CN104017761B - 一种蜡样芽孢杆菌及其应用 - Google Patents

一种蜡样芽孢杆菌及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN104017761B
CN104017761B CN201410283436.6A CN201410283436A CN104017761B CN 104017761 B CN104017761 B CN 104017761B CN 201410283436 A CN201410283436 A CN 201410283436A CN 104017761 B CN104017761 B CN 104017761B
Authority
CN
China
Prior art keywords
fish
gelatin
bacillus cereus
collagen
clostridiopetidase
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201410283436.6A
Other languages
English (en)
Other versions
CN104017761A (zh
Inventor
阮海华
张西轩
王素英
李晔
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Nanjing Xinbai Pharmaceutical Co., Ltd.
Original Assignee
Tianjin University of Commerce
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Tianjin University of Commerce filed Critical Tianjin University of Commerce
Priority to CN201410283436.6A priority Critical patent/CN104017761B/zh
Publication of CN104017761A publication Critical patent/CN104017761A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN104017761B publication Critical patent/CN104017761B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
    • Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
    • Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
    • Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts

Abstract

本发明公开了一种蜡样芽孢杆菌及其应用，而提供一种能够同时分泌两种分子量类型的胶原酶的蜡样芽孢杆菌及其制备方法和应用。本发明的蜡样芽孢杆菌为Bacillus？cereus，保藏编号为CGMCC？NO.8614，所产生的酶液中包含两种分子量不同的胶原酶，即分子量为106kDa的胶原酶Ⅰ和分子量为95kDa的胶原酶Ⅱ。本发明的蜡样芽孢杆菌能够分泌两种分子量类型的胶原酶，能够高效降解鱼鳞、鱼皮、鱼骨、牛骨、猪皮中的胶原蛋白或明胶，有利于农副产品的开发利用、水产品加工、环境污染治理、医疗以及食品工业开发。同时，有利于作为复合酶制剂应用于工业生产中，可大大提高原料的利用率，扩大了微生物胶原酶的应用领域。

