CN105153288B - 参与花青苷生物合成调控的菊花bHLH转录因子 - Google Patents
参与花青苷生物合成调控的菊花bHLH转录因子 Download PDFInfo
- Publication number
- CN105153288B CN105153288B CN201510606298.5A CN201510606298A CN105153288B CN 105153288 B CN105153288 B CN 105153288B CN 201510606298 A CN201510606298 A CN 201510606298A CN 105153288 B CN105153288 B CN 105153288B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- chrysanthemum
- cmbhlh2
- seq
- anthocyanin
- cmmyb6
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 235000007516 Chrysanthemum Nutrition 0.000 title claims abstract description 41
- 229930002877 anthocyanin Natural products 0.000 title claims abstract description 41
- 235000010208 anthocyanin Nutrition 0.000 title claims abstract description 41
- 239000004410 anthocyanin Substances 0.000 title claims abstract description 41
- 150000004636 anthocyanins Chemical class 0.000 title claims abstract description 41
- 230000001851 biosynthetic effect Effects 0.000 title claims abstract description 11
- 244000189548 Chrysanthemum x morifolium Species 0.000 title description 20
- 108010027344 Basic Helix-Loop-Helix Transcription Factors Proteins 0.000 title description 8
- 102000018720 Basic Helix-Loop-Helix Transcription Factors Human genes 0.000 title description 8
- 241000723353 Chrysanthemum Species 0.000 claims abstract description 41
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 claims abstract description 14
- 238000013518 transcription Methods 0.000 claims abstract description 11
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 5
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 5
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 abstract description 11
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 abstract description 10
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 abstract description 8
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 abstract description 5
- 230000008859 change Effects 0.000 abstract description 4
- 239000002932 luster Substances 0.000 abstract description 4
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 abstract description 4
- 244000061176 Nicotiana tabacum Species 0.000 abstract description 3
- 235000009604 Chrysanthemum X morifolium Nutrition 0.000 description 19
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 14
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 14
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 13
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 13
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 11
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 10
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 description 9
- 238000001086 yeast two-hybrid system Methods 0.000 description 9
- 241000208125 Nicotiana Species 0.000 description 7
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 7
- 230000004087 circulation Effects 0.000 description 7
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 7
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 5
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 5
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 5
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 5
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 4
- 229920003266 Leaf® Polymers 0.000 description 4
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 4
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 4
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 4
- 108020003589 5' Untranslated Regions Proteins 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 3
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 3
