JP2022531146A - ＣＲＹ２Ａｉタンパク質をコードするコドン最適化合成ヌクレオチド配列及びその使用 - Google Patents

ＣＲＹ２Ａｉタンパク質をコードするコドン最適化合成ヌクレオチド配列及びその使用 Download PDF

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Abstract

本開示は、鱗翅目に属する害虫を含むがこれらに限定されない害虫に対して殺虫活性を有するバチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）（Ｂｔ）殺虫性結晶Ｃｒｙ２Ａｉタンパク質をコードするコドン最適化合成ヌクレオチド配列を提供する。本開示はまた、植物におけるこれらの配列の発現に関する。本開示はさらに、本発明のコドン最適化合成ヌクレオチド配列を含む、ＤＮＡ構築物、ベクター、及び宿主細胞を提供する。本開示はまた、耐虫性トランスジェニック植物の産生のための、コドン最適化合成ヌクレオチド配列の使用、及び本発明のコドン最適化合成ヌクレオチド配列を含む、バチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）を含む組成物を提供する。

Description

電子的に提出された配列表への参照
[001] 明細書と同時に電子的に提出された、２５ｋｂのサイズを有する、２０１９年４月２３日に作成された「PD033499IN-SC sequence listing.txt」という名称のファイルの配列表の認証謄本は、明細書の一部である。
分野
[002] 本開示は、鱗翅目に属する害虫を含むがこれらに限定されない害虫に対して殺虫活性を有するバチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）（Ｂｔ）殺虫性結晶タンパク質をコードするコドン最適化合成ヌクレオチド配列に関する。本開示はまた、植物におけるこれらの配列の発現に関する。
背景
[003] 害虫は、世界の農作物の損失の主な要因であり、世界の年間総作物生産量の５分の１を破壊する原因であると言われている。ヒトが消費するのに適した作物を人為的に選択する過程で、昆虫の侵入に対して非常に影響を受けやすい植物も選択され、最終的にその経済的価値を低下させ、生産コストを増加させる。
[004] 伝統的に、害虫は、化学的及び／又は生物学的農薬の適用によって制御されている。化学農薬の製造及び使用に関連する環境上の危険性のために、化学農薬の使用には一定の懸念がある。そのような懸念のために、規制当局は、より危険な農薬のいくつかの使用を禁止又は制限している。
[005] さらに、害虫は、新しい状況に適応できる自然淘汰のプロセスとして、例えば、有毒物質の影響を克服する、又は天然若しくは人工の植物耐性を迂回するなど、時間の経過とともに進化する能力があることは周知の事実であり、これはさらに課題を追加するものである。
[006] 生物農薬は、化学農薬に代わる環境的及び商業的に受け入れられる代替品である。これは、汚染及び環境被害のリスクが低く、従来の広域化学殺虫剤よりも高い標的特異性を提供する。
[007] バチルス（Bacillus）属の微生物の特定の種、例えばバチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）（Ｂ．ｔ．）は、広範囲の害虫に対して殺虫活性を有することが知られている。殺虫活性は副芽胞の結晶性タンパク質封入体に集中しているようであるが、殺虫性タンパク質はバチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）の栄養成長期からも単離されている。
[008] 植物におけるバチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）（Ｂｔ）殺虫性結晶（ｃｒｙ）タンパク質遺伝子の発現は当技術分野で公知であるが、植物において天然のＢｔ遺伝子を発現させることは非常に困難であることが見出された。植物で機能する様々なプロモーターと組み合わせて、植物でＢｔ ｃｒｙタンパク質遺伝子を発現させる試みがなされてきた。しかし、トランスジェニック植物においては低レベルのタンパク質しか得られていなかった。
[009] 植物におけるＢｔ ｃｒｙ遺伝子の発現レベルが低い理由の１つは、Ｇ／Ｃ比がＡ／Ｔよりも高い植物遺伝子よりもＢｔ ＤＮＡ配列のＡ／Ｔ含有量が高いことである。細菌遺伝子のＡ／Ｔの全体的な値は６０～７０％で、植物遺伝子は４０～５０％である。結果として、ｃｒｙ遺伝子のコドン使用量におけるＧＣ比は、最適なレベルで発現するには著しく不十分である。さらに、Ａ／Ｔリッチ領域には、転写終結部位（ＡＡＴＡＡＡポリアデニル化）、ｍＲＮＡ不安定モチーフ（ＡＴＴＴＡ）、及び潜在性ｍＲＮＡスプライシング部位も含まれ得る。天然のＢｔ ｃｒｙ遺伝子のコドン使用は、植物遺伝子のものとは有意に異なることが観察されている。結果として、この遺伝子からのｍＲＮＡは効率的に利用されない可能性がある。コドン使用は、翻訳又は転写又はｍＲＮＡプロセシングのレベルで遺伝子の発現に影響を与え得る。植物での発現のために殺虫性遺伝子を最適化するため、形質転換される宿主植物内に天然に含まれる遺伝子に可能な限り類似するように遺伝子を改変する試みがなされてきた。
[0010] しかし、コブノメイガ、イッテンオオメイガなどの特定の害虫に対する耐性を付与する高／最適レベルのＢｔ ｃｒｙタンパク質を発現する作物植物品種の開発は、依然として農業分野で大きな問題となっている。作物植物への昆虫の侵入を制御又は防止するための様々な試みがなされてきたが、特定の害虫は依然として農業において重大な問題である。したがって、トランスジェニック植物における殺虫性タンパク質の所望の発現レベルを有する耐虫性トランスジェニック作物植物の必要性が依然として存在する。
[0011] 本発明は、鱗翅目に属する害虫を含むがこれらに限定されない害虫に対して殺虫活性を有するＢｔ Ｃｒｙ２Ａｉタンパク質をコードする植物コドン最適化合成ＤＮＡ配列を提供することによる、害虫侵入という既存の問題に対する解決策を本明細書に提供する。
概要
[0012] 害虫に対して殺虫活性を有するＢ．チューリンゲンシス（B. thuringiensis）Ｃｒｙ２Ａｉタンパク質をコードするコドン最適化合成ヌクレオチド配列が本明細書に開示される。本開示は、植物細胞における異種遺伝子の発現を増強するための方法に向けられる。ｃｒｙ２Ａｉ遺伝子の遺伝子又はコード領域は、植物特異的な優先コドン配列を提供するために構築される。この様式において、Ｃｒｙ２Ａｉタンパク質のコドン使用は、植物での発現が増加するように変更される。そのような植物最適化コード配列は、植物細胞におけるコード配列の発現を導くことができるプロモーターに作動可能に連結することができる。コドン最適化Ｂ．チューリンゲンシス（B. thuringiensis）合成ヌクレオチド配列を含む形質転換された宿主細胞及びトランスジェニック植物もまた、本開示の態様である。
[0013] 本開示の目的の１つは、殺虫性タンパク質をコードするコドン最適化合成ヌクレオチド配列を提供することであり、ここで、ヌクレオチド配列は、植物における発現のために最適化されている。
[0014] 本開示の別の目的は、植物、好ましくは、ナス、ワタ、イネ、トマト、小麦、トウモロコシ、ソルガム、オート麦、キビ、マメ科植物、キャベツ、カリフラワー、ブロッコリー、アブラナ属（Brassica sp.）、マメ、エンドウマメ、キマメ、ジャガイモ、コショウ、ククルビタ、レタス、サツマイモカノーラ、大豆、アルファルファ、ピーナッツ、ヒマワリからなる群から選択される植物におけるＢｔタンパク質の発現を最大化するために、殺虫性Ｂｔタンパク質をコードするコドン最適化ヌクレオチド配列を提供することである。コドン最適化合成Ｂｔ ｃｒｙ２Ａｉ遺伝子が、最も好ましいナス、イネ及びマメ科植物のコドンを使用して構築されることは、本開示の１つの特徴である。
[0015] 本開示によると、本発明者らは、植物、特にナス、イネ、及びマメ科植物における発現を増加させるために、コドン使用が変更されたＢｔ殺虫性Ｃｒｙ２Ａｉ結晶タンパク質遺伝子を合成した。しかしながら、本発明者らは、全体的なコドン分布に関してナス、イネ又はマメ科植物の遺伝子に類似するようにコドン使用を変更するのではなく、本発明者らは、本開示のヌクレオチド配列の合成において、イネ、ナス、トマト、トウモロコシ及びマメ科植物などの植物において最も好ましいコドンを使用することにより、コドン使用を最適化した。最適化された植物の優先コドン使用は、ナス及びトマトなどの双子葉植物、イネなどの単子葉植物、及びヒヨコマメ及びキマメなどのマメ科植物における、高レベルのＢｔ殺虫性タンパク質の発現に効果的である。
[0016] 本開示のコドン最適化合成ヌクレオチド配列は、配列番号１（NCBI GenBank:ACV97158.1）に記載のアミノ酸配列を有するバチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）Ｃｒｙ２Ａｉタンパク質に由来している。配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質は、オオタバコガ（Helicoverpa armigera）－ワタキバガの幼虫及びオオタバコガの幼虫、コブノメイガ（Cnaphalocrocis medinalis）－コブノメイガ（rice leaffolder）、及びイッテンオオメイガ（Scirpophaga incertulas）－イッテンオオメイガ（rice yellow stem borer）及びワタアカミムシ（Pectinophora gossypiella）を含む、様々な鱗翅目昆虫に対して活性である。
[0017] 本開示は、イネ、ナス、及びヒヨコマメにおける発現について、それぞれナス、イネ及びマメ科植物に最適化されたＢｔ ｃｒｙ２Ａｉヌクレオチドの合成によって例示されてきたが、ナスに最適化されたＢｔ ｃｒｙ２Ａｉヌクレオチドは、トマト、トウモロコシ及びワタなどの他の植物でもタンパク質の発現を最適化するために利用できることが認識されている。さらに、イネに最適化されたＢｔ ｃｒｙ２Ａｉヌクレオチドは、他の植物でもタンパク質の発現を最適化するために利用できることが認識されている。同様に、マメ科植物に最適化されたＢｔ ｃｒｙ２Ａｉヌクレオチドは、他の植物でもタンパク質の発現を最適化するために利用できることが認識されている。
[0018] したがって、本開示の態様の１つは、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするコドン最適化合成ヌクレオチド配列を提供することであり、ここで、前記ヌクレオチド配列は、
ａ．配列番号２に記載の配列、若しくはそれに相補的なヌクレオチド配列、又は
ｂ．配列番号２の２５１～４０２位及び／又は１４５６～１６２８に記載のヌクレオチド配列、若しくはそれに相補的な配列の、少なくとも１０ヌクレオチドに特異的にハイブリダイズするヌクレオチド配列
である。
[0019] 本開示の別の態様は、本明細書に開示されるコドン最適化合成ヌクレオチド配列を含む組換えＤＮＡを提供することであり、ここで、ヌクレオチド配列は、異種調節要素に作動可能に連結されている。
[0020] 本開示の別の態様は、５’非翻訳配列、配列番号１のアミノ酸配列又はその殺虫性部分を含む殺虫性Ｃｒｙ２Ａｉタンパク質をコードするコード配列、及び３’非翻訳領域を含む、目的の殺虫性タンパク質を発現するためのＤＮＡ構築物を提供することであり、ここで、前記５’非翻訳配列は、植物細胞において機能的なプロモーターを含み、前記コード配列は、本明細書に開示されるようなコドン最適化合成ヌクレオチド配列であり、前記３’非翻訳配列は、転写終結配列及びポリアデニル化シグナルを含む。
[0021] 本開示の別の態様は、本明細書に開示される組換えＤＮＡ、又は本明細書に開示されるＤＮＡ構築物を含むプラスミドベクターを提供することである。
[0022] 本開示の別の態様は、本明細書に開示されるコドン最適化合成ヌクレオチド配列を含む宿主細胞を提供することである。
[0023] 本開示の別の態様は、
（ａ）本明細書に開示されるコドン最適化合成ヌクレオチド配列を植物細胞に挿入することであって、ヌクレオチド配列が、（ｉ）植物細胞で機能するプロモーター及び（ｉｉ）ターミネーターに作動可能に連結されていること、
（ｂ）ステップ（ａ）の植物細胞から形質転換植物細胞を得ることであって、前記形質転換植物細胞が、本明細書に開示される前記コドン最適化合成ヌクレオチド配列を含むこと、並びに
（ｃ）ステップ（ｂ）の前記形質転換植物細胞からトランスジェニック植物を産生することであって、前記トランスジェニック植物が、本明細書に開示される前記コドン最適化合成ヌクレオチド配列を含むこと
を含む、植物に耐虫性を付与するための方法を提供することである。
[0024] 本開示の別の態様は、本明細書に開示されるコドン最適化合成ヌクレオチド配列を含むトランスジェニック植物を提供することである。
[0025] 本開示の別の態様は、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するＣｒｙ２Ａｉタンパク質をコードする、本明細書に開示されるコドン最適化合成ヌクレオチド配列を含むバチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）を含む組成物を提供することである。
[0026] 本開示の別の態様は、作物植物における昆虫の侵入を制御し、耐虫性管理を提供する方法を提供することであり、ここで、前記方法は、前記作物植物を本明細書に開示される殺虫有効量の組成物と接触させることを含む。
[0027] 本開示のさらに別の態様は、耐虫性トランスジェニック植物の産生のための、本明細書に開示されるコドン最適化合成ヌクレオチド配列、ＤＮＡ構築物、又はプラスミドの使用である。
[0028] 本開示のさらに別の態様は、殺虫性組成物の産生のための、本明細書に開示されるコドン最適化合成ヌクレオチド配列の使用であり、ここで、組成物は、前記ヌクレオチド配列を含むバチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）細胞を含む。
添付図面の簡単な説明
[0029]ｐＧｒｅｅｎ０１７９－ＣａＭＶ３５Ｓ－２０１Ｍ１のＴ－ＤＮＡ構築物マップを示す。 [0030]トランスジェニックイネ植物の遺伝子形質転換及び再生を示す。 [0031]ｐＧｒｅｅｎ００２９－ＣａＭＶ３５Ｓ－２０１Ｍ１のＴ－ＤＮＡ構築物マップを示す。 [0032]トランスジェニックトマト植物の遺伝子形質転換及び再生を示す。 [0033]イッテンオオメイガ幼虫（S. incertulas）に対する２０１Ｍ１ヌクレオチド配列を保有するトランスジェニックイネ植物の切離茎片バイオアッセイを示す。 [0034]アワヨトウ幼虫（S. mauritia）に対する２０１Ｍ１ヌクレオチド配列を保有するトランスジェニックイネ植物の切離葉片バイオアッセイを示す。 [0035]オオタバコガ（H. armigera）幼虫に対する２０１Ｍ１ヌクレオチド配列を保有するトランスジェニックトマト植物の葉片バイオアッセイを示す。
配列の簡単な説明
[0036] 配列番号１は、Ｃｒｙ２Ａｉタンパク質配列（NCBI GenBank:ACV97158.1）である。
[0037] 配列番号２は、Ｃｒｙ２Ａｉタンパク質（配列番号１）をコードする単子葉植物バイアスコドン最適化合成ｃｒｙ２Ａｉ遺伝子（２０１Ｍ１）の全長ＤＮＡ配列である。
[0038] 配列番号３は、Ｃｒｙ２Ａｉタンパク質（配列番号１）をコードする単子葉植物バイアスコドン最適化合成ｃｒｙ２Ａｉ遺伝子（２０１Ｍ２）の全長ＤＮＡ配列である。
[0039] 配列番号４は、Ｃｒｙ２Ａｉタンパク質（配列番号１）をコードする単子葉植物バイアスコドン最適化合成ｃｒｙ２Ａｉ遺伝子（２０１Ｍ３）の全長ＤＮＡ配列である。
[0040] 配列番号５は、Ｃｒｙ２Ａｉタンパク質（配列番号１）をコードする単子葉植物バイアスコドン最適化合成ｃｒｙ２Ａｉ遺伝子（２０１Ｍ４）の全長ＤＮＡ配列である。
[0041] 配列番号６は、Ｃｒｙ２Ａｉタンパク質（配列番号１）をコードする単子葉植物バイアスコドン最適化合成ｃｒｙ２Ａｉ遺伝子（２０１Ｍ５）の全長ＤＮＡ配列である。
[0042] 配列番号７は、Ｃｒｙ２Ａｉタンパク質（配列番号１）をコードする単子葉植物バイアスコドン最適化合成ｃｒｙ２Ａｉ遺伝子（２０１Ｍ６）の全長ＤＮＡ配列である。
[0043] 配列番号８は、２０１Ｍ１ ＤＮＡ配列（配列番号２）を増幅するためのフォワードプライマー配列である。
[0044] 配列番号９は、２０１Ｍ１ ＤＮＡ配列（配列番号２）を増幅するためのリバースプライマー配列である。
[0045] 配列番号１０は、ｎｐｔＩＩ ＤＮＡ遺伝子の増幅のためのフォワードプライマー配列である。
[0046] 配列番号１１は、ｎｐｔＩＩ ＤＮＡ遺伝子の増幅のためのリバースプライマー配列である。
[0047] 配列番号１２は、ｈｐｔＩＩ遺伝子の増幅のためのフォワードプライマーである。
[0048] 配列番号１３は、ｈｐｔＩＩ遺伝子の増幅のためのリバースプライマーである。
詳細な説明
[0049] 本明細書で提供される詳細な説明は、当業者が本発明を実施するのを支援するためのものであり、本明細書で論じられる実施形態の改変及び変形は、本発明の精神又は範囲から逸脱することなく当業者によってなされ得るため、本発明の範囲を過度に制限すると解釈されるべきではない。本発明は、本発明の全てではないが一部の実施形態が示され、及び／又は説明される、添付の図面及び／又は配列リストを参照して、以下に、より完全に説明される。本発明は、多くの異なる形態で具体化されてもよく、本明細書に記載の実施形態に限定されると解釈されるべきではない。
[0050] 本明細書では特定の用語が使用されているが、それらは一般的且つ説明的な意味でのみ使用され、限定する目的ではない。以下の定義は、実施形態の理解を容易にするために提供される。
[0051] 本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される場合、文脈で明確に指示されていない限り、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、本明細書において、冠詞の文法上の目的語の１つ又は複数（すなわち、少なくとも１つ）を指すために使用されることに留意されたい。したがって、例えば、「プローブ（a probe）」への言及は、複数のそのようなプローブが組成物中に存在し得ることを意味する。同様に、「要素（an element）」への言及は、１つ以上の要素を意味する。
[0052] 明細書全体を通して、「含む」又は「含んでいる」という用語は、記載された要素、整数若しくはステップ、又は要素、整数若しくはステップの群を包含することを意味すると理解されるが、他のいかなる要素、整数若しくはステップ、又は要素、整数、又はステップの群を除外することを意味するものではない。
[0053] 単位、接頭辞、及び記号は、ＳＩで認められた形式で示され得る。特に明記しない限り、核酸は、５’から３’の方向で左から右に書かれ、アミノ酸配列は、アミノからカルボキシの方向で左から右に書かれる。数値範囲には、範囲を定義する数値が含まれる。アミノ酸は、本明細書において、それらの一般的に知られている３文字の記号、又はIUPAC-IUB生化学命名委員会（Biochemical Nomenclature Commission）によって推奨される１文字の記号のいずれかによって示され得る。同様に、ヌクレオチドは、一般的に認められている１文字のコードで示され得る。上記で定義された用語は、明細書全体を参照することにより、より完全に定義される。
[0054] 「核酸」という用語は、典型的には、大きなポリヌクレオチドを指す。「核酸」及び「ヌクレオチド配列」という用語は、本明細書では互換的に使用される。これは、一本鎖又は二本鎖形態のいずれかのデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドポリマーへの言及を含み、他に限定されない限り、それらが天然に存在するヌクレオチドと同様の方法で一本鎖核酸にハイブリダイズするという点で天然ヌクレオチドの本質的な性質を有する既知の類似体（例えば、ペプチド核酸）を包含する。ヌクレオチドは、核酸（ＤＮＡ及びＲＮＡ）を生成するために重合（長鎖に接続）されるサブユニットである。ヌクレオチドは、リボース糖、窒素塩基、及びリン酸基の３つの小成分で構成される。
[0055] 「ポリヌクレオチド」は、核酸の一本鎖又は平行及び逆平行鎖を意味する。したがって、ポリヌクレオチドは、一本鎖又は二本鎖のいずれかの核酸であり得る。
[0056] 「オリゴヌクレオチド」という用語は、典型的には、一般に約５０ヌクレオチド以下の短いポリヌクレオチドを指す。ヌクレオチド配列がＤＮＡ配列（すなわち、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ）によって表される場合、これはまた、「Ｕ」で「Ｔ」が置換されるＲＮＡ配列（すなわち、Ａ、Ｕ、Ｇ、Ｃ）を含むことが理解されよう。
[0057] 「コドン最適化合成ヌクレオチド配列」という用語は、非ゲノムヌクレオチド配列であり、本明細書において、天然又はゲノムヌクレオチド配列と比較してヌクレオチド配列に１つ以上の変化を有する合成ヌクレオチド配列又は核酸分子を指すために互換的に使用される。いくつかの実施形態において、天然又はゲノム核酸分子への変更は、特定の生物、例えば植物における発現のための核酸配列のコドン最適化による核酸配列の変化、遺伝コードの縮重、天然又はゲノム配列と比較して少なくとも１つのアミノ酸置換、挿入、欠失、及び／又は付加を導入するための核酸配列の変化、制限酵素部位を導入するための核酸配列の変化、ゲノム核酸配列に関連する１つ以上のイントロンの除去、１つ以上の異種イントロンの挿入、ゲノム核酸配列に関連する１つ以上の上流又は下流の調節領域の欠失、１つ以上の異種の上流又は下流の調節領域の挿入、ゲノム核酸配列に関連する５’及び／又は３’非翻訳領域の欠失、異種の５’及び／又は３’非翻訳領域の挿入、並びにポリアデニル化部位の修飾を含むが、これらに限定されない。
[0058] 本発明の文脈において、一般的に存在する核酸塩基について、以下の略語が使用される。「Ａ」はアデノシンを指し、「Ｃ」はシチジンを指し、「Ｇ」はグアノシンを指し、「Ｔ」はチミジンを指し、「Ｕ」はウリジンを指す。
[0059] いくつかの実施形態において、非ゲノム核酸分子は、ｃＤＮＡである。いくつかの実施形態において、非ゲノム核酸分子は、合成ヌクレオチド配列である。コドン最適化ヌクレオチド配列は、当技術分野で公知の方法、例えば、Murray et al.(1989) Nucleic Acids Res.17:477-498を使用して、目的の任意の生物について調製することができる。最適化されたヌクレオチド配列は、植物、例えば、イネ、トマト、及びワタ植物などの単子葉植物及び双子葉植物における殺虫性タンパク質の発現を増加させるのに利用される。
[0060] 本明細書に開示される新たに設計されたｃｒｙ２Ａｉ ＤＮＡ配列は、「コドン最適化合成ｃｒｙ２Ａｉヌクレオチド配列」と呼ばれる。
[0061] 「ＤＮＡ構築物」、「ヌクレオチド構築物」、及び「ＤＮＡ発現カセット」という用語は、本明細書において互換的に使用され、ＤＮＡを含むヌクレオチド構築物に実施形態を限定することを意図するものではない。当業者は、ヌクレオチド構築物、特にリボヌクレオチド及びリボヌクレオチドとデオキシリボヌクレオチドの組み合わせから構成されるポリヌクレオチド及びオリゴヌクレオチドもまた、本明細書に開示される方法で使用され得ることを認識するであろう。
[0062] 「組換え」核酸分子又はＤＮＡ又はポリヌクレオチドは、本明細書において、人の手によって改変又は産生され、組換え細菌又は植物宿主細胞内にある、核酸分子又はＤＮＡポリヌクレオチドを指すために使用される。例えば、組換えポリヌクレオチドは、例えば、化学合成によるか、又は遺伝子工学技術によるポリヌクレオチドの単離されたセグメントの操作による、ゲノムから単離されたポリヌクレオチド、ＲＮＡの逆転写によって産生されたｃＤＮＡ、合成核酸分子、又は配列の２つの別の分離されたセグメントの人工的な組み合わせであり得る。
[0063] 本明細書で使用される場合、「相同」という用語は、同じ核酸鎖の２つの領域間、又は２つの異なる核酸鎖の領域間のヌクレオチド配列類似性を指す。両方の領域のヌクレオチド残基の位置が同じヌクレオチド残基によって占められている場合、その領域はその位置で相同である。各領域の少なくとも１つのヌクレオチド残基位置が同じ残基によって占められている場合、第１の領域は第２の領域と相同である。２つの領域間の相同性は、同じヌクレオチド残基が占める２つの領域のヌクレオチド残基位置の比率で表される。例として、ヌクレオチド配列５’－ＡＴＴＧＣＣ－３’を有する領域及びヌクレオチド配列５’－ＴＡＴＧＧＣ－３’を有する領域は、５０％の相同性を共有する。好ましくは、第１の領域は第１の部分を含み、第２の領域は第２の部分を含み、それにより、各部分のヌクレオチド残基位置の少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約７５％、少なくとも約９０％、又は少なくとも約９５％は、同じヌクレオチド残基によって占められている。より好ましくは、各部分の全てのヌクレオチド残基位置は、同じヌクレオチド残基によって占められている。
[0064] 比較のための配列の最適なアラインメントは、当技術分野で公知のアルゴリズムのコンピューターによる実施（Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group (GCG), 575 Science Dr., Madison, WIのＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＢＬＡＳＴ、ＰＡＳＴＡ、及びＴＦＡＳＴＡ）よって、又は検査によって、行ってもよい。
[0065] 本明細書で使用される場合、「配列同一性のパーセンテージ」は、比較ウィンドウ上で２つの最適にアラインされた配列を比較することによって決定され、ここで、比較ウィンドウ内のポリヌクレオチド又はアミノ酸配列の断片は、２つの配列の最適なアラインメントのための参照配列（付加又は欠失を含まない）と比較して、付加又は欠失（例えば、ギャップ又はオーバーハング）を含んでもよい。パーセンテージは、両方の配列で同一の核酸塩基又はアミノ酸残基が出現する位置の数を決定して、一致する位置の数を算出し、一致した位置の数を比較ウィンドウ内の位置の総数で割り、その結果に１００を掛けて、配列同一性のパーセンテージを算出することによって計算される。
[0066] 比較のための配列の最適なアラインメントは、当技術分野で公知のアルゴリズムのコンピューターによる実施（Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group (GCG), 575 Science Dr., Madison, WIのＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＢＬＡＳＴ、ＰＡＳＴＡ、及びＴＦＡＳＴＡ）よって、又は検査によって、行ってもよい。
[0067] 本明細書で使用されるヌクレオチド配列間の「実質的な配列同一性」という用語は、参照配列と比較して少なくとも６５％の配列同一性、好ましくは少なくとも６９％～７７％の配列同一性を有する配列を含むポリヌクレオチドを指す。
[0068] 本明細書で使用される場合、「プロモーター／調節配列」という用語は、プロモーター／調節配列に作動可能に連結された遺伝子産物の発現に必要とされる核酸配列を意味する。一部の例において、この配列は、コアプロモーター配列であってもよく、他の例において、この配列はまた、遺伝子産物の発現に必要とされるエンハンサー配列及び他の調節要素を含んでもよい。プロモーター／調節配列は、例えば、組織特異的な様式で遺伝子産物を発現するものであり得る。
[0069] 「構成的」プロモーターは、細胞内において一定の様式で、それが作動可能に連結されている遺伝子の発現を駆動するプロモーターである。例として、細胞のハウスキーピング遺伝子の発現を駆動するプロモーターは、構成的プロモーターであると考えられる。
[0070] 「誘導性」プロモーターは、遺伝子産物をコード又は特定するポリヌクレオチドと作動可能に連結された場合、実質的に、プロモーターに対応する誘導因子が細胞内に存在する場合にのみ、生細胞において遺伝子産物を産生させるヌクレオチド配列である。
[0071] 「組織特異的」プロモーターは、遺伝子産物をコード又は特定するポリヌクレオチドと作動可能に連結された場合、実質的に、細胞がプロモーターに対応する組織タイプの細胞である場合にのみ、生細胞において遺伝子産物を産生させるヌクレオチド配列である。
[0072] 本明細書で使用される場合、「作動可能に連結された」とは、配向又は距離に関係なく、調節配列とコード配列の間の任意の連結を意味し、ここで、連結は、調節配列がコード配列の発現を制御することを可能にする。「作動可能に連結された」という用語はさらに、連結されている核酸配列が隣接しており、必要な場合、隣接し、同じリーディングフレーム内の２つのタンパク質コード領域を結合することを意味する。「作動可能に連結された」という用語はまた、プロモーターと第２の配列の間の機能的連結を指し、プロモーター配列は、第２の配列に対応するＤＮＡ配列の転写を開始及び媒介する。
[0073] 本明細書で使用される場合、「異種ＤＮＡコード配列」又は「異種核酸」又は「異種ポリヌクレオチド」は、Ｃｒｙ２Ａｉタンパク質又はＣｒｙ２Ａｉタンパク質の任意の相同体を天然にコードするもの以外の任意のコード配列を意味する。
[0074] 本明細書で使用される場合、「コード領域」は、タンパク質をコードする遺伝子、ＤＮＡ又はヌクレオチド配列の部分を指す。「非コード領域」という用語は、コード領域ではない遺伝子、ＤＮＡ又はヌクレオチド配列の部分を指す。
[0075] 本明細書で使用される場合、特定の核酸の文脈で使用される場合の「コードする」又は「コードされた」という用語は、核酸が、特定のタンパク質へのヌクレオチド配列の直接翻訳に必要な情報を含むことを意味する。タンパク質がコードされる情報は、コドンの使用によって特定される。タンパク質をコードする核酸は、核酸の翻訳された領域内に非翻訳配列（例えば、イントロン）を含み得るか、又はそのような介在する非翻訳配列を欠き得る（例えば、ｃＤＮＡのように）。
[0076] 「ポリペプチド」、「ペプチド」、及び「タンパク質」という用語は、本明細書において互換的に使用されて、天然に存在する構造変異体に関連するアミノ酸残基、及びペプチド結合を介して連結されたその合成の天然に存在しない類似体から構成されるポリマーを指す。合成ポリペプチドは、例えば、自動化されたポリペプチドシンセサイザーを使用して合成することができる。これらの用語は、１つ以上のアミノ酸残基が、対応する天然に存在するアミノ酸の人工的な化学的類似体である、アミノ酸ポリマー、及び天然に存在するアミノ酸ポリマーに適用される。「残基」又は「アミノ酸残基」又は「アミノ酸」という用語は、本明細書において互換的に使用されて、タンパク質、ポリペプチド、又はペプチド（総称して「タンパク質」）に組み込まれるアミノ酸を指す。アミノ酸は、天然に存在するアミノ酸であってもよく、他に限定されない限り、天然に存在するアミノ酸と同様の様式で機能することができる天然アミノ酸の公知の類似体を包含してもよい。
[0077] 「タンパク質」という用語は、典型的には、大きなポリペプチドを指す。「ペプチド」という用語は、典型的には、短いポリペプチドを指す。しかし、「ポリペプチド」という用語は、本明細書では、ペプチド結合を介して連結された２つ以上のアミノ酸残基から構成される任意のアミノ酸ポリマーを指すために使用される。
[0078] 本明細書で使用される場合、「発現カセット」は、遺伝子及びその発現に必要な調節領域を含む遺伝子モジュールを意味し、これは、ベクターに組み込まれてもよい。
[0079] 「ベクター」は、核酸分子を含み、単離された核酸を細胞の内部に送達するために使用することができる物質の組成物である。線状ポリヌクレオチド、イオン性又は両親媒性化合物に関連するポリヌクレオチド、プラスミド、及びウイルスを含むがこれらに限定されない多数のベクターが当技術分野で公知である。したがって、「ベクター」という用語は、自律的に複製するプラスミド又はウイルスを含む。この用語はまた、例えば、ポリリジン化合物、リポソームなどの、細胞への核酸の移動を容易にする非プラスミド及び非ウイルス化合物を含むと解釈されるべきである。ウイルスベクターの例には、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクターなどが含まれるが、これらに限定されない。
[0080] 「発現ベクター」という用語は、発現されるヌクレオチド配列に作動可能に連結された発現制御配列を含む組換え核酸を含むベクターを指す。発現ベクターは、発現に十分なシス作用要素を含み、発現のための他の要素は、宿主細胞によって、又はインビトロ発現システムにおいて供給され得る。発現ベクターには、コスミド、プラスミド（例えば、ネイキッド、又はリポソームに含有されるもの）、及び組換え核酸を組み込んだウイルスなどの、当技術分野で公知のもの全てが含まれる。
[0081] 本明細書で使用される場合、「宿主細胞」という用語は、ベクターを含み、発現ベクターの複製及び／又は発現をサポートする細胞を指すことが意図される。宿主細胞は、大腸菌（E. coli）などの原核細胞、又は酵母、昆虫、両生類、若しくは哺乳動物細胞などの真核細胞、又は単子葉又は双子葉の植物細胞であってもよい。単子葉宿主細胞の例はイネ宿主細胞であり、双子葉宿主細胞の例はナス又はトマト宿主細胞である。可能であれば、配列は、予想されるヘアピン二次ｍＲＮＡ構造が避けられるように改変される。
[0082] 本明細書で使用される「毒素」という用語は、殺虫（pesticidal）活性又は殺虫（insecticidal）活性を示すポリペプチドを指す。「Ｂｔ」又は「バチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）」毒素は、そのような毒素を含む、Ｂｔの様々な株に見られるより広範なクラスのＣｒｙ毒素を含むことを意図している。
[0083] 「プローブ」又は「サンプルプローブ」という用語は、その補体又は特定のマイクロアレイ要素によって認識される分子を指す。本発明によって調査することができるプローブの例には、ＤＮＡ、ＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、オリゴ糖、多糖類、糖、タンパク質、ペプチド、モノクローナル抗体、毒素、ウイルスエピトープ、ホルモン、ホルモン受容体、酵素、酵素基質、補因子、並びに細胞表面受容体のアゴニスト及びアンタゴニストを含む薬物が含まれるが、これらに限定されない。
[0084] 本明細書で使用される場合、「相補的」又は「補体」という用語は、二本鎖核酸の水素結合を介して結合する塩基、プリン、及びピリミジンの対を指す。次の塩基対：グアニンとシトシン、アデニンとチミジン、及びアデニンとウラシルは相補的である。本明細書で使用される用語は、完全及び部分的な相補性を含む。
[0085] 本明細書で使用される場合、「ハイブリダイゼーション」という用語は、核酸の鎖が塩基対形成を介して相補的な鎖と結合するプロセスを指す。２つの同一ではないが非常に類似した相補的核酸のハイブリダイゼーションに使用される条件は、２つの鎖の相補性の程度及び鎖の長さによって異なる。したがって、この用語は、部分的及び完全なハイブリダイゼーションを企図している。このような技術及び条件は、この分野の実務家には周知である。
[0086] 「殺虫（insecticidal）活性」及び「殺虫（pesticidal）活性」という用語は、本明細書において互換的に使用されて、害虫の死亡率、害虫の体重減少、害虫の忌避性、及び適切な期間の給餌及び曝露後の害虫のその他の行動的及び物理的変化によって測定できるが、これらに限定されない、生物又は物質（例えば、タンパク質など）の活性を指す。したがって、殺虫活性を有する生物又は物質は、害虫の適応度の少なくとも１つの測定可能なパラメータに悪影響を与える。例えば、「殺虫性タンパク質」は、それ自体で、又は他のタンパク質と組み合わせて、殺虫活性を示すタンパク質である。
[0087] 本明細書で使用される場合、「害虫に影響を与える」という用語は、昆虫の死滅、成長の遅延、繁殖能力の防止、摂食阻害活性などを含むがこれらに限定されない、発達の任意の段階での昆虫の摂食、成長、及び／又は行動の変化を制御することを指す。
[0088] 本明細書で使用される場合、「殺虫有効量」という用語は、害虫の環境に存在する場合に殺虫活性を有する物質又は生物の量を意味する。各物質又は生物に関し、特定の環境で影響を受ける各害虫について殺虫有効量が経験的に決定される。同様に、「殺虫（insecticidally）有効量」は、害虫（pest）が害虫（insect pest）である場合の「殺虫（pesticidally）有効量」を指すために使用され得る。
[0089] 本明細書で使用される場合、「形質転換植物」及び「トランスジェニック植物」という用語は、そのゲノム内に１つ以上の異種ポリヌクレオチドを含む植物を指す。異種ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドが次の世代に受け継がれるように、トランスジェニック植物又は形質転換植物のゲノム内に安定して組み込まれる。異種ポリヌクレオチドは、単独で、又は組換えＤＮＡ分子の一部として、ゲノムに組み込まれてもよい。
[0090] 本明細書で使用される場合、「トランスジェニック」という用語は、任意の植物細胞、植物細胞系列、カルス、組織、植物部分、又は１つ以上の異種核酸の存在によって遺伝子型が変化した植物を含むことを理解されたい。この用語は、当技術分野で公知の遺伝的形質転換法を使用して最初に得られたトランスジェニック、並びに最初のトランスジェニックからの生殖交雑又は無性繁殖によって作られたものを含む。
[0091] 本明細書で使用される「初期トランスジェニック」という用語は、従来の植物育種法による、又はランダム交雑受精、非組換えウイルス感染、非組換え細菌形質転換、非組換え転位、又は自然突然変異などの自然発生事象による、ゲノム（染色体又は染色体外）の変化を包含しない。
[0092] 本明細書で使用される場合、「植物」という用語は、植物全体、植物細胞、植物原形質体、植物を再生することができる植物細胞組織培養物、植物カルス、植物塊、並びに胚、花粉、胚珠、種子、葉、花、枝、果実、穀粒、穂、穂軸、殻、茎、根、根端、葯などの植物又は植物の一部において無傷である植物細胞及びその子孫を含む。トランスジェニック植物の一部は、実施形態の範囲内であり、例えば、植物細胞、原形質体、組織、カルス、胚、並びに実施形態のＤＮＡ分子で形質転換されたトランスジェニック植物又は以前にそれらの子孫に由来し、したがって、少なくとも部分的にトランスジェニック細胞からなる、花、茎、果実、葉、及び根を含む。
バチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）ｃｒｙ遺伝子及びコドン最適化
[0093] 現在、δ－エンドトキシンをコードするおよそ４００のｃｒｙ遺伝子が配列決定されている（Crickmore, N.2005.Using worms to better understand how Bacillus thuringiensis kills insects.Trends in Microbiology, 13(8):347-350）。様々なδ－エンドトキシンは、アミノ酸配列の類似性に基づいてクラス（Ｃｒｙ１、２、３、４など）に分類されている。これらのクラスは、いくつかのサブクラス（Ｃｒｙ１Ａ、Ｃｒｙ１Ｂ、Ｃｒｙ１Ｃなど）で構成されており、これらはサブファミリー又は変異体（Ｃｒｙ１Ａａ、Ｃｒｙ１Ａｂ、Ｃｒｙ１Ａｃなど）に細分化されている。各クラスの遺伝子は互いに４５％を超えて同一である。個々のｃｒｙ遺伝子それぞれの産物は、一般に、少数の種の幼虫期に限定された、限られた範囲の活性を有する。しかし、Ｃｒｙタンパク質の同一性の程度とそれらの活性スペクトルとの間に相関関係を確立することはできなかった。Ｃｒｙ１Ａａ及びＣｒｙ１Ａｃタンパク質は８４％同一であるが、Ｃｒｙ１Ａａのみが、カイコ（Bombyx mori （L.））に対して毒性を有する。反対に、Ｃｒｙ３Ａａ及びＣｒｙ７Ａａは、３３％のみ同一であるが、どちらもコロラドハムシ（Leptinotarsa decemlineata）に対して活性である。他のＣｒｙ毒素は昆虫に対してまったく活性を有しないが、他の無脊椎動物に対しては活性を有する。例えば、Ｃｒｙ５及びＣｒｙ６タンパク質クラスは、線虫に対して活性を有する。より最近では、ハムシ科（Chrysomelidae）の様々な甲虫類の害虫に対して活性を有する、Ｃｒｙ３４Ａｂ１／Ｃｒｙ３５Ａｂ１と呼ばれるＢｔからの二成分毒素も特徴づけられている。それらはＣｒｙ毒素ファミリーの他のメンバーとほとんど相同性を有しないが、Ｃｒｙの名称が割り当てられている。
[0094] トランスジェニック植物で異種タンパク質の望ましい発現レベルを達成するために、野生型又は元のゲノムＤＮＡコード配列と呼ばれることもある天然のものを様々な方法で変更し、その結果、コドン使用は宿主植物種のコドン使用により厳密に一致し、同様に、コード配列のＧ＋Ｃ含有量は宿主植物種のＧ＋Ｃ含有量により厳密に一致することが有益であることが見出されている。
[0095] 植物分子生物学の分野の当業者は、複数のＤＮＡ配列が単一のアミノ酸配列をコードするように設計され得ることを理解するであろう。目的のタンパク質のコード領域の発現を増加させる一般的な手段は、そのコドン組成が、遺伝子が発現されることを標的とする宿主の全体的なコドン組成に類似するようにコード領域を改変することである。
[0096] ゲノム核酸／天然の核酸は、宿主生物における発現の増加のために最適化され得る。したがって、宿主生物が植物である場合、合成核酸は、発現を改善するために植物優先コドンを使用して合成することができる。例えば、実施形態の核酸配列は、単子葉植物及び双子葉植物種の両方で発現され得るが、これらの選好は異なることが示されているので、配列は、単子葉植物又は双子葉植物の特定のコドン選好及びＧＣ含有量選好を構成するように改変され得る（Murray et al.(1989) Nucleic Acids Res.17:477-498）。したがって、特定のアミノ酸のイネ優先コドンは、イネからの公知の遺伝子配列に由来し得、特定のアミノ酸のナス優先コドンは、ナスからの公知の遺伝子配列に由来し得る。
[0097] 追加の配列改変は、細胞宿主における遺伝子発現を増強することが知られている。これには、偽ポリアデニル化シグナル、エクソン－イントロンスプライス部位シグナル、トランスポゾン様リピート、及び遺伝子発現に有害であり得る他の十分に特徴付けられた配列をコードする配列の除去が含まれる。配列のＧＣ含有量は、宿主細胞で発現される公知の遺伝子を参照して計算されるように、所与の細胞宿主の平均レベルに調整され得る。
[0098] Vaeck et al.,（Vaeck M, Reynaerts A, Hoefte H, Jansens S, De Beukeleer M, Dean C, Zabeau M, Van Montagu M, Leemans J (1987) Transgenic plants protected from insect attack. Nature 327:33-37）では、米国及びヨーロッパでトウモロコシを攻撃する主要な害虫の１つであるヨーロッパアワノメイガに対する保護のためにＢｔ ｃｒｙ１Ａｂ遺伝子を発現する耐虫性トランスジェニックタバコ植物の生産が報告された。しかし、強力なプロモーターの使用にもかかわらず、植物の毒素産生は、当初、効果的な農業利用には弱すぎた（Koziel G M, Beland G L, Bowman C, Carozzi N B, Crenshaw R, Crossland L, Dawson J, Desai N, Hill M, Kadwell S, Launis K, Maddox D, McPherson K, Heghji M, Merlin E, Rhodes R, Warren G, Wright M, Evola S (1993) Field performance of elite transgenic maize plants expressing an insecticidal protein derived from Bacillus thuringiensis.Biotechnology 11:194-200）。植物遺伝子とは異なり、Ｂｔ遺伝子はＡ＋Ｔ含有量が高く（６６％）、これは植物にとって最適以下のコドン使用であり、転写のミススプライシング又は早期終止につながる可能性がある（De la Riva and Adang, 1996）。
[0099] Perlak et al.,（Perlak F J, Fuchs R L, Dean D A, McPherson S L, Fishhoff D A (1991) Modification of the coding sequences enhances plant expression of insect control protein genes, Proc.Natl.Acad.Sci.(USA) 88:3324-3328.）は、コードされたペプチド配列を改変せずにｃｒｙ遺伝子のコード配列を改変して、天然遺伝子と比較して植物で２倍の毒素産生を可能にする植物の最適なコドン使用を確実にした。この戦略は、改変されたｃｒｙ１遺伝子で形質転換されたワタ、イネ、トウモロコシ、改変されたｃｒｙ３Ａ遺伝子で形質転換されたジャガイモなどの多くの植物でうまく使用されている。Ｂｔトウモロコシ及びＢｔワタは、世界中で大規模に栽培されている。
[00100] したがって、生物間で天然に存在するコドンバイアスは、異種生物における遺伝子の最適以下の発現につながる。本発明において、バチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）からの天然のｃｒｙ２Ａｉ遺伝子は、双子葉植物及び単子葉植物を含む植物における組換えタンパク質の最適な発現のためにインシリコで再構成された。多変量解析による設計において、希少及び非常に希少なコドンは、双子葉／単子葉植物の非常に好ましいコドンで置換された。遺伝子設計ツールによって設計された再構成された合成遺伝子は、切断されたタンパク質の発現を回避するために、まれなコドン使用、ｍＲＮＡの二次構造の安定性、遺伝子の二次転写の開始について手作業でチェックされた。最適化されたｍＲＮＡの構造及び安定性は、ｍＲＮＡオプティマイザーによってチェック及び確認された。
[00101] 本発明の特定の態様は、Ｃｒｙ２Ａｉ殺虫性タンパク質をコードするコドン最適化合成核酸、殺虫性組成物、ポリヌクレオチド構築物、組換えヌクレオチド配列、組換えベクター、本発明の核酸分子を含む形質転換された微生物及び植物を提供する。これらの組成物は、害虫、特に作物植物害虫を制御するための方法に使用される。
[00102] 本明細書に開示されるコドン最適化合成ヌクレオチド配列は、組換えＤＮＡ分子を調製するための構成的、誘導性、時間的調節、発達的調節、組織優先及び組織特異的プロモーターを含む、様々なプロモーターと融合させることができる。本明細書に開示されるコドン最適化合成ｃｒｙ２Ａｉヌクレオチド配列（コード配列）は、天然のｃｒｙ２Ａｉ遺伝子と比較した場合、形質転換された植物において実質的により高いレベルの発現を提供する。したがって、オオタバコガ（Helicoverpa armigera）－ワタキバガの幼虫及びオオタバコガの幼虫、コブノメイガ（Cnaphalocrocis medinalis）－コブノメイガ（rice leaffolder）、及びイッテンオオメイガ（Scirpophaga incertulas）－イッテンオオメイガ（rice yellow stem borer）及びワタアカミムシ（Pectinophora gossypiella）などの鱗翅目害虫に耐性のある植物が産生される。
[00103] 本発明の一実施形態は、植物優先コドンを有する合成コドン最適化ｃｒｙ２Ａｉヌクレオチド配列を提供する。本発明の別の実施形態は、イネ、トマト及びナスなどの植物における合成コドン最適化ｃｒｙ２Ａｉヌクレオチド配列の発現を提供する。本発明の別の実施形態は、ＤＮＡ発現カセット、本発明の合成ｃｒｙ２Ａｉヌクレオチド配列を含む植物形質転換ベクターを提供する。本発明の別の実施形態は、本明細書に開示される合成コドン最適化ｃｒｙ２Ａｉヌクレオチド配列、又は本明細書に開示される合成コドン最適化ｃｒｙ２Ａｉヌクレオチド配列によってコードされる殺虫性ポリペプチドを含む、組成物を提供する。本明細書に開示される組成物は、本発明の殺虫性（pesticidal）及び／又は殺虫性（insecticidal）タンパク質／ポリペプチドを含む殺虫性（pesticidal）及び／又は殺虫性（insecticidal）組成物であり得る。別の実施形態は、Ｃｒｙ２Ａｉ毒素タンパク質を発現する本発明のコドン最適化合成ｃｒｙ２Ａｉヌクレオチド配列を含むトランスジェニック植物を提供する。
[00104] 特に、本発明は、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、及び配列番号７に記載のコドン最適化合成ヌクレオチド配列を提供し、ここで、前記ヌクレオチドは、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有する殺虫性Ｃｒｙ２Ａｉタンパク質をコードする。
[00105] いくつかの実施形態において、本発明はさらに、本明細書に開示されるコドン最適化ｃｒｙ２Ａｉヌクレオチド配列で形質転換された植物及び微生物、並びに害虫に影響を与えるそのようなヌクレオチド配列、殺虫性組成物、形質転換生物、及びそれらの産物の使用を含む方法を提供する。
[00106] 実施形態のポリヌクレオチド配列を使用して、任意の生物、例えば、植物及びバチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）などの微生物を形質転換して、コードされた殺虫性（insecticidal）及び／又は殺虫性（pesticidal）タンパク質を産生してもよい。植物害虫に影響を与えるか又は制御するためにそのような形質転換された生物の使用を含む方法が提供される。実施形態の核酸及びヌクレオチド配列はまた、葉緑体などの細胞小器官を形質転換するために使用され得る。当業者が本発明に開示されるポリヌクレオチド配列を使用して形質転換を実施することを可能にする、所望の生物の形質転換の方法は、当技術分野で周知である。
[00107] 実施形態の核酸は、特定の生物の細胞による発現のために最適化された核酸又はヌクレオチド配列、例えば、殺虫活性を有するポリペプチドのアミノ酸配列に基づく植物優先コドンを使用して逆翻訳（back-translate）された（すなわち、逆翻訳（reverse translate）された）核酸配列を包含する。
[00108] 本開示は、殺虫性Ｃｒｙ２ａｉタンパク質をコードするコドン最適化合成核酸／ヌクレオチド配列を提供する。合成コード配列は、イネ、トマト、ナス、トウモロコシ、ワタ、マメ科植物などの双子葉植物（dicot）及び単子葉植物（monocot）でのタンパク質の発現における使用に特に適合する。
[00109] 本開示は、植物において良好に発現するように特に適合されたＣｒｙ２Ａｉタンパク質をコードする合成ヌクレオチド配列を提供する。開示されたコドン最適化合成ヌクレオチド配列は、植物種に天然に存在する遺伝子において、平均してそれらが利用されるのとほぼ同じ頻度で植物最適化コドンを利用する。本開示は、植物に耐虫性を付与するためのコドン最適化合成ヌクレオチド配列をさらに含む。植物の形質転換のために、選択可能なマーカー遺伝子が本開示において使用される。本明細書に開示される合成配列を含むＤＮＡ構築物及びトランスジェニック植物は、農業的に重要な植物を使用するための方法及び組成物と同様に教示される。
[00110] コドン最適化合成ヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質はそれぞれ、鱗翅目種阻害性の生物学的活性を示す。双子葉植物及び／又は単子葉植物は、本明細書に開示される各ヌクレオチド配列単独で、又はタンパク質、結晶タンパク質、毒素、及び／又は１つ以上の標的害虫内の遺伝子を抑制するように設計された害虫特異的二本鎖ＲＮＡなどの、殺虫剤をコードする他のヌクレオチド配列と組み合わせて、形質転換されて、バチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）株に由来する公知の鱗翅目殺虫性タンパク質を単に使用することにより、これまで実現できなかった分野での耐虫性管理の手段を達成する。
[00111] 本発明のコドン最適化合成ヌクレオチド配列はまた、鱗翅目害虫、甲虫目害虫、吸汁性及び穿孔性害虫などからなる群から選択される一般的な植物害虫のそれぞれの１つ以上を制御するための少なくとも１つの手段を含むように形質転換された植物を達成するための殺虫性毒素をコードする他のタイプのヌクレオチド配列と組み合わせて、植物において使用され得る。
調節配列
[00112] 転写及び翻訳調節シグナルには、プロモーター、転写開始部位、オペレーター、アクチベーター、エンハンサー、他の調節要素、リボソーム結合部位、開始コドン、終結シグナルなどが含まれるが、これらに限定されない。
[00113] ポリヌクレオチド／ＤＮＡ構築物は、転写の５’から３’方向に、転写及び翻訳開始領域（すなわち、プロモーター）、実施形態のＤＮＡ配列、及び宿主として機能する生物において機能的な転写及び翻訳終結領域（すなわち、終結領域）を含む。転写開始領域（すなわち、プロモーター）は、宿主生物及び／又は実施形態の配列に対して、天然、類似、外来、又は異種であり得る。さらに、プロモーターは、天然の配列又は代替的に合成の配列であり得る。本明細書で使用される場合、「外来」という用語は、プロモーターが、プロモーターが導入される天然の生物に見出されないことを示す。プロモーターが実施形態の配列に対して「外来」又は「異種」である場合、プロモーターは、実施形態の作動可能に連結された配列について天然又は天然に存在するプロモーターではないことが意図される。
[00114] 実施形態の実施において、いくつかのプロモーターを使用することができる。プロモーターは、所望の結果に基づいて選択することができる。本発明のコドン最適化ヌクレオチド配列は、宿主生物における発現のために、構成的、組織優先的、誘導性、又は他のプロモーターと組み合わせることができる。植物宿主細胞における使用に適した構成的プロモーターには、例えば、コアＣａＭＶ ３５Ｓプロモーター、イネアクチン、ユビキチン、ＡＬＳプロモーターなどが含まれる。
[00115] 所望の結果に応じて、誘導性プロモーターから遺伝子を発現させることが有益な場合がある。植物における実施形態のヌクレオチド配列の発現を調節するために特に興味深いのは、創傷誘導性プロモーターである。このような創傷誘導性プロモーターは、昆虫の摂食によって引き起こされる損傷に応答する可能性があり、ジャガイモプロテイナーゼ阻害剤（ｐｉｎ ＩＩ）遺伝子、ｗｕｎ１及びｗｕｎ２、ｗｉｎ１及びｗｉｎ２、ＷＩＰ１、ＭＰＩ遺伝子などを含む。
[00116] さらに、病原体誘導性プロモーターを、実施形態の方法及びヌクレオチド構築物に使用してもよい。このような病原体誘導性プロモーターには、病原体による感染後に誘導される病原性関連タンパク質（ＰＲタンパク質）、例えば、ＰＲタンパク質、ＳＡＲタンパク質、β－１，３－グルカナーゼ、キチナーゼなど、からのプロモーターが含まれる。
[00117] 化学的に調節されるプロモーターは、外因性の化学調節剤の適用を通じて植物における遺伝子の発現を調節するために使用することができる。目的に応じて、プロモーターは、化学物質の適用が遺伝子発現を誘導する化学誘導性プロモーター、又は化学物質の適用が遺伝子発現を抑制する化学抑制性プロモーターであり得る。化学誘導性プロモーターは当技術分野で公知であり、ベンゼンスルホンアミド除草剤毒性緩和剤によって活性化されるトウモロコシＩｎ２－２プロモーター、発芽前除草剤として使用される疎水性求電子化合物によって活性化されるトウモロコシＧＳＴプロモーター、及びサリチル酸によって活性化されるタバコＰＲ－１ａプロモーターを含むが、これらに限定されない。目的の他の化学的に調節されたプロモーターには、ステロイド応答性プロモーターが含まれる。
[00118] 特定の組織において「優先（preferred）」発現を有するプロモーターは、その組織において、少なくとも１つの他の植物組織よりも高度に発現される。一部の組織優先プロモーターは、特定の組織において、ほぼ独占的に発現を示す。組織優先プロモーターを利用して、特定の植物組織内の増強された殺虫性タンパク質発現を標的にすることができる。そのようなプロモーターは、必要に応じて、弱い発現用に改変することができる。
[00119] いくつかの組織特異的プロモーターの例には、葉優先プロモーター、根特異的又は根優先プロモーター、種子特異的又は種子優先プロモーター、花粉特異的プロモーター、及び髄特異的プロモーターが含まれるが、これらに限定されない。
[00120] 根優先又は根特異的プロモーターは公知であり、文献から入手可能なものから選択するか、又は様々な適合性のある種から新たに単離することができる。
[00121] 「種子優先」プロモーターには、「種子特異的」プロモーター（種子貯蔵タンパク質のプロモーターなどの種子発育中に活性なプロモーター）及び「種子発芽」プロモーター（種子発芽中に活性なプロモーター）の両方が含まれる。ガンマゼイン及びＧｌｏｂ－１は、胚乳特異的プロモーターである。双子葉植物の場合、種子特異的プロモーターには、β－ファセオリン、β－コングリシニン、ダイズレクチン、クルシフェリンなどが含まれるが、これらに限定されない。単子葉植物の場合、種子特異的プロモーターには、トウモロコシ１５ｋＤａゼイン、２２ｋＤａゼイン、２７ｋＤａゼイン、ｇ－ゼイン、ｗａｘｙ、ｓｈｒｕｎｋｅｎ１、ｓｈｒｕｎｋｅｎ２、グロブリン１などが含まれるが、これらに限定されない。
[00122] 低レベルの発現が望まれる場合、弱いプロモーターが使用される。一般に、本明細書で使用される「弱いプロモーター」という用語は、低レベルでコード配列の発現を駆動するプロモーターを指す。そのような弱い構成的プロモーターには、例えば、Ｒｓｙｎ７プロモーターのコアプロモーター、コア３５Ｓ ＣａＭＶプロモーターなどが含まれる。
[00123] オクトピンシンターゼ（ＯＣＳ）及びノパリンシンターゼ（ＮＯＳ）終結領域などの終結領域は、Ａ．ツメファシエンス（A. tumefaciens）のＴｉプラスミドから入手可能である。
[00124] ＤＮＡ発現カセットは、さらに５’リーダー配列を含み得る。このようなリーダー配列は、翻訳を増強するように機能することができる。翻訳リーダーは当技術分野で公知であり、ピコルナウイルスリーダー、例えば、ＥＭＣＶリーダー（脳心筋炎５’非コード領域）、ポティウイルスリーダー、例えば、ＴＥＶリーダー（タバコエッチ病ウイルス）、ＭＤＭＶリーダー（トウモロコシ萎縮モザイクウイルス）、アルファルファモザイクウイルス（ＡＭＶ ＲＮＡ ４）のコートタンパク質ｍＲＮＡからの非翻訳リーダー、タバコモザイクウイルスリーダー（ＴＭＶ）、及びトウモロコシクロロティックモトルウイルスリーダー（ＭＣＭＶ）が含まれる。
[00125] 本明細書に開示及び請求される本発明の１つの特定の実施形態において、組織優先又は組織特異的プロモーターは、殺虫性タンパク質をコードする本開示の合成ＤＮＡ配列、及び少なくとも１つのそのような組換え分子で安定に形質転換されたトランスジェニック植物に作動可能に連結される。得られた植物は、ＤＮＡが発現している植物の部分を食べる特定の昆虫に対して耐性がある。
選択可能なマーカー遺伝子
[00126] 一般に、発現カセットは、形質転換された細胞を選択するための選択可能なマーカー遺伝子を含む。選択可能なマーカー遺伝子は、形質転換された細胞又は組織の選択に利用される。マーカー遺伝子には、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩ（ｎｐｔＩＩ）及びハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｈｐｔＩＩ）などの抗生物質耐性をコードする遺伝子、並びにグルホシネートアンモニウム、ブロモキシニル、イミダゾリノン、及び２，４－ジクロロフェノキシアセテート（２，４－Ｄ）などの除草剤化合物に対する耐性を付与する遺伝子が含まれる。適切な選択可能なマーカー遺伝子のさらなる例には、クロラムフェニコール、メトトレキサート、ストレプトマイシン、スペクチノマイシン、ブレオマイシン、スルホンアミド、ブロモキシニル、グリホサート、ホスフィノトリシンに対する耐性をコードする遺伝子が含まれるが、これらに限定されない。
[00127] 上記の選択可能なマーカー遺伝子のリストは、限定することを意図するものではない。任意の選択可能なマーカー遺伝子を実施形態において使用することができる。
ＤＮＡ構築物及びベクター
[00128] 本発明のコドン最適化ＤＮＡ／ヌクレオチド配列は、目的の生物における発現のためのＤＮＡ構築物において提供される。構築物は、本発明の配列に作動可能に連結された５’及び３’調節配列を含む。
[00129] そのようなポリヌクレオチド構築物は、調節領域の転写調節下にあるように、Ｃｒｙ２Ａｉ毒素タンパク質配列をコードするＤＮＡ配列を挿入するための複数の制限部位を備えている。ポリヌクレオチド構築物は、選択可能なマーカー遺伝子をさらに含有し得る。構築物は、所望の生物に共形質転換される少なくとも１つの追加の遺伝子をさらに含んでもよい。或いは、追加の遺伝子を複数のポリヌクレオチド構築物上に提供することができる。
[00130] ＤＮＡ構築物／発現カセットを調製する際に、様々なＤＮＡ断片を操作して、ＤＮＡ配列を適切な方向に、そして適切な場合には適切なリーディングフレームに提供し得る。この目的のために、アダプター又はリンカーを使用してＤＮＡ断片を結合するか、又は他の操作を使用して、便宜的な制限部位、余分なＤＮＡの除去、制限部位の除去などを提供し得る。この目的のために、インビトロ変異誘発、プライマー修復、制限、アニーリング、再置換、例えば、移行及び転換が関与し得る。
[00131] 本発明によると、本明細書に開示されるＤＮＡ構築物／発現カセットは、組換え発現ベクターに挿入され得る。「組換え発現ベクター」という表現は、細菌プラスミド、ファージ、酵母プラスミド、植物細胞ウイルス、哺乳動物細胞ウイルス、又は他のベクターを意味する。一般に、宿主内で複製及び安定化できる限り、任意のプラスミド又はベクターを使用することができる。発現ベクターの重要な特徴は、複製起点、プロモーター、マーカー遺伝子、及び翻訳制御要素を有することである。
[00132] 大腸菌（E. coli）の複製システムと形質転換細胞の選択を可能にするマーカーとを含む多数のクローニングベクターが、高等植物への外来遺伝子の挿入のための調製に利用できる。ベクターは、例えば、とりわけｐＢＲ３２２、ｐＵＣシリーズ、Ｍ１３ｍｐシリーズ、ｐＡＣＹＣ１８４を含む。したがって、Ｂｔ毒素タンパク質をコードする配列を有するＤＮＡ断片は、適切な制限部位でベクターに挿入することができる。得られたプラスミドは、大腸菌（E.coli）への形質転換に使用される。大腸菌（E. coli）細胞は、適切な栄養培地で培養され、採取され、溶解される。プラスミドが回収される。配列分析、制限分析、電気泳動、及び他の生化学的分子生物学的方法は、一般的に分析方法として実行される。各操作の後、使用されるＤＮＡ配列は切断され、次のＤＮＡ配列に結合される。各プラスミド配列は、同じ又は他のプラスミドにクローン化することができる。所望の遺伝子を植物に挿入する方法によっては、他のＤＮＡ配列が必要になる場合がある。例えば、Ｔｉ又はＲｉプラスミドを植物細胞の形質転換に使用する場合、挿入する遺伝子の隣接領域として、少なくともＴｉ又はＲｉプラスミドＴ－ＤＮＡの右の境界、多くの場合は右及び左の境界を結合する必要がある。
[00133] 本開示のコドン最適化ヌクレオチド配列と、転写／翻訳を調節するための適切なシグナルとを含む発現ベクターは、当業者に周知の方法によって構築することができる。そのような方法の例には、インビトロ組換えＤＮＡ技術、ＤＮＡ合成技術、及びインビボ組換え技術が含まれる。ＤＮＡ配列は、ｍＲＮＡの合成を誘導するために、発現ベクター内の適切なプロモーターに効果的に連結することができる。さらに、発現ベクターは、翻訳開始のための部位として、リボソーム結合部位及び転写ターミネーターを含んでもよい。
[00134] 本発明の組換えベクターの好ましい例は、ベクターがアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）などの適切な宿主に存在する場合に、それ自体の一部、すなわちいわゆるＴ領域を植物細胞に移すことができるＴｉプラスミドベクターである。他のタイプのＴｉプラスミドベクターは、現在、植物細胞又はハイブリッドＤＮＡを植物のゲノムに適切に挿入することによって新しい植物を産生することができる原形質体にハイブリッド遺伝子を導入するために使用されている。
[00135] 発現ベクターは、少なくとも１つの選択可能なマーカー遺伝子を含み得る。選択可能なマーカー遺伝子は、一般的な化学的方法で選択できることに基づく特性を有するヌクレオチド配列である。形質転換細胞を非形質転換細胞から分化させるために使用できる全ての遺伝子は、選択的マーカーとなり得る。例には、グリホサート及びホスフィントリシンなどの除草剤に耐性のある遺伝子、及びカナマイシン、ハイグロマイシン、Ｇ４１８、ブレオマイシン、及びクロラムフェニコールなどの抗生物質に耐性のある遺伝子が含まれるが、これらに限定されない。
[00136] 本発明の組換えベクターについて、プロモーターは、ＣａＭＶ ３５Ｓ、アクチン、又はユビキチンプロモーターのいずれかであり得るが、これらに限定されない。形質転換体は、様々な段階で様々なメカニズムにより選択することができるため、構成的プロモーターが本発明にとって好ましい可能性がある。したがって、構成的プロモーターを選択する可能性は、本明細書において限定されない。
[00137] 本発明の組換えベクターについては、任意の従来のターミネーターを使用することができる。その例には、ノパリンシンターゼ（ＮＯＳ）、イネα－アミラーゼＲＡｍｙ１ Ａターミネーター、ファセオリンターミネーター、及びアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）のオプトピン遺伝子のターミネーターなどが含まれるが、これらに限定されない。ターミネーターの必要性に関して、そのような領域が植物細胞における転写の信頼性及び効率を増加させることができることが一般に知られている。したがって、ターミネーターの使用は、本発明の文脈の観点から非常に好ましい。
[00138] 当業者は、本明細書に開示されるＤＮＡ構築物及びベクターが、耐虫性トランスジェニック植物の産生及び／又は殺虫性組成物の産生に使用でき、ここで、組成物は、前記ヌクレオチド配列を含むバチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）細胞、又は本明細書に開示されるヌクレオチド配列を発現してＣｒｙ２Ａｉ殺虫性タンパク質を産生することができる任意の他の微生物を含み得ることを知っているであろう。
組換え細胞
[00139] 実施形態は、本発明の少なくとも１つのコドン最適化核酸、核酸を含む発現カセット、又は発現カセットを含むベクターで、形質転換される微生物をさらに包含する。いくつかの実施形態において、微生物は、植物上で増殖するものである。本発明の一実施形態は、本発明のＣｒｙ２Ａｉタンパク質を発現することができる形質転換微生物を含むカプセル化された殺虫性タンパク質に関する。
[00140] さらなる実施形態は、植物及び昆虫細胞、細菌、酵母、バキュロウイルス、原生動物、線虫、及び藻類からなる群から選択される生物などの形質転換された生物に関する。形質転換された生物は、本発明のコドン最適化合成ＤＮＡ分子、前記ＤＮＡ分子を含む発現カセット、又は前記発現カセットを含むベクターを含み、これらは形質転換された生物のゲノムに安定して組み込まれ得る。
[00141] Ｃｒｙ２Ａｉタンパク質をコードする遺伝子は、昆虫の病原性生物を形質転換するために使用できることが認識されている。このような生物には、バキュロウイルス、真菌、原生動物、細菌、線虫が含まれる。
[00142] 実施形態のＣｒｙ２Ａｉタンパク質をコードするコドン最適化合成ヌクレオチド配列は、適切なベクターを介して微生物宿主に導入され得、前記宿主は、環境、又は植物若しくは動物に適用され得る。核酸を細胞に挿入するという文脈における「導入された」という用語は、「トランスフェクション」又は「形質転換」又は「形質導入」を意味し、真核細胞又は原核細胞への核酸の取り込みへの言及を含み、ここで、核酸は、細胞のゲノム（例えば、染色体、プラスミド、色素体、又はミトコンドリアＤＮＡ）に組み込まれるか、自律レプリコンに変換されるか、又は一時的に発現され得る（例えば、トランスフェクトされたｍＲＮＡ）。
[00143] ＤＮＡの安定した維持及び発現を可能にする条件下で、殺虫性タンパク質を発現する外来ＤＮＡを微生物宿主に導入するための多くの方法が利用可能である。例えば、ヌクレオチド構築物の発現のための転写及び翻訳調節シグナルと作動可能に連結された目的のヌクレオチド構築物、並びに宿主生物の配列と相同なヌクレオチド配列（これにより組み込みが生じる）、及び／又は宿主で機能する複製システム（これにより組み込み又は安定した維持が生じる）を含む発現カセットを構築することができる。
植物の形質転換方法及びトランスジェニック植物の産生
[00144] Ｂｔ Ｃｒｙ２Ａｉ毒素タンパク質をコードする本発明のコドン最適化合成ヌクレオチド配列（ＤＮＡ配列）は、当技術分野で周知の様々な技術を使用して植物細胞に挿入することができる。挿入されたＤＮＡが植物ゲノムに組み込まれると、それは比較的安定である。形質転換ベクターは通常、カナマイシン、ビアラホス、Ｇ４１８、ブレオマイシン、又はハイグロマイシンなどの殺生物剤又は抗生物質に対する形質転換植物細胞の耐性を付与する選択可能なマーカーを含む。したがって、個別に使用されるマーカーは、挿入されたＤＮＡを含まない細胞ではなく、形質転換された細胞の選択を可能にするべきである。
[00145] ＤＮＡを植物宿主細胞に挿入するための多くの技術が利用可能である。これらの技術には、形質転換剤としてアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）又はアグロバクテリウム・リゾゲネス（Agrobacterium rhizogenes）を使用するＴ－ＤＮＡによる形質転換、融合、注入、遺伝子銃（微粒子衝撃）、又はエレクトロポレーション、及び他の可能な方法が含まれる。アグロバクテリウム（Agrobacteria）を形質転換に使用する場合、挿入されるＤＮＡは、特別なプラスミド、すなわち中間ベクター又はバイナリーベクターのいずれかにクローン化する必要がある。中間ベクターは、Ｔ－ＤＮＡの配列と相同である配列のために、相同組換えによってＴｉ又はＲｉプラスミドに組み込むことができる。Ｔｉ又はＲｉプラスミドは、Ｔ－ＤＮＡの転移に必要なｖｉｒ領域も含む。
[00146] 中間ベクターは、アグロバクテリウム（Agrobacteria）で複製することはできない。中間ベクターは、ヘルパープラスミド（接合）によってアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）に転移することができる。バイナリーベクターは、大腸菌（E. coli）及びアグロバクテリウム（Agrobacteria）の両方で複製できる。それらは、選択マーカー遺伝子と、左右のＴ－ＤＮＡ境界領域に挟まれたリンカー又はポリリンカーとを含む。それらは、直接アグロバクテリウム（Agrobacteria）へと形質転換することができる。病原性（ｖｉｒ）領域を保有するプラスミドを含むため、アグロバクテリウム（Agrobacterium）が宿主細胞として使用される。ｖｉｒ領域は、Ｔ－ＤＮＡを植物細胞に転移するために必要である。追加のＴ－ＤＮＡが含まれていてもよい。そのように形質転換された細菌は、植物細胞の形質転換に使用される。植物外植片は、ＤＮＡを植物細胞に転移するために、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）又はアグロバクテリウム・リゾゲネス（Agrobacterium rhizogenes）とともに有利に培養することができる。次に、感染した植物材料（例えば、葉片、茎の断片、根だけでなく、原形質体又は懸濁培養細胞）から、選択用の抗生物質又は殺生物剤を含んでもよい適切な培地で植物全体を再生することができる。そのようにして得られた植物は、次に、挿入されたＤＮＡの存在について試験することができる。注入及びエレクトロポレーションの場合、プラスミドについて特別な要求はない。例えば、ｐＵＣ誘導体などの通常のプラスミドを使用することが可能である。
[00147] 形質転換された細胞は、従来の方法に従って植物へと成長させてもよい。次に、これらの植物を成長させ、同じ形質転換株又は異なる株のいずれかで受粉させ、所望の表現型の特徴の構成的又は誘導性発現を有する得られたハイブリッドを同定し得る。所望の表現型の特徴の発現が安定して維持され、受継されることを確実にするために２世代以上を成長させ、次いで、所望の表現型の特徴の発現が達成されることを確実にするために種子を採取し得る。それらは生殖細胞を形成し、形質転換された形質を子孫植物に伝達することができる。そのような植物は、通常の様式で成長し、同じ形質転換された遺伝的要因又は他の遺伝的要因を有する植物と交配することができる。結果として生じるハイブリッド個体は、対応する表現型の特性を有する。
[00148] 本発明の植物形質転換方法は、本発明のポリヌクレオチドを植物に導入することを含み、ポリヌクレオチドを植物に導入するための特定の方法に依存しない。ポリヌクレオチドを植物に導入するための方法は、安定した形質転換法、一過性の形質転換法、及びウイルス媒介法を含むがこれらに限定されず、当技術分野で公知である。
[00149] 本発明の一実施形態において、植物は、本明細書に開示されるコドン最適化合成ヌクレオチド配列で形質転換された。形質転換植物のいくつかの非限定的な例は、Ｃｒｙ２Ａｉタンパク質をコードする本発明のコドン最適化合成ヌクレオチド配列を含む繁殖性のトランスジェニックイネ及びトマト植物である。イネ及びトマトの形質転換の方法は当技術分野で公知である。本明細書に開示されるコドン最適化合成ヌクレオチド配列を使用して、他の様々な植物も形質転換することができる。
[00150] 「安定した形質転換」は、植物に導入されたヌクレオチド構築物が植物のゲノムに組み込まれ、その子孫によって受継できることを意味することを意図している。「一過性の形質転換」は、ポリヌクレオチドが植物に導入され、植物のゲノムに組み込まれないこと、又はポリペプチドが植物に導入されることを意味することを意図している。
[00151] 形質転換プロトコル並びにヌクレオチド配列を植物に導入するためのプロトコルは、植物又は植物細胞のタイプ、すなわち、形質転換の標的となる単子葉植物又は双子葉植物に応じて異なり得る。植物細胞にヌクレオチド配列を導入し、続いて植物ゲノムに挿入する適切な方法には、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、アグロバクテリウム（Agrobacterium）を介した形質転換、及び弾道粒子加速（ballistic particle acceleration）が含まれる。
[00152] 本発明の一実施形態において、Ｃｒｙ２Ａｉ毒素をコードする本発明のコドン最適化合成ヌクレオチド配列は、高等生物、例えば、本開示のコドン最適化ヌクレオチド配列を使用する植物において発現される。この場合、有効量の毒素を発現するトランスジェニック植物は、害虫から自身を守る。昆虫がそのようなトランスジェニック植物を摂食し始めると、昆虫は発現された毒素も摂取する。これは、昆虫が植物組織にさらに噛み入るのを阻止するか、又は昆虫に害をなすか若しくは殺傷することもある。本発明のヌクレオチド配列は、発現カセットに挿入され、その後、植物のゲノムに安定して組み込まれる。
[00153] 実施形態はまた、実施形態の少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む形質転換又はトランスジェニック植物を包含する。いくつかの実施形態において、植物は、植物細胞における発現を駆動するプロモーターに作動可能に連結された実施形態の少なくとも１つのヌクレオチド配列を含むヌクレオチド構築物で安定に形質転換される。
[00154] 実施形態は、植物の害虫に対する植物の耐性を増加させるための特定の生物学的メカニズムに依存しないが、植物における実施形態のヌクレオチド配列の発現は、実施形態の殺虫性タンパク質の産生をもたらし、植物の害虫に対する植物の耐性の増加をもたらすことができる。実施形態の植物は、害虫に影響を与えるための農業方法に使用される。特定の実施形態は、例えば、イネ及びトマト植物などの形質転換された作物植物を提供し、これは、例えば、コブノメイガ（Cnaphalocrocis medinalis）－コブノメイガ（rice leaffolder）、及びイッテンオオメイガ（Scirpophaga incertulas）－イッテンオオメイガ（rice yellow stem borer）を含む様々な鱗翅目昆虫などの、植物の害虫に影響を与えるための方法において使用される。
[00155] 「対象植物又は植物細胞」とは、目的の遺伝子に関して形質転換などの遺伝子改変が影響を受けたものであるか、又はそのように改変された植物又は細胞の子孫であり、改変を含む植物又は植物細胞である。「対照」又は「対照植物」又は「対照植物細胞」は、対象植物又は植物細胞の表現型の変化を測定するための基準点を提供する。対照植物又は植物細胞は、例えば、（ａ）野生型の植物又は細胞、すなわち、対象の植物又は細胞をもたらした遺伝的変化の出発物質と同じ遺伝子型のもの、（ｂ）出発物質と同じ遺伝子型であるが、ヌル構築物（すなわち、マーカー遺伝子を含む構築物など、目的の形質に公知の影響を及ぼさない構築物）で形質転換された植物又は植物細胞、（ｃ）対象の植物又は植物細胞の子孫の間で形質転換されていない分離個体である植物又は植物細胞、（ｄ）対象の植物又は植物細胞と遺伝的に同一であるが、目的の遺伝子の発現を誘導するであろう条件又は刺激に曝露されていない植物又は植物細胞、又は（ｅ）目的の遺伝子が発現されていない条件下での対象の植物又は植物細胞自体を含み得る。
[00156] ｃｒｙ２Ａｉヌクレオチドで決定された形質のワタ、イネ、ナス（eggplant, brinjal）、トマト、マメ科植物系列などの近交系植物への移入（又は遺伝子移入）は、循環選抜育種、例えば戻し交配によって達成できる。この場合、所望の反復親は、最初に、ｃｒｙ２Ａｉで決定された形質について本明細書に開示されたヌクレオチド配列を保有するドナー近交系（非反復親）と交配される。次に、この交配の子孫は、反復親と戻し交配され、続いて、結果として生じる子孫において、非反復親から遺伝子導入される所望の形質について選択される。所望の形質を選択した反復親との３世代、好ましくは４世代、より好ましくは５世代以上の戻し交配の後、子孫は、導入される形質を制御する遺伝子座に対してヘテロ接合性であるが、他の大半又はほとんど全ての遺伝子は反復親のようである。
[00157] 実施形態はさらに、種子、塊茎、球茎、球根、葉、並びに根及び苗条の切断物を含むがこれらに限定されない、実施形態の形質転換植物の植物繁殖材料に関する。
[00158] 実施形態の方法で使用することができる植物のクラスは、一般に、単子葉植物及び双子葉植物を含むがこれらに限定されない、形質転換技術に適した高等植物のクラスと同じくらい広い。目的の植物の例には、穀物、穀草、野菜、油、果物、観賞用植物、芝草などが含まれるが、これらに限定されない。例えば、イネ（Oryza sativa、Oryza spp.）、トウモロコシ（Zea mays）、ライ麦（Secale cereale）、ソルガム（Sorghum bicolor、Sorghum vulgare）、キビ（millet）（例えば、トウジンビエ（Pennisetum glaucum）、キビ（Panicum miliaceum）、アワ（Setaria italica）、シコクビエ（Eleusine coracana））、小麦（Triticum aestivum、Triticum sp.）、オーツ麦（Avena sativa）、オオムギ（Hordeum vulgare L）、サトウキビ（Saccharum spp.）、ワタ（Gossypium hirsutum、Gossypium barbadense、Gossypium sp.）、トマト（Lycopersicon esculentum）、ナス（brinjal/eggplant）（Solanum melongena）、ジャガイモ（Solanum tuberosum）、テンサイ（Beta vulgaris）、サツマイモ（Ipomoea batatus）、キャッサバ（Manihot esculenta）、レタス（Lactuca sativa）、キャベツ（Brassica oleracea var. capitata）、カリフラワー（Brassica oleracea var. botrytis）、ブロッコリー（Brassica oleracea var. indica）、アブラナ属（例えば、B. napus、B. rapa、B. juncea）、特に種子油の供給源として有用なアブラナ属（Brassica）の種、大豆（Glycine max）、ヒマワリ（Helianthus annuus）、ベニバナ（Carthamus tinctorius）、ピーナッツ（Arachis hypogaea）、キマメ（Cajanus cajan）、ヒヨコマメ（Cicer arietinum）、インゲンマメ（Phaseolus vulgaris）、アオイマメ（Phaseolus limensis）、エンドウマメ（Pisum sativum）、エンドウマメ（Lathyrus spp.）、キュウリ（Cucumis sativus）、カンタループ（Cucumis cantalupensis）、マスクメロン（Cucumis melo）、アルファルファ（Medicago sativa）、タバコ（Nicotiana tabacum）、シロイヌナズナ（Arabidopsisthaliana）である。
[00159] 目的の植物には、目的の種子を提供する穀物植物、油科種子植物、及びマメ科植物が含まれる。目的の種子には、トウモロコシ、小麦、大麦、イネ、ソルガム、ライ麦、キビなどの穀物種子が含まれる。油料種子植物には、ワタ、大豆、ベニバナ、ヒマワリ、アブラナ属（Brassica）、トウモロコシ、アルファルファ、ヤシ、ココナッツ、亜麻、ヒマシ、オリーブなどが含まれる。マメ科植物には、マメ及びエンドウマメが含まれる。マメには、ガウア、イナゴマメ、フェヌグリーク、大豆、エンドウマメ、カウピー、リョクトウ、アオイマメ、ソラマメ、レンズマメ、ヒヨコマメなどが含まれる。
[00160] 特定の実施形態において、本発明の少なくとも１つのコドン最適化合成ヌクレオチド配列は、所望の表現型を有する植物を作製するために、目的のポリヌクレオチド配列の任意の組み合わせとスタッキングすることができる。例えば、コドン最適化合成ヌクレオチド配列は、他のＢｔ毒性タンパク質などの、殺虫（pesticidal）及び／又は殺虫（insecticidal）活性を有するポリペプチドをコードする他の任意のポリヌクレオチドとスタッキングすることができる。生成された組み合わせはまた、目的のポリヌクレオチドのいずれか１つの複数のコピーを含み得る。実施形態のヌクレオチド配列はまた、他の任意の遺伝子又は遺伝子の組み合わせとスタッキングして、高油遺伝子、バランスの取れたアミノ酸、非生物的ストレス抵抗などの動物飼料に望ましい形質を含むがこれらに限定されない、様々な所望の形質の組み合わせを有する植物を産生することができる。
[00161] 本発明のヌクレオチド配列はまた、耐病性又は除草剤耐性、非病原性及び耐病性遺伝子、アセト乳酸シンターゼ（ＡＬＳ）、ホスフィノトリシン又はバスタなどのグルタミンシンターゼの阻害剤（例えば、ｂａｒ遺伝子）、グリホサート耐性に望ましい形質、高油、加工油、加工デンプンなどの製品をプロセシング又は処理するために望ましい形質（例えば、ＡＤＰＧピロホスホリラーゼ（ＡＧＰａｓｅ）、デンプンシンターゼ（ＳＳ）、デンプン分枝酵素（ＳＢＥ）及びデンプン脱分枝酵素（ＳＤＢＥ））とスタッキングすることができる。実施形態のポリヌクレオチドを、雄性不稔、茎の強さ、開花時間などの農業形質、又は細胞周期調節又は遺伝子ターゲティングなどの形質転換技術形質を提供するポリヌクレオチドと組み合わせることもできる。
[00162] これらのスタッキングされた組み合わせは、従来の任意の遺伝的形質転換又は当技術分野で知られている他の任意の方法による交雑育種植物を含むがこれらに限定されない任意の方法によって生成することができる。植物を遺伝的に形質転換することによって形質がスタッキングされている場合、目的のポリヌクレオチド配列は、任意の時間に任意の順序で組み合わせることができる。例えば、１つ以上の所望の形質を含むトランスジェニック植物を、その後の形質転換によってさらなる形質を導入するための標的として使用することができる。形質は、形質転換カセットの任意の組み合わせによって提供される目的のポリヌクレオチドを用いて、共形質転換プロトコルで同時に導入することができる。例えば、２つの配列が導入される場合、２つの配列は、別々の形質転換カセットに含まれる（トランス）か、又は同じ形質転換カセットに含まれる（シス）可能性がある。配列の発現は、同じプロモーター又は異なるプロモーターによって駆動することができる。特定の場合において、目的のポリヌクレオチドの発現を抑制する形質転換カセットを導入することが望ましい場合がある。これは、他の抑制カセット又は過剰発現カセットの任意の組み合わせと組み合わせて、植物における形質の所望の組み合わせを生成してもよい。さらに、ポリヌクレオチド配列は、部位特異的組換えシステムを使用して、所望のゲノム位置にスタッキングできることが認識されている。
トランスジェニック植物の分析
[00163] ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）
[00164] 本発明は、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するＣｒｙ２Ａｉタンパク質をコードする、本発明に開示される配列番号２に記載のコドン最適化ヌクレオチド配列の断片のＰＣＲ増幅のための方法を提供し、これは、配列番号８～９に記載のプライマーの存在下でＰＣＲによりＤＮＡを増幅することを含む。同様に、本発明に開示される配列番号３～８に記載のコドン最適化ヌクレオチド配列の断片は、前記ヌクレオチド配列に特異的なプライマーを使用して増幅することができる。当業者は、前記ヌクレオチドの増幅のためのプライマーセットを設計することができる。テンプレートＤＮＡからのＤＮＡ断片のＰＣＲ増幅のためのプロトコル及び条件は、本明細書の他の箇所に記載されているか、そうでなければ当技術分野で公知である。
[00165] オリゴヌクレオチドプライマーは、本発明のコドン最適化ＤＮＡ配列から対応するＤＮＡ配列を増幅するためのＰＣＲ反応で使用するために設計することができる。ＰＣＲプライマー及びＰＣＲクローニングを設計するための方法は、当技術分野で一般に知られており、Sambrook et al.（1989）Molecular Cloning:A Laboratory Manual（2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, N.Y.）、以下「Sambrook」に開示されている。ＰＣＲの公知の方法には、対プライマー、ネステッドプライマー、単一の特異的プライマー、縮重プライマー、遺伝子特異的プライマー、ベクター特異的プライマー、部分的にミスマッチのプライマーなどを使用する方法が含まれるが、これらに限定されない。
[00166] 一実施形態において、本発明は、殺虫性ポリペプチドをコードする本発明のコドン最適化合成ヌクレオチド配列の断片のＰＣＲ増幅に適したプライマーセット、及びＤＮＡのＰＣＲ増幅においてプライマーセットを使用する方法を提供する。プライマーセットは、本発明のヌクレオチド配列にアニーリングするように設計されたフォワード及びリバースプライマーを含む。
[00167] 本発明の配列番号２に記載のヌクレオチド配列の増幅のためのプライマーセットは、配列番号８及び配列番号９に記載のフォワード及びリバースプライマーを含む。
[00168] サザンハイブリダイゼーション
[00169] ハイブリダイゼーション技術では、公知のヌクレオチド配列の全部又は一部が、クローン化されたゲノムＤＮＡ断片の集団に存在するか、又は選択された生物からのものである、他の対応するヌクレオチド配列に選択的にハイブリダイズするプローブとして使用される。ハイブリダイゼーションプローブは、本発明のコドン最適化ＤＮＡ配列のＰＣＲ増幅されたＤＮＡ断片、又は本明細書に開示される合成ヌクレオチドの対応する配列にハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列又は他のオリゴヌクレオチドを含む線状化プラスミドであってもよく、３２Ｐ又は任意の他の検出可能なマーカーなどの検出可能なグループで標識されてもよい。したがって、例えば、ハイブリダイゼーションのためのプローブは、実施形態の配列に基づいて合成オリゴヌクレオチドを標識することによって作製することができる。ハイブリダイゼーション用のプローブを調製するための方法は、当技術分野で一般に知られており、Sambrookに開示されている。
[00170] 例えば、本明細書に開示される配列全体、又はその１つ以上の部分は、対応する配列に特異的にハイブリダイズすることができるプローブとして使用され得る。様々な条件下で特定のハイブリダイゼーションを達成するために、そのようなプローブは、実施形態の配列に固有であり、一般に少なくとも約１０又は２０ヌクレオチド長である配列を含む。そのようなプローブを使用して、ＰＣＲによってヌクレオチド配列の対応するｃｒｙ２Ａｉヌクレオチド配列を増幅してもよい。
[00171] そのような配列のハイブリダイゼーションは、ストリンジェントな条件下で実施され得る。本明細書で使用される場合、「ストリンジェントな条件」又は「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」という用語は、プローブが他の配列よりも検出可能に大きい程度（例えば、バックグラウンドの少なくとも２倍、５倍、又は１０倍）にその標的配列にハイブリダイズする条件を指す。ストリンジェントな条件は配列依存的であり、環境によって異なる。ハイブリダイゼーション及び／又は洗浄条件のストリンジェンシーを制御することにより、プローブに１００％相補的な標的配列を同定することができる（相同プロービング）。或いは、ストリンジェンシー条件を調整して、一部の配列のミスマッチを許容し、より低い程度の類似性が検出されるようにすることもできる（異種プロービング）。
[00172] 典型的には、ストリンジェントな条件は、塩濃度が約１．５Ｍ Ｎａイオン未満であり、典型的には、ｐＨ７．０～８．３で約０．０１～１．０Ｍ Ｎａイオン濃度（又は他の塩）であり、温度は、短いプローブ（例えば、１０～５０ヌクレオチド）の場合は少なくとも約３０℃であり、長いプローブ（例えば、５０ヌクレオチド超）の場合は少なくとも約６０℃である。ホルムアミドなどの不安定化剤を添加することで、ストリンジェントな条件を達成してもよい。例示的な低ストリンジェンシー条件には、３７℃での３０％～３５％のホルムアミド、１ＭのＮａＣｌ、１％のＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）の緩衝液とのハイブリダイゼーション、及び５０℃～５５℃で１ｘ～２ｘＳＳＣ（２０ｘＳＳＣ＝３．０Ｍ ＮａＣｌ／０．３Ｍクエン酸三ナトリウム）での洗浄が含まれる。例示的な中程度のストリンジェンシー条件には、４０％～４５％のホルムアミド、１．０ＭのＮａＣｌ、３７℃、１％のＳＤＳでのハイブリダイゼーション、及び５５～６０℃で０．５ｘ～１ｘＳＳＣでの洗浄が含まれる。例示的な高ストリンジェンシー条件には、５０％ホルムアミド、１ＭのＮａＣｌ、３７℃での１％のＳＤＳでのハイブリダイゼーション、及び６０℃～６５℃で少なくとも約２０分間の０．１ｘＳＳＣでの最終洗浄が含まれる。任意選択により、洗浄緩衝液は、約０．１％～約１％のＳＤＳを含み得る。ハイブリダイゼーションの持続時間は、一般に約２４時間未満であり、通常は約４～約１２時間である。
[00173] 特異性は、典型的には、ハイブリダイゼーション後の洗浄の機能であり、重要な要素は最終洗浄液のイオン強度及び温度である。ＤＮＡ－ＤＮＡハイブリッドの場合、Ｔｍ（熱融点）はMeinkoth and Wahl (1984) Anal.Biochem.138:267-284の式：Ｔｍ＝８１．５℃＋１６．６（ｌｏｇＭ）＋０．４１（％ＧＣ）－０．６１（％ｆｏｒｍ）－５００／Ｌから概算でき、式中、Ｍは一価カチオンのモル濃度、％ＧＣはＤＮＡ中のグアノシン及びシトシンヌクレオチドのパーセンテージ、「％ｆｏｒｍ」はハイブリダイゼーション溶液中のホルムアミドのパーセンテージ、Ｌは塩基対におけるハイブリッドの長さである。Ｔｍは、相補的な標的配列の５０％が完全に一致するプローブにハイブリダイズする温度（規定のイオン強度及びｐＨの下で）である。洗浄は、典型的には、少なくとも平衡に達し、ハイブリダイゼーションのバックグラウンドレベルが低くなるまで、例えば２時間、１時間、又は３０分間実行される。Ｔｍは、ミスマッチが１％発生するごとに約１℃低下する。したがって、Ｔｍハイブリダイゼーション、及び／又は洗浄条件は、所望の同一性の配列にハイブリダイズするように調整することができる。例えば、９０％の同一性を有する配列が求められる場合、Ｔｍを１０℃下げることができる。一般に、ストリンジェントな条件は、特定の配列のＴｍ並びに規定のイオン強度及びｐＨでのその補体よりも約５℃低くなるように選択される。しかし、高度にストリンジェントな条件では、Ｔｍより１、２、３、又は４℃低いハイブリダイゼーション及び／又は洗浄を利用でき、中程度にストリンジェントな条件では、Ｔｍより６℃、７℃、８℃、９℃、又は１０℃低いハイブリダイゼーション及び／又は洗浄を利用でき、低度にストリンジェントな条件では、Ｔｍより１１℃、１２℃、１３℃、１４℃、１５℃、又は２０℃低いハイブリダイゼーション及び／又は洗浄を利用できる。
[00174] 等式、ハイブリダイゼーション及び洗浄組成物、並びに所望のＴｍを使用して、当業者は、ハイブリダイゼーション及び／又は洗浄液のストリンジェンシーのバリエーションが本質的に記載されていることを理解するであろう。所望のミスマッチ度によりＴｍが４５℃（水溶液）又は３２℃（ホルムアミド溶液）未満になる場合、ＳＳＣ濃度を上げて、より高い温度を使用できるようにすることができる。核酸のハイブリダイゼーションに関する広範なガイドは、Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology--Hybridization with Nucleic Acid Probes,Part I, Chapter 2 (Elsevier, New York)、及びAusubel et al., eds.(1995) Current Protocols in Molecular Biology, Chapter 2 (Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York)に見出される。Sambrook et al.も参照。
[00175] 本発明は、配列番号２に記載のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列、又は配列番号２の２５１～４０２位及び／又は１４５６～１６２８に記載のヌクレオチド配列、若しくはそれに相補的な配列の、少なくとも１０ヌクレオチドに特異的にハイブリダイズするヌクレオチド配列を包含する。当業者は、核酸ハイブリダイゼーションのために本明細書に開示されるヌクレオチド配列に基づくプローブの調製がわかるだろう。
バイオアッセイ
[00176] 多種多様なバイオアッセイ技術が当業者に公知である。一般的な手順には、閉鎖容器内の食料源への実験化合物又は生物の添加が含まれる。殺虫活性は、死亡率、体重減少、誘引、忌避性の変化、及び適切な時間の摂食及び曝露後の他の行動的及び物理的変化によって測定することができるが、これらに限定されない。本明細書に記載のバイオアッセイは、幼虫期又は成虫期の任意の摂食害虫に使用することができる。
殺虫剤の組成
[00177] 生物農薬は、環境及び生物相への害が少ないか、又はまったくない従来の化学農薬よりも有望な代替品の１つである。バチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）（一般にＢｔとして知られている）は、その定常期又はその成長の老化の間にデルタエンドトキシン（δ－エンドトキシン）と呼ばれる結晶性タンパク質を産生する殺虫性グラム陽性胞子形成細菌である。Ｂｔは、１９０２年に石渡繁胤によって病気のカイコ（Bombyx mori）から最初に発見された。しかし、これは、１９１５年に、疾患を有するスジコナマダラメイガの幼虫（Ephestia kuhniella）から、Ernst Berlinerによって公式に特徴づけられた。昆虫を制御するためのその適用の最初の記録は、１９２０年の終わりにハンガリーで、１９３０年代の初めにユーゴスラビアであり、それはヨーロッパアワノメイガを制御するために適用された。先端のバイオラショナル農薬であるＢｔは、当初は昆虫病原体として特徴づけられ、その殺虫活性は主に又は完全に副芽胞結晶に起因するものであった。これは１５０種を超える害虫に対して活性を有する。Ｂｔ培養の毒性は、結晶性タンパク質を産生する能力にあり、この観察結果は、鱗翅目（Lepidoptera）、双翅目（Diptera）、甲虫目（Coleoptera）の間で特定の昆虫種を制御するためのＢｔに基づく生物殺虫剤の開発につながった。
[00178] 実施形態の組成物は、様々な方法で植物、種子、及び植物製品を保護するのに使用される。例えば、組成物は、噴霧、ダスティング、散布、又は種子コーティングからなる群から選択される手順によって、有効量の殺虫性組成物を害虫の環境に置くことを含む方法で使用することができる。
[00179] 植物繁殖材料（果実、塊茎、球根、球茎、穀物、種子）、特に種子が商品として販売される前に、通常、除草剤、殺虫剤、殺真菌剤、殺菌剤、殺線虫剤、軟体動物駆除剤、又はこれらの調製物のいくつかの混合物、必要に応じて、細菌、真菌、又は動物の害虫によって引き起こされる損傷に対する保護を提供するために製剤の分野で通常使用されるさらなる担体、界面活性剤、又は適用促進補助剤との混合物を含む保護コーティングで処理される。種子を処理するために、塊茎又は穀物に液体製剤を含浸させることによって、又は湿式又は乾燥製剤の組み合わせでコーティングすることによって、保護剤コーティングを種子に適用することができる。さらに、特別な場合には、植物への他の適用方法、例えば、芽又は果実に向けられた処理が可能である。
[00180] 実施形態の殺虫性タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む実施形態の植物種子は、例えば、キャプタン、カルボキシン、チラム、メタラキシル、ピリミホスメチル、及び種子処理で一般的に使用される他のものなどの種子処理化合物を含む種子保護コーティングで処理されてもよい。一実施形態において、実施形態の殺虫性組成物を含む種子保護コーティングは、単独で、又は種子処理で通常使用される種子保護コーティングの１つと組み合わせて使用される。実施形態の組成物は、直接適用に適した形態であり得るか、又は適用前に適切な量の水又は他の希釈剤で希釈することを必要とする一次組成物の濃縮物としてであり得る。殺虫剤の濃度は、特定の製剤の性質、具体的には、それが濃縮物であるか直接使用されるかによって異なる。組成物は、１～９８％の固体又は液体の不活性担体、及び０～５０％又は０．１～５０％の界面活性剤を含有する。これらの組成物は、市販製品に表示される割合、例えば、乾燥形態の場合、エーカーあたり約０．０１ポンド～５．０ポンド、液体の場合、エーカーあたり約０．０１ポイント～１０ポイントで投与される。
[00181] 本明細書に開示されるコドン最適化合成ヌクレオチド配列はまた、Ｃｒｙ２Ａｉタンパク質を産生することができる形質転換されたバチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）の産生に使用され得る。次に、形質転換されたバチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）は、害虫管理などの農業活動に有用な殺虫性（insecticidal）及び／又は殺虫性（pesticidal）組成物の産生に使用され得る。
[00182] 実施形態において、形質転換された微生物（全生物、細胞、胞子（本明細書に開示されるコドン最適化合成ヌクレオチド配列で形質転換されたバチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）など）、殺虫性タンパク質、殺虫性成分、害虫に影響を与える成分、変異体、生細胞又は死細胞及び細胞成分（生細胞及び死細胞と細胞成分の混合物を含み、破損細胞及び細胞成分を含む））又は単離された殺虫性タンパク質は、許容される担体とともに、殺虫性組成物、すなわち、例えば懸濁液、溶液、乳濁液、散粉剤、分散性顆粒又はペレット、水和剤、及び乳化性濃縮物、エアロゾル又はスプレー、含浸顆粒、補助剤、コーティング可能なペースト、コロイド、及びカプセル（例えば、高分子物質による）に製剤化することができる。そのような製剤化された組成物は、ポリペプチドを含む細胞の培養物の乾燥、凍結乾燥、均質化、抽出、濾過、遠心分離、沈降、又は濃縮などの従来の手段によって調製することができる。
[00183] 上記で開示された組成物は、界面活性剤、不活性担体、防腐剤、保湿剤、摂食刺激剤、誘引剤、封入剤、結合剤、乳化剤、染料、ＵＶ保護剤、緩衝液、流動剤又は肥料、微量栄養素供与体、又は植物の成長に影響を与える他の調製物の添加によって得てもよい。除草剤、殺虫剤、殺真菌剤、殺菌剤、殺線虫剤、軟体動物駆除剤、ダニ駆除剤、植物成長調節剤、収穫補助剤、及び肥料を含むがこれらに限定されない１つ以上の農薬は、特定の標的害虫に対する製品の取り扱い及び適用を容易にするために、製剤の分野で通常使用される担体、界面活性剤若しくは補助剤、又は他の成分と組み合わせることができる。適切な担体及び補助剤は、固体又は液体であり得、製剤技術で通常使用される物質、例えば、天然又は再生ミネラル物質、溶媒、分散剤、湿潤剤、粘着付与剤、結合剤、又は肥料に対応する。実施形態の有効成分は、通常、組成物の形態で適用され、処理される作物領域、植物、又は種子に適用することができる。例えば、実施形態の組成物は、穀物庫又はサイロなどでの貯蔵の準備中又は貯蔵中に穀物に適用してもよい。実施形態の組成物は、他の化合物と同時に又は連続して適用され得る。実施形態の細菌株によって産生される殺虫性タンパク質の少なくとも１つを含有する、実施形態の有効成分又は実施形態の農薬組成物を適用する方法には、葉面散布、種子コーティング、及び土壌施用が含まれるが、これらに限定されない。適用回数及び適用量は、対応する害虫の侵入の強度に依存する。
[00184] さらなる実施形態において、実施形態の組成物、並びに形質転換された微生物及び殺虫性タンパク質は、前処理が殺虫活性に有害でない限り、標的害虫の環境に適用された場合、殺虫活性を延長するために製剤化の前に処理することができる。そのような処理は、処理が組成物の特性に悪影響を及ぼさない限り、化学的及び／又は物理的手段によることができる。化学試薬の例には、ハロゲン化剤、ホルムアルデヒド及びグルタルアルデヒドなどのアルデヒド、塩化ゼフィランなどの抗感染剤、イソプロパノール及びエタノールなどのアルコールが含まれるが、これらに限定されない。
[00185] 他の実施形態において、標的害虫の環境に実施形態の殺虫性タンパク質組成物を適用する前に、プロテアーゼ、例えばトリプシンでＣｒｙ毒素ポリペプチドを処理してタンパク質を活性化することが有利であり得る。セリンプロテアーゼによるプロトキシンの活性化のための方法は、当技術分野で周知である。
[00186] 組成物（実施形態の形質転換された微生物及び殺虫性タンパク質を含む）は、例えば、散布、噴霧、散粉、分散、コーティング若しくは注入、土壌中若しくは土壌上への導入、灌漑用水への導入、種子処理、又は保護手段として、害虫が出現し始めたとき若しくは害虫が出現する前の、一般的な適用若しくは散粉によって害虫の環境に適用することができる。例えば、実施形態の殺虫性タンパク質及び／又は形質転換された微生物は、貯蔵中に穀物を保護するために穀物と混合されてもよい。植物が最も深刻な被害を受ける可能性がある時期であるため、植物の成長の初期段階で害虫を適切に制御することが一般的に重要である。実施形態の組成物は、これが必要であると考えられる場合、便宜的に別の殺虫剤を含み得る。一実施形態において、組成物は、植え付け時に、バチルス（Bacillus）株又は実施形態の形質転換された微生物の担体及び死細胞の組成物の顆粒形態で、土壌に直接適用される。別の実施形態は、例えば、除草剤、殺虫剤、肥料、不活性担体、及び実施形態のバチルス（Bacillus）株又は形質転換された微生物の死細胞などの農薬を含む組成物の顆粒形態である。
[00187] 当業者は、全ての化合物が全ての害虫に対して等しく有効であるとは限らないことを認識するであろう。実施形態の化合物は、害虫に対する活性を示し、これは、経済的に重要な農業、森林、温室、苗床、観賞用、食品及び繊維、公衆及び動物の健康、住宅及び商業建造物、家庭、及び貯蔵製品の害虫を含み得る。害虫には、鱗翅目（Lepidoptera）からの昆虫が含まれる。鱗翅目（Lepidoptera）の幼虫には、これらに限定されないが、ヤガ科（Noctuidae）のアワヨトウ、ネキリムシ、シャクトリムシ、及びタバコガである、スポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda JE Smith）（ハスモンヨトウ）、シロイチモジヨトウ（S. exigua Hubner）（ビートアワヨトウ）、ハスモンヨトウ（S. litura Fabricius）（ハスモンヨトウ、クラスターキャタピラー）、マメストラ・コンフィグラタ（Mamestra configurata Walker）（バーサヨトウムシ）、ヨトウガ（M. brassicae Linnaeus）（ヨトウガ）、タマヤナガ（Agrotis ipsilon Hufnagel）（タマヤナガ）、Ａ．オルトゴニア（A. orthogonia Morrison）（ウェスタンカットワーム）、ニセタナヤガ（A. subterranea Fabricius）（グラニュレートカットワーム）、アラバマ・アルギラセア（Alabama argillacea Hubner）（コットンリーフワーム）、イラクサギンウワバ（Trichoplusia ni Hubner）（キャベツルーパー）、ダイズシャクトリムシ（Pseudoplusia includens Walker）（ダイズシャクトリムシ）、アンチカルシア・ゲマタリス（Anticarsia gemmatalis Hubner）（ベルベットビーンキャタピラー）、ヒペナ・スカブラ（Hypena scabra Fabricius）（グリーンクローバーワーム）、ヘリオチス・ヴィレセンス（Heliothis virescens Fabricius）（ニセアメリカタバコガ）、プセウダレチア・ユニプンクタ（Pseudaletia unipuncta Haworth）（ヨトウムシ）、アセチス・ミンダラ（Athetis mindara Barnes and Mcdunnough）（ラフスキンカットワーム）、オイキソア・メゾリア（Euxoa messoria Harris）（ダークサイデッドカットワーム）、ミスジアオリンガ（Earias insulana Boisduval）（スピニーボールワーム）、Ｅ．ビデラ（E. vittella Fabricius）（スポッテドボールワーム）、オオタバコガ（Helicoverpa armigera Hubner）（アメリカボールワーム）、アメリカタバコガ（H. zea Boddie）（オオタバコガの幼虫又はワタキバガの幼虫）、メランコリ・ピクタ（Melanchra picta Harris）（ゼブラキャタピラー）、エギラ（キシロミゲス）・クリアリス（Egira（Xylomyges）curialis Grote）（シトラスカットワーム）と、メイガ（Pyralidae）科のキクイムシ、繭を作る昆虫、ウェブワーム、マツマダラメイガ、及びからの葉を食い荒らす幼虫である、ヨーロッパアワノメイガ（Ostrinia nubilalis Hubner）（ヨーロッパアワノメイガ）、アミエロイス・トランシテラ（Amyelois transitella Walker）（ネイブルオレンジムシ）、スジコナマダラメイガ（Anagasta kuehniella Zeller）（スジコナマダラメイガ）、スジマダラメイガ（Cadra cautella Walker）（アーモンド蛾）、ニカメイガ（Chilo suppressalis Walker）（ニカメイガ）、Ｃ．パルテルス（C. partellus）（ソルガムボーラー）、ガイマイツヅリガ（Corcyra cephalonica Stainton）（ガイマイツヅリガ）、ウスギンツトガ（Crambus caliginosellus Clemens）（コーンルートウェブワーム）、シバツトガ（C. teterrellus Zincken）（ナガハグサウェブワーム）、コブノメイガ（Cnaphalocrocis medinalis Guenee）（コブノメイガ）、デスミア・フネラリス（Desmia funeralis Hubner）（グレイプリーフフォルダー）、ジアファニア・ヒアリナタ（Diaphania hyalinata Linnaeus）（メロンワーム）、アメリカウリメイガ（D. nitidalis Stoll）（ピックルワーム）、ジアトラエア・グランジオセラ（Diatraea grandiosella Dyar）（サザンウェスタンコーンボーラー）、Ｄ．サッカラリス（D. saccaralis Fabricius）（サトウキビ害虫）、エオレウマ・ロフチニ（Eoreuma loftini Dyar）（メキシコライスニカメイガ）、チャマダラメイガ（Ephestia elutella Hubner）（タバコ（カカオ）蛾）、ギャレリア・メロネラ（Galleria mellonella Linnaeus）（オオハチミツガ）、クロオビクロメイガ（Herpetogramma licarsisalis Walker）（ソドウェブワーム）、ホメオソマ・エレクテラム（Homoeosoma electellum Hulst）（ヒマワリ蛾）、モロコシマダラメイガ（Elasmopalpus lignosellus Zeller）（レサーコーンストークボーラー）、コハチノスツヅリガ（Achroia grisella Fabricius）（コハチノスツヅリガ）、ロクソステゲ・スチクチカリス（Loxostege sticticalis Linnaeus）（シロオビノメイガ）、オルサガ・シリサリス（Orthaga thyrisalis Walker）（チャノキウェブ蛾）、マメノメイガ（Maruca testulalis Geyer）（マメノメイガ）、シメマダラメイガ（Plodia interpunctella Hubner）（シメマダラメイガ）、イッテンオオメイガ（Scirpophaga incertulas Walker）（イッテンオオメイガ）、ウデア・ルビガリス（Udea rubigalis Guenee）（セルリーリーフタイヤー）と、ハマキガ（Tortricidae）科のハマキムシ、芽を食う毛虫、シードワーム、及びフルーツワームである、アクレリス・グロブラナ（Acleris gloverana Walsingham）（ウェスタンブラックヘッドバドワーム）、Ａ．バリアナ（A. variana Fernald）（イースタンブラックヘッドバドワーム）、アルキプス・アルギロスピラ（Archips argyrospila Walker）（フルーツツリーリーフローラー）、Ａ．ロサナ（A. rosana Linnaeus）（ヨーロッパリーフローラー）と、他のハマキ種（Archips species）の、コカクモンハマキ（Adoxophyes orana Fischer von Roesslerstamm）（リンゴコカクモンハマキ）、コキリス・ホスペス（Cochylis hospes Walshingham）（バンデッドサンフラワーモス）、シディア・ラチフェレアナ（Cydia latiferreana Walshingham）（フィルバートワーム）、コドリンガ（C. pomonella Linnaeus）（コドリンガ）、プラチノタ・フラベダナ（Platynota flavedana Clemens）（マダラハマキムシ）、Ｐ．スツルタナ（P. stultana Walshingham）（オムニボラスリーフローラー）、ホソバヒメハマキ（Lobesia botrana Denis & Schiffermueller）（ヨーロッパブドウツルガ）、リンゴシロヒメハマキ（Spilonota ocellana Denis & Schiffermueller）（アイスポッテッドバッドモス）、グレイプベリーモス（Endopiza viteana Clemens）（グレイプベリーモス）、ブドウホソハマキ（Eupoecilia ambiguella Hubner）（ブドウの害虫蛾）、ボナゴタ・サルブリコラ（Bonagota salubricola Meyrick）（ブラジルアップルリーフローラー）、ナシヒメシンクイ（Grapholita molesta Busck）（ナシヒメシンクイ）、スレイマ・ヘリアンサナ（Suleima helianthana Riley）（サンフラワーバッドモス）、アルギロテニア種（Argyrotaenia spp.）、コリストネウラ種（Choristoneura spp.）が挙げられる。
[00188] 鱗翅目（Lepidoptera）の選択される他の農学上の有害生物には、これらに限定されないが、アルソフィラ・ポメタリア（Alsophila pometaria Harris）（秋シャクトリムシ）、モモキバガ（Anarsia lineatella Zeller）（ピーチツィッグボーラー）、アニソタ・セナトリア（Anisota senatoria J.E. Smith）（オレンジストライプオークワーム）、ヤママユガ（Antheraea pernyi Guerin-Meneville）（柞繭）、カイコガ（Bombyx mori Linnaeus）（カイコ）、ブックラトリクス・ツルベリエラ（Bucculatrix thurberiella Busck）（コットンリーフパーフォレーター）、ミヤマモンキ（Collas eurytheme Boisduval）（アルファルファキャタピラー）、ダタナ・インテジェリマ（Datana integerrima Grote & Robinson）（クルミキャタピラー）、デンドロリムス・シビリクス（Dendrolimus sibiricus Tschetwerikov）（シベリアシルク蛾）、ニレシャクトリムシ（Ennomos subsignaria Huebner）（エルムスパンワーム）、エラニス・チリアリア（Erannis tiliaria Harris）（リンデンルーパー）、エウプロクチス・クリソレア（Euproctis chtysorrhoea Linnaeus）（シロバネドクガ）、ハリシナ・アメリカナ（Harrisina americana Guerin-Meneville）（グレイプリーフスケルトナイザー）、ヘミロイカ・オレビアエ（Hemileuca oliviae Cockrell）（レンジキャタピラー）、アメリカシロヒトリ（Hyphantria cunea Drury）（アメリカシロヒトリ）、ケイフェリア・リコペルシセラ（Keiferia lycopersicella Walsingham）（トマトピンワーム）、ランブダ・フィスセラリア・フィスセラリア（Lambdina fiscellaria fiscellaria Hulst）（イースタンヘムロックルーパー）、Ｌ．フィスセラリア・ラグブローサ（L. fiscellaria lugubrosa Hulst）（ウェスタンヘムロックルーパー）、ヤナギドクガ（Leucoma salicis Linnaeus）（キアシドクガ）、マイマイガ（Lymantria dispar Linnaeus）（マイマイガ）、マンジュカ・キンケマクラタ（Manduca quinquemaculata Haworth）（ファイブスポットスズメガ、トマトスズメガ）、タバコスズメガ（M. sexta Haworth）（トマトスズメガ、タバコスズメガ）、ナミスジフェナミシャク（Operophtera brumata Linnaeus）（ナミスジフェナミシャク）、パレアクリタ・ベマタ（Paleacrita vemata Peck）（スプリングカンカーワーム）、クレスフォンテスタスキアゲハ（Papilio cresphontes Cramer）（オオアゲハ、オレンジドッグ）、フリガニジア・カリフォルニカ（Phryganidia californica Packard）（カリフォルニアオークワーム）、ミカンコハモグリ（Phyllocnistis citrella Stainton）（ミカンハモグリガ）、フィロノリクテル・ブランカルデラ（Phyllonorycter blancardella Fabricius）（マメハモグリバエ）、オオモンシロチョウ（Pieris brassicae Linnaeus）（オオモンシロチョウ）、モンシロチョウ（P. rapae Linnaeus）（モンシロチョウ）、エゾスジグロシロチョウ（P. napi Linnaeus）（エゾスジグロシロチョウ）、プラチプチリア・カルジュイダクチラ（Platyptilia carduidactyla Riley）（アーチチョークプルームモス）、コナガ（Plutella xylostella Linnaeus）（コナガ）、ワタノメイガ（Pectinophora gossypiella Saunders）（ワタアカミムシ）、チョウセンシロチョウ（Pontia protodice Boisduval & Leconte）（ミナミモンシロチョウ）、サブロデス・エーグロタータ（Sabulodes aegrotata Guenee）（オニボラスルーパー）、シズラ・コンシナ（Schizura concinna J.E. Smith）（赤猫背キャタピラー蛾）、バクガ（Sitotroga cerealella Olivier）（バクガ）、タウメトポエア・ピチオカムパ（Thaumetopoea pityocampa Schiffermuller）（マツギョウレツケムシ）、コイガ（Tineola bisselliella Hummel）（コイガ）、トゥタ・アボソリュータ（Tuta absoluta Meyrick）（トマトハモグリバエ）、イポノメウタ・パデラ（Yponomeuta padella Linnaeius）（オコジョ蛾）、ヘリオシス・スブフレッキサ（Heliothis subflexa Guenee）、マラコソマ種（Malacosoma spp.）、及びオルギア種（Orgyia spp.）が挙げられる。
[00189] 害虫は、例えば幼虫又は他の未成熟形態として、初期の発達段階における実施形態の組成物の殺虫活性について試験され得る。昆虫は、約２０℃～約３０℃、且つ約３０％～約７０％の相対湿度で、完全な暗闇の中で飼育してもよい。昆虫の幼虫を飼育し、バイオアッセイを実施する方法は、当業者に周知である。
[00190] 本発明による昆虫、特に鱗翅目（Lepidoptera）を制御する方法は、本発明のコドン最適化ｃｒｙ２Ａｉヌクレオチド配列で形質転換された宿主細胞を含む、保護される遺伝子座（領域）に保護される領域又は植物に本明細書に開示される殺虫性（insecticidal）／殺虫性（pesticidal）組成物を適用（例えば、噴霧）することを含み得る。保護される部位には、例えば、害虫の生息場所又は成長する植物、又は植生が成長する領域が含まれ得る。
[00191] 本開示は、本発明のｃｒｙ２Ａｉヌクレオチド配列で形質転換されたナス植物を植えることによって、又は本発明のＣｒｙ２Ａｉタンパク質を含む組成物を噴霧することによって、保護されるべき領域又は植物に本明細書に開示される殺虫性（insecticidal）／殺虫性（pesticidal）組成物を適用することを含む、鱗翅目ナス害虫を制御するための方法に関する。本発明はまた、ナス植物への損傷を最小限にするための、鱗翅目ナス害虫に対する本発明の組成物の使用に関する。
[00192] 本開示はまた、鱗翅目イネ害虫、特に鱗翅目のニカメイガ（rice stemborer）、コブノメイガ（rice leaffolder）、イチモンジセセリ（rice skipper）、ハスモンヨトウ（rice cutworm）、アワヨトウ（rice armyworm）、又はイネミズメイガ（rice caseworm）、好ましくは、ニカメイガ（Chilo suppressalis）、キロ・パルテルス（Chilo partellus）、サンカメイガ（Scirpophaga incertulas）、イネヨトウ（Sesamia inferens）、コブノメイガ（Cnaphalocrocis medinalis）、Marasmia patnalis、イネタテハマキ（Marasmia exigua）、Marasmia ruralis、シロメイチュウ（Scirpophaga innotata）からなる群から選択される昆虫を制御するための方法に関し、方法は、本発明のｃｒｙ２Ａｉヌクレオチド配列で形質転換されたイネ植物を植えることによって、又は本発明のＣｒｙ２Ａｉタンパク質を含む組成物を噴霧することによって、保護されるべき領域又は保護されるべき植物に保護されるべき領域又は保護されるべき植物に本明細書に開示される殺虫性（insecticidal）／殺虫性（pesticidal）組成物を適用することを含む。本発明はまた、イネ植物への損傷を最小限にするための、鱗翅目イネ害虫に対する本明細書に開示される組成物の使用に関する。
[00193] 本開示はさらに、鱗翅目トマト害虫、特に鱗翅目のオオタバコガ（Helicoverpa armigera）を制御するための方法に関し、方法は、本発明のｃｒｙ２Ａｉヌクレオチド配列で形質転換されたトマト植物を植えることによって、又は本発明のＣｒｙ２Ａｉタンパク質を含む組成物を噴霧することによって、保護されるべき領域又は保護されるべき植物に保護されるべき領域又は保護されるべき植物に本明細書に開示される殺虫性（insecticidal）／殺虫性（pesticidal）組成物を適用することを含む。本発明はまた、トマト植物への損傷を最小限にするための、鱗翅目トマト害虫に対する本明細書に開示される組成物の使用に関する。
[00194] 本開示はさらに、鱗翅目のワタ害虫を制御するための方法に関し、方法は、本発明のｃｒｙ２Ａｉヌクレオチド配列で形質転換されたワタ植物を植えることによって、又は本発明のＣｒｙ２Ａｉタンパク質を含む組成物を噴霧することによって、保護されるべき領域又は保護されるべき植物に保護されるべき領域又は保護されるべき植物に本明細書に開示される殺虫性（insecticidal）／殺虫性（pesticidal）組成物を適用することを含む。本発明はまた、ワタ植物への損傷を最小限にするための、鱗翅目ワタ害虫に対する本明細書に開示される組成物の使用に関する。
[00195] Ｃｒｙ２Ａｉ毒素タンパク質（配列番号１）を得るために、Ｃｒｙ２Ａｉタンパク質を発現する組換え宿主の細胞を、適切な培養培地上で従来の方法で増殖させ、次いで、酵素分解又は界面活性剤などの従来の手段を使用して溶解することができる。次に、毒素は、クロマトグラフィー、抽出、又は電気泳動などの標準的な技術によって分離及び精製することができる。
[00196] したがって、本発明は、害虫、特に植物害虫に影響を与えるための組成物及び方法を提供する。より具体的には、本発明は、オオタバコガ（Helicoverpa armigera）－ワタキバガの幼虫及びオオタバコガの幼虫、コブノメイガ（Cnaphalocrocis medinalis）－コブノメイガ（rice leaf folder）、及びイッテンオオメイガ（Scirpophaga incertulas）－イッテンオオメイガ（rice yellow stem borer）及びワタアカミムシ（Spectinophora gossypiella）などの鱗翅目（Lepidopteran）害虫などであるが、これらに限定されない害虫に対して、生物学的に活性な殺虫性ポリペプチドをコードするコドン最適化ポリヌクレオチドを提供する。
[00197] 本開示によると、実施形態の１つにおいて、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするコドン最適化合成ヌクレオチド配列が提供され、ここで、前記ヌクレオチド配列は、
ａ．配列番号２に記載の配列、若しくはそれに相補的なヌクレオチド配列、又は
ｂ．配列番号２の２５１～４０２位及び／又は１４５６～１６２８に記載のヌクレオチド配列、若しくはそれに相補的な配列の、少なくとも１０ヌクレオチドに特異的にハイブリダイズするヌクレオチド配列
である。
[00198] 別の実施形態において、本開示のコドン最適化合成ヌクレオチド配列が提供され、ここで、配列番号２に記載のヌクレオチド配列に特異的にハイブリダイズするヌクレオチド配列は、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、及び配列番号７からなる群から選択される。
[00199] 別の実施形態において、ヌクレオチド配列が異種調節要素に作動可能に連結されている、本開示のコドン最適化合成ヌクレオチド配列を含む組換えＤＮＡが提供される。別の実施形態は、本明細書に開示される組換えＤＮＡに関し、ここで、前記コドン最適化合成ヌクレオチド配列は、任意選択により、選択可能なマーカー遺伝子、レポーター遺伝子、又はそれらの組み合わせを含む。さらに別の実施形態は、本明細書に開示される組換えＤＮＡに関し、ここで、前記コドン最適化合成ヌクレオチド配列は、任意選択により、液胞、ミトコンドリア、葉緑体、色素体を標的とするため、又は分泌のための、標的化又は輸送ペプチドをコードするＤＮＡ配列を含む。
[00200] 別の実施形態において、５’非翻訳配列、配列番号１のアミノ酸配列又はその殺虫性部分を含む殺虫性Ｃｒｙ２Ａｉタンパク質をコードするコード配列、及び３’非翻訳領域を含む、目的の殺虫性タンパク質を発現するためのＤＮＡ構築物が提供され、ここで、前記５’非翻訳配列は、植物細胞において機能的なプロモーターを含み、前記コード配列は、本明細書に開示されるようなコドン最適化合成ヌクレオチド配列であり、前記３’非翻訳配列は、転写終結配列及びポリアデニル化シグナルを含む。
[00201] 別の実施形態は、組換えＤＮＡ、又は本開示のＤＮＡ構築物を含む、プラスミドベクターを提供する。
[00202] 別の実施形態は、本開示のコドン最適化合成ヌクレオチド配列を含む宿主細胞を提供する。本開示の宿主細胞は、植物、細菌、ウイルス、真菌、及び酵母細胞を包含する。別の実施形態において、開示される宿主細胞は、植物細胞、アグロバクテリウム（Agrobacterium）又は大腸菌（E. coli）である。
[00203] 本発明の別の実施形態は、
（ａ）本明細書に開示されるコドン最適化合成ヌクレオチド配列を植物細胞に挿入することであって、ヌクレオチド配列が、（ｉ）植物細胞で機能するプロモーター及び（ｉｉ）ターミネーターに作動可能に連結されていること、
（ｂ）ステップ（ａ）の植物細胞から形質転換植物細胞を得ることであって、前記形質転換植物細胞が、本開示の前記コドン最適化合成ヌクレオチド配列を含むこと、並びに
（ｃ）ステップ（ｂ）の前記形質転換植物細胞からトランスジェニック植物を産生することであって、前記トランスジェニック植物が、本開示の前記コドン最適化合成ヌクレオチド配列を含むこと
を含む、植物に耐虫性を付与するための方法を提供する。
[00204] 別の実施形態は、本明細書に開示される耐虫性を付与するための方法によって得られるトランスジェニック植物に関する。本発明のさらに別の実施形態は、本明細書に開示されるコドン最適化合成ヌクレオチド配列を含むトランスジェニック植物に関する。本発明のさらに別の実施形態は、コドン最適化合成ヌクレオチド配列を含むトランスジェニック植物に関し、ここで、ヌクレオチド配列は、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、及び配列番号７からなる群から選択される。本開示のさらに別の実施形態は、本明細書に開示されるトランスジェニック植物に関し、ここで、前記植物は、イネ、小麦、トウモロコシ、ソルガム、オート麦、キビ、マメ科植物、ワタ、トマト、ナス、キャベツ、カリフラワー、ブロッコリー、アブラナ属（Brassica sp.）、マメ、エンドウマメ、キマメ、ジャガイモ、コショウ、ククルビタ、レタス、サツマイモカノーラ、大豆、アルファルファ、ピーナッツ、ヒマワリ、ベニバナ、タバコ、サトウキビ、キャッサバ、コーヒー、パイナップル、柑橘類、ココア、茶、バナナ及びメロンからなる群から選択される。
[00205] 本開示のさらなる実施形態は、本発明のトランスジェニック植物から得られた組織、種子又は子孫に関し、ここで、前記種子又は子孫は、本明細書に開示されるようなコドン最適化合成ヌクレオチド配列を含む。本発明のさらに別の実施形態は、本明細書に開示される組織又は種子又は子孫に由来する生物学的サンプルに関し、ここで、前記サンプルは、検出可能な量の本発明の前記コドン最適化合成ヌクレオチド配列を含む。本発明のさらなる実施形態は、本開示に開示されるトランスジェニック植物に由来するコモディティー製品を提供し、ここで、前記製品は、本明細書に開示されるような検出可能な量の前記コドン最適化合成ヌクレオチド配列を含む。
[00206] 本発明の別の実施形態は、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するＣｒｙ２Ａｉタンパク質をコードする、本開示のコドン最適化合成ヌクレオチド配列を含むバチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）を含む組成物を提供する。本明細書に開示される組成物は、任意選択により、同じ害虫に対して毒性であるが、前記殺虫性タンパク質とは異なるモードの殺虫活性を示す追加の殺虫剤を含んでもよい。本開示の組成物の殺虫剤は、バチルス（Bacillus）毒素、ゼノラブダス（Xenorhabdus）毒素、フォトラブダス（Photorhabdus）毒素、及び前記害虫の１つ以上の必須遺伝子の抑制に特異的なｄｓＲＮＡからなる群から選択される。
[00207] 本発明のさらに別の実施形態は、作物植物における昆虫の侵入を制御し、耐虫性管理を提供する方法を提供し、ここで、前記方法は、前記作物植物を上記の殺虫有効量の組成物と接触させることを含む。
[00208] 本発明のさらなる実施形態は、耐虫性トランスジェニック植物の産生のための、本開示のコドン最適化合成ヌクレオチド配列、ＤＮＡ構築物、又はプラスミドの使用に関する。本発明のさらに別の実施形態は、殺虫性組成物の産生のための、本明細書に開示されるコドン最適化合成ヌクレオチド配列の使用に関し、ここで、組成物は、前記ヌクレオチド配列を含むバチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）細胞を含む。
[00209] 本発明の別の実施形態は、本明細書に開示される少なくとも１つのコドン最適化合成ヌクレオチド配列を発現するトランスジェニック植物を提供する。さらなる実施形態は、本明細書に開示される方法によって得られるトランスジェニック植物を提供する。本明細書に開示されるトランスジェニック植物は、イネ、小麦、トウモロコシ、ソルガム、オート麦、キビ、マメ科植物、ワタ、トマト、ナス、キャベツ、カリフラワー、ブロッコリー、アブラナ属（Brassica sp.）、マメ、エンドウマメ、キマメ、ジャガイモ、コショウ、ククルビタ、レタス、サツマイモカノーラ、大豆、アルファルファ、ピーナッツ、ヒマワリ、ベニバナ、タバコ、サトウキビ、キャッサバ、コーヒー、パイナップル、柑橘類、ココア、茶、バナナ及びメロンからなる群から選択される。本発明の一部の実施形態は、本発明のトランスジェニック植物から得られた組織、種子又は子孫に関し、ここで、前記種子又は子孫は、本明細書に記載のコドン最適化合成ヌクレオチド配列を含む。本発明の一部の実施形態は、組織又は種子又は子孫に由来する生物学的サンプルを提供し、ここで、サンプルは、検出可能な量の前記コドン最適化合成ヌクレオチド配列を含む。一実施形態は、本発明のトランスジェニック植物に由来するコモディティー製品を含み、製品は、検出可能な量のコドン最適化合成ヌクレオチド配列を含む。
[00210] 一実施形態において、少なくとも１つの本開示のコドン最適化合成ヌクレオチド配列を含む、バチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）を含む組成物が提供され、ここで、ヌクレオチド配列は、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するＣｒｙ２Ａｉタンパク質をコードする。組成物は、任意選択により、同じ害虫に対して毒性であるが、前記殺虫性タンパク質とは異なるモードの殺虫活性を示す追加の殺虫剤を含む。殺虫剤は、バチルス（Bacillus）毒素、ゼノラブダス（Xenorhabdus）毒素、フォトラブダス（Photorhabdus）毒素、及び前記害虫の１つ以上の必須遺伝子の抑制に特異的なｄｓＲＮＡからなる群から選択される。
[00211] 別の実施形態において、作物植物における昆虫の侵入を制御し、耐虫性管理を提供する方法が提供され、ここで、前記方法は、前記作物植物を本明細書に記載の殺虫有効量の組成物と接触させることを含む。
[00212] 別の実施形態は、耐虫性トランスジェニック植物の産生のための、本開示のコドン最適化合成ヌクレオチド配列、ＤＮＡ構築物、又はプラスミドの使用に関する。さらに別の実施形態は、殺虫性組成物の産生のための、本明細書に開示されるコドン最適化合成ヌクレオチド配列の使用に関し、ここで、組成物は、前記ヌクレオチド配列を含むバチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）細胞を含む。
[00213] 本発明のこれら及び／又は他の実施形態は、本発明の説明の一部を形成する特許請求の範囲の文言に反映されている。
[00214] 本発明の様々な改変及び他の実施形態は、これらの発明が関係する当業者によって提示され得、説明及び関連する図面に提示された教示の利益を有する。したがって、本発明は、本明細書に開示される特定の実施形態に限定されるものではなく、改変及び他の実施形態は、添付の特許請求の範囲内に含まれることが意図されることを理解されたい。
[00215] 以下の実施例は、本発明を説明するものであり、本発明又は求められる保護を制限するために提供されるものではない。
実施例
[00216] 以下の実施例は、当業者に本発明を実施及び使用する方法の完全な開示及び説明を提供するために提示されるものであり、発明者がその発明と見なす範囲を制限することを意図するものではなく、また、以下の実験が実行される全て又は唯一の実験であることを表すことを意図するものでもない。使用される数値（例えば、量、温度など）に関して正確さを確保するための努力がなされてきたが、一部の実験誤差及び偏差を考慮すべきである。
一般的な方法
[00217] ＤＮＡ操作は、当技術分野で標準的な手順を使用して行われた。これらの手順は、結果を実質的に変更することなく、しばしば改変及び／又は置換することができる。他の参考文献が特定されている場合を除き、これらの手順の大半は、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, second edition, 1989に記載される。
実施例１：ＣＲＹ２Ａｉタンパク質（配列番号１）をコードするコドン最適化配列の設計
[00218] 単子葉植物コドンバイアスを有するＤＮＡ配列を、トランスジェニック植物における配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するＣｒｙ２Ａｉタンパク質の発現のために設計及び合成した。単子葉植物のコドン使用表は、配列番号１のＣｒｙ２Ａｉタンパク質配列（NCBI GenBank ACV97158.1）から得られたコード配列から計算された。ＤＮＡ配列は、コドン選択の主要な基準として、モンテカルロアルゴリズム（Villalobos A, Ness J E, Gustafsson C, Minshull J and Govindarajan S (2006) Gene Designer: a synthetic biology tool for constructing artificial DNA segments; BMC Bioinformatics 67:285-293）を使用して最適化された。ＤＮＡ配列を最適化する際に、コドン使用表からの確率が考慮された。希少で頻度の低いコドンが、最も大量に存在するコドンに置換された。加重平均植物コドンセットは、そのアミノ酸の総コドン使用の約１０％未満で使用された重複コドンを全て省略した後に計算された。各コドンの加重平均表示は、次の式を使用して計算された。
[00219] ＣＩの加重平均％＝１／（％Ｃ１＋％Ｃ２＋％Ｃ３＋など）ｘ％Ｃ１ｘ１００（式中、ＣＩは問題のコドンであり、％Ｃ２、％Ｃ３などは残りの同義コドンの平均％使用値を表す）。
[00220] 配列番号１のＣｒｙ２Ａｉタンパク質をコードする単子葉植物コドン最適化ＤＮＡ配列を誘導するために、Ｃｒｙ２Ａｉタンパク質をコードするＤＮＡ配列のコドン置換を行い、得られたＤＮＡ配列が単子葉植物最適化コドンバイアス表の全体的なコドン組成を有するようにした。望ましくない制限酵素認識部位、潜在的な植物イントロンスプライス部位、Ａ／Ｔ又はＣ／Ｇ残基のロングラン、及び植物細胞のコーディング領域のＲＮＡの安定性、転写、又は翻訳を妨げ得るその他のモチーフを排除するために、配列をさらに改良した。遺伝子は、ｍＲＮＡの安定した二次構造の形成のために６．０ｋｃａｌ／モルのカットオフ値で遺伝子設計ソフトウェアを使用することにより、インシリコで最適化された。望ましい制限酵素認識部位を組み込み、長い内部オープンリーディングフレーム（＋１以外のフレーム）を排除するために、他の変更が行われた。ＸｂａＩ、ＮｃｏＩ及びＢａｍＨＩの制限認識部位を開始コドンＡＴＧの前に組み込み、制限認識部位ＳｍａＩを停止コドンの前に挿入して、Ｃ末端タンパク質タグの融合のために原核生物ベクターに最適化された遺伝子をクローニングできるようにした。ＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ及びＳａｃＩの制限認識部位は、終止コドンの後に組み込まれた。最適化された遺伝子において終止コドンＴＧＡが使用された。
[00221] これらの変更は全て、ほぼ単子葉植物バイアスコドン組成を保持するという制約の範囲内で行われた。Ｃｒｙ２Ａｉタンパク質（配列番号１）をコードする完全な単子葉植物コドン最適化配列は、配列番号２～７に記載されている通りである。単子葉植物バイアスコドン最適化ＤＮＡ配列のインシリコ翻訳は、天然Ｃｒｙ２Ａｉタンパク質（配列番号１）と１００％の同一性を示した。単子葉植物コドン最適化ＤＮＡ配列（配列番号２～７）は、２０１Ｍ１、２０１Ｍ２、２０１Ｍ３、２０１Ｍ４、２０１Ｍ５及び２０１Ｍ６と名付けられた。２０１Ｍ１－Ｍ６ ＤＮＡ断片（配列番号２～７）の合成は、商業ベンダー（Genscript Inc,USA）によって実施された。２０１Ｍ１ＤＮＡ断片は、当技術分野で公知の方法を使用することにより、ｐＵＣ５７ベクターにクローン化され、ｐＵＣ５７－２０１Ｍ１と名付けられた。同様に、２０１Ｍ２ ＤＮＡ、２０１Ｍ３ ＤＮＡ、２０１Ｍ４ ＤＮＡ、２０１Ｍ５ ＤＮＡ、及び２０１Ｍ６ ＤＮＡ断片は、ｐＵＣ５７ベクターにクローン化され、それぞれｐＵＣ５７－２０１Ｍ２、ｐＵＣ５７－２０１Ｍ３、ｐＵＣ５７－２０１Ｍ４、ｐＵＣ５７－２０１Ｍ５、及びｐＵＣ５７－２０１Ｍ６と名付けられた。
実施例２：発現ベクターの構築
[00222] 実施例１のｐＵＣ５７－２０１Ｍ１ベクターをＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化して、２０１Ｍ１ ＤＮＡ（配列番号２）断片（反応量－２０μｌ、プラスミドＤＮＡ－８．０μｌ、１０Ｘ緩衝液－２．０μｌ、制限酵素ＢａｍＨＩ－０．５μｌ、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ－０．５μｌ、蒸留水－９．０μｌ）を得た。全ての試薬を混合して反応混合物を得、３７℃で３０分間インキュベートした後、反応混合物を２％アガロースゲルでのゲル電気泳動により分析し、２０１Ｍ１ ＤＮＡ断片を清潔で鋭利なメスを用いて、ＵＶ照明下、アガロースゲルから切り出した。ＤＮＡ断片はゲル溶出キットを使用してゲルから溶出した。ＤＮＡ断片を含有するゲルスライスを２ｍｌエッペンドルフチューブに移し、３Ｘサンプル量の緩衝液ＤＥ－Ａを加えた。ボルテックスによりゲルを緩衝液ＤＥ－Ａに再懸濁し、ゲルが完全に溶解するまで内容物を７５℃に加熱した後、０．５Ｘ緩衝液ＤＥ－Ａ及びＤＥ－Ｂを混合して添加した。エッペンドルフチューブにカラムを入れて準備し、結合混合物をカラムに移した。カラム付きエッペンドルフチューブを短時間遠心分離した。カラムを新しいエッペンドルフチューブに入れ、５００μｌの緩衝液、洗浄緩衝液－Ｗ Ｉ（Qiagen Kit）を加え、遠心分離した。上清を廃棄し、７００μｌの洗浄緩衝液－Ｗ ２をカラムの壁に沿って加えて、全ての残留緩衝液を洗い流した後、遠心分離した。このステップは、緩衝液Ｗ ２のアリコート７００μｌで反復した。カラムを新しいエッペンドルフチューブに移し、６０００ｒｐｍで１分間遠心分離して、残留緩衝液を除去した。カラムを再び新しいエッペンドルフチューブに入れ、４０μｌの溶離緩衝液を膜の中央に加えた。溶離緩衝液を含むカラムを室温で１分間静置し、チューブを１２０００ｒｐｍで１分間遠心分離した。溶出した２０１Ｍ１ ＤＮＡ断片は、さらに使用するまで－２０℃で保存した。
[00223] このようにして得られた単離及び精製された２０１Ｍ１ ＤＮＡ断片を、線形化されたｐＥＴ３２ａベクターに連結した。ライゲーションは、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ酵素（反応量－３０μｌ、１０Ｘライゲーションバッファー－３．０μｌ、ベクターＤＮＡ－５．０μｌ、インサートＤＮＡ－１５．０μｌ、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ酵素－１．０μｌ、蒸留水－６．０μｌ）を使用して行った。試薬を十分に混合し、得られた反応混合物を１６℃で２時間インキュベートした。続いて、大腸菌（E. coli）ＢＬ２１（ＤＥ３）株のコンピテント細胞を、１００μｌのＢＬ２１ ＤＥ３コンピテント細胞に１０μｌのライゲーション混合物を加えることにより、２０１Ｍ１ ＤＮＡを保有するｐＥＴ３２ａベクターを含むライゲーション混合物で形質転換した。このようにして得られた細胞混合物を氷上に３０分間置き、熱ショックのために水浴中で、４２℃で６０秒間インキュベートし、氷上に５～１０分間戻した。続いて、１ｍｌのＬＢブロスを混合物に加え、２００ｒｐｍのインキュベーターシェーカー内で、３７℃で１時間さらにインキュベートした。細胞混合物をＬＢ寒天培地＋５０μｇ／ｍｌカルベニシリン上に塗布し、３７℃で一晩インキュベートした。制限消化分析により陽性クローンを同定した。このようにして得られた発現ベクターをｐＥＴ３２ａ－２０１Ｍ１と名付けた。
[00224] 同様に、配列番号３～７に記載される他の単子葉植物コドン最適化ＤＮＡ配列を保有する発現ベクターを構築し、ｐＥＴ３２ａ－２０１Ｍ２、ｐＥＴ３２ａ－２０１Ｍ３、ｐＥＴ３２ａ－２０１Ｍ４、ｐＥＴ３２ａ－２０１Ｍ５及びｐＥＴ３２ａ－２０１Ｍ６と名付けた。
実施例３：２０１Ｍ１（配列番号２）によってコードされるＣＲＹ２Ａｉタンパク質の発現
[00225] ｐＥＴ３２ａ－２０１Ｍ１と名付けられたｐＥＴ３２ａにクローン化された２０１Ｍ１ ＤＮＡ（配列番号２）は、大腸菌（E. coli）ＢＬ ２１ Ｄ３で発現された。発現は、ＯＤｎｍ＝約０．５～１．０の細胞密度で１ｍＭのＩＰＴＧを用いて誘導された。誘導後、タンパク質生産のために、大腸菌（E. coli）細胞を、シェーカー内で、１６℃で２４～４０時間インキュベートした。Ｃｒｙ２Ａｉタンパク質（配列番号１）は、細胞内で、可溶型で発現された（分泌されなかった）。続いて、培養物を遠心分離管に移し、１００００ｒｐｍで５分間遠心分離した。上清を廃棄し、１０ｍｌの細胞をリゾチームで消化し、室温で１時間インキュベートした。サンプルを１００００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を廃棄した。ペレットを滅菌蒸留水に懸濁し、１００００ｒｐｍで１０分間、遠心分離した。このステップを２回繰り返し、ペレットを－２０℃で保存した。誘導された組換え株からのタンパク質を含有するペレットを１０％ＳＤＳ－ＰＡＧＥで分析した。
[00226] 同様に、配列番号３～７に記載のＤＮＡ配列は、ｐＥＴ３２ａにクローン化され、大腸菌（E. coli）ＢＬ ２１ Ｄ３で発現された。
実施例４：ＣＲＹ２Ａｉタンパク質（配列番号１）をコードする２０１Ｍ１ ＤＮＡ（配列番号２）を含む植物形質転換ベクターの構築
[00227] ２０１Ｍ１ ＤＮＡ（配列番号２）を保有するｐＵＣ５７－２０１Ｍ１ベクターを制限酵素で消化して、２０１Ｍ１ ＤＮＡ断片を放出した（反応量－２０μｌ、プラスミドＤＮＡ－８．０μｌ、１０Ｘ緩衝液－２．０μｌ、制限酵素ＥｃｏＲＶ－０．５μｌ、蒸留水－９．５μｌ）。全ての試薬を混合し、混合物を３７℃で３０分間インキュベートした。制限消化後に得られた産物をゲル電気泳動で分析し、さらに精製した。
[00228] ＴｉプラスミドｐＧｒｅｅｎ００２９ベクターは、ＥｃｏＲＶ酵素による制限消化によって調製した（反応量－２０μｌ、プラスミドＤＮＡ－８．０μｌ、１０Ｘ緩衝液－２．０μｌ、制限酵素ＥｃｏＲＶ－０．５μｌ、蒸留水－９．５μｌ）。全ての試薬を混合し、混合物を３７℃で３０分間インキュベートした。制限消化後に得られた産物をゲル電気泳動で分析した。
[00229] 精製された２０１Ｍ１ ＤＮＡ断片（配列番号２）を線状化されたｐＧｒｅｅｎ００２９ベクターに連結した。ライゲーションは、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ酵素（反応量－３０μｌ、１０Ｘライゲーションバッファー－３．０μｌ、ベクターＤＮＡ－５．０μｌ、インサートＤＮＡ－１５．０μｌ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ酵素－１．０μｌ、蒸留水－６．０μｌ）を使用して行った。試薬を十分に混合し、得られた反応混合物を１６℃で２時間インキュベートした。続いて、大腸菌（E. coli）ＢＬ２１（ＤＥ３）株のコンピテント細胞を、１００μｌのＢＬ２１ ＤＥ３コンピテント細胞に１０μｌのライゲーション混合物を加えることにより、２０１Ｍ１ ＤＮＡ（配列番号２）を保有するｐＧｒｅｅｎ００２９ベクターを含むライゲーション混合物で形質転換した。このようにして得られた細胞混合物を氷上に３０分間置き、熱ショックのために水浴中で、４２℃で６０秒間インキュベートし、細胞混合物を氷上に５～１０分間戻した。続いて、１ｍｌのＬＢブロスを混合物に加え、２００ｒｐｍのインキュベーターシェーカー内で、３７℃で１時間さらにインキュベートした。細胞懸濁液（１００μｌ）を、５０μｇ／ｍｌのカルベニシリンを含有するＬＢ寒天培地上に均一に塗布した。プレートを３７℃で一晩インキュベートした。陽性クローンは制限消化分析によって確認された。このようにして得られた組換えベクターをｐＧｒｅｅｎ００２９ ＣａＭＶ３５Ｓ－２０１Ｍ１と名付けた。
[00230] したがって、組換えプラスミドｐＧｒｅｅｎ００２９－ＣａＭＶ３５Ｓ－２０１Ｍ１は、３５ＳＣａＭＶプロモーターの転写制御下にある植物最適化２０１Ｍ１ ＤＮＡ配列（配列番号２）を含有する。さらに、ｐＧｒｅｅｎ００２９－ＣａＭＶ３５Ｓ－２０１Ｍ１は、ＮＯＳプロモーターの転写制御下にある植物選択可能マーカー遺伝子であるｎｐｔＩＩ遺伝子を含有する。ｐＧｒｅｅｎ００２９－ＣａＭＶ３５Ｓ－２０１Ｍ１ Ｔ領域の構成要素の物理的配置は次のように示される。
[00231] ＲＢ＞３５ＳＣａＭＶ：２０１Ｍ１ ＣＤＳ：ＣａＭＶポリＡ＞ＮＯＳプロモーター：ｎｐｔＩＩ ＣＤＳ：ＮＯＳポリＡ＞ＬＢ
[00232] 同様に、配列番号３～７に記載されるＤＮＡ配列をＴｉプラスミドｐＧｒｅｅｎ００２９にクローン化し、このようにして得られた組換えベクターを、ｐＧｒｅｅｎ００２９－ＣａＭＶ３５Ｓ－２０１Ｍ２、ｐＧｒｅｅｎ００２９－ＣａＭＶ３５Ｓ－２０１Ｍ３、ｐＧｒｅｅｎ００２９－ＣａＭＶ３５Ｓ－２０１Ｍ４、ｐＧｒｅｅｎ００２９－ＣａＭＶ３５Ｓ－２０１Ｍ５、及びｐＧｒｅｅｎ００２９－ＣａＭＶ３５Ｓ－２０１Ｍ６と名付けた。Ｔ領域に前記ＤＮＡ配列（配列番号３～７）を輸送するｐＧｒｅｅｎ００２９－ＣａＭＶ３５Ｓの構成要素の物理的な配置は次のように示される。
[00233] ＲＢ＞３５ＳＣａＭＶ：２０１Ｍ２ ＣＤＳ：ＣａＭＶポリＡ＞ＮＯＳプロモーター：ｎｐｔＩＩ ＣＤＳ：ＮＯＳポリＡ＞ＬＢ
[00234] ＲＢ＞３５ＳＣａＭＶ：２０１Ｍ３ ＣＤＳ：ＣａＭＶポリＡ＞ＮＯＳプロモーター：ｎｐｔＩＩ ＣＤＳ：ＮＯＳポリＡ＞ＬＢ
[00235] ＲＢ＞３５ＳＣａＭＶ：２０１Ｍ４ ＣＤＳ：ＣａＭＶポリＡ＞ＮＯＳプロモーター：ｎｐｔＩＩ ＣＤＳ：ＮＯＳポリＡ＞ＬＢ
[00236] ＲＢ＞３５ＳＣａＭＶ：２０１Ｍ５ ＣＤＳ：ＣａＭＶポリＡ＞ＮＯＳプロモーター：ｎｐｔＩＩ ＣＤＳ：ＮＯＳポリＡ＞ＬＢ
[00237] ＲＢ＞３５ＳＣａＭＶ：２０１Ｍ６ ＣＤＳ：ＣａＭＶポリＡ＞ＮＯＳプロモーター：ｎｐｔＩＩ ＣＤＳ：ＮＯＳポリＡ＞ＬＢ
[00238] さらに、配列番号２～７に記載されるＤＮＡ配列もＴｉプラスミドｐＧｒｅｅｎ０１７９にクローン化し、このようにして得られた組換えベクターをｐＧｒｅｅｎ０１７９－ＣａＭＶ３５Ｓ－２０１Ｍ１、ｐＧｒｅｅｎ０１７９－ ＣａＭＶ３５Ｓ－２０１Ｍ２、ｐＧｒｅｅｎ０１７９－ＣａＭＶ３５Ｓ－２０１Ｍ３、ｐＧｒｅｅｎ０１７９－ＣａＭＶ３５Ｓ－２０１Ｍ４、ｐＧｒｅｅｎ０１７９－ＣａＭＶ３５Ｓ－２０１Ｍ５、及びｐＧｒｅｅｎ０１７９－ＣａＭＶ３５Ｓ－２０１Ｍ６と名付けた。したがって、組換えプラスミドｐＧｒｅｅｎ０１７９－ＣａＭＶ３５Ｓ－２０１Ｍ１は、３５ＳＣａＭＶプロモーターの転写制御下にある植物最適化２０１Ｍ１ ＤＮＡ配列（配列番号２）を含有する。さらに、ｐＧｒｅｅｎ００２９－ＣａＭＶ３５Ｓ－２０１Ｍ１は、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターの転写制御下にある植物選択可能マーカー遺伝子であるｈｐｔＩＩ遺伝子を含有する。Ｔ領域にＤＮＡ配列を輸送するｐＧｒｅｅｎ０１７９－ＣａＭＶ３５Ｓの構成要素の物理的な配置は次のように示される。
[00239] ＲＢ＞３５ＳＣａＭＶプロモーター：２０１Ｍ１：ＣａＭＶポリＡ＞３５ＳＣａＭＶプロモーター：ｈｐｔＩＩ：ＣａＭＶポリＡ＞ＬＢ
[00240] ＲＢ＞３５ＳＣａＭＶプロモーター：２０１Ｍ２：ＣａＭＶポリＡ＞３５ＳＣａＭＶプロモーター：ｈｐｔＩＩ：ＣａＭＶポリＡ＞ＬＢ
[00241] ＲＢ＞３５ＳＣａＭＶプロモーター：２０１Ｍ３：ＣａＭＶポリＡ＞３５ＳＣａＭＶプロモーター：ｈｐｔＩＩ：ＣａＭＶポリＡ＞ＬＢ
[00242] ＲＢ＞３５ＳＣａＭＶプロモーター：２０１Ｍ４：ＣａＭＶポリＡ＞３５ＳＣａＭＶプロモーター：ｈｐｔＩＩ：ＣａＭＶポリＡ＞ＬＢ
[00243] ＲＢ＞３５ＳＣａＭＶプロモーター：２０１Ｍ５：ＣａＭＶポリＡ＞３５ＳＣａＭＶプロモーター：ｈｐｔＩＩ：ＣａＭＶポリＡ＞ＬＢ
[00244] ＲＢ＞３５ＳＣａＭＶプロモーター：２０１Ｍ６：ＣａＭＶポリＡ＞３５ＳＣａＭＶプロモーター：ｈｐｔＩＩ：ＣａＭＶポリＡ＞ＬＢ
[00245] 組換えベクターｐＧｒｅｅｎ０１７９－ＣａＭＶ３５Ｓ－２０１Ｍ１によるアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）の形質転換
[00246] アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）株ＬＢＡ４４０を、配列番号２に記載のＤＮＡ配列を保有する組換えｐＧｒｅｅｎ０１７９－ ＣａＭＶ３５Ｓ－２０１Ｍ１プラスミドで形質転換した。２００ｎｇのｐＧｒｅｅｎ０１７９－ＣａＭＶ３５Ｓ－２０１Ｍ１プラスミドＤＮＡを、１００μｌのＡ．ツメファシエンス（A. tumefaciens）株ＬＢＡ４４０コンピテント細胞のアリコートに加えた。混合物を氷上で３０分間インキュベートし、液体窒素に２０分間移した後、室温で解凍した。次に、アグロバクテリウム（Agrobacterium）細胞を１ｍｌのＬＢブロスに移し、２００ｒｐｍの水浴シェーカー内で、２８℃で２４時間インキュベートした。細胞懸濁液を、５０μｇ／ｍｌのリファンピシン、３０μｇ／ｍｌのカナマイシン、及び５μｇ／ｍｌのテトラサイクリンを含有するＬＢ寒天培地に均一に塗布した。プレートを２８℃で一晩インキュベートした。形質転換されたアグロバクテリウム（Agrobacterium）細胞をプラスミド抽出及び制限消化法で分析し、陽性のＡ．ツメファシエンス（A. tumefaciens）コロニーを選択し、さらなる使用のために保存した。
実施例５（Ａ）ｐＧｒｅｅｎ０１７９－ＣａＭＶ３５Ｓ－２０１Ｍ１構築物によるアグロバクテリウム（Agrobacterium）を介したイネ形質転換
[00247] アグロバクテリウム（Agrobacterium）は、図１のようにＴ－ＤＮＡを含む組換えベクターｐＧｒｅｅｎ０１７９－ＣａＭＶ３５Ｓ－２０１Ｍ１を使用したイネ形質転換を媒介した。イネの未熟胚を形質転換の外植片として使用し（Hiei, Y. and T. Komari, 2008, Agrobacterium-mediated transformation of rice using immature embryos or calli induced from mature seed. Nat. Protocols., 3:824-834）、Department of Plant Biotechnology, Centre for Plant Molecular Biology and Biotechnology, Tamil Nadu Agricultural University, Coimbatore, Indiaで実施した。イネ形質転換の実験の詳細を以下に説明する。
[00248] イネ形質転換の当業者は、他の植物発現可能な選択可能なマーカー遺伝子が使用される場合、イネ形質転換及び形質転換植物の選択のために、他の方法が利用可能であることを理解するであろう。
植物材料
[00249] Department of Rice, Centre for Plant Breeding and Genetics, Tamil Nadu Agricultural University (TNAU), Coimbatore, Indiaからの地元のエリートイネ品種ＡＳＤ１６を、形質転換実験で使用した。植物材料はＴＮＡＵによって入手された。
形質転換のための未熟イネ胚外植片の調製
[00250] 未熟イネ種子は、受粉後１２日～１４日の間に、形質転換実験のためにＴＮＡＵのイネ育種ステーション（Rice Breeding Station）から収集された。未熟種子の皮を除き、７０％エタノールで１分間処理した後、Tween-20を１滴含有する１．５％次亜塩素酸ナトリウム溶液で処理し、続いて滅菌水で洗浄した。種子からの未熟胚を、顕微鏡（ZEISS, Germany又はLeica, Switzerland）下で滅菌鉗子を使用して無菌的に切除し、０．８％（ｗ／ｖ）寒天プレート上で培養した。１．３ｍｍ～１．８ｍｍのサイズの未熟胚を形質転換に使用した。
未熟胚の前処理
[00251] 未熟胚を４３℃の水浴中で３０分間インキュベートし、直ちに氷浴上で１分間冷却し、１１００ｒｐｍで１０分間、２５℃で遠心分離した。前処理された胚は、さらなる形質転換実験において外植片として使用された。
アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）による外植片の前処理及び共培養
[00252] 共培養の３日前に、実施例４に記載のプラスミドｐＧｒｅｅｎ０１７９－ＣａＭＶ３５Ｓ－２０１Ｍ１を保有するＡ．ツメファシエンス（A. tumefaciens）ＬＢＡ４４０４を、リファンピシン（２０ｍｇ／Ｌ）、カナマイシン（１００ｍｇ／Ｌ）、ストレプトマイシン（５０ｍｇ／Ｌ）及びテトラサイクリン（５ｍｇ／Ｌ）を含む５ｍｌのＹＥＰブロスに接種し、シェーカー内で２８℃、２００ｒｐｍで２～３日間インキュベートした。未熟胚の形質転換時に、白金耳量のＡ．ツメファシエンス（A. tumefaciens）培養物を、１．０ｍｌのＡＡ感染培地（表１、ｐＨ５．２）に、６６０ｎｍで、１．０のＯ．Ｄ．で、１ｍｌあたり１ｘ１０９コロニー形成単位（ｃｆｕ）の密度で懸濁した。
・ＹＥＰ培地組成：
酵母エキス：１０．０ｇ
ペプトン：１０．０ｇ
ＮａＣｌ：５．０ｇ
蒸留水：１０００．０ｍｌまで
寒天：１８．０ｇ
ｐＨ：６．８。
[00253] ＹＥＰブロスの場合、寒天を含まない同じ組成。
[00254] 次に、前処理した未熟胚を、胚盤を上に向けた状態でＮＢ－Ａｓ培地（表２）に移した。上記のＡ．ツメファシエンス（A. tumefaciens）懸濁培養物５μｌを未熟胚のそれぞれに滴下し、２５℃で１５の間インキュベートした。次に、胚を、胚盤を上に向けた状態でＮＢ－Ａｓ培地を含むペトリ皿に移し、２５℃で７日間、暗所でインキュベートした。
カルスの誘導及び選択
[00255] 共培養の７日後、未熟胚からカルスが形成された。このようにして得られたカルスをＣＣＭＣ培地（表３）に移し、連続照明（５，０００ｌｘ）下、３１℃で５日間インキュベートした。５日後、カルスを４つに切断し（カルスのサイズに応じて）、ＣＣＭＣ培地に移し、連続照明（５，０００ｌｘ）下、３１℃で１０日間インキュベートした。カルスを、ハイグロマイシンを含有する選択培地ＣＣＭＣＨ５０（表４）にさらに移し、連続照明（５，０００ｌｘ）下、３１℃で１０日間インキュベートし、ＣＣＭＣＨ５０培地で定期的に選択した。
[00256] ＣＣＭＣＨ５０培地で２ラウンド選択した後、ハイグロマイシンに耐性のあるカルスを再生前培地ＮＢＰＲＣＨ４０（表５）に移し、連続照明（５，０００ｌｘ）下、３１℃で７日間インキュベートした。
[00257] 黄白色のよく増殖したカルスを、さらに再生培地ＲＮＭＨ３０（表６）に移し、連続照明（５，０００ｌｘ）下、３１℃で１４日間インキュベートして苗条を得た。このようにして得られた苗条を３０ｍｇ／ＬのハイグロマイシンＢを含む発根培地１／２ＭＳ（Murashige, T; Skoog, F, 1962,“A Revised Medium for Rapid Growth and Bio Assays with Tobacco Tissue Cultures”. Physiologia Plantarum. 15 (3):473-497）に移し、さらなる発達のために、連続照明（５，０００ｌｘ）下で３１℃で１４日間インキュベートした。次に、十分に生長した再生イネを、３０ｍｇ／ＬのハイグロマイシンＢを含む発根培地を含有する培養ボトルに移し、根が十分に発達したイネ植物を土壌に移し、温室で維持した。したがって、８つのＴ０推定トランスジェニックイネ植物（図２）が、ハイグロマイシン耐性カルスから得られ、イベントごとに再生植物の数が変化した。
実施例５（Ｂ）２０１Ｍ１ ＤＮＡ配列（配列番号２）で形質転換された推定トランスジェニックイネ植物の分子分析
（ｉ）ゲノムＤＮＡの単離
[00258] 全ゲノムＤＮＡは、実施例５（Ａ）から得られた推定トランスジェニックイネ植物及び栽培品種ＡＳＤ１６の対照非トランスジェニック植物の葉組織から抽出された。推定トランスジェニックイネ植物及び非トランスジェニックイネ植物から葉を収集し、３００μｌの抽出緩衝液（１ＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１ＭのＮａＣｌ、２００ｍＭのＥＤＴＡ及び１０％のＳＤＳ）でQIAGEN TissueLyser II（Retsch）を使用してホモジナイズし、１２０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。上清を滅菌微量遠心管に移した。上清にクロロホルム－イソアミルアルコール（２４：１）を加え、１２０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。水層を微量遠心管に移した。これに等量の氷冷イソプロパノールを加え、－２０℃で２０分間維持した。次に、上清を廃棄し、ペレットに３００μｌのエタノールを加えた。１００００ｒｐｍで５分間遠心分離した後、上清を廃棄し、ＤＮＡペレットを１５分間風乾し、続いて４０μｌの０．１Ｘ ＴＥ緩衝液（Ｔｒｉｓ－ｐＨ８．０：１０．０ｍＭ及びＥＤＴＡ－ｐＨ８．０：１．０ｍＭ）に溶解した。Nanodrop 1000（登録商標）分光光度計（Thermo Scientific, USA）を使用して、２６０ｎｍでＯＤを測定することにより、ゲノムＤＮＡの質及び量を評価した。さらに、０．８％のアガロースゲルで電気泳動を実施することにより、ＤＮＡの完全性を評価した。
ＰＣＲ分析
[00259] ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、推定トランスジェニックイネ植物及び非トランスジェニック対照イネ植物のゲノムＤＮＡ（１００ｎｇ）に対して、配列番号８及び配列番号９に記載のプライマーを使用して合成ｃｒｙ２Ａｉ－２０１Ｍ１ ＤＮＡにつき、及び配列番号１２及び配列番号１３に記載のプライマーを使用してｈｐｔＩＩ遺伝子につき、実施された。
[00260] ＰＣＲ条件
９４℃で５分間：１サイクル
９４℃で４５秒間
５８～６２℃で４５秒間、３０サイクル
７２℃で４５秒間
７２℃で１０分間：１サイクル。
[00261] ８つの推定トランスジェニックイネ植物は全て、配列番号２に記載のヌクレオチド配列及びｈｐｔＩＩ遺伝子を有するｃｒｙ２Ａｉ－２０１Ｍ１ ＤＮＡに対して陽性であることがわかった。
（ｉｉ）ＥＬＩＳＡによる推定トランスジェニックイネ（Ｔ０）系列の生化学的分析
[00262] EnviroLogix Quantiplateキット（EnviroLogix Inc., USA）を使用したサンドイッチＥＬＩＳＡは、推定トランスジェニックＰＣＲ陽性イネ植物におけるＣｒｙ２Ａｉタンパク質（配列番号１）の定量的推定に関する製造元の指示に従って実施した。キットとともに提供された陽性及び陰性対照を参照として使用した。この実験には、推定トランスジェニックイネ植物の主分げつから２枚目の葉を使用した。約３０ｍｇの葉組織を５００μｌの抽出緩衝液でホモジナイズし、６，０００ｒｐｍ、４℃で７分間遠心分離し、上清をアッセイに使用した。上清（１００μｌ）を、抗Ｃｒｙ２Ａｉタンパク質抗体で予めコーティングしたプレートにロードした。プレートをパラフィルムで覆い、室温（２４℃±２）で１５分間インキュベートした。酵素複合体（１００μｌ）を各ウェルに加えた。１時間後、ウェルを１Ｘ洗浄緩衝液で十分に洗浄した。基質（１００μｌ）を各ウェルに加え、３０分間インキュベートした。停止液（０．１Ｎ塩酸）を加えることによって反応を停止させた。プレートの光学密度（Ｏ．Ｄ．）は、ブランクとして陰性対照を使用して４５０ｎｍで読み取った。各サンプルは２回複製され、各ウェルは複製と見なされた。
[00263] 異なる濃度の標準物質（キットで入手可能）の光学密度間でグラフをプロットした。Ｃｒｙ２Ａｉタンパク質（配列番号１）の濃度は、そのＯ．Ｄ．値を、グラフ上の対応する濃度レベルに対してプロットすることによって決定された。濃度は以下のように計算された。
Figure 2022531146000001
[00264] サンプル中に存在するＣｒｙ２Ａｉタンパク質（配列番号１）の量は、新鮮な葉組織１グラムあたりのマイクログラムとして表された。Ｃｒｙ２Ａｉ定量的ＥＬＩＳＡキットによってスクリーニングされた８つのＰＣＲ陽性トランスジェニックイネ植物（Ｔ０）は全て、トランスジェニックイネ植物の幼若トランスジェニックイネ葉組織におけるＣｒｙ２Ａｉタンパク質（配列番号１）の発現について陽性であることがわかった。これらのトランスジェニックイネ植物におけるＣｒｙ２Ａｉタンパク質（配列番号１）の発現は、栄養生長期で、新鮮な葉組織に対し、０．０８３～０．７６６μｇ／ｇの範囲にあることがわかった（表Ａ）。
Figure 2022531146000002
（ｉｉｉ）サザンハイブリダイゼーション
[00265] サザンハイブリダイゼーションのために７つのＥＬＩＳＡ陽性イネ植物（ＯＳ－１～ＯＳ－７）が選択された。ＥＬＩＳＡ陽性Ｔ０トランスジェニックイネ植物のゲノムＤＮＡ（各５μｇ）をＮｃｏＩ又はＸｂａＩ又はＢａｍＨＩ制限酵素で消化し、［α－３２Ｐ］－ｄＣＴＰ標識された１０７７ｂｐのｃｒｙ２Ａｉプローブを使用したサザンブロットハイブリダイゼーションに供した。
[00266] ＰＣＲ及びＥＬＩＳＡ陽性のトランスジェニックイネ植物及び非トランスジェニックイネ植物のゲノムＤＮＡを、ＮｃｏＩ制限酵素で、３７℃で１６時間消化した。プラスミドＤＮＡ ｐＧｒｅｅｎ０１７９－ＣａＭＶ３５Ｓ－２０１Ｍ１を陽性対照として使用した。消化されたゲノムＤＮＡサンプル及びプラスミドＤＮＡは、０．８％アガロースゲル中、２０Ｖ、１Ｘ ＴＡＥ緩衝液で一晩分離され、ＵＶトランスイルミネーター下での臭化エチジウム染色で視覚化され、ゲルドキュメンテーションシステム（ＳＹＮＧＥＮＥ）で記録された。
[00267] 制限消化され電気泳動的に分離されたゲノムＤＮＡは、ゲルを２倍量の変性溶液に３０分間穏やかに撹拌しながら浸漬することにより、変性させた。ゲルは、穏やかに撹拌される２倍量の中和溶液に３０分間浸漬することにより、中和に供された。ゲルを滅菌脱イオン水で短時間洗浄し、標準プロトコルに従って１６時間、２０Ｘ ＳＳＣ緩衝液中で上向きのキャピラリートランスファーにより、ＤＮＡを正に帯電したナイロン膜（Sigma）に移した。ゲノムＤＮＡが完全に転写された後、ナイロン膜を２Ｘ ＳＳＣ緩衝液で短時間洗浄し、５分間風乾した。膜をＵＶ架橋器（UV Stratalinker（登録商標）1800 Stratagene, CA, USA）中、１１００μＪで１分間曝露することにより、ＤＮＡを架橋した。架橋膜をビニール袋に密封し、サザンブロットハイブリダイゼーションに使用するまで４℃で保存した。
・変性溶液：
ＮａＣｌ：１Ｍ
ＮａＯＨ：０．５Ｎ
・中和溶液：
ＮａＣｌ：１．５Ｍ
トリス：０．５Ｍ
・２０Ｘ ＳＳＣ：
ＮａＣｌ：３．０Ｍ
クエン酸ナトリウム：０．３Ｍ
ｐＨ：濃塩酸で７．０。
２０ｘ ＳＳＣ溶液は、次のように希釈できる。
Figure 2022531146000003
プローブの調製
[00268] バイナリーベクターから増幅され、ゲル抽出ミニプレップキット（Bio Basic Inc., Canada）を使用して精製した約１００ｎｇの１０７７ｂｐのｃｒｙ２Ａｉ－２０１Ｍ１ ＤＮＡ断片は、［α－ ３２Ｐ］－ｄＣＴＰで放射性標識され、標識プローブとして使用した。微量遠心管で４μｌのテンプレートＤＮＡ（ｃｒｙ２Ａｉ－２０１Ｍ１ ＤＮＡ）を１０μｌのランダムプライマー（DecaLabel DNA Labeling Kit, Thermo Fisher Scientific Inc. USA）と混合した。滅菌蒸留水で体積を４０μｌにし、沸騰水浴上で５分間加熱して変性させ、氷上で冷却した。変性したＤＮＡに、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、５μｌの［α－ ３２Ｐ］－ｄＣＴＰ（５０μＣｉ）及び１μｌのＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片を含有する５μｌの標識混合物を加え、水浴中、３７℃で１０分間インキュベートした。１μｌの０．５Ｍ ＥＤＴＡを添加して反応を停止し、沸騰水浴中で４分間インキュベートし、氷上に４～５分間移した。
[00269] プローブとのプレハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーション
[00270] 上記のＤＮＡ架橋膜を、３０ｍｌのハイブリダイゼーション緩衝液を含むハイブリダイゼーションボトル中に静置した。ボトルをしっかりと閉め、プレハイブリダイゼーション処理のために６５℃のオーブンに４５分～１時間入れた。
[00271] ハイブリダイゼーション緩衝液をボトルから注ぎ出し、変性［α－ ３２Ｐ］－ｄＣＴＰ標識ＤＮＡプローブを含有する３０ｍｌのハイブリダイゼーション溶液（６５℃に維持）と交換した。ハイブリダイゼーション溶液の入ったボトルをしっかりと閉め、６５℃のオーブンに１６時間入れた。
・ハイブリダイゼーション溶液：
Ｎａ２ＨＰＯ４、ｐＨ７．２：０．５Ｍ
ＳＤＳ：７％（Ｗ／Ｖ）
ＥＤＴＡ、ｐＨ７．２：１ｍＭ。
[00272] ハイブリダイゼーション緩衝液をボトルから注ぎ出した。洗浄Ｉ溶液を加え、ボトルをゆっくり回転するプラットフォーム上の６５℃のオーブンに１０分間入れた。１０分後、洗浄Ｉ溶液を３０ｍｌの洗浄ＩＩ溶液と交換し、穏やかに撹拌しながら６５℃で５～１０分間インキュベートした。次に、洗浄ＩＩ溶液を注ぎ出し、Gregor-Mullerカウンターを使用して膜内の放射能カウントをチェックした。カウントに応じて、３０ｍｌの洗浄ＩＩＩをボトルに加え、穏やかに撹拌しながら６５℃で３０秒～１分間インキュベートした。続いて、洗浄ＩＩＩ溶液を除去し、膜をWhatman No.1濾紙上で、室温で５～１０分間乾燥させ、暗室でシグナル増強スクリーン（Hyper cassette（登録商標）、Amersham, USA）中、－８０℃で２日間、Ｘ線フィルム（Kodak XAR）に曝露した。
[00273] ２日間の露光後、Ｘ線フィルムを暗室で取り出し、現像液に１分間浸漬した後、水に１分間浸漬した。最後に、Ｘ線フィルムを定着液に２分間浸漬し、続いて水で１～２分間すすぎ、次に風乾した。
・洗浄液
洗浄Ｉ：３Ｘ ＳＳＣ＋０．１％ＳＤＳ
洗浄ＩＩ：０．５Ｘ ＳＳＣ＋０．１％ＳＤＳ
洗浄ＩＩＩ：０．１Ｘ ＳＳＣ＋０．１％ＳＤＳ。
・現像液：
[00274] パックＡの内容物１３．２ｇを８００ｍｌの蒸留水に溶解し、完全に溶解した後、パックＢの成分８９ｇを加え、ゆっくりと撹拌して溶解した。完全に溶解した後、容量を１０００ｍｌにし、琥珀色のボトルに保存した。
・定着液：
[00275] ２６８ｇの定着液をゆっくりと撹拌することにより８００ｍｌの蒸留水に溶解し、完全な溶解量を１０００ｍｌとした後、カントリー（country）ろ紙で濾過し、琥珀色のボトルに保存した。
[00276] ７つのＥＬＩＳＡ陽性トランスジェニックイネイベントは全て、異なるサイズのハイブリダイゼーションシグナルを示し、これは、イネゲノムへの導入遺伝子の組み込みを示した。トランスジェニックイネ植物ＯＳ－６は、単一遺伝子座にｃｒｙ２Ａｉ遺伝子の組み込みを示した。ハイブリダイゼーションシグナルは陽性対照でも見られるが、非トランスジェニックイネ対照（ＡＳＤ１６）植物はハイブリダイゼーションシグナルを示さなかった。
（ｉｖ）ｃｒｙ２Ａｉトランスジェニックイネ（Ｔ２）系列ＯＳ ６の世代進行
[00277] トランスジェニックイネ植物ＯＳ－ ６の３０個のＴ１種子をpro-trayに播種した。２３の種子を発芽させ、１５日齢の実生を鉢に移して温室に植えた。トランスジェニックイネ植物ＯＳ ６の２３のＴ１子孫のうち２０が、定量的ＥＬＩＳＡによってｃｒｙ２Ａｉ遺伝子を発現することが見出された。トランスジェニックイネ植物－ＯＳ ６のＴ１植物で発現されたＣｒｙ２Ａタンパク質（配列番号１）の濃度は、新鮮な葉組織に対し、５５ＤＡＳで０．１９２～０．５８８μｇ／ｇ、８４ＤＡＳで０．０８２～０．３８７μｇ／ｇの範囲であった。ＮｃｏＩ酵素を用いたトランスジェニックイネ植物－ＯＳ ６の６つのＴ１植物のサザンハイブリダイゼーション分析により、Ｔ０トランスジェニックイネ植物と同様のｃｒｙ２ＡｉＭ１（配列番号２）の単一遺伝子座統合が明らかになった。
[00278] トランスジェニックＴ１イネ植物、すなわちＯＳ ６－８及びＯＳ ６－２０からの５０の種子を播種して、Ｔ２トランスジェニックイネ植物を得た。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して、ＯＳ ６－８からの合計８３のＴ２植物４６、及びＯＳ ６－２０からの３７を、ｃｒｙ２ＡｉＭ１ ＤＮＡ（配列番号２）の存在についてスクリーニングした。ＰＣＲにより、８３のトランスジェニックＴ２イネ植物全てに前記ＤＮＡが存在することが明らかになった。代表的な１０のＴ２植物の定量的ＥＬＩＳＡ結果は、播種後日数（ＤＡＳ）７７日で、新鮮な葉組織に対し０．４３３～０．８５７μｇ／ｇのＣｒｙ２Ａｉタンパク質（配列番号２）の濃度を示した（表Ｂ）。
Figure 2022531146000004
実施例５（Ｃ）昆虫バイオアッセイ
イッテンオオメイガに対する切離茎片バイオアッセイ
[00279] イッテンオオメイガ（rice yellow stem borer）（イッテンオオメイガ（Scirpophaga incertulas））の卵塊は、水田（Paddy Breeding Station, TNAU）から直接収集され、相対湿度６０％、２５℃±１で、孵化のために実験室でインキュベートされた。或いは、イッテンオオメイガの成虫の蛾を圃場で収集し、産卵のために、感受性変種ＴＮ１の３０日齢のイネ実生を含む昆虫ケージに放した。次に、葉上の卵をケージから収集し、孵化のために相対湿度６０％、２５℃±１で、微量遠心管で卵と一緒に葉を維持することによって実験室でインキュベートした。卵塊から孵化した新生虫を昆虫バイオアッセイに供した。
[00280] ＥＬＩＳＡ陽性トランスジェニックイネ植物の茎を６つに切り（長さ約５ｃｍ）、各擬茎片を別々のプラスチックペトリ皿の湿ったろ紙上に置き、各擬茎にイッテンオオメイガの５匹の新生幼虫を放った（Chakraborty et al., 2016）。対照は、非トランスジェニックイネＡＳＤ１６から収集された擬茎を使用して維持された。ペトリ皿は、幼虫が皿から逃げるのを防ぐために薄膜で覆われ、相対湿度６０％で２５℃±１に維持された。６日後、細い刃を使用して擬茎片を静かに切離し、トランスジェニック植物と対照植物で幼虫の死亡率を評価した。Ｔ２イネ植物のイッテンオオメイガの新生幼虫を使用した切離茎片バイオアッセイは、８０～８５％の範囲の幼虫死亡率を示した。対照植物には幼虫の死亡はなかった。対照の生存幼虫は、茎組織の内部の大部分を消費し、６日後に茎片に多くの糞粒を伴う穴を開けた（図５）。
[00281] アワヨトウに対するバイオアッセイ
アワヨトウ（rice armyworm）（アワヨトウ（Spodoptera mauritia））の卵塊は、水田（Paddy breeding station, TNAU）から直接収集され、相対湿度６０％、２５℃±１で、孵化のために実験室でインキュベートされた。卵塊から孵化した新生虫を昆虫バイオアッセイに供した。
ＥＬＩＳＡ陽性トランスジェニックイネ植物の葉片及び対応する対照系列を使用したアワヨトウに対するバイオアッセイ及びその後の分析を実施した。
アワヨトウの新生幼虫を用いた切離葉片バイオアッセイは、Ｔ２イネ植物における幼虫の死亡率を示した。対照植物では幼虫の死亡はなく、葉組織の大部分は生存幼虫によって６日間にわたって消費された（図６）。
アワヨトウ（army worm）（アワヨトウ（Spodoptera mauritia））の新生虫を使用した昆虫バイオアッセイ研究では、試験した１０のＴ２植物のうち８つで１００％の死亡率が明らかになり、他の２つの植物では９０％と９５％の死亡率であった（表Ｂ）。
実施例６（Ａ）：アグロバクテリウム（Agrobacterium）を介したトマト形質転換
[00282] アグロバクテリウム（Agrobacterium）は、図３のようにＴ－ＤＮＡ構築物を含む組換えベクターｐＧｒｅｅｎ００２９－ＣａＭＶ３５Ｓ－２０１Ｍ１を使用したイネ形質転換を媒介した。トマトの子葉外植片を形質転換のための外植片として使用した。
[00283] アグロバクテリウム（Agrobacterium）を介したトマト形質転換は、Department of Plant Biotechnology, Centre for Plant Molecular Biology and Biotechnology, Tamil Nadu Agricultural University, Coimbatore, Indiaで実施した。トマト形質転換の実験の詳細を以下に説明する。
[00284] トマト形質転換の当業者は、他の植物発現可能な選択可能なマーカー遺伝子が使用される場合、トマト形質転換及び形質転換植物の選択のために、他の方法が利用可能であることを理解するであろう。
植物リソース
[00285] トマトｃｖ．ＰＫＭ１の種子は、Tamil Nadu Agricultural University (TNAU), PN Pudur, Coimbatore, Tamil Nadu- 641003, Indiaによって、Horticultural College and Research Institute, Coimbatore, Indiaから得た。トマト種子は、Department of Plant Biotechnology, Centre for Plant Molecular Biology and Biotechnology, TNAUによって入手された。
インビトロでの種子の発芽及び前培養
[00286] トマト種子ｃｖ．ＰＫＭ１を滅菌蒸留水で３回洗浄し、７０％エタノールで５分間処理し、Tween 20を含む４％次亜塩素酸ナトリウム溶液で５～７分間処理した。種子をすすぎ、さらに滅菌蒸留水で洗浄し、続いて滅菌ティッシュペーパー上で風乾した。滅菌した種子を、暗所で、半強度ＭＳ培地（上記のとおり）で８～１０日間発芽させた後、植物成長チャンバー内、２５℃で、冷白色蛍光管光（１１０～１３０ｎＭ／ｍ２／ｓ強度）を使用した１６時間の光周期、及び８時間の暗闇のサイクルを行った。
[00287] インビトロで成長させた８～１０日齢の実生からの子葉外植片を切離し、ゼアチン（１．０ｍｇ／ｌ）を含む改変ＭＳ培地を含む前培養培地で２日間培養した後、共培養した。
・改変ＭＳ培地組成／ｌ
改変ＭＳ培地粉末（PT025-Himedia, Mumbai）：４．２ｇ
スクロース：３０．０ｇ
寒天：８．０ｇ
蒸留水：１０００ｍｌ
ｐＨ：５．８。
共培養、選択及び植物体再生
[00288] ２日後、前培養培地からの外植片を、プラスミドｐＧｒｅｅｎ００２９－ＣａＭＶ３５Ｓ－２０１Ｍ１を有するＡ．ツメファシエンス（A. tumefaciens）ＬＢＡ４４０４の懸濁培養物で１０～１２分間感染させた。滅菌ろ紙を用いたブロット乾燥により過剰な懸濁培養物を除去し、改変ＭＳ培地＋ゼアチン（１．０ｍｇ／ｌ）＋アセトシリンゴン（１００μＭ）を含む共培養培地に移した。２６℃の暗所で４８時間共培養した後、外植片を滅菌蒸留水及び２５０ｍｇ／ｌのセフォタキシムを含む水溶液で洗浄した後、滅菌蒸留水で２回洗浄した。共培養した外植片を滅菌ろ紙上でブロット乾燥し、改変ＭＳ培地＋ゼアチン（１．０ｍｇ／ｌ）＋カナマイシン（５０ｍｇ／ｌ）＋セフォタキシム（２５０ｍｇ／ｌ）を含む選択培地で培養した。外植片を同じ培地で１５～２０日間隔で３回継代培養した。得られた十分に発達した苗条を、半分の強度の１．０ＭＳ＋ＩＢＡ（１ｍｇ／ｌ）＋カナマイシン（３０ｍｇ／ｌ）を含む発根培地に移した（図４）。
[00289] 大量の発根後（１５～２０日）、小植物を組織培養ボトルから注意深く取り出し、硬化混合物（赤土：黒土：ミミズ堆肥を１：１：１の比率で）を含有する小さい紙コップで硬化させ、７～８日間２５±２℃に維持し、その後温室に移した。
実施例６（Ｂ）：推定トランスジェニックトマト植物の分子的及び生化学的分析
[00290] 推定トランスジェニックトマト植物を、ＰＣＲ分析によってｃｒｙ２Ａｉ ＤＮＡ ２０１Ｍ１（配列番号２）断片の存在についてスクリーニングし、タンパク質発現を、ＥＬＩＳＡを使用して分析した。
トマトゲノムＤＮＡの単離及びＰＣＲ分析
[00291] ゲノムＤＮＡは、推定トマトトランスジェニック植物及び非形質転換トマト植物（陰性対照として）の葉から抽出された。ＤＮＡ単離については、上記のプロセスに従った。
[00292] 単離されたゲノムＤＮＡを用いて上記のＰＣＲを実施して、配列番号８及び配列番号９に記載のプライマーを使用して、ｃｒｙ２Ａｉ ＤＮＡ断片（２０１Ｍ１）の存在を確認した。２９の推定トランスジェニックトマト植物（Ｔ０）のうち２３が、ｃｒｙ２Ａｉ ＤＮＡ（２０１Ｍ１）断片の存在について陽性であることが確認された。
[00293] 推定トマト形質転換体（Ｔ０）におけるｎｐｔＩＩ遺伝子の存在をチェックするために、ｎｐｔＩＩ遺伝子（選択可能なマーカー遺伝子カナマイシン耐性）の増幅のために配列番号１０及び配列番号１１に記載のプライマーを使用してＰＣＲ分析を行った。分析は、ｎｐｔＩＩ遺伝子の増幅を示した。
定量的ＥＬＩＳＡ及びサザン分析によるトマトのＴ０トランスジェニック植物のスクリーニング
[00294] ２３のＰＣＲ陽性トマト植物のうち１７がＥＬＩＳＡ陽性であることがわかり（Envirologix Cry2Aキット使用）、栄養生長期において、Ｃｒｙ２Ａタンパク質の濃度は、新鮮な葉組織に対し０．００６～０．１５９μｇ／ｇの範囲であった。
[00295] ＸｂａＩ酵素で消化されたＤＮＡを使用して、トマトの５つのＥＬＩＳＡ陽性イベントについてサザンハイブリダイゼーション分析を実施した。サザンの結果により、Ｔ０植物における導入遺伝子の１つから２つの遺伝子座の統合が明らかになり、イベントＳＬ－３４は単一遺伝子座におけるｃｒｙ２Ａｉ遺伝子の統合を示した。
ｃｒｙ２ＡｉトランスジェニックトマトイベントＳＬ－３４の世代進行
[00296] トマトイベントＳＬ－３４の１つの果実からの１８の種子全てを、発芽のために半分の強度のＭＳ培地上に置いた。１２日齢の実生をハードニングのために移した。発芽した１６の実生から、１２のＴ１子孫が温室で定着し、ＰＣＲによってスクリーニングされた。１２のＴ１子孫のうち１１がＰＣＲで陽性であることがわかり、１１の子孫全てがＥＬＩＳＡによってｃｒｙ２Ａｉ遺伝子を発現することがわかった。１１のＴ１植物で発現したＣｒｙ２Ａｉタンパク質の濃度は、８２ＤＡＳで、新鮮な葉組織に対し０．３２０～０．６９５μｇ／ｇの範囲であった（表Ｃ）。５つのＴ１植物のサザンハイブリダイゼーション分析により、Ｔ０植物と同様のｃｒｙ２Ａｉ遺伝子の単一遺伝子座統合が明らかになった。
Figure 2022531146000005
[00297] Ｔ１植物ＳＬ－３４－１１の１つの果実の１９の種子全てから、１４のＴ２子孫が温室内に定着した。１４のＴ２子孫は全て、ＥＬＩＳＡによって定量化されるｃｒｙ２Ａｉ遺伝子を発現することがわかった。Ｔ２トランスジェニック植物で発現したＣｒｙ２Ａｉタンパク質の濃度は、８０ＤＡＳで、新鮮な葉組織に対し、０．５４０～０．７８３μｇ／ｇ、１０４ＤＡＳで０．２８７～０．５４７μｇ／ｇの範囲であった。
[00298] Ｔ２植物ＳＬ－３４－１１－１の１つの果実の３３の種子全てから、２６の植物が温室内に定着した。同じ植物（ＳＬ－３４－１１－１）の別の果実の４２の種子全てから、３７の実生が温室内に定着した。合計で、６３のＴ３子孫が、同じＴ２植物の２つの果実の７５の種子全てから定着した。６３のＴ３植物は全て、ＰＣＲ及び定性的ＥＬＩＳＡによるスクリーニングで陽性であることがわかった。これは、Ｔ２植物ＳＬ－３４－１１－１のホモ接合性を示唆していた。Ｃｒｙ２Ａｉタンパク質の濃度は、３７のＴ３トランスジェニック植物で定量的ＥＬＩＳＡによって推定され、４２ＤＡＳで、新鮮な葉組織に対して０．３２９～０．８８１μｇ／ｇの範囲であった。１１９及び１２８ＤＡＳ中の４つのＴ３子孫の未熟及び成熟果実におけるＣｒｙ２Ａタンパク質の濃度は、新鮮な果実組織に対し約０．１１８～０．３３０μｇ／ｇであることがわかった。
実施例７：昆虫バイオアッセイ
オオタバコガ（H. armigera）に対するｃｒｙ２Ａｉトランスジェニックトマト植物の昆虫バイオアッセイ
[00299] ＥＬＩＳＡによってＣｒｙ２Ａｉタンパク質の存在が確認されたトマト形質転換体をバイオアッセイに供して、オオタバコガ（H. armigera）に対するそれらの耐性を評価した。実験室条件下でのｃｒｙ２Ａトランスジェニックトマト植物における耐虫性の程度を決定するために、葉片バイオアッセイを実施した。トランスジェニック植物及び対照（形質転換されていない）トマト植物の上から２番目の葉を生殖段階で切除し、葉片バイオアッセイに使用した。湿ったろ紙を敷いた滅菌ペトリ皿上に葉片を置いた。オオタバコガ（H. armigera）の新生幼虫１匹が、ラクダ細毛ブラシを使用してろ紙上に重ねられた各葉片上に放たれた。昆虫が放たれた後、プレートをクリンフィルムで包み、暗所に置いた。各処理は、複製ごとに１０枚のプレートで２回複製された。２６～２８℃で６０％相対湿度の実験条件が維持された。幼虫の死亡率及び葉面積の損傷は、４８時間後から２４時間間隔で６日間記録された。
[00300] バイオアッセイの結果は、１２のＥＬＩＳＡ陽性Ｔ０植物のうち５つでオオタバコガ（H. armigera）の１００％の死亡率を示した。ｃｒｙ２ＡｉトランスジェニックトマトイベントＳＬ－３４のＴ１、Ｔ２、及びＴ３子孫の葉片でオオタバコガ（H. armigera）の新生幼虫を使用した昆虫バイオアッセイでも、試験した全てのトランスジェニック植物で１００％の死亡率が示された（図７）。対照植物の葉片には死亡はなかった。
[00301] 前述の発明は、理解を明確にするために例示及び例としてある程度詳細に説明されてきたが、特定の変更及び改変が本開示の範囲内で実施され得ることは明らかであろう。
Figure 2022531146000006
Figure 2022531146000007
[00302] １０ＸＮ６主塩（major salt）、１００ＸＦｅＥＤＴＡ、１００ＸＢ５微量塩（minor salt）、１００Ｘビタミン、１００ｍｇＬ－１ ２，４－Ｄ、１００ｍｇＬ－１ ＮＡＡ、１００ｍｇＬ－１ ６ＢＡを別々に調製し、必要量以上のストック溶液を、スクロース、グルコース、プロリン及びビタミンアッセイのカザミノ酸と混合し、ｐＨを５．２に調整した後、必要量のアガロースを加え、滅菌し、滅菌後、滅菌条件下でストックから必要量のアセトシリンゴンを加える。
Figure 2022531146000008
[00303] １０ＸＣＣ主塩（major salt）、１００ＸＦｅＥＤＴＡ、１００ＸＣＣ微量塩（minor salt）、１００ＸＣＣビタミン、１００ｍｇＬ－１ ２，４－Ｄ、１００ｍｇＬ－１ ＮＡＡ、１００ｍｇＬ－１ ６ＢＡ、２５０ｇＬ－１セフォタキシムを別々に調製し、必要量以上のストック溶液を、マルトース、マンニトール、プロリン及びビタミンアッセイのカザミノ酸と混合する。ｐＨを５．８に調整した後、必要量のゲルライト（gelrite）を加え、滅菌する。滅菌後、滅菌条件下でストックから必要量のセフォタキシムを加える。
Figure 2022531146000009
[00304] １０ＸＣＣ主塩（major salt）、１００ＸＦｅＥＤＴＡ、１００ＸＣＣ微量塩（minor salt）、１００ＸＣＣビタミン、１００ｍｇＬ－１ ２，４－Ｄ、１００ｍｇＬ－１ ＮＡＡ、１００ｍｇＬ－１ ６ＢＡ、５０ｇＬ－１ハイグロマイシンＢを別々に調製し、必要量以上のストック溶液を、マルトース、マンニトール、プロリン及びビタミンアッセイのカザミノ酸と混合する。ｐＨを５．８に調整した後、必要量のアガロースを加え、滅菌する。滅菌後、必要量の５０ｇのＬ－１ハイグロマイシンＢをストックから加える。
Figure 2022531146000010
[00305] １０ＸＮ６主塩（major salt）、１００ＸＦｅＥＤＴＡ、１００ＸＢ５微量塩（minor salt）、１００Ｘビタミン、１００ｍｇＬ－１ ２，４－Ｄ、１００ｍｇＬ－１ ＮＡＡ、１００ｍｇＬ－１ ６ＢＡ、３０ｇＬ－１グルタミン、２５０ｇＬ－１セフォタキシム、５０ｇＬ－１ハイグロマイシンＢを別々に調製し、必要量以上のストックを、マルトース、プロリン及びビタミンアッセイのカザミノ酸と混合し、ｐＨを５．８に調整した後、必要量のアガロースを加え、滅菌し、滅菌後、滅菌条件下でストックから必要量のグルタミン、セフォタキシム及びハイグロマイシンＢを加える。
Figure 2022531146000011
[00306] １０ＸＮ６主塩（major salt）、１００ＸＦｅＥＤＴＡ、１００ＸＢ５微量塩（minor salt）、１００Ｘビタミン、１００ｍｇＬ－１ ＮＡＡ、１００ｍｇＬ－１ ６ＢＡ、３０ｇＬ－１グルタミン、２５０ｇＬ－１セフォタキシム、５０ｇＬ－１ハイグロマイシンＢを別々に調製し、必要量以上のストックを、マルトース、プロリン及びビタミンアッセイのカザミノ酸と混合し、ｐＨを５．８に調整した後、必要量のアガロースを加え、滅菌し、滅菌後、滅菌条件下でストックから必要量のグルタミン、セフォタキシム及びハイグロマイシンＢを加える。

Claims (23)

  1. 配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするコドン最適化合成ヌクレオチド配列であって、前記ヌクレオチド配列が、
    ａ．配列番号２に記載の配列、若しくはそれに相補的なヌクレオチド配列、又は
    ｂ．配列番号２の２５１～４０２位及び／又は１４５６～１６２８に記載のヌクレオチド配列、若しくはそれに相補的な配列の、少なくとも１０ヌクレオチドに特異的にハイブリダイズするヌクレオチド配列
    である、コドン最適化合成ヌクレオチド配列。
  2. 配列番号２に記載のヌクレオチド配列に特異的にハイブリダイズする前記ヌクレオチド配列が、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、及び配列番号７からなる群から選択される、請求項１に記載のコドン最適化合成ヌクレオチド配列。
  3. 前記ヌクレオチド配列が、異種調節要素に作動可能に連結されている、請求項１に記載のコドン最適化合成ヌクレオチド配列を含む組換えＤＮＡ。
  4. 前記コドン最適化合成ヌクレオチド配列が、任意選択により、選択可能なマーカー遺伝子、レポーター遺伝子、又はそれらの組み合わせを含む、請求項３に記載の組換えＤＮＡ。
  5. 前記コドン最適化合成ヌクレオチド配列が、任意選択により、液胞、ミトコンドリア、葉緑体、色素体を標的とするため、又は分泌のための、標的化又は輸送ペプチドをコードするＤＮＡ配列を含む、請求項３に記載の組換えＤＮＡ。
  6. ５’非翻訳配列、配列番号１のアミノ酸配列又はその殺虫性部分を含む殺虫性Ｃｒｙ２Ａｉタンパク質をコードするコード配列、及び３’非翻訳領域を含む、目的の殺虫性タンパク質を発現するためのＤＮＡ構築物であって、前記５’非翻訳配列が、植物細胞において機能的なプロモーターを含み、前記コード配列が、請求項１に記載のコドン最適化合成ヌクレオチド配列であり、前記３’非翻訳配列が、転写終結配列及びポリアデニル化シグナルを含む、ＤＮＡ構築物。
  7. 請求項３に記載の組換えＤＮＡ、又は請求項６に記載のＤＮＡ構築物を含む、プラスミドベクター。
  8. 請求項１に記載のコドン最適化合成ヌクレオチド配列を含む、宿主細胞。
  9. 前記宿主細胞が、植物、細菌、ウイルス、真菌、又は酵母細胞である、請求項８に記載の宿主細胞。
  10. 前記細菌細胞が、アグロバクテリウム（Agrobacterium）又は大腸菌（E. coli）である、請求項９に記載の宿主細胞。
  11. （ａ）請求項１に記載のコドン最適化合成ヌクレオチド配列を植物細胞に挿入することであって、前記ヌクレオチド配列が、（ｉ）植物細胞で機能するプロモーター及び（ｉｉ）ターミネーターに作動可能に連結されていること、
    （ｂ）ステップ（ａ）の植物細胞から形質転換植物細胞を得ることであって、前記形質転換植物細胞が、請求項１に記載の前記コドン最適化合成ヌクレオチド配列を含むこと、並びに
    （ｃ）ステップ（ｂ）の前記形質転換植物細胞からトランスジェニック植物を産生することであって、前記トランスジェニック植物が、請求項１に記載の前記コドン最適化合成ヌクレオチド配列を含むこと
    を含む、植物に耐虫性を付与するための方法。
  12. 請求項１１に記載の方法によって得られる、トランスジェニック植物。
  13. 請求項１に記載のコドン最適化合成ヌクレオチド配列を含む、トランスジェニック植物。
  14. 前記植物が、イネ、小麦、トウモロコシ、ソルガム、オート麦、キビ、マメ科植物、ワタ、トマト、ナス、キャベツ、カリフラワー、ブロッコリー、アブラナ属（Brassica sp.）、マメ、エンドウマメ、キマメ、ジャガイモ、コショウ、ククルビタ、レタス、サツマイモカノーラ、大豆、アルファルファ、ピーナッツ、ヒマワリ、ベニバナ、タバコ、サトウキビ、キャッサバ、コーヒー、パイナップル、柑橘類、ココア、茶、バナナ及びメロンからなる群から選択される、請求項１２又は１３に記載のトランスジェニック植物。
  15. 種子又は子孫が、請求項１に記載のコドン最適化合成ヌクレオチド配列を含む、請求項１２又は１３に記載のトランスジェニック植物から得られる、組織、種子又は子孫。
  16. 検出可能な量の請求項１に記載の前記コドン最適化合成ヌクレオチド配列を含む、請求項１５に記載の組織又は種子又は子孫に由来する生物学的サンプル。
  17. 検出可能な量の請求項１に記載の前記コドン最適化合成ヌクレオチド配列を含む、請求項１２又は１３に記載のトランスジェニック植物に由来するコモディティー製品。
  18. 配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するＣｒｙ２Ａｉタンパク質をコードする、請求項１に記載のコドン最適化合成ヌクレオチド配列を含むバチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）を含む、組成物。
  19. 前記組成物が、任意選択により、同じ害虫に対して毒性であるが、殺虫性タンパク質とは異なるモードの殺虫活性を示す追加の殺虫剤を含む、請求項１８に記載の組成物。
  20. 前記殺虫剤が、バチルス（Bacillus）毒素、ゼノラブダス（Xenorhabdus）毒素、フォトラブダス（Photorhabdus）毒素、及び前記害虫の１つ以上の必須遺伝子の抑制に特異的なｄｓＲＮＡからなる群から選択される、請求項１９に記載の組成物。
  21. 作物植物における昆虫の侵入を制御し、耐虫性管理を提供する方法であって、前記作物植物を請求項１８に記載の殺虫有効量の組成物と接触させることを含む、方法。
  22. 耐虫性トランスジェニック植物の産生のための、請求項１に記載のコドン最適化合成ヌクレオチド配列、請求項６に記載のＤＮＡ構築物、又は請求項７に記載のプラスミドの使用。
  23. 殺虫性組成物の産生のための、請求項１に記載のコドン最適化合成ヌクレオチド配列の使用であって、前記組成物が、前記ヌクレオチド配列を含むバチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）細胞を含む、使用。
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