CN113151178A - 敲除Rc3h1基因和/或Zc3h12a基因的重组T细胞及其应用 - Google Patents

敲除Rc3h1基因和/或Zc3h12a基因的重组T细胞及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了敲除Rc3h1基因和/或Zc3h12a基因的重组T细胞及其应用。本发明首先公开了重组T细胞，其不含Rc3h1基因和/或Zc3h12a基因。本发明进一步公开了上述重组T细胞的制备方法及其在制备抗肿瘤的产品中的应用。本发明在CAR‑T、TCR‑T或其它形式的T细胞中敲除Rc3h1和/或Zc3h12a，可以避免任何与全身辐照或者细胞毒性药物相关的副作用，在不需要任何预处理的情况下使得回输的T细胞大量扩增并发挥抗肿瘤的作用，对患者进行细胞过继治疗，而且本发明需要的细胞数目显著降低，极大的增加CAR‑T以及其他细胞过继治疗的有效性，使用范围广，有效性和安全性高，具有潜在临床应用价值。

Description

敲除Rc3h1基因和/或Zc3h12a基因的重组T细胞及其应用
技术领域
本发明涉及免疫细胞技术领域。具体涉及敲除Rc3h1基因和/或Zc3h12a基因的重组T细胞及其应用。
背景技术
细胞过继治疗(Adoptive cell transfer therapy)包括嵌合抗原受体(CAR)-T和T细胞受体(TCR)-T等，在肿瘤的免疫治疗中具有非常显著的效果，尤其是对于淋巴细胞白血病。
目前所有的CAR-T治疗都需要对患者进行预处理，包括全身辐照或者细胞毒性药物，用于去除患者自身的免疫细胞，以便为输入的T细胞提供扩增的空间。临床试验和动物实验结果都清晰的显示，CAR-T在没有经过预处理(全身辐照或者细胞毒性药物)的患者和动物无法发挥治疗效果，因为回输的CAR-T不会扩增并发挥作用。全身辐照和细胞毒性药物对患者有很大副作用，包括骨髓抑制、免疫缺陷、易发感染、脱发、消化道症状、神经系统症状等。有很多患者因为无法承受这些副作用而不适用于CAT-T治疗，或者因副作用在治疗过程中死亡。因此，如何能够在不需要对患者进行副作用极大预处理的情况下进行有效的CAR-T治疗以及其它细胞过继治疗是一个难题。
Rc3h1和Zc3h12a是细胞中参与mRNA降解的两个蛋白质，目前尚无靶向这两个蛋白质进行疾病治疗的技术。
发明内容
本发明所要解决的技术问题为如何在不需要对患者进行预处理的情况下有效进行肿瘤的免疫治疗。
为解决上述技术问题，本发明首先提供了一种重组T细胞。
本发明重组T细胞为不含Rc3h1基因和/或Zc3h12a基因的T细胞，或者Rc3h1基因和/或Zc3h12a基因产物的生物学功能被抑制的T细胞。
所述Rc3h1基因在小鼠基因组中的基因ID为381305(2019年9月24日更新)；所述Rc3h1基因在人基因组中的基因ID为149041(2019年12月21日更新)；所述Zc3h12a基因在小鼠基因组中的基因ID为230738(2019年12月10日更新)；所述Zc3h12a基因在人基因组中的基因ID为80149(2019年12月21日更新)。
上述重组T细胞中，所述重组T细胞是将靶标T细胞的Rc3h1基因和/或Zc3h12a基因敲除得到的重组T细胞。
上述重组T细胞中，所述靶标T细胞为CAR-T细胞或CD8 T细胞。
上述重组T细胞中，所述CAR-T细胞为CD19-CAR-T细胞。
本发明进一步提供了一种激活的重组T细胞。
本发明激活的重组T细胞，是将上述重组T细胞进行激活得到的。
上述重组T细胞的制备方法也在本发明的保护范围之内。
本发明重组T细胞的制备方法包括将靶标T细胞的Rc3h1基因和/或Zc3h12a基因敲除，得到所述重组T细胞。
上述制备方法中，通过CRISPR-Cas9方法将靶标T细胞的Rc3h1基因和/或Zc3h12a基因敲除。
上述制备方法中，通过CRISPR-Cas9方法将靶标T细胞中Rc3h1基因敲除时靶向Rc3h1基因的靶序列为SEQ ID NO.2(即GGATATAGCTGAGAACCTCG)；通过CRISPR-Cas9方法将靶标T细胞中Zc3h12a基因敲除时靶向Zc3h12a基因的靶序列为SEQ ID NO.3(即CTAGGGGAATTGGTGAAGCA)。
在本发明具体的实施方式中，所述重组T细胞的制备方法包括如下步骤：
1)利用CD3/CD28激活表达Cas9的T细胞，得到表达Cas9的激活的T细胞；
2)将包含靶向Rc3h1基因和/或Zc3h12a基因的sgRNA表达载体或将包含靶向Rc3h1基因和/或Zc3h12a基因的sgRNA和CD19-CAR的表达载体导入表达Cas9的激活的T细胞，即得重组T细胞；
所述包含靶向Rc3h1基因和/或Zc3h12a基因的sgRNA表达载体可以为包含靶向Rc3h1基因的sgRNA表达载体pMSCV-hU6-sgRc3h1-EF1a-Thy1.1(该载体序列为将SEQ IDNO.1第1686-1705位替换为SEQ ID NO.2，且保持其它序列不变得到的序列；所述SEQ IDNO.2为靶向Rc3h1基因的靶序列)、包含靶向Zc3h12a基因的sgRNA表达载体pMSCV-hU6-sgZc3h12a-EF1a-Thy1.1(该载体序列为将SEQ ID NO.1第1686-1705位替换为SEQ IDNO.3，且保持其它序列不变得到的序列；所述SEQ ID NO.3为靶向Zc3h12a基因的靶序列)或包含靶向Rc3h1基因和Zc3h12a的sgRNA表达载体pMSCV-hU6-sgRc3h1-hU6-sgZc3h12a-EF1a-Thy1.1(SEQ ID NO.4；所述SEQ ID NO.4第1666-1685位为靶向Rc3h1基因的靶序列，SEQ ID NO.4第2045-2064位为靶向Zc3h12a基因的靶序列)；
所述包含靶向Rc3h1基因和/或Zc3h12a基因的sgRNA和CD19-CAR的表达载体可以为包含靶向Rc3h1基因的sgRNA和CD19-CAR的表达载体pMSCV-hU6-sgRc3h1-EF1a-Thy1.1-P2A-CD19-CAR(该载体序列为将SEQ ID NO.5第1686-1705位替换为SEQ ID NO.2，且保持其它序列不变得到的序列；所述SEQ ID NO.2为靶向Rc3h1基因的靶序列)、包含靶向Zc3h12a基因的sgRNA和CD19-CAR的表达载体pMSCV-hU6-sgZc3h12a-EF1a-Thy1.1-P2A-CD19-CAR(该载体序列为将SEQ ID NO.5第1686-1705位替换为SEQ ID NO.3，且保持其它序列不变得到的序列；所述SEQ ID NO.3为靶向Zc3h12a基因的靶序列)或包含靶向Rc3h1基因和Zc3h12a的sgRNA和CD19-CAR的表达载体pMSCV-hU6-sgRc3h1-hU6-sgZc3h12a-EF1a-Thy1.1-P2A-CD19-CAR(SEQ ID NO.6，其中第1666-1685位为靶向Rc3h1基因的靶序列，第2045-2064位为靶向Zc3h12a基因的靶序列)。
本发明进一步提供了上述重组T细胞在制备抗肿瘤的产品中的应用。
本发明中抗肿瘤是指抑制肿瘤细胞在体内的生长和/或清除体内的肿瘤细胞。
本发明还提供了敲除Rc3h1基因和/或Zc3h12a基因的物质或抑制Rc3h1基因和/或Zc3h12a基因表达的物质在如下任一中的应用：
1)在制备促进T细胞扩增的产品中的应用；
2)在制备抗肿瘤的产品中的应用；
3)在制备重组T细胞中的应用。
本发明所述敲除Rc3h1基因和/或Zc3h12a基因可通过CRISPR-Cas9方法或同源重组方法实现。所述敲除Rc3h1基因和/或Zc3h12a基因的物质为能与Rc3h1基因和/或Zc3h12a基因特异性结合的物质(如表达sgRNA载体和表达cas9载体或表达sgRNA和cas9载体)，或将Rc3h1基因和/或Zc3h12a基因的替换掉的物质(如同源片段)，或将Rc3h1基因和/或Zc3h12a基因产物的生物学功能进行抑制的物质(如小分子抑制剂)。
在本发明具体的实施方式中，所述敲除Rc3h1基因和/或Zc3h12a基因是通过CRISPR-Cas9方法实现的，敲除Rc3h1基因时靶向Rc3h1基因的靶序列为SEQ ID NO.2(即GGATATAGCTGAGAACCTCG)，敲除Zc3h12a基因时靶向Zc3h12a基因的靶序列为SEQ ID NO.3(即CTAGGGGAATTGGTGAAGCA)。
本发明所述靶标T细胞可为离体的T细胞。
本发明所述靶标T细胞来源于哺乳动物，如人或鼠。
本发明在CAR-T、TCR-T或其它形式的T细胞(如患者自体肿瘤浸润淋巴细胞回输用T细胞)中敲除Rc3h1基因和/或Zc3h12a基因，可以避免任何与全身辐照或者细胞毒性药物相关的副作用，在不需要任何预处理的情况下使得回输的T细胞大量扩增并发挥抗肿瘤的作用，对患者进行细胞过继治疗，而且本发明需要的细胞数目显著降低，极大的增加CAR-T以及其他细胞过继治疗的有效性，使用范围广，有效性和安全性高，具有潜在临床应用价值。
附图说明
图1为敲除Rc3h1基因和/或Zc3h12a基因在无预处理的情况下促进回输的T细胞高效扩增；
其中，a为在CD8 T细胞中敲除Rc3h1基因和/或Zc3h12a基因后，免疫印迹检测目标基因编码蛋白质的表达水平。b为第8天后，流式分析小鼠外周血中基因敲除的CD8 T细胞占总CD8 T细胞的比例；c为对b结果统计学分析的结果(n＝3或4)；采用unpaired student’st-test：NS，无显著差异；*p＜0.05；**p＜0.01；***p＜0.001；****p＜0.0001。
图2为敲除Rc3h1基因和/或Zc3h12a基因在无预处理的情况下抑制肿瘤生长并延长荷瘤小鼠存活期；其中，a为实验流程示意图；b为接种肿瘤后第21天的肿瘤大小，采用unpaired student’s t-test：***p＜0.001；c为接种肿瘤的小鼠生存曲线，采用log-rank(Mantel-Cox)test：**P＜0.01。
图3为在CD19-CAR-T细胞中敲除Rc3h1基因和/或Zc3h12a基因可以在无预处理的条件下高效清除小鼠体内CD19阳性靶细胞；其中，a为同时表达sgRNA和CD19-CAR的载体结构示意图；b为回输第14天后流式分析小鼠外周血CD19+B220+双阳性的靶细胞比例(该细胞即CD19-CAR-T细胞的靶细胞)；c为对b结果统计学分析的结果(n＝3)；采用unpairedstudent’s t-test：***p＜0.001；****p＜0.0001。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1敲除Rc3h1和/或Zc3h12a在无预处理的情况下可促进回输的T细胞高效扩增试验
一、利用CRISPR-Cas9技术敲除体外激活的CD8 T细胞中Rc3h1和/或Zc3h12a，具体步骤如下：
1、基因敲除载体构建：本实施例构建了基于逆转录病毒的sgRNA表达载体，即pMSCV-hU6-sgRNA-EF1a-Thy1.1，其中pMSCV-hU6-sgControl-EF1a-Thy1.1(SEQ ID NO.1，SEQ ID NO.1第1686-1705位为不靶向任何基因的随机序列)作为未敲除任何基因的对照，pMSCV-hU6-sgRc3h1-EF1a-Thy1.1(该载体序列为将SEQ ID NO.1第1686-1705位替换为SEQID NO.2，且保持其它序列不变得到的序列，所述SEQ ID NO.2为靶向Rc3h1基因的靶序列)用于敲除Rc3h1，pMSCV-hU6-sgZc3h12a-EF 1a-Thy1.1(该载体序列为将SEQ ID NO.1第1686-1705位替换为SEQ ID NO.3，且保持其它序列不变得到的序列，所述SEQ ID NO.3为靶向Zc3h12a基因的靶序列)用于敲除Zc3h12a，pMSCV-hU6-sgRc3h1-hU6-sgZc3h12a-EF1a-Thy1.1(SEQ ID NO.4，其中第1666-1685位为靶向Rc3h1基因的靶序列，第2045-2064位为靶向Zc3h12a基因的靶序列)用于同时敲除Rc3h1和Zc3h12a，所有载体通过全基因合成得到。
2、初始CD8 T细胞的分离和激活：通过磁珠分选方法从Cas9转基因小鼠(来自Jaxson Laboratory，Stock No：026430)的脾脏分离得到初始CD8 T细胞，将细胞按106个/孔的密度接种到抗CD3抗体包被的12孔细胞培养皿中，加入2ml RPMI1640培养基(包含5％胎牛血清和白介素-2)中，同时加入抗CD28抗体进行体外激活，即细胞置于5％二氧化碳37℃孵箱中培养，培养24-36小时后进行病毒感染。
3、敲除Rc3h1和Zc3h12a的CD8 T细胞的构建
3.1逆转录病毒制备：Phoenix-Eco细胞贴壁培养24小时后，磷酸钙沉淀法转染相应sgRNA表达载体pMSCV-hU6-sgRc3h1-hU6-sgZc3h12a-EF1a-Thy1.1共转染包装质粒pCL-Eco(购自Addgene，#12371)，转染48小时后分别收获含有包装病毒的上清，病毒上清0.45μm滤膜过滤以去除死细胞杂质，得到逆转录病毒上清。
3.2逆转录病毒体感染：将步骤2体外培养激活36-48小时后的CD8 T细胞，加入1ml步骤3.1得到的逆转录病毒上清，混匀后，于室温2000g水平离心2小时。然后放置于二氧化碳孵箱培养4小时，更换至2ml新鲜RPMI1640培养基(包含5％胎牛血清和白介素-2)继续培养48小时。
3.3T细胞感染效率检测：流式细胞术检测步骤3.2得到的细胞表面标志蛋白的表达以鉴定感染效率，获得Thy1.1阳性细胞，即得到同时敲除Rc3h1和Zc3h12a(表示为sgRc3h1/Zc3h12a)的CD8 T细胞。
4、敲除Rc3h1的CD8 T细胞的构建
与“3、敲除Rc3h1和Zc3h12a的CD8 T细胞的构建”的区别仅在于：将“sgRNA表达载体pMSCV-hU6-sgRc3h1-hU6-sgZc3h12a-EF1a-Thy1.1”替换为“sgRNA表达载体pMSCV-hU6-sgRc3h1-EF1a-Thy1.1”，其它步骤不变，得到敲除Rc3h1的CD8 T细胞。
5、敲除Zc3h12a的CD8 T细胞的构建
与“3、敲除Rc3h1和Zc3h12a的CD8 T细胞的构建”的区别仅在于：将“sgRNA表达载体pMSCV-hU6-sgRc3h1-hU6-sgZc3h12a-EF1a-Thy1.1”替换为“sgRNA表达载体pMSCV-hU6-sgZc3h12a-EF1a-Thy1.1”，其它步骤不变，得到敲除Zc3h12a的CD8 T细胞。
6、未敲除基因的CD8 T细胞的构建
与“3、敲除Rc3h1和Zc3h12a的CD8 T细胞的构建”的区别仅在于：将“sgRNA表达载体pMSCV-hU6-sgRc3h1-hU6-sgZc3h12a-EF1a-Thy1.1”替换为“sgRNA表达载体pMSCV-hU6-sgControl-EF1a-Thy1.1”，其它步骤不变，得到未敲除基因的CD8T细胞。
在上述逆转录病毒体感染CD8 T细胞后的第6天，使用流式细胞术分选出Thy1.1阳性细胞，制备细胞裂解液，采用常规的免疫印迹方法(使用识别Rc3h1抗体(购自Abcam，ab70195)和识别Zc3h12a抗体(购自Abcam，ab211659))检测Rc3h1和Zc3h12a基因敲除效果，结果如图1中a所示，结果显示，与未敲除任何基因的CD8 T细胞相比，敲除Rc3h1的CD8 T细胞中Rc3h1基因编码的蛋白质被完全敲除；敲除Zc3h12a的CD8 T细胞中Zc3h12a基因编码的蛋白质被完全敲除；另外，从图1中a可以看出敲除Rc3h1基因后，Zc3h12a基因的表达水平显著上调，表明Zc3h12a在Rc3h1基因缺失的情况下具有补偿作用。
二、将体重为20-25g的6-8周龄的C57/B6小鼠分成四组，即sgControl组、sgRc3h1组、sgZc3h12a组和sgRc3h1/Zc3h12a组，每组设置三只或四只，未敲除基因的CD8 T细胞用PBS配置成细胞悬液，鼠尾回输至sgControl组的每只小鼠，每只小鼠尾回输至4×105个不敲除基因的CD8 T细胞；敲除Rc3h1的CD8 T细胞用PBS配置成细胞悬液，鼠尾回输至sgRc3h1组的每只小鼠，每只小鼠尾回输至4×105个敲除Rc3h1基因的CD8 T细胞；敲除Zc3h12a的CD8 T细胞用PBS配置成细胞悬液，鼠尾回输至sgZc3h12a组的每只小鼠，每只小鼠尾回输至4×105个敲除Zc3h12a基因的CD8 T细胞；敲除Rc3h1和Zc3h12a的CD8 T细胞用PBS配置成细胞悬液，鼠尾回输至sgRc3h1/Zc3h12a组的每只小鼠，每只小鼠尾回输至4×105个敲除Rc3h1和Zc3h12a基因的CD8 T细胞；8天后，用Thy1.1抗体(敲除载体上带有Thy1.1筛选标签)流式分析每只小鼠的外周血内回输的不敲除基因的CD8 T细胞、敲除Rc3h1的CD8 T细胞、敲除Zc3h12a的CD8 T细胞和同时敲除Rc3h1和Zc3h12a的CD8 T细胞占总CD8 T细胞的比例。
第8天后，流式分析外周血中基因敲除的CD8 T细胞占总CD8 T细胞的比例及分析的结果如图1中b和c所示，sgControl组(图中以“sgControl”表示)向小鼠回输4×105个不敲除基因的CD8 T，第8天这些回输的CD8 T细胞只占外周血总CD8 T细胞的1％，而sgRc3h1组(图中以“sgRc3h1”表示)敲除Rc3h1的CD8 T细胞占外周血总CD8 T细胞的16.3％，sgZc3h12a组(图中以“sgZc3h12a”表示)敲除Rc3h1的CD8 T细胞占外周血总CD8 T细胞的23.7％，sgRc3h1/Zc3h12a组(图中以“sgRc3h1/Zc3h12a”表示)同时敲除Rc3h1和Zc3h12a的CD8 T细胞占外周血总CD8 T细胞的48.2％，结果表明，无需对小鼠进行任何预处理，敲除Rc3h1或Zc3h12a后可促进回输的T细胞在正常C57/B6小鼠体内高效扩增，同时敲除Rc3h1和Zc3h12a可显著增强CD8 T细胞扩增，具有显著的协同效应；另外，图1中aZc3h12a在Rc3h1基因缺失的情况下具有补偿作用，符合图1中b和c，也进一步说明了Rc3h1和Zc3h12a两个基因同时敲除后对T细胞扩增的协同作用。
实施例2敲除Rc3h1和/或Zc3h12a的T细胞在无预处理的情况下可抑制实体肿瘤的生长试验
将体重为20-25g的6-8周龄的C57b1/6小鼠分成四组，即PBS组(8只)、sgControl组(10只)、sgRc3h1组(11只)、sgZc3h12a组(10只)和sgRc3h1/Zc3h12a组(10只)，每组每只皮下接种EL4肿瘤细胞，接种7天后，将实施例1制备得到的不敲除基因的CD8 T细胞用PBS配置成细胞悬液，鼠尾回输至sgControl组的每只小鼠，每只小鼠尾回输至4×105个不敲除基因的CD8 T细胞；敲除Rc3h1的CD8 T细胞用PBS配置成细胞悬液，鼠尾回输至sgRc3h1组的每只小鼠，每只小鼠尾回输至4×105个敲除sgRc3h1基因的CD8 T细胞；敲除Zc3h12a的CD8 T细胞用PBS配置成细胞悬液，鼠尾回输至sgZc3h12a组的每只小鼠，每只小鼠尾回输至4×105个敲除sgZc3h12a基因的CD8 T细胞；敲除Rc3h1和Zc3h12a的CD8 T细胞用PBS配置成细胞悬液，鼠尾回输至sgRc3h1/Zc3h12a组的每只小鼠，每只小鼠尾回输至4×105个敲除Rc3h1和Zc3h12a的CD8 T细胞；PBS组不回输T细胞，输入等体积的PBS作为处理对照。此后，每三天测量一次所有小鼠的肿瘤大小和最终小鼠的成活率(实验流程如图2中a所示)。
接种肿瘤后第21天的肿瘤大小结果如图2中b所示，sgControl组(图中以“sgControl”表示)回输不敲除基因的CD8 T细胞的小鼠的肿瘤面积与PBS组(图中以“PBS”表示)无显著差异，而sgRc3h1组(图中以“sgRc3h1”表示)回输敲除Rc3h1的CD8 T细胞、sgZc3h12a组(图中以“sgZc3h12a”表示)回输敲除Zc3h12a的CD8 T细胞和sgRc3h1/Zc3h12a组(图中以“sgRc3h1/sgZc3h12a”表示)回输同时敲除Rc3h1和Zc3h12a的CD8 T细胞的小鼠的肿瘤面积显著缩小。Rc3h1和/或Zc3h12a CD8 T细胞不仅显著抑制了肿瘤的生长，还极大地延长了淋巴瘤模型小鼠的存活期(图2中c)，同时敲除Rc3h1和Zc3h12a的CD8 T细胞在抑制肿瘤生长和小鼠存活上比单独敲除Rc3h1或Zc3h12a的CD8 T细胞效果更好。
实施例3敲除Rc3h1和/或Zc3h12a的CD19-CAR-T细胞在无任何预处理的情况下有效清除CD19阳性的靶细胞
为验证上述实验结果可否直接用于改进现有的CAR-T细胞治疗方法，我们制备了Rc3h1或/和Zc3h12a基因敲除的CD19-CAR-T细胞，并将其用于清除体内的CD19阳性靶细胞。具体步骤如下：
1、基因敲除载体构建：构建了同时表达CD19-CAR和sgRNA的逆转录病毒载体，即hU6-sgRNA-EF1a-Thy1.1-P2A-CD19-CAR(结构示意图如图3中a)，其中pMSCV-hU6-sgControl-EF1a-Thy1.1-P2A-CD19-CAR(SEQ ID NO.5，SEQ ID NO.5第1686-1705位为不靶向任何基因的随机序列)作为未敲除任何基因的对照CAR-T细胞，pMSCV-hU6-sgRc3h1-EF1a-Thy1.1-P2A-CD19-CAR(该载体序列为将SEQ ID NO.5第1686-1705位替换为SEQ IDNO.2，且保持其它序列不变得到的序列，所述SEQ ID NO.2为靶向Rc3h1基因的靶序列)用于在CD19-CAR-T细胞中敲除Rc3h1，pMSCV-hU6-sgZc3h12a-EF1a-Thy1.1-P2A-CD19-CAR(该载体序列为将SEQ ID NO.5第1686-1705位替换为SEQ ID NO.3，且保持其它序列不变得到的序列，所述SEQ ID NO.3为靶向Zc3h12a基因的靶序列)用于在CD19-CAR-T细胞中敲除Zc3h12a)，pMSCV-hU6-sgRc3h1-hU6-sgZc3h12a-EF1a-Thy1.1-P2A-CD19-CAR(SEQ IDNO.6，其中第1666-1685位为靶向Rc3h1基因的靶序列，第2045-2064位为靶向Zc3h12a基因的靶序列)用于在CD19-CAR-T细胞中同时敲除Rc3h1和Zc3h12a，所有载体通过全基因合成得到。
2、初始CD8 T细胞的分离和激活：与实施例中“2、初始CD8 T细胞的分离和激活”方法一致。
3、敲除Rc3h1和Zc3h12a的CD19-CAR-T细胞的构建
3.1逆转录病毒制备：Phoenix-Eco细胞贴壁培养24小时后，磷酸钙沉淀法转染相应的同时表达CD19-CAR和sgRNA的逆转录病毒载体pMSCV-hU6-sgRc3h1-hU6-sgZc3h12a-EF1a-Thy1.1-P2A-CD19-CAR，共转染包装质粒pCL-Eco，转染48小时后分别收获含有包装病毒的上清，病毒上清0.45μm滤膜过滤以去除死细胞杂质，得到逆转录病毒上清。
3.2逆转录病毒体感染：将步骤2体外培养激活36-48小时后的CD8 T细胞，加入1ml步骤3.1得到的逆转录病毒上清，混匀后，于室温2000g水平离心2小时。然后放置于二氧化碳孵箱培养4小时，更换至2ml新鲜RPMI1640培养基(包含5％胎牛血清和白介素-2)继续培养48小时。
3.3 T细胞感染效率检测：流式细胞术检测步骤3.2得到的细胞表面标志蛋白的表达以鉴定感染效率，获得Thy1.1阳性细胞，即得到敲除Rc3h1和Zc3h12a的CD19-CAR-T细胞。
4、敲除Rc3h1的CD19-CAR-T细胞的构建
与“3、敲除Rc3h1和Zc3h12a的CD19-CAR-T细胞的构建”的区别仅在于：将“同时表达CD19-CAR和sgRNA的逆转录病毒载体pMSCV-hU6-sgRc3h1-hU6-sgZc3h12a-EF1a-Thy1.1-P2A-CD19-CAR”替换为“同时表达CD19-CAR和sgRNA的逆转录病毒载体pMSCV-hU6-sgRc3h1-EF1a-Thy1.1-P2A-CD 19-CAR”，其它步骤不变，得到敲除Rc3h1的CD 19-CAR-T细胞。
5、敲除Zc3h12a的CD19-CAR-T细胞的构建
与“3、敲除Rc3h1和Zc3h12a的CD19-CAR-T细胞的构建”的区别仅在于：将“同时表达CD19-CAR和sgRNA的逆转录病毒载体pMSCV-hU6-sgRc3h1-hU6-sgZc3h12a-EF1a-Thy1.1-P2A-CD19-CAR”替换为“同时表达CD19-CAR和sgRNA的逆转录病毒载体pMSCV-hU6-sgZc3h12a-EF1a-Thy1.1-P2A-CD19-CAR”，其它步骤不变，得到敲除Zc3h12a的CD19-CAR-T细胞。
6、未敲除基因的CD19-CAR-T细胞的构建
与“3、敲除Rc3h1和Zc3h12a的CD19-CAR-T细胞的构建”的区别仅在于：将“同时表达CD19-CAR和sgRNA的逆转录病毒载体pMSCV-hU6-sgRc3h1-hU6-sgZc3h12a-EF1a-Thy1.1-P2A-CD19-CAR”替换为“同时表达CD19-CAR和sgRNA的逆转录病毒载体pMSCV-hU6-sgControl-EF1a-Thy1.1-P2A-CD19-CAR”，其它步骤不变，得到敲除Control的CD19-CAR-T细胞。
7、将体重为20-25g的6-8周龄的的C57/B6小鼠分为五组，即WT组(1只)、sgControl组(3只)、sgRc3h1组(3只)、sgZc3h12a组(3只)和sgRc3h1/Zc3h12a组(2只)，将不敲除基因的CD19-CAR-T细胞用PBS配置成细胞悬液，尾回输至sgControl组的每只小鼠，每只小鼠尾回输至5×105个不敲除基因的CD19-CAR-T细胞；将敲除Rc3h1的CD19-CAR-T细胞用PBS配置成细胞悬液，鼠尾回输至sgRc3h1组每只C57/B6小鼠，每只小鼠尾回输至5×105个敲除敲除Rc3h1基因的CD19-CAR-T细胞；将敲除Zc3h12a的CD19-CAR-T细胞用PBS配置成细胞悬液，鼠尾回输至sgZc3h12a组每只C57/B6小鼠，每只小鼠尾回输至5×105个敲除敲除Zc3h12a基因的CD19-CAR-T细胞；将敲除Rc3h1和Zc3h12a的CD19-CAR-T细胞用PBS配置成细胞悬液，鼠尾回输至sgRc3h1/Zc3h12a组每只C57/B6小鼠，每只小鼠尾回输至5×105个敲除敲除Rc3h1和Zc3h12a基因的CD19-CAR-T细胞；WT组小鼠不输入CAR-T细胞(作为阴性对照)，回输第14天后，流式分析小鼠外周血CD19+B220+双阳性靶细胞的比例。
结果如图3中b和c所示，与WT组(图中以“WT”表示)相比，在没有对小鼠进行任何预处理的条件下，sgControl组(图中以“sgControl”表示)不敲除基因的CD19-CAR-T细胞对表达CD19的靶细胞无任何清除作用，而sgRc3h1组(图中以“sgRc3h1”表示)敲除Rc3h1、sgZc3h12a组(图中以“sgZc3h12a”表示)敲除Zc3h12a以及sgRc3h1/Zc3h12a组(图中以“sgRc3h1/Zc3h12a”表示)同时敲除Rc3h1和Zc3h12a的CD19-CAR-T细胞可以清除95％以上的表达CD19的靶细胞。
综上结果证明，只需要在T细胞抑制1-2个基因(Rc3h1和/或Zc3h12a)的表达，就可以在不需要任何预处理的情况下使得回输的T细胞大量扩增并发挥抗实体肿瘤和血液瘤的作用。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
SEQUENCE LISTING
<110> 清华大学
<120> 敲除Rc3h1基因和/或Zc3h12a基因的重组T细胞及其应用
<130> CGGNQAFY196127
<160> 6
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 6364
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tgaaagaccc cacctgtagg tttggcaagc tagcttaagt aacgccattt tgcaaggcat 60
ggaaaataca taactgagaa tagagaagtt cagatcaagg ttaggaacag agagacagca 120
gaatatgggc caaacaggat atctgtggta agcagttcct gccccggctc agggccaaga 180
acagatggtc cccagatgcg gtcccgccct cagcagtttc tagagaacca tcagatgttt 240
ccagggtgcc ccaaggacct gaaatgaccc tgtgccttat ttgaactaac caatcagttc 300
gcttctcgct tctgttcgcg cgcttctgct ccccgagctc aataaaagag cccacaaccc 360
ctcactcggc gcgccagtcc tccgatagac tgcgtcgccc gggtacccgt attcccaata 420
aagcctcttg ctgtttgcat ccgaatcgtg gactcgctga tccttgggag ggtctcctca 480
gattgattga ctgcccacct cgggggtctt tcatttggag gttccaccga gatttggaga 540
cccctgccca gggaccaccg acccccccgc cgggaggtaa gctggccagc ggtcgtttcg 600
tgtctgtctc tgtctttgtg cgtgtttgtg ccggcatcta atgtttgcgc ctgcgtctgt 660
actagttagc taactagctc tgtatctggc ggacccgtgg tggaactgac gagttctgaa 720
cacccggccg caaccctggg agacgtccca gggactttgg gggccgtttt tgtggcccga 780
cctgaggaag ggagtcgatg tggaatccga ccccgtcagg atatgtggtt ctggtaggag 840
acgagaacct aaaacagttc ccgcctccgt ctgaattttt gctttcggtt tggaaccgaa 900
gccgcgcgtc ttgtctgctg cagcgctgca gcatcgttct gtgttgtctc tgtctgactg 960
tgtttctgta tttgtctgaa aattagggcc agactgttac cactccctta agtttgacct 1020
taggtcactg gaaagatgtc gagcggatcg ctcacaacca gtcggtagat gtcaagaaga 1080
gacgttgggt taccttctgc tctgcagaat ggccaacctt taacgtcgga tggccgcgag 1140
acggcacctt taaccgagac ctcatcaccc aggttaagat caaggtcttt tcacctggcc 1200
cgcatggaca cccagaccag gtcccctaca tcgtgacctg ggaagccttg gcttttgacc 1260
cccctccctg ggtcaagccc tttgtacacc ctaagcctcc gcctcctctt cctccatccg 1320
ccccgtctct cccccttgaa cctcctcgtt cgaccccgcc tcgatcctcc ctttatccag 1380
ccctcactcc ttctctaggc gccggaatta gatctaccgg tttaattaag gtaccgaggg 1440
cctatttccc atgattcctt catatttgca tatacgatac aaggctgtta gagagataat 1500
tagaattaat ttgactgtaa acacaaagat attagtacaa aatacgtgac gtagaaagta 1560
ataatttctt gggtagtttg cagttttaaa attatgtttt aaaatggact atcatatgct 1620
taccgtaact tgaaagtatt tcgatttctt ggctttatat atcttgtgga aaggacgaaa 1680
caccgttcgc acgattgcac cttgggtttt agagctagaa atagcaagtt aaaataaggc 1740
tagtccgtta tcaacttgaa aaagtggcac cgagtcggtg cttttttgaa ttcgctagct 1800
aggtcttgaa aggagtggga attggctccg gtgcccgtca gtgggcagag cgcacatcgc 1860
ccacagtccc cgagaagttg gggggagggg tcggcaattg atccggtgcc tagagaaggt 1920
ggcgcggggt aaactgggaa agtgatgtcg tgtactggct ccgccttttt cccgagggtg 1980
ggggagaacc gtatataagt gcagtagtcg ccgtgaacgt tctttttcgc aacgggtttg 2040
ccgccagaac acaggaccgg ttctagagcg ctgccaccat ggccacaaca atgggtcttt 2100
tctgcagtca ccgtcctcga ggcaccatga acccagccat cagcgtcgct ctcctgctct 2160
cagtcttgca ggtgtcccga gggcagaagg tgaccagcct gacagcctgc ctggtgaacc 2220
aaaaccttcg cctggactgc cgccatgaga ataacaccaa ggataactcc atccagcatg 2280