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 3
- 210000001339 epidermal cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 3
- 238000000034 method Methods 0.000 description 3
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 3
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 3
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 3
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 3
- 230000010474 transient expression Effects 0.000 description 3
- 108020005345 3' Untranslated Regions Proteins 0.000 description 2
- 108700011215 E-Box Elements Proteins 0.000 description 2
- 102100022887 GTP-binding nuclear protein Ran Human genes 0.000 description 2
- 101000774835 Heteractis crispa PI-stichotoxin-Hcr2o Proteins 0.000 description 2
- 101000620756 Homo sapiens GTP-binding nuclear protein Ran Proteins 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 101000702488 Rattus norvegicus High affinity cationic amino acid transporter 1 Proteins 0.000 description 2
- 101100393821 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) GSP2 gene Proteins 0.000 description 2
- 108700005078 Synthetic Genes Proteins 0.000 description 2
- GAMYVSCDDLXAQW-AOIWZFSPSA-N Thermopsosid Natural products O(C)c1c(O)ccc(C=2Oc3c(c(O)cc(O[C@H]4[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O4)c3)C(=O)C=2)c1 GAMYVSCDDLXAQW-AOIWZFSPSA-N 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 235000019504 cigarettes Nutrition 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 229930003944 flavone Natural products 0.000 description 2
- -1 flavone compound Chemical class 0.000 description 2
- 235000011949 flavones Nutrition 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 230000022532 regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 2
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 2
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 2
- VHBFFQKBGNRLFZ-UHFFFAOYSA-N vitamin p Natural products O1C2=CC=CC=C2C(=O)C=C1C1=CC=CC=C1 VHBFFQKBGNRLFZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- 101150039504 6 gene Proteins 0.000 description 1
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 1
- 244000025254 Cannabis sativa Species 0.000 description 1
- 235000005633 Chrysanthemum balsamita Nutrition 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 238000003718 Dual-Luciferase Reporter Assay System Methods 0.000 description 1
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 1
- 108700015679 Nested Genes Proteins 0.000 description 1
- 238000003559 RNA-seq method Methods 0.000 description 1
- 241000220317 Rosa Species 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 108020005038 Terminator Codon Proteins 0.000 description 1
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 1
- 125000000218 acetic acid group Chemical group C(C)(=O)* 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 229930014669 anthocyanidin Natural products 0.000 description 1
- 150000001453 anthocyanidins Chemical class 0.000 description 1
- 235000008758 anthocyanidins Nutrition 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 238000010805 cDNA synthesis kit Methods 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000011712 cell development Effects 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 235000009508 confectionery Nutrition 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 230000005611 electricity Effects 0.000 description 1
- 230000000763 evoking effect Effects 0.000 description 1
- 238000010195 expression analysis Methods 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000012215 gene cloning Methods 0.000 description 1
- CEAZRRDELHUEMR-UHFFFAOYSA-N gentamicin Chemical class O1C(C(C)NC)CCC(N)C1OC1C(O)C(OC2C(C(NC)C(C)(O)CO2)O)C(N)CC1N CEAZRRDELHUEMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000003147 glycosyl group Chemical group 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 238000012482 interaction analysis Methods 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical class O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 230000000149 penetrating effect Effects 0.000 description 1
- 239000000575 pesticide Substances 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000049 pigment Substances 0.000 description 1
- 239000003375 plant hormone Substances 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000006916 protein interaction Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000003938 response to stress Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 1
- 229940040944 tetracyclines Drugs 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
- C12N15/8222—Developmentally regulated expression systems, tissue, organ specific, temporal or spatial regulation
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Botany (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明提供一个参与花青苷生物合成调控的菊花bHLH转录因子（CmbHLH2），具有SEQ：NO. 1所示的核苷酸序列。CmbHLH2与CmMYB6协同在烟草叶片中瞬时过量表达时，可强烈诱导花青苷的积累，使得原本绿色的叶片变成红色。因此，通过转基因的手段，使得CmbHLH2在植物中过量表达，或者抑制菊花植株中CmbHLH2的表达，即可分别获得花青苷合成受到增强或者抑制的转基因植株，其色泽会因花青苷合成的变化而变化。
Description
技术领域
本发明属于植物分子生物技术和基因工程领域，涉及一个参与花青苷生物合成调控的新型菊花bHLH转录因子CmbHLH2（SEQ：NO. 1）。
背景技术
菊花是世界重要花卉之一，为仅次于玫瑰的世界第二大切花。菊花亦是我国传统名花，具有悠久的历史和深厚的文化积淀。至今，我国研究者已自主培育了近250个切花菊品种，其中单头切花大菊占切花产量总数的一半左右。花色是菊花重要的观赏性状之一，单头切花大菊的花色多以原始色系黄、白为主，除此黄、白色系之外，我国自主培育的菊花品种还有绿、青、粉红、红、紫和间色等其他色系。分析紫红粉色系菊花的呈色机制，是培育多色系菊花重要的理论基础，有助于改善切花菊文化的发扬及其产业的多元化。
花青苷是众多紫红粉色系菊花品种的主要呈色色素，其积累量越高花色越偏红紫色。花青苷，又名花色素苷，属黄酮类化合物，由花青素和糖基结合而成。花青苷在植物体内的生物合成起始于苯丙氨酸途径，由多个酶参与催化，而编码这些酶的基因在转录水平上则受到MYB、bHLH和WD40转录因子形成的MBW转录复合体的协同调控。在这三类转录因子中，尽管MYB转录因子对花青苷的生物合成调控具有较高的特异性，然而bHLH转录因子的协同作用亦不容忽视。
bHLH是植物中第2 大转录因子家族，其基因序列中拥有保守的bHLH 结构域，由约60 个氨基酸组成。典型的bHLH 结构域的N 端包含13 ~ 17 个亲水的碱性氨基酸残基，其后连接被任意长度的环一分为二的α螺旋（HLH，helix-loop-helix）。在bHLH结构域的碱性氨基酸序列中，HER（His5-Glu9-Arg13）基序具有高度的保守性，可结合启动子序列中的六核苷酸E-box 基序（CANNTG），进而调控靶基因转录。bHLH可参与植物心皮、花药和表皮细胞的发育，光敏色素信号转导，植物激素信号转导和逆境响应，黄酮类化合物的生物合成调控等生命进程。参与植物花青苷生物合成调控的bHLH成员，已在众多植物体内得到鉴定，然而菊花中参与花青苷生物合成转录调控的bHLH成员至今未见报道，极大地限制了菊花花色品质改良育种及其产业多元化的发展。
发明内容
本发明的目的是提供一个参与花青苷生物合成调控的新型菊花bHLH转录因子（CmbHLH2），具有SEQ：NO. 1的核苷酸序列，其编码序列全长为1842个核苷酸，可编码一个含614氨基酸的蛋白。CmbHLH2氨基酸序列中含有碱性螺旋-环-螺旋结构域，且在碱性结构域内含有高度保守的HER（His5-Glu9-Arg13）基序，可结合启动子序列中六核苷酸E-box 基序（CANNTG）；在其氨基酸序列的C端分布着MIR结构域，可与MYB转录因子相互作用。
本发明提供的菊花bHLH转录因子（CmbHLH2）在红色菊花品种中的基因表达最高，粉色次之，黄色品种中最低。CmbHLH2的这一表达模式与不同菊花品种积累花青苷的能力呈显著正向相关。CmbHLH2可与CmMYB6相互作用形成转录蛋白复合体，结合花青苷合成关键基因CmDFR启动子并增强其表达活性，进而诱导花青苷的积累。
本发明的另一个目的是提供菊花bHLH转录因子在改变植物色泽中的应用。CmbHLH2与CmMYB6协同在烟草叶片中瞬时过量表达时，可强烈诱导花青苷的积累，使得原本绿色的叶片变成红色。因此，通过转基因的手段，使得CmbHLH2在植物中过量表达，或者抑制菊花植株中CmbHLH2的表达，即可分别获得花青苷合成受到增强或者抑制的转基因植株，其色泽会因花青苷合成的变化而变化。
CmbHLH2（SEQ：NO. 1）是菊花中首例克隆并经过功能鉴定的可调控花青苷生物合成，进而修饰植株色泽的bHLH成员。
本发明以三种不同花色的菊花品种Z1（红色），Z2（粉色）和Z3（黄色）为试材，应用RACE、实时定量PCR、酵母双杂交、瞬时表达等生物学技术，分离鉴定出参与菊花花青苷生物合成调控的bHLH成员CmbHLH2 （SEQ：NO. 1）。研究发现，CmbHLH2的基因表达与菊花花色中红色程度呈良好正向相关，即越红的菊花品种中，CmbHLH2的表达量越高；CmbHLH2可与CmMYB6相互作用形成转录蛋白复合体，增强菊花花青苷生物合成关键基因CmDFR启动子活性，进而显著诱导烟草叶片花青苷的积累。
附图说明
图1 菊花2个bHLH基因在不同菊花品种中的表达模式分析。
图2 菊花2个bHLH基因对花青苷合成基因CmDFR启动子的调控效应分析。
图3 菊花2个bHLH与CmMYB6转录蛋白质间的相互作用分析。
图4 CmbHLH2（SEQ：NO. 1）诱导花青苷生物合成功能的鉴定。
具体实施方式
下面结合附图和实施例，对本发明做进一步阐述，但实施例不限制本发明的保护范围。在下述实施例中常规的基因操作方法参照《分子克隆实验指南》（第三版）。
实施例1：菊花CmbHLH2基因克隆
依据菊花RNA-Seq数据库信息，筛选出可能参与菊花花青苷生物合成调控的bHLH转录因子CmbHLH2部分序列（SEQ：NO. 2）。应用基因特异引物2（GSP2）SEQ：NO. 3，以及巢式基因特异引物2（NGSP2）SEQ：NO. 4，利用3' cDNA末端快速扩增（3' RACE）技术获得CmbHLH2的3'非编码区（3'UTR）序列（SEQ：NO. 5）。进而应用基因特异引物1（GSP1）SEQ：NO. 6，以及巢式基因特异引物1（NGSP1）SEQ：NO. 7，利用5' cDNA末端快速扩增（5' RACE）技术获得CmbHLH2的5'非编码区（5' UTR）序列（SEQ：NO. 8）。根据所得的3' 和5' UTR拼接得到自起始密码子（ATG）至终止密码子的CmbHLH2（SEQ：NO. 1）的全长序列。
RACE中第一轮PCR程序为94oC 5min； 94oC 10 s，72oC 2 min 30 s，5个循环；94oC10 s，70oC 30s，72oC 2 min 30 s，5个循环； 94oC 10 s，67oC 30s，72oC 2 min 30 s，30个循环；72oC 10 min，16oC hold。第二轮PCR程序为94oC 5min；94oC 10 s，65oC 30s，72oC 2min 30 s，30个循环；72oC 10 min，16oC hold。
RACE第一轮PCR体系为10×Ex-Buffer 2 μL，2.5 mmol/L dNTPs 1.6 μL，10 μmol/L GSP1或GSP2 0.5 μL，下游引物UPM 2 μL， Ex-Taq 0.1 μL，cDNA 0.5 μL，加灭菌双蒸水至20 μL。第二轮PCR体系为10×Ex-Buffer 2 μL，2.5 mmol/L dNTPs 1.6 μL，10 μmol/L NGSP1或NGSP2 0.5 μL，下游引物NUP 2 μL，Ex-Taq 0.1 μL，稀释10倍的第一轮PCR产物1 μL，加灭菌的双蒸水至20 μL。
根据3' 和5' UTR拼接得到自起始密码子（ATG）至终止密码子的CmbHLH2（SEQ：NO.1）的全长序列。为更加明确阐述本发明的内容，文中还应用了CmbHLH1（GenBank KC686698）和CmMYB6（GenBank KR002097）两个基因，其序列均来自已有的报道。
实施例2：菊花CmbHLH2基因表达模式分析
（一）实验方法
利用Primer Premier 5，依据CmbHLH1（SEQ：NO. 9）和CmbHLH2（SEQ：NO. 5）的3'UTR序列分别设计实时定量PCR（QPCR）引物组合SEQ：NO. 10和SEQ：NO. 11以及SEQ：NO. 12和SEQ：NO. 13，PCR产物包含终止密码子，长度分别为201 bp和192 bp。以菊花actin基因（SEQ：NO. 14）的表达为内参分析CmbHLH1和CmbHLH2的表达模式，其QPCR引物组合为SEQ：NO. 15和SEQ：NO. 16。所有QPCR引物特异性经熔点曲线分析、凝胶电泳分析和QPCR产物再测序验证。
分别提取三种不同花色的菊花品种的花瓣RNA，参照cDNA合成kit（Bio-Rad，USA）说明书，合成cDNA。参照Ssofast EvaGreen Supermix kit（Bio-Rad，USA）说明书开展QPCR分析，采用20 µL体系：其中10 µL 2 ×Ssofast EvaGreen Supermix (Bio-Rad，USA)，1.0µL上游引物（10 µM），1.0 µL下游引物（10 µM），2.0 µL稀释的cDNA和6.0 µL H2O。QPCR程序为：94oC，10 min；94oC 10 s，60oC 30 s，45个循环。
（二）实验结果
基因表达分析结果表明，CmbHLH2（SEQ：NO. 1）的基因表达与不同花色菊花品种中的花青苷积累呈良好正向相关（附图1），即CmbHLH2在红色菊花品种Z1中表达量最高，在粉色菊花品种Z2中表达量次之，而在黄色菊花品种Z3中不表达。CmbHLH1（SEQ：NO. 9）的基因表达虽然也呈相似的趋势，但是相关性弱于CmbHLH2（附图1）。
实施例3：调控靶基因活性分析
（一）实验方法
应用引物组合应用引物组合SEQ：NO. 17和SEQ：NO. 18、SEQ：NO. 19和SEQ：NO. 20以及SEQ：NO. 21和SEQ：NO. 22，分别扩增CmbHLH1（SEQ：NO. 9）、CmbHLH2（SEQ：NO. 1）和CmMYB6（SEQ：NO. 23）的全长序列。扩增时选用FastStart High Fidelity PCR system（Roche），PCR体系为 Buffer（with Mgcl2）2 µL，dNTP（2.5 µM）1.6 µL，上下游引物（10 µM）各2 µL，cDNA 0.5 µL，酶0.5 µL，水11.4 µL。PCR程序为95oC 2 min；95oC 30 s，55-72oC30s，72oC 30 s-3 min，35个循环；72oC 6 min，16oC hold。PCR产物分别经过限制性内切酶组合Not I和Spe I、Sal I和Apa I、Not I和Spe I的消化后，搭载到pGreenII 0029 62-SK表达载体上，重组成表达载体CmbHLH1-SK、CmbHLH2-SK和CmMYB6-SK。将最终确认正确构建的表达载体电转化入GV3101::pSoup农杆菌感受态细胞中，挑选3个阳性克隆，用25%灭菌甘油保存，放于-80oC。
将存放于-80oC的甘油菌划线接种于含25 μg/ml庆大霉素、5 μg/ml四环素和50 μg/ml卡那霉素的LB固体培养基上，28oC培养48h，刮取少量菌落涂布到新的相同LB固体培养基上，28oC培养12h。刮取生长良好的菌落，用渗透液（10 mM MES，10 mM MgCl2，150 mM 乙酰丁香酮，pH 5.6）悬浮，将其OD600调整为0.75左右。
利用双荧光素酶系统，分析不同转录因子与菊花花青苷合成基因CmDFR启动子间是否存在调控效应。将含有不同重组表达载体的农杆菌按照两种方案进行组合处理，将含有pGreenII 0029 62-SK、CmbHLH1-SK、CmbHLH2-SK或CmMYB6-SK的农杆菌菌株分别与含有CmDFR-LUC的农杆菌菌株按照10:1比例混合；将含有CmbHLH1-SK或CmbHLH2-SK的农杆菌菌株分别与含有CmMYB6-SK或pGreenII 0029 62-SK的农杆菌菌株按照1:1比例混合，再按照10:1比例与含有CmDFR-LUC的农杆菌菌株混合。农杆菌菌株混合后，分别注射到本氏烟草叶片中，每株烟草注射3片叶片。每个基因的3个阳性克隆各重复一次上述操作，构成3个生物学重复。
注射后的烟草于16h：8h光暗周期、25oC、75%空气湿度的条件下培养3天，应用Dual-Luciferase Reporter Assay System（Promega，USA）和Modulus Luminometer（Promega，USA）检测叶片中两种荧光素酶（LUC和REN）的比值，据此分析转录因子与目标基因启动子之间的调控效应。
（二）实验结果
双荧光素酶瞬时表达分析结果显示，与pGreenII 0029 62-SK表达载体相似，CmbHLH1（SEQ：NO. 9）和CmbHLH2（SEQ：NO. 1）均无法调控菊花花青苷合成基因CmDFR启动子活性（附图2）。CmMYB6（SEQ：NO. 23）可激活CmDFR启动子的效应，当其与CmbHLH2协同表达时，该激活效应得到极显著增强，可强烈增强CmDFR启动子的转录活性至40多倍（附图2），而CmbHLH1并无此功效。这一结果说明，CmbHLH2可与CmMYB6协同作用，参与菊花花青苷的生物合成调控。
实施例4：蛋白质相互作用分析
（一）实验方法
首先构建应用于酵母双杂交（Y2H）系统的重组表达载体CmbHLH1-AD、CmbHLH1-BD、CmbHLH2-AD、CmbHLH2-BD、CmMYB6-AD和CmMYB6-BD，所用引物组合分别为SEQ：NO. 24和SEQ：NO. 25、SEQ：NO. 26和SEQ：NO. 27、SEQ：NO. 28和SEQ：NO. 29、SEQ：NO. 30和SEQ：NO. 31、SEQ：NO. 32和SEQ：NO. 33以及SEQ：NO. 34和SEQ：NO. 35。扩增基因全长时选用FastStartHigh Fidelity PCR system（Roche），PCR体系为 Buffer（with Mgcl2）2 µL，dNTP（2.5 µM）1.6 µL，上下游引物（10 µM）各2 µL，cDNA 0.5 µL，酶0.5 µL，水11.4 µL。PCR程序为95oC 2min；95oC 30 s，55-72oC 30s，72oC 30 s-3 min，35个循环；72oC 6 min，16oC hold。PCR产物分别经过限制性内切酶组合Sac I和Xho I、EcoR I和BamH I、EcoR I和BamH I的消化后，搭载到酵母双杂交（Y2H）表达载体上，构建重组表达载体。
然后参照Y2H系统（MatchmakerTM Gold Yeast Two-Hybrid System，Clontech，US）说明书，将CmbHLH1-BD、CmbHLH2-BD和CmMYB6-BD分别转化入Y2HGold感受态内，检测其自我激活特性。分析显示，三个转录因子的自我激活特性不同。CmbHLH1和CmbHLH2的自我激活特性较弱，AbA100和AbA400即可分别抑制其自我激活。CmMYB6的自我激活特性则较强，AbA1000亦不可抑制。因此，本发明以CmbHLH1和CmbHLH2为bait，分析两种转录蛋白的相互作用机理。
（二）实验结果
酵母双杂交系统分析结果显示，CmbHLH2（SEQ：NO. 1）可与CmMYB6（SEQ：NO. 23）相互作用，形成转录蛋白复合体（附图3），而CmbHLH1（SEQ：NO. 9）无法与CmMYB6相互作用（附图3）。这一结果说明，CmbHLH2可与CmMYB6协同互作形成转录蛋白复合体，以此增强各自的功效，共同参与CmDFR启动子活性的调控，进而参与菊花花青苷生物合成的调控。
实施例5：诱导花青苷积累分析
（一）实验方法
将分别含pGreenII 0029 62-SK、CmbHLH1-SK、CmbHLH2-SK或 CmMYB6-SK的GV3101::pSoup农杆菌菌株按照1:1比例组合成农杆菌混合液，包括：CmbHLH1-SK+pGreenII 0029 62-SK，CmbHLH2-SK+ pGreenII 0029 62-SK、CmbHLH1-SK+CmMYB6-SK和CmbHLH2-SK+CmMYB6-SK。选取长势优良普通烟草植株的3片嫩叶，以每片叶片中心叶脉为分界线，用无针头注射器在叶片左侧注射CmbHLH1-SK+ pGreenII 0029 62-SK或CmbHLH2-SK+pGreenII 0029 62-SK混合液，右侧注射相应的CmbHLH1-SK+CmMYB6-SK或CmbHLH2-SK+CmMYB6-SK混合液。注射部位为远离叶片中心叶脉的表皮细胞内，每种农杆菌组合注射3株不同的普通烟草植株。烟草于16h：8h光暗周期、25oC、75%空气湿度的条件下培养8天，观察叶片的注射部位有无花青苷的积累。每个基因的3个阳性克隆各重复一次上述操作，构成3个生物学重复。
（二）实验结果
分析结果显示，注射CmbHLH2-SK+CmMYB6-SK（SEQ：NO. 1 + SEQ：NO. 23）混合农杆菌的烟草叶片表皮细胞内可显著积累花青苷，使得叶片注射部位呈现明显的红色（附图4）。而注射CmbHLH1-SK+CmMYB6-SK（SEQ：NO. 9 + SEQ：NO. 23）混合农杆菌的烟草叶片表皮细胞内无花青苷的积累（附图4）。
本发明利用RACE、实时定量PCR、双荧光素酶系统技术、酵母双杂交系统技术和烟草瞬时表达技术，分离并鉴定出菊花CmbHLH2（SEQ：NO. 1）对花青苷生物合成具有转录调控效应，可应用到植物颜色修饰的基因工程中。
<110> 浙江大学
<120> 参与花青苷生物合成调控的菊花bHLH转录因子
<160> 29
<210> 1
<211> 1842
<212> DNA序列
<213>菊花（Chrysanthemum morifolium）
<400> 1
ATGGCTGCCAGCGGACCACCTCGTGATTCACTGAAAGAGATGTTGCAATCTGCTGTCCATTCTATTCAATGGACCTACAGTATTTTCTGGCAACTTTGTCCTCAACAAGGGGTTTTGGTATGGGGAGATGGATACTACAATGGATCTATAAAGACGAGGAAGACTGTTCAGTCGATTGAAGTTAGCACTGAGGAGGCTGCTTTAAGTAGAAGCGATCAACTTAGAGAGCTCTATGATTCGTTGGTTGCTGGTGATCACCTGGTGACAGAGAACCAGCAAGCAGCAACTATAAGGCGACCATCAATGGCCCTGTCACCAGAAGATCTCACTGAATCCGAGTGGTTTTACCTCATGTGTGTCTCTTTTTCTTTTCTTCCTGGTGCCGGATTGGTTGGAGAGGCATACACGAAGCAGCGACATATATGGCTCACAGGGGCAAACCAAGTCGATAGTAAAGTTTTTACCAGAGCTATTCTTGCTAAGAGTTCAAATATACAGACAGTGTTGTGCATCCCTCTACTAAACGGAGTCATAGAGCTTGGAACGACGGACAAGGTGGAAGAGGCTATTGAACTAGTTCAACATGTAAAACTGTTCTTCATGGCCGGCAATGACAAGCCGATTCTCATACCTCCAAAGCCCGCCCTTTCGGCCCATTCTTCAAACACCACCGTTTCCTCAAATCAGATGACAACTACAATCAAACCTCTCGACAACACATATTCAATGGACAAAGATGATGAGAGCGAAGAAGATGAGGAGGATGAGGAAGAATATGAAGAAGCAGAAGAAGAAAATGTGTCGGGCATTGTGGCAGATACATGTCACTATTCCGATTTTCAAAAACCTAGTCGGGATAAAACTGGAATGGATGCAATTATGGAGGCGAACGAATTATTGCCACTTGATATGTCAGAAGATATTAGATTTGGATCACTAAATGATGATCCCAATCACTTGGACTCTCATTTTAACTTGTTAGCAACGAGCCACGACGATTCATATAGAGCCGAGTCAATCCCCAAATGGTCAGATAATTTGGGGTTCAACGAGCCATCAAGCATTCAACTACAAGTATCAGGTGAATTATCACAAGGGGAGGACACACATTATTCTTACACAGTTTTAACCCTTCTCAACAACCAACTAACTCAACGGTCCAATTTTCGGACACCTTCTCACCAAAACTCCATCCAATCAGCCTTCGCCACGTGGACACCAAATCACCACTTTGCCGCCAAAACCACAAAAACATCCCAACGCATCCTAAAATACATGCTATGCACCGTACCTTATCTCCACTCCACAGTCAGCCCCGGAGACACCTCCACAGTGGGAGGGGCAGCCTCTCGCCATGAGGAGGTCAGCACGAACCATGTCATGGCGGAACGGCGTCGTAGAGAGAAGTTAAACGAGCGTTTCATCACACTCCGGTCACTAGTCCCACTAGTGACCAAAATGGACAAAGCGTCGATACTAGGTGACACGATTGAGTACGTGAAACACTTGCGTAAAAAAGTTGCTGAGCTTGAGGCGCGGGGAAGGTTGCCAGAGAAGAGGAAGATTAGGGTTGTTGAAGGTGGAGGTACGGCGGTGGAGGTTTCGATAATCGAGAGTGATGCGTTGGTGGAGATTGAGTGTGTGTATAGAGAAGGGTTGTTGCTTGACGTGATGAAGAAGTTAAGGGAATTTGGTATCGAGATCGTGACCGTTCAATCCTGTGTCGATGGTGGGATTTGTACGGCTGAGATGAGAGCTAAGGTGAAGGTGAAGGGTATTAGGGGGAAGAAAATTAGCATAATGCAAGTAAAGAAAGGCATCAACCAAATAATATCTCCTTAG
<210> 2
<211> 377
<212> DNA序列
<213>菊花（Chrysanthemum morifolium）
<400> 2
ATTCCTGGTGATCACCTGGTGACAGAGAACCAGCAAGCAGCAACTATAAGGCGACCATCAATGGCACTGTCACCAGAAGATCTTACTGAATCCGAGTGGTTTTACCTCATGTGTGTCTCTTTTTCTTTTCCTCCTGGTGTCGGATTGGTTGGAGAGGCATACACGAAGCAGCGACATCTATGGCTCACAGGGGCAAACCAAGTCGATAGTAAAGTTTTTACCAAGAGCTATTCTTGCTAAGAGTGCTAATATACAGACAGTGTTGTGCATCCCTCTACTAAACGGAGTCATAGAACTTGGAACAACGGACAAGGTGGAAGAGGCTACTGAATTATTCAACATGTAAAACTGTTCTTCATGGCCGGCAATGACAACCC
<210> 3
<211> 26
<212> 碱基序列
<213> 人工序列
<400> 3
GTGACAGAGAACCAGCAAGCAGCAAC
<210> 4
<211> 28
<212> 碱基序列
<213> 人工序列
<400> 4
TGGTGTCGGATTGGTTGGAGAGGCATAC
<210> 5
<211> 1741
<212> DNA序列
<213>菊花（Chrysanthemum morifolium）
<400> 5
GTGACAGAGAACCAGCAAGCAGCAACTATAAGGCGACCATCAATGGCCCTGTCACCAGAAGATCTCACTGAATCCGAGTGGTTTTACCTCATGTGTGTCTCTTTTTCTTTTCTTCCTGGTGCCGGATTGGTTGGAGAGGCATACACGAAGCAGCGACATATATGGCTCACAGGGGCAAACCAAGTCGATAGTAAAGTTTTTACCAGAGCTATTCTTGCTAAGAGTTCAAATATACAGACAGTGTTGTGCATCCCTCTACTAAACGGAGTCATAGAGCTTGGAACGACGGACAAGGTGGAAGAGGCTATTGAACTAGTTCAACATGTAAAACTGTTCTTCATGGCCGGCAATGACAAGCCGATTCTCATACCTCCAAAGCCCGCCCTTTCGGCCCATTCTTCAAACACCACCGTTTCCTCAAATCAGATGACAACTACAATCAAACCTCTCGACAACACATATTCAATGGACAAAGATGATGAGAGCGAAGAAGATGAGGAGGATGAGGAAGAATATGAAGAAGCAGAAGAAGAAAATGTGTCGGGCATTGTGGCAGATACATGTCACTATTCCGATTTTCAAAAACCTAGTCGGGATAAAACTGGAATGGATGCAATTATGGAGGCGAACGAATTATTGCCACTTGATATGTCAGAAGATATTAGATTTGGATCACTAAATGATGATCCCAATCACTTGGACTCTCATTTTAACTTGTTAGCAACGAGCCACGACGATTCATATAGAGCCGAGTCAATCCCCAAATGGTCAGATAATTTGGGGTTCAACGAGCCATCAAGCATTCAACTACAAGTATCAGGTGAATTATCACAAGGGGAGGACACACATTATTCTTACACAGTTTTAACCCTTCTCAACAACCAACTAACTCAACGGTCCAATTTTCGGACACCTTCTCACCAAAACTCCATCCAATCAGCCTTCGCCACGTGGACACCAAATCACCACTTTGCCGCCAAAACCACAAAAACATCCCAACGCATCCTAAAATACATGCTATGCACCGTACCTTATCTCCACTCCACAGTCAGCCCCGGAGACACCTCCACAGTGGGAGGGGCAGCCTCTCGCCATGAGGAGGTCAGCACGAACCATGTCATGGCGGAACGGCGTCGTAGAGAGAAGTTAAACGAGCGTTTCATCACACTCCGGTCACTAGTCCCACTAGTGACCAAAATGGACAAAGCGTCGATACTAGGTGACACGATTGAGTACGTGAAACACTTGCGTAAAAAAGTTGCTGAGCTTGAGGCGCGGGGAAGGTTGCCAGAGAAGAGGAAGATTAGGGTTGTTGAAGGTGGAGGTACGGCGGTGGAGGTTTCGATAATCGAGAGTGATGCGTTGGTGGAGATTGAGTGTGTGTATAGAGAAGGGTTGTTGCTTGACGTGATGAAGAAGTTAAGGGAATTTGGTATCGAGATCGTGACCGTTCAATCCTGTGTCGATGGTGGGATTTGTACGGCTGAGATGAGAGCTAAGGTGAAGGTGAAGGGTATTAGGGGGAAGAAAATTAGCATAATGCAAGTAAAGAAAGGCATCAACCAAATAATATCTCCTTAGTAAAAACAGAGTAGAGGGCACATAAGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTAAATATCGGATTTTTTTTCTCTCTTTGAAATAAGATCATGGTATGTGAAGGACGTTTGAAGAGTAATTAAGAATCATTTTTACAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
<210> 6
<211> 28
<212> 碱基序列
<213>人工合成
<400> 6
GTCGCTGCTTCGTGTATGCCTCTCCAAC
<210> 7
<211> 28
<212> 碱基序列
<213>人工合成
<400> 7
TAGTTGCTGCTTGCTGGTTCTCTGTCAC
<210> 8
<211> 429
<212> DNA序列
<213>菊花（Chrysanthemum morifolium）
<400> 8
ACATGGGGATCAACAGTCACTCTCATTTTCTTTTGTATAACAAACACAGTCTCAAAATCTCTACTAGCAGGTTTTGACTGAAACTCGCTGGAGATACTTGCTATTCTCGATTGAAGCAGTTGCCTATTTGAAGCTAAGGAGATGGCTGCCAGCGGACCACCTCGTGATTCACTGAAAGAGATGTTGCAATCTGCTGTCCATTCTATTCAATGGACCTACAGTATTTTCTGGCAACTTTGTCCTCAACAAGGGGTTTTGGTATGGGGAGATGGATACTACAATGGATCTATAAAGACGAGGAAGACTGTTCAGTCGATTGAAGTTAGCACTGAGGAGGCTGCTTTAAGTAGAAGCGATCAACTTAGAGAGCTCTATGATTCGTTGGTTGCTGGTGATCACCTGGTGACAGAGAACCAGCAAGCAGCAACT
<210> 9
<211> 987
<212> DNA序列
<213>菊花（Chrysanthemum morifolium）
<400> 9
ATTTTACCAAACAGCGTCTTACGAGAACAACAAACGCCACCAACCTACCCGCCACATTTCCACCGGAAAATCTTCAATTTCCGACTATGGTTTCACCGGAGACTACTACTAATTGGATCTACGATTGCACAAGTGCGGAACAAGATGGCTCACTTGCGGATTCAGATGGACGCAAGCAAACTGGTTCAAAAAAGCGGGGGAGGGCTGAACCTAGCAGTGGTACGAGTTCCAAAGCATGCCGAGAAAAATTGAGGAGGGATAAGCTAAACGATAAGTTTGTTGAATTGGCGTCGATCCTTGAACCTGGGAAGCCCCCTAAAATTGACAAGGCTGCTATATTGGTTGATGCCGTGCGGAAGCTTGCTCAGTTAAGAAACGAAGCCCAGAAGCTGAAAAACTCAAATACAGAAATTCAGCAGAATATTAAAGAGATGAAGAATGAGAAGACCAAATTGCGGGATGAAAAGCAGAGGCTAAAGTCTAAGAAAGAGGATCTTGAACAAAAAGTCAAATCAATGAACACCCAACCGAACTTTATGATTCCTCCACCTGGAATCCAGGCTGCATATCCTGCTGCCGTTGCAGCAGCTCAAGGCCAAACAATGGGCAATAAATTTGTTCCTGTCATCAGTTACCCGGGAATGGCAATGTGGCAGTTCCTGCCACCAGCTGCTGTCGACACCTCGCAAGATCACGTGCTTCGCCCTCCTGTTGCCTAATCTGAGCCGAGGAGCTTCCATCTGATGAAGCCATGTCCATGGTTTGCCATTGCGTAATGATTGTGTTAGGTTTCTTTTTATGTAATTTATGGAGTCAGGATATGGTTATATCATACATACCTTTTAACTTATAGCTGTGGTGTATTTACTAAGATCCAACGTCTGTGTAATTGTGTGCTATTGTTCAGTTTATGTTGGGTGTCTCCTTAGAACTTAATATAACCTGCATGGTGTCTCCGTTTAGAAATCAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
<210> 10
<211> 23
<212> 碱基序列
<213>人工合成
<400> 10
CCTCCACCTGGAATCCAGGCTGC
<210> 11
<211> 23
<212> 碱基序列
<213>人工合成
<400> 11
CAGATGGAAGCTCCTCGGCTCAG
<210> 12
<211> 24
<212> 碱基序列
<213>人工合成
<400> 12
GTGAAGGTGAAGGGTATTAGGGGG
<210> 13
<211> 24
<212> 碱基序列
<213>人工合成
<400> 13
CTCTTCAAACGTCCTTCACATACC
<210> 14
<211> 532
<212> DNA序列
<213>菊花（Chrysanthemum morifolium）
<400> 14
GTTCCCTGGCATTGCTGACAGGATGAGCAAGGAAATCACCGCTCTTGCTCCCAGCAGCATGAAGATCAAGGTCGTTGCACCCCCAGAGAGAAAATACAGTGTCTGGATCGGAGGATCTATCCTTGCATCACTCAGCACCTTCCAACAGATGTGGATCTCCAAGGGTGAATACGACGAGTCTGGCCCATCCATTGTTCACAGGAAGTGCTTCTAAGTATGGATTTTGTTGCTTTTGAAGATTGAATTTCTTTTGGTTTTTGGTTTTTTTTATTGCCTTTCTTTTTCGTGTTATGTTTCATGTGAACTAAGTAAGGCTGGCAGACGTTGGGCCATGGGGAAAGTGAAGGGGATTAACACCACGTTCATCTCTTAATCCATCACTCTGCTCTACCCCATTTGTCGATTGTTGCCAGAGATGTTTGTAGTTGGAGAGTGGTTGTGATGTCTTATTATGAATTCAAACTGTCGGTCTTTTTTTAATCCGTTTGTTGGCAATAATTATGTCAATGTCTACTGTATCAGAAATTATCTT
<210> 15
<211> 20
<212> 碱基序列
<213>人工合成
<400> 15
CACCCCCAGAGAGAAAATAC
<210> 16
<211> 20
<212> 碱基序列
<213>人工合成
<400> 16
ATCTGTTGGAAGGTGCTGAG
<210> 17
<211> 23
<212> 碱基序列
<213>人工合成
<400> 17
ATGGTTTCACCGGAGACTACTAC
<210> 18
<211> 24
<212> 碱基序列
<213>人工合成
<400> 18
TTAGGCAACAGGAGGGCGAAGCAC
<210> 19
<211> 38
<212> 碱基序列
<213>人工合成
<400> 19
ATCGATACCGTCGACATGGCTGCCAGCGGACCACCTCG
<210> 20
<211> 39
<212> 碱基序列
<213>人工合成
<400> 20
ATTGGTACCGGGCCCCTAAGGAGATATTATTTGGTTGAT
<210> 21
<211> 35
<212> 碱基序列
<213>人工合成
<400> 21
ATGCGGCCGCATGGGGGAGTACAGAAAAATGAGAC
<210> 22
<211> 33
<212> 碱基序列
<213>人工合成
<400> 22
ATACTAGTGGATTGCAATATCATAGTTGGTCCG
<210> 23
<211> 765
<212> DNA序列
<213>菊花（Chrysanthemum morifolium）
<400> 23
ATGGGGGAGTACAGAAAAATGAGACCGAGTAGTAGTACAGGTTTAAGGTTGAAGAAAGGTGCATGGACTCCCAAAGAGGACATGCTTCTCAGGAACTGTATTCAGAAACATGGCGAAGGCAAATGGCATCTAATTCCTCTTAAAGCCGGTTTAAGCCGATGTAGGAAGAGTTGTAGGTTGCGATGGTTAAATTATCTAAGGCCAAATATAAAGAAAGGAGATTTTGAAGAAGATGAGATTGATCTCATTCTAAGGCTTCACAAGCTTCTAGGCAACAGATGGTCACTGATTGCTGGGAGAATACCAGGAAGAACTGCGAATGACGTGAAGAACTACTGGAACACACATATTCGCCCACGGTCCAACAAACAAGATAATGAAGCTAAAGACATTACCACGGCCGTCACAGTTATTAAGCCTCAACCACGGATCTTGTCTAAAACCGTAAATTCTAACCCACCCATTGCAGCTCCTCAAGACTATAACCTAGTAAGGTCAACACATGATGGTGTCGAAACTGCCTTTGATATATCCTCAGGGTATATCTCGTCACCCATCGTATCAGATGCCAAGATTGACAAGTATTTGGTTGAGTTATTTGACAATGAGGATAAGGAATTTGACGGCGAAATAGGGTGGTCATTAGATGGTTGTCCATTCCAAGGGGAGGCTTTAGATGCGGAGCAAGAAGATGGTGAAAGCAGTGTGTTTGATTTGCCCATAGACGAGTTCATGTGGGACTTTTTAAATTCGGACCAACTATGA
<210> 24
<211> 31
<212> 碱基序列
<213>人工合成
<400> 24
ATGAGCTCATGGGAAGAGCACCGTGTTGCCA
<210> 25
<211> 31
<212> 碱基序列
<213>人工合成
<400> 25
ATCTCGAGTTAAGAAAGAAGCCATGCATCTG
<210> 26
<211> 31
<212> 碱基序列
<213>人工合成
<400> 26
ATGAATTCATGGCTGCCAGCGGACCACCTCG
<210> 27
<211> 32
<212> 碱基序列
<213>人工合成
<400> 27
ATGGATCCCTAAGGAGATATTATTTGGTTGAT
<210> 28
<211> 33
<212> 碱基序列
<213>人工合成
<400> 28
ATGAATTCATGGGGGAGTACAGAAAAATGAGAC
<210> 29
<211> 33
<212> 碱基序列
<213>人工合成
<400> 29
ATGGATCCGGATTGCAATATCATAGTTGGTCCG
Claims (2)
1.一个参与花青苷生物合成调控的菊花bHLH转录因子，其核苷酸序列如SEQ：NO. 1所示。
2.根据权利要求1所述的一个参与花青苷生物合成调控的菊花bHLH转录因子在改变植物色泽中的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510606298.5A CN105153288B (zh) | 2015-09-22 | 2015-09-22 | 参与花青苷生物合成调控的菊花bHLH转录因子 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510606298.5A CN105153288B (zh) | 2015-09-22 | 2015-09-22 | 参与花青苷生物合成调控的菊花bHLH转录因子 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN105153288A CN105153288A (zh) | 2015-12-16 |
| CN105153288B true CN105153288B (zh) | 2018-04-20 |
Family
ID=54794369
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201510606298.5A Active CN105153288B (zh) | 2015-09-22 | 2015-09-22 | 参与花青苷生物合成调控的菊花bHLH转录因子 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN105153288B (zh) |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106939038B (zh) * | 2016-01-04 | 2020-09-08 | 深圳市农科集团有限公司 | 一种玉米发育调控蛋白、编码基因及应用 |
| CN111733166B (zh) * | 2020-06-18 | 2021-12-14 | 中国农业科学院郑州果树研究所 | 刺葡萄花色苷合成基因VdbHLH037及其应用 |
| CN112010957B (zh) * | 2020-09-23 | 2022-03-08 | 金天国际医疗科技有限公司 | 一种荷花中促进花青素合成的bHLH类转录因子及其应用 |
| CN113373160B (zh) * | 2021-07-21 | 2022-07-29 | 云南中烟工业有限责任公司 | 烟草bHLH转录因子基因NtFAMA及其应用 |
| CN116064575B (zh) * | 2022-08-23 | 2023-08-22 | 河南师范大学 | 菊花转录因子CmbHLH18及其在抗菊花黑斑病中的应用 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102149821A (zh) * | 2008-07-01 | 2011-08-10 | 孟山都技术公司 | 用于调控靶基因表达的重组dna构建体和方法 |
| CN102703470A (zh) * | 2005-08-30 | 2012-10-03 | 新西兰植物和食品研究院有限公司 | 调控植物中色素生产的组合物和方法 |
-
2015
- 2015-09-22 CN CN201510606298.5A patent/CN105153288B/zh active Active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102703470A (zh) * | 2005-08-30 | 2012-10-03 | 新西兰植物和食品研究院有限公司 | 调控植物中色素生产的组合物和方法 |
| CN102149821A (zh) * | 2008-07-01 | 2011-08-10 | 孟山都技术公司 | 用于调控靶基因表达的重组dna构建体和方法 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| A bHLH transcription factor regulates iron intake under Fe deficiency in chrysanthemum;Zhao, M et al;《SCIENTIFIC REPORTS》;20141024;第4卷;摘要 * |
| A Novel bHLH Transcription Factor Involved in Regulating Anthocyanin Biosynthesis in Chrysanthemums (Chrysanthemum morifolium Ramat.);Xiang, LL et al;《PLOS ONE 》;20151130;第10卷(第11期);第1-17页 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN105153288A (zh) | 2015-12-16 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN104774251B (zh) | 参与花青苷生物合成调控的myb转录因子 | |
| CN105153288B (zh) | 参与花青苷生物合成调控的菊花bHLH转录因子 | |
| US20170306341A1 (en) | Compositions and related methods for modulating transcriptional activation by incorporating gag motifs upstream of core promoter elements | |
| CN106749572B (zh) | 参与调控甜瓜苦味素合成的转录因子及其应用 | |
| CN110923251B (zh) | 烟草多酚氧化酶NtPPO4及其应用 | |
| CN110205330A (zh) | 烟草热激蛋白hsp22及其应用 | |
| CN110240640A (zh) | 烟草aux/iaa及其应用 | |
| CN106868018A (zh) | 白桦BpSPL9基因及其编码蛋白和应用 | |
| CN101698848A (zh) | 金鱼自主转座子基因gfTol2、该基因编码的转座酶及该基因的用途 | |
| Wang et al. | Transcription factor CsDOF regulates glutamine metabolism in tea plants (Camellia sinensis) | |
| CN106967161B (zh) | 调控蓝莓果实中花青素含量的蛋白及其编码基因与应用 | |
| CN106591320A (zh) | 促进提前开花的白桦BplSPL1基因及其编码蛋白 | |
| CN103183731B (zh) | 石斛DnMYB类转录因子、编码基因、载体、工程菌及应用 | |
| CN106518994B (zh) | 参与调控西瓜苦味素合成的转录因子及其应用 | |
| KR20130141261A (ko) | 유전자를 이용하여 벼의 분얼과 뿌리생장을 조절하는 방법 | |
| CN106916826A (zh) | 水稻基因OsNF‑YC4及其应用 | |
| CN114230651B (zh) | 一种利用DhMYB2基因瞬时改变石斛兰花色的方法 | |
| KR20060018817A (ko) | 스트레스 유도성 프로모터 및 그의 이용방법 | |
| CN105112418A (zh) | 陆地棉种子球蛋白基因启动子的克隆及功能鉴定 | |
| CN112094333B (zh) | FaLBD39在增加草莓果实中花青苷积累中的应用及增加草莓果实中花青苷积累的方法 | |
| CN106148346B (zh) | 一种分离出的胚乳不表达启动子safes6及其应用 | |
| CN112029778B (zh) | 马铃薯花青素合成调控基因StWRKY13及其应用 | |
| CN108277227A (zh) | 一种甘蓝型油菜中的nac82转录因子基因及其应用 | |
| CN106282190A (zh) | 高盐胁迫诱导的绒毛白蜡FvNCED3基因启动子的表达基因与应用 | |
| CN102618572A (zh) | 一种培育耐旱植物的方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |