本身并不是必要的活性成分，且施用后没有过分的毒性。

合适的药学上可接受的载体是本领域普通技术人员所熟知的。在Remington’sPharmaceutical Sciences(Mack Pub.Co.，N.J.1991)中可找到关于药学上可接受的载体的充分说明。在组合物中药学上可接受的载体可含有液体，如水、BBS(Balanced SaltSolution)磷酸盐缓冲液、ringer溶液、生理盐水、平衡盐溶液、甘油或山梨醇等。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如润滑剂、助流剂、润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质和稳定剂，等。

基因治疗载体

本发明中的基因治疗载体是病毒表达载体。优选的，根据本发明，病毒表达载体是腺相关病毒(AVV)载体，诸如选自由血清型AAV1、2、3、4、5、6、7、8、9和10，或其衍生的嵌合AAV组成的组中的AAV载体如AAV2-AAV3，AAVrh.10，AAVhu.14，AAV3a/3b，AAVrh32.33，AAV-HSC15，AAV-HSC17，AAVhu.37，AAVrh.8，CHt-P6，AAV2.5，AAV6.2，AAV2i8，AAV-HSC15/17，AAVM41，AAV9.45，AAV6(Y445F/Y731F)，AAV2.5T，AAV-HAE1/2，AAV clone 32/83，AAVShH10，AAV2(Y->F)，AAV8(Y733F)，AAV2.15，AAV2.4，AAVM41，AAVr3.45AAV2或AAV5，这能更好地适于在感兴趣的组织中进行高效率的转导。在转染时，AAV只在宿主中引起轻微的免疫反应(如果有的话)。在本发明的优选实施方式中，基因治疗载体是AAV血清型2或5载体。在进一步优选的实施方式中，基因治疗载体是AAV 2载体。现有技术中认为，AAV包装治疗性基因的能力限制为约4.9kbp，而较长序列会导致AAV颗粒的截断(Wu et al.,2010,Mol Ther 18:80-86)。然而，本文中表明，5.4kbp的超大DNA序列(包括两个反向末端重复序列(ITR)，在CBA或视网膜色素上皮特异的启动子VMD2启动子控制下的AT2R intron 1和hRPE65cDNA，以及SV40多聚腺苷酸信号)的包装，不影响AAV5或AAV2的产生以及hRPE65的高效表达。

本发明所述的AAV载体包括单链AAV和自我互补AAV(self-complementary AAV，scAAV)。采用scAAV可以使hRPE65的表达更强，由于载体容量的限制，采用scAAV时，可以使用sCBA。sCBA包含了CBA启动子(SEQ ID NO:3)的序列和其下游一段缩短的嵌合内含子(shortened chimeric Intron1)序列(SEQ ID NO:14)。

可根据标准技术产生重组病毒载体。例如，重组腺相关病毒载体能在人293细胞(其提供反式E1A和E1B特性)中传播，以达到在10⁷～10¹³个病毒颗粒/mL范围内的滴度。在体内应用之前，病毒载体可通过凝胶过滤方法(诸如琼脂糖柱)进行脱盐，并通过随后的过滤进行纯化。纯化降低给药载体的主体中潜在的有害作用。所给药的病毒基本上不含野生型病毒和可复制型病毒。能通过合适的方法，诸如十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，随后进行银染，来证明病毒的纯度。

用于人的AAV的合适剂量在约1×10¹⁰～1×10¹⁴个病毒颗粒的范围内。

基因治疗载体是眼内注射给药的，可以采用视网膜下腔或玻璃体腔注射给药。下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

本发明实施例中如无特别说明，所用的实验动物、试剂和实验仪器和方法如下所述：

实验动物：正常C57BL/6J小鼠购自上海斯莱克实验动物有限责任公司。rd12小鼠(自然产生的具有RPE65蛋白缺失的)购自美国Jackson实验室。光照周期12h光照-12h黑暗，自由采食，自由饮水，于14天或21天时对其进行视网膜下腔注射。所有的动物研究严格按照国家科学技术委员会颁发的《实验动物管理条例》进行。

主要试剂、耗材：生理盐水(浙江天瑞药业有限公司)；荧光素钠(美国Alcon公司)；30^1/2gauge一次性注射针头(美国Becton Dickinson and Company公司)；1％阿托品滴眼液(美国Alcon公司)；复方托吡卡胺滴眼液(沈阳兴齐眼药股份有限公司)；盐酸四环素氢化可的松眼膏(南京白敬宇制药有限责任公司)。抗红/绿锥视蛋白(Anti-M-Opsin)、蓝锥视蛋白(Anti-S-Opsin)(一抗)多克隆抗体(IgG)(AB5405，AB5407),山羊抗兔IgG-Cy3(二抗)多克隆抗体(AP187C，德国Millipore公司)。牛血清蛋白(Bovine serum albumin，BSA)(北京生兴生物有限公司)，聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)(上海碧云天生物技术研究所)，4％多聚甲醛(北京海德生物有限公司)。

主要仪器：眼科实验手术显微镜(日本Nikon公司)；眼科显微器械(苏州明仁医疗器械有限公司)；微量进样器(美国Hamilton公司)；MicronⅣ视网膜影像系统(美国PhoenixResearch Labs公司)；视觉电生理检测系统(德国Roland Consult公司)；蔡司明视野显微镜(德国Carl Zesis公司)。

视网膜下腔注射：小鼠经充分散瞳后全身麻醉，在眼科专用手术显微镜直视下，在角巩膜缘内侧瞳孔范围内用30^1/2gauge的一次性尖针头穿刺角膜，避免伤及虹膜和晶状体，然后用带33gauge平针头的微量进样器沿穿刺口进入，针头绕过晶体后到达玻璃体，然后逐渐进针至神经视网膜层和视网膜色素上皮(RPE)层之间的潜在视网膜腔隙并缓慢推注，注射量为1ul。注射载体悬浊液中添加0.1％荧光素钠染料(安全浓度)，方便观察注射是否成功及网脱范围。注射过程中，眼表滴2.5％羟丙基甲基纤维素以便于随时观察眼底情况。手术显微镜下如清楚看到眼底局部视网膜呈圆形隆起且网膜隆起下方可见绿色，证明注射成功。一定时间后小泡消失，视网膜局部隆起变平。术中如不能看到视网膜隆起及其下方的绿色或看到视网膜有大出血等并发症，则另选小鼠重新注射。术毕涂1％阿托品眼膏和四环素可的松眼膏，以后每隔1天重复一次，共三次，以减少炎症反应、防止感染。注射后18个月处死动物取眼球进行病理检测。

每只小鼠一侧眼注射1μl滴度为1×10¹³的AAV2-CBA-AT2R intron 1-hPRE65(治疗眼)，另一侧眼则不注射作为对照(未治疗眼或未注射眼)。

实施例1、腺病毒载体的构建和分离纯化

质粒pTR-CBA-AT2R intron 1-hPRE65的构建如图1、图2所示，主要元件包括CMV增强子、CBA启动子、AT2R内含子1以及人PRE65(hPRE65)的cDNA。CMV增强子和特有的AT2R内含子1都可以增强转入基因的表达。目的基因cDNA之后紧接着是SV40聚腺苷酸化信号(SEQ IDNO:9)，表达盒两侧是反向末端重复序列(TR)，即病毒载体包括ITR5’(SEQ ID NO:8)，ITR3’(SEQ ID NO:10)，病毒载体还包括ColE1ori(SEQ ID NO:11)，Amp(r)(SEQ ID NO:12)和f1(+)origin(SEQ ID NO:13)。

病毒载体是通过质粒共转染方法获得的。将含有AAV2外壳蛋白基因和能帮助AAV复制的基因的辅助质粒和pTR-CBA-hPRE65质粒与HEK 293T细胞共转染，初步形成重组腺相关病毒载体。经碘克丁醇初步纯化后，经过以5ml-Hitrp Q琼脂糖凝胶作为填料的快速蛋白液相色谱仪通过离子交换层析进一步纯化(使用仪器为Pharmacia AKTA FPLC system(Amersham Biosciences,Piscataway,NJ))。之后用pH8.0，215mM的NaCl淋洗琼脂糖凝胶柱，对峰值的重组病毒载体进行收集。收集的液体通过浓缩器(100K concentrater,Millipore)后，用含0.014％的吐温20淋洗浓缩器对重组病毒载体进行浓缩。再用DNase I消化掉病毒颗粒以外DNA，并通过实时荧光定量PCR的方法确定病毒的滴度。最后用硝酸银染色-SDS聚丙烯酰氨凝胶电泳法确保病毒载体颗粒没被污染且不含内毒素，并分装零下80度储存。

病毒载体pTR-CBA-AT2R intron 1-hPRE65的特征图谱如图1所示，各元件的起止位点如图2所示。

pTR-VMD2-AT2R intron 1-hPRE65(SEQ ID NO:7)的构建与pTR-CBA-AT2R intron1-hPRE65(SEQ ID NO:6)的构建方法相同，区别仅在于采用视网膜色素上皮特异的VMD2启动子代替CBA。

pTR-sCBA-AT2R intron 1-hPRE65的构建方式如图9所示，与pTR-CBA-AT2Rintron 1-hPRE65的构建方法相同，区别仅在于采用sCBA代替CBA，包含CBA启动子(SEQ IDNO:3)的序列和其下游一段缩短的嵌合内含子(shortened chimeric Intron1)序列(SEQID NO:14)。

实施例2、视网膜电图ERG检测及视杆细胞和视锥细胞电生理测定(图3和图4)

实验方法：小鼠视网膜下腔注射后不同时间进行视网膜电图(electroretinogram，ERG)检测。暗适应过夜，为消除不同时间检测对ERG幅值产生的影响，检测均设在下午，在暗室内暗红光照下操作(>650nm)。小鼠放置在37℃恒温台上，眼表滴一滴复方托吡卡胺滴眼液后行全身麻醉，剪去胡须。将参考电极和接地电极插入头部和尾根部皮下，一对金制的环形电极放置在角膜表面，滴少量0.5％羟甲基纤维素滴眼液于角膜表面湿润保护角膜及降低干扰，增强导电性。全视野暗适应ERG在-1.85和0log cd·s/m²光强度下记录，明适应ERG在0.65log cd·s/m²光强度下记录，在明适应ERG记录之前小鼠在背景光强度为30cd·s/m²下照射10min。

结果：自然产生的具有RPE65蛋白缺失的rd12模式小鼠在生后14天一只眼接受视网膜下腔注射AAV2-CBA-AT2R intron 1-hRPE65载体，另一只对照眼不注射。18个月后治疗眼恢复的视网膜杆细胞功能，即暗适应下视网膜电流图(ERG)在不同刺激强度下仍然存在；未注射眼无任何视网膜杆细胞功能(图3)。

自然产生的具有RPE65蛋白缺失的rd12模式小鼠在生后14天一只眼接受视网膜下腔注射AAV2-CBA-AT2R Intron 1-hRPE65载体，另一只对照眼不注射。18个月后治疗眼恢复的视网膜锥细胞功能，即明适应下视网膜电流图(ERG)在不同刺激强度下仍然存在，且波形很高；未治疗眼视网膜锥细胞功能很差，在最强光线刺激下只有很小的波峰延迟的ERG波形(图4)。

特别重要的是，加入Rat AT2R Intron 1的AAV2-CBA-hRPE65和没有Rat AT2RIntron 1的AAV2-CBA-hRPE65载体注射同一只生后21天的rd12小鼠的右眼和左眼相比，1个月后暗适应下双眼视网膜电图(杆细胞ERG)显示带有Rat AT2R Intron 1的AAV2-CBA-hRPE65载体和传统AAV2-CBA-hRPE65载体相比，注射眼的ERG b波波幅提高20％，显示AAV2-CBA-AT2R Intron 1-hRPE65的优异效果(图8)。

实施例3、眼底检测

实验方法：小鼠全身麻醉后，剪去鼠须，复方托吡卡胺滴眼液散瞳，并在整个操作过程中用羟丙甲纤维素滴眼液湿润角膜，保证屈光间质透明。小鼠置于小动物台上，暴露鼠眼并调整镜头方向，直至视网膜目标血管在屏幕清晰可见，采用Kowa小动物眼底照相机拍摄的(Kowa Genesis small animal fundus camera，托兰斯，加利福尼亚州)拍摄彩色眼底像。

结果：自然产生的具有RPE65蛋白缺失的rd12模式小鼠在生后14天一只眼接受视网膜下腔注射AAV2-CBA-hRPE65载体，另一只对照眼不注射。18个月后未注射眼眼底发现有大量均匀分布的黄白色小点；而注射眼的眼底虽然仍然可以看到视网膜下腔注射的痕迹，但和正常小鼠基本相似，未见明显的黄白色小点(图5)。

实施例4、视网膜光镜或电镜检测

在前面的实施例中，本发明人已通过多项体内外实验部分证实了AAV2-CBA-AT2Rintron 1-hRPE65的治疗作用，本实施例中，本发明人进一步采用光镜和透射电镜观察神经视网膜的显微和超微结构的形态学改变，进一步证实AAV2-CBA-AT2R intron 1-hRPE65的治疗作用。

实验方法：

组织病理学：ERG检测结束后小鼠用颈椎脱臼法处死，充分暴露眼球后使用显微系线镊夹住眼球底部向上提起，用剪刀剪断眼球周围的结膜和肌肉组织，眼球完整取出后放于10％的甲醛中固定24h后，剪去角膜、虹膜和晶状体做成眼杯。然后在自动组织脱水机(KD-TS3，中国)上脱水，脱水结束后浸蜡24h，制成蜡块。使用石蜡切片机做5um切片进行苏木精-伊红(hematoxylin and eosin,H&E)染色。使用蔡司明视野显微镜观察视网膜结构变化并拍照。

光镜和透射电镜：小鼠视网膜下腔注射给药后18个月，摘出rd12小鼠和年龄相匹配的C57B L/6J小鼠的的双眼，按预先描述的过程制备眼杯用于光镜和透射电子显微镜检查。每个年龄组2-6只眼。眼球摘除后立即浸没到含4％戊二醛的0.1M磷酸缓冲液的冷固定液中。移除角膜后的眼在固定液中保留24小时。晶状体在用一系列浓度递增的乙醇脱水后移除。将眼杯嵌入到环氧树脂的混合物中。在每一个样本中，0.5μm的薄片用蓝色的甲苯胺褪色后用于光学显微镜检查，而极薄的切片标本用于电子显微镜检查。

结果：rd12模式小鼠在生后14天一只眼接受视网膜下腔注射AAV2-CBA-hRPE65载体，另一只对照眼不注射。18个月后rd12小鼠未注射眼视网膜外核层只剩下5-6层；而注射眼的外核层还有9-10层，和正常鼠注射相同的载体后外核层层数相似，也和正常未进行视网膜下腔注射的正常小鼠的10-12层的外核层差距不大。同时rd12小鼠未注射眼视细胞外节明显变短，只有正常未注射眼的一半；而rd12注射眼的视细胞外节虽然比正常未注射眼要稍短，但和正常鼠注射相同的载体后视细胞外节长度相似(图6)。

电镜结果显示在未治疗rd12小鼠眼视网膜色素上皮细胞内有大量的脂滴样沉着，同时视细胞外节已明显变性变短，剩余部分呈紊乱样排列；rd12治疗眼和注射相同载体的正常C57鼠一样，视网膜色素上皮细胞内不见脂滴样沉着；而且大部分视细胞外节仍然存在，但比正常C57小鼠未注射眼略短(图7)。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 沈阳复明生物技术有限公司

<120> 一种基因载体及其用于治疗雷柏氏先天性黑矇2型疾病的基因治疗药物

<130> 2017

<160> 14

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1633

<212> DNA

<213> 人

<400> 1

atgtctatcc aggttgagca tcctgctggt ggttacaaga aactgtttga aactgtggag 60

gaactgtcct cgccgctcac agctcatgta acaggcagga tccccctctg gctcaccggc 120

agtctccttc gatgtgggcc aggactcttt gaagttggat ctgagccatt ttaccacctg 180

tttgatgggc aagccctcct gcacaagttt gactttaaag aaggacatgt cacataccac 240

agaaggttca tccgcactga tgcttacgta cgggcaatga ctgagaaaag gatcgtcata 300

acagaatttg gcacctgtgc tttcccagat ccctgcaaga atatattttc caggtttttt 360

tcttactttc gaggagtaga ggttactgac aatgcccttg ttaatgtcta cccagtgggg 420

gaagattact acgcttgcac agagaccaac tttattacaa agattaatcc agagaccttg 480

gagacaatta agcaggttga tctttgcaac tatgtctctg tcaatggggc cactgctcac 540

ccccacattg aaaatgatgg aaccgtttac aatattggta attgctttgg aaaaaatttt 600

tcaattgcct acaacattgt aaagatccca ccactgcaag cagacaagga agatccaata 660

agcaagtcag agatcgttgt acaattcccc tgcagtgacc gattcaagcc atcttacgtt 720

catagttttg gtctgactcc caactatatc gtttttgtgg agacaccagt caaaattaac 780

ctgttcaagt tcctttcttc atggagtctt tggggagcca actacatgga ttgttttgag 840

tccaatgaaa ccatgggggt ttggcttcat attgctgaca aaaaaaggaa aaagtacctc 900

aataataaat acagaacttc tcctttcaac ctcttccatc acatcaacac ctatgaagac 960

aatgggtttc tgattgtgga tctctgctgc tggaaaggat ttgagtttgt ttataattac 1020

ttatatttag ccaatttacg tgagaactgg gaagaggtga aaaaaaatgc cagaaaggct 1080

ccccaacctg aagttaggag atatgtactt cctttgaata ttgacaaggc tgacacaggc 1140

aagaatttag tcacgctccc caatacaact gccactgcaa ttctgtgcag tgacgagact 1200

atctggctgg agcctgaagt tctcttttca gggcctcgtc aagcatttga gtttcctcaa 1260

atcaattacc agaagtattg tgggaaacct tacacatatg cgtatggact tggcttgaat 1320

cactttgttc cagataggct ctgtaagctg aatgtcaaaa ctaaagaaac ttgggtttgg 1380

caagagcctg attcataccc atcagaaccc atctttgttt ctcacccaga tgccttggaa 1440

gaagatgatg gtgtagttct gagtgtggtg gtgagcccag gagcaggaca aaagcctgct 1500

tatctcctga ttctgaatgc caaggactta agtgaagttg cccgggctga agtggagatt 1560

aacatccctg tcacctttca tggactgttc aaaaaatctt gaagtacttt taagggcgaa 1620

ttccagcaca ctg 1633

<210> 2

<211> 156

<212> DNA

<213> 大鼠

<400> 2

taagtcagaa caatttacac atgcttgact cgggaagggg aacattcagc aataaaaagg 60

tttgtatgtg tgcatgtatg aatgttttct ttttcctgtt tttaacactg ccttttgcag 120

aatgccttaa ttctttaacc gctgtttctc ttacag 156

<210> 3

<211> 283

<212> DNA

<213> 鸡

<400> 3

catggtcgag gtgagcccca cgttctgctt cactctcccc atctcccccc cctccccacc 60

cccaattttg tatttattta ttttttaatt attttgtgca gcgatggggg cggggggggg 120

gggggggcgc gcgccaggcg gggcggggcg gggcgagggg cggggcgggg cgaggcggag 180

aggtgcggcg gcagccaatc agagcggcgc gctccgaaag tttcctttta tggcgaggcg 240

gcggcggcgg cggccctata aaaagcgaag cgcgcggcgg gcg 283

<210> 4

<211> 624

<212> DNA

<213> 人

<400> 4

caattctgtc attttactag ggtgatgaaa ttcccaagca acaccatcct tttcagataa 60

gggcactgag gctgagagag gagctgaaac ctacccggcg tcaccacaca caggtggcaa 120

ggctgggacc agaaaccagg actgttgact gcagcccggt attcattctt tccatagccc 180

acagggctgt caaagacccc agggcctagt cagaggctcc tccttcctgg agagttcctg 240

gcacagaagt tgaagctcag cacagccccc taacccccaa ctctctctgc aaggcctcag 300

gggtcagaac actggtggag cagatccttt agcctctgga ttttagggcc atggtagagg 360

gggtgttgcc ctaaattcca gccctggtct cagcccaaca ccctccaaga agaaattaga 420

ggggccatgg ccaggctgtg ctagccgttg cttctgagca gattacaaga agggaccaag 480

acaaggactc ctttgtggag gtcctggctt agggagtcaa gtgacggcgg ctcagcactc 540

acgtgggcag tgccagcctc taagagtggg caggggcact ggccacagag tcccagggag 600

tcccaccagc ctagtcgcca gacc 624

<210> 5

<211> 372

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CMV

<400> 5

gaattcggta ccctagttat taatagtaat caattacggg gtcattagtt catagcccat 60

atatggagtt ccgcgttaca taacttacgg taaatggccc gcctggctga ccgcccaacg 120

acccccgccc attgacgtca ataatgacgt atgttcccat agtaacgcca atagggactt 180

tccattgacg tcaatgggtg gactatttac ggtaaactgc ccacttggca gtacatcaag 240

tgtatcatat gccaagtacg ccccctattg acgtcaatga cggtaaatgg cccgcctggc 300

attatgccca gtacatgacc ttatgggact ttcctacttg gcagtacatc tacgtattag 360

tcatcgctat ta 372

<210> 6

<211> 6952

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 全核苷酸序列

<400> 6

gggggggggg ggggggggtt ggccactccc tctctgcgcg ctcgctcgct cactgaggcc 60

gggcgaccaa aggtcgcccg acgcccgggc tttgcccggg cggcctcagt gagcgagcga 120

gcgcgcagag agggagtggc caactccatc actaggggtt cctagatctg aattcggtac 180

cctagttatt aatagtaatc aattacgggg tcattagttc atagcccata tatggagttc 240

cgcgttacat aacttacggt aaatggcccg cctggctgac cgcccaacga cccccgccca 300

ttgacgtcaa taatgacgta tgttcccata gtaacgccaa tagggacttt ccattgacgt 360

caatgggtgg actatttacg gtaaactgcc cacttggcag tacatcaagt gtatcatatg 420

ccaagtacgc cccctattga cgtcaatgac ggtaaatggc ccgcctggca ttatgcccag 480

tacatgacct tatgggactt tcctacttgg cagtacatct acgtattagt catcgctatt 540

accatggtcg aggtgagccc cacgttctgc ttcactctcc ccatctcccc cccctcccca 600

cccccaattt tgtatttatt tattttttaa ttattttgtg cagcgatggg ggcggggggg 660

gggggggggc gcgcgccagg cggggcgggg cggggcgagg ggcggggcgg ggcgaggcgg 720

agaggtgcgg cggcagccaa tcagagcggc gcgctccgaa agtttccttt tatggcgagg 780

cggcggcggc ggcggcccta taaaaagcga agcgcgcggc gggcgggagt cgctgcgacg 840

ctgccttcgc cccgtgcccc gctccgccgc cgcctcgcgc cgcccgcccc ggctctgact 900

gaccgcgtta ctcccacagg tgagcgggcg ggacggccct tctcctccgg gctgtaatta 960

gcgcttggtt taatgacggc ttgtttcttt tctgtggctg cgtgaaagcc ttgaggggct 1020

ccgggagggc cctttgtgcg ggggggagcg gctcgggggg tgcgtgcgtg tgtgtgtgcg 1080

tggggagcgc cgcgtgcggc ccgcgctgcc cggcggctgt gagcgctgcg ggcgcggcgc 1140

ggggctttgt gcgctccgca gtgtgcgcga ggggagcgcg gccgggggcg gtgccccgcg 1200

gtgcgggggg ggctgcgagg ggaacaaagg ctgcgtgcgg ggtgtgtgcg tgggggggtg 1260

agcagggggt gtgggcgcgg cggtcgggct gtaacccccc cctgcacccc cctccccgag 1320

ttgctgagca cggcccggct tcgggtgcgg ggctccgtac ggggcgtggc gcggggctcg 1380

ccgtgccggg cggggggtgg cggcaggtgg gggtgccggg cggggcgggg ccgcctcggg 1440

ccggggaggg ctcgggggag gggcgcggcg gcccccggag cgccggcggc tgtcgaggcg 1500

cggcgagccg cagccattgc cttttatggt aatcgtgcga gagggcgcag ggacttcctt 1560

tgtcccaaat ctgtgcggag ccgaaatctg ggaggcgccg ccgcaccccc tctagcgggc 1620

gcggggcgaa gcggtgcggc gccggcagga aggaaatggg cggggagggc cttcgtgcgt 1680

cgccgcgccg ccgtcccctt ctccctctcc agcctcgggg ctgtccgcgg ggggacggct 1740

gccttcgggg gggacggggc agggcggggt tcggcttctg gcgtgtgacc ggcggctcta 1800

gagcctctgc taaccatgtt catgccttct tctttttcct acagctcctg ggcaacgtgc 1860

tggttattgt gctgtctcat cattttggca aagaattcct aagtcagaac aatttacaca 1920

tgcttgactc gggaagggga acattcagca ataaaaaggt ttgtatgtgt gcatgtatga 1980

atgttttctt tttcctgttt ttaacactgc cttttgcaga atgccttaat tctttaaccg 2040

ctgtttctct tacagtcgaa gatctaggca acgcgtctcg aggcggccgc caccatgtct 2100

atccaggttg agcatcctgc tggtggttac aagaaactgt ttgaaactgt ggaggaactg 2160

tcctcgccgc tcacagctca tgtaacaggc aggatccccc tctggctcac cggcagtctc 2220

cttcgatgtg ggccaggact ctttgaagtt ggatctgagc cattttacca cctgtttgat 2280

gggcaagccc tcctgcacaa gtttgacttt aaagaaggac atgtcacata ccacagaagg 2340

ttcatccgca ctgatgctta cgtacgggca atgactgaga aaaggatcgt cataacagaa 2400

tttggcacct gtgctttccc agatccctgc aagaatatat tttccaggtt tttttcttac 2460

tttcgaggag tagaggttac tgacaatgcc cttgttaatg tctacccagt gggggaagat 2520

tactacgctt gcacagagac caactttatt acaaagatta atccagagac cttggagaca 2580

attaagcagg ttgatctttg caactatgtc tctgtcaatg gggccactgc tcacccccac 2640

attgaaaatg atggaaccgt ttacaatatt ggtaattgct ttggaaaaaa tttttcaatt 2700

gcctacaaca ttgtaaagat cccaccactg caagcagaca aggaagatcc aataagcaag 2760

tcagagatcg ttgtacaatt cccctgcagt gaccgattca agccatctta cgttcatagt 2820

tttggtctga ctcccaacta tatcgttttt gtggagacac cagtcaaaat taacctgttc 2880

aagttccttt cttcatggag tctttgggga gccaactaca tggattgttt tgagtccaat 2940

gaaaccatgg gggtttggct tcatattgct gacaaaaaaa ggaaaaagta cctcaataat 3000

aaatacagaa cttctccttt caacctcttc catcacatca acacctatga agacaatggg 3060

tttctgattg tggatctctg ctgctggaaa ggatttgagt ttgtttataa ttacttatat 3120

ttagccaatt tacgtgagaa ctgggaagag gtgaaaaaaa atgccagaaa ggctccccaa 3180

cctgaagtta ggagatatgt acttcctttg aatattgaca aggctgacac aggcaagaat 3240

ttagtcacgc tccccaatac aactgccact gcaattctgt gcagtgacga gactatctgg 3300

ctggagcctg aagttctctt ttcagggcct cgtcaagcat ttgagtttcc tcaaatcaat 3360

taccagaagt attgtgggaa accttacaca tatgcgtatg gacttggctt gaatcacttt 3420

gttccagata ggctctgtaa gctgaatgtc aaaactaaag aaacttgggt ttggcaagag 3480

cctgattcat acccatcaga acccatcttt gtttctcacc cagatgcctt ggaagaagat 3540

gatggtgtag ttctgagtgt ggtggtgagc ccaggagcag gacaaaagcc tgcttatctc 3600

ctgattctga atgccaagga cttaagtgaa gttgcccggg ctgaagtgga gattaacatc 3660

cctgtcacct ttcatggact gttcaaaaaa tcttgaagta cttttaaggg cgaattccag 3720

cacactggcg gccgcgggga tccagacatg ataagataca ttgatgagtt tggacaaacc 3780

acaactagaa tgcagtgaaa aaaatgcttt atttgtgaaa tttgtgatgc tattgcttta 3840

tttgtaacca ttataagctg caataaacaa gttaacaaca acaattgcat tcattttatg 3900

tttcaggttc agggggaggt gtgggaggtt ttttagtcga ctggggagag atctaggaac 3960

ccctagtgat ggagttggcc actccctctc tgcgcgctcg ctcgctcact gaggccgccc 4020

gggcaaagcc cgggcgtcgg gcgacctttg gtcgcccggc ctcagtgagc gagcgagcgc 4080

gcagagaggg agtggccaac cccccccccc ccccccctgc agccctgcat taatgaatcg 4140

gccaacgcgc ggggagaggc ggtttgcgta ttgggcgctc ttccgcttcc tcgctcactg 4200

actcgctgcg ctcggtcgtt cggctgcggc gagcggtatc agctcactca aaggcggtaa 4260

tacggttatc cacagaatca ggggataacg caggaaagaa catgtgagca aaaggccagc 4320

aaaaggccag gaaccgtaaa aaggccgcgt tgctggcgtt tttccatagg ctccgccccc 4380

ctgacgagca tcacaaaaat cgacgctcaa gtcagaggtg gcgaaacccg acaggactat 4440

aaagatacca ggcgtttccc cctggaagct ccctcgtgcg ctctcctgtt ccgaccctgc 4500

cgcttaccgg atacctgtcc gcctttctcc cttcgggaag cgtggcgctt tctcaatgct 4560

cacgctgtag gtatctcagt tcggtgtagg tcgttcgctc caagctgggc tgtgtgcacg 4620

aaccccccgt tcagcccgac cgctgcgcct tatccggtaa ctatcgtctt gagtccaacc 4680

cggtaagaca cgacttatcg ccactggcag cagccactgg taacaggatt agcagagcga 4740

ggtatgtagg cggtgctaca gagttcttga agtggtggcc taactacggc tacactagaa 4800

ggacagtatt tggtatctgc gctctgctga agccagttac cttcggaaaa agagttggta 4860

gctcttgatc cggcaaacaa accaccgctg gtagcggtgg tttttttgtt tgcaagcagc 4920

agattacgcg cagaaaaaaa ggatctcaag aagatccttt gatcttttct acggggtctg 4980

acgctcagtg gaacgaaaac tcacgttaag ggattttggt catgagatta tcaaaaagga 5040

tcttcaccta gatcctttta aattaaaaat gaagttttaa atcaatctaa agtatatatg 5100

agtaaacttg gtctgacagt taccaatgct taatcagtga ggcacctatc tcagcgatct 5160

gtctatttcg ttcatccata gttgcctgac tccccgtcgt gtagataact acgatacggg 5220

agggcttacc atctggcccc agtgctgcaa tgataccgcg agacccacgc tcaccggctc 5280

cagatttatc agcaataaac cagccagccg gaagggccga gcgcagaagt ggtcctgcaa 5340

ctttatccgc ctccatccag tctattaatt gttgccggga agctagagta agtagttcgc 5400

cagttaatag tttgcgcaac gttgttgcca ttgctacagg catcgtggtg tcacgctcgt 5460

cgtttggtat ggcttcattc agctccggtt cccaacgatc aaggcgagtt acatgatccc 5520

ccatgttgtg caaaaaagcg gttagctcct tcggtcctcc gatcgttgtc agaagtaagt 5580

tggccgcagt gttatcactc atggttatgg cagcactgca taattctctt actgtcatgc 5640

catccgtaag atgcttttct gtgactggtg agtactcaac caagtcattc tgagaatagt 5700

gtatgcggcg accgagttgc tcttgcccgg cgtcaatacg ggataatacc gcgccacata 5760

gcagaacttt aaaagtgctc atcattggaa aacgttcttc ggggcgaaaa ctctcaagga 5820

tcttaccgct gttgagatcc agttcgatgt aacccactcg tgcacccaac tgatcttcag 5880

catcttttac tttcaccagc gtttctgggt gagcaaaaac aggaaggcaa aatgccgcaa 5940

aaaagggaat aagggcgaca cggaaatgtt gaatactcat actcttcctt tttcaatatt 6000

attgaagcat ttatcagggt tattgtctca tgagcggata catatttgaa tgtatttaga 6060

aaaataaaca aataggggtt ccgcgcacat ttccccgaaa agtgccacct gacgtctaag 6120

aaaccattat tatcatgaca ttaacctata aaaataggcg tatcacgagg ccctttcgtc 6180

tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca 6240

cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg 6300

ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc 6360

accatatgcg gtgtgaaata ccgcacagat gcgtaaggag aaaataccgc atcaggaaat 6420

tgtaaacgtt aatattttgt taaaattcgc gttaaatttt tgttaaatca gctcattttt 6480

taaccaatag gccgaaatcg gcaaaatccc ttataaatca aaagaataga ccgagatagg 6540

gttgagtgtt gttccagttt ggaacaagag tccactatta aagaacgtgg actccaacgt 6600

caaagggcga aaaaccgtct atcagggcga tggcccacta cgtgaaccat caccctaatc 6660

aagttttttg gggtcgaggt gccgtaaagc actaaatcgg aaccctaaag ggagcccccg 6720

atttagagct tgacggggaa agccggcgaa cgtggcgaga aaggaaggga agaaagcgaa 6780

aggagcgggc gctagggcgc tggcaagtgt agcggtcacg ctgcgcgtaa ccaccacacc 6840

cgccgcgctt aatgcgccgc tacagggcgc gtcgcgccat tcgccattca ggctacgcaa 6900

ctgttgggaa gggcgatcgg tgcgggcctc ttcgctatta cgccaggctg ca 6952

<210> 7

<211> 7321

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 全核苷酸序列

<400> 7

gggggggggg ggggggggtt ggccactccc tctctgcgcg ctcgctcgct cactgaggcc 60

gggcgaccaa aggtcgcccg acgcccgggc tttgcccggg cggcctcagt gagcgagcga 120

gcgcgcagag agggagtggc caactccatc actaggggtt cctagatctg aattcggtac 180

cctagttatt aatagtaatc aattacgggg tcattagttc atagcccata tatggagttc 240

cgcgttacat aacttacggt aaatggcccg cctggctgac cgcccaacga cccccgccca 300

ttgacgtcaa taatgacgta tgttcccata gtaacgccaa tagggacttt ccattgacgt 360

caatgggtgg actatttacg gtaaactgcc cacttggcag tacatcaagt gtatcatatg 420

ccaagtacgc cccctattga cgtcaatgac ggtaaatggc ccgcctggca ttatgcccag 480

tacatgacct tatgggactt tcctacttgg cagtacatct acgtattagt catcgctatt 540

accaattctg tcattttact agggtgatga aattcccaag caacaccatc cttttcagat 600

aagggcactg aggctgagag aggagctgaa acctacccgg cgtcaccaca cacaggtggc 660

aaggctggga ccagaaacca ggactgttga ctgcagcccg gtattcattc tttccatagc 720

ccacagggct gtcaaagacc ccagggccta gtcagaggct cctccttcct ggagagttcc 780

tggcacagaa gttgaagctc agcacagccc cctaaccccc aactctctct gcaaggcctc 840

aggggtcaga acactggtgg agcagatcct ttagcctctg gattttaggg ccatggtaga 900

gggggtgttg ccctaaattc cagccctggt ctcagcccaa caccctccaa gaagaaatta 960

gaggggccat ggccaggctg tgctagccgt tgcttctgag cagattacaa gaagggacca 1020

agacaaggac tcctttgtgg aggtcctggc ttagggagtc aagtgacggc ggctcagcac 1080

tcacgtgggc agtgccagcc tctaagagtg ggcaggggca ctggccacag agtcccaggg 1140

agtcccacca gcctagtcgc cagaccctat aaaaagcgaa gcgcgcggcg ggcgggagtc 1200

gctgcgacgc tgccttcgcc ccgtgccccg ctccgccgcc gcctcgcgcc gcccgccccg 1260

gctctgactg accgcgttac tcccacaggt gagcgggcgg gacggccctt ctcctccggg 1320

ctgtaattag cgcttggttt aatgacggct tgtttctttt ctgtggctgc gtgaaagcct 1380

tgaggggctc cgggagggcc ctttgtgcgg gggggagcgg ctcggggggt gcgtgcgtgt 1440

gtgtgtgcgt ggggagcgcc gcgtgcggcc cgcgctgccc ggcggctgtg agcgctgcgg 1500

gcgcggcgcg gggctttgtg cgctccgcag tgtgcgcgag gggagcgcgg ccgggggcgg 1560

tgccccgcgg tgcggggggg gctgcgaggg gaacaaaggc tgcgtgcggg gtgtgtgcgt 1620

gggggggtga gcagggggtg tgggcgcggc ggtcgggctg taaccccccc ctgcaccccc 1680

ctccccgagt tgctgagcac ggcccggctt cgggtgcggg gctccgtacg gggcgtggcg 1740

cggggctcgc cgtgccgggc ggggggtggc ggcaggtggg ggtgccgggc ggggcggggc 1800

cgcctcgggc cggggagggc tcgggggagg ggcgcggcgg cccccggagc gccggcggct 1860

gtcgaggcgc ggcgagccgc agccattgcc ttttatggta atcgtgcgag agggcgcagg 1920

gacttccttt gtcccaaatc tgtgcggagc cgaaatctgg gaggcgccgc cgcaccccct 1980

ctagcgggcg cggggcgaag cggtgcggcg ccggcaggaa ggaaatgggc ggggagggcc 2040

ttcgtgcgtc gccgcgccgc cgtccccttc tccctctcca gcctcggggc tgtccgcggg 2100

gggacggctg ccttcggggg ggacggggca gggcggggtt cggcttctgg cgtgtgaccg 2160

gcggctctag agcctctgct aaccatgttc atgccttctt ctttttccta cagctcctgg 2220

gcaacgtgct ggttattgtg ctgtctcatc attttggcaa agaattccta agtcagaaca 2280

atttacacat gcttgactcg ggaaggggaa cattcagcaa taaaaaggtt tgtatgtgtg 2340

catgtatgaa tgttttcttt ttcctgtttt taacactgcc ttttgcagaa tgccttaatt 2400

ctttaaccgc tgtttctctt acagtcgaag atctaggcaa cgcgtctcga ggcggccgcc 2460

accatgtcta tccaggttga gcatcctgct ggtggttaca agaaactgtt tgaaactgtg 2520

gaggaactgt cctcgccgct cacagctcat gtaacaggca ggatccccct ctggctcacc 2580

ggcagtctcc ttcgatgtgg gccaggactc tttgaagttg gatctgagcc attttaccac 2640

ctgtttgatg ggcaagccct cctgcacaag tttgacttta aagaaggaca tgtcacatac 2700

cacagaaggt tcatccgcac tgatgcttac gtacgggcaa tgactgagaa aaggatcgtc 2760

ataacagaat ttggcacctg tgctttccca gatccctgca agaatatatt ttccaggttt 2820

ttttcttact ttcgaggagt agaggttact gacaatgccc ttgttaatgt ctacccagtg 2880

ggggaagatt actacgcttg cacagagacc aactttatta caaagattaa tccagagacc 2940

ttggagacaa ttaagcaggt tgatctttgc aactatgtct ctgtcaatgg ggccactgct 3000

cacccccaca ttgaaaatga tggaaccgtt tacaatattg gtaattgctt tggaaaaaat 3060

ttttcaattg cctacaacat tgtaaagatc ccaccactgc aagcagacaa ggaagatcca 3120

ataagcaagt cagagatcgt tgtacaattc ccctgcagtg accgattcaa gccatcttac 3180

gttcatagtt ttggtctgac tcccaactat atcgtttttg tggagacacc agtcaaaatt 3240

aacctgttca agttcctttc ttcatggagt ctttggggag ccaactacat ggattgtttt 3300

gagtccaatg aaaccatggg ggtttggctt catattgctg acaaaaaaag gaaaaagtac 3360

ctcaataata aatacagaac ttctcctttc aacctcttcc atcacatcaa cacctatgaa 3420

gacaatgggt ttctgattgt ggatctctgc tgctggaaag gatttgagtt tgtttataat 3480

tacttatatt tagccaattt acgtgagaac tgggaagagg tgaaaaaaaa tgccagaaag 3540

gctccccaac ctgaagttag gagatatgta cttcctttga atattgacaa ggctgacaca 3600

ggcaagaatt tagtcacgct ccccaataca actgccactg caattctgtg cagtgacgag 3660

actatctggc tggagcctga agttctcttt tcagggcctc gtcaagcatt tgagtttcct 3720

caaatcaatt accagaagta ttgtgggaaa ccttacacat atgcgtatgg acttggcttg 3780

aatcactttg ttccagatag gctctgtaag ctgaatgtca aaactaaaga aacttgggtt 3840

tggcaagagc ctgattcata cccatcagaa cccatctttg tttctcaccc agatgccttg 3900

gaagaagatg atggtgtagt tctgagtgtg gtggtgagcc caggagcagg acaaaagcct 3960

gcttatctcc tgattctgaa tgccaaggac ttaagtgaag ttgcccgggc tgaagtggag 4020

attaacatcc ctgtcacctt tcatggactg ttcaaaaaat cttgaagtac ttttaagggc 4080

gaattccagc acactggcgg ccgcggggat ccagacatga taagatacat tgatgagttt 4140

ggacaaacca caactagaat gcagtgaaaa aaatgcttta tttgtgaaat ttgtgatgct 4200

attgctttat ttgtaaccat tataagctgc aataaacaag ttaacaacaa caattgcatt 4260

cattttatgt ttcaggttca gggggaggtg tgggaggttt tttagtcgac tggggagaga 4320

tctaggaacc cctagtgatg gagttggcca ctccctctct gcgcgctcgc tcgctcactg 4380

aggccgcccg ggcaaagccc gggcgtcggg cgacctttgg tcgcccggcc tcagtgagcg 4440

agcgagcgcg cagagaggga gtggccaacc cccccccccc cccccctgca gccctgcatt 4500

aatgaatcgg ccaacgcgcg gggagaggcg gtttgcgtat tgggcgctct tccgcttcct 4560

cgctcactga ctcgctgcgc tcggtcgttc ggctgcggcg agcggtatca gctcactcaa 4620

aggcggtaat acggttatcc acagaatcag gggataacgc aggaaagaac atgtgagcaa 4680

aaggccagca aaaggccagg aaccgtaaaa aggccgcgtt gctggcgttt ttccataggc 4740

tccgcccccc tgacgagcat cacaaaaatc gacgctcaag tcagaggtgg cgaaacccga 4800

caggactata aagataccag gcgtttcccc ctggaagctc cctcgtgcgc tctcctgttc 4860

cgaccctgcc gcttaccgga tacctgtccg cctttctccc ttcgggaagc gtggcgcttt 4920

ctcaatgctc acgctgtagg tatctcagtt cggtgtaggt cgttcgctcc aagctgggct 4980

gtgtgcacga accccccgtt cagcccgacc gctgcgcctt atccggtaac tatcgtcttg 5040

agtccaaccc ggtaagacac gacttatcgc cactggcagc agccactggt aacaggatta 5100

gcagagcgag gtatgtaggc ggtgctacag agttcttgaa gtggtggcct aactacggct 5160

acactagaag gacagtattt ggtatctgcg ctctgctgaa gccagttacc ttcggaaaaa 5220

gagttggtag ctcttgatcc ggcaaacaaa ccaccgctgg tagcggtggt ttttttgttt 5280

gcaagcagca gattacgcgc agaaaaaaag gatctcaaga agatcctttg atcttttcta 5340

cggggtctga cgctcagtgg aacgaaaact cacgttaagg gattttggtc atgagattat 5400

caaaaaggat cttcacctag atccttttaa attaaaaatg aagttttaaa tcaatctaaa 5460

gtatatatga gtaaacttgg tctgacagtt accaatgctt aatcagtgag gcacctatct 5520

cagcgatctg tctatttcgt tcatccatag ttgcctgact ccccgtcgtg tagataacta 5580

cgatacggga gggcttacca tctggcccca gtgctgcaat gataccgcga gacccacgct 5640

caccggctcc agatttatca gcaataaacc agccagccgg aagggccgag cgcagaagtg 5700

gtcctgcaac tttatccgcc tccatccagt ctattaattg ttgccgggaa gctagagtaa 5760

gtagttcgcc agttaatagt ttgcgcaacg ttgttgccat tgctacaggc atcgtggtgt 5820

cacgctcgtc gtttggtatg gcttcattca gctccggttc ccaacgatca aggcgagtta 5880

catgatcccc catgttgtgc aaaaaagcgg ttagctcctt cggtcctccg atcgttgtca 5940

gaagtaagtt ggccgcagtg ttatcactca tggttatggc agcactgcat aattctctta 6000

ctgtcatgcc atccgtaaga tgcttttctg tgactggtga gtactcaacc aagtcattct 6060

gagaatagtg tatgcggcga ccgagttgct cttgcccggc gtcaatacgg gataataccg 6120

cgccacatag cagaacttta aaagtgctca tcattggaaa acgttcttcg gggcgaaaac 6180

tctcaaggat cttaccgctg ttgagatcca gttcgatgta acccactcgt gcacccaact 6240

gatcttcagc atcttttact ttcaccagcg tttctgggtg agcaaaaaca ggaaggcaaa 6300

atgccgcaaa aaagggaata agggcgacac ggaaatgttg aatactcata ctcttccttt 6360

ttcaatatta ttgaagcatt tatcagggtt attgtctcat gagcggatac atatttgaat 6420

gtatttagaa aaataaacaa ataggggttc cgcgcacatt tccccgaaaa gtgccacctg 6480

acgtctaaga aaccattatt atcatgacat taacctataa aaataggcgt atcacgaggc 6540

cctttcgtct cgcgcgtttc ggtgatgacg gtgaaaacct ctgacacatg cagctcccgg 6600

agacggtcac agcttgtctg taagcggatg ccgggagcag acaagcccgt cagggcgcgt 6660

cagcgggtgt tggcgggtgt cggggctggc ttaactatgc ggcatcagag cagattgtac 6720

tgagagtgca ccatatgcgg tgtgaaatac cgcacagatg cgtaaggaga aaataccgca 6780

tcaggaaatt gtaaacgtta atattttgtt aaaattcgcg ttaaattttt gttaaatcag 6840

ctcatttttt aaccaatagg ccgaaatcgg caaaatccct tataaatcaa aagaatagac 6900

cgagataggg ttgagtgttg ttccagtttg gaacaagagt ccactattaa agaacgtgga 6960

ctccaacgtc aaagggcgaa aaaccgtcta tcagggcgat ggcccactac gtgaaccatc 7020

accctaatca agttttttgg ggtcgaggtg ccgtaaagca ctaaatcgga accctaaagg 7080

gagcccccga tttagagctt gacggggaaa gccggcgaac gtggcgagaa aggaagggaa 7140

gaaagcgaaa ggagcgggcg ctagggcgct ggcaagtgta gcggtcacgc tgcgcgtaac 7200

caccacaccc gccgcgctta atgcgccgct acagggcgcg tcgcgccatt cgccattcag 7260

gctacgcaac tgttgggaag ggcgatcggt gcgggcctct tcgctattac gccaggctgc 7320

a 7321

<210> 8

<211> 143

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ITR5’

<400> 8

ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg ccgggcgacc aaaggtcgcc 60

cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc gagcgcgcag agagggagtg 120

gccaactcca tcactagggg ttc 143

<210> 9

<211> 199

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> SV40

<400> 9

cggggatcca gacatgataa gatacattga tgagtttgga caaaccacaa ctagaatgca 60

gtgaaaaaaa tgctttattt gtgaaatttg tgatgctatt gctttatttg taaccattat 120

aagctgcaat aaacaagtta acaacaacaa ttgcattcat tttatgtttc aggttcaggg 180

ggaggtgtgg gaggttttt 199

<210> 10

<211> 142

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ITR3'

<400> 10

acccctagtg atggagttgg ccactccctc tctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc 60

ccgggcaaag cccgggcgtc gggcgacctt tggtcgcccg gcctcagtga gcgagcgagc 120

gcgcagagag ggagtggcca ac 142

<210> 11

<211> 226

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ColE1 ori

<400> 11

tttctcaatg ctcacgctgt aggtatctca gttcggtgta ggtcgttcgc tccaagctgg 60

gctgtgtgca cgaacccccc gttcagcccg accgctgcgc cttatccggt aactatcgtc 120

ttgagtccaa cccggtaaga cacgacttat cgccactggc agcagccact ggtaacagga 180

ttagcagagc gaggtatgta ggcggtgcta cagagttctt gaagtg 226

<210> 12

<211> 1001

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Amp (r)

<400> 12

gagattatca aaaaggatct tcacctagat ccttttaaat taaaaatgaa gttttaaatc 60

aatctaaagt atatatgagt aaacttggtc tgacagttac caatgcttaa tcagtgaggc 120

acctatctca gcgatctgtc tatttcgttc atccatagtt gcctgactcc ccgtcgtgta 180

gataactacg atacgggagg gcttaccatc tggccccagt gctgcaatga taccgcgaga 240

cccacgctca ccggctccag atttatcagc aataaaccag ccagccggaa gggccgagcg 300

cagaagtggt cctgcaactt tatccgcctc catccagtct attaattgtt gccgggaagc 360

tagagtaagt agttcgccag ttaatagttt gcgcaacgtt gttgccattg ctacaggcat 420

cgtggtgtca cgctcgtcgt ttggtatggc ttcattcagc tccggttccc aacgatcaag 480

gcgagttaca tgatccccca tgttgtgcaa aaaagcggtt agctccttcg gtcctccgat 540

cgttgtcaga agtaagttgg ccgcagtgtt atcactcatg gttatggcag cactgcataa 600

ttctcttact gtcatgccat ccgtaagatg cttttctgtg actggtgagt actcaaccaa 660

gtcattctga gaatagtgta tgcggcgacc gagttgctct tgcccggcgt caatacggga 720

taataccgcg ccacatagca gaactttaaa agtgctcatc attggaaaac gttcttcggg 780

gcgaaaactc tcaaggatct taccgctgtt gagatccagt tcgatgtaac ccactcgtgc 840

acccaactga tcttcagcat cttttacttt caccagcgtt tctgggtgag caaaaacagg 900

aaggcaaaat gccgcaaaaa agggaataag ggcgacacgg aaatgttgaa tactcatact 960

cttccttttt caatattatt gaagcattta tcagggttat t 1001

<210> 13

<211> 460

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> f1(+) origin

<400> 13

gttaatattt tgttaaaatt cgcgttaaat ttttgttaaa tcagctcatt ttttaaccaa 60

taggccgaaa tcggcaaaat cccttataaa tcaaaagaat agaccgagat agggttgagt 120

gttgttccag tttggaacaa gagtccacta ttaaagaacg tggactccaa cgtcaaaggg 180

cgaaaaaccg tctatcaggg cgatggccca ctacgtgaac catcacccta atcaagtttt 240

ttggggtcga ggtgccgtaa agcactaaat cggaacccta aagggagccc ccgatttaga 300

gcttgacggg gaaagccggc gaacgtggcg agaaaggaag ggaagaaagc gaaaggagcg 360

ggcgctaggg cgctggcaag tgtagcggtc acgctgcgcg taaccaccac acccgccgcg 420

cttaatgcgc cgctacaggg cgcgtcgcgc cattcgccat 460

<210> 14

<211> 202

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 缩短的嵌合内含子

<400> 14

ggtgagcggg cgggacggcc cttctcctcc gggctgtaat tagcgcttgg tttaatgacg 60

gcttgtttct tttctgtggc tgcgtgaaag ccttgagggg ctccgggagc tagagcctct 120

gctaaccatg ttcatgcctt cttctttttc ctacagctcc tgggcaacgt gctggttatt 180

gtgctgtctc atcattttgg ca 202

Claims

1.一种腺相关病毒载体，其特征在于，所述载体含有增强子、特异性或非特异性启动子、血管紧张素II型受体内含子1和人类视网膜色素上皮细胞主要蛋白65(hRPE65)的基因序列，

所述的RPE65蛋白选自与SEQ ID NO:1有至少95％同源性的核苷酸序列；

所述的血管紧张素II型受体内含子1选自与SEQ ID NO:2有至少90％同源性的核苷酸序列。

2.如权利要求1所述的腺相关病毒载体，其特征在于，

所述的RPE65蛋白的核苷酸序列含有SEQ ID NO:1；

所述的血管紧张素II型受体内含子1的核苷酸序列含有SEQ ID NO:2。

3.如权利要求1中所述的腺相关病毒载体，其特征在于，所述的非特异性启动子为Chicken beta-actin(CBA)启动子，选自与SEQ ID NO:3有至少95％同源性的核苷酸序列。

4.如权利要求1所述的腺相关病毒载体，其特征在于，所述的特异性启动子为视网膜色素上皮特异的VMD2启动子，选自与SEQ ID NO:4有至少95％同源性的核苷酸序列。

5.如权利要求1中任一权利要求所述的腺相关病毒载体，其特征在于，所述腺相关病毒载体的序列含有

(a)SEQ ID NO:1；和

(b)SEQ ID NO:2；和

(c)SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4。

6.如权利要求1中任一权利要求所述的腺相关病毒载体，其特征在于，所述的增强子为CMV，选自与SEQ ID NO:5有至少95％同源性的核苷酸序列。

7.如权利要求1-6中任一权利要求所述的腺相关病毒载体，其特征在于，所述的增强子CMV含有SEQ ID NO:5的核苷酸序列。

8.如权利要求1中任一权利要求所述的腺相关病毒载体，其特征在于，腺相关病毒为AAV2或AAV5。

9.如权利要求1中所述的腺相关病毒载体，其特征在于，腺相关病毒为自我互补AAV。

10.如权利要求9所述的腺相关病毒载体，其特征在于，所述载体还含有一段缩短的嵌合内含子，所述的嵌合内含子序列选自与SEQ ID NO:14有至少90％同源性的核苷酸序列。

11.如权利要求1中任一权利要求所述的腺相关病毒载体，其特征在于，所述腺相关病毒载体的序列含有SEQ ID NO:6。

12.如权利要求1中任一权利要求所述的腺相关病毒载体，其特征在于，所述腺相关病毒载体的序列含有SEQ ID NO:7。

13.一种用于治疗LCA2的药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物含有如权利要求1-12所述的任一腺相关病毒载体和药学上可接受的载体。

14.如权利要求1-12所述的任一腺相关病毒载体在制备治疗LCA2的药物中的应用。