CN113913438A

CN113913438A - 植物biaf基因的应用

Info

Publication number: CN113913438A
Application number: CN202111185723.XA
Authority: CN
Inventors: 刘浩然; 汪俏梅
Original assignee: Zhejiang University ZJU; Tea Research Institute Chinese Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Zhejiang University ZJU; Tea Research Institute Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2021-10-12
Filing date: 2021-10-12
Publication date: 2022-01-11
Anticipated expiration: 2041-10-12
Also published as: CN113913438B

Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及番茄BIAF基因在提高果实硬度中的应用。本发明公开了BIAF基因的用途：调控果实(番茄)的硬度；当BIAF基因过表达时，提高番茄果实的硬度；当BIAF基因沉默时，降低番茄果实的硬度。

Description

植物BIAF基因的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域；具体涉及番茄BIAF基因在提高果实硬度中的应用。

背景技术

番茄原产于南美洲，是全世界栽培最广泛的蔬菜作物之一，我国的番茄种植面积和产量都位居世界前列。随着番茄产量的提高，番茄采后货架期损失成为制约番茄产业发展的重要问题。如何提高番茄果实品质从而延长番茄贮藏时间，正日益受到番茄销售者和科研工作者的关注。番茄果实硬度是影响番茄果实货架期的首要因素，提高果实硬度能显著延长番茄果实货架期；延长果实货架期减少采后损失，有效避免番茄销售者因这些损失造成的经济利益流失。

BIAF(Solyc01g108080)是脱落酸(abscisic acid，ABA)信号转导途径的脱落酸响应转录因子的番茄同源基因之一。过往研究只关注脱落酸响应转录因子在拟南芥中抵抗逆境的功能，而其同源基因BIAF调控番茄果实硬度的功能未见报道。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供BIAF基因在提高果实硬度中的应用。

为了解决上述技术问题，本发明提供BIAF基因的用途：调控果实硬度，BIAF基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所述。

作为本发明BIAF基因的用途的改进：所述果实为番茄。

BIAF基因用于构建转基因番茄，所述转基因番茄的硬度显著提高。当BIAF基因过表达时，提高番茄果实的硬度；当BIAF基因沉默时，降低番茄果实的硬度。

BIAF基因编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

本发明首次构建了番茄BIAF基因过表达和基因沉默植株，并进行功能研究。通过测定果实硬度，发现BIAF基因在提高果实硬度中起到正向调控作用。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1是BIAF基因过表达载体pGWB5-BIAF载体图谱。

图2是BIAF基因沉默载体pBIN19::BIAF载体图谱。

图3是BIAF基因过表达和基因沉默果实中BIAF基因的表达量；

绿熟期(Mature green，MG)，破色期(Breaker，B)，红熟期(Red ripe，R)。星号代表株系与对照具有显著差异(p<0.05)。

图4是BIAF基因过表达果实和基因沉默果实的果实硬度；

绿熟期(Mature green，MG)，破色期(Breaker，B)，粉色期(Pink,P)，红熟期(Redripe，R)。不同字母代表不同组之间具有显著差异(p<0.05)。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

一、获得植物BIAF基因全长序列：

用Primer Premier 6.0设计全基因扩增引物，取种植在浙江省杭州市华家池温室的野生型番茄Ailsa Craig(AC)叶片cDNA为模版(cDNA的提取方式为常规技术，例如可参照CN 104561025 A)，设计特异性引物BIAF-F和BIAF-R，用PrimerSTAR高保真酶PCR扩增BIAF片段。

引物序列为：BIAF-F：5’-ATGGGATCCTACATGAACTTCAAGA-3’

BIAF-R：5’-CTACCAAGGTCCTGTCAGTGTCCTT-3’

PCR扩增反应体系：2xPrimerSTAR buffer 25ul、dNTP Mixture 5ul、PrimerSTARDNA polymerase 1ul、ddH₂O 16ul、cDNA1ul、上下游引物各1ul，共50ul。PCR反应程序为：94℃预变性90秒；94℃变性30秒，57℃退火45秒，72℃延伸1分钟，35个循环；最后72℃终延伸5分钟，将获得的PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳鉴定，然后将扩增条带用Axygen DNA凝胶试剂盒回收纯化，将回收产物构建到pQB-V3载体上，将上述重组质粒送到擎科公司测序确认。

所得基因BIAF的核苷酸序列如SEQ ID No：1所示；该基因编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID No：2所示。

二、BIAF基因过表达载体的构建

BIAF过表达载体的构建，以pGWB5为终载体，构建具有CaMV35S重组型过表达启动子的pGWB5-BIAF载体。

利用LR反应将目的片段(即SEQ ID No：1所述序列)从pQB-V3初始载体中转移到带有pGWB5终载体上。使用

LR

II Enzyme mix(Thermo Fisher)试剂盒，方法参照试剂盒中说明书。

反应后将pGWB5-BIAF质粒转入大肠杆菌DH5α感受态中。涂布法筛选，并用菌落PCR筛选出带有目的片段的pGWB5重组质粒，测序鉴定。用DNAMAN软件分析测序结果。正确转化子命名pGWB5-BIAF(图1)。

三、BIAF基因沉默载体的构建

RNAi干扰载体以pHANNIBAL为原始载体，通过PCR和酶切重组，构建CaMV 35S启动子驱动下的BIAF发卡沉默单元。选取BIAF基因全长片段中约255bp的片段，确定该片段的序列没有编码其它基因，以该序列作为RNA干扰的片段。最终利用原始载体pHANNIBAL和中间载体pBIN19共同的酶切位点SacⅠ&SpeⅠ酶切位点最终整合到植物双元载体pBIN19上，最终得到基因沉默载体pBIN19::BIAF(图2)。

基因沉默用到的255bp的发卡沉默单元片段为：

GTGTAGTTAGAGAAGATATGCAATCTACTTCAAACTCAAGTGGTATTACATTTAACAATGGTTTAAGTCAACAGAACAACAACAATGGTTTCAACATAGCATTTCAGCAACCAACTCAAAACAATGGACTGTTGATTAATCAAATAGCAGCCAATAACATGTTGAATGTGGTTGGTGCCACGGCCTCACAGCAACAACAACCTCAGCAGCAACAGCCTCTTTTCCCCAAGCAAACAACAGTGGCGTTTGCATCTC

四、转基因材料的构建与检测：

将过表达载体pGWB5-BIAF或基因沉默载体pBIN19::BIAF结合转移至农杆菌LBA4404，并进行番茄子叶侵染，通过诱导愈伤，抗性诱导分化以及生根培养，获得组培苗，利用PCR和RT-PCR验证阳性转基因植株。将T2代种子播在卡那霉素(50mg/L)的培养基上发芽，得到5个过表达转基因株系和6个基因沉默株系。

说明：满足种子在卡那霉素(50mg/L)的培养基上长侧根与未长侧根的分离比符合3：1且绿熟期整体果实(整果果皮液氮研磨成粉末取样检测)基因表达量升高条件的属于过表达，基因表达量降低一倍以上的属于基因沉默。选取基因转录水平较高的2个过表达株系OE-1、OE-2和基因转录水平较低的2个基因沉默株系RNAi-1、RNAi-2作为研究对象(图3)。

五、转基因番茄果实硬度研究

野生型和转基因材料种植在浙江大学华家池蔬菜基地同一温室中，待番茄植株长出四穗花序进行花期标记，每个花序疏花至只有四个果实，花后35天不再继续膨大全部绿色果实为绿熟期(Mature green，MG)，绿熟期3d后果实顶端变红为破色期(Breaker，B)，破色期10d后为红熟期(Red ripe，R)。

图3和图4中，AC代表未转基因的野生型番茄，OE-1和OE-2代表BIAF的两个过表达株系，RNAi-1和RNAi-2代表BIAF的两个基因沉默株系。

采用RT-PCR方法对AC、OE-1、OE-2、RNAi-1、RNAi-2于绿熟期、破色期、红熟期的整果果皮部位进行基因表达量检测，所得结果如图3所述。

摘取野生型和转基因材料同一结位的无明显机械损伤的选特定时期果实，每个果实使用仪器TA-XT2i(Godalming,UK)在果实赤道部分均分测定四点，每次测定二十五个左右的生物学重复，每个测定点用直径7.5mm塑胶探头，测定深度为10mm，测定速度为1mm/s(以扎透果皮为标准)。以果实能承受的最大力作为衡量果实硬度的指标，单位为牛顿(N)。

所得结果为：BIAF的两个番茄过表达株系OE-1和OE-2的果实硬度显著升高，BIAF的两个番茄基因沉默株系RNAi-1和RNAi-2果实硬度显著降低(图4)；因此证明：提高BIAF基因表达量能显著提高果实硬度，BIAF基因可以正向调控果实硬度。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

序列表

<110> 中国农业科学院茶叶研究所

浙江大学

<120> 植物BIAF基因的应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1245

<212> DNA

<213> 番茄(Lycopersicon esculentum)

<400> 1

atgggatcct acatgaactt caagaacatt actgacaagc cacaggcgga gagcaacggg 60

gggaagtcag ttggtaatgg tgatatccct ttggctaggc aatcttccat atactcgttg 120

acgtttgatg agcttcaaac tacatttagt ggacttggaa aagattttgg atcaataaac 180

atggaggaac tgttgaaaag catttggaca gctgaagagt ctcaagctgc gacatcttct 240

actgggggag gagaagatgg gattgcacct gtaggaaatc tacagaggca aggttctttg 300

acattacctc ggacactaag tcagaaaact gttgatgaag tatggagaaa ctttcaaaaa 360

gaaactacgg tatgtacccc agacggaagt gaaactggga aatcaaactt tgggcagagg 420

caatctacct tgggagaaat gacattggag gagtttctgg tgaaagcagg tgtagttaga 480

gaagatatgc aatctacttc aaactcaagt ggtattacat ttaacaatgg tttaagtcaa 540

cagaacaaca acaatggttt caacatagca tttcagcaac caactcaaaa caatggactg 600

ttgattaatc aaatagcagc caataacatg ttgaatgtgg ttggtgccac ggcctcacag 660

caacaacaac ctcagcagca acagcctctt ttccccaagc aaacaacagt ggcgtttgca 720

tctcctatgc agttatcaaa taatggtcac ctggctagcc cacgaacaag ggctcctgct 780

gttggaatgt ccagtccttc tgtaaatgct agtatggctc aaggcggagt tatggggaag 840

acaggatttc ataatggagt ttcaccagca aaagtaggat cccctggaaa cgattttatt 900

gcaaggagca atgtggatac atcgtctctt tcaccttccc cctatgcatt tagtgaaggt 960

ggaaggggaa ggagatctgg tagttctttg gaaaaagttg tggagcgaag gcgtaggagg 1020

atgattaaga acagagaatc tgcagctaga tcaagggctc ggaagcaggc ctatacttta 1080

gagttggaag ctgaagtggc aaagctaaaa gaaattaatg aagagttgcg gaagaaacag 1140

gctgaaatta ttgagaagca gaaaaatcag ctaaccgata aaaggaatat gacatgtgga 1200

tataaattaa gatgcttgag aaggacactg acaggacctt ggtag 1245

<210> 2

<211> 414

<212> PRT

<213> 番茄(Lycopersicon esculentum)

<400> 2

Met Gly Ser Tyr Met Asn Phe Lys Asn Ile Thr Asp Lys Pro Gln Ala

1 5 10 15

Glu Ser Asn Gly Gly Lys Ser Val Gly Asn Gly Asp Ile Pro Leu Ala

20 25 30

Arg Gln Ser Ser Ile Tyr Ser Leu Thr Phe Asp Glu Leu Gln Thr Thr

35 40 45

Phe Ser Gly Leu Gly Lys Asp Phe Gly Ser Ile Asn Met Glu Glu Leu

50 55 60

Leu Lys Ser Ile Trp Thr Ala Glu Glu Ser Gln Ala Ala Thr Ser Ser

65 70 75 80

Thr Gly Gly Gly Glu Asp Gly Ile Ala Pro Val Gly Asn Leu Gln Arg

85 90 95

Gln Gly Ser Leu Thr Leu Pro Arg Thr Leu Ser Gln Lys Thr Val Asp

100 105 110

Glu Val Trp Arg Asn Phe Gln Lys Glu Thr Thr Val Cys Thr Pro Asp

115 120 125

Gly Ser Glu Thr Gly Lys Ser Asn Phe Gly Gln Arg Gln Ser Thr Leu

130 135 140

Gly Glu Met Thr Leu Glu Glu Phe Leu Val Lys Ala Gly Val Val Arg

145 150 155 160

Glu Asp Met Gln Ser Thr Ser Asn Ser Ser Gly Ile Thr Phe Asn Asn

165 170 175

Gly Leu Ser Gln Gln Asn Asn Asn Asn Gly Phe Asn Ile Ala Phe Gln

180 185 190

Gln Pro Thr Gln Asn Asn Gly Leu Leu Ile Asn Gln Ile Ala Ala Asn

195 200 205

Asn Met Leu Asn Val Val Gly Ala Thr Ala Ser Gln Gln Gln Gln Pro

210 215 220

Gln Gln Gln Gln Pro Leu Phe Pro Lys Gln Thr Thr Val Ala Phe Ala

225 230 235 240

Ser Pro Met Gln Leu Ser Asn Asn Gly His Leu Ala Ser Pro Arg Thr

245 250 255

Arg Ala Pro Ala Val Gly Met Ser Ser Pro Ser Val Asn Ala Ser Met

260 265 270

Ala Gln Gly Gly Val Met Gly Lys Thr Gly Phe His Asn Gly Val Ser

275 280 285

Pro Ala Lys Val Gly Ser Pro Gly Asn Asp Phe Ile Ala Arg Ser Asn

290 295 300

Val Asp Thr Ser Ser Leu Ser Pro Ser Pro Tyr Ala Phe Ser Glu Gly

305 310 315 320

Gly Arg Gly Arg Arg Ser Gly Ser Ser Leu Glu Lys Val Val Glu Arg

325 330 335

Arg Arg Arg Arg Met Ile Lys Asn Arg Glu Ser Ala Ala Arg Ser Arg

340 345 350

Ala Arg Lys Gln Ala Tyr Thr Leu Glu Leu Glu Ala Glu Val Ala Lys

355 360 365

Leu Lys Glu Ile Asn Glu Glu Leu Arg Lys Lys Gln Ala Glu Ile Ile

370 375 380

Glu Lys Gln Lys Asn Gln Leu Thr Asp Lys Arg Asn Met Thr Cys Gly

385 390 395 400

Tyr Lys Leu Arg Cys Leu Arg Arg Thr Leu Thr Gly Pro Trp

405 410

Claims

1.BIAF基因的用途，其特征是：调控果实硬度，所述BIAF基因的核苷酸序列如SEQ IDNO：1所述。

2.根据权利要求1所述的BIAF基因的用途，其特征是：所述果实为番茄。

3.根据权利要求2所述的BIAF基因的用途，其特征是：

当BIAF基因过表达时，提高番茄果实的硬度；

当BIAF基因沉默时，降低番茄果实的硬度。