CN102154344B - 编码β-葡萄糖苷酶的基因及重组表达载体及重组酿酒酵母表达菌株及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种编码β-葡萄糖苷酶的基因及重组表达载体及重组酿酒酵母表达菌株及应用，编码β-葡萄糖苷酶的基因，它具有序列表SEQ ID No.1所述2913个核苷酸序列中的第1位到第2828位的核苷酸序列。本发明的重组酿酒酵母表达菌株能高效表达β-葡萄糖苷酶，快速、高效降解利用纤维二糖或木质纤维素降解物来产醇，可用于纤维素降解产醇的SSF工艺，降低纤维素酶的成本，提高效率；这对清洁有效的利用废弃的纤维素生产能源、解决当前能源危机具有极其重要的意义。同时，本发明的重组酿酒酵母还能用于医药、食品、化工领域试剂的清洁生产。

Description

编码β-葡萄糖苷酶的基因及重组表达载体及重组酿酒酵母表达菌株及应用

技术领域

本发明涉及一种β-葡萄糖苷酶基因及该基因的表达及其在能源、医药、食品、化工领域中的应用。

背景技术

β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase，EC3.2.1.21)，是一种能催化糖基基团转移反应的酶。它能水解多种β-葡萄糖苷键，具有底物广谱性，几乎存在于一切生物体内，有着多方面的、重要的生理功能；同时在体外特定的条件下，它还能催化合成反应，如催化合成烷基糖苷。因此，它在能源、医药、食品、化工等领域中有着重要的应用价值。

能源领域是β-葡萄糖苷酶最为重要的一个应用领域，即木质纤维素原料降解、生产生物燃料如乙醇、丁醇等。β-葡萄糖苷酶作为纤维素酶系三类水解酶之一(另两类为：外切葡聚糖酶，EC3.2.1.91，cellobiosidase；内切葡聚糖酶，EC 3.2.1.4，glucanohydrolase)，负责进一步水解由外切葡聚糖酶和内切葡聚糖酶作用得到的纤维寡糖或纤维二糖为葡萄糖，同时解除纤维寡糖或纤维二糖积累对外切葡聚糖酶/内切葡聚糖酶的抑制作用，因此，β-葡萄糖苷酶催化的水解反应是纤维素降解、进一步生产生物燃料中的限速步骤(Sukumaran RK，Singhania RR，Pandey A.2005.Microbial cellulases-Production，applications and challenges.Journal of Scientific & Industrial Research，2005，64(11)：832-844)。早先相关的工艺路线是先糖化后发酵(Separate Hydrolysis and Fermentation，SHF)，即先预处理木质纤维素，再用纤维素酶水解其中的纤维素组分产生单糖，然后用酵母菌或其它微生物发酵产生乙醇、丁醇等，其缺点是糖化步骤中积累的葡萄糖会反馈抑制β-葡萄糖苷酶水解纤维二糖，而纤维二糖的积累反过来又抑制外切葡聚糖酶和内切葡聚糖酶的活性，导致纤维素降解的终止。这种工艺后来改进为同步糖化发酵(Simultaneous Saccharification and Fermentation，SSF)，即纤维素酶对纤维素的水解和酵母菌或其它微生物发酵在同一容器中进行，一边酶解产生糖，一边发酵转化成醇，其优点是减少了反应器的个数降低了设备投资，同时避免了产物抑制问题。缺点是纤维素酶酶活低、生产成本高的问题仍然存在，同时纤维素酶的作用温度和常用发酵酵母菌或其它微生物的发酵温度不匹配。解决这些问题的方案之一是开发出能同时高效产生纤维素酶和高效发酵单糖产醇的微生物(Breaking the Biological Barriers to Cellulosic Ethanol：AJoint Research Agenda.Report from the December 2005 Workshop，DOE/SC-0095.U.S.Department of Energy Office of Science)。

在医药领域，通过催化具有强有力的生物学活性的糖苷配基单元的释放和生产，β-葡萄糖苷酶可用于抗肿瘤试剂的生产；在食品领域，能催化大豆中的抗癌成份大豆异黄酮(如genistein、diadzein等)使其从不易为人体吸收的结合型糖苷转化为易为人体吸收的游离型苷元；在化工领域，能催化醇和糖合成烷基糖苷(一类新型具有阴离子性质的非离子表面活性剂)。

β-葡萄糖苷酶已经从多种微生物中分离出来，研究较多的有：霉菌如曲霉(Aspergillus)(McCleary，B.V.，Harrington，J.1988.Purification of beta-D-glucosidase from Aspergillus niger.Methods Enzymol酶学方法.160，575-583)、腐殖菌(Humicola)(Sonia KG，Chadha BS，BadhanAK，et al.2008.Identification of glucose tolerant acid active beta-glucosidases from thermophilicand thermotolerant fungi.World Journal of Microbiology & Biotechnology.24(5)：599-604)、青霉(Penicillium)(Menon K，Rao KK，Pushalkar S.1994.Production of β-glucosidase byPenicillium rubrum O stall.Indian J Exp Biol.32，706-709)、木霉(Trichoderma)(Chen，H，Hayn，M，Esterbauer，H.1992.Purification and characterization of two extracellular beta-glucosidasesfrom Trichoderma reesei.Biochim Biophys Acta，1121(1-2)：54-60)，细菌如芽孢杆菌(Bacillus)、梭菌(Clostridium)，酵母如扣囊复膜孢酵母等。一般认为木霉酶系组分全、产酶量大，是理想的木质纤维素降解酶酶制剂菌种，但其不足之处是β-葡萄糖苷酶活性相对比例过低。而曲霉是产β-葡萄糖苷酶的优良菌种，来自黑曲霉的β-葡萄糖苷酶商品酶制剂如诺维信公司的产品Novozym 188，可用于弥补木霉酶制剂的欠缺。

鉴于β-葡萄糖苷酶的重要性，β-葡萄糖苷酶编码基因也已经从多种微生物中被分离、鉴定出来，并被克隆、表达于不同的宿主，应用于不同的领域，相关的文献和专利很多。但另一方面，虽然微生物产生的β-葡萄糖苷酶种类多，但不同来源的β-葡萄糖苷酶具有多种不同的性质，从而导致各具特色的应用范围，因此，针对不断发展的、不同的工业应用，需要不断地分离和鉴定新的β-葡萄糖苷酶(基因)，开发出具有新特性的β-葡萄糖苷酶，或开发出新的β-葡萄糖苷酶生产工艺、新的应用途径，从而更好地满足生产的需要。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种编码β-葡萄糖苷酶的基因。

本发明的第二个目的是提供一种含有编码β-葡萄糖苷酶的基因的重组表达盒。

本发明的第三个目的是提供含有上述重组表达盒的重组表达载体。

本发明的第四个目的是提供含有上述重组表达盒的重组表达载体的构建方法。

本发明的第五个目的是提供含有上述重组表达载体的重组酿酒酵母表达菌株。

本发明的第六个目的是提供上述重组酿酒酵母表达菌株的用途。

本发明的技术方案概述如下：

一种编码β-葡萄糖苷酶的基因，它具有序列表SEQ ID No.1所述2913个核苷酸序列中的第1位到第2828位的核苷酸序列。

一种含有编码β-葡萄糖苷酶的基因的重组表达盒，由启动子、分泌肽编码序列、基因外显子序列和终止子组成或由启动子、分泌肽编码序列、基因外显子序列、锚定肽编码序列和终止子组成；

启动子为序列表SEQ ID No.2所述的酿酒酵母磷酸丙糖异构酶TPI基因启动子Ptpi；分泌肽编码序列为序列表SEQ ID No.3所述的瑞氏木霉木聚糖酶II分泌肽编码核苷酸序列xyn2S；所述基因外显子序列是编码β-葡萄糖苷酶的基因序列中去除5个内含子后的2526个核苷酸序列组成，所述5个内含子分别是对应SEQ ID No.1所述核苷酸序列中第144位到第195位、第241位到第298位、第352位到第412位、第1603位到第1682位和第2543位到2593位的核苷酸序列；所述锚定肽编码序列为序列表SEQ ID No.4所述的酿酒酵母细胞壁2蛋白基因cwp2 3’端207个核苷酸序列；所述终止子为序列表SEQ ID No.5所述的酿酒酵母乙醇脱氢酶ADH I基因终止子TadhI。

一种含有上述重组表达盒的重组表达载体，用下述方法构建：

将载体YEplac195用PstI和SmaI双切，得到5220bp片段，再用PstI和ScaI双切上述重组表达盒，进行连接，转化大肠杆菌Top10感受态细胞后得到重组表达载体；或将载体YCplac33用PstI和SmaI双切，得到5582bp片段，再用PstI和ScaI双切上述重组表达盒，进行连接，转化大肠杆菌Top10感受态细胞后得到第二种重组表达载体。

一种含有上述重组表达盒的重组表达载体的构建方法，包括如下步骤：

将载体YEplac195用PstI和SmaI双切，得到5220bp片段，再用PstI和ScaI双切权利要求2的重组表达盒，进行连接，转化大肠杆菌Top10感受态细胞后得到重组表达载体；或将载体YCplac33用PstI和SmaI双切，得到5582bp片段，再用PstI和ScaI双切权利要求2的重组表达盒，进行连接，转化大肠杆菌Top10感受态细胞后得到第二种重组表达载体。

一种含有上述重组表达载体的重组酿酒酵母表达菌株。

重组酿酒酵母表达菌株在能源、医药、食品或化工领域中的应用。

本发明提供了一个新的β-葡萄糖苷酶基因序列和其内含子序列、外显子序列，其能编码高活性的β-葡萄糖苷酶，丰富了基因/酶资源；通过基因、拷贝数、表达元件、发酵工艺诸因素的综合、优化搭配，提供了针对不同应用目的的不同的高效表达此β-葡萄糖苷酶的表达盒、表达载体和酿酒酵母表达菌株，从而提供了高效表达此β-葡萄糖苷酶应用于不同目的的方法。本发明的重组酿酒酵母表达菌株能高效表达β-葡萄糖苷酶，快速、高效降解利用纤维二糖或木质纤维素降解物来产醇，可用于纤维素降解产醇的SSF工艺，降低纤维素酶的成本，提高效率；这对清洁有效的利用废弃的纤维素生产能源、解决当前能源危机具有极其重要的意义。同时，本发明的重组酿酒酵母还能用于医药、食品、化工领域试剂的清洁生产。

图说明

图1为PCR产物PCR1片段的琼脂糖凝胶电泳图谱。

图2为质粒pGEM-T-easy-PCR2图谱。

图3为PCR产物PCR3片段图谱。

图4为PCR产物PCR4片段图谱。

图5为质粒pGEM-T easy-Ptpi-xyn2s-exon图谱。

图6为质粒pGEM-T easy-Ptpi-xyn2s-exon-TadhI图谱。

图7为重组表达盒1图谱。

图8为质粒pGEM-T easy-Ptpi-xyn2s-exon-cwp-TadhI图谱。

图9为质粒YCplac33-Ptpi-xyn2s-exon-TadhI图谱。

图10为质粒YCplac33-Ptpi-xyn2s-exon-cwp-TadhI图谱。

图11为质粒YEplac195-Ptpi-xyn2s-exon-TadhI图谱。

图12为质粒YEplac195-Ptpi-xyn2s-exon-cwp-TadhI图谱。

图13为重组菌株YPC培养基、有氧条件下的生长曲线。

图14为重组菌株利用纤维二糖好氧生长发酵的生长曲线。

图15为重组菌株利用纤维二糖厌氧生长发酵的生长曲线。

具体实施方式

酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae是传统的乙醇生产菌株，具有许多优良的生产性能；在酿酒酵母中高效分泌表达木质纤维素水解酶，使其能直接发酵纤维素产醇，将有助于简化加工过程、降低能耗，从而降低生物转化过程的成本。同时，酿酒酵母又是公认的对人体无害的安全菌株，使用其表达β-葡萄糖苷酶的重组菌株来催化合成有医药、营养价值或其它应用价值的试剂，将有助于推动在医药、食品、化工领域中清洁生产的应用。

影响异源纤维素酶基因在酿酒酵母中表达的因素很多，基因来源和序列特性、拷贝数、表达元件的组合、分泌途径及分泌过程中蛋白质的正确加工、锚定与否等等，都会影响到最终的表达水平和降解纤维素发酵产醇或催化合成的效果，这些因素相互之间也有交互作用。

用于纤维素产醇时，纤维素底物的特殊性决定了纤维素酶与底物能否充分接触是影响纤维素酶降解效果的一个重要因素，这也影响到纤维素酶表达于酿酒酵母的方式。而在催化合成如烷基糖苷、大豆异黄酮苷元等的反应中，β-葡萄糖苷酶锚定于酿酒酵母细胞表面、以类似固定化酶的方式作用，可能更有优势。

本发明中，酿酒酵母菌株可以是任何来源的URA缺陷型酿酒酵母菌株。实施例中，在酿酒酵母中表达的β-葡萄糖苷酶基因已经去除了内含子，表达元件包括：酿酒酵母磷酸丙糖异构酶(TPI)基因启动子(P tpi)，酿酒酵母乙醇脱氢酶(ADH I)基因终止子(Tadh I)，瑞氏木霉木聚糖酶II分泌肽编码核苷酸序列xyn2S，酿酒酵母细胞壁2蛋白基因cwp2的3’端207bp核苷酸序列(编码锚定肽，CWP2)；表达载体包括YCplac33(数个拷贝数)和YEplac195(几十个拷贝数)。

下面结合图和具体实施例对本发明做进一步的说明，但本发明的保护范围不仅限于此。若非特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1  以染色体DNA为模板，分离、克隆和测序β-葡萄糖苷酶基因

培养曲霉菌株(Aspergillus)(CICC 2193)，参照文献(吴志红，汪天虹，黄卫，曲音波.简便易行的丝状真菌染色体DNA提取法.菌物系统20(4)：575-577，2001)的方法，提取染色体DNA。以染色体DNA为模板进行PCR，使用表1中的SEQ ID No6、SEQ ID No.7所示序列为上、下游引物P1、P2，全式金公司生产的Fast Pfu聚合酶，50℃退火1min，72℃延伸3min，共32个循环。得到稍小于3kb的PCR片段，命名为PCR1(琼脂糖凝胶电泳图谱见图1)；按Promega公司的TA克隆载体pGEM-T easy试剂盒的说明书操作，将PCR1连至pGEM-T easy，转化大肠杆菌Top10感受态细胞，同时挑选3个转化子克隆进行测序，测序结果表明没有突变发生的克隆片段的核苷酸序列见序列表中SEQ ID No.1(2913bp)，相应的质粒命名为pGEM-T easy-PCR1。

表1、本发明克隆和构建用引物

实施例2  以cDNA为模板，分离、克隆和测序β-葡萄糖苷酶基因

培养同实施例1的曲霉菌株，用Trizol试剂按照试剂盒说明提取曲霉的总RNA，取2μg总RNA，用反转录试剂盒按照试剂盒说明将其反转录成cDNA(Promega公司)，以该cDNA为模板，用表1中SEQ ID No.6、SEQ ID No.7所示序列为上、下游引物P1、P2，进行PCR，扩增出约2.6kb大小的片段，命名为PCR2；按Promega公司的TA克隆载体pGEM-T easy试剂盒的说明书操作，将PCR2连至pGEM-T easy，转化大肠杆菌Top10感受态细胞，同时挑选3个转化子克隆进行测序，测序结果表明没有突变发生的克隆片段的核苷酸序列见序列表中SEQ ID No.22，相应的质粒pGEM-T easy-PCR2图谱见图2。

实施例3  β-葡萄糖苷酶基因序列范围和外显子、内含子序列的生物信息学方法鉴定

将SEQ ID No.1序列与SEQ ID No.22序列进行对比分析，结合生物信息学相关分析软件和手段，初步鉴定出SEQ ID No.1序列中的第1-2828bp核苷酸序列为含内含子的β-葡萄糖苷酶基因，共5个内含子(intron)，其分别对应第144-195bp、第241-298bp、第352-412bp、第1603-1682bp和第2543-2593bp核苷酸序列，大小分别为52bp、58bp、61bp、80bp、51bp；相应地，共有6个外显子(exon)，大小依次为143bp、45bp、53bp、1190bp、860bp、235bp。SEQ ID No.22序列中的第1-2526bp核苷酸序列为不含内含子的β-葡萄糖苷酶基因，其由六个外显子(exon)组成。

实施例4  携带β-葡萄糖苷酶基因的重组表达盒(第一种重组表达盒)的构建

β-葡萄糖苷酶基因的重组表达盒构建示意图见图3。所用引物序列见表1。步骤如下：

1、提取酿酒酵母W303a(ATCC MYA-151)菌株染色体DNA和瑞氏木霉ATCC 56765菌株染色体DNA；

2、以酿酒酵母W303a菌株染色体DNA为模板，使用SEQ ID No.8、SEQ ID No.9所示序列为上、下游引物P3、P4，扩增得到含有SEQ ID No.2所示689bp酿酒酵母tpi基因启动子序列Ptpi的PCR片段(NdeI-AvrII-PstI-Ptpi，734bp)

3、以瑞氏木霉ATCC 56765菌株染色体DNA为模板，使用SEQ ID No.10、SEQ ID No.11所示序列为上、下游引物P5、P6，扩增得到含有SEQ ID No.3所示99bp瑞氏木霉木聚糖酶II分泌肽编码核苷酸序列xyn2S的PCR片段(xyn2s，119bp)；

4、以步骤“2”和“3”中的PCR片段为模板，使用SEQ ID No.8、SEQ ID No.11所示序列为上、下游引物P3、P6，一次交叉重叠延伸PCR扩增得到PCR片段(NdeI-AvrII-PstI-Ptpi-xyn2s，833bp)；

5、以pGEM-T easy-PCR2质粒为模板，使用SEQ ID No.12、SEQ ID No.13所示序列为上、下游引物P7、P8，扩增得到PCR片段(exon1-exon2-exon3-exon4-ClaI，379bp)；

6、以步骤“4”和步骤“5”所得PCR产物为模板，使用SEQ ID No.8、SEQ ID No.13所示序列为上、下游引物P3、P8，二次交叉重叠延伸PCR扩增得到PCR片段(NdeI-AvrII-PstI-Ptpi-xyn2s-exon1-exon2-exon3-exon4-ClaI，1192bp)，命名为PCR3(见图3)；

7、以pGEM-T easy-PCR2质粒为模板，使用SEQ ID No.14、SEQ ID No.15所示序列为上、下游引物P9、P10，扩增得到PCR片段(NcoI-exon4-exon5-exon6，1279bp)；

8、以酿酒酵母W303a菌株染色体DNA为模板，使用SEQ ID No.16、SEQ ID No.17所示序列为上、下游引物P11、P12，扩增得到含有SEQ ID No.5所示330bp酿酒酵母乙醇脱氢酶ADHI基因终止子TadhI序列的PCR片段(TadhI-ScaI-AvrII-NcoI，378bp)；

9、以步骤“7”和步骤“8”所得PCR产物为模板，使用SEQ ID No.14、SEQ ID No.17所示序列为上、下游引物P9、P12，一次交叉重叠延伸PCR扩增得到PCR片段(NcoI-exon4-exon5-exon6-TadhI-ScaI-AvrII-NcoI，1637bp)，命名为PCR4(见图4)；

10、PCR3用NdeI和ClaI双酶酶切后与同样双酶酶切的pGEM-T easy-PCR2质粒大片段连接，得到质粒pGEM-T easy-Ptpi-xyn2s-exon，其图谱见图5；

11、PCR4用NcoI酶切后与同样酶切的质粒pGEM-T easy-Ptpi-xyn2s-exon的大片段连接，筛选得到正向连接转化子质粒，得到质粒pGEM-T easy-Ptpi-xyn2s-exon-TadhI，其图谱见图6。

图6中从NdeI/AvrII/PstI到ScaI/AvrII/NcoI的片段包含了表达元件—酿酒酵母来源启动子、瑞氏木霉来源分泌肽编码核苷酸序列、β-葡萄糖苷酶基因、酿酒酵母来源终止子，即构成了图7中的重组表达盒(第一重组表达盒)。此表达盒可方便地切下而转移到不同的载体中去。

实施例5  携带β-葡萄糖苷酶基因的重组表达盒(第二重组表达盒)的构建

1、提取酿酒酵母W303a菌株染色体DNA；

2、以pGEM-T easy-PCR2质粒为模板，使用SEQ ID No.14、SEQ ID No.18所示序列为上、下游引物P9、P13，扩增得到PCR片段(NcoI-exon4-exon5-exon6，1276bp)，exon6中不包含终止密码子；

3、以酿酒酵母W303a菌株染色体DNA为模板，使用SEQ ID No.19、SEQ ID No.20所示序列为上、下游引物P14、P15，扩增得到含有SEQ ID No.4所示207bp酿酒酵母细胞壁2蛋白基因cwp2 3’端207个核苷酸序列的PCR片段(cwp，227bp)；

4、以酿酒酵母W303a菌株染色体DNA为模板，使用SEQ ID No.21、SEQ ID No.17所示序列为上、下游引物P16、P12，扩增得到含有SEQ ID No.5所示330bp酿酒酵母乙醇脱氢酶ADHI基因终止子TadhI序列的PCR片段(TadhI-ScaI-AvrII-NcoI，379bp)；

5、以步骤“3”和步骤“4”所得PCR产物为模板，使用SEQ ID No.19、SEQ ID No.17所示序列为上、下游引物P14、P12，一次交叉重叠延伸PCR扩增得到PCR片段(cwp-TadhI-ScaI-AvrII-NcoI，586bp)；

6、以步骤“2”和步骤“5”所得PCR产物为模板，使用SEQ ID No.14、SEQ ID No.17所示序列为上、下游引物P9、P12，二次交叉重叠延伸PCR扩增得到PCR片段(NcoI-exon4-exon5-exon6-cwp-TadhI-ScaI-AvrII-NcoI，1842bp)，命名为PCR5；

7、PCR5用NcoI酶切后与同样酶切的质粒pGEM-T easy-Ptpi-xyn2s-exon的大片段连接，筛选得到正向连接转化子质粒，得到质粒pGEM-T easy-Ptpi-xyn2s-exon-cwp-TadhI，其图谱见图8。

图8中从NdeI/AvrII/PstI到ScaI/AvrII/NcoI的片段包含了表达元件—酿酒酵母来源启动子、瑞氏木霉来源分泌肽编码核苷酸序列、β-葡萄糖苷酶基因、酿酒酵母来源锚定肽编码核苷酸序列、酿酒酵母来源终止子，即构成了基因的重组表达盒(第二重组表达盒)。此表达盒可方便地切下而转移到不同的载体中去。

实施例6重组表达质粒的构建

将载体YCplac33用PstI和SmaI双切，得到5582bp片段，再用PstI和ScaI双切实施例4图6所示质粒、得到不含cwp锚定肽核酸序列的表达盒(第一重组表达盒)，或实施例5图8所示质粒、得到含cwp锚定肽核酸序列的表达盒(第二重组表达盒)，分别进行连接，转化大肠杆菌Top10感受态细胞后得到重组表达载体：1)YCplac33-Ptpi-xyn2s-exon-TadhI(见图9)和3)YCplac33-Ptpi-xyn2s-exon-cwp-TadhI(见图10)；

将载体YEplac195用PstI和SmaI双切，得到5220bp片段，再用PstI和ScaI双切实施例4图6所示质粒、得到不含cwp锚定肽核酸序列的表达盒(第一重组表达盒)，或实施例5图8所示质粒、得到含cwp锚定肽核酸序列的表达盒(第二重组表达盒)，分别进行连接，转化大肠杆菌Top10感受态细胞后得到重组表达载体：2)YEplac195-Ptpi-xyn2s-exon-TadhI(见图11)和4)YEplac195-Ptpi-xyn2s-exon-cwp-TadhI(见图12)。

实施例7重组酿酒酵母表达菌株的构建

将实施例6中的四个质粒1)、2)、3)、4)和YCplac33、YEplac195载体质粒分别转化酿酒酵母W303a菌株，使用尿嘧啶(URA)营养缺陷型选择标记进行筛选，即使用缺省了尿嘧啶的基本培养基CMG(氨基酸碱基混合物(见表2)，0.83g/L；不含氨基酸的酵母氮源YeastNitrogen Base(YNB)，6.7g/L；葡萄糖，20g/L)平板简称URA平板进行筛选，共得到6个菌株，依次分别简称为菌株1到菌株6。

表2氨基酸碱基混合物成分

腺嘌呤50mg/L	亮氨酸100mg/L	精氨酸20mg/L	赖氨酸30mg/L
				天冬氨酸100mg/L	甲硫氨酸20mg/L	谷氨酸100mg/L	苯丙氨酸50mg/L
组氨酸100mg/L	丝氨酸150mg/L	异亮氨酸30mg/L	苏氨酸150mg/L
				色氨酸100mg/L	酪氨酸30mg/L	尿嘧啶50mg/L	缬氨酸150mg/L

注：省却特定的氨基酸成分，即可做成选择培养基。调pH值5.6，葡萄糖110℃灭菌15min，其它成分121℃灭菌21min，使用前混合。

实施例8重组酿酒酵母表达菌株以纤维二糖为底物的生长初步评价

从实施例7中的转化板上挑菌接种CMG液体培养基，30℃、190rpm过夜培养进行一次活化，培养20h后，以1％的接种量再次接种CMG液体培养基进行二次活化，20小时后测定OD₆₆₀，根据种子液的OD₆₆₀值确定接种量，控制起始接种OD₆₆₀在0.1左右，接种到装有50ml YPC培养基(酵母提取物Yeast extracts 10g/L，蛋白胨Peptone 20g/L，纤维二糖Cellobiose20g/L，自然pH值)的250ml烧瓶中，多层透气无菌纱布封口、30℃、190rpm培养。生长过程中定时取样，测定OD₆₆₀值，以生长时间h为横轴，OD₆₆₀值为纵轴，绘制重组菌株有氧条件下的生长曲线，结果见图13。由图13可知，多拷贝不带锚定肽的构建菌株2和多拷贝带锚定肽的构建菌株4生长最快，最高OD值可达16左右，而对照菌株6最大OD值1左右(另一对照菌株5结果类似)，初步说明外源基因已经得到了很好的表达且能很好地作用于纤维二糖，而拷贝数和锚定肽的有无显著影响着基因的表达水平和作用于底物纤维二糖的效果。

实施例9重组酿酒酵母表达菌株以纤维二糖为底物的生长发酵产醇评价

同实施例8活化菌株，测定二次活化液的OD660，取适量菌液到1.5ml离心管中，离心收集菌体并洗涤一次，等量接种到装有100ml YPC培养基的500ml烧瓶中，控制接种后的起始OD660都在0.1左右，其中一瓶用透气无菌纱布封口，30℃、190rpm培养，视为有氧条件下的发酵；另一瓶先用70％乙醇处理过的封口膜数层密封，然后盖以无菌纱布，30℃、150rpm培养，视为厌氧条件下的发酵。生长过程中定时取样：取适量菌液适当稀释后立即测定OD660；取800μl菌液12000rpm、4℃、10min离心，取上清液，0.22μm的醋酸纤维滤膜过滤，滤液用于HPLC分析；HPLC分析条件如下：RID 1100，Aminex HPX-87H分离柱，4mMH₂SO₄为流动相，流速0.5ml/min，柱温35℃，检测器温度35℃，分析组分包括乙醇、糖、乳酸、甘油等。测定结果见图14、图15和表3。

表3进入稳定期时间与乙醇浓度最高值及达到时间

注：HPLC测定0h的纤维二糖浓度为20.7g/L，乙醇浓度达到最高浓度时的残糖(0.3～0.5)g/L；对照菌株菌株5和菌株6均只有微弱生长，最大OD660值均在1左右，发酵液中检测不到乙醇。

由图14、图15和表3可知：所有的重组菌株都能利用纤维二糖在好氧或厌氧条件下生长和发酵产醇。而拷贝数、锚定肽的有无和供氧状态都对利用纤维二糖的生长和发酵产醇有影响。在有氧条件和无氧条件下的生长、发酵都相对快的是菌株2和菌株4，但菌株2产醇浓度最高，达8.42g/L。因此，综合起来效果最佳的是菌株2，即多拷贝数、没有锚定肽序列的构建，其能迅速、高效地利用纤维二糖产醇。

实施例10重组酿酒酵母表达菌株β-葡萄糖苷酶酶活测定

同实施例9进行厌氧培养，但改装有100ml YPC培养基的500ml烧瓶为装有50ml YPC培养基的250ml烧瓶。定期取样用pNPG(p-nitrophenyl-β-D-glucopyranoside，Sigma)作为底物测定β-葡萄糖苷酶酶活。方法如下：1、制作标准曲线：6个灭菌的5ml离心管中，分别加入不同量的10mM对硝基酚(p-nitrophenol，pNP)，制作出梯度浓度(0，0.04，0.08，0.12，0.16，0.20mM)的pNP溶液1ml，然后加入1ml 1M Na₂CO₃，室温放置5min，于405nm处测定其吸光值，所得数据用于制作标准曲线。2、取适量菌液14000rpm、4℃离心2-3min，取上清液测定酶活，视为胞外酶活；菌体细胞用与菌液等体积的缓冲液(50mM乙酸钠缓冲液，pH 5.0)重悬，测定酶活，视为细胞酶活。加入适量上清液或细胞重悬液到灭菌5ml离心管中(加入的量以最终测定的OD405在0.3-1.5之间为准)，控制反应最终总体积为1ml，其组分终浓度：5mM pNPG，50mM sodium acetate，pH 5.0。加入酶液启动反应，50℃反应10分钟。加入1ml 1M Na₂CO₃溶液终止反应，室温放置5分钟。然后20000×g、4℃离心5min，取上清液测定405nm处的吸光值即OD405nm。对照标准曲线换算出生成的pNP数量，计算酶活。1个酶活单位(1U)为在测定条件下1分钟内水解产生1μmol pNP所需的酶量。结果见表4。

表4酶活测定结果

菌株代号	1	2	3	4
					24h上清液	0.0634	0.0894	0.0178	0.025
24h细胞重悬液	1.3728	2.3576	1.6646	1.9388
					36h上清液	0.7006	1.026	0.0186	0.0274
36h细胞重悬液	1.1648	2.213	1.8578	1.874
					48h上清液	0.8292	1.46	0.0302	0.0376
48h细胞重悬液	1.2244	1.774	1.4624	1.3688
					60h上清液	0.8558	1.3466	0.031	0.0348
60h细胞重悬液	1.2152	1.6726	1.3636	1.7184
					72h上清液	1.1892	1.6458	0.034	0.0526
72h细胞重悬液	1.3254	2.3832	1.884	2.281
					96h上清液	1.3444	2.0988	0.0418	0.0436
96h细胞重悬液	2.3222	2.2314	1.6666	2.8016
					108h上清液	1.186	1.4946	0.041	0.0428
108h细胞重悬液	1.2854	1.9938	2.041	2.5796

注：单位为折合OD660＝1的菌液所对应的上清液或细胞重悬液每毫升所含的酶活单位。

由表4可知，发酵液酶活在不同时期是变化的，且不同构建胞外酶活和细胞酶活的绝对值和相对值不同。总体上没有锚定肽序列的构建菌株即菌株1和菌株2，胞外酶活远远高于带有锚定肽序列的构建菌株即菌株3和菌株4的胞外酶活，后两者的胞外酶活水平很低且恒定。

实施例11重组酿酒酵母表达菌株催化合成烷基糖苷

同实施例10进行菌株4的厌氧培养，5000×g、4℃离心5min收集48小时生长细胞，加入适量到反应混合物中，控制此反应混合物的最终总体积为20ml，折合此总体积中平均细胞OD660＝10、戊醇占15.5ml、含60mg纤维二糖的50mM乙酸钠(pH5.0)占4.5ml，250rpm、40℃下进行反应24h，然后20000×g、室温离心5min，分离有机相，用HPLC测定烷基糖苷的生成量。HPLC分析条件如下：RID 1100检测器，ODS分离柱，乙腈∶水混合物(60∶40，v/v)为流动相，流速1.0ml/min，柱温32℃，检测器温度32℃。测定结果表明由纤维二糖和戊醇生成烷基糖苷的转化率为28％。

以上四个重组酿酒酵母菌株，不同构建胞外酶活和细胞酶活的绝对值和相对值不同，适用于不同的应用领域。菌株2即W303a(YEplac195-Ptpi-xyn2s-exon-TadhI)相对适于木质纤维素降解产醇，而菌株4即W303a(YEplac195-Ptpi-xyn2s-exon-cwp-TadhI)因β-葡萄糖苷酶固定在细胞表面而表达的酶活又相对较高，适于催化合成烷基糖苷。其它菌株亦各有其应用范围。这些菌株的应用领域不限于上述实施例所示，还能用于通过β-葡萄糖苷酶能催化的糖基基团转移反应/β-葡萄糖苷键水解反应而生成的医药、食品、化工领域试剂的清洁生产。

<110>天津大学

<120>编码β-葡萄糖苷酶的基因及重组表达载体及重组酿酒酵母表达菌株及应用

<160>22

<210>1

<211>2913

<212>DNA

<213>曲霉(Aspergillus)

<220>

<221>Gene

<222>(1)…(2828)

<400>1

gatgaactgg cgttctctcc tccattctat ccctcccctt gggccaatgg ccagggagag 60

tgggcggaag cctaccagcg tgcagtggcc attgtctccc agatgactct ggatgagaag 120

gtcaacctta ccaccggaac tgggtaatga caccacaatt gtcgcgagat gcgtcgcctg 180

ctaacgagct tctagatggg agctggagaa gtgtgtcggt cagactggtg gtgttccaag 240

gtagaaccct tcaaaaatga acttgtttct agtcggctaa ctggcgcctg ctgtctagac 300

tgaacatcgg tggcatgtgt ctccaggaca gtcccttggg aattcgtgac agtaagactt 360

gatctaactc gagcccggcc gctgacactc ttgctaacaa tgtgtcctac aggtgactac 420

aattcggctt tccctgctgg tgtcaacgtt gctgcgacat gggacaagaa cctggcttat 480

ctccgtggcc aggctatggg tcaagaattt agtgacaaag gaatcgatgt tcaattgggc 540

ccggccgcgg gtcccctcgg caggagtcct gatggaggtc gtaactggga aggtttctct 600

ccagacccgg ctcttactgg cgtgctcttt gcggagacga tcaagggtat tcaagatgct 660

ggtgtcgtgg caacagccaa gcattacatt ctcaatgagc aagagcattt ccgccaggtc 720

tcagagtctg cgggctacgg attcaatatc tccgacacgg tcagctcgaa tgttgatgac 780

aagaccattc atgaaatgta cctctggccc ttcgcggatg ccgttcgcgc aggcgttggc 840

gccatcatgt gttcctacaa ccagatcaac aacagctacg gctgccagaa cagttacacg 900

ctgaacaagc ttctgaaggc cgagctcggc ttccagggct tcgtgatgtc tgactggggt 960

gctcaccaca gtggtgttgg ttctgctttg gccggcctgg atatgtcaat gcctggtgat 1020

atcaccttcg attctgccac tagtttctgg ggtaccaacc tgaccattgc tgttctcaac 1080

ggcaccgtcc cgcagtggcg cgttgacgac atggctgttc gtatcatggc tgcctactac 1140

aaggttggcc gcgaccgcct gtaccagccg cctaacttca gctcttggac tcgcgatgaa 1200

tacggcttca agtattttta ccctcaggaa ggtccctatg agaaggtcaa tcactttgtc 1260

aatgtgcagc gcaaccacag cgaggttatt cgcaagttgg gagcagacag cactgttcta 1320

ctgaagaaca acaatgccct gcctctgacc ggaaaggagc gcaaagttgc gatcctgggt 1380

gaagacgccg gatccaactc gtacggtgcc aatggctgct ctgaccgcgg ctgtgacaac 1440

ggtactcttg ccatggcttg gggtagtggc actgccgaat tcccatacct cgtgacccct 1500

gagcaggcta ttcaagctga ggtgctcaag cacaagggca gcgtctatgc catcactgac 1560

aactgggcgc tgagccaggt ggagaccctc gctaaacaag ccaggtaagt cctgtcgtcc 1620

atatcgttgt ttctttttct gtttcaaatc tgatgcttca gtgaactaac atctatctcc 1680

gtagtgtctc tcttgtgttc gtcaactcgg actcgggaga gggctatatc tctgtggacg 1740

gaaacgaggg cgaccgcaac aacctcaccc tctggaagaa tggcgacaac ctcatcaagg 1800

ctgctgcgaa caactgcaac aacacaatcg ttgtcatcca ctccgttgga ccggttttgg 1860

tcgacgagtg gtatgaccac cccaatgtca ctgccatcct ctgggccggt ttgcctggcc 1920

aggagtctgg caactccctg gctgatgtgc tctacggccg cgtcaacccg ggcgccaaat 1980

cgccattcac ctggggcaag acgagggagg cgtacgggga ttaccttgtc cgcgaactca 2040

acaacggcaa cggggctccc caagacgact tctcggaagg tgttttcatt gactaccgcg 2100

gattcgacaa gcgcaatgag accccgatct acgagttcgg acatggtctg agctacacca  2160

ctttcaacta ctctggcctt cacatccagg ttctcaacgc ttcgtccaac gctcaagtag  2220

ccactgagac tggcgctgct cccacattcg gacaagtcgg caatgcctcg gactatgtgt  2280

accctgaggg attgaccaga atcagcaagt tcatctaccc ctggcttaac tccaccgacc  2340

tcaaggcctc atctggcgac ccgtactatg gtgtcgacac cgcggagcac gtccccgagg  2400

gtgctaccga tggctctccc cagcccgttc tgcctgcggg tggtggcttc ggtggtaacc  2460

cccgcctcta cgatgagttg atccgcgttt cggtgacagt caagaacact ggtcgtgttg  2520

ctggtgatgc tgtacctcaa ctggtaatta aatctcccgt gcagtattaa tcccgcatgc  2580

taaccgtttg ccagtatgtt tcccttggtg gacccaatga gcccagggtt gtgttgcgca  2640

aattcgaccg ccttaccctc aagccctccg aggagacggt gtggacgact accctgactc  2700

gtcgcgatct gtccaactgg gacgttgcgg ctcaggattg ggtcattact tcttacccga  2760

agaaggtcca tgttggtagc tcttcgcgtc agctgcccct tcacgcagcg ctcccgaagg  2820

tgcaatgagc ggtggaaggt gtcatgaagg gctttgagcc tgggcctgag gctgcagatg  2880

gagatgatgt acacattttt cccaaatcgt aga 2913

<210>2

<211>689

<212>DNA

<213>酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)

<220>

<221>Promoter

<222>(1)…(689)

<400>2

taacgggagc gtaatggtga tggaactgga cgaatccatc aatagatacg tcctgaggac 60

cgtgctaccc aaatggactg attgtgaggg agacctaact acatagtgtt taaagattac 120

ggatatttaa cttacttaga ataatgccat ttttttgagt tataataatc ctacgttagt 180

gtgagcggga tttaaactgt gaggacctta atacattcag acacttctgc ggtatcaccc 240

tacttattcc cttcgagatt atatctagga acccatcagg ttggtggaag attacccgtt 300

ctaagacttt tcagcttcct ctattgatgt tacacctgga cacccctttt ctggcatcca 360

gtttttaatc ttcagtggca tgtgagattc tccgaaatta attaaagcaa tcacacaatt 420

ctctcggata ccacctcggt tgaaactgac aggtggtttg ttacgcatgc taatgcaaag 480

gagcctatat acctttggct cggctgctgt aacagggaat ataaagggca gcataattta 540

ggagtttagt gaacttgcaa catttactat tttcccttct tacgtaaata tttttctttt 600

taattctaaa tcaatctttt tcaatttttt gtttgtattc ttttcttgct taaatctata 660

actacaaaaa acacatacat aaactaaaa  689

<210>3

<211>99

<212>DNA

<213>瑞氏木霉(Trichoderma reesei)

<220>

<221>Sig_peptide

<222>(1)…(99)

<400>3

atggtctcct tcacctccct cctcgccggc gtcgccgcca tctcgggcgt cttggccgct 60

cccgccgccg aggtcgaatc cgtggctgtg gagaagcgc  99

<210>4

<211>207

<212>DNA

<213>酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)

<220>

<221>Gene

<222>(1)…(207)

<400>4

atttctcaaa tcactgacgg tcaaatccaa gctactacca ctgctaccac cgaagctacc 60

accactgctg ccccatcttc caccgttgaa actgtttctc catccagcac cgaaactatc 120

tctcaacaaa ctgaaaatgg tgctgctaag gccgctgtcg gtatgggtgc cggtgctcta 180

gctgctgctg ctatgttgtt ataagaa    207

<210>5

<211>330

<212>DNA

<213>酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)

<220>

<221>Terminator

<222>(1)…(330)

<400>5

gcgaatttct tatgatttat gatttttatt attaaataag ttataaaaaa aataagtgta 60

tacaaatttt aaagtgactc ttaggtttta aaacgaaaat tcttattctt gagtaactct 120

ttcctgtagg tcaggttgct ttctcaggta tagcatgagg tcgctcttat tgaccacacc 180

tctaccggca tgccgagcaa atgcctgcaa atcgctcccc atttcaccca attgtagata 240

tgctaactcc agcaatgagt tgatgaatct cggtgtgtat tttatgtcct cagaggacaa 300

cacctgttgt aatcgttctt ccacacggat  330

<210>6

<211>16

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<222>(1)…(16)

<400>6

gatgaactgg cgttct 16

<210>7

<211>20

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<222>(1)…(20)

<400>7

tctacgattt gggaaaaatg  20

<210>8

<211>52

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<222>(1)…(52)

<400>8

tgaccacata tggccgccta ggcctcgagc tgcagtaacg ggagcgtaat gg 52

<210>9

<211>26

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<222>(1)…(26)

<400>9

aggagaccat ttttagttta tgtatg 26

<210>10

<211>26

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<222>(1)…(26)

<400>10

taaactaaaa atggtctcct tcacct 26

<210>11

<211>26

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<222>(1)…(26)

<400>11

ccagttcatc gcgcttctcc acagcc 26

<210>12

<211>26

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<222>(1)…(26)

<400>12

ggagaagcgc gatgaactgg cgttct 26

<210>13

<211>18

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<222>(1)…(18)

<400>13

gcccaattga acatcgat  18

<210>14

<211>18

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<222>(1)…(18)

<400>14

ggctgtgaca acggtact  18

<210>15

<211>26

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<222>(1)…(26)

<400>15

agaaattcgc tcattgcacc ttcggg 26

<210>16

<211>26

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<222>(1)…(26)

<400>16

ggtgcaatga gcgaatttct atgatt 26

<210>17

<211>55

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<222>(1)…(55)

<400>17

gttgtaccat ggcctaggcg gccgacgata gtcagtacta tccgtgtgga agaac 55

<210>18

<211>26

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<222>(1)…(26)

<400>18

tttgagaaat ttgcaccttc gggagc 26

<210>19

<211>26

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<222>(1)…(26)

<400>19

gaaggtgcaa atttctcaaa tcactg 26

<210>20

<211>26

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<222>(1)…(26)

<400>20

agaaattcgc ttcttataac aacata 26

<210>21

<211>26

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<222>(1)…(26)

<400>21

gttataagaa gcgaatttct tatgat  26

<210>22

<211>2611

<212>DNA

<213>曲霉(Aspergillus)

<220>

<221>Exon

<222>(1)…(2526)

<400>22

gatgaactgg cgttctctcc tccattctat ccctcccctt gggccaatgg ccagggagag  60

tgggcggaag cctaccagcg tgcagtggcc attgtctccc agatgactct ggatgagaag  120

gtcaacctta ccaccggaac tggatgggag ctggagaagt gtgtcggtca gactggtggt  180

gttccaagac tgaacatcgg tggcatgtgt ctccaggaca gtcccttggg aattcgtgac  240

agtgactaca attcggcttt ccctgctggt gtcaacgttg ctgcgacatg ggacaagaac  300

ctggcttatc tccgtggcca ggctatgggt caagaattta gtgacaaagg aatcgatgtt  360

caattgggcc cggccgcggg tcccctcggc aggagtcctg atggaggtcg taactgggaa  420

ggtttctctc cagacccggc tcttactggc gtgctctttg cggagacgat caagggtatt  480

caagatgctg gtgtcgtggc aacagccaag cattacattc tcaatgagca agagcatttc  540

cgccaggtct cagagtctgc gggctacgga ttcaatatct ccgacacggt cagctcgaat  600

gttgatgaca agaccattca tgaaatgtac ctctggccct tcgcggatgc cgttcgcgca  660

ggcgttggcg ccatcatgtg ttcctacaac cagatcaaca acagctacgg ctgccagaac  720

agttacacgc tgaacaagct tctgaaggcc gagctcggct tccagggctt cgtgatgtct  780

gactggggtg ctcaccacag tggtgttggt tctgctttgg ccggcctgga tatgtcaatg  840

cctggtgata tcaccttcga ttctgccact agtttctggg gtaccaacct gaccattgct  900

gttctcaacg gcaccgtccc gcagtggcgc gttgacgaca tggctgttcg tatcatggct  960

gcctactaca aggttggccg cgaccgcctg taccagccgc ctaacttcag ctcttggact  1020

cgcgatgaat acggcttcaa gtatttttac cctcaggaag gtccctatga gaaggtcaat  1080

cactttgtca atgtgcagcg caaccacagc gaggttattc gcaagttggg agcagacagc  1140

actgttctac tgaagaacaa caatgccctg cctctgaccg gaaaggagcg caaagttgcg  1200

atcctgggtg aagacgccgg atccaactcg tacggtgcca atggctgctc tgaccgcggc  1260

tgtgacaacg gtactcttgc catggcttgg ggtagtggca ctgccgaatt cccatacctc  1320

gtgacccctg agcaggctat tcaagctgag gtgctcaagc acaagggcag cgtctatgcc  1380

atcactgaca actgggcgct gagccaggtg gagaccctcg ctaaacaagc cagtgtctct  1440

cttgtgttcg tcaactcgga ctcgggagag ggctatatct ctgtggacgg aaacgagggc  1500

gaccgcaaca acctcaccct ctggaagaat ggcgacaacc tcatcaaggc tgctgcgaac  1560

aactgcaaca acacaatcgt tgtcatccac tccgttggac cggttttggt cgacgagtgg  1620

tatgaccacc ccaatgtcac tgccatcctc tgggccggtt tgcctggcca ggagtctggc  1680

aactccctgg ctgatgtgct ctacggccgc gtcaacccgg gcgccaaatc gccattcacc  1740

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tctggcgacc cgtactatgg tgtcgacacc gcggagcacg tccccgaggg tgctaccgat  2160

ggctctcccc agcccgttct gcctgcgggt ggtggcttcg gtggtaaccc ccgcctctac  2220

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gtacctcaac tgtatgtttc ccttggtgga cccaatgagc ccagggttgt gttgcgcaaa  2340

ttcgaccgcc ttaccctcaa gccctccgag gagacggtgt ggacgactac cctgactcgt  2400

cgcgatctgt ccaactggga cgttgcggct caggattggg tcattacttc ttacccgaag  2460

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caatgagcgg tggaaggtgt catgaagggc tttgagcctg ggcctgaggc tgcagatgga  2580

gatgatgtac acatttttcc caaatcgtag a  2611

Claims (7)

1.一种编码β-葡萄糖苷酶的基因，其特征是它的序列是序列表SEQ ID No.1所述2913个核苷酸序列中的第1位到第2828位的核苷酸序列。

2.一种含有权利要求1所述基因的重组表达盒，其特征是由启动子、分泌肽编码序列、基因外显子序列和终止子组成或由启动子、分泌肽编码序列、基因外显子序列、锚定肽编码序列和终止子组成；所述启动子为序列表SEQ ID No.2所示的酿酒酵母磷酸丙糖异构酶TPI基因启动子Ptpi，所述分泌肽编码序列为序列表SEQ ID No.3所示的瑞氏木霉木聚糖酶II分泌肽编码核苷酸序列xyn2S，所述基因外显子序列是权利要求1所述编码β-葡萄糖苷酶的基因序列中去除5个内含子后的2526个核苷酸序列组成，所述5个内含子分别是对应SEQ IDNo.1所述核苷酸序列中第144位到第195位、第241位到第298位、第352位到第412位、第1603位到第1682位和第2543位到2593位的核苷酸序列，所述锚定肽编码序列为序列表SEQ ID No.4所述的酿酒酵母细胞壁2蛋白基因cwp23’端207个核苷酸序列，所述终止子为序列表SEQ ID No.5所述的酿酒酵母乙醇脱氢酶ADH I基因终止子Tadh I。

3.一种含有权利要求2的重组表达盒的重组表达载体的构建方法，其特征是包括如下步骤：将载体YEplac195用PstI和SmaI双酶切，得到5220bp片段，再用PstI和ScaI双酶切权利要求2的重组表达盒，进行连接，转化大肠杆菌Top10感受态细胞后得到重组表达载体；或将载体YCplac33用PstI和SmaI双酶切，得到5582bp片段，再用PstI和ScaI双酶切权利要求2的重组表达盒，进行连接，转化大肠杆菌Top10感受态细胞后得到第二种重组表达载体。

4.权利要求3的构建方法构建的重组表达载体。

5.一种含有权利要求4所述重组表达载体的重组酿酒酵母表达菌株。

6.权利要求5所述的重组酿酒酵母表达菌株在以纤维二糖为底物的生长发酵产乙醇中的应用。

7.权利要求5所述的重组酿酒酵母表达菌株在催化合成烷基糖苷中的应用。

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