Description

一种蜡样芽孢杆菌及其应用
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，更具体地说是涉及一种蜡样芽孢杆菌及其在降解胶原蛋白或明胶方面的应用。
背景技术
胶原酶的化学名为胶原蛋白水解酶(Collagenase)，它能在生理pH和温度条件下特异性地降解天然胶原蛋白的三维螺旋结构，而不损伤其它蛋白质和组织。
胶原酶广泛应用于医学以及工业生产上。例如，目前临床上应用最广泛的药用胶原酶是指从溶组织梭状芽孢杆菌的发酵液中提取、纯化并精制而得的白色或类白色无菌冻干粉针生物制剂。胶原酶可使创口边缘胶原纤维降解，具有较好的清创作用，继而促使肉芽生长，上皮化，加快伤口愈合且对正常血管和神经组织无损伤作用。在临床上主要用于严重(II-III度)烧伤的清创、脱痂和植皮，亦可用于皮肤溃疡、褥疮等，治疗确切，安全可靠。此外，在工业方面，胶原酶也被广泛的应用于皮革工业的脱毛及软化过程，代替了传统的浸灰方法，既节省时间，又改善劳动卫生条件，且对环境危害小。同时，胶原酶还被广泛应用于蚕丝脱胶，肉类嫩化及酒类澄清等过程。
目前已研究的胶原酶以动物基质金属蛋白酶(MMPs)为主，细菌来源的胶原酶较少，最早研究的微生物来源胶原酶是溶组织梭状芽孢杆菌胶原酶，现已广泛应用于临床。细菌来源胶原酶与动物胶原酶不同之处主要在于：(1)底物种类不同：微生物胶原酶底物范围更为广泛，对动物胶原酶不能降解的IV、V型胶原也能轻易降解；(2)裂解方式不同：一般微生物胶原酶可作用于胶原的多个位点，产生小分子短肽或氨基酸，而动物胶原酶只作用于胶原N端3/4处Gly-Lue或Gly-Ile肽键，产生一个3/4片段和1/4片段，分别命名为TCA(Tropocollagen“A”fragment)和TCB(Tropocollagen“B”fragment)；(3)获得的难易不同：微生物胶原酶绝大多数可分泌到胞外，通过发酵培养可大量获得，而动物胶原酶需要进行组织培养和提取，较难获得；(4)潜在的降解胶原能力不同：微生物胶原酶具有更高的降解活性。因而，微生物来源的胶原酶具有更广的应用价值。
目前，利用生物技术途径筛选具有胶原酶活性的微生物已成为国内外研究的热点。目前已发现的分泌胶原酶的微生物具有多样性的特点，比如从深海到土壤，从需氧到厌氧，从细菌到真菌等等。
我国在微生物胶原酶方面的研究与应用还处于刚起步阶段，国内市场依赖大量高价进口胶原酶产品，限制了微生物胶原酶的应用。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中存在的技术缺陷，提供一种能够同时分泌两种分子量类型的胶原酶的蜡样芽孢杆菌。
本发明的另一个目的是提供一种蜡样芽孢杆菌在生产胶原酶及降解胶原蛋白或明胶方面的应用。
本发明的再一个目的是提供一种利用蜡样芽孢杆菌降解胶原蛋白或明胶的方法。
为实现本发明的目的所采用的技术方案是：
一种蜡样芽孢杆菌，拉丁文名称为Bacilluscereus，其保藏编号为：CGMCCNO.8614。
一种所述蜡样芽孢杆菌在生产含有胶原酶的酶液方面的应用，所得含有胶原酶的酶液中包含两种分子量不同的胶原酶，即分子量为106kDa的胶原酶Ⅰ和分子量为95kDa的胶原酶Ⅱ。
一种所产含有胶原酶的酶液在降解胶原蛋白和明胶方面的应用。
一种利用蜡样芽孢杆菌降解胶原蛋白或明胶的方法，包括下述步骤：
(1)将权利要求1所述的蜡样芽孢杆菌使用LB液体培养基扩大培养，然后离心除去菌体，得到粗酶液；在冰浴条件下向粗酶液中加入硫酸铵粉末，沉淀所得粗酶液中的蛋白，得到沉淀物；所得沉淀物用pH值为7.5的Tris-HCl缓冲液复溶，所得复溶溶液用pH值为7.5的Tris-HCl缓冲液在4℃条件下透析，透析后得到浓缩酶液；
(2)将含胶原蛋白和/或明胶的溶液与步骤(1)所得浓缩酶液混合后于37℃水浴条件下降解胶原蛋白和/或明胶。
所述含有胶原蛋白和/或明胶的溶液为鱼鳞或鱼皮或鱼骨或牛骨或猪皮的提取液。
所述鱼鳞的提取液通过下述方法得到：
(1)将干燥的鱼鳞浸于HCl溶液中在室温下搅拌脱钙；再将脱钙后的鱼鳞浸于Na2CO3溶液中，在室温条件下搅拌，使胶原蛋白中的胶原纤维的致密结构变疏松；最后，用蒸馏水将鱼鳞反复漂洗至中性；
(2)将漂洗至中性的鱼鳞与蒸馏水混合，在压力为102.9kPa，温度为121℃条件下提取15-20min；待提取液冷却至室温后，在室温下离心去除提取液中的杂质，所得上清液即为鱼鳞的提取液。
所述鱼鳞的脱钙的方法为：将清洗后干燥的鱼鳞浸于0.5mol/L的HCl溶液中在室温条件下搅拌脱钙2-4h。
含有胶原蛋白或明胶的提取液与浓缩酶液等体积混合。
所述鱼皮、鱼骨、牛骨或猪皮的提取液的制备方法为：将鱼皮、鱼骨、牛骨或猪皮作为原材料除去杂质后用电热鼓风干燥箱充分干燥；将每4g干燥后的原材料与100mL超纯水混合，在压力为102.9kPa，温度为121℃条件下提取15-20min；待提取体系冷却至室温后，在室温下离心去除原材料提取液中的杂质，所得上清液即分别为鱼皮、鱼骨、牛骨或猪皮的提取液。
蜡样芽孢杆菌在LB液体培养基中扩大培养的培养时间为24h；Tris-HCl缓冲液浓度为50mmol/L，按照每1mg沉淀用5mLTris-HCl缓冲液的比例复溶沉淀。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
1、本发明的蜡样芽孢杆菌为一种新的胶原酶产生菌，能够分泌产生包含两种分子量类型的胶原酶，即胶原酶Ⅰ和胶原酶Ⅱ。一株细菌同时分泌两种具有胶原蛋白以及明胶降解能力的胶原酶，有利于作为复合酶制剂应用于工业生产中，可大大提高原料的利用率，减少了生产工序，从而降低了生产成本，扩大了微生物胶原酶的应用领域。
2、本发明的蜡样芽孢杆菌能够分泌两种分子量类型的胶原酶，能够高效降解鱼鳞、鱼皮、鱼骨、牛骨、猪皮中的胶原蛋白或明胶，有利于农副产品的开发利用、水产品加工、环境污染治理、医疗以及食品工业开发。
3、本发明的利用蜡样芽孢杆菌降解鱼鳞、鱼皮、鱼骨、牛骨、猪皮中胶原蛋白的方法工艺过程简单，效果明显，实用性强。
附图说明
图1所示为本发明菌株蜡样芽孢杆菌R75E在5％(W/V)脱脂奶粉平板培养后的结果图；
图2所示为本发明菌株蜡样芽孢杆菌R75E16SrDNA的PCR扩增结果图；图中：M为DNA标准；1为16SrDNA扩增片段；
图3所示为本发明菌株蜡样芽孢杆菌R75E粗酶液的胶原蛋白酶谱图；图中：M为蛋白标准；1为粗酶液；
图4所示为本发明菌株蜡样芽孢杆菌R75E粗酶液明胶酶谱图；图中：M为蛋白标准；1为粗酶液；
图5所示为本发明菌株蜡样芽孢杆菌R75E粗酶液经硫酸铵沉淀复溶后所得浓缩酶液的银染结果，图中：M为蛋白标准；1、2均为浓缩酶液；
图6为本发明菌株蜡样芽孢杆菌R75E浓缩酶液对草鱼鱼鳞中Ⅰ型胶原蛋白的降解的SDS-PAGE电泳图；图中：M为蛋白标准；1为未经浓缩酶液处理的草鱼鱼鳞胶原蛋白；2为浓缩酶液与草鱼鱼鳞中Ⅰ型胶原蛋白的反应产物；3-10分别为浓缩酶液稀释2倍、4倍、8倍、16倍、32倍、64倍、128倍、256倍后与草鱼鱼鳞中Ⅰ型胶原蛋白的反应产物；
图7所示为本发明菌株蜡样芽孢杆菌R75E浓缩酶液对草鱼鱼鳞中总胶原蛋白的降解的SDS-PAGE电泳图；图中：M为蛋白标准；1为未经浓缩酶液处理的草鱼鱼鳞胶原蛋白；2为经浓缩酶液降解后草鱼鱼鳞胶原蛋白。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细说明。
本发明的实施例中所用培养基及溶液的配置如下：
5％脱脂奶粉平板的配制方法：在90mLTS溶液中加入5g脱脂奶粉、0.5％酵母提取物以及1％琼脂，用上述TS溶液定容至100mL，于115℃高压蒸汽灭菌锅中灭菌15min后倒平板，冷却后备用。所述TS溶液中含50mmol/LTris-HCl缓冲液，150mmol/LNaCl，pH值为8.0。
LB液体培养基的配制方法：在90mL去离子水中加入胰蛋白胨1g、酵母提取物0.5g、NaCl1g，用5mol/LNaOH调pH值至7.0，用去离子水定容至100mL，于121℃高压蒸汽灭菌锅中灭菌20min后冷却待用。
LB固体培养平板的配制方法：在90mL去离子水中加入胰蛋白胨1g、酵母提取物0.5g、NaCl1g、琼脂1g，用5mol/LNaOH调pH值至7.0，用去离子水定容至100mL，于121℃高压蒸汽锅中灭菌20min后倒平板，冷却后备用。
5×上样缓冲液：250mmol/LTris-HCl缓冲液(pH6.8)，内含0.5％(V/V)溴酚兰，50％(V/V)甘油，10％(W/V)十二烷基硫酸钠，5％(V/V)β-巯基乙醇组成。
洗脱液：50mmol/LTris-HCl缓冲液(pH7.6)，内含2.5％(V/V)聚乙二醇辛基苯基醚(TritonX-100)、5mmol/LCaCl2。
漂洗液：50mmol/LTris-HCl缓冲液(pH7.6)，内含5mmol/LCaCl2。
孵育液：50mmol/LTris-HCl缓冲液(pH7.6)，内含0.02％十二烷基聚乙二醇醚(Brij)、200mmol/LNaCl、5mmol/LCaCl2。
考马斯亮蓝染色液：考马斯亮蓝R-2501.0g溶于450mL甲醇与冰醋酸100mL的混合溶液后用蒸馏水定容至1L。
脱色液：100mL无水甲醇和100mL冰乙酸混合后用蒸馏水定容至1L。
本发明所用的分离胶和浓缩胶的浓度是指丙烯酰胺的浓度。
实施例1:具有蛋白降解活性的蜡样芽孢杆菌R75E的分离纯化
(1)取1mL采集的人初乳用无菌超纯水稀释100倍后取200μL稀释液均匀涂布于5％脱脂奶粉平板上，于37℃培养12h，获得菌落周围具有明显透明圈的菌落。将涂布获得的菌落用牙签挑取分离，于5％脱脂奶粉平板上进行多次划线培养，每次培养条件均为37℃、12h，获得具有最佳蛋白降解效果的菌株，将其命名为R75E。R75E菌株在5％脱脂奶粉平板上37℃培养12h后的结果如图1所示，从图1中可以看出，在5％脱脂奶粉平板上菌株R75E的单菌落周围出现明显透明圈，经测量发现菌落直径大小约为3mm，透明圈直径约8mm。
(2)从步骤(1)中的5％脱脂奶粉平板上挑取菌株R75E的单菌落，分别接种至两管5mLLB液体培养基中培养，培养条件为37℃，150r/min，培养12h。培养结束后于1.5mL无菌离心管分别加入0.8mL菌液和0.2mL灭过菌的浓度为80％的甘油溶液，混合均匀后可长期保存于-80℃冰箱中。
实施例2蜡样芽孢杆菌R75E的鉴定
(1)细菌的形态特征
菌落形态：将实施例1中得到的具有最佳蛋白降解效果的菌株R75E于37℃下在LB固体培养平板上划线培养生长12h后，菌落为灰白色，不透明，边缘不整齐、表面较粗糙，似融蜡状，菌落较大，约3mm。细菌形态：菌体细胞呈杆状,菌体两端较平整，多数呈链状排列。芽胞呈椭圆形，多位于菌体中央或稍偏于一端。菌体大小：通过光学显微镜利用其目镜测微尺与镜台测微尺对菌株R75E单个细胞的大小进行测量，通过测量可知单个细胞宽约为1-2μm，长约为3-5μm。细菌好氧性观察：挑取实施例1中菌株R75E的单菌落于LB液体培养基中，试管密封，于37℃，培养15h。如果细菌分布于整个溶液中，则是兼性厌氧菌；如果主要分布于培养液表面而内部几乎无菌，则是好氧菌。菌株R75E在LB液体培养基中密封培养后，澄清透明的LB液体培养基变浑浊，细菌分布于整个溶液，表明R75E菌株为兼性厌氧菌。
(2)菌株R75E的16SrDNA序列分析
根据细菌基因组16SrDNA的保守序列设计用于PCR鉴定的引物对，如SEQIDNo:1所示的引物P1(5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3)和SEQIDNo:2所示的引物P2(5-CTACGGCTACCTTGTTACGACT-3)。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
用无菌牙签挑取实施例1中所得菌株R75E的单菌落于100μl无菌水充分混匀，获得菌悬液即为扩增16SrDNA片段的模板。50μL菌落PCR反应体系中各成分如下：
10×PCR缓冲液 5μL4 -->
菌悬液 1μL
引物P1(10μmol/L) 1μL
引物P2(10μmol/L) 1μL
dNTP(2mmol/L) 5μL
Taq DNA聚合酶 0.5μL
水 36.5μL
PCR反应条件设定如下：
反应结束后，将PCR产物利用1％的琼脂糖凝胶电泳进行检测，检测条件为110V，35min，结检测果如图2所示，利用该菌落PCR方法成功扩增出了分子量接近1.4kb的16SrDNA片段。将PCR产物割胶回收后送往英潍捷基(上海)贸易有限公司进行测序。经测序，实施例1中所得的16SrDNA的序列如SEQIDNo：3所示。
利用如SEQIDNo：3所示的R75E菌株16SrDNA序列在Genbank数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)中做序列同源性(BLAST)比较，发现与菌株R75E同源性最高的菌株是蜡样芽孢杆菌BacilluscereusSP31，同源性为100％。
(3)生理生化试验
菌株R75E为革兰氏阳性菌，过氧化氢酶反应阳性，硝酸盐还原反应阳性、酪蛋白分解阳性、卵黄反应阳性、溶血反应阳性、可分解L-酪氨酸。
(4)菌株R75E糖发酵实验
挑取实施例1中菌株R75E的单菌落接种至5mLLB液体培养基中培养，培养条件为37℃，150r/min，12h，参照API50CHB液体培养基(生物梅里埃中国有限公司，API50CHBMedium，货号：50430)使用说明书所述，在适当的API50CHB液体培养基中制备接种物(即菌悬液)，菌悬液制备好以后立即用无菌加样器将菌悬液接入API50CH碳水化合物鉴定试剂条(生物梅里埃中国有限公司)上的50个小管中，37℃厌氧培养24h和48h。试剂条上第一个孔不含任何活性成分，仅为API50CHB培养基，以此作为阴性对照，其余的49个孔分别含有49种不同的碳水化合物，如下表1所示。分别记录培养24h和48h后菌株R75E对49种碳水化合物的发酵结果。
表1.菌株R75E的碳源利用情况
底物成分 24h 48h 底物成分 24h 48h
阴性对照 - - 七叶灵 + +
甘油 √ √ 柳醇 + +
赤癣醇 － － 纤维二糖 √ +5 -->
D-阿拉伯糖 － － 麦芽糖 + +
L-阿拉伯糖 － － 乳糖 - -
核糖 + + 蜜二糖 - -
D-木糖 － － 蔗糖 + +
L-木糖 － － 海藻糖 + +
阿东醇 － － 菊糖 - -
β-甲基-D-木糖甙 － － 松叁糖 - -
半乳糖 － － 棉子糖 - -
葡萄糖 + + 淀粉 + +
果糖 + + 肝糖 + +
甘露糖 - - 木糖醇 - -
山梨糖 - - 龙胆二糖 √ √
鼠李糖 - - D-土伦糖 √ √
卫矛醇 - - D-来苏糖 - -
肌醇 - - D-塔格糖 - -
甘露醇 - - D-岩糖 - -
山梨醇 - - L-岩糖 - √
α-甲基-D-甘露糖甙 - - D-阿拉伯糖醇 - -
α-甲基-D-葡萄糖甙 - - L-阿拉伯糖醇 - -
N-乙酰-葡萄糖胺 + + 葡萄糖酸钾 √ +
苦杏仁甙 √ √ 2-酮基-葡萄糖酸盐 - -
熊果甙 + + 5-酮基-葡萄糖酸盐 - -
表中：+：为可利用，-：为不可利用，√：为利用较弱
如表1结果所示：菌株R75E能够高效利用核糖、葡萄糖、果糖、七叶灵、柳醇、蔗糖、海藻糖、淀粉、肝糖、N-乙酰-葡萄糖胺和熊果甙作为碳源进行发酵生长；利用甘油、纤维二糖、苦杏仁甙、龙胆二糖、D-土伦糖、L-岩糖、葡萄糖酸钾等碳源进行发酵生长的能力较低；其余的碳源则完全不能被菌株R75E所利用。将该结果与生物梅里埃中国有限公司的芽孢杆菌碳源利用谱数据库进行比对分析表明，本发明菌株R75E与蜡样芽孢杆菌Bacilluscereus具有99.8％的同源性。
(5)蛋白质结晶毒素试验
综合实施例2中(1)-(4)的结果，结合《伯杰细菌鉴定手册(第八版)》，为了进一步鉴定菌株R75E，取经30℃培养24h并于室温放置2-3天的菌株R75E液体培养物少许于载玻片上，滴加蒸馏水混涂成薄膜。经自然干燥，微火固定后，于涂膜中加甲醇30s后倾掉，再通过火焰干燥，于载片上滴满0.5％碱性复红溶液，放火焰上加热微见蒸汽(勿使染液沸腾)后持续1.5min，移去火焰，使载玻片放置30s，倾去染液。用洁净自来水彻底清洗、晾干、镜检。观察有无游离芽孢和染成黑色的菱形毒素结晶体。如发现游离芽孢形成的不丰富，应将培养物置室温2-3天再行检验。苏云金芽孢杆菌用此法检测为阳性，而蜡样芽孢杆菌为阴性。实验结果表明，实施例1中的菌株R75E室温放置4天后可观察到大量游离芽孢，且无黑色的菱形结晶毒素，即实施例1中的菌株R75E可确定为蜡样芽孢杆菌。
综上，依据形态特征、遗传特性16SrDNA、糖发酵、蛋白质结晶毒素试验表明，实施例1所得菌株R75E为蜡样芽孢杆菌Bacilluscereus，该菌株于2013年12月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮政编码为100101，保藏编号为CGMCCNO.8614。
实施例3菌株R75E所产胶原酶分析
(1)粗酶液的制备：
首先，将实施例1中保存的菌株R75E在LB固体培养平板上划线培养3代，每代培养条件为37℃，12h；随后，从第3代LB固体培养平板上挑取单菌落接种至两管5mLLB液体培养基中培养，培养条件为37℃，150r/min，12h；最后，按照1％的接种量将10mL菌液接种至含有1LLB液体培养基中进行扩大培养，培养条件为37℃，150r/min，24h。扩大培养后得到的菌液于4℃条件下12000r/min离心15min，离心后留取上清液，将上清液用孔径为0.45μm的过滤膜进行除菌过滤，所得滤液即为菌株R75E的粗酶液。
(2)粗酶液的酶谱分析
制胶：分别配制含有终浓度均为0.1％(W/V)的胶原蛋白或明胶的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)，分离胶浓度为10％，浓缩胶浓度为5％，厚度为1mm。用于酶谱分析胶原蛋白的凝胶的配制组分如下表2所示。
用于酶谱分析的明胶的凝胶的配制组分将表2中的1％(W/V)Ⅰ型胶原蛋白水溶液替换成1％(W/V)明胶水溶液，其他组分相同。
表2含有胶原蛋白的凝胶配制组分
成分 分离胶 浓缩胶
1.5mol/L Tris-HCl缓冲液,pH8.8 3.7mL 0mL
0.5mol/L Tris-HCl缓冲液,pH6.8 0mL 1.2mL
30％丙烯酰胺/甲叉双丙烯酰胺凝胶贮液 5mL 0.8mL
10％(W/V)十二烷基硫酸钠(SDS)水溶液 150μL 50μL
10％(W/V)过硫酸铵(AP)水溶液 150μL 25μL
N,N,N',N'-四甲基乙二胺(TEMED) 15μL 5μL
1％(W/V)Ⅰ型胶原蛋白水溶液 1.5mL 0mL
超纯水 4.5mL 2.72mL
总体积 15mL 4.8mL
电泳：将步骤(1)中所得的粗酶液按照体积比为5:1的比例与5×上样缓冲液混合，在室温下静置10min。吸取蛋白Marker5μL(Fermentas公司，货号：00096206)及15μL与5×上样缓冲液混合的粗酶液样品，分别上样至上述含有胶原蛋白或明胶的两种凝胶中。在4℃、110V的条件下电泳2h，待溴酚蓝前沿接近分离胶底部时，关闭电源停止电泳。电泳结束后先将凝胶用洗脱液在室温条件下振荡洗脱2次，每次45min，随后用漂洗液在室温条件下漂洗2次，每次20min，最后将凝胶用孵育液在37℃下孵育12h。孵育结束后将凝胶先经考马斯亮蓝染色液静置染色1h，再经脱色液室温振荡脱色2h后即可观察结果，拍照。本实施例中步骤(1)所制备的粗酶液的胶原酶谱分析结果以及明胶酶谱分析结果分别如图3和图4所示，粗酶液所在的泳道中分别观察到两条明显的胶原降解条带和明胶降解条带。表明本实施例中步骤(1)所制备的粗酶液具有胶原降解活性以及明胶降解活性。且两条胶原酶条带距离很近，分别对应于蛋白Marker中的95kDa条带的上方和下方，按照分子量的大小将其命名为胶原酶Ⅰ(CollagenaseⅠ)和胶原酶Ⅱ(CollagenaseⅡ)。
(3)胶原酶分子量的测定
为了更加准确的分析本实施例中步骤(2)所述胶原酶Ⅰ和胶原酶Ⅱ的分子量，在0℃冰浴条件下向本实施例步骤(1)所得菌株R75E的粗酶液中缓慢加入硫酸铵粉末使硫酸铵的最终饱和度达到85％，在冰浴中充分搅拌过夜后进行离心，离心条件为4℃，12000r/min，20min，离心后弃上清留沉淀。按照每1mg沉淀用5mL浓度为50mmol/L、pH值为7.5的Tris-HCl缓冲液的比例复溶沉淀，将沉淀复溶后得到的溶液用浓度为50mmol/L、pH值为7.5的Tris-HCl缓冲液在4℃条件下透析48h，期间Tris-HCl缓冲液每12h更换一次，最终得到的透析后的溶液即为浓缩酶液。
电泳：将上述浓缩酶液按照体积比为5:1的比例与5×上样缓冲液混合，在室温下静置10min后进行SDS-PAGE凝胶电泳，分离胶浓度为10％，浓缩胶浓度为5％，电泳条件为110V90min，电泳结束后将该凝胶用Sigma公司的银染试剂盒PROTSIL1-1KT按照说明书中的步骤进行银染，银染结果如图5所示。通过将银染结果与本实施例步骤(2)中的胶原酶谱结果进行对比，可在银染凝胶中分别确定胶原酶Ⅰ与胶原酶Ⅱ所对应的蛋白条带；通过计算蛋白Marker及胶原酶Ⅰ、胶原酶Ⅱ在银染凝胶中的迁移率计算出胶原酶Ⅰ的分子量约为106kDa，胶原酶Ⅱ的分子量约为95kDa。
实施例4菌株R75E所产胶原酶对鱼鳞中Ⅰ型胶原蛋白的降解作用
(1)鱼鳞的预处理
清洗与干燥：将市售的草鱼鱼鳞用自来水反复冲洗，直至用肉眼观察不到鱼鳞中掺杂的血液、泥土等杂质成分，将洗净的鱼鳞置于电热鼓风干燥箱中，设定温度为50℃，烘干3-4h使鱼鳞充分干燥。
除杂：称取5g烘干后的鱼鳞浸于50ml0.1mol/L的NaOH溶液中在4℃条件下搅拌36h，每12h换液一次，除去鱼鳞中残留的脂肪、色素等成分，最终用蒸馏水反复漂洗至中性。
脱钙：将除杂后鱼鳞全部转移至50mL0.5mol/L的乙二胺四乙酸二钠(EDTA-2Na)溶液中在4℃条件下搅拌脱钙72h，每24h换液1次。脱钙结束后用蒸馏水反复漂洗至中性。
(2)草鱼鱼鳞中Ⅰ型胶原蛋白的提取
首先，将本实施例步骤(1)中脱钙后的鱼鳞浸于0.5mol/L内含0.1％W/V的胃蛋白酶的醋酸溶液中在4℃条件下搅拌提取Ⅰ型胶原蛋白72h，再将提取液在4℃条件下离心(离心条件为12000r/min，40min)除去少量杂质得到上清液；其次，向上清液中加入等体积4mol/L的NaCl溶液在4℃条件下盐析12h，使Ⅰ型胶原蛋白沉淀；最终，将盐析溶液在4℃条件下离心，离心条件为12000r/min，40min，弃去上清，将沉淀用50ml0.5mol/L的醋酸溶液复溶，将该复溶溶液在4℃条件下用蒸馏水透析48h，透析后即得到草鱼鱼鳞中Ⅰ型胶原蛋白的提取液，在-20℃条件下保存。
(3)浓缩酶液对草鱼鱼鳞中Ⅰ型胶原蛋白的降解
使用实施例3中制备的浓缩酶液与本实施例中步骤(2)所得的草鱼鱼鳞中Ⅰ型胶原蛋白的提取液进行降解反应，降解反应在1.5mL离心管中进行，反应在37℃水浴条件下进行1h，反应体系为：50μL超纯水+10μL0.5mol/LTris-HCl缓冲液(pH值为8.0)+10μL实施例3中制备的浓缩酶液(或其稀释液)+30μL草鱼鱼鳞中Ⅰ型胶原蛋白的提取液，反应1h后按照体积比为5:1的比例与5×上样缓冲液混合，在100℃下静置10min后进行SDS-PAGE凝胶电泳(分离胶浓度为10％，浓缩胶浓度为5％，电泳条件为110V，90min)。
浓缩酶液对鱼鳞胶原蛋白降解情况如图6所示，泳道1为草鱼鱼鳞Ⅰ型胶原蛋白对照，在该泳道中可以清晰的观察到两条重叠在一起的α1链(分子量为126kDa)与一条α2链(分子量为116kDa)以及一条高分子量的β链，结果符合Ⅰ型胶原蛋白的电泳特性；泳道2-10为与浓缩酶液原液及浓缩酶液稀释2、4、8、16、32、64、128、256倍后分别与草鱼鱼鳞中Ⅰ型胶原蛋白反应1h后的产物。从图6中可知，浓缩酶液稀释0-64倍时均可以在本实施例的实验条件下完全降解草鱼鱼鳞中的Ⅰ型胶原蛋白，浓缩酶液稀释128与256倍后在本实施例的实验条件下只能部分降解草鱼鱼鳞中的Ⅰ型胶原蛋白，表明随着稀释倍数的升高，胶原酶水解活性逐渐下降。由图6结果可知，R75E所产的胶原酶可以高效降解鱼鳞中的Ⅰ型胶原蛋白。
实施例5菌株R75E所产胶原酶对鱼鳞中胶原蛋白和明胶的降解作用
(1)鱼鳞的预处理
清洗与干燥：将市售的草鱼鱼鳞用自来水反复冲洗，直至用肉眼观察不到鱼鳞中掺杂的血液、泥土等杂质成分，将洗净的鱼鳞置于电热鼓风干燥箱中，设定温度为50℃，烘干3-4h使鱼鳞充分干燥。
脱钙：称取烘干后的鱼鳞4g浸于100mL0.5mol/L的HCl溶液中，在室温条件下搅拌脱钙2h，将脱钙后的鱼鳞用蒸馏水反复漂洗至中性，再将其浸于100mL0.5mol/L的Na2CO3溶液中，在室温条件下搅拌10h，使鱼鳞中胶原纤维的致密结构变疏松；最后，用蒸馏水将鱼鳞反复漂洗至中性。
(2)鱼鳞中胶原蛋白和明胶的提取
将步骤(1)预处理后的鱼鳞置于150mL三角瓶中并加入100mL蒸馏水，用两层锡纸封口后在压力为102.9kPa(1.05kg/cm2)，121℃条件下提取20min。待提取液冷却至室温后将其在常温下离心(12000r/min，15min)以去除杂质，所得上清液即为鱼鳞中胶原蛋白和明胶的提取液。
(3)浓缩酶液对鱼鳞胶原蛋白和明胶的降解
使用实施例3中制备的浓缩酶液与本实施例中步骤(2)所得的鱼鳞中胶原蛋白和明胶的提取液进行降解反应，降解反应在1.5mL离心管中进行，反应体系共2组，分别为：①本实施例的15μL鱼鳞中胶原蛋白和明胶的提取液+15μL超纯水；②本实施例的15μL鱼鳞胶原蛋白和明胶的提取液+15μL实施例3所得浓缩酶液；反应体系于37℃水浴条件下反应1h。反应1h后立即将反应液按照体积比5:1的比例与5×上样缓冲液混合，终止反应，沸水浴5min后进行SDS-PAGE凝胶电泳分离胶浓度为10％，浓缩胶浓度为5％，电泳条件为110V90min，电泳结束后将凝胶用所述考马斯亮蓝染色液染色1h，再经脱色液室温振荡脱色12h后拍照。
浓缩酶液对鱼鳞胶原蛋白降解情况如图7所示，泳道1为未降解的鱼鳞中胶原蛋白和明胶对照，泳道2为与浓缩酶液反应1h后的鱼鳞中胶原蛋白和明胶。从图中可以看出，鱼鳞中胶原蛋白和明胶经SDS-PAGE电泳后发现蛋白含量高，分子量分布范围广，覆盖了整个泳道且分子量在95kDa以上的蛋白所占的比例较大。而经浓缩酶液降解1h后，大部分的鱼鳞胶原蛋白被降解，降解率达到90％以上。尤其是72kDa分子量以上的高分子量的蛋白几乎全部被降解，降解后的蛋白分子量降至55kDa以下且主要集中在26kDa及以下。表明，本发明的蜡样芽孢杆菌R75E分泌的胶原酶混合物能够高效降解鱼鳞中胶原蛋白和明胶。
实施例6菌株R75E所产胶原酶对鱼骨中胶原蛋白和明胶的降解作用
(1)鱼骨胶原蛋白的提取
按照实施例5中步骤(1)与(2)处理鱼鳞的方法对同样富含胶原蛋白的草鱼鱼骨进行处理，最终得到鱼骨中胶原蛋白和明胶的提取液。
(2)浓缩酶液对草鱼鱼骨胶原蛋白和明胶的降解
使用实施例3中制备的浓缩酶液与本实施例中步骤(1)所得的鱼骨中胶原蛋白和明胶提取液进行降解反应，降解反应在1.5mL离心管中进行。反应体系共2组，分别为：①400μL实施例3所得浓缩酶液+200μL6mol/LNaOH溶液(可使酶液失活)+400μL本实施例的鱼骨中胶原蛋白和明胶的提取液；②400μL本实施例的鱼骨中胶原蛋白和明胶的提取液+400μL实施例3所得浓缩酶液，反应体系①、②分别于37℃水浴条件下反应1h，反应结束后向反应体系②加入200μL6mol/LNaOH溶液终止反应。反应结束后向反应体系①和②中均加入4mL双缩脲试剂于室温下静置20-30min，于540nm处进行比色分析。反应体系①中酶液在与底物反应前就被NaOH灭活，即酶液不降解胶原蛋白和明胶，反应体系②中酶液与底物反应后才被灭活。通过双缩脲法比较体系①和②，可知提取液中胶原蛋白和明胶是否发生降解。结果显示，反应体系②的吸光度值明显低于反应体系①的吸光度值，即反应体系②中胶原蛋白和明胶的浓度低于反应体系①。表明，本发明的蜡样芽孢杆菌R75E分泌的胶原酶混合物能够高效降解鱼骨中的胶原蛋白和明胶。
实施例7菌株R75E所产胶原酶对鱼皮中胶原蛋白和明胶的降解
(1)鱼皮中胶原蛋白和明胶的提取：
先将市售新鲜草鱼去鳞后放入肉采取机进行采肉，实现鱼肉与鱼皮的分离。。将鱼皮用自来水反复冲洗至灰白色，用肉眼不能直接观察到鱼皮中混有血、肉等杂质为止。再将洗净的鱼皮剪成大小约为1cm×1cm的小碎片,用超纯水漂洗2-3次后用电热鼓风干燥箱进行烘干处理，烘干温度为50℃，烘干2h至鱼皮充分干燥。此时，称取4g鱼皮置于盛有100mL超纯水的三角瓶中，用两层锡纸封口后将三角瓶置于102.9kPa(1.05kg/cm2)、121℃条件下提取20min。待提取液冷却至室温后将其在常温下离心(12000r/min，15min)以去除杂质，所得上清液即为草鱼鱼皮中胶原蛋白和明胶的提取液。
(2)浓缩酶液对鱼皮胶原蛋白和明胶的降解
使用实施例3中制备的浓缩酶液与本实施例中步骤(1)所得鱼皮胶原蛋白和明胶的提取液进行降解反应，降解反应在1.5mL离心管中进行。反应体系共2组，分别为：①400μL实施例3得到的浓缩酶液+200μL6mol/LNaOH溶液+400μL本实施例的鱼皮中胶原蛋白和明胶的提取液；②400μL本实施例的鱼皮中胶原蛋白和明胶的提取液+400μL实施例3所得浓缩酶液，将反应体系①和②分别于37℃水浴条件下反应1h，反应结束后向反应体系②中加入200μL6mol/LNaOH溶液终止反应。反应结束后向反应体系①和②中分别加入4mL双缩脲试剂于室温下静置30min，于540nm处进行比色分析。同实施例6结果相似，反应体系②的吸光度值明显低于反应体系①的吸光度值，即反应体系②中胶原蛋白和明胶的浓度低于反应体系①。表明，本发明的蜡样芽孢杆菌R75E分泌的胶原酶混合物能够高效降解鱼皮中的胶原蛋白和明胶。
实施例8菌株R75E所产胶原酶对猪皮中胶原蛋白和明胶的降解
(1)猪皮胶原蛋白和明胶的提取
首先，将市售新鲜猪皮去除皮下脂肪后脱毛切成1cm×1cm的碎片，再用蒸馏水反复洗涤2-3次。再按照实施例6中步骤(1)中所述的鱼皮胶原蛋白的提取方法对猪皮进行烘干以及胶原蛋白和明胶的提取。最终得到猪皮中胶原蛋白和明胶的提取液。
(2)浓缩酶液对猪皮中胶原蛋白和明胶的降解
使用实施例3中制备的浓缩酶液与本实施例中步骤(1)所得猪皮胶原蛋白和明胶提取液进行降解反应，降解反应在1.5mL离心管中进行。反应体系共2组，分别为：①400μL实施例3所得浓缩酶液+200μL6mol/LNaOH溶液+400μL本实施例的猪皮中胶原蛋白和明胶的提取液；②400μL本实施例的猪皮中胶原蛋白和明胶的提取液+400μL实施例3所得浓缩酶液，将反应体系①、②分别于37℃水浴条件下反应1h，反应结束后向反应体系②加入200μL6mol/LNaOH溶液终止反应。反应结束后向反应体系①和②中分别加入4mL双缩脲试剂于室温下静置20-30min，于540nm处进行比色分析。同实施例6结果相似，反应体系②的吸光度值明显低于反应体系①的吸光度值，即反应体系②中胶原蛋白和明胶的浓度低于反应体系①。表明，本发明的蜡样芽孢杆菌R75E分泌的胶原酶混合物能够高效降解猪皮中的胶原蛋白和明胶。
实施例9菌株R75E所产胶原酶对牛骨中胶原蛋白和明胶的降解
(1)牛骨胶原蛋白的提取
牛骨的预处理：将市售新鲜的牛长骨用自来水反复清洗后用刀斧破碎，称取20g牛骨碎块在4℃条件下低温浸泡48h，期间每12h更换一次水除去碎肉、软骨等杂质。浸泡完毕后将牛骨碎块在室温条件下自然晾干，晾干后将牛骨碎块用高速粉碎机粉碎至粉末状，将牛骨粉置于电热鼓风干燥箱中，设定温度为40℃，烘干3-4h至牛骨粉充分干燥。牛骨的脱脂：称取4.0g干燥后的牛骨粉，采用索氏抽提法以石油醚为溶剂在60℃条件下回流低温脱脂4h，控制石油醚回流量在30滴/min左右。牛骨的脱钙及胶原蛋白的提取：按照实施例4中步骤(1)与(2)所述的方法，对脱脂后的牛骨粉进行脱钙及胶原蛋白的提取，得到牛骨中胶原蛋白和明胶提取液。
(2)浓缩酶液对牛骨中胶原蛋白和明胶的降解
使用实施例3中制备的浓缩酶液与本实施例中步骤(1)所得牛骨胶原蛋白和明胶的提取液进行降解反应，降解反应在1.5mL离心管中进行。反应体系共2组，分别为：①400μL实施例3所得浓缩酶液+200μL6mol/LNaOH溶液+400μL本实施例的牛骨中胶原蛋白和明胶的提取液；②400μL本实施例的牛骨中胶原蛋白和明胶的提取液+400μL实施例3所得浓缩酶液，将反应体系①和②分别于37℃水浴条件下反应1h，反应结束后向反应体系②加入200μL6mol/LNaOH溶液终止反应。反应结束后向反应体系①、②中分别加入4mL双缩脲试剂于室温下静置20-30min，于540nm处进行比色分析。同实施例6结果相似，反应体系②的吸光度值明显低于反应体系①的吸光度值，即反应体系②中胶原蛋白和明胶的浓度低于反应体系①。表明，本发明的蜡样芽孢杆菌R75E分泌的胶原酶混合物能够高效降解牛骨中的胶原蛋白和明胶。

Claims (10)

1.一种蜡样芽孢杆菌，拉丁文名称为Bacilluscereus，其保藏编号为：CGMCCNO.8614。
2.一种权利要求1所述的蜡样芽孢杆菌在生产含有胶原酶的酶液方面的应用，所得含有胶原酶的酶液中包含两种分子量不同的胶原酶，即分子量为106kDa的胶原酶Ⅰ和分子量为95kDa的胶原酶Ⅱ。
3.一种权利要求2中所生产的含有胶原酶的酶液在降解胶原蛋白和明胶方面的应用。
4.一种利用权利要求1所述的蜡样芽孢杆菌降解胶原蛋白或明胶的方法，其特征在于，包括下述步骤：
(1)将权利要求1所述的蜡样芽孢杆菌使用LB液体培养基扩大培养，然后离心除去菌体，得到粗酶液；在冰浴条件下向粗酶液中加入硫酸铵粉末，沉淀所得粗酶液中的蛋白，得到沉淀物；所得沉淀物用pH值为7.5的Tris-HCl缓冲液复溶，所得复溶溶液用pH值为7.5的Tris-HCl缓冲液在4℃条件下透析，透析后得到浓缩酶液；
(2)将含胶原蛋白或明胶的溶液与步骤(1)所得浓缩酶液混合后于37℃水浴条件下降解胶原蛋白或明胶。
5.根据权利要求4所述的利用蜡样芽孢杆菌降解胶原蛋白或明胶的方法，其特征在于，所述含有胶原蛋白或明胶的溶液为鱼鳞或鱼皮或鱼骨或牛骨或猪皮的提取液。
6.根据权利要求5所述的利用蜡样芽孢杆菌降解胶原蛋白或明胶的方法，其特征在于，所述鱼鳞的提取液通过下述方法得到：
(1)将干燥的鱼鳞浸于HCl溶液中在室温下搅拌脱钙；再将脱钙后的鱼鳞浸于Na2CO3溶液中，在室温条件下搅拌，使胶原蛋白中的胶原纤维的致密结构变疏松；最后，用蒸馏水将鱼鳞反复漂洗至中性；
(2)将漂洗至中性的鱼鳞与蒸馏水混合，在压力为102.9kPa，温度为121℃条件下提取15-20min；待提取液冷却至室温后，在室温下离心去除提取液中的杂质，所得上清液即为鱼鳞的提取液。
7.根据权利要求6所述的利用蜡样芽孢杆菌降解胶原蛋白或明胶的方法，其特征在于，所述鱼鳞的脱钙的方法为：将清洗后干燥的鱼鳞浸于0.5mol/L的HCl溶液中在室温条件下搅拌脱钙2-4h。
8.根据权利要求4所述的利用蜡样芽孢杆菌降解胶原蛋白或明胶的方法，其特征在于，含有胶原蛋白或明胶的提取液与浓缩酶液等体积混合。
9.根据权利要求5所述的利用蜡样芽孢杆菌降解胶原蛋白或明胶的方法，其特征在于，所述鱼皮、鱼骨、牛骨或猪皮的提取液的制备方法为：将鱼皮、鱼骨、牛骨或猪皮作为原材料除去杂质后用电热鼓风干燥箱充分干燥；将每4g干燥后的原材料与100mL超纯水混合，在压力为102.9kPa，温度为121℃条件下提取15-20min；待提取体系冷却至室温后，在室温下离心去除原材料提取液中的杂质，所得上清液即分别为鱼皮、鱼骨、牛骨或猪皮的提取液。
10.根据权利要求4-9中任一项所述的利用蜡样芽孢杆菌降解胶原蛋白或明胶的方法，其特征在于，蜡样芽孢杆菌在LB液体培养基中扩大培养的培养时间为24h；Tris-HCl缓冲液浓度为50mmol/L，按照每1mg沉淀用5mLTris-HCl缓冲液的比例复溶沉淀。
CN201410283436.6A 2014-06-23 2014-06-23 一种蜡样芽孢杆菌及其应用 Active CN104017761B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201410283436.6A CN104017761B (zh) 2014-06-23 2014-06-23 一种蜡样芽孢杆菌及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201410283436.6A CN104017761B (zh) 2014-06-23 2014-06-23 一种蜡样芽孢杆菌及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN104017761A CN104017761A (zh) 2014-09-03
CN104017761B true CN104017761B (zh) 2016-05-04

Family

ID=51434769

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201410283436.6A Active CN104017761B (zh) 2014-06-23 2014-06-23 一种蜡样芽孢杆菌及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN104017761B (zh)

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104830821A (zh) * 2015-05-13 2015-08-12 天津商业大学 一种蜡样芽胞杆菌胶原酶的纯化方法
CN104988127A (zh) * 2015-05-13 2015-10-21 天津商业大学 在大肠杆菌中表达胶原酶的dna分子、重组胶原酶的方法及应用
CN105087448B (zh) * 2015-09-17 2018-06-29 天津科技大学 一株产胶原蛋白酶的菌株及其水解铬革屑的应用
CN106957803A (zh) * 2016-01-08 2017-07-18 中国科学院天津工业生物技术研究所 一株胶原酶生产菌株及其胶原酶基因序列与应用
CN110156913A (zh) * 2019-05-21 2019-08-23 扬州日兴生物科技股份有限公司 一种利用蜡样芽孢杆菌处理废弃虾蟹壳提取甲壳素的方法
CN110592170A (zh) * 2019-10-29 2019-12-20 浙江黛君生物医药科技有限公司 鱼皮胶原蛋白多肽的提取方法及其提取物和应用
CN113308412B (zh) * 2021-07-09 2022-03-11 清华大学 一种蜡样芽孢杆菌和马铃薯茎叶降解及原位腐熟还田工艺

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Production and properties of two collagenases from bacteria and their application for collage extraction;Warinda Suphatharaprateep et al;《New Biotechnology》;20111031;第28卷(第6期);649-645 *
产骨胶原蛋白酶菌种的筛选与鉴定;刘丽莉 等;《食品与生物技术学报》;20111130;第30卷(第6期);917-913 *
胶原蛋白酶产生菌的筛选及酶的分离纯化;马丽莉 等;《生物工程学报》;20100225;第26卷(第2期);194-200 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN104017761A (zh) 2014-09-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN104017761B (zh) 一种蜡样芽孢杆菌及其应用
CN100419072C (zh) 一种角蛋白酶的产生菌及其制备方法
CN103232963B (zh) 一种胶原蛋白酶产生菌
CN103695341B (zh) 一种由海洋细菌分泌的褐藻胶裂解酶及其制备方法
CN1769424A (zh) 一种芽孢杆菌菌株及其用途
CN102389022B (zh) 利用地衣芽孢杆菌降解羽毛制备菌肽复合蛋白饲料添加剂的方法
CN103820352A (zh) 一种蜡样芽孢杆菌ysq08及其应用
CN106047749A (zh) 一种玉米赤霉烯酮降解菌及其应用
CN104651246A (zh) 一株枯草芽孢杆菌及发酵豆粕前处理工艺
CN114164145B (zh) 一种波茨坦短芽孢杆菌、中性蛋白分解酶及其应用
CN105255771B (zh) 一种产胶原蛋白酶的琥珀葡萄球菌及其应用
CN110317748A (zh) 一株链霉菌菌株及其在降解羽毛中的应用
CN108486002B (zh) 一株产胞外多糖的罗汉果内生菌菌株及其生产胞外多糖的方法和胞外多糖的应用
CN108203729B (zh) 一种巨藻抗氧化肽的制备方法
CN106479944A (zh) 一种解淀粉芽孢杆菌及其应用
CN105349462B (zh) 一株龙舌兰芽孢杆菌Hexi1及其在堆肥中的应用
CN104388331A (zh) 短短芽孢杆菌h3及其应用
CN105199983B (zh) 一株解淀粉芽孢杆菌及其产生的蛋白酶在制革脱毛方面的应用
CN104049026B (zh) 一种用于筛选微生物胞外胶原酶的酶谱方法
CN103789237A (zh) 一种产细菌漆酶的恶臭假单胞菌及应用
CN101165171B (zh) 对胡萝卜软腐欧文氏菌具有抑菌活性的枯草芽胞杆菌BSn5及抑菌蛋白APn5
CN105385632A (zh) 一株木质纤维素类物质高效降解菌s1及其应用
CN109486730A (zh) 芽孢杆菌h3、由其发酵鱼皮制备胶原蛋白多肽的用途和胶原蛋白多肽
CN115772482A (zh) 一株多功能贝莱斯芽孢杆菌、菌剂及其应用
CN105385628A (zh) 一株木质纤维素类物质高效降解菌l124及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
TR01 Transfer of patent right
TR01 Transfer of patent right

Effective date of registration: 20171103

Address after: 210038 No. 68 Xingang Avenue, Nanjing economic and Technological Development Zone, Jiangsu

Patentee after: Nanjing Xinbai Pharmaceutical Co., Ltd.

Address before: Tianjin highway 300134 East Tianjin District of Beichen City

Patentee before: Tianjin University Of Commerce