CN1982463A - 利用正调控基因提高阿维菌素工业菌种的效价 - Google Patents
利用正调控基因提高阿维菌素工业菌种的效价 Download PDFInfo
- Publication number
- CN1982463A CN1982463A CN 200510111466 CN200510111466A CN1982463A CN 1982463 A CN1982463 A CN 1982463A CN 200510111466 CN200510111466 CN 200510111466 CN 200510111466 A CN200510111466 A CN 200510111466A CN 1982463 A CN1982463 A CN 1982463A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- gene
- external source
- positive regulating
- deinsectization streptomycete
- source positive
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明公开了一种外源正调控基因的用途,用于导入除虫链霉菌的染色体中,提高除虫链霉菌的阿维菌素(Avermectin)产量,所述的外源正调控基因选自:aveR基因、orfX基因、或asfR基因。本发明还公开了一种提高阿维菌素产量的方法。本发明还公开了带有所述正调控基因的除虫链霉菌,该除虫链霉菌发酵获得的阿维菌素产量比未经改良的菌株有大幅度提高。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程和微生物学领域,涉及一类提高阿维菌素生产的基因以及调控方法。
背景技术
阿维菌素(avermectins,AVM)是由除虫链霉菌(Streptomyces avermitilis)产生的十六元环内酯类多组份抗生素,按其分子中C-5、C22-23、C26三个位置上的结构差异性可区分为A1a、A1b、A2a、A2b、B1a、B1b、B2a、B2b八种组份。其中以B1组份,特别是B1a的抗线虫、节肢动物活性最高,而被广泛用于家畜寄生虫感染的治疗和农业虫害防治,成为农牧业的重要抗生素。(Burg R W等,Avermectin,new family of potent anthelmintic agents:producingorganism and fermentation.Antimicrob.Agents Chemother.,Mar 1979;15(3):361-7)
传统菌种选育主要采用诱变育种的方法。诱变的方法历史悠久,过去一直依赖诱变及发酵条件条件最优化的方法来提高产量,目前大多数抗生素工业生产仍然在使用这些方法。但是这种方法具有相当大的随机性,而且菌种若长期使用诱变剂处理,其生活能力会逐渐下降。基因工程是近年来兴起的新技术,从分子水平提高抗生素的产量或产生新的抗生素。通过研究发现,抗生素生物合成基因簇通常由几十个甚至几百个基因组成,包括途径特异的调控基因、抗性基因和结构基因。在抗生素合成基因簇之外,存在着大量的调控基因,这些基因常常具有多效性,这些基因相互之间构成的调控网络,以及与抗生素生物合成基因簇上的调控基因的相互作用最终决定了该抗生素的产量。
目前国际上对于调控基因的研究多以天蓝色链霉菌(Streptomycescoelicolor)为对象。研究表明,天蓝链霉菌产生十一烷基灵菌红素(Red)、放线紫红(Act)、次甲霉素(Mmy)和CDA(Calcium-Depen-dentAntibiotic)四种抗生素(李永泉,吴丹.天蓝链霉菌抗生素次生代谢过程的调控因子研究进展.浙江大学学报(理学版),2004,Vol.31 No.4 446-450),其中Red、Act、CDA三种抗生素相应的生物合成基因簇均位于染色体上,而Mmy相应的生物合成基因簇位于SCP1质粒上。四种抗生素生物合成基因簇途径专一调控基因actII-ORF4、redD、mmyR和cdaR分别调控Act、Red、CDA和Mmy的产生。ActII-ORF4和redD的转录累积能明显促进菌体生长进入静止期,随后开始抗生素合成基因的转录;增加actII-ORF4或者redD的拷贝数,能大大提高Act和Red的产量。但mmyR是负调控因子,基因剔除后的变异株产生的次甲霉素产量远高于原菌株。除了受途径专一调控基因的影响,Act和Red的产量也受合成基因簇之外具有多效性的调控基因的调控。afsB就是其中之一,增加afsB的拷贝数,也能够大大提高Act和Red的产量。同时将afsB增加拷贝数后导入变铅青链霉菌中后,发现能够激活自然状态下菌株中通常处于沉默状态的act基因的转录,从而大大提高Act的产量。因此可以看出,合成基因簇之外具有多效性的调控基因,对于抗生素的产生也起着很大的影响,这些基因相互之间构成的调控网络,以及与抗生素生物合成基因簇上的调控基因的相互作用最终决定了该抗生素的产量。同时,同一个基因有时不仅调控某一菌株中抗生素的产量,也有可能调节其他菌株中抗生素的产量。
目前他人还未进行除虫链霉菌抗生素生产的调控基因的研究,因此发现与阿维菌素生物合成相关的正调控基因,并通过有效的途径导入除虫链霉菌的基因组中,从而提高阿维菌素的产量具有十分重要的应用意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种提高阿维菌素生产的基因及调控方法。
本发明的另一目的在于提供一种含有外源正调控基因的除虫链霉菌。
在本发明的一个方面,提供一种外源正调控基因的用途,用于导入除虫链霉菌的染色体中以提高除虫链霉菌的阿维菌素产量,所述的外源正调控基因选自:aveR基因,orfX基因,或asfR基因,并且所述的外源正调控基因来自链霉菌基因组。
在另一优选例中,所述的aveR基因来源于除虫链霉菌的基因组中,GenBank登录号为BAA84600;所述的orfX基因来源于除虫链霉菌的基因组中,EMBL-Bank(European Molecular Biology Laboratory,也可简称为EMBL或EMBL-Bank)登录号为AF440828;所述的asfR基因来源于天蓝色链霉菌的基因组中,Genbank登录号为SCO0898。
在本发明的第二方面,提供一种提高除虫链霉菌的阿维菌素表达量的方法,包括以下步骤:将外源正调控基因整合到除虫链霉菌的染色体中,
并且,所述的外源正调控基因选自:aveR基因、orfX基因、或asfR基因。
在本发明的一个优选例中,所述的将外源正调控基因整合到除虫链霉菌的染色体中包括以下步骤:
(a)将带有外源正调控基因的重组整合型载体转化入宿主菌株中;
(b)将(a)获得的带有重组整合型载体的宿主菌株作为供体菌株,通过供体菌株-链霉菌接合转移的方法导入除虫链霉菌中,从而获得染色体中含有外源正调控基因的除虫链霉菌。
在本发明的另一优选例中,所述的整合型载体为pSET152载体。
在本发明的另一优选例中,所述的宿主细胞为大肠杆菌细胞。
在本发明的另一优选例中,所述的外源正调控基因在除虫链霉菌染色体上的拷贝数为1-15拷贝。更特别的为1-5个拷贝。
在本发明的第三方面,提供一种含有外源正调控基因的除虫链霉菌,所述的除虫链霉菌的染色体中整合有的1-15拷贝(更特别的为1-5个拷贝。)的外源正调控基因,
并且,所述的外源正调控基因选自:aveR基因、orfX基因、或asfR基因。
在本发明的第四方面,提供一种生产阿维菌素的方法,包括步骤:
(a)发酵本发明上述的含有外源正调控基因的除虫链霉菌;
(b)从发酵产物中分离阿维菌素。
在本发明的一个优选例中,所述的外源正调控基因在除虫链霉菌染色体上的拷贝数为1-15拷贝。更特别的为1-5个拷贝。
在本发明的第五方面,提供所述的含有外源正调控基因的除虫链霉菌的用途,其特征在于,用于生产阿维菌素。
本发明的其它方面由于本文的公开内容,对本领域的技术人员而言是显而易见的。
附图说明
图1:出发菌株与改良菌株发酵(pZQ23)最高值的直方图比较。
图2:出发菌株与改良菌株(pZQ24)发酵最高值的直方图比较。
图3:出发菌株与改良菌株(pZQ25)发酵最高值的直方图比较。
图4. 除虫链霉菌MMR630发酵曲线及其拟合曲线。系列1:除虫链霉菌MMR630 B1a组分产量发酵曲线;系列2:除虫链霉菌MMR630(pZQ23)的B1a组分产量发酵曲线;系列3:除虫链霉菌MMR630(pZQ24)的B1a组分产量发酵曲线;系列4:除虫链霉菌MMR630(pZQ25)的B1a组分产量发酵曲线。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究,意外地发现了一类可调控除虫链霉菌抗生素(阿维菌素)生产的正调控基因,所述基因为aveR基因、orfX基因、或asfR基因。将所述正调控基因导入除虫链霉菌的基因组中,可大大提高阿维菌素(Avermectin)的产量。基于此完成了本发明。
在所述正调控基因中,aveR基因和orfX基因是来自除虫链霉菌(Streptomyces avermitilis)自身的正调控基因。并且,本发明人还意外地发现来自天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)的asfR基因也能够提高除虫链霉菌的阿维菌素的表达,将天蓝色链霉菌的基因导入到除虫链霉菌中以提高除虫链霉菌的阿维菌素表达在本领域中是首次发现的。
如本发明所用,AveR基因,全称为阿维菌素合成途径特异性调控基因;asfR基因,全称为天蓝色次生代谢转录激活子;orfX基因,全称为阿维菌素合成途径全局性调控基因。
在本发明中,“调控基因”是指某些可调节控制特定的结构基因表达的基因。因此,“正调控基因”是指一类可正向调控(提高)特定的结构基因表达的基因。“外源正调控基因”是指通过一定的途径导入到除虫链霉菌基因组中的且可正调控除虫链霉菌表达阿维菌素的调控基因,而不是天然除虫链霉菌基因组本身自带的基因(在本发明中,aveR基因,orfX基因在除虫链霉菌中本来有一个拷贝,本身就起正调控作用的,整合以后相当于增加了至少一个拷贝)。在本发明中,从除虫链霉菌的基因组中获得所述的aveR基因(GenBank登录号为BAA84600),从除虫链霉菌的基因组中获得所述的orfX基因(EMBLAF440828),天蓝色链霉菌的基因组中获得所述的asfR基因(Genbank登录号为SCO0898),这些基因在体外经过比如扩增等处理后,接着通过一定的方式导入到除虫链霉菌中,整合入其基因组中。
在本发明中,“除虫链霉菌”(Streptomyces avermitilis)是一种能够代谢产生阿维菌素(avermectins,AVM)的菌。其形态为孢子丝螺旋形,含15个孢子以上。
在本发明中,“整合型载体”是指一类非复制型载体,包括(但不限于)pSET152载体。
在本发明中,“基因转移”是指外源性的遗传物质由供体菌进入受体菌洗把内的过程,基因的转移可通过转化、接合、转导、细胞融合等。“接合转移”是指细菌通过性菌毛相互连接沟通,将遗传物质(主要是质粒DNA)从供体菌转移给受体菌。
在本发明中,外源正调控基因可以以单拷贝的方式整合入除虫链霉菌的染色体中,也可以以多拷贝的形式整合入除虫链霉菌的染色体中,比如可以是1-50个拷贝,特别的为1-15个拷贝,更特别的为1-5个拷贝。但是应理解,采用本发明所述的正调控基因,只需单拷贝的外源正调控基因整合入除虫链霉菌的染色体中,即可达到显著正调控的效果。
目前,已知DNA序列,将该目的DNA序列引入到各种已知DNA分子(如载体)和细胞中是本领域中的常规技术,一般人员只要根据本发明的提示,都可以方便的进行操作。此外,将各种形式的突变引入到各种DNA分子中也是本领域熟知的技术。本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。
用重组DNA转化宿主细胞也是本领域技术人员熟知的常规技术。当宿主为原核生物如大肠杆菌时,能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获,用CaCl2法处理,所用的步骤在本领域众所周知。可供选择的是用MgCl2。如果需要,转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物,可选用如下的DNA转染方法:磷酸钙共沉淀法,常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。获得的转化子可以用常规方法培养,表达目的多肽。
本发明的正调控基因能够正相调节阿维菌素的生物合成,当该调节基因导入除虫链霉菌中进行超量表达时,可以提高阿维菌素的产量。并且,本发明人选择合适的接合转移载体,即整合型载体pSET152,使所述正调控基因能够高效地整合到除虫链霉菌的染色体上并且稳定复制。
在检测阿维菌素产量时,可通过测量出发菌株和改良菌株其中有效组分B1a(avermectin B1a,中文全称:2,6-双脱氧-4-O-(2,6-双脱氧-3-O-甲基-a-L-阿拉伯糖基-吡喃己基)-3-O-甲基-a-L-阿拉伯糖基-吡喃己基[氧化]-3’,4’,5’,6,6’,7,10,14,15,17a,20,20a,20b-十四氢-20,20b-双羟-5’,6,8,19-四甲基-6’-(1-甲丙基)螺旋[11,15-甲撑-2H,13H,17H-呋喃]4,3,2-pq,2,6,[苯并双氧环八癸炔]-吡喃-17-酮)的含量为标准,检测阿维菌素的产量是否提高。
链霉菌原生质体转化是许多链霉菌遗传操作最常用的方法,但是这一方法对某些链霉菌的转化效率并不高。其原因有些是因为某些链霉菌原生质体的制备困难或者再生困难,但即使成功的制备原生质体并且再生,也有难以转化的情况发生。由于除虫链霉菌中存在着90Kb的线性质粒SAP1,而线性质粒SAP1和由pIJ101以及线性质粒SLP2衍生而来的质粒可能存在着质粒的不相容性,因为很多能够在链霉菌中复制的载体都是由上面所提的复制子衍生而来的,从而出现质粒一方面不能稳定复制,另一方面出现了拷贝数降低的情况。在本发明的优选方式中,本发明人应用了接合转移的方法。相对于通过原生质体转化导入外源DNA,出现了质粒的稳定性和拷贝数明显降低的问题来说,接合转移是一个很好的替代方法,因为转移中单链DNA可以避开常规的切割和双链在转移中遇到的修饰限制系统的影响。同时,接合转移本身可能对放线菌生理状态的要求并不像原生质体转化那样高。
应理解,在实施例或其它内容中所显示的成分用量、反应条件等数字或是本申请说明书内容所使用的数字均为大约数值。因此,除非文中特别注明,本说明书的上述数字参数均为近似值,其可根据所需得到的本发明的结果而加以变化。
除非另行定义,文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外,任何与所记载内容相似或均等的方法及材料均可应用于本发明的方法中。
本发明的主要优点在于:
(1)找到了可大大提高除虫链霉菌的阿维菌素产量的一类正调控基因,解决了目前阿维菌素产量低的问题。
(2)意外地发现来自天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)的asfR基因也能够提高除虫链霉菌的阿维菌素的表达。
(3)本发明优选采用接合转移的方式将所述的正调控基因导入到受体菌中,克服了受体菌中质粒不能够稳定复制和拷贝数降低等接合转移中的常见问题。
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件如Sambrook等人,分子克隆:实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件,或按照链霉菌操作手册(Hopwood著,邓子新译,长沙:湖南科技出版社,1988)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。
以下实施例中,除非另外说明,除虫链霉菌MMR630液体培养均用YEME培养基,接合转移培养基为MS培养基。
实施例1 AveR基因对于Streptomyces avermitilis MMR630产量的影响
1.含有阿维菌素正调控基因aveR的DNA片段的获得
正调控基因aveR来源于Streptomyces avermitilis MMR630(获自浙江海正药业股份有限公司,也可购自美国农业研究机构保藏中心(NRRL))。
根据GenBank登录号BAA84600所提供的序列,设计以下列引物:
引物1(SEQ ID NO:1):
5’-GAAGATCT-CCGCACCGCCATACATACC-3’(添加XbaI位点);
引物2(SEQ ID NO:2):
5’-GAAGATCT-GAGGCGGAAGACGAGCACA-3’(添加XbaI位点);
以Streptomyces avermitilisMMR630染色体DNA为模板,进行PCR扩增,PCR反应条件为:94℃ 5min;94℃ 30sec,63℃ 45sec,72℃ 3min 30循环;72℃ 10min;16℃ 30min。PCR反应结束后参照分子克隆进行0.8%琼脂糖凝胶电泳(电泳缓冲液:1×TAE;电压:3V/cm,1h)。
电泳结束后,按照生工UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒(Cat.NO.SK 1132)的说明进行3.3Kb大小片段的回收,回收片断的基因序列进行测序验证,结果与GenBankBAA84600相同。
2.重组载体pZQ23的构建
将实施例1中获得的DNA片断进行限制性内切酶XbaI单酶切(按照宝生物公司2004-2005产品目录操作要求及步骤,详细可查询www.takara.com.cn),0.8%琼脂糖凝胶电泳后,按照生工UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒(Cat.NO.SK 1132)的说明进行目的片段的回收。整合型载体pSET152(购自中国科学院上海植物生理生态研究所,也可参考Bierman,M等,Gene(1992),116:43-49)经过同样的处理后与前者通过T4连接酶16℃连接过夜(按照宝生物公司2004-2005产品目录操作要求及步骤)。
将连接过夜的DNA转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。在含有氨苄(50μg/ml)的LB平板上筛选,获得重组载体pZQ23。
3.重组载体pZQ23导入到Streptomyces avermitils MMR630
将重组载体pZQ23转入大肠杆菌ET12567(pUZ8002)(获自中国科学院微生物研究所)中(因为大肠杆菌DH5α不能辅助接合转移,ET12567中所带得质粒pUZ8002对接合转移有推动做用,再次将重组载体转入大肠杆菌ET12567(pUZ8002)中只是为了借助它推动进行接合转移),得到供体菌株大肠杆菌ET12567(pUZ8002,pZQ23)。挑取大肠杆菌ET12567(pUZ8002,pZQ23)单菌落,接种于3ml LB培养基中(加入作用浓度25ug/ml卡那霉素和氯霉素以及50ug/ml氨苄青霉素)中。37℃过夜培养,将过夜培养的菌液以1/100的比例接种于10ml LB(加入作用浓度25ug/ml卡那霉素和氯霉素以及50ug/ml氨苄青霉素)中,37℃培养4小时左右,至OD600达到0.4,离心沉淀菌体,用不含抗生素的LB培养基洗涤菌体两遍,最后将菌体重悬于1ml培养基中。
制备阿维菌素孢子悬液,加入500μL 2×YT培养基,50℃热激活10min,冷却至室温。将处理好的供体菌株与Streptomyces avermitilis MMR630孢子悬液(10-8个/ul)各0.5ml与eppendorf管中混合,离心沉淀,用少量的残液悬浮后涂布在MS培养基上,30℃培养16-24h。用1ml含阿泊拉霉素和萘啶酮酸(作用浓度均为50ug/ml)的水溶液覆盖。30℃培养3-5天平板上长出菌落Streptomycesavermitilis MMR630(pZQ23)(该名称指整合了外源aveR基因的Streptomycesavermitilis MMR630)。将长出菌落扩大培养,提取总DNA,以提取总的DNA为模板扩增阿泊拉霉素抗性基因,得到预想的750bp的阿泊拉霉素抗性基因,说明pZQ23中的aveR基因已经整合到Streptomyces avermitilis MMR630染色体上。经测定,整合率超过95%。
并且,在已整合的菌中,本发明人发现有98%以上其中整合了单拷贝aveR基因形式的外源基因,同时也筛选到若干个整合有双拷贝aveR基因的菌。
在扩增阿泊拉霉素抗性基因时,采用的引物序列为:
上游引物(SEQ ID NO:3):5′-AATACGAATGGCGAAAAGC-3′,
下游引物(SEQ ID NO:4):5′-CATCGCATTCTTCGCATC-3′。
4.相同发酵条件下,Streptomyces avermitilis MMR630(pZQ23)与出发菌株Streptomyces avermitilis MMR630阿维菌素B1a组分产量的比较
取黄豆饼粉(热榨)1.5g,酵母粉(东立)0.5g,酵母粉(OXIOD)0.5g,CoCl2(10%)0.05ml,加入纯净水,调pH约为7.2,定容至100ml。装入250ml三角瓶中,每瓶装50ml,作为种子培养基,1.0公斤高压蒸汽灭菌30min后备用。
取黄豆饼粉(热榨)6g,淀粉27g,酵母粉(东立)3.6g,a-淀粉酶0.06g,CoCl2(10%)0.12ml,加入纯净水,调pH约为7.2,定容至300ml。装入250ml三角瓶中,每瓶装50ml,作为发酵培养基,1.0公斤高压蒸汽灭菌30min后备用。
将Streptomyces avermitilis MMR630(pZQ23)与Streptomyces avermitilisMMR630菌种接种于新鲜MS培养基中培养约4天,分别接入种子培养基中,30℃、180转/分摇床振荡培养24小时后,按1%的接种量将菌接入上述已准备好的50ml发酵培养基中。30℃、180转/分摇床振荡培养,5天后开始取样,至第11天结束。
对取样的样品中B1a组分的含量进行HPLC测定:取3ml发酵液加入7ml无水乙醇,4℃静置过夜或超声波破碎0.5-1小时。离心,取上清液直接用于HPLC分析,取上清以进行HPLC的测定。HPLC测定中以甲醇∶水=85∶15,流速为0.85ml/in。
发酵结果见图1,分别将出发菌株和改良菌株进行发酵,11天后结束,在第10天时达到发酵的最高值,出发菌株发酵单位最高值达到327ug/ml,而改良菌株的最高发酵单位达到825ug/ml,由此可见,导入这一基因后,除虫链霉菌MMR630发酵产物中B1a组分的含量是出发菌株的2.5倍。
实施例2 afsR基因对于Streptomyces avermitilis MMR630产量的影响
1.来源于天蓝色链霉菌染色体的含有的正调控基因afsR的DNA片段的获得
根据Genbank登录号SCO0898提供的序列,设计以下列引物:
引物3(SEQ ID NO:5):
5,-GAAGATCT-CGTCCTTCATCTTGTCGCTC-3’(添加XbaI位点)
引物4(SEQ ID NO:6):
5,-GAAGATCT-CGATTCCTTCTGGCTGGTCT-3’(添加XbaI位点);
以天蓝色链霉菌A3(2)(中国科学院微生物研究所)染色体DNA为模板,进行PCR扩增,PCR反应条件为:94℃ 5min;94℃ 30sec,63℃ 45sec,72℃ 3min30循环;72℃ 10min;16℃ 30min。PCR反应结束后参照分子克隆进行0.8%琼脂糖凝胶电泳(电泳缓冲液:1×TAE;电压:3V/cm,1h)。电泳结束后,按照生工UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒(Cat.NO.SK 1132)说明进行3.5Kb大小片段的回收。基因序列测序验证与Genbank登录号SCO0898的序列相同。
2.重组载体pZQ24的构建
将实施例1中获得的DNA片断经过限制性内切酶XbaI单酶切(按照宝生物公司2004-2005产品目录操作要求及步骤,详细可查询www.takara.com.cn),0.8%琼脂糖凝胶电泳后,按照生工UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒(Cat.NO.SK 1132)说明进行目的片段的回收。整合型载体pSET152经过同样的处理后与前者通过T4连接酶16℃连接过夜(按照宝生物公司2004-2005产品目录操作要求及步骤)。
将连接过夜的DNA转化大肠杆菌DH5α感受态细胞(按照分子克隆方法)。在含有氨苄(50μg/ml)的LB平板上筛选,获得重组载体pZQ24。
3.重组载体pZQ24导入到Streptomyces avermitilis MMR630
将重组载体pZQ24转入大肠杆菌ET12567(pUZ8002)中,得到供体菌株大肠杆菌ET12567(pUZ8002,pZQ24)。挑取大肠杆菌ET12567(pUZ8002,pZQ24)单菌落,接种于3mlLB培养基中(加入作用浓度25ug/ml卡那霉素和氯霉素以及50ug/ml氨苄青霉素)中。37℃过夜培养,将过夜培养的菌液以1/100的比例接种于10mlLB(加入作用浓度25ug/ml卡那霉素和氯霉素以及50ug/ml氨苄青霉素)中,37℃培养4小时左右,至OD600达到0.4,离心沉淀菌体,用不含抗生素的LB培养基洗涤菌体两遍,最后将菌体重悬于1ml培养基中。
制备阿维菌素孢子悬液,加入500μL 2×YT培养基,50℃热激活10min,冷却至室温。将处理好的供体菌株与Streptomyces avermitilis MMR630孢子悬液(10-8个/ul)各0.5ml与eppendorf管中混合,离心沉淀,用少量的残液悬浮后涂布在MS培养基上,30℃培养16-24h。用1ml含阿泊拉霉素和萘啶酮酸(作用浓度均为50ug/ml)的水溶液覆盖。30℃培养3-5天平板上长出菌落Streptomycesavermitilis MMR630(pZQ24)(该名称指整合了外源afsR基因的Streptomycesavermitilis MMR630)。将长出菌落扩大培养,提取总DNA,以提取总的DNA为模板扩增阿泊拉霉素抗性基因,得到预想的750bp的阿泊拉霉素抗性基因,说明afsR基因已经整合到Streptomyces avermitilis MMR630染色体上。经测定,整合率超过95%。
阿泊拉霉素抗性基因扩增的引物序列同实施例1。
4.相同发酵条件下,Streptomyces avermitilis MMR630(pZQ24)与出发菌株Streptomyces avermitilis MMR630阿维菌素B1a组分产量的比较
取黄豆饼粉(热榨)1.5g,酵母粉(东立)0.5g,酵母粉(OXIOD)0.5g,CoCl2(10%)0.05ml,加入纯净水,调pH约为7.2,定容至100ml。装入250ml三角瓶中,每瓶装50ml,作为种子培养基,1.0公斤高压蒸汽灭菌30min后备用。
取黄豆饼粉(热榨)6g,淀粉27g,酵母粉(东立)3.6g,a-淀粉酶0.06g,CoCl2(10%)0.12ml,加入纯净水,调pH约为7.2,定容至300ml。装入250ml三角瓶中,每瓶装50ml,作为发酵培养基,1.0公斤高压蒸汽灭菌30min后备用。
将Streptomyces avermitilis MMR630(pZQ24)与Streptomyces avermitilisMMR630菌种接种于新鲜MS培养基中培养约4天,分别接入种子培养基中,30℃、180转/分摇床振荡培养24小时后,按1%的接种量将菌接入上述已准备好的50ml发酵培养基中。30℃、180转/分摇床振荡培养,5天后开始取样,至第11天结束。
对取样的样品中B1a组分的含量进行HPLC测定:取3ml发酵液加入7ml无水乙醇,4℃静置过夜或超声波破碎0.5-1小时。离心,取上清液直接用于HPLC分析,取上清以进行HPLC的测定。HPLC测定中以甲醇∶水=85∶15,流速为0.85ml/in。
发酵结果见图2,分别将出发菌株和改良菌株进行发酵,11天后结束,在第10天时达到发酵的最高值,出发菌株发酵单位最高值达到327ug/ml,而改良菌株的最高发酵单位达到960ug/ml,由此可见,导入这一基因后,除虫链霉菌MMR630发酵产物中B1a组分的含量是出发菌株的2.9倍。
实施例3 orfX基因对于Streptomyces avermitilis MMR630产量的影响
1.来源于Streptomyces avermitilis MMR630染色体的含有阿维菌素正调控基因orfX的DNA片段的获得
根据EMBL AF440828提供的序列,设计以下列引物
引物5(SEQ ID NO:7):
5’-GAAGATCT-ACGCGGAGGAGCACATCAT-3’(添加XbaI位点);
引物6(SEQ ID NO:8):
5’-GAAGATCT-CACAACGTGTTCGCCGGTC-3’(添加XbaI位点);
以Streptomyces avermitilis MMR630染色体DNA为模板,进行PCR扩增,PCR反应条件为:94℃ 5min;94℃ 30sec,63℃ 45sec,72℃ 3min循环;72℃10min;16℃ 30min。PCR反应结束后参照分子克隆进行0.8%琼脂糖凝胶电泳(电泳缓冲液:1×TAE;电压:3V/cm,1h)。电泳结束后,按照生工UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒(Cat.NO.SK 1132)说明进行3.2Kb大小片段的回收,基因序列测序验证与EMBL AF440828相同。
2.重组载体pZQ25的构建
将实施例1中获得的DNA片断经过限制性内切酶XbaI单酶切(按照宝生物公司2004-2005产品目录操作要求及步骤,详细可查询www.takara.com.cn),0.8%琼脂糖凝胶电泳后,按照生工UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒(Cat.NO.SK 1132)说明进行目的片段的回收。整合型载体pSET152经过同样的处理后与前者通过T4连接酶16℃连接过夜(按照宝生物公司2004-2005产品目录操作要求及步骤)。
将连接过夜的DNA转化大肠杆菌DH5α感受态细胞(按照分子克隆方法)。在含有氨苄(50μg/ml)的LB平板上筛选。获得重组载体pZQ25。
3.重组载体pZQ25导入到Streptomyces avermitilis MMR630
将重组载体pZQ25转入大肠杆菌ET12567(pUZ8002)中,得到供体菌株大肠杆菌ET12567(pUZ8002,pZQ25)。挑取大肠杆菌ET12567(pUZ8002,pZQ25)单菌落,接种于3ml LB培养基中(加入作用浓度25ug/ml卡那霉素和氯霉素以及50ug/ml氨苄青霉素)中。37℃过夜培养,将过夜培养的菌液以1/100的比例接种于10ml LB(加入作用浓度25ug/ml卡那霉素和氯霉素以及50ug/ml氨苄青霉素)中,37℃培养4小时左右,至OD600达到0.4,离心沉淀菌体,用不含抗生素的LB培养基洗涤菌体两遍,最后将菌体重悬于1ml培养基中。
制备阿维菌素孢子悬液,加入500μL 2×YT培养基,50℃热激活10min,冷却至室温。将处理好的供体菌株与Streptomyces avermitilis MMR630孢子悬液(10-8个/ul)各0.5ml与eppendorf管中混合,离心沉淀,用少量的残液悬浮后涂布在MS培养基上,30℃培养16-24h。用1ml含阿泊拉霉素和萘啶酮酸(作用浓度均为50ug/ml)的水溶液覆盖。30℃培养3-5天平板上长出菌落Streptomycesavermitilis MMR630(pZQ25)(该名称指整合有外源orfX基因的Streptomycesavermitilis MMR630)。将长出菌落扩大培养,提取总DNA,以提取总的DNA为模板扩增阿泊拉霉素抗性基因,得到预想的750bp的阿泊拉霉素抗性基因,说明pZQ25已经整合到Streptomyces avermitilis MMR630染色体上。经测定,整合率超过95%。
阿泊拉霉素抗性基因扩增的引物序列同实施例1。
4.相同发酵条件下,Streptomyces avermitilis MMR630(pZQ25)与出发菌株Streptomyces avermitilis MMR630阿维菌素B1a组分产量的比较
取黄豆饼粉(热榨)1.5g,酵母粉(东立)0.5g,酵母粉(OXIOD)0.5g,CoCl2(10%)0.05ml,加入纯净水,调pH约为7.2,定容至100ml。装入250ml三角瓶中,每瓶装50ml,作为种子培养基,1.0公斤高压蒸汽灭菌30min后备用。
取黄豆饼粉(热榨)6g,淀粉27g,酵母粉(东立)3.6g,a-淀粉酶0.06g,CoCl2(10%)0.12ml,加入纯净水,调pH约为7.2,定容至300ml。装入250ml三角瓶中,每瓶装50ml,作为发酵培养基,1.0公斤高压蒸汽灭菌30min后备用。
将Streptomyces avermitilis MMR630(pZQ25)与Streptomyces avermitilisMMR630菌种接种于新鲜MS培养基中培养约4天,分别接入种子培养基中,30℃、180转/分摇床振荡培养24小时后,按1%的接种量将菌接入上述已准备好的50ml发酵培养基中。30℃、180转/分摇床振荡培养,5天后开始取样,至第11天结束。
对取样的样品中B1a组分的含量进行HPLC测定:取3ml发酵液加入7ml无水乙醇,4℃静置过夜或超声波破碎0.5-1小时。离心,取上清液直接用于HPLC分析,取上清以进行HPLC的测定。HPLC测定中以甲醇∶水=85∶15,流速为0.85ml/in。
发酵结果显示,分别将出发菌株和改良菌株进行发酵,11天后结束,在第10天时达到发酵的最高值,出发菌株发酵单位最高值达到327ug/ml,而改良菌株的最高发酵单位达到663ug/ml,由此可见,导入这一基因后,除虫链霉菌MMR630发酵产物中B1a组分的含量是出发菌株的2倍。
由发酵结果见图3,上述实施例中的基因导入后对于提高,除虫链霉菌发酵产物中B1a组分的含量都有明显的作用。
不带有或带有正调基因的除虫链霉菌MMR630发酵曲线及其拟合曲线见图4。其中,系列1为不带有正调基因的除虫链霉菌MMR630发酵产物中B1a组分产量曲线;系列2为除虫链霉菌MMR630(pZQ23)的发酵产物中B1a组分产量曲线;系列3为除虫链霉菌MMR630(pZQ24)的发酵产物中B1a组分产量曲线;系列4为除虫链霉菌MMR630(pZQ25)的发酵产物中B1a组分产量曲线。可见,在导入了正调基因后,除虫链霉菌MMR630表达阿维菌素的能力大大提高。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考,就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解,在阅读了本发明的上述讲授内容之后,本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改,这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110>中国科学院上海生命科学研究院
<120>利用正调控基因提高阿维菌素工业菌种的效价
<130>059550
<160>8
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>27
<212>DNA
<213>引物
<400>1
gaagatctcc gcaccgccat acatacc 27
<210>2
<211>27
<212>DNA
<213>引物
<400>2
gaagatctga ggcggaagac gagcaca 27
<210>3
<211>19
<212>DNA
<213>引物
<400>3
aatacgaatg gcgaaaagc 19
<210>4
<211>18
<212>DNA
<213>引物
<400>4
catcgcattc ttcgcatc 18
<210>5
<211>28
<212>DNA
<213>引物
<400>5
gaagatctcg tccttcatct tgtcgctc 28
<210>6
<211>28
<212>DNA
<213>引物
<400>6
gaagatctcg attccttctg gctggtct 28
<210>7
<211>27
<212>DNA
<213>引物
<400>7
gaagatctac gcggaggagc acatcat 27
<210>8
<211>27
<212>DNA
<213>引物
<400>8
gaagatctca caacgtgttc gccggtc 27
Claims (10)
1.一种外源正调控基因的用途,其特征在于,用于导入除虫链霉菌的染色体中以提高除虫链霉菌的阿维菌素产量,
所述的外源正调控基因选自:aveR基因、orfX基因、或asfR基因,
并且所述的外源正调控基因来自链霉菌基因组。
2.一种提高除虫链霉菌的阿维菌素表达量的方法,其特征在于,包括以下步骤:将外源正调控基因整合到除虫链霉菌的染色体中,
并且,所述的外源正调控基因选自:aveR基因、orfX基因、或asfR基因。
3.如权利要求2所述的方法,其特征在于,所述的将外源正调控基因整合到除虫链霉菌的染色体中包括以下步骤:
(a)将带有外源正调控基因的重组整合型载体转化入宿主菌株中;
(b)将(a)获得的带有重组整合型载体的宿主菌株作为供体菌株,通过供体菌株-链霉菌接合转移的方法导入除虫链霉菌中,从而获得染色体中含有外源正调控基因的除虫链霉菌。
4.如权利要求3所述的方法,其特征在于,所述的整合型载体为pSET152载体。
5.如权利要求3所述的方法,其特征在于,所述的宿主菌株为大肠杆菌。
6.如权利要求2所述的方法,其特征在于,所述的外源正调控基因在除虫链霉菌染色体上的拷贝数为1-15拷贝。
7.一种含有外源正调控基因的除虫链霉菌,其特征在于,所述的除虫链霉菌的染色体中整合有的1-15拷贝的外源正调控基因,
并且,所述的外源正调控基因选自:aveR基因、orfX基因、或asfR基因。
8.一种生产阿维菌素的方法,其特征在于,包括步骤:
(a)发酵权利要求7所述的含有外源正调控基因的除虫链霉菌;
(b)从发酵产物中分离阿维菌素。
9.如权利要求8所述的方法,其特征在于,所述的外源正调控基因在除虫链霉菌染色体上的拷贝数为1-15拷贝。
10.权利要求7所述的含有外源正调控基因的除虫链霉菌的用途,其特征在于,用于生产阿维菌素。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN200510111466A CN1982463B (zh) | 2005-12-14 | 2005-12-14 | 利用正调控基因提高阿维菌素工业菌种的效价 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN200510111466A CN1982463B (zh) | 2005-12-14 | 2005-12-14 | 利用正调控基因提高阿维菌素工业菌种的效价 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN1982463A true CN1982463A (zh) | 2007-06-20 |
CN1982463B CN1982463B (zh) | 2010-05-12 |
Family
ID=38165305
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN200510111466A Expired - Fee Related CN1982463B (zh) | 2005-12-14 | 2005-12-14 | 利用正调控基因提高阿维菌素工业菌种的效价 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN1982463B (zh) |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN102027107A (zh) * | 2008-03-10 | 2011-04-20 | 冈戈根股份有限公司 | 减少细菌中接合型质粒 |
CN103290032A (zh) * | 2013-05-14 | 2013-09-11 | 华中农业大学 | 硫藤黄链霉菌抗生素调控基因及提高链霉菌抗生素产量的方法 |
CN106191077A (zh) * | 2016-07-19 | 2016-12-07 | 中国农业科学院植物保护研究所 | 一种米尔贝霉素正调控基因milR及其过表达基因工程菌、制备方法和应用 |
-
2005
- 2005-12-14 CN CN200510111466A patent/CN1982463B/zh not_active Expired - Fee Related
Cited By (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN102027107A (zh) * | 2008-03-10 | 2011-04-20 | 冈戈根股份有限公司 | 减少细菌中接合型质粒 |
CN105647948A (zh) * | 2008-03-10 | 2016-06-08 | 冈戈根股份有限公司 | 减少细菌中接合型质粒 |
CN103290032A (zh) * | 2013-05-14 | 2013-09-11 | 华中农业大学 | 硫藤黄链霉菌抗生素调控基因及提高链霉菌抗生素产量的方法 |
CN103290032B (zh) * | 2013-05-14 | 2014-08-06 | 华中农业大学 | 硫藤黄链霉菌抗生素调控基因及提高链霉菌抗生素产量的方法 |
CN106191077A (zh) * | 2016-07-19 | 2016-12-07 | 中国农业科学院植物保护研究所 | 一种米尔贝霉素正调控基因milR及其过表达基因工程菌、制备方法和应用 |
CN106191077B (zh) * | 2016-07-19 | 2019-07-02 | 中国农业科学院植物保护研究所 | 一种米尔贝霉素正调控基因milR及其过表达基因工程菌、制备方法和应用 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN1982463B (zh) | 2010-05-12 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN106191077B (zh) | 一种米尔贝霉素正调控基因milR及其过表达基因工程菌、制备方法和应用 | |
MX2007015618A (es) | Microorganismos modificados con el gen lactato deshidrogenasa inactivado. | |
CN102181470B (zh) | 提高链霉菌抗生素产量的方法及其质粒 | |
CN105039381A (zh) | 一种麦芽糖诱导型海藻糖合酶合成工程菌及其制备方法与应用 | |
CN101613712B (zh) | 提高阿维菌素和/或伊维菌素产量的方法及生产菌株 | |
CN104762247A (zh) | 提高生产子囊霉素产量的基因工程菌株及构建方法 | |
CN105420154A (zh) | 双基因敲除重组红球菌、构建方法及其应用 | |
CN101565710B (zh) | 3-甾酮-△1-脱氢酶基因、相关载体和工程菌及应用 | |
CN112852796A (zh) | 一种纤维二糖差向异构酶突变体及其在制备乳果糖中的应用 | |
CN1982463B (zh) | 利用正调控基因提高阿维菌素工业菌种的效价 | |
CN109295087B (zh) | 一种表达制备udp-葡萄糖-己糖-1-磷酸尿苷酰转移酶的方法 | |
CN108641992A (zh) | 高温产核黄素的工程菌及其构建方法与应用 | |
CN102703495A (zh) | 提高链霉菌抗生素产量的方法及其质粒 | |
CN101368169A (zh) | 产脱氧紫色杆菌素的重组恶臭假单孢菌及其应用 | |
CN111621454A (zh) | 基因工程高产菌株淀粉酶产色链霉菌及ε-聚赖氨酸的生产方法和应用 | |
CN113801834B (zh) | 一种基因工程高产丰加霉素的淀粉酶产色链霉菌及其构建方法和应用 | |
CN108660101B (zh) | 表达天维菌素b的重组微生物、制备方法及其用途 | |
CN102719388A (zh) | 提高链霉菌抗生素产量的方法及其质粒 | |
CN109706106A (zh) | 一种强化脂肪酸降解和乙醛酸循环提高苏氨酸产量的方法 | |
CN109136253A (zh) | 一种通过糖多孢红霉菌sace_5754基因途径提高红霉素产量的方法 | |
CN104513840B (zh) | 一种提高聚酮类化合物发酵产量的方法 | |
CN102162003B (zh) | 一种提高阿维菌素产量的方法及其生产菌株 | |
CN105969714A (zh) | 厦门霉素高产菌株及其培养基、用途 | |
CN106520821B (zh) | 适用于链霉菌的T7RNA聚合酶表达盒PhT7及其表达载体和应用 | |
CN104928313A (zh) | 阿维链霉菌rex基因在提高阿维菌素产量中的应用 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C14 | Grant of patent or utility model | ||
GR01 | Patent grant | ||
CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20100512 Termination date: 20161214 |
|
CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |