CN115633751A - 一种马铃薯茎叶中龙葵素的生物酶降解方法 - Google Patents
一种马铃薯茎叶中龙葵素的生物酶降解方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN115633751A CN115633751A CN202211352739.XA CN202211352739A CN115633751A CN 115633751 A CN115633751 A CN 115633751A CN 202211352739 A CN202211352739 A CN 202211352739A CN 115633751 A CN115633751 A CN 115633751A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- amino acid
- mutated
- site
- solanine
- mutant
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Classifications
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P60/00—Technologies relating to agriculture, livestock or agroalimentary industries
- Y02P60/80—Food processing, e.g. use of renewable energies or variable speed drives in handling, conveying or stacking
- Y02P60/87—Re-use of by-products of food processing for fodder production
Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
本发明涉及饲料领域，具体涉及一种马铃薯茎叶中龙葵素的生物酶降解方法。根据本申请的技术方案，对马铃薯茎叶饲料喷洒酵母突变株混合物，龙葵素含量显著降低(1‑10mg/g)，且远低于安全标准（20mg/100g）。该方法工艺可行性好，操作简单，提高了作用效率，可以提高动物适口性；酵母可以作为动物饲料的一部分提高处理后混合物的蛋白质含量，以及动物健康，提高生产效率，极大的提高马铃薯茎叶的利用效率和实用化前景。
Description
技术领域
本发明涉及饲料领域，具体涉及一种马铃薯茎叶中龙葵素的生物酶降解方法。
背景技术
马铃薯是继玉米，水稻，小麦之后的第四大粮食作物，其茎叶具有较高的饲用价值，含有较高的粗蛋白和较低的中性洗涤纤维。但是马铃薯块茎、表皮、茎叶中都含有不同浓度的龙葵素物质，直接饲喂家畜适口性差，且饲喂不当会引起中毒。
龙葵素，是一类有毒的甾体糖苷生物碱，不易溶于水，其中，茄碱和卡茄碱是主要成分，研究发现有毒的是其所带的糖苷基，因此研究和开发去除糖苷键的方法是降解龙葵素从而提高马铃薯茎叶资源利用率和保证动物生产安全的一个新的出发点。目前，对马铃薯茎叶中龙葵素降解的研究多集中于混贮和化学试剂处理等，龙葵素的降解效率低，而且处理后的马铃薯茎叶适口性差，而且有残留影响动物健康，因此没有得到很好的推广应用。研究和开发新的降解马铃薯茎叶中龙葵素的方法可以极大的提高其资源利用率和保证动物生产安全。
发明内容
本发明的目的在于提供一种马铃薯茎叶中龙葵素的生物酶降解方法。
根据本发明的马铃薯茎叶中龙葵素的生物酶降解方法，包括对马铃薯茎叶喷洒酵母菌株发酵液的混合物的步骤，其中，酵母菌株为包括突变的鼠李糖苷酶（rhaA）的酵母菌株，包括突变的半乳糖苷酶（galA）的酵母菌株，以及包括突变的葡萄糖苷酶（gluA）的酵母菌株，其中，
所述突变的鼠李糖苷酶（rhaA）由序列号为 WP_045271760.1的氨基酸序列经以下突变而得：第20位氨基酸由G突变为D，第82位氨基酸由T突变为I，第89位氨基酸由E突变为D，第105位氨基酸由L突变为P，第115位氨基酸由S突变为W，第162位氨基酸由A突变为S，第210位氨基酸由E突变为D，第221位氨基酸由V突变为A，第252位氨基酸由V突变为D，第348位氨基酸由T突变为M，第352位氨基酸由Q突变为K，第358位氨基酸由G突变为V，第416位氨基酸由S突变为R，第517位氨基酸由F突变为S，第586位氨基酸由T突变为I，第612位氨基酸由P突变为L，第750位氨基酸由I突变为V，以及第815位氨基酸由D突变为E；
所述突变的半乳糖苷酶（galA）由序列号为WP_045271763.1的氨基酸序列经以下突变而得：第20位氨基酸由A突变为G，第91位氨基酸由M突变为K，第102位氨基酸由R突变为C，第147位氨基酸由V突变为E，第150位氨基酸由W突变为G，第188位氨基酸由T突变为S，第282位氨基酸由D突变为V，第362位氨基酸由S突变为A，第386位氨基酸由V突变为F，第443位氨基酸由A突变为D，第664位氨基酸由D突变为N，第739位氨基酸由L突变为M，以及第828位氨基酸由P突变为T；
所述突变的葡萄糖苷酶（gluA）由序列号为WP_045271763.1的氨基酸序列经以下突变而得：第50位氨基酸由D突变为A，第87位氨基酸由K突变为N，第146位氨基酸由A突变为T，第179位氨基酸由V突变为F，第185位氨基酸由A突变为E，第247位氨基酸由G突变为R，第260位氨基酸由P突变为A，第290位氨基酸由R突变为H，第295位氨基酸由H突变为L，第316位氨基酸由E突变为K，第332位氨基酸由T突变为N，第374位氨基酸由A突变为V，第378位氨基酸由R突变为Q，第383位氨基酸由A突变为T，第495位氨基酸由A突变为V，第512位氨基酸由I突变为T，以及第543位氨基酸由L突变为P。
根据本发明的马铃薯茎叶中龙葵素的生物酶降解方法，其中，所述包括突变的鼠李糖苷酶（rhaA）的酵母菌株、包括突变的半乳糖苷酶（galA）的酵母菌株、包括突变的葡萄糖苷酶（gluA）的酵母菌株的发酵液以1:1:1混合。
根据本发明的马铃薯茎叶中龙葵素的生物酶降解方法，其中，将包含编码所述突变的鼠李糖苷酶的基因的重组表达载体导入酵母细胞中，获得所述包括突变的鼠李糖苷酶的酵母菌株。
根据本发明的马铃薯茎叶中龙葵素的生物酶降解方法，其中，将包含编码所述突变的半乳糖苷酶的基因的重组表达载体导入酵母细胞中，获得所述包括突变的半乳糖苷酶的酵母菌株。
根据本发明的马铃薯茎叶中龙葵素的生物酶降解方法，其中，将包含编码所述突变的葡萄糖苷酶的基因的重组表达载体导入酵母细胞中，获得所述包括突变的葡萄糖苷酶的酵母菌株。
本发明的优点在于：
根据本申请的技术方案，对马铃薯茎叶饲料喷洒酵母突变株混合物，龙葵素含量显著降低(1-10mg/g)，且远低于安全标准（20mg/100g）。该方法工艺可行性好，操作简单，提高了作用效率，可以提高动物适口性；酵母可以作为动物饲料的一部分提高处理后混合物的蛋白质含量，以及动物健康，提高生产效率，极大的提高马铃薯茎叶的利用效率和实用化前景。
附图说明
图1 显示原始酵母菌株与突变酵母菌株的酶活力的比较。
具体实施方式
实施例1
（1）克隆鼠李糖苷酶基因（rhaA）、半乳糖苷酶基因（galA）、葡萄糖苷酶基因（gluA）
节杆菌（Arthrobacter sp. S41）含有降解茄碱和卡茄碱的鼠李糖苷酶（α-rhamnosidase (rhaA)）、半乳糖苷酶（β-galactosidase (galA)）、葡萄糖苷酶（β-glucosidase (gluA)）。以节杆菌（Arthrobacter sp. S41）基因组为模板分别扩增出a-鼠李糖苷酶（rhaA）、半乳糖苷酶（galA）、葡萄糖苷酶的基因备用（gluA）。
（2）易错PCR进行随机突变
将（1）中获得rhaA、galA、gluA基因分别克隆到TA载体pMD-19T中，转入DH5α中，之后扩增质粒，得到pMD-19T-rhaA、pMD-19T- galA、pMD-19T-gluA。
根据已知菌株Arthrobacter sp. S41基因组中三个目的基因设计引物，在引物上下游两端分别引入酶切位点，分别以质粒pMD-19T-rhaA、pMD-19T- galA、pMD-19T-gluA为模板，按照 Diversify PCR Random Mutagenesis Kit 的说明书进行易错PCR扩增，胶回收后备用。
（3）构建组成型表达载体：
应用 PCR 方法从 P. pastoris GS115 染色体中扩增三磷酸甘油醛脱氢酶启动子(pGAP), 以其取代诱导型表达载体pPIC9K上的醇氧化酶启动子(pAOX1)，构建组成型表达质粒 pGAP9K。
（4）突变体库构建：
将易错PCR胶回收产物连接到组成型表达质粒 pGAP9K多克隆位点处，转化进入DH5α后扩增得到pGAP9K- rhaA、pGAP9K- galA、pGAP9K- gluA 三个基因的突变库。
（5）毕赤酵母宿主菌转化及阳性转化子的筛选：
用 Sal I单酶切分别处理质粒pGAP9K- rhaA、pGAP9K- galA、pGAP9K- gluA经胶回收后, 通过电转化的方法转化到 P.pastoris GS115 基因组中，涂布在SD平板上。
将SD 平板的转化子点种到YPD平板上，转入YPD液体培养基提基因组，进行PCR验证。同时配置含不同浓度的龙葵碱的BMGY培养基，将长满转化子的YPD平板复制到不同龙葵碱浓度的BMGY平板上，从龙葵碱浓度最高的平板上筛选阳性转化子。挑取从YPD板上PCR阳性转化子，并对照龙葵碱浓度最高的平板，挑选抗龙葵碱效果最好的单克隆（GS115-rhaA#1、GS115-galA#1、GS115-gluA#1）。
突变后的酵母用裂解液裂解，然后通过高效液相色谱-质谱分析突变后酶的氨基酸序列。
（6）组成型表达相关酶：
以龙葵素作为底物测定鼠李糖苷酶（rhaA）、半乳糖苷酶（galA）、葡萄糖苷酶测定酶活，酶活是指在25℃下，在1分钟内能转化1微摩尔龙葵素的酶量。
将最佳阳性单克隆GS115-rhaA#1、GS115-galA#1、GS115-gluA#1置于30 ℃、200r/min 进行摇瓶发酵，培养4 d，同时活化正常表达rhaA、galA、gluA的毕赤酵母GS115-rhaA、GS115-galA、GS115-gluAd的原始菌株，并在30 ℃、200 r/min摇瓶发酵4 d。将发酵液于 4 ℃、8 000 r/min离心10 min，取上清液作为酶液测定酶活力。在相同的操作下测定原始菌株与突变菌株的酶活，重复测定 3 次，每次 3个平行，统计数据。如图1所示，rhaA突变前的酶活为18.7±1.2，突变后的酶活为29.52±1.1；galA突变前的酶活为16.9±0.9，突变后的酶活为27.1±1.4；gluA突变前的酶活为19.8±0.8，突变后的酶活为36.3±1.3.从图1可知，通过改造筛选得到的突变株GS115-rhaA#1、GS115-galA#1、GS115-gluA#1显著提高了各自的酶活力。
实施例2降解马铃薯茎叶中龙葵素
取新鲜马铃薯茎叶，洗净后晾干，切成5厘米小段，过程中采用感应式水分仪和微波炉法持续测定马铃薯茎叶含水量，喷洒实施例1所获得的最佳突变株的酵母混合物（GS115-rhaA#1、GS115-galA#1、GS115-gluA#1），喷洒均匀，室温阴暗处贮藏7天即可。所述酵母GS115-rhaA#1：酵母GS115-galA#1：酵母GS115-gluA#1混合比例为：1：1：1，GS115-rhaA#1的菌体浓度为8.9×108，GS115-galA#1的菌体浓度为9.2×108，GS115-gluA#1的菌体浓度为9.5×108，所述马铃薯茎叶含水量为40%-60%时作切段处理。
2.1. 当测定马铃薯茎叶的含水量为60%时，经测定，降解龙葵素酶的指标及乳酸菌指标为：鼠李糖苷酶活力达到29.52IU/g、半乳糖苷酶27.1IU/g、葡萄糖苷酶36.30IU/g，使马铃薯茎叶中的龙葵素降低92%。
2.2. 当测定马铃薯茎叶的含水量为55%时，本实施例的降解龙葵素酶的指标及乳酸菌指标为：鼠李糖苷酶活力达到30.22IU/g、半乳糖苷酶29.3IU/g、葡萄糖苷酶34.50IU/g。经实施例2.2所述方法后，使马铃薯茎叶中的龙葵素降低94%。
2.3. 当测定马铃薯茎叶的含水量为50%时，本实施例的降解龙葵素酶的指标及乳酸菌指标为：鼠李糖苷酶活力达到31.31IU/g、半乳糖苷酶29.5IU/g、葡萄糖苷酶34.6IU/g，使马铃薯茎叶中的龙葵素降低95%。
2.4. 当测定马铃薯茎叶的含水量为45%时，经测定，降解龙葵素酶的指标及乳酸菌指标为：鼠李糖苷酶活力达到30.2IU/g、半乳糖苷酶28.4IU/g、葡萄糖苷酶34.6IU/g，使马铃薯茎叶中的龙葵素降低97%。
2.5. 当测定马铃薯茎叶的含水量为40%时，经测定，本实施例的降解龙葵素酶的指标及乳酸菌指标为：鼠李糖苷酶活力达到29.22IU/g、半乳糖苷酶28.3IU/g、葡萄糖苷酶34.80IU/g，使马铃薯茎叶中的龙葵素降低95%。
以上实施例仅用于解释本申请的技术方案，本领域技术人员通过简单替换获得的技术方案均在本申请的保护范围内。
Claims (5)
1.一种马铃薯茎叶中龙葵素的生物酶降解方法，其特征在于，所述方法包括对马铃薯茎叶喷洒酵母菌株发酵液的混合物的步骤，其中，酵母菌株为包括突变的鼠李糖苷酶的酵母菌株，包括突变的半乳糖苷酶的酵母菌株，以及包括突变的葡萄糖苷酶的酵母菌株，其中，
所述突变的鼠李糖苷酶由序列号为 WP_045271760.1的氨基酸序列通过以下突变而得：第20位氨基酸由G突变为D，第82位氨基酸由T突变为I，第89位氨基酸由E突变为D，第105位氨基酸由L突变为P，第115位氨基酸由S突变为W，第162位氨基酸由A突变为S，第210位氨基酸由E突变为D，第221位氨基酸由V突变为A，第252位氨基酸由V突变为D，第348位氨基酸由T突变为M，第352位氨基酸由Q突变为K，第358位氨基酸由G突变为V，第416位氨基酸由S突变为R，第517位氨基酸由F突变为S，第586位氨基酸由T突变为I，第612位氨基酸由P突变为L，第750位氨基酸由I突变为V，以及第815位氨基酸由D突变为E；
所述突变的半乳糖苷酶由序列号为WP_045271763.1的氨基酸序列通过以下突变而得：第20位氨基酸由A突变为G，第91位氨基酸由M突变为K，第102位氨基酸由R突变为C，第147位氨基酸由V突变为E，第150位氨基酸由W突变为G，第188位氨基酸由T突变为S，第282位氨基酸由D突变为V，第362位氨基酸由S突变为A，第386位氨基酸由V突变为F，第443位氨基酸由A突变为D，第664位氨基酸由D突变为N，第739位氨基酸由L突变为M，以及第828位氨基酸由P突变为T；
所述突变的葡萄糖苷酶由序列号为WP_045271763.1的氨基酸序列通过以下突变而得：第50位氨基酸由D突变为A，第87位氨基酸由K突变为N，第146位氨基酸由A突变为T，第179位氨基酸由V突变为F，第185位氨基酸由A突变为E，第247位氨基酸由G突变为R，第260位氨基酸由P突变为A，第290位氨基酸由R突变为H，第295位氨基酸由H突变为L，第316位氨基酸由E突变为K，第332位氨基酸由T突变为N，第374位氨基酸由A突变为V，第378位氨基酸由R突变为Q，第383位氨基酸由A突变为T，第495位氨基酸由A突变为V，第512位氨基酸由I突变为T，以及第543位氨基酸由L突变为P。
2.根据权利要求1所述的马铃薯茎叶中龙葵素的生物酶降解方法，其特征在于，所述包括突变的鼠李糖苷酶的酵母菌株、包括突变的半乳糖苷酶的酵母菌株、包括突变的葡萄糖苷酶的酵母菌株的发酵液以1:1:1混合。
3.根据权利要求1所述的马铃薯茎叶中龙葵素的生物酶降解方法，其特征在于，将包含编码所述突变的鼠李糖苷酶的基因的重组表达载体导入酵母细胞中，获得所述包括突变的鼠李糖苷酶的酵母菌株。
4.根据权利要求1所述的马铃薯茎叶中龙葵素的生物酶降解方法，其特征在于，将包含编码所述突变的半乳糖苷酶的基因的重组表达载体导入酵母细胞中，获得所述包括突变的半乳糖苷酶的酵母菌株。
5.根据权利要求1所述的马铃薯茎叶中龙葵素的生物酶降解方法，其特征在于，将包含编码所述突变的葡萄糖苷酶的基因的重组表达载体导入酵母细胞中，获得所述包括突变的葡萄糖苷酶的酵母菌株。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202211352739.XA CN115633751A (zh) | 2022-11-01 | 2022-11-01 | 一种马铃薯茎叶中龙葵素的生物酶降解方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202211352739.XA CN115633751A (zh) | 2022-11-01 | 2022-11-01 | 一种马铃薯茎叶中龙葵素的生物酶降解方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN115633751A true CN115633751A (zh) | 2023-01-24 |
Family
ID=84947024
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202211352739.XA Pending CN115633751A (zh) | 2022-11-01 | 2022-11-01 | 一种马铃薯茎叶中龙葵素的生物酶降解方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN115633751A (zh) |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101856427A (zh) * | 2010-06-29 | 2010-10-13 | 湖南农业大学 | 从马铃薯皮中提制龙葵素的方法 |
| CN103340281A (zh) * | 2013-06-08 | 2013-10-09 | 浙江大学 | 生物转化马铃薯茎叶和向日葵饼粕制备饲料用复合酶兼益生菌制剂的方法 |
| CN103409333A (zh) * | 2013-05-20 | 2013-11-27 | 山东大学 | 一株持续高效分泌β-葡萄糖苷酶的重组酿酒酵母菌株及其应用 |
| CN107518393A (zh) * | 2017-09-27 | 2017-12-29 | 田光 | 一种龙葵酵素及其制备方法 |
-
2022
- 2022-11-01 CN CN202211352739.XA patent/CN115633751A/zh active Pending
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101856427A (zh) * | 2010-06-29 | 2010-10-13 | 湖南农业大学 | 从马铃薯皮中提制龙葵素的方法 |
| CN103409333A (zh) * | 2013-05-20 | 2013-11-27 | 山东大学 | 一株持续高效分泌β-葡萄糖苷酶的重组酿酒酵母菌株及其应用 |
| CN103340281A (zh) * | 2013-06-08 | 2013-10-09 | 浙江大学 | 生物转化马铃薯茎叶和向日葵饼粕制备饲料用复合酶兼益生菌制剂的方法 |
| CN107518393A (zh) * | 2017-09-27 | 2017-12-29 | 田光 | 一种龙葵酵素及其制备方法 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Zhou et al. | Correlation of cellulase gene expression and cellulolytic activity throughout the gut of the termite Reticulitermes flavipes | |
| Li et al. | Achieving efficient protein expression in Trichoderma reesei by using strong constitutive promoters | |
| Allgaier et al. | Targeted discovery of glycoside hydrolases from a switchgrass-adapted compost community | |
| US9080163B2 (en) | Cellobiohydrolase variants | |
| Ogunyewo et al. | Synergistic action of a lytic polysaccharide monooxygenase and a cellobiohydrolase from Penicillium funiculosum in cellulose saccharification under high-level substrate loading | |
| WO2009158627A2 (en) | Cellulosic protein expression in yeast | |
| Zhao et al. | Transcription factor Atf1 regulates expression of cellulase and xylanase genes during solid-state fermentation of ascomycetes | |
| Thomas et al. | Industrial enzymes: xylanases | |
| CN114686386B (zh) | 一种生产甲醇菌体蛋白联产纤维素酶的毕赤酵母及其应用 | |
| Cheema et al. | Isolation of a gene encoding a cellulolytic enzyme from swamp buffalo rumen metagenomes and its cloning and expression in Escherichia coli | |
| Wu et al. | Identification of a novel fungus, Leptosphaerulina chartarum SJTU59 and characterization of its xylanolytic enzymes | |
| Zhang et al. | Identification of an essential regulator controlling the production of raw-starch-digesting glucoamylase in Penicillium oxalicum | |
| Yang et al. | Recombinant multi-functional cellulase activity in submerged fermentation of lignocellulosic wastes | |
| CN113151330B (zh) | 一种酸性蛋白酶突变体及其制备方法和应用 | |
| Azizi et al. | Characterization of a thermostable endoglucanase produced by Isoptericola variabilis sp. IDAH9 | |
| US20210171993A1 (en) | Polysaccharide-oxidizing composition and uses thereof | |
| CN106754987A (zh) | 一种多糖裂解单加氧酶lpmo m1编码基因及其酶与制备方法和应用 | |
| CN115633751A (zh) | 一种马铃薯茎叶中龙葵素的生物酶降解方法 | |
| Li et al. | PoxCbh, a novel CENPB‐type HTH domain protein, regulates cellulase and xylanase gene expression in Penicillium oxalicum | |
| CN114736881B (zh) | 酸稳定性提高的葡萄糖氧化酶GoxM10突变体A4D及其衍生突变体和应用 | |
| CN111757931A (zh) | 变体g6p g7p葡糖淀粉酶组合物及方法 | |
| Banerjee et al. | Molecular cloning, characterisation and expression of a gene encoding cellobiose dehydrogenase from Termitomyces clypeatus | |
| CN114107359B (zh) | 一种通过调控细胞代谢提高里氏木霉表达纤维素酶能力的方法 | |
| CN103987837A (zh) | 简单糖饥饿的木质纤维素生物质酶生产 | |
| Kalinina et al. | Expression of the Xylanase Gene from Paenibacillus brasilensis X1 in Pichia pastoris and Characteristics of the Recombinant Enzyme |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |