CN109722396A

CN109722396A - 同时去除低温地下水中腐殖酸和硝酸盐的假单胞菌及其应用

Info

Publication number: CN109722396A
Application number: CN201910073734.5A
Authority: CN
Inventors: 张多英; 贾学斌; 吴淼男; 张彦龙; 白也; 刘玉勇; 刘红
Original assignee: Heilongjiang University
Current assignee: Heilongjiang University
Priority date: 2019-01-25
Filing date: 2019-01-25
Publication date: 2019-05-07

Abstract

同时去除低温地下水中腐殖酸和硝酸盐的假单胞菌及其应用，涉及微生物领域，尤其涉及一株假单胞菌及其应用。是要解决现有的微生物无法同时去除地下水中腐殖酸和硝酸盐的问题。该假单胞菌为Pseudomonas poae Y5‑5，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2018年10月29日，保藏编号为CGMCC No.16654。该菌株能去除6～10℃地下水中的有机污染物和硝酸盐。经测定硝酸盐还原速率为43.54～90.21mg/L/h，有机物去除率为85.2％。本发明用于去除低温地下水中污染物。

Description

同时去除低温地下水中腐殖酸和硝酸盐的假单胞菌及其应用

技术领域

本发明涉及微生物领域，尤其涉及一株假单胞菌及其应用。

背景技术

地下水是我国居民的生活用水主要来源之一。由于农业经济发展、农业化肥的大量施用，使部分地区的地下水中硝酸盐浓度过高，超过国家《生活饮用水卫生标准》(GB5749-2006)规定的10mg/L。如果饮用水中含有过量的硝酸盐容易引起高铁血红蛋白症，甚至会诱发癌症，对人体造成危害。由于土地渗滤作用，地下水中有机物通常是以难生物降解的腐殖酸形式存在。由于腐殖酸分子量高，难以通过微生物降解或活性炭吸附等方法去除，在经消毒工艺中氯氧化，容易生成三氯甲烷类物质(致癌、至畸、致突变)。如何在去除地下水中硝酸盐的同时，去除水中过量的腐殖酸类有机物仍是尚未解决的问题。

发明内容

本发明是要解决现有的微生物无法同时去除地下水中腐殖酸和硝酸盐的问题，提供一株同时去除低温地下水中腐殖酸和硝酸盐的假单胞菌及其应用。

本发明同时去除低温地下水中腐殖酸和硝酸盐的假单胞菌为Pseudomonas poaeY5-5，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2018年10月29日，保藏编号为CGMCC No.16654。

本发明Pseudomonas poae Y5-5为专性好氧菌，革兰氏染色阴性，菌落凸起，粘稠，呈乳白色；氧化酶阳性，生长温度4～37℃，最适pH值为7.5～8.0。

本发明Pseudomonas poae Y5-5可以产生硫化氢，可以水解明胶、尿素，可以还原硝酸盐；可以以蔗糖、肌糖、树胶醛糖、海藻糖、葡萄糖、葡萄糖酸、天冬酰胺、羟丁氨酸、阿拉伯醇、乙醇、乙酸钠、丁酸钠、苯甲酸钠为碳源进行生长；碱性磷酸酯酶、酯酶(C4)、白氨酸芳胺酶、缬氨酸芳胺酶、胱氨酸芳胺酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、酸性磷酸酶、萘酚-AS-BI磷酸水解酶阳性，可代谢脂类、萘酚类、萘胺类和多肽类化合物。

本发明Pseudomonas poae Y5-5通过16S rDNA序列比对分析，与模式菌株Pseudomonas poae P 527/13^T的相似性为99.78％。通过结合菌体形态特征、生长条件、生理生化鉴定结果确定，本发明的菌株Y5-5属于Pseudomonas poae。

本发明的假单胞菌在去除低温地下水中污染物的应用。

进一步的，所述低温地下水为6～10℃的地下水。

进一步的，所述污染物为有机污染物和硝酸盐。

进一步的，所述有机污染物为腐殖酸。

本发明Pseudomonas poae Y5-5去除6～10℃地下水中的有机污染物和硝酸盐。经测定硝酸盐还原速率为43.54～90.21mg/L/h，腐殖酸去除率为85.2％，经降解后，出水的TOC为1.35～2.06mg/L。

本发明Pseudomonas poae Y5-5可分泌胞外分泌物，通过生物吸附作用吸附水中溶解性腐殖酸类有机物，并利用胞外水解酶，水解腐殖酸类有机物成为小分子有机物，以提高可生物利用的C/N比，提高对水中硝酸盐的还原效率。

本发明Pseudomonas poae Y5-5，属于Pseudomonas poae。保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2018年10月29日，保藏编号为CGMCC No.16654。

附图说明

图1为本发明Pseudomonas poae Y5-5的革兰氏染色结果；

图2为本发明Pseudomonas poae Y5-5的菌落照片。

具体实施方式

本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。

具体实施方式一：本实施方式同时去除低温地下水中腐殖酸和硝酸盐的假单胞菌为Pseudomonas poae Y5-5，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2018年10月29日，保藏编号为CGMCC No.16654。

本实施方式Pseudomonas poae Y5-5为专性好氧菌，革兰氏染色阴性(如图1所示)，菌落凸起，粘稠，呈乳白色(如图2所示)；氧化酶阳性，生长温度4～37℃，最适pH值为7.5～8.0。

参照《伯杰细菌鉴定手册》第八版和《常见细菌系统鉴定手册》对本实施方式Pseudomonas poae Y5-5进行生理生化鉴定：本实施方式Pseudomonas poae Y5-5可以产生硫化氢，可以水解明胶、尿素，可以还原硝酸盐；可以以蔗糖、肌糖、树胶醛糖、海藻糖、葡萄糖、葡萄糖酸、天冬酰胺、羟丁氨酸、阿拉伯醇、乙醇、乙酸钠、丁酸钠、苯甲酸钠为碳源进行生长；碱性磷酸酯酶、酯酶(C4)、白氨酸芳胺酶、缬氨酸芳胺酶、胱氨酸芳胺酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、酸性磷酸酶、萘酚-AS-BI磷酸水解酶阳性，可代谢脂类、萘酚类、萘胺类和多肽类化合物。

具体实施方式二：本实施方式Pseudomonas poae Y5-5的获取方法为：取受硝酸盐污染(硝酸盐浓度140mg/L)的低温地下水(水温4℃)100ml，在2～6℃、150rpm/min下富集12～20d，期间不断补充NaNO₃和腐殖酸，待菌液的OD₆₀₀值达到0.5以上后，梯度稀释并接种于固体培养基上，在2～6℃下培养5～7d，选取典型的单一菌落进行纯化培养。将最终获得的纯培养菌株进行硝酸盐还原试验，选取30min内对硝酸盐还原率达到50％以上、对有机物(TOC)去除率达70％以上的菌株。即为本实施方式的Pseudomonas poae Y5-5。

所述培养基为：NaNO₃ 0.1～0.5g/L，MnSO₄ 0.01～0.05g/L，(NH₄)₂Fe(SO₄)₂·6H₂O0.01～0.10g/L，CaCl₂ 0.01～0.05g/L，腐殖酸0.10～10.0mg/L，Na₂HPO₄ 0.3～0.9g/L，MgSO₄·7H₂O 0.01～0.05g/L，NaCl 0.3～0.9g/L，pH值7.0～7.4，(固体培养基中加入1.8g/L的琼脂)。

对Pseudomonas poae Y5-5进行分子鉴定，提取菌株的总DNA，采用细菌的16SrDNA通用引物，正向引物5’-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3’；反向引物5’-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3’，以基因组DNA为模板进行PCR扩增。PCR反应体系如下：20～50ng模板DNA，0.2μL Taq酶，2.5μL 10×Buffer(含Mg²⁺)，1μL dNTP(各2.5mmol/L)，0.5μL正向引物，0.5μL反向引物，加入无菌去离子水至25μL。PCR扩增条件：94℃预变性4min，之后94℃变性45s，55℃扩增45s，72℃延伸1min，经过30次循环后，72℃延伸10min，之后4℃终止反应，将获得片段用于测序。

Pseudomonas poae Y5-5的16SrDNA序列长度为1408bp，其序列提交至GenBank注册号为MH817854，16SrDNA序列如序列表中SEQ ID NO：1所示。测序结果与GenBank中的16SrDNA序列进行同源性比对，通过16S rDNA序列比对分析，与模式菌株Pseudomonas poae P527/13^T的相似性为99.78％。通过结合菌体形态特征、生长条件、生理生化鉴定结果确定，本发明的菌株Y5-5属于Pseudomonas poae。

具体实施方式三：本实施方式对Pseudomonas poae Y5-5的腐殖酸和硝酸盐降解效果进行测试，具体如下：

本实施方式菌株Pseudomonas poae Y5-5培养至菌液浓度为10⁷～10⁹个/ml取50ml在6000g离心10min获得菌体沉淀，用无菌去离子水对菌体沉淀清洗2～3次，将菌体转入50ml、硝酸盐浓度分别为为100mg/L的模拟地下水中。

其中模拟地下水是模拟地下水环境，温度为6～10℃，溶液中不含有机碳源，添加了7～10mg/L的MnSO₄和5～8mg/L的FeSO₄，用腐殖酸作为碳源，C/N约比为0.5。

实验结果：经过在模拟地下水中降解30min～120min后，测定硝酸盐还原速率和有机物去除率，硝酸盐还原速率为43.54～90.21mg/L/h。腐殖酸去除率为85.2％，经降解后，出水的TOC为1.35～2.06mg/L。

Pseudomonas poae Y5-5产生的胞外分泌物通过冷冻离心和阳离子树脂交换方法分离，应用试剂盒法测定Pseudomonas poae Y5-5产生的胞外分泌物的主要成分，并采用傅里叶红外光谱(FT-IR)分析官能团，结果表明，菌株Y5-5产生的胞外分泌物主要由65.4％的多糖、23.7％的蛋白质和10.9％的核酸及其他物质组成。FT-IR的结果表明，菌株Y5-5的胞外分泌物主要由有还原性羟基、羰基、带负电荷的羧基、酰胺基等基团组成。菌株Y5-5的胞外分泌物特征表明，菌株Y5-5对腐殖酸有很好的吸附性能，其对腐殖酸的降解是通过胞外分泌物的吸附作用，之后经过分泌的各类水解酶类，对腐殖酸进行了彻底的分解氧化，从而达到对腐殖酸的去除。

序列表

<110> 黑龙江大学

<120>同时去除低温地下水中腐殖酸和硝酸盐的假单胞菌及其应用

<160> 3

<210> 1

<211> 1408

<212> DNA

<213> Pseudomonas poae

<220>

<223> Pseudomonas poae Y5-5 16SrDNA

<400> 1

ccatgcagtc gagcggtaga gagaagcttg cttctcttga gagcggcgga cgggtgagta 60

atgcctagga atctgcctgg tagtggggga taacgttcgg aaacggacgc taataccgca 120

tacgtcctac gggagaaagc aggggacctt cgggccttgc gctatcagat gagcctaggt 180

cggattagct agttggtggg gtaatggctc accaaggcga cgatccgtaa ctggtctgag 240

aggatgatca gtcacactgg aactgagaca cggtccagac tcctacggga ggcagcagtg 300

gggaatattg gacaatgggc gaaagcctga tccagccatg ccgcgtgtgt gaagaaggtc 360

ttcggattgt aaagcacttt aagttgggag gaagggcagt tacctaatac gtaattgttt 420

tgacgttacc gacagaataa gcaccggcta actctgtgcc agcagccgcg gtaatacaga 480

gggtgcaagc gttaatcgga attactgggc gtaaagcgcg cgtaggtggt ttgttaagtt 540

ggatgtgaaa tccccgggct caacctggga actgcattca aaactgactg actagagtat 600

ggtagagggt ggtggaattt cctgtgtagc ggtgaaatgc gtagatatag gaaggaacac 660

cagtggcgaa ggcgaccacc tggactaata ctgacactga ggtgcgaaag cgtggggagc 720

aaacaggatt agataccctg gtagtccacg ccgtaaacga tgtcaactag ccgttggaag 780

ccttgagctt ttagtggcgc agctaacgca ttaagttgac cgcctgggga gtacggccgc 840

aaggttaaaa ctcaaatgaa ttgacggggg cccgcacaag cggtggagca tgtggtttaa 900

ttcgaagcaa cgcgaagaac cttaccaggc cttgacatcc aatgaacttt ctagagatag 960

attggtgcct tcgggaacat tgagacaggt gctgcatggc tgtcgtcagc tcgtgtcgtg 1020

agatgttggg ttaagtcccg taacgagcgc aacccttgtc cttagttacc agcacgttat 1080

ggtgggcact ctaaggagac tgccggtgac aaaccggagg aaggtgggga tgacgtcaag 1140

tcatcatggc ccttacggcc tgggctacac acgtgctaca atggtcggta cagagggttg 1200

ccaagccgcg aggtggagct aatcccataa aaccgatcgt agtccggatc gcagtctgca 1260

actcgactgc gtgaagtcgg aatcgctagt aatcgcgaat cagaatgtcg cggtgaatac 1320

gttcccgggc cttgtacaca ccgcccgtca caccatggga gtgggttgca ccagaagtag 1380

ctagtctaac cttcgggagg acggtacc 1408

<210>2

<211> 18

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>正向引物

<400>2

cagagtttgatcctggct 18

<210>3

<211> 19

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223> 反向引物

<400>3

aggaggtgatccagccgca 19

Claims

1.同时去除低温地下水中腐殖酸和硝酸盐的假单胞菌，其特征在于该菌株为Pseudomonas poae Y5-5，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2018年10月29日，保藏编号为CGMCC No.16654。

2.权利要求1所述假单胞菌在去除低温地下水中污染物的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于所述低温地下水为6～10℃的地下水。

4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于所述污染物为有机污染物和硝酸盐。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于所述有机污染物为腐殖酸。