agttcagcct gacccgagag aagaggaagc acgtgctctc aggcaccctt gggatacccg 2340
agcacacgta ccgctcccgc gtcaccctct ccaaccagcc ctatatcaag gtccttaccc 2400
tagccaactt caccaccaag gatgagggcg actacttttg tgagcttcgc gtctcgggcg 2460
cgaatcccat gagctccaat aaaagtatca gtgtgtatag agacaagctg gtcaagtgtg 2520
gcggcataag cctgctggtt cagaacacat cctggatgct gctgctgctg ctttccctct 2580
ccctcctcca agccctggac ttcatttctc tgtgagttta aacggtctcg agcacggaca 2640
tcgacctgca gccaagctta tcgataaaat aaaagatttt atttagtctc cagaaaaagg 2700
ggggaatgaa agaccccacc tgtaggtttg gcaagctagc ttaagtaacg ccattttgca 2760
aggcatggaa aatacataac tgagaataga gaagttcaga tcaaggttag gaacagagag 2820
acagcagaat atgggccaaa caggatatct gtggtaagca gttcctgccc cggctcaggg 2880
ccaagaacag atggtcccca gatgcggtcc cgccctcagc agtttctaga gaaccatcag 2940
atgtttccag ggtgccccaa ggacctgaaa tgaccctgtg ccttatttga actaaccaat 3000
cagttcgctt ctcgcttctg ttcgcgcgct tctgctcccc gagctcaata aaagagccca 3060
caacccctca ctcggcgcgc cagtcctccg atagactgcg tcgcccgggt acccgtgtat 3120
ccaataaacc ctcttgcagt tgcatccgac ttgtggtctc gctgttcctt gggagggtct 3180
cctctgagtg attgactacc cgtcagcggg ggtctttcat gggtaacagt ttcttgaagt 3240
tggagaacaa cattctgagg gtaggagtcg aatattaagt aatcctgact caattagcca 3300
ctgttttgaa tccacatact ccaatactcc tgaaatagtt cattatggac agcgcagaag 3360
agctggggag aattaattcg taatcatggt catagctgtt tcctgtgtga aattgttatc 3420
cgctcacaat tccacacaac atacgagccg gaagcataaa gtgtaaagcc tggggtgcct 3480
aatgagtgag ctaactcaca ttaattgcgt tgcgctcact gcccgctttc cagtcgggaa 3540
acctgtcgtg ccagctgcat taatgaatcg gccaacgcgc ggggagaggc ggtttgcgta 3600
ttgggcgctc ttccgcttcc tcgctcactg actcgctgcg ctcggtcgtt cggctgcggc 3660
gagcggtatc agctcactca aaggcggtaa tacggttatc cacagaatca ggggataacg 3720
caggaaagaa catgtgagca aaaggccagc aaaaggccag gaaccgtaaa aaggccgcgt 3780
tgctggcgtt tttccatagg ctccgccccc ctgacgagca tcacaaaaat cgacgctcaa 3840
gtcagaggtg gcgaaacccg acaggactat aaagatacca ggcgtttccc cctggaagct 3900
ccctcgtgcg ctctcctgtt ccgaccctgc cgcttaccgg atacctgtcc gcctttctcc 3960
cttcgggaag cgtggcgctt tctcatagct cacgctgtag gtatctcagt tcggtgtagg 4020
tcgttcgctc caagctgggc tgtgtgcacg aaccccccgt tcagcccgac cgctgcgcct 4080
tatccggtaa ctatcgtctt gagtccaacc cggtaagaca cgacttatcg ccactggcag 4140
cagccactgg taacaggatt agcagagcga ggtatgtagg cggtgctaca gagttcttga 4200
agtggtggcc taactacggc tacactagaa ggacagtatt tggtatctgc gctctgctga 4260
agccagttac cttcggaaaa agagttggta gctcttgatc cggcaaacaa accaccgctg 4320
gtagcggtgg tttttttgtt tgcaagcagc agattacgcg cagaaaaaaa ggatctcaag 4380
aagatccttt gatcttttct acggggtctg acgctcagtg gaacgaaaac tcacgttaag 4440
ggattttggt catgagatta tcaaaaagga tcttcaccta gatcctttta aattaaaaat 4500
gaagttttaa atcaatctaa agtatatatg agtaaacttg gtctgacagt taccaatgct 4560
taatcagtga ggcacctatc tcagcgatct gtctatttcg ttcatccata gttgcctgac 4620
tccccgtcgt gtagataact acgatacggg agggcttacc atctggcccc agtgctgcaa 4680
tgataccgcg agacccacgc tcaccggctc cagatttatc agcaataaac cagccagccg 4740
gaagggccga gcgcagaagt ggtcctgcaa ctttatccgc ctccatccag tctattaatt 4800
gttgccggga agctagagta agtagttcgc cagttaatag tttgcgcaac gttgttgcca 4860
ttgctacagg catcgtggtg tcacgctcgt cgtttggtat ggcttcattc agctccggtt 4920
cccaacgatc aaggcgagtt acatgatccc ccatgttgtg caaaaaagcg gttagctcct 4980
tcggtcctcc gatcgttgtc agaagtaagt tggccgcagt gttatcactc atggttatgg 5040
cagcactgca taattctctt actgtcatgc catccgtaag atgcttttct gtgactggtg 5100
agtactcaac caagtcattc tgagaatagt gtatgcggcg accgagttgc tcttgcccgg 5160
cgtcaatacg ggataatacc gcgccacata gcagaacttt aaaagtgctc atcattggaa 5220
aacgttcttc ggggcgaaaa ctctcaagga tcttaccgct gttgagatcc agttcgatgt 5280
aacccactcg tgcacccaac tgatcttcag catcttttac tttcaccagc gtttctgggt 5340
gagcaaaaac aggaaggcaa aatgccgcaa aaaagggaat aagggcgaca cggaaatgtt 5400
