EP1771567A2 - Verfahren zur herstellung von transgenen pflanzen mit erh\hter pathogenresistenz durch ver[nderung des gehalts und/oder der aktivit[t von actin-depolymerisierenden faktoren - Google Patents

Verfahren zur herstellung von transgenen pflanzen mit erh\hter pathogenresistenz durch ver[nderung des gehalts und/oder der aktivit[t von actin-depolymerisierenden faktoren

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Publication number
EP1771567A2
EP1771567A2 EP05762476A EP05762476A EP1771567A2 EP 1771567 A2 EP1771567 A2 EP 1771567A2 EP 05762476 A EP05762476 A EP 05762476A EP 05762476 A EP05762476 A EP 05762476A EP 1771567 A2 EP1771567 A2 EP 1771567A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
plant
adf
sequence
sequences
nucleic acid
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP05762476A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Ralph Panstruga
Marco Miklis
Paul Schulze-Lefert
Markus Frank
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
BASF Plant Science GmbH
Original Assignee
Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
BASF Plant Science GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV, BASF Plant Science GmbH filed Critical Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Publication of EP1771567A2 publication Critical patent/EP1771567A2/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8279—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance

Definitions

  • the present invention relates to a method for the production of transgenic plants and / or plant cells having an increased pathogen resistance, wherein the transgenic plants or plant cells have a content that is altered in comparison to the wild type and / or an altered activity on at least one actin depolymerizing factor (ADF). exhibit.
  • ADF actin depolymerizing factor
  • the present invention also relates to the use of nucleic acids encoding at least one ADF for the production of transgenic plants or plant cells having an increased pathogen resistance. Furthermore, the present invention relates to nucleic acid sequences encoding an ADF.
  • Plant diseases caused by various pathogens such as viruses, bacteria and fungi can lead to significant yield losses in the cultivation of crops.
  • fungicides are widely used in agricultural production to control fungal diseases. Despite such controls, a significant portion of the potential yield due to disease is lost.
  • crops with a natural resistance to important fungal pathogens in the context of integrated pest management.
  • genetic engineering approaches play a major role, for example by introducing external resistance genes or by the manipulation of endogenous gene expression in plants targeted resistances in important crops should be introduced.
  • non-host resistance describes the observation that an entire plant species is resistant to a specific pathogen. This hitherto unknown phenomenon is probably due to structural or chemical properties of the plant species. These may be, for example, the thickness of the coticle, the presence of inhibitory substances or the limited availability of nutrients.
  • certain plant species or different cultivars of a species will be resistant or susceptible to a particular pathogen, depending on their genotype.
  • the different resistance mechanisms that are responsible for the resistance or susceptibility of a plant species or their cultivars to certain pathogens are exemplified for the mildew ⁇ Blumeria graminis), which infects several different types of grasses.
  • the powdery mildew fungus as a species comprises several formae speciales depending on whether the respective powdery mildew fungus e.g. Wheat or barley.
  • the respective powdery mildew fungus e.g. Wheat or barley.
  • the respective powdery mildew fungus e.g. Wheat or barley.
  • Blumeria graminis f. sp. hordei In the case of infestation of barley is Blumeria graminis f. sp. hordei, while the infestation of wheat by Blumeria graminis f. sp. tritici acts.
  • different races or pathotypes can be identified within the different formae speciales, to which different cultivars of the host species have a different resistance.
  • Blumeria graminisf. sp. hordei exclusively affects the epidermis cell layer of barley leaves.
  • the fungus penetrates into the plant cell mechanically and enzymatically through the cell wall by means of a penetration peg, which is conidia, i. Asexually formed spores act.
  • the successful infestation of barley leaves is achieved when the haustorium, which is the fungal feeding organ, has formed.
  • the first mechanism is based on the so-called "gene for gene” concept. In this mechanism, resistance is achieved by a dominant resistance gene rendering the plants resistant only to those fungal isolates carrying the corresponding avirulence gene. In most cases, this so-called race-specific resistance, in which a barley cultivar is resistant only to selected mildew isolates, is characterized by the hypersensitive response (HR), i. the host cells of the infection site die off (Heitefuss, R., vide supra).
  • HR hypersensitive response
  • the second mechanism confers broad-spectrum resistance to all known isolates of a formae specialis of powdery mildew fungi and is characterized by the absence of the so-called Mo wild-type gene.
  • Mio is a presumably negative regulator of pathogen defense (Devoto, A. et al. (1999), J. Biol. Chem., 274, 34993-35004).
  • the function of this mechanism also depends on at least two other genes, Rorl and Ror2 (Freialdenhoven, A. et al. (1996), Plant Cell, 8, 5-14).
  • the resistance or Incompatibility, as mediated by the recessive / w / o resistance allele, is generally not characterized by the onset of HR.
  • the papilla subcellular cell wall apposition
  • the papilla which forms directly below the fungal penetration peg, the so-called appresorium.
  • the penetration attempts of the fungus are inhibited at the stage of papule formation, ie there is no formation of a haustorium, which is essential for the establishment of an efficient infestation.
  • transgenic plants which have increased resistance to have different plant pathogens. It is a further object of the present invention to provide plants or plant cells with a race non-specific resistance to various fungal pathogens such as mildew available. It is also an object of the present invention to provide transgenic barley plants having a race-nonspecific sequence against fungal pathogens such as the mildew pathogen. In addition, it is an object of the present invention to provide methods which enable the production of the abovementioned transgenic plants or plant cells having an increased (race-unspecific) resistance to plant pathogens, such as mildew.
  • the stated objects of the present invention are essentially achieved by providing a process for producing transgenic plants with increased pathogen resistance, which is characterized in that the content and / or the activity of at least one actin depolymerizing factor (ADF ) is changed from the corresponding wild-type.
  • ADF actin depolymerizing factor
  • race-nonspecific resistance in barley and other gramineae is mediated by recessive m / o alleles. Therefore, efforts have been made for a long time to identify other genes that interact with the Mo gene. Using a mutagenesis screen, additional genes could be identified with Rorl and Ror2, which are genetically linked to the Mo gene interact (Freialdenhoven et al, vide supra).
  • Rorl and Ror2 which are genetically linked to the Mo gene interact
  • a general problem in identifying other genes that interact with the Mo gene, and thus could also be used by appropriate manipulation to produce race-unspecific resistance is that, depending on the screening method, evidence of modified infection types is provided. and in view of the barley's genomic redundancy, the mutagenesis screening methods used are not always sensitive enough to identify additional genes of the / rc / o mediated resistance mechanism.
  • RNA interference RNA interference
  • ADF3 actin depolymerizing factor 3
  • transgenic plants or plant cells from barley in which the content and / or the activity of ADF3 is changed in comparison to the wild type, thus exhibit an increased race-unspecific resistance to the mildew pathogen.
  • transgenic plants or plant cells of different plant species which are distinguished by an increased resistance to plant pathogens and in particular excel in pathogenic pathogens such as mildew. This should be especially true when the plant pathogens have to enter into a functionally relevant interaction with the actin cytoskeleton to establish an efficient infection (see below).
  • the present invention therefore provides an isolated nucleic acid molecule which is suitable for the ADF3 of barley having the SEQ ID no. 1 coded.
  • nucleic acid molecules which are suitable for functionally equivalent parts of the ADF3 of barley having the SEQ ID NO. 1 coding for mutants of ADF3 from barley with the SEQ ID NO. 1 or nucleic acid molecules which hybridize to the aforementioned nucleic acid molecules under stringent conditions.
  • Another object of the present invention are proteins or protein fragments which are encoded by the aforementioned nucleic acid molecules.
  • the present invention also provides a process for the production of transgenic plants or plant cells having an increased pathogen resistance compared to the wild type and an altered content and / or an altered activity of at least one ADF.
  • the invention likewise provides a process for the production of transgenic plants or plant cells with increased pathogen resistance, in which the expression of at least one ADF by transfer of the abovementioned nucleic acid sequences or nucleic acid sequences corresponding to ADF3 from barley having SEQ ID NO. 1 are homologous, planting or plant cells is effected.
  • Another object of the present invention are methods for the production of transgenic plants or plant cells with increased pathogen resistance, in which the content and / or activity of at least one endogenous ADF is up-regulated or down-regulated.
  • Another object of the invention is a process for the preparation of transgenic plants or plant cells with increased pathogen resistance, in which the activity of at least one endogenous ADF by transfer of nucleic acid molecules for non-functional homologs or parts thereof of the ADF3 from barley with the SEQ ID no. 1, is degraded.
  • Another object of the invention is a method for the production of transgenic plants or plant cells with increased pathogen resistance, in which antibodies that are specific for ADFs and possibly inhibit their function are expressed in the cell.
  • Another object of the invention are methods for the production of transgenic plants or plant cells with increased pathogen resistance, in which the post-translational modification status of at least one overexpressed and / or endogenous ADF is changed.
  • an object of the present invention are methods for the production of transgenic plants or plant cells with increased pathogen resistance, in which the expression of at least one ADF by methods such. antisense, post-transcriptional gene silencing (PTGS), virus-induced gene silencing (VIGS), RNA interference (RNAi), ribonuclease P constructs, hammerhead ribozyme constructs or homologous recombination.
  • PTGS post-transcriptional gene silencing
  • VIGS virus-induced gene silencing
  • RNAi RNA interference
  • ribonuclease P constructs hammerhead ribozyme constructs or homologous recombination.
  • the invention also relates to transgenic plants or plant cells having an increased resistance to pathogens, which have a higher compared to the wild type altered content and / or altered activity of at least one ADF.
  • the present invention also relates to transgenic plants or plant cells which have been produced by one of the methods according to the invention and have increased pathogen resistance in comparison with the wild type.
  • Another object of the present invention is the use of nucleic acids which encode functional or non-functional ADFs or parts thereof from different organisms, for the production of transgenic plants or plant cells with increased pathogen resistance.
  • nucleic acid sequences described in the invention for the described methods or for the production of said transgenic plants and plant cells is also an object of the present invention.
  • Phathogen resistance means reducing or attenuating disease symptoms of a plant as a result of infestation by a pathogen.
  • the symptoms may be of a variety of types, but preferably include those which directly or indirectly affect the quality of the plant, the quantity of yield, the suitability for use as feed or food, or else the sowing, growing, harvesting or processing of the plant Harvests difficult
  • the term "increased pathogen resistance” is understood according to the invention to mean that the transgenic plants or plant cells according to the invention are affected less frequently and / or less frequently by plant pathogens.
  • the term “increased pathogen resistance” also includes a so-called transient pathogen resistance, ie that the transgenic plants or plant cells according to the invention have an increased pathogen resistance compared to the corresponding wild type only for a certain period of time.
  • the reduced frequency or the reduced extent of the pathogen infestation in the transgenic plants or plant cells according to the invention is determined in comparison with the corresponding wild type.
  • an increase in resistance is preferred in the sense that the plant is infested with the pathogen by at least 5%, preferably at least 20%, likewise preferably at least 50%, 60% or 70%, particularly preferably at least 80%, 90 % or 100%, also more preferably by a factor of 5, more preferably by at least a factor of 10, also more preferably by at least a factor of 50, more preferably by at least a factor of 100 and most preferably by at least a factor of 1000 less or less strong compared to the wild type.
  • plant pathogens is understood as meaning those plant pathogens which have to interact with the plant actin cytoskeleton in order to establish an efficient infection.
  • plant pathogens includes fungal pathogens.
  • Fungal pathogens or fungus-like pathogens are preferably selected from the group comprising Plasmodiophoramycota, Oomycota,
  • Plasmodiophoromycota such as Plasmodiophora brassicae (cabbage hernia, clubroot of crucifer), Spongospora subterranea (powdery scab of potato tubers),
  • Ascomycota such as Microdochium nivale (snow mold on rye and wheat), Fusarium graminearum, Fusarium culmorum (ear rot especially in wheat), Fusarium oxysporum (Fusarium wilt on tomato), Blumeria graminis (powdery mildew on barley (f.sp. hordei) and Wheat (f.sp. tritici)), Erysiphe pisi (powdery mildew), Nectria galligena (fruit tree crayfish), Unicnula necator (grapevine powdery mildew), Pseudopeziza tracheiphila (red
  • Burner of the grapevine Claviceps purpurea (ergot on eg rye and grasses), Gaeumannomyces graminis (blacklegs on wheat, rye grasses), Magnaporthe grisea (rice blast disease), Pyrenophora graminea (stripe disease on barley), Pyrenophora teres (net blotch on barley), Pyrenophora tritici-repentis (leaf blotch (leaf drought) on wheat), Venturia inaequalis (apple scab), Sclerotinia sclerotium (Thstengeltechnik, Rapskrebs), Pseudopeziza medicaginis (valve scab)
  • Basidiomycetes such as Typhula incarnata (Typhula rot on barley, rye, wheat), Ustilago maydis (blubber on corn), Ustilago nuda (blaze of barley), Ustilago tritici (blaze of wheat, spelled), Ustilago avenae
  • Puccinia striiformis yellow rust on wheat, barley, rye and numerous grasses
  • Uromyces appendiculatus bean rust
  • Sclerotium rolfsii root and stem reds of many plants.
  • Deuteromycetes such as Septoria nodorum (teal tubers) on wheat (Septoria tritici), Pseudocercosporella herpotrichoides (broken wheat on cereals, barley, rye), Rynchosporium secalis (leaf spot disease on rye and barley), Alternaria solani (drought on potato, tomato), Phoma betae (root burn on beta beet), Cercospora beticola (Cercospora leaf spot disease on beta
  • Phytophthora infestans (late blight, late blight in tomato, etc.), Microdochium nivale (formerly Fusarium nivale, snow mold on rye and wheat), Fusarium graminearum, Fusarium culmorum (wheat spike), Fusarium oxysporum (Fusarium wilt Tomato), Blumeria grammis (powdery mildew on barley (formerly hordei) and wheat (for sp.
  • Tritici Tritici
  • Magnaporthe grisea rice blast disease
  • Sclerotinia sclerotium white stem, rape
  • Septoria nodorum and Septoria tritici Tuber spot on wheat
  • Alternaria brassicae oval seed rape on canola, cabbage and other cruciferous vegetables
  • Phoma Hungary turnip disease, blackleg on cabbage, root-neck or stem rot on rape).
  • bacterial pathogens include the pathogens listed in Table 2 and the diseases associated with them.
  • transgenic plants produced according to the invention are particularly preferably resistant to the following pathogenic bacteria:
  • Corynebacterium sepedonicum (bacterial ring rot on potato), Erwinia carotovora (blackleg on potato), Erwinia amylovora (fire blight on pear, apple, quince), Streptomyces scabies (potato scab), Pseudomonas syringae pv. Tabaci (wildfire on tobacco), Pseudomonas syringae pv. Phaseolicola (Fatty stain disease on bushbeam), Pseudomonas syringae pv. Tomato ("bacterial speck” on tomato), Xanthomonas campestris pv. Malvacearum (leaf spot disease on cotton) and Xanthomonas campestris pv. Oryzae (bacterial blight on rice and other grasses).
  • viral pathogens includes all plant viruses such as tobacco or or cucumber-mosaic virus, ringpot virus, Necrosis virus, corn dwarf-mosaic virus etc.
  • viral pathogens include the pathogens listed in Table 3 and the diseases associated with them.
  • insects and nematodes can also be resistant to animal pests such as insects and nematodes.
  • insects such as beetles, caterpillars, lice or mites may be mentioned.
  • the plants according to the invention are preferably resistant to insects of the genera Coleoptera, Diptera, Hymenoptera, Lepidoptera, Mallophaga, Homoptera, Hemiptera, Orthoptera, Thysanoptera. Dermaptera, Isoptera, Anoplura, Siphonaptera, Trichoptera, etc.
  • insects of the genera Coleoptera and Lepidoptera such as the European corn borer (ECB), Diabrotica barberi (“Northern com rootworm”), Diabrotica undecimpunctata (“Southern com rootworm”), Diabrotica virgifera (“Western com rootworm”), Agrotis ipsilon (“black cutworm”), Crymodes devastator (“glassy cutworm”), Feltia **ns (“dingy cutworm”), Agrotis gladiaria (“claybacked cutworm “), Melanotus spp., Aeolus mellillus (“ wireworm “), Aeolus mancus (“ wheat wireworm “), Horistonotus uhlerii (“ sand wireworm “), Sphenophorus maidis (“ maize billbug “), Sphenophorus zeae (“ timothy billbug ").
  • EBCB European corn borer
  • Diabrotica barberi Northern com rootworm
  • Diabrotica undecimpunctata
  • Sphenophorus parvulus bluegrass billbug
  • Sphenophorus callosus southem com billbug
  • Phyllogphaga spp. White grubs
  • Anuraphis maidiradicis com root aphid
  • Delia platura seedcom maggot
  • Colaspis brunnea grain colaspis
  • Stenolophus lecontei seedcom beetle
  • Clivinia impressifrons (“lender seedcom beetle”).
  • Femer are the cereal cockerel (Oulema melanopus), the frit fly (Oscinella frit), wireworm (Agrotis lineatus) and aphids (such as oat aphid Rhopalosiphum padi, large cereal aphid Sitobion avenae).
  • nematode pests include the pathogens listed in Table 4 and the diseases associated with them.
  • the transgenic plants according to the invention are resistant to Globodera rostochiensis and G. pallida (cysts on potatoes, tomato and other nightshade plants), Heterodera schachtii (beet cysts on sugar beets and fodder beet, oilseed rape, cabbage, etc.), Heterodera avenae (oat cysts on oats cereals), Ditylenchus dipsaci (stem or small beetle, turnip head on rye, oats, corn, clover, tobacco, turnip), Anguina tritici (wheat, wheel disease on wheat (spelled, rye), Meloidogyne hapla (Wurzelgallenälchen to carrot, cucumber, Salad, tomato, potato, Sugar beet, alfalfa).
  • the plants according to the invention are preferably resistant to the following pathogens:
  • Canola against the fungal, bacterial or viral pathogens Albugo Candida, Alternaria brassicae, Leptosphaeria maculans, Rhizoctonia solani, Sclerotinia sclerotiorum, Mycosphaerella brassiccola, Pythium ultimum, Peronospora parasitica, Fusarium roseum, Alternaria alternata.
  • Puccinia graminis f.sp. tritici Puccinia recondita f.sp. tritici, Puccinia striiformis, Pyrenophora tritici-repentis, Septoria nodorum, Septoria tritici, Septoria avenae, Pseudocercosporella herpotrichoides, Rhizoctonia solani, Rhizoctonia cerealis, Gaeumannomyces graminis var.
  • Zignosellus lesser cornstalk borer; Oulema melanopus (cereal leaf beetle); Hypera punctata (clover leaf weevil); Diabrotica undecimpunctata howardi (southern com rootworm); Russian wheat aphid; Schizaphis graminum (greenbug); Macrosiphum avenae (English grain aphid); Melanoplus femurrubrum (redlegged grasshopper); Melanoplus differentialis (differential grasshopper); Melanoplus sanguinipes
  • Agromyza parvicornis (com blot leafininer); Anaphothrips obscrurus (grass thrips); Solenopsis milesta (thief ant); Tetranychus urticae (twospotted spider mite).
  • Diatraea saccharalis (sugarcane borer); Spodoptera frugiperda (fall armyworm); Helicoverpa zea (com earworm); Colaspis brunnea (grape colaspis); Lissorhoptrus oryzophilus (rice water weevil); Sitophilus oryzae (rice weevil); Nephotettix nigropictus (rice leafhopper); Blissus leucopterus leucopterus (chinch bug); Acrosternum hilare (green stink bug);
  • plant pathogen includes pathogens of the group Blumeria graminisf. sp. hordei, tritici, avenae, secalis, lycopersici, vitis, cucumis, cucurbitae, pi $ i, pruni, solani, rosae, fragariae, rhododendri, mali and nicotianae.
  • ADF3 barley actin depolymerizing factor 3
  • ADFs actin-depolymerizing factors
  • ADF3 is discussed below, the ADF3 of barley with SEQ ID no. 1, whereas by use of the term “ADFs” is meant the ADF3 from barley and / or those proteins having significant or substantial homology to the ADF3 from barley.
  • content of ADF3 from barley or ADFs in general means according to the invention the amount of ADF3 or a specific ADF, as can be determined for the wild type of a plant or plant cell.
  • ADF3 or ADFs in general is their ability to interact with globular actin (G-actin) or filamentous actin (F-actin) or other physiological binding partners.
  • a “content altered with respect to the type of WT" of ADFs is therefore understood according to the invention to be an increased or reduced amount of ADFs compared to the wild type.
  • Increasing the level of ADFs can be achieved by increasing the amount of endogenous ADFs or by adding an additional amount of exogenous ADFs.
  • the lowering of the amount of ADFs in the transgenic plants or plant cells according to the invention is generally achieved by a lowering of the content of endogenous ADFs.
  • a wild-type is understood to mean the corresponding non-genetically modified starting organism.
  • the increase in activity on ADFs can be achieved by increasing the activity of the endogenous ADFs and / or by adding an additional amount of functional ADFs. Decreasing activity on ADFs can be achieved by lowering the activity of the endogenous ADFs.
  • a decrease in the activity of ADFs is understood to mean that the activity on endogenous ADF3 or endogenous ADFs remains unchanged, but the interaction of the ADFs with their physiological binding partners is significantly inhibited by, for example, the expression of non-functional forms of the ADFs or antibodies.
  • the increase in the content and / or the activity of ADFs in a transgenic plant or plant cell caused by a method according to the invention is at least 5%, preferably at least 20%, also preferably at least 50%, particularly preferably at least 100%, also particularly preferred at least the factor 5, particularly preferably at least the factor 10, also particularly preferred at least the factor 50, more preferably at least the factor 100 and most preferably at least the factor 1000.
  • the transgenic plants according to the invention have comparable increases in content and / or activity of ADFs in a transgenic plant or plant cell.
  • the reduction of the content and / or the activity of ADFs in a transgenic plant cell or plant caused by a method according to the invention is at least 5%, preferably at least 10%, particularly preferably at least 20%, also particularly preferably at least 40%, also particularly preferred at least 60%, more preferably at least 80%, also more preferably at least 90% and most preferably at least 98%.
  • an object of the present invention relates to an isolated nucleic acid molecule which is suitable for the ADF3 of barley having the SEQ ID no. 1 coded.
  • Another object of the present invention relates to nucleic acid molecules suitable for functionally equivalent parts of the ADF3 from barley having the SEQ ID NO. 1 encode.
  • ADF3 ADF3 fragments of the nucleic acid sequences as described for the ADF3 of SEQ ID no. 1, whose expression still leads to proteins with the binding properties and structural properties of ADF3.
  • functionally equivalent parts is to be understood when referring to protein fragments in general. These are particularly preferably nucleic acid sequences which lead to ADF3 fragments which have deletions of several amino acids at the N- and / or C-terminus, without there being any change in the structural properties or the
  • binding properties of the ADF3 comes.
  • binding properties of ADF3 is meant in particular the binding behavior of ADF3 to G-actin and / or F-actin.
  • mutants of ADF3 are nucleic acid molecules encoding mutants of ADF3.
  • mutants of ADF3 is meant both functional and non-functional mutants of ADF3.
  • Functional mutants are forms of ADF3 that have point mutation (s), insertion (s) and / or deletion (s), without any significant loss of the structural or binding properties of ADF3. ⁇
  • ADF3 The binding properties of ADF3 from Zea mays as well as its structural properties have been described (Jiang et al., (1997), Proc. Natl. Acad., See, USA, 94, 9973-9978).
  • ADF3 is an ADF which is essentially homologous to ADF3 from barley for the purposes of the present invention, the findings described in said publication regarding the binding behavior of ADFs to G-actin and F-actin in the production of functional and non-functional mutants of the barley ADF3 according to the invention (see below).
  • An example of a conservative amino acid exchange is an exchange of a valine for an alanine.
  • the skilled person will note whether the conservative amino acid exchange is located in a region of ADF3 that is essential for its binding behavior to F-actin or G-actin. Evidence of whether a specific region is essential for the binding behavior of ADF3 can be obtained through a so-called sequence alignment with already known ADFs for which the binding properties and structural properties have already been determined (see Jiang et al., Vide supra).
  • the mutated amino acid is located at position 6 of the amino acid sequence, with the wild type serine (S) being changed to an alanine (A) (Smertenko, A.P. et al. (1998) Plant J 14, 187-193).
  • an object of the invention are also nucleic acid molecules which code for non-functional mutants of ADF3 from barley.
  • Such non-functional mutants of ADF3 are forms of ADF3 that are no longer or at least very limited in their ability to interact with G-actin and / or F-actin or other physiological binding partners of ADF3.
  • Such non-functional mutants of ADF3 may in turn comprise point mutation (s), insertion (s) and / or deletion (s).
  • Such non-functional mutants of ADF3 are e.g. useful in the production of transgenic plants or cells in which the content of endogenous ADF3 in the barley is not altered, but the activity on endogenous ADF3 is blocked by overexpression of said non-functional mutants.
  • non-functional mutants of ADF3 have substantially the same nucleic acid or amino acid sequences as functional mutants of ADF3. However, they have in some places point mutation (s), insertion (s) or deletion (s) of nucleotides or amino acids, which cause, in contrast to functional mutants of ADF3, that the non-functional mutants of ADF3 not or only very limited in are able to associate with F-actin, G-actin and / or other physiological binding partners to interact.
  • Such functional or non-functional mutants of ADF3 according to the invention can be identified by a person skilled in the art in a simple manner.
  • a variety of techniques are available to those skilled in the art with which it is possible to insert point mutation (s), insertion (s) or deletion (s) into the nucleic acid sequences encoding functional or non-functional mutants of ADF3 (Sambrook (2001), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Edition, Coldspring Harbor Laboratory Press). After introduction of the point mutation / insertion and / or deletion, which are also generally referred to as mutation, the skilled worker can determine by appropriate binding tests, as shown in the examples or known from the prior art, whether the mutagenized ADF3 still on their have normal binding properties with respect to G-actin, F-actin and / or other physiological binding partners.
  • Non-functional mutants of ADF3 have a decreased binding specificity compared to the non-mutagenized ADF3 or the functional mutant of ADF3, preferably towards G-actin and / or F-actin.
  • a non-functional mutant of ADF3 has from 1 to 90%, preferably from 1 to 70%, more preferably from 1 to 50%, also more preferably from 1 to 30%, most preferably from 1 to 15% and most preferably Over 1 to 10% of the binding efficiency of ADF3 or the corresponding functional mutants of ADF3 to the respective pathogenic and / or physiological binding partner, in this case preferably to G-actin and / or F-actin.
  • Non-functional mutants of ADF3 are also referred to as inactivated or inactive ADF3 in the invention.
  • the functional and / or non-functional mutants of ADF3 according to the invention which carry the abovementioned point mutation (s), insertion (s) and / or deletion (s) or the functionally equivalent parts are distinguished by a substantial sequence homology to ADF3 ,
  • Essential sequence homology is generally understood according to the invention as meaning that the nucleic acid or amino acid sequence of a DNA molecule or a protein is at least 40%, preferably at least 50%, more preferably at least 60%, also preferably at least 70%, 80% or 85%, more preferably at least 90%, more preferably at least 95%, and most preferably at least 98% to the Nukleinklare ⁇ or amino acid sequences of ADF3 or its functionally equivalent parts is identical.
  • the homology is determined over the entire sequence length of ADF3.
  • identity between two proteins is meant the identity of the amino acids over a particular protein region, preferably the total protein length, especially the identity, as determined by comparison with the laser gene software of DNA Star Inc., Madison, Wisconsin (USA) Application of the CLUSTAL method (Higgins et al., 1989), Comput. Appl. Biosci., 5 (2), 151). The homology is thus preferably calculated over the entire amino acid or nucleic acid sequence range.
  • other programs are available to the person skilled in the art for the comparison of different sequences, which are based on different algorithms. The algorithms of Needleman and Wunsch or Smith and Waterman provide particularly reliable results. For example, the program PiIe Aupa can also be used for the sequence comparisons (J.
  • the Clustal-W program was used, as it can be accessed via http://www.ebi.ac.uk/clustalw.
  • the parameters of the mentioned start page remained unchanged for the alignments.
  • nucleic acid molecules which hybridize with the nucleic acid molecules encoding ADF3, functionally equivalent parts thereof or functional or non-functional mutants of ADF3 under stringent conditions or are substantially complementary to these.
  • complementarity is meant the ability of one nucleic acid molecule to hybridize to another nucleic acid molecule due to hydrogen bonding between complementary bases. The person skilled in the art knows that two nucleic acid molecules do not have to have 100% complementarity in order to be able to hybridize with one another.
  • nucleic acid sequence which is intended to hybridize with another nucleic acid sequence, to this at least 40%, at least 50%, at least 60%, preferably at least 70%, particularly preferably at least 80%, also more preferably at least 90%, more preferably at least 95%, and most preferably at least 98% or 100% complementary.
  • homology, complementarity and identity levels are to be determined over the entire protein or nucleic acid length.
  • Nucleic acid molecules are identical if they have identical nucleotides in the same 5 '-3'
  • stringent conditions thus refers to conditions under which a nucleic acid sequence preferentially binds to a target sequence, but not or at least substantially reduced to other sequences.
  • Stringent conditions depend on the circumstances. Longer sequences hybridize specifically at higher temperatures. In general, stringent conditions are chosen so that the hybridization temperature is about 5 ° C below the melting point (Tm) for the specific sequence at a defined ionic strength and a defined pH. Tm is the temperature (at a defined pH, a defined ionic strength and a defined nucleic acid concentration) at which 50% of the molecules that are complementary to a target sequence hybridize to this target sequence.
  • stringent conditions include salt concentrations between 0.01 and 1.0 M sodium ions (or another salt) and a pH between 7.0 and 8.3. The temperature is at least 30 ° C for short molecules (eg, those that range from 10 to 50 nucleotides).
  • stringent conditions may include the addition of destabilizing agents such as formamide.
  • Typical hybridization and washing buffers have the following composition.
  • Hybridization solution prehybridization solution.
  • nucleic acid sequences encoding barley ADF3, functionally equivalent portions thereof, or functional or non-functional mutants thereof can be used to target transgenic plants having altered levels and / or altered activity To produce ADF3, which has the consequence that these plants have an increased pathogen resistance to the mildew fungus Blumeria graminisf. sp. hordei grouting.
  • the present invention is not directed to methods of producing transgenic barley cells that exhibit increased resistance to Blumeria graminisf due to altered content and / or altered activity of barley ADF3. sp. hordei show limited.
  • the present invention thus generally relates to methods for the production of transgenic plants or plant cells with an increased resistance to pathogens, in which the content and / or the activity of at least one ADF is changed compared to the wild type.
  • the methods described below for producing transgenic plants with increased pathogen resistance and changing the content and / or the activity of at least one ADF it is therefore also possible to use, in addition to the abovementioned nucleic acid sequences, those nucleic acid sequences which code for ADFs which are substantially homologous to the ADF3 with the SEQ ID no. 1 are from barley.
  • nucleic acid or amino acid sequence of such ADF to at least 40%, preferably at least 50%, more preferably at least 60%, also preferably at least 70%, 80% or 85%, especially preferably at least 90%, more preferably at least 95%, and most preferably at least 98% to the nucleic acid or amino acid sequences of the ADF3 from barley.
  • sequence homology can be determined by the methods mentioned above.
  • nucleic acid sequences which code for ADFs which are substantially homologous to barley ADF3 the methods according to the invention may also use those nucleic acids which code for functionally equivalent parts of the ADFs or functional or non-functional mutants of the ADFs provided that they are ADFs that are substantially homologous to the ADF3 of barley.
  • the ones described above Definitions for functionally equivalent parts or functional or nonfunctional mutants also apply to the ADFs in general.
  • ADFs which can be used for the methods according to the invention are the Arabidopsis thaliana, Zea mays, Hordeum vulgare, Oryza sativa and Triticum aestivum ADFs given in Table 5.
  • Suitable nucleotide and amino acid sequences for the ADFs can be deduced by the person skilled in the art both from the database entries given in the table and from the sequence listing.
  • GenBank database can be accessed at http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez.
  • the TIGR database can be accessed at http://www.tigr.org.
  • DNA sequences with a high homology, ie a high similarity or identity are bona f ⁇ de candidate for DNA sequences corresponding to the DNA sequences of the invention, ie ADF3.
  • These gene sequences can be isolated by standard methods such as PCR and hybridization, and their function determined by appropriate enzyme activity assays and other experiments by those skilled in the art.
  • Homology comparisons with DNA sequences can also be used according to the invention to design PCR primers by first identifying the regions that exist between the DNA sequences of different organisms are most conserved. Such PCR primers can then be used to isolate, in a first step, DNA fragments that are components of DNA sequences that are homologous to the DNA sequences of the invention.
  • search engines that can be used for such homology comparisons. These search engines include e.g. the CLUSTAL program group of the BLAST program provided by the NCBI.
  • the ADF3 from barley and the ADFs generally have a so-called consensus region.
  • consensus region there is a so-called sequence alignment of various ADF sequences from A. thaliana with ADF3 from barley.
  • Consensus Sequence I comprises the following sequence:
  • X 1 may comprise any desired amino acid, preferably L or I.
  • X 2 may comprise any amino acid.
  • X 3 may comprise any amino acid, preferably N or D.
  • X 4 may comprise any amino acid, preferably D or E.
  • X 5 may comprise any amino acid, preferably Y or F,
  • X 6 may be any amino acid, preferably A or C include.
  • X 7 may comprise any amino acid, preferably V or I.
  • Xg can include any amino acid.
  • X 9 may include any amino acid.
  • X 10 may include any amino acid, preferably D or E.
  • X 11 may comprise any amino acid, preferably F or Y. The amino acids are given after the usual one-letter code.
  • ADFs that can be used in the methods of the invention are characterized by the presence of a second consensus sequence.
  • This second consensus sequence II comprises the following sequence:
  • Y 1 can be any amino acid, preferably K or R.
  • Y 2 can be any amino acid, preferably K or R.
  • Y 3 may be any amino acid, preferably F or Y.
  • Y 4 may be any amino acid, preferably F, I or V.
  • Y 5 can be any amino acid.
  • Y 6 may be any amino acid, preferably S or C.
  • Y 7 may be any amino acid, preferably S, E or D.
  • Y 8 can be any amino acid.
  • Y 9 may be any amino acid, preferably S or A.
  • Y 10 may be any amino acid.
  • Y 11 may be any amino acid, preferably I, V or M.
  • Y 12 can be any amino acid.
  • Y 13 may be any amino acid, preferably I, V or M.
  • Y 14 can be any amino acid.
  • Y 15 may be any amino acid, preferably S or A. Again, the amino acids are given in single-letter code.
  • ADFs suitable for use in any of the methods of the invention are characterized by the following consensus sequence.
  • Consensus Sequence III comprises the following sequence: RZ 1 Z 2 Z 3 GZ 4 Z 5 Z 6 EZ 7 Z 8 ATDZ 9 Z 1 OZ 11 Z 12 (SEQ ID NO. 91)
  • Z 1 may be any amino acid, preferably E, V or T.
  • Z 2 may be any amino acid, preferably L or M.
  • Z 3 may be any amino acid, preferably Q, E or D.
  • Z 4 may be any amino acid, preferably I or V.
  • Z 5 may be any amino acid, preferably H or Q.
  • Z 6 can be any amino acid.
  • Z 7 may be any amino acid, preferably I, L, M or F.
  • Z 8 may be any amino acid, preferably Q or H.
  • Z 9 can be any amino acid.
  • Z 10 may be any amino acid, preferably T or S.
  • Z 11 may be any amino acid, preferably E or D.
  • Z 12 may be any amino acid, preferably V 5 M or I. The amino acids are again indicated in single letter code.
  • the ADF sequences according to the invention or the ADFs that can be used for the methods according to the invention can also contain the aforementioned three consensus sequences I, II and III in combination.
  • the present invention thus also relates to nucleic acid sequences which i.a. for the consensus sequence shown above with the SEQ ID no. 89, 90 and / or 91 and their use in the inventive method for the production of transgenic plants with an increased pathogen resistance by changing the content and / or the activity of at least one ADF.
  • ADFs the change in the content and / or the activity of ADFs or ADF3 can take place in various ways.
  • this always includes the ADF3 from barley.
  • the increase in the ADF activity and the ADF content for example, by switching off inhibitory regulatory mechanisms at the transcriptional, translational and protein level or by increasing the gene expression of a nucleic acid encoding at least one ADF or functional homologs, parts or mutants thereof to the wild-type respectively. This can be done, for example, by inducing the respective endogenous ADF gene (s) or by introducing nucleic acids coding for ADFs or functional homologs, parts or mutants thereof.
  • the increase in the ADF activity or the ADF content compared to the wild type by increasing the gene expression of a nucleic acid encoding an ADF.
  • the gene expression of a nucleic acid coding for an ADF is increased by introducing nucleic acids encoding at least one ADF into the respective plant or plant cell.
  • the ADF genes of a wide variety of organisms ie any nucleic acid coding for an ADF with substantial homology to ADF3 from barley or functional homologues, parts or mutants thereof, can be used for this purpose.
  • nucleic acid sequences from eukaryotic sources containing introns in the event that the host organism is unable or unable to splice the corresponding ADF sequences, preferably already processed nucleic acid sequences such as corresponding cDNAs to use. All nucleic acids mentioned in the description can e.g. an RNA, DNA or cDNA sequence.
  • a nucleic acid sequence which codes for at least one ADF is transferred to a plant or plant cell.
  • This transfer leads to an increase in the expression or the activity of ADF compared to the wild type and, correspondingly, to an increase in the pathogen resistance in the transgenic plants or plant cells.
  • Such a method can be used to increase the expression of DNA sequences encoding ADFs or their functionally equivalent homologues, parts or functional mutants, and thus also increase the pathogen resistance in the transgenic plants or plant cells.
  • vectors which comprises these sequences and regulatory sequences, such as promoter and termination sequences, is known to the person skilled in the art.
  • Such a method typically comprises the following steps according to the invention:
  • step a) The person skilled in the art knows how a vector from step a) can be transferred to plant cells and what features a vector must have in order to be integrated into the plant genome.
  • An example of the overexpression of a functional mutant of an ADF is the overexpression of HvADF3-S 6 A (SEQ ID No. 2, see examples). Due to the amino acid exchange of serine for alanine, the ADF3 can no longer be phosphorylated in position 6. This leads to a constitutively active form of ADF3. Thus, overexpression of this mutant leads both to an increase in the content of ADF3 in the transgenic plants and to an increased activity on ADF3.
  • the ADF content in transgenic plants or plant cells is increased by transferring a nucleic acid which codes for an ADF from another organism such as Dictyostelium discoideum, then it is recommended that the amino acid sequence encoded by the nucleic acid sequence, for example from Dictyostelium discoideum, by backtranslating the Polypeptide sequence according to the genetic code in a nucleic acid sequence to carry over, which mainly comprises those codons, which are used more frequently due to the organism-specific codon Usage.
  • the codon usage can be easily determined by computer evaluations of other known genes of the organisms concerned.
  • the manipulation of the expression of the organism-specific and, in particular, the plant-specific endogenous ADFs is understood according to the invention. This can be achieved, for example, by altering the promoter DNA sequence for ADF-encoding genes. Such a change, which results in an altered, preferably increased expression rate of at least one endogenous ADF gene, can be effected by deletion or insertion of DNA sequences.
  • a change in the promoter sequence of endogenous ADF genes usually leads to a change in the expressed amount of the ADF gene and thus also to a change in the cell or plant detectable ADF activity.
  • an altered or increased expression of at least one endogenous ADF gene can be achieved in that a regulatory protein that does not occur in the untransformed organism interacts with the promoter of these genes.
  • a regulatory protein that does not occur in the untransformed organism interacts with the promoter of these genes.
  • Such a regulator may be a chimeric protein consisting of a DNA binding domain and a transcriptional activator domain, as described, for example, in WO 96/06166.
  • Another way to increase the activity and content of endogenous ADFs is to up-regulate transcription factors involved in the transcription of the endogenous ADF genes, eg, by overexpression.
  • the measures for the overexpression of transcription factors are known in the art and are also disclosed in the context of the present invention for ADFs.
  • a change in the activity of endogenous ADFs can be achieved by targeted mutagenesis of endogenous gene copies.
  • Altering the endogenous ADFs can also be achieved by influencing the post-translational modifications of ADFs. This can e.g. This can be done by regulating the activity of enzymes such as kinases or phosphatases involved in the post-translational modification of ADFs by appropriate means such as overexpression or gene silencing.
  • endogenous ADFs can also be regulated via the expression of aptamers that bind specifically to the promoter sequences of ADFs. Depending on whether the aptamers bind to stimulating or repressing promoter regions, the amount and, in this case, the activity of endogenous ADF is increased.
  • the reduction of the content and / or the activity of at least one ADF can be achieved by different strategies.
  • expression of at least one ADF in transgenic plants can be lowered by "silencing".
  • a nucleic acid which codes for and / or is complementary to at least one ADF or parts thereof is transferred to the plant.
  • the nucleic acid to be transferred is usually transferred to the plant by a vector, such as a plasmid, which is able to stably replicate within the plant cell or the to integrate transferred nucleic acid into the plant genome.
  • the RNAi method can be used for the silencing of ADFs.
  • a vector to the plant cell comprising, in the 5 '-3' direction, the following elements: a plant-functional promoter; operatively linked thereto, a DNA sequence comprising the antisense sequence of the sequence encoding the ADF or portions thereof and having 3 'exon sequences recognizable at its 3' end by the spliceosome; an intron; a DNA sequence comprising the sense sequence of the DNA sequence encoding the ADF or portions thereof and having 5'-exon sequences recognizable at its 5'-end from the spliceosome; and a termination sequence.
  • a vector is shown in Figure 2.
  • the position of the antisense and sense sequences can be reversed. It is clear to the person skilled in the art that the respective 5 'and 3' splice sites must be adapted accordingly.
  • RNA molecules comprising a first exon comprising the antisense sequence of the sequence encoding the ADF or parts thereof, an intron and a second exon containing the sense sequence for the ADF or parts thereof consists of coding DNA sequence. Since the intron is removed by the splicing process, a continuous RNA molecule is formed with regions that are complementary to one another. Such an RNA molecule will form a double-stranded structure (Smith et al, 2000, Nature, 407: 319-320).
  • Such double-stranded RNA molecules are capable of specifically silencing the mRNA of ADFs by induction of the PTGS system, resulting in ADFs no longer be expressed. Which ADFs are no longer expressed, can be determined by the appropriate choice of antisense and sense sequences.
  • the finding of protein-characteristic sequences belongs to the usual knowledge of a person skilled in the art. The skilled worker knows that a multiplicity of ADFs can also be achieved by the multiple use of characteristic sequences in each case.
  • Such a method may e.g. following steps include:
  • a) Preparation of a vector comprising the following nucleic acid sequences in 5'-3 'orientation: a plant-functional promoter sequence operatively linked to the identical or homologous antisense sequence of the sequence coding for the at least one ADF or parts thereof, the sequence at its 3 'end of the spliceosome recognizable 3' exon sequences
  • vectors for the RNAi method or PTGS can also be used.
  • Such vectors may be constructed, for example, such that the sense and antisense sequences each transcribed from a U6 promoter, hybridize in the cell and induce the PTGS system (Tuschl, 2002, Nat. Biotechnol., 20, 446-448; Miyagishi et al, 2002, Nat. Biotechnol., 20, 497- 500, Lee et al., 2002, Nat. Biotechnol., 20, 500-505).
  • the sense and antisense sequences are linked by a "loop" sequence and are transcribed from a human RNAse P RNA H1 promoter.
  • the sense and antisense sequences can hybridize, form double-stranded RNA, and induce the PTGS system (Tuschl, 2002, vide supra; Paul et al., 2002, Nat. Biotechnol., 20, 505-508 Paddison et al., 2002, Genes Dev., 16, in press, Brummelkamp et al., 2002, Science, 296, 550-553).
  • PTGS system Tuschl, 2002, vide supra; Paul et al., 2002, Nat. Biotechnol., 20, 505-508 Paddison et al., 2002, Genes Dev., 16, in press, Brummelkamp et al., 2002, Science, 296, 550-553.
  • RNAi method no vectors are used, but pre-synthesized double-stranded RNA molecules which possess the above-described sense or antisense sequences, e.g. biolistic methods are introduced directly into the cell to be transfected.
  • the vectors used to transfer the nucleic acids comprise a promoter in 5'-3 'orientation, operably linked thereto, a DNA sequence comprising the sequence encoding ADFs or portions thereof and complementary to itself Contains sections, as well as a termination sequence.
  • the transcription of these vectors into the plant cell produces RNA molecules that have sequence regions that can hybridize to themselves.
  • double-stranded RNA molecules can be found in the cell that induce the PTGS system, which then causes the mRNA to be specifically degraded by ADFs.
  • This process also referred to as co-suppression, for silencing of plant proteins requires that the mRNA of the ADF (s) to be suppressed has sections which are complementary to one another.
  • Such portions may be identified by one skilled in the art by simple visual inspection of the DNA sequence encoding the particular protein, or by appropriate sequence programs such as DNAStar from DNASTAR Inc., Madison, USA.
  • Such a method may include, for example, the following steps:
  • Termination sequence b) transferring the vector from a) to plant cells and optionally integration into the plant genome.
  • the vectors used to transfer the nucleic acids in 5'-3 'orientation comprise a promoter, operably linked thereto, a DNA sequence comprising the antisense sequence of the sequence encoding ADFs or portions thereof, as well as a termination sequence.
  • the transcription of such vectors into plant cells produces an RNA molecule whose sequence is complementary to the mRNA sequence coding for ADFs or parts thereof.
  • Such a method may e.g. the following steps include:
  • promoter-functional promoter sequence operatively linked to the identical or homologous antisense sequence of the sequence encoding the endogenous ADF (s) or parts thereof;
  • vectors are used to transfer the nucleic acids to the plant cells, in the 5'- 3 'orientation a promoter which is functional in plants, operatively attached thereto a DNA sequence which codes for a ribozyme, the specifically recognize the mRNA of at least one ADF, and include a termination sequence.
  • a promoter which is functional in plants, operatively attached thereto a DNA sequence which codes for a ribozyme, the specifically recognize the mRNA of at least one ADF, and include a termination sequence.
  • ribozymes also refers to those RNA sequences which, in addition to the actual ribozyme, also comprise guide sequences which are complementary to the mRNA of the ADFs or parts thereof and thus more specifically target the mRNA-specific ribozyme to the mRNA. Substrate of the ribozyme drove.
  • Such a method includes e.g. the following steps:
  • RNA molecules are produced in the cell which have a leader sequence (the antisense sequence) which directs the RNAse P to the mRNA of the ADFs, causing cleavage of the mRNA by RNAse P (US Pat 5,168,053).
  • the leader sequence comprises 10 to 15 nucleotides complementary to the DNA sequence of the ADFs and a 3'-NCCA nucleotide sequence, wherein N is preferably a purine.
  • the transcripts of the external leader sequence bind to the target mRNA through the formation of base pairs, allowing cleavage of the mRNA by the RNAase P at nucleotide 5 'of the paired region. Such a cleaved mRNA can not be translated into a functional protein.
  • Such a method may e.g. the following steps include:
  • Termination sequence b) transferring the vector from a) to plant cells and optionally integration into the plant genome.
  • vectors which contain a DNA sequence which has the following components in the 5'-3 'orientation: A DNA sequence which corresponds to the 5' region the DNA sequence encoding an ADF, a DNA sequence for resistance genes, and a DNA sequence corresponding to the 3 'region of the ADF coding sequence.
  • Such vectors can be used to induce specific gene knock-out of the ADF of interest via homologous recombination.
  • the sequence encoding the resistance gene is inserted into the DNA encoding the ADF so that functional mRNA of the ADF can no longer be produced in the cell.
  • Antibiotic resistance genes are typically used as resistance genes. Of course, other resistance genes that allow for selection of the cells in which the recombination has taken place can also be used.
  • Such a method may e.g. following steps include:
  • Termination sequence b) transfer of the vector from a) to plant cells and integration into the plant genome.
  • nucleic acid sequences which code for ADFs or parts thereof this means both the complete coding DNA sequence of the ADFs and the complete mRNA sequence or the respective subregions. Since some of the above-mentioned methods of producing transgenic plants in which the expression of ADFs is significantly reduced rely on specific hybridization between the endogenous mRNA of ADFs and the sequences resulting from the transcription of the above-mentioned vectors (such as the antisense strategy), the person skilled in the art will understand that the transferred nucleic acids need not always contain all of the coding sequence for the ADFs, whether it be the sense or antisense sequence. Rather, for a specific hybridization, even relatively short regions of the ADF-encoding sequences may be sufficient for efficient silencing.
  • sequences corresponding to the sequence regions of the mRNA of ADFs ultimately lead to double-stranded RNA molecules with approximately 25 nucleotides, preferably 21, 22 or 23 nucleotides in length.
  • the sequences transferred in the antisense strategy generally comprise between 20-1000 nucleotides, preferably between 20-750 nucleotides, more preferably around 400-800 and 500-750 nucleotides. However, sequences may also be used which comprise between 20-500 nucleotides, between 20-300 nucleotides, between 20-150 nucleotides and between 20-100 or 20-50 nucleotides.
  • RNAi or PTGS the sense and antisense RNAs used for the formation of double-stranded RNA molecules can also comprise around 21, 22 or 23 nucleotides with a characteristic 3 'overhang (Tuschl, 2002, Nat Biotechnol., 20, 446-448).
  • nucleic acids When nucleic acids are transferred to the plant cells whose transcription in the cell results in sequences complementary to the mRNA of ADFs (as in the antisense strategy, for example), then these sequences need not be one hundred percent complementary to the mRNA. Rather, it is sufficient if these sequences are at least 50%, preferably at least 60%, more preferably at least 70%, further particularly preferably at least 80%, more preferably at least 90% and most preferably at least 95% complementary , The deviations can be caused by deletion, substitution and / or insertion. Of course, it will be clear to those skilled in the art that with decreasing complementarity, the likelihood of multiple ADFs increasing will increase.
  • the length of complementary sequences is preferably between 20-1000 nucleotides, also preferably between 20-750 nucleotides, more preferably between 20-500 nucleotides, also more preferably between 20-300 nucleotides, particularly preferably between 20-150 nucleotides, also particularly preferred between 20-75 nucleotides, and most preferably about 20-50 nucleotides. Under certain circumstances, the sequences may also comprise only about 20 or 25 nucleotides.
  • Some of the above-mentioned methods can also be performed with sequences that are not part of or complementary to the coding part of the mRNA of ADFs. It can e.g. be sufficient if they are sequences from the 5 'or 3' untranslated region, provided that these regulatory sequences are characteristic of the mRNA of the respective ADF's.
  • mRNA encompasses not only the coding components of the mRNA of ADFs, but also all regulatory sequences which occur in the pre-mRNA or mature mRNA and which are characteristic of the mRNA of the ADFs. This also applies to the DNA sequence. This may be e.g. 5'- and 3'-untranslated regions to act promoter sequences, upstream activating sequences, introns etc.
  • the leader sequence When using vectors whose transcription results in RNA molecules consisting of a leader sequence and RNAse P, then the leader sequence must be sufficiently complementary to specifically recognize the ADF. Which region of the mRNA of the ADF through the leader sequence can be selected according to the respective requirements. Preferably, such leader sequences comprise around 20 nucleotides, but they should not be significantly shorter than 15 nucleotides. With 100% complementarity of the leader sequence, 12 nucleotides should suffice. Of course, the leader sequences may comprise up to 100 nucleotides or more, as this only increases their specificity for the particular mRNA.
  • sequences which correspond to the coding strand of the genes for ADFs or comprise parts thereof are meant those sequences which correspond to the coding strand of the genes for ADFs or comprise parts thereof.
  • sequences need not be 100% identical to the sequences encoding the ADFs of interest. It suffices if the sequences are sufficiently similar to the ADF-encoding sequences that their expression in plant cells results in efficient and specific silencing of the ADFs in the cell, e.g. by RNA interference or co-suppression.
  • sequences are at least 50% identical, preferably at least 60%, more preferably at least 70%, even more preferably at least 80%, more preferably at least 90% and most preferably at least 95% identical are.
  • sequences are homologous to one another or have homology (see above).
  • the deviations from the sequences coding for the ADFs or parts thereof may be due to deletion, addition, substitution and / or insertion.
  • the skilled person is of course clear that with decreasing identity the
  • sequences which correspond to the noncoding DNA strand of the genes of the ADFs of interest are not sufficiently specific and unsuitable for the methods of the invention. Accordingly, when referring to antisense sequences, it is meant according to the invention those sequences which correspond to the noncoding DNA strand of the genes of the ADFs of interest. Of course, these sequences, too, need not be one hundred percent identical to the sequence of the non-coding DNA strand of the genes of the respective ADFs of interest, but may have the abovementioned degrees of homology. This fact is also expressed in the fact that antisense sequences, which by definition are complementary to the mRNA of a gene, need not be 100% complementary to this mRNA.
  • the antisense sequences may also be at least 50% complementary, preferably at least 60% complementary, more preferably at least 70% complementary, still more preferably at least 80% complementary, more preferably at least 90% complementary and most preferably at least 95%, 98% and / or 100% complementary.
  • the antisense sequences are capable of specifically hybridizing to the particular mRNA of interest of ADFs. Hybridization can occur either in vivo under cellular conditions or in vitro.
  • Hybridization of an antisense sequence with an endogenous ⁇ iRNA sequence typically occurs in vivo under cellular conditions or in vitro.
  • antisense sequences which, for example, can not specifically hybridize in vivo and / or in vitro with coding sense sequences of ADFs, ie also hybridize with the coding sense sequences of other protein classes, can not be used.
  • the antisense strategy can be coupled with a ribozyme method. Ribozymes are catalytically active RNA sequences which, coupled to the antisense sequences, catalytically cleave the target sequences (Tanner et al., (1999) FEMS Microbiol Rev. 23 (3), 257-75). This can increase the efficiency of an antisense strategy.
  • ADFs genes for reducing the expression of ADFs, particularly in plants as organisms, include overexpression of homologous ADF nucleic acid sequences leading to cosuppression (Jorgensen et al., (1996) Plant Mol. Biol. 31 (5), 957-973) or the induction of specific RNA degradation by the plant using a viral expression system (amplicon) (Angell et al., (1999) Plant J. 20 (3), 357-362). These methods are also referred to as "post-transcriptional gene silencing" (PTGS) (see above).
  • PTGS post-transcriptional gene silencing
  • gene repression is also possible with specific DNA-binding factors, for example factors of the type of the zinc finger transcription factors.
  • factors can be introduced into a cell that inhibit the target protein itself.
  • the protein binding factors may be eg aptamers (Famulok et al., (1999) Curr Top Microbiol Immunol., 243, 123-36). The reduction can also be done by aptamers. Aptamers can also be designed to bind specifically to the ADF proteins and reduce the activity of the ADFs by, for example, binding to the catalytic center of the ADFs.
  • aptamers The expression of aptamers is usually done by vector-based overexpression and is well known to those skilled in the art as well as the design and selection of aptamers (Famulok et al., (1999) Curr Top Microbiol Immunol., 243, 123-36).
  • ADF-specific antibodies Other protein-binding factors whose expression in plants causes a reduction in the content and / or activity of ADFs are ADF-specific antibodies.
  • the production of monoclonal, polyclonal or recombinant ADF-specific antibodies follows standard protocols (Guide to Protein Purification, Meth. Enzymol. 182, pp. 663-679 (1990), M.P. Deutscher, ed.).
  • the expression of antibodies is also known from the literature (Fiedler et al., (1997) Immunotechnology 3, 205-216, Maynard and Georgiou (2000) Annu Rev. Biomed, Eng 2, 339-76). This approach is detailed below.
  • a further method according to the invention for the production of transgenic plants with increased pathogen resistance provides that the activity of endogenous ADFs is reduced by non-functional mutants of ADFs being expressed in the plant or in the plant cells.
  • non-functional mutants which are preferably dominant-negative mutants
  • the interaction of the endogenous ADFs with their cellular binding partners is inhibited.
  • non-functional mutations into the endogenous ADFs it is likewise possible according to the invention for plants and plants Plant cells are produced, which have an increased pathogen resistance.
  • non-functional mutants are understood to be forms of ADFs which possess mutations which prevent the ADFs from interacting with G-actin, F-actin, components of the pathogen and / or with other physiological binding partners.
  • Such dominant negative mutants When such dominant negative mutants are expressed or overexpressed in the transgenic cell or plant, they are capable of interfering with the interaction of the pathogen components with wild-type ADFs and the interaction of wild-type ADFs with the other physiological factors, e.g. Actin, so that the pathogen has no opportunity for propagation.
  • the pathogen Surprising in this method is that it can produce transgenic plants which have increased pathogen resistance and at the same time have a substantially normal phenotype, although such dominant-negative mutants should influence the endogenous cytoskeleton of the plant cell.
  • transgenic plants and plant cells according to the invention can be produced not only by expression or overexpression of dominant negative mutants of ADFs from plants such as ADF3, but of course also by expression or overexpression of dominant-negative mutants of ADFs other organisms.
  • ADFs from eukaryotes such as yeasts (for example S. cerevisiae), C. elegans or higher mammals such as mice, rats and humans are suitable.
  • yeasts for example S. cerevisiae
  • C. elegans or higher mammals such as mice, rats and humans are suitable.
  • the prerequisite is that the expression of these dominant-negative mutants a Konipetition the endogenous plant ADFs with pathogen components and / or their cellular
  • the ADFs from other organisms can be identified by the database analyzes and homology comparisons described above. The prerequisite is that they have a region or regions which are homologous to the consensus sequences mentioned above.
  • Transgenic plants expressing dominant-negative mutants of ADFs can be made by transferring a corresponding expression vector to plant cells.
  • Such a method may e.g. the following steps include:
  • Non-functional mutations that are dominant-negative mutants of ADFs can be identified by one skilled in the art by simple routine experimentation.
  • a number of mutations e.g. from the ADF3 of maize that inhibit interaction with F-actin and G-actin, respectively.
  • These are mutations in which the tyrosine residues at positions 67 and 70 of ADF3 from maize are replaced by phenylalanine.
  • sequence alignments By means of so-called sequence alignments, the positions equivalent to tyrosines 67 and 70, e.g. in ADF3 from barley or other ADFs, thus producing similar mutations.
  • the barley ADF3 is e.g. around the positions phenylalanine-66 and phenylalanine-69. These may e.g. be replaced by alanine.
  • Mutations preventing the interaction of ADFs with G-actin, F-actin, other physiological binding partners and / or pathogen components, can be easily determined by preparing recombinant ADF proteins carrying different mutation and / or deletion and testing these recombinant proteins in binding assays with the aforementioned components.
  • mutant-negative mutations all types of mutations, i. Insertion, deletion and point mutation capable of inhibiting the interaction of ADFs with G-actin, F-actin, other cellular binding partners and / or pathogen components.
  • point mutation s
  • insertion mutation s
  • deletion mutation s
  • Point mutations are preferred ("PCR technology: Principle and Applications for DNA Amplification", H. Ehrlich, Id, Stockton Press). Examples of the introduction of point mutations into DNA sequences coding for ADF3 can also be found in the exemplary embodiments.
  • Transgenic plants or plant cells, which have an increased pathogen resistance can also be prepared according to the invention such that, for example, a recombinant antibody specifically the interaction of ADFs (and preferably ADF3 from barley) with G-actin, F-actin, other cellular Binding partners and / or pathogen components blocked or competitively expressed in the plants.
  • a specific domain of ADFs can be isolated and identified, as known to those skilled in the art and can be found in the literature (Harlow et al., 1999, Using antibodies: a laboratory nianual, ColD Spring Harbor Laboratory Press).
  • Recombinant antibodies according to the invention are understood to be the known different forms of recombinant antibodies, as used e.g. in Skerra et al. (Curr Opin Immunol (1993) 2, 250-262).
  • the recombinant antibodies according to the invention comprise the so-called Fab fragments, Fv fragments, scFv antibodies, scFv homodimers which are linked to one another via disulfide bridges and so-called VH chains.
  • the Fab fragments consist of assembled full light and truncated heavy chains, whereas Fv fragments consist of non-covalently linked VH and VL chains.
  • scFv antibodies are preferably used according to the invention. These consist of the variable portion of the light chain and the variable portion of the heavy chain, which are fused together via a flexible linker peptide.
  • the production of such scFv antibodies has been extensively described in the prior art (see, inter alia Conrad et al., Vide supra; Breitling et al. (1999) Recombinant Antibodies, John Wiley & Sons, New York).
  • the scFv antibodies have the same antigenic specificity and activity as normal antibodies, but unlike other natural or recombinant antibodies, do not have to be assembled from single chains in vivo. They are therefore particularly suitable for the inventive method.
  • phage display libraries Another way of producing recombinant antibodies known to those skilled in the art is the screening of recombinant antibody libraries (so-called phage display libraries, see also Hoogenboom et al., (2000) Immunology Today 21, 371-378; Winter et al Ann., Rev. Immunol., 12, 433-455, De Wildt et al., (2000) Nat. Biotechnol., 18, 989-994).
  • recombinant antibodies to a given antigen can be enriched, selected and isolated in this method.
  • a method of expressing antibodies to ADFs may be e.g. the following steps include:
  • a) production of a vector comprising the following nucleic acid sequences in the 5'-3 'orientation: a plant-functional promoter sequence, operatively linked thereto a DNA sequence encoding a recombinant antibody specific for the endogenous ADF (s) and / or blocking interactions with physiological binding partners, preferably G-actin and / or F-actin , operatively linked to a plant functional
  • a plant-functional promoter sequence operatively linked thereto a DNA sequence encoding a recombinant antibody specific for the endogenous ADF (s) and / or blocking interactions with physiological binding partners, preferably G-actin and / or F-actin , operatively linked to a plant functional
  • Termination sequence b) transferring the vector from a) to the plant cells and optionally integration into the plant genome.
  • Another object of the present invention relates to plant cells and plants in which the endogenous genes of ADFs mutations, i. Substitutions, insertions and / or deletions have the result that the expressed endogenous ADFs are no longer or only partially able to interact with pathogen factors and / or their endogenous cellular binding partners.
  • Plants or plant cells having endogenous gene copies for ADFs having such mutations will, like the transgenic plants and plant cells described above, be characterized by increased transient or permanent pathogen resistance to the above-mentioned virus groups and strains.
  • Such plants and plant cells, which are not transgenic in contrast to the above-mentioned plants and plant cells can be prepared by classical mutagenesis.
  • non-transgenic plants or plant cells must have the abovementioned mutation types in the genes coding for endogenous ADFs, which lead to a modulation of the expression of the endogenous ADFs and / or the binding behavior of the endogenous ADFs.
  • Modulation of the expression of the endogenous ADFs can mean, for example, that the expression of the endogenous ADFs is downregulated by mutations in regulatory DNA elements of the genes of the endogenous ADFs, such as promoters, enhancers or generally so-called "upstream activating sequences".
  • the modulation of the binding behavior of ADFs in the context of the present invention means that the abovementioned mutation types lead to a change in the binding behavior of the endogenous ADFs in relation to the pathogenic factors and / or the normal cellular binding partners. Preference is given to a modulation of the binding behavior of the endogenous ADFs, which means that they no longer or only to a limited extent interact with pathogen factors and / or their cellular partners. A combination of the modulation of the expression and the binding behavior of the endogenous ADFs is also conceivable.
  • plants or plant cells may have mutations in the gene sequences for endogenous ADFs that result in the reduction of expression of these proteins.
  • Other plants or plant cells have mutations that lead to the dominant-negative mutants described above. In both cases, plants with increased pathogen resistance are obtained.
  • mutagenesis for example, plants or plant cells can be produced which have a reduction in the expression of these proteins due to mutations in enhancer and / or promoter sequences of the genes for endogenous ADFs and at the same time mutations in the coding
  • Have areas of genes encoding endogenous ADFs that cause the remaining expressed ADFs can no longer or only limitedly interact with the pathogenic and / or other cellular binding partners.
  • the non-transgenic plants and plant cells according to the invention which are distinguished by a modulation of the expression and / or the binding behavior of the endogenous ADFs and have a permanent or transient pathogen resistance, can preferably be produced by the so-called "TILLING" approach (Targeting Induced Local Lesion in US Pat Genomes).
  • TILLING Targeting Induced Local Lesion in US Pat Genomes. This method is described in detail in Colbert et al. (2001, Plant Physiology, 126, 480-484), McCallum et al. (2000, Nat. Biotechnol., 18, 455-457) and McCallum et al. (2000, Plant
  • the TILLING procedure is a so-called reverse genetics strategy that allows the production of high levels of point mutations in mutagenized plant collections, e.g. by chemical mutagenesis with ethyl methanesulphonate (EMS), combined with rapid systematic identification of mutations in target sequences.
  • EMS ethyl methanesulphonate
  • the target sequence is amplified by PCR in DNA pools of mutagenized M2 populations.
  • Denaturing and annealing reactions of the heteroallelic PCR products allow the formation of heteroduplexes in which one strand of DNA originates from the mutated and the other from the "wild-type" PCR product, at the point of point mutation, a so-called mismatch, either denaturing HPLC (DHPLC, McCallum et al., 2000, Plant Physiol., 123, 439-442) or with the CeZI mismatch detection system
  • the vectors which are used for the expression or silencing of ADFs comprise, in addition to the nucleic acid sequence to be transferred, further regulatory elements. Which specific regulatory elements these vectors must contain depends in each case on the method that should be carried out with these vectors. Which regulatory elements and other elements need to have these vectors is known to those skilled in the art familiar with the various methods mentioned above for producing transgenic plants in which the expression of a protein is inhibited.
  • operably linked means that the sequences that link the different nucleic acid sequences used are selected so as to preserve the function of the respective linked nucleic acid segment. If, for example, If the coding sequences of ADF3 are expressed in a cell, care must be taken that there are no sequences between the sequence for the promoter and the coding sequence for ADF3 which would lead to termination of the transcription.
  • the regulatory elements that contain the vectors are those that ensure transcription and, if desired, translation in the plant cell.
  • such elements can also bring about targeted localization of the proteins in specific cell types or cell organelles. This can be done, for example, by using epidermis cell-specific promoters.
  • the nucleic acid sequences to be transferred may be under the control of promoters functional in plants.
  • These promoters may be constitutive, but also inducible or tissue- or development-specific promoters. In addition, it may also be fungus-specific promoters.
  • constitutive 35S promoter typically, one will use the constitutive 35S promoter as promoter for vectors.
  • other promoters can be used, which are derived from different sources such. are obtained from plants or plant viruses and are suitable for the expression of genes in plants. The selection of the promoter as well as other regulatory sequences determine the spatial and temporal expression pattern and thus also the expresson or the silencing of the ADFs in transgenic plants.
  • Promoters of the phosphoenolpyruvate carboxylase from maize Hudspeth et al., 1989, Plant Mol. Biol., 12: 579) or potato fructose-1,6-bisphosphatase (WO 98/18940), which mediate leaf-specific expression, are suitable . It is also possible to use wound, light or pathogen induced as well as other developmentally dependent promoters or control sequences (Xu et al., 1993, Plant Mol. Biol.
  • Suitable promoters also include promoters which guarantee expression only in photosynthetically active tissues, such as the ST-LS1 promoter (Stockhaus et al., (1987) Proc Natl Acad., See, USA 84: 7943-7947, Stockhaus et al (1989) EMBO J. 8: 2445-2451). Also useful may be promoters that are active during plant transformation, plant regeneration or certain stages of these processes, such as cell division specific promoters such as the histone H3 promoter (Kapros et al., (1993) In Vitro Cell Cev. Biol. Plant 29: 27- 32) or the chemically inducible Tet repressor system (Gatz et al. (1991) Mol. Gen.
  • ST-LS1 promoter Stockhaus et al., (1987) Proc Natl Acad., See, USA 84: 7943-7947, Stockhaus et al (1989) EMBO J. 8: 2445-2451.
  • inducible promoters include virus-inducible promoters, such as the ACMV virion-sense promoter (Hong et al., 1996, Virology, 220: 119-227), which is induced by the gene product AC2.
  • virus-inducible promoters such as the ACMV virion-sense promoter (Hong et al., 1996, Virology, 220: 119-227), which is induced by the gene product AC2.
  • all promoters of such proteins that are induced in virus-infested tissue such as e.g. Phenylalanine, ammonium lyase, chalcone synthase, hydroxyproline-rich glycoprotein, extensin, pathogenesis-related proteins (e.g., PR-Ia) and wound-inducible protease inhibitors (US 6,013,864).
  • cDNA clones which are based on poly (A) + RNA molecules from a non-storage organ tissue, from the first bank identified by hybridization those clones whose corresponding poly (A) + RNA molecules accumulate only in the tissue of the storage organ.
  • promoters which have storage-organ-specific regulatory elements are isolated.
  • the skilled person is also available further PCR-based methods for the isolation of suitable storage organ-specific promoters.
  • the potato class I patatin gene B33 promoter is the potato class I patatin gene B33 promoter.
  • Further preferred promoters are those which are active in particular in fruits. These include, for example, the promoter of a polygalacturonase gene, e.g. from tomato which expresses expression during the ripening of tomato fruits (Nicholass et al. (1995) Plant Mol. Biol. 28: 423-435; this prior art describes the analysis of promoter / GUS fusion constructs), the promoter of an ACC- Oxidase, eg from apple, which confers maturity and fruit specificity in transgenic tomatoes (Atkinson et al. (1998) Plant Mol. Biol.
  • inducible promoters allows the production of plants and plant cells which express the sequences according to the invention only transiently or transiently.
  • transient expression allows the production of plants that are only transient Show pathogen resistance.
  • Such a transient resistance may be desirable, for example, when the danger of pathogen contamination threatens and the plants therefore only have to be resistant to the pathogen for a certain period of time.
  • Other situations in which transient resistance is desirable are known to those skilled in the art. It is also known to those skilled in the art that they can achieve transient or transient silencing and transient resistance by using unstable replicating vectors in plant cells carrying the appropriate sequences for expression for silencing ADFs.
  • Enhancer elements may also contain resistance genes, replication signals and other DNA regions which may cause propagation of the vectors in bacteria such as e.g. Allow E. coli.
  • the regulatory elements also include sequences that cause stabilization of the vectors in the host cells.
  • regulatory elements include sequences that enable stable integration of the vector into the host genome of the plant or autonomous replication of the vector in the plant cells.
  • Such regulatory elements are known to the person skilled in the art.
  • termination sequences are sequences that ensure that transcription or translation is properly terminated. If the transferred nucleic acids are to be translated, they are typically stop codons and corresponding regulatory sequences; If the transferred nucleic acids are only to be transcribed, they are generally poly A sequences.
  • vectors are plasmids, cosmids, viruses and other vectors commonly used in genetic engineering, with which nucleic acid molecules can be transferred to plants or plant cells.
  • cloning vectors which contain a replication signal for E. coli and a marker gene for the selection of transformed bacterial cells.
  • examples of such vectors are pBR322, pUC series, M13mp series, pACYC184, etc.
  • the desired sequence can be introduced into the vector at an appropriate restriction site.
  • the resulting plasmid is used for the transformation of E. coli cells.
  • Transformed E. coli cells are grown in a suitable medium and then harvested and lysed. The plasmid is recovered.
  • the analytical method used to characterize the plasmid DNA obtained is generally restriction analyzes, gel electrophoresis and other biochemical molecular biological methods.
  • the plasmid DNA can be cleaved and recovered DNA fragments can be linked to other DNA sequences.
  • Each plasmid DNA sequence can be cloned in the same or different plasmids. Cloning standard methods can be found in Sambrook et al., 2001 (Molecular cloning: A laboratory manual, 3rd edition, CoId Spring Harbor Laboratory Press).
  • plasmids By injection and electroporation of DNA into plant cells per se, no special requirements are imposed on the plasmids used. The same applies to direct gene transfer. Simple plasmids such as pUC derivatives can be used. However, if whole plants are to be regenerated from such transformed cells, the presence of a selectable marker gene is necessary. The skilled worker knows the usual selection markers and it is no problem for him to select a suitable marker. Common seclution markers are those which confer resistance to a biocide or an antibiotic on the transformed plant cells, such as kanamycin, G418, ampicillin, bleomycin, hygromycin, methotrexate, glyphosate, streptomycin,
  • the Ti or Ri plasmid are used for the transformation of the plant cell, then at least the right border, but frequently the right and left borders of the T-DNA contained in the Ti and Ri plasmid, must be connected as the flank region with the genes to be introduced ,
  • the DNA to be introduced must be cloned into specific plasmids, either into an intermediate or a binary vector.
  • the intermediate vectors can be integrated by homologous recombination into the Ti or Ri plasmid of the Agrobacterium due to sequences homologous to sequences in the T-DNA. This also contains the necessary for the transfer of T-DNA viral Region. Intermediate vectors can not replicate in agrobacteria. By means of a helper plasmid, the intermediate vector can be transferred to Agrobacterium tumefaciens (conjugation). Binary vectors can replicate in both E. coli and Agrobacteria.
  • the host cell serving Agrobacterium is to contain a plasmid carrying a vir region.
  • the vir region is necessary for the transfer of T-DNA into the plant cell.
  • T-DNA may be present.
  • the thus transformed Agrobacterium is used to transform plant cells.
  • T-DNA for plant cell transformation has been extensively studied and sufficiently described in EP 120,515.
  • plant explants may conveniently be cultured with Agrobacterium tumefaciens or Agrobacterium rhizogenes.
  • Whole plants can then be regenerated from the infected plant material (for example leaf pieces, stem segments, roots, but also protoplasts or suspension-cultivated plant cells) in a suitable medium which may contain antibiotics or biocides for the selection of transformed cells.
  • the regeneration of the plants is carried out by conventional regeneration methods using known nutrient media.
  • the plants or plant cells thus obtained can then be examined for the presence of the introduced DNA.
  • Cells are the transformation by the biolistic approach (Wan and Lemaux (1994) Plant Physiol 104, 37-48, Vasil et al (1993) Bio / Technology 11, 1553-1558, Ritala et al (1994) Plant Mol. Biol., 24, 317-325, Spencer et al., (1990), Theor. Appl. Genet., 79, 625-631), protoplast transformation, electroporation of partially permeabilized cells, and introduction of DNA by means of glass fibers.
  • the transformed cells grow within the plant in the usual way (see also McCormick et al., (1986) Plant Cell Reports 5, 81-84).
  • the resulting plants can be grown normally and crossed with plants having the same transformed genetic material or other genetic material.
  • the resulting hybrid individuals have the corresponding phenotypic properties.
  • Two or more generations should be grown to ensure that the phenotypic trait is stably maintained and inherited. Seeds should also be harvested to ensure that the corresponding phenotype or other peculiarities have been preserved.
  • transgenic lines that are homozygous for the new nucleic acid molecules and their phenotypic behavior can be determined by conventional methods examined for existing or non-existent pathogen responsiveness and compared with that of hemizygous lines.
  • plant cells containing the nucleic acid molecules according to the invention may also be used as plant cells (including
  • the vectors shown above can be transferred to plant cells in a variety of ways. Whether the vectors must be in linear or circular form depends on the particular application. The skilled person knows whether and when he can use corresponding linearized vectors or not. For example, one skilled in the art will appreciate that to produce specific knock-outs of genes for ADFs by homologous recombination, it may be sufficient to linearize the corresponding vectors and to inject them into transgenic plants.
  • transgenic plant encompasses both the plant in its entirety and all plant parts in which the expression and / or activity of ADFs according to the invention is altered.
  • plant parts may be plant cells, plant seeds, leaves, flowers and pollen.
  • Propagating material of transgenic plants according to the invention such as e.g. Seeds, fruits, cuttings, tubers, root pieces, etc., said propagation material optionally containing transgenic plant cells described above, as well as parts of these plants such as protoplasts, plant cells and calli.
  • transgenic plants In the production of transgenic plants, various methods and possibilities are available, as has already been stated above.
  • plants or plant cells can be modified by conventional genetic engineering transformation methods such that the new nucleic acid molecules are integrated into the plant genome, ie that stable Transformants are generated and the transferred nucleic acid molecules are replicated with the plant genome.
  • the vector system used it is also possible according to the invention to produce transgenic plants in which the nucleic acids to be transferred are contained in the plant cell or plant as a self-replicating system.
  • the vectors used to transfer the plants must then have correspondingly DNA sequences enabling the replication of plasmids used for transfer within the cell.
  • the plants used for the process according to the invention may, in principle, be any plant. Preferably, it is a monocot or dicotyle useful, food or forage plant.
  • monocotyledonous plants are plants belonging to the genera Avena (oats), Triticum (wheat), sea ale (rye), Hordeum (barley), Oryza (rice), Panicum, Pennisetum, Setaria, sorghum (millet), Zea (maize ) and the like.
  • Dicotyledonous crops include, but are not limited to, cotton, legumes such as legumes, and especially alfalfa, soybean, rapeseed, tomato, sugarbeet, potato, ornamentals, and trees.
  • Other crops may include fruits (especially apples, pears, cherries, grapes, citrus, pineapple and bananas), squash, cucumber, wine, oil palms, tea, cocoa and coffee bushes, tobacco, sisal and medicinal plants Rauwolfia and Digitalis.
  • the cereals are particularly preferably wheat, rye, oats, barley, rice, corn and millet, sugar beet, rapeseed, soy, tomato, potato and tobacco.
  • Other crops can be found in US Pat. No. 6,137,030.
  • Preferred plants are cereals, alfalfa, oats, barley, rye, wheat, triticale, millet, rice, alfalfa, flax, cotton, hemp and Brassicacaeen such as rape or canola.
  • Such transgenic plants, their propagation material, and their plant cells, tissue or parts are a further subject of the present invention.
  • the invention thus also relates to harvest products and propagation material of transgenic plants, which were prepared by a method according to the invention and have an increased pathogen resistance.
  • the harvested products and the propagation material are, in particular, fruits, seeds, flowers, tubers, rhizomes, seedlings, cuttings, etc. These may also be parts of these plants, such as plant cells, protoplasts and calli.
  • the present invention also relates to the use of the abovementioned nucleic acid sequences for the production of transgenic plants or plant cells having an increased pathogen resistance in the context of the present invention.
  • the present invention has for the first time succeeded in identifying, in addition to Rorl and Ror2 with ADF3, another gene in the barley which is involved in the mutant-mediated resistance.
  • ADF3 another gene in the barley which is involved in the mutant-mediated resistance.
  • transgenic plants have the advantage over other resistant plants that they are resistant not only to some specific mildew isolates, but to a variety of said mildew isolates, and this resistance is not limited to individual barley cultivars.
  • a particularly preferred embodiment of the present invention relates to transgenic barley plants or cells having increased resistance opposite Blumeria graminisf. sp. hordei in which the content and / or the activity of ADF3 from barley having the SEQ ID no. 1 is changed from the wild type.
  • particularly preferred embodiments of the present invention relate to methods for producing transgenic barley plants or the corresponding cells which have an increased resistance to Blumeria graminisf. sp. hordei in which the content and / or the activity of ADF3 with SEQ ID NO. 1 is changed from the wild type.
  • a particularly preferred embodiment of the present invention relates to the isolated nucleic acid sequence encoding ADF3 from barley of SEQ ID NO. 1 encoded as well as functionally equivalent parts and functional or non-functional
  • nucleic acid sequences which are essentially complementary to the particularly preferred last-mentioned nucleic acid sequences and hybridize to them under stringent conditions.
  • the Mo gene has been identified in all investigated land plants and thus in other organisms than barley such as ⁇ rabidopsis thaliana and in other Gramineae such as wheat, oats, corn, rye, rice, Panicum, Pennisetum, Setaria, sorghum, Maize and the like, it can be considered that the barley ADF3 acts as a prototype for the corresponding homologous ADFs from other plants in the production of transgenic plants having increased pathogen resistance.
  • the respective pathogen resistance may preferably be a resistance to formae speciales of Blumeria graminis, since this parasitism also occurs, for example, in wheat, oats and rye.
  • transgenic plants and plant cells according to the invention can have a permanent or transient pathogen resistance.
  • the type of resistant depends on the vectors used and the selection mechanisms used.
  • transgenic plants having increased pathogen resistance selected from the group consisting of wheat, barley, oats, rice, panicum, pennisetum, setaria, sorghum, corn and the like.
  • the above plants are resistant to the various formae speciales of the mildew pathogen Blumeria graminis, e.g. the isolates Blumeria graminis f. sp. Hordei, Blumeria graminis f. sp. tritici, Blumeria graminis f. sp. avenae.
  • the identification of factors involved in the / w / o-mediated race-nonspecific resistance mechanism in barley has usually been carried out by mutation screening methods (Freialdenhoven et al., vide supra). This is based on barley cultivars that have mlo alleles and are resistant to isolates of Blumeria graminisf. sp. hordei are.
  • the identification of factors that interact with the Mo locus is accomplished by selecting for plants that are mutagenic despite a mlo genotype for infection with isolates of Blumeria graminisf. sp. hordei are sensitive.
  • RNA interference-based screening method was used to identify genes that influence broad-band resistance as mediated by recessive loss-of-function mloallele.
  • Tissue Epidermis was withdrawn from 7-day old plants inoculated with Blumeria graminis hordei or tritici 6 and 24 hours after inoculation
  • the cDNA library was constructed using a Stratagene kit (pBluescript II XR cDNA Library Construction Kit, Catalog No. 200455). The selection of the transformed cells was carried out with ampicillin.
  • the thus-isolated cDNA fragments were then cloned using the Gateway ® technology Invitrogen into the vector pUAMBN.
  • the use of the Gateway ® technology is described in detail in Walhout et al. (Walhout et al., (2000) "GATEWAY recombinational cloning: Application of the cloning of large frames of ORFeoms", Applications of Chimeric Genes and Hybrid Proteins, San Diego: ACADEMIC PRESS Inc., pp 575-592 ).
  • the cDNA fragments were amplified by PCR through Gateway®- compatible oligonucleotides having the following sequences:
  • the underlined sequence is specific for the cDNA library.
  • the mirotiter plates were incubated at RT for 24 h; the complete batches were transformed into 50 ⁇ l chemocompetent E. coli (DH5 ⁇ ) (1 hr 4 ° C, 2 min 42 ° C); the complete transformations were plated on LB-Kan 3. then colonies were picked and grown in microtiter plates and Millipore 96 min minipreparation made. The DNA was taken up in 50 ⁇ l
  • the mirotiter plates were incubated at RT for 24 h; the complete batches were transformed into 50 ⁇ l chemocompetent E. coli (DH5 ⁇ ) (1 hr 4 ° C, 2 min 42 ° C); the complete transformations were plated on LB-Amp
  • the pU AMBN vector has a corn polyubiquitin promoter followed by two Gateway ® recombination cassettes in opposite orientation separated by the third intron of the barley mai resistance gene (see Fig.
  • This arrangement of the vector ensures that the fragments amplified by PCR are in the sense and antisense direction in the vector.
  • PCR fragment once in the sense and antisense direction in the vector is cloned, created after transfection of the vector into the plant cell and expression of the sequences, a double-stranded oligonucleotide molecule, which is able to trigger an RNAi response in the plants.
  • the Particle Delivery System ® Biolistic PDS- 1000 / He BioRad
  • gold particles were coated with the corresponding DNA.
  • To coat the gold particles typically 5 ⁇ l of DNA (1 ⁇ g / ⁇ l), 50 ⁇ l of 2.5 M CaCl 2 and 20 ⁇ l of 0.1 M spermidine were added to pre-prepared gold particles.
  • the particles were then pelleted by means of a bench top centrifuge and washed with 140 ⁇ l 70% ethanol and 140 ⁇ l 100% ethanol. After re-centrifugation, the coated gold particles were resuspended in 48 to 60 ⁇ l of 100% ethanol. Subsequently, the epidermis cells were bombarded according to the manufacturer's instructions with the coated particles.
  • the so-called single-cell transient expression assay as described by Shirasu et al. (Shirasu et al. (1999), Plant J., 17, 293-299).
  • the reporter plasmid containing the GUS gene was coated on gold particles. The coating and bombardment of the leaves was done as shown above. The bombarded leaves were transferred to 1% agar plates supplemented with 8% mM benzimidazole and incubated at 18 ° C. for 4 hours. Subsequently, the leaves were stained for GUS activity and examined microscopically.
  • the GUS construct is described in Nielsen et al. (Nielsen et al., (1999) Physiol. Mol. Plant Pathol., 54, 1-12).
  • dsRNAi constructs each containing a barley gene in the form of inverted repeats in pUAMBN as described above, were used together with a plasmid expressing the constitutive expression of the reporter protein ⁇ -glucuronidase (GUS). mediated transfected into the epidermis cells of individual barley leaves.
  • GUS reporter protein ⁇ -glucuronidase
  • the transformed samples with Blumeria graminisf. sp. hordei (Bgh) 96 hours after ballistic transfection. Forty-eight hours after inoculation, the leaves were stained for GUS activity, and individual transformed epidermal cells inoculated with IgA spores were examined microscopically for the fungal penetration success.
  • the barley cultivars transfected with the two named vectors were both the wild-type Mio and powdery mildew resistant m / o genotypes, as well as genotypes conferring race-specific resistance to certain mildew isolates. Mal, Mla6, Mlal2, MIg).
  • Cultivar Golden Promise (Mio): Max Planck Institute, Cologne Cultivar 110 (Mlal2): near isogenic to cv Ingrid cultivar BCPallasM ⁇ i cultivar BCPallasM ⁇ tf cultivar BCPallasMg cultivar BCIngridm / o5 cultivar BCIngridw / o5
  • a gene whose expression is expressed by the dsRNAi construct may be considered to be part of the Mo race non-specific resistance mechanism if it causes increased sensitivity to the Bgh pathway in the resistant m / o genotype, but does not affect breed-specific resistance in the Mal, Mla6, Mal 2, Mg genotypes.
  • the penetration success is examined microscopically, e.g. the extent of haustoria formation is observed.
  • ADF3 which is referred to below as ADF3 or HvADF3
  • HvADF3 HvADF3
  • This barley exhibited high amino acid sequence similarity to the previously described Arabidopsis thaliana and Zea mays actin depolymerizing factors.
  • the barley ADF3 has the sequence with SEQ ID no. 1.
  • a sequence alignment with other Arabidopsis thaliana ADFs is shown in FIG.
  • BCIngrid / M / o5 Penetration rate 15% ⁇ 3% Control: 0% ⁇ 0%
  • HvADF3 Variant of HvADF3 carrying an S 6 A-amino acid substitution that renders the protein inaccessible for N-terminal phosphorylation.
  • a corresponding mutant has been described for maize ADF3 (Smertenko et al., Plant J 14, 187-193.)
  • HvADF3-CA-F (has HmdlII site and mutation Ser6 ⁇ Ala6): 5'-TTT AAG CTT GCC ACC ATG GCA AAC GCT TCA GCA GGT GCT GGG-3 1
  • the serine ⁇ against alanine exchange was inserted into the wild-type gene of HvADF3 by design of the corresponding primers.
  • the PCR product was cut with the above-mentioned restriction enzymes and ligated into the overexpression vector pUbi-MCS-Nos previously cleaved with the same restriction enzymes.
  • the resulting overexpression vector (pHvADF3-CA, Fig. 3) has a maize polyubiquitin promoter (pUbi), the mutant HvADF3 gene (HvADF3-CA), and a nopaline synthase transcription / termination sequence (NOS).
  • HvADF3 SEQ ID No. 45
  • Gateway primers SEQ ID No. 45
  • Primer HvADF3 gate F (has attB 1 region):
  • Primer HvADF3-Gate-R (has attB2 region):
  • HvADF3 specific sequences are underlined.
  • the dsRED vector (pUbi-RFP-Nos, Fig. 4) has a maize polyubiquitin
  • PTS peroxisome target sequence
  • Primer GFP-F (has Hm ⁇ II site and binds to GFP sequence): 5'-GCG AAG CTT GCC ACC ATG GTG AGC AAG GGC GAG-3 '
  • Primer GFP-PTS-R (has additional PTS and Mwl site, binds in GFP sequence): 5'-AAG ACG CGT TTA GAG GCG GGA CTT GTA CAG CTC G-3 '
  • the PCR was carried out with a GFP sequence as template.
  • the PCR product was cut with the above-mentioned restriction enzymes and ligated into the overexpression vector pUbi-MCS-Nos previously cleaved with the same restriction enzymes.
  • the GFP peroxisome target sequence vector (pGFPTS, Fig. 6) has a maize polyubiquitin promoter (pUbi), the green fluorescent protein coding gene including the peroxisome target sequence (GFPTS) and a nopaline synthase transcription termination sequence (NOS). ,
  • HvADFS are changed from the wild type
  • HvADFS intracellular transport mechanisms as a consequence of overexpression or silencing of HvADFS
  • transport-dependent defense mechanisms e.g.
  • the accumulation of vesicles at sites of infection may be the reason for an increase in the number of experiments that led to the identification of HvADFS
  • the fungus can form only very short hyphae in cells in which HvADFS is overexpressed, which prevents the establishment of a sustainable infection.
  • the fungal structures are fully formed in stomata cells that have not been transfected (see Fig. 8 c).
  • the fungal pathogen initially benefits from the host's degraded actin cytoskeleton in successful cell wall penetration, it can not establish a successful infection because apparently intact actin filaments are necessary for maintaining a compatible interaction.
  • Degradation of the content and / or activity of ADF3 in barley may result in race-nonspecific resistance to various Bgh isolates.
  • the SEQ ID NO. 11 specified nucleic acid sequence for ADF 3 from Ar ⁇ bidopsis th ⁇ li ⁇ n ⁇ can be amplified by the following primers:
  • the resulting fragment is cloned into a binary vector.
  • a subcloning into the vector pCR®2.1 TOPO (Invitrogen, Düsseldorf), from which the gene with the enzymes EcoRV and HindUI can be excised again (see Fig. 9).
  • the overhanging ends are filled in with the help of the Klenow enzyme.
  • the fragment prepared above is ligated into the Smal-opened, dephosphorylated binary vector pSUN2 (see Figure 10).
  • AtADF3 In order to enable the pathogen-inducible expression of AtADF3 as well, it is excised from pSUN2 with BgHI and ⁇ l and ligated into the vector Lo215.
  • This vector already contains the Arabidopsis thaliana Thi2.1 promoter (Acc. L41244, EppleJP., Apel, K. and Bohlmann, H. (1995)
  • An Arabidopsis thaliana thionin gene is inducible via a signal transduction pathway different from that for pathogenesis Plant Physiol. 109 (3), 813-820), which is induced by pathogen attack, which has already been demonstrated via a downstream GUS gene.
  • AtADF3 is cloned in place of the existing GUS gene by excising it with SacI and Smal from the vector, dephosphorylating and filling the vector and ligating the AtADF3 fragment into the vector. Via a homologous recombination (Gateway® reaction, Invitrogen, Düsseldorf) the promoter gene construct was subsequently recloned into the binary vector Lol23 (see FIG. 11).
  • the transformation is carried out according to the floral-dip method (modified according to Clough and Bent, 1998).
  • the seeds are sterilized overnight after harvesting with chlorine gas and then laid out on selection plates.
  • the antibiotics are added depending on the plant resistance marker. at BASTA is added to pSUN2, kanamycin is added to Lo 123.
  • the seeds are placed on the selection plates after sterilization and stored for stratification for 2 days at 4 0 C in the cold room. Thereafter, they will continue to be observed under short-day conditions.
  • the first selection of the plants can be carried out. Non-transgenic plants bleach during selection, while the transgenic plants that possess the corresponding resistance gene remain green.
  • the plants that remain green after the first selection are selected a second time under the same conditions.
  • the plants that do not bleach during the second selection can then be transplanted to soil.
  • the plants are selfed and the resulting T2 seed populations subjected to phytopathological analysis.
  • Refrigerator at about 16 ° C with a plastic bag covered dark and kept moist.
  • the plastic bag After one day, the plastic bag is opened slightly and later completely removed.
  • the biotrophic mildew fungus is cultured on Arabidopsis thaliana PüanzQn.
  • Arabidopsis thaliana PüanzQn To infect the 4 week old transgenic Ar ⁇ bidopsis PüaDzen conidia carriers are removed with a fine brush on the surface of the leaves and painted on the leaves of the transgenic plants. The plants are incubated for 7 days at 20 0 C. Seven days after inoculation, the conidiophores become visible on the leaves and chlorosis and necrosis appear in the following days. These symptoms are quantified and tested for significance.
  • transgenic Arabidopsis plants expressing vltADF3 constitutively or pathogen-inducible show significantly increased resistance to both Peronospor ⁇ p ⁇ r ⁇ sitic ⁇ and Erysiphe cichoracearum compared to non-transgenic wild-type plants.
  • Fig. 1 shows a sequence alignment of HvADFS and various ADFs from Arabidopsis thaliana (see also Table 7)
  • Figure 2 shows the vector pUAMBN used for dsRNAi-based silencing in barley epidermal cells.
  • Ubi corn polyubiquitin promoter; attRl and attR2, Gateway recombination sites; ccdB, negative selection marker; nos, Agrobacterium tumefaciens nopaline synthase transcriptional terminator.
  • Fig. 3 shows the vector pHvADF3-CA.
  • Fig. 4 shows the vector pUbi-RFP-nos.
  • FIG. 5 shows the visualization of the actin cytoskeleton in transfected individual epidermis leaf cells of oats by phalloidin staining.
  • the cells were transfected with a plasmid expressing dsRED (RFP) to label bombarded cells.
  • RFP plasmid expressing dsRED
  • FIG. 5 shows the visualization of the actin cytoskeleton in transfected individual epidermis leaf cells of oats by phalloidin staining.
  • the cells were transfected with a plasmid expressing dsRED (RFP) to label bombarded cells. When no additional gene was expressed (control, A), stained actin fibers were detectable within the labeled cells as well as in adjacent cells.
  • RFP plasmid expressing dsRED
  • Fig. 6 shows the vector pGFPTS.
  • Fig. 7 shows the movement of GFP-labeled peroxisomes in individual leaf epidermis cells of barley.
  • a plasmid encoding a GFP variant with a C-terminal peroxisomal targeting sequence was either isolated (A, control) or together with a plasmid carrying a "constitutively active" variant of HvADF3 carrying an S A-amino acid substitution (B ), expressed. While in the control transfections (A) GFP-labeled peroxisomes were constantly moving within the bombarded cells, the co-expressing peroxisomes of the constitutively active variant of HvADF3 (B) slowed down and finally aggregated.
  • Fig. 8 shows that overexpression of HvADF3 inhibits the development of the fungus.
  • Barley leaf dermis cells were transfected with GUS ( ⁇ -glucuronidase) reporter plasmids and a plasmid expressing the ectopic expression of a constitutively active variant of HvADF3 (which has an S 6 A-
  • FIG. 9 shows the vector ⁇ CR2.1 TOPO with inserted -4tADF3 gene.
  • Fig. 10 shows the vector pSUN2 with inserted -4tADF3 gene.
  • Fig. 11 shows the vector Lol23 with inserted AtAOF3 gene.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von transgenen Pflanzen und/oder Pflanzenzellen mit einer erhöhten Pathogenresistenz, wobei die transgenen Pflanzen bzw. Pflanzenzellen einen im Vergleich zum Wildtyp veränderten Gehalt und/oder eine veränderte Aktivität von mindestens einem Actin­ depolymerisierenden Faktor (ADF) aufweisen. Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls die Verwendung von Nukleinsäuren, die für mindestens einen ADF kodieren, zur Herstellung von transgenen Pflanzen bzw. Pflanzenzellen mit einer erhöhten Pathogenresistenz. Weiterhin betrifft die vorliegende Erfindung Nukleinsäuresequenzen, die für einen ADF kodieren.

Description

Verfahren zur Herstellung von transgenen Pflanzen mit erhöhter
Pathogenresistenz durch Veränderung des Gehalts und/oder der Aktivität von Actin-depolymerisierenden Faktoren
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von transgenen Pflanzen und/oder Pflanzenzellen mit einer erhöhten Pathogenresistenz, wobei die transgenen Pflanzen bzw. Pflanzenzellen einen im Vergleich zum Wildtyp veränderten Gehalt und/oder eine veränderte Aktivität an mindestens einem Actin- depolymerisierenden Faktor (ADF) aufweisen. Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls die Verwendung von Nukleinsäuren, die für mindestens einen ADF kodieren, zur Herstellung von transgenen Pflanzen bzw. Pflanzenzellen mit einer erhöhten Pathogenresistenz. Weiterhin betrifft die vorliegende Erfindung Nukleinsäuresequenzen, die für einen ADF kodieren.
Pflanzenkrankheiten, die durch verschiedene Pathogene wie z.B. Viren, Bakterien und Pilze verursacht werden, können zu erheblichen Ausbeuteverlusten beim Anbau von Kulturpflanzen führen. Heutzutage werden zur Kontrolle von Pilzerkrankungen Fungizide bei der landwirtschaftlichen Herstellung intensiv benutzt. Trotz solcher Kontrollmöglichkeiten geht ein beträchtlicher Anteil der möglichen Ausbeute infolge von Erkrankungen verloren. Um zum einen diese Ausbeuteverluste und zum anderen die Verwendung von Fungiziden im Allgemeinen zu reduzieren, gibt es seit längerem Bestrebungen, Kulturpflanzen mit einer natürlichen Resistenz gegen wichtige pilzliche Pathogene im Rahmen eines integrierten Pflanzenschutzes zu verwenden. Neben den klassischen Züchtungsverfahren zur Herstellung von Pflanzen mit einer natürlichen Resistenz spielen in den letzten Jahren verstärkt gentechnologische Ansätze eine große Rolle, bei denen z.B. durch Einführen externer Resistenzgene oder durch die Manipulation der endogenen Genexpression in den Pflanzen gezielt Resistenzen in wichtige Kulturpflanzen eingeführt werden sollen. Bei den natürlicherweise auftretenden Resistenzen können verschiedene Resistenz- mechanismen unterschieden werden. Die so genannte vorgeformte "Nicht- Wirt"- Resistenz beschreibt die Beobachtung, dass eine ganze Pflanzenart gegenüber einem spezifischen Erreger resistent ist. Dieses bisher nicht verstandene Phänomen beruht wahrscheinlich auf strukturellen oder chemischen Eigenschaften der Pflanzenart. Dabei kann es sich z.B. um die Dicke des Kotikels, das Vorhandensein von inhibitorischen Substanzen oder die begrenzte Verfügbarkeit von Nährstoffen handeln.
Aktive Resistenzmechanismen umfassen dagegen solche Reaktionen und
Mechanismen, die in der Wirtspflanze durch das angreifende Pathogen ausgelöst werden. In der Regel ist letzterer Resistenzmechanismus wichtiger, auch wenn betont werden muss, dass eine klare Trennung zwischen den aktiven Resistenzmechanismen und der vorgeformten Resistenz nicht immer möglich ist (Heitefuss, R. (2001), Naturwissenschaften, 88, 273-283).
Außerdem müssen Unterschiede hinsichtlich der Wirt-Pathogen-Interaktion berücksichtigt werden. Zum Beispiel benötigen obligat biotrophe Pathogene lebendes Wirtsgewebe. Daher kann der schnelle Zelltod im Wirt, wie er durch die so genannte hypersensitive Reaktion (HR) ausgelöst wird, eine wichtige Komponente in der Resistenz gegen biotrophe Pathogene sein. Im Gegensatz dazu bewirken pertothrophe Pathogene einen Zelltod im Wirt, der für eine weitere Entwicklung des Pathogens auf dem zerstörten Gewebe notwendig ist.
Es muss betont werden, dass Pflanzen gegen die große Mehrheit potentieller Pathogene resistent sind, d.h. eine bestimmte Pflanzenart kann nur durch eine begrenzte Anzahl an Pathogenen erfolgreich angegriffen werden. Das Scheitern eines erfolgreichen Angriffs durch ein Nicht-Pathogen ist die Folge der oben erwähnten "Nicht-Wirt"-Resistenz. Die Voraussetzung für einen erfolgreichen Angriff einer Pflanzenart durch ein Pathogen ist in der so genannten Basiskompatibilität zu sehen, die sich wahrscheinlich infolge einer Koevolution von Pflanzenwirt und den möglichen Pathogenen entwickelt hat. Ein Angriff wird nur erfolgreich sein, wenn das Pathogen über Faktoren verfügt, die es erlauben, die Basisresistenz der Pflanzenart zu überwinden.
Entsprechend werden bestimmte Pflanzenarten bzw. verschiedene Kultivare einer Art gegenüber einem bestimmten Pathogen abhängig von ihrem Genotyp resistent oder empfänglich sein. Die unterschiedlichen Resistenzmechanismen, die für die Resistenz oder Empfänglichkeit einer Pflanzenart bzw. deren Kultivaren gegenüber bestimmten Pathogenen verantwortlich sind, sollen beispielhaft für den Mehltauerreger {Blumeria graminis), der mehrere unterschiedliche Gräserarten befällt, dargestellt werden.
Der Mehltaupilz als Art umfasst mehrere formae speciales abhängig davon, ob der jeweilige Mehltaupilz z.B. Weizen oder Gerste befällt. Im Falle des Befalls von Gerste handelt es sich um Blumeria graminis f. sp. hordei, während es sich beim Befall von Weizen um Blumeria graminis f. sp. tritici handelt. Darüber hinaus können innerhalb der verschiedenen formae speciales unterschiedliche Rassen oder Pathotypen identifiziert werden, denen gegenüber unterschiedliche Kultivare der Wirtsarten eine unterschiedliche Resistenz aufweisen.
Im Folgenden werden die unterschiedlichen Resistenzmechanismen der Gerste gegenüber Mehltauerregern dargestellt, da dieses Wirts-Pathogen-System am besten untersucht ist. Die daraus gewonnenen Erkenntnisse können jedoch auch auf andere Mehltau-Wirt-Systeme wie z.B. den oben erwähnten Befall von Weizen durch Mehltauerreger übertragen werden. Andere Pflanzenarten, die durch Mehltauerreger befallen werden, umfassen z.B. Arabidopsis thaliana, Hordeum vulgäre (Gerste), Triticum aestivum und T. durum (Weizen), Seeale cereale (Roggen), Avena sativa - A -
(Hafer), Lycopersicon spp. (Tomate), Vitis spp. (Wein), Cucumis spp. (Gurke), Cucurbita spp. (Kürbis), Pisum spp. (Erbse), Prunus spp. (Pfirsich), Solarium tuberosum (Kartoffel), Rosa spp. (Rose), Fragaria ananassa (Erdbeere), Rhododendron spp. (Azalee), Malus domestica (Apfel) und Nicotiana tabacum (Tabak).
Blumeria graminisf. sp. hordei befällt ausschließlich die Epidermiszellschicht von Gersteblättern. Der Pilz dringt in die Pflanzenzelle mechanisch und enzymatisch durch die Zellwand mittels eines Penetrationspflocks ein, bei dem es sich um Konidien, d.h. asexuell gebildete Sporen handelt. Der erfolgreiche Befall von Gerstenblättern ist erreicht, wenn sich das Haustorium, bei dem es sich um das pilzliche Ernährungsorgan handelt, gebildet hat.
Man kann zwei verschiedene genetische Mechanismen unterscheiden, die Gerste gegenüber Mehltau Resistenz verleihen. Der erste Mechanismus basiert auf dem so genannten "Gen für Gen"-Konzept. Bei diesem Mechanismus wird die Resistenz dadurch erreicht, dass ein dominant agierendes Resistenzgen die Pflanzen nur gegenüber solchen Pilzisolaten resistent macht, die das entsprechende Avirulenzgen tragen. In den meisten Fällen ist diese so genannte Rassen-spezifische Resistenz, bei der ein Gerstekultivar nur gegenüber ausgewählten Mehltauisolaten resistent ist, durch die hypersensitive Reaktion (HR) gekennzeichnet, d.h. die Wirtszellen der Infektionsstelle sterben ab (Heitefuss, R., vide supra).
Im Gegensatz hierzu verleiht der zweite Mechanismus eine Breitbandresistenz gegen alle bekannten Isolate einer formae specialis des Mehltaupilzes und wird durch die Abwesenheit des so genannten Mo-Wildtypgens gekennzeichnet. Bei Mio handelt es sich um einen vermutlich negativen Regulator der Pathogenverteidigung (Devoto, A. et al (1999), J. Biol. Chem., 274, 34993 - 35004). Die Funktion dieses Mechanismus hängt auch von mindestens zwei weiteren Genen, Rorl und Ror2 ab (Freialdenhoven, A. et al. (1996), Plant Cell, 8, 5 - 14). Die Resistenz bzw. Inkompatibilität, wie sie durch rezessive /w/o-Resistenzallele vermittelt wird, ist im Allgemeinen nicht durch das Auftreten einer HR gekennzeichnet. Vielmehr ist der einzige sichtbare zelluläre Effekt, der während der Verteidigung der Pflanze gegen den angreifenden Pilz sichtbar wird, die Bildung einer subzellulären Zellwandapposition, die als Papille bezeichnet wird und sich direkt unterhalb des pilzlichen Penetrationspflocks, dem so genannten Appresorium, bildet. Bei dieser Art der Rasse-unspezifischen Resistenz, die durch rezessive mlo- Allele vermittelt wird, werden die Penetrationsversuche des Pilzes auf der Stufe der Papülenbildung inhibiert, d.h. es kommt nicht zur Ausbildung eines Haustoriums, was für die Etablierung eines effizienten Befalls essentiell ist.
Die Pathogen-induzierte Papillenbildung wird auch bei anderen Gramineae-Artcn beobachtet, was daraufhindeutet, dass die Rasse-unspezifische Resistenz, wie sie für das Gerste-Mehltau-System bekannt ist, auch bei anderen Pflanzenarten auftaucht. Dafür spricht auch, dass Mo-Proteine bei anderen Arten wie z.B. Arabidopsis thaliana oder Oryza sativa auftreten.
Da bei der Rasse-unspezifischen Resistenz ein Gerstekultivar gegenüber verschiedensten Mehltauisolaten resistent ist bzw. mehrere Gerstekultivare gegenüber verschiedensten Mehltauisolaten vom Blumeria graminisf. sp. hordei resistent sind (und dies, wegen der funktionellen Äquivalenz der Mo-Proteine in den verschiedenen Pflanzenarten, in denen diese auftreten, auch wahrscheinlich für diese Pflanzen gilt), haben diese Pflanzen gegenüber Pflanzen, die nur eine Rasse¬ spezifische Resistenz besitzen, erhebliche Vorteile und sind von besonderem Interesse. Es besteht daher ein Bedarf an weiteren Pflanzen bzw. Pflanzenzellen, die eine solche Rasse-unspezifische Resistenz gegenüber pilzlichen Erregern wie z.B. Mehltau zeigen.
Es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, transgene Pflanzen bzw. Pflanzenzellen zur Verfügung zu stellen, die eine erhöhte Resistenz gegenüber verschiedenen pflanzlichen Pathogenen aufweisen. Es ist weiterhin eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Pflanzen bzw. Pflanzenzellen mit einer Rasse- unspezifischen Resistenz gegenüber verschiedenen pilzlichen Pathogenen wie z.B. Mehltau zur Verfügung zu stellen. Es ist ebenfalls eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, transgene Gerstepflanzen bzw. Gerstepflanzenzellen zur Verfügung zu stellen, die eine Rasse-unspezifische Sequenz gegenüber pilzlichen Pathogenen, wie z.B. dem Mehltau-Erreger aufweisen. Darüber hinaus ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Verfahren zur Verfügung zu stellen, die die Herstellung der oben genannten transgenen Pflanzen bzw. Pflanzenzellen mit einer erhöhten (Rasse- unspezifischen) Resistenz gegenüber pflanzlichen Pathogenen, wie z.B. Mehltau, ermöglichen.
Zur Lösung dieser und weiterer Aufgaben, wie sie sich aus der Beschreibung ergeben, dienen die Merkmale der unabhängigen Ansprüche.
Bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung sind durch die Merkmale der Unteransprüche definiert.
Die genannten Aufgaben der vorliegenden Erfindung werden im Wesentlichen dadurch gelöst, dass ein Verfahren zur Herstellung von transgenen Pflanzen mit erhöhter Pathogenresistenz zur Verfügung gestellt wird, das dadurch gekennzeichnet ist, dass der Gehalt und/oder die Aktivität von mindestens einem Actin- depolymerisierenden Faktor (ADF) gegenüber dem entsprechenden Wildtyp verändert ist.
Wie oben dargestellt wurde, wird die Rasse-unspezifische Resistenz bei Gerste und anderen Gramineaen durch rezessive m/o- Allele vermittelt. Es sind daher seit längerem Anstrengungen unternommen worden, andere Gene zu identifizieren, die mit dem Mo-Gen interagieren. Durch einen Mutagenese-Screen konnten dabei mit Rorl und Ror2 weitere Gene identifiziert werden, die mit dem Mo-Gen genetisch interagieren (Freialdenhoven et al, vide supra). Ein generelles Problem bei der Identifizierung weiterer Gene, die mit dem Mo-Gen interagieren und damit ebenfalls durch entsprechende Manipulation zur Herstellung einer Rasse-unspezifϊschen Resistenz verwendet werden könnten, besteht darin, dass, abhängig von dem Screeningverfahren, mit dem modifizierte Infektionstypen nachgewiesen werden, und angesichts der genomischen Redundanz der Gerste die verwendeten Mutagenese-Screeningverfahren nicht immer sensitiv genug sind, um weitere Gene des durch /rc/o-vermittelten Resistenzmechanismus zu identifizieren.
In der vorliegenden Erfindung ist es durch einen neuen Screeningansatz, bei dem durch RNA-Interferenz (RNAi) epidermal exprimierte Gene gesilenct werden, erstmals gelungen, neben den bereits erwähnten Rorl und Ror2 ein weiteres Gen zu identifizieren, das genetisch mit Mio interagiert. Dabei handelt es sich um den Actin- depolymerisierenden Faktor 3 (ADF3) aus Gerste, dessen Aminosäuresequenz mit der SEQ ID No. 1 angegeben ist.
Überraschenderweise konnte im Rahmen der vorliegenden Erfindung ebenfalls gezeigt werden, dass die Überexpression oder Repression dieses Actin- depolymerisierenden Faktors eine Rasse-unspezifische Breitbandresistenz der Gerste gegen Mehltau vermittelt.
Die transgenen Pflanzen bzw. Pflanzenzellen aus Gerste, bei denen der Gehalt und/oder die Aktivität von ADF3 im Vergleich zum Wildtyp verändert ist, weisen somit eine erhöhte Rasse-unspezifische Resistenz gegenüber dem Mehltauerreger auf.
Es kann daher davon ausgegangen werden, dass durch Veränderung des Gehalts und/oder der Aktivität von ADFs im Vergleich zum Wildtyp transgene Pflanzen bzw. Pflanzenzellen verschiedener Pflanzenarten hergestellt werden können, die sich durch eine erhöhte Resistenz gegenüber pflanzlichen Pathogenen und insbesondere püzlichen Pathogenen wie Mehltau auszeichnen. Dies sollte insbesondere dann gelten, wenn die pflanzlichen Pathogene zur Etablierung einer effizienten Infektion eine funktionell relevante Interaktion mit dem Actin-Cytoskelett eingehen müssen (siehe unten).
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher ein isoliertes Nukleinsäuremolekül, das für den ADF3 aus Gerste mit der SEQ ID No. 1 kodiert. Ebenso Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind Nukleinsäuremoleküle, die für funktionell äquivalente Teile des ADF3 aus Gerste mit der SEQ ID No. 1 kodieren, die für Mutanten des ADF3 aus Gerste mit der SEQ ID No. 1 kodieren oder Nukleinsäuremoleküle, die zu den vorgenannten Nukleinsäuremolekülen unter stringenten Bedingungen hybridisieren.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind Proteine oder Proteinfragmente, die durch die vorhergehend genannten Nukleinsäuremoleküle kodiert werden.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch ein Verfahren zur Herstellung von transgenen Pflanzen bzw. Pflanzenzellen mit im Vergleich zum Wildtyp erhöhter Pathogenresistenz und einem veränderten Gehalt und/oder einer veränderten Aktivität von mindestens einem ADF.
Ebenfalls Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von transgenen Pflanzen bzw. Pflanzenzellen mit erhöhter Pathogenresistenz, bei denen die Expression von mindestens einem ADF durch Übertragung der oben genannten Nukleinsäuresequenzen oder solcher Nukleinsäuresequenzen, die zu ADF3 aus Gerste mit der SEQ ID No. 1 homolog sind, aufpflanzen bzw. Pflanzenzellen bewirkt wird. Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind Verfahren zur Herstellung von transgenen Pflanzen bzw. Pflanzenzellen mit erhöhter Pathogenresistenz, bei denen der Gehalt und/oder die Aktivität von mindestens einem endogenen ADF hoch- oder herunter-reguliert wird.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von transgenen Pflanzen bzw. Pflanzenzellen mit erhöhter Pathogenresistenz, bei denen die Aktivität von mindestens einem endogenen ADF durch Übertragung von Nukleinsäuremolekülen, die für nicht-funktionelle Homologe bzw. Teile davon des ADF3 aus Gerste mit der SEQ ID No. 1 kodieren, erniedrigt wird.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von transgenen Pflanzen bzw. Pflanzenzellen mit erhöhter Pathogenresistenz, bei denen Antikörper, die für ADFs spezifisch sind und möglicherweise deren Funktion hemmen, in der Zelle exprimiert werden.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind Verfahren zur Herstellung von transgenen Pflanzen bzw. Pflanzenzellen mit erhöhter Pathogenresistenz, bei denen der posttranslationale Modifikationsstatus von mindestens einem überexprimierten und/oder endogenen ADF verändert wird.
Ebenfalls ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind Verfahren zur Herstellung von transgenen Pflanzen bzw. Pflanzenzellen mit erhöhter Pathogenresistenz, bei denen die Expression von mindestens einem ADF durch Verfahren wie z.B. antisense-Verfahren, post-transcriptional gene silencing (PTGS), virus-induced gene silencing (VIGS), RNA interference (RNAi), Ribonuklease P-Konstrukte, Hammerhead-Ribozym-Konstrukte oder homologe Rekombination gesilenct wird.
Gegenstand der Erfindung sind ebenfalls transgene Pflanzen bzw. Pflanzenzellen mit einer erhöhten Pathogenresistenz, die über einen im Vergleich zum Wildtyp veränderten Gehalt und/oder eine veränderte Aktivität von mindestens einem ADF verfügen.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind ebenfalls transgene Pflanzen bzw. Pflanzenzellen, die nach einem der erfindungsgemäßen Verfahren hergestellt wurden und über im Vergleich zum Wildtyp erhöhte Pathogenresistenzen verfugen.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung von Nukleinsäuren, die für funktionelle oder nicht-funktionelle ADFs bzw. Teile davon aus verschiedenen Organismen kodieren, zur Herstellung von transgenen Pflanzen bzw. Pflanzenzellen mit erhöhter Pathogenresistenz.
Die Verwendung der in der Erfindung beschriebenen Nukleinsäuresequenzen für die beschriebenen Verfahren bzw. zur Herstellung der genannten transgenen Pflanzen und Pflanzenzellen ist ebenfalls ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung.
"Pathogenresistenz" meint das Vermindern oder Abschwächen von Krankheitssymptomen einer Pflanze infolge eines Befalls durch ein Pathogen. Die Symptome können vielfältiger Art sein, umfassen aber bevorzugt solche, die direkt oder indirekt zu einer Beeinträchtigung der Qualität der Pflanze, der Quantität des Ertrags, der Eignung zur Verwendung als Futter- oder Nahrungsmittel fuhren oder aber auch Aussaat, Anbau, Ernte oder Prozessierung des Ernteguts erschweren
Unter dem Begriff "erhöhte Pathogenresistenz" wird erfindungsgemäß verstanden, dass die erfindungsgemäßen transgenen Pflanzen bzw. Pflanzenzellen durch pflanzliche Pathogene weniger stark und/oder weniger häufig befallen werden. Der Begriff "erhöhte Pathogenresistenz" beinhalt dabei auch eine so genannte transiente Pathogenresistenz, d.h. dass die erfindungsgemäßen transgenen Pflanzen bzw. Pflanzenzellen nur für einen bestimmten Zeitraum eine gegenüber dem entsprechenden Wildtyp erhöhte Pathogenresistenz aufweisen. Die reduzierte Häufigkeit bzw. das reduzierte Ausmaß des Pathogenbefalls bei den erfindungsgemäßen transgenen Pflanzen bzw. Pflanzenzellen wird dabei im Vergleich zum entsprechenden Wildtyp bestimmt. Erfindungsgemäß bevorzugt ist eine Erhöhung der Resistenz in dem Sinne, dass ein Befall der Pflanze mit dem Pathogen um mindestens 5%, bevozugt mindestens 20%, ebenfalls bevorzugt um mindestens 50%, 60% oder 70%, besonders bevorzugt um mindestens 80%, 90% oder 100%, ebenfalls besonders bevorzugt um den Faktor 5, insbesondere bevorzugt um mindestens den Faktor 10, ebenfalls insbesondere bevorzugt um mindestens den Faktor 50, noch bevorzugter um mindestens den Faktor 100 und am meisten bevorzugt um mindestens den Faktor 1000 seltener bzw. weniger stark im Vergleich zum Wildtyp ist.
Unter dem Begriff "pflanzliche Pathogene" werden erfindungsgemäß solche Pflanzenpathogene verstanden, die zur Etablierung einer effizienten Infektion mit dem pflanzlichen Actin-Cytoskelett interagieren müssen. Bevorzugt umfasst der Begriff "pflanzliche Pathogene" pilzliche Erreger.
Pilzpathogene oder pilz-ähnliche Pathogene (wie z.B. Chromista) stammen vorzugsweise aus der Gruppe umfassend Plasmodiophoramycota, Oomycota,
Ascomycota, Chytridiomyceten, Zygomyceten, Basidiomycota und Deuteromyceten (Fungi imperfecti). Beispielhaft jedoch nicht einschränkend seien die in Tabelle 1 und 2 genannten Pathogene und die mit ihnen in Zusammenhang gebrachten Erkrankungen zu nennen. Tabelle 1 : Pflanzliche Pilzerkrankungen
Besonders bevorzugt sind
Plasmodiophoromycota wie Plasmodiophora brassicae (Kohlhernie, clubroot of crucifers), Spongospora subterranea (powdery scab of potato tubers),
Polymyxa graminis (root disease of cereals and grasses),
Oomycota wie Bremia lactucae (Falscher Mehltau an Salat), Peronospora (Falscher Mehltau) bei snapdragon (P. antirrhini), Zwiebel (P. destructor), Spinat (P. effusa), Sojabohne (P. manchurica), Tabak ("blue mold" =
Blauschimmel; P. tabacina) Alfalfa und Klee (P. trifolium), Pseudoperonospora humuli (Falscher Mehltau an Hopfen), Plasmopara (Falscher Mehltau bei Trauben) (P. viticola) und Sonnenblume (P. halstedii), Sclerophtohra macrospora (Falscher Mehltau bei Cerealien und Gäsern), Pythium (seed rot, seedling damping-off, and root rot and all types of plants, z.B. Wurzelbrand an
Beta-Rübe durch P. debaryanum), Phytophthora infestans (Kraut- und Knollenfäule bei Kartoffel, Braunfäule bei Tomate etc.), Albugo spec. (white rust on cruciferous plants.
- Ascomycota wie Microdochium nivale (Schneeschimmel an Roggen und Weizen), Fusarium graminearum, Fusarium culmorum (Ährenfäule v.a. bei Weizen), Fusarium oxysporum (Fusarium- Welke an Tomate), Blumeria graminis (Echter Mehltau an Gerste (f.sp. hordei) und Weizen (f.sp. tritici)), Erysiphe pisi (Erbsenmehltau), Nectria galligena (Obstbaumkrebs), Unicnula necator (Echter Mehltau der Weinrebe), Pseudopeziza tracheiphila (Roter
Brenner der Weinrebe), Claviceps purpurea (Mutterkorn an z.B. Roggen und Gräsern), Gaeumannomyces graminis (Schwarzbeinigkeit an Weizen, Roggen u.a. Gräsern), Magnaporthe grisea (rice blast disease), Pyrenophora graminea (Streifenkrankheit an Gerste), Pyrenophora teres (Netzfleckenkrankheit an Gerste), Pyrenophora tritici-repentis (Blattfleckenkrankheit (Blattdürre) an Weizen), Venturia inaequalis (Apfelschorf), Sclerotinia sclerotium (Weißstengeligkeit, Rapskrebs), Pseudopeziza medicaginis (Klappenschorf an
Luzerne, Weiß- und Rotklee).
Basidiomyceten wie Typhula incarnata (Typhula-Fäule an Gerste, Roggen, Weizen), Ustilago maydis (Beulenbrand an Mais), Ustilago nuda (Flugbrand an Gerste), Ustilago tritici (Flugbrand an Weizen, Dinkel), Ustilago avenae
(Flugbrand an Hafer), Rhizoctonia solani (Wurzeltöter an Kartoffeln), Sphacelotheca spp. (head smut of sorghum), Melampsora lini (rust of flax), Puccinia graminis (Schwarzrost an Weizen, Gerste, Roggen, Hafer), Puccinia recondita (Braunrost an Weizen), Puccinia dispersa (Braunrost an Roggen), Puccinia hordei (Braunrost an Gerste), Puccinia coronata (Kronenrost an
Hafer), Puccinia striiformis (Gelbrost an Weizen, Gerste, Roggen sowie zahlreichen Gräsern), Uromyces appendiculatus (Bohnenrost), Sclerotium rolfsii (root and stem rots of many plants).
Deuteromyceten (Fungi imperfecti) wie Septoria nodorum (Spelzenbräune) an Weizen (Septoria tritici), Pseudocercosporella herpotrichoides (Halmbruchkrankheit an Weizen, Gerste, Roggen), Rynchosporium secalis (Blattfleckenkrankheit an Roggen und Gerste), Alternaria solani (Dürrfleckenkrankheit an Kartoffel, Tomate), Phoma betae (Wurzelbrand an Beta-Rübe), Cercospora beticola (Cercospora-Blattfleckenkrankheit an Beta-
Rübe), (Alternaria brassicae (Rapsschwärze an Raps, Kohl u.a. Kreuzblütlern), Verticillium dahliae (Rapswelke und -stengelfäule), Colletotrichum lindemuthianum (Brennfleckenkrankheit an Bohne), Phoma lingam - Umfallkrankheit (Schwarzbeinigkeit an Kohl; Wurzelhals- oder Stengelfäule an Raps), Botrytis cinerea (Grauschimmel an Weinrebe, Erdbeere, Tomate, Hopfen etc.).
Ebenfalls bevorzugt sind Phytophthora infestans (Kraut- und Knollenfäule, Braunfäule bei Tomate etc.), Microdochium nivale (vormals Fusarium nivale; Schneeschimmel an Roggen und Weizen), Fusarium graminearum, Fusarium culmorum (Ährenfäule an Weizen), Fusarium oxysporum (Fusarium- Welke an Tomate), Blumeria grammis (Echter Mehltau an Gerste (f. sp. hordei) und Weizen (f. sp. tritici)), Magnaporthe grisea (rice blast disease), Sclerotinia sclerotium (Weißstengeligkeit, Rapskrebs), Septoria nodorum und Septoria tritici (Spelzenbräune an Weizen), Alternaria brassicae (Rapsschwärze an Raps, Kohl u.a. Kreuzblütlern), Phoma Ungarn (Umfallkrankheit, Schwarzbeinigkeit an Kohl; Wurzelhals- oder Stengelfäule an Raps).
Beispielhaft, jedoch nicht einschränkend, für bakterielle Pathogene seien die in Tabelle 2 aufgeführten Pathogene und die mit ihnen in Zusammenhang gebrachten Erkrankungen zu nennen.
Tabelle 2: Bakterielle Erkrankungen
Besonders bevorzugt sind die erfindungsgemäß hergestellten transgenen Pflanzen resistent gegen nachfolgende pathogene Bakterien:
Corynebacterium sepedonicum (Bakterienringfäule an Kartoffel), Erwinia carotovora (Schwarzbeinigkeit an Kartoffel), Erwinia amylovora (Feuerbrand an Birne, Apfel, Quitte), Streptomyces Scabies (Kartoffelschorf), Pseudomonas syringae pv. tabaci (Wildfeuer an Tabak), Pseudomonas syringae pv. phaseolicola (Fettfleckenkrankheit an Buschbohne), Pseudomonas syringae pv. tomato ("bacterial speck" an Tomate), Xanthomonas campestris pv. malvacearum (Blattfleckenkrankheit an Baumwolle) und Xanthomonas campestris pv. oryzae (Bakterienfäule an Reis und anderen Gräsern).
Der Begriff "virale Pathogene" schließt sämtliche Pflanzenviren ein wie beispielsweise Tabak- oder oder Cucumber-Mosaiv Virus, Ringspot- Virus, Nekrose-Virus, Mais Dwarf-Mosaic Virus etc.
Beispielhaft, jedoch nicht einschränkend, für virale Pathogene seien die in Tabelle 3 aufgeführten Pathogene und die mit ihnen in Zusammenhang gebrachten Erkrankungen zu nennen.
Tabelle 3: Virale Erkrankungen
Auch gegen tierische Schädlinge wie Insekten und Nematoden können die erfindungsgemäßen Pflanzen und Pflanzenzellen resistent sein. Beispielhaft, jedoch nicht einschränkend, seien Insekten wie beispielsweise Käfer, Raupen, Läuse oder Milben zu nennen.
Bevorzugt sind die erfindungsgemäßen Pflanzen resistent gegen gegen Insekten der Gattungen Coleoptera, Diptera, Hymenoptera, Lepidoptera, Mallophaga, Homoptera, Hemiptera, Orthoptera, Thysanoptera. Dermaptera, Isoptera, Anoplura, Siphonaptera, Trichoptera, etc. Besonders bevorzugt sind Insekten der Gattungen Coleoptera and Lepidoptera, wie beispielsweise der Maiszünsler (European Com Borer (ECB)), Diabrotica barberi ("northern com rootworm"), Diabrotica undecimpunctata ("southern com rootworm"), Diabrotica virgifera ("Western com rootworm"), Agrotis ipsilon ("black cutworm"), Crymodes devastator ("glassy cutworm"), Feltia ducens ("dingy cutworm"), Agrotis gladiaria ("claybacked cutworm"), Melanotus spp., Aeolus mellillus ("wireworm"), Aeolus mancus ("wheat wireworm"), Horistonotus uhlerii ("sand wireworm"), Sphenophorus maidis ("maize billbug"), Sphenophorus zeae ("timothy billbug"), Sphenophorus parvulus ("bluegrass billbug"), Sphenophorus callosus ("southem com billbug"), Phyllogphaga spp.("white grubs"), Anuraphis maidiradicis ("com root aphid"), Delia platura ("seedcom maggot"), Colaspis brunnea ("grape colaspis"), Stenolophus lecontei ("seedcom beetle") und Clivinia impressifrons ("lender seedcom beetle").
Femer sind zu nennen: Das Getreidehähnchen (Oulema melanopus), die Fritfliege (Oscinella frit), Drahtwürmer (Agrotis lineatus) und Blattläuse (wie z.B. Haferblattlaus Rhopalosiphum padi, Grosse Getreideblattlaus Sitobion avenae).
Beispielhaft, jedoch nicht einschränkend, für Nematodenschädlinge seien die in Tabelle 4 aufgeführten Pathogene und die mit ihnen in Zusammenhang gebrachten Erkrankungen zu nennen.
Tabelle 4: Parasitäre Nematoden
Ganz besonders bevorzugt sind die erfindungsgemäß hergestellten transgenen Pflanzen resistent gegen Globodera rostochiensis und G. pallida (Zystenälchen an Kartoffel, Tomate u.a. Nachtschattengewächsen), Heterodera schachtii (Rübenzystenälchen an Zucker- und Futterrübe, Raps, Kohl etc.), Heterodera avenae (Haferzystenälchen an Hafer u.a. Getreidearten), Ditylenchus dipsaci (Stengel- oder Stockälchen, Rübenkopfälchen an Roggen, Hafer, Mais, Klee, Tabak, Rübe), Anguina tritici (Weizenälchen, Radekrankheit an Weizen (Dinkel, Roggen), Meloidogyne hapla (Wurzelgallenälchen an Möhre, Gurke, Salat, Tomate, Kartoffel, Zuckerrübe, Luzerne).
Bei einzelnen landwirtschaftlich besonders bedeutenden Sorten sind die erfindungsgemäßen Pflanzen bevorzugt gegen die folgenden Pathogene resistent:
Bei Gerste gegen die Pilz-, bakteriellen und viralen Pathogene Puccinia graminis f.sp. hordei (barley stem rast), Blumeria (Erysiphe) graminis f.sp. hordei (Barley Powdery Mildew), barley yellow dwarf virus (BYDV), und die pathogenen Insekten / Nematoden Ostrinia nubilalis (European com borer); Agrotis ipsilon (black cutworm); Schizaphis graminum (greenbug); Blissus leucopterus leucopterus (chinch bug); Acrosternum hilare (green stink bug); Euschistus servus (brown stink bug); Deliaplatura (seedcorn maggot); Mayetiola destructor (Hessian fly); Petrobia latens (brown wheat mite).
Bei der Sojabohne gegen die Pilz-, bakteriellen oder viralen Pathogene Phytophthora megasperma fsp.glycinea, Macrophomina phaseolina, Rhizoctonia solani, Sclerotinia sclerotiorum, Fusarium oxysporum, Diaporthe phaseolorum var. sojae (Phomopsis sojae), Diaporthe phaseolorum var. caulivora, Sclerotium rolfsii, Cercospora kikuchii, Cercospora sojina, Peronospora manshurica, Colletotrichum dematium (Colletotrichum truncatum), Corynespora cassiicola, Septoria glycines, Phyllosticta sojicola, Alternaria alternata, Pseudomonas syringae p.v. glycinea, Xanthomonas campestris p.v. phaseoli, Microsphaera diffussa, Fusarium semitectum, Phialophora gregata, Sojabohnen Mosaikviras, Glomerella glycines, Tobacco Ring spot virus, Tobacco Streak virus, Phakopsorapachyrhizi, Pythium aphanidermatum, Pythium ultimum, Pythium debaryanum, Tomato spotted wilt virus, Heterodera glycines, Fusarium solani und die pathogenen Insekten / Nematoden Pseudoplusia includens (soybean looper); Anticarsia gemmatalis (velvetbean Caterpillar); Plathypena scabra (green cloverworm); Ostrinia nubilalis (European com borer); Agrotis ipsilon (black cutworm); Spodoptera exigua (beet armyworm); Heliothis virescens (cotton budworm); Helicoverpa zea (cotton bollworm); Epilachna varivestis (Mexican bean beetle); Myzus persicae (green peach aphid); Empoasca fabae (potato leaf hopper); Acrostemum hilare (green stink bug); Melanoplus femurrubrum (redlegged grasshopper); Melanoplus differentialis (differential grasshopper); Hylemya platura (seedcom maggot); Sericothrips variabilis (soybean thrips); Thrips tabaci (onion thrips); Tetranychus turkestani (strawberry spider mite); Tetranychus urticae (twospotted spider mite).
Bei Canola gegen die Pilz-, bakteriellen oder viralen Pathogene Albugo Candida, Alternaria brassicae, Leptosphaeria maculans, Rhizoctonia solani, Sclerotinia sclerotiorum, Mycosphaerella brassiccola, Pythium ultimum, Peronospora parasitica, Fusarium roseum, Alternaria alternata.
Bei Alfalfa gegen die Pilz-, bakteriellen oder viralen Pathogene Clavibater michiganese subsp. insidiosum, Pythium ultimum, Pythium irreguläre, Pythium splendens, Pythium debaryanum, Pythium aphanidermatum, Phytophthora megasperma, Peronospora trifoliorum, Phoma medicaginis var. medicaginis, Cercospora medicaginis, Pseudopeziza medicaginis, Leptotrochila medicaginis, Fusarium, Xanthomonas campestris p.v. alfalfae, Aphanomyces euteiches, Stemphylium herbarum, Stemphylium alfalfae.
Bei Weizen gegen die Pilz-, bakterielle oder virale Pathogene Pseudomonas syringae p.v. atrofaciens, Urocystis agropyri, Xanthomonas campestris p.v. translucens, Pseudomonas syringae p.v. syringae, Alternaria alternata, Cladosporium herbarum, Fusarium graminearum, Fusarium avenaceum, Fusarium culmorum, Ustilago tritici, Ascochyta tritici, Cephalosporium gramineum, Collotetrichum graminicola, Erysiphe graminis f.sp. tritici, Puccinia graminis f.sp. tritici, Puccinia recondita f.sp. tritici, Puccinia striiformis, Pyrenophora tritici-repentis, Septoria nodorum, Septoria tritici, Septoria avenae, Pseudocercosporella herpotrichoides, Rhizoctonia solani, Rhizoctonia cerealis, Gaeumannomyces graminis var. tritici, Pythium aphanidermatum, Pythium arrhenomanes, Pythium ultimum, Bipolaris sorokiniana, Barley Yellow Dwarf Virus, Brome Mosaic Virus, Soil Borne Wheat Mosaic Virus, Wheat Streak Mosaic Virus, Wheat Spindle Streak Virus, American Wheat Striate Virus, Claviceps purpurea, Tilletia tritici, Tilletia laevis, Ustilago tritici, Tilletia indica, Rhizoctonia solani, Pythium arrhenomannes, Pythium gramicola, Pythium aphanidermatum, High Plains Virus, European wheat striate virus, Puccinia graminis f.sp. tritici (Wheat stem rust), Blumeria (Erysiphe) graminis f.sp. tritici (Wheat Powdery Milde w) und die pathogenen Insekten / Nematoden Pseudaletia unipunctata (army worm); Spodoptera,frugiperda (fall armyworm); Elasmopalpus lignosellus (lesser cornstalk borer); Agrotis orthogonia (western cutworm); Elasmopalpus
Zignosellus (lesser cornstalk borer); Oulema melanopus (cereal leaf beetle); Hypera punctata (clover leaf weevil); Diabrotica undecimpunctata howardi (southern com rootworm); Russian wheat aphid; Schizaphis graminum (greenbug); Macrosiphum avenae (English grain aphid); Melanoplus femurrubrum (redlegged grasshopper); Melanoplus differentialis (differential grasshopper); Melanoplus sanguinipes
(migratory grasshopper); Mayetiola destructor (Hessian fly); Sitodiplosis mosellana (wheat midge); Meromyza americana (wheat stem maggot); Hylemya coarctata (wheat bulb fly); Frankliniella fusca (tobacco thrips); Cephus cinctus (wheat stem sawfly); Aceria tulipae (wheat curl mite).
Bei der Sonnenblume gegen die Pilz-, bakteriellen oder viralen Pathogene Plasmophora halstedii, Sclerotinia sclerotiorum, Aster Yellows, Septoria helianthi, Phomopsis helianthi, Alternaria helianthi, Alternaria zinniae, Botrytis cinerea, Phoma macdonaldii, Macrophomina phaseolina, Erysiphe cichoracearum, Rhizopus oryzae, Rhizopus arrhizus, Rhizopus stolonifer, Puccinia helianthi, Verticillium dahliae, Erwinia carotovorum p.v. Carotovora, Cephalosporium acremonium, Phytophthora cryptogea, Albugo tragopogonis und die pathogenen Insekten / Nematoden Suleima helianthana (sunflower bud moth); Homoeosoma electellum (sunflower moth); zygogramma exclamationis (sunflower beetle); Bothyrus gibbosus (carrot beetle); Neolasioptera murtfeldtiana (sunflower seed midge).
Bei Mais gegen die Pilz-, bakteriellen oder viralen Pathogene Fusarium moniliforme var. subglutinans, Erwinia stewartii, Fusarium moniliforme, Gibberella zeae (Fusarium graminearum), Stenocarpella maydi (Diplodia maydis), Pythium irreguläre, Pythium debaryanum, Pythium graminicola, Pythium splendens, Pythium ultimum, Pythium aphanidermatum, Aspergillus flavus, Bipolaris maydis 0, T (Cochliobolus heterostrophus), Helminthosporium carbonum I, II & III (Cochliobolus carbonum), Exserohilum turcicum I, II & III, Helminthosporium pedicellatum, Physoderma maydis, Phyllosticta maydis, Kabatiella maydis, Cercospora sorghi, Ustilago maydis, Puccinia sorghi, Puccinia polysora, Macrophomina phaseolina, Penicillium oxalicum, Nigrospora oryzae, Cladosporium herbarum, Curvularia lunata, Curvularia inaequalis, Curvularia pallescens, Clavibacter michiganese subsp. nebraskense, Trichoderma viride, Maize Dwarf Mosaic Virus A & B, Wheat Streak Mosaic Virus, Maize Chlorotic Dwarf Virus, Claviceps sorghi, Pseudonomas avenae, Erwinia chrysanthemi p.v. Zea, Erwinia corotovora, Cornstunt spiroplasma, Diplodia macrospora, Sclerophthora macrospora, Peronosclerospora sorghi, Peronosclerospora philippinesis, Peronosclerospora maydis, Peronosclerospora sacchari, Spacelotheca reiliana, Physopella zeae, Cephalosporium maydis, Caphalosporium acremonium, Maize Chlorotic Mottle Virus, High Plains Virus, Maize Mosaic Virus, Maize Rayado Fino Virus, Maize Streak Virus (MSV, Maisstrichel- Virus), Maize Stripe Virus, Maize Rough Dwarf Virus und die pathogenen Insekten / Nematoden Ostrinia nubilalis (European com borer); Agrotis ipsilon (black cutworm); Helicoverpa zea (com earworm); Spodoptera frugiperda. (fall armyworm); Diatraea grandiosella (southwestem com borer); Elasmopalpus lignosellus (lesser comstalk borer); Diatraea saccharalis (surgarcane borer); Diabrotica virgifera (westem com rootworm); Diabrotica longicornis barberi (northem com rootworm); Diabrotica undecimpunctata howardi (southem com rootworm); Melanotus spp. (wireworms); Cyclocephala borealis (northem masked chafer; white grub); Cyclocephala immaculata (southem masked chafer; white grub); Popilliajaponica (Japanese beetle); Chaetocnema pulicaria (com flea beetle); Sphenophorus maidis (maize billbug); Rhopalosiphum maidis (com leaf aphid); Anuraphis maidiradicis (com root aphid); Blissus leucopterus leucopterus (chinch bug); Melanoplus femurrubrum (redlegged grasshopper); Melanoplus sanguinipes (migratory grasshopper); Hylemva plarura (seedcom maggot);
Agromyza parvicornis (com blot leafininer); Anaphothrips obscrurus (grass thrips); Solenopsis milesta (thief ant); Tetranychus urticae (twospotted spider mite).
Bei Sorghum gegen die Pilz-, bakteriellen oder viralen Pathogene Exserohilum turcicum, Colletotrichum graminicola (Glomerella graminicola), Cercospora sorghi, Gloeocercospora sorghi, Ascochyta sorghina, Pseudomonas syringae p.v. syringae, Xanthomonas campestris p.v. holcicola, Pseudomonas andropogonis, Puccinia purpurea, Macrophomina phaseolina, Perconia circinata, Fusarium monilifonne, Altemaria alternate, Bipolaris sorghicola, Helminthosporium sorghicola, Curvularia lunata, Phoma insidiosa, Pseudomonas avenae (Pseudomonas alboprecipitans), Ramulispora sorghi, Ramulispora sorghicola, Phyllachara sacchari, Sporisorium reilianum (Sphacelotheca reiliana), Sphacelotheca cruenta, Sporisorium sorghi, Sugarcane mosaic H, Maize Dwarf Mosaic Virus A & B, Claviceps sorghi, Rhizoctonia solani, Acremonium strictum, Sclerophthona macrospora, Peronosclerospora sorghi, Peronosclerospora philippinensis, Sclerospora graminicola, Fusarium graminearum, Fusarium oxysporum, Pythium arrhenomanes, Pythium graminicola und die pathogenen Insekten / Nematoden Chilo partellus (sorghum borer); Spodoptera frugiperda (fall armyworm); Helicoverpa zea (com ear- worm); Elasmopalpus lignosellus (lesser comstalk borer); Feltia subterranea (granulate cutworm); Phvllophaga crinita (white grub); Eleodes, Conoderus und Aeolus spp. (wireworm); Oulema melanopus (cereal leaf beetle); Chaetocnema pulicaria (com flea beetle); Sphenophorus maidis (maize billbug); Rhopalosiphum maidis (com leaf aphid); Siphaflava (yellow sugarcane aphid); Blissus leucopterus leucopterus (chinch bug); Contarinia sorghicola (sorghummidge); Tetranychus cinnabarinus (carmine spider mite); Tetranychus urticae (two spotted spider mite).
Bei Baumwolle gegen die pathogenen Insekten / Nematoden: Heliothis virescens (cotton budworm); Helicoverpa zea (cotton bollworm); Spodoptera exigua (beet araiyworm); Pectinophora gossypiella (pink bollworm); Anthonomus grandis grandis (boll weevil); Aphis gossypii (cotton aphid); Pseudatomoscelis seriatus (cotton fleahopper); Trialeurodes abutilonea (bandedwinged whitefly); Lygus lineolaris (tarnished plant bug); Melanoplus femurrubrum (redlegged grasshopper); Melanoplus differentialis (differential grasshopper); Thrips tabaci (onion thrips); Franklinkiella fusca (tobacco thrips); Tetranychus cinnabarinus (carmine spider mite); Tetranychus urticae (twospotted spider mite);
Bei Reis gegen die pathogenen Insekten / Nematoden Diatraea saccharalis (sugarcane borer); Spodoptera frugiperda (fall armyworm); Helicoverpa zea (com earworm); Colaspis brunnea (grape colaspis); Lissorhoptrus oryzophilus (rice water weevil); Sitophilus oryzae (rice weevil); Nephotettix nigropictus (rice leafhopper); Blissus Ieucopterus leucopterus (chinch bug); Acrosternum hilare (green stink bug);
Bei Raps gegen die pathogenen Insekten / Nematoden Brevicoryne brassicae (cabbage aphid); Phyilotreta cruciferae (Flea beetle); Mamestra conjgurata (Bertha armyworm); Plutella xylostella (Diamond-back moth); Delia ssp. (Root maggots).
Insbesondere bevorzugt umfasst der Begriff "pflanzliches Pathogen" Pathogene der Gruppe Blumeria graminisf. sp. hordei, tritici, avenae, secalis, lycopersici, vitis, cucumis, Cucurbitae, pi$i,pruni, solani, rosae,fragariae, rhododendri, mali und nicotianae.
Unter "Actin-depolymerisierender Faktor 3 (ADF3) aus Gerste" wird ein Protein mit der SEQ ID No. 1 erfindungsgemäß verstanden. Unter "Actin-depolymerisierenden Faktoren (ADFs)" werden erfindungsgemäß solche Proteine verstanden, deren Sequenz eine signifikante Homologie zu dem oben genannten ADF3 aus Gerste aufweist.
Wenn im Folgenden von ADF3 gesprochen wird, ist damit der ADF3 aus Gerste mit der SEQ ID No. 1 gemeint, wohingegen bei Verwendung des Begriffs "ADFs" der ADF3 aus Gerste und/oder solche Proteine gemeint sind, die eine signifikante oder wesentliche Homologie zu dem ADF3 aus Gerste aufweisen.
Unter dem "Gehalt" an ADF3 aus Gerste bzw. ADFs im Allgemeinen wird erfindungsgemäß die Menge an ADF3 bzw. einem bestimmten ADF verstanden, wie er für den Wildtyp einer Pflanze bzw. Pflanzenzelle bestimmt werden kann.
Unter der "Aktivität" von ADF3 bzw. ADFs im Allgemeinen wird deren Fähigkeit verstanden, mit globulärem Actin (G- Actin) oder filamentösem Actin (F- Actin) bzw. anderen physiologischen Bindungspartnern zu interagieren.
Unter einem "gegenüber dem Wüdtyp veränderten Gehalt" an ADFs wird erfindungsgemäß daher eine gegenüber im Vergleich zum Wildtyp erhöhte oder erniedrigte Menge an ADFs verstanden. Die Erhöhung des Gehalts an ADFs kann dabei durch eine Erhöhung der Menge an endogenen ADFs oder durch Zuführen einer zusätzlichen Menge an exogenen ADFs erzielt werden. Die Erniedrigung der Menge an ADFs in den erfindungsgemäßen transgenen Pflanzen bzw. Pflanzenzellen wird im Allgemeinen durch eine Erniedrigung des Gehalts an endogenen ADFs erzielt.
Unter einem "Wildtyp" wird erfindungsgemäß der entsprechende nicht genetisch veränderte Ausgangsorganismus verstanden. Die Erhöhung der Aktivität an ADFs kann durch eine Erhöhung der Aktivität der endogenen ADFs und/oder durch Zufuhr einer zusätzlichen Menge an funktionellen ADFs erreicht werden. Eine Erniedrigung der Aktivität an ADFs kann durch eine Erniedrigung der Aktivität der endogenen ADFs erzielt werden. Gleichermaßen wird erfindungsgemäß unter einer Erniedrigung der Aktivität an ADFs verstanden, dass die Aktivität an endogenem ADF3 bzw. endogenen ADFs unverändert bleibt, die Interaktion der ADFs mit ihren physiologischen Bindungspartnern durch z.B. die Expression nicht-funktioneller Formen der ADFs oder Antikörpern aber signifikant inhibiert wird.
Vorzugsweise beträgt die durch ein erfindungsgemäßes Verfahren bewirkte Erhöhung des Gehalts und/oder der Aktivität an ADFs in einer transgenen Pflanze bzw. Pflanzenzelle mindestens 5%, bevorzugt mindestens 20%, ebenfalls bevorzugt mindestens 50%, besonders bevorzugt mindestens 100%, ebenfalls besonders bevorzugt mindestens den Faktor 5, insbesondere bevorzugt mindestens den Faktor 10, ebenfalls insbesondere bevorzugt mindestens den Faktor 50, noch bevorzugter mindestens den Faktor 100 und am meisten bevorzugt mindestens den Faktor 1000. Die erfindungsgemäßen transgenen Pflanzen weisen vergleichbare Erhöhungen des Gehalts und/oder der Aktivität an ADFs in einer transgenen Pflanze bzw. Pflanzenzelle auf.
Vorzugsweise beträgt die durch ein erfindungsgemäßes Verfahren bewirkte Erniedrigung des Gehalts und/oder der Aktivität an ADFs in einer transgenen Pflanzenzelle bzw. Pflanze mindestens 5%, bevorzugt mindesten 10%, besonders bevorzugt mindestens 20%, ebenfalls besonders bevorzugt mindestens 40%, ebenfalls besonders bevorzugt mindestens 60%, insbesondere bevorzugt mindestens 80%, ebenfalls insbesondere bevorzugt mindestens 90% und am meisten bevorzugt mindestens 98%. Wie bereits oben erwähnt wurde, betrifft ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung ein isoliertes Nukleinsäuremolekül, das für den ADF3 aus Gerste mit der SEQ ID No. 1 kodiert. Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft Nukleinsäuremoleküle, die für funktionell äquivalente Teile des ADF3 aus Gerste mit der SEQ ID No. 1 kodieren.
Wenn im Rahmen der Erfindung von "funktionell äquivalenten Teilen von ADF3" gesprochen wird, dann sind damit Fragmente der Nukleinsäuresequenzen, wie sie für den ADF3 mit der SEQ ID No. 1 kodieren, gemeint, deren Expression noch zu Proteinen mit den Bindungseigenschaften und strukturellen Eigenschafen des ADF3 führen. Gleichermaßen ist der Begriff "funktionell äquivalente Teile" zu verstehen, wenn er sich auf Proteinfragmente im Allgemeinen bezieht. Besonders bevorzugt handelt es sich dabei um Nukleinsäuresequenzen, die zu ADF3 -Fragmenten führen, die Deletionen von mehreren Aminosäuren am N- und/oder C-Terminus aufweisen, ohne dass es zu einer Veränderung der strukturellen Eigenschaften bzw. der
Bindungseigenschaften des ADF3 kommt. Mit Bindungseigenschaften von ADF3 ist insbesondere das Bindungsverhalten des ADF3 an G- Actin und/oder F- Actin gemeint.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind Nukleinsäuremoleküle, die für Mutanten des ADF3 kodieren. Unter "Mutanten von ADF3" werden sowohl funktionelle als auch nicht-funktionelle Mutanten des ADF3 verstanden. Bei funktionellen Mutanten handelt es sich um Formen von ADF3, die Punktmutation(en), Insertion(en) und/oder Deletion(en) aufweisen, ohne dass es dadurch zu einem wesentlichen Verlust der strukturellen Eigenschaften bzw. der Bindungseigenschaften des ADF3 kommt. ~
Die Bindungseigenschaften von ADF3 aus Zea mays sind ebenso wie dessen strukturelle Eigenschaften beschrieben worden (Jiang et al. (1997), Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 94, 9973 - 9978). Da es sich bei dem ADF3 aus Mais um einen ADF handelt, der im Sinne der vorliegenden Erfindung im Wesentlichen homolog zu ADF3 aus Gerste ist, können die in der genannten Publikation beschriebenen Erkenntnisse bezüglich des Bindungsverhaltens von ADFs an G- Actin und F-Actin auch bei der Herstellung von funktionellen und nicht-funktionellen Mutanten des erfindungsgemäßen ADF3 aus Gerste verwendet werden (siehe unten).
Funktionelle Punktmutanten wird man in der Regel dann erhalten, wenn ein so genannter konservativer Aminosäureaustausch vorgenommen wird, d.h. Aminosäuren mit vergleichbaren physiko-chemischen Eigenschaften werden gegeneinander ausgetauscht. Dabei werden hydrophobe für hydrophobe
Aminosäuren, hydrophile für hydrophile Aminosäuren, positiv geladene für positiv geladene Aminosäuren, etc. ausgetauscht. Ein Beispiel für einen konservativen Aminosäureaustausch ist ein Austausch von einem Valin für ein Alanin. Dabei wird der Fachmann beachten, ob sich der konservative Aminosäureaustausch in einer Region von ADF3 befindet, die für dessen Bindungsverhalten an F-Actin oder G- Actin essentiell ist. Anhaltspunkte darüber, ob eine bestimmte Region für das Bindungsverhalten von ADF3 essentiell ist, kann sich durch ein so genanntes Sequenz-Alignment mit bereits bekannten ADFs ergeben, für die die Bindungseigenschaften und strukturellen Eigenschaften bereits ermittelt wurden (siehe Jiang et al., vide supra). Im Gegensatz zu einer konservativen Mutation wird der Fachmann eher nicht davon ausgehen, dass bei einem Austausch von z.B. einem Lysin gegen ein Glutamat, d.h. einem positiv geladenen Rest gegen einen negativ geladenen Rest, es nicht zu einer funktionellen bzw. strukturellen Änderung des ADF kommt. Die gleichen Überlegungen, die bei der Herstellung von funktionellen Punktmutanten von ADF3 angestellt werden, gelten auch bei der Herstellung von funktionellen Insertions- und/oder Deletionsmutanten von ADF3 mit der Maßgabe, dass der Fachmann in diesem Fall besonders darauf achten wird, ob die hinzugefügten bzw. entfernten Aminosäuresequenzbereiche sich in einem Bereich befinden, der für die Bindung an Actin essentiell ist oder nicht. Ein Beispiel für eine funktionelle Mutante ist ein S6A- Aminosäureaustausch, der verhindert, dass das Protein am N-Terminus phosphoryliert wird. Durch den Austausch von Serin gegen Alanin in der Aminosäureposition 6 ist eine solche Mutante von ADF3 (SEQ ID No. 2) permanent aktiv und nicht mehr posttranslational regulierbar.
Die mutierte Aminosäure befindet sich an Position 6 der Aminosäuresequenz, wobei das Wildtyp Serin (S) gegen ein Alanin (A) getauscht wurde (Smertenko, A.P. et al. (1998) Plant J 14, 187-193).
Wie bereits oben erwähnt, sind ein Gegenstand der Erfindung ebenfalls Nuklein- säuremoleküle, die für nicht-funktionelle Mutanten des ADF3 aus Gerste kodieren. Bei solchen nicht-funktionellen Mutanten des ADF3 handelt es sich um Formen von ADF3, die nicht mehr oder zumindest nur noch sehr beschränkt in der Lage sind, mit G-Actin und/oder F- Actin bzw. anderen physiologischen Bindungspartnern von ADF3 zu interagieren. Solche nicht-funktionellen Mutanten von ADF3 können wiederum Punktmutation(en), Insertion(en) und/oder Deletion(en) umfassen. Solche nicht-funktionellen Mutanten von ADF3 sind z.B. bei der Herstellung von transgenen Pflanzen bzw. Pflanzenzellen nützlich, bei denen der Gehalt an endogenem ADF3 in der Gerste nicht verändert wird, die Aktivität an endogenem ADF3 durch Überexpression der genannten nicht-funktionellen Mutanten aber blockiert wird.
Nicht-funktionelle Mutanten von ADF3 verfugen erfindungsgemäß über im Wesentlichen gleiche Nukleinsäure- bzw. Aminosäuresequenzen wie funktionelle Mutanten von ADF3. Sie weisen jedoch an einigen Stellen Punktmutation(en), Insertion(en) oder Deletion(en) von Nukleotiden oder Aminosäuren auf, die im Gegensatz zu funktionellen Mutanten von ADF3 bewirken, dass die nicht¬ funktionellen Mutanten von ADF3 nicht oder nur sehr begrenzt in der Lage sind, mit F-Actin, G-Actin und/oder anderen physiologischen Bindungspartnern zu interagieren. Solche erfindungsgemäßen funktionellen bzw. nicht-funktionellen Mutanten von ADF3 können vom Fachmann in einfacher Weiser identifiziert werden. Dem Fachmann stehen eine Reihe von Techniken zur Verfügung, mit denen es möglich ist, Punktmutation(en), Insertion(en) oder Deletion(en) in die Nukleinsäuresequenzen, die für funktionelle bzw. nicht-funktionelle Mutanten von ADF3 kodieren, einzufügen (Sambrook (2001), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd edition, Coldspring Harbour Laboratory Press). Nach Einführung der Punktmutation/Insertion und/oder Deletion, die auch allgemein als Mutation bezeichnet werden, kann der Fachmann durch entsprechende Bindungstests, wie sie in den Beispielen dargestellt oder aus dem Stand der Technik bekannt sind, feststellen, ob die mutagenisierten ADF3 noch über ihre normalen Bindungseigen¬ schaften bezüglich G- Actin, F-Actin und/oder anderen physiologischen Bindungspartnern verfügen.
Nicht-funktionelle Mutanten von ADF3 verfügen über eine im Vergleich zum nicht- mutagenisierten ADF3 bzw. zur funktionellen Mutante von ADF3 erniedrigte Bindungsspezifität, bevorzugt gegenüber G- Actin und/oder F-Actin. Erfindungsgemäß verfügt eine nicht-funktionelle Mutante von ADF3 über 1 bis 90%, bevorzugt über 1 bis 70%, besonders bevorzugt über 1 bis 50%, ebenfalls besonders bevorzugt über 1 bis 30%, insbesondere bevorzugt über 1 bis 15% und am meisten bevorzugt über 1 bis 10% der Bindungseffizienz von ADF3 bzw. der entsprechenden funktionellen Mutanten von ADF3 gegenüber dem jeweiligen pathogenen und/oder physiologischen Bindungspartner, hierbei bevorzugt gegenüber G-Actin und/oder F- Actin.
Beispiele für Aminosäurepositionen, die für die Interaktion mit G-Actin und/oder F- Actin wichtig sind, sind die Aminosäurepositionen in ADF3 aus Gerste, die den Positionen Tyrosin-67 und Tyrosin-70 im ADF3 aus Mais entsprechen. Dabei handelt es sich um die Positionen Phenylalanin-66 und Phenylalanin-69 in HvADF3. Erfindungsgemäß umfasst der Begriff "nicht-funktioneller ADF3" nicht solche Proteine, die keine wesentliche Sequenzhomologie auf Aminosäure- bzw. Nukleinsäureebene zu funktionellem ADFF3 aufweisen. Proteine, die nicht in der Lage sind, an G-Actin und/oder F-Actin zu binden und keine wesentliche Sequenzhomologie zu ADF3 aufweisen, sind daher definitionsgemäß mit dem erfindungsgemäßen Begriff "nicht-funktionelle Mutante von ADF3" nicht gemeint. Nicht-funktionelle Mutanten von ADF3 werden im Rahmen der Erfindung auch als inaktivierte oder inaktive ADF3 bezeichnet.
Somit zeichnen sich die erfindungsgemäßen funktionellen und/oder nicht¬ funktionellen Mutanten von ADF3, die die oben genannte Punktmutation(en), Insertion(en) und/oder Deletion(en) tragen, oder die funktionell äquivalenten Teile durch eine wesentliche Sequenzhomologie zu ADF3 aus.
Unter "wesentlicher Sequenzhomologie" wird erfindungsgemäß allgemein verstanden, dass die Nukleinsäure- bzw. Aminosäuresequenz eines DNA-Moleküls bzw. eines Proteins zu mindestens 40%, bevorzugt zu mindestens 50%, weiter bevorzugt zu mindestens 60%, ebenfalls bevorzugt zu mindestens 70%, 80% oder 85%, besonders bevorzugt zu mindestens 90%, insbesondere bevorzugt zu mindestens 95% und am meisten bevorzugt zu mindestens 98% zu den Nukleinsäure¬ bzw. Aminosäuresequenzen von ADF3 oder dessen funktionell äquivalenten Teilen identisch ist. Vorzugsweise wird die Homologie über die gesamte Sequenzlänge von ADF3 bestimmt.
Unter "Identität zwischen zwei Proteinen" wird die Identität der Aminosäuren über einen bestimmten Proteinbereich verstanden, vorzugsweise die gesamte Proteinlänge, insbesondere die Identität, die durch Vergleich mit Hilfe der Lasergene-Software der Firma DNA Star Inc., Madison, Wisconsin (USA) unter Anwendung der CLUSTAL- Methode (Higgins et al., 1989), Comput. Appl. Biosci., 5 (2), 151) berechnet wird. Bevorzugt wird die Homologie also über den gesamten Aminosäure- bzw. Nuklein- säuresequenzbereich berechnet. Neben den oben genannten Programmen stehen dem Fachmann für den Vergleich verschiedener Sequenzen noch weitere Programme zur Verfügung, die auf verschiedenen Algorithmen beruhen. Dabei liefern die Algorithmen von Needleman und Wunsch oder Smith und Waterman besonders zuverlässige Ergebnisse. Für die Sequenzvergleiche kann z.B. auch das Programm PiIe Aupa verwendet werden (J. Mol. Evolution. (1987), 25, 351 - 360; Higgins et al., (1989), Cabgos, 5, 151 - 153) oder die Programme Gap und Best Fit (Needleman und Wunsch, (1970), J. Mol. Biol, 48, 443 - 453 sowie Smith und Waterman (1981), Adv., Appl. Math., 2, 482 - 489), die im GCG-Software-Paket der Genetics Computer Group (575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711) enthalten sind.
Für die im Rahmen der vorliegenden Erfindung durchgeführten Sequenz- Alignments wurde das Clustal-W-Programm verwendet, wie es über http://www.ebi.ac.uk/clustalw aufgerufen werden kann. Die Parameter der genannten Startseite blieben für die Alignments unverändert.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind Nukleinsäuremoleküle, die mit den Nukleinsäuremolekülen, die für ADF3, funktionell äquivalente Teile davon bzw. funktionelle oder nicht-funktionelle Mutanten von ADF3 kodieren, unter stringenten Bedingungen hybridisieren bzw. zu diesen im Wesentlichen komplementär sind. Mit dem Begriff "Komplementarität" wird die Fähigkeit eines Nukleinsäuremoleküls beschrieben, mit einem anderen Nukleinsäuremolekül aufgrund von Wasserstoffbrücken zwischen komplementären Basen zu hybridisieren. Der Fachmann weiß, dass zwei Nukleinsäuremoleküle nicht über eine 100%ige Komplementarität verfugen müssen, um miteinander hybridisieren zu können. Bevorzugt ist eine Nukleinsäuresequenz, die mit einer anderen Nukleinsäuresequenz hybridisieren soll, zu dieser zu mindestens 40%, zu mindestens 50%, zu mindestens 60%, bevorzugt zu mindestens 70%, besonders bevorzugt zu mindestens 80%, ebenfalls besonders bevorzugt zu mindestens 90%, insbesondere bevorzugt zu mindestens 95% und am meisten bevorzugt zu mindestens 98% bzw. 100% komplementär.
Bevorzugt sind Homologie-, Komplementaritäts- und Identitätsgrade über die gesamte Protein- bzw. Nukleinsäurelänge zu bestimmen.
Nukleinsäuremoleküle sind identisch, wenn sie gleiche Nukleotide in gleicher 5 '-3'-
Reihenfolge aufweisen.
Stringente in vitro Hybridisierungsbedingungen sind dem Fachmann bekannt und können der Literatur entnommen werden (siehe z.B. Sambrook et al., vide supra).
Der Begriff "spezifische Hybridisierung" bezieht sich auf den Umstand, dass ein
Molekül unter stringenten Bedingungen präferentiell an eine bestimmte Nuklein- säuresequenz bindet, wenn diese Nukleinsäuresequenz Teil einer komplexen
Mischung von z.B. DNA- oder RNA-Molekülen ist.
Der Begriff "stringente Bedingungen" bezieht sich damit auf Bedingungen, unter denen eine Nukleinsäuresequenz präferentiell an eine Zielsequenz bindet, aber nicht oder zumindest wesentlich reduziert an andere Sequenzen.
Stringente Bedingungen sind von den Umständen abhängig. Längere Sequenzen hybridisieren spezifisch bei höheren Temperaturen. Generell werden stringente Bedingungen so gewählt, dass die Hybridisierungstemperatur circa 5°C unter dem Schmelzpunkt (Tm) für die spezifische Sequenz bei einer definierten ionischen Stärke und einem definierten pH- Wert liegt. Tm ist die Temperatur (bei einem definierten pH- Wert, einer definierten ionischen Stärke und einer definierten Nuklemsäurekonzentration), bei der 50% der Moleküle, die zu einer Zielsequenz komplementär sind, mit dieser Zielsequenz hybridisieren. Typischerweise umfassen stringente Bedingungen Salzkonzentrationen zwischen 0,01 und 1,0 M Natriumionen (oder eines anderen Salzes) und einen pH zwischen 7,0 und 8,3. Die Temperatur ist mindestens 30°C für kurze Moleküle (z.B. für solche, die zwischen 10 bis 50 Nukleotiden umfassen). Zusätzlich können stringente Bedingungen die Zugabe von destabilisierenden Agenzien wie z.B. Formamid umfassen. Typische Hybridisierungs- und Waschpuffer haben folgende Zusammensetzung.
Prähybridisierungslösung:
0,5 % SDS
5x SSC
5O mM NaPO4, pH 6,8
0,1% Na-Pyrophosphat
5x Denhardt's Reagenz
100 μg/ml Lachssperm
Hybridisierungslösung: Prähybridisierungslsg.
1x106 cpm/ml Sonde (5-10 min 95°C)
2Ox SSC: 3 M NaCl
0,3 M Natriumeitrat ad pH 7 mit HCl
50x Denhardt's Reagenz: 5 g Ficoll
5 g Polyvinylpyrrolidon 5 g Bovine Serum Albumine ad 500 ml A. dest.
Eine typische Verfahrensweise für die Hybridisierung sieht folgendermaßen aus:
Optional: Blot 30 min in Ix SSC/ 0,1% SDS bei 65°C waschen Prähybridisierung: mindestens 2 h bei 50-55°C
Hybridisierung: über Nachi : bei 55-60°C
Waschen: 5 min 2x SSC/ 0,1% SDS Hybridisierungstemp
30 min 2x SSC/ 0,1% SDS Hybridisierungstemp
30 min Ix SSC/ 0,1% SDS Hybridisierungstemp
45 min 0,2x SSC/ 0,l% SDS 65°C
5 min O5Ix SSC Raumtemperatur
Wie bereits oben erwähnt wurde, können die oben genannten Nukleinsäuresequenzen, die für ADF3 aus Gerste, funktionell äquivalente Teile davon bzw. funktionelle oder nicht-funktionelle Mutanten davon kodieren, benutzt werden, um transgene Pflanzen mit einem veränderten Gehalt und/oder einer veränderten Aktivität an ADF3 herzustellen, was zur Folge hat, dass diese Pflanzen über eine erhöhte Pathogenresistenz gegenüber dem Mehltauerreger Blumeria graminisf. sp. hordei verfugen.
Die vorliegende Erfindung ist jedoch nicht auf Verfahren zur Herstellung von transgenen Gerstepflanzen bzw. Gerstepflanzenzellen, die aufgrund eines veränderten Gehalts und/oder veränderten Aktivität von ADF3 aus Gerste eine erhöhte Resistenz gegenüber Blumeria graminisf. sp. hordei zeigen, beschränkt.
Es wird davon ausgegangen, dass (i) durch die Veränderung des Gehalts und/oder der Aktivität von Homologen von ADF3 in anderen Pflanzen ebenfalls transgene Pflanzen bzw. Pflanzenzellen hergestellt werden können, die über eine erhöhte Pathogenresistenz im Sinne der vorliegenden Erfindung verfugen und (ii), dass zur Herstellung von transgenen Pflanzen bzw. Pflanzenzellen mit einer erhöhten Pathogenresistenz auch auf Homologe von ADF3 aus Gerste zurückgegriffen werden kann.
Die vorliegende Erfindung betrifft damit generell Verfahren zur Herstellung von transgenen Pflanzen bzw. Pflanzenzellen mit einer erhöhten Pathogenresistenz, bei denen im Vergleich zum Wildtyp der Gehalt und/oder die Aktivität von mindestens einem ADF verändert ist. Bei den im Folgenden beschriebenen Verfahren zur Herstellung von transgenen Pflanzen mit erhöhter Pathogenresistenz und Änderung des Gehalts und/oder der Aktivität von mindestens einem ADF können daher neben den oben erwähnten Nukleinsäuresequenzen auch solche Nukleinsäuresequenzen zum Einsatz kommen, die für ADFs kodieren, die im Wesentlichen homolog zu dem ADF3 mit der SEQ ID No. 1 aus Gerste sind.
Unter wesentlicher Sequenzhomologie von ADFs zu dem ADF3 mit der SEQ ID No. 1 aus Gerste wird dabei erfindungsgemäß verstanden, dass die Nukleinsäure- bzw. Aminosäuresequenz eines solchen ADFs zu mindestens 40%, bevorzugt zu mindestens 50%, weiter bevorzugt zu mindestens 60%, ebenfalls bevorzugt zu mindestens 70%, 80% oder 85%, besonders bevorzugt zu mindestens 90%, insbesondere bevorzugt zu mindestens 95% und am meisten bevorzugt zu mindestens 98% zu den Nukleinsäure- bzw. Aminosäuresequenzen des ADF3 aus Gerste sind. Die Sequenzhomologie kann dabei nach den oben genannten Methoden festgestellt werden.
Bei den erfindungsgemäßen Verfahren können neben den genannten Nukleinsäuresequenzen, die für ADFs, die im Wesentlichen homolog zu ADF3 aus Gerste sind, kodieren, auch solche Nukleinsäuren verwendet werden, die für funktionell äquivalente Teile der ADFs bzw. funktionelle oder nicht-funktionelle Mutanten der ADFs kodieren, vorausgesetzt, dass es sich um ADFs handelt, die im Wesentlichen homolog zu dem ADF3 aus Gerste sind. Die oben beschriebenen Definitionen für funktionell äquivalente Teile bzw. funktionelle oder nicht¬ funktionelle Mutanten gelten dabei auch für die ADFs im Allgemeinen.
Beispiele für solche ADFs, die für die erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden können, sind die in Tabelle 5 angegebenen ADFs aus Arabidopsis thaliana, Zea mays, Hordeum vulgäre, Oryza sativa und Triticum aestivum. Geeignete Nukleotid- und Aminosäure-Sequenzen für die ADFs kann der Fachmann sowohl den in der Tabelle angegebenen Datenbankeinträgen als auch dem Sequenzprotokoll entnehmen.
Tabelle 5
Die GenBank-Datenbank kann über http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez aufgerufen werden. Die TIGR-Datenbank kann über http://www.tigr.org aufgerufen werden.
Es sind somit eine Vielzahl von DNA-Sequenzen, die für im Wesentlichen Homologe von ADF3 aus Gerste kodieren, bereits bekannt. Darüber hinaus können im Rahmen der vorliegenden Erfindung auch die Sequenzen von ADFs verwendet werden, die im Moment noch nicht in den öffentlichen Datenbanken zur Verfügung stehen.
Dem Fachmann ist bekannt, wie er entsprechende korrespondierende DNA- Sequenzen von anderen Organismen isolieren kann. Typischerweise wird der Fachmann zunächst durch Homologie- Vergleiche in den etablierten Datenbanken wie z.B. der GenBank-Datenbank am NCBI versuchen, entsprechende homologe Sequenzen zu identifizieren. Solche Datenbanken können auf der NCBI-Homepage beim NIH unter http://www.ncbi.nlm.nih.gov gefunden werden.
DNA-Sequenzen mit einer hohen Homologie, d.h. einer hohen Ähnlichkeit oder Identität sind bona fϊde Kandidaten für DNA-Sequenzen, die den erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen, d.h. ADF3 entsprechen. Diese Gensequenzen können durch Standardmethoden, wie z.B. PCR und Hybridisierung isoliert werden, und ihre Funktion durch entsprechende Enzymaktivitätstests und andere Experimente durch den Fachmann bestimmt werden. Homologievergleiche mit DNA-Sequenzen können erfindungsgemäß auch verwendet werden, um PCR-Primer zu designen, indem zunächst die Regionen identifiziert werden, die zwischen den DNA-Sequenzen von verschiedenen Organismen am meisten konserviert sind. Solche PCR-Primer können dann benutzt werden, um in einem ersten Schritt DNA-Fragmente zu isolieren, die Bestandteile von DNA-Sequenzen sind, die zu den DNA-Sequenzen der Erfindung homolog sind.
Es gibt eine Reihe von Suchmaschinen, die für solche Homologievergleiche bzw. -suchen verwendet werden können. Diese Suchmaschinen umfassen z.B. die CLUSTAL-Programmgruppe des BLAST-Programms, das durch das NCBI zur Verfügung gestellt wird.
Darüber hinaus sind dem Fachmann eine Reihe von experimentellen Methoden bekannt, mit denen DNA-Sequenzen aus verschiedensten Organismen isoliert werden können, die zu den erfindungsgemäßen ADFs homolog sind. Dazu gehört z.B. das Anfertigen und Screenen von cDNA-Bibliotheken mit entsprechend degenerierten Sonden (siehe auch Sambrook et al., vide suprä).
Erfindungsgemäß weisen der ADF3 aus Gerste und die ADFs im Allgemeinen eine so genannte Konsensusregion auf. In Abb. 1 findet sich ein so genanntes Sequenz- Alignment von verschiedenen ADF-Sequenzen aus A. thaliana mit ADF3 aus Gerste.
Aus diesem Sequenz-Alignment können verschiedene Konsensussequenzen abgeleitet werden, die für die erfindungsgemäßen ADFs charakteristisch sind. Die Konsensussequenz I umfasst die folgende Sequenz:
X1PX2X3X4CRX5X6X7X8DX9X10X11 (SEQ ID No. 89)
Dabei kann X1 jede beliebige Aminosäure, bevorzugt L oder I, umfassen. X2 kann jede Aminosäure umfassen. X3 kann jede Aminosäure, bevorzugt N oder D umfassen. X4 kann jede beliebige Aminosäure, bevorzugt D oder E umfassen. X5 kann jede Aminosäure, bevorzugt Y oder F umfassen, X6 kann jede Aminosäure, bevorzugt A oder C umfassen. X7 kann jede Aminosäure, bevorzugt V oder I umfassen. Xg kann jede Aminosäure umfassen. X9 kann jede Aminosäure umfassen. X10 kann jede Aminosäure, bevorzugt D oder E umfassen. X11 kann jede Aminosäure, bevorzugt F oder Y, umfassen. Die Aminosäuren sind dabei nach dem üblichen Einbuchstabencode angegeben.
Daneben sind die ADFs, die zur Verwendung in den erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt werden können, durch das Vorhandensein einer zweiten Konsensussequenz gekennzeichnet.
Diese zweite Konsensussequenz II umfasst folgende Sequenz:
Y1IY2Y3Y4Y5WY6PY7Y8Y9Y1OYI1RYI2YI3YI4YIS (SEQ ID NO. 90)
Dabei kann Y1 jede Aminosäure, bevorzugt K oder R, sein. Y2 kann jede
Aminosäure sein. Y3 kann jede Aminosäure, bevorzugt F oder Y sein. Y4 kann jede Aminosäure, bevorzugt F, I oder V sein. Y5 kann jede Aminosäure sein. Y6 kann jede Aminosäure, bevorzugt S oder C sein. Y7 kann jede Aminosäure, bevorzugt S, E oder D, sein. Y8 kann jede Aminosäure sein. Y9 kann jede Aminosäure, bevorzugt S oder A sein. Y10 kann jede Aminosäure sein. Y11 kann jede Aminosäure, bevorzugt I, V oder M sein. Y12 kann jede Aminosäure sein. Y13 kann jede Aminosäure, bevorzugt I, V oder M sein. Y14 kann jede Aminosäure sein. Y15 kann jede Aminosäure, bevorzugt S oder A sein. Auch hier sind die Aminosäuren im Einbuchstabencode angegeben.
Weiterhin sind die ADFs, die zur Verwendung in einem der erfindungsgemäßen Verfahren geeignet sind, durch folgende Konsensussequenz charakterisiert.
Die Konsensussequenz III umfasst die folgende Sequenz: RZ1Z2Z3GZ4Z5Z6EZ7Z8ATDZ9Z1OZ11Z12 (SEQ ID NO. 91)
Z1 kann jede Aminosäure, bevorzugt E, V oder T sein. Z2 kann jede Aminosäure, bevorzugt L oder M sein. Z3 kann jede Aminosäure, bevorzugt Q, E oder D sein. Z4 kann jede Aminosäure, bevorzugt I oder V sein. Z5 kann jede Aminosäure, bevorzugt H oder Q sein. Z6 kann jede Aminosäure sein. Z7 kann jede Aminosäure, bevorzugt I, L, M oder F sein. Z8 kann jede Aminosäure, bevorzugt Q oder H sein. Z9 kann jede Aminosäure sein. Z10 kann jede Aminosäure, bevorzugt T oder S sein. Z11 kann jede Aminosäure, bevorzugt E oder D sein. Z12 kann jede Aminosäure, bevorzugt V5 M oder I sein. Die Aminosäuren sind wiederum im Einbuchstabencode angegeben.
Die erfindungsgemäßen ADF-Sequenzen bzw. die ADFs, die für die erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden können, können die vorgenannten drei Konsensussequenzen I, II und III auch in Kombination enthalten.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich somit auch auf Nukleinsäuresequenzen, die u.a. für die oben dargestellte Konsensus-Sequenz mit der SEQ ID No. 89, 90 und/oder 91 kodieren sowie deren Verwendung in den erfindungsgemäßen Verfahren zur Herstellung von transgenen Pflanzen mit einer erhöhten Pathogenresistenz durch Änderung des Gehalts und/oder der Aktivität von mindestens einem ADF.
Wie bereits erwähnt, kann die Änderung des Gehalts und/oder der Aktivität von ADFs bzw. ADF3 auf verschiedene Weise erfolgen. Wenn im Folgenden auf ADFs im Allgemeinen Bezug genommen wird, schließt dies den ADF3 aus Gerste immer mit ein. Die Erhöhung der ADF -Aktivität und des ADF-Gehalts kann z.B. durch Ausschalten von hemmenden Regulationsmechanismen auf Transkriptions-, Translations- und Proteinebene oder durch Erhöhung der Genexpression einer Nukleinsäure kodierend für mindestens einen ADF bzw. funktionellen Homologen, Teilen oder Mutanten davon gegenüber dem Wildtyp erfolgen. Dies kann beispielsweise durch Induzierung des/der jeweiligen endogenen ADF-Gen(e) oder durch Einbringen von Nukleinsäuren kodierend für ADFs bzw. funktionellen Homologen, Teilen oder Mutanten davon erfolgen.
In einer bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Erhöhung der ADF- Aktivität bzw. des ADF-Gehalts gegenüber dem Wildtyp durch eine Erhöhung der Genexpression einer Nukleinsäure kodierend für einen ADF. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Erhöhung der Genexpression einer Nukleinsäure kodierend für einen ADF durch Einbringen von Nukleinsäuren, kodierend für mindestens ein ADF, in die jeweilige Pflanze bzw. Pflanzenzelle. Dazu können prinzipiell die ADF-Gene verschiedenster Organismen, also jede Nukleinsäure, die für einen ADF mit wesentlicher Homologie zu ADF3 aus Gerste bzw. funktionellen Homologen, Teilen oder Mutanten davon kodiert, verwendet werden. Bei genomischen ADF-Nukleinsäuresequenzen aus eukaryontischen Quellen, die Introns enthalten, sind für den Fall, dass der Wirtsorganismus nicht in der Lage ist oder nicht in die Lage versetzt werden kann, die entsprechenden ADF-Sequenzen zu spleißen, bevorzugt bereits prozessierte Nukleinsäuresequenzen wie entsprechende cDNAs zu verwenden. Alle in der Beschreibung erwähnten Nukleinsäuren können z.B. eine RNA-, DNA- oder cDNA-Sequenz sein.
Bei einem bevorzugten erfindungsgemäßen Verfahren zur Herstellung von transgenen Pflanzen bzw. Pflanzenzellen mit erhöhter Pathogenresistenz wird eine Nukleinsäuresequenz, die für mindestens einen ADF kodiert, auf eine Pflanze bzw. Pflanzenzelle übertragen. Diese Übertragung führt zu einer Erhöhung der Expression bzw. der Aktivität an ADF im Vergleich zum Wildtyp und entsprechend zu einer Erhöhung der Pathogenresistenz in den transgenen Pflanzen bzw. Pflanzenzellen. Ein solches Verfahren kann verwendet werden, um die Expression von DNA-Sequenzen, die für ADFs oder deren funktionell äquivalente Homologe, Teile bzw. funktionelle Mutanten kodieren, zu erhöhen und damit die Pathogenresistenz in den transgenen Pflanzen bzw. Pflanzenzellen ebenfalls zu erhöhen. Die Verwendung von Vektoren, die diese Sequenzen und regulatorische Sequenzen, wie Promotor- und Termi- nationssequenzen, umfassen, ist dem Fachmann bekannt.
Ein solches Verfahren umfasst erfindungsgemäß typischerweise die folgenden Schritte:
a) Herstellung eines Vektors umfassend folgende Nukleinsäuresequenzen in 5'-3'- Orientierung: eine in Pflanzen funktionelle Promotersequenz, - operativ damit verknüpft eine DNA-Sequenz, die für mindestens einen
ADF oder funktionell äquivalente Homologe, Teile oder Mutanten davon kodiert, operativ damit verknüpft eine in Pflanzen funktionelle Terminationssequenz b) Übertragung des Vektors aus Schritt a) auf eine Pflanzenzelle und gegebenenfalls Integration in das pflanzliche Genom.
Der Fachmann weiß, wie ein Vektor aus Schritt a) auf Pflanzenzellen übertragen werden kann und welche Merkmale ein Vektor besitzen muss, um ins pflanzliche Genom integriert werden zu können.
Ein Beispiel für die Überexpression einer funktionellen Mutante eines ADFs ist die Überexpression von HvADF3-S6A (SEQ ID No. 2, siehe Beispiele). Durch den Aminosäureaustausch von Serin gegen Alanin kann der ADF3 nicht mehr in der Position 6 phosphoryliert werden. Dies fuhrt zu einer konstitutiv aktiven Form von ADF3. So führt die Überexpression dieser Mutante sowohl zu einer Erhöhung des Gehalts an ADF3 in den transgenen Pflanzen als auch zu einer erhöhten Aktivität an ADF3. Wenn der ADF-Gehalt in transgenen Pflanzen bzw. Pflanzenzellen durch Übertragen einer Nukleinsäure erhöht wird, die für eine ADF aus einem anderen Organismus wie z.B. Dictyostelium discoideum kodiert, dann ist es empfehlenswert, die durch die Nukleinsäuresequenz z.B. aus Dictyostelium discoideum kodierte Aminosäuresequenz durch Rückübersetzung der Polypeptidsequenz gemäß dem genetischen Code in eine Nukleinsäuresequenz zu überfuhren, die vor allem solche Codons umfasst, die aufgrund der Organismus-spezifischen Codon-Usage häufiger verwendet werden. Die Codon-Usage lässt sich anhand von Computerauswertungen anderer bekannter Gene der betreffenden Organismen leicht ermitteln.
Unter Erhöhung der Genexpression bzw. der Aktivität einer Nukleinsäure kodierend einen ADF wird erfindungsgemäß auch die Manipulation der Expression der Orga¬ nismus- und insbesondere der Pflanzen-eigenen endogenen ADFs verstanden. Dies kann beispielsweise durch Veränderung der Promotor-DNA-Sequenz für ADF kodierende Gene erreicht werden. Eine solche Veränderung, die eine veränderte, vorzugsweise erhöhte Expressionsrate mindestens eines endogenen ADF-Gens zur Folge hat, kann durch Deletion oder Insertion von DNA-Sequenzen erfolgen.
Eine Veränderung der Promotor-Sequenz von endogenen ADF-Genen führt in der Regel zu einer Veränderung der exprimierten Menge des ADF-Gens und damit auch zu einer Änderung der in der Zelle bzw. der Pflanzen nachweisbaren ADF -Aktivität.
Des Weiteren kann eine veränderte bzw. erhöhte Expression mindestens eines endogenen ADF-Gens dadurch erzielt werden, dass ein im nicht transformierten Organismus nicht vorkommendes Regulatorprotein mit dem Promotor dieser Gene in Wechselwirkung tritt. Solch ein Regulator kann ein chimäres Protein darstellen, welches aus einer DNA-Bindedomäne und einer Transkriptionsaktivator-Domäne besteht, wie beispielsweise in WO 96/06166 beschrieben. Eine weitere Möglichkeit zur Erhöhung der Aktivität und des Gehalts von endogenen ADFs besteht darin, Transkriptionsfaktoren, die in die Transkription der endogenen ADF-Gene involviert sind, z.B. durch Überexpression hochzuregulieren. Die Maßnahmen zur Überexpression von Transkriptionsfaktoren sind dem Fachmann bekannt und werden ebenfalls im Rahmen der vorliegenden Erfindung für ADFs offenbart.
Darüber hinaus kann eine Veränderung der Aktivität von endogenen ADFs durch gezielte Mutagenese der endogenen Genkopien erreicht werden.
Eine Veränderung der endogenen ADFs kann ebenfalls durch Beeinflussung der post-translationalen Modifikationen von ADFs erreicht werden. Dies kann z.B. dadurch geschehen, dass die Aktivität von Enzymen wie Kinasen oder Phosphatasen, die in die post-translationale Modifikation von ADFs involviert sind, durch ent- sprechende Maßnahmen wie Überexpression oder "gene silencing" reguliert wird.
Die Expression von endogenen ADFs kann auch über die Expression von Aptameren, die spezifisch an die Promotorsequenzen von ADFs binden, reguliert werden. Je nachdem, ob die Aptamere an stimulierende oder reprimierende Promotorbereiche binden, wird die Menge und in diesem Fall damit die Aktivität an endogenem ADF erhöht.
Bei den erfindungsgemäßen Verfahren zur Herstellung von transgenen Pflanzen bzw. Pflanzenzellen mit erhöhter Pathogenresistenz kann die Erniedrigung des Gehalts und/oder der Aktivität von mindestens einem ADF durch unterschiedliche Strategien erreicht werden. Zum Beispiel kann die Expression von mindestens einem ADF in transgenen Pflanzen durch "Silencing" erniedrigt werden.
Beim Silencing wird z.B. eine Nukleinsäure, die für mindestens einen ADF oder Teile davon kodiert und/oder dazu komplementär ist, auf die Pflanze übertragen. Um sicherzustellen, dass die Pflanzen für die übertragenen Nukleinsäuren transgen sind, wird die zu übertragende Nukleinsäure in der Regel durch einen Vektor, wie z.B. ein Plasmid auf die Pflanze übertragen, der in der Lage ist, sich innerhalb der Pflanzen¬ zelle stabil zu replizieren oder die übertragene Nukleinsäure in das pflanzliche Genom zu integrieren.
Bevorzugt kann für das Silencing von ADFs das RNAi- Verfahren verwendet werden. Dabei wird z.B. ein Vektor auf die Pflanzenzelle übertragen, der in 5 '-3 '-Richtung die folgenden Elemente umfasst: Einen in Pflanzen funktionsfähigen Promotor; operativ daran gebunden eine DNA-Sequenz, die die antisense-Sequenz der für den ADF oder Teile davon kodierenden Sequenz umfasst und an ihrem 3'-Ende vom Spleißosom erkennbare 3'-Exonsequenzen aufweist; ein Intron; eine DNA-Sequenz, die die sense-Sequenz der für den ADF oder Teile davon kodierenden DNA-Sequenz umfasst und an ihrem 5'-Ende vom Spleißosom erkennbare 5'-Exon-Sequenzen aufweist; sowie eine Terminationssequenz. Ein solcher Vektor ist in Abbildung 2 dargestellt. Die Position der antisense und sense-Sequenzen kann natürlich vertauscht werden. Dem Fachmann ist dabei klar, dass die jeweiligen 5'- und 3'- Splice sites entsprechend angepasst werden müssen.
Werden solche Vektoren stabil auf Pflanzenzellen übertragen, entsteht bei der
Transkription dieser Vektoren zunächst eine prä-mRNA, die aus einem ersten Exon, das die antisense-Sequenz der für den ADF oder Teile davon kodierenden Sequenz umfasst, einem Intron und einem zweiten Exon, das die sense-Sequenz der für den ADF oder Teile davon kodierenden DNA-Sequenz umfasst, besteht. Da durch den Spleiß-Vorgang das Intron entfernt wird, entsteht ein kontinuierliches RNA-Molekül mit Bereichen, die zueinander komplementär sind. Ein solches RNA-Molekül wird eine doppelsträngige Struktur ausbilden (Smith et al, 2000, Nature, 407:319-320).
Solche doppelsträngigen RNA-Moleküle sind in der Lage, durch Induktion des PTGS-Systems spezifisch die mRNA von ADFs zu silencen, so dass als Folge ADFs nicht mehr exprimiert werden. Welche ADFs nicht mehr exprimiert werden, kann dabei durch die entsprechende Wahl der antisense- und sense-Sequenzen bestimmt werden. Das Auffinden von Protein-charakteristischen Sequenzen gehört dabei zum üblichen Wissen eines Fachmanns. Der Fachmann weiß, dass eine Vielzahl von ADFs auch durch die mehrfache Verwendung von jeweils charakteristischen Sequenzen gesilenct werden können.
Ein solches Verfahren kann z.B. folgende Schritte umfassen:
a) Herstellung eines Vektors, umfassend folgende Nukleinsäuresequenzen in 5 '-3 '- Orientierung: eine in Pflanzen funktionelle Promotersequenz operativ daran gebunden die identische oder homologe antisense-Sequenz der für den mindestens einen ADF oder Teilen davon kodierenden Sequenz, wobei die Sequenz an ihrem 3 '-Ende vom Spleißosom erkennbare 3 '-Exon-Sequenzen aufweist
- operativ daran gebunden ein Intron
- operativ daran gebunden die identische oder homologe sense-Sequenz der für den mindestens einen ADF oder Teilen davon kodierenden Sequenz, wobei die Sequenz an ihrem 5 '-Ende vom Spleißosom erkennbare 5'-
Exon-Sequenzen aufweist
- operativ daran gebunden eine in Pflanzen funktionelle Terminationssequenz
b) Übertragen des Vektors aus a) auf Pflanzenzellen und gegebenenfalls Integration ins pflanzliche Genom.
Der Fachmann weiß ebenfalls, dass neben den genannten Vektoren auch andere Vektoren für das RNAi- Verfahren bzw. PTGS eingesetzt werden können. Solche Vektoren können z.B. so gebaut sein, dass die sense- und antisense-Sequenzen jeweils von einem U6-Promotor ausgehend transkribiert werden, in der Zelle hybridisieren und das PTGS-System induzieren (Tuschl, 2002, Nat. Biotechnol. 20, 446-448; Miyagishi et al, 2002, Nat. Biotechnol., 20, 497-500; Lee et al., 2002, Nat. Biotechnol., 20, 500-505). Bei anderen Vektoren sind die sense- und antisense- Sequenzen durch eine "loop"-Sequenz verbunden und werden von einem humanen RNAse P RNA Hl -Promotor transkribiert. Durch Rückfaltung des "loop" können die sense- und antisense-Sequenzen hybridisieren, doppelsträngige RNA ausbilden und das PTGS-System induzieren (Tuschl, 2002, vide supra; Paul et al., 2002, Nat. Biotechnol., 20, 505-508; Paddison et al., 2002, Genes Dev., 16, in press, Brummelkamp et al., 2002, Science, 296, 550-553). Bei einer weiteren
Ausführungsform des RNAi-Verfahrens werden keine Vektoren verwendet, sondern vorsynthetisierte doppelsträngige RNA-Moleküle, die über die oben beschriebenen Sense- bzw. Antisense-Sequenzen verfügen z.B. duch biolistische Methoden direkt in die zu transfizierenden Zelle eingebracht.
In einer weiteren Ausführungsform umfassen die Vektoren, die zur Übertragung der Nukleinsäuren verwendet werden, in 5'-3'-Orientierung einen Promotor, operativ daran gebunden eine DNA-Sequenz, die die für ADFs oder Teile davon kodierende Sequenz umfasst und zu sich selbst komplementäre Abschnitte enthält, sowie eine Terminationssequenz. Bei der Transkription dieser Vektoren in der Pflanzenzelle entstehen RNA-Moleküle, die über Sequenzbereiche verfügen, die mit sich selbst hybridisieren können. Dadurch können in der Zelle doppelsträngige RNA-Moleküle auftreten, die das PTGS-Systems induzieren, was dann dazu führt, dass die mRNA von ADFs spezifisch abgebaut wird. Dieses auch als Co-Suppression bezeichnete Verfahren zum Silencing von pflanzlichen Proteinen setzt voraus, dass die mRNA des (der) zu supprimierenden ADF(s) über Abschnitte verfügt, die zueinander komplementär sind. Solche Abschnitte können vom Fachmann durch einfache visuelle Inspektion der für das jeweilige Protein kodierenden DNA-Sequenz oder durch entsprechende Sequenzprogramme wie z.B. DNAStar der DNASTAR Inc., Madison, USA, identifiziert werden. Ein solches Verfahren kann z.B. die folgenden Schritte umfassen:
a) Herstellung eines Vektors, umfassend folgende Nukleinsäuresequenzen in 5 '-3'- Orientierung:
- eine in Pflanzen funktionelle Promotersequenz,
- operativ daran gebunden die identische oder homologe sense-Sequenz der für den/die endogenen ADF(s) oder Teilen davon kodierenden Sequenz, wobei die Sequenz über selbst-komplementäre Bereiche verfügt, - operativ daran gebunden eine ein Pflanzen funktionelle
Terminationssequenz, b) Übertragen des Vektors aus a) auf Pflanzenzellen und gegebenenfalls Integration ins pflanzliche Genom.
Bei einer anderen Ausführungsform der Erfindung umfassen die zur Übertragung der Nukleinsäuren verwendeten Vektoren in 5 '-3 '-Orientierung einen Promotor, operativ daran gebunden eine DNA-Sequenz, die die antisense-Sequenz der für ADFs oder Teile davon kodierenden Sequenz umfasst, sowie eine Terminationssequenz. Bei der Transkription solcher Vektoren in Pflanzenzellen entsteht ein RNA-Molekül, dessen Sequenz komplementär zu der für ADFs oder Teilen davon kodierenden mRNA- Sequenz ist. Durch Hybridisierung der antisense-Sequenz mit endogenen mRNA- Sequenzen von ADFs in vivo kann daher die Expression von ADFs in Pflanzenzellen unterdrückt werden.
Ein solches Verfahren kann z.B. die folgenden Schritte umfassen:
a) Herstellung eines Vektors, umfassend folgende Nukleinsäuresequenzen in 5 '-3 '- Orientierung:
- eine in Pflanzen funktionelle Promotersequenz, operativ daran gebunden die identische oder homologe antisense-Sequenz der für den/die endogenen ADF(s) oder Teilen davon kodierenden Sequenz,
- operativ daran gebunden eine ein Pflanzen funktionelle Terminationssequenz, b) Übertragen des Vektors aus a) auf Pflanzenzellen und gegebenenfalls Integration ins pflanzliche Genom.
Bei einer anderen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens werden zur Übertragung der Nukleinsäuren auf die Pflanzenzellen Vektoren verwendet, die in 5'- 3'-Orientierung einen in Pflanzen funktionsfähigen Promotor, operativ daran gebun¬ den eine DNA-Sequenz, die für ein Ribozym kodiert, das spezifisch die mRNA von mindestens einem ADF erkennt, sowie eine Terminationssequenz umfassen. Dem Fachmann ist bekannt, wie Ribozyme, die eine gegen eine bestimmte mRNA gerichtete Endonuklease- Aktivität besitzen, hergestellt werden können. Im Detail ist dies z.B. in Steinecke et al. beschrieben (1992, EMBO J., 11 : 1525). Im Rahmen dieser Erfindung sind mit dem Begriff "Ribozymen" auch solche RNA-Sequenzen gemeint, die neben dem eigentlichen Ribozym noch Führungssequenzen umfassen, die zu der mRNA der ADFs oder Teilen davon komplementär sind und so das mRNA-spezifische Ribozym noch gezielter zum mRNA-Substrat des Ribozyms fuhren.
Ein solches Verfahren umfasst z.B. die folgenden Schritte:
a) Herstellung eines Vektors, umfassend folgende Nukleinsäuresequenzen:
- eine in Pflanzen funktionelle Promotersequenz,
- operativ daran gebunden eine DNA-Sequenz, die für ein Ribozym kodiert, das spezifisch die mRNA des/der endogenen ADF(s) erkennt,
- operativ daran gebunden eine ein Pflanzen funktionelle Terminationssequenz, b) Übertragen des Vektors aus a) auf Pflanzenzellen und gegebenenfalls Integration ins pflanzliche Genom.
Eine weitere Alternative zur Herstellung von transgenen Pflanzen mit erhöhter Pathogenresistenz bietet die Übertragung von Nukleinsäuren durch Vektoren, die in 5 '-3 '-Orientierung einen in Pflanzen funktionsfähigen Promotor, operativ daran gebunden eine DNA-Sequenz, die antisense-Sequenzen der für ADFs oder Teile davon kodierenden Sequenzen sowie die für RNAse P kodierende Sequenz umfasst, sowie eine Terminationssequenz umfassen. Bei der Transkription solcher Vektoren entstehen in der Zelle RNA-Moleküle, die über eine Führungssequenz (die antisense- Sequenz) verfügen, welche die RNAse P zur mRNA der ADFs führt, wodurch die Spaltung der mRNA durch RNAse P bewirkt wird (US-Patent Nr. 5,168,053). Vorzugsweise umfasst die Führungssequenz 10 bis 15 Nukleotide, die zur DNA- Sequenz der ADFs komplementär sind, und eine 3'-NCCA Nukleotidsequenz, wobei N vorzugsweise ein Purin ist. Die Transkripte der externen Führungssequenz binden an die Ziel-mRNA über die Ausbildung von Basenpaaren, was die Spaltung der mRNA durch die RNAase P am Nukleotid 5' von der gepaarten Region ermöglicht. Eine solche gespaltene mRNA kann nicht in ein funktionsfähiges Protein translatiert werden.
Ein solches Verfahren kann z.B. die folgenden Schritte umfassen:
a) Herstellung eines Vektors, umfassend folgende Nukleinsäuresequenzen in 5 '-3'- Orientierung: - eine in Pflanzen funktionelle Promotersequenz,
- eine operativ daran gebundene DNA-Sequenz, die zu der für die mRNA des/der endogenen ADF(s) oder Teilen davon kodierenden Sequenz komplementär ist,
- operativ daran gebunden eine DNA-Sequenz, die für Ribonuklease P kodiert, - operativ daran gebunden eine ein Pflanzen funktionelle
Terminationssequenz, b) Übertragen des Vektors aus a) auf Pflanzenzellen und gegebenenfalls Integration ins pflanzliche Genom.
Darüber hinaus können zur erfindungsgemäßen Herstellung von transgenen Pflanzen mit einer erhöhten Pathogenresistenz auch Vektoren verwendet werden, die eine DNA-Sequenz enthalten, die in 5'-3'-Orientierung die folgenden Bestandteile aufweist: Eine DNA-Sequenz, die dem 5'-Bereich der für einen ADF kodierenden DNA-Sequenz entspricht, eine DNA-Sequenz für Resistenzgene, sowie eine DNA- Sequenz, die dem 3'-Bereich der für einen ADF kodierenden Sequenz entspricht. Solche Vektoren können verwendet werden, um über homologe Rekombination einen spezifischen Gen-knock-out des interessierenden ADF's herbeizuführen. Bei Pflanzenzellen, in denen die homologe Rekombination stattgefunden hat, wird in die DNA, die für den ADF kodiert, die Sequenz für das Resistenzgen inseriert, so dass keine funktionelle mRNA des ADF's mehr in der Zelle hergestellt werden kann. Durch Selektion gegen das Resistenzgen können die Pflanzenzellen, in denen die Rekombination stattgefunden hat, identifiziert werden. Wie solche Vektoren zum Gen-Knock-out durch homologe Rekombination im Einzelnen zu konstruieren sind, welche Elemente sie umfassen müssen (Promotoren, Enhancer, flankierende
Sequenzen) und wie die Pflanzenzellen des Knock-outs identifiziert werden, ist dem Fachmann bekannt. Als Resistenzgene werden typischerweise Antibiotika- Resistenzgene verwendet. Andere Resistenzgene, die eine Selektion der Zellen, in denen die Rekombination stattgefunden hat, erlauben, können natürlich auch verwendet werden.
Ein solches Verfahren kann z.B. folgende Schritte umfassen:
a) Herstellung eines Vektors, umfassend folgende Nukleinsäuresequenzen in 5'-3'- Orientierung: - eine in Pflanzen funktionelle Promotersequenz,
- operativ daran gebunden eine DNA-Sequenz, die identisch oder homolog zu der für das 5 '-Ende des/der endogenen ADF (s) kodierenden Sequenz(en) ist, - operativ daran gebunden eine DNA-Sequenz, die für ein Resistenzgen kodiert, operativ daran gebunden eine DNA-Sequenz, die identisch oder homolog zu der für das 3 '-Ende des/der endogenen ADF(s) kodierenden Sequenz(en) ist, - operativ daran gebunden eine in Pflanzen funktionelle
Terminationssequenz, b) Übertragen des Vektors aus a) auf Pflanzenzellen und Integration ins pflanzliche Genom.
Wenn im Rahmen der vorliegenden Erfindung von Nukleinsäure-Sequenzen gesprochen wird, die für ADFs oder Teile davon kodieren, dann sind damit sowohl die komplette kodierende DNA-Sequenz der ADFs als auch die komplette mRNA- Sequenz bzw. die jeweiligen Teilbereiche gemeint. Da einige der oben erwähnten Verfahren zur Herstellung von transgenen Pflanzen, in denen die Expression von ADFs signifikant reduziert ist, darauf beruhen, dass eine spezifische Hybridisierung zwischen der endogenen mRNA von ADFs und den Sequenzen, die bei der Transkription der oben erwähnten Vektoren entstehen, stattfindet (wie z.B. der antisense-Strategie), weiß der Fachmann, dass die übertragenen Nukleinsäuren nicht immer die gesamte für die ADFs kodierende Sequenz, unabhängig ob es sich um die sense- oder antisense-Sequenz handelt, enthalten müssen. Vielmehr können für eine spezifische Hybridisierung bereits relativ kurze Bereiche der für ADFs kodierenden Sequenzen ausreichend für ein effizientes Silencing sein.
Bei Vektoren, deren Transkription zu doppelsträngigen RNA-Molekülen führt, reicht es aus, wenn die Sequenzen, die den Sequenzbereichen der mRNA von ADFs entsprechen, letztendlich zu doppelsträngigen RNA-Molekülen mit ca. 25 Nukleotiden, bevorzugt 21, 22 oder 23 Nukleotiden Länge fuhren. Die bei der Antisense-Strategie übertragenen Sequenzen umfassen in der Regel zwischen 20- 1000 Nukleotide, bevorzugt zwischen 20-750 Nukleotide, besonders bevorzugt um die 400-800 und 500-750 Nukleotide. Es können aber auch Sequenzen verwendet werden, die zwischen 20-500 Nukleotide, zwischen 20-300 Nukleotide, zwischen 20- 150 Nukleotide und zwischen 20-100 oder 20-50 Nukleotide umfassen.
Der Fachmann weiß, dass beim RNAi bzw. PTGS die zur Ausbildung von doppel- strängigen RNA-Molekülen verwendeten sense- und antisense RNAs auch um die 21, 22 oder 23 Nukleotide mit einem charakteristischen 3 '-Überhang umfassen können (Tuschl, 2002, Nat. Biotechnol. 20, 446-448).
Wenn Nukleinsäuren auf die Pflanzenzellen übertragen werden, deren Transkription in der Zelle zu Sequenzen führen, die zu der mRNA von ADFs komplementär sind (wie z.B. bei der antisense-Strategie), dann müssen diese Sequenzen nicht hundertprozentig komplementär zu der mRNA sein. Vielmehr reicht es aus, wenn diese Sequenzen zu mindestens 50%, bevorzugt zu mindestens 60%, besonders bevorzugt zu mindestens 70%, weiterhin besonders bevorzugt zu mindestens 80%, insbesondere bevorzugt zu mindestens 90% und am meisten bevorzugt zu mindestens 95% komplementär sind. Die Abweichungen können dabei durch Deletion, Substitution und/oder Insertion entstanden sein. Dem Fachmann ist natürlich klar, dass mit abnehmender Komplementarität die Wahrscheinlichkeit steigt, dass mehrere ADFs gesilenct werden.
Generell gilt, dass nur solche komplementären Sequenzen erfindungsgemäß ver¬ wendet werden können, die in der Lage sind, spezifisch mit mRNA-Bereichen von ADFs zu hybridisieren. Sequenzen, die in vivo mit RNA-Bereichen von anderen Proteinen als ADFs hybridisieren und deren Silencing bewirken, sind für die erfmdungsgemäßen Verfahren nicht geeignet. Je nach der gewählten Sequenz und je nach dem Komplementaritätsgrad, wird eine Vielzahl oder einige wenige ADFs gesilenct werden. Unter Umständen wird nur die Expression eines ganz spezifischen ADF unterbunden. Die Länge von komplementären Sequenzen beträgt bevorzugt zwischen 20-1000 Nukeotide, ebenfalls bevorzugt zwischen 20-750 Nukleotide, besonders bevorzugt zwischen 20-500 Nukleotide, ebenfalls besonders bevorzugt zwischen 20-300 Nukleotide, insbesondere bevorzugt zwischen 20-150 Nukleotide, ebenfalls insbesondere bevorzugt zwischen 20-75 Nukleotide und am meisten bevorzugt um die 20-50 Nukleotide. Unter Umständen können die Sequenzen auch nur um die 20 oder 25 Nukleotide umfassen.
Einige der oben erwähnten Verfahren können auch mit Sequenzen durchgeführt werden, die nicht Bestandteil des kodierenden Teils der mRNA von ADFs sind oder dazu komplementär sind. Es kann z.B. ausreichend sein, wenn es sich um Sequenzen aus dem 5'- oder 3'- untranslatierten Bereich handelt, sofern diese regulatorischen Sequenzen charakteristisch für die mRNA des jeweiligen ADF's sind.
Solche Sequenzen können insbesondere dann eingesetzt werden, wenn das Silencing durch doppelsträngige RNA-Konstrukte induziert wird oder die Translation einer mRNA durch antisense-Konstrukte inhibiert wird. Daher umfasst der Begriff mRNA erfindungsgemäß nicht nur die kodierenden Bestandteile der mRNA von ADFs, sondern auch alle regulatorischen Sequenzen, die in der prä-mRNA oder reifen mRNA auftreten und die für die mRNA der ADFs charakteristisch sind. Dies gilt entsprechend auch für die DNA-Sequenz. Dabei kann es sich z.B. um 5'- und 3'- untranslatierte Bereiche handeln, um Promotorsequenzen, um upstream activating sequences, um Introns etc.
Wenn Vektoren verwendet werden, deren Transkription zu RNA-Molekülen führt, die aus einer Führungssequenz und RNAse P bestehen, dann muss die Führungssequenz ausreichend komplementär sein, um spezifisch den ADF zu erkennen. Welcher Bereich der mRNA des ADF's durch die Führungssequenz erkannt wird, kann gemäß den jeweiligen Erfordernissen gewählt werden. Bevorzugt umfassen solche Führungssequenzen um die 20 Nukleotide, sie sollten jedoch nicht wesentlich kürzer als 15 Nukleotide sein. Bei einer 100%-igen Komplementarität der Führungssequenz sollten auch 12 Nukleotide ausreichend sein. Selbstverständlich können die Führungssequenzen bis zu 100 Nukleotide oder mehr umfassen, da dadurch lediglich ihre Spezifität für die jeweilige mRNA erhöht wird.
Wenn im Rahmen der vorliegenden Erfindung von sense-Sequenzen gesprochen wird, dann sind damit diejenigen Sequenzen gemeint, die dem kodierenden Strang der Gene für ADFs entsprechen oder Teile davon umfassen. Solche Sequenzen müssen jedoch nicht zu 100% identisch mit den für die interessierenden ADFs kodierenden Sequenzen sein. Es genügt, wenn die Sequenzen zu den für ADFs kodierenden Sequenzen derart ausreichend ähnlich sind, dass ihre Expression in pflanzlichen Zellen zu einem effizienten und spezifischen Silencing der ADFs in der Zelle z.B. durch RNA interference oder Co-Suppression führt.
Es sollte ausreichen, wenn diese Sequenzen zu mindestens 50% identisch sind, bevorzugt zu mindestens 60%, besonders bevorzugt zu mindestens 70%, weiterhin besonders bevorzugt zu mindestens 80%, insbesondere bevorzugt zu mindestens 90% und am meisten bevorzugt zu mindestens 95% identisch sind. Bei solchen Identitätsgraden wird erfindungsgemäß davon gesprochen, dass die Sequenzen zueinander homolog sind bzw. eine Homologie aufweisen (siehe oben). Die Abweichungen zu den für die ADFs oder Teilen davon kodierenden Sequenzen können dabei durch Deletion, Addition, Substitution und/oder Insertion entstanden sein. Dem Fachmann ist natürlich klar, dass mit abnehmender Identität die
Wahrscheinlichkeit steigt, dass mehrere ADFs gesilenct werden. Sequenzen, deren Identitäts- bzw. Homologiegrad so gering ist, dass andere Proteine als ADFs gesilenct werden, sind für die erfindungsgemäßen Verfahren nicht ausreichend spezifisch und nicht geeignet. Wenn entsprechend von antisense-Sequenzen gesprochen wird, dann sind erfindungsgemäß diejenigen Sequenzen gemeint, die dem nicht kodierenden DNA- Strang der Gene der interessierenden ADFs entsprechen. Auch diese Sequenzen müssen natürlich nicht hundertprozentig identisch mit der Sequenz des nicht- kodierenden DNA-Strangs der Genen der jeweiligen interessierenden ADFs sein, sondern können die oben genannten Homologiegrade aufweisen. Dieser Sachverhalt kommt auch in dem Umstand zum Ausdruck, dass antisense-Sequenzen, die definitionsgemäß zu der mRNA eines Gens komplementär sind, nicht zu 100% komplementär zu dieser mRNA sein müssen. Sie können z.B. auch zu mindestens 50% komplementär, bevorzugt zu mindestens 60% komplementär, besonders bevorzugt zu mindestens 70% komplementär, weiterhin besonders bevorzugt zu mindestens 80% komplementär, insbesondere bevorzugt zu mindestens 90% komplementär und am meisten bevorzugt zu mindestens 95%, 98% und/oder 100% komplementär sein. Wie oben ausgeführt, ist es ausreichend, wenn die antisense- Sequenzen in der Lage sind, spezifisch mit der jeweiligen interessierenden mRNA von ADFs zu hybridisieren. Die Hybridisierung kann entweder in vivo unter zellulären Bedingungen oder in vitro stattfinden.
Die Hybridisierung einer antisense-Sequenz mit einer endogenen πiRNA-Sequenz findet typischerweise in vivo unter zellulären Bedingungen oder in vitro statt.
Die Begriffe "sense" und "antisense" sind darüber hinaus dem Fachmann bekannt. Der mit dem Silencing von Genen in Pflanzen vertraute Fachmann weiß entsprechend aus dem Stand der Technik auch, wie groß die zum Silencing verwendeten Nukleinsäuremoleküle sein müssen und welche Homologie bzw.
Komplementarität sie zu den jeweils interessierenden Sequenzen aufweisen müssen. Erfindungsgemäß können antisense-Sequenzen, die z.B. in vivo und/oder in vitro nicht spezifisch mit kodierenden sense-Sequenzen von ADFs hybridisieren können, d.h. auch mit den kodierenden sense-Sequenzen von anderen Protein-Klassen hybridisieren, nicht verwendet werden. Prinzipiell kann die antisense-Strategie mit einem Ribozym-Verfahren gekoppelt werden. Ribozyme sind katalytisch aktive RNA Sequenzen, die, gekoppelt an die antisense-Sequenzen, die Zielsequenzen katalytisch spalten (Tanner et al., (1999) FEMS Microbiol Rev. 23 (3), 257-75). Dies kann die Effizienz einer antisense- Strategie erhöhen.
Weitere Methoden zur Reduzierung der Expression von ADFs insbesondere in Pflanzen als Organismen umfassen die zur Kosuppression führende Überexpression homologer ADF-Nukleinsäuresequenzen (Jorgensen et al., (1996) Plant Mol. Biol. 31 (5), 957-973) oder die Induktion des spezifischen RNA-Abbaus durch die Pflanze mit Hilfe eines viralen Expressionssystems (Amplikon) (Angell et al., (1999) Plant J. 20 (3), 357-362). Diese Methoden werden auch als "post-transcriptional gene silencing" (PTGS) bezeichnet (siehe oben).
Weitere Methoden sind die Einfuhrung von Nonsense-Mutationen in das endogene Gen mittels Einfuhrung von RNA/DNA-Oligonukleotiden in die Pflanze (Zhu et al., (2000) Nat. Biotechnol. 18 (5), 555-558) oder die Generierung von Knockout- Mutanten mit Hilfe von z.B. T-DNA-Mutagenese (Koncz et al., (1992) Plant Mol. Biol. 20 (5) 963-976) oder homologer Rekombination (Hohn et al., (1999) Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 96, 8321-8323.).
Ferner ist eine Genrepression (aber auch die Genüberexpression) auch mit spezifischen DNA-bindenden Faktoren z.B. Faktoren vom Typus der Zink- fingertranskriptionsfaktoren möglich. Ferner können Faktoren in eine Zelle eingebracht werden, die das Zielprotein selber inhibieren. Die proteinbindenden Faktoren können z.B. Aptamere sein (Famulok et al., (1999) Curr Top Microbiol Immunol. 243, 123-36). Die Reduktion kann auch durch Aptamere erfolgen. Aptamere können auch so entworfen werden, dass sie spezifisch an die ADF-Proteine binden und durch z.B. Bindung an das katalytische Zentrum der ADFs die Aktivität der ADFs reduzieren. Die Expression von Aptameren erfolgt üblicherweise durch Vektor-basierte Überexpression und ist dem Fachmann ebenso wie der Entwurf und die Selektion von Aptameren wohl bekannt (Famulok et al., (1999) Curr Top Microbiol Immunol., 243,123-36).
Eine gute Übersicht zu einigen der oben beschriebenen Verfahren findet sich in z.B. Waterhouse et al., (2001), Nature 411, 834-842; Tuschl (2002), Nat. Biotechnol. 20, 446-448 und weiteren Publikationen in dieser Ausgabe, Paddison et al., (2002), Genes Dev., 16, 948 - 958; Brummelkamp et al., (2002), Science 296, 550-553).
Als weitere proteinbindende Faktoren, deren Expression in Pflanzen eine Reduktion des Gehalts und/oder der Aktivität an ADFs bewirkt, kommen ADF-spezifische Antikörper in Frage. Die Herstellung von monoklonalen, polyklonalen oder rekombinanten ADF-spezifischen Antikörpern folgt Standard-Protokollen (Guide to Protein Purifϊcation, Meth. Enzymol. 182, pp. 663-679 (1990), M. P. Deutscher, ed.). Die Expression von Antikörpern ist ebenfalls aus der Literatur bekannt (Fiedler et al., (1997) Immunotechnology 3, 205-216; Maynard and Georgiou (2000) Annu. Rev. Biomed. Eng. 2, 339-76). Dieser Ansatz ist weiter unten ausführlich dargestellt.
Ein weiteres erfindungsgemäßes Verfahren zur Herstellung von transgenen Pflanzen mit erhöhter Pathogenresistenz sieht vor, dass die Aktivität an endogenen ADFs dadurch verringert wird, dass in der Pflanze bzw. in den Pflanzenzellen nicht¬ funktionelle Mutanten von ADFs exprimiert werden. Durch Einführung solcher nicht-funktioneller Mutanten, bei denen es sich bevorzugt um dominant-negative Mutanten handelt, wird die Interaktion der endogenen ADFs mit ihren zellulären Bindungspartnern inhibiert. Durch Einführung von nicht-funktionellen Mutationen in die endogenen ADFs können erfindungsgemäß ebenfalls Pflanzen und Pflanzenzellen hergestellt werden, die über eine erhöhte Pathogenresistenz verfugen. Unter nicht-funktionellen Mutanten werden erfϊndungsgemäß Formen von ADFs verstanden, die über Mutationen verfugen, die verhindern, dass die ADFs mit G- Actin, F-Actin, Komponenten des Pathogens und/oder mit anderen physiologischen Bindungspartnern interagieren.
Wenn solche dominant-negativen Mutanten in der transgenen Zelle bzw. Pflanze exprimiert bzw. überexprimiert werden, sind sie in der Lage, die Interaktion der Pathogenkomponenten mit Wildtyp- ADFs bzw. die Interaktion von Wildtyp- ADFs mit den anderen physiologischen Faktoren, wie z.B. Actin, auszukompetitieren, so dass das Pathogen keine Möglichkeit zur Propagation hat. Überraschend bei diesem Verfahren ist, dass dadurch transgene Pflanzen hergestellt werden können, die über eine erhöhte Pathogenresistenz verfugen und gleichzeitig einen im Wesentlichen normalen Phänotyp aufweisen, obwohl solche dominant-negativen Mutanten das endogene Cytoskelett der Pflanzenzelle beeinflussen sollten.
Der Fachmann ist sich darüber bewusst, dass erfindungsgemäße transgene Pflanzen und Pflanzenzellen nicht nur durch Expression bzw. Überexpression dominant¬ negativer Mutanten von ADFs aus Pflanzen wie ADF3 hergestellt werden können, sondern selbstverständlich auch durch Expression bzw. Überexpression von dominant-negativen Mutanten von ADFs aus anderen Organismen. Dabei kommen ADFs aus Eukaryoten wie Hefen (z.B. S. cerevisiae), C. elegans oder höheren Säugetieren wie Maus, Ratte und Mensch in Frage. Voraussetzung ist, dass die Expression dieser dominant-negativen Mutanten eine Konipetition der endogenen pflanzlichen ADFs mit Pathogenkomponenten und/oder deren zellulären
Interaktionspartnern bewirkt. Die ADFs aus anderen Organismen können durch die oben beschriebenen Datenbankanalysen und Homologie-Vergleiche identifiziert werden. Voraussetzung ist, dass sie über eine Region bzw. Regionen verfügen, die zu den oben genannten Konsensus-Sequenzen homolog ist. Transgene Pflanzen, die dominant-negative Mutanten von ADFs exprimieren, können hergestellt werden, indem ein entsprechender Expressionsvektor auf Pflanzenzellen übertragen wird.
Ein solches Verfahren kann z.B. die folgenden Schritte umfassen:
a) Herstellung eines Vektors, umfassend folgende Nukleinsäuresequenzen in 5'-3'- Orientierung:
- eine in Pflanzen funktionelle Promotersequenz, - operativ daran gebunden eine DNA-Sequenz, die für eine dominant¬ negative Mutante eines pflanzlichen ADFs, kodiert
- operativ daran gebunden eine in Pflanzen funktionelle Terminationssequenz, b) Übertragen des Vektors aus a) auf die Pflanzenzellen und gegebenenfalls Integration ins pflanzliche Genom.
Nicht-funktionelle Mutationen, bei denen es sich um dominant-negative Mutanten von ADFs handelt, kann der Fachmann durch einfaches routiniertes Experimentieren identifizieren. Zum einen sind, wie bereits oben erwähnt, eine Reihe von Mutationen z.B. aus dem ADF3 von Mais bekannt, die die Interaktion mit F-Actin bzw. G-Actin inhibieren. Bei diesen handelt es sich um Mutationen, bei denen die Thyrosinreste in den Positionen 67 und 70 von ADF3 aus Mais durch Phenylalanin ersetzt werden. Durch so genannte Sequenz-Alignments können die für die Thyrosine 67 und 70 äquivalenten Positionen z.B. in ADF3 aus Gerste bzw. anderen ADFs bestimmt werden und auf diese Weise ähnlich Mutationen hergestellt werden. Beim ADF3 aus Gerste handelt es sich z.B. um die Positionen Phenylalanin-66 und Phenylalanin-69. Diese können z.B. durch Alanin ersetzt werden.
Mutationen, die die Interaktion von ADFs mit G-Actin, F-Actin, anderen physiologischen Bindungspartnern und/oder Pathogenkomponenten unterbinden, können durch Herstellen von rekombinanten ADF-Proteinen, die unterschiedliche Mutation und/oder Deletion tragen, und Testen dieser rekombinanten Proteine in Bindungsassays mit den vorgenannten Komponenten in einfacher Weise ermittelt werden.
Auf gleiche Weise kann z.B. in in vztro-Bindungstests getestet werden, ob dominant¬ negative Mutanten von ADF-Proteinen und bevorzugt von ADF3 aus Gerste in der Lage sind, die Interaktion der ADF mit G- Actin, F- Actin, anderen zellulären Bindungspartnern und/oder Pathogenkomponenten zu kompetitieren.
Unter "dominant-negativen Mutationen" werden alle Mutationsarten verstanden, d.h. Insertion, Deletion und Punktmutation, die in der Lage sind, die Interaktion von ADFs mit G- Actin, F- Actin, anderen zellulären Bindungspartnern und/oder Pathogenkomponenten zu unterbinden.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren zum Herstellen von transgenen Pflanzen mit erhöhter Pathogenresistenz durch Expression von dominant-negativen Mutanten von ADFs findet eine Modulation des Grades an Interaktion zwischen den endogenen ADFs mit ihren Bindungspartnern und kein Silencing der Wirtsfaktoren statt, was den zusätzlichen Vorteil bringt, dass dieser Mechanismus keinen direkten Angriffspunkt für Pathogen-kodierte Suppressoren bietet.
Dem Fachmann ist bekannt, wie Punktmutation(en), Insertionsmutation(en) oder Deletionsmutation(en) in die für ADFs kodierende Nukleinsäuresequenzen eingeführt werden können. PCR-Techniken können z.B. zur Einführung von
Punktmutationen bevorzugt sein ("PCR technology: Principle and Applications for DNA Amplification", H. Ehrlich, id, Stockton Press). Beispiele zur Einführung von Punktmutationen in für ADF3 kodierende DNA-Sequenzen finden sich zudem in den Ausführungsbeispielen. Transgene Pflanzen bzw. Pflanzenzellen, die eine erhöhte Pathogenresistenz aufweisen, können erfindungsgemäß auch derart hergestellt werden, dass z.B. ein rekombinanter Antikörper, der spezifisch die Interaktion von ADFs (und bevorzugt ADF3 aus Gerste), mit G- Actin, F-Actin, anderen zellulären Bindungspartnern und/oder Pathogenkomponenten blockiert bzw. kompetitiert, in den Pflanzen exprimiert wird.
Wie solche rekombinanten Antikörper gegen z.B. eine spezifische Domäne von ADFs isoliert und identifiziert werden können, ist dem Fachmann bekannt und kann der Literatur entnommen werden (Harlow et al., 1999, Using antibodies: a laboratory nianual, CoId Spring Harbor Laboratory Press).
Unter rekombinanten Antikörpern werden erfindungsgemäß die bekannten unterschiedlichen Formen von rekombinanten Antikörpern verstanden, wie sie z.B. in Skerra et al. (Curr. Opin. Immunol. (1993) 2, 250 - 262) beschrieben wurden. Die erfindungsgemäßen rekombinanten Antikörper umfassen dabei die so genannten Fab-Fragmente, Fv-Fragmente, scFv-Antikörper, scFv-Homodimere, die über Disulfid-Brücken miteinander verknüpft sind und so genannte VH-Ketten. Die Fab- Fragmente bestehen aus assemblierten vollständigen leichten und verkürzten schweren Ketten, wohingegen Fv-Fragmente aus nicht-kovalent miteinander verknüpften VH- und VL-Ketten bestehen. Ein Überblick über die genannten Fragmente und rekombinanten Antikörper findet sich in Conrad et al. (Plant Mol. Biol. (1998) 38, 101 - 109). Die genannten Fab- und Fv-Fragmente können in vivo miteinander assoziieren.
Da dieser Prozess unter Umständen jedoch nicht sehr effizient abläuft, werden erfindungsgemäß bevorzugt scFv-Antikörper eingesetzt. Diese bestehen aus dem variablen Anteil der leichten Kette und dem variablen Anteil der schweren Kette, die über ein flexibles Linkerpeptid miteinander fusioniert sind. Die Herstellung solcher scFv-Antikörper ist im Stand der Technik intensiv beschrieben worden (siehe u.a. Conrad et al., vide supra; Breitling et al. (1999) Recombinant Antibodies, John Wiley & Sons, New York). Die scFv-Antikörper weisen die gleiche Antigen- Spezifität und Aktivität wie normale Antikörper auf, müssen aber nicht wie andere natürliche oder rekombinante Antikörper in vivo aus Einzelketten assembliert werden. Sie eignen sich deshalb insbesondere für die erfindungsgemäßen Verfahren.
In den oben angegebenen Referenzen wird ausführlich dargestellt, wie Nukleinsäure- sequenzen, die für die erfindungsgemäß bevorzugten scFv-Antikörper kodieren, durch den Fachmann isoliert und hergestellt werden können.
Üblicherweise wird dabei von bestehenden Hybridoma-Zelllinien ausgegangen, die monoklonale Antikörper produzieren. Danach werden die für die leichte und schwere Ketten des Antikörpers kodierenden cDNAs isoliert und in einem zweiten Schritt die kodierenden Regionen für die variable Region der leichten und der schweren Kette in einem Molekül miteinander fusioniert.
Ein weiterer, dem Fachmann bekannter Weg zur Erzeugung rekombinanter Antikörper ist das Screening von Bibliotheken rekombinanter Antikörper (so genannte "phage display libraries", siehe auch Hoogenboom et al. (2000) Immunology Today 21, 371-378; Winter et al. (1994) Annu. Rev. Immunol. 12, 433- 455; De Wildt et al. (2000) Nat. Biotechnol. 18, 989-994). Durch dem Fachmann bekannte Vorgehensweisen können bei diesem Verfahren rekombinante Antikörper gegen ein gegebenes Antigen angereichert, selektiert und isoliert werden.
Ein Verfahren zur Expression von Antikörpern gegen ADFs kann z.B. die folgenden Schritte umfassen:
a) Herstellung eines Vektors, umfassend folgende Nukleinsäuresequenzen in 5'-3'- Orientierung: - eine in Pflanzen funktionelle Promotersequenz, - operativ daran gebunden eine DNA-Sequenz, die für einen rekombinanten Antikörper kodiert, der für die endogene(n) ADF(s) spezifisch ist und/oder die Interaktionen mit physiologischen Bindungspartnern, bevorzugt G- Actin und/oder F- Actin, blockiert, - operativ daran gebunden eine in Pflanzen funktionelle
Terminationssequenz, b) Übertragen des Vektors aus a) auf die Pflanzenzellen und gegebenenfalls Integration ins pflanzliche Genom.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft Pflanzenzellen und Pflanzen, in denen die endogenen Gene von ADFs Mutationen, d.h. Substitutionen, Insertionen und/oder Deletionen aufweisen, die dazu fuhren, dass die exprimierten endogenen ADFs nicht mehr oder nur bedingt in der Lage sind, mit Pathogenfaktoren und/oder ihren endogenen zellulären Bindungspartnern zu interagieren. Pflanzen bzw. Pflanzenzellen, die solche Mutationen aufweisenden, endogenen Genkopien für ADFs besitzen, werden sich, wie die oben beschriebenen transgenen Pflanzen und Pflanzenzellen, durch eine erhöhte transiente oder permanente Pathogenresistenz gegenüber den oben genannten Virusgruppen und Stämmen auszeichnen. Solche Pflanzen und Pflanzenzellen, die im Gegensatz zu den oben genannten Pflanzen und Pflanzenzellen nicht transgen sind, können durch klassische Mutagenese hergestellt werden.
Erfindungsgemäß müssen solche nicht-transgenen Pflanzen oder Pflanzenzellen aber in den für endogene ADFs kodierenden Genen die oben genannten Mutationsarten aufweisen, die zu einer Modulation der Expression der endogenen ADFs und/oder des Bindungsverhaltens der endogenen ADFs führen. Modulation der Expression der endogenen ADFs kann z.B. bedeuten, dass durch Mutationen in regulatorischen DNA-Elementen der Gene der endogenen ADFs, wie z.B. Promotor, Enhancern oder allgemein so genannten "upstream activating sequences", die Expression der endogenen ADFs herunterreguliert wird. Die Modulation des Bindungsverhaltens von ADFs bedeutet im Rahmen der vorliegenden Erfindung, dass die oben genannten Mutationsarten zu einer Veränderung des Bindungsverhaltens der endogenen ADFs gegenüber den pathogenen Faktoren und/oder den normalen zellulären Bindungspartnern führen. Bevorzugt ist eine Modulation des Bindungsverhaltens der endogenen ADFs, die dazu führt, dass diese nicht mehr oder nur bedingt mit Pathogenfaktoren und/oder ihren zellulären Partnern interagieren. Auch eine Kombination der Modulation der Expression und des Bindungsverhalten der endogenen ADFs ist denkbar.
Zum Beispiel können Pflanzen oder Pflanzenzellen Mutationen in den Gensequenzen für endogene ADFs aufweisen, die zur Reduktion der Expression dieser Proteine führen. Andere Pflanzen oder Pflanzenzellen weisen Mutationen auf, die zu den oben beschriebenen dominant-negativen Mutanten führen. In beiden Fällen werden Pflanzen mit einer erhöhten Pathogenresistenz erhalten.
Der Fachmann ist sich bewusst, dass durch Mutagenese z.B. auch Pflanzen bzw. Pflanzenzellen hergestellt werden können, die aufgrund von Mutationen in Enhancer- und/oder Promotor-Sequenzen der Gene für endogene ADFs eine Reduktion der Expression dieser Proteine aufweisen und gleichzeitig Mutationen in den kodierenden Bereichen der für endogene ADFs kodierenden Gene aufweisen, die bewirken, dass die verbleibenden exprimierten ADFs nicht mehr oder nur begrenzt mit den pathogenen und/oder anderen zellulären Bindungspartnern interagieren können. Umgekehrt können entsprechende Mutationen in Enhancer- und/oder Promotor-Sequenzen und in den kodierenden Sequenzen bewirken, dass eine oben dargestellte dominant-negative Mutante von endogenen ADFs, die nicht mehr oder nur sehr begrenzt in der Lage ist, mit pathogenen und/oder normalen zellulären Inter¬ aktionspartnern wechselzuwirken, überexprimiert wird und es somit zur oben beschriebenen Kompetitionsreaktion kommt. Diese Pflanzen zeichnen sich durch eine erhöhte transiente oder permanente Pathogenresistenz gegenüber den oben genannten Pathogenen aus.
Bevorzugt können die erfindungsgemäßen nicht-transgenen Pflanzen und Pflanzenzellen, die sich durch eine Modulation der Expression und/oder des Bindungsverhaltens der endogenen ADFs auszeichnen und eine permanente oder transiente Pathogenresistenz besitzen, durch den so genannten "TILLING"-Ansatz (Targeting Induced Local Lesion in Genomes) hergestellt werden. Dieses Verfahren ist im Detail in Colbert et al. (2001, Plant Physiology, 126, 480 - 484), McCallum et al. (2000, Nat. Biotechnol., 18, 455 - 457) und McCallum et al. (2000, Plant
Physiology, 123, 439 - 442) beschrieben worden. Die vorgenannten Referenzen werden hier explizit als Offenbarung hinsichtlich der "TILLING"-Methode eingeführt.
Das TILLING-Verfahren ist eine Strategie der so genannten reversen Genetik, das die Produktion hoher Dichten von Punktmutationen in mutagenisierten Pflanzen¬ kollektionen, z.B. durch chemische Mutagenese mit Ethylmethansulphonat (EMS), mit der schnellen systematischen Identifizierung von Mutationen in Zielsequenzen kombiniert. Zunächst wird die Zielsequenz über PCR in DNA-Pools mutagenisierter M2-Populationen amplifiziert. Denaturierungs- und Annealingsreaktionen der heteroallelischen PCR-Produkte erlauben die Ausbildung von Heteroduplexen, bei denen ein DNA-Strang von dem mutierten und der andere vom „Wildtyp" PCR- Produkt stammt. An der Stelle der Punktmutation erfolgt ein sogenannter Mismatch, der entweder über denaturierende HPLC (DHPLC, McCallum et al., 2000, Plant Physiol., 123, 439-442) oder mit dem CeZI Mismatch-Detektionssystem
(Oleykowsky et al, 1998, Nucl. Acids Res. 26, 4597-4602) identifiziert werden kann. Cell ist eine Endonuklease, die Mismatche in Heteroduplex-DNA erkennt und spezifisch an diesen Stellen die DNA spaltet. Die Spaltungsprodukte können dann über automatisierte Sequenzierungs-Gelelektrophorese aufgetrennt und detektiert werden (Colbert et al., 2001, vide supra). Nach Identifizierung von Zielgen- spezifischen Mutationen in einem Pool werden individuelle DNA-Proben entsprechend analysiert, um die Pflanze mit der Mutation zu isolieren. Auf diese Weise wird bei den erfindungsgemäßen Pflanzen und Pflanzenzellen nach der Herstellung der mutagenisierten Pfanzenpopulationen durch Verwendung gegen ADF3 bzw ADFs gerichtete Primersequenzen die Identifizierung der mutagenisierten Pflanzenzellen bzw. Pflanzen durchgeführt. Das TILLING- Verfahren ist generell für alle Pflanzen anwendbar und daher sind die oben genannten Kultur- und Nutzpflanzen für das erfindungsgemäße Verfahren geeignet.
Die Vektoren, die zur Expression bzw. zum Silencing von ADFs verwendet werden, umfassen neben der zu übertragenden Nukleinsäuresequenz weitere regulatorische Elemente. Welche konkreten regulatorischen Elemente diese Vektoren enthalten müssen, hängt dabei jeweils von der Methode ab, die mit diesen Vektoren durchgeführt werden sollen. Über welche regulatorischen Elemente und auch anderen Elemente diese Vektoren verfügen müssen, ist dem Fachmann, der mit den verschiedenen oben erwähnten Verfahren zum Herstellen von transgenen Pflanzen, in denen die Expression eines Proteins unterbunden wird, vertraut ist, bekannt.
Der Begriff "operativ verknüpft" bedeutet, dass die Sequenzen, die die unterschiedlichen verwendeten Nukleinsäuresequenzen miteinander verknüpfen, so ausgewählt sind, dass die Funktion des jeweiligen verknüpften Nukleinsäuresegments erhalten bleibt. Sollen z.B. die kodierenden Sequenzen von ADF3 in einer Zelle exprimiert werden, ist darauf zu achten, dass sich zwischen der Sequenz für den Promotor und der kodierenden Sequenz für ADF3 keine Sequenzen befinden, die zu einer Beendigung der Transkription führen würden.
Typischerweise handelt es sich bei den regulatorischen Elementen, die die Vektoren enthalten, um solche, die die Transkription und, falls erwünscht, Translation in der Pflanzenzelle gewährleisten. Solche Elemente können aber auch eine gezielte Lokalisierung der Proteine in bestimmten Zelltypen bzw. Zellorganellen bewirken. Dies kann z.B. durch Verwendung von Epidermiszellen-spezifischen Promotoren geschehen.
So können die zu übertragenden Nukleinsäuresequenzen beispielsweise unter Kontrolle von in Pflanzen funktionellen Promotoren stehen. Bei diesen Promotoren kann es sich um konstitutive, aber auch induzierbare oder gewebe- bzw. entwicklungsspezifische Promotoren handeln. Darüber hinaus kann es sich auch um pilzspezifische Promotoren handeln.
Typischerweise wird man als Promotor für Vektoren den konstitutiven 35S-Promotor verwenden. Darüber hinaus können natürlich auch weitere Promotoren verwendet werden, die aus unterschiedlichen Quellen wie z.B. aus Pflanzen oder Pflanzenviren erhalten werden und für die Expression von Genen in Pflanzen geeignet sind. Die Auswahl des Promotors wie auch anderer regulatorischer Sequenzen bestimmen dabei das räumliche und zeitliche Expressionsmuster und damit auch die Expresson bzw. das Silencing der ADFs in transgenen Pflanzen.
Neben weiteren konstitutiven Promotoren wie beispielsweise dem Actin Promotor (McElroy et al., 1990, Plant Cell, 2:163) und dem Ubiquitin Promotor (Binet et al., 1991, Plant Science, 79:87) kommen als gewebespezifische Promotoren die
Promotoren der Phosphoenolpyruvat-Carboxylase aus Mais (Hudspeth et al., 1989, Plant Mol. Biol., 12:579) oder der Fructose-l,6-bisphosphatase aus Kartoffel (WO 98/18940), die blattspezifische Expression vermitteln, in Frage. Es können auch Verwundungs-, Licht- oder Pathogen-induzierte sowie andere entwicklungs- abhängige Promotoren oder Kontrollsequenzen verwendet werden (Xu et al., 1993, Plant Mol. Biol. 22:573; Logemann et al., 1989, Plant Cell, 1:151; Stockhaus et al., 1989, Plant Cell, 1:805; Puente et al., 1996, EMBO J., 15:3732; Gough et al., 1995, Mol. Gen. Genet, 247:323). Eine Zusammenfassung von verwendbaren Kontrollsequenzen findet sich z.B. in Zuo et al., 2000, Curr. Opin. Biotech., 11 :146. Geeignete Promotoren umfassen auch Promotoren, die eine Expression lediglich in photosynthetisch aktiven Geweben garantieren, wie z.B. der ST-LSl -Promotor (Stockhaus et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84:7943-7947; Stockhaus et al. (1989) EMBO J. 8:2445-2451). Ebenfalls verwendet werden können Promotoren, die während der Pflanzentransformation, der Pflanzenregeneration oder bestimmten Stadien dieser Prozesse aktiv sind, wie z.B. zellteilungsspezifische Promotoren wie der Histon H3-Promotor (Kapros et al. (1993) InVitro Cell Cev. Biol. Plant 29:27- 32) oder das chemisch induzierbare Tet-Repressor-System (Gatz et al. (1991) Mol. Gen. Genet. 227:229-237). Weitere geeignete Promotoren können der Literatur, z.B. Ward (1993, Plant Mol. Biol. 22:361-366), entnommen werden. Gleiches gilt für induzierbare und zell- bzw. gewebespezifische Promotoren, wie Meristem- spezifische Promotoren, die ebenfalls in der Literatur beschrieben worden sind und im Rahmen der Erfindung ebenfalls geeignet sind.
Weitere induzierbare Promotoren umfassen virusinduzierbare Promotoren wie den ACMV virion-sense Promotor (Hong et al., 1996, Virology, 220:119-227), der durch das Genprodukt AC2 induziert wird. Darüber hinaus sind alle Promotoren solcher Proteine geeignet, die in Virus-befallenem Gewebe induziert werden, wie z.B. Phenylalanin Ammonium Lyase, Chalcone Synthase, Hydroxyprolin-reiches Glykoprotein, Extensin, Pathogenese-verwandte Proteine (z.B. PR-Ia) und Wund- induzierbare Protease-Inhibitoren (US 6,013,864).
Darüber hinaus ist der Durchschnittsfachmann in der Lage, mittels Routinemethoden weitere geeignete Promotoren zu isolieren. So kann der Fachmann mit Hilfe gängiger molekularbiologischer Methoden, z.B. Hybridisierungsexperimenten oder DNA- Protein-Bindungsstudien, Speicherorgan-spezifische regulatorische Nukleinsäurelemente identifizieren. Dabei wird z.B. in einem ersten Schritt aus Speicherorgangewebe des gewünschten Organismus, aus dem die regulatorischen Sequenzen isoliert werden sollen, die gesamte poly( A)+-RNA isoliert und eine cDNA-Bank angelegt. In einem zweiten Schritt werden mit Hilfe von cDNA-Klonen, die auf poly(A)+-RNA-Molekülen aus einem Nicht-Speicherorgangewebe basieren, aus der ersten Bank mittels Hybridisierung diejenigen Klone identifiziert, deren korrespondierende poly(A)+-RNA-Moleküle lediglich im Gewebe des Speicherorgans akkumulieren. Anschließend werden mit Hilfe dieser so identi- fizierten cDNAs Promotoren isoliert, die über Speicherorgan-spezifische regulatorische Elemente verfügen. Dem Fachmann stehen darüber hinaus weitere auf PCR basierende Methoden für die Isolierung geeigneter Speicherorgan-spezifischer Promotoren zur Verfügung.
In einer weiteren Ausführungsform handelt es sich um den Promotor des Klasse I Patatin-Gens B33 aus Kartoffel. Weiterhin bevorzugte Promotoren sind solche, die insbesondere in Früchten aktiv sind. Hierzu zählen beispielsweise der Promotor eines Polygalacturonase-Gens, z.B. aus Tomate, der während der Reife von Tomatenfrüchten Expression vermittelt (Nicholass et al. (1995) Plant Mol. Biol. 28:423-435; dieser Stand der Technik beschreibt die Analyse von Promotor/GUS- Fusionskonstrukten), der Promotor einer ACC-Oxidase, z.B. aus Apfel, der in transgenen Tomaten Reife- und Fruchtspezifität vermittelt (Atkinson et al. (1998) Plant Mol. Biol. 38:449-460; dieser Stand der Technik offenbart ebenfalls Promotor/GUS-Expressionsanalysen), oder der 2Al 1 -Promotor aus Tomate (van Haaren et al. (1991) Plant Mol. Biol. 17:615-630, beschreibt ebenfalls Promotor/GUS -Fusionen) .
Auch im Fall von Frucht-spezifischen Promotoren kann der Fachmann weitere geeignete Promotoren der Literatur entnehmen oder, wie oben für Speicherorgan- spezifische Promotoren beschrieben, mittels Routineverfahren isolieren.
Der Fachmann weiß, dass die Verwendung von induzierbaren Promotoren die Herstellung von Pflanzen und Pflanzenzellen erlaubt, die die erfindungsgemäßen Sequenzen nur transient exprimieren bzw. transient silencen. Eine solche transiente Expression erlaubt die Herstellung von Pflanzen, die nur eine transiente Pathogenresistenz zeigen. Solch eine transiente Resistenz kann z.B. dann wünschenswert sein, wenn die Gefahr einer Pathogenkontamination droht und die Pflanzen deswegen nur für einen bestimmten Zeitraum resistent gegen das Pathogen sein müssen. Weitere Situationen, in denen eine transiente Resistenz wünschenswert ist, sind dem Fachmann bekannt. Dem Fachmann ist darüber hinaus auch bekannt, dass er durch die Verwendung nicht stabil in Pflanzenzellen replizierender Vektoren, die die entsprechenden Sequenzen zur Expression zum Silencing von ADFs tragen, eine transiente Epxression bzw. ein transientes Silencing und eine transiente Resistenz erzielen kann.
Auch sonst kann durch wähl eines entsprechenden Vektors sichergestellt sein, dass die Transfektion der transgenen Pflanzen nur transient erfolgt. Welche Vektoren für eine transiente Transfektion geeignet sind und welche Vektoren für eine stabile Transfektion verwendet werden müssen, ist dem Fachmann bekannt.
Die erfindungsgemäßen Vektoren können als regulatorische Elemente auch noch z.B. Enhancer-Elemente umfassen, ferner können sie Resistenzgene, Replikationssignale und weitere DNA-Bereiche enthalten, die eine Propagation der Vektoren in Bakterien wie z.B. E. coli ermöglichen. Die regulatorischen Elemente umfassen auch Sequenzen, die eine Stabilisierung der Vektoren in den Wirtszellen bewirken.
Insbesondere umfassen solche regulatorischen Elemente Sequenzen, die eine stabile Integration des Vektors in das Wirtsgenom der Pflanze oder eine autonome Replikation des Vektors in den Pflanzenzellen ermöglichen. Solche regulatorischen Elemente sind dem Fachmann bekannt.
Bei den so genannten Terminationssequenzen handelt es sich um Sequenzen, die sicherstellen, dass die Transkription bzw. die Translation ordnungsgemäß beendet wird. Sollen die übertragenen Nukleinsäuren translatiert werden, handelt es sich bei ihnen typischerweise um Stopcodons und entsprechende regulatorische Sequenzen; sollen die übertragenen Nukleinsäuren nur transkribiert werden, handelt es sich in der Regel um poly-A-Sequenzen.
Erfindungsgemäß sind mit Vektoren Plasmide, Cosmide, Viren und andere in der Gentechnik gängige Vektoren gemeint, mit denen Nukleinsäuremoleküle auf Pflanzen bzw. Pflanzenzellen übertragen werden können.
Zur Vorbereitung der Einführung fremder Gene in höhere Pflanzen bzw. deren Zellen stehen eine große Anzahl von Klonierungsvektoren zur Verfügung, die ein Replikationssignal für E. coli und ein Markergen zur Selektion transformierter Bakterienzellen enthalten. Beispiele für derartige Vektoren sind pBR322, pUC- Serien, M13mp-Serien, pACYC184 usw. Die gewünschte Sequenz kann an einer passenden Restriktionsschnittstelle in den Vektor eingeführt werden. Das erhaltende Plasmid wird für die Transformation von E. co/7-Zellen verwendet. Transformierte E. co/ϊ-Zellen werden in einem geeigneten Medium gezüchtet und anschließend geerntet und lysiert. Das Plasmid wird wiedergewonnen. Als Analysemethode zur Charakterisierung der gewonnenen Plasmid-DNA werden im Allgemeinen Restriktionsanalysen, Gelelektrophoresen und weitere biochemisch- molekularbiologische Methoden eingesetzt. Nach jeder Manipulation können die Plasmid-DNA gespalten und gewonnene DNA-Fragmente mit anderen DNA- Sequenzen verknüpft werden. Jede Plasmid-DNA-Sequenz kann in den gleichen oder anderen Plasmiden kloniert werden. Klonierungsstandard- verfahren können Sambrook et al., 2001 (Molecular cloning: A laboratory manual, 3rd edition, CoId Spring Harbor Laboratory Press) entnommen werden.
Für die Einführung von DNA in eine pflanzliche Wirtszelle stehen eine Vielzahl bekannter Techniken zur Verfügung, wobei der Fachmann die jeweils geeignete Methode ohne Schwierigkeiten ermitteln kann. Diese Techniken umfassen die Transformation pflanzlicher Zellen mit T-DNA unter Verwendung von Agrobacterium tumefaciens oder Agrob acterium rhizogenes als Transformationsmittel, die Fusion von Protoplasten, den direkten Gentransfer isolierter DNA in Protoplasten, die Elektroporation von DNA, die Einbringung von DNA mittels der biolistischen Methode sowie weitere Möglichkeiten. Dabei können sowohl stabile als auch transiente Transformanten erzeugt werden.
Bei der Injektion und Elektroporation von DNA in Pflanzenzellen werden per se keine speziellen Anforderungen an die verwendeten Plasmide gestellt. Ähnliches gilt für den direkten Gentransfer. Es können einfache Plasmide wie beispielsweise pUC- Derivate verwendet werden. Sollen aber aus derartig transformierten Zellen ganze Pflanzen regeneriert werden, ist die Anwesenheit eines selektierbaren Markergens notwendig. Dem Fachmann sind die gängigen Selektionsmarker bekannt und es stellt für ihn kein Problem dar, einen geeigneten Marker auszuwählen. Gebräuchliche Seklektionsmarker sind solche, die den transformierten Pflanzenzellen Resistenz gegenüber einem Biozid oder einem Antibiotikum wie Kanamycin, G418, Ampicillin, Bleomycin, Hygromycin, Methotrexat, Glyphosat, Streptomycin,
Sulfonyl-Harnstoff, Gentamycin oder Phosphinotricin und dergleichen vermitteln.
Je nach Einfuhrungsmethode gewünschter Gene in die Pflanzenzelle können weitere DNA-Sequenzen erforderlich sein. Werden beispielsweise für die Transformation der Pflanzenzelle das Ti- oder Ri-Plasmid verwendet, so muss mindestens die rechte Begrenzung, häufig jedoch die rechte und linke Begrenzung der im Ti- und Ri- Plasmid enthaltenen T-DNA als Flankenbereich mit den einzuführenden Genen verbunden werden.
Werden für die Transformationen Agrobakterien verwendet, muss die einzuführende DNA in spezielle Plasmide kloniert werden, und zwar entweder in einen intermediären oder in einem binären Vektor. Die intermediären Vektoren können aufgrund von Sequenzen, die homolog zu Sequenzen in der T-DNA sind, durch homologe Rekombination in das Ti- oder Ri-Plasmid der Agrobakterien integriert werden. Dieses enthält außerdem die für den Transfer der T-DNA notwendige vir- Region. Intermediäre Vektoren können nicht in Agrobakterien replizieren. Mittels eines Helferplasmids kann der intermediäre Vektor auf Agrobacterium tumefaciens übertragen werden (Konjugation). Binäre Vektoren können sowohl in E. coli als auch in Agrobakterien replizieren. Sie enthalten ein Selektionsmarker-Gen und einen Linker oder Polylinker, welche von der rechten und linken T-DNA-Grenzregion eingerahmt werden. Sie können direkt in die Agrobakterien transformiert werden (Holsters et al. (1978), Molecular and General Genetics 163, 181-187). Das als Wirtszelle dienende Agrobakterium soll ein Plasmid, das eine vir-Region trägt, enthalten. Die vir-Region ist für den Transfer der T-DNA in die Pflanzenzelle notwendig. Zusätzlich kann T-DNA vorhanden sein. Das derartig transformierte Agrobakterium wird zur Transformation von Pflanzenzellen verwendet.
Die Verwendung von T-DNA für die Transformation von Pflanzenzelle ist intensiv untersucht und ausreichend in EP 120 515 beschrieben worden.
Für den Transfer der DNA in die Pflanzenzelle können Pflanzen-Explantate zweckmäßigerweise mit Agrobacterium tumefaciens oder Agrobacterium rhizogenes kultiviert werden. Aus dem infizierten Pflanzenmaterial (beispielsweise Blattstücke, Stengelsegmente, Wurzeln, aber auch Protoplasten oder Suspensions-kultivierte Pflanzenzellen) können dann in einem geeignetem Medium, welches Antibiotika oder Biozide zur Selektion transformierter Zellen enthalten kann, wieder ganze Pflanzen regeneriert werden. Die Regeneration der Pflanzen erfolgt nach üblichen Regenerationsmethoden unter Verwendung bekannter Nährmedien. Die so erhaltenen Pflanzen bzw. Pflanzenzellen können dann auf Anwesenheit der eingeführten DNA untersucht werden.
Andere Möglichkeiten der Einführung fremder DNA unter Verwendung des biolistischen Verfahrens oder durch Protoplasten-Transformation sind dem Fachmann bekannt (vgl. L. Willmitzer (1993) Transgenic Plants in: Biotechnology, A Multi-Volume Comprehensive Treatise (Herausgeber: HJ. Rehm et al), Band 2, 627-659, VCH Weinheim, Deutschland).
Während die Transformation dikotyler Pflanzen bzw. derer Zellen über Ti-Plasmid- Vektorsysteme mit Hilfe von Agrobacterium tumefaciens wohl etabliert ist, weisen neuere Arbeiten daraufhin, dass auch monokotyle Pflanzen bzw. deren Zellen der Transformation mittels auf Agrobakterien basierender Vektoren sehr wohl zugänglich sind (siehe u.a. Chan et al. (1993), Plant Mol. Biol. 22, 491-506).
Alternative Systeme zur Transformation von monokotylen Pflanzen bzw. deren
Zellen sind die Transformation mittels des biolistischen Ansatzes (Wan und Lemaux (1994) Plant Physiol. 104, 37-48; Vasil et al. (1993) Bio/Technology 11, 1553-1558; Ritala et al. (1994) Plant Mol. Biol. 24, 317-325; Spencer et al. (1990), Theor. Appl. Genet. 79, 625-631), die Protoplasten-Transformation, die Elektroporation von partiell permeabilisierten Zellen sowie die Einbringung von DNA mittels Glasfasern.
Die transformierten Zellen wachsen innerhalb der Pflanze in der üblichen Weise (siehe auch McCormick et al. (1986), Plant Cell Reports 5, 81-84). Die resultierenden Pflanzen können normal angezogen werden und mit Pflanzen, die die gleiche transformierte Erbanlage oder andere Erbanlagen besitzen, gekreuzt werden. Die daraus entstehenden hybriden Individuen besitzen die entsprechenden phänotypischen Eigenschaften.
Es sollten zwei oder mehrere Generationen angezogen werden, um sicherzustellen, dass das phänotypische Merkmal stabil beibehalten und vererbt wird. Auch sollten Samen geerntet werden, um sicherzustellen, dass der entsprechende Phänotyp oder andere Eigenarten erhalten geblieben sind.
Ebenso können nach üblichen Methoden transgene Linien bestimmt werden, die für die neuen Nukleinsäuremoleküle homozygot sind und ihr phänotypisches Verhalten hinsichtlich einer vorhandenen bzw. nicht vorhandenen Pathogen-Responsivität untersucht und mit dem von hemizygoten Linien verglichen werden.
Selbstverständlich können Pflanzenzellen, die die erfϊndungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle enthalten, auch als Pflanzenzellen (einschließlich
Protoplasten, Kalli, Suspensionskulturen und dergleichen) weiterkultiviert werden.
Die oben dargestellten Vektoren können auf Pflanzenzellen auf verschiedene Weise übertragen werden. Ob die Vektoren in linearer oder zirkulärer Form vorliegen müssen, hängt von der jeweiligen Anwendung ab. Dem Fachmann ist bekannt, ob und wann er entsprechende linearisierte Vektoren verwenden kann oder nicht. Zum Beispiel weiß der Fachmann, dass zur Herstellung von spezifischen Knock-outs von Genen für ADFs durch homologe Rekombination es ausreichen kann, die entsprechenden Vektoren zu linearisieren und in transgene Pflanzen zu injizieren.
Erfindungsgemäß umfasst der Begriff transgene Pflanze sowohl die Pflanze in ihrer Gesamtheit, als auch alle Pflanzenteile, in denen erfindungsgemäß die Expression und/oder Aktivität von ADFs verändert ist. Bei solchen Pflanzenteilen kann es sich um Pflanzenzellen handeln, um Pflanzensamen, um Blätter, um Blüten und um Pollen. Mit "transgener Pflanze" sind erfindungsgemäß auch das
Vermehrungsmaterial von erfindungs gemäßen transgenen Pflanzen gemeint wie z.B. Samen, Früchte, Stecklinge, Knollen, Wurzelstücke etc., wobei dieses Vermehrungsmaterial ggf. oben beschriebene transgene Pflanzenzellen enthält, sowie Teile dieser Pflanzen wie Protoplasten, Pflanzenzellen und Kalli.
Bei der Herstellung von transgenen Pflanzen bieten sich verschiedene Methoden und Möglichkeiten an, wie bereits oben ausgeführt worden ist. Generell können Pflanzen bzw. Pflanzenzellen mit Hilfe herkömmlicher gentechnologischer Transformationsmethoden derart modifiziert werden, dass die neuen Nukleinsäuremoleküle in das pflanzliche Genom integriert werden, d.h. dass stabile Transformanten erzeugt werden und die überführten Nukleinsäuremoleküle mit dem pflanzlichen Genom repliziert werden. Je nach dem verwendeten Vektorsystem können erfindungsgemäß auch transgene Pflanzen hergestellt werden, bei denen die zu übertragenden Nukleinsäuren in der Pflanzenzelle bzw. der Pflanze als selbstständig replizierendes System enthalten sind. Die zur Übertragung der Pflanzen verwendeten Vektoren müssen dann entsprechend über DNA-Sequenzen verfügen, die die Replikation von zur Übertragung verwendeten Plasmiden innerhalb der Zelle ermöglichen.
Bei den für das erfindungsgemäße Verfahren verwendeten Pflanzen kann es sich im Prinzip um jede beliebige Pflanze handeln. Vorzugsweise ist es eine monokotyle oder dikotyle Nutz-, Nahrungs- oder Futterpflanze. Beispiele für monokotyle Pflanzen sind Pflanzen, die zu den Gattungen Avena (Hafer), Triticum (Weizen), Seeale (Roggen), Hordeum (Gerste), Oryza (Reis), Panicum, Pennisetum, Setaria, Sorghum (Hirse), Zea (Mais) und dergleichen gehören.
Dikotyle Nutzpflanzen umfassen unter anderem Baumwolle, Leguminosen wie Hülsenfrüchte und insbesondere Alfalfa, Sojabohne, Raps, Tomate, Zuckerrübe, Kartoffel, Zierpflanzen sowie Bäume. Weitere Nutzpflanzen können Obst (ins- besondere Äpfel, Birnen, Kirschen, Weintrauben, Citrus, Ananas und Bananen), Kürbis, Gurke, Wein, Ölpalmen, Tee-, Kakao- und Kaffeesträucher, Tabak, Sisal sowie bei Heilpflanzen Rauwolfia und Digitalis umfassen. Besonders bevorzugt sind die Getreide Weizen, Roggen, Hafer, Gerste, Reis, Mais und Hirse, Zuckerrübe, Raps, Soja, Tomate, Kartoffel und Tabak. Weitere Nutzpflanzen können dem US- Patent US 6, 137,030 entnommen werden.
Bevorzugte Pflanzen sind Getreide, Alfalfa, Hafer, Gerste, Roggen, Weizen, Triticale, Hirse, Reis, Luzerne, Flachs, Baumwolle, Hanf und Brassicacaeen wie beispielsweise Raps oder Canola. Solche transgenen Pflanzen, deren Vermehrungsgut, sowie deren Pflanzenzellen, -gewebe oder -teile sind ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung.
Die Erfindung betrifft somit ebenfalls Ernteprodukte und Vermehrungsmaterial transgener Pflanzen, die nach einem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellt wurden und eine erhöhte Pathogenresistenz aufweisen. Bei den Ernteprodukten und dem Vermehrungsmaterial handelt es sich insbesondere um Früchte, Samen, Blüten, Knollen, Wurzelstöcke, Sämlinge, Stecklinge, etc. Es kann sich auch um Teile dieser Pflanzen wie Pflanzenzellen, Protoplasten und Kalli handeln.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch die Verwendung der vorgenannten Nuklein- säuresequenzen zur Herstellung von transgenen Pflanzen bzw. Pflanzenzellen mit einer erhöhten Pathogenresistenz im Sinne der vorliegenden Erfindung.
Durch die vorliegende Erfindung ist es erstmals gelungen, neben Rorl und Ror2 mit ADF3 ein weiteres Gen in der Gerste zu identifizieren, das in die durch mlo- vermittelte Resistenz involviert ist. Darüber hinaus konnte im Rahmen der vorliegenden Erfindung, wie aus den im Folgenden dargestellten Experimenten hervorgeht, gezeigt werden, dass durch die Erhöhung oder Erniedrigung der Expression bzw. der Aktivität von ADF3 in Gerste resistente Gerstepflanzen erhalten werden, die über eine Rasse-unspezifische Resistenz gegenüber verschiedenen Isolaten des Pflanzenpathogens Blumeria graminisf. sp. hordei verfügen.
Solche transgenen Pflanzen weisen gegenüber anderen resistenten Pflanzen den Vorteil auf, dass sie nicht nur gegenüber einigen spezifischen Mehltauisolaten resistent sind, sondern gegenüber einer Vielzahl der genannten Mehltauisolate, und diese Resistenz auch nicht auf einzelne Gerste-Kultivare beschränkt ist.
Daher betrifft eine besonders bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung transgene Gerstepflanzen bzw. -zellen mit einer erhöhten Resistenz gegenüber Blumeria graminisf. sp. hordei, bei denen der Gehalt und/oder die Aktivität von ADF3 aus Gerste mit der SEQ ID No. 1 gegenüber dem Wildtyp verändert ist. Ebenso betreffen besonders bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung Verfahren zur Herstellung von transgenen Gerstepflanzen bzw. der entsprechenden Zellen, die eine erhöhte Resistenz gegenüber Blumeria graminisf. sp. hordei aufweisen, bei denen der Gehalt und/oder die Aktivität an ADF3 mit der SEQ ID No. 1 gegenüber dem Wildtyp verändert ist. Ebenso betrifft eine besonders bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung die isolierte Nukleinsäuresequenz, die für ADF3 aus der Gerste mit der SEQ ID No. 1 kodiert sowie funktionell äquivalente Teile und funktionelle oder nicht-funktionelle
Mutanten davon. Dasselbe gilt für Nukleinsäuresequenzen, die zu den besonders bevorzugten zuletzt genannten Nukleinsäuresequenzen im Wesentlichen komplementär sind und unter stringenten Bedingungen an diese hybridisieren.
Da das Mo-Gen bisher in allen untersuchten Landpflanzen identifiziert wurde und somit auch in anderen Organismen als Gerste wie z.B. Ärabidopsis thaliana sowie in anderen Gramineae-Atten wie z.B. Weizen, Hafer, Mais, Roggen, Reis, Panicum, Pennisetum, Setaria, Sorghum, Mais und dergleichen auftritt, kann davon ausgegangen werden, dass der ADF3 aus Gerste als Prototyp für die entsprechenden homologen ADFs aus anderen Pflanzen bei der Herstellung von transgenen Pflanzen bzw. Pflanzenzellen mit einer erhöhten Pathogenresistenz fungiert. Bei der jeweiligen Pathogenresistenz kann es sich dabei bevorzugt um eine Resistenz gegen formae speciales von Blumeria graminis handeln, da dieser Parasitismus auch z.B. bei Weizen, Hafer und Roggen auftritt. Darüber hinaus kann die Verwendung von ADFs zur Herstellung von transgenen Pflanzen bzw. Pflanzenzellen mit erhöhter Pathogenresistenz auch auf solche Pathogene ausgedehnt werden, die eine funktionelle Interaktion mit dem Actin-Cytoskelett eingehen müssen, um eine effiziente Infektion zu etablieren. Die erfindungsgemäßen transgenen Pflanzen und Pflanzenzellen können eine permanente oder transiente Pathogenresistenz aufweisen. Die Art der Resistent hängt von den verwendeten Vektoren und angewandten Selektionsmechanismen ab.
Besonders bevorzugt sind transgene Pflanzen mit einer erhöhten Pathogenresistenz, die ausgewählt sind aus der Gruppe enthaltend Weizen, Gerste, Hafer, Reis, Panicum, Pennisetum, Setaria, Sorghum, Mais und dergleichen.
Besonders bevorzugt sind die oben genannten Pflanzen resistent gegen die verschiedenen formae speciales des Mehltauerregers Blumeria graminis, wie z.B. die Isolate Blumeria graminis f. sp. hordei, Blumeria graminis f. sp. tritici, Blumeria graminis f. sp. avenae.
Die Identifizierung von ADF3 aus Gerste als ein Faktor, der eine Rasse- unspezifische Resistenz gegen verschiedene Isolate von Blumeria graminis f. sp. hordei vermittelt, wird nun im Folgenden dargestellt. Darüber hinaus werden Experimente dargestellt, die die Verwendung von ADF3 zur Herstellung von transgenen Pflanzen bzw. Pflanzenzellen mit erhöhter Resistenz gegen Blumeria graminis f. sp. hordei belegen. Diese Experimente dienen lediglich der Illustrierung der allgemeinen Aspekte der vorliegenden Erfindung und sind in keiner Weise ausschließend zu deuten.
Experimente
1. Identifizierung von ADF3 aus Gerste
Die Identifizierung von Faktoren, die in den durch /w/o-vermittelten Rasse- unspezifischen Resistenz-Mechanismus in Gerste verwickelt sind, ist üblicherweise anhand von Mutations-Screeningverfahren durchgeführt worden (Freialdenhoven et al., vide supra). Dabei wird von Gerstekultivaren ausgegangen, die über mlo-Allele verfugen und resistent gegen Isolate von Blumeria graminisf. sp. hordei sind. Die Identifizierung von Faktoren, die mit dem Mo-Locus interagieren, erfolgt dadurch, dass aufpflanzen selektioniert wird, die nach der Mutagenese trotz eines mlo- Genotyps für eine Infektion mit Isolaten von Blumeria graminisf. sp. hordei sensitiv sind. Der Nachteil dieser Identifikationsmethoden liegt darin, dass sie in einem erheblichen Ausmaß von der Sensitivität und der Stringenz des Screeningverfahrens zum Nachweis eines modifizierten Infektionstyps abhängen. Dieser Umstand sowie die Tatsache der genetischen Redundanz von verschiedenen Gramineae-Axtsn kann die Erklärung dafür sein, dass es bisher nicht gelungen ist, weitere Bestandteile des m/o-vermittelten Rasse-unspezifischen Mechanismus zu identifizieren.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurde daher ein komplett anderer Ansatz zur Identifizierung von Faktoren, die die m/o-vermittelte Resistenz in Gerste beeinflussen, gewählt. Dazu wurde ein auf doppelsträngiger RNA interference basierendes Screeningverfahren durchgeführt, durch das Gene identifiziert werden sollten, die die Breitbandresistenz, wie sie durch rezessive "Loss of Function" mlo- Allele vermittelt wird, beeinflussen.
Damit wurde im Rahmen der vorliegenden Erfindung ein Screeningverfahren verwendet, mittels dem es möglich ist, durch RNAi sämtliche Allele eines Gens spezifisch auszuschalten. Dazu wurde eine cDNA-Bibliothek verwendet, die Epidermis-spezifische cDNA aus Gerste enthielt und von Dr. Patrick Schweizer (IPK Gatersleben, Deutschland) zur Verfügung gestellt wurde.
Die Herstellung einer solchen Epidermis-spezifischen cDNA-Bibliothek aus Gerste erfolgt dabei folgendermaßen:
Bibliothek: HO Pflanze: Hordeum vulgäre Sorte: Ingrid BC mlo5
Gewebe: Epidermis wurde von 7 Tage alten Pflanzen, die mit Blumeria graminis hordei oder tritici beimpft worden waren, 6 und 24 h nach der Beimpfung abgezogen
kompetente Zellen: XL 10_Gold von Stratagene Vector: pBluescript SK+
Insertionsstellen: EcoRI (5 '-Ende der cDNA), Xhol (3 '-Ende der cDNA)", Selektion der transformierten Zellen: Ampicillin
Die cDNA Bank wurde mit einem Kit von Stratagene erstellt (pBluescriptll XR cDNA Library Construction Kit, Katalog Nr. 200455). Die Selektion der transformierten Zellen erfolgte mit Ampicillin.
Die so isolierten cDNA-Fragmente wurden dann mittels der Gateway®-Technologie der Firma Invitrogen in den Vektor pUAMBN kloniert. Die Verwendung der Gateway®-Technologie ist im Detail in Walhout et al. beschrieben (Walhout et al. (2000) "GATEWAY recombinational cloning: Application of the cloning of large numbers of open reading frames or ORFeomes", in Applications of Chimeric Genes and Hybrid Proteins, San Diego: ACADEMIC PRESS Inc., pp 575-592).
Die cDNA-Fragmente wurden mittels PCR durch Gateway®-kompatible Oligonukleotide mit folgenden Sequenzen amplifiziert:
HO-attB-For:5'-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTGTGG ATCCCCCGGGCTGCAGG-3'
Die unterstrichene Sequenz ist für die cDNA-Bibliothek spezifisch. HO-attB-Rev: 5'-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTTAGG GCGAATTGGGTACCGGG-3'
Die unterstrichene Sequenz ist für die cDNA-Bibliothek spezifisch.
Anschließend wurden diese amplifizierten PCR-Fragmente in den Vektor pDONR (Invitrogen) durch die BP -Rekombination gemäß der Gateway®-Technologie inseriert und anschließend in den Vektor pUAMBN durch LR-Rekombination gemäß der Gateway®-Technologie transferiert.
Die Klonierung erfolgte im Detail folgendermaßen:
1. Kolonie-PCR (je 50 μl in 96er well) aus HO-Bibliothek
2. von diesen PCR-Reaktionen wurden je 1 μl in 4 μl BP-Gateway-Reaktion eingesetzt:
• 1 μl DNA (ca. 75 ng) • 1 μl Vektor pDonr201 (ca. 75 ng)
• 1 μl BP-Reaktionspuffer
• 1 μl BP-Enzym
• 1 μl H2O
Die Mirotiterplatten wurden 24 h bei RT inkubiert; die kompletten Ansätze wurden in 50 μl chemokompetente E. coli (DH5α) transformiert ( 1 Std. 4° C; 2 Min. 42° C); die kompletten Transformationen wurden auf LB-Kan ausplattiert 3. dann wurden Kolonien gepickt und in Mikrotiterplatten angezogen und Millipore 96er Minipräparation hergestellt. Die DNA wurde in 50 μl aufgenommen
4. je 1 μl der Minipräparationen wurde in 4 μl LR-Reaktion eingesetzt
• 1 μl DNA (ca. 75 ng)
• 1 μl Vektor pUAMBN ( ca. 75 ng)
• 1 μl LR-Reaktionspuffer • l μl LR-Enzym
• 1 μl H2O
Die Mirotiterplatten wurden 24 h bei RT inkubiert; die kompletten Ansätze wurden in 50 μl chemokompetente E.coli (DH5α) transformiert ( 1 Std. 4° C; 2 Min. 42° C); die kompletten Transformationen wurden auf LB-Amp ausplattiert
5. dann wurden Kolonien gepickt und in Mikrotiterplatten angezogen und
Millipore 96er Minipräparation hergestellt. Die DNA wurde in 50 μl aufgenommen
Der pU AMBN- Vektor hat einen Polyubiquitin-Promotor aus Mais, dem zwei Gateway®-Rekombinationskassetten in entgegengesetzter Orientierung folgen, die durch das dritte Intron des Gerste Mai -Resistenzgens getrennt werden (siehe Abb.
Durch diese Anordnung des Vektors ist gewährleistet, dass sich die durch PCR amplifizierten Fragmente in sense- und antisense-Richtung im Vektor befinden. Da das gleiche PCR-Fragment einmal in sense- und antisense-Richtung in den Vektor kloniert wird, entsteht nach der Transfektion des Vektors in die Pflanzenzelle und Expression der Sequenzen ein doppelsträngiges Oligonukleotidmolekül, das in der Lage ist, in den Pflanzen eine RNAi-Antwort auszulösen.
Für die biolistische Transfektion wurde das Particle Delivery System Biolistic® PDS- 1000/He (BioRad) verwendet. Das Verfahren wurde gemäß den Herstellerangaben durchgeführt. Dazu wurden Goldpartikel mit der entsprechenden DNA beschichtet. Zur Beschichtung der Goldpartikel wurden typischerweise 5 μl DNA (1 μg/μl), 50 μl 2,5 M CaCl2 und 20 μl 0,1 M Spermidin auf vorpräparierte Goldpartikel gegeben. Die Partikel wurden dann mittels einer Tischzentrifuge pelletiert und mit 140 μl 70% Ethanol und 140 μl 100% Ethanol gewaschen. Nach erneuter Zentrifugation wurden die beschichteten Goldpartikel in 48 bis 60 μl 100% Ethanol resuspendiert. Anschließend wurden die Epidermiszellen gemäß den Herstellerangaben mit den beschichteten Partikeln beschossen.
Zur Transfektion mit dem GUS-Reporterplasmid wurde der so genannte Single-Cell Transient Expression Assay, wie er von Shirasu et al. beschrieben wurde, verwendet (Shirasu et al. (1999), Plant J., 17, 293 - 299). Dazu wurde das Reporterplasmid, das das GUS-Gen enthielt, auf Goldpartikel beschichtet. Die Beschichtung und Bombardierung der Blätter wurde wie oben dargestellt durchgeführt. Die beschossenen Blätter wurden auf l%ige Agar-Platten, die mit 8% mM Benzimidazol versetzt waren, transferiert und bei 180C für 4 Stunden inkubiert. Anschließend wurden die Blätter bezüglich GUS-Aktivität angefärbt und mikroskopisch untersucht.
Das GUS-Konstrukt ist in Nielsen et al. beschrieben (Nielsen et al. (1999) Physiol. Mol. Plant Pathol., 54, 1 - 12).
In Experimenten, in denen die dsRNAi-Konstrukte zusammen mit den GUS- Konstrukten transfiziert wurden, wurden die entsprechenden DNA-Konstrukte vor der Beschichtung auf die Goldpartikel vermischt. Die Experimente wurden dann entsprechend durchgeführt.
Gruppen von jeweils fünf doppelsträngigen RNAi (dsRNAi)-Konstrukten, die jeweils ein Gerstegen in Form von "inverted repeats" in der oben beschriebenen Weise in pUAMBN enthielten, wurden zusammen mit einem Plasmid, das die konstitutive Expression des Reporterproteins ß-Glucuronidase (GUS) vermittelt, in die Epidermis-Zellen von einzelnen Gersteblättern transfiziert.
Anschließend wurden die transformierten Proben mit Blumeria graminisf. sp. hordei (Bgh) 96 Stunden nach der ballistischen Transfektion beimpft. 48 Stunden nach der Beimpfung wurden die Blätter hinsichtlich GUS-Aktivität gefärbt und einzelne transformierte Epidermiszellen, die mit i?gÄ-Sporen beimpft worden waren, wurden mikroskopisch hinsichtlich des Penetrationserfolges des Pilzes untersucht. Bei den Gerstekultivaren, die mit den zwei genannten Vektoren transfiziert wurden, handelte es sich sowohl um den Mio- Wildtyp als auch um Mehltau-resistente m/o-Genotypen, sowie Genotypen, die eine Rasse-spezifische Resistenz gegen bestimmte Mehltau- Isolate verleihen {Mal, Mla6, Mlal2, MIg).
Es wurden folgende Gerste-Kultivare verwendet:
Kultivar Golden Promise (Mio) : Max Planck Institut, Köln Kultivar 110 (Mlal2) : near isogenic to cv Ingrid Kultivar BCPallasMαi Kultivar BCPallasMαtf Kultivar BCPallasMg Kultivar BCIngridm/o5 Kultivar BCIngridw/o5
Es wurden folgende Mehltau Isolate verwendet: Blumeria graminis f.sp. hordei Kl Blumeria graminis f.sp. hordei A6 Blumeria graminis f.sp. tritici JIW2
Bei dieser Vorgehensweise kann ein Gen, dessen Expression durch das dsRNAi- Konstrukt gesilenct wird, dann als Teil des Mo-Rasse-unspezifischen Resistenzmechanismus angesehen werden, wenn es in dem resistenten m/o-Genotyp eine erhöhte Sensitivität gegenüber dem Bgh-Eπeget bewirkt, aber die Rasse- spezifische Resistenz in den Mal-, Mla6-, Mal 2-, Mg-Genotypen nicht beeinflusst.
Der Penetrationserfolg wird dabei mikroskopisch untersucht, indem z.B. das Ausmaß der Haustorienbildung beobachtet wird.
Auf diese Weise konnte das Gerstegen, das im Folgenden als ADF3 oder HvADF3 benannt wird, identifiziert werden. Dieses Gerstegen wies eine hohe Aminosäuresequenzähnlichkeit zu den bereits früher beschriebenen Actin- depolymerisierenden Faktoren aus Arabidopsis thaliana und Zea mays auf. Der ADF3 aus Gerste hat die Sequenz mit der SEQ ID No. 1. Ein Sequenz- Alignment mit anderen ADFs aus Arabidopsis thaliana ist in Abb. 1 gezeigt.
Es wurden die folgenden Penetrationsraten beim Silencing der Expression von ADF3 beobachtet. Die Daten repräsentieren Mittelwerte und Standardabweichungen von drei von einenander unabhängigen Versuchen:
BCIngrid/»/o3: Penetrationsrate 17 % ± 1 % Kontrolle: 0 % ± 1 %
BCIngrid/M/o5: Penetrationsrate 15 % ± 3 % Kontrolle: 0 % ± 0 %
Golden Promise {Mo): Penetrationsrate 27 % ± 1 % Kontrolle: 13 % ± 1 % 2. Interaktionen von HvADFS mit dem Actin-Cytoskelett
Eine genaue Untersuchung der Auswirkungen sowohl der Überexpression als auch des Silencing von HvADF3 auf das Actin-Cytoskelett zeigte, dass sowohl die Überexpression als auch das Silencing zu einem beinahe kompletten Verlust an Phalloidin-färbbaren Actin-Filamenten fuhrt.
Für dieses Experiment wurden Blatt-Epidermiszellen von Gerste mit einem Plasmid transfiziert, das dsRED (RFP) exprimiert, um die transfizierten Zellen zu kenn- zeichnen. Zusätzlich wurde in manchen Experimenten eine konstitutiv aktive
Variante von HvADF3, die eine S6A-Aminosäuresubstitution trägt, die das Protein für eine N-terminale Phosphorylierung unzugänglich macht, exprimiert. Eine entsprechende Mutante wurde für ADF3 aus Mais beschrieben (Smertenko et al., Plant J 14, 187-193.)
Zur Herstellung der HvADF3-(S6A)-Mutante wurde ein PCR-Mutagenese-Verfahren verwendet:
Primer: HvADF3-CA-F (hat HmdlII-Stelle sowie Mutation Ser6 → Ala6): 5'-TTT AAG CTT GCC ACC ATG GCA AAC GCT TCA GCA GGT GCT GGG-31
Primer: HvADF3-CA-R (hatMwI-Stelle):
5'-GTT ACG CGT CTA GTG TGC GCG CTC CTT GA-3'
Der Serinό gegen Alaninö-Austausch wurde durch Design der entsprechenden Primer in das Wildtyp-Gen von HvADF3 eingefügt. Das PCR-Produkt wurde mit den oben angegebenen Restriktionsenzymen geschnitten und in den Überexpressionvektor pUbi-MCS-Nos ligiert, der zuvor mit denselben Restriktionsenzymen geschnittenen worden war. Der resultierende Überexpressionvektor (pHvADF3-CA, Abb. 3) besitzt einen Mais Polyubiquitin Promotor (pUbi), das mutierte HvADF3-Gen (HvADF3-CA)und eine Nopaline Synthase Transkriptions-Teπninationssequenz (NOS).
Zur Herstellung der Silencing- Vektoren wurde die Sequenz von HvADF3 (SEQ ID No. 45) mit spezifischen Gateway Primern amplifiziert und mit Hilfe der Gateway- Technologie in den Vektor pUAMBN (siehe oben) rekombiniert. Folgende Primer wurden verwendet:
Primer HvADF3 -Gate-F (verfügt über attB 1 -Region) :
5'-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTGCCACCATGGCA AACGCTTCATCAGG-3'
Primer HvADF3-Gate-R (verfügt über attB2-Region):
5'-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTTAGTGTGCGCGCT CCTTGA-3'
HvADF3 spezifische Sequenzen sind unterstrichen.
Diese Vektoren wurden dann wie oben beschrieben zur Transfektion der Pflanzen verwendet.
Der dsRED Vektor (pUbi-RFP-Nos, Abb. 4) besitzt einen Mais Polyubiquitin
Promotor (pUbi), das kodierende Gen für das rot fluoreszierende Protein (Discosoma sp. fluorescent protein FP583; RFP) und eine Nopaline Synthase Transkriptions- Terminationssequenz (NOS). Die GenBank Accessionnumber für RFP ist AF168419. Die Experimente wurden in BCIngridm/o5 durchgeführt.
Wenn kein zusätzliches HvADFi (S6A) exprimiert wurde, konnten gefärbte Actinfasern sowohl innerhalb der bombardierten Zelle als auch in den benachbarten Zellen nachgewiesen werden (Abb. 5 a). Dagegen konnten bei der gleichzeitigen Expression von dsRED sowie HvADF3 (S6A) anfärbbare Actinfasern nur in den benachbarten, aber nicht in den bombardierten mit dsRED-markierten Zellen nachgewiesen werden, unabhängig davon ob HvADF3 gesilenct (siehe Abb. 5 b) oder überexprimiert wurde (siehe Abb. 5 c).
Um die HvADF3 -Funktion in Gerste weiter zu untersuchen, wurde die Auswirkung der Überexpression oder des Silencings von HvADFS auf die Mobilität von Peroxisomen untersucht. Für Peroxisomen ist bekannt, dass sie entlang Actinfilamenten bewegt werden (Mathur (2002) Plant Physiology, Vol. 128, 1031 - 1045). Gerste-Peroxisomen wurden dabei durch die Co-Transformation eines Plasmids, das eine Variante des Green Fluorescent Protein (GFP) mit einer peroxisomalen Targetingsequenz exprimierte (Mathur et al., vide supra), visualisiert. Dabei wurden Blatt-Epidermiszellen von Gerste entweder nur mit dem GFP- Konstrukt oder zusammen mit der bereits erwähnten Mutante von HvADFS (S6A) transfiziert. Die Expression dieser Mutante entspricht einer Erhöhung des Gehalts und der Aktivität an ADF3.
Mit Hilfe der PCR-Methode wurde C-terminal an das grün fluoreszierende Protein eine so genannte Peroxisomen-Zielsequenz (PTS) fusioniert. Diese besteht aus den drei Aminosäuren Serin (S), Arginin (R) und Leucin (L) (Jedd, G. et al. (2002) Plant Cell Physiol 43, 384-392).
Primer GFP-F (hat Hm<ΛII-Stelle und bindet in GFP-Sequenz): 5'-GCG AAG CTT GCC ACC ATG GTG AGC AAG GGC GAG-3' Primer GFP-PTS-R (hat zusätzliche PTS und Mwl-Stelle, bindet in GFP-Sequenz): 5'-AAG ACG CGT TTA GAG GCG GGA CTT GTA CAG CTC G-3'
Die PCR wurde mit einer GFP-Sequenz als Template durchgeführt.
Das PCR Produkt wurde mit den oben angegebenen Restriktionsenzymen geschnitten und in den Überexpressionsvektor pUbi-MCS-Nos ligiert, der zuvor mit denselben Restriktionsenzymen geschnittenen worden war.
Der GFP -Peroxisomen-Zielsequenz- Vektor (pGFPTS, Abb. 6) besitzt einen Mais Polyubiquitin Promotor (pUbi), das kodierende Gen für das grün fluoreszierende Protein inklusive der Peroxisomen-Zielsequenz (GFPTS) und eine Nopaline Synthase Transkriptions-Terminationssequenz (NOS).
Die Überexpression von HvADFS wurde wie oben beschrieben durchgeführt. Die Silencing-Experimente wurden ebenfalls wie oben beschrieben durchgeführt.
Die Überexpression, aber auch das Silencing (Daten nicht gezeigt) von HvADFS bewirkte eine drastische Verlangsamung oder sogar einen kompletten Stopp der peroxisomalen Bewegung und führte häufig zur Bildung von peroxisomalen Aggregaten (siehe Abb. 7). Während sich bei der Kontrolltransfektion mit GFP alleine GFP -markierte Peroxisomen konstant innerhalb der bombardierten Zelle bewegen (siehe Abb. 7 a), ist die Bewegung der Peroxisomen bei Co-Expression von HvADFS (S6A) wesentlich verlangsamt, und es kommt schließlich zu einer Aggregation der Peroxisomen (siehe Abb. 7 b).
Zusammenfassend zeigen diese Ergebnisse, dass die Überexpression und ebenso das Silencing von HvADFS zu einem Verlust an Phalloidin-färbbaren Actin-Filamenten des Cytosekeletts fuhrt, was zur Folge hat, dass intrazelluläre durch Actin-Filamente vermittelte Transportprozesse beeinträchtigt sind. 3. Resistenz von Pflanzen, die bezüglich des Gehalts bzw. der Aktivität von
HvADFS gegenüber dem Wildtyp verändert sind
Die oben beschriebene Beeinträchtigung der intrazellulären Transportmechanismen in Folge der Überexpression oder des Silencing von HvADFS kann zur Konsequenz haben, dass Transport-abhängige Verteidigungsmechanismen wie z.B. die Vesikelanhäufung an Infektionsstellen der Grund dafür sein könnten, dass in den Experimenten, die zur Identifizierung von HvADFS führten, eine erhöhte
Penetrationsrate in eigentlich resistenten m/o-Genotypen beobachtet wurde. Es wurde daher untersucht, ob die Überexpression oder das Silencing von HvADFS ebenfalls zu einer Rasse-unspezifischen Resistenz gegen verschiedene 5g7z-Isolate führt.
Daher wurden Zellen untersucht, die mit HvADFS Überexpressions-Konstrukten transfiziert worden waren.
Eine genaue Analyse solcher transfϊzierten Zellen ergab, dass die Entwicklung des Pathogens zu späteren Zeitpunkten entweder arretiert oder zumindest erheblich verlangsamt war. Während 72 Stunden nach der Infektion die Entwicklung von Pilzstrukturen in Stomatazellen, die sich in der Nähe der transfizierten Zellen befanden, normal erschien, waren die Pilzstrukturen von Sporen, die die transfizierten Zellen attackierten, nur gering entwickelt. Dabei muss beachtet werden, dass Stomatazellen eine verbleibende Empfindlichkeit für Mehltauinfektion auch in /w/o-Genotypen behalten.
Für diese Experimente wurden Blatt-Epidermiszellen von Gerste mit einem Plasmid für den GUS-Reporter zusammen mit einem Plasmid, das für HvADFS (S6A) kodiert, wie oben beschrieben ko-transfiziert. Vier Stunden nach dem Bombardement wurden die Blätter mit Z?g/*-Konidien infiziert und 22 Stunden nach der Beimpfung wurden die Blätter hinsichtlich GUS-Aktivität und Pilzstrukturen gefärbt. Die Abbildungen 8 a und b zeigen die Pilzentwicklung in einer transfizierten Blatt-Epidermiszelle. Die Abb. 8 c zeigt die Pilzentwicklung in einer Stomatazelle. Die Expression von Hv ADF3 (S6A) entspricht einer Überexpression von HvADF3. Die Experimente wurden in BCIngridm/o5-Pflanzen durchgeführt.
Wie man aus den Abbildungen 8 a, b und c erkennt, kann der Pilz bei Zellen, in denen HvADFS überexprimiert wird, nur sehr kurze Hyphen bilden, was die Etablierung einer nachhaltigen Infektion verhindert. Dagegen werden die Pilzstrukturen in Stomatazellen, die nicht transflziert wurden, voll ausgebildet (siehe Abb. 8 c). Es sieht daher so aus, dass das pilzliche Pathogen zwar zunächst von dem beeinträchtigten Actin-Cytoskelett des Wirts bei der erfolgreichen Zellwandpenetration profitiert, aber eine erfolgreiche Infektion nicht etablieren kann, da offensichtlich intakte Actin-Filamente für die Aufrechterhaltung einer kompatiblen Interaktion notwendig sind. Somit kann durch Erhöhung bzw.
Erniedrigung des Gehalts und/oder der Aktivität von ADF3 in Gerste eine Rasse- unspezifische Resistenz gegen verschiedene Bgh-Isolats erreicht werden.
Die vorstehend beschriebenen Experimente beruhen alle auf einer transienten Expression mittels Particle Bombardement. Die dadurch gewonnen Ergebnisse lassen sich jedoch ohne weiteres auf stabil transformierte transgene Pflanzen übertragen, bei denen die Expression von ADFs dauerhaft gesteigert oder reduziert ist. Stabil transformierte Pflanzen können z.B. wie nachfolgend beschrieben hergestellt werden.
Die in SEQ ID No. 11 angegebene Nukleinsäuresequenz für ADF 3 aus Arαbidopsis thαliαnα kann durch folgende Primer amplifiziert werden:
Fra224 atggctaatgcagcatcagg Fra 255 tcaattggctcggcttttga
Zur Transformation wird das erhaltene Fragment in einen binären Vektor kloniert. Vorher erfolgt eine Subklonierung in den Vektor pCR®2.1 TOPO (Invitrogen, Karlsruhe), aus dem das Gen mit den Enzymen EcoRV und HindUI wieder ausgeschnitten werden kann (siehe Abb. 9). Die überhängenden Enden werden mit Hilfe des Klenow-Enzyms aufgefüllt.
Für die konstitutive Expression von AtADF3 wird das oben hergestellte Fragment in den mit Smal geöffneten, dephosphorylierten binären Vektor pSUN2 ligiert (siehe Abb. 10).
Um auch die pathogen-induzierbare Expression von AtADF3 zu ermöglichen, wird dieses mit BgHI und^δαl aus pSUN2 ausgeschnitten und in den Vektor Lo215 ligiert. Dieser Vektor enthält bereits den Thi2.1 -Promotor aus Arabidopsis thaliana (Acc. L41244; EppleJP., Apel,K. and Bohlmann,H. (1995) An Arabidopsis thaliana thionin gene is inducible via a signal transduction pathway different from that for pathogenesis-related proteins. Plant Physiol. 109 (3), 813-820), der durch Pathogenbefall induziert wird, was über ein nachgeschaltetes GUS-Gen bereits gezeigt wurde. AtADF3 wird an die Stelle des vorhandenen GUS-Gens kloniert, indem dieses mit SacI und Smal aus dem Vektor ausgeschnitten, der Vektor dephosphoryliert und aufgefüllt und das AtADF3 -Fragment in den Vektor ligiert wird. Über eine homologe Rekombination (Gateway®-Reaktion, Invitrogen, Karlsruhe) wurde das Promotor-Gen Konstrukt anschließend in den binären Vektor Lol23 umkloniert (siehe Abb. 11).
Die Transformation wird nach der Floral-Dip-Methode (modifiziert nach Clough und Bent, 1998) durchgeführt. Die Samen werden nach dem Ernten über Nacht mit Chlorgas sterilisiert und anschließend auf Selektionsplatten ausgelegt. Die Antibiotikazugabe erfolgt in Abhängigkeit vom pflanzlichen Resistenzmarker. Bei pSUN2 wird BASTA zugesetzt, bei Lo 123 wird Kanamycin zugegeben. Die Samen werden nach der Sterilisation auf den Selektionsplatten ausgelegt und zur Stratifizierung zwei Tage bei 4 0C im Kühlraum aufbewahrt. Danach werden sie unter Kurztagbedingungen weiter beobachtet. Nach etwa 10 Tagen kann die erste Selektion der Pflanzen durchgeführt werden. Nicht-transgenen Pflanzen bleichen während Selektion aus, während die transgenen Pflanzen, die das entsprechende Resistenz-Gen besitzen, grün bleiben. Die Pflanzen, die nach der ersten Selektion grün bleiben, werden ein zweites Mal unter den gleichen Bedingungen selektiert. Die Pflanzen, die auch während der zweiten Selektion nicht ausbleichen, können dann auf Erde umgesetzt werden. Die Pflanzen werden geselbstet und die resultierenden T2-Samenpopulationen der phytopathologischen Analyse unterworfen.
Zur Analyse der Resistenz der transgenen Arabidopsis thaliana-PΑanzQn gegenüber pathogenen Pilzen werden Inokulationen mit den biotrophen Oomyceten bzw. Pilzen Peronosporα pαrαsiticα und Erysiphe cichorαceαrum vorgenommen.
a) Infektion mit Peronosporα pαrαsiticα
5 bis 8 Wochen alte Pflanzen werden mit einer Konidiensporensuspension (ca. 106 Sporen / ml) besprüht. Die inokulierten Pflanzen werden über Nacht in einem
Kühlschrank bei ca. 16°C mit einer Plastiktüte überdeckt dunkel und feucht gehalten.
Nach einem Tag wird die Plastiktüte etwas geöffnet und später vollständig entfernt.
Sechs Tage nach Inokulation werden die Pflanzen wieder über Nacht mit der
Plastiktüte zugedeckt, wodurch die Sporulation induziert wird. Am folgenden Tag werden die Blätter auf das Auftreten von Konidiophoren untersucht. Das interzelluläre Wachstum des Pilzes führt in den nächsten Tagen zur Induktion von schwachen Chlorosen bis hin zu starken Nekrosen in den Blättern. Diese Symptome werden quantifiziert und auf Signifikanz getestet. b) Infektion mit Erysiphe cichoracearum
Der biotrophe Mehltau-Pilz wird auf Arabidopsis thaliana-PüanzQn kultiviert. Zur Infektion der 4 Wochen alten transgenen Arαbidopsis-PüaDzen werden mit einem feinen Pinsel Konidienträger auf der Oberfläche der Blätter abgenommen und auf die Blätter der transgenen Pflanzen gestrichen. Die Pflanzen werden für 7 Tage bei 200C inkubiert. 7 Tage nach Inokulation werden die Konidienträger auf den Blättern sichtbar, und es treten in den folgenden Tagen Chlorosen und Nekrosen zutage. Diese Symptome werden quantifiziert und auf Signifikanz getestet.
c) Ergebnisse
Die transgenen Arabidopsis Pflanzen, die vltADF3 konstitutiv oder pathogen- induzierbar exprimieren, zeigen sowohl gegen Peronosporα pαrαsiticα als auch gegen Erysiphe cichoracearum eine signifikant erhöhte Resistenz im Vergleich zu nicht-transgenen Wildtyp-Pflanzen zeigen.
Abbildungslegende
Abb. 1: Abb. 1 zeigt ein Sequenz- Alignment von HvADFS sowie verschiedenen ADFs aus Arabidopsis thaliana (siehe auch Tabelle 7)
Abb. 2:
Abb. 2 zeigt den Vektor pUAMBN, der für das dsRNAi-basierte Silencing in Epidermiszellen von Gerste verwendet wurde. Ubi, Mais Polyubiquitin Promotor; attRl und attR2, Gateway Rekombinationsstellen; ccdB, negativer Selektionsmarker; nos, Agrobacterium tumefaciens Nopaline Synthase transkriptioneller Terminator.
Abb. 3: Abb. 3 zeigt den Vektor pHvADF3-CA.
Abb. 4:
Abb. 4 zeigt den Vektor pUbi-RFP-nos.
Abb. 5:
Abb. 5 zeigt die Visualisierung des Actin-Cytoskeletts in transfizierten einzelnen Epidermisblattzellen von Hafer durch Phalloidin-Färbung. Die Zellen wurden mit einem Plasmid transfiziert, das dsRED (RFP) exprimierte, um bombardierte Zellen zu markieren. Wenn kein zusätzliches Gen exprimiert wurde (Kontrolle, A), waren gefärbte Actin-Fasern innerhalb der markierten Zellen sowie in benachbarten Zellen detektierbar. Sowohl im Fall von dsRNAi-basiertem Silencing von HvADF3 (B) als auch im Fall der Überexpression einer konstitutiv aktiven Variante von HvADF3, die eine S6A- Aminosäuresubstitution trägt, die eine N-terminale Phosphorylierung des Proteins verhindert (C), waren Actin-Fasern nur in den benachbarten Zellen, aber nicht in den durch dsRED-markierten Zellen sichtbar. Abb. 6:
Abb. 6 zeigt den Vektor pGFPTS.
Abb. 7:
Abb. 7 zeigt die Bewegung von GFP-markierten Peroxisomen in einzelnen Blattepidermiszellen von Gerste. Ein Plasmid, das eine GFP -Variante mit einer C- terminalen peroxisomalen Targetingsequenz kodierte, wurde entweder alleine (A, Kontrolle) oder zusammen mit einem Plasmid, das eine "konstitutiv aktive" Variante von HvADF3, die eine S A- Aminosäuresubstitution trägt (B), exprimiert. Während sich in den Kontrolltransfektionen (A) GFP-markierte Peroxisomen konstant innerhalb der bombardierten Zellen bewegten, waren die Peroxisomen bei Co- Expression der konstitutiv aktiven Variante von HvADF3 (B) verlangsamt und aggregierten schließlich.
Abb. 8:
Abb. 8 zeigt, dass die Überexpression von HvADF3 die Entwicklung des Pilzes inhibiert. Blattepidermiszellen von Gerste wurden mit GUS (ß-Glucuronidase)- Reporterplasmiden und einem Plasmid transfiziert, das die ektopische Expression einer konstitutiv aktiven Variante von HvADF3 (die eine S6A-
Aminosäuresubstitution trägt) bewirkt. 4 Stunden nach der Bombardierung wurden die Zellen mit 5g/z-Konidiosporen beimpft und 72 Stunden nach der Beimpfung wurden die Blätter auf GUS -Aktivität und pilzliche Strukturen gefärbt. A, B, die pilzliche Entwicklung einer transfizierten Blattepidermiszelle. C, die püzliche Entwicklung einer erfolgreich befallenen Stomatazelle.
Abb. 9:
Abb. 9 zeigt den Vektor ρCR2.1 TOPO mit inseriertem -4tADF3-Gen.
Abb. 10: Abb. 10 zeigt den Vektor pSUN2 mit inseriertem -4tADF3-Gen.
Abb. 11:
Abb. 11 zeigt den Vektor Lol23 mit inseriertem AtAOF3-Gen.

Claims

P A T E N T A N S P R Ü C H E
1. Verfahren zur Herstellung von transgenen Pflanzen und/oder Pflanzenzellen mit erhöhter Pathogenresistenz, dadurch gekennzeichnet, dass der Gehalt und/oder die Aktivität von mindestens einem Actin-depolymerisierenden Faktor (ADF) in den Pflanzen bzw. Pflanzenzellen gegenüber dem Wildtyp verändert wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass es sich um mindestens einen ADF, bevorzugt aus Pflanzen, besonders bevorzugt aus Gerste, Hafer, Weizen, Raps, Mais, Panicum, Pennisetum, Setavia, Sorghum und/oder Arabidopsis thaliana, insbesondere bevorzugt um ADF3 aus Gerste, oder um ADFs handelt, die zu den genannten ADFs im Wesentlichen funktionell homolog sind.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um die ADFs mit den SEQ ID Nos 1 bis 44 aus Tabelle 5, bevorzugt um den ADF mit der SEQ ID No. 1, oder um ADFs mit Sequenzen handelt, die zu den Sequenzen der genannten ADFs im Wesentlichen funktionell homolog sind.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um einen ADF handelt, der die Konsensussequenzen SEQ ID No. 89, 90 und/oder 91 aufweist.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass der ADF-Gehalt und/oder die ADF-Aktivität durch Übertragung mindestens einer Nukleinsäure, die für mindestens einen ADF oder einen funktionell äquivalenten Teil und/oder Mutante davon kodiert, auf die Pflanze bzw. Pflanzenzelle erhöht wird.
6. Verfahren nach Anspruch 5, umfassend die folgenden Schritte: a) Herstellung eines Vektors umfassend folgende Nukleinsäuresequenzen in 5 '-3 '-Orientierung: - eine in Pflanzen funktionelle Promotersequenz, operativ damit verknüpft eine DNA-Sequenz, die für mindestens einen ADF oder funktionell äquivalente Teile oder Mutanten davon kodiert, operativ damit verknüpft eine in Pflanzen funktionelle Terminationssequenz b) Übertragung des Vektors aus Schritt a) auf eine Pflanzenzelle und gegebenenfalls Integration in das pflanzliche Genom.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass der Gehalt und/oder die Aktivität von mindestens einem endogenen ADF im Vergleich zum Wildtyp geändert wird.
8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass der Gehalt und/oder die Aktivität von mindestens einem endogenen ADF durch Beeinflussung der Transkription und/oder Translation erhöht wird.
9. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass der Gehalt und/oder die Aktivität von mindestens einem endogenen ADF durch Beeinflussung der posttranslationalen Modifikationen erhöht wird.
10. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass der Gehalt und/oder die Aktivität von mindestens einem endogenen ADF durch Übertragung von Nukleinsäuremolekülen umfassend Sequenzen, die identisch, homolog oder komplementär zu den Sequenzen sind, die für die endogenen ADFs oder Teile davon kodieren, auf Pflanzenzellen erniedrigt wird.
11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass der Teil der übertragenen Nukleinsäuresequenzen, der identisch, homolog oder komplementär zu den für endogene ADFs oder Teilen davon kodierenden Sequenzen ist, 20 bis 1000 Nukleotide, 20 bis 750 Nukleotide, bevorzugt 20 bis 500 Nukleotide, ebenfalls bevorzugt 20 bis 250 Nukleotide, besonders bevorzugt 20 bis 150 Nukleotide, insbesondere bevorzugt 20 bis 100 Nukleotide und am meisten bevorzugt um die 20-50 Nukleotide umfasst.
12. Verfahren nach Anspruch 10 oder 11 , dadurch gekennzeichnet, dass ein Teil der übertragenen Nukleinsäuresequenzen mindestens zu 50%, bevorzugt mindestens zu 60%, ebenfalls bevorzugt mindestens zu 70%, besonders bevorzugt mindestens zu 80%, insbesondere bevorzugt mindestens zu 90% und am meisten bevorzugt mindestens zu 95% homolog zu den für endogene ADFs oder Teilen davon kodierenden Sequenzen ist.
13. Verfahren nach Anspruch 10 oder 11 , dadurch gekennzeichnet, dass ein Teil der übertragenen Nukleinsäuresequenzen mindestens zu 50%, bevorzugt mindestens zu 60%, ebenfalls bevorzugt mindestens zu 70%, besonders bevorzugt mindestens zu 80%, insbesondere bevorzugt mindestens zu 90% und am meisten bevorzugt mindestens zu 95% komplementär zu den für endogene ADFs oder Teilen davon kodierenden Sequenzen ist.
14. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 13 , dadurch gekennzeichnet, dass die Erniedrigung des Gehalts und/oder der Aktivität von mindestens einem endogenen ADF durch PTGS, VIGS, RNAi oder homologe Rekombination erfolgt.
15. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 14, umfassend die folgenden Schritte: a) Herstellung eines Vektors, umfassend folgende Nukleinsäuresequenzen in 5 '-3 '-Orientierung: - eine in Pflanzen funktionelle Promotersequenz,
- operativ daran gebunden eine identische oder homologe antisense- Sequenz der für den mindestens einen ADF oder Teilen davon kodierenden Sequenz, wobei die Sequenz an ihrem 3 '-Ende vom Spleißosom erkennbare 3'-Exon-Sequenzen aufweist, - operativ daran gebunden ein Intron, operativ daran gebunden eine identische oder homologe sense-Sequenz der für den mindestens einen ADF oder Teilen davon kodierenden Sequenz, wobei die Sequenz an ihrem 5 '-Ende vom Spleißosom erkennbare 5 '-Exon-Sequenzen aufweist, - operativ daran gebunden eine in Pflanzen funktionelle
Terminationssequenz, b) Übertragen des Vektors aus a) auf Pflanzenzellen und gegebenenfalls Integration ins pflanzliche Genom.
16. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 14, umfassend die folgenden Schritte: a) Herstellung eines doppelsträngigen RNA-Moleküls von 15 bis 100 Nukleotiden Länge, bevorzugt von 20 bis 75 Nukleotiden Länge, insbesondere bevorzugt von 20 bis 50 Nukleotiden Länge, ebenfalls insbesondere bevorzugt von 20 bis 40 oder 20 bis 30 Nukleotiden Längen und am meisten bevorzugt von 20 bis 25 oder 21, 22 oder 23 Nukleotiden Länge, umfassend Nukleinsäuresequenzen, deren sense-Strang identisch oder homolog zu einem Teil der den/die endogenen ADF(s) kodierenden Sequenz(en) ist, b) Übertragen des Moleküls aus a) auf Pflanzenzellen.
17. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 14, umfassend die folgenden Schritte: a) Herstellung eines Vektors, umfassend folgende Nukleinsäuresequenzen in 5 '-3 '-Orientierung: - eine in Pflanzen funktionelle Promotersequenz,
- operativ daran gebunden eine identische oder homologe antisense- Sequenz der für den/die endogenen ADF(s) oder Teilen davon kodierenden Sequenz(en), operativ daran gebunden eine in Pflanzen funktionelle Terminationssequenz, b) Übertragen des Vektors aus a) auf Pflanzenzellen und gegebenenfalls Integration ins pflanzliche Genom.
18. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 14, umfassend die folgenden Schritte: a) Herstellung eines Vektors, umfassend folgende Nukleinsäuresequenzen in 5 '-3 '-Orientierung:
- eine in Pflanzen funktionelle Promotersequenz,
- operativ daran gebunden eine identische oder homologe sense-Sequenz der für den/die endogenen ADF(s) oder Teilen davon kodierenden
Sequenz(en), wobei die Sequenz über selbst-komplementäre Bereiche verfügt,
- operativ daran gebunden eine in Pflanzen funktionelle Terminationssequenz, b) Übertragen des Vektors aus a) auf Pflanzenzellen und gegebenenfalls Integration ins pflanzliche Genom.
19. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 14, umfassend die folgenden Schritte: a) Herstellung eines Vektors, umfassend folgende Nukleinsäuresequenzen in 5 '-3 '-Orientierung: eine in Pflanzen funktionelle Promotersequenz,
- eine operativ daran gebundene DNA-Sequenz, die zu der/den für die mRNA des/der endogenen ADF(s) oder Teilen davon kodierenden
Sequenz(en) komplementär ist,
- operativ daran gebunden eine DNA-Sequenz, die für Ribonuklease P kodiert,
- operativ daran gebunden eine in Pflanzen funktionelle Terminationssequenz, b) Übertragen des Vektors aus a) auf Pflanzenzellen und gegebenenfalls Integration ins pflanzliche Genom.
20. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 14, umfassend die folgenden Schritte: a) Herstellung eines Vektors, umfassend folgende Nukleinsäuresequenzen in 5 '-3 '-Orientierung:
- eine in Pflanzen funktionelle Promotersequenz,
- operativ daran gebunden eine DNA-Sequenz, die identisch oder homolog zu der für das 5 '-Ende des/der endogenen ADF(s) kodierenden
Sequenz(en) ist,
- operativ daran gebunden eine DNA-Sequenz, die für ein Resistenzgen kodiert, - operativ daran gebunden eine DNA-Sequenz, die identisch oder homolog zu der für das 3 '-Ende des/der endogenen ADF(s) kodierenden Sequenz(en) ist,
- operativ daran gebunden eine in Pflanzen funktionelle Terminationssequenz, b) Übertragen des Vektors aus a) auf Pflanzenzellen und Integration ins pflanzliche Genom.
21. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 14, umfassend die folgenden Schritte: a) Herstellung eines Vektors, umfassend folgende Nukleinsäuresequenzen:
- eine in Pflanzen funktionelle Promotersequenz,
- operativ daran gebunden eine DNA-Sequenz, die für ein Ribozym kodiert, das spezifisch die mRNA des/der endogenen ADF(s) erkennt, - operativ daran gebunden eine in Pflanzen funktionelle
Terminationssequenz, b) Übertragen des Vektors aus a) auf Pflanzenzellen und gegebenenfalls Integration ins pflanzliche Genom.
22. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Erniedrigung des Gehalts und/oder der Aktivität des/der endogenen ADF(s) durch Expression mindestens eines nicht¬ funktionellen ADFs oder Teilen davon erfolgt, die Punktmutation(en), Deletion(en) und/oder Insertion(en) aufweisen.
23. Verfahren nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um mindestens einen nicht¬ funktionellen ADF handelt, der Punktmutation(en), Deletion(en) und/oder Insertion(en) aufweist, die die Bindung an pathogene oder physiologische Bindungspartner, bevorzugt an G-Actin und/oder an F-Actin, verhindern.
24. Verfahren nach einem der Ansprüche 22 oder 23, umfassend die folgenden Schritte: a) Herstellung eines Vektors, umfassend folgende Nukleinsäuresequenzen in 5 '-3 '-Orientierung: eine in Pflanzen funktionelle Promotersequenz,
- operativ daran gebunden eine DNA-Sequenz, die für eine dominant¬ negative Mutante eines pflanzlichen ADFs, kodiert operativ daran gebunden eine in Pflanzen funktionelle Terminationssequenz, b) Übertragen des Vektors aus a) auf die Pflanzenzellen und gegebenenfalls Integration ins pflanzliche Genom.
25. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Erniedrigung des Gehalts und/oder der Aktivität des/der endogenen ADF(s) durch Expression mindestens eines rekombinanten Antikörpers erfolgt, der für den/die endogenen ADF(s) spezifisch ist und die Interaktionen mit pathogenen und/oder physiologischen Bindungspartnern, bevorzugt G- Actin und/oder F-Actin, blockiert.
26. Verfahren nach Anspruch 25, umfassend die folgenden Schritte: a) Herstellung eines Vektors, umfassend folgende Nukleinsäuresequenzen in 5 '-3 '-Orientierung:
- eine in Pflanzen funktionelle Promotersequenz, - operativ daran gebunden eine DNA-Sequenz, die für einen rekombinanten
Antikörper kodiert, der für den/die endogenen ADF(s) spezifisch ist und die Interaktionen mit pathogenen und/oder physiologischen Bindungspartnern, bevorzugt G- Actin und/oder F-Actin, blockiert,
- operativ daran gebunden eine in Pflanzen funktionelle Terminationssequenz, b) Übertragen des Vektors aus a) auf die Pflanzenzellen und gegebenenfalls Integration ins pflanzliche Genom.
27. Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 26, dadurch gekennzeichnet, dass der Vektor zusätzlich zu Promoter- und
Terminationssequenzen weitere regulatorische und funktionelle Sequenzen enthält.
28. Verfahren nach dem Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den regulatorischen Sequenzen um Enhancer, um Replikationssignale, Selektionsmarker und/oder um Sequenzen handelt, die eine Propagation der Vektoren in Bakterien und/oder eine transiente und/oder permanente Replikation in Pflanzenzellen ermöglichen.
29. Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 28, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den Vektoren um Plasmide, Cosmide und/oder rekombinante Viren handelt.
30. Verfahren nach Anspruch 29, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den Vektoren um pBR322, um pUC- Vektoren, um Ml 3mp- Vektoren oder um Vektoren handelt, die vom Ti- oder Ri- Plasmid von Agrobacterien abgeleitet sind.
31. Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 30, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem Promotersequenzen um konstitutive Promotoren, bevorzugt um den 35S- , den Actin- oder den Ubiquitin-Promotor, um gewebespezifische Promotoren, bevorzugt um den Phosphoenolpyruvat- Carboxylase- oder den Fructose-l,6-bisphosphatase-Promoter, um blattspezifische, um entwicklungsspezifische, licht-, verwundungs-, oder pathogeninduzierte Promotoren handelt.
32. Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 31 , dadurch gekennzeichnet, dass der Vektor durch Transformation, Transfektion, Injektion, biolistische Methoden und/oder Elektroporation auf die Pflanzen übertragen wird.
33. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 32, dadurch gekennzeichnet, dass der/die ADF(s) mindestens ein Aminosäuresequenzmotiv enthalten, das mindestens zu 40%, bevorzugt mindestens zu 50%, besonders bevorzugt mindestens zu 60%, insbesondere bevorzugt mindestens zu 70%, ebenfalls insbesondere bevorzugt mindestens zu 80% und am meisten bevorzugt bis zu 90% homolog zu einer der Aminosäuresequenzen SEQ ED No. 89, 90 oder 91 ist.
34. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 33, dadurch gekennzeichnet, dass der/die ADF (s) mindestens zu 40%, bevorzugt mindestens zu 50%, besonders bevorzugt mindestens zu 60%, insbesondere bevorzugt mindestens zu 70%, ebenfalls insbesondere bevorzugt mindestens zu 80% und am meisten bevorzugt mindestens zu 90% oder 98% homolog zu der Aminosäuresequenz SEQ ID No. 1 ist.
35. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 34, dadurch gekennzeichnet, dass die transgenen Pflanzen eine erhöhte Resistenz gegen Pathogene zeigen, die ausgewählt sind aus der Gruppe enthaltend Blumeria graminisf. sp. hordei, tritici, avenae, secalis, lycopersici, vitis, cucumis, Cucurbitae, pisi,pruni, solani, rosae,fragariae, rhododendri, mali und nicotianae.
36. Verfahren nach Anspruch 35 , dadurch gekennzeichnet, dass die Pflanzen eine erhöhte Resistenz gegen Blumeria graminisf. sp. hordei zeigen.
37. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 36, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den transgenen Pflanzen um monokotyle Pflanzen, bevorzugt um Pflanzen, die zu den Gattungen Avena (Hafer), Triticum (Weizen), Seeale (Roggen), Hordeum (Gerste), Oryza (Reis), Panicum, Pennisetum, Setaria, Sorghum (Hirse), Zea (Mais) und dergleichen gehören, handelt.
38. Verfahren nach Anspruch 37, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um Gerste oder Weizen handelt.
39. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 38, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den transgenen Pflanzen um dikotyle Pflanzen, bevorzugt um Baumwolle, Leguminosen wie Hülsenfrüchte und insbesondere Alfalfa, Sojabohne, Raps, Tomate, Zuckerrübe, Kartoffel, Zierpflanzen, Tabak sowie Bäume handelt.
40. Verwendung mindestens einer Nukleinsäuresequenz, die für einen funktionellen oder nicht-funktionellen Actin-depolymerisierenden Faktor (ADF), funktionell äquivalente Teile und/oder Derivate davon kodiert, und/oder mindestens einer Nukleinsäuresequenz, die für einen rekombinanten Antikörper kodiert, der für den/die endogenen ADF(s) spezifisch ist und die Interaktionen mit pathogenen oder physiologischen Bindungspartnern, bevorzugt G- Actin und/oder F-Actin, blockiert, zur Herstellung von transgenen Pflanzen und/oder Pfanzenzellen mit erhöhter Pathogenresistenz.
41. Verwendung nach Anspruch 40, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um die Nukleinsäuresequenz für einen pflanzlichen ADF, bevorzugt einen ADF aus Pflanzen, die zu den Gattungen Avena (Hafer), Triticum (Weizen), Seeale (Roggen), Hordeum (Gerste), Oryza (Reis), Panicum, Pennisetum, Setaria, Sorghum (Hirse), Zea (Mais) und dergleichen gehören, handelt.
42. Verwendung nach Anspruch 41 , dadurch gekennzeichnet, dass es sich um die ADFs mit den SEQ ID Nos 1 bis 44 aus Tabelle 5, bevorzugt um den ADF mit der SEQ ID No. 1, oder um ADFs mit Sequenzen handelt, die zu den Sequenzen der genannten ADFs homolog sind.
43. Verwendung nach einem der Ansprüche 40 bis 42, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den nicht-funktionellen ADFs um dominant-negative Mutanten handelt.
44. Transgene Pflanze oder Pflanzenzelle mit erhöhter Pathogenresistenz, dadurch gekennzeichnet, dass der Gehalt und/oder die Aktivität mindestens eines Actin-depolymerisierenden Faktors (ADF) im Vergleich zum Wildtyp verändert ist.
45. Transgene Pflanze oder Pflanzenzelle nach Anspruch 44, dadurch gekennzeichnet, dass der Gehalt und/oder die Aktivität von mindestens einem endogenen ADF und/oder von mindestens einem exogenem ADF erhöht ist.
46. Transgene Pflanze oder Pflanzenzelle nach Anspruch 44, dadurch gekennzeichnet, dass der Gehalt und/oder die Aktivität von mindestens einem endogenen ADF erniedrigt ist.
47. Transgene Pflanze oder Pflanzenzelle nach einem der Ansprüche 44 bis 46, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um die ADFs mit den SEQ ID Nos 1 bis 4 aus Tabelle 5, bevorzugt um den ADF mit der SEQ ID No. 1, oder um ADFs mit Sequenzen handelt, die zu den Sequenzen der genannten ADFs im Wesentlichen funktionell homolog sind.
48. Transgene Pflanze oder Pflanzenzelle nach einem der Ansprüche 44 bis 47, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um einen ADF handelt, der die Konsensussequenzen SEQ ID No. 89, 90 und/oder 92 aufweist.
49. Transgene Pflanze oder Pflanzenzelle nach einem der Ansprüche 44 bis 48, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um mindestens einen ADF, bevorzugt aus Pflanzen, besonders bevorzugt aus Gerste, Hafer, Weizen, Raps, Mais, Reis, Panicum, Pennisetum, Setaria, Hirse, Mais und/oder Arabidopsis thaliana, insbesondere bevorzugt um ADFs aus Gerste, oder um ADFs handelt, die zu den genannten ADFs im Wesentlichen funktionell homolog sind.
50. Transgene Pflanze oder Pflanzenzelle nach einem der Ansprüche 44 dadurch gekennzeichnet, dass die transgenen Pflanzen eine erhöhte Resistenz gegen Pathogene zeigen, die ausgewählt sind aus der Gruppe enthaltend Blumeria graminisf. sp. hordei, tritici, avenae, secalis, lycopersici, vitis, cucumis, Cucurbitae, pisi,pruni, solani, rosae,fragariae, rhododendri, mali und nicotianae.
51. Transgene Pflanze oder Pflanzenzelle nach einem der Ansprüche 44 bis 50, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den transgenen Pflanzen um monokotyle Pflanzen, bevorzugt um Pflanzen, die zu den Gattungen Avena (Hafer), Triticum (Weizen), Seeale (Roggen), Hordeum (Gerste), Oryza (Reis), Panicum, Pennisetum, Setaria, Sorghum (Hirse), Zea (Mais) und dergleichen gehören, handelt.
52. Transgene Pflanze oder Pflanzenzelle nach einem der Ansprüche 44 bis 51, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem ADF, dessen Gehalt und/oder Aktivität gegenüber dem Wildtyp verändert ist, um ADF3 aus Gerste, bei der Pflanze um Gerste und bei dem Pathogen, gegen das die Pflanze resistent ist, um Blumeria graminisf. sp. hordei handelt.
53. Transgene Pflanzenzelle oder Pflanze mit erhöhter Pathogenresistenz, hergestellt durch ein Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 39.
54. Isoliertes Nukleinsäuremolekül, ausgewählt aus der Gruppe umfassend: a) Nukleinsäuremoleküle, die für den Actin-depolymerisierenden Faktor 3 (ADF3) aus Gerste mit der SEQ ID No. 1 kodieren, b) Nukleinsäuremoleküle, die für funktionelle äquivalente Teile des ADF3 aus Gerste mit der SEQ ID No. 1 kodieren, c) Nukleinsäuremoleküle, die für Mutanten des ADF3 aus Gerste mit der
SEQ ID No. 1 kodieren, d) Nukleinssäuremoleküle, die zu den Nukleinsäuremolekülen aus a), b) und c) hybridisieren, wobei die Nukleinsäuremoleküle aus b) und c) für Proteine bzw. Proteinfragmente kodieren, die zu dem ADF3 aus Gerste mit der SEQ ID No. 1 mindestens zu 80%, bevorzugt mindestens zu 85%, besonders bevorzugt mindestens zu 90%, insbesondere bevorzugt zu mindestens 95% und meisten bevorzugt zu mindestens 98% homolog sind und wobei die Nukleinsäuremoleküle aus d) zu den Nukleinsäuremolekülen aus a), b) und c) zu mindestens zu 80%, bevorzugt mindestens zu 85%, besonders bevorzugt mindestens zu 90%, insbesondere bevorzugt zu mindestens 95% oder 97% und meisten bevorzugt zu mindestens 98% komplementär sind.
55. Isoliertes Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 54, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um Nukleinsäuremoleküle mit den Sequenzen SEQ ID No. 45 und 46 handelt.
56. Expressionsvektor, umfassend: - eine in Pflanzen funktionelle Promotersequenz, operativ damit verknüpft eine DNA-Sequenz gemäß den Ansprüchen 54 oder 55, operativ damit verknüpft eine in Pflanzen funktionelle Terminationssequenz.
57. Isoliertes Protein, das durch eine der Nukleinsäuren gemäß Anspruch 54 oder 55 kodiert wird.
58. Verwendung einer Nukleinsäuresequenz gemäß Anspruch 54 oder 55 in einem Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 39.
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