CN102094055A - 一种由苏云金杆菌发酵液制备活性毒素的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种由苏云金杆菌发酵液制备活性毒素的方法。该方法首先将苏云金杆菌发酵液离心去除上清液，沉淀物用水悬浮后加碱处理，或直接用稀碱液调配成悬浮液，直接获取含有活性毒素的悬浮液，然后经过离心、超滤、等电点沉淀、洗涤、冷冻干燥等操作，制备活性毒素干粉末。本发明的方法简便，成本低，与普通方法相比缩短了提取周期短，且提取量大。同时克服了伴胞晶体与芽胞分离操作中对发酵液固形物含量的限制，可以对大量胞晶混合物进行碱溶，提取量明显提高。
Description
【技术领域】
本发明涉及微生物农药苏云金杆菌发酵液后处理技术领域，特别是一种将苏云金杆菌发酵液中的伴胞晶体和芽胞沉淀不经洗涤直接碱解制备活性毒素的方法。
【背景技术】
苏云金杆菌（Bacillus thuringiensis,简称Bt）是一种产生伴胞晶体、能寄生于昆虫体内引起昆虫发病的芽胞杆菌。自20世纪中期实现工业化生产以来，已成为当前世界上产量最大、应用最广的一种生物杀虫剂，广泛用于防治农业、林业、贮藏害虫以及医学昆虫。苏云金杆菌的工业生产主要采用深层液体发酵法，菌种在发酵罐内经过30-36 h的搅拌培养产生大量的伴胞晶体和芽胞，发酵液经过离心或超滤浓缩后制备液体制剂，或喷雾干燥后制备粉剂。
苏云金杆菌制剂中的伴胞晶体是主要杀虫成分，但伴胞晶体本身没有毒性，它是由原毒素为基本单元组成的二聚体结构。伴胞晶体被昆虫取食后，在肠道碱性环境下溶解释放出原毒素蛋白（分子量约130 kDa），原毒素蛋白在酶的作用下发生降解，最终得到分子量为65-70 kDa 活性毒素蛋白。这种活性毒素蛋白是一种稳定片段，它可以特异性地结合于昆虫中肠细胞的糖蛋白受体上，在细胞膜上产生一个直径1-2纳米的孔。这个孔洞导致中肠上皮细胞膨胀并瓦解，引起昆虫死亡。为了研究苏云金杆菌的杀虫效果和毒素蛋白结构，科研人员经常需要提取这种活性毒素。根据文献报道（宋萍 , 潘映红 , 陆秀君，等. 两种纯化苏云金杆菌HD-73 毒素蛋白方法的比较研究[J]. 河北农业大学学报, 2005,28(3): 63-65；周艳琴，姚宝安，夏雪山，等. Bt 伴胞晶体毒素对小鼠体内不同时期日本血吸虫的作用[J]. 华中农业大学学报, 2005,24(5): 492-494），苏云金杆菌活性毒素的提取要经过以下几个步骤：
（1）发酵液制备。采用摇瓶或发酵罐制备苏云金杆菌发酵液。
（2）胞晶混合物的制备。苏云金杆菌发酵液经离心沉淀、去除上清液后获得芽胞和伴胞晶体混合物。
（3）胞晶混合物的洗涤。采用0.5-1 mol/L氯化钠溶液和无菌水依次洗涤，去除对伴胞晶体有降解作用的蛋白酶类。
（4）原毒素的制备。胞晶混合物采用碱液处理，伴胞晶体在溶解过程释放出原毒素。离心分离沉淀，原毒素溶液进行等电点沉淀。
（5）活性毒素的制备。原毒素采用蛋白酶降解，获得活性毒素溶液。活性毒素溶液经过透析、等电点沉淀、离心、洗涤、冻干等步骤得到活性毒素粉末，或经过凝胶层析过滤柱纯化，冷冻干燥制备活性毒素干粉。
有些国内外文献提供的操作程序更为复杂，它们首先对发酵液中的伴胞晶体与芽胞进行分离，然后对纯净的伴胞晶体进行碱溶、酶解获得活性毒素溶液（田野. 苏云金芽孢杆菌Cry1Ac毒素对棉铃虫作用机理的研究[D]，长沙：湖南师范大学. 2008年12月）。在伴胞晶体与芽胞分离过程中，发酵液的固形物含量不能过高，因此处理量较小。
上述方法提取活性毒素操作步骤多，提取量较小。研究表明，伴胞晶体的降解是从C端开始的，最后得到一段分子量65000-70000的N端片段。这个片段对蛋白酶的水解具有很强的稳定性，普通蛋白酶不能将其继续降解。基于此点考虑，预先对胞晶混合物进行氯化钠洗涤和进行胞晶分离是不必要的，而且提取液中保留足够数量的蛋白酶反而有利于活性毒素的生成。本发明简化了活性毒素的提取程序，将苏云金杆菌发酵液离心去除上清液后，直接碱溶，经过离心、超滤、等电点沉淀、冷冻干燥得到活性毒素粉末。这种提取方法操作简便，提取量大。
【发明内容】
本发明的目的在于改进现有的苏云金杆菌杀虫毒素提取的方法，通过简化原毒素蛋白的制备程序，直接将伴胞晶体降解成对蛋白酶稳定的活性毒素片段。这种活性毒素不仅比原毒素耐贮藏，而且能够完整保持杀虫活性。
本发明公开了这种苏云金杆菌活性毒素的提取方法，其特征在于按照下列步骤操作：
（1）将苏云金芽胞杆菌发酵液装入离心管，高速离心去除上清液，得到胞晶混合物沉淀物。
（2）将步骤1所得的胞晶混合物沉淀物，用去离子水调配成固形物含量的重量与体积比为5%-15%的悬浮液，在搅拌下水浴升温，在30-60℃条件下滴加1mol/L NaOH溶液，维持溶解体系的pH在10—12之间，碱解4—5 h，得到伴胞晶体的碱溶解液； 或者：
将步骤1所得的胞晶混合物沉淀物，直接用0.01-0.05 mol/L碳酸钠溶液调配成悬浮液，固形物含量的重量与体积比在5%-15%之间，在搅拌下升温，在30-60℃条件下碱解4—5 h；碱解期间用0.5mol/L Na2CO3溶液调节悬浮液pH在10—12之间；
（3）将步骤2所得的伴胞晶体的碱溶解液离心去沉淀，收集上清液；
（4）将步骤3所得的上清液用截留分子量≤60kDa的离心过滤装置过滤，滤除小分子物质；
（5）收集步骤4中被截留的活性毒素，采用等电点法对活性毒素进行沉淀；
（6）步骤5所得的活性毒素沉淀用去离子水洗涤，离心脱水后冷冻干燥，得浅棕色粉末。
步骤（5）所述被截留的活性毒素用pH 10—12的碱液清洗处理，碱液是氢氧化钠溶液或是碳酸钠溶液；所得活性毒素的碱性溶液用重量比10%-20% 的盐酸溶液中和，但最好用10%-30% (w/v)的醋酸溶液中和至pH 4-5，转入4oC冰箱静置沉降4-8 h。
步骤（6）所述沉淀的活性毒素用去离子水洗涤的步骤是：活性毒素沉淀静置完成后小心倾出部分上清液，剩余部分悬液搅拌均匀，分装离心管，在6000-12000 r/min离心20 min。去掉清液，毒素沉淀用去离子水洗涤3-6次。
本发明制备苏云金杆菌活性毒素的方法简便，成本低，与普通方法相比具有如下特点。
（1）缩短了提取周期短。本发明省去了胞晶分离、胞晶混合物洗涤等操作，提取周期较常规工艺缩短15-24 h。
（2）提取量大。本发明克服了伴胞晶体与芽胞分离操作中对发酵液固形物含量的限制，可以对大量胞晶混合物进行碱溶，提取量明显提高。
【具体实施方式】
本发明提出的由苏云金杆菌发酵液制备活性毒素的方法，首先将苏云金杆菌发酵液离心去除上清液，沉淀物用水悬浮后加碱处理，或直接用稀碱液调配成悬浮液，直接获取含有活性毒素的悬浮液。经过离心、超滤、等电点沉淀、洗涤、冷冻干燥等操作，制备活性毒素干粉末。
本发明由苏云金杆菌发酵液制备活性毒素的方法可以通过以下操作实现：
（1）发酵液胞晶沉淀的制备：
将苏云金芽胞杆菌发酵液摇匀，分装到50-500 mL的离心管内，调配平衡后放入离心机，在6000-12000 r/min离心20 min，伴胞晶体和芽胞沉降到管底。倾出上清液，胞晶混合物沉淀收集到烧杯。
（2）胞晶混合物的碱解：
胞晶混合物沉淀用去离子水调配成固形物含量为5%-15%（w/v）的悬浮液，在搅拌下水浴升温至30-60℃，滴加1mol/L NaOH溶液，维持溶解体系的pH在10—12之间，碱解4—5 h。另一种溶解方法是，将胞晶混合物沉淀直接用0.01-0.05 mol/L碳酸钠溶液调配成悬浮液，固形物含量在5%-15%（w/v）之间，在搅拌下升温至30-60℃，碱解4—5 h。期间若悬浮液的pH下降到10以下，用0.5 mol/L Na2CO3溶液调节至pH 10以上。
（3）碱解残渣的去除：
将碱解处理后的悬浮液装入离心管，在6000-12000 r/min离心20 min，小心倾出上清液，沉淀去掉。
（4）活性毒素的超滤：
活性毒素溶解液用截留分子量≤60kDa的离心过滤装置超滤，活性毒素截留在滤筒内，小分子物质进入滤液。
（5）活性毒素的沉淀：
被截留的活性毒素用pH 10—12的碱液清洗处理，碱液可是氢氧化钠溶液，也可以是碳酸钠溶液。清洗液收集在烧杯。活性毒素的碱性溶液用10%-20% (W/W)的盐酸溶液中和，但最好用10%-30% (w/v)的醋酸溶液中和。中和液在pH 6附近出现沉淀。继续加酸至pH 4-5，转入4oC冰箱静置沉降4-8 h。
（6）活性毒素的洗涤、干燥：
活性毒素沉淀静置完成后小心倾出部分上清液，剩余部分悬液搅拌均匀，分装离心管，在6000-12000 r/min离心20 min。去掉清液，毒素沉淀用去离子水洗涤3-6次。冷冻干燥，得活性毒素棕色粉末。
实施例1：苏云金杆菌库斯塔克亚种活性毒素的制备
苏云金杆菌库斯塔克亚种发酵液1.8 L（固含量8.5%，w/v），分装到6个500 mL离心管内，在8000 r/min条件下离心20 min。去掉清液，胞晶沉淀用用药匙转入2000 mL烧杯内。胞晶混合物沉淀用去离子水调配成固形物含量为10%（w/v）的悬浮液，在搅拌下水浴升温至60℃，滴加1mol/L NaOH溶液，维持溶解体系的pH在11—12之间，溶解4 h。
碱解悬浮液分装到6个500 mL离心管内，在8000 r/min离心20 min，小心收集上清液，沉淀弃去。活性毒素溶解液用容积50 mL、截留分子量≤60kDa的离心过滤装置超滤，在5000 r/min离心10 min，然后补充装液一次。每支超滤管连续装液、离心两次后，截留的活性毒素用pH 11—12的氢氧化钠溶液清洗，洗液收集在3000 mL烧杯。待洗液收集齐备，活性毒素溶解液用25%（w/v）的醋酸溶液中和至pH 4.5。烧杯转入4℃冰箱静置沉降4 h，小心倾出大部分上清液，剩余部分悬液搅拌均匀后装入500 mL离心管，在8000 r/min离心20 min。去掉清液，毒素沉淀用去离子水洗涤3次。冷冻干燥，得活性毒素棕色粉末4.6 g，经SDS-PAGE电泳检测，分子量65kDa。
实施例2：苏云金杆Cry1Ac菌工程菌活性毒素的制备
取表达Cry1Ac 原毒素的苏云金杆菌发酵液0.5 L（固含量6.0%，w/v），分装到8个100 mL离心管内，在11000 r/min条件下离心20 min。去掉清液，胞晶沉淀用药匙转入1000 mL烧杯内。胞晶混合物沉淀用0.03mol/L碳酸钠溶液调配成固形物含量为6%（w/v）的悬浮液，在搅拌下升温至37℃，碱解4 h。随时监测溶解液的pH值，当悬浮液的pH＜10时，用0.5mol/L Na2CO3溶液调节至pH 10以上。
碱解后的悬浮液分装到100 mL离心管内，在11000 r/min离心20 min，小心收集上清液，沉淀弃去。活性毒素溶解液用容积50 mL、截留分子量≤60kDa的离心过滤装置超滤（在5000 r/min离心10 min）。截留的活性毒素用0.05 mol/L Na2CO3溶液洗涤，洗液收集在1000 mL烧杯。活性毒素溶解液用20%（w/w）的盐酸溶液中和至pH 4.4。烧杯转入4oC冰箱静置沉降4 h，小心倾出大部分上清液，剩余部分悬液搅拌均匀后装入100 mL离心管，在11000 r/min离心20 min。去掉清液，毒素沉淀用去离子水洗涤3次。冷冻干燥，得活性毒素棕色粉末1.8 g,经SDS-PAGE电泳检测，分子量65kDa。
实施例3：苏云金杆菌拟步行甲亚种活性毒素的制备
苏云金杆菌拟步行甲亚种发酵液1.8 L（固含量6.4%，w/v），分装到6个500 mL离心管内，在8000 r/min条件下离心20 min。去掉清液，胞晶沉淀用药匙转入3000 mL烧杯内。胞晶混合物沉淀用去离子水调配成固含量为5%（w/v）的悬浮液，在搅拌下升温至45℃，滴加1mol/L NaOH溶液，维持溶解体系的pH在11—12之间，溶解5 h。
碱解悬浮液分装到6个500 mL离心管内，在8000 r/min离心20 min，小心收集上清液，沉淀弃去。活性毒素溶解液用容积50 mL、截留分子量≤60kDa的离心过滤装置超滤，在5000 r/min离心10 min。第一次超滤结束后，继续补液超滤第二次。截留的活性毒素用pH 11-12氢氧化钠溶液洗涤，洗液收集在3000 mL烧杯。活性毒素溶解液用20%（w/w）的醋酸溶液中和至pH 4.6。烧杯转入4oC冰箱静置沉降6 h，小心倾出大部分上清液，剩余部分悬浮液搅拌均匀装入500 mL离心管，在8000 r/min离心20 min。去掉清液，毒素沉淀用去离子水洗涤3次。冷冻干燥，得活性毒素棕色粉末2.3 g，经SDS-PAGE电泳检测，分子量68kDa。
Claims (3)
1.一种由苏云金杆菌发酵液制备活性毒素的方法，其特征在于按照下列步骤操作：
（1）将苏云金芽胞杆菌发酵液装入离心管，高速离心去除上清液，得到胞晶混合物沉淀物；
（2）将步骤1所得的胞晶混合物沉淀物，用去离子水调配成固形物含量的重量与体积比为5%-15%的悬浮液，在搅拌下水浴升温，在30-60℃条件下滴加1mol/L NaOH溶液，维持溶解体系的pH在10—12之间，碱解4—5 h，得到伴胞晶体的碱溶解液； 或者：
将步骤1所得的胞晶混合物沉淀物，直接用0.01-0.05 mol/L碳酸钠溶液调配成悬浮液，固形物含量的重量与体积比在5%-15%之间，在搅拌下升温，在30-60℃条件下碱解4—5 h；碱解期间用0.5mol/L Na2CO3溶液调节悬浮液pH在10—12之间；
（3）将步骤2所得的伴胞晶体的碱溶解液离心去沉淀，收集上清液；
（4）将步骤3所得的上清液用截留分子量≤60kDa的离心过滤装置过滤，滤除小分子物质；
（5）收集步骤4中被截留的活性毒素，采用等电点法对活性毒素进行沉淀；
（6）步骤5所得的活性毒素沉淀用去离子水洗涤，离心脱水后冷冻干燥，得浅棕色粉末。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤（5）所述被截留的活性毒素用pH 10—12的碱液清洗处理，碱液是氢氧化钠溶液或是碳酸钠溶液；所得活性毒素的碱性溶液用重量比10%-20% 的盐酸溶液中和，或者重量与体积比在10%-30%的醋酸溶液中和至pH 4-5，转入4oC冰箱静置沉降4-8 h。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于步骤（6）所述沉淀的活性毒素用去离子水洗涤的步骤是：活性毒素沉淀静置完成后小心倾出部分上清液，剩余部分悬液搅拌均匀，分装离心管，在6000-12000 r/min离心20 min，去掉清液，毒素沉淀用去离子水洗涤3-6次。
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