gaatactcat actcttcctt tttcaatatt attgaagcat ttatcagggt tattgtctca 5460
tgagcggata catatttgaa tgtatttaga aaaataaaca aataggggtt ccgcgcacat 5520
ttccccgaaa agtgccacct gacgtctaag aaaccattat tatcatgaca ttaacctata 5580
aaaataggcg tatcacgagg ccctttcgtc tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc 5640
tctgacacat gcagctcccg gagacggtca cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca 5700
gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg 5760
cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc accatagcct atagagtacg agggtatgcg 5820
gtgtgaaata ccgcacagat gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgcc attcgccatt 5880
caggctgcgc aactgttggg aagggcgatc ggtgcgggcc tcttcgctat tacgccagct 5940
ggcgaaaggg ggatgtgctg caaggcgatt aagttgggta acgccagggt tttcccagtc 6000
acgacgttgt aaaacgacgg cgcaaggaat ggtgcatgca aggagatggc gcccaacagt 6060
cccccggcca cggggcctgc caccataccc acgccgaaac aagcgctcat gagcccgaag 6120
tggcgagccc gatcttcccc atcggtgatg tcggcgatat aggcgccagc aaccgcacct 6180
gtggcgccgg tgatgccggc cacgatgcgt ccggcgtaga ggcgattagt ccaatttgtt 6240
aaagacagga tatcagtggt ccaggctcta gttttgactc aacaatatca ccagctgaag 6300
cctatagagt acgagccata gataaaataa aagattttat ttagtctcca gaaaaagggg 6360
ggaa 6364
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ggatatagct gagaacctcg 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ctaggggaat tggtgaagca 20
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<211> 6723
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tgaaagaccc cacctgtagg tttggcaagc tagcttaagt aacgccattt tgcaaggcat 60
ggaaaataca taactgagaa tagagaagtt cagatcaagg ttaggaacag agagacagca 120
gaatatgggc caaacaggat atctgtggta agcagttcct gccccggctc agggccaaga 180
acagatggtc cccagatgcg gtcccgccct cagcagtttc tagagaacca tcagatgttt 240
ccagggtgcc ccaaggacct gaaatgaccc tgtgccttat ttgaactaac caatcagttc 300
gcttctcgct tctgttcgcg cgcttctgct ccccgagctc aataaaagag cccacaaccc 360
ctcactcggc gcgccagtcc tccgatagac tgcgtcgccc gggtacccgt attcccaata 420
aagcctcttg ctgtttgcat ccgaatcgtg gactcgctga tccttgggag ggtctcctca 480
gattgattga ctgcccacct cgggggtctt tcatttggag gttccaccga gatttggaga 540
cccctgccca gggaccaccg acccccccgc cgggaggtaa gctggccagc ggtcgtttcg 600
tgtctgtctc tgtctttgtg cgtgtttgtg ccggcatcta atgtttgcgc ctgcgtctgt 660
actagttagc taactagctc tgtatctggc ggacccgtgg tggaactgac gagttctgaa 720
cacccggccg caaccctggg agacgtccca gggactttgg gggccgtttt tgtggcccga 780
cctgaggaag ggagtcgatg tggaatccga ccccgtcagg atatgtggtt ctggtaggag 840
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gacgttgggt taccttctgc tctgcagaat ggccaacctt taacgtcgga tggccgcgag 1140
acggcacctt taaccgagac ctcatcaccc aggttaagat caaggtcttt tcacctggcc 1200
cgcatggaca cccagaccag gtcccctaca tcgtgacctg ggaagccttg gcttttgacc 1260
cccctccctg ggtcaagccc tttgtacacc ctaagcctcc gcctcctctt cctccatccg 1320
ccccgtctct cccccttgaa cctcctcgtt cgaccccgcc tcgatcctcc ctttatccag 1380
ccctcactcc ttctctaggc gccggaatta gatctgaggg cctatttccc atgattcctt 1440
catatttgca tatacgatac aaggctgtta gagagataat tagaattaat ttgactgtaa 1500
acacaaagat attagtacaa aatacgtgac gtagaaagta ataatttctt gggtagtttg 1560
cagttttaaa attatgtttt aaaatggact atcatatgct taccgtaact tgaaagtatt 1620
tcgatttctt ggctttatat atcttgtgga aaggacgaaa caccgggata tagctgagaa 1680
cctcggtttt agagctagaa atagcaagtt aaaataaggc tagtccgtta tcaacttgaa 1740
aaagtggcac cgagtcggtg cttttttgag atctaccggt ttaattaagg taccgagggc 1800
ctatttccca tgattccttc atatttgcat atacgataca aggctgttag agagataatt 1860
agaattaatt tgactgtaaa cacaaagata ttagtacaaa atacgtgacg tagaaagtaa 1920
taatttcttg ggtagtttgc agttttaaaa ttatgtttta aaatggacta tcatatgctt 1980
accgtaactt gaaagtattt cgatttcttg gctttatata tcttgtggaa aggacgaaac 2040
accgctaggg gaattggtga agcagtttta gagctagaaa tagcaagtta aaataaggct 2100
agtccgttat caacttgaaa aagtggcacc gagtcggtgc ttttttgaat tcgctagcta 2160
ggtcttgaaa ggagtgggaa ttggctccgg tgcccgtcag tgggcagagc gcacatcgcc 2220
cacagtcccc gagaagttgg ggggaggggt cggcaattga tccggtgcct agagaaggtg 2280
gcgcggggta aactgggaaa gtgatgtcgt gtactggctc cgcctttttc ccgagggtgg 2340
gggagaaccg tatataagtg cagtagtcgc cgtgaacgtt ctttttcgca acgggtttgc 2400
cgccagaaca caggaccggt tctagagcgc tgccaccatg ggtgtcccta cccagctcct 2460
gggactgctc ctgctgtgga tcaccgacgc catctgcgac atccagatga cccagagccc 2520
tgccagcctg tctaccagcc tgggcgagac agtgaccatc cagtgtcagg ccagcgagga 2580
catctactct ggcctggctt ggtatcagca gaagcccggc aagagccctc agctgctgat 2640
ctacggcgcc agcgacctgc aggacggcgt gcctagcaga ttcagcggca gcggctccgg 2700
aacccagtac agcctgaaga tcaccagcat gcagaccgag gacgagggcg tgtacttctg 2760
ccagcaaggc ctgacctacc ctagaacctt cggaggaggc accaagctgg aactgaaggg 2820
cggaggcgga agtggaggcg gaggatctgg cggcggaggc tctgaagtgc agctgcagca 2880
gtctggcgct gaactggtcc ggcctggcac tagcgtgaag ctgtcctgca aggtgtccgg 2940
cgacaccatc accttctact acatgcactt cgtgaagcag aggccaggac agggcctgga 3000
atggatcggc agaatcgacc ctgaggacga gagcaccaag tacagcgaga agttcaagaa 3060
caaggccacc ctgaccgccg acaccagcag caacaccgcc tacctgaagc tgtctagcct 3120
gacctccgag gacaccgcca cctacttttg catctacggc ggctactact tcgactactg 3180
gggccagggc gtgatggtca ccgtgtccag catcgagttc atgtaccccc ctccctacct 3240
ggacaacgag agaagcaacg gcaccatcat ccacatcaaa gaaaagcacc tgtgccacac 3300
ccagagcagc cccaagctgt tctgggccct ggtggtggtg gccggcgtgc tgttctgtta 3360
cggcctgctg gtcacagtgg ccctgtgcgt gatctggacc aacagcagaa gaaacagagg 3420
cggccagagc gactacatga acatgacccc cagaaggcca ggcctgacca gaaagcccta 3480
ccagccctac gcccctgcca gagacttcgc cgcctacaga cccagagcca agttcagcag 3540
atccgccgag acagccgcca acctgcagga tcccaaccag ctgtttaacg agctgaacct 3600
gggcagacgg gaggaatttg acgtgctgga aaagaagaga gccagggacc ccgagatggg 3660
cggcaagcag cagagaagaa gaaaccctca ggaaggcgtc tacaacgccc tgcagaaaga 3720
caagatggcc gaggcctaca gcgagatcgg caccaagggc gagagaagaa ggggcaaggg 3780
ccacgatggc ctgtttcagg gcctgtccac cgccaccaag gacacctttg acgccctgca 3840
catgcagacc ctggccccca gatgagttta aacggtctcg agcacggaca tcgacctgca 3900
gccaagctta tcgataaaat aaaagatttt atttagtctc cagaaaaagg ggggaatgaa 3960
agaccccacc tgtaggtttg gcaagctagc ttaagtaacg ccattttgca aggcatggaa 4020
aatacataac tgagaataga gaagttcaga tcaaggttag gaacagagag acagcagaat 4080
atgggccaaa caggatatct gtggtaagca gttcctgccc cggctcaggg ccaagaacag 4140
atggtcccca gatgcggtcc cgccctcagc agtttctaga gaaccatcag atgtttccag 4200
ggtgccccaa ggacctgaaa tgaccctgtg ccttatttga actaaccaat cagttcgctt 4260
ctcgcttctg ttcgcgcgct tctgctcccc gagctcaata aaagagccca caacccctca 4320
ctcggcgcgc cagtcctccg atagactgcg tcgcccgggt acccgtgtat ccaataaacc 4380
ctcttgcagt tgcatccgac ttgtggtctc gctgttcctt gggagggtct cctctgagtg 4440
attgactacc cgtcagcggg ggtctttcat gggtaacagt ttcttgaagt tggagaacaa 4500
cattctgagg gtaggagtcg aatattaagt aatcctgact caattagcca ctgttttgaa 4560
tccacatact ccaatactcc tgaaatagtt cattatggac agcgcagaag agctggggag 4620
aattaattcg taatcatggt catagctgtt tcctgtgtga aattgttatc cgctcacaat 4680
tccacacaac atacgagccg gaagcataaa gtgtaaagcc tggggtgcct aatgagtgag 4740
ctaactcaca ttaattgcgt tgcgctcact gcccgctttc cagtcgggaa acctgtcgtg 4800
ccagctgcat taatgaatcg gccaacgcgc ggggagaggc ggtttgcgta ttgggcgctc 4860
ttccgcttcc tcgctcactg actcgctgcg ctcggtcgtt cggctgcggc gagcggtatc 4920
agctcactca aaggcggtaa tacggttatc cacagaatca ggggataacg caggaaagaa 4980
catgtgagca aaaggccagc aaaaggccag gaaccgtaaa aaggccgcgt tgctggcgtt 5040
tttccatagg ctccgccccc ctgacgagca tcacaaaaat cgacgctcaa gtcagaggtg 5100
gcgaaacccg acaggactat aaagatacca ggcgtttccc cctggaagct ccctcgtgcg 5160
ctctcctgtt ccgaccctgc cgcttaccgg atacctgtcc gcctttctcc cttcgggaag 5220
cgtggcgctt tctcatagct cacgctgtag gtatctcagt tcggtgtagg tcgttcgctc 5280
caagctgggc tgtgtgcacg aaccccccgt tcagcccgac cgctgcgcct tatccggtaa 5340
ctatcgtctt gagtccaacc cggtaagaca cgacttatcg ccactggcag cagccactgg 5400
taacaggatt agcagagcga ggtatgtagg cggtgctaca gagttcttga agtggtggcc 5460
taactacggc tacactagaa ggacagtatt tggtatctgc gctctgctga agccagttac 5520
cttcggaaaa agagttggta gctcttgatc cggcaaacaa accaccgctg gtagcggtgg 5580
tttttttgtt tgcaagcagc agattacgcg cagaaaaaaa ggatctcaag aagatccttt 5640
gatcttttct acggggtctg acgctcagtg gaacgaaaac tcacgttaag ggattttggt 5700
catgagatta tcaaaaagga tcttcaccta gatcctttta aattaaaaat gaagttttaa 5760
atcaatctaa agtatatatg agtaaacttg gtctgacagt taccaatgct taatcagtga 5820
ggcacctatc tcagcgatct gtctatttcg ttcatccata gttgcctgac tccccgtcgt 5880
gtagataact acgatacggg agggcttacc atctggcccc agtgctgcaa tgataccgcg 5940
agacccacgc tcaccggctc cagatttatc agcaataaac cagccagccg gaagggccga 6000
gcgcagaagt ggtcctgcaa ctttatccgc ctccatccag tctattaatt gttgccggga 6060
agctagagta agtagttcgc cagttaatag tttgcgcaac gttgttgcca ttgctacagg 6120
catcgtggtg tcacgctcgt cgtttggtat ggcttcattc agctccggtt cccaacgatc 6180
aaggcgagtt acatgatccc ccatgttgtg caaaaaagcg gttagctcct tcggtcctcc 6240
gatcgttgtc agaagtaagt tggccgcagt gttatcactc atggttatgg cagcactgca 6300
taattctctt actgtcatgc catccgtaag atgcttttct gtgactggtg agtactcaac 6360
caagtcattc tgagaatagt gtatgcggcg accgagttgc tcttgcccgg cgtcaatacg 6420
ggataatacc gcgccacata gcagaacttt aaaagtgctc atcattggaa aacgttcttc 6480
ggggcgaaaa ctctcaagga tcttaccgct gttgagatcc agttcgatgt aacccactcg 6540
tgcacccaac tgatcttcag catcttttac tttcaccagc gtttctgggt gagcaaaaac 6600
aggaaggcaa aatgccgcaa aaaagggaat aagggcgaca cggaaatgtt gaatactcat 6660
actcttcctt tttcaatatt attgaagcat ttatcagggt tattgtctca tgagcggata 6720
catatttgaa tgtatttaga aaaataaaca aataggggtt ccgcgcacat ttccccgaaa 6780
agtgccacct gacgtctaag aaaccattat tatcatgaca ttaacctata aaaataggcg 6840
tatcacgagg ccctttcgtc tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat 6900
gcagctcccg gagacggtca cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg 6960
tcagggcgcg tcagcgggtg ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga 7020
gcagattgta ctgagagtgc accatagcct atagagtacg agggtatgcg gtgtgaaata 7080
ccgcacagat gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgcc attcgccatt caggctgcgc 7140
aactgttggg aagggcgatc ggtgcgggcc tcttcgctat tacgccagct ggcgaaaggg 7200
ggatgtgctg caaggcgatt aagttgggta acgccagggt tttcccagtc acgacgttgt 7260
aaaacgacgg cgcaaggaat ggtgcatgca aggagatggc gcccaacagt cccccggcca 7320
cggggcctgc caccataccc acgccgaaac aagcgctcat gagcccgaag tggcgagccc 7380
gatcttcccc atcggtgatg tcggcgatat aggcgccagc aaccgcacct gtggcgccgg 7440
tgatgccggc cacgatgcgt ccggcgtaga ggcgattagt ccaatttgtt aaagacagga 7500
tatcagtggt ccaggctcta gttttgactc aacaatatca ccagctgaag cctatagagt 7560
acgagccata gataaaataa aagattttat ttagtctcca gaaaaagggg ggaa 7614

Claims (10)

1.重组T细胞，其特征在于：所述重组T细胞不含Rc3h1基因和/或Zc3h12a基因，或所述重组T细胞的Rc3h1基因和/或Zc3h12a基因产物的生物学功能被抑制。
2.根据权利要求1所述的重组T细胞，其特征在于：所述重组T细胞是将靶标T细胞的Rc3h1基因和/或Zc3h12a基因敲除得到的重组T细胞。
3.根据权利要求1或2所述的重组T细胞，其特征在于：所述靶标T细胞为CAR-T细胞或CD8 T细胞。
4.根据权利要求3所述的重组T细胞，其特征在于：所述CAR-T细胞为CD19-CAR-T细胞。
5.激活的重组T细胞，其特征在于：所述激活的重组T细胞是将权利要求1-4任一所述的重组T细胞进行激活得到的。
6.权利要求1-4中任一所述的重组T细胞的制备方法，其特征在于：所述制备方法包括将靶标T细胞的Rc3h1基因和/或Zc3h12a基因敲除，得到所述重组T细胞。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于：所述方法中通过CRISPR-Cas9方法将靶标T细胞的Rc3h1基因和/或Zc3h12a基因敲除。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述通过CRISPR-Cas9方法将靶标T细胞中Rc3h1基因敲除时靶向Rc3h1基因的靶序列为SEQ ID NO.2；
所述通过CRISPR-Cas9方法将靶标T细胞中Zc3h12a基因敲除时靶向Zc3h12a基因的靶序列为SEQ ID NO.3。
9.权利要求1-4任一所述的重组T细胞在制备抗肿瘤的产品中的应用。
10.敲除Rc3h1基因和/或Zc3h12a基因的物质或抑制Rc3h1基因和/或Zc3h12a基因表达的物质在如下任一中的应用：
1)在制备促进T细胞扩增的产品中的应用；
2)在制备抗肿瘤的产品中的应用；
3)在制备重组T细胞中的应用。
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